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SERVICIO DE GENÓMICA DEL IIBM (SQP)
ELABORADO POR: Gemma Rodríguez-Tarduchy Responsable del SQP
FECHA:10/10/10
REQUISITOS DE LAS MUESTRAS PARA PCR EN TIEMPO REAL
Requisitos de Calidad de las muestras
Uno de los pasos críticos para el éxito de los análisis realizados mediante PCR a Tiempo Real es la calidad de las muestras de RNA. La calidad del
RNA se mide en base a tres parámetros básicos:
Pureza: La contaminación de la muestras con impurezas orgánicas e inorgánicas (p.ej. fenol, cloroformo), y proteínas afecta de forma significativa
la sensibilidad y especificad del resultado. Para determinar el grado de pureza del RNA se determina la relación de absorbancia A260/280 y
A260/230, que debe ser = 1,8.
Integridad: La absorbancia a 260 nm y la relación A260/280 sólo nos da una indicación de la cantidad de RNA y del grado de contaminación de
impurezas orgánicas e inorgánicas, pero no nos dice nada sobre el nivel de degradación de RNA. Existen dos métodos para determinar el grado de
degradación del RNA:
Relación entre las bandas ribosomales 28S y 18S que se observan en un gel de agarosa como bandas discretas y cuya relación 28S/18S en
un RNA íntegro es cercano a dos. Se recomienda una relación 28S/18S = 1,2.
RIN: RNA Integrity Number, es un número que aplica el algoritmo del software del Bioanalizador 2100 Bioanalyzer de Agilent
Technologies y que es un indicador del grado de degradación de la muestra de RNA. Un RNA intacto tiene un RIN 9-10, mientras que un
RNA degradado tendría un RIN <6. Para las aplicaciones de PCR a tiempo Real se recomienda un RIN mínimo de 7, aunque depende del
tipo de muestra.
Contaminación de DNA genómico: Las técnicas de análisis de expresión génica mediante PCR a tiempo real son técnicas extremadamente sensibles
a la contaminación de DNA genómico de la muestra de RNA. La contaminación de DNA puede afectar de forma significativa a la sensibilidad y
especificidad del resultado de expresión génica. El mejor método para evitar la contaminación de DNA genómico es el utilizar un método de
extracción que combine al extracción orgánica en fenol (Trizol Reagent) y la posterior purificación en columna. Existen kits de purificación en
columna que incluyen un pretratamiento en columna con DNasa y posterior elución del RNA. En aquellos casos en los que la muestra contenga un
grado de contaminación inaceptable para la aplicación de PCR a tiempo Real con SYBR Green (especialmente importante) debe tratarse la muestra
con DNasa (QIAGEN o AMBION) y repurificar en columna tras el tratamiento. Es muy importante eliminar totalmente la DNasa ya que inactiva la
reacción de retrotranscripción requerida en la síntesis de cDNA o cRNA.
* DNA-free: a new method to remove DNA, AMBION
* Avoiding DNA contamination in RT-PCR
* RNase free DNase set, QIAGEN
Es esencial que las todas las muestras del análisis tengan grados de pureza (A260/280) e integridad (28S/18S y/o número RIN) comparables.
Recomendaciones para la extracción del RNA
Se recomienda el uso de muestras frescas para la obtención del RNA. Para la extracción de RNA a partir de tejidos, congelar el tejido en nitrógeno
líquido inmediatamente después de su obtención. El tejido así congelado puede mantenerse a -80ºC hasta la extracción del RNA. Para la extracción,
trocear y pesar el tejido sin descongelar, mantenerlo en hielo seco hasta su homogenización en la solución de lisis. Otra solución para acumular
tejido hasta el momento de la extracción, es utilizar una solución estabilizadora de RNA como el RNAlater de AMBION (Cat #AM7020, AM7024)
o QIAGEN (Cat # 76104, 76106). Seguir las instrucciones del fabricante.
Para el análisis de expresión génica es imprescindible el procesamiento de las muestras control o referencia y experimental en paralelo y siguiendo
exactamente el mismo procedimiento.
Las técnicas de PCR a tiempo real son técnicas extremadamente sensibles que requieren de muestras de gran calidad e integridad, libres de
impurezas y DNA genómico.
Métodos de extracción de RNA:
Para la extracción del RNA a partir de tejidos, incluidas células sanguíneas, se recomienda una combinación de extracción orgánica con Trizol
Reagent (Invitrogen, Cat.# 15596-018) seguido de una purificación en columna (RNeasy Mini kit, QIAGEN, Cat # 74104).
Para células en suspensión o cultivos celulares la extracción con RNeasy Mini kit (QIAGEN) es suficiente.
En el caso de muestras para PCR a tiempo Real también ha sido validado el sistema de purificación en columna RNAqueous-4PCR kit de AMBION
(Cat # AM1914), obteniéndose un RNA libre de contaminación de DNA genómico.
Para la extracción de RNA a partir de pequeñas cantidades de muestras, por ejemplo obtenidas a partir de microdisección por láser se recomiendan
dos métodos ya validados para PCR a tiempo real: Absolutely RNA Nanoprep kit de Stratagene (Cat # 400753); y RNAqueous Mikro kit de
AMBION ( Cat # AM1931) combinado con LCM Staining kit (AMBION, Cat # AM1935).
Para la extracción de RNA para el análisis de microRNAs mediante el sistema de microarrays de miRNA, Agilent Technologies recomienda tres
métodos de extracción: miRNeasy Mini kit de QIAGEN (CAT # 217004), mirVana RNA isolation kit de AMBION (CAT # AM1560, AM1561), o
Trizol Reagent de Invitrogen (Cat.# 15596-018). Agilent recomienda seguir las instrucciones de los fabricantes para la extracción de RNA total.