Ihosvanni Cuesta Mola

Transcripción

Universidad de la Habana
Facultad de Biología
Departamento de Microbiología
Título: Importancia de la inoculación de Glomus mosseae-Bacillus subtilis y
Glomus mosseae-Pseudomonas fluorescens sobre el crecimiento y
micorrización de plántulas de Swietenia macrophyla x mahagoni en vivero.
Tesis presentada en opción al título de Maestro en Microbiología mención
en Microbiología General.
Autor: Lic. Ihosvanni Cuesta Mola.
Tutor: M. Sc. Luis Casadesus Romero.
2003
TRIBUNAL
Autor
Tutor
Presidente
Secretario
Vocal
Oponente
Calificación
Indice
Páginas
Dedicatoria.
Agradecimiento.
Resumen.
Introducción
1
1-Revisión Bibliográfica
4
1.1-Micorriza y sus tipo
4
1.2-Desarrollo de la infección VAM
7
1.3-Taxonomía de los hongos micorrizógenos
10
1.4-Micotrofía obligada y facultativa de las plantas
10
1.5-Funciones de la micorriza
11
1.6-Comunidad bacteriana de la rizosfera y taxonomía bacteriana
13
1.7-MHB (Micorrhization Helper Bacteria)
18
1.8-Género Swietenia. Sus especies e híbrido
19
2-Materiales y Métodos
20
2.1-Influencia de Glomus mosseae-Bacillus subtilis y
20
Glomus mosseae-Pseudomonas fluorescens sobre
los indicadores de crecimiento y micorrización de
Swietenia macrophyla x mahagoni.
2.1.1-Preparación del suelo y las bolsas
20
2.1.2-Inoculación fúngica
20
2.1.3-Preparación del inóculo micorrizógeno
20
2.1.4-Aislamiento de esporas de Glomus mosseae y
21
examen de pureza del inóculo.
2.1.5-Inoculación bacteriana
22
2.1.6-Preparación del inóculo bacteriano
22
2.1.7-Siembra de Swietenia macrophylla x mahagoni
23
2.1.8-Condiciones experimentales y medición de los
23
indicadores de crecimiento y micotrofía.
2.1.9-Diseño experimental
25
2.2-Influencia de Bacillus subtilis y Pseudomonas
26
fluorescens sobre la efectividad de Glomus
mosseae en los indicadores de crecimiento de
Swietenia macrophyla x mahagoni.
2.2.1-Tratamientos e indicadores de crecimiento
26
2.2.2-Clasificación de la efectividad del inóculo
27
28
fluorescens sobre la fase de la infección
micorrizógena de Swietenia macrophyla
x mahagoni con Glomus mosseae.
2.3.1-Tratamientos y construcción de la curva de
28
infección micorrizógena vs días.
3-Resultados y Discusión
29
3.1-Influencia de Glomus mosseae-Bacillus subtilis
29
y Glomus mosseae-Pseudomonas fluorescens
sobre los indicadores de crecimiento y
micorrización de Swietenia macrophyla x mahagoni.
3.1.1-Altura
29
3.1.2-Peso Seco Foliar
31
3.1.3-Peso Seco Radical
33
3.1.4-Diámetro
34
3.1.5-Infección Micorrizógena
35
3.1.6-Micelio externo
38
3.1.7-Respuesta a la Micorriza
40
3.1.8-Longitud de las Raíces Micorrizadas
41
43
fluorescens sobre la efectividad de Glomus
mosseae en los indicadores de crecimiento
de Swietenia macrophyla x mahagoni.
3.2.1-Altura
43
44
45
3.2.4-Diámetro
46
47
fluorescens sobre las fases de la infección
micorrizógena de Swietenia macrophyla
x mahagoni con Glomus mosseae.
4-Discusión General
50
5-Conclusiones
54
6-Recomendaciones
56
7-Bibliografía
57
INTRODUCCION
Los trópicos constituyen la zona de mayor potencial para el crecimiento de las
plantas, con relación a la disponibilidad de luz y temperatura. Sin embargo, el
desarrollo de las plantas a menudo está limitado por estrés hídrico y limitaciones
de nutrientes. Se calcula que la extensión del área con situaciones de estrés de
nutrientes representa el 30% de la región tropical, con estrés hídrico el 33%, con
exceso de agua el 11%, suelos poco profundos el 17% y alarmantemente solo el
9% no presenta limitación para el desarrollo de la planta (Sieverding, 1991). Con
frecuencia las situaciones de estrés se combinan, originando un impacto más
desfavorable en la planta; se estima que el 43% de la región tropical presenta
deficiencia de nutrientes (N, P, K, Ca, Zn y B), toxicidad (Al y Mn) y alta capacidad
de fijación del fósforo (pH entre 5.3 y 7.5) (Sánchez y Salinas, 1981).
Unido a lo planteado anteriormente se suman las alteraciones provocadas por la
actividad humana como: el uso excesivo de fertilizantes químicos y plaguicidas,
que conllevan a un mayor deterioro de los suelos. Todo esto ha provocado la
necesidad de recurrir a formas biológicas que contribuyan a alcanzar y/o
mantener la fertilidad de los suelos. Dentro de estas soluciones biológicas se
encuentran
los
biofertilizantes,
con
especial
atención
en
los
hongos
micorrizógenos por su positiva incidencia en la conservación de los suelos al
disminuir la aplicación de fertilizantes que habitualmente se añaden con el fin de
obtener altos niveles de desarrollo de la planta.
La simbiosis micorrizógena aumenta de forma marcada la absorción de nutrientes
como nitrógeno, potasio y especialmente fósforo (Merryweather y Fitter, 1996 y
Alkaraki y Clark, 1998), mejora el transporte y absorción del agua en el vegetal,
así como la resistencia de la planta huésped a la sequía (Rivas-Platero, 1997 y
Alkaraki, 1998) y la formación de agregados del suelo (Cuenca y col.,1998).
Glomus mosseae (Nicolson & Gerdemann) Gerdemann & Trappe es un hongo
micorrizógeno de una amplia gama de hospederos, lo que sumado a su
capacidad de infección y producción de beneficios a la planta, desde pastos
(Pellet y Sieverding, 1986) hasta especies forestales (Ferreira y col.,1982, y
Bouza y col.,1986), aún cuando se encuentra en sitios de alta actividad
agronómica (Dehne, 1988) convierte a este microorganismo en uno de los más
usados como biofertilizante.
La adición conjunta de hongos formadores de micorriza y bacterias que estimulen
la simbiosis micorrizógena resulta de gran interés en la esfera agrícola y forestal,
sobre todo por los altos niveles de crecimiento obtenidos, incluso al compararlos
con la aplicación exclusiva del mismo hongo formador de micorriza.
Bacillus y Pseudomonas representan los géneros bacterianos de mayor utilización
con el fin de incrementar la simbiosis micorrizógena (Mayo, 1986; Von Alten, 1993
y Garbaye, 1994) y el desarrollo de las plántulas en vivero (Frommel, 1993;
Powell y Rhodes, 1994 y Glick, 1995). Siendo Bacillus subtilis y Pseudomonas
fluorescens las especies más utilizadas en cada género anteriormente
mencionado.
La novedad científica de este trabajo está enmarcada en el hecho de que en
nuestro país los trabajos relacionados con la aplicación dual hongo-bacteria son
muy escasos, presentándose solamente en la actividad agrícola (Hernández,
2001). Debido a lo planteado anteriormente decidimos realizar esta experiencia en
la actividad forestal trazándonos los siguientes objetivos:
Determinar la influencia de Glomus mosseae-Bacillus subtilis y Glomus
mosseae-Pseudomonas fluorescens sobre los indicadores de crecimiento y
micotrofía de Swietenia macrophyla x mahagoni en fase de vivero.
Determinar la influencia de Bacillus subtilis y Pseudomonas fluorescens sobre
la efectividad de Glomus mosseae en los indicadores de crecimiento de
Swietenia macrophyla x mahagoni en fase de vivero.
Determinar la influencia de Bacillus subtilis y Pseudomonas fluorescens sobre
las fases de la infección micorrizógena de Glomus mosseae sobre Swietenia
macrophyla x mahagoni en fase de vivero.
1-REVISION BILIOGRAFICA
1.1-Micorriza y sus tipos
El término MICORRIZA define la relación simbiótica entre determinados hongos
del suelo y plantas superiores. Su denominación se debe al botánico alemán
Albert Bernard Frank, quien en 1885 nombró de esta forma la unión de dos
especies diferentes en una estructura, donde se nutren la planta y el hongo.
MICORRIZA proviene del griego mikes que significa hongo y del vocablo latín
rhiza que significa raíz (LePage y col.,1997).
Estas asociaciones eran ya conocidas, aproximadamente 50 años antes del
pronunciamiento de Frank, pero se consideraban de naturaleza parasítica, debido
a esto, las especulaciones de Frank en cuanto al posible papel de esta asociación
en la nutrición y crecimiento de las plantas fueron refutadas por los científicos de
la época, hasta que pudo demostrar de manera convincente que la colonización
de las raíces de los árboles por los hongos producía abundante micelio en la
rizosfera aumentando la absorción de nutrientes del suelo y la incapacidad de
atacar, dañar o causar disfunción en las raíces, quedando así establecido el
carácter mutualista de la asociación.
Existen reportes de la presencia de micorrizas, tanto en la región ártica como en
fósiles (Taylor y col.,1995), lo que demuestra que los hongos micorrizógenos
coevolucionaron junto con las plantas, distribuyéndose dentro de los grupos
vegetales y en distintas regiones climáticas del planeta.
Las micorrizas se agrupan en tres grupos fundamentales atendiendo a la
anatomía de las raíces que colonizan:
Ectomicorrizas: Caracterizadas por la penetración intercelular del micelio fúngico
en la corteza radicular, formando la red de Hartig y un manto hifal alrededor de
segmentos de raíces colonizados, provocando cambios anatómicos evidentes que
producen el crecimiento dicotómico de estas raíces (Harley y Smith, 1983; Landis,
1989, y Molina y col., 1992).
La importancia de este tipo de micorriza como biofertilizantes radica en que se
presenta mayoritariamente en especies arbóreas de interés económico de las
familias Fagaceae, Pinaceae y Betulaceae. Sin embargo, se consideran de
distribución restringida, principalmente en regiones templadas, presentando una
baja frecuencia en los trópicos (Molina y col., 1992).
Alrededor de 5000 especies de hongos son responsables de este tipo de
micorriza y pertenecen a Basidiomicotina, Ascomicotina y Zigomicotina (Harley y
Smith, 1983, y Molina y col., 1992).
El establecimiento de la simbiosis ectomicorrizógena se inicia por la activación de
los propágulos del hongo que en el caso de las esporas, germinan y forman una
red de hifas en la rizosfera, colonizando la superficie de las raíces y finalmente
penetrándola a través de las uniones celulares de la zona de infección. Esta zona
de infección micorrizógena se localiza detrás de la zona meristemática apical de
la raicilla. Posterior a la penetración, las hifas colonizan los espacios intercelulares
de la corteza por digestión enzimática de la lámina media, ocupando todo el
espacio intercelular, lo que da origen a la red de Hartig, zona de intercambio de
nutrientes, agua y fotosintatos entre los simbiontes. Al mismo tiempo que se forma
la red de Hartig, las hifas envuelven las raíces formando el manto hifal. Esta
estructura es de gran interés, ya que a partir de su color se procede a la
clasificación de la micorriza (Dominik, 1969). El micelio extramátrico se forma una
vez que las hifas comienzan a crecer hacia la rizosfera, convirtiéndose en la
estructura encargada de la absorción de nutrientes y agua.
Ectendomicorrizas: Son básicamente ectomicorrizas, pero con penetración
intracelular. Existen diferencias anatómicas en función de la planta hospedera, de
manera que se diferencian los subgrupos de las Pinaceae y de las Ericales
(géneros Arbutus y Monotropa; micorrizas arbutoides) (Warcup, 1988; Landis,
1989, y Molina y col., 1992).
Las ectendomicorrizas fueron descubiertas en 1922 cuando Melin notó la
infección
intracelular
en
las
micorrizas
ectotróficas,
llamándolas
ectendomicorrizas, ya que combinan
características de ambos tipos de
micorrizas. Las ectendomicorrizas se presentan en raíces de plantas leñosas y
muy raramente en herbáceas, resaltando los géneros Arbutus, Arctous y
Arctostaphylos.
Los beneficios de esta simbiosis se encuentran netamente restringidos a los
pocos géneros hospederos que la forman. Por otra parte, resultan escasos los
estudios relacionados con este tipo de micorriza, que por estar relacionados con
las ectomicorrizas sus métodos de estudio, inoculación y multiplicación son muy
similares (Molina y col., 1992).
Endomicorrizas: Caracterizadas por la penetración inter e intracelular, pero sin
formación de manto hifal, ni modificaciones morfológicas evidentes en las raíces.
Dentro de este tipo de micorriza se encuentran las ericoides, las orquidiodes y las
vesículo-arbusculares. Las dos primeras establecidas con los taxones hospederos
que le dan nombre y la tercera, las micorrizas vesículo-arbusculares, las de más
amplia distribución de todos los microorganismos biofertilizadores, tanto
geográfica como florísticamente. (Molina y col., 1992 y Sylvia, 1994).
Las micorrizas ericoides son de corta distribución y por tanto poco importantes
como biofertilizante. Siendo los hospederos de este tipo de micorriza los
miembros de la familia Ericaceae.
Como su nombre indica las micorrizas orquidiodes se establecen únicamente con
los miembros de la familia Orchidaceae, por lo que encierran una gran
importancia económica al no poderse cultivar orquídeas prescindiendo de esta
simbiosis.
Las micorrizas vesículo-arbuscular representan la simbiosis micorrizógena más
extendida sobre el planeta. De acuerdo con Gerdemann (1975) con la excepción
de las familias básicamente ectomicorrizógenas (Fagaceae, Betulaceae y
Pinaceae), las que forman endomicorrizas ericoides y orquidiodes, y unas pocas
familias no reportadas como micorrizógenas (Chenopodiaceae, Cruciferaceae,
Fumariaceae, Cyperaceae, Commelinaceae, Urticaceae y Polygonaceae), la
vasta mayoría de las especies restantes pertenece el tipo de micorriza vesículoarbuscular.
Geográficamente, las micorrizas de este tipo se han reportado desde el ártico
hasta los trópicos, lo que unido a su amplio espectro de hospederos, hace que
muy pocos ambientes naturales no contengan especies con este tipo de
simbiosis, siendo las excepciones las plantas que crecen en ambientes acuáticos
y los bosques monoespecíficos densos estrictamente ectomicorrizógenos
(Trappe, 1987).
1.2-Desarrollo de la infección VAM
Según Bowen (1987) la infección por hongos micorrizógenos consta de 6 pasos
principales:
Preinfección: Las esporas, hifas o fragmentos de raíz con estructuras
fúngicas, constituyen fuentes a partir de los cuales puede iniciarse la
formación de micorriza. Excepto las esporas, todas estas fuentes de micorriza
más conocidas como propágulos micorrizógenos originan la micorriza al
ponerse en contacto con las raíces. En el caso de las esporas se requiere de
la germinación y crecimiento del tubo germinativo en el suelo, este evento está
influenciado por factores físicos (oxígeno, dióxido de carbono y contenido de
agua) y químicos del suelo (pH, nutrientes, fuentes de nutrientes, efecto
fungistático). La propiedad infectiva del tubo germinativo se pierde en un
periodo que abarca desde días a pocas semanas, por lo que se requiere de su
pronta puesta en contacto con la raíz del hospedero potencial
Infección primaria (penetración a la raíz):
El hongo penetra la raíz del
hospedero entre las células de la epidermis y a menudo forma un apresorio en
la primera capa de células. A partir de este momento finaliza el crecimiento
autotrófico del hongo.
Formación de arbúsculos y vesículas: Posterior a la penetración las hifas
crecen inter e intracelularmente, sin invadir epidermis, endomermis, xilema,
floema y tejidos superiores. Los arbúsculos se forman dentro de las células
poco tiempo después de la penetración (2 a 5 días). El arbusculo es una
ramificación de una hifa que penetra la pared celular y constituye la estructura
de contacto entre el hongo y la planta. La formación del arbúsculo incrementa
la actividad metabólica de las células del hospedero, debido a la transferencia
bidireccional de metabolitos hacia el hongo y nutrientes para la planta. La vida
media del arbúsculo está comprendida entre 4 y 15 días, transcurrido este
tiempo esta estructura se degenera y es digerida por la célula hospedera. Al
mismo tiempo que ocurre la formación del arbúsculo, o poco tiempo después,
los hongos forman vesículas inter y/o intracelularmente. Estas estructuras son
ensachamientos apicales o intermedios de la hifa que contienen alta
concentración de lípidos, por lo que representan sitios de reserva del hongo.
Durante situaciones de estrés (bajo suministro de metabolitos hacia el hongo)
el contenido lipídico de las vesículas es metabolizado por el hongo. Sin
embargo no todos los géneros de estos hongos producen vesículas como lo
son: Gigaspora y Scutellospora. Estos dos géneros producen las células
auxiliares como estructura de reserva.
Extensión del crecimiento fúngico en las raíces y en la rizosfera: La
extensión de la infección en la raíz está dividida en las siguientes fases:
1)fase inicial (fase lag): Ocurre la infección primaria,
2)fase exponencial: Ocurre el crecimiento fúngico en el interior de la raíz, y es
el momento donde la velocidad de crecimiento del hongo supera la de la raíz.
3)fase estacionaria (fase plateau): Se igualan las velocidades de crecimiento
del hongo y de la raíz.
La planta, el hongo y los factores físicos y químicos del suelo influyen en la
duración de todas las fases antes mencionadas. La extensión del crecimiento
fúngico en las raíces, especialmente en las raíces secundarias, se desarrolla
durante la fase exponencial. Las hifas siguen la dirección del crecimiento de las
raíces y penetran dentro de las mismas a distancias irregulares. La colonización
de las raíces puede ser interna o en la superficie de las raíces (Wilson, 1984).
Expansión del crecimiento fúngico en el suelo: Posterior a la infección
primaria y una vez que las hifas han colonizado las raíces y la rizosfera
comienza la exploración del suelo. Esta función es realizada por el micelio
externo, que es el elemento más importante en la obtención y transporte de
nutrientes provenientes de la solución del suelo hacia la planta. Este micelio
externo no es septado y se ramifica dicotómicamente
Formación de esporas de los hongos micorrizógenos: Los hongos
micorrizógenos forman esporas en el micelio externo. El diámetro de estas
esporas depende de la especie fúngica y oscila entre 15 y 80 m. El tiempo
que media entre la infección de las raíces y el proceso de formación de
esporas es de 3 a 4 semanas aproximadamente. El hongo, el hospedero y las
condiciones ambientales del suelo influyen en el tiempo y la extensión de la
esporulación.
1.3-Taxonomía de los hongos micorrizógenos
Los hongos micorrizógenos vesículo arbuscular se ubican actualmente en el
Orden Glomales de la Clase Zygomicetes. Dentro de este orden existen dos
grupos: Glomineae y Gigasporineae. En el primero se encuentran las familias
Acaulosporaceae, Glomaceae, Archaesporaceae y Paraglomaceae, las cuales
encierran a los géneros Entrophospora y Acaulospora, Glomus, Archaespora y
Paraglomus, respectivamente. En el segundo grupo se ubica la familia
Gigasporaceae, la cual encierra a los géneros Gigaspora y Scutellospora (INVAM,
2001). Hasta hace muy poco una única familia (Endogonaceae) comprendía todos
estos géneros e incluía además, al género Endogone, formador de ectomicorriza
y de zigosporas sexuales.
Un gran inconveniente para el trabajo con estos hongos radica en su incapacidad
para crecer en medios axénicos, por lo que su identificación es estrictamente
basada en los siguientes caracteres morfológicos: (1) estructuras de la micorriza
dentro de las raíces, (2) modo de formación de las esporas, (3) estructuras de la
espora (capas de pared de espora, paredes interiores flexibles), y (4) el modo de
germinación de la espora (INVAM, 2001).
1.4-Micotrofia obligada y facultativa de las plantas
Las plantas micotróficas se distinguen por su
grado de dependencia
micorrizógena, el cual se define como: “El grado al cual la planta es dependiente a
la micorriza para producir su máximo crecimiento o rendimiento, en un nivel dado
de fertilidad del suelo” (Gerdemann, 1975). Las plantas con un sistema radical
extenso son altamente dependientes de la micorriza, en este caso se encuentran
la cebolla (Allium spp.) y la mayoría de las leguminosas tropicales.
Adicionalmente, la dependencia micorrizógena es correlacionada con la
morfología de los pelos radicales; las plantas con alta densidad de pelos radicales
son menos dependientes de la micorriza que aquellas que presentan pocos o
cortos pelos radicales (Sieverding, 1991).
La dependencia micorrizógena es una propiedad intrínseca de la planta (Janos,
1988).Las plantas pueden ser dependientes obligadas o facultativas de la
micorriza, lo cual está definido por su habilidad de crecer con y sin micorriza en
diferentes niveles de fertilidad del suelo (usualmente medido como concentración
de fósforo en la solución del suelo, ya que este elemento a menudo limita el
crecimiento de las plantas en el trópico y la micorriza tiene su principal efecto en
su obtención). Las plantas que no crecen sin micorriza en niveles de fósforo de
100 g/g de suelo (suelo altamente fértil), se consideran dependientes obligadas
de la micorriza.
La dependencia micorrizógena no debe ser confundida con la respuesta del
hospedero a la micorriza (Janos, 1988). La respuesta a la micorriza depende de la
fertilidad del suelo y está influenciado por las dos especies envueltas en la
micorriza, constituyendo una medida de la efectividad del hongo en la simbiosis,
por lo que una planta micotrófica obligada puede mostrar desde una baja hasta
una alta respuesta a la micorriza, de igual forma ocurre con una planta micotrófica
facultativa
1.5-Funciones de la micorriza
La simbiosis micorrizógena se caracteriza por:
Incremento de la rizosfera: Una vez establecida la micorrización, los hongos
micorrizógenos desarrollan un micelio alrededor de las raíces. El crecimiento
de este micelio depende de la especie fúngica (Abbott and Robson, 1985), de
la planta y factores del suelo (Kought, 1985). La función de este micelio
consiste en incrementar considerablemente la rizosfera, de forma tal que se
incrementa el volumen de suelo al cual tiene acceso la planta. Se ha calculado
que 1 cm de raíz sin micorriza puede explorar alrededor de 1-2 cm3 volumen
de suelo con ayuda de los pelos radicales, este volumen de suelo es
potencialmente incrementado de 5-200 veces por el micelio de los hongos
micorrizógenos, por lo que 1 cm de raíz micorrizada puede explorar hasta 200
cm3 de volumen de suelo. Aunque lo común es de 12 a 15 cm 3(Sieverding,
1991).
Incremento de la absorción de nutrientes a la planta: La obtención de
nutrientes por la planta es principalmente determinado por la capacidad de
absorción de las raíces (Merryweather y Fitter, 1996) y por la difusión de los
nutrientes en la solución del suelo. Esta capacidad de absorción de nutrientes
con baja velocidad de difusión como: fósforo, zinc y molibdeno, y en baja
concentración como el potasio, el azufre y el ión amoniacal aumenta en
plantas micorrizadas (Fabio, 1982). El fósforo constituye el principal elemento
absorbido por los hongos micorrizógenos, lo cual es de gran interés en el
trópico, donde la concentración de fósforo es baja en la solución del suelo. Las
plantas micorrizadas son más eficiente en el uso de fosfatos insolubles, esto
se ha relacionado a procesos químicos del suelo (Sieverding and Galvez,
1988). En suelos tropicales ácidos (pH < 5.3) las rocas fosfóricas son
solubilizadas constantemente y a alta velocidad, produciendo fuentes más
solubles de fósforo. En suelos con pH de 5.5 a 6.5 la solublización de rocas
fosfóricas está relacionada, especialmente las apatitas, con
la alta
acidificación de la rizósfera (pH 3.5-4.5) (Nye and Kirk, 1987). Algunos
micronutrientes como el Cu, S y B son activamente absorbidos por los hongos
micorrizógenos y transportados a la planta. Otros microelementos como: Fe,
Mn y Cl son generalmente encontrados en mayor concentración en plantas
micorrizadas que en las no micorrizadas (Buwalda y col., 1983)
Reciclaje de nutrientes: Las esporas de los hongos micorrizógenos son una
pequeña fuente de nutrientes en ecosistemas naturales capaz de ingresar al
suelo 10-60 g N/ha, 1-30 g P/ha, 1-18 g K/ha, 4-50 g Ca/ha y 1-10 g Mg/ha
(Sieverding, 1989). En comparación con las esporas la biomasa fúngica es
una gran fuente de nutrientes. Considerando que 42 m de hifas fúngicas son
equivalentes a 1mg de masa seca fúngica (Herrera y col., 1986) estos hongos
pueden aportar al suelo 240-1900 Kg de biomasa seca fúngica/ha. Si
asumimos que estos hongos tienen similar concentración que sus esporas
ingresarían al suelo 4-32 Kg de N/ha, 0.6-5Kg P/ha, 0.2-1.7 Kg K/ha, 1-7.5 Kg
Ca/ha y 0.2-1.7 Kg Mg/ha.
Este tipo de hongos participa activamente en el transporte de nutrientes del
suelo hacia la planta mediante la explotación intensiva de las capas superiores
del suelo, donde existe gran cantidad de materia orgánica y ocurre
mayoritariamente el crecimiento radical, por lo que este reciclaje de nutrientes
en las capas profundas del suelo prácticamente es nulo (Bowen, 1980).
Agregación del suelo: Los hongos micorrizógenos a través de su micelio
externo pueden agregar partículas del suelo (Cuenca y col.,1998). Esta
formación de agregados pueden mejorar las condiciones físicas del suelo y
constituye un control potencial de la erosión del suelo. Esta función de las
micorrizas ha sido subestimada, en la actualidad se conoce que las hifas están
unidas a las partículas del suelo mediante polisacáridos amorfos (Burns y
Davies, 1986)
Resistencia de la planta a situaciones climáticas de estrés: Una
temperatura del suelo entre 25 y 300c y una capacidad máxima de retención
de agua entre 40 y 80 %, son fisiológicamente óptimos para el establecimiento
de micorrizas vesículo-arbuscular (Sieverding, 1980). Sin embargo, en muchas
regiones tropicales durante el día las temperaturas alcanzan de 40-450c.
Cuando esto ocurre el desarrollo de la planta se reduce dramáticamente,
dependiendo la planta en gran manera los hongos micorrizógenos, ya que
estas temperaturas no se encuentran a una profundidad mayor de 5 cm, por lo
que estos hongos no se afectan. La micorriza también representa una gran
ayuda contra el estrés hídrico (Rivas-Platero, 1997 y Alkaraki, 1998), el cual es
un problema en el trópico. Algunos beneficios de las micorrizas en relación
con el agua son: decremento de la resistencia a la conductividad hidráulica de
la planta, efectos positivos sobre la regulación de los estomas, sistema radical
más ramificado (Nelson, 1987) y mayor absorción de fósforo y potasio por la
planta (Mengel y Kirkby, 1982).
Las plantas cuando se encuentran en transpiración máxima se les reduce el
diámetro radical y la película de agua alrededor de las raíces se pierde
(Bernstein y col., 1959). Se ha sugerido que en estos casos que las hifas del
hongo pueden funcionar como un puente físico y mantener esta película de
agua en contacto con la raíz, de esta forma el flujo de agua a la raíz se
mantiene, aún en transpiración máxima (Sieverding, 1980). En muchas
regiones tropicales es necesario que las plantas sobrevivan cortos períodos de
sequía. Durante este período hay un rápido decremento del contenido de agua
en los primeros 15 cm de profundidad, lo cual afecta el crecimiento de las
raíces. Bajo estas condiciones las hifas del hongo son más resistentes que las
raíces, por lo que realizan más exitosamente la absorción del agua (Ahmadsad,
1985)
Incremento
de
microorganismos
beneficiosos
del
suelo:
Existen
evidencias de la interacción tripartita Rhizobium-Leguminosa-Micorriza. Las
leguminosas micotróficas realizan una simbiosis ineficiente con Rhizobium
cuando la planta no está micorrizada (Gianinazzi-Pearson y Diem, 1982). De
forma similar ocurre con Frankia (nitrofijador) y especies no leguminosas. Los
hongos micorrizógenos incrementan no solo la población de microorganismos
nitrofijadores de vida libre como: Azotobacter, Azospirillum, y nitrofijadores
simbióticos como: Rhizobium., sino también la población de microorganismos
fosfosolubilizadores (Pseudomonas sp, Agrobacterium sp, Bacillus circulans,
Aspergillus niger, Penicillium funiculosum).(Sieverding, 1991).
Control de microorganismos patógenos: Los hongos micorrizógenos son
capaces de incrementar la resistencia de las plantas contra patógenos de la
raíz (Dassi y col.,1998), esto ocurre cuando colonizan la raíz antes del
patógeno. Una micorrización efectiva reduce la incidencia de nemátodos y los
daños causados por los nemátodos se compensan con el desarrollo micelial
del hongo. Los mecanismos por los cuales estos hongos controlan a los
fitopatógenos se relacionan con los cambios en la morfología o en la fisiología
del hospedero. Las alteraciones morfológicas se relacionan con la lignificación
de las paredes celulares, la producción de otros polisacáridos e incremento del
sistema vascular. Las dos primeras aumentan la dificultad de penetración del
patógeno a la planta y la última eleva el flujo de nutrientes y agua en la planta
hospedera. Fisiológicamente, la concentración de micro y macroelementos es
acrecentada, disminuyendo la susceptibilidad de las plantas a enfermedades
(Graham, 1983)
1.6-Comunidad bacteriana de la rizosfera y taxonomía bacteriana
El suelo es un desierto nutricional si lo comparamos con la región que se
encuentra adyacente a las raíces de las plantas, rizosfera, la cual es rica en
nutrientes, debido al suministro de fotosintatos provenientes de la planta,
aproximadamente el 40% de los fotosintatos que se encuentran en la raíz (Lynch
and Whipps, 1991). No es sorprendente entonces que la rizosfera sea la zona de
mayor presencia y actividad microbiana. La población microbiana más abundante
en esta región la representan las bacterias con una concentración que oscila entre
1010 y 1012 ufc/g de suelo (Lazarovits and Nowak, 1997). El efecto beneficioso de
las rizobacterias se relaciona principalmente con el incremento del crecimiento de
las plantas, de ahí que se les denomine PGPR (Plant Growth Promoting
Rhizobacteria) (Dileep y Dubet, 1992). Según Kloepper y col. (1989) el efecto
beneficioso de las rizobacterias radica en diferentes mecanismos mediante los
cuales ellas ejercen su acción. Bashan y Levanony (1990) plantean que los
cambios más marcados de la inoculación ocurren en el sistema radical de las
plantas, lo que conlleva posteriormente a un incremento en la adquisición de
sustancias nutritivas y agua. Según Fendrik y col. (1995) y Martínez y col. (1997)
las bacterias rizosféricas son capaces de producir sustancias fisiológicamente
activas como vitaminas, giberelinas, citoquininas y ácido indol acético en
cantidades importantes, las cuales mediante su acción conjunta estimulan la
germinación de la semilla. Por otra parte, Martínez y Dibut (1996) plantean que
ciertos géneros bacterianos, fundamentalmente los de vida libre, fijan el nitrógeno
atmosférico en proporciones considerables. Goendi y col. (1995) encontraron que
los géneros Azospirillum y Azotobacter producen polisacáridos extracelulares
durante su crecimiento y proliferación. Estos compuestos son efectivos en la
formación de agregados del suelo, lo que trae como consecuencias mejoras en el
intercambio gaseoso y en la capacidad hídrica de los suelos.
Las PGPR intervienen en el control de patógenos mediante la producción de
antibióticos, inducción de resistencia, activación de los mecanismos de defensa y
producción de sideróforos; compuestos con una alta afinidad por el hierro que son
elaborados por una gran variedad de microorganismos, principalmente por el
género Pseudomonas. Estos metabolitos suprimen a los patógenos de la rizosfera
del hierro, provocando una limitante en su crecimiento (Miranda y col.,1998).
Aunque las propuestas anteriores están basadas en evidencias experimentales,
son cuantitativamente insuficientes para soportar el hecho de que alguno de los
mecanismos sea por si solo el responsable de los cambios que se producen en el
crecimiento de las plantas. Bashan(1993) propone una “Hipótesis Aditiva” donde
probablemente más de un mecanismo participa en la asociación, ya sea
simultánea o en sucesión. La suma de sus actividades en la condición ambiental
específica resulta en los cambios observados en el crecimiento de las plantas.
Dentro del grupo de las PGPR se incluyen varios géneros bacterianos:
Arthrobacter, Bacillus, Enterobacter, Serratia (Kloepper y col., 1989), Azospirillum,
Pseudomonas y Azotobacter (Bashan, 1993)
Según Kilbertus y Schwartz (1984) la mayoría de las bacterias aerobias y
anaerobias facultativas se distribuyen en los siguientes géneros, de acuerdo a sus
características culturales y aspecto de su colonia.
GRAM +
I-Cocos
Micrococcus
Cohn
II-Bacilos esporulados
Bacillus
Cohn
II-Bacillus asporógenos
-Degrada celulosa
Cellulomonas Bergey y
col
-No degrada celulosa
Arthrobacter
Cohn
GRAM –
I-Bacterias sin motilidad
-Colonias no pigmentadas
a)Acumulación de gránulos de phb
Oxidasa +
Paracoccus
Davis
b)Sin acumulación de phb
Oxidasa -
Acinetobacter Brisou y
Prévot
-Colonias pigmentadas
Gelatina + y Almidón +
Flavobacterium Bergey y
col.
II-Bacterias con motilidad
-Colonias no pigmentadas
a)Flagelos polares
-Formación de hipertrofías en plantas
Agrobacterium
Cohn
-No formación de hipertofías en plantas
Pseudomonas
Migula
b) Flagelos peritricos
-Oxidasa *Formación de hipertrofías en plantas
Cohn
Agrobacterium
*No Formación de hipertrofías en plantas
Alcaligenes Castellani y
Chalmers
-Oxidasa +
*H2S +, Rojo de metilo + (37 0c)
Proteus
Haliser
*H2S -, Rojo de metilo - (37 0c)
-Voges Proskauer – (22 0c)
Hafnia
Høller
-Voges Proskauer + (22 0c)
Enterobacter Hochmaeche y
Edwards
-Colonias pigmentadas
a) Flagelo(s) polar(es)
*Pigmento violeta no fluorescente
Chromobacterium
Bergonzini
*Pigmento fluorescente
Pseudomonas
Migula
b)Flagelo peritrico
*Pigmento rojo
Serratia
Bizio
*Pigmento amarillo
Flavobacterium Bergey y
col.
1.7-MHB (Micorrhization Helper Bacteria)
El establecimiento de los hongos micorrizógenos en las raíces de los hospederos
es afectado o promovido por los microorganismos de la rizosfera, en especial por
las
bacterias.
A
estas bacterias capaces de
incrementar la
infección
micorrizógena se les conoce por MHB (Micorrhization Helper Bacteria)(Garbaye,
1994).
Mosse (1962), y Meyer y Linderman (1986) constataron que la infección
micorrizógena de plántulas de Trifolium subterraneum L. se favoreció con la
introducción de una especie del género Pseudomonas. La coinoculación
Micorriza-Azospirillum es un ejemplo de interacción benéfica, ya que la
colonización de las raíces por los hongos estimula el flujo de carbohidratos desde
el follaje hasta la raíz. Estos carbohidratos pueden constituir fuentes de carbono
para el crecimiento de la bacteria, por otra parte, se ha comprobado que las
hormonas vegetales que produce Azospirillum en medio de cultivo estimulan la
formación y desarrollo de la simbiosis micorrízógena en una gran gama de
hospederos (Coscaturca, (1995). Glandfor, (1994) demostró que la inoculación de
Pseudomonas fluorescens en tomate estimula la colonización micorrízica en la
raíz e incrementa significativamente la producción del cultivo. En 1996 Guerrero
planteó que la inoculación con Azotobacter sp y Azospirillum sp incrementa los
niveles de colonización micorrízica.
1.8-Género Swietenia. Sus especies e híbridos
El género Swietenia está constituido por tres especies: Swietenia mahagoni Jacq.,
oriunda de las Antillas Mayores, las Bahamas y el sur de la Florida. Swietenia
macrophylla King, cuya extensión abarca desde México hasta Bolivia y Swietenia
humilis Zucc, que se extiende por la costa del Pacífico desde México hasta Costa
Rica (Lamb, 1966).
Swietenia macrophyla x mahagoni constituye el híbrido más importante entre
estas especies y del que más reportes se han hecho. Surge como resultado de la
plantación de ambas especies en proximidad. Se destaca por presentar más
resistencia a los plaguicidas (Nobles and Briscoe, 1966), mayor calidad de
madera que S. macrophyla, mejor forma que S. mahagoni y crecimiento más
rápido que ambos progenitores (Lamb, 1966 y Geary y col., 1972). La
identificación de este híbrido se realiza por la medida intermedia del tamaño de la
hoja con relación a la de sus parentales.
El carácter micotrófico de la mayoría de los miembros de la familia Meliaceae en
conjunción con su marcado valor económico, debido a los crecientes precios de
su madera en el mercado internacional, conllevaron a la selección de Swietenia
macrophyla x mahagoni como planta indicadora de este trabajo.
2-MATERIALES Y METODOS
2.1-Influencia de Glomus mosseae-Bacillus subtilis y Glomus mosseaePseudomonas
fluorescens
sobre
los
indicadores
de
crecimiento
y
micorrización de Swietenia macrophyla x mahagoni
2.1.1-Preparación del suelo y las bolsas.
Este experimento se desarrolló en el Instituto de Investigaciones Forestales,
perteneciente al Ministerio de la Agricultura, en el laboratorio del área de
micorriza.
El suelo usado en este experimento, el cual se clasifica como Pardo con
Carbonato, se sometió a esterilización en autoclave durante 45 min. Una semana
después de la esterilización, para que desaparezca la toxicidad que surge en el
suelo, se procedió al llenado de las bolsas de polietileno (12 cm X 20 cm) con 800
g del suelo esterilizado.
2.1.2-Inoculación fúngica
La inoculación de Glomus mosseae se realizó por medio de la adición de 10 g de
suelo micorrizado con esta especie micorrizógena en las bolsas de polietileno.
Con lo que se establece una proporción de 1:10. En el caso de la variante no
inoculada se adiciona 10 g de suelo esteril.
2.1.3-Preparación del inóculo micorrizógeno
El suelo micorrizado con Glomus mossea se obtuvo según la técnica de
propagación de hongos micorrizógenois de Menge (1984), en un cantero de 106 x
52 x 30 cm de la siguiente manera:

Esterilización del suelo, la cual se realizó por adición de 150 ml de
formaldehido por m2 de suelo.

Adición de 20 esporas de Glomus mosseae en cada sitio de siembra de
Sorghum vulgare, especie que se selecciona como hospedero por poseer los
requerimientos planteados por Menge (1984):
- Micotrofía obligada
- Rápido crecimiento.
- Adaptación a las condiones climáticas del sitio experimental
- Capacidad de establecer simbiosis micorrizógena con un gran número de
este tipo de hongos.

A los 3 o 4 meses de edad del cultivo se procede a cortar y eliminar la parte
aerea de la planta, quedando el suelo con las raices infectadas con Glomus
mosseae, además de esporas y micelio externo de este mismo hongo.

Aproximadamente tres meses después del desmonte se comprobó la pureza
del inóculo obtenido, mediante aiislamiento e identificación de las esporas
presentes en el suelo.
2.1.4-Aislamiento de esporas de Glomus mosseae y examen de pureza del
inóculo
Las esporas de Glomus mosseae mencionadas anteriormente y el aislamiento de
esporas, que se realizó en el control de pureza del inóculo siguieron la técnica
desarrollada por Gerdemann y Nicolson en 1963
-
Tomar de 50 a 100 g de suelo y coloquelos en un beaker plástico de 1 L de
capacidad y agregar agua corriente
-
Agítar durante 15 min aproximadamente.
-
Verter sobre un tamiz de 100 µm. que permite la captura de las esporas del
hongo en cuestión.
-
Colocar en tubos de centrífuga de 30 ml el material contenido en el tamiz
con 5 ml de agua destilada esteril, aproximadamente.
-
Inyectar con una jeringuilla de 50 ml, alrededor de 20 ml de una solución de
sacarosa de 2 M con Tween 80 al 2% de manera que esta quede por
debajo de del material suspendido en agua, cuidando no romper interfase
agua-sacarosa
-
Centrifugar a 2000 rpm durante 10 min.
-
Con ayuda de una jeringuilla de 20 ml, recorra la superficie de la interfase y
un poco por debajo y por arriba, para capturar las esporas que atravesaron
y no atravesaron la interfase.
-
Verter el conrenido de la jeringuilla sobre el tamiz de 45 µm y lavar con
agua corriente lo más pronto posible para eliminar la sacrosa. que puede
plamolisar las esporas.
-
Recoger el contenido del tamiz en una placa petri y con ayuda del
estereomicroscopio aisle las esporas que encuentre en una placa de
porcelana excavada de 9 o más plazas.
-
Separar tantos tipos de esporas como sea posible, colocándolos en las
diferentes plazas de la placa de porcelana. Las esporas se toman con
pinzas muy finas o capilares
2.1.5- Inoculación bacteriana
La inoculación de Bacillus subtilis y Pseudomonas fluorescens se realizó al mismo
tiempo que la inoculación fúngica mediante la aplicación de 1 ml de una solución
que contenía 108 ufc/ml. En el caso de las variantes no inoculadas con bacterias
se adicionó 1 ml de agua destilada esteril.
2.1.6-Preparación del inóculo bacteriano
Las especies bacterianas que se aplicaron en el experimento, Bacillus subtilis y
Pseudomonas fluorescens, se obtuvieron del Cepario de la Facultad de Biología,
Universidad de la Habana. Dichas bacterias se sembraron en medio TSB 3%
(Caldo Soya Triptona) y se incubaron a 37 0C por espacio de 48 h. A partir de
este medio de cultivo se obtuvo una solución en agua destilada esteril de cada
una de dichas bacterias con una concentración de 10 8 ufc/ml.
2.1.7-Siembra de Swietenia macrophylla x mahagoni
En cada bolsa se sembraron dos semillas de Swietenia macrophylla x mahagoni,
procedencia Atabey, lo cual garantiza al menos una plántula por bolsa. En las
bolsas donde se obtuvieron dos plántulas se eliminó la de menor desarrollo.
2.1.8-Condiciones experimentales y medición de los indicadores de
crecimiento y micotrofía
Este experimento se mantuvo a una temperatura aproximada de 280c, riego diario
y un regimen de luz de 9 h diarias. Al concluir el primer y segundo mes de edad
de las plántulas se evaluaron los indicadores de crecimiento y micotrofía de
dichas plántulas:
Altura (cm).
Se midió desde el suelo hasta el borde apical de la plántula con ayuda de una
regla de 40 cm.
PSF: Peso seco foliar (g).
PSR: Peso seco radical (g).
Tanto el PSF como el PSR resultaron de pesar en una balanza técnica las
muestras aereas y radicales de la planta, respectivamente, luego de que las
mismas estuvieran en la estufa a 800 c durante 3 días.
Diámetro (cm).
Utilizando un pie de Rey se midió el diámetro de la plántula a nivel del terreno.
Infección micorrizógena (%).
La determinación de este indicador micotrófico consta de: la tinción de las raíces
infectadas con el hongo micorrizógeno y la cuantificación de la infección
micorrizógena.La tinción se efectuó de acuerdo al método creado por Phillips and
Hayman en 1970, cuyo basamento es la tinción de las hifas y estructuras del
hongo dentro de las raíces micorrizadas. El procedimiento consiste primeramente
en:
- Obtención de raicillas (diámetro menor de 2mm) y lavarlas cuidadosamente.
- Introducirlas en un vial con KOH al 10% a una temperatura de 90 0c, por
espacio de 30 a 60 min. Este paso produce la decoloración de las raíces,
- Decantar el KOH y lavar las raíces con agua corriente.
- Cubrir las raíces con peróxido de hidrógeno durante 20 min. Este paso se
obvia cuando las raíces se decoloran en el primer paso.
- Decantar el peóxido y lavar las raíces con agua corriente.
- Cubrir las raíces con HCl 10% durante 15 min. para permitir la entrada del
colorante a las estructuras fúngicas.
- Decantar el HCl sin lavar las raíces.
- Cubrir las raíces con una solución de Azul de Tripán 0.5% en lactoglicerina
(ácido láctico+glicerol+agua) en proporción 1+1+1 durante 3 días
- Decantar solución de Azul de Tripán, con el fin de eliminar el exceso de
colorante.
Posterior a la tinción de las raíces se procede a la cuantificación de la infección
micorrizógena, siguiendo la técnica creada por Giovannetti y Mosse en 1980:
- Disgregar las raíces con unos ml de agua sobre una placa petri cuadriculada
de cuadrículas de 1.27 cm
- Usando un estereomicroscopio se cuentan las raíces teñidas (micorrizadas)
y las que no lo están (no micorrizadas) que están sobre los lados de
las
cuadrículas
- Repetir el paso anterior al menos 4 veces, pero moviendo las raíces sobre la
placa petri.
- Promediar los valores obtenidos en las 4 repeticiones
-Verificar presencia de arbúsculos o vesículas, que son la evidencia de
existencia de micorriza.
- Calcular infección micorrizógena mediante la fórmula: IM= (No. de raíces
micorrizadas/ total de raíces) X 100.
Longitud de las raíces micorrizadas.
Se mide teniendo en cuenta lo establecido por Marsh (1971), cuando la cuadrícula
es de 1.27 cm la longitud de las raíces micorrizadas, en metros, coincide con el
número de intersecciones de las raíces micorrizadas.
Respuesta a la micorriza.
Se obtiene mediante la fórmula R= (M – NM)/ NM desarrollada por Plenchette y
col (1983), donde R es la respuesta a la micorriza, M es el PSF de las plantas
micorrizadas y NM es el PSF de las plantas no micorrizadas.
Cuantificación indirecta del micelio externo
Este indicador se determina a través de la agregación del suelo a la raíz por el
método de Graham y col (1982). El cual se basa en en la proporción que existe
entre el micelio externo y el suelo adherido a las raíces.
Esta técnica se efectúa de la siguiente manera:
- Tomar las raíces de la planta y someterlas a secado al aire.
- Mover vigorosamente las raíces para remover el suelo que no está
firmemente unido a las raíces.
- Sumergir las raíces en recipiente con agua y esperar a que el suelo se
asiente en el fondo del recipiente
- Decantar el agua y separar el suelo precipitado que se encontraba adherido a
las raíces.
- Secar el suelo precipitado
- Determinar el peso seco de las raíces y del suelo adherido a las raíces
- Expresar el resultado como cantidad de suelo por gramo seco de raíz.
2.1.9-Diseño experimental
El diseño experimental aplicado corresponde a un completamente aleatorizado. El
cual está formado por 6 tratamientos, 4 réplicas por tratamiento y 25 plántulas por
réplica. Los tratamientos ensayados consistieron en la interacción de los
siguientes factores:
Factor 1
- Inoculación de Glomus mosseae
- Sin inoculación de Glomus mosseae
Factor 2 - Bacillus subtilis
- Pseudomonas fluorescens
- Sin bacteria
Los resultados obtenidos de los indicadores de crecimiento y micotrofía, tomando
15 plántulas por réplica en cada tratamiento, fueron sometidos a un ANOVA y un
Test de Rangos Múltiples de Duncan (5%) para la comparación de medias, los
cuales
se
realizaron
utilizando
el
procesador
estadístico
automatizado
STATGRAPGHIC PLUS 3.
2.2-Influencia de Bacillus subtilis y Pseudomonas fluorescens sobre la
efectividad de Glomus mosseae en los indicadores de crecimiento de
Swietenia macrophyla x mahagoni
2.2.1-Tratamientos e indicadores de crecimiento
Para esta experiencia se tomaron los resultados obtenidos en el experimento
anterior para los indicadores de crecimiento:
Altura (cm).
Peso seco foliar (g)
Peso seco radical (g).
Diámetro (cm).
2.2.2-Clasificación de la efectividad del inóculo.
Al concluir el segundo mes de edad en los tratamientos:
Glomus mosseae
Glomus mosseae + Bacillus subtilis
Glomus mosseae + Pseudomonas fluorescens
Testigo
A diferencia del experimento anterior en esta experiencia se usa el LSD (1%)
como Test de Comparación de Medias, lo cual permite la clasificación de la
efectividad del inóculo de acuerdo a Smith y Gianinazzi-Pearson (1988) en:
No efectivo: Cuando el hongo micorrizógeno no produce diferencia significativa
en comparación con el testigo.
Ligeramente efectivo: Cuando el hongo micorrizógeno produce niveles
superiores significativamente al alcanzado por el testigo, pero menores que el
promedio del experimento.
Moderadamente efectivo: Cuando el hongo micorrizógeno produce niveles
iguales o mayores, pero no significativamente mayor que el promedio del
experimento,
Altamente efectivo: Cuando el hongo produce niveles significativamente
superiores que el promedio del experimento
2.3-Influencia de Bacillus subtilis y Pseudomonas fluorescens sobre la fase
de la infección micorrizógena de Swietenia macrophyla x mahagoni con
Glomus mosseae.
2.3.1-Tratamientos y construcción de la curva de infección micorrizógena vs
días.
Esta experiencia se le aplicó a los tratamientos:
Glomus mosseae
Glomus mosseae + Bacillus subtilis
Glomus mosseae + Pseudomonas fluorescens
Al inicio del experimento y al finalizar los: 15, 30, 45 y 60 días se midió la infección
micorrizógena de cada tratamiento, tomando 5 plántulas por replica en cada
tratamiento, para más tarde construir una curva de Infección micorrizógena de
Glomus mosseae vs días y delimitar todas las fases de infección micorrizógena
establecidas por Bowen (1987).
3-RESULTADOS Y DISCUSION
3.1-Influencia de Glomus mosseae-Bacillus subtilis y Glomus mosseaePseudomonas
fluorescens
sobre
los
indicadores
de
crecimiento
y
micotrofía de Swietenia macrophyla x mahagoni durante los 2 meses de
edad.
3.1.1-Altura
Tabla 1: Incidencia de los factores y sus interacciones sobre la altura de plántulas
de Swietenia macrophyla x mahagoni en los meses analizados
Fuente de Variación
Factor 1
Factor 2
Promedio
Promedio
(cm)
(cm)
mes 1
mes 2
Con G. mosseae
20.7 a
23.6 a
Sin G. mosseae
16.8 a
17.7 b
B. subtilis
21.2 a
23.0 a
P. fluorescens
20.7 a
23.5 a
Sin Bacteria
14.2 b
15.5 b
G. mosseae x B. subtilis
22.0 ab
25.2 a
G. mosseae x P. fluorescens
23.1 a
27.1 a
17.0 b
18.5 b
Sin G. mosseae x B. subtilis
20.3 ab
20.7 b
Sin G. mosseae x P. fluorescens
18.7 ab
19.8 b
11.3 c
12.5 c
Factor 1x2 G. mosseae x sin Bacteria
Sin G. mosseae x sin Bacteria
Letras diferentes en la misma columna representan diferencia significativa para
Duncan (5%).
Como muestra la tabla 1, el factor 1 tiene incidencia significativa sobre la altura a
partir de los 2 meses de edad de las plántulas. Esto significa que los beneficios de
esta simbiosis no se reflejan en la altura hasta transcurrir 2 meses, donde las
plántulas
inoculadas
con
G.
mosseae
poseen
un
valor
de
altura
significativamente mayor que aquellas plántulas sin inoculación fúngica. Este
comportamiento coincide con los obtenidos por Linderman (1996) y Jones y
col.(1998) al aplicar Glomus intraradices y Glomus mosseae sobre Allium spp y
Eucalyptus coccifera, respectivamente.
Debido a que este indicador de crecimiento no es muy sensible en vivero a la
acción de los hongos micorrizógenos, resulta relevante el hecho de que este
hongo produzca un efecto significativo en este indicador de crecimiento en tan
corto período de tiempo. Esto podría deberse a la obtención de fósforo
(Merryweather y Fitter, 1996 y Alkaraki y Clark, 1998) y a la producción fúngica de
auxinas (Sieverding, 1991), los cuales entre otras funciones están relacionados
con el crecimiento de la planta
La tabla muestra una incidencia significativa del factor 2 sobre la altura en el
primer y segundo mes
Lo cual nos permite clasificarlas como PGPR. La
producción de auxina y el incremento de la disponibilidad de fósforo (Lazarovits y
Nowak, 1997), producto de la solubilización y mineralización característica de
estos géneros
podrían ser las causas de que la adición bacteriana a estas
plántulas supere en cada caso, significativamente, a la no aplicación de las
mismas desde el primer mes, avalando la utilización de estas bacterias en la fase
de vivero. De forma similar Nowak y col., (1995) potenciaron el crecimiento de
Solanum tuberosum con bacterias de estos géneros.
En los dos meses medidos, la interacción entre el factor 1 y el 2 incide de forma
significativa en la altura (tabla 1), lo que demuestra que estos factores no son
independientes. En el primer y segundo mes todas las variantes de inoculación de
microorganismos superan al testigo absoluto, aunque en el primer mes no existe
diferencia significativa entre ellas. A diferencia de lo que ocurre en el primero, en
el
segundo
mes
las
inoculaciones
dual
hongo-bacteria
se
ubican,
estadísticamente, en la cima del resto de las interacciones. Estos resultados
coinciden con los obtenidos por Meyer y Linderman (1986), Oliveira y col., 1987 y
Linderman, 1996 al aplicar un hongo formador de micorriza-Pseudomonas putida
sobre Trifolium subterraneum, Glomus manihotis-Pseudomonas putida a Manihot
sculenta Crantz y Glomus intraradices-bacteria a Allium spp, respectivamente.
El efecto sinérgico de este hongo formador de micorriza y estas bacterias, en el
segundo mes podría ser explicado por la producción combinada de auxinas por
parte de estos microorganismos .
Tabla 2: Incidencia de los factores y sus interacciones sobre el peso seco foliar de
plántulas de Swietenia macrophyla x mahagoni en los meses analizados
Factor 1
Factor 2
Promedio
Promedio
(g)
(g)
mes 1
mes 2
Con G. mosseae
1.39 a
1.55 a
Sin G. mosseae
1.23 a
1.34 a
B. subtilis
1.55 a
1.70 a
P. fluorescens
1.48 ab
1.64 a
Sin Bacteria
0.90 b
1.00 b
1.64 a
1.80 a
1.51 ab
1.74 a
1.01 bc
1.10 bc
1.46 ab
1.60 ab
1.45 ab
1.53 ab
0.78 c
0.90 c
Duncan (5%).
El factor 1 no presenta influencia significativa sobre el peso seco foliar (tabla 2) en
ninguno de los meses analizados; por el contrario, el factor 2 sí incide
significativamente sobre este indicador en ambos meses. En el primer mes solo la
inoculación de Bacillus subtilis alcanzó valores significativamente mayores que los
conseguidos sin inoculación bacteriana. Sin embargo, en el segundo mes la
adición de cada una de estas bacterias supera significativamente a la ausencia de
inoculación bacteriana.
Lo citado anteriormente refleja la factibilidad del uso de estas bacterias para
incrementar significativamente este indicador de crecimiento en estas plántulas,
incluso desde el primer mes sí se inocula Bacillus subtilis. El comportamiento que
se obtiene con estas bacterias podría ser la respuesta a un mayor crecimiento de
estas plántulas bajo la acción de estos microorganismos y al aumento de la
absorción de nitrógeno y otros microelementos por parte de la planta como efecto
indirecto de una mayor absorción de fósforo (Sieverding, 1991).
La influencia significativa en ambos meses de la interacción de los factores 1 y 2
sobre el peso seco foliar muestra la dependencia entre estos factores e indica que
los valores de cada una de las combinaciones hongo-bacteria se sitúan,
significativamente, en la cima del resto de las interacciones. Esta posición cimera
podría ser el resultado de una mayor absorción fúngica de nutientes como el
fósforo y el nitrógeno (George y col.,1994, y Santhanakrishnan y Anandan, 1996),
los cuales están muy ligados al desarrollo de la planta al aumentar la
disponibilidad de fósforo en la solución del suelo producto de la mineralización y la
solubilización de este nutriente por parte de estas bacterias, las que superan
significativamente al control absoluto, además de ubicarse estadísticamente en el
mismo nivel que la inoculación dual. Todos estos resultados coinciden con los
obtenidos con Meyer y Linderman (1986), y Santhanakrishnan y Anandan (1996)
con Trifolium subterraneum y Azadiracha indica, respectivamente.
Análogo a lo que ocurre con el peso seco foliar, el factor 1 no produce efecto
significativo sobre la biomasa seca radical en ninguno de los meses estudiados
(tabla 3); solo el factor 2 incide significativamente sobre este indicador de
crecimiento en los dos meses. Siendo la inoculación de Bacillus subtilis, tanto en
el primero como en el segundo mes, la única que sobrepasa significativamente a
su versión no inoculada (tabla 3),.
Tabla 3: Incidencia de los factores y sus interacciones sobre el peso seco radical
de plántulas de Swietenia macrophyla x mahagoni en los meses analizados
Factor 1
Factor 2
Promedio
Promedio
(g)
(g)
mes 1
mes 2
Con G. mosseae
0.23 a
0.26 ab
Sin G. mosseae
0.17 a
0.21 a
B. subtilis
0.24 a
0.28 a
P. fluorescens
0.22 ab
0.25 ab
Sin Bacteria
0.16 b
0.19 b
0.26 a
0.30 a
0.24 ab
0.26 ab
0.20 ab
0.23 b
0.22 ab
0.25 b
0.19 b
0.23 b
0.11 c
0.14 c
Duncan (5%)..
En los dos meses estudiados la interacción de estos factores también actúa
significativamente sobre este indicador de crecimiento (tabla 3), lo que resulta
similar a lo mostrado por Meyer y Linderman (1986) y Palenzuela y col., (1996) en
Trifolium subterraneum y Medicago sativa, respectivamente. Las plántulas
inoculadas con Glomus mosseae y/o bacterias sobrepasan, estadísticamente, al
control absoluto. Además de que la combinación hongo-bacteria, donde se
involucra a Bacillus subtilis alcanza, significativamente el más alto nivel para este
indicador en estos meses (tabla 3), esto podría ser causado por la producción
conjunta de fitohormonas por parte de estos microorganismos (Manske, 1996).
3.1.4-Diámetro
Contrario a lo acontecido con el indicador de crecimiento anterior, solo el factor 1
tiene influencia significativa sobre el diámetro de las plántulas en ambos meses.
El aumento significativo logrado con la inoculación de Glomus mosseae con
respecto a su variante no inoculada puede estar relacionado con la obtención de
nitrógeno (Hurtado y Sieverding, 1986).
Tabla 4: Incidencia de los factores y sus interacciones sobre el diámetro de
plántulas de Swietenia macrophyla x mahagoni en los meses analizados
Factor 1
Factor 2
Promedio
Promedio
(cm)
(cm)
mes 1
mes 2
Con G. mosseae
0.57 a
0.63 a
Sin G. mosseae
0.44 b
0.48 b
B. subtilis
0.53 a
0.57 a
P. fluorescens
0.53 a
0.59 a
Sin Bacteria
0.47 a
0.52 a
0.61 a
0.65 a
0.58 ab
0.68 a
0.51 bc
0.56 b
0.44 cd
0.48 c
0.47 cd
0.50 bc
0.42 d
0.47 c
Duncan (5%).
Como consecuencia de la influencia significativa de la interacción de los factores
1 y 2, la inoculación fungica simple y sus combinaciones con las bacterias
exceden, desde el punto de vista estadístico, al testigo absoluto en los dos meses
analizados. Incluso hasta las simples inoculaciones bacterianas se encuentran en
un nivel significativamente inferior con relación a las combinaciones hongobacteria en ambos meses.
3.1.5-Infección micorrizógena
La tabla 5 nuestra como en los dos meses a diferencia del factor 2, el cual no
tiene incidencia significativa sobre la infección micorrizógena; el factor 1 incide de
manera significativa sobre este indicador micotrófico, lo cual reafirma a este tipo
de hongo como único responsable de esta simbiosis.
Cono resultado de la interacción significativa de estos factores sobre la infección
micorrizógena (tabla 5). En ambos meses las inoculaciones fúngicas representan
un nivel más elevado significativamente que sus versiones no inoculadas. En el
primer mes las inoculaciones hongo-bacteria superan significativamente a todas
las interacciones, incluyendo a la inoculación simple de Glomus mosseae, lo que
se traduce en un efecto estimulador de la infección micorrizógena por parte de
estas bacterias, de ahí que podamos clasificarlas como MHB.
Tabla 5: Incidencia de los factores y sus interacciones sobre la infección
micorrizógena de plántulas de Swietenia macrophyla x mahagoni en los meses
analizados
Factor 1
Factor 2
Promedio
Promedio
(%)
(%)
mes 1
mes 2
Con G. mosseae
72.3 a
100 a
Sin G. mosseae
0b
0b
B. subtilis
40.1 a
50 a
P. fluorescens
38.2 a
50 a
Sin Bacteria
30.2 a
50 a
80.2 a
100 a
76.4 a
100 a
60.4 b
100 a
0b
0b
0b
0b
0b
0b
Duncan (5%).
El incremento en la infección micorrizógena puede resultar de uno o más de los
siguientes efectos (Garbaye, 1994):
Efecto de MHB en el reconocimiento hongo-raíz: En este mecanismo la
bacteria interfiere en el reconocimiento hongo-planta, el cual constituye el
primer paso de esta simbiosis, el cual se encuentra mediado por compuestos
fenólicos, enzimas, fibrillas de naturaleza glicoproteica o polisacarida y
fitohormonas (Anderson, 1988). La MHB puede intervenir entre los simbiontes
mediante la transformación de las sustancias mediadoras o contribución a la
producción de compuestos claves en la micorriza, tales como auxinas y
enzimas líticas. La unón de la bacteria al hongo o la planta, o a ambos puede
modificar las propiedades de la pared celular y facilitar el establecimiento de la
simbiosis a través de un puente químico (Duponnois, 1992)
Efecto de la MHB sobre la receptividad de las raíces: De acuerdo a este
mecanismo, la bacteria prolifera en la rizosfera y promueve el desarrollo de las
raíces antes que el hongo se ponga en contacto con el hospedero. De esta
forma la planta desarrolla más raíces cortas en el mismo volumen de suelo,
por lo que la probabilidad de ponerse en contacto hongo y raíz aumenta. Este
mecanismo se sustenta en la frecuente producción de ácido indol acético por
parte de muchas rizobacterias. Como otra forma de aumentar la receptividad
de las raíces se ha planteado que las MHBs pudieran hacer menos rígidas las
paredes celulares entre las células de la corteza de las raíces y favorecer la
penetración del hongo (Duponnis, 1992).
Efecto de MHB sobre el crecimiento fúngico: Este mecanismo se basa en la
estimulación bacteriana del crecimiento del hongo en el estado presimbiótico.
Dentro de este modo de acción se encuentran la producción de metabolitos
que son usados directamente por el hongo, potenciando su anabolismo.
Dentro de estos metabolitos resaltan los ácidos orgánicos, predominantemente
ácido málico y cítrico, los cuales representan una fuente de carbono tan
importante como la glucosa para el crecimiento fúngico. La detoxificación del
medio donde crece el hongo también se encuentra dentro de este mecanismo
de acción de MHB, cuyo basamento consiste en retardar por parte de la
bacteria el fenómeno de autotoxificación de la rizosfera por parte del hongo
(Garbaye, 1994).
Efecto de MHB sobre la germinación de propágulos fúngicos: En este
mecanismo se centra la atención en la capacidad bacteriana de acelerar la
germinación de las esporas. Aunque se desconocen los compuestos
involucrados, la adición de rizobacterias
ha potenciado la germinación de
clamidiosporas de Glomus mosseae (Azcon, 1987 y Mosse, 1962) y Glomus
versiforme (Mayo, Davis and Motta, 1986 y Linderman and Paulitz, 1990).
El comportamiento observado en el primer mes se modifica en el segundo, ya que
todas las inoculaciones que involucran a Glomus mosseae llegan al máximo nivel
de infección micorrizógena y por ende no se apreciar diferencia significativa entre
estas inoculaciones, mostrándose únicamente diferencia significativa entre las
inoculaciones que involucran a Glomus mosseae y las que no. Todo esto se
asemeja a lo exhibido en trabajos anteriores (Rovira, 1965, Meyer y Linderman,
1986 Manske y col., 1996 y Palenzuela, Toro y Barea, 1996).
3.1.6-Micelio externo
En la tabla 6 se puede observar como ambos factores, en los dos meses, inciden
significativamente sobre este indicador, resaltando el aumento significativo de la
inoculación fúngica y la inoculación bacteriana, con respecto a sus respectivas
contrapartes. Todo esto indica el papel que juegan bacterias y hongos en la
agregación del suelo (Andrade,1998).
La tabla expone la incidencia significativa de la interacción de los factores 1 y 2
sobre la agregación del suelo, lo que trae consigo dos hechos relevanteses: el
primero se refiere a la ubicación de las combinaciones hongo-bacteria en el nivel
más alto, desde el punto de vista estadístico cn relación al resto de las
interacciones (Andrade, 1998), y la posición secundaria, estadíticamente, que
ocupa la inoculación simple de Glomus mosseae al superar a las inoculaciones
bacterianas y al control absoluto. Concordando con lo obtenido por Andrade
(1998) con Sorghum bicolor al estudiar el efecto de Glomus mosseae y
rizobacterias sobre este mismo indicador de micotrofía.
Tabla 6: Incidencia de los factores y sus interacciones sobre el suelo adherido a la
raíz en plántulas de Swietenia macrophyla x mahagoni en los meses analizados
Factor 1
Factor 2
Promedio
Promedio
g suelo/g raíz
g suelo/g raíz
mes 1
mes 2
Con G. mosseae
2.2 a
2.5 a
Sin G. mosseae
0.3 b
0.4 b
B. subtilis
1.5 a
1.6 a
P. fluorescens
1.6 a
1.9 a
Sin Bacteria
0.8 b
1.0 b
2.5 a
2.8 a
2.9 a
3.2 a
1.2 b
1.5 b
0.4 c
0.4 c
0.3 c
0.3 c
0.3 c
0.4 c
Duncan (5%).
De lo planteado anteriormente se puede afirmar que estas bacterias desempeñan
un importante papel en el desarrollo del micelio externo, que es la estructura que
se encarga de agregar las partículas del suelo, ya que comparativamente la
agregación del suelo por parte de las bacterias es menos eficiente que la fúngica
(Harris y col., 1966, Tisdall y Oades, 1982 y Thomas, 1993), debido a que las
hifas de los hongos micorrizógenos penetran en el suelo hasta distancias de 90
mm más alla de las raíces del hospedero (Camel y col., 1991)
La acción bacteriana en la estimulación de la agregación del suelo pudo ser
directa e/o indirecta. De forma directa porque las bacterias contribuyen a la
agregación del suelo e indirecta porque la bacteria puede estimular la exudación
en la planta de compuestos que acrecentan el desarrollo del micelio fúngico
(Paula, 1989).
3.1.7-Respuesta a la Micorriza
Tanto en el primero como en el segundo mes, los factores 1 y 2 generan
diferencia significativa en la respuesta de la planta a la micorriza (tabla 7).
Obteniéndose en cada factor que las variantes inoculadas generan valores de
respuesta de la planta a la micorriza, estadísticamente, superiores en
comparación con sus respectivas variantes no inoculadas, de ahí la relevancia de
la aplicación de estos microorganismos a la planta.
Del efecto significativo de la interacción de estos factores sobre este indicador,
puesto de manifiesto en los meses 1 y 2 (tabla 7) se deriva la necesidad de
aplicar
Glomus
mosseae
a
estas
plántulas,
tratamiento
que
supera
significativamente al resto de los tratamientos analizados; con excepción de los
tratamientos que involucran a ambos microorganismos, quienes se alzan con las
respuestas a la micorriza más altas desde el punto de vista estadístico, llegando
en el caso de Glomus mosseae-Bacillus subtilis a niveles superiores al 100 %.
La fórmula de la respuesta de la planta a la micorriza, constituye una forma de
expresar en base al peso seco foliar de la planta cuando no está micorrizada del
exceso que se obtiene en este parámetro en plantas micorrizadas; por lo que este
incremento en la respuesta de la planta a la micorriza, en inoculaciones hongobacteria parece ser la consecuencia del aumento en los niveles de peso seco
foliar cuando se inoculan a ambos microorganismos.
Tabla 7: Incidencia de los factores y sus interacciones sobre la respuesta a la
micorriza en de plántulas de Swietenia macrophyla x mahagoni los meses
analizados
Factor 1
Factor 2
Promedio
Promedio
(%)
(%)
mes 1
mes 2
Con G. mosseae
78 a
72 a
Sin G. mosseae
0b
0b
B. subtilis
55 a
50 a
P. fluorescens
47 a
47 a
Sin Bacteria
15 b
11 b
110 a
100 a
94 a
93 a
29 b
22 b
0c
0c
0c
0c
0c
0c
Duncan (5%).
3.1.8-Longitud de las raíces micorrizadas
En la tabla 8 se constata la acción significativa que tiene el factor 1 sobre la
longitud de las raíces micorrizadas en los dos meses analizados, lo que se
corresponde con la necesidad de la aplicación de este hongo formador de
micorriza para elevar los valores de este indicador desde el punto de vista
estadístico. A diferencia del factor 1, el factor 2 no logra actuar de forma
significativa sobre dicho indicador.
Tabla 8: Incidencia de los factores y sus interacciones sobre la longitud de las
raíces micorrizadas de plántulas de Swietenia macrophyla x mahagoni en los
meses analizados
Factor 1
Factor 2
Promedio
Promedio
(m)
(m)
mes 1
mes 2
Con G. mosseae
0.9 a
1.3 a
Sin G. mosseae
0b
0b
B. subtilis
0.5 a
0.7 a
P. fluorescens
0.6 a
0.8 a
Sin Bacteria
0.4 a
0.5 a
1.0 a
1.5 a
1.1 a
1.4 a
0.7 b
0.9 b
0c
0c
0c
0c
0c
0c
Duncan (5%).
Como resultado de la incidencia significativa de la interacción de estos factores
(tabla 8) se obtuvo en ambos meses diferencia significativa entre las formas de
inoculacion dual y la simple de Glomus mosseae, a favor de las primeras y a su
vez ambas inoculaciones superan significativamente al testigo absoluto, quien
también fue superado por la inoculación simple de Glomus mosseae. Similares
resultados fueron obtenidos por Palenzuela y col., (1996) al adicionar Glomus
deserticola-Enterobacter sp a Medicago sativa.
Adquiere gran significación la incidencia significativa de la interacción de estos
factores (tabla 8), ya que demuestra el papel que juegan estas bacterias en el
proceso de establecimiento de esta simbiosis. El incremento en longitud de las
raíces micorrizadas en presencia de estas bacterias podría ser el resultado de
una mayor producción de raíces por parte de la planta, debido a la producción
bacteriana de auxina, trayendo consigo mayor receptividad de la planta al
establecimiento de la simbiosis (Duponnois, 1992 y Garbaye,1994).
3.2-Influencia de Bacillus subtilis y Pseudomonas fluorescens sobre la
efectividad de Glomus mosseae en los indicadores de crecimiento de
Swietenia macrophyla x mahagoni a los 2 meses de edad.
3.2.1-Altura
Tabla 9:Efectividad sobre la altura de Swietenia macrophyla x mahagoni a los 2
meses de edad.
Tratamientos
Altura (cm)
Efectividad
Glomus+Bacillus subtilis
25.2 a
Moderada
Glomus +Pseudomonas fluorescens
27.1 a
Moderada
Glomus mosseae
18.5 bc
Ninguna
Testigo
12.5 c
Promedio
20.8 ab
LSD(1%).
La tabla 9 exhibe los resultados de la prueba de efectividad en estado no
competitivo, es decir, suelo estéril. Como se puede apreciar la inoculación con
Glomus mosseae no genera diferencia significativa en la altura con respecto al
testigo de absoluto, de ahí su clasificación como no efectivo. Esta clasificación lo
invalidaría para su uso como inóculo micorrizógeno en un estado competitivo
(Sieverding, 1991). Sin embargo las combinaciones de este hongo con cada una
de estas bacterias, logran convertirlo en moderadamente efectivo para este
indicador de crecimiento, por lo que su clasificación de efectividad bajo estas
condiciones le permite su utilización en condiciones competitivas (Sieverding,
1991).
Este resultado coincide con el obtenido por Sieverding (1991) con Pueraria
phaseoloides al aplicar la combinación Entrophospora colombiana-Rhizobium.
Tabla 10: Efectividad sobre el peso seco foliar de Swietenia macrophyla x
mahagoni a los 2 meses de edad.
Tratamientos
PSF (g)
Efectividad
1.80 a
Moderada
1.74 a
Moderada
Glomus mosseae
1.10 b
Ninguna
Testigo
0.90 b
Promedio
1.39 ab
LSD(1%).
La tabla 10 refleja el mismo comportamiento presentado por la altura. La
inoculación exclusiva del hongo es incapaz de sobrepasar, estadísticamente, los
niveles de biomasa seca foliar del testigo absoluto. Esta inefectividad mostrada
por este hongo se convierte en efectividad moderada cuando se aplica cualquiera
de las interacciones hongo-bacteria, lo que coincide con lo obtenido con
Sieverding (1991) con Pueraria phaseoloides al aplicar la combinación
Entrophospora colombiana-Rhizobium.
Al igual que en la altura, estas bacterias garantizan la utilización de este hongo en
pruebas de efectividad en estado competitivo, lo que implica su posible selección
como inóculo para la formación de biofertilizante.
La tabla 11 muestra la efectividad moderada que generan la inoculación simple de
Glomus mosseae y cada una de sus interacciones con Bacillus subtilis y
Pseudomonas fluorescens, al acrecentar significativamente al testigo absoluto e
igualar y superar al promedio del experimento, respectivamente. Esto coincide
con lo obtenido por Sieverding (1991) con Pueraria phaseoloides al combinar
Glomus fasciculatum-Rhizobium.
Tabla 11: Efectividad sobre el peso seco radical de Swietenia macrophyla x
mahagoni a los 2 meses de edad.
Tratamientos
P S R (g)
Efectividad
0.30 a
Moderada
0.26 a
Moderada
Glomus mosseae
0.23 a
Moderada
Testigo
0.14 b
Promedio
0.23 a
LSD (1%).
No obstante a lo planteado anteriormente, cabe destacar que las interacciones
hongo-bacteria; además de mantener la categoría de moderada son las únicas
que exceden al promedio del experimento, lo que las hace más promisorias de
conseguir mejores resultados en el estado competitivo.
3.2.4-Diámetro
En la tabla 12 se exponen las categorías efectivas dentro de las que se
encuentran ambos tipos de inoculación después de realizar una prueba de
efectividad en estado no competitivo. Como exhibe dicha tabla la inoculación
exclusiva de este hongo se ubica dentro de la efectividad ligera, al encontrase
estadísticamente por encima del testigo absoluto y numéricamente por debajo del
promedio del experimento.
La
clasificación
alcanzada por Glomus mosseae, al igual que en los casos
anteriores no le permite su utilización en estado competitivo. Sin embargo su
interacción con Bacillus subtilis y Pseudomonas fluorescens eleva esta
clasificación a moderada y altamente efectivo, respectivamente. Estoe resultado
resulta similar al reportado por Sieverding (1991) con Pueraria phaseoloides al
combinar
Gigaspora
margarita-Rhizobium y
Glomus
manihotis-Rhizobium,
respectivamente.
Tabla 12: Efectividad sobre el diámetro de Swietenia macrophyla x mahagoni a
los 2 meses de edad.
Tratamientos
D(cm)
Efectividad
0.65 ab
Moderada
Glomus+Pseudomonas fluorescens
0.68 a
Alta
Glomus mosseae
0.56 c
Ligera
Testigo
0.47 d
Promedio
0.59 bc
LSD(1%).
Las dos clasificaciones conseguidas con las interacciones hongo-bacteria, no solo
permite su aplicación en estado competitivo, sino que en el caso de Glomus
mosseae-Pseudomonas fluorescens al clasificarse como altamente efectivo se
convierte automáticamente en un inóculo micorrizógeno de uso en condiciones
competitivas.(Buckkhardt y Howeler, 1985)
3.3-Influencia de Bacillus subtilis y Pseudomonas fluorescens aobre las
fases de la infección micorrizógena de Glomus mosseae sobre Swietenia
macrophyla x mahagoni
En la figura 1 se puede apreciar como la fase inicial en las combinaciones hongobacteria y en la inoculación simple fúngica comienza aproximadamente a los 10
días, de lo que se infiere que estas bacterias no influyen en la infectividad de los
propágulos micorrizógenos. Sin embargo,
la fase exponencial, que se
corresponde con un crecimiento fúngico más rápido que el de las raíces y un
aumento de la infección micorrizógena de las inoculaciones hongo-bacteria,
resulta ser más corta que en la de la inoculación simple. Esto indica la influencia
bacteriana sobre esta fase, lo cual podría deberse a un mayor desarrollo del
micelio fúngico, de manera tal que se coloniza más rápido el sistema radical. Este
desarrollo micelial fue mostrado con anterioridad en el desarrollo del micelio
externo. Este incremento en la infección micorrizógena fue encontrado por Meyer
y Linderman (1986) con Trifolium subterraneum con la adición de un hongo
micorrizógeno y Pseudomonas putida. De igual forma Santhanakrishnan (1996)
elevó la infección de Azadirachta indica cuando se aplicó Glomus constrictumPseudomonas striata.
La temprana colonización fúngica del sistema radical de estas plantulas se pone
de manifiesto en la fase plateau, que es el momento en que la planta alcanza su
máxima infección micorrizógena. Esta fase se alcanza en la inoculación dual y en
Infección micorrizógena (%)
la simple a los 35 y 45 días, respectivamente
120
Fase
Fase Exponencial
Fase Plateau
Inicial
100
80
Gm + Bs
Gm + Pf
Gm
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
60
70
días
Figura 1: Fases de la infección micorrizógena sobre Swietenia macrophyla x
mahagoni durante los 2 meses de edad.
Esta conducta de estas bacterias puede ser explicada a través de los siguientes
mecanismos:
Efecto de MHB sobre el crecimiento fúngico: Este mecanismo se basa en la
estimulación bacteriana del crecimiento del hongo en el estado presimbiótico.
Dentro de este modo de acción se encuentran la producción de metabolitos que
son usados directamente por el hongo, potenciando su anabolismo. Dentro de
estos metabolitos resaltan: ácidos orgánicos, predominantemente ácido málico y
cítrico, los cuales representan una fuente de carbono tan importante como la
glucosa para el crecimiento fúngico. Un compuesto volátil como el dióxido de
carbono, ha mostrado su efecto inhibitorio o estimulante, según su concentración,
del crecimiento de diferentes hongos (Imolehin and Grogan, 1980 y Le Tacon,
Skinner and Mosse, 1983). La detoxificación del medio donde crece el hongo
también se encuentra dentro de este mecanismo de acción de MHB, cuyo
basamento consiste en retardar por parte de la bacteria, el fenómeno de
autotoxificación de la rizosfera por parte del hongo (Garbaye, 1994).
Modificación de la rizosfera: En este mecanismo se vincula la actividad bacteriana
con el cambio en las propiedades físico-químicas del suelo, de modo que se
facilite la formación de micorriza. El cambio de pH o la producción de sideróforos
ejemplifican este mecanismo. El gran potencial de los sideróforos en futuras
investigaciones sobre este mecanismo se sustenta en la producción por parte del
hongo de hidroxiamato sideróforo, por lo que la producción bacteriana de este
compuesto modificaría el equilibrio hongo-planta.
4-DISCUSION GENERAL
Las plantas necesitan fósforo, especialmente, durante las primeras fases de su
desarrollo, el cual se acumula en los órganos jóvenes para activar el desarrollo
radical y el crecimiento de las plantas (Guerrero, 1990 y Fuentes, 1992). Este
macroelemento se encuentra en dos formas fundamentales: una orgánica y otra
inorgánica que representan, aproximadamente un 85% y un 15% del fósforo total
del suelo, respectivamente (Awan, 1964). Solo un por ciento ínfimo del fósforo
total se encuentra en la solución del suelo a disposición de la planta (Borie y
Barea, 1981).
Dentro de los procesos de mineralización y solubilización del fósforo, encargados
de incorporar fósforo a la solución del suelo, se ubican ambos géneros
bacterianos, por lo que los compuestos organo-fosforados presentes en el suelo y
los liberados por la planta pueden ser sometidos a hidrólisis enzimática por estas
bacterias y liberar fósforo disponible a las plántulas (Borie y Barea, 1981). De
forma similar los compuestos inorgánicos del fósforo liberan a éste cuando se
encuentren en presencia de ácidos orgánicos como: el tartárico, el málico, el
cítrico, que son producidos por ambas bacterias en condiciones de anaerobiosis.
Además de que estos mismos microorganismos producen dióxido de carbono en
condiciones de aerobiosis que también logra liberar fósforo de los compuestos
inorgánicos (Jones y Darrah, 1994)..
A lo planteado anteriormente, se le suma el incremento en el volumen de suelo
explorado con ayuda del micelio externo. La tabla 13 expone de forma
convincente esta característica, al mostrar que desde el primer mes el volumen de
suelo explorado por cada gramo de raíz de las plántulas inoculadas,
exclusivamente, con Glomus mosseae se corresponde con 4 veces lo explorado
por gramo de raíz de las plántulas sin iinoculación fúngica, lo cual se eleva a 8 y
9 veces
cuando se inocula la combinación hongo-bacteria. Esta relación se
mantiene de forma similar durante el segundo mes. lo que traería consigo una
mayor obtención de agua y nutrientes e incluso un aumento de la velocidad de
absorción de estos elementos, permitiendo que el fósforo liberado lejos de las
raíces llegue a estas.
Tabla 13: Volumen y masa de suelo adherido por gramo seco de raíz.
Inoculación
Promedio (mes 1)
Promedio (mes 2)
SAR
SAR
VAR
VAR
2.5
2.3
2.8
2.5
P. 2.9
2.6
3.2
2.9
1.2
1.1
1.5
1.4
Sin G. mosseae x sin 0.3
0.3
0.4
0.4
G.
mosseae
x
fluorescens
G. mosseae
Bacteria
Leyenda: SAR= Suelo adherido a la raíz, expresado en g de suelo /g de raíz
VAR= Volumen de suelo adherido a la raíz (SAR*0.9), expresado en
cm3 de suelo /g de raíz
Los incrementos obtenidos en los indicadores de crecimiento con la inoculación
dual hongo-bacteria podrían ser causados, no solo por el efecto combinado del
hongo y las bacterias, sino por un establecimiento más temprano de la simbiosis
micorrizógena. Como se observa en la fig 1 las interacciones hongo-bacteria
producen una fase exponencial más corta que la producida con la inoculación
exclusiva de Glomus mosseae, de forma tal que alcanza la fase de equilibrio 10
días antes. Este rápido establecimiento del hongo en el sistema radical de su
hospedero producirá entonces, que los beneficios de esta simbiosis se reflejen
tempranamente.
La inoculación hongo-bacteria reporta ventajas desde el punto de vista
económico, ecológico y fisiológico. Económicamente se obtiene aproximadamente
un ahorro de un mes de salario y recursos, ya que los 25 cm de altura requeridos
para el transplante a plantación se alcanzan en las plántulas inoculadas con la
combinación hongo-bacteria a los 2 meses, lo cual representa aproximadamente
un mes antes de lo que normalmente se demora en vivero. Fisiológicamente se
obtiene un aumento significativo, con respecto a la ausencia de inoculación y a
veces a la inoculación simple del hongo, en los indicadores de crecimiento y
micorrización cuando se aplica la combinación hongo-bacteria y ecológicamente
se garantiza una mayor supervivencia en plantación al tener un 100% de infección
micorrizógena .
Es obvio que la efectividad fúngica sobre los indicadores de crecimiento es el
resultado de la interacción fisiológica entre los simbiontes bajo un determinado
entorno ambiental. De acuerdo a Smith y Gianinazzi-Pearson (1988) la eficiencia
simbiótica está relacionada con el hongo (velocidad de crecimiento, obtención de
nutrientes, translocación de fósforo del micelio externo, velocidad de infección y
producción de arbúsculos) y el hospedero (morfología de la raíz, velocidad de
crecimiento de la raíz, requerimiento nutricional y actividad fotosintética). Es en
esta interacción hongo-planta que las bacterias juegan un papel importante,
logrando elevar la efectividad de Glomus mosseae en los indicadores de
crecimiento. La base de esta efectividad acrecentada con la combinación hongobacteria pudiera atribuirse a la acción de estas bacterias en la nutrición fosfórica y
a un aumento en la absorción de nutrientes por parte del hongo y por consiguiente
de la planta. La elevación de los niveles de nitrógeno produce mayor cantidad del
contenido de clorofila en las hojas (Devlin, 1982), lo que se traduce en una mayor
tasa fotosintética.
La efectividad medida bajo condiciones controladas, constituye el primer paso en
la selección de los aislamientos fúngicos que luego son sometidos a condiciones
no controladas, donde se presentan relaciones de competencia con otros
microorganismos, principalmente la comunidad nativa de hongos micorrizógenos
y microorganismos patógenos. La elevación de la clasificación de la efectividad de
no efectivo o ligeramente
efectivo
a moderada o altamente efectivo,
respectivamente, alcanzada por Glomus mosseae-bacteria le permite a este
hongo no solo poder competir con otros microorganismos, sino que se incluya en
el banco de germoplasma. Este incremento de efectividad es de gran importancia,
ya que aproximadamente el 60% de los aislamientos fóngicos son no efectivos y
ligeramente efectivos en estado no competitivo (Burchhardt y Howeler, 1985 y
Sieverding, 1991).
5-CONCLUSIONES
La inoculación de Glomus mosseae no influye significativamente, en el primer
mes, sobre ningún indicador de crecimiento de Swietenia macrophyla x
mahagoni, excepto el diámetro.
La inoculación de Glomus mosseae influye significativamente, en el segundo
mes, sobre la altura y el diámetro de Swietenia macrophyla x mahagoni.
La inoculación de Glomus mosseae influye significativamente, en los 2 meses
evaluados, sobre todos los indicadores micotróficos de Swietenia macrophyla
x mahagoni.
La inoculación de ninguna de las especies bacterianas aplicadas, Bacillus
subtilis y Pseudomonas fluorescens, logra influir significativamente, en el
primer mes, sobre ningún indicador de crecimiento de Swietenia macrophyla x
mahagoni, excepto la altura.
Ambas inoculaciones de las especies bacterianas aplicadas, Bacillus subtilis y
Pseudomonas fluorescens influyen significativamente, en el segundo mes,
sobre todos los indicadores de crecimiento de Swietenia macrophyla x
mahagoni, excepto el diámetro.
En todos los indicadores de crecimiento de de Swietenia macrophyla x
mahagoni
ambas
inoculaciones
dual
hongo-bacteria
sobrepasan
significativamente al testigo absoluto en los dos meses de análisis.
Las dos combinaciones hongo-bacteria sobrepasan estadísticamente a la
inoculación exclusiva de Glomus mosseae en la altura, peso seco foliar y el
diámetro de Swietenia macrophyla x mahagoni, en el segundo mes de análisis.
En todos los indicadores de micotrofía de Swietenia macrophyla x mahagoni,
las inoculaciones dual hongo-bacteria sobrepasan significativamente al testigo
absoluto y a la inoculación exclusiva de Glomus mosseae, en el primer y
segundo mes de análisis.
Las inoculaciones dual hongo-bacteria consiguen convertir la inefectividad de
Glomus mosseae en efectividad moderada en determinados indicadores de
crecimiento como: altura y peso seco foliar de Swietenia macrophyla x
mahagoni.
En el diámetro de Swietenia macrophyla x mahagoni, la inoculación dual
Glomus
mosseae-Bacillus
subtilis
y
Glomus-mosseae-Pseudomonas
fluorescens elevan la efectividad de Glomus mosseae de ligera a moderada y
alta, respectivamente.
Las inoculaciones dual hongo-bacteria influyen en la fase exponencial de la
infección micorrizógena, haciéndola más corta, con lo cual provocan un
establecimiento más temprano de la simbiosis con relación a Glomus
mosseae.
6-RECOMENDACIONES
Realizar este experimento con varios hongos formadores de micorriza y esras
mismas bacterias en estado no competitivo y competitvo, además de un
análisis foliar y de suelo.
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DEDICATORIA
A mi familia, especialmente a mis padres y hermana, por estar a mi lado siempre.
AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer a todos los compañeros del Departamento de Genética y
Protección, especialmente a Valle, Nati, a mi padre estadístico (Montalvo), a mi
tutor Luis Casadesus y a mis micorrizógenas madres, Anairad y Emelina; sin los
cuales no hubiera sido posible la realización de esta tesis.
Aprovecho para agradecer una vez más a Anairad y Emelina por todo lo que me
han enseñado, a mis inmensas madre y hermana por no parar de quererme y a mi
mejor y eterno amigo JOSE.
RESUMEN
Se analizó la importancia de la aplicación dual de Glomus mosseae-Bacillus
subtilis y Glomus mosseae-Pseudomonas fluorescens sobre los indicadores de
crecimiento (altura, peso seco foliar, peso seco radical y diámetro) y micotrofía
(Infección micorrizógena, longitud de las raíces micorrizadas, micelio externo y
respuesta a la micorriza) de posturas de Swietenia macrophylla x mahagoni en
fase de vivero, así como la influencia de estas combinaciones sobre la efectividad
de Glomus mosseae sobre los indicadores de crecimiento y las fases de la
infección micorrizógena de dichas plántulas por parte de este hongo
micorrizógeno. Con este fin se probaron los siguientes tratamientos: Glomus
mosseae, Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, Glomus mosseae +
Bacillus subtilis, Glomus mosseae + Pseudomonas fluorescens y el testigo.
Obteniéndose
que
las
dos
combinaciones
hongo-bacteria
sobrepasan
estadísticamente a la inoculación simple de Glomus mosseae en la altura, peso
seco foliar y el diámetro de Swietenia macrophyla x mahagoni, en el segundo mes
de análisis. Para todos los indicadores de micotrofía de Swietenia macrophyla x
mahagoni, las inoculaciones dual hongo-bacteria sobrepasan significativamente al
testigo absoluto y a la inoculación exclusiva de Glomus mosseae durante el
primer y segundo mes de análisis. Las inoculaciones dual hongo-bacteria
consiguen convertir la inefectividad de Glomus mosseae en efectividad moderada
en determinados indicadores de crecimiento como: altura y peso seco foliar de
Swietenia macrophyla x mahagoni y en el diámetro de Swietenia macrophyla x
mahagoni, la inoculación dual Glomus mosseae-Bacillus subtilis y Glomus
mosseae-Pseudomonas fluorescens elevan la efectividad de Glomus mosseae de
ligera a moderada y alta, respectivamente. Como último las inoculaciones dual
hongo-bacteria influyen en la fase exponencial de la infección micorrizógena,
haciéndola más corta, con lo cual provocan un establecimiento más temprano de
la simbiosis con relación a Glomus mosseae.

Ihosvanni Cuesta Mola

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