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Transcripción

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE MAR DEL PLATA
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
“Participación del óxido nítrico en las vías de señalización
inducidas por auxinas que conducen a la formación de
raíces adventicias en pepino (Cucumis sativus)”
Lic. María Luciana Lanteri
Director: Dr. Lorenzo Lamattina
Instituto de Investigaciones Biológicas
Tesis para optar por el título de Doctor en Ciencias Biológicas
2008
Puedes llegar a cualquier parte, siempre que andes lo suficiente
Lewis Carroll (escritor británico)
AGRADECIMIENTOS
A Lorenzo Lamattina, “Loren”, por confiar en mí, por darme libertad para opinar y trabajar, por
la experiencia que adquirí todos estos años y por su admirable capacidad y ganas de trabajar.
Gracias Loren!!
A Ana Laxalt, “Anita”, por su energía, paciencia y ayuda en la realización y análisis de los
experimentos presentados en el Capítulo IV. Además, por ser un referente de muchas cosas y
por darme la oportunidad de compartir 2 años de postdoc.
Al “team lípidos” (Anita, Gaby y Aye) por su apoyo constante, por sus comentarios
constructivos y por discutir una y mil veces los resultados de las TLCs!!
A Gabriela Pagnussat, “Gaby”, por iniciarme en la ciencia y por haberme dejado el legado de
las raíces adventicias.
Al laboratorio de la Dra. Dra. Eny Floh (Departamento de Botánica, Universidad de San Pablo,
Brasil) por su colaboración con la medición y análisis del contenido de IAA libre.
A Pablo, “cu”, por amarme y contenerme, por ser mi cable a tierra, por sus ganas contagiosas de
superarse cada día. Y simplemente por hacerme FELIZ!!
A mi familia (mamá, papá y hermanas) por estar siempre pero siempre presentes con una
palabra de aliento, por ser irreemplazables en mi vida y por todo lo que hicieron y hacen por mí
cada día. Los adoro!!
A mi querida abuela Elisa por sus visitas de médico y sus cortas llamadas por teléfono para no
“robarme tiempo”, pero para saber cómo estoy y cómo van mis cosas. Sos una ídola!!
A los “Cariñanos” (Mari, Juan, Geri y Javier) por los hermosos fines de semana en familia, por
quererme y aconsejarme sabiamente.
A la gente del “laboratorio 8” por su apoyo y su palabra de aliento, por hacer divertidos e
inolvidables los días de trabajo. A cada uno de ustedes (Male, Arjen, Charlie, Ramiro, Pedro,
Leo, Vane, Aye, Noe, Anita, Raulito, Meli, Nati): GRACIAS y aguante el 8!!
A mis “amiguis” (Anita, Ceci, Gaby, Juli, Lu, Nati, Male y Vicky) por los innumerables
momentos de diversión y simplemente por estar cuando las necesito. Sin ustedes hoy no podría
haber llegado acá!! Las adoro!!
A mi amiga Cecilia Caino, “Ceci”, por estar siempre en mi vida, por ser mi “alma gemela”. Te
extraño mucho!!
A mis amigas, Pau, Pame, Lau y Juli por compartir casi todas nuestras vidas juntas!! Y por
muchos años más de amistad!!
A toda la gente del Instituto de Investigaciones Biológicas por compartir tantas lindas cosas
todos estos años y por ser mi “segundo hogar”.
A la Universidad Nacional de Mar del Plata por permitirme formar parte de su comunidad
educativa.
Al CONICET por haberme otorgado la beca para desarrollar mis estudios de postgrado.
ÍNDICE GENERAL
Página
RESUMEN……………………………………………………………………………………..
1
INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………………...
2
OBJETIVOS E HIPÓTESIS DE TRABAJO…………………………………………………..
23
MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………………………
24
RESULTADOS CAPÍTULO I…………………………………………………………………
35
DISCUSIÓN CAPÍTULO I…………………………………………………………………….
44
RESULTADOS CAPÍTULO II………………………………………………………………...
49
DISCUSIÓN CAPÍTULO II……………………………………………………………………
56
RESULTADOS CAPÍTULO III……………………………………………………………….
60
DISCUSIÓN CAPÍTULO III…………………………………………………………………..
68
RESULTADOS CAPÍTULO IV……………………………………………………………….
74
DISCUSIÓN CAPÍTULO IV…………………………………………………………………..
86
RESULTADOS CAPÍTULO V………………………………………………………………...
94
DISCUSIÓN CAPÍTULO V…………………………………………………………………...
101
DISCUSIÓN GENERAL Y CONCLUSIONES……………………………………………….
105
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………………………………
121
TRABAJOS ORIGINADOS A PARTIR DE ESTA TESIS…………………………………...
141
ÍNDICE TEMÁTICO
Página
RESUMEN……………………………………………………………………………...
1
INTRODUCCIÓN
1. Auxinas
1.1. Generalidades………………………………………………………………..
2
1.2. Transporte polar de auxinas…………………………………………………
2
1.3. Mecanismo de señalización por auxinas…………………………………….
3
2. Transducción de señales en plantas
2.1. Óxido nítrico
2.1.1. Generalidades……………………………………………………….
4
2.1.2. Vías enzimáticas y no enzimáticas de producción de NO……….…
5
2.1.3. Mecanismo de acción del NO………………………………………
6
2.1.4. Bioquímica del NO…………………………………………………
8
2.1.5. Dadores y secuestrantes de NO……………………………………..
9
2.1.6. Participación del NO en los procesos regulados por auxinas………
10
2.2. Calcio………………………………………………………………………... 12
2.3. Quinasas de proteína
2.3.1. Quinasas de proteína dependientes de Ca2+………………………...
13
2.3.2. Quinasas de proteína activadas por mitógenos……………………..
14
2.4. Fosfolípidos………………………………………………………………..
15
2.5. ATP extracelular…………………………………………………………...
16
3. Raíces adventicias
3.1. Generalidades………………………………………………………………..
17
3.2. Rol de las auxinas en la formación de raíces adventicias…………………… 17
3.3. ¿Por qué estudiar el efecto del NO sobre la formación de raíces
adventicias?............................................................................................................
18
3.4. Importancia del proceso de formación de raíces adventicias………………..
18
4. Antecedentes sobre la formación de raíces adventicias en pepino y especies leñosas
4.1. El NO actúa por debajo de las auxinas………………………………………
19
4.2. El cGMP es un segundo mensajero………………………………………….
19
4.3. Compuestos que afectan la formación de raíces adventicias en pepino……..
20
4.4. Estudio anatómico…………………………………………………………...
20
4.3. El NO induce la formación de raíces adventicias en especies leñosas………
21
OBJETIVOS E HIPÓTESIS DE TRABAJO…………………………………………...
23
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Material vegetal
1.1. Condiciones generales de crecimiento de las plántulas de pepino…………..
24
1.2. Ensayos de enraizamiento con los explantos de pepino……………………..
24
1.2.1. Evaluación del enraizamiento en presencia de auxinas y NO……...
25
1.2.2. Evaluación del enraizamiento en presencia de luz y oscuridad…….
25
1.2.3. Evaluación del enraizamiento en presencia del inhibidor permeable
de MAPKKs PD098059…………………………………………………...
26
1.2.4. Evaluación del enraizamiento en presencia de quelantes de Ca2+
extracelular o de inhibidores de canales de Ca2+………………………….
26
1.2.5. Evaluación del enraizamiento en presencia de antagonistas de
calmodulina permeables…………………………………………………...
27
1.2.6. Evaluación del enraizamiento en presencia de alcoholes y
fosfolípidos………………………………………………………………..
27
1.2.7. Evaluación del enraizamiento en presencia de ATP extracelular…..
28
2. Medición del contenido de IAA libre………………………………………………...
29
3. Depleción de auxinas endógenas……………………………………………………..
29
4. Preparación de extractos proteicos solubles totales…………………………………..
30
5. Cuantificación de proteínas…………………………………………………………..
30
6. Ensayos de actividad quinasa de proteína
6.1. Ensayo en gel de actividad quinasa de proteína activada por mitógenos……
30
6.2. Ensayo en gel de actividad quinasa de proteína dependiente de Ca2+……….
31
6.3. Ensayo in vitro de actividad quinasa de proteína activada por mitógenos…..
31
2+
6.4. Ensayo in vitro de actividad quinasa de proteína dependiente de Ca ……...
32
7. Marcación, extracción y análisis de fosfolípidos……………………………………..
33
8. Determinación de la calidad de fosfolípidos exógenos………………………………
34
9. Tratamiento estadístico de los datos………………………………………………….
34
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
CAPÍTULO I: Efectos de la luz, la oscuridad, la depleción de auxinas endógenas y la
remoción de parte de los explantos de pepino sobre la formación de raíces adventicias
La auxina IAA y el dador de NO SNAP inducen la formación de raíces
adventicias de forma dosis dependiente………………………………………….
35
El contenido de IAA libre no se modifica en presencia de NO………………….
37
La oscuridad adelanta el proceso de formación de raíces adventicias…………...
38
El NO revierte el efecto inhibitorio de la depleción de auxinas endógenas sobre
la formación de raíces adventicias……………………………………………….
40
Las auxinas y el NO requieren de explantos enteros para promover la formación
de raíces adventicias en luz y oscuridad………………………………………….
41
DISCUSIÓN…………………………………………………………………………….
44
CAPÍTULO II: El NO es requerido para la activación de una cascada de señalización
mediada por MAPKs, inducida por auxinas e involucrada en la formación de raíces
adventicias en pepino
El NO es requerido para la actividad MAPK inducida por IAA durante la
formación de raíces adventicias………………………………………………….
49
La actividad MAPK es inhibida por el inhibidor de MAPK quinasa PD098059... 52
La inhibición de MAPKKs previene la formación de raíces adventicias inducida
por IAA o NO…………………………………………………………………….
53
La actividad MAPK es inducida por NO en una vía independiente de cGMP…..
54
DISCUSIÓN…………………………………………………………………………….
56
CAPÍTULO III: El Ca2+ y las CDPKs están involucrados en la formación de raíces
adventicias inducida por auxinas y NO en pepino
Inhibidores de canales de Ca2+ y quelantes de Ca2+ previenen la formación de
raíces adventicias inducida por auxinas y NO…………………………………… 60
La actividad CDPK es inducida por IAA en una vía mediada por NO…………..
62
La actividad CDPK es requerida para la formación de raíces adventicias……….
65
El inhibidor de la guanilato ciclasa LY83583 previene la activación de CDPKs
por auxinas y NO…………………………………………………………………
66
DISCUSIÓN…………………………………………………………………………….
68
CAPÍTULO IV: Las auxinas y el NO inducen la acumulación de ácido fosfatídico vía
fosfolipasa D durante la formación de raíces adventicias en pepino
Las auxinas y el NO inducen la acumulación de fosfolípidos señales…………...
74
Los fosfolípidos señales se acumulan rápida y transientemente frente a
tratamientos con auxinas y NO…………………………………………………..
78
La acumulación de fosfolípidos señales inducida por auxinas depende de NO….
79
La actividad PLD está involucrada en la acumulación de PA inducida por
auxinas y NO……………………………………………………………………..
81
La activación de PLD es requerida para la formación de raíces adventicias
inducida por auxinas y NO………………………………………………….........
83
La aplicación exógena de PA promueve la formación de raíces adventicias…….
84
DISCUSIÓN…………………………………………………………………………….
86
CAPÍTULO V: El ATP extracelular induce la formación de raíces adventicias en una
vía dependiente de NO
El ATP induce el número y la longitud de raíces adventicias de forma dosis
dependiente………………………………………………………………………
94
El ATP y el ADP inducen el número y la longitud de raíces adventicias de
forma similar……………………………………………………………………..
96
La hidrólisis del ATP no es requerida para la formación de raíces adventicias
inducida por ATP………………………………………………………………...
97
El NO endógeno es requerido para la formación de raíces adventicias inducida
por ATP…………………………………………………………………………..
98
El ATP induce la formación de raíces adventicias vía receptores de tipo P2……
99
DISCUSIÓN…………………………………………………………………………….
101
DISCUSIÓN GENERAL Y CONCLUSIONES
Integración de los resultados obtenidos en esta tesis en un modelo de vías de
señalización que conducen a la formación de raíces adventicias en pepino……..
105
Cruce de información entre vías de señalización reguladas por luz, MAPKs,
Ca2+-CDPKs, fosfolípidos y ATP extracelular…………………………………...
107
Fuentes enzimáticas de producción de NO involucradas en la formación de
raíces adventicias…………………………………………………………………
110
Efectos de diversos compuestos sobre la formación de raíces adventicias en
pepino y otras especies vegetales………………………………………………...
112
Consideraciones finales y perspectivas…………………………………………..
118
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………………………………….
121
TRABAJOS ORIGINADOS A PARTIR DE ESTA TESIS……………………………
141
ABREVIATURAS
[Ca2+]cit: concentración citosólica de Ca2+
ABA: ácido abscísico
BAPTA-AM: 1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N′,N′-ácido tetraacético tetra(acetoximetil) ester
cADPR: ADP ribosa cíclica
CDPK: quinasa de proteína dependiente de Ca2+
cGMP: GMP cíclico
CO: monóxido de carbono
cPTIO: 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide, potassium salt
CPZ: hidrocloruro de clorpromazina
DAG: diacilglicerol
DGK: diacilglicerol quinasa
DMSO: dimetilsulfóxido
eATP: ATP extracelular
EGTA: etilen glicol-bis(2-aminoetileter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético
EtOH: etanol
FRA: formación de raíces adventicias
GC: guanilato ciclasa
HO: hemo oxigenasa
IAA: ácido indol-3-acético
IP3: inositol 1,3,5-trifosfato
LaCl3: cloruro de lantano
LiCl: cloruro de litio
LY83583: 6-anilinoquinoline-5,8-quinone
MAPK: quinasa de proteína activada por mitógenos
MAPKK: MAPK quinasa
MAPKKK: MAPKK quinasa
MBP: proteína básica de mielina
MES: 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid
MV: hidrocloruro de metoxiverapamil
NA: nicotinamida
NAA: ácido 1-naftilacético
NEO: sulfato de neomicina
NO: óxido nítrico
NOS: óxido nítrico sintasa
NPA: ácido 1-naftilftalámico
NR: nitrato reductasa
PA: ácido fosfatídico
PBut: fosfatidilbutanol
PC: fosfatidilcolina
PD098059: 2-(2-amino-3-methoxyphenyl)-oxanaphthalen-4-one
PE: fosfatidiletanolamina
PG: fosfatidilglicerol
PI: fosfatidilinositol
PIP: fosfatidilinositol fosfato
PIP2: fosfatidilinositol bifosfato
PL: fosfolípido
PLC: fosfolipasa C
PLD: fosfolipasa D
ROS: especies reactivas de oxígeno
RR: rojo rutenio
SDS: dodecil sulfato de sodio
SNAP: S-nitroso N-acetil penicilamina
SNP: nitroprusiato de sodio
SPL: fosfolípido estructural
TFP: dihidrocloruro de trifluoroperazina
TLC: cromatografía en capa delgada
W-7: hidrocloruro de N-(6-aminohexil)-5-cloro-1-naftalensulfonamida
RESUMEN
RESUMEN
La formación de raíces adventicias (FRA) involucra el desarrollo de un tejido
meristemático luego de la remoción del sistema radical primario. La FRA es un proceso
complejo que está bajo el control de factores endógenos (principalmente hormonas) y exógenos
(luz, temperatura, estrés mecánico, etc). La FRA posee implicancias prácticas en agronomía e
interés económico porque muchas plantas son recalcitrantes para enraizar. Dentro de las
hormonas, las auxinas juegan un rol central en integrar y sincronizar las vías de señalización
desencadenadas por estímulos endógenos y exógenos que conducen a la FRA.
El óxido nítrico (NO) es una molécula señal involucrada en varios procesos asociados al
crecimiento, desarrollo y fisiología de las plantas. La presente tesis describe e interpreta
evidencias fisiológicas, bioquímicas y moleculares que demuestran la participación del NO en la
FRA inducida por auxinas. El NO es necesario para incrementar el número y la longitud de
raíces adventicias en explantos de pepino (Cucumis sativus). Las auxinas inducen la síntesis de
NO en la base de los hipocótilos de pepino, un paso esencial para activar las vías de
señalización que conducen a la FRA. Dichas vías involucran un complejo set de mensajeros
celulares como GMP cíclico (cGMP), ADP ribosa cíclica, inositol 1,4,5-trifosfato, Ca2+,
quinasas de proteína activadas por mitógenos (MAPKs), quinasas de proteína dependientes de
Ca2+ (CDPKs), y fosfolipasas C y D.
En la presente tesis se demuestra que: i) la oscuridad posee un efecto estimulatorio
sobre la FRA y que la presencia de auxinas endógenas y de explantos enteros (cotiledones,
meristema caulinar e hipocótilo) son necesarios para desencadenar este proceso, ii) el NO es
requerido para la activación de una cascada de señalización mediada por MAPKs, inducida por
auxinas e involucrada en la FRA, siendo esta cascada independiente de la vía de cGMP, iii) el
Ca2+ y las CDPKs están involucrados en la FRA inducida por auxinas y NO, siendo la
activación de CDPKs dependiente de la vía de cGMP, iv) las auxinas y el NO inducen la
acumulación de ácido fosfatídico vía fosfolipasa D durante la FRA en pepino, siendo la
actividad de esta enzima requerida para disparar el proceso de FRA, v) el ATP extracelular
induce un incremento en el número y la longitud de raíces adventicias, siendo el NO endógeno
requerido para este efecto.
1
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
1. Auxinas
1.1. Generalidades
Dentro de las hormonas vegetales, las auxinas incluyen un grupo de moléculas
orgánicas naturales o sintéticas que presentan un enorme espectro de actividades biológicas. El
ácido indol-3-acético (IAA) es la auxina natural más abundante y fisiológicamente más
relevante en las plantas. Las auxinas juegan un rol central en numerosos procesos del desarrollo
de las plantas funcionando como señal para la división, la elongación y la diferenciación celular.
Se ha descripto su participación en procesos bien diversos tales como el desarrollo radical, la
dominancia apical y las respuestas trópicas (Estelle, 1992).
Los mecanismos biológicos que controlan el balance y la actividad de las auxinas son la
biosíntesis y degradación, la conjugación y el transporte (Normanly y Bartel, 1999). La
biosíntesis de auxinas se produce en tejidos aéreos jóvenes y también en raíces, principalmente
en ápices de raíces primarias y laterales (Ljung et al., 2005). Las auxinas son sintetizadas a
partir de indol por medio de vías dependientes o independientes de triptófano. La especificidad
de la respuesta a auxinas depende de una gran variedad de factores incluyendo el tipo y la etapa
del desarrollo de las células, y las condiciones ambientales que las rodean (Leyser, 2002).
1.2. Transporte polar de auxinas
El transporte polar de auxinas mediado por proteínas transportadoras transmembrana es
un mecanismo unidireccional de transporte célula a célula que resulta en una distribución
controlada de auxina activa libre. La dirección de transporte es basípeta, esto es, desde el ápice
caulinar hacia las raíces (Jones, 1998). La hipótesis quimioosmótica explica este mecanismo a
través de la participación de transportadores de eflujo e influjo de auxinas. La localización
subcelular de los transportadores de eflujo determina la dirección del transporte de auxinas
(Raven, 1975). Se han identificado varias familias de transportadores de eflujo de auxinas como
PIN (PIN-FORMED), MDR (multidrug resistance) y PGP (P glycoproteins), y para el influjo de
auxinas la proteína AUX1. Estas familias de proteínas se localizan opuesta y asimétricamente en
las membranas celulares. La entrada de auxinas a las células ocurre principalmente por difusión
2
INTRODUCCIÓN
y en menor medida por transporte activo. El influjo dependiente de AUX1 sólo se necesita en
zonas con alta tasa de transporte de auxinas (Vieten et al., 2007).
1.3. Mecanismo de señalización por auxinas
Los mecanismos de acción hormonal implican la percepción de hormonas por parte de
receptores específicos y la subsiguiente inducción de vías de transducción de señales.
Los genes de respuesta a auxinas más estudiados pertenecen a 3 familias génicas, SAUR
(Small Auxin Upregulated RNA), GH3 (Gretchen Hagen 3) y Aux/IAA (Auxin/Indol-3-acetic
Acid), las cuales se inducen rápidamente en respuesta al tratamiento con auxinas (Hagen y
Guilfoyle, 2002). Los genes SAUR han sido poco estudiados. Los genes GH3 codifican para
enzimas que conjugan auxinas, reduciendo así los niveles de auxina libre. Los genes Aux/IAA
codifican para represores transcripcionales de los genes de respuesta a auxinas, con localización
nuclear y vida media corta (Reed, 2001). El análisis de las regiones promotoras de estas 3
familias génicas permitió la identificación de elementos de respuesta a auxinas denominados
ARE (Auxin Response Element; Hagen y Guilfoyle, 2002), los cuales son blancos de unión de
las proteínas ARF (Auxin Response Factor; Ulmasov et al., 1997). Se demostró que las
proteínas ARF y Aux/IAA pueden formar homodímeros y heterodímeros dentro y entre los
diferentes miembros de las familias (Kim et al., 1997).
Por otra parte, el gen TIR1 (Transport Inhibitor Response 1) codifica para una proteína
F-box (Ruegger et al., 1998). Las proteínas F-box son subunidades del complejo proteico E3
ligasa llamado SCF (Skp1-Cullin-F-box), el cual poliubiquitina específicamente proteínas para
su degradación vía proteasoma 26S (Vierstra, 2003). La especificidad de sustrato está definida
por las proteínas F-box dentro del complejo SCF. La proteína TIR1 posee homología con las
proteínas AFB1, AFB2 y AFB3 (Auxin-related F-box proteins), siendo sus funciones
parcialmente redundantes (Dharmasiri et al., 2005a). Se ha demostrado que las auxinas se unen
a las proteínas TIR1 y AFBs, funcionando como receptores de auxinas (Dharmasiri et al.,
2005a; 2005b; Kepinski y Leyser, 2005).
3
INTRODUCCIÓN
En síntesis, cuando las concentraciones de auxinas están por debajo de un nivel umbral
los represores Aux/IAA están asociados con los factores de transcripción ARF reprimiendo la
expresión de genes de respuesta a auxinas. Cuando las concentraciones de auxinas aumentan,
éstas se unen a los receptores TIR1-AFBs activando la expresión génica como consecuencia de
la degradación de los represores transcripcionales Aux/IAA vía proteasoma 26S.
2. Transducción de señales en plantas
2.1. Óxido nítrico
2.1.1. Generalidades
El óxido nítrico (NO) es un gas altamente reactivo y ubicuo que difunde rápidamente en
las membranas celulares, participando de la señalización intercelular. El NO funciona como
molécula señal regulando un diverso espectro de funciones celulares en especies distantes
filogenéticamente (desde procariotas a mamíferos). Su especificidad depende de complejos
mecanismos regulatorios dados por su tasa de producción y difusión, el tipo celular y el
ambiente que rodea a las células blanco (Lamattina et al., 2003).
En animales, el NO está involucrado en numerosos procesos incluyendo vasorelajación, neurotransmisión e inmuno-regulación de procesos patofisiológicos (Anbar, 1995;
Moilanen y Vapaatalo, 1995). En los últimos años, ha crecido notoriamente la investigación
sobre las diversas actividades biológicas del NO durante el ciclo de vida de las plantas. El NO
es un segundo mensajero en la señalización de procesos fisiológicos como la tolerancia frente a
estreses bióticos y abióticos (Lamattina et al., 2003; Romero-Puertas et al., 2004). Por otra
parte, el NO es una molécula regulatoria del crecimiento y desarrollo de las plantas con efectos
sobre la germinación, la respiración, la senescencia y la tuberización (Lamattina et al., 2003).
El NO ha sido nombrado molécula del año en 1992 por la revista Science. Además, se
han creado una sociedad científica (Nitric Oxide Society) y una revista científica (Nitric Oxide)
dedicada enteramente al estudio del NO.
4
INTRODUCCIÓN
2.1.2. Vías enzimáticas y no enzimáticas de producción de NO
En animales, la biosíntesis de NO está catalizada principalmente por la enzima NO
sintasa (NOS) que oxida L-arginina a L-citrulina y NO. Se han identificado tres isoformas de
NOS conservadas evolutivamente y de localización citosólica o unida a membranas: NOS
inducible (de expresión inducible), NOS neuronal y NOS endotelial (ambas de expresión
constitutiva). A su vez, se ha demostrado la producción no enzimática de NO a partir de nitrito
en ambientes reductores/acídicos (Weitzberg y Lundberg, 1998).
En plantas, el NO se produce por una vía inorgánica del nitrógeno (no enzimática) o por
catálisis enzimática. La enzima nitrato reductasa (NR) cataliza la reducción NAD(P)Hdependiente de nitrito a NO utilizando molibdeno como cofactor. Esta enzima posee un rol
fundamental en la asimilación de nitrógeno y produce NO cuando la fotosíntesis está ausente o
inhibida y cuando el nitrito se acumula (Yamasaki, 2000). La producción de NO a partir de la
actividad NR se ha documentado en varias especies vegetales, tanto in vitro como in vivo. En
particular, se ha medido actividad productora de NO dependiente de NR in vivo en raíces y
hojas de pepino (Cucumis sativus; de la Haba et al., 2001).
Se han identificado actividades tipo NOS en varias especies vegetales a través de la
medición de la oxidación de L-arginina a L-citrulina (Neill et al., 2003). Se ha observado
inhibición de la producción de NO mediante el uso de inhibidores de NOS de mamíferos
(Wendehenne et al., 2001). Además, se han obtenido evidencias inmunológicas e
inmunocitoquímicas utilizando anticuerpos contra NOS de mamíferos (Modolo et al., 2002). Sin
embargo, la existencia de una actividad tipo NOS en plantas ha sido objeto de discusión debido
a que: i) los anticuerpos contra NOS de mamíferos reconocen proteínas no relacionadas con
NOS (Butt et al., 2003) y ii) no se han encontrado genes con similitud de secuencia a la NOS de
animales en el genoma de Arabidopsis (Arabidopsis thaliana; Neill et al., 2003). A pesar de
esto, la proteína NOS1 de Arabidopsis (renombrada NOA1 por NO-associated protein 1) se ha
identificado como una potencial NOS. Las plantas mutantes nulas Atnoa1 producen solamente
un 10-20 % de NO comparado con las plantas salvajes. Además, son plantas pequeñas con hojas
amarillentas, fenotipo que es rescatado por el tratamiento con NO exógeno. Dependiendo del
5
INTRODUCCIÓN
tipo de respuesta fisiológica estudiada, la producción de NO no siempre es deficiente en Atnoa1.
Resultados publicados recientemente mostraron que AtNOA1 es incapaz de unir arginina y
oxidarla a NO. Esta proteína es miembro de la familia de GTPasas permutadas circularmente,
que unen e hidrolizan GTP específicamente (Moreau et al., 2008).
Otras fuentes de producción de NO en plantas incluyen: (i) nitrito-NO óxido reductasa.
Es una enzima unida a membrana plasmática y específica de raíz que utiliza citocromo c como
dador de electrones in vitro. Se ha caracterizado bioquímicamente pero aún se desconoce su rol
fisiológico y su identidad genética (Stöhr y Stremlau, 2006). (ii) reducción de nitrito a NO en
mitocondrias de tabaco (Nicotiana tabaccum; Planchet et al., 2005). Se desconoce si este
proceso ocurre en hojas o raíces (Modolo et al., 2005; Gupta et al., 2005). (iii) producción de
NO a partir de L-arginina o nitrito en cloroplastos de soja (Glycine max; Jasid et al., 2006). Se
desconocen las enzimas responsables de dicha producción. (iv) producción no enzimática de
NO a partir de nitrito en el apoplasto de la capa de aleurona de semillas de cebada (Hordeum
vulgare; Bethke et al., 2004a). Un pH ácido y compuestos reductores como el ascorbato y los
fenoles, que son abundantes en plantas, pueden acelerar la tasa de producción de NO
(Yamasaki, 2000; Bethke et al., 2004b). A su vez, la producción no enzimática de NO se
incrementa en respuesta a giberelinas y ácido abscísico (ABA), hormonas que acidifican el
apoplasto. Aún se desconoce la relevancia fisiológica de la síntesis no enzimática de NO.
2.1.3. Mecanismo de acción del NO
Se ha demostrado que el NO modula vías de transducción de señales que involucran: (i)
modificación en la concentración citosólica de Ca2+ ([Ca2+]cit), (ii) activación de quinasas de
proteína y (iii) modificaciones posttraduccionales en proteínas tales como S-nitrosilación de
cisteínas y nitración de tirosinas.
(i) En animales, se ha reportado que el NO induce la actividad de la enzima guanilato
ciclasa (GC) a través de la unión reversible al grupo hemo de la misma, resultando en un
incremento transiente en el nivel de GMP cíclico (cGMP; Stamler et al., 2001). El NO
incrementa la [Ca2+]cit tanto por una vía dependiente como independiente de cGMP. Este
6
INTRODUCCIÓN
aumento es consecuencia de una entrada de Ca2+ a la célula desde el espacio extracelular y/o de
una liberación de Ca2+ a partir de reservorios intracelulares, mediada por ADP ribosa cíclica
(cADPR) e inositol 1,4,5-trifosfato (IP3; Volk et al., 1997; Berkels et al., 2000). En plantas,
experimentos bioquímicos y farmacológicos mostraron que el NO regula el nivel endógeno de
cGMP vía activación de GC. El cGMP puede incrementar la [Ca2+]cit a través de la activación de
la enzima ADPR ciclasa, la cual produce cADPR. En particular, se ha reportado que el cGMP
puede mediar los efectos del NO durante interacciones planta-patógeno induciendo la expresión
de genes de defensa (Durner et al., 1998) y la muerte celular programada en Arabidopsis
(Clarke et al., 2000). El tratamiento con NO induce un incremento transiente en la
concentración endógena de cGMP (Durner et al., 1998). Se ha observado que la activación de
genes de defensa por NO mediada por cADPR, es inhibida por un bloqueante de canales de
Ca2+, lo cual localiza a este ión por debajo de la cADPR en la vía de señalización por NO
(Durner et al., 1998; Klessig et al., 2000). En células de la guarda de haba (Vicia faba), la
cADPR forma parte de la cascada de señales desencadenada por ABA y mediada por NO (Neill
et al., 2002; García-Mata y Lamattina, 2002). Se ha visto que inhibidores de la síntesis de
cGMP y cADPR, y de quinasas de proteína suprimen la movilización de Ca2+ por NO (GarcíaMata et al., 2003; Lamotte et al., 2004; Sokolovski et al., 2005). Lamotte et al. (2006)
demostraron, en células de tabaco, que la activación de la quinasa de proteína NtOSAK
(miembro de la familia SnRK2) precede al incremento en la [Ca2+]cit mediada por NO. Sin
embargo, la síntesis de cADPR regulada por NO aún no se ha demostrado en plantas y se
desconoce la identidad de los canales de Ca2+ y de las enzimas que generan cADPR. En
Arabidopsis, Ludidi y Gehring (2003) reportaron la existencia de una GC que no posee un
grupo hemo, lo cual es consistente con su insensibilidad al NO.
(ii) Se ha descripto que el NO promueve la activación de quinasas de proteína activadas
por mitógenos (MAPKs) en Arabidopsis (Clarke et al., 2000; Capone et al., 2004) y tabaco
(Kumar y Klessig, 2000), y la quinasa de proteína NtOSAK de tabaco (Lamotte et al., 2006).
Sin embargo, aún no se han estudiado modificaciones en los patrones de fosforilación de
proteínas en respuesta al NO.
7
INTRODUCCIÓN
(iii) La S-nitrosilación es la unión covalente entre el NO y un grupo tiol de un residuo
de cisteína (Wang et al., 2006). La especificidad está dada por la proximidad de los residuos de
cisteína a las fuentes de NO, por el estado redox del microambiente y por la identidad de los
residuos flanqueantes al residuo de cisteína (Mannick y Schonhoff, 2002). La nitrosilación de
grupos sulfidrilo es una modificación postraduccional reversible que afecta la actividad
biológica de las proteínas, constituyendo un proceso importante en la transducción de señales.
Durante la última década, se ha demostrado que la S-nitrosilación modula la función de
proteínas regulatorias, estructurales y metabólicas en animales (Hess et al., 2005). En plantas, se
han identificado numerosas proteínas modificadas por S-nitrosilación in vitro, las cuales regulan
procesos metabólicos, de señalización o relacionados con estrés o con el estado redox celular
(Wang et al., 2006). Sin embargo, resta determinar cuáles de estas proteínas se nitrosilan in vivo
durante procesos fisiológicos de plantas regulados por NO.
La nitración de tirosinas es una modificación covalente resultado de la adición de un
grupo nitro a uno de los dos carbonos orto equivalentes del anillo aromático de residuos de
tirosinas (Gow et al., 2004). En animales, esta modificación se utiliza como marcadora de
enfermedades patológicas y de estrés nitrosativo (Ischiropoulos, 2003). Si bien se conoce poco
acerca de la nitración de tirosinas en proteínas de plantas, se considera que también es un
marcador de estrés nitrosativo (Corpas et al., 2007).
2.1.4. Bioquímica del NO
El NO es un radical libre inestable, pequeño, simple y ubicuo que puede, bajo
condiciones fisiológicas, ganar o perder un electrón hacia estructuras más favorables
energéticamente dependiendo del estado redox, llamadas catión nitrosonio (NO+) y anión
nitroxilo (NO-). El NO posee una vida media relativamente larga (en comparación con otros
radicales libres) de 3-5 segundos en sistemas biológicos (Tuteja et al., 2004). Posee una alta
difusividad (4.8 x 10-5 cm-2 s-1 en H2O) y propiedades hidrofóbicas, por lo que migra fácilmente
en las fases lipídicas de las membranas celulares y difícilmente en las regiones hidrofílicas
como el citoplasma celular.
8
INTRODUCCIÓN
El NO reacciona rápidamente con: (i) oxígeno atmosférico para formar otros óxidos,
incluyendo dióxido de nitrógeno, trióxido de dinitrógeno y peróxido de nitrógeno; los cuales
pueden degradarse a nitrito y nitrato (Neill et al., 2003), (ii) el radical libre superóxido para
formar el anión peroxinitrito, siendo ambos especies reactivas de oxígeno (ROS), (iii) amidas o
tioles celulares como cisteínas o tirosinas (Stamler et al., 2001) o (iv) metales de transición (Cu,
Zn, Fe), especialmente grupos hemo o centros hierro-azufre en proteínas (Stamler et al., 1992).
Debido a la alta reactividad del NO, su actividad biológica se debe considerar conjuntamente
con la de los ROS, que afectan la acumulación y función del NO.
Las plantas regulan finamente el nivel de NO endógeno ya que, además de producirlo,
están expuestas al NO atmosférico. Los mecanismos de detoxificación del NO incluyen la
oxidación de NO a nitrito por hemoglobinas (vía más estudiada) y las enzimas xantina oxidasa,
glutatión peroxidasa y nitrosoglutatión reductasa (Delledonne, 2005).
2.1.5. Dadores y secuestrantes de NO
La mayor parte de la información actual sobre los efectos del NO proviene de estudios
farmacológicos utilizando dadores y secuestrantes de NO. Sin embargo, esta aproximación
metodológica no reproduce exactamente los verdaderos cambios de concentración y
localización del NO dentro de las células. Como consecuencia, es difícil distinguir entre un
efecto fisiológico del NO y una respuesta a un tratamiento farmacológico. Además, los dadores
de NO poseen distintas tasas de liberación y especies de NO liberadas. Por lo tanto, es necesario
realizar ensayos con distintas dosis de diferentes dadores de NO para asegurar fiabilidad y
reproducibilidad de los resultados, para determinar los tratamientos más efectivos y para
establecer comparaciones entre procesos o sistemas experimentales. Para confirmar el rol del
NO en un cierto proceso fisiológico, se puede también administrar NO en forma gaseosa en un
ambiente controlado y utilizar herramientas genéticas. Uno de los mayores desafíos es crear
dadores de NO específicos de células o tejidos con alta estabilidad, mayor vida media y tasa
controlada de liberación de NO (Arasimowicz y Floryszak-Wieczorek, 2007).
9
INTRODUCCIÓN
El dador de NO nitroprusiato de sodio (SNP) es un complejo inorgánico donde el hierro
se encuentra en el estado ferroso y el NO está unido como NO+. El SNP requiere de irradiación
con luz o de reducción de un electrón para liberar NO (Feelisch, 1998). Se ha reportado que una
solución de SNP 100 µM libera en promedio una concentración de 167 nM NO por hora durante
las primeras 48 horas (Beligni y Lamattina, 2002).
El dador de NO S-nitroso N-acetil penicilamina (SNAP) pertenece a la clase de Snitrosotioles, compuestos inestables termodinámica y fotolíticamente (Feelisch, 1998). El SNAP
libera principalmente NO en la forma redox de radical libre sin carga (Hou et al., 1999). Se ha
demostrado que una solución de SNAP 100 µM libera una concentración de 1.4 µM NO por
minuto a 37 °C, la cual es linear a lo largo de un amplio rango de concentraciones (Feelish,
1991).
Las mediciones de las tasas de liberación de NO por ambos dadores indicaron que el
SNAP posee una menor estabilidad (expresada como vida media) y, por lo tanto, una
estimulación más rápida de la respuesta en comparación con el SNP (Floryszak-Wieczorek et
al., 2006).
El secuestrante específico de NO 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline1-oxyl-3-oxide, potassium salt (cPTIO) es un compuesto inestable que oxida el NO a nitrito. Si
bien se ha postulado que el cPTIO es impermeable a las membranas celulares (Espey et al.,
2001), no se conoce aún con precisión si sólo actúa fuera de las células.
2.1.6. Participación del NO en los procesos regulados por auxinas
Hace algunos años, Gouvêa et al. (1997) demostraron que segmentos de raíces de maíz
(Zea mays) responden al NO incrementando sus velocidades de elongación en una manera dosis
dependiente. Debido a que el IAA y el NO promueven la misma respuesta en la planta, los
investigadores propusieron que ambos compuestos podrían compartir pasos en la vía de
transducción de señales.
El NO afecta profundamente la morfología y el patrón de desarrollo de las raíces. El NO
induce la formación de raíces adventicias (FRA) en pepino (Pagnussat et al., 2002) y en Vigna
10
INTRODUCCIÓN
radiata (She y Huang, 2004; Huang et al., 2007). Además, el NO participa en la promoción de
raíces laterales en tomate (Solanum lycopersicum; Correa-Aragunde et al., 2004). Altas
concentraciones de NO producen una inhibición del crecimiento de raíces primarias (CorreaAragunde et al., 2004), mientras que bajas concentraciones inducen la elongación de las mismas
(Gouvêa et al., 1997; Hu et al., 2005). La densidad de pelos radicales se incrementa frente a la
aplicación exógena de NO en varias especies vegetales (Lombardo et al., 2006). El NO media la
respuesta gravitrópica de raíces de soja (Hu et al., 2005).
La Figura 1 muestra que los efectos del NO sobre la morfología y fisiología de las
raíces se distribuyen a lo largo de toda la raíz y de la zona de unión entre la raíz y el hipocótilo.
Todos estos procesos mediados por NO están bajo el control de las auxinas. Más aún, se ha
observado acumulación de NO en respuesta a auxinas durante la FRA, la formación de raíces
laterales y el gravitropismo (Pagnussat et al., 2002; Correa-Aragunde et al., 2004; Hu et al.,
2005).
11
INTRODUCCIÓN
Figura 1. Modelo esquemático que muestra la participación del NO en diferentes procesos del crecimiento
y desarrollo de las raíces. El NO generado endógenamente o aplicado exógenamente regula la fisiología y
desarrollo de la raíz: 1) FRA a partir de células parenquimáticas del floema en la unión de la raíz con el
hipocótilo; 2) formación de raíces laterales a partir de células del periciclo; 3) desarrollo de pelos
radicales en la zona de diferenciación de la raíz; 4) elongación de la raíz primaria: estimulación a bajas
concentraciones e inhibición a altas concentraciones de NO; 5) división celular: el NO regula
positivamente genes promotores del ciclo celular durante la formación de primordios de raíces laterales;
6) respuesta gravitrópica.
2.2. Calcio
El calcio es un nutriente mineral esencial que influencia fuertemente el enraizamiento
(Druart, 1997). Como catión divalente, el Ca2+ cumple funciones estructurales en paredes y
membranas celulares, y actúa como segundo mensajero en vías de señalización intra y
extracelulares. Se ha demostrado que el Ca2+ está involucrado en la división celular y en el
proceso de elongación celular en los primordios radicales (Blazich, 1988). Bellamine et al.
(1998) sugirieron que el Ca2+ juega un rol esencial en el crecimiento y la emergencia de los
primordios de raíces, ya sea como mineral o como segundo mensajero en la vía de transducción
de señales disparada por auxinas.
Diferentes señales endógenas o exógenas desencadenan cambios únicos y específicos en
la [Ca2+]cit. Diversos factores intervienen en el control de dicha especificidad. En primer lugar,
12
INTRODUCCIÓN
se ha observado que una misma señal puede desencadenar diferentes respuestas en distintos
tipos celulares, tejidos u órganos (Kiegle et al., 2000). En segundo lugar, cambios temporales y
espaciales del Ca2+ así como el origen de la señal (proveniente del medio extracelular o de
reservorios intracelulares) contribuyen a determinar la especificidad de la respuesta (McAinsh y
Hetherington, 1998). En tercer lugar, la existencia de una gran variedad de sensores de Ca2+,
cada uno de ellos con un patrón de expresión particular, una localización subcelular determinada
y blancos de acción altamente específicos es otro factor determinante de la especificidad
(Reddy, 2001). La variación de estos factores frente a un estímulo en particular ha sido
denominada calcium signature (Trewavas y Mahló, 1998).
Existen evidencias que indican que el IP3 y la cADPR cumplen un rol fundamental en
elevar la [Ca2+]cit a través de la activación de canales intracelulares de Ca2+ (Navazio et al.,
2001). Se han identificado canales, poros y transportadores de Ca2+ en la membrana plasmática
y nuclear, en el tonoplasto, en la membrana del retículo endoplásmico, en el aparato de Golgi,
en la mitocondria y en el cloroplasto. Muchas de estas proteínas se han caracterizado desde el
punto de vista molecular, mientras que otras sólo por electrofisiología (Sanders et al., 2002).
2.3. Quinasas de proteína
2.3.1. Quinasas de proteína dependientes de Ca2+
Las quinasas de proteína dependientes de Ca2+ (CDPKs; EC 2.7.1.37) son una familia
de quinasas de serina y treonina distribuidas en plantas vasculares y no vasculares, en algas
verdes y en protozoos (Klimecka y Muszyńska, 2007). Las CDPKs han sido implicadas en el
control de numerosos aspectos del crecimiento y desarrollo de las plantas, y en múltiples vías de
transducción de señales. Se han identificado isoformas de CDPKs en todo el reino vegetal
(Hrabak, 2000; Harmon et al., 2001). El genoma de Arabidopsis contiene una familia génica con
34 miembros que codifican para CDPKs con homología de secuencia entre sí (Harmon et al.,
2001). Cada isoforma exhibe características particulares de unión a Ca2+ y de localización
subcelular, decodificando un subgrupo de señales de Ca2+ (Harmon et al., 2000). Todas las
CDPKs clonadas hasta el presente poseen un dominio amino terminal de longitud y secuencia
13
INTRODUCCIÓN
variable
(que
frecuentemente
presenta
secuencias
consenso
de
miristoilación
y/o
palmitoilación), un dominio catalítico de quinasa de proteínas de serina y treonina, un dominio
regulatorio similar a la calmodulina que une Ca2+ en cuatro (o menos) motivos hélice-vueltahélice denominados “manos EF” y una secuencia autoinhibitoria que se une al sitio activo en
ausencia de Ca2+. Esta estructura molecular única permite que las CDPKs sean reguladas por
Ca2+ en forma directa (Harmon et al., 2000). En condiciones normales, la [Ca2+]cit es mantenida
a bajos niveles (10-200 nM), asegurando una actividad CDPK basal. Un gran número de
estímulos bióticos y abióticos desencadena un incremento en la [Ca2+]cit, resultando en la
activación de ciertas CDPKs (Harmon et al., 2000; Hrabak, 2000). Las CDPKs han sido
detectadas en el citosol, en el núcleo, como también en asociación con el citoesqueleto, o con
membranas microsomales o plasmáticas (Hrabak, 2000). Los potenciales blancos de acción de
las CDPKs incluyen enzimas solubles, factores de transcripción, canales y bombas iónicas, y
proteínas citoesqueléticas (Harmon et al., 2000; Hrabak, 2000).
2.3.2. Quinasas de proteína activadas por mitógenos
Las cascadas de fosforilación de MAPK transducen estímulos extracelulares en
respuestas intracelulares en mamíferos, levaduras y plantas. El módulo básico de una cascada de
MAPK consiste en tres quinasas de proteína funcionalmente interconectadas, una MAP quinasa
quinasa quinasa (MAPKKK), una MAP quinasa quinasa (MAPKK) y una MAPK (Colcombet y
Hirt, 2008). Cada quinasa de proteína constituye una familia de proteínas, multiplicidad que
contribuye a la especificidad de la señal transmitida. La activación de MAPKs ocurre por
fosforilación, catalizada por MAPKKs, de sus residuos de treonina y tirosina en la secuencia
TXY (donde X=E, P, D o G) dentro de su dominio de activación. Por su parte, las MAPKKs son
fosforiladas en el dominio SXXXS/T por MAPKKKs (Colcombet y Hirt, 2008). Luego de su
activación, las MAPKs se translocan desde el citoplasma al núcleo y fosforilan factores de
transcripción, lo que conlleva a cambios en la expresión génica (Yang et al., 1998). En plantas,
las cascadas de MAPKs señalizan estreses bióticos y abióticos y estímulos hormonales (Pedley
y Martin, 2005; Samaj et al., 2004). En Arabidopsis, se han identificado 20 genes que codifican
14
INTRODUCCIÓN
para MAPKs (denominados MPK), 10 genes que codifican para MAPKKs (denominados
MKK) y 60 genes que codifican para MAPKKKs (Colcombet y Hirt, 2008).
2.4. Fosfolípidos
En los últimos años se ha descubierto que ciertos fosfolípidos (PLs), además de ser
componentes de las membranas celulares, forman parte de mecanismos de transducción de
señales acumulándose rápida y transientemente en respuesta a una gran variedad de estímulos.
El PL ácido fosfatídico (PA) se ha descripto como un segundo mensajero en plantas. Se
produce en respuesta a estreses abióticos (Munnik, 2001) y bióticos (Laxalt y Munnik, 2002).
Las fuentes enzimáticas de producción de PA involucran la enzima fosfolipasa D (PLD) y la vía
que involucra las enzimas fosfolipasa C (PLC) y diacilglicerol quinasa (DGK; Figura 2). La
enzima PLC (EC 3.1.4.11) hidroliza los PLs señales fosfatidilinositol fosfato (PIP) o
fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) para generar los segundos mensajeros diacilglicerol (DAG)
e inositol 1,4-bisfosfato (IP2) o IP3, respectivamente (Figura 2A). IP2 puede ser
subsecuentemente fosforilado a IP3, e IP3 promueve la liberación de Ca2+ desde reservorios
intracelulares y un incremento en la [Ca2+]cit (Bootman et al., 2001). El DAG es fosforilado a
PA a través de la acción de la enzima DGK (Figura 2A; Munnik et al., 1998). La otra vía de
producción de PA en plantas es la enzima PLD (EC 3.1.4.4). PLD hidroliza PLs estructurales
como fosfatidilcolina (PC) o fosfatidiletanolamina (PE) en la unión fosfodiester terminal para
producir PA y un grupo funcional R libre (Figura 2B; Wang, 2000).
El PA es un PL minoritario, representando un 1-2 % de los PLs totales de una célula
eucariota (Munnik, 2001). Por su parte, los isómeros de PIP (PI3P, PI4P, y PI5P) y de PIP2
[PI(3,5)P2, PI(4,5)P2, y PI(3,4)P2] identificados en plantas (Brearley y Hanke, 1993; Munnik et
al., 1994; Meijer et al., 2001) representan en conjunto menos del 1 % de los PLs totales (van
Leeuwen et al., 2004), siendo la razón PIP: PIP2 dentro del rango de 10:1 a 100:1 (Munnik et
al., 1994; 1998).
15
INTRODUCCIÓN
3. Raíces adventicias
3.1. Generalidades
El sistema radical es importante para el crecimiento y la supervivencia de las plantas por
su rol como soporte físico, y en la adquisición de agua y nutrientes del suelo. Para incrementar
la superficie de absorción las plantas pueden desarrollar raíces adventicias, raíces laterales y/o
pelos radicales. Las raíces adventicias emergen de tallos jóvenes o hipocótilos y pueden
formarse durante el normal desarrollo de las plantas (por ejemplo en monocotiledóneas) o por
estrés mecánico, como en la mayoría de las dicotiledóneas (Osmont et al., 2007). Las raíces
adventicias poseen generalmente un origen endógeno, formándose cerca de los tejidos
vasculares y creciendo a través de los tejidos situados por fuera del punto de origen. Los
primordios de las raíces adventicias se inician por divisiones de células del parénquima
interfascicular, las cuales son similares a las divisiones que dan origen a las raíces laterales en el
periciclo de raíces. Por lo tanto, las raíces adventicias emergen cerca del xilema o del floema.
Las raíces adventicias pueden producir raíces laterales (Osmont et al., 2007).
3.2. Rol de las auxinas en la formación de raíces adventicias
Poco después de determinar que las auxinas promueven la elongación celular, se
descubrió su efecto inductor sobre la FRA utilizando explantos de uva (Vitis labrusca;
Thimann, 1938). Este descubrimiento dio lugar a una de las aplicaciones prácticas más
importantes de las auxinas. Subsecuentemente, surgió un gran número de publicaciones
detallando los mejores métodos de tratamiento y los compuestos más activos para cada especie
vegetal.
La FRA involucra el desarrollo de un tejido meristemático luego de la remoción del
sistema radical primario. La auxina IAA promueve este proceso a través de la regulación de la
dediferenciación celular, reestableciendo el nuevo meristema apical (Doerner, 2000). Aunque
una variedad de componentes del transporte y de la transducción de señales mediada por
auxinas han sido identificados, gran parte de los mecanismos moleculares e intermediarios que
conducen al enraizamiento permanecen aún por dilucidar.
17
INTRODUCCIÓN
Figura 2. Esquema que muestra las vías enzimáticas de producción de ácido fosfatídico (PA) en plantas.
(A) La enzima fosfolipasa C (PLC) hidroliza los PLs señales fosfatidilinositol fosfato (PIP) o
fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) para generar los segundos mensajeros diacilglicerol (DAG) e
inositol 1,4-bisfosfato (IP2) o inositol 1,4,5-trifosfato (IP3), respectivamente. El DAG es fosforilado a PA
a través de la acción de la enzima DGK. (B) La enzima fosfolipasa D (PLD) hidroliza PLs estructurales
como fosfatidilcolina (PC) o fosfatidiletanolamina (PE) para producir PA.
2.5. ATP extracelular
La adenosina trifosfato (ATP) es la fuente energética esencial y ubicua de las células,
con una concentración intracelular aproximada de 1-2 mM (Drury y Szent-Gyorgyi, 1929). El
ATP extracelular (eATP) se ha descripto como una molécula señal tanto en animales como en
plantas (Zimmermann, 2000; Roux y Steinebrunner, 2007). En animales, el eATP participa en la
regulación de una variedad de procesos tales como la presión sanguínea, la respuesta inmune, la
neurotransmisión, el crecimiento y la viabilidad celular (Ralevic y Burnstock, 1998). En plantas,
el eATP está involucrado en diversos procesos tales como: i) viabilidad celular (Chivasa et al.,
2005), ii) transporte polar de auxinas, gravitropismo y formación de raíces laterales (Tang et al.,
2003), iii) regulación de la [Ca2+]cit (Demidchik et al., 2003; Jeter et al., 2004; Wu et al., 2008;
Wu y Wu, 2008), iv) inducción de transcriptos de MAPKs y de genes relacionados con la
síntesis y la señalización por etileno (Jeter et al., 2004), v) estrés mecánico y formación de ROS
vía activación de la enzima NADPH oxidasa (Song et al., 2006; Wu et al., 2008) y vi)
producción de NO vía la actividad de NR y/o NOS (Foresi et al., 2007; Wu y Wu, 2008).
16
INTRODUCCIÓN
3.3. ¿Por qué estudiar el efecto del NO sobre la formación de raíces adventicias?
El estudio del efecto del NO sobre la FRA comenzó en el año 2000 cuando en nuestro
laboratorio se estaban realizando ensayos para determinar el rol del NO en la de-etiolación de
cotiledones de pepino crecidos en oscuridad. Los sistemas radicales de las plántulas de pepino
se removieron para evitar que las señales derivadas de la raíz interfieran con la respuesta de deetiolación. Luego de algunos días de tratamiento, se observó que aquellos pepinos etiolados que
habían sido tratados con NO poseían mas raíces adventicias que aquellos no tratados. Esto
originó la siguiente pregunta: ¿Por qué los explantos de pepino tratados con NO inducen la
FRA? Desde entonces, se intenta responder dicha pregunta estudiando principalmente la
relación entre las auxinas y el NO. En la presente tesis se describen e interpretan algunos de los
mecanismos bioquímicos y componentes moleculares activados por auxinas y NO que conducen
al enraizamiento, utilizando explantos de pepino como modelo experimental.
3.4. Importancia del proceso de formación de raíces adventicias
El cultivo in vitro de tejidos vegetales es una herramienta fundamental para la
propagación de plantas con aplicación tanto en el área de producción agronómica y forestal
como en el mejoramiento de cultivos y la mantención de germoplasma. Un paso crítico para la
reproducción vegetativa lo constituye la inducción del proceso de FRA (Moncousin, 1992).
Existen numerosas especies que presentan dificultades vinculadas a la inducción del
enraizamiento (Moncousin, 1992). Como consecuencia, problemas asociados con el
enraizamiento de los explantos resultan frecuentemente en pérdidas económicas significativas
(De Klerk et al., 1999). La inducción del enraizamiento por medio de la aplicación de NO
genera nuevas posibilidades en el área de producción vegetal y, en especial, en la propagación
vegetativa de especies recalcitrantes a la FRA.
18
INTRODUCCIÓN
4. Antecedentes sobre la formación de raíces adventicias en pepino y especies
leñosas
4.1. El NO actúa por debajo de las auxinas
Las auxinas inducen un incremento en la concentración endógena de NO en la base de
los hipocótilos de pepino (Pagnussat et al., 2002). En concordancia, la FRA inducida por
auxinas es revertida por aplicación del secuestrante específico de NO cPTIO (Pagnussat et al.,
2002). Para corroborar que el NO es un segundo mensajero de la vía de transducción de señales
de auxinas, se realizaron experimentos depletando de auxinas endógenas los explantos de
pepino a través de la anulación de la producción apical de IAA por decapitación y del bloqueo
del transporte basípeto de auxinas por el tratamiento con ácido 1-naftilftalámico (NPA). La
FRA se redujo significativamente en los explantos depletados de auxinas endógenas (Pagnussat
et al., 2003). Este efecto inhibitorio fue revertido por NO, sugiriendo que el IAA y el NO actúan
a través de una vía de señalización lineal. En conjunto, estos resultados indicaron que el NO
opera por debajo de las auxinas induciendo la FRA en explantos de pepino (Figura 3A).
4.2. El cGMP es un segundo mensajero
Debido a que el NO activa la enzima GC en animales, se analizó la participación del
mensajero cGMP en la FRA inducida por auxinas y NO. El inhibidor de GC 6-anilinoquinoline5,8-quinone (LY83583) redujo el desarrollo de raíces adventicias mediado por IAA o NO,
mientras que el análogo de cGMP permeable a la membrana plasmática 8-Br-cGMP revirtió
este efecto (Pagnussat et al., 2003). La concentración endógena de cGMP está regulada por la
síntesis vía GC y la degradación vía actividad de la enzima fosfodiesterasa. El inhibidor de
fosfodiesterasa sildenafil citrato fue capaz de inducir per se la FRA tanto en explantos no
depletados como depletados de auxinas endógenas (Pagnussat et al., 2003). Estas evidencias
indican que las auxinas y el NO promueven la FRA a través de la síntesis de cGMP catalizada
por GC (Figura 3A).
19
INTRODUCCIÓN
4.3. Compuestos que afectan la formación de raíces adventicias en pepino
Al inicio de la presente tesis, sólo se habían reportado compuestos que inhibían el
proceso de FRA en pepino. Éstos son las hormonas brasinosteroides (Adam y Marquardt, 1986)
y citoquininas (Kuroha et al., 2002) y el aminoácido metoxibencilglutamina (Satoh et al., 1998;
Figura 3A).
4.4. Estudio anatómico
Resultados previos mostraron que luego de 3 días de la remoción del sistema radical
primario, la emergencia de primordios de raíces adventicias fue detectada en explantos de
pepino tratados con IAA o con NO, mientras que al mismo tiempo ningún primordio radical se
detectó en explantos tratados con H2O (Figura 3B; ML Lanteri, Tesis de Grado, 2003).
20
INTRODUCCIÓN
Figura 3. Antecedentes sobre la FRA en explantos de pepino. (A) En color rojo se muestra la vía de
señalización regulada por NO y cGMP previamente reportada en nuestro laboratorio (las flechas sólidas
indican vías enzimáticas, las flechas punteadas indican activación directa o indirecta y ⊥ indica
inhibición) y en color azul se muestran los compuestos que inhiben el proceso de FRA. NPA, ácido 1naftilftalámico; LY83583, 6-anilinoquinoline-5,8-quinone; C, cotiledón; H, hipocótilo; RA, raíz
adventicia. Barra=5 mm. (B) Se muestra la formación de primordios de raíces adventicias (PRs) en
secciones transversales de hipocótilos tratados por 3 días con IAA o NO. Las fotografías están
magnificadas X100 (Barra=0.2 mm) y los insets X400 (Barra=0.05 mm). MC, células meristemáticas; P,
parénquima; PH, floema; VP, parénquima vascular; X, xilema. Las flechas indican las MC o RP
magnificadas en los insets. Adaptado de ML Lanteri, Tesis de Grado, 2003.
4.5. El NO induce la formación de raíces adventicias en especies leñosas
En nuestro laboratorio se observó que explantos de especies leñosas como lavanda
(Lavanda dentata) y ciprés (Chamaecyparis spp.) desarrollan más raíces adventicias cuando son
21
INTRODUCCIÓN
tratados con el dador de NO SNP (Lamattina et al., 2003). El tratamiento con NO también
incrementó en un 100 % la tasa de supervivencia de los explantos luego de 60 días de
tratamiento (Lamattina et al., 2003). Estas evidencias proveen una base experimental para el uso
de NO como método para mejorar el enraizamiento en explantos. Sin embargo, se requieren más
estudios para desarrollar un producto comercial capaz de liberar NO bajo condiciones
controladas durante la propagación vegetativa de cultivos.
22
OBJETIVOS E HIPÓTESIS DE TRABAJO DE LA PRESENTE TESIS
Objetivo general
Profundizar el estudio del mecanismo de acción del NO para inducir la formación de
raíces adventicias.
Objetivos particulares
1.
Evaluar los efectos de la luz, la oscuridad, la depleción de auxinas endógenas y
la remoción de parte de los explantos de pepino sobre la formación de raíces adventicias
inducida por auxinas y NO.
2.
Analizar la participación de quinasas de proteína inducidas por mitógenos en la
vía de señalización inducida por auxinas y NO que conduce a la formación de raíces adventicias
en explantos de pepino. Determinar su relación con la vía dependiente de cGMP.
3.
Analizar la participación del Ca2+ y de quinasas de proteína dependientes de
Ca2+ durante la formación de raíces adventicias inducida por auxinas y NO en explantos de
pepino. Determinar su relación con la vía dependiente de cGMP.
4.
Estudiar vías de señalización reguladas por fosfolípidos durante la formación de
raíces adventicias inducida por auxinas y NO en explantos de pepino.
5.
Determinar si el ATP extracelular induce la formación de raíces adventicias en
explantos de pepino, evaluando su dependencia de NO endógeno.
Hipótesis de trabajo
El NO promueve el desarrollo de raíces adventicias, en numerosas especies vegetales,
induciendo vías de señalización dependientes e independientes de cGMP que involucran la
participación de Ca2+ y de actividades enzimáticas (quinasas de proteínas, fosfolipasas, etc)
modulando así los niveles endógenos de diversos mensajeros celulares.
23
1. Material vegetal
1.1. Condiciones generales de crecimiento de las plántulas de pepino
Las semillas de pepino (Cucumis sativus L. cv ´Poinsett 76´) se germinaron en cajas de
Petri conteniendo un papel de filtro embebido en H2O. Las plántulas (Figura 4) se mantuvieron
a 25 ºC por 7-10 días con un fotoperíodo de 14 horas luz/ 10 horas oscuridad y una radiación
fotosintéticamente activa de 200 μmol m-2 s–1. Luego, se removieron los sistemas radicales
primarios (PR) de las plántulas y los explantos resultantes (Figura 4) se mantuvieron en las
condiciones ya descriptas por diferentes períodos y en presencia de distintos compuestos según
se indica en cada experimento. Luego de 4-6 días de tratamiento, se cuantificaron distintos
parámetros de crecimiento en los explantos enraizados (Figura 4). Como se observa en la Figura
4, las raíces adventicias (RAs) emergen de la zona basal de los hipocótilos (H) de dichos
explantos.
Figura 4. Diseño experimental utilizado para evaluar la FRA en explantos de pepino. El sistema radical
primario (PR) de plántulas de pepino de 7 días se removió y se obtuvieron explantos. Las raíces
adventicias (RAs) emergen de la base de los hipocótilos (H), luego de 4-6 días de tratamiento.
C=cotiledón. Barra=5 mm.
1.2. Ensayos de enraizamiento con los explantos de pepino
Luego de la remoción de los sistemas radicales primarios, los explantos de pepino se
incubaron en placas de Petri conteniendo un papel de filtro embebido en distintos compuestos
según se indica en cada experimento. Alternativamente, los explantos se trataron por tiempos
cortos en tubos eppendorf de 0,5 mL y luego se transfirieron a placas de Petri conteniendo un
papel de filtro embebido en H2O.
24
Las concentraciones de los compuestos y los tiempos de tratamiento utilizados se
seleccionaron de acuerdo con resultados previos obtenidos en nuestro laboratorio (Pagnussat et
al., 2002; 2003) o luego de una puesta a punto tomando como referencia concentraciones
utilizadas en la bibliografía disponible. Cada puesta a punto se realizó tratando explantos de
pepino con diferentes dosis del compuesto a evaluar para determinar aquella/s que produce/n un
efecto significativo en la FRA sin afectar el normal crecimiento y fenotipo de los explantos.
Luego de 4-6 días de tratamiento se cuantificó el número y/o la longitud de raíces
adventicias por explanto, considerando solamente aquellas que poseían una longitud igual o
mayor a 1 mm.
1.2.1. Evaluación del enraizamiento en presencia de auxinas y NO
Explantos de pepino se incubaron en placas de Petri embebidas en H2O (control), en
distintas concentraciones de la auxina IAA (Fluka, Buchs, Suiza) o en distintas concentraciones
de los dadores de NO SNP (Merck, Darmstadt, Alemania) y SNAP (Calbiochem, San Diego,
USA), tanto en presencia como en ausencia de 200 μM del secuestrante específico de NO
cPTIO (Molecular Probes, Oregon, EEUU).
1.2.2. Evaluación del enraizamiento en presencia de luz y oscuridad
Semillas de pepino se germinaron en placas de Petri conteniendo papel de filtro
embebido en H2O y se mantuvieron a 25 ºC por 7 días bajo luz (fotoperíodo de 14 horas luz/ 10
horas oscuridad) u oscuridad continua. Se removieron luego los sistemas radicales primarios de
las plántulas y los explantos resultantes se mantuvieron en las mismas condiciones por 4 días en
presencia de H2O (control), IAA 10 µM o SNP 10 µM. Se realizó un tratamiento control con
SNP en presencia de cPTIO 200 µM.
25
1.2.3. Evaluación del enraizamiento en presencia del inhibidor permeable de
MAPK quinasa PD098059
Explantos de pepino se incubaron en placas de Petri embebidas en H2O (control) o en 2(2-amino-3-metoxifenil)-oxanaftalen-4-one (PD098059; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) a 10
μM, 50 μM o 100 μM, tanto en presencia como en ausencia de SNP 10 μM o de IAA 10 μM.
Luego de 4 o 5 días de tratamiento, se cuantificó el número y/o la longitud de las raíces
adventicias.
1.2.4. Evaluación del enraizamiento en presencia de quelantes de Ca2+ extracelular
o de inhibidores de canales de Ca2+
Plántulas de pepino de 7 días se preincubaron durante 2 horas en presencia de: 1) etilen
glicol-bis(2-aminoetileter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético (EGTA) o 1,2-bis(o-aminofenoxi)etanoN,N,N′,N′-ácido tetraacético tetra(acetoximetil) ester (BAPTA-AM), quelantes de Ca2+
impermeable y permeable a la membrana plasmática, respectivamente; 2) hidrocloruro de
metoxiverapamil (MV), rojo rutenio (RR) o nicotinamida (NA) que inhiben la liberación de
Ca2+ desde canales sensibles a cADPR; 3) cloruro de litio (LiCl) o sulfato de neomicina (NEO)
que bloquean canales de Ca2+ regulados por IP3; o 4) cloruro de lantano (LaCl3) que actúa sobre
canales de Ca2+ de membrana plasmática. Todos estos reactivos se compraron en Sigma-Aldrich
(St. Louis, USA); excepto BAPTA-AM que se compró en Calbiochem (San Diego, USA). Las
especificidades y concentraciones utilizadas de los inhibidores se detallan en el Capítulo III.
Luego de esta preincubación, se removieron los sistemas radicales primarios y los explantos
resultantes se incubaron en cajas de Petri conteniendo un papel de filtro embebido sólo en los
diferentes inhibidores, o junto con IAA 10 μM o con SNP 10 μM.
26
1.2.5. Evaluación del enraizamiento en presencia de antagonistas de calmodulina
permeables
Plántulas de pepino de 7 días se preincubaron durante 2 horas en presencia de 100 μM
de los antagonistas de calmodulina permeables a la membrana plasmática dihidrocloruro de
trifluoperazina (TFP), hidrocloruro de N-(6-aminohexil)-5-cloro-1-naftalensulfonamida (W-7) o
hidrocloruro de clorpromazina (CPZ). Estos reactivos se compraron en Sigma-Aldrich (St.
Louis, USA). Luego de la preincubación, se removieron los sistemas radicales primarios y los
explantos resultantes se incubaron en cajas de Petri conteniendo un papel de filtro embebido
sólo en los diferentes antagonistas, o junto con IAA 10 μM o con SNP 10 μM.
1.2.6. Evaluación del enraizamiento en presencia de alcoholes y fosfolípidos
Explantos de pepino se trataron por diferentes tiempos en tubos Eppendorf de 0.5 mL
conteniendo buffer (MES-KOH 5 mM pH 6, KCl 1 mM) más 0.02 % (v/v) 1,1,1,3,5,5,5heptametiltrisiloxanil propilmetoxi-poli[etilen óxido] (Silwet L-77; Lehle Seeds, Texas, USA)
en presencia de diferentes compuestos. Luego, se transfirieron a cajas de Petri embebidas en
H2O por 5 días. El detergente Silwet L-77 se agregó para incrementar la penetración de los
reactivos a las células, excepto para los tratamientos con los PLs ácido fosfatídico (PA),
fosfatidilcolina (PC) o fosfatidilserina (PS). El tratamiento control con buffer más Silwet L-77
no causó un efecto significativo en ninguno de los experimentos realizados.
Se probaron volúmenes equivalentes de los solventes utilizados para resuspender las
auxinas y los dadores de NO para confirmar que los solventes no interfieran con las respuestas a
los distintos tratamientos. En particular, etanol (EtOH) 0.002 % (v/v) y dimetilsulfóxido
(DMSO) 0.5 % (v/v) fueron las concentraciones finales equivalentes a las alcanzadas en los
tratamientos con IAA 10 μM y SNAP 500 μM, respectivamente. Los solventes se compraron en
Merck (Darmstadt, Alemania).
Adicionalmente, los explantos se trataron con cPTIO 200 μM, o 1-butanol o 2-butanol a
0.1 % o 0.5 % (v/v) en presencia o ausencia de IAA 10 μM o SNAP 500 μM. Debido a que la
27
aplicación de alcoholes puede alterar varios procesos celulares (Dhonukshe et al., 2003), se
eligió la concentración de 1-butanol 0.1 % (v/v) como la menor que fue efectiva en bloquear la
FRA. Se utilizó como control una solución de SNAP 500 μM inactivada en luz por 15 días, para
asegurar la descomposición completa antes del tratamiento de los explantos (la vida media para
SNAP bajo iluminación continua es de 3 horas, Floryszak-Wieczorek et al., 2006). Los
alcoholes 1-butanol y 2-butanol se compraron en Merck (Darmstadt, Alemania).
Por otra parte, los explantos se trataron por 1 hora con buffer o con buffer más 5 μM de
los siguientes PLs: PA C8:0 (1,2-Dioctanoyl-sn-glycerol 3-phosphate sodium salt), PC C8:0
(1,2-Dioctanoyl-sn-glycerol 3-phosphocholine sodium salt), PA C16:0 (1,2-Dipalmitoyl-snglycerol 3-phosphate sodium salt), PC C16:0 (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerol 3-phosphocholine),
PA C18:1 (1,2-Dioleoyl-sn-glycerol 3-phosphate sodium salt) o PS C18:1 (1,2-Dioleoyl-snglycerol 3-phosphoserine sodium salt). Los lípidos se compraron en Avanti Polar Lipids
(Birmingham, USA), excepto PA C8:0 y PC C8:0 que se compraron en Sigma-Aldrich (St.
Louis, USA). Los lípidos se disolvieron en CHCl3 (Merck, Darmstadt, Alemania) y se secaron
en savant. Se agregó luego la cantidad apropiada de Tris-HCl 10 mM pH 7.5 para las soluciones
stock de lípidos. Las soluciones se hidrataron por 30 minutos a temperatura ambiente y se
sonicaron antes de ser usadas.
1.2.7. Evaluación del enraizamiento en presencia de ATP extracelular
Explantos de pepino se incubaron en placas de Petri embebidas en H2O (control) o en
diferentes concentraciones de ATP, tanto en presencia como en ausencia de cPTIO o del
antagonista no específico de receptores de tipo P2X piridoxal-fosfato-6-azofenil 2’,4’disulfonato (PPADS). Como control, los explantos se trataron con adenosina monofosfato
(AMP), adenosina difosfato (ADP), citosina trifosfato (CTP) o con el análogo de ATP no
hidrolizable adenosina 5’-[γ-tio]trifosfato tetralitio sal (ATP-γ-S). Luego de 5 días de
tratamiento, se cuantificó el número y/o la longitud de las raíces adventicias. Todos estos
reactivos se compraron en Sigma-Aldrich (St. Louis, USA).
28
2. Medición del contenido de IAA libre
El contenido de IAA libre se determinó en el laboratorio de la Dra. Eny Floh
(Departamento de Botánica, Universidad de San Pablo, Brasil) de acuerdo a Silveira et al.
(2004). Dos muestras de hipocótilos (0.7 g peso fresco cada una) de cada tratamiento se
homogeneizaron en 5 mL de buffer de extracción [etanol 80 % (v/v) + polivinilpirrolidona-40 1
% (p/v)]. Las muestras extraídas se transfirieron a tubos Falcon de 15 mL y se agregó IAA [3H]
como estándar interno radiactivo. Luego de 90 minutos de incubación, las muestras se
centrifugaron durante 15 minutos a 4 °C y a 15500 g. Los sobrenadantes se concentraron en
savant a 45 °C hasta un 20 % del volumen inicial. Los volúmenes se llevaron a 3 mL y el pH se
ajustó a 2.5 utilizando HCl 1 N. Las muestras se particionaron dos veces usando éter etílico
como solvente orgánico. Las fases orgánicas se combinaron y transfirieron a nuevos tubos, y los
residuos acuosos se eliminaron por congelamiento de los tubos durante 5 segundos en N2
líquido. Las fases orgánicas conteniendo IAA se secaron en savant a 45 °C y se disolvieron en
300 μL de metanol 100 %. Se transfirieron luego a tubos Eppendorf y se almacenaron a -20 °C.
Alícuotas de 40 μl se analizaron por HPLC (High performance liquid chromatography) en fase
reversa usando una columna de 5 μm C18 (Shimadzu Shinpack CLC ODS). El gradiente se
desarrolló mezclando proporciones crecientes de metanol absoluto a una mezcla de metanol 10
% (v/v) + ácido acético 0.5 % (v/v) en H2O. El contenido de IAA se cuantificó usando un
detector fluorescente a 280 nm (excitación) y 350 nm (emisión). Las fracciones conteniendo
IAA se colectaron y analizaron en un contador de centelleo líquido Packard Tri-Carb para
estimar las pérdidas.
3. Depleción de auxinas endógenas
La depleción de auxinas endógenas se llevó a cabo según Pagnussat et al. (2003).
Brevemente, se removieron los meristemas caulinares (decapitación) localizados entre los
cotiledones de plántulas de pepino de 7-10 días. Las plántulas decapitadas se preincubaron por 2
días en presencia de 10 μM del bloqueante del transporte polar de auxinas NPA (Chem Service,
29
New Orleans, USA). Finalizada esta preincubación, se removieron los sistemas radicales
primarios y los explantos resultantes se mantuvieron por 4 días en presencia de NPA 10 μM y
de diferentes tratamientos.
4. Preparación de extractos proteicos solubles totales
Los hipocótilos de explantos de pepino tratados según se indica en cada experimento
fueron cosechados, pesados, inmediatamente congelados en N2 líquido y almacenados a -80 ºC
hasta su uso. Los homogenatos se prepararon moliendo el material vegetal en mortero bajo N2
líquido y suspendiendo el polvo obtenido en 3 volúmenes de buffer de extracción (3 mL de
buffer por gramo de peso fresco) conteniendo Tris-HCl 50 mM pH 7.5, EDTA 5 mM, EGTA 5
mM, DTT 2 mM, Na3VO4 10 mM, NaF 10 mM, ß-glicerolfosfato 50 mM, PMSF 20 μM,
aprotinina 0.2 μg/mL y leupeptina 0.2 μg/mL. Los extractos se centrifugaron en tubos
Eppendorf a 4 °C y a 13000 rpm, durante 15 minutos. Los sobrenadantes se transfirieron a
nuevos tubos y se utilizaron inmediatamente para las mediciones de actividad quinasa de
proteína soluble total. Todos estos reactivos se compraron en Sigma-Aldrich (St. Louis, USA).
5. Cuantificación de proteínas
El contenido proteico se midió de acuerdo con el método de Bradford (1976) utilizando
seroalbúmina bovina (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) como proteína estándar.
6. Ensayos de actividad quinasa de proteína
6.1. Ensayo en gel de actividad quinasa de proteína activada por mitógenos
Los ensayos de actividad MAPK en gel se realizaron de acuerdo con el protocolo
descripto por Zhang y Klessig (1997), con pequeñas modificaciones. Extractos conteniendo 10
μg de proteína se sometieron a electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 12
% (p/v) con SDS al 10 % (p/v) utilizando 0.25 mg/mL de proteína básica de mielina (MBP;
Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) como sustrato en el gel separador. Luego de las electroforesis,
30
los geles se lavaron a temperatura ambiente con buffer de lavado (Tris-HCl 25 mM pH 7.5,
DTT 0.5 mM, Na3VO4 0.1 mM, NaF 5 mM, BSA 0.5 mg/mL y Triton X-100 0.1 % [v/v]) 3
veces por 30 minutos cada uno. Las proteínas presentes en los geles se sometieron a un proceso
de renaturalización mediante una incubación en buffer de renaturalización conteniendo Tris-HCl
25 mM pH 7.5, DTT 1 mM, Na3VO4 0.1 mM y NaF 5 mM durante toda la noche a 4 °C con 3
cambios adicionales de buffer. Posteriormente, los geles se incubaron por 60 minutos a
temperatura ambiente en 30 mL de buffer de reacción conteniendo Tris-HCl 25 mM pH 7.5,
MgCl2 12 mM, DTT 1 mM, Na3VO4 0.1 mM, EGTA 2 mM y ATP 200 nM, ATP [γ-32P] 50 μCi
(6000 Ci/mmol; Perkin-Elmer, Massachusetts, USA). Las reacciones se finalizaron transfiriendo
el gel a una solución conteniendo ácido tricloroacético 5 % (p/v)/ NaPPi 1 % (p/v). El ATP [γ32
P] no incorporado se removió lavando con la misma solución por al menos 6 horas con 5
cambios. Los geles se secaron en vacío a 80 ºC durante 1 hora y se expusieron a películas de
rayos X (Kodak X-OMAT AR). Se usaron marcadores de peso molecular preteñidos (Bio-Rad,
California, USA) para estimar el peso molecular de las quinasas de proteína detectadas en las
autorradiografías. Los reactivos utilizados para la preparación de los buffers se compraron en
Sigma-Aldrich (St. Louis, USA).
6.2. Ensayo en gel de actividad quinasa de proteína dependiente de Ca2+
Los ensayos de actividad CDPK en gel se realizaron de acuerdo con lo descripto en el
punto 6.1 excepto que: i) los geles se copolimerizaron con Histona IIIS 0.25 mg/mL (SigmaAldrich, St. Louis, USA) como sustrato de CDPK y ii) los geles se incubaron con buffer de
reacción conteniendo EGTA 2 mM o CaCl2 2 mM para detectar aquellas señales que eran
dependientes de Ca2+.
6.3. Ensayo in vitro de actividad quinasa de proteína activada por mitógenos
La actividad MAPK se determinó in vitro midiendo la incorporación de fosfato a la
MBP (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final
de 15 μL, conteniendo 12 μL de muestra y 3 μL de una mezcla de reacción con MBP 0.25
31
mg/mL, Tris-HCl 25 mM pH 7.5, MgCl2 5 mM, EGTA 1 mM y DTT 1 mM. Las reacciones se
iniciaron con el agregado de ATP [γ-32P] 0.5 μCi (6000 Ci/mmol; Perkin-Elmer, Massachusetts,
USA). Luego 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, se sembraron 10 μL de la
mezcla en cuadrados de papel de fosfocelulosa P81 (Whatman, Maidstone, UK) y la reacción se
detuvo por inmersión en H3PO4 150 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). Luego de lavar con
H3PO4 150 mM, los cuadrados de papel se trataron con acetona para facilitar el secado y la
radiactividad presente se contó con un contador de centelleo líquido Beckman LS 7000 como se
describe en Ulloa et al. (1991). Los reactivos utilizados para la mezcla de reacción se compraron
en Sigma-Aldrich (St. Louis, USA).
6.4. Ensayo in vitro de actividad quinasa de proteína dependiente de Ca2+
La actividad CDPK in vitro se ensayó de acuerdo con el procedimiento de Roskoski
(1983) con modificaciones menores. Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de
30 μL, siendo 10 μL de muestra, 15 μL de mezcla de reacción y 5 μL de ATP 100 μM más ATP
[γ-32P] 0.7 μCi (6000 Ci/mmol; Perkin-Elmer, Massachusetts, USA). La mezcla de reacción
contenía 25 μM del péptido sintético syntide-2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) como sustrato,
Tris-HCl 20 mM pH 7.5, MgCl2 10 mM, DTT 1 mM y, CaCl2 5 μM o EGTA 500 μM según se
indica. La secuencia del péptido syntide-2 es PLARTLSVAGLPGKK (motivo de fosforilación
subrayado) y deriva de una región fosforilable de la glucógeno sintasa. Las reacciones se
iniciaron con los 5 μL de ATP frío y ATP [γ-32P]. Luego de 15 minutos de incubación a
temperatura ambiente, las reacciones se finalizaron sembrando alícuotas de 25 μL en cuadrados
de papel de fosfocelulosa P-81 (Whatman, Maidstone, UK), los cuales se sumergieron
inmediatamente en H3PO4 75 mM. El péptido sintético syntide-2, debido a su naturaleza básica,
es capaz de unirse a papeles de fosfocelulosa. Los papeles se lavaron 5 veces de 10 minutos
cada una con H3PO4 75 mM y en constante agitación. Los papeles se trataron con acetona para
facilitar el secado y la radiactividad presente se contó con un contador de centelleo líquido
Beckman LS 7000 como se describe en Ulloa et al. (1991). La actividad CDPK in vitro se
32
calculó como la diferencia entre la actividad medida en presencia de Ca2+ y la actividad medida
en presencia de EGTA. Los reactivos utilizados para la mezcla de reacción se compraron en
Sigma-Aldrich (St. Louis, USA).
7. Marcación, extracción y análisis de fosfolípidos
Los explantos de pepino se marcaron in vivo por 16 horas en tubos Eppendorf de 0.5
mL conteniendo buffer más 15 μCi de H332PO4 (32Pi; Amersham Biosciences, Buckinghamshire,
UK) por explanto. Los explantos se transfirieron a nuevos tubos Eppendorf de 0.5 mL y se
trataron como se menciona en el punto 1.2.6. Las incubaciones se detuvieron agregando ácido
perclórico 5 % (v/v) por 30 minutos. Los niveles in vivo de PLs se midieron en segmentos de 5
mm de longitud de la base del hipocótilo, donde se desarrollan las raíces adventicias (Figura 4).
Para ensayar la actividad PLD in vivo, se midió la producción de fosfatidilbutanol
(PBut) en explantos tratados con buffer, IAA 10 μM o SNAP 500 μM, en presencia de 1butanol o 2-butanol a 0.5 % (v/v) (Munnik et al., 1995).
Los reactivos para la extracción y análisis de lípidos en placas de cromatografía en capa
delgada (TLC) de Silica-60 (20 x 20 cm) se compraron en Merck (Darmstadt, Alemania). La
extracción de lípidos totales se realizó según Munnik et al. (1995) con modificaciones menores.
Brevemente, se agregaron 750 μL de CHCl3/MeOH/HCl (50:100:1, v/v) a tubos Eppendorf de 2
mL conteniendo segmentos de hipocótilos. Los tubos se agitaron vigorosamente por 15 minutos
y se centrifugaron por 2 minutos. Se indujo la formación de 2 fases por adición de 200 μL de
NaCl 0.9 % (p/v) y CHCl3 750 μL, y se removieron las fases superiores. Posteriormente, se
lavaron las fases inferiores orgánicas con 750 μL CHCl3/MeOH/1 M HCl (3:45:47, v/v) por 7
minutos. Las muestras se secaron en savant por 45 minutos a 50 ºC y se disolvieron en 20 μL
CHCl3.
Los lípidos se cromatografiaron en placas de TLC activadas por calor empleando un
sistema de solventes alcalino [CHCl3/MeOH/NH4OH 25 % (p/v)/H2O (90:70:4:15, v/v)]
(Munnik et al., 1994) o el sistema de etil acetato (EtAc) [EtAc/isooctano/HCOOH/H2O
33
(12:2:3:10, v/v)] (Munnik et al., 1998). Para el sistema alcalino, las placas fueron impregnadas
en oxalato de potasio 1.2 % (p/v), EDTA 2 mM en MeOH/H2O (2:3, v/v) y luego activadas por
calor. Los PLs marcados se visualizaron utilizando películas de rayos X (AGFA Ortho CP-G
Plus) y se cuantificaron a partir de al menos 2 autorradiografías con exposiciones diferentes
usando el software ImageJ (1.33u, NIH, USA). Las autorradiografías mostradas en la presente
tesis corresponden a un resultado representativo de 3-5 experimentos independientes. Se sembró
la misma cantidad de radiactividad por tratamiento en las placas de TLC. La radiactividad de los
lípidos señales se cuantificó como la razón entre la radiactividad en cada PL señal sobre la
radiactividad total. Los valores se expresaron como veces de acumulación dividiendo la razón
en un tratamiento sobre la del control correspondiente, tomando el control como 1.
8. Determinación de la calidad de fosfolípidos exógenos
Se evaluó la calidad del PA y PS aplicado exógenamente a los explantos de pepino
luego de 1 hora de incubación a 25 °C por la técnica de charring. Brevemente, se extrajeron los
lípidos del medio de incubación y se separaron por EtAc TLC. La misma cantidad de cada
lípido se sembró en la TLC como estándar. Las placas de TLC se sumergieron en una solución
de tinción [acetato cúprico 3 % (p/v) + H3PO4 8 % (v/v)] por 15 segundos y luego se colocaron
en estufa a 180 °C hasta la visualización de las señales lipídicas.
9. Tratamiento estadístico de los datos
Cuando se indica, los valores se expresan como la media +/- error estándar (ES) siendo
el resultado de al menos 2 experimentos independientes. Para el análisis estadístico de los datos,
se realizaron test de T, luego de comprobar la normalidad de los mismos. Un valor de p<0.05 se
consideró significativo para las diferencias entre las medias.
34
y la remoción de parte de los explantos de pepino
sobre la formación de raíces adventicias
CAPÍTULO I
Efectos de la luz, la oscuridad, la depleción de auxinas endógenas
CAPÍTULO I: Resultados
La auxina IAA y el dador de NO SNAP inducen la formación de raíces adventicias
de forma dosis dependiente
Resultados previos obtenidos a partir del tratamiento de explantos de pepino con
diferentes concentraciones del dador de NO SNP indicaron que el efecto del NO sobre la FRA
es dosis dependiente, con una máxima respuesta biológica a SNP 10 μM (Pagnussat et al.,
2002). Se ha reportado que una solución de SNP 100 µM libera en promedio una concentración
de 167 nM NO por hora durante las primeras 48 horas (Beligni y Lamattina, 2002). El
tratamiento con SNP 10 μM mimetiza el efecto de IAA 10 μM en inducir la FRA. Con el
objetivo de estudiar si diferentes concentraciones de IAA promueven diferencias en el
enraizamiento, se llevaron a cabo experimentos tratando explantos de pepino con H2O (control)
o con dosis crecientes de IAA (1, 5, 10, 25, 50 y 100 μM).
En la Figura 5 se observa que el efecto del IAA sobre la FRA es dosis dependiente, con
un número de raíces adventicias significativamente mayor que el tratamiento control a 10, 25 y
50 μM de IAA. Se realizaron experimentos control con etanol (EtOH) debido a que es el
solvente utilizado para disolver el IAA. Los tratamientos con EtOH 0.1 % y 0.5 % (v/v) son
equivalentes a las concentraciones finales alcanzadas en los tratamientos con IAA 10 μM e IAA
50 μM, respectivamente. La Figura 5 muestra que el EtOH solo, a esas concentraciones, no
induce la FRA.
Debido a que IAA 10 μM es la menor concentración testeada a la cual se produce un
efecto significativo, se decidió utilizar esta dosis para los siguientes ensayos.
35
Figura 5. La auxina IAA induce la FRA de forma dosis dependiente. (A) Explantos de pepino se trataron
con H2O (control), con IAA 1, 5, 10, 25, 50 o 100 μM, o con etanol (EtOH) 0.1 o 0.5 % (v/v) por 4 días.
Los valores se expresan como la media ± ES (n=10 explantos de al menos 3 experimentos
independientes). Las barras con asterisco son significativamente diferentes (test de T, p<0.05) del
tratamiento con H2O. (B) Se muestran fotografías representativas a los 4 días de tratamiento. Barra=5
mm.
Se ha reportado que el tratamiento con 10 μM del dador de NO SNAP induce la FRA en
explantos de pepino luego de 5 días de tratamiento (Pagnussat et al., 2002). Se sabe también que
el efecto del NO depende de las concentraciones del dador (Pagnussat et al., 2002; FloryszakWieczorek et al., 2006), y que una solución de SNAP 100 µM libera una concentración de 1.4
µM NO por minuto a 37 °C, la cual es linear a lo largo de un amplio rango de concentraciones
(Feelish, 1991). Con el fin de analizar si el efecto del SNAP es dosis dependiente, se trataron
explantos de pepino con SNAP 1 µM, 10 µM, 500 µM o 1000 µM. Dosis similares se han
utilizado para otros dadores de NO como el SNP (Pagnussat et al., 2002). En la Figura 6 se
observa que la intensidad de la respuesta depende de la dosis del dador de NO. El NO liberado
por SNAP 1 µM o por SNAP 1000 µM no produjo efecto significativo sobre el número de
raíces adventicias. Sin embargo, los tratamientos con SNAP 10 µM y SNAP 500 µM indujeron
el enraizamiento de forma similar al tratamiento con IAA 10 µM (Figuras 5 y 6). Se realizaron
ensayos tratando explantos de pepino con el solvente dimetilsulfóxido (DMSO) que fue
36
utilizado para disolver el SNAP. No se detectaron cambios significativos en el enraizamiento
cuando los explantos se trataron con DMSO 0.1 % (v/v). Por el contrario, el tratamiento con
DMSO 0.5 % (v/v), equivalente a la concentración final alcanzada en el tratamiento con SNAP
500 μM, provocó un incremento significativo en el número de raíces por explanto (Figura 6).
Debido a que SNAP 10 μM es la menor concentración testeada a la cual se produce un efecto
significativo, se decidió utilizar esta dosis para los siguientes ensayos.
Figura 6. El dador de NO SNAP induce la FRA de forma dosis dependiente. Explantos de pepino se
trataron con H2O (control), con SNAP 1, 10, 500 o 1000 μM, o con dimetilsulfóxido (DMSO) 0.1 o 0.5 %
(v/v) por 4 días. Los valores se expresan como la media ± ES (n=10 explantos de al menos 3
experimentos independientes). Las barras con asterisco son significativamente diferentes (test de T,
p<0.05) del tratamiento con H2O.
El contenido de IAA libre no se modifica en presencia de NO
Se sabe que la auxina IAA promueve un incremento transiente en la concentración de
NO endógeno en la base de los explantos de pepino. Esta acumulación se midió utilizando una
sonda fluorescente específica para NO y se cuantificó por medio de la técnica de resonancia
paramagnética del electrón. La máxima concentración de NO fue de 60 nmoles por gramo de
peso fresco luego de 1 día de tratamiento con IAA (Pagnussat et al., 2002). Sin embargo, aún
resta estudiar si el NO produce algún efecto sobre la concentración endógena de IAA. Por lo
tanto, se determinó el contenido endógeno de IAA libre en hipocótilos de pepino tratados por 1
37
día con H2O, SNP 10 μM o SNAP 10 μM. La Figura 7 muestra que el contenido de IAA libre
en los tratamientos con dadores de NO es similar al tratamiento control con H2O.
Figura 7. Contenido de IAA libre en explantos de pepino tratados con NO. Explantos de pepino se
trataron con H2O (control), SNP 10 μM o SNAP 10 μM por 1 día. El contenido de IAA libre se midió en
los hipocótilos de dichos explantos. Los valores se expresan como la media ± ES (n=20 explantos de 2
experimentos independientes).
La oscuridad adelanta el proceso de formación de raíces adventicias
La luz es un estímulo ambiental que puede inducir o inhibir el proceso de FRA
dependiendo de su calidad y cantidad, y de la especie vegetal (Drew et al., 1991). De manera de
estudiar los efectos de la luz y la oscuridad sobre la FRA inducida por auxinas y NO en
explantos de pepino, se llevaron a cabo ensayos manteniendo los explantos bajo luz
(fotoperíodo de 14 horas luz/ 10 horas oscuridad) u oscuridad continua. Para ello, semillas de
pepino se germinaron en placas de Petri conteniendo papel de filtro embebido en H2O y se
mantuvieron a 25 ºC por 7 días bajo luz u oscuridad. Luego, se removieron los sistemas
radicales primarios de las plántulas y los explantos resultantes se mantuvieron en las mismas
condiciones por 4 días en presencia de H2O (control), IAA 10 µM o SNP 10 µM. Se realizó un
tratamiento control con SNP en presencia de 200 µM del secuestrante específico de NO cPTIO.
Los explantos crecidos en oscuridad mostraron un fenotipo etiolado con hipocótilos largos y
cotiledones amarillentos y cerrados (no mostrado).
38
La Figura 8A muestra la cinética de FRA en explantos de pepino tratados en luz. Luego
de 4 días de tratamiento, el número de raíces adventicias fue 400 % mayor en los explantos
tratados con NO e IAA que en los explantos control. Como ya se ha demostrado (Pagnussat et
al., 2002), el secuestro de NO con cPTIO resulta en una disminución en el número de raíces
(Figura 8A). Por otra parte, se observa que la emergencia de raíces adventicias en los explantos
de pepino tratados en oscuridad (Figura 8B) es previa a la de los explantos tratados en luz
(Figura 8A). Sin embargo, el tratamiento con SNP fue menos efectivo en inducir la FRA en los
explantos tratados en oscuridad que en aquellos tratados en luz (Figura 8). Este fenómeno puede
ser explicado teniendo en cuenta que la luz induce la liberación de NO del SNP (Bates et al.,
1991).
Figura 8. Efecto de la oscuridad sobre la cinética de FRA. Explantos de pepino mantenidos en luz (A) u
oscuridad (B) se trataron con H2O (control), IAA 10 μM, SNP 10 μM o SNP en presencia de 200 μM del
secuestrante específico de NO cPTIO. El número de raíces se midió durante 4 días de tratamiento cada 24
horas. Los valores se expresan como la media ± ES (n=10 explantos de al menos 3 experimentos
independientes). Las barras con asterisco son significativamente diferentes (test de T, p<0.05) del
tratamiento con H2O.
39
El NO revierte el efecto inhibitorio de la depleción de auxinas endógenas sobre la
formación de raíces adventicias
Se estudió el efecto de la depleción de auxinas endógenas sobre la FRA en presencia de
luz u oscuridad. La depleción de auxinas se realizó mediante el bloqueo de la síntesis de auxinas
por remoción del meristema caulinar (decapitación) y el bloqueo del transporte polar de auxinas
por el uso del inhibidor NPA. Los explantos de pepino no depletados (ND) o depletados (D) de
auxinas endógenas se incubaron por 4 días con H2O (control), IAA 10 μM, SNP 10 μM o SNP
10 μM en presencia de cPTIO 200 μM.
En la Figura 9A se observa que la depleción de auxinas endógenas bloquea el
enraizamiento bajo luz, tal como se había reportado previamente (Pagnussat et al., 2003). Tanto
la auxina IAA como el dador de NO SNP revirtieron el efecto inhibitorio de la depleción.
Resultados similares se obtuvieron en los explantos tratados en oscuridad con IAA (Figura 9B).
Sin embargo, el tratamiento con SNP fue menos efectivo en inducir la FRA en los explantos
tratados en oscuridad que en los tratados en luz (Figura 9B). Nuevamente, este resultado puede
ser atribuido a que la luz induce la liberación de NO del SNP (Bates et al., 1991).
40
Figura 9. Número de raíces adventicias en explantos de pepino no depletados (ND) o depletados (D) de
auxinas endógenas y tratados con H2O (control), IAA 10 μM, SNP 10 μM o con SNP más 200 μM
cPTIO. Los explantos se mantuvieron en luz (A) u oscuridad (B) por 4 días. Los valores se expresan
como la media ± ES (n=10 explantos de al menos 3 experimentos independientes). Las barras con
asterisco son significativamente diferentes (test de T, p<0.05) del tratamiento control con H2O.
Las auxinas y el NO requieren de explantos enteros para promover la formación
de raíces adventicias en luz y oscuridad
Se realizaron ensayos tendientes a establecer el efecto de la: i) remoción de un
cotiledón, ii) remoción del hipocótilo, iii) remoción de los dos cotiledones sobre la FRA en
presencia de luz u oscuridad. Para ello, a plántulas de pepino mantenidas en luz u oscuridad se
les removió el sistema radical primario y: i) un cotiledón, o ii) el hipocótilo desde la base de los
cotiledones (se mantiene una mínima parte del hipocótilo), o iii) los dos cotiledones junto con el
meristema caulinar (hipocótilos escindidos). Los explantos resultantes se trataron con H2O
(control), IAA 10 μM o SNP 10 μM y se cuantificó el número de raíces adventicias a los 6 días
de tratamiento.
41
La Figura 10A y B muestra que los explantos de pepino conteniendo un cotiledón o una
mínima parte del hipocótilo enraizaron significativamente más cuando se mantuvieron en
oscuridad que cuando se mantuvieron en luz. Sin embargo, en estos explantos los tratamientos
con IAA y NO arrojaron resultados similares al tratamiento control con H2O tanto en luz como
en oscuridad (Figura 10A y B). Comparativamente, los explantos conteniendo un cotiledón
fueron menos eficaces en enraizar que aquellos conteniendo una mínima parte de su hipocótilo
(Figura 10A y B). Por otra parte, no se desarrollaron raíces adventicias ni en luz ni en oscuridad
y bajo ningún tratamiento en los hipocótilos escindidos (no mostrado).
Para determinar si las auxinas o el NO afectan la elongación del hipocótilo en
oscuridad, se midió la longitud del hipocótilo en los explantos de pepino conteniendo una
mínima parte de sus hipocótilos. Los resultados presentados en la Figura 10C muestran que
estos tratamientos no modifican la longitud del hipocótilo, similar a lo obtenido en plántulas
etioladas de Arabidopsis ecotipo erecta tratadas con NO (Beligni y Lamattina, 2000).
En conjunto, estas evidencias indican que tanto en luz como en oscuridad se requiere de
explantos enteros (cotiledones, meristema caulinar e hipocótilo) para obtener los efectos
inductores del IAA y del NO. Las diferencias de enraizamiento entre los explantos tratados en
oscuridad con aquellos tratados en luz sugieren una inhibición parcial en el transporte o en la
producción de auxinas por luz.
42
Figura 10. Efecto de la remoción de un cotiledón o del hipocótilo sobre la FRA en explantos de pepino. A
plántulas de pepino mantenidas en luz u oscuridad se les removió el sistema radical primario y un
cotiledón (A) o el hipocótilo desde la base de los cotiledones (B y C). Los explantos resultantes se
trataron con H2O (control), IAA 10 μM o SNP 10 μM y se mantuvieron en luz u oscuridad por 6 días. Los
valores del número de raíces por explanto y de la longitud del hipocótilo se expresan como la media ± ES
(n=10 explantos de 2 experimentos independientes).
43
CAPÍTULO I: Discusión
El rol regulatorio de la luz sobre la FRA resulta, al menos en parte, de la interacción
entre la luz y las hormonas, particularmente las auxinas. La luz puede inhibir el transporte de
auxinas induciendo la producción de flavonoides (Jacobs y Rubery, 1988) o también modular la
producción de auxinas (Tian y Reed, 2001). En Arabidopsis, el ambiente lumínico es
monitoreado por al menos 3 grupos de fotorreceptores: fitocromos que absorben luz roja/roja
lejana, criptocromos que absorben luz UV-A y azul, y fototropinas (Chen et al., 2004). Los
fitocromos son potentes reguladores del crecimiento y desarrollo de las plantas, afectando la
elongación de hipocótilos, la expansión foliar, la elongación de pelos radicales y de raíces
primarias, y el fototropismo y gravitropismo de raíces. Se ha demostrado recientemente que el
fitocromo controla estos procesos regulando el transporte de auxinas (Salisbury et al., 2007).
En Arabidopsis, el gen AGO1 (Argonaute 1) está involucrado en la regulación del
silenciamiento génico posttranscripcional (Fagard et al., 2000). Plántulas mutantes nulas en
AGO1 poseen un menor número de raíces adventicias y un similar número de raíces laterales
comparado con plántulas salvajes (Sorin et al., 2005). Sin embargo, las mutantes ago1 son
capaces de desarrollar algunas raíces adventicias en respuesta a auxinas cuando son previamente
etioladas, efecto que es independiente de la longitud de los hipocótilos. Estas mutantes
solamente elongan sus hipocótilos (aunque en menor medida que las salvajes) cuando se crecen
en oscuridad, mientras que bajo luz roja, roja lejana o azul no son capaces de elongarlos;
sugiriendo una hipersensibilidad a la luz (Sorin et al., 2005). Adicionalmente, las mutantes ago1
responden normalmente al tratamiento con citoquininas, giberelinas y etileno, por lo que son
específicamente resistentes a dos respuestas mediadas por auxinas: elongación de hipocótilos y
FRA. Esto puede ser explicado, al menos parcialmente, teniendo en cuanta que estas mutantes
poseen una acumulación del factor de respuesta a auxinas ARF17 en los hipocótilos, el cual
reprime la expresión de genes de respuesta a auxinas de la familia GH3. Consistentemente, la
sobreexpresión del gen ARF17 provoca una disminución de la FRA (Sorin et al., 2005). Estos
resultados indican que ARF17 sería un regulador de la FRA reprimiendo la expresión de genes
GH3 y modulando así las respuestas reguladas por auxinas de una manera dependiente de la luz.
44
Las auxinas y la luz pueden interactuar a múltiples niveles, como por ejemplo la
regulación de la estabilidad o de la actividad de genes blanco comunes. En particular, la
proteína HY5 (long hypocotyl 5) ha sido implicada en la señalización por auxinas a través del
control de reguladores negativos de la vía. Plantas de Arabidopsis que son mutantes nulas en
HY5 poseen defectos en la señalización por fitocromos y también en procesos regulados por
auxinas como la elongación de hipocótilos, el gravitropismo y la formación de raíces laterales
(Oyama et al., 1997). Por lo tanto, la proteína HY5 se ha propuesto como un punto de
integración de señales donde convergen las vías de señalización por luz y por auxinas (Cluis et
al., 2004). Es posible que los fitocromos modulen la señalización por auxinas a través de HY5
(Salisbury et al., 2007). Teniendo en cuenta estas evidencias, resulta interesante cuantificar el
número y la longitud de raíces adventicias en plantas mutantes nulas en HY5.
La luz usualmente inhibe el proceso de FRA en diversas plantas, actuando
antagónicamente a las auxinas. Este es el caso de los explantos de Eucalyptus saligna y
Eucalyptus globulus y de los explantos de crisantemo (Chrysanthemum morifolium) y clavel
(Dianthus caryophyllus; Fett-Neto et al., 2001). En Acacia mangium, se producen más raíces
adventicias en oscuridad que en luz, pero las raíces producidas bajo luz son más largas que las
de oscuridad (Monteuuis y Bon, 2000). Contrariamente, los hipocótilos de tomate sólo enraizan
efectivamente bajo luz blanca, mientras que la FRA es reducida en oscuridad o bajo luz roja o
azul (Tyburski y Tretyn, 2004). En explantos de Juniperus scopulorum y Thuja occidentalis, el
tratamiento con luz roja ha resultado en mejores enraizamientos que los obtenidos bajo luz azul
o blanca (Bielenin, 2000). En Pelargonium, la FRA es impedida en presencia de oscuridad,
probablemente por una depleción en los niveles de carbohidratos en hojas (Druege et al., 2004).
Nuestros resultados indican que el tratamiento con oscuridad adelanta el proceso de FRA en
explantos de pepino (Figura 8). En conclusión, los efectos diferenciales de la luz y las auxinas
sobre la FRA en diversas especies vegetales permiten sugerir que si bien las auxinas están
siempre implicadas en el proceso de FRA, estudios bioquímicos y moleculares profundos serán
necesarios para entender la red de interacciones existente.
En Arabidopsis, las raíces adventicias pueden formarse espontáneamente cuando las
45
plantas son etioladas en oscuridad (Sorin et al., 2005). En efecto, las plantas que crecen en luz
baja y luego se transfieren a luz alta desarrollan raíces adventicias a lo largo de sus hipocótilos
intactos. Sin embargo, la remoción de los sistemas radicales incrementa la frecuencia de FRA en
dichas plantas. Adicionalmente, el incremento de la intensidad de la luz o el tratamiento con
auxinas induce un mayor número de raíces adventicias. Por otra parte, el tratamiento con el
inhibidor del transporte de auxinas NPA o la remoción del meristema caulinar inhiben la FRA
(Sukumar et al., 2007). En pepino, las raíces adventicias raramente se generan en plántulas con
hipocótilos intactos, mientras que la remoción de los sistemas radicales primarios es necesaria
para inducir un mayor número de raíces. Más aún, los procesos de dediferenciación y
proliferación celular requeridos para la formación de primordios de raíces adventicias ocurren
principalmente en las regiones de los hipocótilos de pepino que fueron sometidos a daño
mecánico (Pagnussat et al., 2002). La competencia para la división celular inducida por estrés
mecánico es una respuesta empleada en el cultivo de tejidos in vitro. La remoción de los
sistemas radicales primarios permite la acumulación de auxinas en la base de los hipocótilos
(Liu y Reid, 1992; Pagnussat et al., 2002). Las auxinas son necesarias para dirigir las células en
activa división hacia programas específicos de diferenciación.
Se han optimizado las condiciones para la FRA en Arabidopsis y en tomate a través de
la elongación de los hipocótilos en luz baja y la subsiguiente escisión de los mismos (Sorin et
al., 2005). El enraizamiento incrementado en los hipocótilos escindidos está acompañado por un
aumento de la síntesis y del transporte de auxinas. En este sistema, la remoción de la fuente de
producción de auxinas o la aplicación de inhibidores del transporte polar de auxinas previenen
la FRA, siendo el enraizamiento reestablecido por tratamiento con auxinas exógenas (Sorin et
al., 2005). En comparación, nuestros ensayos indican que los hipocótilos de pepino escindidos
no son capaces de enraizar (no mostrado). De forma similar a lo que ocurre en Arabidopsis, la
depleción de auxinas endógenas afecta negativamente el enraizamiento de los explantos de
pepino tanto en luz como en oscuridad (Figura 9); demostrando el rol primordial de estas
hormonas en desencadenar el proceso de FRA.
46
Se ha estudiado la FRA en cotiledones aislados o en partes apicales de plántulas
(cotiledones más nudo cotiledonar y plúmula) de mostaza (Sinapis alba; Mohr y Schopfer,
1995). Ambos tipos de explantos fueron capaces de enraizar cuando se colocaron bajo luz roja
continua, mientras que la FRA no se indujo en aquellos explantos que permanecieron en
oscuridad. Más aún, el aislamiento de los cotiledones es una condición requerida para la
generación de raíces adventicias. Los autores concluyeron que un factor hormonal producido en
los cotiledones en respuesta al fitocromo dispara el proceso de FRA en dicha especie. Este
factor no puede ser reemplazado por aplicación exógena de auxinas, giberelinas, citoquininas o
etileno (Mohr y Schopfer, 1995). Hasta el momento desconocemos si cotiledones aislados de
pepino son capaces de enraizar y cuál es el efecto del tratamiento con luz roja sobre la FRA en
pepino. Sin embargo, los explantos de pepino conteniendo un cotiledón o una mínima parte del
hipocótilo enraizaron significativamente más cuando se mantuvieron en oscuridad que cuando
se mantuvieron en luz blanca (Figura 10). Además, el tratamiento exógeno con auxinas o NO
induce la FRA sólo en explantos enteros (cotiledones, meristema caulinar e hipocótilo) y tanto
en luz como en oscuridad (Figura 8).
Se sabe que la auxina IAA promueve un incremento transiente en la concentración de
NO endógeno en la base de los explantos de pepino (Pagnussat et al., 2002). Sin embargo, aún
no se ha estudiado si el NO produce efectos sobre la concentración endógena de IAA en ningún
sistema experimental. Nuestros resultados indican que el contenido endógeno de IAA libre en
hipocótilos de explantos de pepino no se modifica por tratamiento con los dadores de NO SNP y
SNAP, a las concentraciones que son efectivas para desencadenar la FRA (Figura 7). Se ha
establecido que el NO puede inducir o inhibir la síntesis de etileno. En particular, se ha
observado que el NO inhibe la producción de etileno en frutos no climatéricos como la frutilla
(Fragaria ananassa; Zhu y Zhou, 2007). El NO induce la producción de etileno durante la
respuesta al ozono en plantas de tabaco (Ederli et al., 2006), durante la germinación de semillas
dormantes de manzana (Malus domestica; Gniazdowska et al., 2007) y durante interacciones
planta-patógeno (Mur et al., 2008). Por otra parte, se ha reportado que el NO estimula la síntesis
de ácido salicílico durante respuestas de defensa en tabaco (Durner et al. 1998; Durner y
47
Klessig, 1999; Van Camp et al., 1998) y durante estrés mecánico en plantas de Arabidopsis
(Huang et al., 2004). El NO también dispara la acumulación de ácido jasmónico en
suspensiones celulares de Sophora flavescens (Xu y Dong, 2008), aunque no produce cambios
en los niveles de ácido jasmónico en plantas de Arabidopsis (Huang et al., 2004).
48
mediada por MAPKs, inducida por auxinas e involucrada en la
formación de raíces adventicias en pepino
CAPÍTULO II
El NO es requerido para la activación de una cascada de señalización
CAPÍTULO II: Resultados
El NO es requerido para aumentar la actividad MAPK inducida por auxinas
durante la formación de raíces adventicias
Debido a que las casadas de fosforilación de MAPKs juegan un rol principal en la
regulación de muchos aspectos del crecimiento y desarrollo, se analizó si el NO modula la
actividad de MAPKs durante la FRA. La aproximación metodológica consistió en cuantificar la
actividad MAPK tanto in vitro como en geles desnaturalizantes de poliacrilamida
copolimerizados con proteína básica de mielina (MBP) como sustrato de MAPK. Para ello,
semillas de pepino se germinaron en H2O y se mantuvieron a 25 ºC por 7 días con un
fotoperíodo de 14 horas luz/ 10 horas oscuridad. Los sistemas radicales primarios de las
plántulas se removieron y los explantos resultantes se trataron con H2O (control), IAA o SNP,
en presencia o ausencia del secuestrante específico de NO cPTIO. Se obtuvieron extractos
solubles proteicos a partir de cada tratamiento. De manera de caracterizar las actividades
MAPKs, se separaron las proteínas en geles de proteínas conteniendo MBP. Luego de un
tratamiento de renaturalización, se determinó la actividad quinasa de proteína en el gel
incubándolo en un medio fosforilante en presencia de ATP [γ-32P].
Luego de 1 día de tratamiento con SNP, se detectó un incremento en la actividad
MAPK fosforilante de MBP in vitro, alcanzando un máximo luego de 3 días de tratamiento
(Figura 11A). El tratamiento con SNP más cPTIO arrojó valores de actividad MAPK in vitro
similares al tratamiento control con H2O (Figura 11A, los ES de dichos tratamientos no se
muestran por la claridad de la Figura). En concordancia, la actividad de una quinasa de proteína
que fosforila MBP y de masa molecular aparente de 48 kDa se detectó por ensayos en gel, con
una máxima activación luego de 3 días de tratamiento con SNP (Figura 11B). La actividad de
esta quinasa de proteína disminuyó luego de 4 días de tratamiento. En los explantos tratados con
SNP más cPTIO, la actividad de la quinasa de proteína de 48 kDa fue débilmente detectada
luego de 4 días de tratamiento (Figura 11B). En los explantos tratados con H2O, se detectó una
débil actividad quinasa de proteína hasta los 3 días de tratamiento, la cual se incrementó al 4to
día de tratamiento (Figura 11B). Esta señal fue menor al tratamiento con NO en todos los
tiempos analizados.
49
Figura 11. La actividad MAPK es inducida por NO durante la FRA. (A) Explantos de pepino se
incubaron por diferentes tiempos con H2O (control) o 10 μM del dador de NO SNP o con SNP más 200
μM del secuestrante específico de NO cPTIO. La actividad fosforilante de MBP in vitro se midió en
extractos proteicos solubles. Los valores se expresan como la media ± ES de 2 experimentos
independientes con 3 repeticiones para cada punto. (B) Ensayos de quinasa de proteína en gel. Las flechas
indican una masa molecular aparente de 48 kDa.
La actividad MAPK fosforilante de MBP también se ensayó en extractos de hipocótilos
de explantos tratados con IAA o con IAA más el secuestrante específico de NO cPTIO. La
actividad MAPK se detectó en explantos tratados con IAA por experimentos tanto in vitro como
en gel, con una máxima activación entre el 2do y el 3er día de tratamiento, respectivamente
(Figura 12A y B). Se observó una actividad MAPK fosforilante de MBP de 48 kDa en extractos
de explantos tratados con IAA (Figura 12B). La actividad fosforilante de MBP fue débilmente
detectada en explantos tratados con IAA en presencia de cPTIO en ensayos in vitro (Figura
12A), mientras que ninguna señal fue detectada en ensayos en gel (Figura 12B).
50
Figura 12. La actividad MAPK inducida por IAA requiere de NO endógeno. (A) Explantos de pepino se
incubaron por diferentes tiempos con IAA 10 μM o con IAA más 200 μM cPTIO. La actividad
fosforilante de MBP in vitro se midió en extractos solubles totales de los hipocótilos. Los valores se
expresan como la media ± ES de 2 experimentos independientes con 3 repeticiones para cada punto. (B)
Ensayos de quinasa de proteína en gel. La flecha indica una masa molecular aparente de 48 kDa.
En todos los experimentos en gel se detectó una única banda de actividad
correspondiente a una quinasa de proteína con una masa molecular aparente de 48 kDa. Esta
actividad se observó en ausencia de Ca2+ (EGTA 2 mM) y exhibió una fuerte preferencia por
MBP de entre otros sustratos testeados (proteínas histónicas y caseína, no mostrado). Cuando
los extractos proteicos se ensayaron en ausencia de vanadato (un inhibidor general de tirosín
fosfatasas), no se detectó la actividad de 48 kDa (no mostrado), lo cual es consistente con el
hecho de que las MAPKs se activan por fosforilación de residuos de tirosina dentro de su
dominio de activación (Colcombet y Hirt, 2008). En conjunto, estos datos sugieren que la
actividad fosforilante de MBP detectada por ensayos en gel es una MAPK. Sin embargo, se ha
reportado que la MBP puede ser fosforilada por otras quinasas de proteína de serina y treonina
como NPK15 de tabaco (Ito et al., 1994).
51
La actividad MAPK es inhibida por el inhibidor de MAPK quinasa PD098059
Para confirmar inequívocamente que la actividad fosforilante de MBP detectada en
explantos de pepino es una MAPK, se midió la actividad quinasa de proteína por ensayos in
vitro y en gel en explantos tratados con el inhibidor de MAPK quinasa (MAPKK) 2-(2-amino3-metoxifenil)-oxanaftalen-4-one (PD098059). Este inhibidor previene la activación de
MAPKK, el activador directo de MAPK, por unión a su forma defosforilada inactiva (Alessi et
al., 1995). Se llevaron a cabo experimentos con SNP o IAA en presencia o ausencia de
PD098059. La actividad quinasa de proteína se determinó midiendo la incorporación de 32P al
sustrato MBP mediante un contador de centelleo líquido.
La Figura 13 muestra que en presencia de PD098059 50 μM, el incremento en la
actividad quinasa de proteína observada en los tratamientos con SNP o IAA se redujo 2-3 veces.
No se detectó ninguna señal en explantos tratados con PD098059 por ensayos en gel (no
mostrado). Estos resultados indican que la quinasa de proteína que fosforila MBP y que se
activa por tratamiento con auxinas y NO es una MAPK.
Figura 13. La actividad MAPK inducida por IAA y NO es inhibida por el inhibidor de MAPK quinasa
(MAPKK) PD098059. La actividad fosforilante de MBP in vitro se midió en extractos solubles totales de
explantos de pepino tratados con SNP 10 μM o IAA 10 μM en presencia o ausencia de PD098059 50 μM
(PD) por diferentes tiempos como se indica. Los valores se expresan como la media ± ES de 2
experimentos independientes con 3 repeticiones para cada punto.
52
La inhibición de MAPKKs previene la formación de raíces adventicias inducida
por IAA o NO
Con el objeto de testear la participación de la vía de MAPK durante la FRA, se ensayó
la capacidad del inhibidor de MAPKKs permeable a las células PD098059 de afectar la FRA
inducida por IAA y NO. Se realizaron experimentos con SNP en presencia de 10 μM, 50 μM o
100 μM de PD098059.
La Figura 14 muestra que el efecto del inhibidor es dosis dependiente, con una respuesta
biológica máxima a 50 μM. Los tratamientos con SNP más PD098059 produjeron un retraso en
la emergencia de las raíces (no mostrado) y una reducción significativa tanto en el número como
en la longitud de raíces adventicias en explantos de pepino (Figura 14).
Debido a que PD098059 50 μM es la menor concentración testeada a la cual se produce
un efecto significativo, se decidió utilizar esta dosis para los siguientes ensayos.
Figura 14. Efecto de diferentes concentraciones de PD098059 sobre la FRA inducida por NO. Explantos
de pepino se trataron con H2O (control) o SNP 10 μM en presencia o ausencia de 10 μM, 50 μM o 100
μM del inhibidor de MAPKK PD098059 (PD) por 4 días. El número (A) y la longitud (B) de raíces
adventicias se expresan como la media ± ES de 3 experimentos independientes (n=10 explantos).
Los explantos de pepino se trataron con H2O (control), IAA o SNP en presencia o
ausencia de PD098059 50 μM o sólo con PD098059 50 μM. El inhibidor PD098059 bloqueó
tanto el número como la longitud de las raíces adventicias en los explantos tratados con SNP o
53
IAA (Figura 15A y B). Cuando PD098059 se administró sólo, el número de raíces adventicias
fue similar al control no tratado (Figura 15A).
Figura 15. La actividad MAPK es requerida para la FRA inducida por IAA y NO. (A) Explantos de
pepino se trataron por 5 días como se indica. El número de raíces adventicias se expresó como la media ±
ES de 3 experimentos independientes (n=10 explantos). Las barras con asterisco son significativamente
diferentes (test de T, p<0.05) de su control sin SNP o IAA. El inhibidor de MAPKK PD098059 se
administró a 50 μM, y SNP e IAA a 10 μM. (B) Se muestran fotografías representativas de la FRA en
explantos de pepino a los 4 días de tratamiento. Barra=5 mm.
La actividad MAPK es inducida por NO en una vía independiente de cGMP
Se ha reportado que una vía dependiente de cGMP participa durante la FRA inducida
por auxinas y NO en pepino (Pagnussat et al., 2003). Con el objetivo de evaluar si el cGMP y la
actividad de MAPKs inducida por NO están relacionados, se midió la actividad MAPK
fosforilante de MBP in vitro en explantos de pepino tratados con 6-anilinoquinoline-5,8quinone (LY83583), un inhibidor de la enzima guanilato ciclasa (GC), la cual cataliza la síntesis
de cGMP. Se ha descripto que el inhibidor LY83583 reduce significativamente el desarrollo de
raíces adventicias inducida por IAA o NO, a una concentración de 50 μM (Pagnussat et al.,
2003).
La Figura 16 muestra que la actividad MAPK fosforilante de MBP in vitro se indujo por
tratamiento con NO y no fue afectada por el agregado de LY83583. La actividad MAPK
disminuyó significativamente cuando 50 μM del inhibidor PD098059 se administró a explantos
54
de pepino conjuntamente con SNP y LY83583 (Figura 16). Por lo tanto, la cascada de MAPKs
involucrada en la FRA es activada por IAA en una vía dependiente de NO e independiente de
cGMP.
Figura 16. La actividad MAPK es inducida por NO en una vía independiente de cGMP. Explantos de
pepino se incubaron por diferentes tiempos con 10 μM de SNP o con SNP más 50 μM del inhibidor de la
enzima guanilato ciclasa 6-anilinoquinoline-5,8-quinone (LY83583) en presencia o ausencia de 50 μM
del inhibidor de MAPKKs PD098059. La actividad fosforilante de MBP in vitro se midió en extractos
solubles totales de hipocótilos de dichos explantos. Los valores se expresan como la media ± ES de 2
experimentos independientes con 3 repeticiones para cada punto.
55
CAPÍTULO II: Discusión
Las cascadas de señalización que involucran MAPKs son importantes mediadoras en
muchos procesos biológicos, conectando la percepción de estímulos externos con las respuestas
celulares. Las MAPKs han sido involucradas en la señalización de respuestas a varios estreses
bióticos y abióticos, y en la regulación del ciclo celular y de procesos del desarrollo en plantas.
En este Capítulo, se presenta evidencia de que una cascada de señalización de MAPKs se activa
durante la FRA inducida por IAA en una vía mediada por NO e independiente de cGMP. No
hemos analizado si las auxinas y el NO promueven cambios en la actividad MAPK a tiempos
cortos (minutos), donde usualmente son evaluados, debido a que quisimos correlacionar las
actividades enzimáticas medidas con el proceso de FRA.
Se detectó un incremento en la actividad MAPK in vitro en explantos de pepino luego
de 1 día de tratamiento con el dador de NO SNP o con la auxina IAA, con un pico de actividad
máxima a los 2-3 días. A su vez, la máxima activación de una MAPK de 48 kDa se detectó a los
3 días de tratamiento con estos compuestos (Figuras 11 y 12). El secuestrante específico de NO
cPTIO previno la activación de dicha MAPK cuando se aplicó conjuntamente con SNP o IAA,
sugiriendo que la MAPK de 48 kDa detectada por ensayos en gel es la misma y requiere de NO
endógeno para activarse (Figuras 11 y 12). Aún se desconoce si la activación de esta MAPK
está acompañada por un incremento paralelo en el nivel de proteína.
El incremento en la actividad MAPK durante la FRA en explantos de pepino puede
estar relacionado con cambios a nivel de división y diferenciación celular en los hipocótilos
tratados con NO o IAA. La máxima actividad MAPK (Figuras 11 y 12) se detectó
simultáneamente con la máxima proliferación celular y la formación de primordios de raíces
adventicias (Figura 3B). Varios estudios conectan las cascadas de MAPKs con la división
celular en plantas: i) mutaciones nulas en genes que codifican para MAPKKKs disrumpen la
citocinesis en tabaco (Nishihama y Machida, 2001) y en Arabidopsis (Krysan et al., 2000), ii)
MAPK detectada en el fragmoplasto en células de alfalfa (Medicago sativa; Bögre et al., 1999)
y iii) cascada de MAPKs que controla la citocinesis en Arabidopsis (Takahashi et al., 2004). En
la presente tesis se muestra que el tratamiento de los explantos de pepino con SNP o IAA más el
inhibidor de MAPKK PD098059 produce una reducción dosis dependiente en la FRA (Figura
56
13), indicando que una cascada de MAPKs podría estar involucrada en este proceso inducido
por auxinas. En Arabidopsis, se ha descripto que mutantes nulas de genes de MAPKKKs poseen
paredes celulares incompletas y células binucleadas, lo cual es indicativo de fallas en la división
celular (Krysan et al., 2000). Coincidentemente, células binucleadas se detectaron en las
secciones transversales de explantos de pepino tratados con IAA o NO en presencia del
inhibidor de MAPKKs PD098059 (no mostrado). Esto sugiere que la actividad MAPK
detectada podría estar involucrada en la regulación de la división celular más que en la
formación de primordios de raíces adventicias. La cascada de MAPKs puede mediar la FRA en
respuesta a IAA y NO no sólo vía activación del proceso mitótico, sino también vía regulación
de la expresión de genes de respuesta a auxinas (Mockaitis y Howell, 2000).
Varias líneas de evidencia han implicado cascadas de MAPKs en la acción y
señalización por auxinas. Las auxinas activan una MAPK de tabaco (Mizoguchi et al., 1994) y
una MAPK en raíces de Arabidopsis (Mockaitis y Howell, 2000). Sin embargo, una cascada de
MAPKs inducida por estrés oxidativo regula negativamente respuestas tempranas de auxinas
(Kovtun et al., 1998). En plantas de Arabidopsis que son mutantes nulas en MEKK1 o MPK4,
Nakagami et al. (2006) demostraron defectos en la activación de genes de respuesta a auxinas de
la familia Aux-IAA. Otros resultados que involucran a cascadas de MAPK en procesos regulados
por auxinas se obtuvieron a partir del estudio de la fosfatasa de MAPK IBR5. Plantas de
Arabidopsis mutantes nulas en IBR5 poseen patrones vasculares aberrantes, raíces más largas e
hipocótilos más cortos. Aún se desconocen las MAPKs inactivadas por IBR5 (MonroeAugustus et al., 2003). Por otra parte, la expresión diferencial (por sobreexpresión y antisentido)
de la MAPKK7 de Arabidopsis indicó que esta quinasa de proteína regula negativamente el
transporte polar de auxinas (Dai et al., 2006). A pesar de numerosos estudios de genética
directa, aún no se han aislado mutantes de MAPK con fenotipos relacionados con auxinas,
siendo probablemente atribuible a la redundancia dentro de la familia de MAPKs.
Como se mencionó anteriormente, Mockaitis y Howell (2000) reportaron un incremento
rápido (pico a los 5 minutos) y transiente en la actividad MAPK en raíces de Arabidopsis
tratadas con auxinas. Más aún, la actividad MAPK estimulada por auxinas se duplicó en
57
presencia de los inhibidores de MAPKK PD098059 y UO126 (Mockaitis y Howell, 2000).
Estos resultados en conjunto con los nuestros sugieren que los inhibidores de MAPKK disparan
distintos efectos en diferentes vías de transducción de señales. Estas vías poseen diferencias en
la cinética de activación de MAPKs, en los componentes activadores río arriba, o en el tipo y
número de isoformas de MAPKs. Las cascadas de señalización de MAPKs pueden también
diferir según la especie vegetal que se considere, el tipo celular, el ambiente alrededor de las
células y la historia previa de las células.
Nuestros resultados contribuyen a descifrar parte de los eventos moleculares que
ocurren río abajo del IAA para desencadenar el proceso de FRA. Uno de ellos es la activación
de una cascada de MAPKs mediada por NO. Se ha reportado que el NO está involucrado en la
activación de MAPKs durante respuestas de defensa frente a patógenos en tabaco (Kumar y
Klessig, 2000) y en células de Arabidopsis (Clarke et al., 2000). Un estudio reciente mostró que
una cascada de MAPKs incrementa la concentración de NO durante interacciones plantapatógeno (Asai et al., 2008), indicando que las MAPKs pueden también actuar río arriba del
NO.
La cascada de señalización de MAPK involucrada en la FRA en explantos de pepino
parece ser independiente de cGMP, debido a que la actividad MAPK in vitro inducida por NO
no fue afectada por el inhibidor de la enzima GC LY83583 (Figura 16). Sin embargo, el
inhibidor LY83583 previene la FRA inducida por NO (Pagnussat et al., 2003). Por lo tanto,
podría sugerirse que la activación de la vía de MAPKs no es suficiente para asegurar el proceso
de FRA en explantos de pepino. Se propone entonces que el NO activa al menos dos vías
diferentes durante la inducción de la FRA: una dependiente de cGMP y otra independiente de
cGMP que involucra una cascada de señalización de MAPKs. La activación de ambas vías
parece ser requerida para la FRA en pepino ya que si una es bloqueada este proceso no se
desarrolla. Estos resultados son consistentes con reportes previos que sugieren que el NO induce
una vía independiente de cGMP en la que participan fosfatasas y quinasas de proteína
incluyendo MAPKs (Lamattina et al., 2003; Neill et al., 2003).
58
En conjunto, estos datos sugieren que los componentes de la señalización regulados por
NO y descriptos en animales son también funcionales en plantas y revelan la complejidad de las
respuestas reguladas por NO, las cuales pueden ser mediadas por fosforilación o cGMP. En
particular, la FRA inducida por auxinas y NO está regulada por un complejo set de mensajeros
celulares, entre ellos MAPKs y cGMP.
59
adventicias inducida por auxinas y NO en pepino
CAPÍTULO III
El Ca2+ y las CDPKs están involucrados en la formación de raíces
CAPÍTULO III: Resultados
Inhibidores de canales de Ca2+ y quelantes de Ca2+ previenen la formación de
raíces adventicias inducida por auxinas y NO
Varios reportes mostraron que la generación de cGMP, cADPR y los incrementos en la
[Ca2+]cit están involucrados en las respuestas de las plantas frente al tratamiento con NO
(Wendehenne et al., 2001; Neill et al., 2003; García-Mata et al., 2003). En nuestro laboratorio se
ha demostrado que el NO opera río abajo de la auxina IAA promoviendo la FRA en explantos
de pepino a través de eventos mediados por cGMP (Pagnussat et al., 2003). Teniendo en cuenta
que el Ca2+ participa en numerosas vías de señalización reguladas por NO, se estudió el
requerimiento de Ca2+ para la FRA inducida por IAA y NO. Se evaluó el efecto de varios
inhibidores de canales de Ca2+ y quelantes de Ca2+ sobre la FRA inducida por IAA y NO. Para
ello, semillas de pepino se germinaron en H2O y se mantuvieron a 25 ºC por 7 días con un
fotoperíodo de 14 horas luz/ 10 horas oscuridad. Las plántulas se preincubaron por 2 horas con
los agentes a testear y luego de la remoción de los sistemas radicales primarios, se evaluó el
enraizamiento de los explantos incubándolos en cajas de Petri conteniendo papel de filtro
embebido sólo en los diferentes agentes, o junto con 10 μM IAA o 10 μM del dador de NO
SNP. Los agentes farmacológicos utilizados fueron los siguientes: 1) hidrocloruro de
metoxiverapamil (MV; Moyen et al., 1998; Shishova y Lindberg, 2004), rojo rutenio (RR; Price
et al., 1994; Allen et al., 1995) y nicotinamida (NA) que inhiben la liberación de Ca2+ desde
canales sensibles a cADPR/rianodina; 2) cloruro de litio (LiCl) y sulfato de neomicina (NEO)
que bloquean canales de Ca2+ regulados por IP3; 3) cloruro de lantano (LaCl3) que actúa sobre
canales de Ca2+ de membrana plasmática y 4) etilen glicol-bis(2-aminoetileter)-N,N,N',N'-ácido
tetraacético
(EGTA)
y
1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N′,N′-
ácido
tetraacético
tetra(acetoximetil) ester (BAPTA-AM), quelantes de Ca2+ impermeable y permeable a la
membrana plasmática, respectivamente.
La Figura 17 muestra que los tratamientos con NO e IAA promueven la FRA en pepino,
y que la aplicación de los agentes RR y MV bloquea significativamente la inducción del
enraizamiento promovida por NO o IAA. Debido a que se ha observado que la aplicación
exógena de RR y MV puede inhibir canales de Ca2+ de membrana plasmática (White, 2000;
60
White et al., 2002), se testeó el efecto de NA que, siendo un producto de la actividad de la
enzima ADPR ciclasa, inhibe la síntesis de cADPR (Wu et al., 1997). El tratamiento de los
explantos de pepino con NA resultó en una reducción significativa en la FRA inducida por IAA
o NO (Figura 17).
El eflujo de Ca2+ desde reservorios intracelulares puede también ser mediado por el
segundo mensajero IP3 (Allen et al., 1995). Por lo tanto, los bloqueantes de canales de Ca2+
regulados por IP3 LiCl (que suprime la síntesis de IP3 inhibiendo la enzima inositol-1-fosfatasa;
Gillaspy et al., 1995; Liang et al., 1996) y NEO (que inhibe la síntesis de IP3 evitando la unión
de la enzima PLC a su sustrato PIP2; Munnik et al, 1998) se administraron a explantos de pepino
en presencia o ausencia de NO o IAA. Estos inhibidores suprimieron significativamente la FRA
inducida por IAA o NO (Figura 17).
Debido a que las vías de señalización mediadas por Ca2+ dependen de la activación de
canales de Ca2+ de membrana plasmática y el consecuente influjo de Ca2+ extracelular a las
células (Sanders et al., 2002), se analizó el efecto del inhibidor de canales de Ca2+ de membrana
plasmática LaCl3 (Huang et al., 1994; van der Meulen et al., 1996) sobre la inducción de la
FRA. Los resultados presentados en la Figura 17 indican que el LaCl3 fue capaz de prevenir el
efecto estimulatorio del NO e IAA en la FRA. Sin embargo, estos resultados deben ser
interpretados con precaución debido a que el LaCl3 puede también bloquear canales de Ca2+
intracelulares. Se ha observado que el LaCl3 entra a las células cuando se provee en
concentraciones milimolares por períodos mayores a 1 minuto (Peeters et al., 1989).
La participación de Ca2+ extracelular e intracelular se confirmó utilizando el quelante de
Ca2+ impermeable a la membrana plasmática EGTA y el quelante de Ca2+ permeable a la
membrana plasmática BAPTA-AM (van der Luit et al., 1999; Cousson, 2003), respectivamente.
La Figura 17 muestra que estos compuestos bloquearon significativamente la FRA inducida por
IAA o NO.
61
Figura 17. El Ca2+ es requerido para la FRA inducida por IAA o NO. Explantos de pepino se incubaron
por 5 días con diferentes quelantes de Ca2+ o inhibidores de canales de Ca2+ en presencia o ausencia de 10
µM del dador de NO SNP o de 10 μM de la auxina IAA. Los valores de número de raíces se expresan
como la media ± ES (n=10 explantos de al menos 3 experimentos independientes). Las barras con
asterisco son significativamente diferentes (test de T, p<0.05) de su control sin SNP o IAA. MV,
hidrocloruro de methoxiverapamil (150 μM); RR, rojo rutenio (50 μM); NA, nicotinamida (100 μM);
LiCl, cloruro de litio (5 mM); NEO, sulfato de neomicina (50 μM); LaCl3, cloruro de lantano (500 μM);
EGTA, etilen glicol-bis(2-aminoetileter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético (100 μM); BAPTA-AM, 1,2-bis(oaminofenoxi)etano-N,N,N′,N′- ácido tetraacético tetra(acetoximetil) ester (100 μM). Las concentraciones
utilizadas de los compuestos se seleccionaron luego de una puesta a punto tomando como referencia
concentraciones utilizadas en la bibliografía disponible.
La actividad CDPK es inducida por IAA en una vía mediada por NO
Con el objetivo de estudiar una posible relación entre el Ca2+ y las proteínas sensoras de
Ca2+, se midió la actividad de CDPKs en explantos de pepino. La aproximación metodológica
consistió en cuantificar su actividad tanto in vitro como en geles desnaturalizantes de
poliacrilamida copolimerizados con la proteína histona IIIS como sustrato. Para ello, explantos
de pepino se trataron con H2O (control), IAA, SNP, o con IAA o SNP con el agregado del
secuestrante específico de NO cPTIO; y se obtuvieron extractos solubles proteicos a partir de
cada tratamiento. De manera de caracterizar las actividades CDPKs, se separaron las proteínas
de los extractos en geles de proteínas conteniendo histona IIIS (Roberts y Harmon, 1992).
Luego de un tratamiento de renaturalización, se determinó la actividad quinasa de proteína en el
gel incubándolo en un medio fosforilante en presencia de ATP [γ-32P] y de Ca2+ o de EGTA.
62
Se detectó una única banda de actividad que fue dependiente de Ca2+ por ensayos en
gel, correspondiendo a una masa molecular aparente de 50 kDa (Figura 18). Debido a que no se
detectó ninguna señal en ausencia de Ca2+ (SNP+EGTA e IAA+EGTA, Figura 18A y B,
respectivamente), la señal fosforilante de 50 kDa fue atribuida a una actividad CDPK. Sin
embargo, se ha reportado que la histona IIIS puede ser fosforilada por otras quinasas de proteína
de serina y treonina como NtOSAK de tabaco (Lamotte et al., 2006).
La actividad CDPK se detectó luego del 1er día de tratamiento con SNP e IAA y se
extendió hasta el 3er o el 4to día de tratamiento, respectivamente (Figura 18A y B). La actividad
de la CDPK de 50 kDa se retrasó en extractos proteicos de explantos tratados con SNP más
cPTIO (Figura 18A). Más aún, esta actividad fue tenue tanto en el 3er como en el 4to día de
tratamiento con IAA+cPTIO comparado con el tratamiento con IAA (Figura 18B). Bajo estas
condiciones experimentales ninguna actividad se detectó en los tratamientos con H2O y con
cPTIO (Figura 18C).
Figura 18. La actividad CDPK es inducida por IAA y NO durante la FRA. (A) Explantos de pepino se
incubaron por diferentes tiempos con SNP 10 μM o con SNP más 200 μM del secuestrante específico de
NO cPTIO. La actividad CDPK se midió por ensayos en gel en extractos proteicos solubles totales de
hipocótilos de explantos en presencia o ausencia de Ca2+ (+EGTA). La flecha indica una masa molecular
aparente de 50 kDa. (B) Explantos de pepino se incubaron por diferentes tiempos con IAA 10 μM o con
IAA más cPTIO 200 μM. La actividad quinasa de proteína se midió en presencia o ausencia de Ca2+
(+EGTA). La flecha indica una masa molecular aparente de 50 kDa. (C) Explantos de pepino se
incubaron por diferentes tiempos con H2O o con cPTIO 200 μM y los extractos proteicos de los
hipocótilos de dichos explantos se utilizaron para ensayos en gel.
63
Para confirmar inequívocamente que la actividad CDPK de 50 kDa detectada durante la
FRA inducida por IAA y NO es un miembro de la familia de CDPKs, se llevaron a cabo
experimentos de quinasa de proteína en gel con extractos proteicos de explantos tratados con
SNP o IAA en presencia de 100 μM de los antagonistas de calmodulina dihidrocloruro de
trifluoperazina (TFP) e hidrocloruro de N-(6-aminohexil)-5-cloro-1-naftalensulfonamida (W-7).
Se ha reportado que TFP inhibe CDPKs de plantas por competencia de la unión del Ca2+ al
dominio similar a la calmodulina (Harmon et al., 1987; Roberts y Harmon, 1992). W-7 es
ampliamente usado para estudiar el rol de la calmodulina en diferentes vías de señalización y se
ha demostrado que es un inhibidor bastante inespecífico de enzimas dependientes de Ca2+ (Lam
et al., 1989; Anil y Rao, 2000). La señal fosforilante de 50 kDa no se detectó cuando los
ensayos de actividad quinasa de proteína en gel se llevaron a cabo con extractos de explantos
tratados con inhibidores (no mostrado), sugiriendo que la CDPK de 50 kDa posee dominios de
unión a Ca2+ similares a la calmodulina.
Debe señalarse que los resultados obtenidos en los ensayos de actividad quinasa de
proteína en gel dependen de la capacidad que posee cada CDPK de resistir el proceso de
desnaturalización y subsecuente renaturalización. Por ello, se realizaron ensayos de actividad
quinasa de proteína in vitro en presencia de ATP [γ-32P] y syntide-2 como sustrato sintético para
confirmar y cuantificar el efecto de los antagonistas de calmodulina TFP y W-7. La actividad
CDPK se determinó midiendo la incorporación de 32P al sustrato syntide-2 en presencia de Ca2+
o de EGTA mediante un contador de centelleo. La actividad CDPK se calculó como la
diferencia entre la actividad en presencia de Ca2+ y la actividad en presencia de EGTA.
La Tabla 1 muestra que en los extractos proteicos de los explantos tratados con SNP en
presencia de TFP 100 μM y W-7 100 μM (SNP+INH), la actividad CDPK se inhibió totalmente
al 1er día y más de un 40 % entre el 2do y el 4to día. Adicionalmente, la actividad CDPK in
vitro se inhibió significativamente en extractos provenientes de explantos tratados con IAA más
una combinación de los antagonistas de calmodulina TFP 100 μM y W-7 100 μM (Tabla 1).
64
Tabla 1. Efecto de antagonistas de calmodulina sobre la actividad CDPK inducida por NO o IAA en
explantos de pepino.
Explantos de pepino se incubaron por diferentes tiempos con SNP 10 µM o IAA 10 µM en presencia
(INH) o ausencia de una combinación de 100 µM de los antagonistas de calmodulina dihidrocloruro de
trifluoperazina (TFP) e hidrocloruro de N-(6-aminohexil)-5-cloro-1-naftalensulfonamida (W-7). La
actividad CDPK in vitro se midió en extractos proteicos solubles totales de los hipocótilos. Los datos se
expresan como la media ± ES de 2 experimentos independientes con 2 repeticiones para cada punto. La
actividad CDPK in vitro fue de aproximadamente 25 pmol 32P min-1 mg-1 prot a cada tiempo en los
explantos control tratados con H2O, y al momento de la remoción del sistema radical primario (T0).
Actividad CDPK (pmol 32P min-1 mg-1 prot)
Tratamiento
Días de tratamiento
1
2
3
4
SNP
42.7±3.5
62.4±8.7
96.9±8.7
89.9±5.2
SNP+INH
2.2±1.0
34.6±3.8
56.5±7.0
48.2±4.1
IAA
53.6±8.8
72.9±3.6
58.9±2.6
44.1±2.2
IAA+INH
4.5±2.1
2.3±0.9
28.5±1.5
2.4±1.0
La actividad CDPK es requerida para la formación de raíces adventicias
Se evaluó si la inhibición de la actividad CDPK afecta la capacidad de enraizamiento de
los explantos. Para ello, plántulas de pepino se preincubaron con TFP 100 μM, W-7 100 μM o
hidrocloruro de clorpromazina (CPZ) 100 μM por 2 horas. Luego, se removieron los sistemas
radicales primarios y los explantos resultantes se incubaron sólo con los antagonistas de
calmodulina, o junto con IAA o con SNP.
Como se observa en la Figura 19A, los antagonistas de calmodulina previnieron la FRA
inducida por IAA y NO. El efecto inhibitorio de TFP fue mayor que el de W-7 y el de CPZ
(Figura 19A). La potencia de estas drogas está de acuerdo con trabajos en los cuales se evalúo la
eficacia de estos tres compuestos en inhibir la actividad de CDPKs (Abo-El-Saad y Wu, 1995;
MacIntosh et al., 1996). La Figura 19A muestra que el inhibidor TFP disminuyó
significativamente la FRA comparada con los explantos tratados con H2O, sugiriendo que las
vías de señalización que se encuentran bajo el control de pooles endógenos de auxinas y NO han
sido afectados. En la Figura 19B se muestran fotos de explantos de pepino representativos luego
de 5 días de tratamiento.
65
Figura 19. La inhibición de la actividad CDPK bloquea la FRA inducida por NO o IAA. (A) Explantos de
pepino se trataron con SNP 10 μM o IAA 10 μM en presencia o ausencia de dihidrocloruro de
trifluoperazina (TFP) 100 μM, de hidrocloruro de N-(6-aminohexil)-5-cloro-1-nafthalensulfonamida (W7) 100 μM o de hidrocloruro de clorpromazina (CPZ) 100 μM por 5 días como se indica. El número de
raíces se expresa como la media ± ES (n=10 explantos de al menos 3 experimentos independientes). Las
barras con asterisco son significativamente diferentes (test de T, p<0.05) de su control sin SNP o IAA.
(B) Se muestran fotografías representativas a los 5 días de tratamiento. Barra=5 mm.
El inhibidor de la enzima guanilato ciclasa LY83583 previene la activación de
CDPKs por auxinas y NO
Resultados de nuestro laboratorio demostraron que la FRA inducida por IAA es
mediada por NO y requiere de la actividad de la enzima GC (Pagnussat et al., 2003). Como se
dijo previamente, GC cataliza la síntesis del segundo mensajero cGMP. Con el objeto de
estudiar la dependencia de cGMP en la activación de CDPKs, se midió la actividad CDPK in
vitro y en gel en extractos proteicos solubles de explantos tratados con IAA o con SNP en
presencia o ausencia de 50 μM del inhibidor de GC LY83583. Se ha demostrado que a esta
concentración el inhibidor LY83583 bloquea los efectos del IAA y del NO en promover la FRA
en explantos de pepino (Pagnussat et al., 2003).
En la Figura 20 se observa que la actividad CDPK in vitro en respuesta a auxinas y NO
fue fuertemente inhibida por la aplicación de LY83583. Esta inhibición fue transientemente
66
revertida por la adición del análogo de cGMP permeable a la membrana plasmática 8-Br-cGMP
(no mostrado). A su vez, los experimentos en gel de explantos tratados con SNP+LY83583 o
IAA+LY83583 resultaron en una inhibición total de la actividad de la CDPK de 50 kDa (no
mostrado). Estas evidencias indican que la actividad CDPK es inducida por IAA en una vía
dependiente de NO y de cGMP.
Figura 20. El inhibidor de la enzima guanilato ciclasa LY83583 previene la inducción de la actividad
CDPK por NO o IAA. Explantos de pepino se incubaron por diferentes tiempos con SNP 10 μM o IAA
10 μM en presencia o ausencia de LY83583 50 μM. La actividad CDPK in vitro se midió en extractos
proteicos solubles totales de los hipocótilos de los explantos. Los valores se expresan como pmol 32P min1
mg-1 prot. Los datos provienen de 2 experimentos independientes con 2 repeticiones para cada punto.
67
CAPÍTULO III: Discusión
La cADPR y los incrementos en la [Ca2+]cit han sido descriptos como mensajeros en las
vías de señalización dependientes de cGMP inducidas por NO tanto en animales como en
plantas (Stamler et al., 1992; Neill et al., 2003; Lamattina et al., 2003). En este capítulo, se
analizó si la FRA inducida por NO y mediada por cGMP (Pagnussat et al., 2003) involucra una
vía dependiente de cADPR y de Ca2+. Los datos obtenidos a partir del tratamiento de los
explantos de pepino con compuestos que bloquean canales de Ca2+ sensibles a
cADPR/rianodina (MV y RR) o bloquean la síntesis de cADPR (NA) indican que estos
inhibidores provocan una reducción significativa en la FRA inducida por IAA y NO (Figura
17). Estos resultados son consistentes con un reporte que mostró que la estimulación de la
formación de raíces de novo por auxinas en la monocotiledónea Commelina communis fue
suprimida por el tratamiento con el: (i) inhibidor de GC LY83583, (ii) quelante de Ca2+
BAPTA, (iii) inhibidor de la liberación de Ca2+ desde reservorios intracelulares RR o (iv)
inhibidor de la síntesis de cADPR NA (Cousson, 2004). Estas evidencias sugieren que el cGMP
puede estar implicado en la movilización del Ca2+ por estimulación de la síntesis de ADPR y la
liberación subsecuente de Ca2+ desde canales de Ca2+ sensibles a cADPR/rianodina. Nuestros
resultados indican que esta vía de señalización también es operativa en una planta dicotiledónea
durante la FRA y que depende de NO. Aunque no se puede excluir la posibilidad de que otros
canales de Ca2+ pueden afectarse debido a la baja especificidad de los inhibidores MV y RR, los
resultados presentados en la Figura 17 sugieren que canales de Ca2+ sensibles a
cADPR/rianodina están involucrados en las vías de señalización disparadas por IAA y NO que
conducen a la FRA. Un proceso similar ocurre en animales donde el NO activa canales de Ca2+
sensibles a cADPR/rianodina indirectamente mediante una vía dependiente de cGMP y de
cADPR (Willmott et al., 1996) o directamente a través de S-nitrosilación (Xu et al., 1998).
Además de la función del cGMP en mediar vías dependientes de cADPR y de Ca2+, el
cGMP participa también en la activación de canales de Ca2+ de membrana plasmática. Estos
canales se denominan CNGCs (cyclic nucleotide-gated ion channels) y fueron identificados a lo
largo de todo el reino vegetal. Los CNGCs son permeables a cationes monovalentes y divalentes
68
(típicamente K+, Na+ y Ca2+) y son activados directamente por cGMP y/o cAMP (LemtiriChlieh et al., 2004; Bridges et al., 2005).
Otra vía por la cual el Ca2+ es liberado desde reservorios intracelulares es a través de
canales de Ca2+ regulados por IP3 (Alexandre et al., 1991; Allen et al., 1995). Nuestros datos
indican que los inhibidores de canales de Ca2+ regulados por IP3 reducen significativamente la
FRA en los explantos tratados con NO o con IAA (Figura 17). En concordancia, existe
evidencia de que las auxinas inducen incrementos en la concentración de IP3 (Ettlinger y Lehle,
1988; Zbell et al., 1989). Se ha propuesto que los canales de Ca2+ regulados por IP3 del
tonoplasto podrían estar involucrados en el incremento de la [Ca2+]cit disparada por auxinas
(Shishova y Lindberg, 2004). En animales, se ha reportado que el NO activa la enzima PLC, la
cual cataliza la formación de IP3. Por lo tanto, la actividad PLC se ha propuesto como parte de
la vía inducida por NO que controla la [Ca2+]cit a través de IP3 (Clementi et al., 1995).
Resultados obtenidos en nuestro laboratorio muestran también una activación de PLC
dependiente de NO en células de tomate tratadas con el elicitor fúngico xylanasa (Laxalt et al.,
2007).
Se ha investigado la existencia de canales de Ca2+ regulados por IP3 o por
cADPR/rianodina en plantas como los descriptos en animales. Sobre la base del análisis de
secuencias, los autores no encontraron proteínas homólogas en los genomas de Arabidopsis y
arroz (Oryza sativa; Nagata et al., 2004). Sin embargo, ambos tipos de canales han sido
implicados en diferentes procesos en plantas por estudios bioquímicos, electrofisiológicos y
farmacológicos. En particular, la apertura de canales de Ca2+ regulados por IP3 está involucrada
en: i) la regulación del turgor en respuesta a estrés hiperosmótico en raíces de remolacha (Beta
vulgaris; Allen y Sanders, 1994), ii) el cierre estomático en respuesta a ABA (Staxén et al.,
1999) y iii) la auto-incompatibilidad y las respuestas de reorientación de tubos polínicos
(Malhó, 1998; Franklin-Tong, 1999). Por otra parte, se ha propuesto que los canales de Ca2+
sensibles a cADPR/rianodina participan de 2 vías de señalización dependientes de ABA: cierre
estomático e inducción de genes; las cuales son prevenidas por inhibición de la producción de
69
cADPR y estimuladas por microinyección de cADPR o de Ca2+ (Wu et al., 1997; Leckie et al.,
1998).
Los resultados indican que el bloqueante de canales de Ca2+ de membrana plasmática
LaCl3 compromete significativamente la FRA inducida por IAA o NO (Figura 17). En
concordancia, se ha reportado que el NO regula cambios en la [Ca2+]cit a través del influjo de
Ca2+ desde la membrana plasmática en células de tabaco (Lamotte et al., 2004). En la misma
dirección, las auxinas activan el transporte de Ca2+ desde el espacio extracelular a través de
canales de Ca2+ de membrana plasmática en protoplastos de hoja de trigo (Triticum aestivum;
Shishova y Lindberg, 2004). El requerimiento de Ca2+ extracelular para promover la FRA en
explantos de pepino fue corroborado por medio del uso del quelante de Ca2+ impermeable a la
membrana plasmática EGTA (Figura 17).
A pesar de las limitaciones que poseen las aproximaciones farmacológicas, los datos
presentados en la Figura 17 indican que fuentes de Ca2+ intracelulares y extracelulares y que el
mantenimiento de una homeostasis del catión Ca2+ son requeridas para la acción del IAA y del
NO en inducir la FRA en pepino. Por lo tanto, además de la función del Ca2+ como nutriente
mineral modulando el crecimiento de la raíz (Druart, 1997; Bellamine et al., 1998), las
evidencias sugieren que el Ca2+ es un segundo mensajero que conecta a las auxinas y al NO con
la activación del proceso de FRA.
Se ha postulado que las CDPKs están involucradas en vías de señalización que utilizan
cambios en la [Ca2+]cit para acoplar respuestas celulares a estímulos extracelulares (Roberts y
Harmon, 1992). En los explantos de pepino, se detectó un incremento en la actividad de una
CDPK de 50 kDa luego de 1 día de tratamiento con SNP o IAA (Figura 18). El secuestrante
específico de NO cPTIO retrasó la inducción de la actividad CDPK en los explantos tratados
con NO y la disminuyó en aquellos tratados con IAA (Figura 18). Estos resultados sugieren que
la CDPK de 50 kDa detectada por ensayos en gel en los tratamientos con NO e IAA es la misma
y requiere de la presencia de NO para su máxima y sostenida activación. Aún se desconoce si la
activación de esta CDPK está acompañada por un incremento paralelo en el nivel de proteína.
70
La tasa de liberación de NO del dador SNP muestra un pico máximo al 2do día en
solución acuosa (Beligni y Lamattina, 2002). Este hecho podría explicar la inactivación parcial
de la CDPK de 50 kDa en el tratamiento con SNP+cPTIO al 2do y 3er día de tratamiento
(Figura 18). Por otra parte, se ha reportado un incremento transiente en el nivel de NO endógeno
durante el 1er día de tratamiento de los explantos de pepino con IAA (Pagnussat et al., 2002).
Por lo tanto, la cantidad de cPTIO utilizada podría ser insuficiente para secuestrar
completamente el NO e inhibir completamente la actividad CDPK durante el 1er y 2do día de
tratamiento con IAA+cPTIO (Figura 17).
Las diferencias en los patrones de actividad CDPK medida por ensayos in vitro (Tabla
1) y en gel (Figura 18) podrían ser explicadas por la naturaleza de los experimentos. Mientras
que en los ensayos in vitro se mide la actividad CDPK total, en los ensayos en gel sólo se
detectan las CDPKs que son capaces de renaturalizarse bajo las condiciones experimentales.
Adicionalmente, syntide-2 es usado como sustrato para los ensayos in vitro e histona IIIS para
los ensayos en gel.
Se han estudiado los cambios en la actividad CDPK in vitro en explantos de pepino
tratados por tiempos cortos (10, 20, 40, 60, 90 y 120 minutos) con SNP o IAA 10 µM (ML
Lanteri, Tesis de Grado, 2003). Luego de 10 minutos de tratamiento con SNP, se observó un
incremento en la actividad CDPK, alcanzando un máximo a los 20 minutos de tratamiento. El
agregado de IAA también resultó en un pico máximo de actividad CDPK in vitro a los 20
minutos de tratamiento. En los explantos tratados con IAA o SNP en presencia de cPTIO, la
actividad CDPK fue similar al control con H2O a todos los tiempos analizados. Sin embargo, no
pudo detectarse ninguna actividad CDPK por ensayos en gel en tratamientos por tiempos cortos
con SNP o IAA (ML Lanteri, Tesis de Grado, 2003).
Es importante destacar que los antagonistas de calmodulina TFP, W-7 y CPZ no son
específicos para inhibir las CDPKs, sino que también afectan la actividad de otras proteínas de
unión a Ca2+ como la calmodulina y las proteínas relacionadas con calcineurina B (Anil y Rao,
2000). Sin embargo, nuestros resultados muestran una inhibición de la actividad CDPK por
estos compuestos tanto en los ensayos in vitro (Tabla 1) como en los ensayos en gel (no
71
mostrado). Esto no excluye la posibilidad de que la inhibición de otras proteínas por TFP, W-7 y
CPZ puede afectar el proceso de FRA.
Las auxinas afectan la expresión de diversas CDPKs. Se ha reportado una inducción de
la expresión del gen MsCPK3 en respuesta a auxinas en microcallos en suspensión de alfalfa
(Davletova et al., 2001). El tratamiento de plantas de Vigna radiata con IAA y cloruro de Ca2+
induce la expresión de VrCPK1 (Botella et al., 1996). El tratamiento de hojas de tabaco con
IAA causa una leve inducción del transcripto de NtCPK1 (Yoon et al., 1999). En pepino, el
tratamiento de cotiledones etiolados con IAA incrementó la expresión del transcripto de
CsCPK5 (Kumar et al., 2004). Sin embargo, al momento de la realización de esta tesis no existía
ninguna evidencia con respecto a la regulación de la expresión y/o la actividad de CDPKs
mediada por NO. En este Capítulo se presenta evidencia de que durante la FRA, las auxinas y el
NO regulan vías de señalización mediadas por Ca2+, afectando así la actividad CDPK.
El aislamiento de 5 cDNAs que codifican para CDPKs en pepino provee evidencia de la
existencia de múltiples isoformas y genera el interrogante de la función fisiológica de cada una
de ellas (Ullanat y Jayabaskaran, 2002; Kumar et al., 2004). Para dilucidar la función de cada
isoforma serán necesarios estudios que incluyan: i) perfiles de expresión específicos de tipos
celulares, tejidos y órganos, ii) identificación de sustratos específicos y iii) localización
subcelular. La actividad de la CDPK de 50 kDa se detectó en hipocótilos de pepino luego del
1er día de tratamiento con IAA, manteniéndose dicha actividad por 3 días de tratamiento
continuo con IAA (Figura 18). Debido a que la actividad CDPK se detectó en etapas tempranas
de la FRA, esta quinasa de proteína podría estar asociada con la dediferenciación, división y/o
diferenciación celular. Estos resultados confirman aquellos reportados por Kobayashi y Fukuda
(1994) y por Komatsu et al. (1996), quienes mostraron que proteínas de unión a Ca2+ y quinasas
de proteína están involucradas en procesos de diferenciación celular en plantas. Además,
estudios con plantas de tabaco transgénicas han confirmado un rol de señalización para NtCPK1
mediando respuestas a auxinas. Plantas con expresión suprimida de NtCPK1 poseen un
desarrollo radical anormal, con una reducción en la formación de raíces laterales, en la
elongación de las raíces (Lee et al., 2003a) y en el crecimiento de pelos radicales (Ivashuta et
72
al., 2005). Adicionalmente, NtCPK1 interactúa con y fosforila una subunidad del complejo
regulatorio del proteasoma 26S (Lee et al., 2006). Como la vía ubiquitina/proteasoma ha sido
relacionada con la señalización por auxinas (Kepinski y Leyser 2005; Dharmasiri et al., 2005a),
NtCPK1 podría integrar señales de Ca2+ con la activación de la vía del proteasoma inducida por
auxinas, sincronizando procesos de división, expansión y diferenciación celular.
La mayoría de las vías de señalización de eucariotas involucran especificidad espacial y
temporal de los incrementos en la [Ca2+]cit, tanto por liberación de Ca2+ desde reservorios
intracelulares como por influjo de Ca2+ desde el espacio extracelular, estando estos procesos
íntimamente relacionados. El otro mecanismo recurrente en la señalización de células eucariotas
es la fosforilación reversible de proteínas que incluye quinasas de proteína y fosfatasas. Los
resultados presentados en este Capítulo proveen evidencias que sustentan la participación de
estos dos eventos de señalización en las vías inducidas por auxinas y NO durante la FRA en
73
vía fosfolipasa D durante la formación de
raíces adventicias en pepino
CAPÍTULO IV
Las auxinas y el NO inducen la acumulación de ácido fosfatídico
CAPÍTULO IV: Resultados
Las auxinas y el NO inducen la acumulación de fosfolípidos señales
Debido a que bloqueantes de canales de Ca2+ regulados por IP3 suprimieron la FRA
inducida por IAA o NO (Figura 17), hipotetizamos que la enzima PLC, que cataliza la
formación de IP3 y DAG, podría formar parte de la vía de señalización que conduce a la FRA.
En plantas, DAG es subsecuentemente convertido a PA a través de la acción de la enzima DGK
(Figura 2). Se abordó entonces el estudio de la señalización por PLs durante la FRA inducida
por auxinas y NO en explantos de pepino. Para ello, semillas de pepino se germinaron en H2O y
se mantuvieron a 25 ºC por 7 días con un fotoperíodo de 14 horas luz/ 10 horas oscuridad. El
sistema radical primario de las plántulas se removió y los explantos resultantes se marcaron in
vivo con 32Pi por 16 horas y luego se trataron por distintos tiempos. Los niveles de PLs in vivo se
midieron en segmentos de 5 mm de longitud obtenidos de la base de los hipocótilos, donde se
desarrollan las raíces adventicias (Figura 4). Los PLs se analizaron por TLC y posterior
autorradiografía. Se realizaron diferentes exposiciones de las autorradiografías para obtener
señales correctas (no sobreexpuestas) para los análisis densitométricos (Figura 21). Las
cuantificaciones se realizaron utilizando el software ImageJ. La estandarización se llevó a cabo
dividiendo la radiactividad en los PLs señales sobre la de los PLs totales para cada tratamiento.
Los valores se expresan como veces de acumulación con respecto al control ± SE, tomando el
control como 1. La identificación de los PLs se estableció por co-cromatografía y comparación
de Rfs (movilidad relativa del PL al frente de solventes) con lípidos de composición conocida y
estándares comerciales.
74
Figura 21. Esquema que muestra autoradiografías enteras de TLCs alcalinas (A y B) y TLCs EtAc (C y
D). Se observan dos exposiciones de las autoradiografías, una para cuantificar las intensidades de las
señales correspondientes a los PLs estructurales (SPLs; B y D) y otra para los PLs señales (A y C). Las
muestras correspondientes a los lípidos extraídos de los distintos tratamientos (C=control, SNAP, NAA e
IAA) se corrieron juntas en la misma TLC. Los lípidos de hipocótilos independientes de un mismo
tratamiento se sembraron uno al lado del otro.
La Figura 22A muestra un patrón típico de los PLs radiactivos extraídos de los
hipocótilos de pepino y separados por TLC con un sistema de solventes alcalino. Los resultados
indican que este sistema permite la detección de: i) PLs estructurales (SPLs): fosfatidilglicerol
(PG), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilcolina (PC) y fosfatidilinositol (PI), y ii) PLs señales:
PA, PIP y PIP2. Para una mejor visualización de PA, se muestra también la autorradiografía
correspondiente a los PLs separados por TLC con el sistema de solvente de EtAc (Figura 22B).
Como se visualiza en la Figura 20A, la mayoría del 32Pi se incorporó en los SPLs, siendo sus
niveles invariables en todos los tratamientos (Figura 22C).
75
Con el objeto de investigar si las auxinas inducen vías de señalización por PLs, los
explantos se trataron por 10 minutos con buffer (C=control) o con 10 μM de las auxinas ácido
1-naftilacético (NAA) o IAA. En la Figura 22A se observa que los tratamientos con NAA 10
μM o IAA 10 μM promueven una acumulación de los PLs señales PA, PIP y PIP2. Ambos
tratamientos con auxinas resultaron en valores de acumulación de PLs de aproximadamente 2
veces (Figura 22C). Se decidió utilizar IAA 10 μM para continuar con el estudio del efecto de
las auxinas en la señalización por PLs.
Debido a que el tratamiento con auxinas induce la formación de NO (Pagnussat et al.,
2002), se analizó si el dador de NO SNAP era capaz de mimetizar el efecto de la auxina en
inducir la acumulación de PLs señales. Se sabe que el tratamiento con SNAP 10 μM induce la
FRA luego de 5 días de tratamiento y que el efecto del NO depende de las concentraciones del
dador (Pagnussat et al., 2002). Las concentraciones comúnmente aplicadas de dadores de NO y
que han demostrado un efecto biológico varían entre 10 μM y 500 μM (Floryszak-Wieczorek et
al., 2006), por lo que se eligieron estas dos dosis para los experimentos. En la Figura 22B y C se
muestra que la intensidad de la respuesta depende de la dosis de NO. El NO liberado luego de
10 minutos de tratamiento con SNAP 10 µM no produjo efecto sobre los niveles de PA, PIP y
PIP2. Sin embargo, el tratamiento con SNAP 500 µM indujo una acumulación de
aproximadamente 2 veces, similar al efecto de las auxinas (Figura 22C). Por otra parte, el dador
de NO SNP no indujo acumulación de PA, PIP y PIP2 en las mismas dosis y tiempos utilizados
para SNAP (no mostrado).
Los solventes EtOH y DMSO se utilizaron para disolver las auxinas (NAA e IAA) y el
SNAP, respectivamente. No se detectaron cambios significativos en la acumulación de los PLs
señales cuando los explantos se trataron con EtOH 0.002 % (v/v) o DMSO 0.5 % (v/v),
equivalentes a las concentraciones finales alcanzadas en los tratamientos con IAA 10 μM y
SNAP 500 μM, respectivamente (no mostrado).
76
Figura 23. PA, PIP y PIP2 se acumulan rápida y transientemente frente al tratamiento con auxinas y NO.
Explantos de pepino se marcaron como se explica en la Figura 22 y se incubaron con buffer (C=control),
IAA 10 μM o SNAP 500 μM por diferentes tiempos. Los PLs se extrajeron y separaron por TLC usando
el sistema de solventes de EtAc (A) o un sistema alcalino de solventes (B). La radiactividad se visualizó
por autorradiografía y se cuantificó como se describió. (C) Autorradiografía de mayor exposición de la
TLC mostrada en B mostrando el incremento en PIP2. (D) Los resultados se expresan como veces de
acumulación con respecto al control ± ES tomando los valores controles como 1. Los datos representan 3
experimentos independientes. Los valores con asterisco son significativamente diferentes (test de T,
p<0.05) del tratamiento control.
La acumulación de fosfolípidos señales inducida por auxinas depende de NO
Con el fin de evaluar si la acumulación de PLs señales por auxinas requiere de NO, se
llevaron a cabo experimentos utilizando el secuestrante específico de NO cPTIO. Para ello, los
explantos se marcaron con
32
Pi por 16 horas y luego se trataron por 10 minutos con buffer
79
Figura 22. Las auxinas y el NO inducen la acumulación de PA, PIP y PIP2. Explantos de pepino se
marcaron con 32Pi (15 μCi por explanto) durante 16 horas, y luego se trataron por 10 minutos con buffer
(C=control), con las auxinas NAA o IAA o con el dador de NO SNAP. Los PLs se extrajeron y separaron
por TLC utilizando un sistema alcalino de solventes (A) o el sistema de solventes de EtAc (B). La
radiactividad se visualizó por autorradiografía y se cuantificó a partir de autorradiografías no
sobreexpuestas usando el software ImageJ. (C) La estandardización se llevó a cabo expresando los
resultados como la razón entre la radiactividad en PA, PIP o PIP2 sobre la radiactividad total en PLs. Los
valores se expresaron como veces con respecto al control ± ES dividiendo la razón en un tratamiento por
aquella en el control, tomando el control como 1. Los datos representan 5 experimentos independientes.
Las barras con asterisco son significativamente diferentes (test de T, p<0.05) del tratamiento control.
77
Los fosfolípidos señales se acumulan rápida y transientemente frente a
tratamientos con auxinas y NO
Para caracterizar la acumulación de PLs señales inducida por auxinas y NO, se llevó a
cabo un experimento midiendo los niveles de PLs in vivo en función del tiempo de tratamiento.
Los explantos se marcaron con
32
Pi por 16 horas y luego se trataron por 1, 5, 10, 20 y 30
minutos con buffer (C=control), IAA 10 µM o SNAP 500 µM. Los PLs se separaron por TLC
con el sistema de solventes de EtAc (Figura 23A) y con un sistema de solventes alcalino
(Figuras 23B y C), y se cuantificaron como se describió previamente.
En la Figura 23 A-D se observa que la acumulación de PA, PIP y PIP2 es una respuesta
rápida frente al tratamiento con auxinas y NO (alrededor de 1.5 veces de acumulación luego de
1 minuto de tratamiento). Como se muestra en la Figura 23D, la máxima acumulación de PIP y
PIP2 es previa (pico máximo a 5 minutos) a la de PA (pico a 10 minutos). Además, las auxinas y
el NO indujeron curvas de tiempo similares, debido a que los niveles de los PLs señales
retornaron al valor control luego de 20-30 minutos de tratamiento (Figura 23D). Por lo tanto, el
efecto de la auxina y del NO en inducir la acumulación de PA, PIP y PIP2 es rápido y transiente.
78
(C=control) o IAA 10 µM en presencia o ausencia de cPTIO 200 µM. El tratamiento sólo con
cPTIO arrojó valores de acumulación de PA, PIP y PIP2 similares al control (no mostrado).
Como se muestra en la Figura 24A, el cPTIO bloqueó la acumulación de PA, PIP y PIP2
inducida por auxinas, sugiriendo que el NO actúa por debajo de las auxinas. La Figura 24B
muestra que el cPTIO también bloqueó el efecto del SNAP en inducir la acumulación de PA,
PIP y PIP2, indicando que el efecto del SNAP es específico del NO liberado por este dador.
Estos resultados se confirmaron utilizando una solución de SNAP 500 μM inactivada en luz por
15 días, la cual resultó en una acumulación de PLs similar al control (no mostrado).
Figura 24. La acumulación de PLs señales inducida por auxinas es dependiente de NO. Explantos de
pepino se marcaron como en la Figura 22 y se trataron por 10 minutos con buffer (control), IAA 10 μM
(A) o SNAP 500 μM (B) en presencia o ausencia de 200 μM del secuestrante específico de NO cPTIO.
Los resultados de 3 experimentos independientes se expresan como veces de acumulación de PLs señales
con respecto al control ± ES tomando los valores controles como 1. Los valores con asterisco son
significativamente diferentes (test de T, p<0.05) del tratamiento control.
80
La actividad PLD está involucrada en la acumulación de PA inducida por auxinas
y NO
Las fuentes enzimáticas de producción de PA involucran la enzima PLD y la vía
PLC/DGK. PLD hidroliza SPLs y PLC hidroliza PIP o PIP2 (Munnik et al., 1998; Wang, 2000).
En este punto, nos propusimos dilucidar la fuente(s) enzimática de producción de PA durante el
tratamiento con auxinas en explantos de pepino y no estudiamos por el momento el mecanismo
por el cual las auxinas inducen la acumulación de PIP y PIP2.
Para determinar si la actividad PLD contribuye a la formación de PA, se realizó un
ensayo in vivo para estudiar la capacidad de dicha enzima de transferir el grupo fosfatidil de un
PL sustrato al alcohol primario 1-butanol (denominada actividad fosfatidiltransferasa). La
formación del producto PBut es una medida relativa de la actividad PLD (Munnik et al., 1995).
Los explantos de pepino se marcaron con 32Pi por 16 horas y luego se trataron por 10 minutos
con buffer (C=control) o IAA 10 μM en presencia o ausencia de 1-butanol 0.5 % (v/v).
La Figura 25A muestra una autorradiografía representativa de los PLs extraídos y
separados por TLC utilizando el sistema de solventes de EtAc que separa PBut y PA de los
demás PLs (Munnik et al., 1998). El incremento en PBut es claramente visualizado en la Figura
25B, que corresponde a una autorradiografía de mayor exposición que aquella mostrada en la
Figura 25A. El nivel de PBut se cuantificó y expresó como veces de acumulación con respecto
al control (Figura 25C). Debido a que la cantidad de PBut refleja la actividad PLD, los
resultados presentados en la Figura 25 A-C indican que la auxina induce la activación de PLD.
Debido a que el NO actúa por debajo de las auxinas, se estudió la capacidad de SNAP 500 μM
de mimetizar el efecto de la auxina. El tratamiento con el dador de NO SNAP resultó en una
inducción significativa de la actividad PLD (Figura 25C). Los datos indican que la actividad de
la enzima PLD se incrementa por el tratamiento con auxinas y NO generando PA.
En presencia de 1-butanol, la enzima PLD produce PBut a expensas de PA.
Consecuentemente, el tratamiento con 1-butanol reduce la formación de PA vía actividad PLD.
Por esta razón, se cuantificaron los niveles de PA en explantos de pepino tratados con auxina o
NO en presencia o ausencia de 1-butanol. La Figura 25C muestra una reducción significativa en
81
los niveles de PA en respuesta a auxinas y NO cuando se mide en presencia de 1-butanol,
comparados con la ausencia del alcohol. Finalmente, el agregado de 2-butanol 0.5 % (v/v), un
alcohol secundario que no es sustrato de PLD, no provocó la formación de PBut ni cambios en
los niveles de PA (no mostrado). En resumen, la presencia de 1-butanol causa la aparición de
PBut y una consecuente reducción en los niveles de PA.
Figura 25. La actividad de la enzima PLD está involucrada en la acumulación de PA inducida por auxinas
y NO. Explantos de pepino se marcaron como se indica en la Figura 22 y la actividad PLD in vivo se
midió en explantos tratados por 10 minutos con buffer (C=control), IAA 10 μM o SNAP 500 μM en
presencia o ausencia de 1-butanol 0.5 % (v/v). (A) Los PLs se separaron por EtAc TLC. (B)
Autorradiografía de mayor exposición de la TLC presentada en (A), mostrando el incremento en
fosfatidilbutanol (PBut). (C) Los resultados de 3 experimentos independientes se expresan como veces de
acumulación de PBut o PA con respecto al control ± ES tomando los valores controles como 1. Los
valores con asterisco son significativamente diferentes (test de T, p<0.05) del tratamiento control. ╪
significa diferente de las veces de acumulación de PA en presencia de butanol.
Con el objeto de testear si la actividad DGK contribuye a la formación de PA inducida
por auxinas, se llevó a cabo un experimento de marcación corta basado en que el
32
Pi se
incorpora rápidamente al pool de ATP, el cual es utilizado por DGK para fosforilar DAG y
producir PA (Munnik et al., 1998). Para ello, los explantos se estabilizaron en buffer por 16
horas y luego se marcaron con 32Pi en presencia de buffer (como control) o IAA 10 µM por 1, 5,
10 y 20 minutos. El porcentaje de PA marcado comparado con el total de los PLs marcados se
82
calculó para los tratamientos control e IAA, resultando en valores similares a todos los tiempos
ensayados (no mostrado). Estos resultados preliminares sugieren que la auxina no produce PA
por activación de DGK.
La actividad PLD es requerida para la formación de raíces adventicias inducida
por auxinas y NO
Con el objeto de correlacionar las vías de señalización por PLs y el proceso de FRA, se
llevó a cabo un experimento que consistió en tratar los explantos de pepino por 10 minutos con
buffer (C=control), IAA 10 µM o SNAP 500 µM en presencia o ausencia de cPTIO 200 µM, y
luego incubarlos en H2O por 5 días. Al cabo de ese tiempo se analizó la FRA.
Como se muestra en la Figura 26, los tratamientos de 10 minutos con auxinas y NO
indujeron la FRA, arrojando valores de número de raíces por explanto de 2 veces con respecto
al control. Este resultado es similar al obtenido a los 5 días de tratamiento con auxinas y NO
(Pagnussat et al., 2002). En la Figura 26 se observa también que el cPTIO bloqueó los efectos
del SNAP y de la auxina IAA indicando que: i) el efecto del SNAP es debido a la liberación de
NO y ii) las auxinas dependen de NO endógeno para inducir la FRA. Los tratamientos con
EtOH 0.002 % (v/v), con DMSO 0.5 % (v/v) o con una solución de SNAP 500 μM inactivada
en luz por 15 días no promovieron efectos significativos sobre la FRA (no mostrado).
Finalmente, se evaluó el efecto de 10 minutos de tratamiento con SNP 10 µM o SNP 500 µM
sobre la FRA. Los resultados indicaron que el SNP no afecta este proceso a las concentraciones
utilizadas (no mostrado).
Para investigar si la inhibición de la enzima PLD bloquea la FRA, los explantos se
trataron por 10 minutos con IAA 10 μM o SNAP 500 μM en presencia o ausencia de 1-butanol
0.1 % (v/v) o de 2-butanol 0.1 % (v/v), y se transfirieron subsecuentemente a H2O por 5 días.
La Figura 26 muestra que mientras que el 1-butanol bloqueó completamente la FRA
inducida por auxinas o NO, su isómero inactivo 2-butanol no tuvo efecto sobre la FRA.
83
Figura 26. La actividad de la enzima PLD es requerida para la FRA inducida por auxinas y NO.
Explantos de pepino se trataron por 10 minutos con buffer (C=control), IAA 10 µM o SNAP 500 µM en
presencia o ausencia de cPTIO 200 μM, de 1-butanol 0.1 % (v/v) o de 2-butanol 0.1 % (v/v), y se
transfirieron a H2O por 5 días. Los valores de número de raíces se expresan como la media ± ES (n=10
explantos de al menos 3 experimentos independientes). Las barras con asterisco son significativamente
diferentes (test de T, p<0.05) del tratamiento control.
La aplicación exógena de PA promueve la formación de raíces adventicias
Finalmente se examinó el efecto del agregado exógeno de PA, PC o PS sobre la FRA.
Los explantos se trataron por 1 hora con buffer (C=control) o con buffer más 5 μM de los PLs
debajo detallados, y luego se incubaron en H2O por 5 días. Los PLs ensayados poseen cadenas
de ácidos grasos cortas y saturadas (PA C8:0 y PC C8:0), largas y saturadas (PA C16:0 y PC
C16:0) o largas e insaturadas (PA C18:1 y PS C18:1). La Figura 27 muestra que todas las
especies de PA estimularon la FRA mientras que los tratamientos con PC o PS no resultaron en
un efecto significativo en el número de raíces adventicias por explanto.
En conclusión, las Figuras 26 y 27 presentan evidencia de que el PA derivado de la
actividad PLD está involucrado en la FRA inducida por auxinas y NO en pepino.
84
Figura 27. El agregado exógeno de PA estimula la FRA. Explantos de pepino se trataron por 1 hora con
buffer (C=control) o buffer más 5 µM de PA C8:0, PC C8:0, PA C16:0, PC C16:0, PA C18:1 o PS C18:1,
y luego se transfirieron a H2O por 5 días. Los valores de número de raíces por explanto se expresan como
la media ± ES (n=10 explantos de al menos 3 experimentos independientes). Las barras con asterisco son
significativamente diferentes (test de T, p<0.05) del tratamiento control.
85
CAPÍTULO IV: Discusión
Se ha reportado que el tratamiento de explantos de pepino por 5 días con los dadores de
NO SNAP y SNP induce la FRA (Pagnussat et al., 2002). Los resultados indican que el
tratamiento de 10 minutos con SNAP induce una acumulación significativa de los PLs señales
PA, PIP y PIP2 (Figura 22), y un incremento en el enraizamiento de los explantos (Figura 26).
Sin embargo, el tratamiento con SNP no afecta ni la acumulación de los PLs señales ni el
proceso de FRA (no mostrado). Los efectos disímiles de ambos dadores de NO pueden ser
explicados por su diferente naturaleza. Mientras que el SNAP libera principalmente NO en la
forma redox de radical libre (sin carga), el SNP libera predominantemente NO+ (Hou et al.,
1999). Los dadores de NO pueden también tener distintos efectos por las cantidades de NO que
liberan en el tiempo. Las mediciones de las tasas de liberación de NO por ambos dadores
indicaron que el SNAP posee una menor estabilidad (expresada como vida media) y, por lo
tanto, una estimulación más rápida de la respuesta en comparación con el SNP (FloryszakWieczorek et al., 2006).
En este Capítulo se demostró que la auxina induce una acumulación de PIP y PIP2
dependiente de NO en hipocótilos de pepino (Figura 24A). Tres isómeros de PIP (PI3P, PI4P, y
PI5P) y tres isómeros de PIP2 [PI(3,5)P2, PI(4,5)P2, y PI(3,4)P2] se han identificado en plantas
(Brearley y Hanke, 1993; Munnik et al., 1994; Meijer et al., 2001). La existencia de isómeros de
PIP y PIP2 crea especificidad, determinando diferentes eventos de señalización río abajo
(Stevenson et al., 2000). Se ha reportado que la abundancia relativa de los isómeros de PIP y
PIP2 es muy variable, dependiendo de los tipos celulares y/o de las condiciones de crecimiento
de las plantas (Westergren et al., 2001). Sin embargo, hasta el momento se desconoce que
isómero(s) se induce(n) frente a los tratamientos con auxinas y NO.
Se ha demostrado que la auxina genera una disminución rápida y transiente en los
niveles de PIP y PIP2 concomitante con un incremento en el nivel de IP3 en suspensiones
celulares de Catharanthus roseus (Ettlinger y Lehle, 1988; Grabowski et al., 1991). En
concordancia, las auxinas disparan un aumento en el nivel de IP3 seguido de una activación de
canales de Ca2+ localizados en reservorios intracelulares en membranas aisladas de zanahoria
(Daucus carota; Zbell y Walter-Back, 1989; Zbell et al., 1989). Debido a que la activación de
86
PLC puede ser monitoreada por disminución en el nivel de PIP y PIP2 e incrementos en IP3,
estas evidencias sugieren una inducción de la actividad PLC por auxinas. Sin embargo, hasta el
momento, no existen evidencias directas que involucren la participación de la vía PLC/DGK y
la consecuente producción de PA durante la señalización por auxinas. Los resultados
presentados en la Figura 17 sugieren la participación de la actividad PLC durante la FRA
inducida por auxinas y NO en pepino, regulando los incrementos en la [Ca2+]cit vía IP3. Los
resultados presentados en la Figura 25 muestran que las auxinas y el NO inducen la formación
de PA vía activación de PLD. Estos resultados están de acuerdo con un trabajo reciente que
reportó que la expresión de una PIP quinasa de humanos en suspensiones celulares de tabaco
conllevó a una acumulación de PIP2 y a una subsecuente producción de IP3 vía PLC. Los
autores sugirieron que la acumulación de PA podría provenir de la activación de PLD y no por
activación de la vía PLC/DGK (Im et al., 2007). Adicionalmente, datos farmacológicos de
plántulas de Arabidopsis sugirieron que en respuesta al estrés salino la señalización por PLC
involucra la liberación de Ca2+ a través de canales de Ca2+ regulados por IP3 pero no la
formación de PA a partir de DAG (Parre et al., 2007).
Los incrementos en la actividad PLD usualmente resultan de la estimulación de la
proteína preexistente y no de una síntesis de novo de la enzima, debido a que varios genes que
codifican para PLDs se transcriben constitutivamente (Wang, 2000). Sin embargo, se han
reportado incrementos en los niveles de transcriptos de PLDs es respuesta a hormonas y a
estreses abióticos como sequía, salinidad, frío y estrés mecánico (Wang, 2000). Estas evidencias
sugieren que la rápida activación (10 minutos) de PLD en tratamientos con auxinas y NO
(Figura 25) estaría relacionada con cambios conformacionales de las proteínas preexistentes en
los hipocótilos de pepino. Para confirmarlo, se podría medir la acumulación de PBut en
presencia de IAA o SNAP más un inhibidor de la síntesis proteica como la cicloheximida.
Se ha reportado que los PLs señales PIP y PIP2 inducen la actividad PLD in vitro,
siendo PIP2 un activador más fuerte que PIP (Pappan et al., 1997; Qin et al., 1997). La mayoría
de los 12 miembros de la familia de PLD de Arabidopsis requiere de Ca2+ para su actividad in
vitro y sólo algunos de ellos son dependientes de PIP2 (Bargmann y Munnik, 2006). Tomando
87
en cuenta estas evidencias y nuestros resultados mostrando que la acumulación de PIP y PIP2
precede a la producción de PA por PLD (Figuras 23 y 25), se podría sugerir que PIP y/o PIP2
pueden activar directamente la enzima PLD(s) y/o cumplimentar su requerimiento de Ca2+ vía
actividad PLC. Hasta el momento, la actividad PLD en pepino se ha medido in vitro en el
mesocarpo del fruto, y resultó ser estimulada por Ca2+ (Mao et al., 2007). Sin embargo, el efecto
de PIP y/o PIP2 sobre dicha actividad PLD no fue estudiado aún. Una vez que los isómeros de
PIP y PIP2 sean identificados, diferentes experimentos se podrían diseñar para probar la
hipótesis presentada anteriormente. Estos podrían incluir estudiar el efecto de la aplicación
exógena de isómeros específicos de PIP y PIP2 sobre la acumulación de PA y sobre la FRA, y
estudiar el efecto de disminuir los niveles endógenos de PIP y PIP2 sobre la acumulación de PA
y sobre la FRA inducidas por auxinas y NO. Además del efecto positivo de PIP y/o PIP2 sobre
la actividad PLD, el NO puede inducir modificaciones posttraduccionales para activar PLD
como S-nitrosilación de residuos de cisteínas o nitración de residuos de tirosinas. Se requieren
análisis futuros para caracterizar los eventos moleculares desencadenados por NO para activar la
PLD.
En este Capítulo hemos demostrado que la actividad PLD se induce in vivo durante
tratamientos con auxinas y NO generando PA en explantos de pepino (Figura 25). Los efectos
de las auxinas y del NO sobre la actividad PLD han sido previamente analizados en otras
condiciones y sistemas experimentales. Las auxinas no poseen efecto sobre la actividad PLD in
vitro en membranas aisladas preparadas de hipocótilos de calabacín (Cucurbita pepo) y
marcadas con [14C]-PC o [14C]-PE (André y Scherer, 1991). A su vez, se midió la actividad PLD
in vivo en respuesta al tratamiento con auxinas en suspensiones celulares de perejil
(Petroselinum crispum) y soja utilizando como sustrato el análogo fluorescente de PC bisBODIPY-PC (Paul et al., 1998). Los autores no encontraron acumulación de PA fluorescente a
partir de la hidrólisis de bis-BODIPY-PC. Por lo tanto, los autores excluyeron a PLD de la vía
de transducción de señales por auxinas (Paul et al., 1998). Sin embargo se debe aclarar que el
PA derivado de PLD pudo haber sido suficientemente bajo y por tanto indetectable y/o pudo
haberse convertido a PA no fluorescente. Adicionalmente, se ha propuesto que el metabolismo
88
de lípidos artificiales no es una copia exacta al metabolismo de los lípidos naturales (Paul et al.,
1998). Por otro lado, el efecto del NO sobre la actividad fosfatidiltransferasa in vivo de PLD se
evaluó en suspensiones celulares de tomate tratadas con SNAP 1 mM y 1-butanol 0.5 % (v/v).
Este tratamiento no resultó en un incremento detectable de la actividad PLD (Laxalt et al.,
2007). En conjunto, estos resultados destacan las diferentes respuestas obtenidas cuando se
trabaja con material vegetal distinto (por ejemplo membranas aisladas, suspensiones celulares o
explantos), y/o condiciones fisiológicas o de crecimiento distintas.
Scherer y André (1989) demostraron que la enzima fosfolipasa A2 (PLA2) se estimula
por auxinas. PLA2 hidroliza PLs generando ácidos grasos libres y lisoPLs. Se detectó una rápida
acumulación de [14C]-lisoPC o [14C]-lisoPE in vitro en respuesta al tratamiento con auxinas en
membranas aisladas marcadas con [14C]-PC o [14C]-PE, respectivamente. Se requiere una alta
concentración de auxinas (mayor a 100 μM de ácido 2,4-diclorofenoxiacético) para medir el
efecto estimulatorio de las auxinas sobre la actividad PLA2 in vivo en suspensiones celulares y
segmentos de hipocótilos (Scherer y André, 1989, 1993; André y Scherer, 1991; Scherer, 1995;
Paul et al., 1998). En la presente tesis no detectamos ningún otro incremento en PLs que
aquellos ya discutidos para PA, PIP y PIP2. Más aún, nosotros identificamos todos los PLs
presentes en las TLCs alcalinas (por ejemplo Figura 21A), sugiriendo que no existen lisoPLs en
los lípidos extraídos de hipocótilos de pepino. Estas evidencias indican que la actividad PLA2
no es influenciada por el tratamiento con auxinas bajo nuestras condiciones experimentales. Las
diferencias entre los resultados obtenidos por el grupo del Dr. Scherer y los nuestros pueden ser
explicadas por las diferentes concentraciones y/o tipo de auxinas utilizadas para los
experimentos. Además de estos datos bioquímicos, se ha demostrado que tanto el crecimiento
dependiente de auxinas (Scherer y Arnold, 1997; Holk et al., 2002) como la expresión de genes
regulados por auxinas (Scherer et al., 2007) son suprimidos por el agregado de inhibidores de
PLA. Estudios genéticos han confirmado un rol regulatorio para PLA2 en el crecimiento celular
debido a que plantas de Arabidopsis que sobreexpresan PLA2 muestran una mayor elongación
celular, mientras que plantas silenciadas en PLA2 poseen una menor elongación celular (Lee et
al., 2003b).
89
En este Capítulo se involucró a la formación de PA vía PLD en la FRA inducida por
auxinas y NO. Mientras que el 1-butanol bloqueó completamente los efectos de las auxinas y
del NO (Figura 26), la aplicación exógena de PA estimuló significativamente la FRA (Figura
27). Nuestros resultados están de acuerdo con los reportados recientemente por Li y Xue (2007),
quienes analizaron el efecto del tratamiento con 1-butanol, 2-butanol o PA en raíces de
Arabidopsis. El tratamiento con PA incrementó la respuesta gravitrópica, mientras que la
inhibición de PLD con 1-butanol resultó en una disminución del gravitropismo y en una
supresión de la formación de raíces laterales. El tratamiento con 2-butanol no mostró efectos
significativos en estos procesos (Li y Xue, 2007). Además, evidencias genéticas demostraron
que las respuestas a auxinas están reducidas en mutantes nulas del gen PLDξ2 (miembro de la
clase de ξ) de Arabidopsis (Li y Xue, 2007). Se encontró que las mutantes nulas pldξ2 poseen
una respuesta gravitrópica reducida y una elongación del hipocótilo suprimida; mientras que
plántulas transgénicas sobreexpresando PLDξ2 mostraron los fenotipos opuestos. Los autores
sugirieron que PLDξ2 media positivamente las respuestas de auxinas probablemente a través de
una regulación del transporte y de la distribución de auxinas. Los autores también discutieron
que no hay evidencia de que PLDξ2 y PA están involucrados directamente en la señalización
por auxinas (Li y Xue, 2007). Además, se ha demostrado que la inhibición de PLD con 1butanol también afecta la elongación de pelos radicales en Arabidopsis (Gardiner et al., 2003).
Todos estos procesos del crecimiento y desarrollo de las plantas regulados por auxinas
(gravitropismo, formación de raíces laterales, elongación de hipocótilos y de pelos radicales)
son dependientes de NO (Beligni y Lamattina, 2000; Correa-Aragunde et al., 2004; Hu et al.,
2005; Lombardo et al., 2006). Finalmente, se demostró que el bloqueo de la actividad PLD con
1-butanol resultó en una reducción en la inducción por NO de la H+-ATPasa y la H+-PPasa
vacuolares, enzimas claves en las respuestas al estrés salino. En ese mismo trabajo, la aplicación
exógena de PA estimuló la actividad de tales enzimas (Zhang et al., 2006). El uso de PLs
exógenos como reguladores del crecimiento de las plantas está recién comenzando. Se requieren
estudios futuros para entender los efectos del agregado de PLs exógenos sobre la homeostasis
90
endógena de PLs y la iniciación de vías de señalización (Cowan, 2006). Debido a que el PA
aplicado al medio de tratamiento puede ser metabolizado en el medio o durante su entrada a las
células, se estudió la calidad del PA aplicado exógenamente luego de tratar los explantos de
pepino por 1 hora a 25 °C. La Figura 28 muestra que el PA permanece inalterado a lo largo de
todo el experimento.
Figura 28. Detección de lípidos extraídos del medio de tratamiento por la técnica de charring. Los
explantos se trataron por 1 hora a 25 °C con buffer (C=control) o con buffer más 100 µM PA C16:0, PA
C18:1 o PS C18:1. Los lípidos se extrajeron del medio (M) y se separaron por EtAc TLC. La misma
cantidad de cada lípido se sembró en la TLC como estándar (S). Para mayores detalles acerca de la
técnica de charring ver punto 8 de Materiales y Métodos.
Está ampliamente documentado que quinasas de proteína pertenecientes a diversas
familias actúan por debajo de PA. En zanahoria, una CDPK fue activada por PA y localizada en
membranas, lo cual es consistente con un rol en vías de transducción de señales que involucran
PLD (Farmer y Choi, 1999). En soja, el tratamiento con PA indujo una MAPK activada por
estrés mecánico que media la señalización por estrés y etileno (Lee et al., 2001). En
91
Arabidopsis, el PA derivado de PLD se unió a AtPDK1 (quinasa de proteína dependiente de 3fosfoinosítidos), que actúa río arriba de la quinasa de proteína AGC2-1, promoviendo la
elongación de pelos radicales (Anthony et al., 2004). Adicionalmente, AtPDK1 fosforila y
activa la quinasa de proteína PINOID, que es otro miembro de la familia AGC y está implicado
en la localización asimétrica de la familia PIN de facilitadores del transporte de auxinas
(Zegzouti et al., 2006). Todos estos datos sugieren que el PA puede activar vías de señalización
dependientes de CDPKs y MAPKs, las cuales se han propuesto es esta tesis que participan en la
FRA inducida por auxinas y NO en explantos de pepino.
A raíz de los resultados presentados en el presente Capítulo surge un número de
preguntas que hasta el momento carece de respuestas. En primer lugar, cómo el NO induce la
acumulación de PIP y PIP2? Los niveles de PIP y PIP2 son regulados por la actividad de PLC y
de quinasas y fosfatasas de lípidos. Por lo tanto, sería interesante cuantificar las actividades de
estas enzimas durante tratamientos con auxinas y NO. En segundo lugar, cuáles de los isómeros
de PIP y PIP2 se acumulan? Un incremento en PI3P se detectó frente al tratamiento con auxinas
en membranas aisladas de raíces de Arabidopsis, con un rol en señalización durante la respuesta
gravitrópica de la raíz (Joo et al., 2005). En tercer lugar, cuál(es) de las isoformas de PLD están
implicadas en la FRA inducida por auxinas y NO? Hasta el momento, no se ha clonado ningún
gen que codifica para PLD en pepino haciendo imposible la correlación de las actividades
enzimáticas medidas en nuestro trabajo con un producto génico específico. Por lo tanto, una
estrategia útil para identificar la(s) isoforma(s) de PLD(s) podría ser un análisis por genética
reversa con mutantes nulas de PLD en Arabidopsis que involucre la cuantificación de raíces
adventicias y la formación de PA en respuesta a auxinas y NO. PLDξ2 es un buen candidato
considerando los resultados recientes reportados por Li y Xue (2007), y por Mancuso et al.
(2007). Sería interesante analizar el nivel de PA en respuesta al tratamiento con auxinas en la
mutante pldξ2. Sin embargo, se ha sugerido que otros miembros de PLD o PLC pueden estar
involucrados en las respuestas a auxinas, ya que plantas salvajes tratadas con 1-butanol
reprimen más fuertemente la formación de raíces laterales y la respuesta gravitrópica que
plantas mutantes nulas de PLDξ2 (Li y Xue, 2007). En cuarto lugar, si el PA está río arriba de
92
quinasas de proteínas, cuáles CDPKs y MAPKs participan como mensajeros río abajo de PA?
Resta aún probar si el tratamiento con PA activa y el tratamiento con 1-butanol inhibe las
actividades CDPK y MAPK que se inducen por auxinas y NO durante la FRA en explantos de
pepino. El progreso en el estudio de éstas y otras cuestiones ampliará el conocimiento sobre las
vías de señalización mediadas por auxinas, NO y PLs en plantas.
93
en una vía dependiente de NO
CAPÍTULO V
El ATP extracelular induce la formación de raíces adventicias
CAPÍTULO V: Resultados
El ATP induce el número y la longitud de raíces adventicias de forma dosis
dependiente
El ATP es la molécula energética esencial de la célula. Se ha reportado la presencia de
eATP tanto en animales como en plantas con diversos roles en señalización. Con el objeto de
determinar si el eATP induce la FRA, se llevaron a cabo ensayos en los que se trataron
explantos de pepino con dosis crecientes de ATP desde pM a mM. Para ello, semillas de pepino
se germinaron en H2O y se mantuvieron a 25 ºC por 7 días con un fotoperíodo de 14 horas luz/
10 horas oscuridad. El sistema radical primario de las plántulas se removió y los explantos
resultantes se trataron con H2O (control), IAA 10 μM, SNP 10 μM o ATP a 1 pM, 10 pM, 100
pM, 1 nM, 100 nM, 1 μM, 100 μM, 1000 μM o 2000 μM.
La Figura 29 muestra que el ATP induce significativamente la FRA a 1 nM, 100 μM y 1
mM. Este efecto inductor es comparable al obtenido por tratamiento con IAA o SNP. Por el
contrario, una concentración de ATP de 2 mM ejerce un efecto inhibitorio sobre la FRA (Figura
29). En concordancia, el tratamiento con ATP 5 mM resulta en un efecto tóxico sobre los
explantos de pepino (no mostrado). Estos resultados sugieren que existe un rango óptimo de
concentración de ATP para estimular la FRA en pepino. El efecto del ATP es sinérgico con el
de las auxinas, debido a que el tratamiento de explantos de pepino con ATP más IAA resulta en
una mayor inducción de la FRA con respecto al tratamiento sólo con ATP o con IAA (no
mostrado).
Teniendo en cuenta estos resultados, se decidió utilizar ATP 1 nM y/o ATP 100 μM y/o
ATP 1 mM para continuar con el estudio del efecto del ATP sobre la FRA.
94
Figura 29. El ATP induce la FRA de forma similar a las auxinas y al NO. Explantos de pepino se trataron
por 5 días con H2O (control), SNP 10 µM, IAA 10 μM o ATP a las concentraciones indicadas. El número
de raíces adventicias se expresa como la media +/- SE de al menos 3 experimentos independientes (n=10
explantos). Las barras con asterisco son significativamente diferentes (test de T, p<0.05) del control.
Se estudió también el efecto del ATP sobre otro parámetro de crecimiento como lo es la
longitud de raíces adventicias. En la Figura 30A se observa que el ATP induce la elongación de
las raíces adventicias a 1 nM, 100 μM y 1 mM, de forma análoga a la auxina IAA y al NO. En
la Figura 30B se muestran fotografías de explantos de pepino tratados por 5 días con H2O o con
ATP 1 nM, en las cuales se evidencian los efectos inductores del ATP tanto en el número como
en la longitud de las raíces adventicias.
95
Figura 30. El ATP induce la elongación de las raíces adventicias de forma similar a las auxinas y al NO.
(A) Explantos de pepino se trataron por 5 días con H2O (control), SNP 10 µM, IAA 10 μM, ATP 1 nM,
ATP 100 μM o ATP 1 mM. La longitud de raíces adventicias se expresa como la media +/- SE de al
menos 3 experimentos independientes (n=10 explantos). Las barras con asterisco son significativamente
diferentes (test de T, p<0.05) del control. (B) Las fotografías se obtuvieron luego de 5 días de tratamiento
con H2O o con ATP 1 nM.
El ATP y el ADP inducen el número y la longitud de raíces adventicias de forma
similar
Con el objetivo de determinar la especificidad de la respuesta al ATP, se realizaron
ensayos para evaluar el enraizamiento en explantos tratados con diferentes nucleótidos fosfato
como adenosina monofosfato (AMP), adenosina difosfato (ADP) y citosina trifosfato (CTP).
Explantos de pepino se trataron por 5 días con H2O (control), o con ATP, AMP, ADP o CTP a 1
nM o a 1 mM; y se cuantificó el número y la longitud de las raíces adventicias.
En la Figura 31A se observa que el número de raíces por explanto en presencia de ATP
o de ADP, y tanto a 1 nM como a 1 mM, es significativamente mayor con respecto al obtenido
en respuesta a las mismas concentraciones de AMP y CTP. En el mismo sentido, los
tratamientos con ATP y ADP indujeron la elongación de raíces adventicias, mientras que los
tratamientos con AMP y CTP se comportaron de manera similar al control (Figura 31B). Estos
96
resultados indican una especificidad similar a otras respuestas inducidas por eATP en plantas
(Jeter et al., 2004; Song et al., 2006; Foresi et al., 2007; Wu y Wu, 2008).
Figura 31. El ATP y el ADP inducen la FRA. Explantos de pepino se trataron por 5 días con H2O
(control) o con 1 nM o 1 mM de los siguientes nucleótidos fosfato: ATP, adenosina monofosfato (AMP),
adenosina difosfato (ADP) y citosina trifosfato (CTP). El número (A) y la longitud (B) de raíces
adventicias se expresa como la media +/- SE de al menos 3 experimentos independientes (n=10
La hidrólisis del ATP no es requerida para la formación de raíces adventicias
inducida por ATP
A fin de analizar si el efecto del ATP es debido a su hidrólisis, se realizaron ensayos
utilizando el análogo de ATP no hidrolizable adenosina 5’-[γ-tio]trifosfato tetralitio sal (ATP-γS), que se comporta como agonista de ATP. Para ello, explantos de pepino se trataron por 5 días
con H2O (control), o con ATP o ATP-γ-S a 100 pM, 1 nM o 100 μM.
La Figura 32 muestra que el efecto del ATP-γ-S sobre la FRA es similar al obtenido por
el tratamiento con ATP. Se observa, además, que el ATP-γ-S induce la FRA a una
97
concentración de 100 pM, la cual no resulta efectiva para el ATP. Esto puede deberse a una
mayor estabilidad del compuesto no hidrolizable. En conclusión, los resultados sugieren que no
se requiere de la hidrólisis del ATP para obtener el efecto estimulatorio del ATP sobre la FRA
en explantos de pepino.
Figura 32. El ATP-γ-S induce la FRA de forma similar al ATP. Explantos de pepino se trataron por 5 días
con H2O (control), SNP 10 µM, IAA 10 μM, o ATP o ATP-γ-S a 100 pM, 1 nM o 100 μM. El número de
raíces adventicias se expresa como la media +/- SE de al menos 3 experimentos independientes (n=10
El NO endógeno es requerido para la formación de raíces adventicias inducida por
ATP
En la presente tesis y en resultados publicados previamente por nuestro laboratorio
(Pagnussat et al., 2002; 2003), se ha determinado que las auxinas requieren de NO endógeno
para activar las vías de señalización que conducen a la FRA en explantos de pepino. Con el
objeto de determinar si la FRA inducida por ATP requiere de NO, se llevaron a cabo
tratamientos utilizando el secuestrante específico de NO cPTIO. Para ello, explantos de pepino
se trataron con H2O (control), IAA 10 μM o con ATP 1 nM o 1 mM en presencia o ausencia de
cPTIO 200 μM, y se cuantificó el número y la longitud de las raíces adventicias luego de 5 días
de tratamiento.
98
Como se presenta en la Figura 33, el cPTIO revirtió el efecto del ATP en inducir el
número y la longitud de las raíces adventicias, sugiriendo que el NO endógeno es requerido para
la FRA inducida por ATP. Como ya se había reportado, el secuestro del NO por cPTIO afecta el
enraizamiento inducido por la auxina IAA (Figura 33; Pagnussat et al., 2002).
Figura 33. El NO endógeno es requerido para la formación de raíces adventicias inducida por ATP.
Explantos de pepino se trataron por 5 días con H2O (C=control), IAA 10 μM o ATP a 1 nM o 1 mM, en
presencia o ausencia de cPTIO 200 μM. El número (A) y la longitud (B) de raíces adventicias se expresa
como la media +/- SE de al menos 3 experimentos independientes (n=10 explantos). Las barras con
asterisco son significativamente diferentes (test de T, p<0.05) del control.
El ATP induce la formación de raíces adventicias vía receptores de tipo P2
En animales, el eATP es sensado por receptores purinérgicos de tipo P2X y P2Y
(Burnstock y Kennedy, 1985). En plantas, se ha reportado que respuestas inducidas por ATP
son inhibidas por antagonistas no específicos de receptores de tipo P2X de animales como el
piridoxal-fosfato-6-azofenil 2’,4’-disulfonato (PPADS). PPADS es un inhibidor no competitivo
99
que se une al sitio alostérico de los receptores desde el espacio extracelular. En particular, el
tratamiento con PPADS inhibe la producción de NO inducida por ATP en células de tomate,
sugiriendo la presencia de receptores de tipo P2 involucrados en la percepción de ATP (Foresi
et al., 2007). Teniendo en cuenta estas evidencias, se realizaron experimentos tratando explantos
de pepino con H2O (control) o ATP 1 nM en presencia o ausencia de PPADS 1 μM o 10 μM.
La Figura 34 muestra que el bloqueante PPADS inhibe significativamente el efecto
estimulatorio del ATP sobre el número de raíces adventicias a una concentración de 10 μM.
Estos resultados sugieren que la FRA inducida por ATP es mediada por receptores de tipo P2 en
Figura 34. El antagonista no específico de receptores de tipo P2X de animales PPADS inhibe la FRA
inducida por ATP. Explantos de pepino se trataron por 5 días con H2O (C=control) o ATP 1 nM en
presencia o ausencia de PPADS 1 μM o 10 μM. El número de raíces adventicias se expresa como la
media +/- SE de al menos 3 experimentos independientes (n=10 explantos). Las barras con asterisco son
significativamente diferentes (test de T, p<0.05) del control.
100
CAPÍTULO V: Discusión
En animales, se ha descripto que el ATP puede ser liberado a la matriz extracelular a
través de canales iónicos y proteínas pertenecientes a la familia de transportadores de tipo ABC
(Abraham et al., 1993). Además, se ha demostrado un mecanismo de liberación de ATP a través
de vesículas secretorias que se fusionan a las membranas plasmáticas (Lazarowski et al., 2003).
El eATP es sensado por receptores purinérgicos de unión a nucleótidos de membrana llamados
P2X y P2Y. Estos receptores son altamente específicos para determinados nucleótidos, siendo
ATP y ADP los agonistas más activos (Burnstock y Kennedy, 1985). Los receptores P2X están
ligados a canales iónicos, mientras que los receptores P2Y están acoplados a la proteína G
(Duan et al., 2003). Los receptores P2Y están asociados a la activación de PLC con la
consiguiente generación de IP3 y DAG, segundos mensajeros que inducen la liberación de Ca2+
intracelular y la activación de la quinasa de proteína C, respectivamente (Communi et al., 1999).
A su vez, un reporte muestra una activación de la enzima PLD por eATP río abajo de la proteína
G (Neary et al., 1999).
En plantas, se ha propuesto que el ATP puede ser secretado de las células mediante
transportadores de tipo ABC de la subfamilia PGP (P glycoproteins). Las PGPs están también
involucradas en el transporte de auxinas (Vieten et al., 2007). En plántulas de Arabidopsis, Jeter
et al. (2004) reportaron la liberación de ATP por estreses mecánico, osmótico y salino. Durante
el estrés mecánico, se daña la membrana celular por lo que pueden liberarse concentraciones
considerables de ATP al espacio extracelular (Jeter et al., 2004). Subsecuentemente, Song et al.
(2006) cuantificaron la concentración de ATP liberada durante estrés mecánico en hojas de
Arabidopsis, que fue de 40 μM aproximadamente. Otros investigadores mostraron la presencia
de eATP en zonas de activo crecimiento de la raíz de Medicago truncatula (Kim et al., 2006).
Teniendo en cuenta todos estos resultados se podría especular que, luego del estrés mecánico
generado por la remoción de los sistemas radicales primarios, el contenido de eATP se
incrementa en la parte basal de los hipocótilos de pepino desencadenando el proceso de FRA.
Los resultados presentados en la Figura 31 indican que los tratamientos con ATP y ADP
inducen un aumento en el número y en la longitud de raíces adventicias en explantos de pepino,
mientras que los tratamientos con AMP y CTP no presentan efectos significativos sobre estos
101
parámetros. En nuestro laboratorio se han obtenido resultados que indican que el ATP y en
menor medida el ADP y el AMP, inducen la producción de NO en células de tomate (Foresi et
al., 2007). Resultados similares se obtuvieron estudiando la producción de NO por tratamiento
con ATP y sus derivados en cultivos de pelos radicales de Salvia miltiorrhiza (Wu y Wu, 2008).
A su vez, se ha reportado que las plantas responden al ATP y al ADP incrementando la [Ca2+]cit,
mientras que esta respuesta no se observa con AMP o pirimidinas (Demidchik et al., 2003; Jeter
et al., 2004). En Arabidopsis, tanto el ATP como el ADP (pero no el AMP) inducen la
producción de ROS a concentraciones nanomolares (Song et al., 2006). El hecho de que el
eATP induce cambios en los niveles de diversos mensajeros celulares (NO, Ca2+, ROS, etc)
desde concentraciones submicromolares refuerza la hipótesis de que las plantas, como los
animales, poseen receptores purinérgicos que unen ATP con alta afinidad. Sin embargo, aún no
se ha identificado ningún receptor purinérgico involucrado en la percepción del eATP en plantas
(Demidchik et al., 2003; Jeter y Roux, 2006). A pesar de ello, el inhibidor PPADS bloquea el
incremento en la [Ca2+]cit inducido por ATP en raíces de Arabidopsis (Demidchik et al., 2003) y
la producción de NO en células de tomate (Foresi et al., 2007). Debido a que el tratamiento con
PPADS inhibe la FRA inducida por ATP en explantos de pepino (Figura 34), se sugiere la
presencia de receptores de tipo P2 involucrados en la percepción de eATP y mediando la señal
que conduce a la FRA. En este sentido, tratamientos con el agonista de receptores de tipo P2
ATP-γ-S inducen un número de raíces adventicias similar al alcanzado por el ATP (Figura 32).
Las plantas controlan finamente sus niveles de eATP. La actividad de las apirasas,
enzimas que hidrolizan ATP y ADP, juega un rol primordial en mantener concentraciones
adecuadas de eATP para sostener el crecimiento y desarrollo de las plantas. Las mayoría de las
apirasas se encuentran ancladas a la membrana plasmática con el sitio activo hacia la matriz
extracelular, denominándose por esta característica ectoapirasas (Wu et al., 2007). En
Arabidopsis, se han identificado 7 genes que codifican para apirasas. Hasta el momento, se han
clonado y caracterizado 2 de ellos: APY1 y APY2 (Steinebrunner et al., 2000). Los promotores
de dichos genes poseen elementos de respuesta a luz y a auxinas. La luz regula negativamente la
expresión de transcriptos de apirasa durante la inhibición del crecimiento de hipocótilos (Wu et
102
al., 2007). Sin embargo, aún no se ha estudiado el efecto de la luz sobre la abundancia de
transcriptos de APY1 y APY2 en raíces. Por otra parte, se ha observado que los tejidos que
poseen mayor expresión de APY1 y APY2 están en activo crecimiento y diferenciación. Ellos
son la zona de unión entre hipocótilos y raíces (de donde surgen las raíces adventicias), los
ápices de las raíces primarias, los pelos radicales, y el sistema vascular y caliptra de raíces
laterales (Wu et al., 2007). Se ha demostrado que plantas de Arabidopsis suprimidas en apirasa
poseen un mayor número de raíces adventicias en comparación con plantas salvajes (Wu et al.,
2007). En el mismo sentido, la aplicación exógena de ATP induce el número y la longitud de
raíces adventicias en explantos de pepino (Figuras 29 y 30). Debido a que estos procesos del
crecimiento y desarrollo de las raíces están bajo el control de auxinas y NO, es probable que el
eATP regule la producción y/o distribución y/o señalización de estos compuestos. En
Arabidopsis, se ha reportado que el eATP promueve la acumulación de auxinas en los ápices de
las raíces, evaluada por medio de la actividad del promotor de respuesta a auxinas DR5 como
fusión al gen marcador GUS (Tang et al., 2003). Adicionalmente, el ATP incrementa la
sensibilidad de las raíces a la aplicación de auxinas exógenas (Tang et al., 2003). En el mismo
reporte se observó que concentraciones milimolares de ATP inhiben la respuesta gravitrópica de
las raíces afectando el transporte (probablemente el eflujo) de auxinas. Hu et al. (2005)
describieron que, durante la respuesta gravitrópica, la distribución asimétrica de auxinas induce
una producción asimétrica de NO y un crecimiento asimétrico de la raíz. Los datos presentados
en la Figura 33 sugieren que el NO endógeno es requerido para que el ATP promueva la FRA
en pepino. El requerimiento de NO en la vía de transducción de señales dependiente de ATP
está de acuerdo con estudios previos realizados en animales y en plantas. En animales, se ha
reportado que el ATP induce la síntesis de NO mediante activación de la enzima NOS. La
activación de NOS se produce vía incremento en la [Ca2+]cit a través de canales de Ca2+
regulados por IP3 (Li et al., 2003). En plantas, datos farmacológicos indican que las actividades
NOS y/o NR estarían implicadas en la producción de NO inducida por ATP (Foresi et al., 2007;
Wu y Wu, 2008). Todas estas evidencias en conjunto indican que el eATP puede regular las
concentraciones endógenas de auxinas y/o NO generando cambios profundos en la arquitectura
103
radical. Proponemos entonces que el eATP podría promover la acumulación de auxinas en la
parte basal de los hipocótilos de pepino por medio de la regulación del transporte basípeto de
auxinas desde el meristema caulinar. Este incremento en la concentración de auxinas induciría
la producción de NO y las vías de señalización que conducen al proceso de FRA. Resulta
entonces de sumo interés realizar ensayos de enraizamiento en presencia de eATP y del
inhibidor del transporte basípeto de auxinas NPA.
Nuestro próximo interés es estudiar si las vías de señalización disparadas por ATPe
están relacionadas con aquellas dependientes de cGMP que fueron descriptas para la inducción
de la FRA en pepino (Pagnussat et al., 2003). Se estudiará entonces: 1) si el ATPe induce la
acumulación de cGMP durante la FRA en pepino, cuantificando el nivel de cGMP en
tratamientos con ATP por la técnica de radioinmunoensayo y 2) el efecto del inhibidor de la
enzima GC LY83583 sobre la FRA inducida por ATPe.
104
Integración de los resultados obtenidos en esta tesis en un modelo de vías de
señalización que conducen a la formación de raíces adventicias en pepino
Los resultados obtenidos en esta tesis apoyan la hipótesis de que la FRA en explantos de
pepino está controlada por un complejo set de mensajeros celulares que incluye auxinas, NO,
cGMP, cADPR, IP3, Ca2+, CDPKs, MAPKs; PLC y PLD.
En la Figura 35 se presenta un modelo simplificado que integra las vías de señalización
y moléculas involucradas en la FRA, tanto aquellas descriptas anteriormente (Pagnussat et al.,
2002; 2003) como las descriptas en el presente trabajo: (i) el transporte basípeto de auxinas
desde el meristema caulinar, regulado probablemente por eATP, induce la producción de NO en
la base de los hipocótilos; (ii) el NO incrementa los niveles de cGMP y cADPR, y activa
canales de Ca2+ de membrana plasmática (PM) resultando en la elevación de la [Ca2+]cit; (iii) el
NO también induce la acumulación de PIP y PIP2, los cuales pueden ser hidrolizados por la
actividad de la enzima PLC para generar IP3; (iv) el IP3 libera Ca2+ desde reservorios
intracelulares y contribuye a la elevación de la [Ca2+]cit; (v) la actividad CDPK es inducida por
incrementos en la [Ca2+]cit; (vi) la enzima PLD puede ser activada por elevaciones en la [Ca2+]cit
y/o en los niveles de PIP y PIP2; (vii) la formación de PA vía PLD puede activar las vías de
señalización mediadas por CDPK y MAPK que conducen a la activación de la división celular y
la FRA. Todas estas vías de señalización parecen ser requeridas para la FRA ya que el efecto
estimulatorio de las auxinas y del NO se bloquea si una de ellas está comprometida.
105
Figura 35. Modelo que integra la red de vías de señalización inducidas por auxinas y mediadas por NO
durante la FRA en explantos pepino. (i) el transporte basípeto de auxinas desde el meristema caulinar,
regulado probablemente por ATP extracelular (eATP), induce la producción de NO en la base de los
hipocótilos; (ii) el NO incrementa los niveles de cGMP y cADPR, y activa canales de Ca2+ de membrana
plasmática (PM) resultando en una elevación en la concentración de Ca2+ citosólica ([Ca2+]cit); (iii) el NO
también induce la acumulación de PIP y PIP2, los cuales pueden ser hidrolizados por la actividad de la
enzima PLC para generar IP3; (iv) el IP3 libera Ca2+ desde reservorios intracelulares y contribuye a la
elevación de la [Ca2+]cit. (v) la actividad CDPK es inducida por incrementos en la [Ca2+]cit; (vi) la enzima
PLD puede ser activada por elevaciones en la [Ca2+]cit y/o en los niveles de PIP y PIP2; (vii) la formación
de PA vía PLD puede contribuir en la activación de las vías de señalización mediadas por CDPK y
MAPK que conducen a la activación de la división celular y la FRA. Las flechas sólidas indican vías
enzimáticas y las flechas punteadas indican activación (directa o indirecta). Los signos de interrogación
(?) indican las vías aún no probadas experimentalmente. En color verde se destacan los mensajeros
celulares descriptos en esta tesis por medio de ensayos farmacológicos, en color celeste los mensajeros
celulares descriptos por medio de ensayos bioquímicos y en color rojo las actividades enzimáticas
medidas.
106
Cruce de información entre vías de señalización reguladas por luz, MAPKs, Ca2+CDPKs, fosfolípidos y ATP extracelular
Los fitocromos son fosfoproteínas y quinasas de proteína reguladas por luz que
catalizan su propia fosforilación y la de otras proteínas (Kim et al., 2005). Se ha demostrado que
la señalización por fitocromos involucra un incremento rápido en la [Ca2+]cit (Bowler et al.,
1994; Neuhaus et al., 1997). A su vez, varios autores describieron que procesos de
fosforilación/defosforilación de proteínas están mediados por fitocromos (Datta et al., 1985;
Chandok y Sopory, 1996; Malec et al., 2002). En particular, Malec et al. (2002) determinaron
que el incremento en la [Ca2+]cit mediado por fitocromos permite una rápida activación de
CDPKs. Además, se ha postulado que el Ca2+ y las CDPKs modulan el gravitropismo mediado
por luz (Lu et al., 1996). Se ha demostrado la participación del NO en 3 procesos mediados por
luz como la germinación, la de-etiolación y la elongación del hipocótilo (Beligni y Lamattina,
2000), siendo dichos procesos regulados por Ca2+-calmodulina. En arroz, Frattini et al. (1999)
reportaron que el nivel de transcripto y proteína de la CDPK OsCPK2 se incrementa por
transferencia de las plantas de luz a oscuridad. En pepino, Ullanat y Jayabaskaran (2002)
clonaron 4 CDPKs y demostraron que el tratamiento con luz blanca continua promueve una
disminución en el nivel del transcripto de CsCPK3 en hipocótilos escindidos y raíces, mientras
que un incremento en cotiledones escindidos. Posteriormente, se observó que el tratamiento con
la auxina IAA promueve la expresión de CsCPK5 tanto en hipocótilos como en cotiledones de
pepino escindidos y etiolados (Kumar et al., 2004). En conjunto, estos resultados indican que la
luz y las hormonas regulan la expresión de CsCPKs de manera órgano-específica.
Recientemente, se ha reportado que las actividades de 2 CDPKs de pepino participan en las
respuestas de transducción de señales por fitocromos durante la de-etiolación en cotiledones de
pepino (Vidal et al., 2007). En el Capítulo I de la presente tesis se ha estudiado el efecto de la
luz sobre la FRA inducida por auxinas y NO en explantos de pepino, aunque aún no se ha
determinado si existe cruce de información entre esta vía y la de Ca2+-CDPKs.
Los fitocromos y el Ca2+ controlan la actividad NR en cotiledones de pepino
(Bergareche et al., 1994). Adicionalmente, se ha descripto que fosfatidilinositoles y procesos de
107
fosforilación de proteínas están involucrados en la vía de fototransducción que regula la
actividad NR en cotiledones de pepino (Vidal et al., 2001). Sin embargo, la actividad NR in vivo
(medida como producción de NO) en raíces de pepino resultó ser independiente de los cambios
de luz y oscuridad (de la Haba et al., 2001). Sería interesante estudiar la producción de NO
mediada por la actividad NR en hipocótilos de pepino en diferentes condiciones experimentales
(luz, oscuridad, etc) y en presencia de diferentes compuestos como por ejemplo auxinas,
fosfatidilinositoles e inhibidores de quinasas de proteína y fosfatasas.
La luz regula la actividad y expresión de varias enzimas que participan en vías de
señalización por PLs. Se ha reportado que hipocótilos de girasol (Helianthus annuus) irradiados
con luz blanca producen una disminución en el nivel de PIP2, debido a una inhibición de la
actividad de PIP quinasas (Memon y Boss, 1990). A su vez, la irradiación con luz blanca o roja
inhibe la actividad PLD en plántulas etioladas de avena (Avena sativa), con la participación de
fitocromos en esta respuesta (Kabachevskaya et al., 2007). El promotor del gen PsPLC de
arveja (Pisum sativum) posee elementos de respuesta a luz y la expresión de PsPLC se regula
por luz de manera tejido-específica, con una estimulación más pronunciada en raíces
(Venkataraman et al., 2003). En Arabidopsis, la quinasa de lípidos y proteínas AtItpk-1 está
involucrada en la fotomorfogénesis bajo luz roja, posiblemente vía interacción con el
señalosoma COP9 (Qin et al., 2005). Adicionalmente, la vía de señalización mediada por PLC
participa en el incremento de la [Ca2+]cit inducido por fototropinas (Harada et al., 2003),
indicando que la señalización por PLs está conectada con el proceso de fotomorfogénesis.
Varias líneas de evidencias indican que las vías de señalización mediadas por CDPK y
MAPK no funcionan independientemente y que una activación concertada de ambas vías
controla la respuesta a estreses bióticos y abióticos (Ludwig et al., 2005). Romeis et al. (2001)
han demostrado que cascadas de fosforilación de MAPKs pueden modificar la actividad de
varias CDPKs. Inversamente, algunas CDPKs están involucradas en la inducción de actividades
MAPKs como ocurre en raíces de arroz expuestas a metales pesados (Huang y Huang, 2008).
Aún resta determinar si existe interrelación entre las vías de señalización dependientes de
MAPK y de Ca2+-CDPK durante la FRA en explantos de pepino, aunque es poco probable que
108
una induzca a la otra. Sin embargo, se requiere una activación concertada de ambas vías para
desencadenar el proceso de FRA en pepino (Figura 35).
Estudios bioquímicos revelaron que en presencia de Ca2+ ciertos PLs incrementan in
vitro la actividad de CDPKs. Sin embargo, los dominios de unión a Ca2+ y PLs (C2, FYVE, PX
y PH) no están conservados en las CDPKs (Szczegielniak et al., 2005). Una CDPK de avena es
inducida por PS, PI, PC y lysoPC (Schaller et al., 1992). AtCPK1 es estimulada por lysoPC, PI,
PIP y PIP2, pero no inositol, IP3, PC o PS (Harper et al., 1993). DcCPK1, una CDPK de
zanahoria, es activada por PS (Farmer y Choi, 1999), y una CDPK putativa de maíz ZmCPK11
es estimulada por DAG, PA y estrés mecánico (Szczegielniak et al., 2005). Estas observaciones
sugieren que ZmCPK11 está involucrada en la rápida señalización inducida por estrés mecánico
y mediada por PA. ZmCPK11 no posee un sitio de miristoilación/palmitoilación, como sí lo
poseen AtCPK1 y DcCPK1 (Szczegielniak et al., 2005). La activación de CDPKs por PLs
sugiere que la asociación a membranas puede ser un factor que contribuye a la actividad CDPK.
Además, diferentes PLs estimulan en forma específica distintas isoformas de CDPKs,
sugiriendo que este mecanismo regulatorio podría tener relevancia fisiológica (Klimecka y
Muszyńska, 2007).
Por otra parte, una MAPK de soja es específicamente activada por PA (otros lípidos
fueron incapaces de activarla; Lee et al., 2001). La activación de esta MAPK fue suprimida por
tratamiento con 1-butanol, indicando que el PA derivado de PLD es esencial para su activación
(Lee et al., 2001). Teniendo en cuenta estas evidencias y los resultados presentados en esta tesis
acerca de la participación de cascadas de fosforilación de MAPK (Capítulo II) y de CDPK
(Capítulo III) y la participación de PLs señales (Capítulo IV), resulta de especial interés el
estudio del efecto del tratamiento exógeno con PLs como PA y con 1-butanol sobre la actividad
de CDPKs y/o MAPKs durante la FRA en explantos de pepino.
Se ha involucrado una CDPK en la activación de vías de señalización por PLs. La PI
quinasa PIK-A49, una proteína soluble de 49 kDa, activa la PI4-quinasa de membrana
plasmática de células de zanahoria (Yang y Boss, 1994). La actividad de PI4-quinasa es crítica
para mantener los niveles de PI4P y PI(4,5)P2 dentro de la célula. Una CDPK fosforila PIK-A49
109
e incrementa su actividad, mientras que la defosforilación revirtió este efecto (Yang y Boss,
1994). Esta regulación implica que incrementos en la [Ca2+]cit y en la activación de CDPKs
podría resultar en la acumulación de PI4P y PI(4,5)P2. La regulación de la [Ca2+]cit por IP3
podría proveer un mecanismo de control desde dentro (feedforward) y una manera de recuperar
los niveles de PI4P y PI(4,5)P2 luego de la activación de PLC (Yang y Boss, 1994).
Se ha estudiado el efecto del eATP sobre la regulación de la [Ca2+]cit en raíces
escindidas de Arabidopsis, ya que son los órganos directamente expuestos al suelo donde ocurre
la liberación de ATP de microorganismos y de células de raíces dañadas o muertas. Se observó
un incremento dosis dependiente de la [Ca2+]cit en tratamientos con eATP, siendo requerido el
influjo de Ca2+ desde las membranas plasmáticas (Demidchik et al., 2003). Un reporte
subsiguiente corroboró estos mismos resultados en plántulas intactas de Arabidopsis, mostrando
además la inducción de transcriptos de MAPKKs y MAPKs asociados al estrés mecánico (Jeter
et al., 2004). En conjunto, estos datos sugieren que las respuestas fisiológicas de las plantas al
estrés mecánico son, al menos en parte, mediadas por eATP y que cambios transientes en la
[Ca2+]cit y en cascadas de MAPK están involucrados en la transmisión del estímulo.
Recientemente, se ha establecido que el NO participa en las vías de señalización
desencadenadas por eATP en plantas (Foresi et al., 2007; Wu y Wu, 2008). En estos reportes se
detectó un incremento rápido y dosis dependiente en la producción de NO por tratamiento con
eATP. En particular, la producción de NO en cultivos de pelos radicales de S. miltiorrhiza es
inhibida por el quelante de Ca2+ EGTA, sugiriendo una dependencia del influjo de Ca2+ en la
célula a través de la membrana plasmática para este proceso. Este resultado es consistente con el
requerimiento de una actividad tipo NOS estimulada por Ca2+ para la producción de NO (Wu y
Wu, 2008). Por lo tanto, sería interesante medir la producción endógena de NO en explantos de
pepino tratados con ATP.
Fuentes enzimáticas de producción de NO involucradas en la formación de raíces
adventicias
Se ha estudiado la distribución histológica y la fuente de NO durante la FRA en
110
hipocótilos de Vigna radiata (She y Huang, 2004; Huang et al., 2007). Los autores concluyeron
que una enzima tipo NOS, analizada por un ensayo de actividad NADPH-diaforasa que es
comúnmente usado como marcador de NOS, es responsable de la producción de NO. Se
demostró que la actividad NADPH-diaforasa y la fluorescencia específica de NO detectada por
la sonda DAF2-DA se incrementó gradualmente durante la FRA, distribuyéndose
principalmente en los meristemas de las raíces adventicias (She y Huang, 2004; Huang et al.,
2007).
Resultados recientes sugieren que la producción de NO dependiente de arginina a través
de actividades tipo NOS está involucrada en la FRA (Flores et al., 2008). En Arabidopsis, los
genes ARGAH1 y ARGAH2 codifican para arginasas, enzimas que catalizan la hidrólisis de
arginina a ornitina y urea. Se ha reportado que mutantes nulas en dichos genes poseen mayor
contenido de arginina para la síntesis de espermina y de otras poliaminas, y/o para la síntesis de
NO vía actividades tipo NOS (Flores et al., 2008). A su vez, la espermina estimula la
producción de NO en Arabidopsis (Tun et al., 2006). Las plántulas mutantes nulas en ARGAH1
y ARGAH2 tratadas con arginina poseen un fenotipo similar al disparado por NO, exhibiendo
hipocótilos y pecíolos elongados, cotiledones enroscados, engrosamiento de hojas y raíces,
acortamiento de raíces primarias y desarrollo de raíces adventicias y laterales (Flores et al.,
2008). Por su parte, las plántulas salvajes poseen una menor respuesta al agregado de arginina,
careciendo de raíces adventicias, aunque se observan algunas raíces laterales y una leve
inhibición de la elongación de raíces primarias. Los autores proponen que la arginina o un
derivado de la misma es una fuente potencial de NO y que una reducción en la actividad
arginasa resulta en una mayor conversión de arginina a NO, potenciando así la acción de las
auxinas en las raíces (Flores et al., 2008).
Está establecido ampliamente que los microoganismos que habitan el suelo son
importantes productores de NO. En relaciones simbióticas entre plantas y microorganismos, es
probable que ambos interactores contribuyan en la homeostasis del NO e influencien la
síntesis/degradación de NO recíprocamente. El género bacteriano Azospirillum pertenece al
grupo de bacterias promotoras del crecimiento de las plantas, induciendo cambios drásticos en
111
la arquitectura radical. Se ha reportado que la inoculación de plantas con estas bacterias
promueve la formación de raíces laterales, de pelos radicales y de raíces adventicias en varias
especies vegetales (Okon y Labandera-González, 1994). Se ha propuesto que la producción o
modificación de fitohormonas por Azospirillum es uno de los factores responsables de inducir
dichos procesos del crecimiento y desarrollo de las plantas (Tien et al., 1979). Creus et al.
(2005) determinaron que A. brasilense es capaz de producir NO creciendo bajo condiciones
aeróbicas. Más recientemente, se ha demostrado que el NO posee un rol importante en la FRA
inducida por A. brasilense en hipocótilos de tomate (Molina-Favero et al., 2008). El porcentaje
de plántulas de tomate con raíces adventicias se incrementó 10 veces en aquellas que fueron
inoculadas con A. brasilense respecto de las no inoculadas. La adición del secuestrante de NO
cPTIO revirtió este efecto (Molina-Favero et al., 2008).
Teniendo en cuenta estas evidencias, sería interesante explorar la participación de
fuentes enzimáticas y no enzimáticas de producción de NO durante la FRA en explantos de
pepino.
Efectos de diversos compuestos sobre la formación de raíces adventicias en pepino
y otras especies vegetales
Se ha estudiado el efecto de numerosos compuestos de muy variada naturaleza sobre el
proceso de FRA en diversas especies vegetales. La Tabla 2 reúne la información bibliográfica
disponible y los resultados de la presente tesis con respecto a los compuestos que inducen y
aquellos que inhiben la FRA. Debido a la gran cantidad de compuestos que contiene la Tabla 2,
nos centraremos sólo en explicar el efecto de aquellos que fueron probados en pepino.
112
Tabla 2. Resumen de los efectos de numerosos compuestos sobre la FRA en diversas especies vegetales.
Los compuestos se agrupan según induzcan o inhiban el proceso de FRA. A su vez, se dividen en clases
de acuerdo con similitudes estructurales y/o de función. En negrita se destacan los compuestos que se han
probado en Cucumis sativus. Nota 1: no se citan los trabajos referidos al efecto inductor de las auxinas
sobre la FRA por ser demasiado numerosos. Nota 2: el NO y el monóxido de carbono se incluyen dentro
de la clase hormonas por poseer características similares a las hormonas y por ser consideradas como
tales en la literatura. Nota 3: el ácido jasmónico y el metiljasmonato también son consideradas como
hormonas en la literatura.
COMPUESTOS QUE INDUCEN LA FRA
CLASE
COMPUESTO
Derivados de difenilurea
AMIDA
AZUCAR
FENOLICO
Alcámidos
Fructosa,
Glucosa,
Sacarosa
Ácido ferúlico
Auxinas
Etileno
HORMONA
NO
Monóxido de carbono
Brasinosteroides
Ca2+
NUTRIENTE
MINERAL
OXILIPINA
POLIAMINA
SISTEMA
REDOX
OTRO
Ca2+, Zinc, Nitrato,
Manganeso, Hierro
Deficiencia de fosfato
Ácido 9-oxononanoico,
Traumatina,
Ácido colnelénico,
Ácido colneleico
Putrescina
Ascorbato
Peróxido de hidrógeno
Superóxido
Ácido fosfatídico
ATP extracelular
Melatonina
Oxígeno
ESPECIE VEGETAL
Malus pumila,
Vigna radiata
Arabidopsis thaliana
Campos-Cuevas et al., 2008
Takahashi et al., 2003
Panax ginseng
Numerosas
Oryza sativa
Ali et al., 2007
Numerosos
Lorbiecke y Sauter, 1999;
Mergeman y Sauter, 2000
Clark et al., 1999
Solanum lycopersicum,
Petunia hybrida
Pinus contorta
Cucumis sativus
Vigna radiata
Panax ginseng
Cucumis sativus
Vigna radiata
Glycine max
Populus tremula x
Populus tremuloides
Eucalyptus globulus
REFERENCIA
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Tewari et al., 2008
Xuan et al., 2008
Xu et al., 2006b
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1990
Bellamine et al., 1998
Schwambach et al, 2005
Phaseolus vulgaris
Solanum lycopersicum
Miller et al., 1998
Kim et al., 2008
Vellosillo et al., 2007
Vigna radiata
Solanum lycopersicum
Cucumis sativus
Panax ginseng
Cucumis sativus
Nag et al., 2001
Tyburski et al., 2006
Li et al., 2007
Tewari et al., 2008
Presente tesis
Lupinus albus
Arnao y Hernández-Ruiz,
2007
Li et al., 2006c
Salix nigra
113
COMPUESTOS QUE INHIBEN LA FRA
CLASE
AMINOACIDO
FENOLICO
COMPUESTO
Metoxibenzilglutamina
Fenoles
Ácido cafeico
Cafeína
Giberelinas
Ácido abscísico
HORMONA
Citoquininas
Brasinosteroides
OXILIPINA
Ácido jasmónico
Metiljasmonato
ESPECIE VEGETAL
Cucumis sativus
Nothofagus pumilio
Vigna radiata
Pisum sativum,
Phaseolus lunatus
Helianthus annuus
Oryza sativa
Cucumis sativus
Oryza sativa
Phaseolus vulgaris,
Vigna radiata,
Cucumis sativus
Oryza sativa
Panax ginseng
Bupleurum kaoi
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Kuroha et al., 2006
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Moons et al., 1997
Kim et al., 2004
Chen et al., 2007
Dentro de los compuestos que inducen el proceso de FRA en pepino, se encuentran las
auxinas, el NO, el ácido fosfatídico y el ATP extracelular (estudiados por nosotros), el
monóxido de carbono (CO) y el peróxido de hidrógeno (Tabla 2).
El monóxido de carbono (CO) es un gas diatómico de bajo peso molecular que se
produce por las enzimas hemo oxigenasas (HOs). En animales, el CO funciona como molécula
señal siendo la mayoría de sus efectos mediados por NO y por la síntesis de cGMP vía
activación de la enzima GC. Algunas de las funciones más estudiadas del CO incluyen la
neurotransmisión, la proliferación celular y la modulación de las reacciones inflamatorias. La
presencia de CO en plantas fue reportada por primera vez en 1959 por Wilks. En Arabidopsis, el
gen HO1 codifica para una HO plastídica, la cual cataliza la formación de biliverdina a partir de
hemo con la concomitante producción de CO en presencia de ferredoxina reducida (Muramoto
et al., 2002). Sin embargo, se conoce poco acerca de la biosíntesis de CO en plantas por HO in
vivo (Muramoto et al., 2002). Se ha demostrado la participación del CO en diferentes procesos
biológicos en plantas mediante el uso de CO gaseoso o de inductores de HO como hematina o
hemina. Algunos de estos procesos incluyen la dormición y germinación de semillas (Xu et al.,
2006a), la inducción de la elongación de la raíz (Xuan et al., 2007), la reversión del daño
oxidativo inducido por salinidad (Huang et al., 2006) o por cadmio (Han et al., 2008) y la FRA
114
(Zimmerman et al., 1933; Xu et al., 2006b; Xuan et al., 2008). En particular, se ha reportado que
el agregado exógeno de CO o de hematina induce la FRA en explantos de Vigna radiata, efecto
que es bloqueado por tratamiento con un secuestrante de NO o con un inhibidor de la enzima
NOS (Xu et al., 2006b). En este mismo sentido apuntan los resultados obtenidos con explantos
de pepino ya que el tratamiento con CO o hematina induce la FRA de manera dosis dependiente
(Xuan et al., 2008). A su vez, la depleción de auxinas endógenas (por decapitación de explantos
y tratamiento con NPA) disminuye el número de raíces adventicias, la actividad HO y el
contenido endógeno de CO. El tratamiento con la auxina IAA o con el dador de NO SNP
incrementa tanto la actividad HO como el contenido de CO. Además, la aplicación del inhibidor
específico de HO1 zinc protoporfirina IX bloquea la FRA inducida por IAA. Finalmente,
también se ha visto que el CO induce la expresión de genes que codifican para CDPKs (Xuan et
al., 2008). En su conjunto, estas evidencias sugieren que el transporte basípeto de auxinas
induce la producción de CO en la región basal de los hipocótilos de pepino. Este incremento en
el nivel de CO induce la expresión de genes de CDPKs. Aún no hay evidencias experimentales
acerca de un posible cruce de información entre las vías de señalización reguladas por CO y por
NO. Sin embargo, Xuan et al. (2008) sugieren que el NO podría inducir la actividad HO con el
consecuente incremento de la producción de CO. En conclusión, los resultados discutidos
evidencian profundas similitudes entre los efectos de los gases CO y NO tanto en animales
como en plantas.
El peróxido de hidrógeno es una ROS que funciona como molécula señal frente a
numerosos estímulos incluyendo auxinas y ABA. Se ha reportado que el peróxido de hidrógeno
participa en los procesos de formación de raíces laterales (Su et al., 2006) y de pelos radicales
(Foreman et al., 2003). Más recientemente, se ha observado que el estrés mecánico producido
por remoción de los sistemas radicales de plántulas de pepino induce la generación de peróxido
de hidrógeno (Li et al., 2007). El tratamiento con peróxido de hidrógeno incrementa el número y
el peso fresco de las raíces adventicias, efectos que son bloqueados por el agregado de
ascorbato, o de la enzima catalasa o de un inhibidor de la enzima NADPH oxidasa (Li et al.,
2007).
115
Hasta el momento, los compuestos reportados que inhiben el proceso de FRA en pepino
son los brasinosteroides, las citoquininas y el aminoácido metoxibencilglutamina (Tabla 2).
Se ha analizado el efecto de la aplicación exógena de brasinosteroides sobre procesos
del crecimiento y desarrollo de las raíces. En general, los brasinosteroides inhiben la elongación
de las raíces primarias, la formación de raíces laterales y la FRA; aunque a bajas
concentraciones (menores a 1 pM) pueden inducir algunos de estos procesos (Sathiyamoorthy y
Nakamura, 1990). En particular, el tratamiento de explantos de pepino con brasinólide resulta en
una inhibición de la FRA (Adam y Marquardt, 1986).
Las citoquininas son reguladores negativos de los procesos del crecimiento y desarrollo
de las raíces. En particular, la aplicación exógena de citoquininas inhibe la FRA en diversas
especies vegetales. Sin embargo, sus efectos son dependientes de la dosis aplicada. Se ha
estudiado el efecto de citoquininas como la zeatina o un ribósido de zeatina (purificado a partir
de savia xilemática de raíces de calabacín) sobre la FRA en pepino, encontrándose una
inhibición dosis dependiente de este proceso (Kuroha et al., 2002). Los autores especulan que,
luego del estrés mecánico generado por la remoción de los sistemas radicales primarios, el
contenido de giberelinas disminuye en la parte basal de los hipocótilos, mientras que el
contenido de auxinas y etileno aumenta, resultando en una inducción de la FRA (Kuroha et al.,
2002). Resultados similares se han obtenido en girasol y arveja (Fabijan et al., 1981; Bollmark
et al., 1988; Liu et al., 1990).
Se ha observado que varios inhibidores del proceso de FRA se localizan en las raíces. El
aminoácido glutamina es un transportador de nitrógeno desde las raíces a los tallos a través de la
savia xilemática (Schurr y Schulze, 1995). La metoxibencilglutamina [N5-(4-metoxifenil)metilL-glutamina] es un derivado de la glutamina. El tratamiento con metoxibencilglutamina
purificada a partir de savia xilemática de raíces no sólo inhibe la FRA sino también el desarrollo
de los cotiledones y de la primera hoja en pepino (Satoh et al., 1998). Sin embargo, aún se
desconoce la concentración real de este derivado y sus funciones fisiológicas en las plantas.
Luego del análisis de la bibliografía citada en la Tabla 2 con respecto a los efectos
generados por la deficiencia de fosfato en las raíces (Miller et al., 1998; Kim et al., 2008) y de
116
otros reportes sobre este tema, surgen varios puntos a discutir relacionados con las auxinas y
con vías de señalización de PLs que involucran la enzima PLD. El fosfato es un nutriente
mineral esencial para el crecimiento, desarrollo y reproducción de las plantas, jugando un rol
importante no sólo en la regulación de varias enzimas sino también como constituyente de
componentes celulares como PLs estructurales y ácidos nucleicos (Schachtman et al., 1998). La
disponibilidad de fosfato en el suelo, frecuentemente escaso, es un factor importante para
determinar la morfología de la raíz (Forde y Lorenzo, 2001). La deficiencia de fosfato puede
alterar dramáticamente la arquitectura radical, inhibiendo la elongación de raíces primarias e
incrementando la formación de pelos radicales, y de raíces laterales y adventicias (Linkohr et
al., 2002; Miller et al., 1998; Kim et al., 2008). Otra de las respuestas adaptativas frente a la
deficiencia de fosfato es el reemplazo, en las membranas celulares, de PLs por lípidos que no
contienen fosfato como los galactolípidos y los sulfolípidos. El lípido de reemplazo más
predominante es digalactosil diacilglicerol (DGDG). Se ha determinado que la alteración de
lípidos de membrana durante la limitación de fosfato es dependiente de la señalización y del
transporte de auxinas (Kobayashi et al., 2006). Nacry et al. (2005) demostraron que, durante la
deficiencia de fosfato, la concentración de IAA se incrementa en raíces primarias y laterales.
Adicionalmente, se ha observado un incremento en la actividad del promotor de respuesta a
auxinas DR5 como fusión al gen marcador GUS por deprivación de fosfato en primordios de
raíces laterales (López-Bucio et al., 2005; Nacry et al., 2005).
Por otra parte, se ha propuesto que las enzimas PLD y PLC están involucradas en la
disminución del contenido de PLs durante la deprivación de fosfato (Russo et al., 2007). En
Arabidopsis, la subfamilia de PLDξ comprende 2 genes, PLDξ1 y PLDξ2, los cuales se inducen
en respuesta a condiciones limitantes de fosfato (Li et al., 2006a). Se ha reportado que PLDξ2
(y en menor medida PLDξ1) participa en la hidrólisis de PC y PE para producir DAG para la
síntesis de DGDG, y fosfato libre para sostener otros procesos que requieren fosfato como el
metabolismo celular (Cruz-Ramírez et al., 2006; Li et al., 2006b). Adicionalmente, plantas
mutantes nulas en PLDξ2 (pero no en PLDξ1) sometidas a deficiencia de fosfato poseen un
117
menor contenido de PA en raíces que plantas salvajes (Li et al., 2006a). Estos resultados en
conjunto sugieren que PLDξ2 contribuiría en la regulación del recambio de PLs y la
acumulación de galactolípidos en respuesta a la limitación de fosfato.
Evidencias genéticas demostraron que procesos regulados por auxinas como el
gravitropismo y la elongación de hipocótilos y de raíces primarias están reducidos en mutantes
nulas de PLDξ2, probablemente debido a una alteración en el transporte y distribución de
auxinas (Li y Xue, 2007). Un estudio subsiguiente demostró que específicamente PLDξ2, y no
otra PLD, está especializada en la regulación del transporte polar de auxinas en la parte distal de
la zona de transición de los ápices radicales (Mancuso et al., 2007).
En conclusión, se podría sugerir que la síntesis, el transporte y la señalización por
auxinas son requeridos para las respuestas inducidas por deficiencia de fosfato, siendo PLDξ2
un regulador positivo de la vía.
Consideraciones finales y perspectivas
Los avances tecnológicos de los últimos años han modificado profundamente la manera
en que se intenta responder a las preguntas en biología. Con el advenimiento de la genómica,
transcriptómica, proteómica y metabolómica se ha logrado dilucidar los componentes de
muchas vías de señalización e identificar genes potenciales y proteínas interactoras dentro de las
mismas.
Se ha determinado que las vías de transducción de señales en plantas involucran
numerosos elementos que actúan de manera positiva o negativa y que interaccionan entre sí a
través de mecanismos de control tales como cruce de información, interferencia, integración,
intersección, sinergismo, antagonismo, cooperativismo, divergencia, feedback y feedforward
(Xing y Jordan, 2000). Esto es particularmente útil para dotar de plasticidad a las plantas y para
la necesidad que poseen las mismas de responder a estímulos ambientales de manera rápida y
precisa.
118
Las vías de señalización son robustas, y la robustez se obtiene a través de los complejos
mecanismos de control mencionados anteriormente. Asimismo, la redundancia es necesaria para
la fiabilidad de las vías de señalización. Por lo tanto, es posible afirmar que dentro de ellas
abundan no sólo isoformas de proteínas reguladoras claves sino también circuitos de control
superpuestos (Trewavas, 2002). Por ejemplo, debido a la enorme cantidad de estímulos que
generan cambios en la [Ca2+]cit, las plantas poseen numerosas isoformas de CDPKs con
potencial para decodificar dichos estímulos de manera específica.
El desarrollo de órganos de novo u organogénesis involucra una serie coordinada de
divisiones celulares y una subsecuente inducción de procesos de elongación y diferenciación
celular. La diferenciación celular es el resultado de la expresión de un grupo particular de genes
dentro del genoma de cada célula. Las hormonas coordinan el crecimiento y desarrollo actuando
como mensajeros químicos entre células. Dentro de ellas, las auxinas poseen un rol primordial
en determinar patrones de crecimiento y diferenciación celular en las raíces. Brinker et al.
(2004) investigaron la expresión génica por microarreglos de cDNAs durante la FRA en
hipocótilos de Pinus contorta tratados con auxinas y encontraron más de 200 genes expresados
diferencialmente. Estos genes están relacionados con el transporte de auxinas, la fotosíntesis, la
replicación celular y la formación de pared celular. Un análisis proteómico posterior en
hipocótilos de Arabidopsis (Sorin et al., 2006) confirmó los resultados obtenidos a nivel
transcripcional por Brinker et al. (2004). Sorin et al. (2006) identificaron proteínas relacionadas
con auxinas y luz que actúan positiva o negativamente en la FRA.
En la presente tesis hemos descifrado sólo una parte de los mecanismos bioquímicos y
moleculares que controlan la FRA, utilizando explantos de pepino como modelo experimental.
Las extrapolaciones de nuestros resultados a otras especies vegetales no son directas y se
requiere de experimentación adicional para generalizar las evidencias. Luego del
descubrimiento del efecto inductor del gas CO sobre la FRA en pepino (Xuan et al., 2008),
surge un abanico de posibilidades de estudio con respecto a un posible cruce de información
entre las vías de señalización reguladas por CO y por NO. A su vez, algunas de las preguntas
para las cuales aún no poseemos respuestas son: (i) Puede el NO incrementar la sensibilidad a
119
las auxinas?, (ii) Puede el NO afectar la distribución de auxinas?, (iii) Puede el NO actuar como
un antioxidante previniendo la oxidación de auxinas?
Por medio de ensayos farmacológicos, bioquímicos, y fisiológicos hemos demostrado
que existe una red compleja de interacciones entre diversos mensajeros celulares que participa
de la vía de transducción de señales inducida por auxinas que conduce a la FRA (Figura 34).
Dentro de esta vía, el NO activa simultáneamente numerosos pasos que pueden estar conectados
entre sí o ser independientes. No obstante, las evidencias experimentales indican que todos esos
pasos deben permanecer activados para obtener un óptimo enraizamiento.
Un desafío a futuro es entender cómo cambios muy pequeños y precisos en la
concentración de una molécula ubicua como el NO pueden estar simultánea y específicamente
involucrados en tan diversas vías de señalización activadas por auxinas. Probablemente el NO
se comporte como un regulador principal o master dentro del circuito de señalización hormonal.
Dentro de esta jerarquía de señales, existirían reguladores secundarios que no afectarían
directamente el proceso o respuesta celular desencadenada por la hormona.
Por otra parte, nuestros resultados ponen en evidencia un alto grado de conservación
entre los mecanismos de transducción de señales inducidos por NO en animales y plantas.
Sorprendentemente, todos los componentes celulares (cGMP, cADPR, inositol 1,4,5-trifosfato,
fosfolípidos señales, Ca2+) y actividades enzimáticas (quinasas de proteínas y fosfolipasas) que
participan de la FRA en explantos de pepino han sido involucrados en procesos regulados por
NO en distintas células eucariotas.
Hasta el momento, las herramientas disponibles dentro de los protocolos utilizados para
la regeneración de especies vegetales incluyen complejos tratamientos hormonales y regímenes
específicos de luz y estrés mecánico. Las evidencias experimentales que aporta esta tesis sobre
el mecanismo de acción del NO para promover la FRA, abren nuevas puertas al estudio de sus
aplicaciones en la propagación vegetativa de especies vegetales con comportamientos
recalcitrantes al enraizamiento, y de cultivos de interés agronómico y comercial.
120
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TRABAJOS ORIGINADOS A PARTIR DE ESTA TESIS
Los resultados descriptos en este trabajo de tesis fueron presentados en las siguientes
publicaciones científicas y/o comunicados en las siguientes presentaciones a congresos
nacionales e internacionales. A su vez, hemos recibido distinciones por una publicación
científica y por dos presentaciones a congresos.
Publicaciones Científicas:
Lanteri María Luciana, Laxalt Ana M., Lamattina Lorenzo. 2008. Nitric oxide triggers
phosphatidic acid accumulation via phospholipase D during auxin-induced adventitious root
formation in cucumber. Plant Physiology 147(1): 188-198.
Lanteri María Luciana, Pagnussat Gabriela Carolina, Lamattina Lorenzo. 2006. Calcium and
calcium-dependent protein kinases are involved in nitric oxide- and auxin-induced
adventitious root formation in cucumber. Journal of Experimental Botany 57(6): 1341-1351.
Lanteri María Luciana†, Pagnussat Gabriela Carolina†, Lombardo María Cristina, Lamattina
Lorenzo. 2004. Nitric oxide mediates the indole acetic acid induction activation of a
mitogen-activated protein kinase cascade involved in adventitious root development. Plant
Physiology 135(1): 279-286.
Trabajos Publicados como Capítulos de Libro:
Lanteri María Luciana, Pagnussat Gabriela, Laxalt Ana María, Lamattina Lorenzo. 2008.
Nitric oxide is downstream auxin and is required for inducing adventitious root formation in
herbaceous and woody plants. En: Adventitious root formation in forest trees and woody
horticultural crops - from genes to applications. Karoliina Niemi, Carolyn Scagel (Eds.).
Research Signpost. En prensa.
Lanteri M Luciana†, Distéfano Ayelen M†, ten Have Arjen, García-Mata Carlos, Lamattina
Lorenzo, Laxalt Ana M. 2008. Nitric oxide and phosphatidic acid signalling in plants. En:
Lipid Signaling in Plants. Series: Plant Cell Monographs. Munnik Teun (Ed.). SpringerBerlin, Heidelberg, Germany. En prensa.
Molina Favero Celeste, Creus Cecilia, Lanteri María Luciana, Correa-Aragunde Natalia;
Lombardo María Cristina, Barassi Carlos Alberto, Lamattina Lorenzo. 2007. Nitric oxide
and plant growth promoting rhizobacteria: common features influencing root growth and
development. En: Advances in Botanical Research. Vol 46. Kader Jean-Claude, Delseny
Michel (Eds.). Elsevier/Academic Press, San Diego, CA, USA. pp 1-33. ISBN:
9780123737052.
Correa-Aragunde Natalia, Lanteri María Luciana, García-Mata Carlos, ten Have Arjen, Laxalt
Ana María, Graziano Magdalena, Lamattina Lorenzo. 2007. Nitric Oxide Functions as
Intermediate in Auxin, Abscisic Acid and Lipid Signaling Pathways. En: Nitric Oxide in
Plant Growth, Development and Stress Physiology. Series: Plant Cell Monographs, Vol. 6.
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Lamattina Lorenzo, Polacco Joseph C (Eds.). Springer-Berlin, Heidelberg, Germany. pp
113-130. ISBN: 978-3-540-45128-0.
Lanteri María Luciana, Graziano Magdalena, Correa-Aragunde Natalia, Lamattina Lorenzo.
2006. From cell division to organ shape: nitric oxide is involved in auxin-mediated root
development. En: Communication in Plants: Neuronal Aspects of Plant Life. Baluška
František, Mancuso Stefano, Volkmann Dieter (Eds.). Springer-Verlag, London, UK. pp
123-133. ISBN: 3-540-28475-3.
Lamattina Lorenzo, Lanteri Luciana, García-Mata Carlos, Graziano Magdalena, CorreaAragunde Natalia. 2004. Nitric oxide is required as intermediate in hormone signaling
pathways in higher plants. Proceedings of the XII Biennial Meeting, Society for Free Radical
Research International. Eds: Puntarulo S y Boveris A. Monduzzi Editore International
Proceedings Division, Bologna, Italy. pp 357-363. ISBN: 88-7587-109-4.
†Estos autores contribuyeron por igual en este trabajo.
Presentaciones a Congresos Nacionales:
Lanteri María Luciana, Laxalt Ana María, Lamattina Lorenzo. 2008. La producción de ácido
fosfatídico vía fosfolipasa D es requerida para la formación de raíces adventicias inducida
por auxinas y óxido nítrico. Jornadas de Lípidos 2008, 7 y 8 de agosto de 2008, Rosario,
Santa Fe, Argentina. Tipo de presentación: Comunicación oral.
Lanteri María Luciana, Laxalt Ana María, Lamattina Lorenzo. Auxin and nitric oxide trigger
phosphatidic acid accumulation via phospholipase D in cucumber. 2007. BIOCELL Vol. 31.
Pág. 46. XLIII Reunión Argentina de la SAIB, 17 al 20 de noviembre de 2007, Mar del
Plata, Buenos Aires, Argentina. Tipo de presentación: Comunicación oral.
Lanteri María Luciana, Laxalt Ana María, Lamattina Lorenzo. 2006. Señalización por
fosfolipídos inducida por auxinas y óxido nítrico durante la formación de raíces adventicias.
Resúmenes de Conferencias, Simposios y Trabajos presentados. Pág. 47. XXVI Reunión
Argentina de Fisiología Vegetal, 4 al 6 de octubre de 2006, Chascomús, Buenos Aires,
Argentina. Tipo de presentación: Póster.
Lanteri María Luciana, Pagnussat Gabriela Carolina, Lamattina Lorenzo. 2004. La formación
de raíces adventicias es inducida por AIA y óxido nítrico mediante vías dependientes e
independientes de cGMP. Resúmenes de Conferencias, Simposios y Trabajos presentados.
Pág. 163. XXV Reunión Argentina de Fisiología Vegetal, 22 al 24 de septiembre de 2004,
Santa Rosa, La Pampa, Argentina. Tipo de presentación: Póster.
Lanteri María Luciana, Pagnussat Gabriela Carolina, Lamattina Lorenzo. 2003. Nitric oxide,
cGMP, CDPKs and MAPKs are involved in the IAA-induced adventitious root formation in
cucumber. BIOCELL Vol. 27. Pág. 57. XXXIX Reunión Nacional de la SAIB, 17 al 21 de
142
noviembre de 2003, San Carlos de Bariloche, Río Negro, Argentina. Tipo de presentación:
Comunicación oral.
Presentaciones a Congresos Internacionales:
Lanteri Luciana, Correa-Aragunde Natalia, Lombardo Cristina, Laxalt Ana, Lamattina
Lorenzo. 2008. Nitric oxide is downstream of auxin regulating root growth and
developmental processes. Resúmenes de Conferencias, Simposios y Trabajos. Pág. 44. XIII
Reunión Latinoamericana y XXVII Reunión Argentina de Fisiología Vegetal, 21 al 24 de
septiembre de 2008, Rosario, Santa Fe, Argentina. Tipo de presentación: Comunicación oral.
Simposio: Morfogénesis.
Lanteri María Luciana, Lamattina Lorenzo, Correa-Aragunde Natalia, Lombardo Cristina,
Graziano Magdalena. 2006. Nitric oxide: a critical signal molecule that functions in plant
root development. First Plant NO Group Meeting, 28 y 29 de agosto de 2006, Verona, Italia.
Tipo de presentación: Comunicación oral (idioma inglés).
Lanteri María Luciana, Laxalt Ana María, Lamattina Lorenzo. 2005. Phospholipid and nitric
oxide signaling involved in auxin-induced adventitious root formation. BIOCELL Vol. 29.
Pág. 204. XLI Reunión Nacional de la SAIB, 3 al 6 de diciembre de 2005, Pinamar, Buenos
Aires, Argentina. Tipo de presentación: Póster.
Distinciones Obtenidas:
Puesto Nro 16 del “Top 100 Nitric oxide publications for 2006” al siguiente trabajo: Lanteri
María Luciana, Pagnussat Gabriela Carolina y Lamattina Lorenzo. 2.006. Calcium and
calcium-dependent protein kinases are involved in nitric oxide- and auxin-induced
adventitious root formation in cucumber. Journal of Experimental Botany 57(6): 1341-1351.
Mención de Honor al Póster “Señalización por fosfolípidos inducida por auxinas y óxido nítrico
durante la formación de raíces adventicias”. Sección Temática “El desarrollo de las Plantas”,
XXVI Reunión Argentina de Fisiología Vegetal, 4 al 6 de octubre de 2006, Chascomús,
Buenos Aires, Argentina.
Mención de Honor al Póster “La formación de raíces adventicias es inducida por AIA y óxido
nítrico mediante vías dependientes e independientes de cGMP”, Sección Temática
“Desarrollo y Acción Hormonal”, XXV Reunión Argentina de Fisiología Vegetal, 22 al 24
de septiembre de 2004, Santa Rosa, La Pampa, Argentina.
143
ABSTRACT
Adventitious root (AR) formation involves the development of a meristematic tissue
after the removal of primary root systems. AR formation is a complex process under the control
of endogenous (mainly hormones) and exogenous (light, temperature, wounding, etc) factors.
AR formation has practical applications in agronomy and economic interest because many
plants are recalcitrant to rooting. Within hormones, auxins play a central role in integrating and
synchronizing the signaling pathways triggered by endogenous and exogenous stimuli leading
to AR formation.
Nitric oxide (NO) is a signal molecule involved in many processes associated to growth,
development and physiology in plants. The present thesis describes and interprets physiological,
biochemical and molecular evidence that demonstrate the participation of NO in AR formation
induced by auxins. NO is necessary to increase the number and length of ARs in cucumber
(Cucumis sativus) explants. Auxins induce the synthesis of NO at the base of cucumber
hypocotyls, a crucial step to activate the signaling pathways leading to AR formation. These
pathways involves a complex set of cellular messengers such as cyclic GMP (cGMP), cyclic
ADP ribose, inositol 1,4,5-triphosphate, Ca2+, mitogen activated protein kinases (MAPKs),
Ca2+-dependent protein kinases (CDPKs), and phospholipases C and D.
In the present thesis we demonstrate that: i) darkness has a stimulatory effect on AR
formation and the presence of endogenous auxins and entire explants (cotyledons, caulinar
meristem and hypocotyl) are necessary to trigger this process, ii) NO is required for the
activation of a MAPK signaling cascade induced by auxin and involved in AR formation, being
this cascade independent of cGMP, iii) Ca2+ and CDPKs are involved in AR formation induced
by auxins and NO, being this CDPK activation dependent on cGMP, iv) auxins and NO induce
the accumulation of phosphatidic acid via phospholipase D during AR formation in cucumber,
being the activity of this enzyme required for triggering the process of AR formation, v)
extracellular ATP induce an increase in the number and length of ARs, being endogenous NO
required for this effect.

portada tapa 3

Transcripción

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FELICES FIESTAS!!! Espero que todos tengan unas vacaciones