Libro 2da. Edición Dr. Torres

Transcripción

MANUAL PRÁCTICO DE
BACTERIOLOGÍA MÉDICA
por
Miguel F. Torres
Portada interna:
Microfotografía electrónica de Salmonella typhi en división. Muestra los flagelos, las
fimbrias y la pared celular de la bacteria que causa la fiebre tifoidea. Inserto: dibujos de bacterias de la microbiota oral, por A. van Leeuwenhoek, siglo XVII.
© 1996, Miguel Francisco Torres Rubín
Químico Biólogo graduado de la Universidad de San Carlos de Guatemala. Posee
Maestría en Microbiología Médica de la Universidad de Duke, Carolina del Norte,
Estados Unidos.
Fundador del Laboratorio Microbiológico de Referencia (LAMIR) y catedrático titular de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Microbiología, Escuela de
Química Biológica, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, Universidad de San
Carlos de Guatemala.
Por muchos años fue microbiólogo del Instituto Guatemalteco de Seguridad Social
(IGSS) y del Hospital Militar en la ciudad de Guatemala. Es miembro de la Academia de Ciencias Médicas, Físicas y Naturales de Guatemala, y fundador de la Academia Guatemalteca de Historia de la Medicina.
Los criterios expresados en esta publicación son de la exclusiva responsabilidad
del autor e incluyen su experiencia personal.
Impreso en Editorial Serviprensa C.A.
3a. avenida 14-68, zona 1
Tels. 232-5424, 232-9025 Fax: 232-0237
Guatemala, Guatemala, 1996
ÍNDICE
PRESENTACIÓN / 11
AGRADECIMIENTOS / 13
PRÓLOGO / 15
Foto: Antonio van Leeuwenhoek. Foto: Luis Pasteur. Foto: Roberto Koch.
CAPÍTULO 1:
BREVE INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA / 21
El Nombre Correcto de los Microorganismos. Recomendaciones de Bioseguridad
para el Laboratorio de Microbiología. Medidas de Bioseguridad. Métodos de
Esterilización o Desinfección. Descontaminación. Antisepsia. Uso efectivo de
Antisépticos, Desinfectantes y Procedimientos de Esterilización. Resistencia de
Microorganismos a Germicidas Químicos.
CAPÍTULO 2:
INTRODUCCIÓN A LA BACTERIOLOGÍA / 29
Cómo Organizar el Area de Trabajo de Bacteriología. Fig. 1 Mesa de Trabajo para
Bacteriología. La Coloración de Gram. Foto: Hans Gram. Fórmulas: Reactivos para
la Coloración de Gram. Fig. 2 Clases de Asas Microbiológicas y su Uso, 1 Asas para
Bacteriología, 2 Asas para Micología y Micobacterias. Fig. 3 Inoculación de Medios
Sólidos por Estrías.
CAPÍTULO 3:
COPROCULTIVO / 41
Propósito. Muestra. Procedimiento. Fig. 4 Marcha Bacteriológica para Coprocultivo.
Interpretación de Resultados. Fig. 5 Observación y Señalamiento de Colonias
Sospechosas. Fig. 6 Técnica para tomar Inóculo de Colonias Individuales. Reacciones
de varias Enterobacterias en TSI/LIA. Diferenciación de las Especies del Género
Shigella. Diferenciación de las Especies del Género Salmonella. Informe.
Procedimiento para Cultivo de Cuerdas Encapsuladas (Enterotest) para Colección
de Muestras Duodenales. La Epidemiología y Etiología de la Diarrea. Patógenos
Frecuentemente Identificados en Niños con Diarrea Aguda, Atendidos en Centros
de Tratamiento, en Países en Desarrollo.
CAPÍTULO 4:
COPROCULTIVO PARA CÓLERA / 63
Propósito. Muestra. Procedimiento. Interpretación de Resultados. Fig. 7 Marcha
Bacteriológica Acortada para Aislamiento de Vibrio cholerae 01. Informe. Fórmulas:
1 Agua Peptonada Alcalina (APA), 2 Medio de Transporte Cary-Blair.
CAPÍTULO 5:
COPROCULTIVO PARA Campylobacter jejuni / 71
Propósito. Muestra. Condiciones necesarias. Procedimiento. Interpretación de
Resultados. Informe.
CAPÍTULO 6:
INVESTIGACIÓN DE Helicobacter pylori / 75
Propósito. Muestra. Observación Directa. Prueba de Ureasa. Cultivo. Informe.
CAPÍTULO 7:
UROCULTIVO / 79
Propósito. Manifestaciones Clínicas y Microorganismos Asociados con Varios Tipos
de Infecciones Urinarias. Toma de la Muesta. Toma de Urocultivo en el Hombre.
Toma de Urocultivo en la Mujer. Toma de Urocultivo en Niños Pequeños. Punción
Supra-púbica (PSP). Procedimiento. Foto: Biplaca para Urocultivo. Fig. 8 Marcha
Bacteriológica para Urocultivo. Interpretación de Resultados. Informe. Detección
de Bacteriuria por la Coloración de Gram de Orina no Centrifugada.
CAPÍTULO 8:
CULTIVO DE GARGANTA / 91
Propósito. Muestra. Procedimiento. Fig. 9 Marcha Bacteriológica para Cultivo de
Garganta/Exudado Faríngeo. Interpretación. Foto: Interpretación de la Prueba de
Bacitracina. Identificación Presuntiva de Streptococcus agalactiae (Grupo B), Prueba
de CAMP. Fig. 10 Siembra e Interpretación de la Prueba de CAMP. Características
Físicas, Hematológicas y Químicas de la Sangre de Carnero. Ventajas del Uso de la
Sangre de Carnero en el Laboratorio Clínico.
CAPÍTULO 9:
CULTIVOS DE GARGANTA ESPECIALES / 105
Propósito. Investigación de Corynebacterium diphtheriae. Muestra y Procedimento.
Interpretación de Resultados. Informe. Investigación de Neisseria meningitidis en
Cultivos de Garganta de Contactos. Muestra y Procedimiento. Interpretación.
Informe.
CAPÍTULO 10:
CULTIVO DE ESPUTO / 121
Propósito. Muestra. El Frote Gram de Esputo. Interpretación del Frote Gram de
Esputo. Cultivo de Esputo. Interpretación de Resultados e Informe. Etiología y
Sintomatología de Neumonía y Bronquitis.
CAPÍTULO 11:
HEMOCULTIVO / MIELOCULTIVO / 129
Propósito. Muestra. Procedimiento. Observaciones en Hemocultivos que Orientan
el Diagnóstico Bacteriológico. Interpretación de Resultados. Etiología y
Sintomatología de Septicemia. Informe.
CAPÍTULO 12:
SECRECIONES DIVERSAS / 137
Propósito. Muestra. 1 Piel. Etiología y Sintomatología de Heridas Infectadas. 2 Ojos.
Etiología y Sintomatología de Infección Ocular. 3 Oídos. Etiología y Sintomatología
de Otitis Media. 4 Misceláneos. Procedimiento. Interpretación de Resultados e
Informe. Principales Pruebas para la Diferenciación de Tres Especies del Género
Staphylococcus de Origen Humano.
CAPÍTULO 13:
SECRECIONES GENITALES / 147
Propósito. Diagnóstico de Gonorrea. Foto: Neisseria gonorrhoeae, Frote Gram de Pus
Uretral Masculino. Diferenciación de Dos Especies de Neisseria de Importancia
Clínica. Diagnóstico de Chancro Blando (Chancroide). Diagnóstico Directo de la
Sífilis. Foto: Treponema pallidum, Campo Oscuro de Chancro. Agentes Infecciosos
del Tracto Genital Femenino. Introducción. Vaginitis. Cervicitis. Otros Agentes
Etiológicos.
CAPÍTULO 14:
LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO Y FLUIDOS CORPORALES / 163
Propósito. Muestra. Etiología y Sintomatología de Infección Osea y Articulaciones.
Procedimiento. Fig. 11 Marcha Bacteriológica para Líquido Cefalorraquídeo (LCR).
Interpretación de Resultados. Informe.
CAPÍTULO 15:
TEJIDOS Y BIOPSIAS / 171
Propósito. Muestra. Procedimiento. Interpretación de Resultados e Informe.
CAPÍTULO 16:
PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD (ANTIBIOGRAMA) / 177
Propósito. Medio de Cultivo. Procedimiento. Esquema: Jarro Gas-Pak. Fig. 12
Marcha Bacteriológica para Antibiograma. Antibióticos Aprobados (FDA-USA) que
deben Usarse Rutinariamente para Pruebas de Susceptibilidad en Varios Grupos
Bacterianos. 1 Enterobacterias, 2 Pseudomonas aeruginosa y otros Bacilos gramnegativo no de la Familia Enterobacteriaceae, 3 Sthapylococcus spp. Interpretación de
Resultados. Interpretación de los Diámetros de las Zonas de Inhibición (mm) para
Miembros de la Familia Enterobacteriaceae. Interpretación de los Diámetros de las
Zonas de Inhibición (mm) para Staphylococcus spp. Control de Calidad. Límites
Aceptables de los Halos de Inhibición (mm) que Deben Obtenerse con las Cepas
Control. Fuentes Comunes de Error.
CAPÍTULO 17:
ANAEROBIOS / 193
Propósito. Muestra. Toma de Muestra para Cultivo de Anaerobios. Transporte de
las Muestras al Laboratorio. Procedimiento. Interpretación de Resultados.
Características Morfológicas de Algunos Bacilos Anaerobios Gram-negativo de
Importancia Médica. Interpretación del Cultivo. Morfología Microscópica. Fig. 12
Diversas Morfologías Bacterianas. Informe.
CAPÍTULO 18:
MICOBACTERIAS / 203
Propósito. Muestras. 1 Esputo, 2 Lavado Gástrico, 3 Orina, 4 Otro Tipo de Muestras.
Procedimiento. Procedimiento de la Coloración de Ziehl-Neelsen. Fórmulas:
Reactivos para Ziehl-Neelsen. Coloración de Kinyoun. Fórmulas: Reactivos para
Kinyoun. Interpretación e Informe de Baciloscopías. Reporte de Frotes para
Micobacterias. Cultivo para Micobacterias. Digestión y Descontaminación de
Esputos. Método de Digestión y Descontaminación con N-acetil-levo-cisteína
(NALC). Fórmulas. Digestión y Descontaminación de Esputos por el Método
Convencional de Hidróxido de Sodio. Fórmulas. Procedimiento de Digestión/
Descontaminación para Esputos de Pacientes cuyas muestras están constantemente
contaminadas con Pseudomonas sp. o Proteus sp. Procedimiento para Lavados
Gástricos. Procedimiento para Orina. Procedimiento para Hisopo Faríngeo.
Procedimiento para Tejido o Piel. Procedimiento para Otros Fluidos Corporales.
Interpretación del Cultivo. Prueba de Niacina. Grupos de Runyon (Micobacterias
“Atípicas”).
BIBLIOGRAFÍA / 223
ÍNDICE DE FIGURAS
Fig.1 / 34
MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGÍA
Fig.2 / 39
CLASES DE ASAS MICROBIOLÓGICAS Y SU USO
1 Asas para Bacteriología
2 Asas para Micología
Fig.3 / 40
INOCULACIÓN DE MEDIOS SÓLIDOS POR ESTRÍAS
Fig.4 / 45
MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVO
Fig.5 / 46
OBSERVACIÓN Y SEÑALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSAS
Fig.6 / 48
TÉCNICA PARA TOMAR INÓCULO DE COLONIAS INDIVIDUALES
Fig.7 / 67
MARCHA BACTERIOLÓGICA ACORTADA PARA AISLAMIENTO DE Vibrio
cholerae 01
Fig.8 / 84
MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA UROCULTIVO
Fig.9 / 94
MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA CULTIVO DE GARGANTA
FIG.10 / 100
SIEMBRA E INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA DE CAMP
Fig. 11 / 166
MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO (LCR)
Fig.12 / 181
MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA ANTIBIOGRAMA
Fig.13 / 201
DIVERSAS MORFOLOGÍAS BACTERIANAS
Nota:
Al centro del libro, a partir de la página 111 aparecen 32 fotografías a color y
sus explicaciones correspondientes.
Guatemala, agosto de 1996
PRESENTACIÓN
Las enfermedades infecciosas continúan siendo la principal causa de morbimortalidad en Mesoamérica. Entre las variadas infecciones que afectan la salud
pública de nuestros pueblos, las infecciones de origen bacteriano son unas de las
más frecuentes. Por este motivo, cualquier esfuerzo orientado a capacitar personal
de salud en diagnóstico bacteriológico, incide directamente en su mejor tratamiento
y control.
La Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos
de Guatemala, se complace en presentar el siguiente MANUAL PRÁCTICO DE
BACTERIOLOGÍA MÉDICA a la comunidad científica de Guatemala y Centroamérica.
Como su título lo indica, se trata de un libro fácil de leer, comprender y aplicar,
dirigido a profesionales, estudiantes y técnicos que estudian o trabajan directamente
la bacteriología en los laboratorios clínicos privados o estatales.
El autor es catedrático titular desde hace 22 años en el Departamento de
Microbiología, Escuela de Química Biológica de esta Casa de Estudios. Durante estos
años, ha tenido a su cargo la enseñanza de la bacteriología médica a los estudiantes
de Química Biológica. Cuenta con una gran trayectoria profesional dentro y fuera
de la Universidad de San Carlos de Guatemala. Se ha destacado no sólo como
catedrático e investigador a través de sus múltiples publicaciones en revistas
científicas nacionales e internacionales, sino también a lo largo de los años ha
demostrado su empeño por mejorar la microbiología en nuestro medio. Uno de sus
principales logros fue la creación del Laboratorio Microbiológico de Referencia
-LAMIR- en 1991.
La experiencia de Miguel F. Torres en la docencia e investigación en
bacteriología, parasitología y micología, aunados a sus conocimientos y experiencia
adquiridos durante varios años de servicio como microbiólogo clínico del Instituto
Guatemalteco de Seguridad Social y del Hospital Militar, garantizan el contenido
del manual.
Esta obra fue completada por el autor durante su año sabático de la Universidad
de San Carlos. Constituye un valioso libro de texto para los estudiantes de diversas
carreras. Por este motivo, no dudamos en recomendarlo y desearle muchos éxitos.
Atentamente,
Lic. Jorge Rodolfo Pérez Folgar
Decano
Lic. Gerardo Arroyo Catalán
Director de la Escuela
de Química Biológica
Licda. Heidi Logemann Lima
Jefe del Departamento
de Microbiología
AGRADECIMIENTOS
El autor desea patentizar sus agradecimientos a los siguientes destacados
bacteriólogos de Centroamérica y el Caribe, por su valiosa colaboración al haber
revisado el manuscrito de este libro. Los distinguidos colegas efectuaron valiosos
comentarios y sugerencias, los cuales dada su gran experiencia y prestigio,
enriquecen la obra.
Licda. Floridalma Cano Granados
Supervisora del Laboratorio de Bacteriología y Parasitología Intestinal
Laboratorios de Microbiología “Dr. Leonardo J. Mata”
Instituto de Nutrición de Centroamérica y Panamá
Guatemala
Dr. Edmundo E. Poujol
Ex-Director del Departamento de Microbiología
Universidad Nacional Autónoma
Honduras
Dr. Jaime Guevara R.
Jefe de la Sección de Laboratorios
Dirección Técnica de Servicios de Salud
Caja Costarricense de Seguro Social
Costa Rica
Dra. Marion C. de Martin
Vice-decana de la Facultad de Medicina
Universidad Nacional
Panamá
Dr. Gerardo F. Martínez
Jefe del Departamento de Bacteriología / Micología
Sub-Dirección de Microbiología
Instituto de Medicina Tropical “Dr. Pedro Kourí”
Cuba
A los personeros del Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social de
Guatemala que brindaron su apoyo para lograr el financiamiento de 250 copias de
la Segunda Edición del presente Manual. Ellos permitieron hacer llegar nuestro
mensaje académico y guía de trabajo a profesionales, técnicos de laboratorio y
estudiantes. Actualizar y estandarizar la bacteriología médica en nuestros países,
debe ser la meta. Estas labores deben ser dinámicas y constantes.
PRÓLOGO A LA SEGUNDA EDICIÓN
Las tres diferentes formas que presentan las bacterias fueron observadas por
primera vez por Antonio van Leeuwenhoek en Delft, Holanda, en el siglo XVII. Sin
embargo, la bacteriología médica surgió como tal hacia fines del siglo XIX, con los
geniales descubrimientos de Pasteur en Francia y Koch en Alemania. Por primera
vez en la historia, en 1876, Roberto Koch propagó una bacteria patógena en cultivo
puro fuera del cuerpo. Al aislar Bacillus anthracis no sólo estableció ésta bacteria
como causa del ántrax en el ganado vacuno, sino inauguró un método de
investigación de las infecciones, actualmente vigente.
Hoy en día, la bacteriología clínica ha avanzado enormemente y en la última
década del siglo XX es muy extensa y diversa. Por este motivo, se hace necesario
extraer de la literatura actualizada los conocimientos, técnicas y criterios
interpretativos necesarios para efectuar adecuadamente los análisis bacteriológicos
más frecuentes, y ordenarlos de manera simple y comprensible. Estos son los
propósitos fundamentales de la presente publicación.
Este MANUAL PRÁCTICO DE BACTERIOLOGÍA MÉDICA no es un texto
exhaustivo de la materia, ni mucho menos un tratado de taxonomía bacteriana. Es
una guía simplificada de trabajo, orientada hacia la obtención de resultados lo más
rápido posible y con el mayor significado clínico. Al final del libro, se seleccionan
las referencias bibliográficas más relevantes.
Anteriormente se aceptaba que el buen bacteriólogo clínico era aquel capaz
de identificar hasta especie todas las bacterias presentes en determinado cultivo.
Hoy en día este concepto ha cambiado y el buen bacteriólogo clínico es quien
discrimina efectivamente los microorganismos potencialmente patógenos de la
microbiota normal, los identifica total o presuntivamente lo más pronto posible y
emite un informe claro y correcto. Por este motivo, en el presente manual práctico
se hace énfasis en los criterios actualizados de interpretación.
El estudio de la Historia de la Humanidad, permite comprender la realidad
presente y proyectarse mejor hacia el futuro. En el caso de la bacteriología médica,
los inspiradores escritos, sus retratos y el ejemplo de tres pioneros de esta ciencia,
que aparecen al principio del libro, van dedicados al amable lector.
15
Es imperativo hacer mención del gran aporte que el invento del microscopio
representó para las ciencias biológicas. Antonio van Leeuwenhoek durante el siglo
XVII fue el primer humano que observó las bacterias. Este personaje longevo, no
sólo efectuó grandes descubrimientos con sus microscopios de “lente de gota”,
sino también nos legó su ejemplo del valor de la palabra científica escrita. El
microscopio compuesto que usamos hoy en día fue inventado posteriormente por
los hermanos Hans y Zacarías Janssen, en Middleburg, Holanda. Luego fue
perfeccionado por Galileo Galilei y Johannes Kepler.
Durante el siglo XVIII, estos refinados instrumentos fueron curiosa
entretención para científicos y aficionados, incluyendo a las ilustradas damas de
las cortes europeas. No fue sino hasta el siglo XIX, que los grandes titanes de la
bacteriología, Luis Pasteur en Francia y Roberto Koch en Alemania, efectuaron los
descubrimientos básicos que han permitido el desarrollo de la bacteriología médica
moderna. Los logros de estos dos pioneros fueron múltiples, por lo que es muy
difícil sumarizarlos. Conviene recordar que el increíble avance de la bacteriología
en las postrimerías del siglo XX, y el que vivirán nuestros descendientes en el
próximo milenio, se fundamentan en sus descubrimientos y los de sus discípulos.
La Primera Edición de este MANUAL PRÁCTICO DE BACTERIOLOGÍA
MÉDICA, fue patrocinada por la compañía farmacéutica Pfizer, en septiembre de
1996. Esta edición se agotó rápidamente entre profesionales y estudiantes de
laboratorio clínico en Centroamérica. Hasta la fecha, este libro ha sido adoptado
como referencia del trabajo rutinario en bacteriología clínica en múltiples
laboratorios y es libro de texto en varias universidades.
En 1999, el Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social de Guatemala, ha
reconocido la necesidad de patrocinar una Segunda Edición, la cual llegará a todos
los profesionales y técnicos de la Red Nacional de Laboratorios Clínicos, ahora
como norma obligatoria a observar en bacteriología médica. El autor ha plasmado
en el presente libro, treinta años de experiencia en la materia, de manera simplista
y expresando lo mínimo que es necesario efectuar en los laboratorios clínicos de
Mesoamérica.
Miguel F. Torres, Q.B., M.A.
Ciudad de Guatemala, 25 de octubre de 1999
16
El ojo humano es incapaz de visualizar objetos menores de 30 micras. Por este motivo,
antes de la invención del microscopio, el hombre desconoció la vida microscópica y la estructura
celular de los tejidos.
Antonio van Leeuwenhoek fue un comerciante de telas, nacido en 1632 en Delft, Holanda.
Fabricó ingeniosos microscopios con pequeños lentes fundidos en placas de diversos metales.
Con los cientos de microscopios que hizo personalmente a lo largo de su vida, fue el primer ser
humano que observó las bacterias, los protozoos, los glóbulos rojos y los espermatozoides.
Durante 50 años, informó periódicamente sus maravillosos hallazgos en detalladas cartas
dirigidas a la Real Sociedad de Londres. A partir de preparaciones de material interdental,
dibujó y reportó por primera vez los tres tipos de formas bacterianas.
17
Carta a sus hermanas:
“La voluntad es algo grande, pues la acción y el trabajo
generalmente siguen a la voluntad y casi siempre el trabajo se
acompaña del éxito.
Estas tres cosas, trabajo, voluntad y éxito, llenan la existencia
humana.
La voluntad abre la puerta al éxito, ambos brillantes y felices, el
trabajo pasa estas puertas y al final del viaje el éxito corona nuestros
esfuerzos”.
LOUIS PASTEUR, 1841 (Besançon, Francia)
18
Roberto Koch fue un médico rural alemán, nacido en 1843. Sus aportes a la
bacteriología médica fueron enormes. Primero cultivó la bacteria causante del ántrax en
humor vítreo de buey. Luego desarrolló gradualmente técnicas bacteriológicas fundamentales,
como el uso del agar extraído de algas marinas para solidificar los medios de cultivo y
así poder observar colonias.
Con su discípulo Paul Ehrlich, aplicó los colorantes derivados de la anilina a la
coloración de microorganismos. Descubrió las bacterias causantes de el cólera, la tuberculosis (bacilo de Koch) y el protozoo causante de la enfermedad del sueño.
19
CAPÍTULO 1
BREVE INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA
La microbiología es la ciencia que estudia a los seres vivos microscópicos, es
decir que sólo pueden observarse con ayuda del microscopio. Los pequeños organismos microscópicos son llamados vulgarmente “microbios”, pero la palabra correcta para designarlos es microorganismos. La microbiología se aplica no sólo a la
ciencia médica, sino también a la veterinaria, a la agronomía y a la industria, por lo
que forma parte del plan de estudios de varias carreras universitarias.
Existen muchas clases de microorganismos, los cuales se clasifican según su
estructura, manera de reproducirse y muchas otras características. Los grupos más
importantes de microorganismos son: los virus, las bacterias, los protozoos y los
hongos. Los virus son los microorganismos más pequeños, se reproducen únicamente dentro de las células y tienen forma similar a cristales. La palabra
microorganismo abarca grupos de seres vivos muy diferentes entre sí.
La microbiología se sub-divide en varias disciplinas que estudian cada grupo
taxonómico de microorganismos. Algunos no son propiamente microorganismos,
pero su estudio se basa en estructuras microscópicas.
Microbiología
Bacteriología (bacterias)
Micología (hongos)
Virología (virus)
Parasitología
Protozoología (protozoos)
Helmintología (helmintos)
Entomología (insectos, ácaros, otros)
La mayoría de los microorganismos no son capaces de causar enfermedades
en el hombre y se les llama por esta razón “saprófitos” o “saprobios”. Sin embargo,
algunos causan enfermedades en el hombre, llamadas infecciones. Cuando un
microorganismo es capaz de producir infección, se dice que es “patógeno”; la
“virulencia” es la cuantificación de la patogenicidad.
La inmunología nació ligada a la microbiología como el estudio de los mecanismos de defensa contra los microorganismos. Ahora su campo de acción se ha
extendido mucho y es una ciencia biológica independiente.
21
En todos los ambientes que rodean al hombre existen microorganismos. Las
bacterias y los hongos son los más abundantes; prácticamente todos los objetos que
vemos y tocamos están cubiertos de ellos. El cuerpo humano, especialmente donde hay membranas mucosas (intestino, vagina, boca, etc.), está cubierto de
bacterias. De los microorganismos que viven constantemente en el hombre, se dice
que forman parte de alguna “microbiota”. Por microbiota se entiende aquel conjunto de diversos microorganismos que normalmente convive con el hombre sin
causarle ningún daño. La palabra “flora” no es correcta, y por lo tanto no debe
utilizarse. Se dice que los microorganismos de las microbiotas “colonizan”, no
infectan, aunque eventualmente pueden hacerlo y en este caso se les llama
“oportunistas”.
EL NOMBRE CORRECTO DE LOS MICROORGANISMOS:
Todos los nombres científicos de los seres vivos, de acuerdo con el sistema
binario de Linneo, se componen de dos palabras: la primera que indica un gran
grupo, es el género y siempre se escribe la primera letra con mayúscula. El segundo
nombre es la especie y siempre se escribe con letras minúsculas. Casi todos los
nombres científicos de los microorganismos se derivan del griego o del latín, por
esta razón:
a)
b)
Siempre se subrayan discontinuamente o se escriben con letra cursiva
Nunca se tildan
Ejemplos:
Staphylococcus aureus (bacteria)
Escherichia coli (bacteria)
Streptococcus pyogenes (bacteria)
Pseudomonas aeruginosa (bacteria)
Entamoeba histolytica (parásito, protozoo)
Giardia lamblia (parásito, protozoo)
Ascaris lumbricoides (parásito, helminto)
Trichophyton rubrum (hongo)
Microsporum canis (hongo)
Además del nombre científico, en algunos casos existe un nombre de uso común o vulgar. El uso de este tipo de nombres debe evitarse.
Los nombres vulgares más conocidos son los siguientes:
22
Nombre correcto:
Nombre vulgar:
Escherichia coli
Streptococcus pneumoniae
Neisseria gonorrhoeae
Enterobius vermicularis
Trichuris trichiura
Entamoeba histolytica
Entamoeba coli
Hymenolepis nana
Candida albicans
colibacilo (bacteria)
neumococo (bacteria)
gonococo (bacteria)
oxiuro (parásito, helminto)
tricocéfalo (parásito, helminto)
ameba histolítica (parásito, protozoo)
ameba coli (parásito, protozoo)
tenia nana (parásito, helminto)
monilia (hongo)
Si se desea hacer referencia a todas las especies de un género se usa la abreviatura para especies: “spp.” y no se subraya. Si sólo se refiere a una especie no
determinada de un género dado, se usa: “sp.” abreviatura de especie.
Ejemplos:
Streptococcus spp. = todos los estreptococos que existen.
Shigella sp. = una especie no determinada del género Shigella.
Tomado de:
RECOMENDACIONES DE BIOSEGURIDAD PARA EL
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
Dr. Miguel F. Torres y Dra. Margarita Paz de Ramírez
Laboratorio Microbiológico de Referencia (LAMIR) y Depto. de Citohistología.
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, Universidad de San Carlos.
23
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
Lavarse las manos frecuentemente
Usar gabacha
Usar guantes de caucho en buen estado cuando es necesario
Usar mascarilla cuando es necesario
Rotular adecuadamente todo el material y los reactivos
No comer en el área de trabajo
No almacenar comida en el área de trabajo
No fumar
Usar adecuadamente los desinfectantes
Usar detergentes y desinfectantes adecuados para cada tipo de material
Clasificar los desechos
Descontaminar el material biológico antes de descartarlo
Esterilizar o incinerar el material contaminado
Destruir el material descartable o no reusable
No utilizar materiales inflamables cerca del mechero
Conocer el uso y manejo de los extinguidores
Neutralizar los desechos químicos
Descontaminar el material radioactivo antes de su descarte
Equipo necesario:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Campana bacteriológica
Campana de flujo laminar cuando es necesario
Lámpara de pie
Mechero o incinerador
Incubadora bacteriológica
Autoclave
Horno esterilizador
Agitador de tubos
Centrífuga
24
Equipo de seguridad necesario en un laboratorio de investigación:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Extinguidores en lugares accesibles
Basureros cerrados
Lava-ojos
Extractor de vapores
Incinerador
Recipientes con desinfectantes y descontaminantes
Campana de flujo laminar y/o de bioseguridad
Equipo adecuado para descarte de material contaminado y de solventes
Recipientes plomados
MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN O DESINFECCIÓN
Método
ESTERILIZACIÓN:
Calor
Húmedo (autoclave)
Seco (horno)
Concentración o nivel
Gas
Oxido de etileno
Líquido Glutaraldehido
Peróxido de hidrógeno
Formaldehido
Dióxido de cloro
121° C a diferentes intervalos de tiempo
171° C por 1 hora; 160° C por 2 horas;
121° C por 16 horas
450-500 mg/litro a 55-60° C
variable
6-30%
6-8%
variable
DESINFECCIÓN
Calor
Húmedo
(incluye pasteurización)
Líquido glutaraldehido
peróxido de hidrógeno
formaldehido
compuestos clorinados
alcoholes (etanol, isopropílico)
compuestos fenólicos
compuestos yodados
75-100° C
variable
3-6%
1-8%
500-5,000 mg de cloro libre/litro
70%
0.5-3%
0.1-0.2%
ANTISEPSIA
alcoholes
yodóforos
hexaclorofeno
70%
1-2 mg de yodo libre/litro
1-3%
25
Actividad
alta
alta-media
alta-media
alta-media
intermedia
intermedia
media-baja
media-baja
DESINFECCIÓN:
Proceso generalmente menos letal que la esterilización.
Elimina virtualmente todos los microorganismos patógenos pero no necesariamente todas las formas microbianas (esporas).
El procedimiento de desinfección carece del margen de seguridad que
se logra por los procedimientos de esterilización.
Factores:
1.
2.
3.
4.
Naturaleza y número de microorganismos contaminantes.
El tipo y configuración del material a desinfectar.
Tipo y concentración del germicida químico usado.
Tiempo y temperatura de exposición.
DESCONTAMINACIÓN:
Es un término usado para describir un proceso o tratamiento aplicado a
una superficie ambiental o a un instrumento de trabajo. Este término abarca
desde lavado con agua y jabón hasta la desinfección o esterilización.
ANTISEPSIA:
Un antiséptico es definido como un germicida usado sobre piel o tejido
vivo con el propósito de inhibir o destruir microorganismos.
USO EFECTIVO DE ANTISÉPTICOS, DESINFECTANTES Y
PROCEDIMIENTOS DE ESTERILIZACIÓN
Factores para la elección de desinfectantes y procedimientos de
esterilización.
1.
2.
3.
Grado de muerte microbiana requerida.
Naturaleza del material o la superficie a ser tratada.
Costo y disponibilidad de los agentes germicidas.
26
ESTERILIZACIÓN:
Uso de procedimiento físico o químico para destruir toda la vida
microbiana, incluyendo grandes cantidades de endosporas bacterianas
altamente resistentes.
Tipos de esterilización:
Calor húmedo: autoclave de vapor
Calor seco: horno esterilizador
Gas de óxido de etileno
Esterilizantes químicos: germicidas basados en glutaraldehido.
RESISTENCIA
RESISTENCIADE
DEMICROORGANISMOS
MICROORGANISMOSAAGERMICIDAS
GERMICIDASQUÍMICOS
QUIMICOS(*)
(*)
ESPORAS BACTERIANAS
Bacillus subtilis
Clostridium sporogenes
MICOBACTERIAS
Mycobacterium tuberculosis var. bovis
VIRUS PEQUEÑOS O NO LIPÍDICOS
Poliovirus - Coxsackievirus - Rhinovirus
HONGOS
Trichophyton sp.-Cryptococcus sp.-Candida sp.
BACTERIAS VEGETATIVAS
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
Salmonella choleraesuis
VIRUS DE MEDIANO TAMAÑO O LIPÍDICOS
Herpes simplex - Cytomegalovirus
Virus sincitial respiratorio
Virus de Hepatitis B
Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)
(*) En orden descendente de resistencia
27
CAPÍTULO 2
INTRODUCCIÓN A LA BACTERIOLOGÍA
Las bacterias son microorganismos formados por una sola célula muy simple, que en condiciones ideales realiza funciones de alimentación y reproducción.
Son uno de los grupos microbianos más frecuentes y abundantes en casi todos los
ambientes.
La reproducción de las bacterias ocurre por simple partición de una célula en
dos células hijas, y ocurre en un tiempo muy corto en comparación con la reproducción de otros seres vivientes. Algunas tienen la capacidad de producir esporas
que son estructuras de resistencia. Las bacterias pueden ser móviles o inmóviles.
Cuando tienen movimiento, lo hacen por medio de flagelos o filamentos largos
que agitan en forma de látigo.
Para que las bacterias puedan reproducirse in vitro, es decir en las condiciones de laboratorio, debe proporcionárseles todas las sustancias nutritivas que requieren (proteínas, azúcares, vitaminas, etc.). Estos nutrientes se encuentran en los
medios de cultivo. El pH es muy importante y debe mantenerse estable y regulado
según cada medio de cultivo.
Las bacterias se clasifican en base a diversas características. Según sus requerimientos de oxígeno, las bacterias pueden ser:
a.
Aerobias: Crecen bien en la atmósfera que respiramos, es decir en presencia de oxígeno, el cual requieren para su sobrevivencia.
b.
Microaerofílicas: Crecen mejor en presencia de pocas cantidades de oxígeno. Para disminuir la concentración de oxígeno en el microambiente
en el cual se incuban cultivos de bacterias, se recomienda introducirlos
en jarros de vidrio con una candela encendida, lo que enriquece con un
5 al 10 % de anhídrido carbónico (CO2).
c.
Anaerobias: Son incapaces de crecer en presencia de oxígeno, el cual les
es sumamente tóxico e impide su crecimiento.
29
d.
Facultativas: Son capaces de crecern en ausencia de oxígeno y tienen la
facultad de también crecer en aerobiosis.
Según la temperatura óptima de crecimiento, las bacterias pueden ser:
a.
Mesófilas: Crecen a temperaturas intermedias, semejantes a la temperatura del cuerpo humano o a la temperatura del ambiente. En este
grupo se incluyen todas las bacterias patógenas, por esta razón la temperatura a la cual deben mantenerse constantemente las incubadoras
bacteriológicas es de 36 grados centígrados.
b.
Termófilas: Crecen a altas temperaturas (calor).
c.
Criófilas: Crecen a bajas temperaturas (frío).
d.
Psicrotróficas: Crecen a temperaturas de refrigeración.
Según su forma, las bacterias se clasifican en tres grupos:
a.
Cocos: Son bacterias de forma esférica o redondeada. Ejemplo, Foto A
página siguiente: Microfotografía de Staphylococcus aureus en división.
b.
Bacilos: Son bacterias alargadas, de forma similar a una salchicha o
bastoncillo. Ejemplo, Foto B página siguiente: bacilos en división.
c.
Espiroquetas: Son bacterias alargadas y retorcidas en forma de resorte o
espiral. Ejemplo, Foto C página siguiente: Microfotografía de bacterias
de la microbiota oral; Treponema sp. (espiroquetas), bacilos y cocos.
Dependiendo de su forma de agrupación los cocos pueden clasificarse así:
a.
Diplococos: Agrupación de bacterias esféricas en grupos de dos, o
parejas (ejemplos: Streptococcus pneumoniae y Neisseria gonorrhoeae).
b.
En cadenas. Ejemplo: estreptococos (Streptococcus spp.)
c.
En racimos. Ejemplo: estafilococos (Staphylococcus spp.)
Este tipo de clasificación no se aplica a los bacilos ni a las espiroquetas.
30
A
B
C
31
CÓMO ORGANIZAR EL ÁREA DE TRABAJO DE BACTERIOLOGÍA
Para poder trabajar bacteriología médica, se requiere del siguiente material y
equipo básico, según se ilustra en la figura 1 (pág. 34).
1. Una superficie lisa del alto de un escritorio de oficina (76 a 78 cm de alto),
material liso, blanco o negro mate, lavable, tipo fórmica. El lugar de trabajo debe
estar lejos de ventanas que permitan corrientes de aire, lavatrastos o basureros.
Contar con una silla cómoda, giratoria, con respaldo, y ajustable al alto adecuado.
2. Un mechero quemador de gas propano tipo Meker, Bunsen o “Touch-OMatic”. Ajustar la entrada de aire a manera de obtener una llama azul y translúcida
(no amarilla). Debe tenerse presente que solamente es estéril el aire que está un pie
(30 cm) alrededor del mechero encendido, por lo que se debe trabajar lo más cerca
posible. Situarlo al frente ligeramente hacia la derecha. También puede usarse
incinerador.
3. Una campana bacteriológica de madera o fibra de vidrio para aislar el área
de trabajo, la cual debe desinfectarse diariamente antes de iniciar el trabajo. Frotarla por dentro con formol al 10 por ciento, fenol al 1 por ciento, o por lo menos con
alcohol al 70 por ciento. La campana no es indispensable; puede trabajarse sin ella,
si se hace con cuidado, es decir sobre una superficie desinfectada y cerca del mechero.
4. Un autoclave para esterilizar con calor húmedo a presión, material y medios de cultivo, “matar” material contaminado y cultivos (esterilizar previo descarte o limpieza). Puede ser pequeño, tipo olla de presión. Calibrarlo a manera de
autoclavear siempre por 15-20 minutos a 121o C y 15 libras de presión por pulgada cuadrada.
5. Un soporte de asas, que puede ser de madera forrada con fórmica, con las
siguientes asas de “nichrome” (aleación de níquel y cromo), según se ilustra en la
figura 2 (pág. 39): dos en anillo (no calibrada), dos en aguja, y una asa calibrada de
platino puro en anillo pequeño para tomar 0.001 ml (para inocular urocultivos).
Para trabajar Micología (hongos) debe contarse también con asa espatulada, asa en
“L” y dos agujas de disección. Las asas bacteriológicas deben ponerse rectas y limpiarse diariamente. Esto se hace fácilmente haciéndolas rodar en el suelo deslizando el zapato a manera que rueden y luego hacer el anillo con el cabo de otra asa.
Debe trabajarse siempre con dos asas en anillo, cuando una se forma, se usa la que
ya está fría.
32
6. Una lámpara de mesa de pie corto (tipo escritorio) o de “cuello de ganso”;
colocarla al frente, ligeramente hacia la izquierda, de manera que ilumine fuertemente el área sobre la mesa, pero que la luz no dé directamente a los ojos.
7. Microscopio óptico binocular de buena calidad, con condensador de campo oscuro.
8. Lupa o de preferencia microscopio estereoscópico para observar bien
las colonias.
9. Incubadora bacteriológica que debe mantenerse constantemente a 36o C
exactos (no a 37o C ó a 35o C). Debe mantenerse siempre cerrada y pegarle una hoja
de control diario de temperatura.
10. Balanza para pesar medios de cultivo.
11. Hornilla eléctrica de dos discos y temperatura graduable.
12. Refrigerador con congelador.
13. Frascos grandes de boca ancha, de los que se usan para dulces en las tiendas, con tapadera metálica de rosca que cierre bien. Tener suficientes veladoras
(velas gruesas) de parafina. Alternativamente usar jarra Gas-Pak con sobres
microaerofílicos.
14. Jarro Gas-Pak (BBL) o similar, sobres generadores de anaerobiosis,
catalizadores e indicadores para incubar cultivos anaerobios.
15. Agitador de tubos tipo “vortex”.
16. Colorantes, soluciones y medios de cultivo según se describe en cada
capítulo.
17. Gradillas para colocar tubos con medios de cultivo o muestras.
33
Fig. 1 MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGÍA
34
LA COLORACIÓN DE GRAM
Las bacterias son microorganismos incoloros, por
este motivo deben teñirse para poder observarlos con ayuda del microscopio. Por esta razón, a continuación se describe la técnica más importante que debe usarse para diferenciar bacterias: la coloración de Gram. Se recomienda
usar la modificación de Hucker según Bartholomew, de
acuerdo con la bibliografía que aparece al final de este
manual.
a)
Preparación de frotes:
Hans Gram
La coloración de Gram puede aplicarse a frotes extendidos sobre portaobjetos
de vidrio (también llamados frotis) de todo tipo de muestras clínicas, o a frotes de
suspensiones de cultivos. Frotar la muestra suavemente y sin revolver mucho sobre la superficie de un portaobjetos limpio y seco. Esperar que seque sobre una
superficie lisa o flamear muy levemente. Rotular adecuadamente con crayón graso
por detrás de la lámina. Una vez que el frote ya está seco, fijar pasando levemente
por la llama del mechero dos veces, sin que se caliente excesivamente (que no queme al ponerlo sobre la piel del dorso de la mano). Dejar que el frote se enfríe antes
de colorearlo, pues si se colorea caliente precipitan los colorantes.
Si la muestra que se va a colorear contiene mucha sangre, el frote debe
hemolizarse con agua. Proceder así: dejarlo secar y fijar con calor, cubrir completamente con agua del chorro un minuto, y luego proceder a colorearlo con Gram.
Este tratamiento permite destruir los eritrocitos y poder observar las bacterias.
b)
Técnica de la coloración de Gram:
1. Cubrir el frote ya fijado y frío con cristal violeta, dejar el colorante por un
minuto (ver preparación de colorantes adelante). Enjuagar en un chorro suave de
agua corriente. Escurrir muy bien.
2. Cubrir con lugol de Gram y dejar por un minuto. Enjuagar de nuevo suavemente con agua corriente, escurrir bien.
3. Aplicar gota a gota el decolorante alcohol-acetona por 4 ó 5 segundos,
hasta que ya no salga más cristal violeta. Este paso es crucial y debe ser muy breve
en frotes delgados y más prolongado en frotes gruesos.
35
4. Cubrir el frote con safranina sólo por 30 segundos. Enjuagar suavemente
con agua, escurrir y dejar secar. El frote puede secarse dentro de la incubadora a
36° C, o flamear muy levemente, si es urgente. Otra alternativa es secarlo con aire
obtenido de una pera de hule o un secador para manos.
5. Examinar en el microscopio con el lente de inmersión, con aceite especial
de viscosidad adecuada.
c)
Resultados:
Bacterias gram-positivo: morado-azul obscuro.
Bacterias gram-negativo: rojo.
La diferencia de coloraciones se debe al grosor de la pared celular, que es más
“delgada” en las bacterias gram-negativo. Esta coloración sólo es válida para cocos
y casi todos los bacilos (excepto micobacterias), no es válida para espiroquetas. Si
el frote es de material clínico, es decir de muestras de pacientes, debe quedar rojo a
simple vista después de colorearlo. Si hay leucocitos presentes en la muestra éstos
deben ser rojos (gram-negativo) y si hay levaduras deben verse azul-morado (gramnegativo), lo que sirve para evaluar si el frote se decoloró adecuadamente.
d)
Informe:
El reporte correcto de una bacterioscopía (observación de bacterias) con Gram
debe contener los siguientes elementos y en este orden:
1. Identificación del paciente (apellidos, nombres, número de registro o
afiliación, servicio y fecha).
2. Título que indique el tipo de muestra examinada y el sitio anatómico de
donde proviene. Por ejemplo: Secreción de úlcera en miembro inferior derecho.
Coloración de Gram:
3. Mencionar primero las bacterias observadas. Empezar por la clase más
freuente en la muestra, indicar agrupación y cantidad (muy escaso, escaso, regular
cantidad, abundante o muy abundante ó +, ++, +++, ++++). Por ejemplo: cocos
gram-positivo en cadenas cortas: abundantes; bacilos gram-negativo: regular cantidad, diplococos gram-negativo: muy escasos. Usar siempre positivo y negativo
36
en singular con respecto al Gram, nunca gram-positivos o gram-negativos en
plural.
4. Luego es muy importante para el médico saber si hay glóbulos blancos en
la muestra, su clase y cantidad. Por ejemplo: Leucocitos polimorfonucleares: abundantes. Este dato indica que hay verdadera infección y que la muestra era purulenta.
Si se observan bacterias dentro del citoplasma de los leucocitos, mencionar
“intracelular” en el reporte, lo que es de especial interés clínico en los frotes de
secreciones uretrales masculinas. La presencia de linfocitos indica infección crónica o viral (no purulenta).
5. Indicar siempre la presencia y cantidad de levaduras o micelio de hongos
(gram-positivo); de células epiteliales, de especial interés en frotes de esputo (se
miran gram-negativo aplanadas con citoplasma grande, transparente y núcleo
pequeño redondo u ovalado). Aunque no es crucial, indicar la presencia de fibrina,
que se mira en forma de hebras gram-negativo alargadas e irregulares.
6. Cuando es necesario, con experiencia y cautela podrán incluirse al final
comentarios sobre la calidad de la muestra, indicar que la morfología observada es
compatible con una especie de bacterias o recomendaciones de tratamiento (con
mucha prudencia).
Reactivos para la coloración de Gram:
(Modificación de Hucker según Bartholomew)
1.
CRISTAL VIOLETA:
Solución “A”:
Cristal violeta (certificado) ............................................... 2 gramos
Alcohol etílico al 95 % ....................................................... 20 ml
Solución “B”:
Oxalato de amonio ............................................................ 0.8 gramos
Agua destilada ................................................................... 80 ml
Mezclar ambas soluciones, para preparar 100 ml. Guardar (en oscuridad) 24
horas antes de usarse y filtrar con papel filtro directamente al frasco de coloración.
2.
LUGOL DE GRAM:
Cristales de yodo ............................................................... 1 gramo
Yoduro de potasio .............................................................. 2 gramos
37
Moler en un mortero el yodo y el yoduro. Agregar el agua destilada (en
probeta) poco a poco. Continuar moliendo para disolver completamente; agregar
el agua a manera de ir lavando el mortero, hacia una botella de vidrio oscuro
(ámbar). Sólo dura una semana.
3.
ALCOHOL-ACETONA (Decolorante):
Mezclar volúmenes iguales de acetona pura (para análisis) y alcohol etílico
al 95 %.
4.
SAFRANINA:
Solución stock (concentrada):
Safranina-0 (certificada) .................................................... 2.5 gramos
Alcohol etílico al 95 %. ...................................................... 100 ml
Solución de trabajo:
Diluir 1:10 la solución stock (concentrada), así:
Solución stock .................................................................... 10 ml
Solución anticorrosiva para desinfectar bisturíes:
Formaldehido (Formol) .................................................... 8 %
Alcohol etílico .................................................................... 60-70 %
Nitrito de sodio .................................................................. 0.2 %
Para preparar un litro:
En un balón aforado de 1,000 ml (1 litro), colocar 2 gramos de nitrito de sodio,
luego agregar 700 ml de etanol absoluto y 200 ml de formaldehido al 40 %. Luego
aforar con 100 ml de agua destilada.
Los bisturíes con sus mangos deben mantenerse constantemente sumergidos
en esta solución, dentro de un recipiente de acero inoxidable con tapadera.
38
Fig . 2 CLASES DE ASAS MICROBIOLÓGICAS Y SU USO
ASAS PARA BACTERIOLOGÍA:
1.
Asa en argolla o anillo, no calibrada. Generalmente de almbre de
nichrome. Sirve para siembra por estrías e inoculaciones en general.
2.
Asa recta o en hilo. Sirve para trasladar una sola colonia a medios de
identificación, o subcultivo.
3.
Asa de platino en anillo. Calibrada para tomar 0.001 ml, para
urocultivo.
ASAS PARA MICOLOGÍA Y MICOBACTERIAS:
4.
Asa espatulada, para manipular colonias duras y tomar muestras.
5.
Asa de almbre grueso en "L", para purificar colonias de hongos y
procedimientos especiales.
6.
Aguja de disección con punta aguda, para purificar colonias pequeñas
y distribuir las preparaciones de hongos en fresco.
39
Fig . 3 INOCULACIÓN DE MEDIOS
SÓLIDOS POR ESTRÍAS
1. Con asa o hisopo estéril,
estriar inóculo original de
aproximadamente 0.5 cm,
en el borde de la caja de Petri.
2. Flamear primera vez al
terminar el inóculo original.
3. Segunda estría cruzada,
debe tocar ligeramente
el inóculo original.
4. Flamear segunda vez, al
terminar la segunda estría.
5. Tercera estría. Debe tocar
ligeramente la segunda estría,
y cubrir toda la superficie libre
del medio sin tocar al final el
inóculo original.
40
CAPÍTULO 3
COPROCULTIVO
PROPÓSITO:
Demostrar por medio de cultivo, la presencia de bacterias enteropatógenas,
es decir que infectan el intestino penetrando o no su mucosa. Esto causa diarrea,
dolor abdominal, fiebre y a veces la muerte.
Las principales especies enteropatógenas que se buscan en el coprocultivo,
en orden de importancia en Guatemala son:
-
Shigella flexneri
Salmonella typhi
Shigella sonnei
Salmonella enteritidis
Shigella dysenteriae tipo 1
-
Shigella boydii
Arizona hinshawii
Edwardsiella tarda
Yersinia enterocolitica
(Shigella grupo B)
(agente de fiebre tifoidea)
(Shigella grupo D)
(Shigella A-1 o “Bacilo de Shiga”,
causa severa disentería epidémica)
(Shigella grupo C, rara en Guatemala)
(rara)
(muy rara)
(muy rara)
Las bacterias de la familia Enterobacteriaceae, normalmente habitan en el intestino humano, por lo que se conocen comúnmente como “enterobacterias”. Forman aproximadamente el uno por ciento de la microbiota fecal, el resto son bacterias anaerobias. Por esta razón es muy importante que el laboratorio esté en capacidad de aislar, diferenciar e identificar correctamente los enteropatógenos de la lista
anterior.
MUESTRA:
Para efectuar un coprocultivo pueden inocularse las siguientes muestras:
-
heces frescas (la mejor muestra)
hisopo rectal (cuando no se obtienen heces)
41
-
material obtenido por proctoscopía
biopsia de mucosa intestinal
Las muestras deben tomarse antes de iniciar tratamiento con antibióticos. Las
heces deberán procesarse lo más pronto posible, de preferencia antes de 2-3 horas
de ser emitidas; no es necesario que el paciente esté en ayunas. El hisopo rectal es
una buena toma de muestra (en caso de no ser posible obtener muestra de heces
reciente) porque arranca las bacterias que se encuentran dentro de la mucosa.
En los adultos, introducir con cuidado en el ano un hisopo estéril 4 centímetros,
dar 3 vueltas a la derecha y 3 vueltas a la izquierda. En los niños, introducir el
hisopo 2.5 centímetros y dar la misma cantidad de vueltas. En el adulto es más fácil
tomar el hisopo rectal, con el paciente acostado de lado y él mismo separándose los
glúteos. Los niños deben acostarse boca arriba y con la mano izquierda tomar
ambos pies, presionar a manera de flexionar las rodillas hacia abajo y luego
introducir el hisopo.
Cuando las heces, que se encuentran a 37° C dentro del intestino, son colectadas y permanecen a temperatura ambiente (aproximadamente a 20° C), el pH baja
considerablemente (acidez) y hace que las bacterias especialmente Shigella spp. pierdan su viabilidad (capacidad de reproducirse en cultivo). Por esta razón si la muestra de heces no se procesa con la velocidad ya indicada, debe colocarse en un medio de transporte bufferado que evite los cambios bruscos de pH. Para este propósito colocar con hisopo estéril una porción anormal de las heces (con moco, sangre
o pus) aproximadamente del tamaño del hisopo bien cargado en tubos o viales con
3 ml del siguiente medio de transporte: glicerol-salino bufferado, (especialmente
para Shigella), o caldo Hajna GN (Gram-negativo). Probablemente el mejor medio
de transporte para enterobacterias sea Carry-Blair. El caldo GN es de
enriquecimiento, por lo que debe incubarse a 36°C por aproximadamente 18 horas
antes de sembrarse, pero puede usarse como transporte alternativo en ausencia de
glicerol-salino bufferado.
Glicerol salino bufferado
Para transporte de coprocultivos
Cloruro de sodio ...................................................................... 4.2 gramos
Fosfato dipotásico (anhidro) ..................................................3.1 gramos
Fosfato monopotásico (anhidro) ...........................................1.0 gramos
Rojo fenol .................................................................................. 0.003 gramos
Agua destilada .........................................................................700 ml
Glicerina ...................................................................................300 ml
42
El pH final debe ser 7.2. Medir 3 ml en viales o tubos con tapón de rosca y
luego autoclavear a 121°C por 10 a 15 minutos. Descartar si el medio se acidifica
y vira a color amarillo.
Otros caldos de enriquecimiento como Selenito-F o Tetrationato con yodo no
deben usarse excepto en encuestas especiales para buscar Salmonella spp., ya que
su uso retrasa 24 horas el resultado del coprocultivo, lo que disminuye considerablemente su utilidad clínica.
La coloración de Gram de heces nunca debe practicarse por carecer de significado clínico, excepto en los siguientes casos: colitis pseudomembranosa causada
por Staphylococcus aureus donde predominan en el frote cocos gram-positivo, o en
caso de candidosis intestinal, donde predominan en el Gram las levaduras
(gram-positivo).
PROCEDIMIENTO:
Debe conocerse la edad del paciente, anotar si es niño menor de 6 meses.
Para efectuar el coprocultivo deben usarse medios que sean selectivos (contienen inhibidores, por lo que sólo permiten el crecimiento de bacilos gram-negativo)
y diferenciales (contienen lactosa e indicadores de pH que viran cuando se produce ácido, lo que hace cambiar el color de las colonias y así las diferencia).
Algunos de estos medios contienen sales de hierro que precipitan en forma
de sulfuro ferroso de color negro intenso si las bacterias producen ácido sulfhídrico.
El coprocultivo debe efectuarse en dos medios selectivos/diferenciales diferentes,
de preferencia uno más inhibidor que otro. Se recomienda usar rutinariamente agar
MacConkey y agar XLD o agar SS (Salmonella y Shigella).
En caso de heces con moco y sangre (disentería) debe incluirse adicionalmente
el medio de Hektoen, lo mismo que para material obtenido por biopsia intestinal y
proctoscopía.
El color original y los virajes producidos por el crecimiento bacteriano, en
estos tres medios que contienen el azúcar lactosa (como agente diferencial) es el
siguiente:
43
MEDIO
COLOR
ANTES DE
INOCULAR
COLONIAS
LACTOSAPOSITIVO
COLONIAS
LACTOSANEGATIVO
COLONIAS
CON ÁCIDO
SULFHÍDRICO
MacConkey
rosado
rojo (rosado)
incoloras
no cambian
SS
rosado
ligeramente
amarillento
rojo
incoloras
negro
Hektoen
verde claro
anaranjadosalmón
verde
azuladas
negro
XLD
rojo
amarillas
rojas
negro
Efectúe el coprocultivo así:
1-
Inocular una porción anormal de heces (con moco, sangre o pus) o de muestra similar, directamente en una caja de MacConkey y una caja de SS. El inóculo
se coloca con asa en anillo (flameada y fría) o con hisopo en las cajas de ambos
medios. Inocular sólo 1/2 cm en un extremo en el MacConkey y 1 cm en el SS.
El Hektoen se inocula igual que el MacConkey.
2-
Diseminar el inóculo utilizando dos asas en anillo. Flamear una de las asas
mientras la otra se enfría (ver figura 3, pág. 40).
3-
Ya diseminadas de esta manera las muestras en la superficie de las cajas,
incubar a 36°C por 18 a 24 horas, en la incubadora, con esa temperatura controlada diariamente (ver figura 4, pág. 45).
44
Fig. 4 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVO
Muestras:
Heces frescas Hisopo rectal Sedimento de
enema salino
INOCULAR
Rutina
MacConkey
Material de
proctoscopía,
biospia intestinal
XLD ó SS
Medios:
Diseminar por estrías, incubar a 36o C
Seleccionar colonias según el caso,
trasladar a TSI/LIA/urea
45
Opcional
Hektoen
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
1-
Después de incubadas, observar cuidadosamente las dos o tres cajas de cada
paciente simultáneamente. Debe contarse con una luz de lámpara que ilumine las cajas por detrás y observarlas utilizando una lupa corriente. Marcar
por detrás con un círculo de crayón graso cada tipo diferente de colonias sospechosas así: Primero escoger en el MacConkey una colonia por cada tipo de
colonias lactosa-negativo (incoloras), empezando por las colonias más pequeñas (más o menos 1 mm de diámetro). Si el paciente es un niño menor de un
año, se marcará adicionalmente en el MacConkey una colonia típica de
Escherichia coli (roja, brillante y de bordes lisos pero no mucosa), de la parte
de la caja donde las colonias están más separadas y ponerle con crayón graso
por detrás “C” al lado. Examinar el SS de la misma forma. En este medio el
crecimiento será más escaso pues es más inhibidor. Marcar por detrás una
colonia por cada tipo de colonias lactosa-negativo (incoloras) empezando por
las más pequeñas, e incluyendo una colonia con centro negro (ácido
sulfhídrico) si las hay. Si se inoculó Hektoen, marcar una colonia pequeña
verde azulado (lactosa-negativo).
CR
AY
Ó
N
GR
AS
O
Fig. 5 OBSERVACIÓN Y SEÑALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSAS
Marcar colonias
sospechosas por
detrás de la caja de Petri
46
2-
El laboratorio debe contar con un microscopio estereoscópico para hacer los
sub-cultivos con asa en aguja o recta así:
Colocar las cajas con las colonias previamente marcadas bajo el microscopio
estereoscópico y enfocar. Usar un par de asas en hilo bien rectas, flameadas y
frías, acostúmbrese a usarlas según se indica a continuación: apoyándose en
el borde del microscopio con los dedos meñique y anular de la mano derecha
(izquierda si es zurdo), tome el asa recta a manera de lápiz y bájela lentamente hasta que aparezca en el campo del microscopio y sólo toque la superficie
de la colonia seleccionada, con cuidado de no pincharla o pasar tocando otras
colonias cercanas. Con cuidado de no contaminar la punta del asa que ya
tocó la colonia sospechosa, destape un tubo (13X100) de TSI (medio rojo)
con el dedo meñique de la mano derecha, flamee bien la boca del tubo y
luego pinche el medio en el centro y hasta el fondo a manera de tocar exactamente el centro del fondo del tubo, retire el asa sin salir del tubo de TSI y
luego haga un estriado rápido y parejo en la superficie inclinada. Sin flamear
y con la misma asa, inocule el medio LIA (morado) pinchando esta vez tres
veces y luego estriar la superficie y con la misma asa sin flamear, haga una
estría en un tubo de agar urea de Christensen (mejor tomar una nueva colonia de igual morfología). Si no cuenta con microscopio estereoscópico proceda así:
Tome la caja ya marcada de MacConkey, XLD o SS Hektoen entre los dedos
pulgar, índice y medio de la mano izquierda (retraiga los dedos anular y meñique). Colóquela verticalmente a manera que la luz pase por detrás a través
de la caja, tome su asa recta agarrada como un lápiz con la mano derecha,
apoye firmemente los dedos anular y meñique en la palma de su mano izquierda que sostiene la caja. Acerque cuidadosamente el asa y toque con mucho
cuidado la colonia seleccionada sin pincharla ni tocar otras colonias cercanas.
(ver figura 6, pág. 48). Inocule simultáneamente una pareja de TSI/LIA y urea
agar según ya se describió. Estos tres medios en tubo deben tener 2.5 cm de
fondo y 3.8 cm de superficie inclinada para que funcionen correctamente,
Rotular ambos tubos y colocarlos por pareja en gradillas. Si el MacConkey
sólo presenta colonias lactosa-positivo (rojas) descártelo. Lo mismo se hará
con el Hektoen que sólo presenta colonias lactosa-positivo (anaranjado salmón), o el XLD que sólo presenta colonias amarillas. Reincube la caja de SS
otras 24 horas a temperatura ambiente para investigar la presencia de Yersinia
enterocolitica.
47
Fig. 6 TÉCNICA PARA TOMAR INÓCULO DE COLONIAS INDIVIDUALES
3-
Incube a 36°C la gradilla con las parejas TSI/ LIA y urea, de manera que no
quede duda de qué tubo de TSI corresponde a su LIA. Deben permanecer en
incubación de 18 a 24 horas. Los tapones de rosca deben quedar ligeramente
flojos para permitir la entrada de oxígeno. Las colonias marcadas “g” (E. coli,
niños menores de un año) pueden pasar sólo a TSI, para ahorrar LIA y urea.
4-
Examine las reacciones coloreadas en el TSI/LIA simultáneamente; tome
ambos tubos juntos hacia abajo con la mano derecha y obsérvelos contra la
luz. Interprete resultados de acuerdo a la siguiente tabla.
48
Reacción ya
ya
Reacción
incubada
incubada
A=ácido K=alcalino
R=rojo
N=neutro
Gas (g)
(-a+++)
Medio sin
Medio sin
inocular
inocular
ácido
sulfhídrico
(h) (-a+++)
TSI
(rojo)
Amarillo
rojo
no
aplicable
no
aplicable
burbujas
o
rupturas
negro
LIA
(morado)
Amarillo
violeta
Superficie
roja
antre
amarillo
y morado
burbujas
o
rupturas
negro
Urea de Christensen: (amarillo ligeramente anaranjado), positivo = rosado fuerte;
negativo = no hay cambio
Para expresar en clave y abreviadamente las reacciones en TSI o LIA use las
abreviaturas A, K, R, N, -, +, g, h, según la tabla anterior en este orden: superficie/
fondo, gas, ácido sulfhídrico.
Por ejemplo las reacciones de Escherichia coli en TSI; LIA se expresan así:
TSI;LIA = A/A, g+; h-/ K/K, g+, h- o
TSI;LIA = K/A, g-; h-/K/N, g-, hLas reacciones coloreadas en TSI/LIA, son muy útiles para la identificación
de los enterobacterias, por lo que en el laboratorio debe contarse con una tabla
actualizada de reacciones en TSI/LIA y pruebas bioquímicas en general.
Reacciones a las cuales debe ponerse especial atención:
Bacteria
TSI
LIA
UREA
Shigella spp.
K/A,g-,h-
K/A (N),g-,h-
-
Salmonella sp.
K/A,g+,h++
K/K,g+,h+
-
A/A,g-,h-
A (K)/A,g-,h-
+
49
5-
Los tubos de TSI, marcados “g” y que corresponden a coprocultivos de
niños menores de un año deben aglutinarse para investigar Escherichia
coli enteropatógena (“pools” A, B y C) (Según Dr. Myron Levine, U. de
Maryland VI Congreso C.A. de Microbiología, comunicacion personal). El
informe final deberá reportarse así: “Se aisló Escherichia coli enteropatógena
del grupo ___ ” . Debe hacerse notar que aunque el valor cIínico de esta prueba ha sido puesto en duda, ya que también existen E. coli invasivas y productoras de toxinas que no se investigan, actualmente debe realizarse la
aglutinación para demostrar la presencia de serotipos clásicos enteropatógenos
en los niños pequeños. Inocule una asada pequeña en caldo tripticasa soya o
caldo BHI (infusión de cerebro y corazón de buey), proceda efectuar la prueba de susceptibilidad antimicrobiana según el método de Bauer-Kirby, descrito más adelante. Si no se observa ninguna aglutinación, ni se aisla Shigella o
Salmonella apunte en el libro de trabajo la clave N-SSE, y el informe final debe
redactarse así: “Negativo para Shigella, Salmonella y Escherichia coli
enteropatógena”. (Sólo para niños menores de un año). Las claves sugeridas
para registro en los libros de trabajo evitan escritura innecesaria, facilitan y
aceleran el trabajo.
50
REACCIONES DE VARIAS ENTEROBACTERIAS EN TSI Y LIA
Enterobacteria
LIA
TSI
UREA
Escherichia coli
A(K)/A, g+ (-), h-
K/KóN, g-ó+, h-
-
Shigella spp.*
K/A, g-, h-
K/A, g-, h-
-
Salmonella typhi*
K/A, g-, h++- (poco)
K/K, g-, h-(+)
-
Salmonella spp.*
K/A, g-, h+++(-)
K/KóN, g-, h+ (-)
-
Arizona hinshawii*
K(A)/A, g+, h+++
K/KóN, g-, h+ (-)
-
Yersinia enterocolitica*
A/A, g-, h-
A(K)/A, g-, h-
+
Citrobacter sp.
K(A)/A, g+, h+++(-)
K/A, g-ó+, h+ó-
Edwarsiella tarda
K/A, g+, h+++
(indol +)
K/K, g-ó+, h+
Klebsiella sp.
A/A, g++, h(mucosidad ++)
KóN/KóN, g+ó, h-
Enterobacter sp.
A/A, g++, h-
KóN/KóN, g+(-), h-
-(+)
Serratia sp.
KóA/A, g-, h-
KóN/KóN, g-, h-
-ó+
Proteus vulgaris
A(K)/A, g+, h+++
R/A, g-, h-(+)
+
Proteus mirabilis
K(A)/A, g+, h+++
R/A, g-, h-(+)
+
Morganella morganii
(antes Proteus morganii)
K/A, g-(+), h-
KóR/A, g-, h-
+
Providencia sp.
K/A, g+ ó-, h
R/A, g-, h-
-
+ó-
+
Nota Importante:
Solamente reportar como coprocultivo positivo las enterobacterias marcadas con * el resto
es microbiota normal y no debe reportarse nunca. Reacciones menos probables entre
paréntesis. Todas las reacciones con reacción roja (R) en la superficie de LIA, presuntivamente
son Proteus sp., Morganella sp. o Providencia sp., no tienen importancia clínica en coprocultivos
y no deben tomarse en cuenta. Esta tabla es sólo una guía, que debe actualizarse
constantemente.
51
DIFERENCIACIÓN DE LAS ESPECIES DEL GÉNERO SHIGELLA:
TSI y LIA = K/A,g-,hOler el medio de TSI sin tocarlo con nariz o boca, el olor a “semen” es característico de Shigella spp., especialmente de Shigella grupo B (Shigella flexneri), la más
frecuente en Guatemala. El fondo de los tubos de TSI y LIA no presentan gas, ni
ácido sulfhídrico y tienen un color “amarillo canario”. La reacción K (alcalino) de
la superficie del TSI es roja de un tono fresa no muy intenso. Aglutinar el crecimiento del TSI sospechoso, o del LIA así:
Utilice la tapadera limpia y seca de una caja de Petri, ráyela con crayón graso
por detrás a manera de hacer rayas paralelas y perpendiculares que formen cuadritos
de aproximadamente un centímetro cuadrado. Coloque todas sus parejas TSI/LIA
con reacción sospechosa de Shigella, en orden numérico en una gradilla. En la misma gradilla pero en otro extremo ordene en pares los TSI/LIA con reacción sospechosa de Salmonella y los TSI marcados “C” (Escherichia coli) para proceder a aglutinar.
Por cada pareja sospechosa de Shigella (K/A,g-,h-; K/A,g-,h-) coloque en el centro
de un cuadrito una gotita de antisuero “Shigella grupo B” (Shigella flexneri). Aglutine
tomando una porción pequeña del crecimiento en TSI (puede ser también del LIA)
con asa en anillo estéril; coloque el crecimiento sobre la caja (mueva el asa en óvalo
pequeño sin tocar la gota), luego suspenda bien el crecimiento en la gota a manera
de obtener una suspensión ligeramente lechosa. Observe inmediatamente después
de inclinar la tapadera de la caja hacia adelante y hacia atrás la aparición de
aglutinación franca y obvia.
Sólo tomar en cuenta aglutinaciones que ocurren antes de 1 minuto después
de mezclar. Si aglutina reportar Shigella B en el libro de trabajo. Si no aglutina siga
aglutinando pero siempre en este orden para ahorrarse trabajo y anti-sueros, que
son muy caros:
1234-
Shigella flexneri, grupo B
Shigella sonnei, grupo D
- La más frecuente en Guatemala
- La segunda más frecuente en
Guatemala
Shigella dysenteriae, grupo A - Rara pero grave y epidémica, debe
darse alerta al médico.
Shigella boydii, grupo C
- Muy rara vez se aisla en el país.
52
DIFERENCIACIÓN DE LAS ESPECIES DEL GÉNERO SALMONELLA:
La taxonomía moderna del género Salmonella ha cambiado, sin embargo para fines
prácticos de diagnóstico y de investigación, se recomienda usar la clasificación antigua simplificada así:
-
Salmonella typhi:
causa fiebre tifoidea con diseminación generalizada de la bacteria (puede aislarse de heces,
médula ósea, sangre, orina, etc).
-
Salmonella enteritidis:
causa infección intestinal y puede diseminarse
a la sangre.
-
Salmonella choleraesuis:
rara, causa infección en animales y rara vez
en el hombre.
Salmonella typhi presenta en TSI dos características muy importantes para
su identificación, las que se complementan con LIA, citrato de Simmons y
aglutinación:
12-
345-
No produce gas.
Produce poco ácido sulfhídrico (una pequeña mancha negra,
a veces difícil de apreciarse en el área del tubo donde empieza el
inclinado).
Generalmente, el LIA es todo morado (K/K,g-,h-(+)
Es citrato-negativo.
Aglutina con el antisuero anti-antígeno Vi.
El agar inclinado de citrato de Simmons es un medio verde que se prepara
inclinado con las mismas medidas del TSI/LIA. Debe inocularse con una asada del
crecimiento de los tubos TSI o LIA sospechosos de Salmonella, luego se incuba a
36°C de 18 a 24 horas y los cambios de color se interpretan así:
verde = negativo
azul = positivo
53
Diferencie presuntivamente las especies del género Salmonella con estas tres
pruebas sencillas:
Prueba
Especie
Gas
(TSI)
Ácido sulhídrico
(TSI)
Citrato
Salmonella typhi
-
+ débil
-
Salmonella enteritidis
+
+++
+
+
+ (sólo 60%)
(+)
(+) = positivo lento, más de 3 días de incubación.
En resumen, para diferenciar e identificar Salmonella siga estos pasos:
1-
Identifique las reacciones sospechosas en TSI/LIA de Salmonella typhi y
Salmonella spp. según la tabla. Es muy importante notar la reacción toda
morado-violeta en el LIA (K/K), es decir el medio no cambia de color lo
cual es típico del género Salmonella. Anote la cantidad de ácido sulfhídrico
en el TSI.
2-
Ordene sus TSI/LIA/urea en la gradilla de tubos para aglutinación y, según
ya se explicó, aglutine todos los TSI con una gota de antisuero comercial
polivalente de Salmonella.
3-
Si la reacción es positiva, inocule un tubo de citrato de Simmons e incube,
simultáneamente inocule la prueba de susceptibilidad antimicrobiana.
4-
Si el laboratorio cuenta con el set de antisueros de grupo de Salmonella, aglutine
sólo los tubos con aglutinación franca en el antisuero polivalente a Salmonella
en los antisueros de grupo. Algunos grupos frecuentes en Guatemala son B,
G, y C1. Salmonella typhi pertenece al grupo D, por lo que aglutinación positiva a este grupo, además de las otras pruebas sencillas confirma esta especie.
Si se investiga el grupo, éste debe informarse, por ejemplo:
Se aisló Salmonella enteritidis del grupo B.
Idealmente el laboratorio podrá confirmar con más seguridad y mayor
54
trabajo las especies de enterobacterias con sistemas de múltiples pruebas
bioquímicas miniaturizadas, por ejemplo API, según las condiciones de trabajo.
INFORME:
El informe del coprocultivo debe constar de 3 partes:
1-
Título: coprocultivo, cultivo de biopsia colónica, etc. De preferencia debe escribirse con mayúsculas y centrado.
2-
Resultado: Para ahorrar tiempo y trabajo, debe apuntarse el resultado en clave, en el libro de trabajo y luego la secretaria del laboratorio lo deberá
transcribir con el texto correcto, según la próxima tabla. Incluir el grupo de
Salmonella si se efectuó. En el caso de Shigella no es necesario poner el grupo,
sólo la especie, par ejemplo: Se aisló Shigella flexneri.
3-
Prueba de susceptibilidad antimicrobiana (S/A): con los antibióticos de utilidad clínica para tratar infecciones por enterobacterias.
Utilice la siguiente tabla para registrar e informar el resultado del coprocultivo:
RESULTADO
CLAVE
en libro de trabajo
(técnico)
TEXTO (Secretaria)
Coprocultivo negativo
de adulto
NP
No se aislan enteropatógenos, desarrollan
bacterias de la microbiota normal
Coprocultivo negativo de
niño menor de un año
N-SSE
Negativo para Shigella, Salmonella y
Escherichia coli enteropatógena
Coprocultivo positivo
Shigella A
Se aisló Shigella dysenteriae. S/A
Shigella B
Se aisló Shigella flexneri. S/A
Shigella C
Se aisló Shigella boydii. S/A
Shigella D
Se aisló Shigella sonnei. S/A
Salmonella typhi
Se aisló Salmonella typhi. S/A
Salmonella grupo ____
Se aisló Salmonella enteritidis del grupo ____. S/A
Se aisló Salmonella choleraesuis. S/A
Arizona
Se aisló Arizona hinshawii. S/A
Yersinia
Se aisló Yersinia enterocolitica. S/A
S/A = susceptibilidad antimicrobiana.
55
PROCEDIMIENTO PARA CULTIVO DE CUERDAS ENCAPSULADAS
(ENTEROTEST)
PARA COLECCIÓN DE MUESTRAS DUODENALES
El objetivo de este procedimiento es obtener una muestra de la bilis del paciente para cultivar específicamente Salmonella typhi; también puede usarse para
examinar en fresco su contenido para trofozoitos de Giardia lamblia, huevos de
Clonorchis sinensis, o larvas de Strongyloides stercoralis. El pH de la parte distal de la
cuerda debe ser alcalino, si llegó al duodeno. El procedimiento consiste en dar al
paciente (en ayunas) una cuerda de nylon absorbente (de 90 a 140 cm para adulto y
67 cm para niños) dentro de una cápsula, la cual debe tragarse con agua. Un extremo de la cuerda se pega por fuera a la cara del paciente con cinta adhesiva y el otro
distal debe llegar hasta el duodeno, donde permanece cuatro horas para empaparse de bilis. El paciente sólo debe beber agua, mínimo un vaso por hora.
Procedimiento:
1-
El médico debe extraer (usar guantes) la cuerda de la boca mediante una tracción rápida pero suave. Luego cortar con tijeras estériles la punta de la cuerda
(amarilla por la bilis), a manera de que caiga asépticamente en un tubo o
botellita con caldo tetrationato.
2-
El caldo tetrationato sirve para enriquecer la muestra para el aislamiento de
Salmonella. Agitar e incubar 24 horas a 36° C.
3-
Después de la incubación, inocular por estrías una asada del caldo tetrationato (agitado) en MacConkey y SS. Incubar 18 a 24 horas aeróbicamente a
36° C.
4-
Trasladar las colonias lactosa-negativo (incoloras) a TSI, LIA, urea y citrato,
incubar 18 a 24 horas a 36° C.
5-
Identificar Salmonella typhi por medio de sus reacciones en TSI, LIA, urea y
citrato. Aglutinar con anti-suero polivalente de Salmonella, antígeno Vi y grupo D, según ya se explicó.
Medio de cultivo:
Preparar el caldo de tetrationato adicionado con yodo y verde brillante según
las instrucciones en el frasco de la base en polvo, así:
56
Suspender 17.5 gramos de la base en polvo en 500 ml de agua destilada, calentar hasta que hierva. Dejar enfriar a menos de 45° C y luego agregar: 10 ml de
solución de yodo (yodo: 6 g, yoduro de potasio: 5 g, agua destilada: 20 ml.) y 5 ml
de solución acuosa de verde brillante al 0.1 %.
Medir 10 ml en frasquitos estériles (de los que vienen con el medio Thayer
Martin) o tubos estériles con tapón de rosca. El medio debe quedar verde con precipitado blanco.
LA EPIDEMIOLOGÍA Y ETIOLOGÍA DE LA DIARREA
Adaptado de:
World Health Organization. 1992. Control of Diarrheal Diseases Program.
Readings on Diarrhea, Student Manual, Unit I The Epidemiology and Etiology
of Diarrhea. Geneva.
Usualmente se define a la diarrea como la eliminación de tres o más
evacuaciones intestinales líquidas o blandas en un período de 24 horas.
Existen tres tipos de diarrea:
Diarrea aguda, líquida
Disentería
Diarrea persistente
El problema que representan las enfermedades diarréicas
La diarrea es una de las causas principales de enfermedad y muerte en
los niños menores de 5 años de los países en desarrollo, en donde ocurren
aproximadamente 1.3 mil millones de episodios y 3.2 millones de muertes al
año por diarrea. En promedio, estos niños padecen 3.3 episodios de diarrea
por año, pero en algunas áreas, el promedio pasa de nueve episodios por año.
Es común que donde los episodios son frecuentes, los niños pasen el 15% de
sus vidas con diarrea. Dentro de este grupo de edad, los niños menores de
dos años, son los que sufren la mayor morbilidad y mortalidad. Se estima que
aproximadamente 80-90% de las muertes por diarrea ocurre en niños menores de dos años. La causa principal de muertes por diarrea aguda es la
deshidratación, la cual resulta por la pérdida de líquidos y electrolitos. Otras
causas importantes de muerte son disentería, desnutrición y otras infecciones
serias, como neumonía.
57
Disentería
Esta forma de diarrea se caracteriza por la presencia de sangre visible en
las heces fecales y frecuentemente presencia de moco. Sus efectos importantes incluyen anorexia, pérdida de peso rápida y daños a la mucosa intestinal
causados por la bacteria invasora.
La mayoría de los casos de disentería aguda en niños, son causados por
Shigella spp. Otras causas son Campylobacter jejuni y menos frecuentemente
Escherichia coli entero invasora (EIEC) y Salmonella. El protozoo Entamoeba
histolytica, puede causar disentería seria en adultos jóvenes, pero es una causa
muy rara en niños. En alrededor de 90% de los casos de infección intestinal
por Entamoeba histolytica, las cepas no son virulentas.
Los pacientes con disentería causada por Shigella dysenteriae tipo 1 (Bacilo de Shiga), están a menudo clínicamente muy enfermos. Este síndrome
clínico casi siempre incluye fiebre alta, síntomas tóxicos y cólicos abdominales intensos y tenesmo. Ocasionalmente se registran convulsiones. A veces se
acompaña de complicaciones graves, como el síndrome hemolítico urémico.
Pueden presentarse epidemias de gran magnitud causadas por este
enteropatógeno. Esto ocurrió en Centroamérica en los años 1969 y 1970. La
terapia antimicrobiana apropiada aminora significativamente la gravedad y
duración de la disentería y de la fiebre, así como la excreción del patógeno.
EPIDEMIOLOGÍA
Transmisión de los agentes que causan diarrea
Los agentes infecciosos que causan diarrea generalmente se diseminan
por la ruta fecal-oral, lo cual incluye la ingestión de agua o alimentos contaminados fecalmente, y el contacto directo con heces fecales.
Varios comportamientos específicos de las personas contribuyen a la
propagación de los enteropatógenos y por consiguiente incrementan el riesgo de sufrir diarrea. Estos incluyen:
-
Falta de lactancia materna exclusiva durante los primeros 4-6
meses de vida.
58
-
-
Usar biberones para alimentar a los niños.
Guardar alimentos a temperatura ambiente.
Beber agua contaminada con bacterias fecales.
No lavarse las manos después de defecar, después de desechar las
heces de los niños o de limpiar los pañales y antes de preparar o
servir alimentos.
No desechar higiénicamente las heces (incluyendo las de los
lactantes).
Epidemias
En las áreas tropicales, la diarrea por rotavirus ocurre todo el año, aumenta su frecuencia durante los meses secos y más fríos, mientras que las
diarreas bacterianas aumentan durante la estación lluviosa y más cálida. La
incidencia de diarrea persistente sigue el mismo patrón estacional de la diarrea aguda líquida.
Hay dos enteropatógenos Vibrio cholerae y Shigella dysenteriae tipo 1 que
provocan grandes epidemias en las que la morbilidad y mortalidad en todos
los grupos de edad son altas. Desde 1961, el cólera causado por el biotipo
Eltor de V. cholerae 01 se ha diseminado a países de Asia, el Mediterráneo
Oriental, Africa, y a algunos países de Europa. Desde 1991, ha causado epidemias en prácticamente todos los países de América Latina y casos sin
diseminación secundaria en los Estados Unidos. Durante el mismo período
de tiempo Shigella dysenteriae tipo 1 ha ocasionado grandes epidemias de
disentería grave en Centro América (69-70) y, más recientemente, en Africa
Central y Sur de Asia.
ETIOLOGÍA
Enteropatógenos importantes:
Virus:
Rotavirus
Bacterias: Escherichia coli enterotoxigénica
Shigella spp.
Campylobacter jejuni
Vibrio cholerae 01
Salmonella spp.
Protozoos: Cryptosporidium parvum
59
Patógenos frecuentemente identificados en niños con diarrea
aguda, atendidos en centros de tratamiento, en países en desarrollo
Patógeno
Porcentaje de
casos
Antimicrobianos
recomendados en
base clínica*
Virus
Rotavirus
15-25
Ninguno***
Bacterias
Escherichia coli
enterotoxigénica
10-20
Ninguno
Shigella
5-15
Trimetoprimsulfametoxazol,
Ácido nalidíxico
Campylobacter jejuni
10-15
Ninguno
Vibrio cholerae 01
5-10**
Tetraciclina,
Doxiciclina,
otros
Salmonella (no tifoidea)
1-5
Ninguno***
Escherichia coli
enteropatógena
1-5
Ninguno
Cryptosporidium parvum
5-15
Ninguno***
20-30
Ninguno***
Protozoos
Ningún patógeno
aislado
*
**
***
Para cepas sensibles
En áreas endémicas; puede ser más alto durante epidemias
Ningún antimicrobiano efectivo
60
Otros patógenos, cuya importancia como causa de diarrea aguda en
niños en los países en desarrollo es mínima, o no está bien definida. Estos
incluyen:
Virus:
agente Norwalk
adenovirus entéricos
Bacterias: Aeromonas hydrophila
Escherichia coli enteroagregativa
Escherichia coli enteroinvasora
Escherichia coli enterohemorrágica
Plesiomonas shigelloides
Vibrio cholerae que no es 01
Vibrio parahaemolyticus
Protozoos: Giardia lamblia
Entamoeba histolytica
Isospora belli
Cyclospora cayetanensis
Mecanismos Patogénicos de los Agentes Etiológicos de Diarrea
Los enteropatógenos causan diarrea por varios mecanismos, algunos de
los cuales se revisan a continuación.
Virus
Los rotavirus se replican dentro de las células epiteliales maduras que
cubren la porción superior de las vellosidades intestinales, causando destrucción celular y acortamiento de las vellosidades.
Bacterias
Adherencia a la mucosa
Producción de toxinas que causan secreción intestinal
Invasión de la mucosa
Protozoos
Adherencia a la mucosa
Invasión de la mucosa
61
Shigella
Shigella es la causa más importante de disentería, encontrándose en alrededor de 60% de todos los episodios y en prácticamente en todos los episodios graves de esta forma de diarrea; también pueden causar diarrea líquida.
S. flexneri es la especie más prevalente en países en desarrollo, sin embargo, S. dysenteriae tipo 1 que causa epidemias regionales es responsable de
la disentería más grave. La destrucción tisular y posiblemente la diarrea líquida son producidas en parte por la extremadamente potente toxina de
Shiga, que es producida en cantidades relativamente grandes por S. dysenteriae
tipo 1. Shigella se disemina principalmente por la transmisión de persona a
persona. El tratamiento efectivo contra Shigella spp. se hace con
antimicrobianos a los cuales son susceptibles, pero es común la resistencia
antimicrobiana. Puede haber resistencia a múltiples antimicrobianos especialmente en las cepas de S. dysenteriae tipo 1. Los antimicrobianos más útiles son
trimetoprim-sulfametoxazol y ácido nalidíxico; en algunas áreas también es
efectiva la ampicilina.
62
CAPÍTULO 4
COPROCULTIVO PARA CÓLERA
PROPÓSITO:
Demostrar por medio de cultivo la presencia de Vibrio cholerae 01, la bacteria
causante del cólera. Esta bacteria se adquiere por ingestión de bebidas o alimentos
contaminados. Llega al intestino delgado, donde se adhiere a la mucosa y, debido a
la producción de una potente toxina, causa la salida masiva de agua y electrolitos.
En un bajo porcentaje de los pacientes infectados, se produce el colera gravis, la
forma clínica del cólera agudo, con muy abundante diarrea acuosa (semejante a
“agua de arroz”) y vómitos. Esto provoca en el paciente deshidratación severa que
puede causar la muerte, si no se instituye tratamiento de rehidratación y antibióticos.
El cólera ha sido endémico en la India y en otros países desde la más remota
antigüedad. En 1961 se inició la séptima pandemia en Indonesia. En enero de 1991
apareció en Perú y a partir de allí se ha diseminado a varios países de Latinoamérica,
donde ahora es una infección endémica, más frecuente durante la época lluviosa.
Vibrio cholerae 01 (01 indica que pertenece al serogrupo 1 según su antígeno
somático), se subdivide en tres serotipos: Inaba, Ogawa, y el serotipo Hikojima que
aún no se ha detectado en Latinoamérica. Generalmente si la epidemia se inicia
con el serotipo Inaba, después de algún tiempo se transforma en Ogawa, debido a
cambio de antígenos. Esta clasificación sólo tiene interés epidemiológico. Existen
dos biotipos de V. cholerae 01: eltor y clásico. En Latinoamérica, durante la presente
pandemia, el biotipo presente es eltor, el cual se caracteriza por causar epidemias
con pocos casos graves (aproximadamente 2%) y muchos casos leves o
asintomáticos; también sobrevive más tiempo en el medio ambiente, y es más resistente a los agentes químicos.
El tratamiento principal del cólera es evitar la muerte por deshidratación, por
medio del pronto reemplazo de agua y electrolitos. Debe hacerse por vía oral y si
es necesario por vía intravenosa. El tratamiento con antibióticos ayuda a la recuperación, pues elimina los vibrios y acorta la diarrea, además evita portadores de la
bacteria. En adultos se recomienda la tetraciclina, y en niños el trimetoprimsulfametoxazol (cotrimoxazol). En el caso de mujeres embarazadas se indica la
furazolidona.
63
El diagnóstico definitivo de cólera se establece sólo por la demostración de V.
cholerae 01 por medio de cultivo. El frote Gram directo de las heces puede ser indicativo de cólera, pero no se considera un procedimiento diagnóstico exacto.
MUESTRA:
Las muestras adecuadas para efectuar el diagnóstico bacteriológico de el cólera son: heces diarréicas (principalmente con apariencia de “agua de arroz”), hisopo
rectal o vómitos. Deben recolectarse de preferencia dentro de las primeras 24 horas
de la enfermedad y previo a la administración de antibióticos. Si las muestras de
heces frescas van a ser procesadas en un tiempo adecuado (antes de dos horas),
deben recolectarse en un recipiente de vidrio o plástico bien limpio, de preferencia
estéril, y enviarse inmediatamente al laboratorio. En caso contrario deben inocularse dos hisopos con material fecal en el medio de transporte Cary-Blair, que
debe enviarse al laboratorio de referencia sin necesidad de refrigeración. En
el medio hospitalario no es necesario usar inútilmente el medio de transporte
Cary-Blair, ya que la muestra de heces frescas debe remitirse al laboratorio para su
cultivo directo inmediato.
PROCEDIMIENTO:
Existen muchas variantes en la marcha bacteriológica a seguir para el aislamiento e identificación de Vibrio cholerae 01. La marcha simplificada propuesta es,
en la experiencia del autor, efectiva y sencilla (ver figura 7, pág. 67). V. cholerae 01
puede aislarse directamente de las heces, pero se logran resultados mucho mejores
si previamente se hace un enriquecimiento en el caldo selectivo alcalino llamado
agua pepto nada alcalina o APA. En este caldo el agente etiológico del cólera prolifera en la superficie, pues resiste la alcalinidad extrema del medio (pH 9.0 a 9.2), y
otras bacterias de la microbiota fecal se destruyen, por lo que se obtienen cultivos
casi puros.
1.
Inocular masivamente un tubo con 5 ml de agua peptonada alcalina,
con un hisopo estéril bien cargado de heces o vómito. Sacar el hisopo y
agitar muy bien el tubo, luego incubar verticalmente y con el tapón ligeramente suelto, solamente por 5 a 8 horas a 36° C.
2.
Si se trata de heces, inocular directamente cajas de agar MacConkey,
XLD o SS e idealmente Hektoen para el aislamiento de Shigella y
Salmonella, ya que las infecciones intestinales causadas por estos dos
géneros, clínicamente pueden semejar cólera.
64
3.
Después del tiempo crítico de incubación del APA, retirar el tubo cuidadosamente de la incubadora y colocarlo verticalmente en una gradilla o
soporte. Destaparlo despacio, sin que se agite, y con el asa en anillo,
tomar verticalmente una asada de la superficie del caldo (no más de 5
mm de profundidad). Inocular una caja de agar TCBS y una de agar
sangre de carnero al 5%. Incubar aeróbicamente 18 a 24 horas a 36° C.
El agar TCBS (tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa) contiene elevadas
concentraciones de tiosulfato de sodio y citrato de sodio. La fuerte alcalinidad del
medio de cultivo TCBS, inhibe considerablemente las enterobacterias; la bilis de
buey y el colato inhiben sobre todo a los enterococos. Los coliformes que eventualmente puedan crecer, no fermentan la sacarosa (sinónimo: sucrosa). Contiene dos
indicadores de pH: azul de timol y azul de bromotimol, que viran al color amarillo
en presencia de acidez. Vibrio cholerae es sacarosa positivo, por lo que produce colonias amarillas. Vibrio fluvialis, V. furnissii y V. alginolyticus, también producen
colonias amarillas en TCBS; estos vibrios son de muy poca importancia
epidemiológica. Algunas cepas de enterococos, Proteus y Klebsiella sacarosa-positivo, también pueden producir colonias amarillas, pero de morfología distinta a las
que produce V. cholerae 01.
1.
Vibrio cholerae 01 produce en TCBS el crecimiento masivo y puro de colonias grandes (de 2 a 3 mm de diámetro), de color amarillo canario
(sacarosa-positivo), aplanadas o de bordes delgados. Este tipo de colonias en TCBS, en grandes cantidades debido al enriquecimiento selectivo en APA, son muy indicativas de la presencia de la bacteria.
2.
Si hay crecimiento típico en TCBS, en el agar sangre de carnero se desarrollará un crecimiento masivo y casi puro de colonias grandes incoloras, brillantes, de bordes aplanados y no hemolíticas. En el área de la
caja donde el crecimiento es confluente, generalmente aparece una zona
de decoloración del medio que semeja hemólisis; probablemente se debe
al metabolismo de la bacteria, reminiscencia de la hemólisis específica a
los eritrocitos de carnero, que presentaba originalmente V. cholerae 01
del biotipo eltor; en todo caso, es una característica adicional que ayuda
a sospechar la presencia de la bacteria en este medio.
3.
Aglutinar las colonias típicas y aisladas del agar sangre de carnero, con
antisuero polivalente anti-V. cholerae 01. Al hacerlo, evitar tomar de las
65
colonias pequeñas o blancas que pueden aparecer, ya que el medio no es
inhibitorio. Nunca debe aglutinarse del TCBS, pues en este medio las
colonias son “chiclosas”, muy adherentes al medio, y no se pueden suspender bien en el antisuero, por lo que la aglutinación sólo es confiable
a partir del crecimiento en agar sangre de carnero.
4.
Si se obtiene una reacción de aglutinación positiva, franca e inmediata,
generalmente con presencia de grumos grandes, se ha demostrado la
presencia de V. cholerae 01. Proceder a aglutinar el crecimiento típico del
agar sangre de carnero en antisueros anti-serotipo Inaba y anti-serotipo
Ogawa; generalmente la aglutinación es más fina, pero evidente. Esto
último no es crucial, pero si deseable. La prueba de oxidasa es positiva;
debe hacerse en caso de duda o confirmación.
5.
Si el laboratorio no cuenta con antisuero polivalente anti-V. cholerae 01,
se deberá seleccionar una colonia típica del TCBS, y subcultivar en TSI y
LIA. En estos medios la reacción después de 18 a 24 horas de incubación,
generalmente es TSI: K/A (A/A); LIA: K/K-N, sin gas ni ácido
sulfhídrico en ambos tubos. El tubo de TSI debe remitirse al laboratorio
de referencia donde se efectúa la confirmación.
6.
Efectuar prueba de susceptibilidad a los antibióticos, según el método
de Bauer-Kirby. Sólo deben colocarse los siguientes discos: tetraciclina y
trimetoprim-sulfametoxazol, son indispensables; ampicilina o algún otro
antibiótico, son optativos. Interpretar los diámetros de los halos de inhibición igual que para enterobacterias. Es deseable, pero no indispensable, colocar en el centro de la caja de agar Mueller-Hinton, un disco con
50 UI de polimixina-B. La resistencia con ausencia de zona de inhibición
a este antibiótico, indica que la cepa aislada de V. cholerae 01, pertenece
al biotipo eltor. Esto es de esperarse en Latinoamérica, ya que el biotipo
clásico no está actualmente presente. Si se detecta una cepa susceptible
a polimixina-B, debe remitirse al laboratorio nacional de referencia pertinente, para que confirme este hallazgo de interés nacional. El biotipo
eltor presenta una prueba de Voges-Proskauer positiva.
66
Fig. 7 MARCHA BACTERIOLÓGICA ACORTADA PARA
AISLAMIENTO DE Vibrio cholerae 01
Muestras:
Heces líquidas
Hisopo rectal
Vómitos
1. Inocular con hisopo estéril bien cargado un tubo con APA,
descartar el hisopo y agitar
o
2. Incubar 5-6 horas a 36 C
Vibro cholerae
en la superficie
del APA
APA
3. Tomar inóculo de la
superficie del APA
4. Sembrar TCBS y agar
sangre de carnero (ASC)
5. Incubar 18-24 horas
o
a 36 C
No agitar
6. Interpretar simultáneamente
TCBS
Colonias:
- Amarillas
- Grandes
- Planas
Sembrar antibiograma
ASC
Colonias:
- Grandes
- No hemolíticas
Hacer frote
Gram: bacilos
gram-negativo, algunos curvos.
Aglutinar, si positivo dar informe
STAT
STAT: Vibrio cholerae 01
Nota: El diagnóstico definitivo se puede obtener en 24 horas
67
INFORME:
En el caso de cólera el reporte debe ser inmediato, ya que en los casos graves
la vida del paciente puede depender de este resultado. Por este motivo se justifica
plenamente usar una técnica simplificada y evitar pruebas innecesarias, para ahorrar tiempo. Nunca debe esperarse el resultado del antibiograma para hacer el reporte de un cultivo positivo. Se recomienda informar así, lo más pronto posible, y
al lugar más indicado:
1.
Inmediatamente después de una prueba de aglutinación franca a partir
del agar sangre de carnero:
Se aisló Vibrio cholerae O1.
2.
Después de aglutinación positiva con antisuero polivalente anti-V.
cholerae 01 y luego aglutinación positiva con antisuero de serotipo Ogawa
o Inaba:
Se aisló Vibrio cholerae 01, serotipo Inaba (u Ogawa).
3.
Después de interpretar la prueba de susceptibilidad, pero posteriormente
a haber enviado un reporte preliminar:
Se aisló Vibrio cholerae 01, serotipo Ogawa (o Inaba), biotipo eltor.
Susceptible a: ... ; Resitente a: ...
FÓRMULAS:
1. AGUA PEPTONADA ALCALINA (APA):
Peptona ...................................................................... 10 gramos
Cloruro de sodio. ...................................................... 10 gramos
Agua destilada .......................................................... 1,000 ml
Ajustar pH final a 9.0-9.2 con hidróxido de sodio 1N.
Distribuir 5 ml en tubos 13x100 o de mayor volumen con tapón de rosca.
Autoclavear 15 minutos a 121° C (15 libras de presión por pulgada cuadrada).
68
2. MEDIO DE TRANSPORTE CARY-BLAIR:
Tioglicolato de sodio ................................................ 1.5 gramos
Fosfato dibásico de sodio ........................................ 1.1 gramos
(Na2HPO4)
Cloruro de sodio ....................................................... 5.0 gramos
Agar. ........................................................................... 5.0 gramos
Agua destilada .......................................................... 991.0 ml
Disolver los ingredientes en el agua por calentamiento, y con agitación constante.
Enfriar a 50 grados centígrados, y adicionar 9 ml de cloruro de calcio al 1%, recientemente preparado (0.1 gramos de cloruro de calcio + 10 ml de agua). Ajustar pH a
8.4 con hidróxido de sodio 1N, y distribuir 6 ml en tubos de 13x100 con tapón de
rosca, a manera de dejar un pequeño espacio de aire entre el tapón y el medio.
Autoclavear a 100 grados centígrados en Baño de María hirviendo, por 15 minutos.
Enroscar bien el tapón y almacenar en refrigeración y oscuridad.
69
CAPÍTULO 5
COPROCULTIVO PARA Campylobacter jejuni
PROPÓSITO:
Demostrar por medio de cultivo, la presencia de Campylobacter jejuni. A partir
de 1977, se considera a esta bacteria como un importante agente causal de diarrea
humana. C. jejuni es más frecuente que Shigella y Salmonella en coprocultivos. Estudios efectuados por el autor en Guatemala, revelan que en heces de niños menores
de cinco años de edad con diarrea, esta bacteria se aisla aproximadamente en el 10
por ciento. Estos resultados son comparables con otros estudios similares en Latino-américa; la frecuencia mundial de aislamiento a partir de coprocultivos varía
del 4 al 30 por ciento. Sin embargo, debido a que su aislamiento requiere de un
medio de cultivo y condiciones de incubación especiales, su búsqueda no se efectúa rutinariamente, lo cual debería hacerse debido a su importancia epidemiológica.
Campylobacter jejuni es un bacilo gram-negativo, curvo, en espiral o en
forma de “S”. Presenta dos flagelos, uno en cada extremo de la célula, lo que le
proporciona un movimiento rápido y helicoidal, que lanza a la bacteria a manera
de dardo. Es una bacteria estrictamente microaerofílica, oxidasa-positivo, que no
fermenta ni oxida los carbohidratos. Crece a 36 grados centígrados, pero se utiliza
su capacidad diferencial (termófila) de crecer mejor a 42 grados centígrados, para
su aislamiento.
La infección intestinal por este bacilo causa diarrea con dolor abdominal,
fiebre y ocasionalmente vómitos. Puede haber sangre macroscópica en las heces,
especialmente en las muestras pediátricas. La infección se adquiere por vía oral,
al consumir agua o alimentos contaminados, especialmente carne mal cocinada y
leche no pasteurizada. La infección puede adquirirse de otro humano, o ser una
zoonosis, pues también puede adquirirse de los animales. C. jejuni es muy frecuente en animales domésticos y mascotas. Especialmente coloniza pollos y otras
aves; causa enteritis en ganado bovino, y aborto en ovejas. En el humano, además
de enteritis, ocasionalmente causa septicemia, artritis séptica, meningitis y otras
infecciones.
El diagnóstico de campilobacteriosis puede efectuarse presuntivamente por
la observación directa de bacterias con “movimiento de dardo” en las heces con
71
campo oscuro o contraste de fases. Un frote coloreado con Gram, muestra abundantes bacilos gram-negativo curvos. El diagnóstico definitivo se establece por
medio del aislamiento e identificación de C. jejuni.
MUESTRA:
En vista que para el aislamiento de C. jejuni se deben aplicar procedimientos
especializados, las muestras deben ser heces frescas, que deben procesarse antes de
dos horas de haber sido emitidas. Las heces no deben estar contaminadas con
orina. También puede utilizarse hisopo rectal, si la inoculación se efectúa inmediatamente.
CONDICIONES NECESARIAS:
El procedimiento para el aislamiento eficaz de esta bacteria, debe incluir los
siguientes aspectos:
1.
Un agar sangre de carnero selectivo, recientemente preparado. Se
recomienda el Agar Skirrow modificado, que contiene como inhibidores: vancomicina (10 mg/lt), polimixina-B (2,500 UI/lt) y trimetoprim (5 mg/lt). Idealmente debe prepararse con la siguiente base:
Blood Agar Base No. 2 (Oxoid), adicionada de 10% de sangre de
carnero desfibrinada/estéril. La sangre de carnero remueve formas
tóxicas de oxígeno en el medio de cultivo. La mezcla de antibióticos que hacen al medio selectivo para C. jejuni puede obtenerse comercialmente.
2.
Incubación en microaerofilia estricta. Idealmente: 5% de oxígeno, 10%
de anhídrido carbónico y 85% de nitrógeno. La forma más fácil y efectiva de lograr esta atmósfera, es usar el jarro Gas-Pak (BBL), sin catalítico
ni indicador. Según las instrucciones del productor, usar el sobre rojo
generador de anaerobiosis (BBL). La incubación en jarro con candela no
es adecuada, pues proporciona una atmósfera con demasiado oxígeno
(12%-17%) para permitir el crecimiento de C. jejuni.
3.
Incubación a 42° C por 48 horas. Inhibe la microbiota intestinal,
y permite el crecimiento termófilo de Campylobacter jejuni, C. coli y
C. laridis.
72
PROCEDIMIENTO:
1.
Analizar microscópicamente la muestra fecal, para buscar la presencia
de leucocitos polimorfonucleares. Si no los hay, no vale la pena efectuar
el cultivo para C. jejuni, pues las posibilidades de aislarlo son muy bajas.
2.
Analizar macroscópicamente la muestra fecal, y tomar con asa o hisopo
estéril, las porciones con moco, sangre o pus. Inocular por estrías dos
cajas de Agar Skirrow, y una de agar chocolate.
3.
Inmediatamente colocar las tres cajas en atmósfera microaerofílica, por
medio del jarro Gas-Pak sin catalítico ni indicador, con sobre generador
de anaerobiosis (BBL). Es necesario quitar la canastilla con paladio
iridiado (catalítico) del jarro.
4.
Incubar a 42 grados centígrados exactos, por no menos de 48 horas.
1.
Retirar las cajas de la incubadora y del jarro Gas-Pak. Con microscopio
estereoscópico, o al menos con lupa, examinar detenidamente las colonias aisladas. Buscar colonias con la siguiente morfología típica: húmedas o ligeramente mucosas, muy aplanadas, blanco-grisáceas o incoloras, no hemolíticas, rodeadas de un “velo” de crecimiento que se esparce sobre el agar circundante a la colonia, bordes irregulares y poco perceptibles. Menos frecuentemente las colonias son más secas, convexas y
amarillentas; con incubación prolongada se transforman en rugosas. Si
no se encuentran colonias típicas, incubar por otras 24 a 48 horas antes
de descartar el cultivo como negativo.
2.
De una colonia aislada con morfología típica, hacer inmediata y cuidadosamente un frote (de preferencia del “velo” circundante), en una pequeña gota de agua. Colorear con Gram (dejar la safranina por tres minutos, pues la bacteria se tiñe pálidamente), o con fuchsina básica al 1%
por 10 a 20 segundos, después de fijar al calor.
3.
Si el frote presenta bacilos gram-negativo curvos, algunos en forma de
“gaviota”, en forma de “S”, o en espiral (ondulante), presuntivamente
se ha aislado Campylobacter jejuni. Reportar este hallazgo de inmediato.
En los cultivos expuestos al aire predominan las formas cocoides.
73
4.
De otra colonia típica, subcultivar con el asa en hilo a otra caja de Agar
Skirrow, y a una caja de agar sangre de carnero, e inocular un tubo de
agar TSI. Estriar e incubar los tres medios en atmósfera microaerofílica a
42° C, según ya fue descrito.
5.
El cultivo puro que resulta del subcultivo en Skirrow o agar sangre de
carnero generalmente es una “capa” blanquecina de crecimiento; sirve
para confirmar de nuevo la morfolofía bacteriana típica, y efectuar las
siguientes pruebas confirmativas:
-
Oxidasa y catalasa: ambas deben ser positivas, y se consideran como
suficientes. Campylobacter jejuni, C. coli y C. laridis dan ambas
pruebas positivas.
-
El tubo de TSI debe ser K/K, sin gas, y sin ácido sulfídrico.
-
No es indispensable, pero si existen facilidades, hacer la prueba de
hidrólisis del hipurato. Es positiva para C. jejuni, y negativa para
C. coli.
-
C. jejuni es susceptible a un disco de 30 microgramos de ácido
nalidíxico, mientras que C. laridis es resistente; esta diferenciación
tampoco se considera indispensable.
-
Eventualmente algunas cepas de Pseudomonas aeruginosa pueden
crecer en el medio Skirrow microaerofílico/termófilo, sin
embargo, éstas se diferencian por su pigmento verdoso y su olor
característico.
INFORME:
Al detectar la morfología bacteriana típica en las colonias que desarrollan a
las 48 horas de incubación, informar:
Se aisló Campylobacter jejuni, confirmación pendiente.
Al efectuar las pruebas confirmatorias, reportar:
Se aisló Campylobacter jejuni, se recomienda considerar el tratamiento
con eritromicina.
74
CAPÍTULO 6
INVESTIGACIÓN DE Helicobacter pylori
PROPÓSITO:
Demostrar por medio de observación, cultivo, o la técnica indirecta de ureasa,
la presencia de Helicobacter pylori. Esta bacteria se ha reconocido recientemente como
agente causal de gastritis crónica activa tipo B, y predispone a la producción de
úlceras pépticas. Anteriormente se clasificaba en el género Campylobacter, pero debido a varias diferencias en su estructura, composición y susceptibilidad
antimicrobiana, a partir de 1989, se clasifica en el género Helicobacter.
Es un bacilo gram-negativo helicoidal o espiral, que presenta movilidad en
forma de dardo debida a sus flagelos. Es una bacteria microaerofílica, cuyo crecimiento óptimo es a 36° C. Se observa o aisla a partir de biopsias de la mucosa
gástrica.
Su detección tiene actualmente mucha importancia clínica. El mecanismo
más probable para explicar la patología gástrica que causa, es su gran actividad
sobre las células parietales del estómago, lo que induce la producción de gran cantidad de ácido clorhídrico. Además, la potente enzima ureasa que produce H. pylori,
degrada la mucina del moco gástrico y libera gran cantidad de amonio. En
Latinoamérica en general, la gastritis es una enfermedad muy frecuente. Se sabe
que el 70 por ciento la población guatemalteca sufre de infección gástrica asociada
a H. pylori, lo que indica la importancia de su búsqueda en nuestro medio. Esta
bacteria es susceptible a eritromicina, tetraciclina, penicilina, gentamicina, cefalotina,
clindamicina, ciprofloxacina y otros antibióticos; también es susceptible a las sales
de bismuto que contienen varios medicamentos contra la gastritis. Es resistente a
las sulfonamidas, ácido nalidíxico y trimetoprim-sulfametoxazol.
MUESTRA:
La muestra siempre debe ser obtenida por el gastroenterólogo por medio de
gastroscopía. Las biopsias, cepillados o aspirados, se toman por el gastroscopio, de
antro pilórico, de cuerpo y de fondo del estómago. Las biopsias producen los resultados más confiables. También puede usarse la técnica de la cuerda encapsulada o
Enterotest para extraer moco gástrico.
75
OBSERVACIÓN DIRECTA:
Puede efectuarse por medio de la observación de la bacteria en fresco (en
preparaciones con solución salina), con microscopía de contraste de fases (o campo
oscuro), o en frotes coloreados. En el caso de la observación en fresco y contraste de
fases, se buscan bacilos curvos muy móviles con el típico movimiento en forma de
dardo. La coloración de Gram no se considera adecuada para teñir H. pylori. Lo
más usado es la detección de la bacteria en el laboratorio de Patología, donde se
preparan cortes y frotes por aposición de la biopsia, y se tiñen con Giemsa modificado, hematoxilina-eosina o la compleja impregnación con sales de plata según
Warthin-Starry. Se buscan abundantes bacilos curvos o helicoidales directamente
sobre la mucosa.
PRUEBA DE UREASA:
H. pylori produce abundante ureasa, enzima que actúa sobre el sustrato urea,
con producción de abundante amoníaco, lo cual alcaliniza el medio. Es una prueba
indirecta de la presencia de H. pylori en la muestra, por lo tanto se considera
presuntiva. Proceder así:
1.
Macerar asépticamente la biopsia, idealmente en macerador pequeño
de vidrio, con 0.3 ml de solución estéril de glucosa al 20%.
2.
Inocular masivamente un tubo de caldo urea, o agar urea de Christensen.
3.
Incubar a 36 grados centígrados por pocas horas.
4.
Se considera como una prueba positiva cuando el medio vira rápidamente a color rosado fuerte, al alcalinizarse.
CULTIVO:
El aislamiento de H. pylori por medio de cultivo, constituye la confirmación
definitiva de este diagnóstico bacteriológico. Para efectuarlo, se recomienda proceder así:
1.
Macerar la biopsia con 0.3 ml de solución estéril de glucosa al 20%.
2.
Inmediatamente inocular 0.03 ml del macerado en dos cajas de agar
chocolate y dos cajas de Agar Skirrow. Diseminar por estrías.
76
3.
Introducir las cajas en un jarro Gas-Pak (BBL), sin catalítico en la tapadera,
ni indicador de anaerobiosis. Introducir según las instrucciones del productor, un sobre rojo generador de anaerobiosis. Sin el catalítico presente, proporciona una atmósfera microaerofílica adecuada para el cultivo
de H. pylori.
4.
Incubar a 36 grados centígrados por cinco días.
5.
Después de la incubación prolongada, buscar con ayuda del microscopio estereoscópico o lupa, colonias con las siguientes características: muy
pequeñas (0.5 mm de diámetro, no mayores de 2 mm), circulares,
translúcidas y no pigmentadas. Efectuar observación en fresco con contraste de fases o campo oscuro y/o frote Gram modificado (fucsina básica al 1% como contraste). Si se observan bacterias con el típico movimiento en forma de dardo y bacilos gram-negativo curvos o espirales, el
cultivo es compatible con H. pylori.
6.
Las pruebas confirmatorias a partir del cultivo puro son las siguientes:
-
Ureasa: positivo fuerte.
Catalasa: positivo
Oxidasa: positivo
Acido sulfhídrico en TSI: negativo (optativo)
Otra prueba muy específica pero no indispensable es la hidrólisis
del indoxil acetato.
INFORME:
1.
Si la observación directa arroja los resultados esperados, informar:
Se observan abundantes bacilos de morfología compatible con
Helicobacter pylori.
2.
Si la prueba de ureasa es positivo fuerte en pocas horas, informar:
Prueba de ureasa rápida: positivo fuerte, muy indicativa de la
presencia de Helicobacter pylori.
3.
Si el cultivo presenta los resultados de observación directa y pruebas
confirmatorias con los resultados esperados, informar:
Se aisló Helicobacter pylori.
77
CAPÍTULO 7
UROCULTIVO
PROPÓSITO:
El cultivo de orina que ha sido colectada adecuadamente o urocultivo se
efectúa para demostrar la presencia de un número significativo de bacterias. En
condiciones normales, la orina dentro del cuerpo es estéril, pero siempre se contamina con bacterias al obtener la muestra. Por esta razón, el criterio para interpretar
el crecimiento es cuantitativo. De acuerdo con el llamado “criterio de Kass”, un
número de bacterias mayor o igual a 100,000 UFC/ml (unidades formadoras de
colonia por mililitro de orina) se considera infección urinaria verdadera, es decir,
es un recuento significativo.
A diferencia de otros cultivos bacteriológicos, las bacterias que causan la
infección urinaria, se limitan a unos pocos microorganismos de crecimiento rápido. Las principales bacterias que infectan el sistema urinario son las enterobacterias
(bacilos gram-negativo). Escherichia coli es sin duda la bacteria que con más
frecuencia se aisla de urocultivos positivos, luego:
Klebsiella spp.
Enterobacter spp.
Proteus spp.
Pseudomonas aeruginosa (no es enterobacteria)
De menor importancia son los cocos gram positivo:
Enterococcus spp.
Streptococcus pyogenes y Streptococcus sp. (raros)
Staphylococcus epidermidis (puede ser contaminación)
Staphylococcus saprophyticus (puede ser contaminación)
Las infecciones mixtas causadas por dos o más especies bacterianas son raras,
por lo que el crecimiento con varios tipos de colonias indica contaminación.
La demostración de la piuria (presencia de leucocitos polimorfonucleares en
el sedimento urinario) y la bacteriuria (bacterias en la orina), son ambos de gran
importancia para establecer el diagnóstico de infección urinaria.
79
80
*Escherichia coli
Chlamydia trachomatis
Staphylococcus saprophyticus
Trichomonas vaginalis (protozoo)
Virus Herpes simplex tipo 2
Candida albicans (hongo)
*Bacilos gram-negativo
Ureaplasma urealyticum
Chlamydia trachomatis
Sintomático: disuria,
frecuencia
Asintomático
Disuria, frecuencia
Agudo: fiebre, calofríos,
dolor de espalda
Tracto urinario
inferior:
cistitis
Uretritis
Prostatitis
Mayor o igual a
100
Mayor o igual a
100
Mayor o igual a
100,000
(criterio de Kass)
Mayor o igual a
100,000
(criterio de Kass)
CONTEO
SIGNIFICATIVO
(UFC/ml)
Tomado de: Pezzlo, M. 1992. Urine Culture Procedure. In: Isenberg, H.D. (Editor in Chief). Clinical Microbiology
Procedures Handbook. Two volumes. American Society for Microbiology. Washington, D.C., USA.
*Escherichia coli
*Otros bacilos gram-negativo
Enterococcus spp.
Staphylococcus coagulasa-negativo
Agudo: fiebre, calofríos, dolor
de cintura posterior, náusea,
vómitos, cilindros leucocitarios, invasión tisular
Crónico: asintomático,
moderado o agudo, lesiones,
cilindros leucocitarios
Tracto urinario
superior:
pielonefritis
* Aislamiento común.
*Bacilos gram-negativo
Staphylococcus coagulasa-negativo
Candida spp. (hongo)
Mycobacterium spp.
Mycoplasma hominis
MANIFESTACIONES
CLÍNICAS
TIPO DE
INFECCIÓN
MICROORGANISMOS
ASOCIADOS CON
LA INFECCIÓN
MANIFESTACIONES CLÍNICAS Y MICROORGANISMOS ASOCIADOS
CON VARIOS TIPOS DE INFECCIONES URINARIAS
TOMA DE LA MUESTRA:
Si en algún examen bacteriológico la toma de la muestra es crucial, para obtener un resultado de cultivo con correlación clínica, es en el urocultivo. El meato
urinario, o sea el agujero de salida de la uretra (tubo que desagua la vejiga), está
siempre colonizado por bacterias saprófitas, tanto en el hombre como en la mujer.
Por esta razón, los genitales deben desinfectarse antes de tomar la muestra, según
se explica a continuación. Tomar la muestra de orina para urocultivo después de
dos horas sin que el paciente haya orinado. Si la muestra se toma antes, la orina no
ha pasado suficiente tiempo en la vejiga, para alcanzar cantidades significativas.
TOMA DE UROCULTIVO EN EL HOMBRE:
1.
Desinfectar bien la punta del pene del paciente con una gasa estéril empapada en jabón antiséptico no irritante. Remover el jabón con otra
gasa estéril, empapada en agua estéril.
2.
Pedir al paciente que orine directamente en la taza del sanitario.
3.
Después de transcurridos unos 3 a 5 segundos, destapar rápidamente
pero con cuidado un frasco estéril de boca ancha y tomar “al vuelo” una
muestra de orina de la parte central de la micción. Se deja correr la
primera porción de orina para que remueva las bacterias de la parte
anterior del meato urinario, que contaminaría el urocultivo. Tapar rápidamente el frasco.
4.
Si no es posible inocular el urocultivo antes de una hora de obtenida la
muestra, refrigerarla (no congelar). La muestra conservada en refrigeración se mantiene en buenas condiciones para ser inoculada, por un
máximo de 48 horas.
TOMA DE UROCULTIVO EN LA MUJER:
En el caso de la mujer, debe observarse especial cuidado en la toma de la
muestra, ya que sus genitales no están expuestos y están abundantemente colonizados por bacterias. Proceder así:
1.
Solicitar a la paciente que se coloque sobre la taza del inodoro con las
piernas abiertas. Con los dedos índice y medio de la mano izquierda
debe separarse los labios genitales mayores.
81
2.
Con una gasa empapada en jabón antiséptico no irritante limpiar bien
toda el área y luego remover el jabón con otra gasa empapada en agua
estéril.
3.
Obtener la muestra de orina “al vuelo” dejando al igual que en el caso
del hombre, que corra el chorro de orina unos segundos y luego tomar
de la porción central de la micción. Tapar rápidamente.
4.
Sembrar antes de una hora o refrigerar la muestra.
TOMA DE UROCULTIVO EN NIÑOS PEQUEÑOS:
Con los niños que aún no saben hablar para comprender instrucciones y
orinar a voluntad, debe procederse así:
1.
En los niños varones desinfectar bien, con jabón antiséptico no irritante,
todo el pene y el área genital. En las niñas desinfectar bien los labios
mayores y el área genital que los rodea. Quitar bien el jabón con gasa y
agua estéril, luego secar finalmente con una gasa estéril seca.
2.
Pegar una bolsita de plástico estéril y descartable, especial para tomar
urocultivos infantiles. En los niños tener la precaución de introducir todo
el pene en el orificio del llenado y en las niñas que el agujero de la
bolsita quede pegado al centro por donde saldrá la orina. Colocar
los pañales en su lugar y fijar la bolsita en su lugar con tiras de
“masking-tape”.
3.
Generalmente se le pide a la madre o a quien lleve al niño al laboratorio,
que espere hasta que orine. Algunos procedimientos que aceleran la
micción son: dar bebidas (agua, leche, etc.), aplicar presión sobre la vejiga. También se puede estimular al niño según el reflejo de Castañeda:
cargar al niño boca abajo con la mano derecha y con el ángulo que forma
el dedo pulgar doblando de la mano izquierda hacer presión en forma
de rayas en la parte baja de la espalda del niño.
PUNCIÓN SUPRA-PÚBICA (PSP):
Es la obtención de la muestra de orina por medio de punción directa a la
vejiga, con una aguja larga. Por ser un procedimiento delicado que conlleva algunos riesgos debe hacerse sólo por el pediatra. Se debe efectuar sólo en estos casos:
82
-
Malformación anatómica que evite la micción normal del niño, causando contaminaciones.
Urocultivo aerobio negativo varias veces, continúan los síntomas, el
sedimento urinario presenta leucocitos y se sospecha de una infección
urinaria causada por bacterias anaerobios.
Nota importante: Jamás introduzca sonda para tomar el urocultivo. Hace varios
años que esta técnica cayó en desuso, pues introduce a la vejiga bacterias que están
colonizando el meato urinario. Recuerde que de ser posible debe tomarse la primera orina de la mañana, generalmente esto no es posible, por lo que debe esperarse
un mínimo de dos horas sin que el paciente orine antes de obtener el urocultivo
para que las bacterias tengan suficiente tiempo para reproducirse hasta números
significativos dentro del sistema urinario.
PROCEDIMIENTO:
1.
Ya que la muestra ha sido colectada siguiendo estrictamente las instrucciones anteriores, sembrar la orina en dos medios de cultivo según la
técnica del asa calibrada usada en la Clínica Mayo (Rochester, Minnesota,
EUA). Los dos medios de cultivo a utilizar son:
Agar sangre de carnero al 5%: crecen la mayoría de bacterias.
MacConkey: crecen sólo bacilos gram-negativo aerobios (enterobacterias) pues es selectivo y diferencial.
Alternativamente usar solamente el medio CLED si el microbiólogo
a cargo conoce su interpretación, la cual puede ser confusa, por lo
que no se recomienda.
2.
Para sembrar, usar una asa calibrada de platino (95% platino, 5% rodio)
que tome 0.001 ml. Agitar el frasco de orina (de preferencia con agitador
“vortex”, abrir delante del mechero y flamear la boca del mismo. Introducir verticalmente el asa flameada y fría
en la orina, justamente por debajo de la
superficie.
3.
Inocular primero el agar sangre deslizando el asa una sola vez a lo largo de la caja
y pasando por el centro. Flamear e inocular en igual forma el MacConkey. Alternativamente, sembrar una biplaca de
agar sangre de carnero y MacConkey, con
83
Agar sangre carnero
MacConkey
Biplaca para urocultivo
Fig. 8 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA UROCULTIVO
Muestra Orina colectada
“al vuelo”
1. Agitar
2. Tomar 0.001 ml
con asa calibrada
de platino,
verticalmente y
justamente por
debajo de la
superficie
Ó
INOCULAR DE RUTINA
BIPLACA
ASC
MacConkey
Medios: 1o: Agar sangre
de carnero (ASC)
2o. MacConkey
3. En ambos medios, primero una
estría longitudinal con asa de
platino calibrada (0.001 ml)
4. Con asa corriente flameada y
fría, estriar perpendicularmente
toda la caja
Idealmente, incubar el agar sangre
en jarro con candela a 36o C
Incubar aeróbicamente a 36o C
84
0.001 ml en cada mitad según la foto. Esto permite el ahorro de cajas
de Petri.
4.
Inmediatamente estriar con asa corriente en anillo el inóculo de orina,
por ambas cajas, haciendo estrías tupidas y perpendiculares a la estría
dejada por el asa calibrada.
5.
Con el objeto de ahorrar cajas de Petri, alternativamente puede usarse
una caja dividida por la mitad o biplaca, con agar sangre de carnero en
un lado y MacConkey en el otro; estriar de la misma manera.
5.
Idealmente, incubar el agar sangre a 36° C en jarro de boca ancha con un
trozo de papel absorbente húmedo y una veladora o candela encendida,
cerrar bien.
6.
Incubar el MacConkey sin jarro en la incubadora a 36° C.
1.
Después de incubar ambas cajas durante 18 a 24 horas, interpretar
resultados de ambas cajas simultáneamente y con buena luz.
2.
Teóricamente cada bacteria origina una colonia en la superficie del medio, pero esto no es estrictamente cierto, pues cadenas o grupos de bacterias también pueden originar una sola colonia. Por esta razón se deben contar y reportar “unidades formadoras de colonias” o UFC. La
cantidad de colonias, en el agar sangre debe ser igual o muy similar en
el MacConkey. Si en el MacConkey crece una enterobacteria, en el agar
sangre también deberá aparecer, es decir, debe haber correlación entre
ambas cajas. De allí se deriva la importancia de interpretar el crecimiento de ambas cajas simultáneamente y de usar un medio selectivo/diferencial y otro rico no inhibidor, cuando se trata de una bacteria grampositivo, sólo crece en agar sangre.
3.
Contar el número de colonias presentes y multiplicar por 1000, si se usó
el asa calibrada de 0.001 ml. Multiplicar por 100 si se utilizó una asa
calibrada de 0.01 ml. Ejemplos con asa de 0.001 ml:
85
No. colonias contadas
25
78
100 en adelante
4.
UFC/ml de orina
25,000
78,000
más de 100,000
En la mayoría de urocultivos positivos, se observa el crecimiento de 100
más o colonias rojas (lactosa-positivo), brillantes pero no mucosas en la
superficie del MacConkey, con correlación en el agar sangre.
En este caso informar presuntivamente:
CLAVE :
(en libro de registros)
TEXTO
DEL INFORME:
E. coli más de 100,000
UFC /ml. S/A (susceptibilidad antimicrobiana)
Se aisló Escherichia coli, más de 100,000 UFC /ml. Infección urinaria verdadera, según el criterio de Kass. S/A.
De una colonia típica, inocular un TSI, LIA, MIO y Citrato de Simmons para
confirmar la identificación presuntiva de E. coli y al mismo tiempo inocular de la
misma colonia y otras idénticas, la prueba de susceptibilidad antimimicrobiana o
antibiograma, según la técnica de Bauer-Kirby descrita. Pueden aislarse cepas de
E. coli fermentadoras lentas de lactosa y deberán identificarse con TSI y LIA, no
presentan diseminación en cepas en el agar sangre.
Si las colonias en el MacConkey son rojas (lactosa positivo) pero mucosas,
informar:
CLAVE:
TEXTO:
Klebsiella-Enterobacter más
de 100,000 UFC /ml. S/A.
Se aisló Klebsiella-Enterobacter más de 100,000 UFC ml. Infección urinaria verdadera, según el criterio de Kass. S/A.
Inocular TSI y susceptibilidad. La diferenciación de estos dos géneros y de las
enterobacterias en general debe hacerse por medio de pruebas bioquímicas, de preferencia con el sistema API-ATB/VITEK (Bio Merièux) o SENSIDENT (Merck).
6.
Si las colonias en MacConkey son lactosa-negativo (incoloras), hay correlación en el agar sangre (donde las colonias son grandes, beta
86
hemolíticas y de color verdoso), y los cultivos huelen a perraje o güipil
nuevo (telas típicas de Guatemala, olor semejante a uvas), inocular para
confirmar TSI y LIA y susceptibilidad, informar:
CLAVE:
TEXTO:
más de 100,000 UFC /ml.
S/A.
Se aisló Pseudomonas aeruginosa, más de 100,000 UFC/ml. Infección urinaria verdadera, según el criterio de Kass. S/A.
Si las colonias son lactosa-negativo (incoloras) en MacConkey, no huelen a
perraje o güipil nuevo, y en el agar sangre de carnero presentan diseminación en
capas, inocular TSI, LIA y urea y susceptibilidad, informar:
CLAVE:
TEXTO:
Proteus sp. más de 100,000
UFC ml. S/A.
Se aisló Proteus sp. más de 100,000 UFC ml. Infección urinaria verdadera, según el criterio de Kass. S/A.
Después de 18 a 24 horas de incubación a 36° C de las pruebas de identificación interpretar para confirmar su reporte inicial con las reacciones en TSI, LIA y
urea según el Capítulo del coprocultivo. Notar reacción roja (R) en la superficie de
LIA y urea positivo para el género Proteus.
8.
Los cocos gram-positivo no crecen en MacConkey, por lo que aparecen
formando colonias sólo en el agar sangre. Para tomarlos en cuenta y
reportarlos como agentes causantes de infección urinaria deben aparecer en cultivos puros en el agar sangre. Identifique así:
Primero notar la presencia de hemólisis alrededor de cada colonia. Hemólisis
es la acción causada por algunas sustancias producidas por las bacterias que destruyen total o parcialmente los eritrocitos del medio. Hay dos tipos de hemólisis,
los cuales se discuten en detalle en el Capítulo 8:
TIPO DE HEMÓLISIS
SE OBSERVA
Alfa
Un halo verde
Beta
Un halo claro, del color del medio
87
Staphylococcus aureus: colonias grandes (1 a 2 mm de diámetro), pueden o no
ser hemolíticas (no importante), a veces presentan pigmento amarillo. Coloración
de Gram: cocos gram-positivo, bien redondos, agrupados en racimos. Identificar
con dos pruebas específicas descritas en el Capítulo 8: coagulasa y manitol-sal.
Inocular prueba de susceptibilidad con discos de antibióticos para gram-positivo
según la tabla del capítulo correspondiente. Staphylocccus epidermidis (coagualasa y
manitol-negativos). Generalmente es contaminante. Tomarlo en cuenta y reportar
sólo si está presente en cantidad significativa y en cultivo puro.
Streptococcus pyogenes: colonias pequeñas (1 mm o menos), la hemólisis es
beta, ésta característica es muy importante. Coloración de Gram: cocos gram-positivo ligeramente alargados y agrupados en cadenas cortas o parejas. Identificación
específica: ver prueba de inhibición por disco de bacitracina en próximo capítulo.
Streptococcus sp. alfa hemolítico, sólo debe tomarse en cuenta si se presenta en
conteos altos y en cultivo puro.
9.
Si no se observa ningún crecimiento a las 24 horas de incubación, descarte las cajas y reporte así los urocultivos negativos:
CLAVE:
TEXTO:
N-24
Urocultivo negativo a las 24 horas de incubación a 36° C.
No se debe perder tiempo y esfuerzo en reincubar los urocultivos rutinarios
hasta las 48 horas, porque las bacterias cuasantes de infección urinaria son aerobios
de crecimiento rápido. En casos especiales pueden efectuase urocultivos para
anaerobios, hongos o micobacterias.
INFORME:
Deben establecerse los siguientes criterios para reportar o no los crecimientos
de los urocultivos así:
88
UFC/ml
CRITERIO PARA REPORTAR
10,000 - 10,000 *
Negativo a las 24 horas de incubación a 36° C
10,000 - 50,000
Sugerir repetir cultivo. Revisar condiciones de toma de muestra y
correlación de leucocitos en el sedimento urinario.
50,000 - 100,000
Se aisló _________ , _____ ,000 UFC/ml. S/A (reportar el número
de UFC contado y la especie bacteriana con su S/A).
100,000 o más
Se aisló_________ , más de 100,000 UFC/ml. Infección urinaria verdadera de acuerdo con el criterio de Kass. S/A.
*30 a 50 por ciento de mujeres con infección vesical y/o uretral con disuria,
urgencia y frecuencia (síndrome uretral agudo) no llenan el criterio de Kass.
En estos casos, 100 UFC/ml de orina debe ser el límite para hacer diagnóstico
correcto, en asociación íntima con el médico tratante. (Según Jacobo Sabbaj K.,
VI Congreso Centroamericano de Microbiología, Guatemala, 5-9 de diciembre de
1983).
DETECCIÓN DE BACTERIURIA POR LA COLORACIÓN
DE GRAM DE ORINA NO CENTRIFUGADA:
En aquellos laboratorios en donde no es posible efectuar urocultivo, este método fácil y barato lo sustituye. La coloración de Gram de orina puede detectar
tanto la presencia de bacterias como de leucocitos. Proceder así:
1.
En un porta-objetos de vidrio (limpio) colocar 10 µl (una gota) de orina
no centrifugada bien mezclada.
2.
Dejar secar al aire, fijar con calor, marcar por detrás con un círculo de
crayón graso y colorear cuidadosamente con Gran.
3.
Observar con aceite de inmersión.
4.
Informar la cantidad de bacterias por campo en inmersión.
5.
La presencia de una o más bacterias por campo de inmersión correlaciona
bien con un urocultivo mayor o igual a 100,000 UFC/ml (criterio de
Kass).
89
6.
La presencia de muchas células epiteliales (citoplasma grande y claro,
núcleo pequeño) y diferentes tipos de bacterias indican contaminación
y el examen debe repetirse.
90
CAPÍTULO 8
CULTIVO DE GARGANTA
PROPÓSITO
El cultivo de garganta, se efectúa para demostrar la presencia de Streptococcus
pyogenes (Streptococcus que pertenece al grupo “A” de Lancefield y es beta hemolítico).
No debe llamarse “orocultivo”, pues este término significa literalmente cultivo de
boca. Algunas otras bacterias mucho menos importantes en infecciones de la faringe,
son:
Haemophilus influenzae
Klebsiella pneumoniae
Otras enterobacterias
Estos microorganismos sólo deben reportarse si predominan sobre la
microbiota normal de la garganta, que es abundante y muy variada.
Streptococcus agalactiae del grupo B y los estreptococos de los grupos C, F y G
de Lancefield también son beta hemolíticos (generalmente presenta poca hemólisis
beta). Pueden ser agentes etiológicos de faringitis, por lo que debe identificarse
adecuadamente.
Los síntomas frecuentemente asociados a infecciones de la faringe por
Streptococcus pyogenes son: dolor de garganta, ganglios linfáticos del cuello agrandados, dolor de cabeza, náusea, vómitos y dolor abdominal. La infección de la
faringe causada por virus provoca tos, secreción nasal y nariz tapada. Sin embargo,
con mucha frecuencia no es posible establecer diagnóstico sólo en base a observaciones clínicas.
MUESTRA:
No es necesario que el paciente esté en ayunas; sin embargo, conviene dejar
pasar 1 a 2 horas para que se vuelva a formar la secreción que fue deglutida. Debe
tomarse siempre antes de iniciar el tratamiento con antibióticos. El cultivo de
garganta debe tomarse con sumo cuidado. Es indispensable examinar bien las le-
91
siones en la garganta del paciente en el laboratorio para tomar la muestra del lugar
preciso. Siga al pie de la letra las siguientes instrucciones:
1.
Colocar al paciente sentado y pedirle que trague saliva fuertemente dos
veces.
2.
Pedir al paciente, viendo hacia arriba que abra la boca, saque la lengua y
diga aahh.
3.
Con un bajalenguas, presionar fuertemente la lengua hacia abajo y
simultáneamente iluminar bien el fondo de la garganta (detrás de la
úvula o campanilla), con una lámpara portátil de baterías o “flash light”.
4.
Localizar en el fondo de la garganta y en las amígdalas (que se encuentran a los lados), las siguientes lesiones:
Inflamación (enrojecimiento)
Pus (secreción blanquecina o amarillenta)
Úlceras blanquecinas
5.
Con un hisopo estéril frotar firmemente las lesiones con sumo cuidado
de no tocar la lengua, la campanilla, la pared interna de los carrillos
(cachetes) o los labios, al retirar el hisopo.
PROCEDIMIENTO:
1.
Inocular inmediatamente una caja (o placa) de agar sangre de carnero
al 5%; hacer dos cortadas en el agar durante la siembra. Las cortadas
deben ser aproximadamente de 1 cm de largo y el asa debe llegar al
fondo de la caja; orientar las cortadas de la orilla de la caja al centro. En
este caso no flamear el asa entre cada estría (ver figura 9, pág. 90). El
propósito de las cortadas es introducir las bacterias dentro del agar para
alejarlos del oxígeno atmosférico y así incrementar la hemólisis tipo beta.
Anteriormente se acostumbraba enriquecer previamente por 2 horas en
caldo Todd-Hewitt, pero los resultados indican que no vale la pena.
2.
Con el objeto de obtener cultivos evidentes de Streptococcous pyogenes,
sin necesidad de hacer sub-cultivos, proceder así:
Con pinza flameada y fría, colocar en la zona de más fuerte
inoculación en el agar sangre de carnero (primera estría), un disco
de 30 mcg de neomicina. A unos 8-10 mm de distancia, colocar un
92
disco de 0.04 unidades de bacitracina. Streptococcus pyogenes y
Streptococcus pneumoniae son resistentes al antibiótico neomicina,
por lo que crecen en cultivo casi puro alrededor de este disco. Como
el disco de bacitracina (también llamado taxo A) se encuentra muy
cerca frecuentemente puede acelerarse la identificación presutiva.
Las colonias que crecen alrededor del disco de neomicina (N-30)
pueden usarse para hacer sub-cultivos y antibiogramas (según:
Maxted, W. R.: J. Clin. Path. 6: 224, 1953).
Este método sencillo que clarifica la interpretación, puede aplicarse para facilitar el aislamiento, y efectuar la identificación
presuntiva rápida de Streptococcus pneumoniae.
3.
Introducir la caja en un frasco de vidrio de boca ancha, poner en el fondo una toalla de papel húmeda, colocar la caja con el medio arriba y
luego introducir sobre una tapa de caja de Petri una veladora o candela
corta encendida. Cerrar el frasco bien, sellarlo con “masking-tape”. La
vela se apagará sola. Es conveniente aplicar (una vez a la semana) un
poco de cera a la boca del frasco y a la rosca interna de la tapadera, para
que sellen bien.
4.
Incubar por 18 a 24 horas a 36° C. Es indispensable el uso del jarro con
candela y humedad, para obtener reacciones hemolíticas correctas. Si
no se usa, la recuperación de Streptococcus pyogenes será mucho menor.
El propósito de usar sangre de carnero en el medio, es aumentar la beta
hemólisis característica e inhibir a Haemophilus haemolyticus que puede confundirse
con Streptococcus pyogenes. Con sangre de carnero se obtiene una excelente diferenciación entre alfa y beta hemólisis, entre otras ventajas (ver pág. 103).
Evitar el uso de sangre humana vencida de banco de sangre en todos los cultivos bacteriológicos ya que puede ser inhibitoria al crecimiento bacteriano por
contener anticoagulantes, anticuerpos o antibióticos, además del peligro potencial
de la transmisión del virus del SIDA, hepatitis B, etc.
No hacer frotes Gram directos de faringe, pues su interpretación es muy difícil debido a lo abundante de la microbiota y no tiene significado clínico.
93
Fig. 9 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA CULTIVO
DE GARGANTA/EXUDADO FARÍNGEO
1.
Muestra: Tomar un
hisopo faríngeo con
buena luz y bajalenguas
Úvula
Amígdala
Farínge
posterior
2. Inocular una caja de agar sangre de carnero por estrías, con dos cortadas
de 1 cm, sin flamear entre cada estría
3. Colocar sobre la primera estría, un disco de bacitracina de 0.04 unidades
y un disco de 30 mcg de neomicina, separados 8-10 mm entre sí
4. Incubar en jarro con candela y humedad a 36o C
Cortada 1
Disco de bacitracina
Disco de neomicina
A
N
30
Cortada 2
5. Después de 18-24 horas de incubación, interpretar con buena luz. Buscar
e identificar colonias beta hemolíticas
94
INTERPRETACIÓN:
La microbiota de la faringe es sumamente variada; predominan Streptococcus
sp. alfa hemolíticos (hemólisis verde) llamados por esta razón “grupo viridans” y
neisserias no patógenas. Estos grupos bacterianos nunca deben reportarse.
Con el objeto de no perderse en la interpretación de este cultivo, que siempre
presenta muchos tipos de colonias, utilice los siguientes criterios:
1.
Tener presente que el patógeno más importante es Streptococcus pyogenes
que es beta hemolítico. Tomar la caja de agar sangre de carnero con la
mano izquierda entre los dedos pulgar y medio sosteniendo por detrás
de la caja con el dedo índice.
2.
Con una lupa en la mano derecha examinar cuidadosamente la caja con
buena luz transmitida (por detrás), según la foto. En primer lugar notar
si hay o no hemólisis beta (clara) en las cortadas (ver fotografía en la
portada de este manual). Si la hay, buscar con cuidado colonias separadas beta hemolíticas pequeñas y brillantes, sospechosas de Streptococcus
pyogenes. Aunque sólo se observe una de estas colonias, debe tomarse
en cuenta.
3.
Con una asa recta estéril y siguiendo la técnica ilustrada en la figura 6,
pág. 46, trasladar una sola colonia típica al centro de otra caja de agar
sangre de carnero. Sólo tocar la superficie del medio rotando el asa (no
pinchar el medio). Luego con una asa en argolla estriar en tres direcciones opuestas y luego colocar con pinzas estériles en el centro del
inóculo un disco de bacitracina de 0.04 unidades (“taxo A”, o “disco B”
según la marca). La bacitracina es un antibiótico originalmente aislado
de Bacillus licheniformis. La prueba presuntiva de la inhibición selectiva por este antibiótico tiende a ser sustituida por otras pruebas. Sin
embargo, se sigue usando debido a su facilidad y alto porcentaje de
exactitud.
4.
Si las colonias beta hemolíticas no están aisladas, hacer una purificación así: con una asa recta o aguja de disección flameada, tomar las colonias beta hemolíticas con cuidado, aunque se tome de otras colonias
que estén muy cercanas o adyacentes. De preferencia hacer esto bajo el
microscopio estereoscópico. Trasladar el inóculo dos o tres veces a un
extremo de una caja de agar sangre de carnero y luego con dos asas en
95
anillo, estriar en toda la caja con dos cortadas, al igual que el cultivo
inicial. Colocar con pinzas estériles un disco bacitracina en el inicio de la
segunda estría.
5.
Tipo de hemólisis
Apariencia de halo
Alfa
Verde (incompleta)
Beta
Claro, del color del medio (completa)
6.
*
Para interpreter correctamente los crecimientos de cultivos de exudados
faríngeos memorizar esta tabla:
Interpretar resultados sólo para Streptococcus beta hemolíticos así:
Inhibición por disco de bacitracina
Reportar
+ (si produce halo),
ver foto abajo
* Se aisló Streptococcus pyogenes beta
hemolítico del grupo “A” de Lancefield.
- (no inhibición)
Streptococcus sp. beta hemolítico no del
grupo “A” de Lancefield (hacer prueba de CAMP).
La inhibición por el disco de bacitracina identifica a S. pyogenes con 95% de certeza. Cualquier
diámetro de halo de inhibición se considera significativo. Efectuar simultáneamente susceptibilidad a un disco de trimetoprim-sulfametoxazol; S. pyogenes es resistente a este antibiótico, lo que
aumenta la certeza de la identificación, junto con la prueba de CAMP negativa (técnica adelante).
Interpretación, con buena
luz transmitida por detrás
del sub-cultivo en agar
sangre de carnero.
Se observa el halo de inhibición del crecimiento
alrededor del disco de
bacitracina (halo oscuro
sin hemólisis).
96
7.
8.
Aparte de las causadas por Streptococcus pyogenes, son raras las infecciones de la garganta ocasionadas por otras bacterias. Reportar las bacterias que se citan a continuación solamente cuando predominan por encima de la microbiota normal. Examinar la última estría que presenta
colonias separadas. Con mucho cuidado y con lupa, observar si hay más
colonias que Streptococcus sp. alfa hemolítico y Neisseria sp., de:
–
Streptococcus pneumoniae (neumococo): coco gram-positivo ovalado o lanceolado, agrupado en parejas. Colonias alfa hemolíticas
aplanadas o ligeramente mucosas (debido a la presencia de cápsula). Al pasarlo a otro agar sangre de carnero es inhibido por el
disco de optoquina “Taxo P” o “Disco N”). Ver tabla adelante en
número 8. Esta bacteria es parte de la microbiota normal de la garganta, en bajas concentraciones.
–
Staphylococcus aureus: coco gram-positivo esférico, en racimos,
coagulasa positivo; crecimiento amarillo en agar manitol-sal. No
causa frecuentemente faringitis como erróneamente se cree.
–
Enterobacterias: principalmente Klebsiella sp., Enterobacter sp. y
Escherichia coli.
–
Pseudomonas aeruginosa: bacilo gram-negativo aerobio, colonias
grandes, generalmente beta hemolíticas con pigmento verdoso y olor
característico. TSI/LIA no viran (no fermentador), y el pigmento
que se nota en la superficie del crecimiento fluorece bajo la luz
ultravioleta.
–
Haemophilus influenzae: bacilo gram-negativo muy corto y fino,
pleomórfico (es decir formas cocobacilares y formas largas juntas).
Crece en agar chocolate con jarro con candela y en agar sangre de
carnero colonias muy pequeñas sólo alrededor de colonias de
Staphylococcus aureus, a lo que se llama ”satelitismo”.
Para diferenciar en cultivo de garganta o en cualquier otro cultivo
bacteriológico (L.C.R., hemocultivo, esputo, secreciones oculares, etc.)
las colonias alfa hemolíticas planas que crecen en el agar sangre de
carnero, memorizar esta tabla:
97
Inhibición por disco de optoquina
Informar
+ (presencia de halo)*
Se aisló Streptococcus pneumoniae
- (no inhibe)
Streptococcus sp. alfa hemolítico **
*
Si se usa un disco impregnado de optoquina de 6 mm de diámetro, se considera significativa una
zona de inhibición sólo si es mayor de 14 mm de diámetro.
**
En cultivo de garganta es microbiota normal, no informarlo.
9.
El cultivo de garganta negativo es aquel que:
no presenta colonias beta hemolíticas
no presenta beta hemólisis en las cortadas
no predomina ninguna de las bacterias citadas
el crecimiento consiste principalmente de colonias alfa hemolíticas no
aplanadas y pequeñas colonias amarillentas que se desprenden fácilmente del agar con el asa (Neisseria, Branhamella.)
Informar cultivos de garganta negativos así:
Clave
Informar
NP
(en libro de registro)
No se aislan patógenos, desarrollan bacterias de
la microbiota normal.
10.
En la garganta pueden existir Streptococcus sp. beta hemolíticos no del
grupo “A” de Lancefield. A los Streptococcus pyogenes del grupo “A” de
Lancefield no se les debe hacer prueba de susceptibilidad, ya que por lo
general son muy susceptibles a la penicilina que es el antibiótico de elección. Por el contrario, a los Streptococcus sp. beta hemolíticos no del grupo “A” de Lancefield sí debe efectuarse prueba presuntiva de susceptibilidad a la penicilina, con un disco del antibiótico en agar sangre de
carnero. Además, debe hacerse la prueba de CAMP para Streptococcus
sp. beta hemolíticos no del grupo “A” de Lancefield. Existen procedimientos de agrupamiento serológico, los cuales pueden usarse dependiendo de los recursos del laboratorio.
98
ETIOLOGÍA Y SINTOMATOLOGÍA DE INFECCIONES
RESPIRATORIAS SUPERIORES
SIGNOS Y SÍNTOMAS
Sinusitis/Rinitis:
BACTERIA POTENCIALMENTE ASOCIADA
Cefalea
Streptococcus pyogenes (grupo A)
Dolor/eritema en región malar
Rayos-X: Consolidación, nivel
de líquido, engrosamiento de la
pared de los senos
Klebsiella spp. y otras enterobacterias
Bacteroides spp. y otros anaerobios (sinusitis)
Garganta y faringe:
Streptococcus pyogenes (grupo A)
Eritema y edema de mucosas
Corynebacterium diphtheriae
Pus en amígdalas
Pseudomembranas
Bordetella pertussis
Edema de la úvula
Lengua con cubierta grisácea
Linfadenitis cervical
IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA DE Streptococcus agalactiae
(GRUPO B). PRUEBA DE CAMP:
1.
Esta bacteria es resistente al disco de 0.04 unidades de bacitracina. Es
indispensable contar con agar sangre de carnero al 5% para hacer la
prueba de CAMP. En una caja de este medio hacer con el asa en argolla
una estría recta a lo largo de toda la caja con una cepa de Staphylococcus
aureus productor de doble zona de beta hemólisis.
2.
Luego con sumo cuidado, hacer una estría con el Streptococccus beta
hemolítico a identificar, perpendicular a la estría de S. aureus pero que
no la toque (A). Generalmente S. agalactiae presenta un halo pequeño de
hemólisis beta, el cual puede disminuir al sub-cultivar.
3.
Incubar en jarro con candela y humedad de 18 a 24 horas a 36° C. Interpretar como Streptococcus agalactiae del grupo “B” de Lancefield si se
produce una “flecha” de intensa beta hemólisis que apunta hacia la estría de Staphylococcus aureus (B).
99
Fig. 10 SIEMBRA E INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA DE CAMP
Strepto.
Strepto.
Flecha
Staph.
Staph.
A. Siembra prueba de CAMP
B. Flecha de beta hemólisis indica
B: prueba de CAMP positiva
4.
Hacer la prueba con un control positivo (cepa conocida de S. agalactiae)
y un control negativo (cepa conocida de S. pyogenes). Estas cepas control
y la cepa de S. aureus de doble zona de beta hemólisis, deben conservarse suspendiendo masivamente cultivos puros en aproximadamente 3
ml de sangre de carnero pura, en tubos estériles y congelar.
5.
Streptococcus agalactiae es un agente etiológico de vaginitis y meningitis
neonatal, por lo que también debe buscarse cultivando en agar sangre
de carnero al 5% las secreciones vaginales y líquidos cefalorraquídeos.
100
Tomado de:
CARACTERÍSTICAS FÍSICAS, HEMATOLÓGICAS
Y QUÍMICAS DE LA SANGRE DE CARNERO
Miguel F. Torres, Q.B., M.A.
La sangre desfibrinada y estéril de diversos animales, se ha utilizado
desde el siglo XIX como enriquecimiento para el cultivo de diversas bacterias
patógenas. El agar sangre como se utiliza hoy en día, fue introducido por
primera vez en Francia en 1903, por Bezançon y Griffon. Posteriormente en
1919, Brown demostró la exactitud de la sangre ovina para clasificar al género Streptococcus según el tipo de hemólisis.
En vista de la comprobada utilidad de la sangre de carnero en la bacteriología del Laboratorio Clínico actualizado, es conveniente conocer las características de la sangre en la especie Ovis aries (oveja/carnero). Para este
propósito, debe compararse con la sangre humana.
La revisión de literatura especializada, indica que el peso específico,
viscosidad relativa, presión osmótica y punto de congelación son idénticos a
la sangre humana.
Las principales características hematológicas de la sangre de carnero
completa, son: hemoglobina 9-15 g/dl (promedio: 11.5); hematocrito 27-45%
(promedio: 35); glóbulos rojos 9-l5 millones/mm3 (promedio: 12); leucocitos
101
4,000-12,000/mm 3 (promedio: 8,000); linfocitos 62%; velocidad de
sedimentación 0.5 mm/hr. Los valores de hemoglobina y hematocrito disminuyen con la edad y se elevan cuando el animal está excitado.
Los glóbulos rojos ovinos son más pequeños que los humanos. La membrana celular de los pequeños eritocitos de carnero es muy susceptible a la
acción de las hemolisinas bacterianas. Esto es especialmente cierto en el caso
de las estreptolisinas O y S de Streptococcus pyogenes. Esta característica aunada a su fragilidad ligeramente mayor en comparación a los eritrocitos humanos, hace que los eritrocitos ovinos sean excelentes indicadores de hemólisis
in vitro.
La sangre de carnero presenta velocidad de sedimentación mucho menor en comparación con la sangre humana. Esta característica es deseable, ya
que los eritrocitos de la sangre desfibrinada, suspendidos en su propio suero
y almacenados en refrigeración durante menos de 21 días, no se compactan
tanto como en el caso de la sangre humana. Esto permite que se preserven
mejor.
Se sabe que el aumento de glucosa en el suero de la sangre desfibrinada
utilizada para enriquecer medios de cultivo sólidos, es inversamente proporcional al diámetro de los halos de hemólisis. Por este motivo su bajo contenido de glucosa es la característica bioquímica que hace a la sangre ovina ideal
para demostrar los amplios y típicos halos de hemólisis alrededor de las colonias productoras de hemolisinas. Los valores normales se encuentran en el
rango de 30 a 57 mg/dl.
El resto de los valores químicos es muy similar a la sangre humana,
excepto en el caso del ácido úrico, que es muy bajo en los carneros. El rango
normal de esta sustancia oscila entre 0.05 y 1.9 mg/dl.
Tomado de:
¿POR QUÉ SANGRE DE CARNERO
EN EL LABORATORIO CLÍNICO?
Por Miguel F. Torres, QB, MA. Guatemala, 1992.
102
VENTAJAS DEL USO DE LA SANGRE DE CARNERO
EN EL LABORATORIO CLÍNICO
La palabra hemólisis deriva del griego ηαιµα (haima=sangre) y λψσισ
(lysis=disolver). Se refiere a la acción de ciertas bacterias sobre los glóbulos
rojos. La ruptura eritrocítica la provocan toxinas protéicas llamadas por su
efecto hemolisinas. Muchas bacterias producen hemolisinas, pero probablemente la única que provoca hemólisis in vivo sea la toxina alfa de Clostridium
perfringens, la cual es una alfa lecitinasa que causa lisis de la lipoproteína de la
membrana celular del eritrocito humano (aparte de la hemólisis causada por
anticuerpos o drogas en presencia de complemento).
En Streptococcus pyogenes, una citolisina thiol-activada, llamada
estreptolisina -O (oxígeno lábil), altera la permeabilidad de la membrana
eritrocítica al unirse con el colesterol. Esto provoca destrucción completa de
los eritrocitos, y su efecto macroscópico es llamado hemólisis beta. La
estreptolisina -S (oxígeno estable) también causa hemólisis beta en presencia
de oxígeno en la superficie del agar sangre. Las reacciones hemolíticas, así
como los crecimientos bacterianos típicos y exuberantes, son fundamentales
en el diagnóstico bacteriológico. Debe usarse sangre de carnero para preparar
el agar al 5% y obtener las siguientes ventajas técnicas:
1
2
3
Debido a que los eritrocitos de la especie Ovis aries (carnero: macho, oveja: hembra y cría: cordero) son sumamente susceptibles a
la acción de las hemolisinas bacterianas, se incrementan considerablemente las hemólisis de tipo beta.
Se evitan reacciones hemolíticas dudosas, que dificultan la interpretación de los cultivos, pues en agar sangre de carnero se diferencian perfectamente las hemólisis verdosas de tipo alfa, de las
reacciones de hemólisis completa tipo beta.
En los cultivos de garganta es muy importante su uso, pues la sangre de carnero por su bajo contenido de nucleótidos de piridina
(factor V) es inhibitoria para Haemophilus haemolyticus, que produce colonias idénticas a Streptococcus pyogenes, por lo que evita
falsos positivos.
103
4
5
La sangre de carnero desfibrinada asépticamente, no contiene
anticoagulantes (como la sangre vencida de Banco), ni anticuerpos
contra las bacterias patógenas del hombre o antibióticos, por lo
que en general permite mejores crecimientos.
Se evita manipular volúmenes considerables de sangre humana,
por lo que se anula el riesgo de contraer SIDA, hepatitis B y otras
infecciones humanas, durante la preparación del agar sangre.
Referencia:
Torres, M.F. 1986. Estandarización de la Bacteriología Médica en Guatemala
(Conferencia magistral). En: Memorias, III Congreso Nacional de
Microbiología, página 20. Guatemala 2-6 diciembre.
104
CAPÍTULO 9
CULTIVOS DE GARGANTA ESPECIALES
PROPÓSITO:
Demostrar por medio de cultivo la presencia de dos bacterias que solamente
deben investigarse en casos especiales y justificados:
1.
Corynebacterium diphtheriae: es la bacteria causante de la difteria. Debe
investigarse solamente en pacientes cuya sintomatología clínica es compatible con esta infección. Los síntomas de la difteria laríngea son: formación de pseudo-membranas (pellejos) de color gris en la garganta,
que sangran mucho al desprenderse, fiebre y el paciente se encuentra
severamente intoxicado (debido a la potente toxina que produce la bacteria). Actualmente en Latinoamérica la difteria es muy rara, debido
a la efectividad de la vacuna llamada “triple” o DPT (difteria, pertusis,
tétanos).
2.
Neisseria meningitidis: es la bacteria causante de severa y muy contagiosa meningitis (infección de las membranas que cubren el cerebro), y por
lo tanto se investiga principalmente en líquido cefalorraquídeo. Su presencia debe investigarse por cultivo de garganta en parientes, médicos,
enfermeras, o técnicos de laboratorio que han estado en contacto directo
con pacientes (generalmente niños) con meningitis meningocóccica. A
estas personas se les llama “contactos”. El propósito fundamental es
erradicar la bacteria de la garganta de los contactos con tratamiento
antibiótico adecuado, para evitar la diseminación de la infección que
puede llegar a ser epidémica.
INVESTIGACIÓN DE Corynebacterium diphtheriae:
MUESTRA Y PROCEDIMIENTO:
El diagnóstico de la difteria es primordialmente clínico. De ninguna manera
es aceptable que el médico delegue esta responsabilidad en el laboratorio de
microbiología, por medio de un frote de exudado faríngeo coloreado con Gram.
C. diphtheriae es un bacilo gram-positivo en forma de “maza” (un extremo más
105
ancho que otro). En el frote Gram de material tomado directamente de las
pseudo-membranas de la garganta. No puede diferenciarse de otros “difteroides”
de igual morfología.
Proceder a tomar la muestra así:
1.
Debe contarse con buena iluminación (lámpara portátil de mano), para
poder examinar bien la garganta. Deprimir la lengua con bajalenguas
de madera estéril, y buscar áreas necróticas o grisáceas (pseudo-membranas). Con un hisopo estéril, frotar firmemente las lesiones descritas.
Retirar el hisopo de tal manera que no toque las paredes internas de los
carrillos, ni la lengua.
2.
Inocular con el hisopo, un tubo de medio inclinado de Loeffler (suero
animal más caldo glucosado, coagulado). Este medio debe ser color crema pálido. Incubar aeróbicamente a 36° C durante 18 a 24 horas.
3.
Tomar de nuevo muestra con otro hisopo, e inocular una caja de agar
chocolate-telurito de potasio. Incubar aeróbicamente a 36° C por 18 a 24
horas.
4.
Tomar un tercer hisopo de las pseudo-membranas, e inocular directamente una caja de agar sangre de carnero al 5%, con cortadas, para investigar la presencia de Streptococcus pyogenes. Incubar en jarro húmedo
con candela a 36° C.
El objeto del medio de Loeffler es permitir que C. diphtheriae crezca más
abundantemente que la microbiota de la garganta, sólo durante las primeras
ocho horas de incubación, y sobre todo con su morfología típica.
Proceder así:
1.
Después de incubar el tubo de Loeffler solamente de dos a ocho horas a
36° C, preparar dos frotes del leve crecimiento. Al efectuar los frotes,
tratar de remover lo menos posible el escaso crecimiento al suspenderlo
en una pequeña gota de agua, pues es necesario preservar la forma de
agrupación típica de C. diphtheriae.
106
2.
Colorear un frote con Gram. Fijar el otro frote con calor leve a la llama, y
teñirlo un minuto con azul de metileno de Ziehl-Neelsen.
3.
Buscar en el frote Gram: bacilos gram-positivo pleomórficos y en forma
de maza. Se agrupan en forma de “letras chinas” o en ángulos en forma
de “V” o “Y”. No se agrupan en empalizadas (paralelos) como otros
difteroides.
4.
En el frote coloreado con azul de metileno, se observa el mismo tipo de
agrupación y además coloración discontinua en forma de bandas azules causada por los corpúsculos metacromáticos de polimetafosfato, que
son reservas alimenticias de la bacteria.
5.
Después de 18 a 24 horas de incubación, C. diphtheriae forma en el medio
agar chocolate-telurito colonias de color negro intenso. Un frote Gram
de estas colonias revela bacilos gram-positivo pleomórficos. No descartar como negativo antes de 48 horas de incubación. Si la morfología de
las colonias negras no es muy típica en el agar chocolate-telurito, pero si
las hay en el Loeffler, hacer un pasaje de una asada del crecimiento en
Loeffler a otra caja de chocolate-telurito para confirmar.
6.
C. diphtheriae es catalasa y nitratos positivo. Para efectuar estas pruebas,
subcultivar las colonias negras del chocolate-telurito, a agar sangre de
carnero. Al obtener cultivo puro con morfología compatible en Gram,
suspender sobre un porta objetos una asada del crecimiento en una gota
de agua oxigenada, y observar la aparición de burbujas de oxígeno. Debe
tenerse la precaución de tomar solamente del crecimiento y no del medio de cultivo, pues sangre o suero dan reacciones positivas falsas de
catalasa. La prueba de reducción de nitratos a nitritos, puede hacerse en
caldo nitratado, si se cuenta con él y los reactivos necesarios, pero no es
indispensable.
INFORME:
1.
Si la morfología del crecimiento en Loeffler (incubado sólo de 2 a 8 horas) es muy típica, y no se cultivó en chocolate-telurito, informar:
Se aisló un bacilo gram-positivo, de morfología compatible con
Corynebacterium diphtheriae.
107
2.
Si la morfología microscópica del crecimiento en Loeffler es típica y hay
colonias negras en chocolate-telurito, reportar:
Se aisló Corynebacterium diphtheriae. Identificación preliminar,
pendiente de demostrar la producción de toxina in vitro o in vivo.
INVESTIGACIÓN DE Neisseria meningitidis
EN CULTIVOS DE GARGANTA DE CONTACTOS:
MUESTRA Y PROCEDIMIENTO:
Neisseria meningitidis sobrevive pobremente en el medio ambiente y su único
hospedero es el hombre, por lo tanto los portadores humanos son el principal
reservorio. La transmisión ocurre por contacto directo con secreciones respiratorias, o por pequeñas gotas suspendidas en el aire, que acarrean la bacteria. El porcentaje promedio de portadores de N. meningitidis en la orofaringe y nasofaringe es
de 5 a 15 por ciento, y usualmente sólo durante algunas semanas en cada individuo. En un pequeño porcentaje de personas, la bacteria se disemina de la nasofaringe
hasta el torrente circulatorio, y produce meningococcemia, meningitis, o ambas.
Además de los síntomas de meningitis, en el 75 por ciento de los casos, hay profundos efectos vasculares, que provocan petequias o exantema purpúrico, lo que ayuda al diagnóstico clínico, que debe ser confirmado siempre por Bacteriología.
El cultivo de garganta/nasofaringe para el aislamiento de N. meningitidis, debe
obtenerse exclusivamente de “contactos” (personas que han tenido contacto directo con algún paciente en el cual se ha demostrado la presencia de la bacteria en su
líquido cefalorraquídeo). Se logra mayor porcentaje de aislamientos si la muestra
se obtiene de la nasofaringe en lugar de la garganta. De ninguna manera es un
procedimiento de rutina.
Proceder así:
1.
Con hisopo estéril y buena iluminación, frotar firmemente el fondo de
la garganta. Si es posible, usar un hisopo largo y curvo, que llegue lo
más profundo posible. Con otro hisopo delgado y curvo, tomar muestra
de la nasofaringe (por la nariz).
2.
Con cada hisopo por separado, inocular un tubo del medio ThayerMartin; estriar bien la superficie del medio con el mismo hisopo.
108
3.
Introducir los tubos, con el tapón de rosca ligeramente flojo, dentro
de un jarro con candela encendida y humedad. Incubar por 18 a 24
horas a 36° C.
INTERPRETACIÓN:
1.
Después del período de incubación, observar el crecimiento de colonias
pequeñas, grises, brillantes y ligeramente mucosas.
2.
Con el asa en hilo, y con mucho cuidado, hacer un pequeño frote Gram
de las colonias sospechosas; deben observarse diplococos gram-negativo en forma de “granos de café”, agrupados en parejas.
3.
Para obtener un cultivo puro, subcultivar las colonias que presentan esta
morfología microscópica a una caja de agar chocolate (sin inhibidores),
e incubar en jarro con candela por 18 a 24 horas.
4.
Efectuar la prueba de oxidasa, ya sea agregando el reactivo directamente sobre la caja, o frotar las colonias con palillo de madera sobre discos
húmedos con el reactivo de oxidasa. La aparición de coloración morado
oscuro-negro, indica una prueba positiva. Si este es el caso, proceder a
efectuar la prueba de oxidación de maltosa y sacarosa, según se indica
en el capítulo de secreciones genitales. N. meningitidis oxida la maltosa,
pero no la sacarosa (sucrosa). Neisseria lactomica que también crece en el
medio Thayer-Martin y tiene interés clínico, debe identificarse con la
oxidación positiva de la lactosa.
5.
Desde el punto de vista epidemiológico, es muy conveniente saber a
cual grupo pertenece el aislamiento (A,B,C,D,X,Y,Z, y otros). Por este
motivo, si el laboratorio no cuenta con los antisueros de tipificación,
debe remitir el cultivo en agar chocolate (bien sellado) al laboratorio
nacional de referencia correspondiente.
INFORME:
Si todas las pruebas anteriores son positivas, y se está seguro que no se trata
de una Neisseria sp. o Branhamella catarrhalis, tan frecuentes en la microbiota normal de la garganta, informar: Se aisló Neisseria meningitidis.
Si se cuenta con los antisueros de tipificación, realícela e informe:
Se aisló Neisseria meningitidis del grupo __. (según el que haya aglutinado)
109
Fotografías
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FOTOGRAFÍAS
Foto 1. Listeria monocytogenes, en contraste de fases. Los bacilos aparecen incoloros y
brillantes . No es una coloración, ésta técnica de observación en fresco proporciona
excelente contraste. Foto: CDC, Atlanta, Georgia, EUA.
Foto 2. Listeria monocytogenes, coloración de Gram. Aislamiento de líquido
cefalorraquídeo. Bacilos regulares de coloración sólida. Presentan el típico color morado
negruzco las bacterias gram-positivo. Foto: Walter Reed Institute, Washington, D.C.,
E.U.A.
Foto 3. Staphylococcus aureus, coloración de Gram de cultivo puro obtenido de secreción
de herida infectada. Son cocos esféricos de una micra de diámetro, agrupados en forma
de racimos. Foto: Walter Reed Institute, Washington, D.C., E.U.A.
Foto 4. Streptococcus pyogenes, frote Gram de secreción de oreja necrótica. Presenta
abundantes cocos gram-positivo pequeños y ligeramente ovalados, sueltos, en parejas
y cadenas cortas. Infección infantil mortal, Laboratorio de Microbiología, Hospital
General del IGSS zona 9, agosto de 1982. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 5. Streptococcus pneumoniae, frote Gram de esputo purulento de paciente con
neumonía lobar. Imagen típica de esta bacteria: cocos gram-positivo agrupada en
parejas. Foto: Institut Pasteur, París, Francia.
Foto 6. Streptococcus pneumoniae, frote de sedimento de líquido cefalorraquídeo (LCR)
de paciente con meningitis grave. Presenta abundantes cocos gram-positivo ovalados;
se insinúa la cápsula como un halo claro difuso alrededor de las células. Aparecen dos
leucocitos polimorfonucleares (gram-negativo). Foto: Rubén Mayorga Peralta,
Guatemala.
Foto 7. Escherichia coli, frote Gram de cultivo puro obtenido de urocultivo positivo.
Bacilos gram-negativo, regulares, de coloración sólida y bordes redondeados. Esta
morfología es típica en las enterobacterias. Foto: Walter Reed Institute, Washington,
D.C., E.U.A.
Foto 8. Bacteroides fragilis, coloración de Gram de cultivo puro. Presenta coloración rojo
pálido (típica de los anaerobios gram-negativo) y pleomorfismo. Foto: Anaerobe
Laboratory, Virginia Politechnic Institute, Blacksbourg, E.U.A.
Foto 9. Shigella flexneri, Salmonella enteritidis y Escherichia coli en Agar Hektoen Enterics.
Este medio selectivo para bacilos gram-negativo, brinda buena diferenciación. Las
colonias de bacterias lactosa-positivo como E. coli presentan color salmón; las lactosa-
117
negativo como Shigella spp. dan colonias puntiformes color verde pálido. Las colonias
productoras de ácido sulfhídrico como Salmonella spp. manifiestan color negro en la
colonia. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 10. Arizona hinshawii y Escherichia coli en MacConkey (izquierda) y Hektoen
(derecha). Cultivo mixto de miositis necrotizante severa en un paciente pediátrico,
Hospital General del IGSS zona 9, 1982. Este cultivo semeja un coprocultivo positivo a
Salmonella enteritidis. En MacConkey las colonias lactosa-positivo son rojas y las lactosanegativo incoloras. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 11. Reacciones típicas de Salmonella enteritidis en TSI/LIA. TSI (abajo): superficie
alcalina (rojo), fondo ácido (amarillo, oculto por el precipitado negro), presenta
abundante gas (burbuja y fondo separado) y ácido sulfhídrico (negro). El LIA (arriba)
es alcalino/alcalino (violeta), lo que indica descarboxilación del aminoácido lisina,
también presenta precipitado negro debido al ácido sulfhídrico. Foto: CDC, Atlanta,
E.U.A.
Foto 12. Reacciones típicas de Shigella flexneri en TSI/LIA. TSI (abajo): superficie alcalina
(rojo), fondo ácido (amarillo), no presenta gas ni ácido sulfhídrico. El LIA (arriba) es
alcalino/ácido (K/A), sin gas ni ácido sulfhídrico. En Shigella spp. frecuentemente el
color del fondo de ambos tubos es amarillo canario y el TSI huele a semen. Foto: Miguel
F. Torres, Guatemala.
Foto 13. Reacciones de tres enterobacterias en TSI. De izquierda a derecha: medio no
inoculado (K/K), Escherichia coli (A/A,++,-), Salmonella enteritidis (K/A, +,+++) y
Salmonella typhi (K/A,-,+poco). Foto: CDC, Atlanta, E.U.A.
Foto 14. Vibrio cholerae 01 en agar TCBS. Cultivo de heces de paciente guatemalteco con
cólera enriquecido en agua peptonada alcalina (APA), luego sembrada en TCBS.
Colonias típicas: grandes, aplanadas y amarillas (sacarosa-positivo). Foto: Miguel F.
Torres, Guatemala.
Foto 15. Efecto del enriquecimento de coprocultivo en APA para el aislamiento de
Vibrio cholerae 01. Izquierda: cultivo en TCBS de enriquecimiento en APA, muestra
crecimiento puro y masivo. Derecha: cultivo de heces sembradas directamente en TCBS,
sin enriquecimiento, presenta crecimiento más escaso de cultivo mixto. Foto: Miguel F.
Torres, Guatemala.
Foto 16. Prueba de susceptibilidad según el método de Bauer-Kirby. El biotipo eltor de
Vibrio cholerae 01 es resistente al disco de 50 UI de Polimixina-B, que se observa en el
centro. Fotografía: Miguel F. Torres, previamente publicada en Torres, M. et al. 1991.
Etiología y Diagnóstico de Laboratorio de el Cólera. OPS/OMS, Guatemala.
118
Foto 17. Urocultivo positivo a Klebsiella pneumoniae, más de 100,000 UFC/ml, en agar
MacConkey sembrado con de 0.001 ml de orina con asa calibrada de platino. Muestra
colonias grandes y muy mucosas debido a la presencia de cápsula. Foto: Miguel F.
Torres, Guatemala.
Foto 18. Urocultivo positivo a Escherichia coli, más de 100,000 UFC/ ml, en agar
MacConkey. Esta imagen es la más frecuente en urocultivos positivos. Las incontables
colonias son rojas, brillantes y de bordes enteros. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 19. Streptococcus pyogenes, sub-cultivo sobre agar sangre de carnero al 5%, con un
disco de bacitracina. Este cultivo fué incubado en jarro húmedo con candela a 37 grados
centígrados por 24 horas. Se observa claramente la inhibición del crecimiento provocada
selectivamente por este antibiótico, como un halo rojo (sin destrucción de los eritrocitos
ovinos) alrededor del disco. En el crecimento de esta bacteria se observa intensa
hemólisis de tipo beta. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 20. Streptococcus pyogenes, prueba de CAMP negativa; siembra sobre agar sangre
de carnero. Las estrías verticales de Staphylococcus aureus de doble zona de beta hemólisis
presentan crecimiento blanco. Las estrías perpendiculares de varias cepas de S. pyogenes
son beta hemolíticas, pero la hemólisis no se incrementa en forma de flecha donde el
crecimiento de ambas bacterias se acerca sin tocarse. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 21. Crecimiento de Streptococcus pneumoniae, cultivo de LCR en agar sangre de
carnero. Las colonias típicas son pequeñas, redondas, planas, de bordes enteros y
francamente alfa hemolíticas. Las colonias jóvenes son elevadas; a medida que el cultivo
envejece, las colonias se aplastan y su centro se deprime debido a la acción de enzimas
autolíticas; esto no ocurre con otros estreptococos viridans.La típica hemólis alfa se
incrementa al incubar en microaerofilia con jarro húmedo con candela. Foto: Miguel F.
Torres, Guatemala.
Foto 22. Sub-cultivo del crecimiento original de la foto anterior con disco de optoquina.
El halo de inhibión mayor de 14 mm de diámetro, identifica presuntivamente a
Streptococcus pneumoniae. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 23. Cultivo de esputo en agar sangre de carnero, de paciente guatemalteco con
neumonía lobar causada por Streptococcus pyogenes. Las cepas muy virulentas que
poseen cápsula gruesa, presentan colonias mucosas como las de éste caso. Las colonias
confluentes presentan la típica hemólisis tipo alfa. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 24. Sub-cultivo del crecimiento mucoso de la foto anterior, con un disco de
optoquina. Se observa un amplio halo de inhibición del cultivo por el hidrocloruro de
119
etil cupreína (optoquina, derivado de la quinina). Las cepas mucosas dan también las
reacciones típicas de inhibición y alfa hemólisis. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 25. Haemophilus influenzae, prueba de satelitismo de sub-cultivo de aislamiento de
LCR. Paciente guatemalteco de un año con meningitis mortal. H. influenzae crece sólo
muy cerca de la estría de Staphylococcus aureus. En el agar sangre de carnero el factor V
(nucleótidos de piridina o nicotinamida adenina dinucleótido) se encuentra dentro de
los eritrocitos, el factor X (hemina) sí se encuentra libre en el medio. S. aureus libera
factor V, por lo que causa satelitismo de ciertos Haemophilus spp. Foto: Miguel F. Torres,
Guatemala.
Foto 26. Shigella dysenteriae tipo 1 (Bacilo de Shiga). Prueba de susceptibilidad según el
método de Bauer-Kirby, de una cepa aislada en INCAP (Instituto de Nutrición de
Centroamérica y Panamá, Guatemala) durante la epidemia de shigellosis 1969-70. Foto:
Leonardo J. Mata, Costa Rica.
Foto 27. Demostración del método para preparación de frotes de esputo entre dos portaobjetos. M. Torres y sus estudiantes en el curso Bacteriología II, Laboratorio de
Microbiología, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, USAC, 1979. Foto: anónima.
Foto 28. Mycobacterium tuberculosis en frote de esputo coloreado con la técnica de ZiehlNeelsen. Los bacilos alcohol-ácido resistentes aparecen teñidos de color rojo. La
coloración de Kinyoun da los mismos resultados. Foto: Gillies R.R. y T.C. Dodds,
Inglaterra.
Foto 29. Colonias de Mycobacterium tuberculosis, acercamiento con microscopio
estereoscópico. Este tipo de colonias rugosas y de bordes irregulares, son llamadas
“eugónicas”. No presentan pigmento. Foto: CDC, Atlanta, E.U.A.
Foto 30. Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, con factor cordón. Las cepas más virulentas
de M. tuberculsis manifiestan esta característica. Se observa el crecimiento en forma de
cordones sinuosos. Foto: Rubén Mayorga Peralta.
Foto 31. Mycobacterium kansasii, crecimiento eugónico en el medio de Lowenstein-Jensen.
Fué cultivado en la oscuridad por varias semanas, con el tubo cubierto por papel negro
de manera que no tuviera contacto con la luz. No presenta pigmento. Foto: CDC, Atlanta,
E.U.A.
Foto 32. Mycobacterium kansasii, cultivo en Lowenstein-Jensen después de exposición a
la luz. Es fotocromógeno, es decir que presenta pigmento anaranjado fuerte sólo en
presencia de luz. Foto: CDC, Atlanta, E.U.A.
120
CAPÍTULO 10
CULTIVO DE ESPUTO
PROPÓSITO:
Demostrar por medio de frote coloreado con Gram y cultivo, la presencia de
bacterias causantes de infección respiratoria inferior. La neumonía bacteriana, o
infección del pulmón causada por bacterias puede ser de dos tipos:
a.
b.
Neumocóccica: causada por Streptococcus pneumoniae.
No neumocóccica: causada por Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus
aureus, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae, y ocasionalmente
por otras bacterias.
MUESTRA:
La infección bacteriana de tráquea y bronquios produce abundante esputo.
Debe obtenerse el primer esputo de la mañana, pues es más espeso y no está contaminado por comida. Indicar al paciente que al despertar, se enjuague la boca con
agua corriente (sin usar antisépticos ni pasta dental) y luego acostado en su cama
(boca abajo) debe desgarrar esputo con fuerza, y depositarlo directamente en un
recipiente estéril de boca ancha proporcionado por el laboratorio. Para este propósito, el laboratorio debe contar con recipientes estériles de plástico, descartables. Si
no se cuenta con este material, deben esterilizarse suficientes frascos de vidrio,
pequeños y de boca ancha.
En el caso del cultivo de esputo, para obtener resultados confiables, es crucial
la obtención de una buena muestra. Si el cultivo se efectúa de material inadecuado
como saliva, el resultado confundirá al médico tratante porque no se detectó el
verdadero patógeno, o se recuperó de la microbiota de la saliva un patógeno potencial que no es el agente etiológico primario de la neumonía. Por este motivo, el
laboratorio deberá rechazar sin vacilar las muestras que se consideren insatisfactorias, según los criterios que aparecen más adelante.
Aproximadamente 1 a 3 ml de esputo mucopurulento son suficientes para
efectuar el frote Gram y cultivo de rutina, pero son insuficientes para el cultivo de
121
micobacterias (BK). Si la muestra no se va a procesar de inmediato, debe refrigerarse
por no más de tres horas.
Debe ponerse atención en el color, olor y consistencia del esputo. Las muestras hialinas y completamente líquidas deben rechazarse de inmediato pues no son
esputo, son saliva. Una muestra de esputo muy tenaz y adherente puede indicar la
presencia de Klebsiella pneumoniae. Mal olor indica la presencia de anaerobios, pero
el esputo nunca debe cultivarse para anaerobios, pues siempre van a estar presentes por el paso de la muestra a través de la boca, donde son muy abundantes. En
caso de sospecharse infección pulmonar por anaerobios, debe obtenerse muestra
por punción trans-traqueal.
Al laboratorio pueden remitirse otras muestras que provienen del aparato
respiratorio inferior, las cuales se procesan de manera similar al esputo, en busca
de las mismas bacterias y además anaerobios (en caldo tioglicolato). Estas muestras obtenidas por técnicas invasivas, siempre son obtenidas por el médico
neumólogo: aspirado traqueal, lavado bronquial, cepillado bronquial, biopsia bronquial, lavado bronco-alveolar, aspirado trans-traqueal, aspirado pulmonar, y biopsia
pulmonar. Al procesar estas muestras, que frecuentemente son pequeñas, debe tomarse en cuenta su importancia y la dificultad de su obtención, por lo que con
frecuencia son imposibles de repetir.
EL FROTE GRAM DE ESPUTO:
En primer lugar debe procederse a evaluar la calidad de la muestra, es decir
determinar si es adecuada y confiable para ser cultivada o no. Proceder así:
1.
Vertir asépticamente el esputo en una caja de Petri estéril y colocarla
sobre un fondo obscuro.
2.
Quebrar los extremos de dos aplicadores de madera estériles. Con ayuda de las puntas irregulares, seleccionar las partículas anormales: con
pus (blanquecino), o sangre (rojizo).
3.
Con cuidado, colocar la partícula anormal en el extremo de un
porta-objetos. Con otro porta-objetos, presionar la muestra varias veces
a manera de “cortar” el esputo, y luego deslizar ambos porta-objetos
uno sobre otro, para obtener dos frotes delgados.
4.
Seleccionar el mejor de los dos frotes. Dejar secar, y luego fijar con calor
122
sobre el mechero. Colorear el frote seleccionado con Gram y el otro con
Ziehl-Neelsen, si así fue solicitado por el médico.
5.
Observar varios campos en el microscopio con un aumento de 100X (seco
débil).
Descartar el esputo si presenta:
a.
b.
Más de 10 células epiteliales/campo, y
Menos de 25 leucocitos/campo (criterio de la Clínica Mayo, de
Murray y Washington, y de Van Scoy).
En el verdadero esputo, se observan en fresco abundantes leucocitos y
macrófagos alveolares.
6.
Si el esputo es aceptable para ser cultivado, ponerle una gota de aceite y
observarlo con lente de inmersión, según los siguientes criterios.
INTERPRETACIÓN DEL FROTE GRAM DE ESPUTO:
1.
Al interpretar un frote de esputo coloreado con Gram, debe tenerse en
cuenta que esta muestra siempre va a presentar bacterias de la microbiota
de la boca. Sin embargo, deben reportarse cuantitativamente todas las
bacterias observadas, según los criterios que aparecen en este manual,
en la técnica e informe de la coloración de Gram.
2.
No debe sobre interpretarse la presencia de bacterias. Es muy importante detectar y reportar principalmente el tipo de bacterias que predomina. Los cocos gram-positivo usualmente se localizan alrededor de las
células epiteliales.
3.
El predominio de un tipo de bacterias, permite distinguir simple colonización de infección verdadera. El médico debe relacionar estos datos
con las observaciones clínicas.
4.
La morfología bacteriana observada en el esputo nunca identifica la
especie (Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, etc.), el hacerlo causa errores en el tratamiento del paciente. Sin embargo, la presencia de
abundantes cocos gram-positivo lanceolados, solos, en pares o cadenas
cortas, cuya cápsula se insinúa pero no se tiñe con Gram, y abundantes leucocitos polimorfonucleares, permite sospechar la presencia
123
de Streptococcus pneumoniae (neumococo) como agente causante de la
neumonía.
5.
Observar cuidadosamente la presencia de pequeños cocobacilos gramnegativo (Haemophilus influenzae), hongos filamentosos que son grampositivo, y filamentos gram-positivo delgados y ramificados (Nocardia
asteroides o Actinomyces israelii). Los hongos intracelulares deben detectarse con la coloración de Giemsa.
6.
Los cristales de Charcot-Leyden, que provienen de los gránulos de los
eosinófilos, son alargados y terminados en punta. Deben reportarse si
se observan.
CULTIVO DE ESPUTO:
El esputo vertido en una caja de Petri estéril (para poder seleccionar mejor la
fracción de la muestra a analizar), debe procesarse así:
1.
Seleccionar con las puntas irregulares de dos aplicadores estériles de
madera, las partículas anormales (con pus y/o sangre). Pasar estas partículas y unirlas en un espacio seco de la caja de Petri.
2.
Tomar la muestra seleccionada con el asa en argolla (flameada y fría) y
estriar con cortadas en la superficie de una caja de agar sangre de carnero al 5%.
3.
Si aún queda muestra de la partícula seleccionada, inocular una caja de
MacConkey. Si esto no es posible, seleccionar otra partícula anormal.
4.
Si el frote coloreado con Gram indica la posible presencia de Haemophilus
influenzae, debe inocularse también agar chocolate.
5.
Incubar el agar sangre de carnero y el agar chocolate en jarro húmedo
con candela, y el MacConkey aeróbicamente, por 18 a 24 horas a 36° C.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS E INFORME:
1.
Examinar las cajas simultáneamente, con lupa y buena luz o microscopio estereoscópico. En primer lugar, buscar en el agar sangre de carnero
colonias de Streptococcus pneumoniae, con las siguientes características:
124
alfa hemolíticas (hemólisis verdosa), planas (deprimidas en el centro y
con los bordes ligeramente más elevados), brillantes, transparentes, y
pequeñas (menos de un milímetro de diámetro). Algunas veces las colonias de S. pneumoniae no son típicas, y pueden ser grandes (hasta 4 mm),
convexas y muy mucosas (debido a la cápsula). Siempre presentan la
hemólisis verdosa (alfa) característica.
2.
Con la técnica ya indicada para sub-cultivar Streptococcus beta hemolítico
en cultivos de garganta, trasladar con el asa en hilo, una o dos colonias a
una caja de agar sangre de carnero. Estriar en varias direcciones, y con
pinzas flameadas colocar en el centro un disco de optoquina (Taxo “P” o
disco “O”). Incubar en jarro con candela a 36° C por 18 a 24 horas, e
interpretar así:
a.
b.
Inhibición positiva (si hay halo); sólo se considera significativa una
zona de inhibición mayor de 14 mm de diámetro. Reportar: Se aisló Streptococcus pneumoniae.
Inhibición negativa (no hay halo); se trata de un Streptococcus alfa
hemolítico (grupo viridans), no debe reportarse pues es microbiota
normal.
Se ha demostrado que aproximadamente en el 45 por ciento de pacientes con
neumonía neumocóccica, no se aísla la bacteria responsable. Por este motivo, un
cultivo de esputo negativo, no descarta definitivamente la presencia de esta infección.
3.
Buscar colonias beta hemolíticas en el agar sangre de carnero. Si las hay,
proceder de acuerdo con las recomendaciones para la identificación de
Streptococcus pyogenes en el capítulo de cultivo de garganta. No efectuar
antibiograma a esta bacteria, por su susceptibilidad prácticamente uniforme a la penicilina, que es el tratamiento de elección.
4.
Haemophilus influenzae crece bien en agar chocolate, presenta colonias
pequeñas (frecuentemente menos de un milímetro de diámetro), brillantes y circulares. En agar sangre de carnero crece solamente alrededor de las colonias de otras bacterias (Staphylococcus aureus, etc.), a lo
que se conoce como satelitismo natural, el cual de preferencia, pero no
necesariamente, debe observarse con microscopio estereoscópico. Si hay
duda, sub-cultivar en otra caja de agar sangre de carnero, con una estría
de Staphylococcus aureus , para observar el satelitismo artificial (creci125
miento sólo muy cerca de la estría de S. aureus). El frote Gram del crecimiento de las pequeñas colonias satélites presenta predominio de
cocobacilos gram-negativo, con algunas formas filamentosas. Es oxidasapositivo.
5.
Buscar en el MacConkey colonias lactosa-positivo (rojo-rosado) mucosas
(bacterias capsuladas), indicativas de la presencia de Klebsiella
pneumoniae. Si el crecimiento predominante son este tipo de colonias
grandes, francamente mucosas, trasladar con el asa en hilo a TSI, LIA,
MIO, urea y citrato e interpretar según las indicaciones en el capítulo de
coprocultivo. Si las pruebas son compatibles, reportar:
Se aisló Klebsiella pneumoniae.
6.
En el caso de Streptococcus pneumoniae: debe efectuarse prueba de susceptibilidad antimicrobiana a la penicilina. Cada vez aparecen más reportes en la literatura de cepas de S. pneumoniae resistentes a penicilina
por la producción de beta lactamasa. Hacer la prueba para determinar
la susceptibilidad a la penicilina en agar Mueller-Hinton + 5% de sangre
de carnero en jarro con candela, con un disco de 1 µg de oxacilina; se
interpreta como susceptible la presencia de un halo de inhibición mayor
o igual a 20 mm (NCCLS, M100-56, 1995). Si es posible, detectar la producción de beta lactamasa por un método confiable. En el caso de
Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, otras
enterobacterias o Haemophilus influenzae (en este caso en agar chocolate), sí efectuar prueba de susceptibilidad.
7.
Debe tomarse en cuenta que en los cultivos de esputo, rara vez se obtienen cultivos puros. Identificar otras bacterias que pueden causar neumonía humana, solamente si su crecimiento predomina.
8.
El cultivo de esputo para aislar Legionella pneumophila, debe efectuarse
por procedimientos especiales, y sólo en casos plenamente justificados.
Para este propósito, deberá consultarse literatura especializada.
9.
Si en la interpretación del cultivo de esputo no se toman en cuenta los
criterios anteriores, es un examen inútil que puede conducir a graves
errores en el tratamiento del paciente. Si no se aisla S. pneumoniae o S.
pyogenes (aunque sea escaso), u otras bacterias predominantes sobre la
microbiota, reportar:
No se aislan patógenos, desarrollan bacterias de la microbiota normal.
126
ETIOLOGÍA Y SINTOMATOLOGÍA DE NEUMONÍA Y BRONQUITIS
SIGNOS Y SÍNTOMAS
Tos
Dolor toráxico
Disnea
Consolidación pulmonar
Klebsiella pneumoniae y otras enterobacterias
Sonidos anormales
Legionella spp.
Disminución de sonido respiratorio
Mycobacterium spp.
Infiltrado (Rayos-X)
Fusobacterium nucleatum
Matidez a la percusión
Bacteroides melaninogenicus
Cavitación
y otros anaerobios
Empiema
127
CAPÍTULO 11
HEMOCULTIVO / MIELOCULTIVO
PROPÓSITO:
El hemocultivo o cultivo de sangre, sirve para detectar las bacterias que se
están reproduciendo en la sangre, lo que provoca septicemia. El mielocultivo es el
cultivo de médula ósea y sirve para detectar bacterias en esta muestra, especialmente Salmonella typhi. La septicemia es una de las enfermedades infecciosas
más graves, por esta razón la detección efectiva y rápida de la bacteria causante,
constituye una de las funciones más importantes del diagnóstico bacteriológico. La
detección de bacterias en sangre o médula ósea tiene importancia diagnóstica y
pronóstica. En el caso de fiebre tifoidea, causada por S. typhi, su hallazgo en la
sangre, o más efectivamente en médula ósea, constituye el diagnóstico de ésta severa infección, y permite instituir tratamiento con el delicado antibiótico de elección (cloranfenicol).
En condiciones normales no se detectan bacterias en la sangre. Las bacterias
penetran hacia el torrente circulatorio desde sitios extravasculares, por los vasos
linfáticos. Cuando las bacterias se multiplican a una velocidad que excede la capacidad del sistema reticulo-endotelial para removerlas de la sangre, ocurre la
septicemia. Se diferencia de la bacteremia, que es la presencia transitoria de bacterias en el torrente circulatorio, la cual ocurre cotidianamente durante el cepillado
dental, contacto sexual, etc. Actualmente existe la tendencia por usar estos dos
términos (septicemia y bacteremia) indistintamente
Usualmente causa septicemia una sola especie bacteriana. Sin embargo, la
septicemia polimicrobiana se presenta con una frecuencia no despreciable.
MUESTRA:
Los síntomas del paciente que indican la necesidad de obtener un hemocultivo
son: aumento súbito del pulso y la temperatura, cambios sensoriales, calofríos,
postración y presión baja. La recuperación de las bacterias de la sangre depende de
estos factores:
129
1.
La cantidad de sangre que se cultiva. En niños debe ser al menos 2.5 ml
y en adultos usualmente 5 ml, aunque sería preferible cultivar 10 ml.
2.
La relación entre sangre y caldo de cultivo debe ser siempre 1:10, es
decir sangre al diez por ciento en caldo, con el objeto de evitar la coagulación de la sangre.
3.
La presencia de inhibidores bacterianos en el suero, tales como
anticuerpos, complemento o antibióticos.
4.
Los métodos de cultivo en el laboratorio de microbiología.
5.
La característica de la bacteria de ser “fastidiosa”, es decir que requiere
un medio de cultivo enriquecido y complejo.
El hemocultivo debe obtenerse siempre antes de iniciar el tratamiento con
antibióticos. No es crucial obtener la muestra de sangre cuando sube la temperatura del paciente; si es posible, deberá tomarse antes del alza esperada de temperatura o inmediatamente después del calofrío. En algunos casos, se justifica obtener
varias muestras del paciente, en tiempos y de sitios diferentes, es decir “seriado”.
Los hemocultivos seriados, obtenidos antes de la antibioticoterapia, son especialmente útiles en el caso de sepsis aguda, meningitis, osteomielitis, neumonía
bacteriana, pielonefritis y endocarditis.
Debido a que la piel humana normal está constantemente cubierta de abundante microbiota, es muy importante tomar la muestra con precauciones especiales. Para obtener la muestra no es necesario utilizar “campo estéril”, pero sí observar todas las indicaciones necesarias para la toma aséptica de la muestra. Al obtener la sangre para hemocultivo, deben seguirse cuidadosamente las siguientes instrucciones:
1.
Destapar el frasco con caldo de hemocultivo, para descubrir el tapón de
hule perforable. Dejar la tapadera a un lado, y con un algodón empapado en solución de yodo al 3 por ciento en alcohol (tintura), limpiar bien
el tapón perforable. Dejar secar mientras se atiende al paciente.
2.
Colocar la ligadura en el brazo del paciente, luego palpar la vena y localizar con precisión el sitio donde se va a puncionar.
3.
Es una buena práctica rutinaria lavar con agua y jabón el brazo del
130
paciente, antes de aplicar desinfectantes. Limpiar el sitio exacto con un
algodón empapado en tintura de yodo al 3 por ciento. Dejar secar y
luego limpiar el sitio de punción con un algodón empapado en alcohol,
con movimientos circulares en forma de espiral que se inicia en el sitio
de punción. Después de esta prepación no se debe volver a tocar la vena.
4.
Con aguja y jeringa estériles, puncionar la vena y obtener asépticamente
5 ml o más de sangre.
5.
Nunca debe cambiarse aguja después de obtener la sangre, excepto cuando se falla en el intento de hacerlo, y se punciona en otro sitio. Inyectar
exactamente 5 ml de sangre en el frasco que contiene 45 ml de caldo, o
10 ml en un frasco con 90 ml de caldo. En los hemocultivos pediátricos,
inyectar 2.5 ml de sangre en 25 ml de caldo.
6.
El caldo preparado comercialmente que debe usarse, es el caldo thiol,
especialmente diseñado para efectuar hemocultivos de pacientes que
pudieran haber recibido penicilina, estreptomicina o sulfonamidas. El
caldo debe contener de 0.025 por ciento a 0.05 por ciento de polianetol
sulfonato de sodio (SPS). Esta sustancia actúa como anticoagulante, y
además inhibe la actividad bactericida del suero y la fagocitosis de los
leucocitos, inactiva el complemento y neutraliza lisozimas y antibióticos
aminoglucósidos. También debe tener vacío parcial y atmósfera enriquecida con anhídrido carbónico. Los frascos comerciales deben mantenerse en la oscuridad y a temperatura ambiente.
7.
En caso de no contarse con frascos o botellitas comerciales para
hemocultivo, éstas pueden prepararse en el laboratorio, en recipientes
de vidrio esterilizables y con doble tapón, el interno perforable. Los caldos BHI (infusión de cerebro y corazón de buey) o Tripticasa-soya dan
buenos resultados. Usualmente el hemocultivo para anaerobios no se
efectúa, a menos que se cuente con botellitas anaerobias comerciales;
sin embargo, algunos anaerobios aerotolerantes eventualmente pueden
crecer.
8.
Agitar suavemente las botellas ya inoculadas, e incubar a 36° C.
9.
Las muestras de médula ósea para efectuar el mielocultivo siempre deben ser obtenidas por el médico, quien puncionará el esternón o la cresta
131
ilíaca. Esta muestra debe procesarse exactamente igual que el
hemocultivo.
PROCEDIMIENTO:
1.
Incubar los hemocultivos y mielocultivos a 36° C por siete días, excepto
en casos especiales en los cuales debe prolongarse la incubación, por
ejemplo para el aislamiento de Brucella spp.
2.
Con mucho cuidado para que el caldo no se agite, examinar diariamente los frascos contra la luz, para buscar alguno de los siguientes signos
visibles que indican crecimiento bacteriano, los cuales orientan hacia el
tipo de bacteria que está creciendo:
OBSERVACIONES EN HEMOCULTIVOS QUE ORIENTAN
EL DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO
Signo visible
Posible bacteria
Turbidez
Bacilos gram-negativo aerobios
Staphylococcus spp.
Bacteroides spp.
Hemólisis
Streptococcus spp.
Staphylococcus spp.
Listeria spp.
Clostridium spp.
Bacillus spp.
Formación de gas
Bacilos gram-negativo aerobios
Anaerobios
Colonias visibles como “motas de algodón”
Staphylococcus spp.
Streptococcus spp.
Formación de película
Pseudomonas spp.
Bacillus spp.
Levaduras
Formación de coágulo gelatinoso
Coloración verdosa (raro)
132
3.
En caso de observar cualquiera de estas características, agitar suavemente, limpiar el tapón perforable con algodón y alcohol, puncionar
con jeringa y aguja estériles (puede ser de tuberculina) y aspirar una
pequeña cantidad del caldo. Inocular una gota, y luego estriar con asa
sobre una caja de agar sangre de carnero y una caja de agar chocolate;
incubar ambas cajas en jarro con candela. Es aconsejable sembrar tres
gotas del hemocultivo, pero sólo estriar una. Si no se observa crecimiento en las gotas no rayadas y lo hay en las estrías, posiblemente se trata
de contaminación. Simultáneamente, dejar secar dos gotas del caldo sobre un porta-objetos; colorear con Gram.
4.
Observar cuidadosamente el frote Gram con lente de inmersión, pues la
observación de las bacterias es la base de su caracterización. Además,
algunas bacterias como Haemophilus influenzae no producen signos visibles en el caldo. Si se observan bacilos o cocobacilos gram-negativo,
inocular adicionalmente una caja de agar MacConkey; incubar
aeróbicamente. Esto es especialmente importante para el aislamiento e
identificación de Salmonella typhi.
5.
Si se observan cocos gram-positivo esféricos y con tendencia a agruparse en racimos, inocular una caja de agar manitol-sal, para facilitar el
aislamiento e identificación de Staphylococcus aureus. Si se observan
diplococos o cadenas cortas de cocos gram-positivo ovalados, aplicar
los discos de optoquina y bacitracina sobre la segunda estría del agar
sangre de carnero, para acelerar la identificación presuntiva de
Streptococcus pneumoniae y Streptococcus pyogenes.
6.
Rutinariamente, revisar los hemocultivos y mielocultivos aparentemente
negativos. Proceder así: hacer asépticamente un frote Gram del caldo a
las 48 horas, y también al séptimo día de incubación. La incubación
prolongada puede producir una leve turbidez de fibrina.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS;
1.
Con siete días de incubación a 36° C se recupera el 95 por ciento de las
bacterias clínicamente significativas. Identificar los crecimientos
bacterianos según el caso, con las técnicas descritas. Si se observa en
MacConkey el crecimiento de colonias lactosa-negativo sospechosas de
Salmonella typhi, aglutinar inmediatamente el crecimiento en agar sangre de carnero, con antisuero polivalente anti-Salmonella, anti-Salmonella
133
grupo D, y anti-antígeno Vi. Si hay aglutinación franca, reportar inmediatamente la presencia de Salmonella typhi.
2.
Algunas bacterias frecuentes en hemocultivos positivos, son las
siguientes:
-
3.
Salmonella typhi
Escherichia coli
Streptococcus pyogenes
Algunas bacterias que frecuentemente crecen en hemocultivos, como
contaminantes provenientes de la microbiota de la piel, son los siguientes bacilos gram-positivo:
-
Bacillus sp. (esporulado)
Corynebacterium sp. (no esporulado, difteroide)
ETIOLOGÍA Y SINTOMATOLOGÍA DE SEPTICEMIA
SIGNOS Y SÍNTOMAS
Fiebre en picos
Streptococcus pyogenes (grupo A) en todas las edades
Calofríos
Streptococcus alfa hemolítico (endocarditis)
Murmullo cardíaco (endocarditis) Streptococcus grupos A, B y D neonatos
Petequias en piel y mucosas
Hemorragia puntiforme en uñas
Malestar
Salmonella typhi (fiebre tifoidea)
Escherichia coli
Bacteroides fragilis y otros anaerobios
Listeria monocytogenes
134
INFORME:
1.
Los hemocultivos deben reportarse como negativos si no se observan
bacterias en el segundo control por coloración de Gram, a los siete días
de incubación, nunca antes. Reportar así:
Negativo a los siete días de incubación a 36° C.
2.
Si el hemocultivo presenta crecimiento a cualquier tiempo de incubación,
reportar cuanto antes la bacteria aislada, identificada si es posible hasta
especie, aunque la identificación sea presuntiva. Reportar así:
Se aisló ___________ , susceptibilidad pendiente.
3.
En el caso del aislamiento e identificación de Streptococcus pneumoniae o
Streptococcus pyogenes de hemocultivo, reportar así:
Se aisló Streptococcus ___________ , se recomienda tratamiento con penicilina.
Si se trata de S. pneumoniae si hacer la prueba de susceptibilidad a la
penicilina.
4.
Después de interpretar los resultados de la prueba de susceptibilidad
antimicrobiana, enviar otro reporte, así:
Se aisló: ___________________
Susceptible a: ______________
Intermedio a: ______________
Resistente a: _______________
Si el laboratorio tiene capacidad económica suficiente, es conveniente utilizar
el sistema para detección de bacterias por lisis-centrifugación (ISOLATOR, Laboratorios Wampole), o algún sistema automatizado para efectuar hemocultivos (por
ejemplo BACTEC, Becton Dickinson).
135
CAPÍTULO 12
SECRECIONES DIVERSAS
PROPÓSITO:
Detectar por medio de frote Gram y cultivo aerobio, la presencia de bacterias
que causan infecciones con presencia de pus en la piel, ojos, oídos, tejido subcutáneo, heridas infectadas y otros sitios anatómicos diversos. A las bacterias que
provocan la formación de pus se les llama piógenas. En este tipo de infecciones,
son de especial interés los llamados “cocos piógenos gram-positivo”, que son los
siguientes:
-
Menos frecuentemente pueden aislarse de este tipo de lesiones, otras bacterias tales como:
-
Pseudomonas aeruginosa (de importancia en quemaduras infectadas)
Escherichia coli
Haemophilus aegyptius (en infecciones oculares)
Salmonella typhi (raro)
Mycobacterium tuberculosis (raro)
MUESTRA:
La muestra deberá obtenerse según el sitio anatómico, siempre con material
estéril y antes de tratamiento con antibióticos. En la mayoría de los casos puede
usarse hisopo estéril (envuelto en papel individual, no dentro de frasco). Cuando
la cantidad de pus es muy escasa, tomar la muestra con el extremo puntiagudo y
delgado de un aplicador de madera estéril que ha sido quebrado por los extremos.
También puede usarse la punta de una asa espatulada flameada y fría, bisturí pequeño (número 15), o una lanceta estéril.
137
Debe considerarse como regla general indispensable, hacer siempre un frote
para Gram, sobre un porta-objetos limpio. Es de vital importancia observar las
bacterias en el frote, especialmente cuando deben interpretarse cultivos con alguna
microbiota normal además de algún patógeno.
1. PIEL:
Si no hay apertura por donde salga el pus, escoger una lesión intacta y “madura”, de preferencia con punta blanquecina. Limpiar el área de donde se tomará
la muestra para frote Gram y cultivo, con algodón empapado en alcohol y exprimido. Limpiar bien pero con cuidado de no sacar el pus, luego con lanceta estéril o
bisturí pequeño, puncionar a manera de evitar que salga sangre. Si es necesario
(usar guantes de hule estériles) presionar a los lados de la lesión, hacia el centro,
para “exprimir” el pus hacia afuera. Tomar una pequeña gota de pus con el asa
espatulada estéril, punta de aplicador de madera estéril (quebrado) o hisopo estéril, e inocular siempre los siguientes medios de cultivo, en este orden:
Primero: Agar sangre de carnero al 5%
Segundo: Agar chocolate
Tercero: Agar manitol-sal (en caja de Petri)
Cuarto: Agar MacConkey
Luego hacer un frote Gram delgado, sin frotar mucho sobre el porta-objetos.
Los medios de cultivo deben inocularse con una asada de pus, en un extremo de la
caja. El objeto de hacerlo en el orden indicado, es evitar el acarreo de inhibidores
del MacConkey y manitol-sal, hacia el agar sangre de carnero y el agar chocolate,
que no son inhibitorios.
ETIOLOGÍA Y SINTOMATOLOGÍA DE HERIDAS INFECTADAS
SIGNOS Y SÍNTOMAS
Secreción serosa o purulenta
Absceso: subcutáneo o submucoso
Eritema y edema
Clostridium spp., Bacteroides spp. y otros anaerobios
Crepitación (gas en tejidos)
Enterobacterias
Dolor
Ulceración y formación de fístulas
Enterococos
138
2. OJOS:
Tomar la muestra con hisopo estéril, así: bajar el párpado inferior, haciendo
presión hacia abajo, a manera de exponer la conjuntiva enrojecida y purulenta (usar
guantes de hule estériles). Frotar la conjuntiva al mismo tiempo que se rota el hisopo
hacia afuera, con mucho cuidado de no raspar el globo del ojo. Inocular agar sangre de carnero, agar chocolate, agar manitol-sal y agar MacConkey, en ese orden.
Descartar el hisopo, y con un segundo hisopo estéril, tomar más muestra. Hacer un
frote pequeño sobre un porta-objetos limpio, con cuidado de no frotar excesivamente.
En los cultivos oculares es muy importante incluir siempre agar chocolate,
para lograr el crecimiento de las bacterias fastidiosas (difíciles de cultivar) que causan conjuntivitis. Si en el frote Gram se observan diplococos gram-negativo, inocular un tubo de medio Thayer-Martin, selectivo para N. gonorrhoeae.
ETIOLOGÍA Y SINTOMATOLOGÍA DE INFECCIÓN OCULAR
SIGNOS Y SÍNTOMAS
Secreción conjuntival serosa
o purulenta
Hiperemia ocular
Dolor ocular
Haemophilus spp., especialmente H. aegyptius
Moraxella lacunata
Pseudomonas aeruginosa (reportar stat)
3. OÍDOS:
En los casos de otitis media, generalmente no es necesario que el médico
otorrinolaringólogo puncione el tímpano (timpanocentesis). Este procedimiento
jamás debe practicarse por el personal del laboratorio. Proceder así: con un hisopo
empapado en alcohol, y luego exprimido con papel absorbente, limpiar bien el
oído externo. Introducir en el canal auditivo otro hisopo estéril, despacio y sin tocar el pabellón de la oreja, con cuidado de no llegar al tímpano. No debe haber
sangrado. Con el hisopo empapado en pus, inocular los siguientes medios: agar
sangre de carnero, agar chocolate, agar manito-sal y agar MacConkey, en ese or139
den. Con un segundo hisopo estéril, tomar más muestra y sin frotar mucho, hacer
un pequeño frote sobre porta-objetos limpio.
ETIOLOGÍA Y SINTOMATOLOGÍA DE OTITIS MEDIA
SIGNOS Y SÍNTOMAS
Secreción ótica purulenta
Agudo:
Dolor agudo en oído y mandíbula
Cefalea pulsátil
Tímpano rojo y abultado
Crónico:
Proteus spp.
Anaerobios
4. MISCELÁNEOS:
Antes de obtener la muestra, debe ponerse especial cuidado en desinfectar
bien las áreas que se espera estén colonizadas por abundante microbiota. El objeto
de esta operación, es evitar contaminaciones innecesarias que dificultan la interpretación del frote Gram y el cultivo.
El material para tomar las muestras debe ser estéril. La toma de muestra debe
ser agresiva pero cuidadosa; un hisopo frotado descuidadamente sobre una lesión
seca y no de un sitio representativo, es completamente inútil. El sangrado debe
evitarse en la medida de lo posible. Para la toma de muestras difíciles o invasivas,
que representen peligro para el paciente, debe solicitarse la intervención del
microbiólogo o del médico.
Los líquidos acuosos y de volumen grande, deben centrifugarse y luego hacer frote Gram y cultivo del sedimento. Inocular el medio de Thayer-Martin si se
sospecha la presencia de Neisseria gonorrhoeae, y el medio de Lowenstein-Jensen si
se sospecha la presencia de Mycobacterium tuberculosis. En el capítulo 17 sobre
Anaerobios, se explica que tipo de muestras deben sembrarse en anaerobiosis y
como deben procesarse.
140
PROCEDIMIENTO:
Teñir el frote con la coloración de Gram, según el capítulo correspondiente.
Las muestras obtenidas siguiendo las instrucciones anteriores, y que fueron inoculadas directamente en un extremo de cada caja, deben diseminarse asépticamente
en la superficie de los medios de cultivo. Para este propósito, usar dos asas en
argolla (bien rectas y con la argolla circular y cerrada). Mientras una asa se flamea,
la otra se enfría en el soporte que la mantiene vertical. Según se indicó, trabajar
cerca del mechero encendido y con buena luz.
Si en el frote Gram de una secreción purulenta (especialmente de piel), se
observan abundantes cocos gram-positivo, ligeramente ovalados, con tendencia a
agruparse en pares o cadenas cortas y acompañados de abundantes leucocitos
polimorfonucleares, inocular el agar sangre de carnero con cortadas (igual que el
cultivo de garganta). Luego colocar con pinzas flameadas un disco de bacitracina
de 0.04 unidades en la segunda estría, para acelerar y facilitar el aislamiento e identificación de Streptococcus pyogenes.
Incubar el agar sangre de carnero y el agar chocolate a 36° C en jarro con
candela encendida y humedad (papel absorbente húmedo en el fondo del jarro). La
boca del jarro, donde enrosca la tapadera, debe frotarse esporádicamente con la
misma candela, para que la cera o parafina forme un sello. Cerrar bien el jarro, y
luego sellar con “masking tape”. Incubar el agar manitol-sal y MacConkey
aeróbicamente.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS E INFORME:
Es importante observar el frote lo más pronto posible, ya que en base a este
resultado se puede iniciar tratamiento preliminar. Observar los frotes Gram con
aceite y el lente objetivo de inmersión. Es de gran importancia observar cual es la
bacteria que predomina en el frote. Informar la cantidad de bactrias observadas, la
cantidad de leucocitos y de qué tipo son. En el frote, los leucocitos deben observarse gram-negativo (rojos); si aparecen gram-positivo (morados), falta decoloración
y debe aplicarse más alcohol-acetona.
Examinar los cultivos después de 18 a 24 horas de incubación, con microscopio estereoscópico o lupa y buena luz. En el agar sangre buscar colonias pequeñas
beta hemolíticas; si las hay, identificar un subcultivo en agar sangre de carnero con
discos de bacitracina y trimetoprim-sulfametoxazol y prueba de CAMP. Si hay co-
141
lonias planas alfa hemolíticas (hemólisis verdosa), identificar un sub-cultivo en agar
sangre de carnero con disco de optoquina para Streptococcus pneumoniae.
De diversas secreciones, pueden aislarse Enterococcus spp. alfa hemolíticos o
no hemolíticos, que pertenecen al grupo D de Lancefield. Son llamados
“enterococos” por su probable origen fecal, y los más importantes son: E. faecalis, E.
faecium, E. durans y E. avium. Sub-cultivar a agar bilis-esculina; un color negro a las
24 horas de incubación a 36° C indica hidrólisis de la esculina positiva. Debe tomarse en cuenta que esta reacción también la dan positiva E. bovis y E. equinus, que
no son enterococos. Para identificar correctamente a los enterococos, debe sembrarse en un caldo con 6.5% de cloruro de sodio y observar el crecimiento halófilo
(soporta la sal), antes de 48 horas de incubación, con viraje del púrpura al amarillo
y turbidez. El caldo con cloruro de sodio al 6.5%, se prepara fácilmente así:
Caldo tripticasa soya ......................................15 gramos
Cloruro de sodio .............................................. 32.5 gramos
Agua destilada .................................................50 ml
Servir 6 ml en tubos con tapón de rosca, esterilizar en autoclave a 121° C por
15 minutos.
Enterococcus spp. son cocos gram positivo, catalasa-negativo, se agrupan en
pares y cadenas (no en racimos o tétrodos), y son halófilos (turbidez en el caldo con
6.5% de cloruro de sodio).
Si se observa crecimiento de colonias grandes (más de 1 mm de diámetro),
blancas o amarillentas (tanto en el agar sangre de carnero como en el manitol-sal),
identificar a Staphylococcus aureus por medio de la prueba de coagulasa. Colocar en
porta-objetos o caja de Petri, una gota de plasma humano citratado (del que se usa
para tiempo de protrombina). Suspender allí una asada pequeña del cultivo en
agar sangre de carnero. Si se observa franca aglutinación, la prueba de coagulasa es
positiva; reportar: Se aisló Staphylococcus aureus, y efectuar la prueba de susceptibilidad. Si la prueba de coagulasa en lámina es dudosa, pero hay coloración amarilla
alrededor de las colonias en el agar manitol-sal (acidificado por la fermentación del
manitol), debe efectuarse la prueba en tubo. Proceder así: en un pequeño tubo de
hemólisis, medir 0.5 ml de plasma citratado, suspender allí una asada del cultivo
en agar sangre, incubar de 4 a 24 horas a 36° C. Un coágulo bien formado indica
prueba positiva de coagulasa en tubo. Observar la presencia de coágulo a las 4
horas de incubación a 36° C; si no lo hay, reincubar a temperatura ambiente, para
evitar la lisis del coágulo por la enzima estreptokinasa. La prueba de coagulasa en
142
tubo es más sensible y confiable, pero si la reacción da positiva en lámina es suficiente para identificar a Stapylococcus aureus, pues hay aproximadamente 96 por
ciento de correlación.
Si la prueba de coagulasa es negativa, y la fermenteción del manitol también
es negativa (colonias rosadas en manitol-sal), puede reportarse presuntivamente
Staphylococcus epidermidis o Staphylococcus coagulasa-negativo. Hacer el reporte de
esta bacteria con prudencia, ya que en la gran mayoría de los casos no causa infección, pero se aisla con frecuencia pues es miembro importante de la microbiota de
la piel. Si la coagulasa es negativa y la fermentación del manitol positiva, puede
tratarse de Staphylococcus saprophyticus, hacer susceptibilidad a un disco con
novobiocina, que debe presentar inhibición. Si es necesario, hacer pruebas adicionales según la tabla a continuación. En caso de cocos gram-positivo con agrupación en pares, paquetes o grupos de cuatro bacterias, descartar Micrococcus sp. por
la prueba de OF-glucosa, es oxidativo.
PRINCIPALES PRUEBAS PARA LA DIFERENCIACIÓN DE TRES
ESPECIES DEL GÉNERO Staphylococcus DE ORIGEN HUMANO*
*
PRUEBA
S. aureus
S. epidermidis
S. saprophyticus
Coagulasa
+
-
-
Fermentación del manitol
(producción de ácido)
+
-
+/-
DNAsa
+
-
-
Resistencia a novobiocina
-
-
+
Crecimiento en anaerobiosis
+
+
-
Hemólisis
+
-
-
Tomado de: Isada, C.M. et al.: Infectious Diseases Handbook, 1995-96.
Si hay duda entre los géneros Staphylococcus y Streptococcus, hacer la prueba
de catalasa, que es positiva en el caso de los estafilococos y negativa en los
estreptococos.
El género Haemophilus está formado por cocobacilos gram-negativo
pleomórficos, que requieren el enriquecimiento de los medios de cultivo con sangre, para poder desarrollarse. Esto se debe a que como su nombre lo indica, requieren de varios factores sanguíneos para su nutrición y reproducción. La mayor parte
de los aislamientos clínicos de este género de bacterias, puede identificarse hasta
143
género por medio de la prueba de satelitismo; la diferenciación hasta especie requiere de pruebas más complejas. El crecimiento de Haemophilus spp. se logra en
agar chocolate incubado en jarro con candela, pues son microorganismos
microaerofílicos. Crece solamente en agar chocolate, y no en agar sangre, pues en el
primero los factores de crecimiento se encuentran libres en el medio, y no dentro de
los eritrocitos.
Hacer la identificación de Haemophilus sp. por medio de la prueba de
satelitismo, así:
1.
En agar chocolate se observan colonias muy pequeñas, puntiformes, de
menos de un milímetro de diámetro, translúcidas y ligeramente mucosas.
Hacer un frote Gram a estas pequeñas colonias, con cuidado de tomar
sólo de ellas; predominan cocobacilos gram-negativo pequeños, casi
esféricos y escasos bacilos largos y filamentosos (pleomorfismo).
2.
Tomar una asada del crecimiento en agar chocolate y estriarla en el centro de una caja de agar sangre de carnero al 5%, sólo en una dirección.
3.
En sentido perpendicular a la estría efectuada, hacer una estría de
Staphylococcus aureus, recta y a lo largo de toda la caja. Esta cepa pura
puede provenir de otro cultivo, o de preferencia tener una cepa típica
de S. aureus, en cualquier agar inclinado en tubo, conservada en
refrigeración.
4.
Incubar el agar sangre de 24 a 48 horas a 36° C en jarro húmedo con
candela. Una prueba positiva de satelitismo consiste en el crecimiento
de las pequeñas colonias del Haemophilus sólo muy cerca de la estría de
S. aureus. Hacer frote Gram a este crecimiento satélite para confirmar la
morfología.
Si en el cultivo original también hay colonias de Staphylococcus sp.,
enterobacterias o algunas otras bacterias, puede observarse el satelitismo natural.
Este consiste en el crecimiento de las pequeñas colonias puntiformes de Haemophilus
alrededor de colonias grandes. Este fenómeno se aprecia bien con el microscopio
estereoscópico o lupa al efectuar la interpretación.
144
Con fines prácticos, es aceptable el reporte de los aislamientos con satelitismo
positivo así:
Cultivo de ojos, reportar: Se aisló Haemophilus aegyptius.
Cultivo de cualquier otra secreción: Se aisló Haemophilus influenzae.
Hacer susceptibilidad en agar chocolate. Diseminar sobre toda la superficie
de la caja varias asadas del crecimiento en el agar chocolate original, o de colonias
satélites, con mucho cuidado de no tocar la estría de S. aureus.
Las enterobacterias aisladas de cualquier secreción en cantidad considerable,
deben identificarse con medios diferenciales (TSI, LIA, MIO, urea y citrato), o de
preferencia con el método API (Bio Merièux). Bacilos gram-negativo no fermentadores pueden eventualmente aislarse de secreciones; efectuarles antibiograma y
si es posible identificarlos.
145
CAPÍTULO 13
SECRECIONES GENITALES
PROPÓSITO:
Demostrar la presencia de microorganismos de varios tipos que infectan los
órganos genitales femeninos y masculinos, en especial los siguientes:
Bacteria, causante de la gonorrea.
Treponema pallidum
Bacteria, causante de la sífilis.
Gardnerella vaginalis
Bacteria, bacilo gram-negativo causante de
vaginosis.
Candida albicans
Hongo levaduriforme, causante de vulvovaginitis.
Trichomonas vaginalis
Protozoo, causante de tricomoniasis vaginal.
DIAGNÓSTICO DE GONORREA
Muestra:
La gonorrea es una enfermedad de transmisión sexual que en
el hombre generalmente causa el
aparecimiento de pus cremoso,
amarillento o verdoso que sale de
la punta del pene. En la mujer,
este síntoma puede no ser
evidente, lo que hace más difícil
el diagnóstico.
El agente causal de la
gonorrea es la bacteria Neisseria
gonorrhoeae un diplococo gram-negativo (rojo). Las neiserias presentan forma arriñonada y se agrupan
en pares que semejan granos de
café. El diagnóstico de laboratorio
de la gonorrea consiste en la obser-
Neisseria gonorrhoeae, frote
Gram de pus uretral masculino.
147
vación de la morfología típica de la bacteria en frotes Gram de pus uretral (sólo en
el hombre, no así en la mujer), y en el cultivo de la bacteria Neisseria gonorrhoeae.
Puede aislarse de descargas uretrales, vaginales e hisopos rectales; rara vez se aislan de heces, sangre, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, etc. Los niños que
nacen de madres con gonorrea, se infectan con la bacteria al pasar por el canal
vaginal durante el parto y generalmente presentan conjuntivitis purulenta. En el
pus de los ojos de estos niños puede observarse y cultivarse la bacteria.
La toma de la muestra es diferente en el hombre y en la mujer. Obtener la
muestra antes de tratamiento, así:
Hombres:
1-
Tener listo el siguiente material: hisopos estériles, porta-objetos limpios,
una caja de agar sangre y una caja o botellita de medio Thayer-Martin.
2-
Pedir al paciente que se ponga de pie y con ambas manos “exprimir” el
pene hacia adelante, a manera de forzar a salir el pus de la uretra.
3-
Con hisopo estéril de madera (quebrado) o palillo de dientes, tomar
una gota del pus, tratando de no tocar la piel.
4-
Preparar cuidadosamente un frote delgado sobre porta-objetos de
vidrio limpio, haciendo rodar el palillo o hisopo sobre la lámina,
no frotar. El propósito de preparar el frote con estas precauciones
es no romper los leucocitos presentes ni alterar la posición de las
bacterias.
5-
Tomar una gota de pus con la punta de algodón de un hisopo estéril.
Inmediatamente inocular la caja o botellita de Thayer-Martin; en botellitas frotar el hisopo en la superficie del medio desde el fondo. Simultáneamente sembrar una caja de agar sangre de carnero, para aislar otros
patógenos. Transportar las muestras rápidamente al laboratorio.
Mujeres:
1-
Idealmente la muestra debe obtenerse por el ginecólogo, con la paciente
acostada en posición y en cama ginecológicas, usando espéculo para
separar las paredes vaginales y observar el cuello uterino. Tener listo el
mismo material que para la toma de muestra masculina.
148
2-
Con la punta de algodón de un hisopo estéril tomar pus de donde se
localice (usar buena luz), es decir del cuello uterino, vagina o uretra.
Preparar un frote para Gram haciendo rodar el hisopo sobre un portaobjetos de vidrio.
3-
Tomar más pus con otro hisopo estéril, e inocular una caja o botellita de
Thayer-Martin, y una caja de agar sangre de carnero.
Procedimiento:
1-
Colorear los frotes con Gram según la técnica ya explicada.
2-
Con asas flameadas y frías, diseminar por estrías el inóculo sobre toda
la superficie de cajas o botellitas.
3-
Incubar tanto el agar sangre como el Thayer-Martin de 24 a 48 horas a
36° C en jarro húmedo con candela encendida. Si el Thayer-Martin está
en botellitas, tomar la precaución de dejarlas semi-abiertas, nunca bien
cerradas.
Interpretación de resultados:
Gram: buscar diplococos adosados en forma de granos de café y gram-negativo (rojos). Anotar si se encuentran adentro de los leucocitos polimorfonucleares
(intracelulares), o libres fuera de estas células (extracelulares). En el pus uretral
masculino, la presencia de estas bacterias típicas indica gonorrea. Reportar la cantidad y clase de leucocitos observados. En los frotes masculinos, los diplococos
gram-negativo intracelulares se asocian a gonorrea aguda; extacelulares se asocian
a gonorrea crónica. El frote Gram endocervical es de diagnóstico limitado y
correlaciona con el cultivo en Thayer-Martin en 65 por ciento de los casos.
En el caso de las mujeres por lo general la imagen microscópica no es típica y
se observan muchas clases de bacterias, tanto gram-positivo como gram-negativo, de la abundante microbiota normal de la vagina. Algunas bacterias de esta
microbiota pueden ser idénticas a Neisseria gonorrhoeae . Por estas razones el diagnóstico de gonorrea femenina se basa en el cultivo y no en el frote Gram.
Cultivo:
Después de 24 a 48 horas de incubación a 36° C en jarro con candela, exami149
nar el Thayer-Martin con buena luz. Debido a que el Thayer-Martin contiene sustancias enriquecedoras que favorecen el crecimiento de Neisseria gonorrhoeae, y sustancias inhibidoras de otras bacterias, por lo general sólo crece este microorganismo
en cultivo puro. N. gonorrhoeae presenta colonias pequeñas (menos de 1 mm de
diámetro), translúcidas, brillantes y de bordes lisos.
Hacer una coloración de Gram de las pequeñas colonias en Thayer-Martin,
suspenderlas en una pequeña gota de agua destilada o solución salina fijar con
calor y luego colorear. Si se observan diplococos gram-negativo, el cultivo es muy
sospechoso de N. gonorrhoeae y debe efectuarse la prueba de oxidasa. Esta prueba
demuestra la presencia de la enzima indofenol-oxidasa, que da al reactivo
(dihidrocloruro de tetrametil-p-fenilendiamina al 1% en agua, 0.1 g en 10 ml de
agua) un color morado o negro.
La prueba de oxidasa puede efectuarse aplicando directamente el reactivo
líquido al cultivo o sobre discos de papel filtro ya impregnados con el reactivo.
Para efectuar la prueba en discos de papel, proceder así: con pinzas flameadas,
colocar un disco de oxidasa en una caja de Petri vacía. Humedecerlo con una gota
de solución salina. Con el asa calibrada de platino o palillo de dientes de madera
tomar una o dos colonias típicas frotar este crecimiento sobre el disco húmedo. Si
aparece una coloración morado-negruzco antes de 10 segundos en la parte del disco donde se frotaron las colonias, la prueba es positiva. Esta prueba debe
interpretarse antes de 10 segundos, pues el oxígeno del aire puede ocasionar falsos
positivos. Nunca usar el asa corriente en esta prueba, pues el alambre con hierro o
nichrome causa por sí solo una reacción positiva.
Efectuar la prueba con el reactivo líquido así: aplicar unas gotas del reactivo
recién preparado directamente sobre la caja de Thayer-Martin, si las colonias toman rápidamente un color rosado, luego morado y luego negro, la prueba es positiva. Si se observa este viraje en el color de las colonias, o la prueba en disco es
positiva, sub-cultivar inmediatamente una colonia típica sin reactivo, o una colonia al empezar a cambiar de color a una caja de agar chocolate. Incubar 24 horas
a 36°C en jarro húmedo con candela. Después de incubar, hacer frote Gram al
crecimiento en agar chocolate, que debe presentar diplococos arriñonados gramnegativo.
Identificar la especie N. gonorrhoeae por medio de la prueba de oxidación de
los tres azúcares: maltosa, glucosa y sacarosa (sucrosa) en el medio base de CTA
(cistina-tripticasa agar). El medio CTA es un medio semi-sólido; al medio base estéril se le adiciona el carbohidrato en solución acuosa (esterilizado por filtración)
150
hasta una concentración de 1%. Debe prepararse en tubos 13 X 100 con tapón de
rosca, inocular los tres tubos de maltosa, glucosa y sacarosa con dos asadas bien
cargadas por tubo. Depositar el crecimiento masivo sólo unos pocos milímetros
por debajo de la superficie del medio. Cerrar bien apretado el tapón de rosca e
incubar de 48 a 72 horas a 37° C. Una coloración amarilla en la superficie del medio
indica reacción positiva. Interpretar resultados según esta tabla:
Diferenciación de dos especies de Neisseria
de importancia clínica
Especie
*
Glucosa
Maltosa
Sacarosa
+
-
-
Neisseria meningitidis*
+
+
-
Ver capítulo 14
Las pruebas de CTA frecuentemente dan resultados dudosos, tienen la desventaja que para preparar los medios en tubo se requiere esterilizar por filtración la
solución del carbohidrato que debe ser muy puro. Es adecuado usar por lo menos
sólo el tubo con maltosa, que diferencia bien las dos especies.
En términos generales y según las características del trabajo bacteriológico en
nuestro medio, se considera adecuado reportar (aunque sea presuntivamente) como
Neisseria gonorrhoeae a aquellos aislamientos de secreciones genitales con morfología
típica de Neisseria, oxidasa positivo y un frote Gram de la secreción que indique la
presencia de esta bacteria. Efectuar la prueba de susceptibilidad inoculando masivamente la bacteria en cultivo puro, en la superficie de una caja de agar chocolate
(base Mueller-Hinton caliente + 5% sangre de carnero).
Informe:
Tomando en cuenta los procedimientos y comentarios anteriores, si se está seguro aunque sea presuntivamente, reportar la presencia de N. gonorrhoeae. Debe tomarse en cuenta que un reporte de este tipo implica que el o la paciente contrajeron
una infección por contacto sexual. Un error del laboratorio puede por lo tanto causar serios problemas conyugales o dejar a un paciente infectado sin tratamiento.
151
DIAGNÓSTICO DE CHANCRO BLANDO (CHANCROIDE)
Muestra y Procedimiento:
El chancro blando o chancroide es una infección de transmisión sexual causada por una bacteria fastidiosa (difícil de cultivar) llamada Haemophilus ducreyi. Es
un bacilo pequeño gram-negativo, que en frotes de lesiones genitales o cultivos se
presenta formando cadenas de 5 a 20 bacilos, paralelas entre sí o entrelazadas,
por lo que se ha descrito esta agrupación característica como “cardúmenes de
peces” o “huella digital”.
Las lesiones en los genitales son generalmente úlceras bien circunscritas dolorosas con base necrótica y bordes socavados y blandos. De estas características se
deriva el nombre de chancro blando o chancroide (similar al chancro sifilítico típico). Las lesiones rara vez son más grandes de 2 cm de diámetro, pueden haber
lesiones múltiples por autoinoculación y en más de la mitad de los casos, los ganglios
de la ingle están endurecidos.
El diagnóstico del chancro blando se basa en las características clínicas y en el
frote Gram directo de la lesión .
Para efectuar el diagnóstico de laboratorio del chancro blando, proceder así:
Frotar un hisopo estéril en los bordes y el fondo de la lesión y luego
rodarlo cuidadosamente sobre un porta-objetos bien limpio, sólo en una
dirección para no destruir la agrupación característica de la bacteria.
Dejar secar, fijar con calor y colorear con Gram.
Interpretación de Resultados e Informe:
Observar cuidadosamente el frote Gram del material de la lesión con el
lente de inmersión y aceite. Buscar bacilos gram-negativo agrupados en
cadenas largas, paralelas o entrelazadas (“cardúmen de peces”), los cuales deben predominar sobre otras formas de bacterias. Si se observa esta
morfología típica reportar inmediatamente así: Se observan (escasos, regular cantidad o abundantes) bacilos gram-negativo, agrupados en cadenas largas (o cortas según el caso) de morfología compatible con
Haemophilus ducreyi. Esta morfología se considera presuntivamente
diagnóstica de chancro blando.
152
DIAGNÓSTICO DIRECTO DE LA SIFILIS
La sífilis es una enfermedad que
se transmite por contacto sexual. Es
causada por Treponema pallidum, una
bacteria del grupo de las espiroquetas, con forma alargada, enrollada a manera de “tirabuzón” y muy
móvil. T. pallidum no se puede colorear con Gram ni cultivar in vitro, por
estas razones es indispensable utilizar técnicas especiales para demostrar su presencia. Generalmente la
detección de anticuerpos inespecíficos o “reaginas”, por la prueba
de V.D.R.L. (Venereal Diseases
Research Laboratory) y la detección
de anticuerpos específicos contra esta
bacteria por FTA-ABS (Fluorescent
Treponemal Antibodies-Absorbed),
establecen el diagnóstico de sífilis. Sin
embargo, debe transcurrir algún
tiempo después del contagio para que
las pruebas serológicas se positivicen.
Treponema pallidum,
campo oscuro de chancro.
En la mayoría de los casos de sífilis primaria aparece una lesión típica en los
órganos genitales, llamada “chancro”. El chancro se caracteriza por ser una úlcera
no purulenta, generalmente de forma redondeada y de bordes duros. Es una lesión muy infectiva que contiene muchas espiroquetas, por lo que debe manipularse
con guantes.
Debido a que T. pallidum es una bacteria muy delgada y que no toma los colorantes de Gram, su presencia debe demostrarse por observación microscópica en
fresco con condensador de campo oscuro. Es muy importante que el paciente no
haya recibido tratamiento con antibióticos especialmente penicilina, que hace desaparecer rápidamente los treponemas de las lesiones. Para el examen se procede
así:
1-
Tener listo el siguiente material: guantes de hule estériles, gotero con
solución salina, tubos capilares no heparinizados, bulbo de hule peque153
ño para tubos capilares (de los que vienen en kits de serología), portaobjetos, cubre-objetos, solución salina estéril en frasco, gasa estéril y algodón con alcohol.
2-
Es imprescindible examinar bien al paciente en un cubículo privado con
buena luz para localizar bien el chancro más típico. Usar los guantes
puestos para este procedimiento, limpiar suavemente la superficie del
chancro con gasa estéril seca para causar ligera abrasión. Si hay costra
levantarla con cuidado.
3-
Llenar un tubo capilar, aproximadamente un centímetro con solución
salina estéril, dejarle puesto el bulbito de hule y tomarlo con la mano
derecha.
4-
Con la mano izquierda, tomar la lesión entre los dedos pulgar e índice y
presionar fuertemente hasta que brote del fondo de la lesión un líquido
translúcido. Este procedimiento es doloroso para el paciente, pero debe
soportar el dolor sin anestesia.
5-
Causar leve abrasión con el tubo capilar sin causar sangramiento, rápidamente dejar caer en el centro de la lesión una gota de solución salina
del tubo capilar, succionarla. Gotearla de nuevo en la lesión, dos o tres
veces más. Debe usarse lo menos posible de solución salina para no diluir la muestra, que debe ser un líquido lechoso ligeramente hemorrágico
que queda dentro del tubo capilar. Puede usarse pipeta Pasteur o asa
estéril si se considera más fácil de manejar.
6-
Colocar con cuidado una gota de la muestra así obtenida en un portaobjetos limpio, cubrir con cubre-objetos a manera de no dejar burbujas
en la preparación en fresco.
7-
Descartar el tubo capilar en un lugar adecuado, tomando en cuenta que
es material muy infectivo. Limpiar el bulbito de hule con algodón y alcohol, lo mismo que los guantes antes de quitárselos.
8-
Transportar la muestra con su respectiva solicitud de laboratorio lo más
pronto posible, y examinarla inmediatamente con campo oscuro. No
debe retrasarse la observación porque las espiroquetas pierden su movilidad típica.
154
9-
Cambiar el condensador de campo claro corriente que se usa en el microscopio, por un condensador especial para campo oscuro. Bajar el
condensador de campo oscuro y colocarle dos gotas de aceite de
inmersión de buena calidad, de manera que no queden burbujas de aire.
Colocar la muestra en la platina con el cubre-objetos hacia arriba. Subir
lentamente el condensador hasta que el lente pegue con el aceite por debajo de la lámina (que no queden burbujas). Aumentar la intensidad de
la luz del microscopio al máximo, luego enfocar la muestra con seco
débil; subir y bajar lentamente el condensador hasta que se obtenga el
máximo de contraste, es decir los objetos más brillantes y el campo más
oscuro.
10-
Cambiar al lente seco fuerte (de preferencia con diafragma) y enfocar de
nuevo con el tornillo micrométrico y la altura del condensador. Una vez
claramente enfocado, buscar detenidamente bacterias (ver foto y figura
12) con las siguientes características:
a)
b)
c)
d)
e)
f)
Tamaño ligeramente mayor al diámetro promedio de un eritrocito
(8 micras).
Muy finas alargadas y en forma de espiroquetas (como saca-corchos).
Espiras regulares que no desaparecen al moverse.
De 8 a 14 espiras en cada bacteria.
Movimiento rápido de flexión en el centro y rotación sobre su eje
mayor (en la mayoría de las muestras).
Movimiento activo hacia adelante y hacia atrás (especialmente en
muestras de chancros bien desarrollados con abundante material
mucoide y viscoso).
11-
Dependiendo del estadío de la lesión, puede observarse de un sólo
microorganismo en 20 campos hasta 50 por campo.
12-
El procedimiento de campo oscuro también sirve para observar T.
pallidum de lesiones en piel de pacientes con sífilis secundaria. Para tomar la muestra forrar ambas ramas de una pinza con tubo de hule. “Morder” la lesión firmemente a manera de forzar la salida de líquido transparente el cual se observa en campo obscuro según el procedimiento
descrito.
155
Interpretación de resultados e informe:
Debe tomarse en cuenta que espiroquetas de idéntica morfología forman parte de la microbiota de los genitales y la boca, por lo que son indiferenciables y
pueden causar falsos positivos. Este factor debe ser tomado en cuenta por el médico e interpretarse según la sintomatología del paciente, no es responsabilidad del
laboratorio que debe reportar lo observado.
Si la observación en campo obscuro coincide con la mayoría de las características descritas en el punto 10 anterior, reportar así:
Campo oscuro: POSITIVO, se observan (escasas, regulares, abundantes)
espiroquetas de morfología compatible con Treponema pallidum.
En caso que sólo se observen leucocitos y eritrocitos escasos, pero no
espiroquetas, reportar así:
Campo oscuro: NEGATIVO, no se observan espiroquetas.
Los treponemas son bacterias muy delgadas y por lo tanto difíciles de colorear. Antiguamente se utilizaban coloraciones por impregnación con sales de plata
para observarlos, con malos resultados. Ninguno de los tratados modernos revisados para la preparación del presente manual menciona este tipo de coloraciones,
que han caído en desuso. Puede utilizarse el condensador de contraste de fases,
pero los treponemas se observan menos obvios que con campo oscuro. Si no se
cuenta con microscopio con campo oscuro, remitir al paciente a una unidad que sí
cuente con esta facilidad.
156
AGENTES INFECCIOSOS DEL TRACTO GENITAL FEMENINO
Gerardo Arroyo, QB, CMIAC, MSc.
Director de la Escuela de Química Biológica
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia
Universidad de San Carlos de Guatemala
INTRODUCCION
Los procesos infecciosos del tracto genital femenino (TGF) son el motivo de consulta más frecuente en las clínicas de Ginecología. Se manifiestan
clínicamente por la presencia de flujo vaginal, prurito, eritema, dispareunia o
sangrado anormal (menorragia o metrorragia). Las infecciones del TGF son
importantes además de las molestias que causan a la paciente, por las potenciales complicaciones al diseminarse a otros órganos como el útero o las trompas de Falopio y porque representan también un riesgo para el feto en la
mujer embarazada.
Según el área anatómica afectada por los procesos infecciosos, éstos pueden clasificarse como vaginitis, vulvovaginitis, cervicitis, endometritis,
salpingitis, enfermedad pélvica inflamatoria (EPI) o abcesos tubo-ováricos.
Esta clasificación brinda las bases para el manejo clínico y también orienta
sobre la etiología, epidemiología y tratamiento de los mismos. Es también
importante mencionar, que durante las diferentes etapas fisiológicas de la
vida de la mujer (niñez, edad reproductiva, postparto o postmenopausia), se
presentan con mayor o menor frecuencia algún tipo de microorganismos en
particular.
VAGINITIS
La etiología de la vaginitis depende de la edad y de la etapa fisiológica
de la paciente, por lo que debe dividirse en vaginitis en niñas premenárquicas,
vaginitis en la mujer en edad reproductiva y vaginitis en la mujer
postmenopáusica. Los síntomas y signos clínicos de la vaginitis incluyen
flujo vaginal, prurito, eritema de la mucosa vaginal y exocervical y sangrado
anormal. Estas manifestaciones son interpretadas de diversas maneras por
las pacientes que pueden aceptar condiciones patológicas como normales, o
157
viceversa. Por este motivo, es importante establecer criterios objetivos que
permiten determinar cuando se encuentra presente un proceso infeccioso y
cuando son situaciones fisiológicas. La vaginitis es definida objetivamente
cuando se encuentran trastornos cualitativos o cuantitativos en el flujo vaginal
y/o síntomas asociados a la presencia de microorganismos patógenos. Los
cambios cualitativos incluyen aumento del pH por arriba de 4.5, prueba de
amina positiva y presencia de células clave.
1.
Vaginitis en niñas premenárquicas
La vagina de las niñas después de 30 días de nacidas, es susceptible de
infectarse con Neisseria gonorrhoeae y Chlamydia trachomatis, así como por otros
microorganismos como Streptococcus spp. y enterobacterias. Las infecciones
por Candida spp. son sumamente raras en niñas antes de la pubertad. El
origen de las infecciones gonocócicas y clamidiales en niñas, es el abuso sexual;
y por el contrario, las infecciones por estreptococos y enterobacterias son por
contaminación ano-vaginal.
Existen procesos inflamatorios no infecciosos que se diagnostican con
mayor frecuencia en niñas e incluyen vaginitis a cuerpo extraño, vaginitis
atrófica, (asociada muchas veces a mala higiene perianal), así como cierto
número de casos de vaginitis por Enterobius vermicularis.
2.
Vaginitis en la mujer de edad reproductiva
Durante los años de la vida reproductiva de la mujer, la vaginitis se
presenta con una frecuencia de hasta 40% en embarazadas, 25% en mujeres
de clínicas de planificación familiar y 18% en adolescentes. Más del 80% de
los casos de vaginitis infecciosa son causadas por Trichomonas vaginalis
(protozoo), Candida spp. (hongo) y la llamada vaginosis bacteriana (VB). Además de estos microorganismos, también pueden aislarse estreptococos,
estafilococos y enterobacterias. Otras etiologías incluyen la vaginitis ulcerativa
que acompaña al Síndrome de Choque Tóxico, vaginitis asociada al uso de
tampones, vaginitis por cuerpos extraños, vaginitis alergica al Nonoxinol-9
(espermicida) y otros tipos de vaginitis idiopática.
158
3.
Vaginitis en mujeres postmenopáusicas
Durante la etapa postmenopáusica, el epitelio atrófico es susceptible de
inflamaciones que tienen su origen principalmente en la falta de maduración
epitelial por ausencia de estímulo estrogénico. La más común e importante
en este grupo de pacientes es la vaginitis atrófica, la cual es en la mayoría de
los casos no infecciosa y responde satisfactoriamente al tratamiento local o
sistémico con estrógenos.
A.
Tricomoniasis
La tricomoniasis es una enfermedad de transmisión sexual, que se presenta clínicamente con flujo vaginal profuso, de color amarillo-verdoso, a veces
espumoso, de mal olor, acompañado de prurito, y eritema de la vagina y
exocérvix. El eritema del exocérvix ha sido descrito como “cuello en fresa”.
El pH del flujo vaginal es arriba de 5.0, la prueba de amina es generalmente
positiva y al examen en fresco es posible observar Tropozoitos móviles de
Trichomonas vaginalis, con un alto grado de sensibilidad y especificidad.
La tricomoniasis ha sido identificada en 10.3% de mujeres embarazadas, 7.3% de mujeres en clínicas de planificación familiar y en 8.5% de mujeres adolescentes (12 a 18 años).
B.
Candidosis vulvovaginal
La candidiasis vulvovaginal, generalmente causada por Candida albicans,
puede transmitirse sexualmente, la mayoría de los casos se deben a contaminación ano-vaginal. Clínicamente se presenta con prurito, irritación vulvar y
un flujo espeso de color blanco espeso que semeja leche cortada y que se adhiere a las paredes vaginales. El pH es muy parecido al normal o menor y la
reacción de amina es negativa. El examen en fresco revela la presencia de
levaduras, micelio y pseudomicelio asociado a variable cantidad de leucocitos
polimorfonucleares.
En diferentes grupos de mujeres guatemaltecas se ha reportado una frecuencia de 12.6% en embarazadas, 5.3% en pacientes de planificación familiar
y 6.8% en adolescentes.
159
C.
Vaginosis bacteriana
La VB es el tipo más frecuente de vaginitis infecciosa. Se ha reportado
en 20.1% de mujeres embarazadas, 13.5% de pacientes en planificación familiar y en 1.7% de adolescentes. Esta enfermedad ha recibido diversos nombres, entre ellos vaginitis inespecífica, vaginitis por Gardnerella y vaginosis
inespecífica entre otros, de los cuales el término VB es quizás el más apropiado en vista de que el epitelio escamoso no muestra generalmente infiltración
leucocitaria. La VB se define como el sobrecrecimiento de otras bacterias sobre la microbiota normal de bacilos de Döderlein. Entre las bacterias que han
sido aisladas de casos de VB se encuentran Gardnerella vaginalis, Bacteroides
spp., Eubacterium lentum, Peptococcus spp., Peptostreptococcus spp., Mycoplasma
hominis, Mobiluncus curtisii y Mobiluncus mulieri.
La presentación clínica incluye secreción vaginal acuosa homogénea, de
color blanco grisáceo que se adhiere a las paredes vaginales, con mal olor. El
pH del flujo vaginal es generalmente mayor de 5.0, la reacción de amina es
positiva y es característica la presencia de células clave. El frote Gram revela
la ausencia de bacilos de Döderlein (gram-positivo) y abundantes bacilos
pleomórficos gram-negativo. Los frotes Gram son de utilidad cuando se interpretan como presencia de microbiota normal, microbiota mixta o compatibles con VB. El diagnóstico de esta condición se establece cuando se encuentran presentes tres criterios de los antes mencionados, incluyendo entre
ellos la presentación clínica característica. Los cultivos in vitro no son útiles
para el diagnóstico, en vista de que es posible aislar la mayoría de los
microorganismos mencionados en pacientes sanas.
CERVICITIS
La cervicitis es la inflamación del canal endocervical y las glándulas
endocervicales y en la mayoría de los casos, los síntomas son vagos e
inespecíficos. Los agentes infecciosos más importantes son Neisseria gonorrhoeae
y Chlamydia trachomatis. Además de estos microorganismos son importantes
el virus Herpes simplex y por extensión de los procesos infecciosos vaginales,
Trichomonas vaginalis y Candida albicans.
En nuestro medio se ha reportado cervicitis en un 10.6% de mujeres embarazadas (gonorrea=0.7% y clamidia=5.3%), 9.2% de pacientes en clínicas
160
de planificación familiar (gonorrea=0.3% y clamidia=7.0%) y en 9.0% de las
adolescentes (gonorrea=1.7% y clamidia=6.8%).
El diagnóstico clínico de cervicitis no es posible en muchos casos pues
además de que los síntomas no son siempre característicos, los signos pueden confundirse con otras condiciones. Por esta razón es importante hacer
énfasis en los aspectos objetivos que correlacionan mejor con el diagnóstico
de cervicitis. Entre ellos se encuentra la observación de muco-pus procedente del canal endocervical. Esto se efectúa por medio de la prueba del hisopo
endocervical, la cual se basa en que al retirarlo del canal muestra coloración
amarilla, verde o roja que indica muco-pus o friabilidad de la mucosa, y la
presencia de más de 10 leucocitos polimorfonucleares por campo de 40X.
El diagnóstico etiológico debe buscar la presencia de N. gonorrhoeae y C.
trachomatis. El diagnóstico microbiológico de clamidia se basa en la detección
de antígenos del microorganismo mediante técnicas de ELISA o pruebas rápidas. Las técnicas citológicas que utilizan Papanicolaou o Giemsa para identificar células con inclusiones, han demostrado muy baja sensibilidad aunque
una especificidad aceptable, por lo que no deben utilizarse para diagnóstico.
OTROS AGENTES ETIOLÓGICOS
Mycobacterium tuberculosis
endometritis, salpingitis
Actinomyces spp. y Arachnia sp.
colonización uterina en pacientes
Entamoeba gingivalis (protozoo)
con dispositivos intrauterinos
Entamoeba histolytica (protozoo)
vaginitis, cervicitis
Enterebius vermicularis (helminto)
vaginitis en niñas
161
CAPÍTULO 14
LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO Y
FLUIDOS CORPORALES
PROPÓSITO:
Demostrar por medio de bacterioscopía con Gram y cultivo, la presencia de
bacterias en estas muestras, que normalmente deben ser estériles. Las bacterias que
tienen mayor importancia en el líquido cefalorraquídeo son:
Gram negativo:
Neisseria meningitidis (causa meningitis meningocócica severa)
Haemophilus influenzae (especialmente en niños de 6 meses a 4 años de
edad)
Escherichia coli y otras enterobacterias (en pacientes debilitados, neonatos
y post-craneotomía)
Gram-positivo:
Streptococcus pneumoniae (muy importante)
Streptococcus sp. (grupos B y D en neonatos)
Listeria monocytogenes (raro)
Otros microorganismos importantes:
Mycobacterium tuberculosis, Leptospira interrogans y Treponema pallidum
(bacterias).
Cryptococcus neoformans y Candida albicans (hongos levaduriformes)
V arios virus (enterovirus, paperas y otros).
MUESTRA:
Las muestras incluidas en los fluidos corporales son:
Líquido cefalorraquídeo (conocido también como fluido espinal o LCR)
163
Líquido ventricular (líquido cisternal, líquido craneal)
Fluido abdominal (líquido peritoneal o aseíbico, líquido de parasentesis, líquido de diálisis, bilis)
Líquido pleural, torasentesis y empiema (obtenido del tórax)
Líquido pericárdico
Líquido sinovial
Médula ósea, sangre (ver capítulo de hemocultivo y mielocultivo)
Por lo general estas muestras son obtenidas por el médico que solicita su análisis. Deben obtenerse antes de iniciar tratamiento con antibióticos y las debe colectar en recipientes estériles proporcionados por el laboratorio.
Las muestras deben transportarse inmediatamente al laboratorio y ser procesadas inmediatamente no después de 30 minutos de recolectadas. Rotular con el
nombre del paciente, número de registro, fecha y naturaleza de la muestra. Si el
médico sospecha que la muestra puede contener bacilos alcohol-ácido resistentes
debe hacerlo saber en su solicitud al laboratorio.
Los síntomas de irritación de las meninges (membranas que cubren el cerebro
y la médula espinal), que puede ser causada por microorganismos son: fiebre, dolor de cabeza, vómitos, rigidez y dolor de nuca, reflejos aumentados, estupor a
coma y petequias en la piel. En los niños estos síntomas son vagos e inespecíficos,
por esta razón sólo los resultados del laboratorio pueden establecer el diagnóstico.
En caso de meningitis bacteriana, el líquido cefalorraquídeo (LCR) generalmente
es purulento (turbio), con abundantes leucocitos (generalmente más de 1,000 por
milímetro cúbico), con predominio de neutrófilos polimorfonucleares y glucosa
disminuida (consumida por las bacterias). En la meningitis tuberculosa, generalmente el LCR es límpido y su glucosa normal.
ETIOLOGÍA Y SINTOMATOLOGÍA DE INFECCIÓN ÓSEA Y ARTICULACIONES
SIGNOS Y SÍNTOMAS
Edema articular
Eritema y calor
Dolor al movimiento
Dolor a la palpación
Rayos X: sinovitis u osteomielitis
Enterobacterias
Micobacterias
164
PROCEDIMIENTO:
1.
El médico debe obtener la muestra (LCR o cualquier otro fluido corporal del cual desee examen completo) en dos tubos estériles 13 x 100 con
tapón de rosca o frasquitos estériles que cierren bien. Enviarlos inmediatamente al laboratorio. Mantener la muestra dentro de la incubadora a 36°C mientras se procesa. En caso de recibirse un solo frasquito
separar asépticamente en dos porciones.
2.
Uno de los tubos no se centrifuga, enviarlo a donde corresponda
para citología (recuento total de células), recuento diferencial
(fórmula) y análisis químico. El otro tubo sirve para el análisis
microbiológico.
3.
Centrifugar la muestra 15 minutos a alta velocidad (2500-3000 rpm). Decantar asépticamente, tapar agitar y procesar sólo el sedimento.
4.
Sembrar una asada del sedimiento en cada uno de estos medios:
Agar sangre de carnero al 5%
Agar chocolate
MacConkey
Sabouraud (hongos), no Micosel
Tioglicolato
Lowenstein-Jensen (sólo si se solicita)
5.
Diseminar por estrías en toda la superficie de los medios sólidos. Introducir el agar sangre de carnero y el agar chocolate en jarro húmedo con
candela encendida. Incubar todos los medios a 36°C, excepto el
Sabouraud que se incuba a 27°C (o a temperatura ambiente para aislamiento de hongos patógenos especialmente Cryptococcus neoformans).
6.
En porta-objetos nuevos o bien limpios con alcohol, hacer dos frotes
pequeños (de aproximadamente un centímetro de diámetro) en el
centro de la lámina. Si el material es muy escaso poner una gota
del sedimiento, dejar secar, luego colocar otra gota encima y dejar secar
de nuevo.
7.
Colorear un frote con Gram y otro con Ziehl-Neelsen.
165
Fig. 11 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA
LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO (LCR)
Muestra: LCR obtenido siempre por el médico, en
dos recipientes estériles, ya sea tubos o
frasquitos preparados por el laboratorio.
1. Enviar un recipiente sin centrifugar a Citología y
Química
2. Centrifugar 15 minutos, decantar asépticamente y procesar sedimento
GRAM
ZIEHL-NEELSEN
sedimento
3. RUTINARIAMENTE SEMBRAR EN
agar sangre
agar
MacConkey
de carnero chocolate
Sabouraud
4. Incubar en jarro
con candela
OPCIONAL
Tioglicolato Lowenstein-Jensen
NO INCLINAR
5. Incubar aeróbicamente a 36o C,
Sabouraud a 27o C
6. Aislamiento e identificación de bacterias, micobacterias u hongos
166
Lo más pronto posible, observar los frotes de sedimento de LCR con lente de
inmersión. En vista que del resultado de los frotes depende el tratamiento inmediato de pacientes con infección grave de las meninges, su observación debe hacerse con todo cuidado. Poner especial cuidado en observar las siguientes morfologías:
1.
Diplococos gram-negativo (rojos), arriñonados, dispuestos en parejas
como granos de café, idénticos a N. gonorrhoeae de pus uretral: morfología
compatible con N. meningitidis. Dar alerta al médico inmediatamente.
2.
Cocobacilos gram-negativo (rojo pálido) pleomórficos, con escasas formas bacilares: morfología compatible con H. influenzae, agente de
meningitis en niños de 6 meses a 4 años; raro en adultos.
3.
Cocos gram-positivo (morados), lanceolados, ovalados, dispuestos en
parejas o cadenas cortas, la cápsula se insinúa como un halo claro
alrededor de las bacterias: En LCR morfología compatible con
S. pneumoniae. En otros fluidos puede ser S. pyogenes con mayor
frecuencia.
4.
Bacilos gram-negativo (rojos) de coloración sólida, no pleomórficos,
bacilos alargados: morfología compatible con enterobacterias o
pseudomonas (E. coli, Salmonella sp., Pseudomonas aeruginosa, etc.)
5.
Levaduras redondeadas, algunas con gemaciones laterales, gram-positivo, se insinúa cápsula, hacer “tinta china” para demostrar la presencia
de la levadura capsulada C. neoformans.
6.
En el Ziehl-Neelsen: bacilos alcohol-ácido resistente (rojos), cortos, algunos con coloración dispareja en forma de gránulos: morfología compatible con M. tuberculosis.
Si hay bacterias en los frotes, el laboratorio está en la obligación de alertar al
médico de inmediato. Reportar el Gram según se indicó. Es muy importante señalar la cantidad y clase de leucocitos presentes. Si la morfología es típica, informar
con que bacteria es compatible según las explicaciones anteriores. Si no hay seguridad, reportar sólo el tipo y cantidad de bacterias observadas.
167
Los cultivos deben observarse a las 24 horas de incubación a 36°C. Si no se
observa crecimiento, reincubar todas las cajas. Si a las 48 horas de incubación tampoco hay crecimiento, apuntar en el libro de control: N-48, y reportar “Negativo a
las 48 horas de incubación a 36°C en aero-anaerobiosis”. Si se observa algún crecimiento a las 24 ó 48 horas, comparar con la siguiente tabla:
Crecimiento en
BACTERIA
Agar Sangre
Agar Chocolate
MacConkey
Tioglicolato
Sabouraud
-/+
+
-
-
-
H. influenzae
-
+
-
-
-
S. pneumoniae
+
+
-
+/-
+
Enterobacterias
y pseudomonas
+
+
+
+
+
Cryptococcus
neoformans
-
-
-
-
+
Anaerobios
-
-
-
+
-
N. meningitidis
Hacer frote Gram de las colonias para confirmar morfología e identificar
según los capítulos anteriores, así:
BACTERIA
*
**
COLONIAS
PRUEBAS DE CONFIRMACIÓN
N. meningitidis
Pequeñas (1 mm de diámetro o menos)
brillantes, bordes enteros, no hemolíticas)
Oxidasa*, azúcares en CTA (ver
tabla en capítulo 13)
H. influenzae
Muy pequeñas (puntiformes) brillantes,
bordes enteros, no hemolíticas)
Prueba de satelitismo con Staphylococcus aureus**
S. pneumoniae
Pequeñas (1 mm de diámetro o más)
aplanadas, alfa hemolíticas
Inhibición por disco de optoquina
(ver capítulo 8)
Enterobacterias
Grandes, brillantes, bordes lisos crecen
en todos los medios. Notar en
MacConkey si son lactosa positivo
(rojas) o negativo (incoloras)
TSI/LIA/MIO/urea/citrato; o API.
Aglutina-ción con antisueros
Aglutinar con antisueros específicos, los grupos más frecuentes son A, B y C. Hacer antibiograma
en agar Mueller-Hinton con 5% de sangre, achocolatdo.
Prueba de “satelitismo” para H. influenzae (de LCR, secreciones) y H. aegyptis (de ojos).
168
Efectuar la prueba de satelitismo así:
1.
2.
3.
4.
5.
Obtener un cultivo puro en agar chocolate en jarro húmedo con candela, a 36° C.
Tomar una asada y estriar en la superficie de una caja de agar sangre,
sólo en una dirección.
Tomar una asada de un cultivo de Staphylococcus aureus (de otro cultivo
cualquiera o de preferencia una cepa pura mantenida en refrigeración).
Hacer con el asa en argolla una sola estría recta, perpendicular a las
estrías del Haemophilus.
Incubar en jarro con candela 24 horas a 36° C y luego examinar con lupa
y buena luz.
Una reacción positiva se manifiesta por el crecimiento de pequeñas colonias puntiformes y translúcidas que crecen sólo muy cerca de la estría
de S. aureus.
INFORME:
El informe del frote Gram de LCR debe haberse enviado previamente, el día
en que se recibió la muestra. Después informar lo más pronto posible el resultado
del cultivo con el nombre correcto de la bacteria, y la cantidad de colonias observadas (escaso, regular, abundante cantidad) en las cajas originales, por ejemplo:
Primer informe, entregar el mismo día de obtención de la muestra:
Frote Gram: Se observan escasos diplococos gram-positivo, lanceolados
y capsulados, de morfología compatible con S. pneumoniae. Leucocitos
polimorfonucleares: regular cantidad. Cultivo: Pendiente
Segundo informe, entregar el día que termina la identificación:
Cultivo: Se aisló S. pneumoniae. Antibiograma.
169
CAPÍTULO 15
TEJIDOS Y BIOPSIAS
PROPÓSITO:
Demostrar por frote y cultivo la presencia de bacterias en piezas de tejidos de
sala de operaciones, o piezas aún más pequeñas obtenidas por biopsia. Las bacterias que pueden estar presentes son muy variadas. Anteriormente sólo se efectuaba histopatología de estas muestras, en la actualidad el examen microbiológico es
también de gran ayuda diagnóstica. Además, la microbiología post-mortem contribuye a elucidar las infecciones mortales.
MUESTRA:
Este tipo de muestras son exclusivamente obtenidas por el médico en condiciones asépticas, y depositadas en recipientes estériles de boca ancha con un poco
de solución salina estéril, proporcionados por el laboratorio.
Debe obtenerse suficiente cantidad y no debe adicionarse ninguna sustancia
fijadora como formol. Después de procesarse, la muestra debe almacenarse en refrigeración o congelación, en solución salina estéril para que no se deseque, con el
propósito de preservarla para nuevos estudios, ya que generalmente hay riesgo
para el paciente al tomar nueva muestra.
De úlcera o tractos fistulosos debe efectuarse curetaje profundo tomando parte del tejido de la pared del tracto fistuloso. Debe desinfectarse la piel circundante
e introducir un catéter venoso de plástico estéril, y luego aspirar con jeringa estéril.
De las úlceras obtener material de la base. Si se justifica, el material de estas muestras debe obtenerse en algún medio de transporte anaeróbico adecuado (ver capítulo 17). En el caso de material de fístulas, debe hacerse una preparación en fresco
para buscar gránulos de Actinomyces, Nocardia u hongos.
Para obtener cultivos de material de autopsia, la piel debe ser desinfectada
aplicando una espátula caliente para quemar la piel. Si se trata de un órgano, debe
sumergirse en agua hirviendo por 5 a 10 segundos, y luego debe disecarse con
instrumentos estériles y tomar para cultivo material del centro. La mitad de la
171
muestra debe fijarse en formol, y la otra enviarse en recipiente estéril con un poco
de solución salina estéril al laboratorio de microbiología.
PROCEDIMIENTO:
No es adecuado inocular los medios sólo tocando o frotando la pieza con una
asa. Debe hacerse de la siguiente manera:
1-
Colocar la pieza con pinzas estériles en una caja de Petri estéril. Con
tijeras estériles, picarla finamente y luego pasarla a un macerador de
tejido estéril o, si no lo hay, a un pequeño mortero estéril.
2-
Usar arena esteril para triturar bien la muestra. Si se hace en un mortero, adicionar una pequeña cantidad de solución salina estéril. Dejar sedimentar para cultivar el sobrenadante. Si se sospecha la presencia de
hongos, no triturar, sólo picar finamente con tijeras estériles.
3-
Con aguja y jeringa estériles, aspirar asépticamente una porción del
sobrenadante. Inyectar aproximadamente un mililitro en un frasco de
caldo para hemocultivo.
4-
Seleccionar los otros medios de cultivo a inocularse con base en el o los
microorganismos sospechados, u observados en una coloración de Gram.
Si se desconoce la historia del paciente inocular con una gota del resto
de la muestra en la jeringa los siguientes medios: agar sangre de carnero
al 5%, agar chocolate, MacConkey, manitol-sal, tioglicolato, Sabouraud,
mycosel y Lowenstein-Jensen.
5-
Incubar a 36°C el agar sangre y el agar chocolate en jarro húmedo con
candela; MacConkey, manitol-sal, tioglicolato y Lowenstein-Jensen,
aeróbicamente a 36°C, y los tubos de Sabouraud y mycosel a 27°C o a
temperatura ambiente.
6-
Preparar dos frotes, colorear uno con Gram y el otro con Ziehl-Neelsen.
7-
Las muestras de sangre de autopsia deben procesarse como hemocultivo,
sin importar la presencia de coágulos.
172
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS E INFORME
Si se observa crecimiento en los medios después de 24 a 48 horas de incubación,
hacer las coloraciones y sub-cultivos adecuados para efectuar la identificación según el caso. Pueden encontrarse los siguientes microorganismos con interés clínico: anaerobios como Actinomyces sp., bacterias aerobias comunes, Nocardia sp.,
hongos sistémicos y Mycobacterium sp. Descartar cultivos para bacterias a las 48
horas de incubación, cultivos para hongos después de dos semanas y el LowensteinJensen después de 6 semanas de incubación. Reportar según las normas de los
capítulos anteriores.
173
ANUNCIO
ZITHROMAX
175
DOCUMENTO
ZITHROMAX
176
CAPÍTULO 16
PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
(ANTIBIOGRAMA)
PROPÓSITO
La prueba de susceptibilidad sirve para determinar in vitro a qué antibióticos
es susceptible o resistente una determinada cepa bacteriana aislada del paciente.
Este método permite al médico escoger el antibiótico más adecuado con base científica proporcionada por el laboratorio, y evita dar tratamientos útiles.
Susceptible: Cuando los microorganismos responsables de una infección son
inhibidos por concentraciones de antibiótico obtenidas con un régimen usual de
dosificación.
Moderadamente susceptible: Cuando los microorganismos son inhibidos por
concentraciones altas de antibiótico.
Resistente: Si los microorganismos que causan la infección, toleran concentraciones de antibiótico superiores a las que pueden obtenerse en la sangre por
medio de un régimen usual de dosificación.
Intermedio (Indeterminado): Hoy en día se considera como prueba errática
que por lo tanto debe repetirse, ya que realmente se trata de una población bacteriana
resistente.
El nombre “Antibiograma” es adecuado para designar esta prueba, pero no
lo es “Prueba de sensibilidad”, pues las bacterias no “sienten” la acción de los
antibióticos, son susceptibles a estos medicamentos. La técnica que debe usarse es
la de Bauer-Kirby, ligeramente modificada por el Comité Nacional de Estándares
para Laboratorios Clínicos de Estados Unidos (NCCLS).
MEDIO DE CULTIVO
Por medio de la técnica de Bauer-Kirby modificada se obtienen resultados
confiables, reproducibles y de gran utilidad clínica siempre y cuando se sigan al
pie de la letra las instrucciones de este capítulo. Es una técnica relativamente sen177
cilla que siempre debe efectuarse con el agar de Mueller-Hinton; el grosor de la
caja, concentración del inóculo, humedad, temperatura y otros factores deben estar
perfectamente estandarizados para que los resultados puedan ser comparables entre
los diversos laboratorios. Es muy importante tomar en cuenta que esta técnica sólo
sirve para efectuar el antibiograma de las siguientes bacterias aeróbicas o facultativas de crecimiento rápido:
-
Enterobacterias
Pseudomonas
El antibiograma para Haemophilus spp. y Neisseria spp. debe hacerse en MuellerHinton con 5% de sangre, “achocolatado”.
Preparar el agar Mueller-Hinton según las indicaciones del productor y con
las siguientes características:
1-
Las cajas de Petri de tamaño estándar (100 mm de diámetro), deben
llenarse con aproximadamente 25 ml del agar líquido ya autoclaveado,
a manera de dar un medio de 4 mm de grueso.
Idealmente deben usarse cajas de Petri descartables de plástico, de 150
mm de diámetro con la misma profundidad, para poder colocar los discos más separados
2-
Deben guardarse en la refrigeradora dentro de bolsas plásticas selladas,
(de 2 a 8° C), por no más de 7 días.
3-
El pH del medio debe ser de 7.2 a 7.4. Medir el pH del medio con
potenciómetro. Dejar solidificar un poco del medio dentro de un pequeño beaker alrededor del electrodo del aparato. Ajustar si es necesario,
antes de autoclavear, con NaOH 1N, o HCl 1N.
4-
De cada lote de medio, incubar dos cajas por 24 horas a 36° C para comprobar su esterilidad. Descartar estas cajas ya que no son adecuadas
para efectuar antibiograma después de ser incubadas.
5-
Inmediatamente antes de usar el medio Mueller-Hinton, secarlo a 36° C.
Colocar las cajas en la incubadora por 20 minutos con el medio arriba y
la tapadera ligeramente abierta.
178
Almacenaje de discos con antibióticos
Para que el procedimiento proporcione datos con verdadera correlación clínica, en primer lugar debe tomarse la siguiente precaución para el almacenaje de los
discos de papel impregnados con los diferentes antibióticos, que se obtienen comercialmente. Almacenar los discos de acuerdo con las siguientes instrucciones,
para que no pierdan su potencia:
1-
Congelar (idealmente a -20° C) los discos de penicilina, ampicilina,
carbenicilina y cefalosporinas. Descongelar periódicamente sólo los discos que serán usados durante la semana. Descongelarlos por lo menos
dos horas antes de usarse.
2-
Los discos del resto de antibióticos pueden almacenarse refrigerados
sin congelación. De preferencia con una pastilla desecante.
3-
Si se usan los cartuchos de discos montados en dispensador, introducir
dos pastillas desecantes de las que vienen con los discos y cerrar bien
después de usar.
PROCEDIMIENTO:
Efectuar el antibiograma así:
1-
Con el asa flameada y fría tomar 4 a 5 colonias bien aisladas y de igual
morfología del cultivo original en cualquier medio sólido. Debe trasladarse siempre un cultivo puro.
2-
Inocular un tubo con 4 ml de caldo tripticasa soya o caldo infusión de
cerebro y corazón (BHI).
3-
Incubar el caldo de 2 a 5 horas a 36° C, hasta que aparezca una ligera
tubidez.
4-
Ajustar la turbidez del caldo a la turbidez del estándar de MacFarland
0.5. Si el caldo es más turbio que el estándar agregarle más caldo o solución salina estéril. Comparar ambos tubos (muestra y estándar) con buena
luz y frente a un fondo blanco con una línea negra para evaluar
visualmente la turbidez.
179
Preparar el estándar 0.5 de MacFarland así: mezclar 0.5 ml de cloruro de
bario 0.048 M (1.175 g BaCl2. 2H2O en balón de 100 ml, aforar con agua
destilada), más 99.5 ml de ácido sulfúrico 0.36 N (1 ml de H2SO4 en
balón de 100 ml, aforar con agua destilada). Llenar tubos que cierren
bien, sellarlos, guardarlos en la oscuridad con fecha. Hacer nuevo
estándar cada 6 meses.
5-
Antes de quince minutos de diluídos los caldos, inocular la caja presecada de agar Mueller-Hinton así: introducir un hisopo estéril en el
caldo de turbidez igual al estándar; exprimir bien el hisopo presionándolo firmemente contra las paredes del tubo, arriba del nivel del caldo.
6-
Con el hisopo exprimido sembrar la caja en tres direcciones opuestas
sobre toda la superficie, cerca del mechero encendido. En caso de urgencia puede sembrarse la prueba con la muestra directa, sólo si el frote
Gram revela una sola clase de bacteria (LCR o secreciones varias), pero
esto debe evitarse y considerarse preliminar.
7-
Dejar secar la caja de 3 a 5 minutos, pero no más de 15 minutos, con la
tapadera cerrada.
8-
Con pinzas estériles o dispersador especial, colocar los discos impregnados de antibióticos a manera de que queden lo más separados entre sí
que sea posible. Con las pinzas flameadas y frías presionar los discos ya
colocados para adherirlos bien al medio de cultivo.
Escoger los antibióticos a colocar dependiendo de la bacteria estudiada,
según el listado básico actualizado de cada laboratorio y de acuerdo
con los listados oficiales del NCCLS (1995), que aparecen en las páginas
182 y 183 de este manual.
Es preferible usar discos comerciales y no los obsequiados por el productor del antibiótico. Al recibir discos obsequiados por el productor
del antibiótico, debe verificarse que éstos sean elaborados por una compañía especializada (por ejemplo: DIFCO o BBL), y no por la misma
compañía productora del antibiótico.
9-
Invertir las cajas e incubarlas por 16 a 18 horas a 36° C, nunca usar jarro
con candela (excepto para Haemophilus spp. y Neisseria spp.)
180
Fig. 12 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA ANTIBIOGRAMA
1. Tomar 4 ó 5 colonias
de igual morfología
del cultivo original
2. Inocular un tubo con
4 ml de caldo
Cualquier
medio sólido
o
3. Incubar por 2 a 5 hrs a 36 C hasta alcanzar la
turbidez del estándar 0.5 de MacFarland
Agar Mueller-Hinton
5. Sembrar caja
pre-secada en tres
direcciones opuestas
4. Empapar hisopo estéril, exprimir
bien contra las paredes del tubo
6. Dejar secar de 3 a 5
minutos (no más de 15)
y colocar discos de
antibióticos para
gram-positivo o
gram-negativo
7. Incubar por 16 a 18 hrs a
o
36 C y medir diámetros
de halos de inhibición;
interpretar según tablas
181
ANTIBIÓTICOS APROBADOS (FDA-USA) QUE DEBEN
USARSE RUTINARIAMENTE PARA PRUEBAS DE
SUSCEPTIBILIDAD EN VARIOS GRUPOS BACTERIANOS
Según: NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards), M7-A3
(M100-56), 1995.
Enterobacterias:
Grupo A, prueba inicial, reportar siempre:
11. Ampicilina*
12. Cefazolina*
13. Cefalotina*
14. Gentamicina*
Grupo B, prueba inicial, reportar selectivamente:
15. Mezlocilina o piperacilina
16. Ticarcilina
17. Ampicilina-sulbactam* o amoxicilina-ácido clavulánico
18. Piperacilina-tazobactam
19. Ticarcilina-ácido clavulánico
10. Cefmetazol
11. Cefoperazona
12. Cefotetan
13. Cefoxitina*
14. Cefamandol/cefonicida/cefuroxima
15. Cefotaxima*/ceftizoxima/ceftriaxona
16. Imipenem
17. Amikacina
18. Ciprofloxacina*
19. Trimetoprim-sulfametoxazol*
*
De utilidad en infección urinaria, además de carbenicilina, cinoxacina,
lamefloxacina/norfloxacina/ofloxacina, loracarbef y nitrofurantoína.
182
Pseudomonas aeruginosa y otros bacilos gram-negativo facultativos no de la
familia Enterobacteriaceae:
11. Mezlocilina o ticarcilina
12. Piperacilina
13. Gentamicina
14. Ceftazidima
15. Ticarcilina-ácido clavulánico
16. Cefoperazona
17. Aztreonam
18. Imipenem
19. Amikacina
10. Tobramicina
11. Ciprofloxacina
12. Trimetoprim-sulfametoxazol
Staphylococcus spp.:
11. Penicilina
12. Oxacilina o meticilina
13. Azitromicina
14. Vancomicina
15. Clindamicina
16. Claritromicina
17. Eritromicina
18. Trimetoprim-sulfametoxazol
1-
Después de 16 a 18 horas de incubación, examinar con buena luz las
cajas ya crecidas.
2-
Medir en milímetros el diámetro de los halos de inhibición completa
183
con una regla por detrás de la caja de Petri, o con patrones especiales.
No tomar en cuenta escasas colonias separadas dentro del halo de inhibición o crecimiento muy débil (80% de inhibición). Sin embargo, si se
observan múltiples colonias dentro del halo de inhibición, éstas deben
sub-cultivarse para descartar contaminación. En caso de tratarse de la
misma bacteria que se analiza, repetir el antibiograma de las colonias
que crecen dentro del halo. El “velo” de crecimiento de Proteus sp. dentro del halo, tampoco debe tomarse en cuenta. Medir siempre hasta el
márgen donde se inicia el crecimiento grueso.
3-
En el caso de sulfonamidas, puede ocurrir crecimiento dentro del halo,
el cual no debe tomarse en cuenta.
4-
En caso de urgencia puede efectuarse una lectura preliminar después
de 5 ó 6 horas de incubación, siempre y cuando la caja se reincube y
posteriormente se envíe el informe definitivo.
5-
Transformar las medidas de los diámetros de los halos de inhibición en
milímetros, a: resistente, intermedio, moderadamente susceptible o susceptible por medio del uso de tablas actualizadas.
Se deben utilizar las tablas de interpretación que son oficiales en Estados Unidos: National Comittee for Clinical Laboratory Standards
(NCCLS). Para este propósito, utilice las tablas de las páginas 185, 186 y
187 de este manual.
184
INTERPRETACIÓN DE LOS DIÁMETROS DE LAS ZONAS DE INHIBICIÓN (mm)
PARA MIEMBROS DE LA FAMILIA Enterobacteriaceae
Agente
antimicrobiano
Amikacina
Amoxicilinaácido clavulánico
Moderadamente
Contenido
Resistente Intermedio
Susceptible
susceptible
del disco (mcg)
≥17
130
≤14
20/10
≤13
14-17
≥18
15-16
110
≤13
14-16
≥17
10/10
≤11
12-14
≥15
130
≤15
16-21
≥22
Cefamandol
130
≤14
15-17
≥18
Cefazolina
130
≤14
15-17
≥18
Cefmetazol
130
≤12
13-15
≥16
Cefonicida
130
≤14
15-17
≥18
Cefoperazona
175
≤15
16-20
≥21
Cefotaxima
130
≤14
15-22
≥23
Cefotetan
130
≤12
13-15
≥16
Cefoxitina
130
≤14
15-17
≥18
Ceftazidima
130
≤14
15-17
≥18
Ceftizoxima
130
≤14
15-19
≥20
Ceftriaxona
130
≤13
14-20
≥21
Cefuroxima (oral)
130
≤14
15-22
≥23
Cefuroxima (parenteral)
130
≤14
15-17
≥18
Cefalotina
130
≤14
15-17
≥18
Cloranfenicol
130
≤12
Ciprofloxacina
135
≤15
Gentamicina
110
≤12
Imipenem
110
≤13
Kanamicina
130
≤13
Mezlocilina
175
≤17
Netilmicina
130
≤12
Piperacilina
100
≤17
Tetraciclina
130
≤14
Ticarcilina
175
≤14
Ampicilina
Ampicilina-sulbactam
Aztreonam
185
≥18
13-17
16-20
≥21
≥15
13-14
14-15
≥16
≥18
14-17
18-20
≥21
≥15
13-14
18-20
≥21
≥19
15-18
15-19
≥20
(Continuación)
Agente
Antimicrobiano
Ticarcilina-ácido
clavulánico
Moderadamente
Contenido
Susceptible
del disco (mcg)
susceptible
≥20
75/10
≤14
310
≤12
1.25/23.75
≤10
11-15
≥16
Carbenicilina
100
≤19
20-22
≥23
Cinoxacina
100
≤14
15-18
≥19
Nitrofurantoína
300
≤14
15-16
≥17
Norfloxacina
310
≤12
13-16
≥17
Ofloxacina
315
≤12
13-15
≥16
Sulfisoxazol
250 ó 300
≤12
13-16
≥17
315
≤10
11-15
>16
Tobramicina
Trimetoprimsulfametoxazol
15-19
≥15
13-14
Reportar sólo en
urocultivos:
Trimetoprim
INTERPRETACIÓN DE LOS DIÁMETROS DE LAS ZONAS
DE INHIBICIÓN (mm) PARA Staphylococcus spp.
Agente
antimicrobiano
Contenido
del disco
Moderadamente
Susceptible
susceptible
Amoxicilina- ácido
clavulánico
120/10 mcg
≤19
≥20
Ampicilina
10 mcg/ml
≤28
≥29
≥15
10/10 mcg
≤11
15-17
Cefazolina
30 mcg
≤14
15-17
Cefotaxima
30 mcg
≤14
15-22
≥23
Ceftriaxona
30 mcg
≤13
14-20
≥21
Cefalotina
30 mcg
≤14
15-17
≥18
Cloranfenicol
30 mcg
≤12
Ciprofloxacina
35 mcg
≤15
Clindamicina
32 mcg
≤14
15-20
≥21
Eritromicina
15 mcg
≤13
14-22
≥23
Gentamicina
10 mcg
≤12
13-14
≥15
Imipenem
10 mcg
≤13
186
12-14
≥18
≥18
13-17
16-20
14-15
≥21
≥16
(Continuación)
Agente
antimicrobiano
Contenido
del disco
Moderadamente
Susceptible
susceptible
Meticilina
135 mcg
≤9
10-13
≤9
≥14
Ofloxacina
315 mcg
≤12
≤12
13-15
≥16
Oxacilina
311 mcg
≤10
11-12
≤10
≥13
Penicilina G
10 U
≤28
≤28
≤28
≥29
Rifampicina
315 mcg
≤16
17-19
≤16
≥20
Tetraciclina
330 mcg
≤14
15-18
3≤14
≥19
1.25/23.75 mcg
≤10
≤10
11-15
≥16
330 mcg
3≤9
10-11
3≤9
3≥12
Trimetoprimsulfametoxazol
Vancomicina
Reportar
sólo sólo
en uro:
Reportar
en urocultivos:
Nitrofurantoína
300 mcg
≤14
15-16
≤14
≥17
Norfloxacina
310 mcg
≤12
13-16
≥17
Sulfisoxazol
250 ó 300 mcg
≤12
≤12
13-16
Trimetoprim
315 mcg
≤10
11-15
≥16
≥17
Tomado de: Munro, S. 1992. Disk Diffusion Susceptibility Testing. In: Isenberg, H.D. (Editor
in Chief). CLINICAL MICROBIOLOGY PROCEDURES HANDBOOK. Two
volumes. American Society for Microbiology. Washington, D.C., U.S.A. Basado
en: NCCLS. 1991. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility
Testing. Third informational supplement. M100-S3. NCCLS, Villanova,
Pennsylvania, U.S.A.
CONTROL DE CALIDAD
Para controlar la efectividad y reproducibilidad de la prueba, cada laboratorio
debe mantener refrigeradas en agar inclinado y sub-cultivar semanalmente las
siguientes dos cepas bacterianas estándar, que producen patrones de suscepti-bilidad
conocidos:
a)
b)
Escherichia coli ATCC 25922 (gram-negativo)
Staphylococcus aureus ATCC 25923 (gram-positivo)
La susceptibilidad de las dos cepas patrón debe probarse con cada lote nuevo
187
de medio Mueller-Hinton, o una vez a la semana. Nunca hacerlo de los cultivos
refrigerados, hacerlo de colonias previamente sub-cultivadas en agar sangre.
Las zonas de inhibición de los patrones conocidos sirven para evaluar la precisión de la prueba. Los halos de inhibición de las dos cepas control deben estar
entre los rangos de la siguiente tabla:
LÍMITES ACEPTABLES DE LOS HALOS DE INHIBICIÓN (mm)
QUE DEBEN OBTENERSE CON LAS CEPAS CONTROL Y ALGUNOS
ANTIBIÓTICOS
Antibiótico
S. aureus ATCC 25923
E. coli ATCC 25922
Amikacina
--------
19 - 26
Ampicilina
27 - 35
16 - 22
29 - 37
20 - 24
Aztreonam
--------
28 - 36
Ceftazidima
--------
25 - 32
Clindamicina
24 - 30
--------
Cloranfenicol
19 - 26
21 - 27
Eritromicina
22 - 30
--------
Gentamicina
19 - 27
19 - 26
Penicilina-G
26 - 37
--------
Tetraciclina
19 - 28
18 - 25
Tobramicina
--------
18 - 26
Trimetoprim-sulfametoxazol
24 - 32
24 - 32
FUENTES COMUNES DE ERROR:
12345-
Usar otro medio que no sea Mueller-Hinton.
Mala estandarización de la turbidez del inóculo.
Mala preparación del medio, no ajustar el pH entre 7.2 y 7.4.
Usar medio vencido o cajas mal almacenadas.
Mal almacenaje de los discos con antibióticos.
188
161718191011121314151617-
Mala preparación o almacenaje del estándar 0.5 de MacFarland.
No exprimir el hisopo en las paredes del tubo.
Retraso entre la preparación del inóculo y la siembra (aumenta la
concentración bacteriana).
Retraso en la aplicación de los discos en las cajas ya inoculadas.
Exceso de incubación de las cajas.
Uso de jarro con candela o incubación a otra temperatura que no sea
36° C.
Lectura prematura antes de 16 a 18 horas de incubación.
Mala medición de los halos de inhibición.
Cultivos mixto, no puros.
Aplicación de la técnica a anaerobios o bacterias de crecimiento lento.
No usar las cepas control.
Errores de transcripción de resultados.
La prueba de susceptibilidad antimicrobiana de difusión sobre agar, propuesta
desde 1966 por Bauer, Kirby, Sherris y Truck, continúa siendo aceptable y práctica.
Es indispensable hacer notar el enorme avance que se ha logrado recientemente en
la miniaturización y automatización del antibiograma. Si el laboratorio tiene posibilidades económicas y técnicas, debe utilizar alguno de los procedimientos modernos de antibiograma por dilución, miniaturizado e idealmente automatizado.
El autor tiene conocimiento de dos métodos de este tipo, disponibles en nuestro
medio que dan buenos resultados: ATB/VITEK de Bio Merièux y SENSIDENT de
Merck.
ESPECIFICACIONES PARA PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD*
DE DOS ANTIBIÓTICOS DE PFIZER
(Para bacilos gram-negativo facultativos y Staphylococcus spp.)
Nombre
genérico
Nombre
comercial
Azitromicina
(macrólido,
azálido)
Zithromax
Ampicilinasulbactam
Unasyn
(Sultamicilina)
Contenido
del disco
Interpretación del diámetro
del halo (mm)
Intermedio Susceptible
Resistente
15 mcg
≤ 13
14-17
≥ 18
10 mcg de
ampicilina +
10 mcg
sulbactam
≤ 11
12-14**
≥ 15
** Método de difusión en disco sobre agar según Bauer-Kirby.
** Moderadamente susceptible.
189
ANUNCIO
UNASYN
(blanco y negro,
cara de niño)
191
DOCUMENTO
UNASYN
(blanco y negro
columna vertical,
debe decir
UNASYN al
principio)
192
CAPÍTULO 17
ANAEROBIOS
PROPÓSITO:
Demostrar por medio de cultivo con procedimientos especiales, la presencia
de bacterias anaerobias, es decir aquellas que no crecen en presencia de oxígeno
del aire. Estas bacterias son normales y predominan en las microbiotas de las
mucosas (boca, intestino, heces, vagina, etc.) En determinadas circunstancias llegan a sitios anatómicos diferentes y causan infección, generalmente en asociación
con bacterias aerobias tales como enterobacterias, pseudomonas o cocos gram-positivo. Por esta razón, siempre debe hacerse frote Gram del material clínico y cultivo aerobio, además del cultivo en anaerobiosis (ausencia de oxígeno).
MUESTRA:
Si en algún tipo de análisis bacteriológico es de vital importancia la toma de
la muestra y su transporte al laboratorio, es en el caso de los anaerobios. Esto se
debe principalmente a dos factores:
-
La muestra debe tomarse con mucho cuidado a manera de no contaminarla con bacterias de los sitios colonizados normalmente por anaerobios.
Por esta razón, el médico a veces debe tomar muestras de secreciones
del pulmón por punción trans-traqueal (para evitar los anaerobios de la
orofaringe), o punción suprapúbica de la vejiga (para evitar los
anaerobios de la uretra).
-
Las bacterias anaerobias son muy susceptibles al oxígeno del aire. Si los
anaerobios en la muestra entran brevemente en contacto con aire, pierden muy rápidamente su viabilidad (capacidad de reproducirse en cultivo). Por esta razón deben seguirse al pie de la letra instrucciones, tanto
para toma de la muestra como para su transporte al laboratorio.
Hallazgos clínicos que sugieren infección causada por anaerobios:
12-
Pus con mal olor.
Infección cerca de membranas mucosas.
193
131415161718191011121314-
Tejido necrótico, gangrena o formación de pseudo-membranas.
Gas en tejido o secreción.
Endocarditis con hemocultivos rutinarios negativos.
Infección asociada con cáncer u otros procesos que causan destrucción
de tejidos.
Infección relacionada con uso de antibióticos aminoglucósidos.
Tromboflebitis séptica.
Bacteremia con ictericia.
Infección causada por mordidas humanas o de animales (investigar
Pasteurella multocida, cocobacilo gram-negativo aerobio).
Pus sanguinolento y negruzco que puede fluorecer de color rojo bajo
luz ultravioleta (Bacteroides melaninogenicus).
Presencia de “gránulos de azufre” en pus de lesiones en mandíbula u
otro sitio (actinomicosis, buscar Actinomyces israelii).
Signos y síntomas de gangrena gaseosa.
Entidades clínicas que generalmente implican anaerobios como aborto
séptico, o cirugía gastrointestinal infectada.
TOMA DE MUESTRA PARA CULTIVO DE ANAEROBIOS:
Si se sospechan anaerobios en la muestra, ésta debe manejarse de manera
especial. Los sitios anatómicos de donde se requiere tomar muestra son muy variados, generalmente las muestras aceptables para cultivo de anaerobios son:
1234567-
Pus aspirado.
Tejidos varios (biopsia, cirugía, autopsia).
Fluidos corporales (LCR, líquido pleural, paracentésis, pericárdico,
sinovial).
Aspirado por punción trans-traqueal.
Aspirado por punción pulmonar directa.
Orina aspirada por punción supra-púbica.
“Gránulos de azufre” de pacientes con sospecha de actinomicosis.
Las muestras no aceptables para cultivo de anaerobios, pues contienen normalmente estas bacterias y siempre deben ser rechazadas si se solicita este tipo de
cultivo, son:
123-
Hisopos de garganta o boca.
Esputo espectorado.
Material de broncoscopía no colectado con catéter de doble lumen.
194
45678-
Heces, contenido intestinal, hisopo rectal.
Hisopo de lesiones superficiales (úlceras de decúbito, etc.)
Material contiguo a mucosas.
Orina colectada al vuelo.
Hisopos vaginales o cervicales.
En todo caso, evitar contaminaciones con microbiota anaerobia normal. No
deben pasar más de 10 minutos para transportar este tipo de muestras al laboratorio. Si no es posible transportarla con esta rapidez la muestra debe inocularse en un
frasco o dispositivo especial que la mantenga en anaerobiosis.
El laboratorio de microbiología debe ser alertado que se tomará una muestra
para anaerobios, para que tenga listo el material necesario y la muestra se siembre
cuanto antes. El personal del laboratorio debe conocer bien los procedimientos especiales para toma de muestra y aislamiento de anaerobios. Tomar las muestras
con hisopo es menos satisfactorio que aspirar. Esto se debe a que el hisopo puede
exponer a los anaerobios al oxígeno del ambiente, tiende a secarse rápidamente y
permite colectar una muestra muy pequeña.
En resumen para lograr el cultivo de las bacterias anaerobias deben tomarse
las siguientes precauciones.
1234-
Cultivar el material clínico inmediatamente después de obtenido.
Emplear medios frescos.
Obtener condiciones anaerobias adecuadas.
Efectuar el sub-cultivo de colonias inmediatamente después de sacarlas
del medio anaerobio.
TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS AL LABORATORIO:
Si la muestra no va a ser inoculada antes de 10 minutos de obtenida, debe
colocarse en ambiente anaerobio para su transporte. Para este propósito, usar recipientes especiales obtenidos comercialmente (de preferencia “culturettes”, para
transporte de anaerobios). En caso de no contarse con este material, por lo menos
colocar la muestra lo más pronto posible en caldo tioglicolato. Este medio líquido
contiene tioglicolato de sodio que reduce el medio y lo hace anaerobio en el fondo.
Siempre debe usarse medio fresco, calentar el tubo por 10 minutos (tapón de rosca
flojo) en baño de agua hirviendo, y luego enfriar en agua fría. El caldo debe quedar amarillo con una capa rosada delgada en la superficie.
195
Si la muestra se aspiró con una jeringa, debe sacarse todo el aire (que no queden burbujas), y sellar la punta de la aguja insertando un tapón de hule.
PROCEDIMIENTO:
La muestra recién tomada, o adecuadamente transportada al laboratorio, debe procesarse así:
En primer lugar, siempre hacer un frote y colorearlo con Gram.
2-
Sembrar la muestra por estrías en una
caja de agar sangre de carnero al 5%
fresca y en el fondo de un tubo de caldo tioglicolato (hervido y enfriado).
3-
Introducir rápidamente la caja con el
medio hacia arriba y el tioglicolato en
un jarro Gas-Pak limpio y seco. Abrir
un sobrecito indicador de anaerobiosis
Jarro Gas-Pak
y colocarlo dentro del jarro a manera
de que la almohadilla con azul de metileno se vea claramente. Inmediatamente cortar con tijera la esquina indicada del sobre generador de hidrógeno y CO2 (sin apacharlo), y con pipeta de vidrio (no insertarla),
agregarle 10 ml de agua destilada. Colocar el sobre con la abertura hacia
arriba y cerrar fuertemente el jarro con la tapadera especial y la pinza de
tornillo. La tapadera tiene por dentro una canastilla metálica que puede
desenroscarse. Adentro debe colocarse un sobrecito de trocitos de paladio
iridiado que actúa como catalítico para combinar el oxígeno dentro del
jarro con el hidrógeno producido por el sobre generador y formar agua.
Con el uso, el catalítico se inactiva, por lo que una vez a la semana deben calentarse los trocitos a 100° C por treinta minutos (en cápsula de
porcelana, dentro del horno de secar material), para reactivarlo y secarlo periódicamente.
4-
Adicionalmente, toda la muestra que llega al laboratorio para cultivo de
anaerobios debe sembrarse por estrías en otro agar sangre de carnero,
MacConkey y manitol-sal, los cuales se incuban aeróbicamente.
196
H2+CO2
1-
Hallazgos bacteriológicos que sugieren la presencia de anaerobios:
1-
Morfología sugestiva en el Gram directo de la muestra.
2-
Ausencia de crecimiento aerobio de las bacterias observadas en el Gram
directo.
3-
Crecimiento en el fondo del tioglicolato hace sospechar anaerobios. Ausencia de crecimiento en tioglicolato no descarta definitivamente la presencia de anaerobios.
4-
Gas o mal olor en la muestra o el cultivo.
5-
Colonias características en el agar sangre incubado en Gas-Pak.
6-
Colonias negras después de incubación prolongada indican Bacteriodes
melaninogenicus; las colonias jóvenes pueden dar fluorescencia roja bajo
luz ultravioleta.
La identificación hasta especie de todas las bacterias anaerobias de interés
clínico es una tarea compleja y altamente especializada. Se recomienda seguir las
siguientes claves para efectuar la identificación presuntiva. En primer lugar, una
interpretación correcta y acuciosa del frote de la muestra original coloreado con
Gram, permite sospechar qué bacterias anaerobias se deben aislar, y en algunos
casos permite la detección de anaerobios cuyo aislamiento no se logra por alguna
causa. Observar y reportar el frote Gram según lo indicado y luego correlacionar
con las bacterias anaerobias y aerobias aisladas.
Observar y registrar en el frote Gram del material clínico, lo siguiente:
1-
La reacción al Gram, el tamaño, la forma y la cantidad relativa de las
bacterias presentes.
2-
La presencia de esporas, su forma y posición en la célula.
3-
Cualquier característica morfológica especial como ramificación pseudoramificación, formación de cadenas, filamentos, cuerpos esféricos o diminutas formas granulares.
197
4-
Comparar con la siguiente tabla como guía, y correlacionar con el cultivo anaerobio.
CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE ALGUNOS BACILOS ANAEROBIOS
GRAM-NEGATIVO DE IMPORTANCIA MÉDICA
ESPECIE
*
MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA
COLONIA
Bacteroides
fragilis
Bacilos regulares con extremos redondeados*, pueden ser pleomórficos (agar
sangre); comúnmente vacuolados (tioglicolato); pueden presentar cuerpos
esféricos en su interior.
En motas, circular, entera y brillante.
Bacteroides
melaninogenicus
Cocobacilos* (agar sangre); pleomórficos,
vacuolados,
bacilos
degenerados
(tioglicolato).
Colonias negras en
agar sangre después de
4-5 días de incubación.
Bacteroides
variabilis
Bacilos pequeños con extremos redondeados*; vacuolados.
Colonias circulares,
enteras, brillantes u
opacas con bordes
translúcidos.
Fusobacterium
necrophorum
(Sphaerophorus
necrophorus)
Bacilos pleomórficos con extremos redondeados*; esférulas y cuerpos redondeados.
Umbonada (con centro
más alto que el resto
de la colonia), opaca,
con borde translúcido
circular.
Fusobacterium
fusiforme
Bacilos delgados con extremos adelgazados
terminados en punta; algunos o la mayoría
filamentosos (agar sangre y tioglicolato).
Circular, entera.
Ver figura 12: Diversas Morfologías Bacterianas
INTERPRETACIÓN DEL CULTIVO
1-
Después de no menos de 48 horas de incubación, destapar el jarro: Antes de abrirlo notar que el indicador debe estar blanco y la superficie
interior del jarro con gotas de agua. Si el indicador está celeste y no hay
agua de condensación, significa que no se produjo anaerobiosis y deben
revisarse los procedimientos. Notar un fuerte olor pútrido característi198
co de los anaerobios. Descartar el indicador y el sobre generador de hidrógeno y CO2.
2-
Examinar simultáneamente la caja de agar sangre y el tubo de tioglicolato.
Debe tenerse a mano el resultado de los crecimientos aerobios, ya que
muchas bacterias facultativas crecen tanto en aerobiosis como en
anaerobiosis. Es de esperarse que enterobacterias, pseudomonas,
estafilococos y estreptococos también crezcan en el agar sangre anaerobio,
pues son facultativos. Examinar las cajas con buena luz, con lupa y microscopio estereoscópico.
3-
Hacer inmediatamente frote Gram y sub-cultivo en agar sangre de carnero al 5% y en tioglicolato (hervido y enfriado) de cada tipo de colonias
que no corresponda a aerobios ya previamente identificados. También
sembrar un sub-cultivo en agar sangre aerobio donde los anaerobios
verdaderos no crecen. Es muy frecuente que se encuentran en la misma
muestra dos o más anaerobios además de varios aerobios.
4-
Incubar aeróbicamente el agar sangre de carnero donde se efectuó el
sub-cultivo y el tioglicolato original. Si no se observa crecimiento en el
agar sangre aerobio a las 24 a 48 horas, se trata verdaderamente de un
anaerobio. Hacer frote Gram del crecimiento en tioglicolato y referirse a
la tabla para confirmar la identificación presuntiva de los anaerobios.
5-
La presencia de colonias con doble zona de beta hemólisis. Y que
microscópicamente son bacilos gram-positivo gruesos, generalmente
poco o no esporulados, indican la presencia de Clostridium perfringens.
Esta bacteria se aisla de lesiones gangrenosas y heridas contaminadas
con tierra (gangrena gaseosa). Debe reportarse inmediatamente.
6-
La mayoría de anaerobios que causan infección verdadera en humanos
son gram-negativo, en especial Bacteroides fragilis. Identificar
presuntivamente a los anaerobios gram-negativo según la tabla que aparece en la página siguiente.
199
IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA DE VARIOS
ANAEROBIOS DE IMPORTANCIA MÉDiCA
MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA
Bacilos gram-negativo, pleomóficos; se colorean pálidamente
algunos presentan cuerpos esféricos o predo minio de cocobacilos*.
Bacteroides sp.
Bacilos pálidamente gram-negativo, finos con los extremos en
punta*.
Fusobacterium sp.
Pequeños diplococos* gram-negativo, semejantes a Neisseria pero
mucho más pequeños.
Veillonella sp.
Bacilos gram-positivo gruesos o finos que presentan esporas las
cuales no se tiñen con Gram.
Clostridium sp.
Cocos gram-positivo ovalados o lanceolados* con tendencia a
agruparse en cadenas; semejantes a Streptococcus sp., pero
anaerobios.
*
REPORTAR
Peptostreptococcus sp.
Cocos gram-positivo redondos con tendencia a agruparse en racimos*; semejantes a Staphylococcus sp., pero anaerobios
Peptococcus sp.
Bacilos gram-positivo no esporulados.
Se aisló un bacilo
anaerobio gram-negativo no esporulado.
Bacilos gram-positivo no esporulados, ligeramente ramificados;
colonias en forma de “muelas”.
Actinomyces sp.
Ver figura 13: Diversas Morfologías Bacterianas
200
Fig. 13 DIVERSAS MORFOLOGÍAS BACTERIANAS
Cocos sueltos
Cocos en parejas
(diplococos)
Cocos en cadenas
(estreptococos)
Cocos en racimos
(estafilococos)
Cocos en
tétradas
Cocobacilos
Bacilos en forma
de maza
(difteroides)
Bacilos con bordes
redondeados
Bacilos con
bordes
cuadrados
Fusobacterium sp.
Vibrio sp.
Spirillum sp.
Borrelia sp.
Treponema sp.
201
Leptospira sp.
7-
En el caso de bacilos anaerobios gram-negativo, hacer un sub-cultivo en
agar sangre de carnero y colocar en las primeras estrías los siguientes
discos:
-
Kanamicina
Vancomicina
Colistina
(1,000 mcg)
(5 mcg)
(10 mcg)
La presencia de halo de inhibición indica susceptible (S), no hay halo es resistente (R), V = variable. Interpretar los resultados junto con otras pruebas
confirmatorias, así:
Bacteria
Kanamicina
Vancomicina
Colistin
Bacteroides fragilis
R
R
R
Otros Bacteroides sp.
R
R
V
B. melaninogenicus
R
R
V
B. ureolyticus
S
R
S
Fusobacterium nucleolatum
S
R
S
F. necrophorum
S
R
S
F. mortiferum
S
R
S
F. varium
S
R
S
Fusobacterium sp.
S
R
S
Se sugiere que en los laboratorios clínicos, sea el profesional microbiólogo
quien efectúe la identificación definitiva o presuntiva de los anaerobios.
INFORME:
Según los criterios anteriores y otros que pueden obtenerse en literatura especializada, informar las bacterias anaerobias aisladas. No se efectúa prueba de susceptibilidad para anaerobios mientras no se cuente con una técnica sencilla que
pueda implementarse en los diversos laboratorios de nuestro medio.
202
CAPÍTULO 18
MICOBACTERIAS
PROPÓSITO:
Demostrar por medio de coloraciones y cultivos especiales la presencia de
bacterias pertenecientes al género Mycobacterium especialmente Mycobacterium tuberculosis, llamado comúnmente “BK” (Bacilo de Koch).
Este grupo de bacterias en forma de bacilo, se tiñen con dificultad por el alto
contenido de grasas en su pared celular. Para lograr teñirlas deben usarse colorantes con fenol y/o calor. Una vez teñidas con fuchsina carbólica (fenolada) no se
decoloran con alcohol acidificado. Por esta característica muy particular se les llama “bacilos alcohol-ácido resistentes” (abreviado BAAR). No usar el término “ácido-alcohol resistentes”.
Las micobacterias son aerobios estrictos, no móviles, no poseen cápsula ni
producen esporas. Su crecimiento es sumamente lento; la mayoría de las especies
patógenas crecen después de 2 a 6 semanas de incubación a 36° C en el medio de
Lowenstein-Jensen. Aproximadamente 12 especies de Mycobacterium se asocian a
infección humana. En nuestro medio, sin lugar a duda, M. tuberculosis es la especie
más importante. Las micobacterias en general producen granulomas destructivos
de crecimiento lento, que pueden sufrir necrosis o cavitación. La detección de
micobacterias es una gran responsabilidad para el laboratorio de microbiología, ya
que un resultado positivo de frote o cultivo implica serias consecuencias para el
paciente y afecta su vida con un tratamiento específico por varios meses, o incluso
años.
MUESTRAS
1.
Esputo: La tuberculosis es en nuestro medio la infección humana más importante causada por micobacterias. Esta infección crónica generalmente ocurre
en los pulmones por la inhalación del agente causal, el cual por lo general es
M. tuberculosis (muy rara vez M. bovis o M. kansasii). Por esta razón, el esputo
es la muestra que con mayor frecuencia se remite al laboratorio para la investigación de tuberculosis.
203
El esputo debe colectarse temprano en la mañana, inmediatamente al
despertar. De preferencia tres a cuatro muestras (seriadas) en días
alternos.
El primer esputo de la mañana es la muestra más adecuada para el análisis,
pues es concentrada y menos contaminada, ya que el paciente no ha comido
o bebido durante la noche. Un sólo esputo es más adecuado que un “pool” o
mezcla de varias muestras.
Colectar la muestra de esputo así: el esputo, al igual que cualquier otra muestra para micobacterias, debe colectarse antes de iniciar tratamiento, que puede inhibir el crecimiento.
Indicar al paciente que al despertar se enjuague la boca dos veces con agua
corriente; no usar pasta dental o cualquier otro antiséptico.
Acostado boca abajo en su cama, el paciente debe desgarrar esputo lo más
profundamente posible; así como estar consciente de que descargas
nasofaríngeas o saliva no son esputo. El esputo se produce después de un
acceso de tos que expulsa material exudativo de los pulmones; 5 a 10 ml de
esputo es la cantidad adecuada para análisis, pero cualquier volumen debe
procesarse.
El paciente debe depositar la muestra en un recipiente estéril de boca ancha
proporcionado por el laboratorio. De preferencia deberán usarse recipientes
especiales de plástico descartables, del tipo que incluye adentro un tubo grueso
para efectuar el proceso.
El buen esputo para análisis de micobacterias es caseoso (apariencia de queso), puede ser verdoso o amarillento. Si no se remite o procesa rápidamente,
adicionar aproximadamente 0.5 g de carbonato de sodio (Na2CO3), para disminuir el crecimiento de contaminantes y luego debe refrigerarse o congelarse. Se debe identificar bien la muestra con una etiqueta que tenga el nombre y
número de registro del paciente, la fecha y tipo de muestra.
Debido a que el exterior del recipiente puede contaminarse durante la
obtención de la muestra, debe colocarse en una bolsa plástica y luego llevarse
al laboratorio. Si el paciente produce muy poca cantidad de esputo, puede
examinarse un “pool” de 24 a 48 horas de colección continua, aunque no es lo
deseable.
204
En pacientes que tienen dificultad para producir esputo puede usarse varios
métodos:
2.
a)
Nebulización de solución salina hipertónica (cloruro de sodio al 10%,
sin propilenglicol), es excelente para inducir la producción de esputo,
generalmente diluído.
b)
Los hisopos faríngeos pueden ser usados en estos pacientes para extraer el esputo. Especialmente este procedimiento es aconsejable para
niños pequeños a los cuales no se les puede pedir una muestra adecuada.
c)
Broncoscopía: puede ser usada para obtener las muestras directamente
del sitio infectado. Se obtienen muy buenas muestras.
Lavado gástrico: Frecuentemente se solicita lavado gástrico para análisis de
micobacterias. No se usa para detectar tuberculosis del estómago, sirve para
demostrar micobacterias del esputo que el paciente involuntariamente se ha
tragado.
Este procedimiento está indicado en los siguientes pacientes:
a)
Con evidencia radiológica de tuberculosis pulmonar y en quienes los
exámenes de esputo son negativos.
b)
En pacientes que no cooperan, diciendo que no producen esputo o se lo
tragan.
c)
Los que no pueden expectorar porque padecen de otros trastornos: estados de coma, enfermedad neurológica, etc.
d)
En los niños en los que normalmente se hace difícil obtener la muestra
de esputo.
La investigación microscópica de BAAR en lavado gástrico no es recomendable como un procedimiento diagnóstico único y definitivo, pues BAAR como
M. gastri forman parte de la microbiota gástrica y no se pueden diferenciar de
M. tuberculosis. Sin embargo, múltiples BAAR en contenido gástrico generalmente se correlacionan con cultivos positivos de M. tuberculosis y constituye
información valiosa inmediata con utilidad clínica.
205
El lavado gástrico debe ser efectuado en la mañana, cuando el estómago está
vacío (por lo menos 8 horas después que el paciente ha comido o tomado
medicamentos orales), es mejor que el paciente se levante de su cama y que la
muestra se obtenga 30 minutos después de inducir esputo por nebulización.
Deben usarse sondas de Levin, jeringas estériles de 50 ml y 20 a 30 ml de agua
destilada estéril. Introducir la sonda al estómago por la nariz, inyectar el agua,
succionar e inyectar de nuevo varias veces.
La muestra obtenida debe colocarse en recipiente estéril de boca ancha. Debido a que las micobacterias pueden destruirse rápidamente en los lavados
gástricos por la acción del ácido clorhídrico del estómago, la muestra debe ser
procesada en un período de tiempo que no exceda de 20 minutos.
Si por cualquier circunstancia no es posible procesarla rápidamente, es necesario neutralizarla, agregando carbonato de sodio al 10%, solución de fosfato
trisódico anhidro al 10%, solución de fosfato trisódico con 12 moléculas de
agua al 23% o bien cristales de fosfato disódico. En todos los casos es aconsejable usar rojo fenol como indicador para saber si el pH está entre 7 y 8. No
neutralizar las muestras que son procesadas antes de 4 horas después de obtenidas y mantenidas en refrigeración.
3.
Orina: Se debe examinar un mínimo de tres muestras de la primera orina de
la mañana colectada “al vuelo” en recipiente estéril de boca ancha (ver capítulo 7), o muestras obtenidas por catéter. Se debe colectar toda la orina posible cada vez, algunas veces se utiliza orina colectada durante 12 a 24 horas, la
cual es menos adecuada porque generalmente está muy contaminada y contiene menos micobacterias viables que la primera orina de la mañana. Las
muestras deben mantenerse refrigeradas mientras se procesan lo antes posible; no utilizar recipientes con preservativos.
4.
Otro tipo de muestras: La tuberculosis es una infección que puede localizarse
en casi cualquier parte del cuerpo, por esta razón pueden analizarse las siguientes muestras de líquidos, exudados o tejidos:
Lavado bronquial
Fragmentos de pulmón
Hisopo faríngeo
Líquido cefalorraquídeo
Líquido pleural
Líquido articular
Pus
206
-
Raspado endometrial/sangre menstrual
Médula ósea
Líquido pericárdico
Trozos de varios tejidos obtenidos en autopsia
Heces (en ocasiones muy especiales)
Por lo general este tipo de muestras son obtenidas por el médico en recipientes estériles proporcionados por el laboratorio. Si es necesario se puede adicionar heparina o citrato de sodio como anticoagulantes; no usar preservativos o fijadores.
Es conveniente obtener un volumen grande de muestra; si la cantidad es pequeña adicionar solución salina para evitar desecación. Si la muestra no se
examina inmediatamente debe refrigerarse.
PROCEDIMIENTO:
Baciloscopía: El diagnóstico de micobacteriosis se basa en la observación de
los bacilos alcohol-ácido resistente en la muestra y su cultivo in vitro. Los bacilos
alcohol-ácido resistentes deben teñirse con las coloraciones de Ziehl-Neelsen o
Kinyoun; ambas tinciones dan buenos resultados. La diferencia fundamental consiste en lo siguiente: Ziehl-Neelsen sí utiliza calentamiento de la lámina y Kinyoun
no, además la fuchsina de Kinyoun es más concentrada.
Coloración de Ziehl-Neelsen: Preparar frotes delgados de la muestra a examinar. Si se trata de esputo trasladar la muestra a una caja de Petri estéril y examinarla con buena luz sobre fondo oscuro. Con aplicadores de madera quebrados,
seleccionar los fragmentos anormales (con pus verdoso, blanquesino o amarillento; sangre rojiza o herrumbrosa). Colocar un pequeño fragmento entre dos
portaobjetos de vidrio, aplastar varias veces el esputo y luego deslizar una lámina
sobre otra para obtener dos frotes parejos y delgados. Escoger el mejor, dejar secar
y luego fijar moderadamente con calor sobre la llama del mechero (igual que para
la coloración de Gram). Puede colorearse sedimento del esputo digerido/
descontaminado, u otras muestras clínicas.
Procedimiento de la coloración de Ziehl-Neelsen:
1-
Poner el frote ya fijado y frío en el soporte de coloración cerca del lavatrastos,
colocarle encima un trozo de papel filtro para que mantenga el colorante sobre el frote.
207
12-
Cubrir el papel filtro con fuchsina carbónica de Ziehl-Neelsen; debe quedar
bien empapado.
13-
Calentar cuidadosamente la lámina por debajo, ya sea con un mechero de
alcohol o con un hisopo grande empapado en alcohol. Calentar suavemente
hasta el aparecimiento de humos blancos. No debe hervir. Dejar colorear el
frote por 5 minutos sin calentar más. Si la lámina se seca agregar más fuchsina
sin volver a calentar.
14-
Remover el papel filtro y lavar con agua corriente (usar poca presión).
15-
Decolorar el frote con alcohol-ácido hasta que ya no salga más colorante rojo
(aproximadamente 2 minutos). Debe insistirse en la decoloración ya que es el
paso diferencial. Los frotes gruesos requieren mayor tiempo de decoloración,
pero tampoco se debe decolorar excesivamente.
16-
Lavar brevemente con agua corriente.
17-
Cubrir el frote con azul de metileno por 1 ó 2 minutos.
18-
Lavar con agua corriente.
19-
Dejar secar al aire o flamear muy brevemente, pero no secar con papel absorbente.
10-
Examinar el frote con el lente de inmersión, con cuidado de limpiar el aceite
del lente entre cada frote para no acarrear micobacterias de una muestra a
otra.
11-
No efectuar coloraciones simultáneas de varias muestras en recipientes de
Coplin, porque también puede haber transferencia de micobacterias entre las
muestras.
REACTIVOS PARA ZIEHL-NEELSEN
1-
Fuchsina carbólica de Ziehl-Neelsen (colorante principal)
Solución saturada de fuchsina básica .............................. 10 ml
Preparar solución saturada de fuchsina básica así:
Disolver 3 gramos de fuchsina básica en 100 ml de alcohol etílico al 95%.
208
Solución acuosa de fenol al 5% ........................................ 90 ml
Preparar solución de fenol al 5%, así: (Fundir los cristales de fenol en baño de
María, medir 5 ml con probeta, (no con pipeta), y luego llevar a volumen de
100 ml con agua destilada estéril.
2-
Alcohol-ácido (decolorante):
Acido clorhídrico concentrado ......................................... 93 ml
Alcohol etílico al 95% ........................................................ 95 ml
3-
Azul de metileno (colorante de contraste):
Cloruro de azul de metileno ........................................... 0.3 gramos
Agua destilada .................................................................. 100 ml
Según F. Ziehl (1882), y Neelsen (1885), Alemania.
COLORACIÓN DE KINYOUN:
Esta coloración da buenos resultados, comparables al Ziehl-Neelsen, si se efectúa según la técnica exacta. Tiene la ventaja que no necesita calentamiento. Proceder así:
1-
Preparar el frote igual que para Ziehl-Neelsen y fijarlo con calor.
2-
Colocar la lámina en la gradilla de coloración y dejar que enfríe. Cubrir el
frote con fuchsina de Kinyoun y dejar que se coloree por 4 minutos. No es
necesario calentar.
3-
4-
Decolorar el frote con alcohol-ácido hasta que ya no salga más colorante rojo.
Insistir en este paso pues es el que diferencia a las bacterias.
5-
6-
Cubrir el frote con azul de metileno por 1 ó 2 minutos.
7-
8-
Dejar secar y examinar con el lente de inmersión. En general tomar las mínimas precauciones que para la coloración de Ziehl-Neelsen.
209
REACTIVOS PARA KINYOUN
1-
Fuchsina carbólica de Kinyoun:
Fuchsina básica .................................................................... 4 gramos
Fenol fundido ................................................................... 128 ml
Alcohol etílico al 95% ...................................................... 120 ml
Agua destilada .................................................................. 100 ml
Disolver la fuchsina en el alcohol y luego adicionar el agua lentamente con
agitación. Fundir cristales de fenol en baño de agua caliente a 56° C, medir
con pipeta 8 ml y adicionar a la fuchsina.
2-
Alcohol ácido: igual al de Ziehl-Neelsen (ácido clorhírico concentrado: 3 ml,
más alcohol etílico al 95%: 97 ml)
3-
Azul de metileno: igual al de Ziehl-Neelsen (0.3 gramos de cloruro de azul
de metileno, disolver en 100 ml de agua destilada).
Según Kinyoun: Am. J. Pub. Health, 5: 867, 1915.
INTERPRETACIÓN E INFORME DE BACILOSCOPIAS:
La característica de “alcohol-ácido resistencia” típica de las micobacterias hace
que la baciloscopía tenga una importancia fundamental. Se usa para seguir el curso
del tratamiento y para dar de alta al paciente en el hospital, para continuar su tratamiento ambulatorio.
Tomar muy en cuenta las siguientes consideraciones:
1-
Sin excepción alguna, utilice la siguiente clave para reportar todos los frotes para micobacterias. Esta forma de reportar ha sido estandarizada por la
Asociación Nacional de Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias de Estados Unidos, con el objeto de poder comparar resultados de distintos laboratorios y orientar adecuadamente al médico.
210
REPORTE DE FROTES PARA MICOBACTERIAS
NÚMERO DE BACILOS
ALCOHOL-ÁCIDO RESISTENTE
0
REPORTE
No se observan bacilos alcohol-ácido resistentes
1 a 2 en todo el frote
Informar el número de BAAR encontrados y pedir
nueva muestra
3 a 9 en todo el frote
+ o escasos
10 ó más en todo el frote
++ o regular cantidad
1 ó más por campo
+++ o abundantes
2-
Un frote para diagnóstico de tuberculosis o cualquiera otra micobacteriosis
debe examinarse de 10 a 15 minutos antes de darse por negativo. Si se trata
de L.C.R. debe observarse aún por más tiempo.
3-
La especie del microorganismo alcohol-ácido resistente no puede determinarse sólo por la morfología microscópica, debe hacerce por cultivo. Sin embargo, algunas características pueden orientar, por ejemplo:
Nocardia spp. frecuentemente produce ramificaciones y Mycobacterium kansasii
puede formar células largas y anchas, con coloración en bandas.
4-
La característica alcohol-ácido resistente de un microorganismo puede variar
con la edad del cultivo o exposición a drogas.
5-
Con el lente de inmersión, Mycobacterium tuberculosis aparece típicamente como
bacilos bien definidos, ligeramente curvos, de color rojo brillante (se aprecia
mejor con luz intensa). Pueden aparecer con coloración discontinua en forma
de varios gránulos de color rojo más intenso, observar con atención gránulos
rojos en la preparación ya que pueden ser parte de un BAAR.
6-
En el frote pueden aparecer artefactos alcohol-ácido resistentes, especialmente si el frote es grueso o no fue suficientemente decolorado. Sólo bacilos bien
definidos deben considerarse BAAR.
7-
En caso que se observen muy escasos BAAR debe repetirse el frote. Si el frote
211
es muy grueso es probable que se desprenda de la lámina durante la coloración,
por esto debe evitarse la transferencia de BAAR de una preparación a otra
por medio de aceite de inmersión, lentes sucios o colorantes.
18-
Ocasionalmente, la buena selección de las partes anormales de la muestra
para preparar el frote puede dar resultados mucho mejores que el uso de concentraciones.
19-
Puede ocurrir que la misma muestra sea negativa por frote, pero positiva por
cultivo, ya que la baciloscopía es menos sensible para detectar micobacterias
que el cultivo.
10-
Nunca dejar el azul de metileno por más tiempo del indicado: 1 ó 2 minutos.
11-
A veces es difícil distinguir los artefactos acidófilos (rojos) de verdaderos bacilos alcohol-ácido resistentes. La observación de “cuerpos esféricos alcoholácido resistentes” debe mencionarse como “sospechosa”. Los “gránulos de
Much” son micobacterias, sin pared celular (esferoplastos), son gram-positivo y no alcohol-ácido resistentes.
12-
La liberación irregular de micobacterias de los focos endotraquiales puede
dar frotes positivos y negativos en el mismo paciente.
13-
Los BAAR observados no presentes originalmente en la muestra, pueden provenir del agua del chorro, colorantes contaminados, recipientes o de
portaobjetos sucios.
CULTIVO PARA MICOBACTERIAS
Los procedimientos para obtener el crecimiento in vitro de las microbacterias
son especializados; deben seguirse estrictamente las instrucciones para tener éxito
en su recuperación. Por lo general, las muestras para cultivo de micobacterias contienen muchas bacterias de las microbiotas, especialmente el esputo que siempre se
contamina con microbiota de la boca. Además el esputo es una muestra difícil de
manipular por su mucosidad, tenacidad y adherencia. Por estas razones para su
cultivo, el esputo debe digerirse para hacerlo líquido y descontaminarse; es decir,
darle algún tratamiento químico para destruir las bacterias contaminantes que crecen rápido, pero sin destruir a las micobacterias.
212
DIGESTIÓN Y DESCONTAMINACIÓN DE ESPUTOS
Para efectuar la digestión/descontaminación de esputos pueden usarse dos
métodos:
aMétodo convencional de hidróxido de sodio
bMétodo de N-acetil-levo-cisteína (NALC)
El método de hidróxido de sodio es muy fuerte y destruye un porcentaje considerable de micobacterias. Por esa razón, debe hacerse todo lo posible para
implementar la técnica de NALC. El método de la acetil-cisteína proporciona mayor porcentaje de aislamiento de micobacterias pero su desventaja consiste en la
dificultad de conseguir esta sustancia química en nuestro medio. La N-acetil levocistenía (NALC), puede obtenerse de las siguientes compañías:
aBBL, Cockeysville, Maryland, USA.
bMead Johnson Research Center, Evansville, Indiana, USA.
cSigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA.
La NALC digiere el moco del esputo por ruptura de las uniones disalfuro de
la mucina y además destruye las bacterias comunes sin dañar a las micobacterias.
Al procesar esputos u otras muestras para cultivo, debe hacerse con sumo
cuidado y dentro de una campana bacteriológica. Descartar todo el material contaminado en recipientes con fenol al 5 por ciento. Evitar los aerosoles que se producen al flamear las asas; introducirlas antes de flamear dentro de un recipiente con
alcohol y arena en el fondo (el alcohol debe quedar 2.5 cms por encima de la arena).
Método de digestión/descontaminación con N-acetil-levo-cisteína (NALC).
(Según Kubica et al. Am. Rev. Respir. Dis. 89:284, 1964)
1-
El reactivo para digerir/descontaminar es inestable pues es inactivado por
oxígeno, iones de metales pesados y hemoglobina. Por esta razón, el reactivo
debe prepararse diariamente y sólo dura un día. Si sobra solución NALC,
puede guardarse en frasco bien cerrado y usarse al día siguiente, pero nunca
al tercer día después de preparada. El polvo de NALC debe mantenerse refrigerado. Debe prepararse sólo la cantidad de solución que se usará en un día
mezclando los tres componentes así:
213
Cantidad a
preparar
NaOH al 4%
estéril
Citrato de sodio
al 2.9% estéril
Polvo de NALC
(refrigerado)
125 ml
12.4 ml
12.5 ml
0.125 g
150 ml
25 ml
25 ml
0.25 g
100 ml
50 ml
50 ml
0.5
g
Las soluciones individuales deben prepararse así:
-
Hidróxido de sodio Na0H al 4% (1N): Disolver 40 g de hidróxido de
sodio para análisis en 1 litro de agua destilada. Autoclavear y guardar a
temperatura ambiente. Si precipita descartar.
-
Citrato de sodio al 2.9% (0.1M): Disolver 29.4 g de citrato de sodio
anhidro en 1 litro de agua destilada. Autoclavear y guardar a temperatura ambiente. Si precipita descartar.
2-
Colectar la muestra de esputo según lo indicado. Transferir aproximadamente 10 ml a un tubo plástico, descartable de 50 ml. Esto debe hacerse bajo una
campana bacteriológica. Limpiar la superficie de trabajo periódicamente, con
desinfectante.
3-
Agregar un volumen igual del reactivo de acetil-cisteína, pero no más que el
volumen de esputo. Si el esputo es muy escaso o mucoso agregar el NALC
directamente al recipiente de colección y luego pasar al tubo.
4-
Tapar bien el tubo, y agitar bien en agitador “vortex” de 5 a 20 segundos o
hasta que el esputo se digiera. La agitación demasiado violenta puede desnaturalizar el reactivo NALC.
5-
Dejar en reposo exactamente 15 minutos a temperatura ambiente, para que la
muestra se descontamine.
6-
Llenar el tubo con agua destilada estéril, hasta que el nivel del líquido quede
12 mm por debajo del borde. Tapar el tubo y agitar por inclinación para mezclar bien.
7-
Centrifugar a 3,000 rpm (1800 a 2400 g) por 15 minutos.
214
18-
Decantar el tubo a manera de guardar el sedimento (sobre un recipiente con
desinfectante, formol al 10%). Flamear la boca de los tubos para evitar contaminación.
19-
Con una pipeta serológica estéril, adicionar al sedimento 1.0 ml de albúmina
bovina al 0.2% (aproximadamente 20 gotas), mezclar bien a mano. Efectuar
asépticamente un frote si este no se ha hecho de esputo original, colorear con
Ziehl-Neelsen o Kinyoun.
10-
Con pipeta capilar estéril, inocular dos gotas del sedimento con albúmina en
la superficie de un tubo (dos de preferencia según disponibilidad), de medio
de cultivo Lowenstein-Jensen.
11-
Colocar los tubos dentro de la incubadora a 36° C, inclinados de manera que
la superficie del medio quede totalmente horizontal por 1 a 2 días para distribuir bien el inóculo; luego incubar verticalmente en gradilla.
12-
De preferencia colocar a cada tubo un capuchón de cartulina negra para evitar que al cultivo le de la luz. Dejar el tapón de rosca ligeramente flojo.
DIGESTIÓN/DESCONTAMINACIÓN DE ESPUTOS POR EL MÉTODO
CONVENCIONAL DE HIDRÓXIDO DE SODIO
Este procedimiento es muy utilizado, pero el porcentaje de recuperación de
micobacterias es menor que el que se obtiene con el método de la acetil-cisteína.
Utilizar este método sólo si no se consigue el polvo de NALC.
1-
Trasladar asépticamente el esputo a una caja de Petri, sobre fondo oscuro.
Con dos aplicadores con las puntas quebradas, seleccionar las porciones anormales del esputo (pus, sangre, etc.).
2-
En un tubo de centrífuga grande, colocar una fracción anormal del esputo.
Adicionar igual volumen de hidróxido de sodio al 3.5% con 0.004% de rojo
fenol. Agitar vigorosamente por 10 minutos, de preferencia en máquina
homogenizadora.
3-
Centrifugar el tubo a 3,000 rpm por 20 minutos.
4-
Decantar cuidadosamente el sobrenadante sobre un recipiente con desinfectante.
215
5-
Con pipeta Pasteur estéril, adicionar lentamente ácido clorhídrico 2N, hasta
obtener un color amarillo definitivo.
6-
Neutralizar el sedimento con unas pocas gotas de hidróxido de sodio al 3.5%
hasta un punto final con un color rosado débil.
7-
Inocular un tubo del medio de Lowenstein-Jensen con dos asadas del sedimento.
8-
Incubar a 36° C según lo indicado.
Reactivos para la técnica de digestión/descontaminación con Na0H:
1-
Hidróxido de sodio al 3.5% con 0.004% rojo fenol:
Pesar 35 gramos de hidróxido de sodio para análisis, colocar las lentejas ya
pesadas dentro de un balón aforado de 1 litro. Poner el balón en baño de agua
fría, y adicionar lentamente agua destilada con agitación constante hasta casi
llegar a la marca. Dejar enfriar y luego aforar exactamente a la marca de un
litro. Pesar 0.04 g (40 mg) de rojo fenol en polvo. Adicionarlo al hidróxido y
mezclar bien hasta obtener una solución rosado fuerte.
2-
Acido clorhídrico 2N:
Medir 16 ml de ácido clorhídrico concentrado en el fondo de un balón aforado
de 1 litro. Adicionar lentamente agua destilada hasta aforar a la marca de 1
litro.
Procedimiento de digestión/descontaminación para esputos de pacientes cuyas
muestras están constantemente contaminadas con Pseudomonas sp. o Proteus sp:
1-
Agregar al esputo un volumen igual de ácido oxálico al 5% (si no se cuenta
con este reactivo usar ácido sulfúrico al 4%).
2-
Mezclar en agitador vortex y dejar en reposo 30 minutos a temperatura ambiente, con agitación ocasional.
3-
Agregar solución salina estéril para bajar el peso específico y diluir el ácido.
4-
Centrifugar a 3,000 rpm (1800 a 2400 g) por 15 minutos.
216
5-
Decantar el líquido sobrenadante y neutralizar el sedimento con NaOH al
3.5% con 0.004% de rojo fenol.
6-
Inocular dos asadas del sedimento en Lowenstein-Jensen.
Procedimiento para lavados gástricos
Si el material es mucoide:
1-
Agregar una pizca (50 a 100 mg) de polvo NALC a 20-50 ml del lavado gástrico.
2-
Mezclar manualmente en agitador vortex.
3-
Centrifugar a 3,000 rpm por 30 minutos.
4-
Decantar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 2 a 5 ml de agua
destilada estéril.
5-
Agregar un volumen igual de la solución NALC-NaOH y proceder igual que
esputo.
Si el material es fluido:
1-
Centrifugar toda la muestra por 30 minutos a 3,000 rpm.
2-
Decantar el líquido sobrenadante y resuspender el sedimento en 2 a 5 ml de
agua destilada estéril. Unir todos los sedimentos si se centrifugan varios tubos.
3-
Agregar igual volumen de la solución NALC-NaOH y proceder igual que
esputo.
Procedimiento para orina:
1-
Centrifugar toda la muestra de la primera orina de la mañana por 30 minutos
a 3,000 rpm. Puede ser necesario utilizar varios tubos estériles.
2-
Decantar los sobrenadantes, y unir los sedimentos.
3-
Agregar al sedimento igual volumen de ácido sulfúrico al 4%.
217
4-
Mezclar y dejar en reposo por exactamente 15 minutos.
5-
Llenar el tubo con agua destilada estéril.
6-
Centrifugar a 3,000 rpm por 15 minutos.
7-
Decantar el sobrenadante y agregar al sedimento unas gotas de albúmina
bovina al 0.2%.
Procedimiento para hisopo faríngeo:
1-
Trasladar el hisopo con pinzas flameadas a un tubo de centrífuga estéril (sólo
la punta).
2-
Agregar 2 ml de agua destilada estéril o solución salina estéril.
3-
Agregar 2 ml de la solución digestora NALC-NaOH.
4-
Agitar en agitador vortex.
5-
Dejar en reposo 15 minutos.
6-
Remover el hisopo del tubo con pinzas flameadas.
7-
Llenar el tubo con agua destilada estéril hasta 12 mm del borde.
8-
Centrifugar 15 minutos a 3,000 rpm y continuar el procedimiento como esputo.
Procedimiento para tejido o piel:
1-
Utilizar macerador de tejidos o mortero estéril para triturar la muestra asépticamente en solución salina estéril. Si el tejido es mucoso (por ejemplo pulmón), adicionar una pizca de polvo NALC. Si se desea investigar hongos patógenos es mejor no triturar, mejor cortar en pedazos finos con tijeras estériles.
2-
Si la muestra fue colectada asépticamente, inocular directamente un pequeño
trozo en Lowenstein-Jensen.
3-
Si el tejido no ha sido colectado asépticamente, colocar el macerado en un
tubo estéril y procesar como esputo.
218
Procedimiento para otros fluidos corporales:
Si el material es muco-purulento:
1-
Procesar igual que esputo si el volumen es de 10 ml o menos.
2-
Si el volumen es mayor de 10 ml, proceder como lavado gástrico mucoso.
Si el material es fluido:
1-
Si el material se obtuvo asépticamente, centrifugar o inocular el sedimento
directamente en Lowenstein-Jensen.
2-
Si el material no se obtuvo asépticamente, proceder como esputo si el volumen es menor de 10 ml, si es mayor procesar como lavado gástrico fluido.
3-
Efectuar procedimientos especiales para aislamiento de micobacterias de sangre o heces fecales, debe justificarse plenamente y por lo general no se efectúa. Médula ósea: sembrar directamente en Lowenstein-Jensen.
INTERPRETACIÓN DEL CULTIVO
Examinar los tubos con lupa o microscopio estereoscópico y buena luz, a los 5
días después de inoculados, y luego una vez por semana, los días lunes, para observar crecimiento. Los tubos negativos deben incubarse hasta 6 a 8 semanas, a
36° C, antes de ser descartados como negativos. Debe reportarse como negativo a
las 6 semanas; si hay crecimiento posterior debe modificarse el reporte.
Las micobacterias pueden producir en el medio de Lowenstein-Jensen dos
tipos de colonias:
-
Eugónicas: Colonias secas, superficie rugosa, bordes irregulares color
crema amarillento. Son típicas de la mayoría de micobacterias especialmente M. tuberculosis. M. kansasii es menos rugoso.
-
Disgónicas: Colonias brillantes de superficie lisa y bordes enteros típicas de Mycobacterium bovis y Mycobacterium avium-intracelulare. Al observarse estos tipos de crecimiento en el tubo de Lowenstein-Jensen de
preferencia observados con microscopio estereoscópico, hacer frote en
una gota de solución salina o colorear con Ziehl-Neelsen.
219
Si se observan colonias eugónicas de color crema formadas por bacilos
alcohol-ácido resistentes (las cepas más virulentas con “factor cordón”:
forman cordones sinuosos de bacilos agrupados paralelamente), y no
produce pigmento, presuntivamente se trata de Mycobacterium tuberculosis.
Reportar el crecimiento observado cuantitativamente según esta tabla:
Número de colonias
Reporte de cantidad
No se observan colonias
Negativo para Mycobacterium tuberculosis
Menos de 50 colonias
Mencionar el número de colonias
50-100 colonias
+(1+)
100-200 colonias
++ ( 2 + )
Casi confluente (200-500)
+++ ( 3 + )
Confluente (más de 500)
++++ ( 4 + )
Por ejemplo si el tubo de Lowenstein-Jensen presenta el crecimiento de 70
colonias eugónicas de BAAR, identificadas como M. tuberculosis por niacina, e informar:
Se aisló Mycobacterium tuberculosis +.
Identificar M. tuberculosis por las siguientes características:
1-
Crecimiento lento de colonias eugónicas no pigmentadas en LowensteinJensen que crecen entre 4 y 7 semanas.
2-
El Ziehl-Neelsen de estas colonias revela BAAR cortos, ligeramente
curvos de coloración sólida, a veces agrupados en cordones.
3-
Confirmar con la reacción de producción de niacina positiva.
Prueba de niacina:
La producción de la vitamina niacina (ácido nicotínico) en el medio
Lowenstein-Jensen es típica de M. tuberculosis. Las otras micobacterias son niacina
negativo, por lo que con esta única prueba se logra una diferenciación adecuada.
Esta diferenciación se conoce desde 1955 según Konno et al. (Science, 124: 985, 1956
y Am. Rev. Resp. Dis. 75: 529, 1957).
220
Las colonias eugónicas no pigmentadas sobre el medio, producen niacina la
cual se difunde hacia el medio. La niacina se produce lentamente al igual que se
desarrollan las colonias. Por esta razón, la prueba sólo puede hacerse en cultivos
puros que tengan de 50 a 100 colonias (1 +), y de 3 a 4 semanas de incubación.
Se utiliza un procedimiento sencillo de extracción de la niacina que se encuentra en el medio (no en las colonias), la cual luego se identifica por la producción de un color amarillo en las tiras que contienen los reactivos químicos adecuados. Proceder así si el cultivo llena los requisitos mencionados:
1-
Al tubo de Lowenstein-Jensen, con un cultivo puro de colonias eugónicas
(50 a 100) no pigmentadas y 3 a 4 semanas de incubación, agregar 1.5 ml
de agua destilada estéril o solución salina estéril. No usar cultivos contaminados que presentan coloración azul en el Lowenstein-Jensen.
2-
Con el asa espatulada o pipeta capilar, cortar profundamente varias veces el medio de cultivo dentro del tubo, para que el agua o solución
salina penetre y extraiga la niacina.
3-
Inclinar el tubo sobre algún soporte, de manera que la superficie del
medio quede horizontal y cubierta de líquido.
4-
Dejar el tubo en reposo en esta posición por 30 minutos.
5-
Colocar el tubo verticalmente en una gradilla con mucho cuidado,
succionar aproximadamente 0.6 ml de extracto con pipeta Pasteur y
bulbo. Pasarlo al fondo de un tubo 13 X 75 mm con tapón de rosca.
Marcar el tubo con el número de muestra.
6-
Como control negativo, pipetear 0.6 ml del agua o solución salina utilizada para hacer el extracto en otro tubo 13 X 75 mm. Marcar el tubo
“control negativo”.
7-
Con pinzas flameadas, dejar caer en ambos tubos una tira reactiva de
niacina (DIFCO 3182-30-8, Bacto-TB Niacina Test Strips), de manera que
la flecha indicadora quede apuntando al fondo del tubo; tapar los tubos
inmediatamente. Mantener las tiras en refrigeración.
8-
Agitar los tubos suavemente; repetir esta agitación suave de 5 a 10 minutos.
221
9-
Después de 12 a 15 minutos, pero no después de 30 minutos, comparar
el color de los extractos.
10-
Interpretación: la prueba de niacina es positiva si aparece color amarillo en el extracto de la muestra, y el control negativo no presenta color.
Autoclavear los tubos con extractos de muestras.
Si el cultivo en Lowenstein-Jensen presenta crecimiento de colonias
pigmentadas (amarillo-anaranjado), o de crecimiento rápido (antes de 5 días), o
niacina negativo, se debe sospechar de otras especies “atípicas” del género
Mycobacterium o más correctamente de los grupos de Runyon.
En Guatemala son mucho menos frecuentes que Mycobacterium tuberculosis.
En este caso el personal técnico deberá entregar el cultivo al microbiólogo a cargo
del laboratorio, quien clasificará el BAAR aislado en alguno de los cuatro grupos
de Runyon por medio de pruebas especiales.
Grupos de Runyon (micobacterias “atípicas”):
Grupo I:
Fotocromógenos: producen pigmento sólo cuando el cultivo se expone a la luz. En
la obscuridad producen colonias sin pigmentación, son de crecimiento lento. Ejemplos: Mycobacterium kansasii y Mycobacterium marinum (crece a 30°C).
Grupo II:
Escotocromógenos: producen pigmento tanto en la oscuridad como en la luz y son
de crecimiento lento. Ejemplo: Mycobacterium scrofulacem, que causa adenopatía
cervical en niños.
Grupo III:
No fotocromógenos: no producen pigmento y son de crecimiento lento. Ejemplo:
Mycobacterium avium-intracelulare.
Grupo IV:
Crecedores rápidos: se caracterizan por crecer antes de 7 días de incubación. Ejemplo: Mycobacterium fortuitum, puede causar tuberculosis resistente a varias drogas.
222
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Esta publicación fue impresa en los talleres
gráficos de Editorial Serviprensa C.A. de
Guatemala, C.A. en el mes de septiembre
de 1996. Esta edición consta de 1,000
ejemplares en papel bond 80 gramos.

Libro 2da. Edición Dr. Torres

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