efecto del calostro sobre los métodos microbiológicos de detección

efecto del calostro sobre los métodos microbiológicos de detección

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EFECTO DEL CALOSTRO SOBRE LOS MÉTODOS
MICROBIOLÓGICOS DE DETECCIÓN DE ANTIBIÓTICOS
EN LECHE DE OVEJA
THE INHIBITORY EFFECT OF COLOSTRUM ON
MICROBIOLOGICAL METHODS USED FOR ANTIBIOTIC
DETECTION IN EWES MILK
BELTRÁN M.C., BORRÁS M., RODRÍGUEZ M., MOLINA M.P.
Instituto de Ciencia y Tecnología Animal. Universidad Politécnica de Valencia. Camino de Vera, s/n.
46022 Valencia. Email: [email protected]
RESUMEN
El estudio evalúa el efecto de la presencia de calostro sobre la respuesta de diferentes métodos microbiológicos de detección de inhibidores en leche de oveja. Para ello se utiliza leche de oveja libre de sustancias inhibidoras a la que se adicionan cantidades crecientes de tres tipos de calostro (0-12, 24 y 48
horas postparto) procedentes de ovejas no tratadas con antibióticos en el momento del secado. Las
muestras se analizaron con tres métodos microbiológicos (BRT®AiM, Delvotest®MCS y Eclipse®100). La
presencia de calostro en la leche de oveja afecta a la respuesta de los métodos microbiológicos de detección de inhibidores a concentraciones relativamente elevadas en la leche. La concentración de calostro capaz de provocar la aparición de un 95% de resultados positivos en los métodos ensayados
(CMI) depende del tipo de calostro (horas postparto) y del método considerado. En general, esta concentración se incrementa con el tiempo transcurrido desde el parto en todos los métodos utilizados
siendo el método BRT®AiM el más afectado por la presencia de la secreción calostral en la leche.
Palabras clave: calostro, leche de oveja, inhibidores, métodos microbiológicos.
SUMMARY
The aim of this study is to analyse the effect that the presence of colostrum has on the response of the
microbiological methods for the detection of inhibitors in ewes milk. Antibiotic free ewe’s milk samples
were used, artificially spiked with three types of colostrum (0-12, 24 and 48 hours postpartum) obtained from ewes not treated with antibiotics in the moment of the drying off. The spiked samples
were analysed by three microbiological tests (BRT®AiM, Delvotest®MCS and Eclipse®100). The presence
of colostrum in the milk affects the response of the methods at relatively high concentrations in the
milk. The minimal inhibitory concentration of colostrum (CMI) in the milk depends on the type of
colostrum and considered method. In general, the CMI increases with the time passed from the parturition in all the used methods being the method BRT®AiM the most affected by the presence of this secretion in the milk.
Key words: colostrum, ewe’s milk, inhibitors, microbiological method.
5. CALIDAD DE PRODUCTOS
451
Índice Introducción
El calostro se considera un alimento imprescindible para el cordero durante las primeras
fases de su vida postnatal, por su capacidad
de transmitir al recién nacido una inmunidad
de tipo pasivo que le permite hacer frente a
posibles infecciones procedentes del medio
ambiente que le rodea. Sin embargo, su presencia en la leche resulta indeseable y la legislación española, así como la de otros muchos países, exige que la leche destinada al
consumo humano no contenga calostros (Real
Decreto 2484/1967). Esta restricción se debe,
principalmente, al hecho de que el calostro
presenta unas características fisicoquímicas
muy diferentes a las de la leche, propiamente dicha, que repercuten negativamente sobre su calidad higiénica y su aptitud tecnológica (Tsioulpas y col., 2007).
Por otra parte, el incremento de proteínas, especialmente de inmunoglobulinas (IgG), que
supone la incorporación de calostro a la leche
podría estar relacionado, en determinadas circunstancias, con los resultados “falsos positivos” que se obtienen con los métodos microbiológicos de detección de antibióticos en
leche (Egan y Meaney, 1984). Estos métodos,
basados en la inhibición del crecimiento microbiano, pueden verse afectados por varios
factores, tanto metodológicos (presencia de
conservante, calentamiento previo de las
muestras) como relacionados con la propia
composición de la leche (Althaus y col., 2003).
Así, por ejemplo, elevados recuentos de células somáticas, de ácidos grasos libres y de grasa o proteína, han sido relacionados con un
elevado porcentaje de resultados “falsos positivos” en diversos métodos comerciales de
cribado (Andrew, 2001).
El calostro presenta, además de un gran contenido en grasa y proteína, grandes cantidades de inhibidores naturales (lactoferrina e inmunoglobulinas) que pueden interferir en el
crecimiento del microorganismo del método
452
SALIR
incrementando el porcentaje de resultados
“falsos positivos” o “falsos no conformes”. Por
tanto, el objetivo de este trabajo es estudiar
el efecto de la presencia de calostro en la leche de oveja sobre la respuesta de los métodos microbiológicos de detección de inhibidores en leche más utilizados en España.
Materiales y métodos
Se utilizó una muestra de leche de mezcla, libre de sustancias inhibidoras, con una composición y calidad higiénica estándar para la
leche de oveja. Esta muestra se dividió en 3
alícuotas y a cada una de ellas se adicionaron
cantidades crecientes de diferentes tipos de
calostro hasta obtener 12 concentraciones de
ensayo. Las muestras de calostro utilizadas en
el estudio procedían de 12 ovejas de raza
Manchega y fueron obtenidas a las 0-12, 24 y
48 horas postparto.
La composición química de las muestras de
calostro y leche se determinó con un espectrofotómetro de infrarrojos (MilkoScan FT120.
Foss. Hillerod, Dinamarca) previamente calibrado para la leche de oveja y el recuento de
células somáticas, se calculó según el método fluoro-opto-electrónico con el equipo automático Fossomatic 5000 (Foss. Hillerod, Dinamarca). El pH se midió con un pH-metro
comercial (Crison. Mod. Basic 20+. Barcelona,
España) y la concentración de inmunoglobulinas (IgG) siguiendo el procedimiento descrito por Rodríguez y col. (2009) mediante la utilización de un kit comercial ELISA (Bethyl
Laboratories, Inc. Montgomery, USA).
Todas las muestras de leche adicionadas de
calostro se analizaron con tres métodos microbiológicos: BRT®AiM (Analytik in Milch Produktions-und Vertriebs-GmbH. Munich, Alemania), Delvotest®MCS (DSM Food Specialties.
Delf, Holanda) y Eclipse®100 (Zeu-Inmunotec.
Zaragoza, España) siguiendo las indicaciones
del fabricante. Para cada una de las concentraciones se ensayaron un total de 16 repeti-
XXXV CONGRESO DE LA SEOC • VALLADOLID 2010
Índice SALIR
ciones. La lectura de resultados se realizó de
manera visual por tres personas entrenadas,
clasificando los resultados como negativos
(“conformes”) y positivos (“no conformes”).
95% de resultados positivos, para cada tipo
de calostro y método considerado en el estudio.
Para el tratamiento estadístico de los datos se
aplicó un procedimiento de regresión logística mediante el programa estadístico SAS®
(2001). A partir de los datos obtenidos se calculó la “concentración mínima inhibitoria”
(CMI) de calostro, definida como el porcentaje de calostro que provoca la aparición de un
Resultados y discusión
Las características fisicoquímicas de las muestras de calostro y leche utilizadas en el experimento (Tabla 1) son similares a las indicadas
por otros autores para el calostro y la leche
del ganado ovino (Molina y col., 1995).
Tabla 1. Características fisicoquímicas de las muestras de calostro y de leche utilizadas.
Muestra
Calostro 0-12 horas
Calostro 24 horas
Calostro 48 horas
Leche
Principales componentes (%)
pH
RCS
(x103 cel/ml)
G
P
L
ST
IgG
(mg/ml)
6,36
6,42
6,66
6,75
5.442
1.890
1.364
402
10,86
10,80
8,95
7,11
21,63
15,36
8,06
4,96
1,71
2,52
4,12
5,25
35,2
29,68
22,06
18,32
51,52
39,43
10,30
4,55
RCS= recuento de células somáticas; G= grasa, P= proteína; L= lactosa; IgG= inmunoglobulina G.
En la Tabla 2 se presentan las frecuencias de
resultados positivos obtenidos con los tres tipos de calostro (0-12, 24 y 48 horas postparto) en los distintos métodos microbiológicos
de control. Como se puede observar, con con-
5. CALIDAD DE PRODUCTOS
centraciones del 5%, 12,5% y 22,5% de calostro en la leche, se obtienen un 37,5%, 25% y
6,3% de resultados positivos para los métodos BRT®AiM, Delvotest®MCS y Eclipse®100,
respectivamente.
453
Índice SALIR
Tabla 2. Frecuencia de resultados positivos según la concentración y el tipo de calostro
añadido.
Concentración calostro (%)
Método
Edad
analítico calostro
0
1
2,5
5
7,5
10
12,5
15
20
25
35
50
12 horas
24 horas
48 horas
12 horas
24 horas
48 horas
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
37,5
0
0
0
0
0
37,5
0
0
0
0
0
56,3
31,3
0
0
0
0
100
43,8
0
25
0
0
100
100
0
50
50
0
100
100
0
100
50
0
100
100
0
100
100
0
100
100
0
100
100
0
100
100
0
100
100
0
12 horas
Eclipse®100 24 horas
48 horas
0
0
0
0
2,5
0
0
0
5
0
0
0
10
0
0
0
15
0
0
0
27,5
81,3
0
0
30
100
50
0
40
100
100
0
50
100
100
0
BRT®AiM
Delvotest®
MCS
Concentración calostro (%)
Cuando se adiciona a la leche calostro de 24
horas se observa que son necesarias mayores
concentraciones para provocar la aparición de
un resultado positivo en todos los métodos
utilizados (BRT®AiM=10%, Delvotest®MCS=
15% y Eclipse®100=30%) siendo nuevamente
el método BRT®AiM el más afectado por la presencia de esta secreción en la leche.
Sin embargo con el calostro de 48 horas, no
se observan interferencias con ninguno de los
métodos utilizados, hasta una concentración
del 50%, ya que los resultados obtenidos fueros negativos para todas las concentraciones
de ensayo en todos los métodos de control.
Estos resultados podrían estar relacionados
con el marcado descenso de la concentración
de IgG en el calostro ovino que se produce en
las primeras 48 horas después el parto (Ray-
454
20
0
0
0
22,5
6,3
0
0
25
25
0
0
nal-Lujtac y col., 2005) y que explicarían la normalización de los resultados analíticos transcurrido este tiempo.
En la Tabla 3 se presentan las ecuaciones de
predicción obtenidas a partir del modelo de
regresión logística que en todos los casos, presentan elevados coeficientes de concordancia (>91%). A partir de estas ecuaciones se calculó la CMI de calostro para cada uno de los
métodos y tipo de calostro utilizado que,
como puede observarse, depende del tipo de
calostro y del método considerado. En general, se incrementa a medida que aumenta el
tiempo transcurrido tras el parto en todos los
métodos utilizados siendo el BRT®AiM el más
afectado por la presencia de secreción calostral en la leche, al presentar la CMI más baja
en todos los momentos considerados.
XXXV CONGRESO DE LA SEOC • VALLADOLID 2010
Índice SALIR
Tabla 3. Ecuación de regresión y Concentración mínima inhibitora (CMI) de calostro.
BRT AiM
Delvotest
Eclipse
CMI (%)
L=Logit [P]=b0+b01[T1]+b02 [T2]+b2 [Cal]
C
(%)
12 h
24 h
48 h
L=-5,1049-2,5217[T1]-42,1017[T2]+0,6382 [Calostro]
L=-7,9546-1,5359[T1]-35,0601[T2]+0,5276[Calostro]
L=-29,4168-4,6043[T1]-43,6274[T2]+1,1344[Calostro]
91,06
91,28
93,79
12,61
20,66
28,53
16,56
23,57
32,58
78,58
87,11
96,98
Método
L= ln (probabilidad de resultado (+)/1-probabilidad resultado (+)); Tipo calostro: Calostro 12 h T1=0 y T2=0; Calostro 24 h T1=1 y T2=0; Calostro 48 h T1=0 y
T2=1; C: coeficiente de concordancia porcentual
Conclusiones
La presencia de calostro en la leche de oveja
puede interferir en la respuesta de los métodos microbiológicos de detección de inhibidores aunque su efecto depende del tipo de
calostro (horas postparto) y del método considerado. En general, estas interferencias se
presentan a concentraciones relativamente
elevadas en la leche de oveja (5-25%) especialmente con el calostro más próximo al parto (0-12 horas postparto). Transcurridas 48 horas postparto, son necesarias concentraciones
muy elevadas de calostro en la leche (>50%)
para provocar la aparición de un resultado positivo en los métodos microbiológicos de con-
Bibliografía
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