Caracterización de sustancias fluorescentes y fosforescentes

Caracterización de sustancias fluorescentes y fosforescentes

Instrumentación espectroscópica para
la caracterización de sustancias
fluorescentes y fosforescentes
Responsable: Dra. M. Pilar Lillo.
e-mail: [email protected].
Teléfono: 915619400 Ext 1027 y 1400
Acceso: colaboración científica
Espectrofotómetro Vis/UV
Datos técnicos: Varian Cary 3E
– Intervalo longitud de onda:
190-900 nm (±0.2 nm)
– Doble haz
– Control temperatura (manual):
Peltier [-10 / 50ºC]
– Agitación
Medidas: Absorbancia
– Espectros de absorción
– Cinéticas de absorción
Espectrofluorímetro/Fosforímetro de estado estacionario
Datos técnicos: ISS PC1
– Intervalo longitud de onda:
200-800 nm (±0.2 nm)
– Polarizadores Glan
– Detección contaje de fotones
(PMT Hamamatsu R928)
– Substracción fondo automatizada
– Control temperatura: Peltier
– Agitación
Medidas: Fluorescencia en estado estacionario
– Espectros de emisión y excitación
corregidos
– Anisotropía de fluorescencia
– Cinéticas lentas de fluorescencia y polarización de fluorescencia
Campo de aplicación:
– Caracterización espectroscópica de colorantes fluorescentes
– Estudios de interacciones proteína-ligando, proteína-proteína, proteína-ADN
(anisotropía de fluorescencia). Determinación de constantes de unión
– Cambios conformacionales y organización 3-D de complejos multicomponentes
(FRET) en disolución o en una suspensión de células
Espectrómetro láser con resolución
temporal de picosegundos:
Datos técnicos:
– Excitación UV-VIS :
Ti:Za 240-1000 nm, 0.8-4 MHz, 800 fs
Diodos láser pulsados 375 nm, 405
nm, 2.5-40 MHz, 60 ps
– Detección: contaje de fotones únicos correlacionados temporalmente
Medidas: Fluorescencia con resolución temporal de ps
– Vidas medias de fluorescencia
– Tiempos de correlación rotacional
– Distancias/distribuciones de distancias intra- e intermoleculares (10-120 Å)
Campo de aplicación:
– Estudios estructurales, dinámicos y de interacciones en disolución y en
sistemas complejos
– Cambios conformacionales y organización 3-D (FRET y anisotropía de
fluorescencia) de complejos multicomponentes, en disolución o en una
suspensión de células
Microespectrómetro láser con resolución temporal:
Datos técnicos: PicoQuant MicroTime 200
– Excitación multifotónica
(Ti:Za 750-850 nm, 80 MHz, 100fs)
– Detección: contaje de fotones únicos
correlacionados temporalmente.
Medidas:
– Fluorescencia
y
polarización
de
fluorescencia con resolución temporal de
picosegundos
– Transferencia de energía resonante
(FRET)
– Espectroscopia de correlación de
fluorescencia: correlación cruzada (2
canales de emisión)
– Imágenes
de
vidas
medias
de
fluorescencia y de polarización de
fluorescencia
Campo de aplicación:
– Estudios estructurales, dinámicos y de interacciones, con resolución de
molécula única, en disolución y en sistemas complejos
– Cambios conformacionales y organización 3-D (FRET y anisotropía de
fluorescencia) de complejos multicomponentes, en disolución o en células
completas
– Caracterización de materiales
– Estudios de sensores moleculares
– Plegamiento de proteínas
– Biología celular
Figura: Utilizando métodos de espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS)
hemos cuantificado el impedimento a la difusión traslacional de la proteína
apomioglobina (apoMb) debido a la presencia de otras moléculas de proteína
diferentes, como RNasa A (se comportan como obstáculos móviles). En la figura se
compara apoMb en tampón y apoMb en un medio aglomerado en un experimento
típico de FCS (volumen de detección ~ 1 fL, que incluye 1-2 moléculas de apoMb, en
rojo, acompañadas de las moléculas de RNasa A, en rosa) (Zorrilla et al. Biophys.
Chem. 2007).