Vitrification Freeze Kit (Vit Kit® - Freeze)

Transcripción

ENGLISH
EU CAUTION: For Professional Use Only.
Vitrification Freeze Kit (Vit Kit - Freeze)
®
US CAUTION: Federal (U.S.) law restricts this device to sale by or on the
order of a physician.
INTENDED USE
Vit Kit® - Freeze is intended for use in assisted reproductive procedures for
vitrification and storage of human oocytes (MII), pronuclear (PN) zygotes through
day 3 cleavage stage embryos and blastocyst stage embryos. This kit is designed
for use with Irvine Scientific’s CryoTip® (Catalog #40709), and Vitrification Thaw
Kit (Vit Kit® - Thaw) for optimal recovery of specimens.
Catalog No. 90133-SO Includes:
• Equilibration Solution - ES (white cap)
2 x 1 mL Vials
• Vitrification Solution - VS (blue cap)
2 x 1 mL Vials
PRODUCT DESCRIPTION
Equilibration Solution-ES is a HEPES buffered solution of Medium-199
containing gentamicin sulfate (35 µg/mL), 7.5% (v/v) of each DMSO and ethylene
glycol and 20% (v/v) Dextran Serum Supplement.
Symbols:
Vitrification Solution-VS is a HEPES buffered solution of Medium-199
containing gentamicin sulfate (35 µg/mL), 15% (v/v) of each DMSO and ethylene
glycol, 20% (v/v) Dextran Serum Supplement and 0.5 M sucrose.
Catalog Number
For assisted reproductive procedures.
Für betreute fortpflanzungsverfahren.
Lot Number
Per tecniche di riproduzione assistita.
Sterilized using aseptic
processing techniques
(aseptically filtered)
Para utilización en técnicas de reproducción asistida.
These two solutions are to be used in sequence according to the step-wise
microdrop vitrification protocol.
COMPOSITION
Expiration:
Year - Month - Day
Pour les techniques de procréation médicalement assistée.
Para utilização em técnicas de reprodução assistida.
Caution:See instructions
for use
Για διαδικασίες επιβοηθούμενης αναπαραγωγής.
Pro technologie asistované reprodukce.
8°C
Til brug ved assisteret reproduktion.
Storage Temperature
2°C
Avusteisiin lisääntymismenettelyihin.
Do Not Re-Sterilize
Pentru asistenţă privind procedurile de reproducere.
Do Not Use If
Package Is Damaged
För procedurer för assisterad reproduktion.
Kasutamiseks reproduktiivse abi protseduurides.
Asszisztált reprodukciós eljárásokhoz.
Yardımla üreme prosedürleri için.
F P
RX On y
European Representative
MPIE
Schutweg 13A
5145 NP Waalwijk, The Netherlands
Pre technológie asistovanej reprodukcie
Emergo Europe
Molenstraat 15
2513 BH The Hague
The Netherlands
ES1
2 min
1
ES3
ES2
2
2 min
20 µL
Drops
H
1 min
ES3
6-10 min
VS
(within 110 seconds after
exposure to VS drop)
(pipette once
to rinse)
Figure 7a:
Seal #2
Mark #4
Figure 2:
ES3
Mark #2
VS
50 µL
Drops
Mark #1
Figure 3:
Prepare CryoTip for loading
Seal #1
Figure 7b:
Connector or
adaptor
C o ane
CryoTip
Hamilton Syringe or
appropriate aspiration tool
Cover Sleeve
Figure 4:
Prepare HSV straw for loading
Gob e
C oT p HSV
S aw C o o
Insertion device
LN2
Capillary tube
F gure 5
P epa e C yo ock o oad ng
Figure 8:
p
cap
Load CryoTip/HSV
Straw/Cryolock
ES
COMPOSITION
DL-Méthionine
DL-Phénylalanine
DL-Sérine
DL-Thréonine
DL-Tryptophane
DL-Valine
L-Cysteine
L-Hydroxyproline
L-Cystine
Sels & ions
Chlorure de sodium
Phosphate de sodium
Chlorure
de potassium
Sulfate de magnésium
Acétate de sodium
Chlorure de calcium
Nitrate ferrique
Chlorure de choline
Acide nicotinique
Amide d’acide
nicotinique
Acide pantothénique
Riboflavine
Pyridoxine
Thiamine
D-Biotine
Alpha-Tocophérol
Bisulfite de sodium
Antioxydant
Glutathion, réduit
Tampon
Bicarbonate
de sodium
HEPES
Acides aminés
L-Arginine
Glycine
L-Histidine
L-Lysine
L-Proline
L-Tyrosine
DL-Alanine
DL-Acide aspartique
DL-Acide glutamique
DL-Isoleucine
DL-Leucine
PROTOCOLE DE VITRIFICATION
REMARQUE : ces procédures doivent être effectuées à
température ambiante (20-27 °C). Ne pas utiliser la platine
chauffante du microscope durant ce procédé. ATTENTION :
minimiser l’exposition des spécimens à la lumière durant
l’équilibration dans les solutions ES et VS.
1. Amener un flacon de chacune des solutions ES et VS à température ambiante
(20-27°C) plus du milieu modified-HTF (HEPES) avec protéines, requis pour
les ovocytes. Le milieu modified-HTF (tamponné au HEPES) avec protéines
est aussi requis pour le protocole de vitrification des ovocytes.
2. Remplir le réservoir d’azote liquide (en quantité suffisante pour obtenir 10 cm de
profon
m
m
m
m
A
m
m
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m
m
M
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ES VS
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fica on des OVOCYTES M
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m
Dans a mesu e du
poss b e sé ec onne un quemen es ovocy es M de
me eu e qua é
ATTENT ON m n m se expos on des spéc mens à a um è e
du an équ b a on dans es gou e e es H ES e VS
A
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m
µ
m H HEPES
m
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m
m
2 m nu es
A
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mm
2 m nu es
m m mm
ES
6 à 10 m nu es Rema que équ b a on
des ovocy es dans ES3 es comp è e quand épa sseu de
a one pe uc de e ce e de espace pé v e n son éga es
Les ovocy es se dépose on au ond de a gou e e e dans
es 3 m nu es
7 Du an ce e équ b a on dans ES3
Ve se asep quemen une 1 gou e de 50 µL de so u on de
v fica on VS avan de e m ne équ b a on e p épa e
e C yoT p fig 3 a pa e e VHS fig 4 ou e C yo ock fig 5
pou e dépô
REMARQUE E m
m
mm
C yoT p
H m
m
REMARQUE
m
m
m
Pa e e VHS
m
m
C yo ock
Les é apes su van es 9 13 do ven ê e comp é ées
en 80 à 110 secondes ATTENT ON
expos on des
spéc mens au VS do ê e m ée pou p éven ou e
cy o ox c é Les spéc mens on endance à flo e dans
a so u on de v fica on VS a us e a m se au po n
du m c oscope pou ma n en une v sua sa on con nue
du an expos on e ga de e bou de a p pe e de
ans e p oche pou assu e un ans e
ap de en e
es d é en es gou e e es VS Se é é e à a figu e 6
À
ES
ES
m
m m m
m
ES
gou e e e VS pendan 30 secondes
Cha ge e soude à a cha eu e C yoT p comme nd qué
c ap ès vo a figu e 7a
G
m
m
C
E m
m
epè e n 1
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M
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C
C
VS
epè e n 3
C
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epè e n 2 C
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VS
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REMARQUE L usage de op on B n es pas au o sé
aux É a s Un s
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REMARQUE Tou ou s s ocke e C yo ock avec e
capuchon ve s e bas
P
C
VHS
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B P o oco e de v
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fica on des emb yons PN au b as ocys e
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Dans a mesu e du poss b e
sé ec onne un quemen es emb yons de me eu e qua é
pou a v fica on
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m
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ES
m
Rema que e spéc men va é éc e g adue emen e ouve à
sa a e d o g ne cec nd que que équ b a on es comp è e
ATTENT ON m n m se expos on des spéc mens à a
um è e du an équ b a on dans es gou e e es ES e VS
4 Du an ce emps d équ b a on dans ES
dépose une gou e de 50 µL de VS comme nd qué su
a figu e 8 pu s p épa e e C yoT p a pa e e VHS ou e
C yo ock pou e dépô
Su v e e p o oco e e que déc
c dessus sec on A
P o oco e de v fica on des ovocy es M des é apes 9 à 12
pou expos on aux so u ons de v fica ons a p océdu e
de dépô su e C yoT p a pa e e VHS ou e C yo ock
mme s on dans a o e qu de e e s ockage à ong e me
P
m
m
m m
C
CONS GNES DE CONSERVAT ON ET STAB L TÉ
m
m
C C
K
V
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C
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PRÉCAUT ONS ET M SE EN GARDE
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C
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M
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T
m
mm
UN ON EUROPÉENNE
es mesu es s anda d pou
év e es n ec ons ésu an de u sa on de p odu s
méd c naux ab qués à pa
de sang ou de p asma
huma n nc uen a sé ec on des donneu s a eche che
de ma queu s spéc ques d n ec on su es dons
nd v due s e es mé anges de p asma a ns que e
ecou s à des é apes de ab ca on e caces pou
nac va on é m na on des v us Ma g é ce a o sque
des p odu s méd c naux ab qués à pa
de sang
ou de p asma huma n son adm n s és à un pa en a
poss b é de ansm ss on d agen s n ec eux ne peu
ê e o a emen exc ue Ce a s app que éga emen aux
v us nconnus ou éme gen s e au es pa hogènes
Aucun cas de ansm ss on de v us n a é é s gna é avec
a bum ne ab quée con o mémen aux spéc ca ons
de a Pha macopée eu opéenne se on des p océdés
é ab s es v vemen ecommandé d en eg s e e nom
e e numé o de o du p odu chaque o s qu un m eu
de cu u e pou déve oppemen emb yonna e v ne
Sc en c es adm n s é à un pa en a n de conse ve
un en en e e pa en e e o du p odu
ÉTATS UN S
a so u on d hya u on dase con en
de a bum ne sé que huma ne HSA Le ma é e de
sou ce huma ne u sé dans a ab ca on de ce p odu
a é é es é pa des k s app ouvés pa a FDA Aucune
éac on n a é é obse vée avec es an co ps du v us
de hépa e C HCV n ceux d gés con e e v us de
mmunodé c ence huma n V H Cependan
n y a pas
de mé hode d ana yse qu o e une ce ude abso ue que
es p odu s d o g ne huma ne ne son pas con am nés
Man pu e ou ma é e d o g ne huma ne comme s
é a suscep b e de ansme e une n ec on en u san
es p écau ons d usage Les donneu s à o g ne de ce
ma é e on ous sub s des ana yses pou dé ec e a
ma ad e de C eu z e d Jakob CJD
CONTRE ND CAT ON
Ce p odu con en du su a e de gen am c ne Des p écau
ons adéqua es do ven ê e p ses pou assu e que a
pa en e n es pas sens b sée à ce an b o que
PORTUGUÊS
PRECAUÇÃO EU A
UT L ZAÇÃO PREV STA
V K ®
m
PN
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V
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m
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wK V K ®
DESCR ÇÃO DO PRODUTO
Equ b a on So u on So ução Equ b an e ES m
m
m HEPES
M
m
m
m
%
DMSO
%
D
S
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fica on So u on So ução de V ficação VS m
m
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M
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m
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DMSO
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soudu e n 1 G
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C
soudu e n 2
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epè e n 4
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Cm
Cha ge e soude ensemb e onc cap a e HSV comme
nd qué c ap ès
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C op o ec o
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Am
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GAS GH ®
m
P
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P
A
PRECAUTIONS AND WARNINGS
This device is intended to be used by staff trained in assisted reproductive
procedures. These procedures include the intended application for which this
device is intended.
The user facility of this device is responsible for maintaining traceability of the
product and must comply with national regulations regarding traceability, where
applicable.
As an added precaution during the preparation procedure, we recommend
that each Cryotip be carefully examined when taken out of the package. Prior
to use, the CryoTips should be examined under a suitable magnification (40x
power) for possible damage (such as tip breakages or cracks) that may have
occurred during transport.
Do not use any vial of solution which shows evidence of damage, leaking,
particulate matter, cloudiness or has shifted color. Discard the product in
accordance with applicable regulations.
To avoid problems with contamination, handle using aseptic techniques.
Currently, research literature indicates the long-term effects
of vitrification on oocytes and embryos remains unknown.
Do not use any bottle in which the sterile packaging has
been compromised.
EU: Standard measures to prevent infections resulting
from the use of medicinal products prepared from human
blood or plasma include selection of donors, screening
of individual donations and plasma pools for specific
markers of infection and the inclusion of effective
manufacturing steps for the inactivation/removal of
viruses. Despite this, when medicinal products prepared
from human blood or plasma are administered, the
possibility of transmitting infective agents cannot
be totally excluded. This also applies to unknown or
emerging viruses and other pathogens. There are no
reports of proven virus transmissions with albumin
manufactured to European Pharmacopeia specifications
by established processes. It is strongly recommended
that every time Irvine Scientific Reproductive Media
Products culture media are administered to a patient,
the name and batch number of the product are recorded
in order to maintain a link between the patient and the
batch of the product.
US: This product contains Human Serum Albumin (HSA).
Human source material used in the manufacture of this
product has been tested by FDA-licensed kits and found
to be non-reactive to the antibodies to Hepatitis C (HCV),
and antibodies to Human Immunodeficiency Virus (HIV).
However, no test method offers complete assurance that
products derived from human sources are noninfectious.
Handle all human source material as if it were capable
of transmitting infection, using universal pre-cautions.
Donors of the source material have also been screened
for CJD.
CONTRAINDICATION
Product contains Gentamicin Sulfate. Appropriate
precautions should be taken to ensure that the patient is
not sensitized to this antibiotic.
Irvine Scientific®, the Irvine Scientific logo, CryoTip® and Vit Kit® are trademarks of Irvine
Scientific Sales Company. All other trademarks are the property of their respective owners.
m
m
m m
S
HSV
D
®
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m
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m
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NSTRUÇÕES DE ARMAZENAMENTO E ESTAB L DADE
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PRECAUÇÕES E AV SOS
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ficação de OÓC TOS MM
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ES ES ES ES
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M
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Quando o poss ve
se ecc one apenas os oóc os no es ád o M de me ho
qua dade
CU DADO m n m e a expos ção do espéc me à u du an e
a ase de equ b o nas go as H ES e VS
m m m
m m m m m m
µ
H
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m
2 m nu os
Em
ES
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m
2 m nu os
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m m m
ES
6 a 10 m nu os
No a o equ b o do s oóc o s em ES3 es a á comp e o
quando a espessu a dos espaços da ona pe úc da e espaço
pe v e no são gua s O s oóc o s vão assen a no undo
da go a no espaço de 3 m nu os
Du an e o empo de equ b o em ES3
D spense assep camen e uma 1 go a de 50 µL de VS
2 m nu os an es de conc u a equ b ação e p epa e a
C yoT p F g 3 a Pa h nha HSV F g 4 ou o C yo ock
F g 5 pa a ca egamen o
NO A E m
m
m
C yoT p
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m
m
m
m
NO A
m
m
m
Pa h nha HSV
m
m
m
m
m
m
C yo ock
m
Os passos segu n es 9 13 devem se comp e ados em 80
110 segundos CU DADO a expos ção das amos as à VS
deve se m ada pa a ev a c o ox c dade Os espéc mes
endem a flu ua na VS po sso a us e o oco a avés
do m c oscóp o pa a man e uma v sua ação con nua
du an e a expos ção e man enha a pon a da p pe a de
ans e ênc a pe o pa a assegu a a ans e ênc a áp da
en e go as de VS Consu e a figu a 6
A
m ES
m
m
ES
m
m m
m
m m
ES
VS du an e 30 segundos
Ca ega e veda e m camen e o C yoT p da segu n e o ma
Ve figu a 7a
m
m
C
m
S
C
m
m
m
m
VS
Ma ca N 1
C
C
m
m
m
m VS
Ma ca N 2 C
A
m
C
P m m
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Ma ca N 3
O
m m
Ma ca N 2 Ma ca N 3
S
Se agem N 1 C
ao n ve da Ma ca N 1
m m
m
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R
m
C
m
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Se agem N 2
m
C
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Ma ca N 4
M
C
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m
Cm V
Ca ega e veda a Pa h nha HSV da segu n e o ma
U
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A
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C
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P
m
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SYMS
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NSTRUÇÕES DE UT L ZAÇÃO
N
m
V K
E
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P o oco o de V ficaçãodos Oóc os
ou
µ
P o oco o de V ficação do Emb ão
V
S
VS
µ
P o oco o de V ficação
C
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HSV C
gua da a é 2 amos as
C
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m
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m
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Ca ega o C yo ock como se segue
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m N A
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NOTA A opção B não es á au o ada pa a u
ação
nos EUA
M
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C
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NOTA Gua de semp e o C yo ock com a ampa vo ada
pa a ba xo
C
C
HSV
C
N
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m
m m
m
m
m
M
N
N
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m
B P o oco o de V ficação de EMBR ÕES PN a b as oc o
D
m
m
µ
ES
m m
P
R m
m
m
m
Quando o poss ve se ecc one apenas
os emb ões de me ho qua dade pa a v ficação
R
ES
ES
m
m
m m
m m m
m
ES
m
O m
m
m
ES
m
No a O espéc me va enco he e depo s g adua men e vo a á
ao seu amanho o g na o que nd ca que o p ocesso de
equ b o es á comp e o
CU DADO M n m e a expos ção do s espéc me s à u
du an e o p ocesso de equ b o nas go as de ES e VS
Du an e o empo de equ b o em ES
p epa e uma go a de 50 µL de so ução de VS con o me
ex b do na figu a 8 e p epa e a C yoT p a Pa h nha HSV
ou o Cy o ock pa a ca egamen o
S ga o p o oco o como o desc o ac ma Secção A – P o oco o
de V ficação de Oóc os M do passo 9 ao 12 pa a expos ção
a so uções de VS ca egamen o da C yoT p Pa h nha HSV ou
C yo ock me são em LN2 e a ma enamen o a ongo p a o
µ
µm
m
m
H
SYMS
P
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m
A
P
é de emba age a
U
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MATER A S NECESSÁR OS MAS NÃO NCLU DOS
C
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C RC G C RC C C RC Y C RC O
C
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HEPES M
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Ne pas u se de flacon don
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P
Fon e de
p o e na
A m
H m
mC
C
m
m
M
m
m
a sé
A
G
E
mm
m
As human source material is present in the product it may develop some
particulate matter during storage. This type of particulate matter is not
known to have an effect on product performance.
Á
Subs a os
ene gé cos
D
V am nas
e m ne a s
Á
Á
P m
C
Á
GARANT A DE QUAL DADE
A
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m
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C
V K
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E
m
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USP S
Ac ue emen es comp es endus de eche che nd quen que
es e e s à ong e me de a v fica on su es ovocy es e
es emb yons demeu en nconnus
PRECAUÇÃO EUA A
A
Á
Á
m
m
Do not use media for more than eight (8) weeks once containers have
been opened.
S
m
S
M
PROTOCOLO DE V TR F CAÇÃO
NOTA Os p oced men os devem e ec ua se à empe a u a
amb en e 20 27 C NÃO u
e a ase de m c oscóp o aquec do
pa a os p oced men os segu n es CU DADO m n m e a
expos ção do espéc me à u du an e a ase de equ b o com
as so uções ES e VS
D
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S
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G
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A
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DR
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Med do de pH
V m
Á
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B
A
B
An ox dan es
G
R
Tampão
B
HEPES
Am noác dos
A
G
H
m
D
STORAGE INSTRUCTIONS AND STABILITY
Store the unopened vials refrigerated at 2°C to 8°C. When stored as
directed, Vitrification Freeze Kit Solutions are stable until the expiration
date shown on the vial labels.
A
D
D S
D
D
D V
C
H
C
Sa s e ões
C
S
S
C
P
S
M
A
S
C
C
N
C
C
m
m
For additional details on the use of these products, each laboratory should
consult its own laboratory procedures and protocols which have been
specifically developed and optimized for your individual medical program.
COMPOS ÇÃO
m
m
m
R m
O
mm
Cryoprotecteur
Sucrose
Dextrane
Éthylèneglycol
Diméthylsulfoxyde
MATÉRIEL REQUIS, NON INCLUS DANS LE KIT
• CryoTip™ d’Irvine Scientific (référence catalogue no40709) ou paillette de
VHS (vitrification de haute sécurité, référence catalogue no25246-25251)
ou Cryolock™ (références catalogue : CL-R-CT-B, CL-R-CT-G, CL-R-CT-C,
CL-R-CT-Y, CL-R-CT-O)
• Connecteur Irvine Scientific (référence catalogue no40736) ou adaptateur
• Boites de pétri stériles (50 x 9 mm, Falcon 351006 ou équivalent)
• Cryotubes (4.5 mL) ou gobelets et Cryocanes
• HTF - HEPES modifié (référence du catalogue 90126) milieu de culture
supplémenté en protéines
• Hyaluronidase (référence catalogue no90101)
• Seringue Hamilton GASTIGHT® (50 µl, référence du catalogue 80901) ou autre
outil d’aspiration
• Pipettes de transfert (pipettes de verre étirées ou des bouts de micro-pipettes
avec un diamètre interne d’environ 200 µm)
• Brucelles ou pince à dissection
• Thermosoudeuse électrique à impulsions
• Soudeuse SYMS pour l’ensemble jonc-capillaire HSV
• Chronomètre
• Réservoir d’azote liquide (réservoir Dewar ou Styrofoam avec couvercle d’une
capacité de 1 à 2 litres)
• Azote liquide (volume suffisant pour remplir le réservoir à hauteur de 10,2 cm
(4 po))
CONSEILS D’UTILISATION
Composantes du Vit Kit – Freeze requises (par application):
• Solution d’équilibration (ES) :
60 µl pour le protocole de vitrification des
ovocytes
ou
50 µl pour le protocole de vitrification des
embryons
• Solution de vitrification (VS) :
50 µl pour le protocole de vitrification
• 1 CryoTip ou paillette VHS ou Cryolock (stocke jusqu’à 2 spécimens)
• Un connecteur
REMARQUE
m
D m
H HEPES m
P
Source
protéique
Albumine (humaine)
Les résultats de ces tests sont disponibles dans un certificat d’analyses spécifique
à chaque lot et mis à disposition sur demande.
m
m
P océde au dépô su e C yo ock comme su
À
m
m
m
m m
mm
m
ASSURANCE QUALITÉ
Les solutions contenues dans le Vit Kit® - Freeze sont passées à travers un filtre
à membrane et conditionnées aseptiquement, conformément aux procédures de
fabrication préalablement validées.
Chaque lot de Vit Kit – Freeze a subi les tests suivants :
Solutions et CryoTips:
• Endotoxines par méthode LAL (lysat d’amébocytes de limule) (≤ 0,6 UE/mL)
• Test de toxicité sur embryon de souris (une cellule) (≥ 80 % de
blastocystes expansés)
• Stérilité : test de stérilité actuel de la pharmacopée des États-Unis (USP),
chapitre 71 (Validation)
P
m
A P o oco e de v
REMARQUE
(pipette once
to rinse)
m
SYMS
Substrats
énergétiques
Dextrose
Inositol
Vitamines et
minéraux
Acide ascorbique
Acide
paraminobenzoïque
Calciférol
Acide folique
m
30 Seconds
µ D
m m m
mm
P
Antibiotique
Sulfate de
gentamicine
Autre
Guanine
Hypoxanthine
Thymine
Uracile
Xanthine
Adénosine
Sulfate d’adénine
2-Déoxy -D-Ribose
Ribose
Indicateur de pH
Rouge de phénol
P
(within 110 seconds after
exposure to VS drop)
VS
50 µL
Drops
6-10 min
Vitamins And
Minerals
Calciferol
Ascorbic Acid
A. OOCYTE (MII) Vitrification Protocol:
NOTE 1: Retrieved oocytes are to be denuded with Hyaluronidase to confirm
they are MII.
NOTE 2: Refer to Section B for embryo vitrification protocol.
1. Aseptically dispense 20 µL drop of culture medium, Modified HTF - HEPES
with protein, and ES in close proximity on an inverted lid of sterile petri dish
as shown in Figure 1, and place the dish on the microscope stage:
• one- 20 µL drop of Modified HTF (HEPES with protein)
• three- 20 µL drops (60 µL total) of ES (ES1, ES2, ES3)
2. Remove the culture dish containing MII oocytes from the incubator and
check the quality of the specimens under microscope. Where possible,
select only the best quality MII stage oocyte(s).
CAUTION: Minimize the exposure of the specimen(s) to
light during equilibration in the H, ES and VS drops.
3. Transfer the oocyte (up to 2 at a time) with minimal volume of medium from
the culture dish (in incubator) into the 20 µL drop of H for one minute.
4. Merge the drop of H to ES1 (See Fig. 1, arrow 1) with the tip of the transfer
pipette and allow spontaneous mixing of the two solutions to occur for 2
minutes.
5. Then merge the drop of ES2 (arrow 2) to the previously merged drops and
leave for 2 minutes.
6. Transfer the oocyte(s) with minimal volume of solution from merged drop to
ES3 drop for 6-10 minutes. Note: equilibration of oocyte(s) in
ES3 is complete when the thickness of the zona pellucida
and perivitelline space is equal. The oocyte(s) will settle
to the bottom of the drop within 3 minutes.
7. During the equilibration time in ES3:
Aseptically dispense one (1) 50 µL drop of VS 2 minutes
prior to complete equilibration and prepare the CryoTip
(Fig. 3), HSV Straw (Fig. 4), or Cryolock (Fig. 5) for loading:
NOTE: Carefully examine the vitrification device and tip before starting
procedure
• CryoTip: connect to the Hamilton syringe or appropriate aspiration
tool using a connector or adaptor to assure a tight seal. NOTE: Keep
the metal cover sleeve over the fine pulled tip to protect it until ready to
load specimens.
• HSV Straw: connect the longer end of the blue plastic insertion device
to the colored end of the handling rod.
• Cryolock: detach the cap.
8. The following steps (9-13) should be completed in 80-110
seconds. CAUTION: Exposure of specimens to VS should
be limited to prevent cytotoxicity. Specimen(s) tend to
float in VS, so adjust the focus through the microscope
to maintain continuous visualization during exposure and
keep the tip of the transfer pipette nearby to assure rapid
transfer between VS drops. Refer to Figure 6.
9. After equilibration in ES is complete, draw up some ES into the transfer pipet
and transfer the specimen(s) with minimal volume from the drop of ES into
the drop of VS for 30 seconds.
10. Load and heat seal the CryoTip as follows (See Figure 7a):
• Slide the metal cover sleeve up along the CryoTip to expose the fine
fragile tip end.
• Handling the CryoTip and Hamilton syringe while observing under the
microscope, carefully aspirate a small volume of VS to the Mark #1 on
the CryoTip.
• Continue observation under the microscope and gently aspirate the
specimen with VS to the Mark #2 on the CryoTip.
Metal
Cover
Sleeve
Mark #3
20 µL
Drops
Cryoprotectant
Dextran
Sucrose
Ethylene Glycol
Dimethylsulfoxide
VITRIFICATION PROTOCOL:
NOTE: Procedures are to be done at room temperature (2027ºC). DO NOT use heated microscope stage for the following
procedures. CAUTION: Minimize exposure of specimen to
light during equilibration in ES and VS solutions.
1. Bring the quantity to be used of ES and VS to room temperature (20-27°C).
NOTE: Avoid bringing the entire vials of ES and VS to room temperature
repeatedly when a partial of the solution is needed each time. It is better
to aliquot the quantity to be used and return the vials to 2-8°C right after
aliquoting. Modified HTF (HEPES) with protein is also required for oocyte
vitrification protocol.
2. Fill the liquid nitrogen reservoir with liquid nitrogen (sufficient to achieve a
depth of 4 inches or to completely submerge cryotube on cane) and place
close to microscope. Attach a cryotube or goblet (uncapped) to the bottom
clamp of a cryocane and submerge in the liquid nitrogen in preparation for
storage of the vitrified specimens.
3. Determine the number of specimens to be vitrified.
4. Label each sterile petri dish (or lid) and Cryo storage device with necessary
information.
5. Gently invert each vial of ES and VS twice to mix contents before use.
6. Prepare dish with droplets of solutions for Vitrification Procedure as follows:
Load CryoTip/HSV
Straw/Cryolock
30 Seconds
50 µL
Drops
6-10 min
Protein
Albumin (Human)
DIRECTIONS FOR USE
Vit Kit-Freeze component requirements (per application):
• Equilibration Solution (ES):
60 µL for Oocyte Vitrification Protocol
Or
50 µL for Embryo Vitrification Protocol
• Vitrification Solution (VS):
50 µL for Vitrification Protocol
• 1 CryoTip or HSV Straw or Cyrolock (stores up to 2 specimens)
• 1 Connector
Figure 6:
H = Modified HTF with HEPES (90126) + protein
ES = Equilibration Solution (90131)
Energy Substrates
Dextrose
Inositol
All results are reported on a lot specific Certificate of Analysis which is available
upon request.
MATERIALS REQUIRED BUT NOT INCLUDED
• Irvine Scientific CryoTip (Catalog #40709) or HSV Straw (Catalog #2524625251) or Cryolock™ (Catalog #CL-R-CT-B, CL-R-CT-G, CL-R-CT-C,
• Irvine Scientific Connector (Catalog #40736) or other adaptor
• Sterile petri dishes (50 X 9 mm, Falcon 351006 or equivalent)
• Cryotubes (4.5 mL) or goblets and cryocanes
• Modified HTF - HEPES (Catalog #90126) culture medium supplemented
with protein
• Hyaluronidase (Catalog #90101)
• Disposable gloves
• Hamilton GASTIGHT® Syringe (50 µL, Catalog #80901) or other aspiration tool
• Transfer pipettes (pulled glass pipettes or micropipette tips with an inner tip
diameter of ~200µm)
• Tweezers or forceps
• Impulse Heat Sealer
• SYMS Sealer for HSV Straw
• Stopwatch or timer
• Liquid nitrogen reservoir (dewar or styrofoam container with lid, 1-2 L volume)
• Liquid nitrogen (sufficient volume to achieve 4 inch depth in reservoir)
CE Mark
2511 Daimler Street, Santa Ana, California 92705 USA
Telephone: 1 949 261 7800 • 1 800 437 5706
Fax: 1 949 261 6522 • www.irvinesci.com
PN 40695 Rev.21
Figure 1:
Antibiotics
Gentamicin Sulfate
Each lot of Vit Kit-Freeze receives the following tests:
Solutions and CryoTips.
Endotoxin by Limulus Amebocyte Lysate (LAL) methodology (≤0.6 EU/mL)
Mouse Embryo Assay (one-cell) (≥ 80% expanded blastocyst)
Sterility by the current USP Sterility Test <71> (Pass)
U
O
See instructions
for use.
0050
0050
Antioxidant
Glutathione
Other
Adenine Sulfate
2-Deoxy-D-Ribose
Ribose
Guanine
Uracil
Xanthine
Thymine
Hypoxanthine
Adenosine
P-Aminobenzoic
Acid
Nicotinic Acid
Nicotinic Acid Amide
Pantothenic Acid
Riboflavin
Thiamine
D-Biotin
Pyridoxine
Sodium Bisulfite
Alpha-Tocopherol
QUALITY ASSURANCE
The solutions in Vit Kit-Freeze are membrane filtered and aseptically processed
according to manufacturing procedures which have been validated.
Phthalate, DBP, DEHP
Skirta pagalbinio apvaisinimo procedūroms.
Buffer
Sodium Bicarbonate
Hepes
Amino Acids
L-Arginine
Glycine
L-Histidine
L-Lysine
L-Proline
L-Tyrosine
DL-Alanine
DL-Aspartic Acid
DL-Glutamic Acid
DL-Isoleucine
Voor geassisteerde voortplantingsprocedures.
Dla procedur wspomagających rozrodczość.
DL-Leucine
DL-Methionine
DL-Phenylalanine
DL-Serine
DL-Threonine
DL-Tryptophan
DL-Valine
L-Hydroxyproline
L-Cystine
L-Cysteine
pH Indicator
Phenol Red
Manufacturer:
Irvine Scientfic®
Ar palīglīdzekļiem veicamām reproduktīvām procedūrām.
Salts & Ions
Sodium Chloride
Sodium Phosphate
Potassium Chloride
Magnesium Sulfate
Sodium Acetate
Sodium Phosphate
Calcium Chloride
Choline Chloride
Ferric Nitrate
• Now observe the CryoTip directly and aspirate more VS to the Mark #3.
• Specimen must be located between Mark #2 and Mark #3.
• Heat seal (Seal #1) the CryoTip on (or just below) Mark #1, and slide
the cover sleeve back down to cover and protect the fine fragile tip.
• Carefully remove the CryoTip from the aspiration tool and adaptor and
then heat seal (Seal #2) at the thick end of the CryoTip above the Mark
#4.
• Plunge the covered CryoTip directly into liquid nitrogen (cooling at a rate
of –12,000º C/min) (See Figure 7b).
Load and seal the HSV straw as follows:
• Using a micropipette, carefully deposit the specimen(s) into the gutter of
the capillary rod at 1 mm from the end. The drop holding the specimen(s)
must be under 0.5 µl. Maximum of 2 oocytes or embryos for each capillary
rod.
• Immediately place the capillary rod and handler into the straw and push
until the rectangular portion of the handler comes in contact with the flared
end of the straw.
• Slightly pinch the straw between your thumb and finger and remove the
insertion device.
• While still holding the straw in place, seal the open end using a SYMS
sealer.
• Hold the straw using tweezers in the area of the handling rod.
• Quickly plunge the entire straw into LN2 vertically. Gently stir the straw in
LN2 for a few seconds so as to avoid formation of an isolating air bubble
layer around the straw.
Load the Cryolock as follows:
• Using a micropipette, carefully load a maximum of 2 embryos on the
concave surface of the tip (same side of Cryolock logo) about 3 mm
(1/8”) from the edge of tip (use black mark as a reference), removing
any excess of cryoprotectant solution leaving as minimum volume of
vitrification media as possible (≤ 1 μL).
• Option A: Immediately and before immersing the Cryolock into LN2,
carefully insert the tip into the cap twisting tightly until secure
• Option B: Immediately immerse tip and cap under LN2. Wait for
bubbling to stop to allow for equilibration. Carefully insert the tip into
the cap, twisting tightly enough until secure.
NOTE: Option B not cleared for use in the U.S.
• Quickly plunge Cryolock into liquid nitrogen.
NOTE: Always store the Cryolock with the cap facing
down.
11. Place the vitrified CryoTip, HSV straw or Cryolock into the submerged LN2
filled cryotube or goblet (on the cryocane). Cap the cryotube (or goblet) or
attach up-side-down with another uncapped cryotube in order to secure the
vitrified device in liquid nitrogen.
12. Move the LN2 reservoir close to the LN2 cryo-freezer and transfer the
cryocane with contents to the cryo-freezer for long-term storage.
B. EMBRYOS (PN to Blastocyst)
Vitrification Protocol:
1. Aseptically dispense one- 50 µL drop of ES on an inverted lid of Petri dish.
2. Remove the culture dish with embryo(s) from the incubator and check the
quality of the specimen(s) under microscope. Where possible, select
only the best quality embryo(s) for vitrification.
3. Carefully transfer the specimen (up to two at one time) with a minimal volume
of medium from the culture dish to the drop of ES and start the timer.
Embryos should equilibrate in the ES drop slowly by free-fall for 6-10 minutes.
Note: The specimen will shrink and then gradually return
to its original size, which indicates that the equilibration
is complete.
CAUTION: Minimize the exposure of specimen(s) to light
during equilibration in ES and VS drops.
4. During this equilibration time in ES:
• set up one-50 µL drop of VS solution as shown in Fig
8 and prepare the CryoTip, HSV Straw, or Cyrolock for
loading.
Follow protocol as written above (Section A - Oocyte [MII]
Vitrification Protocol) from steps 9 through 12 for exposure
to VS solutions, loading of CryoTip, HSV Straw, or Cryolock,
plunging in LN2 and long term storage.
m
E
m
m
m
O
m
m
C m
m
m
m
m
m
m
N
mA
C
X
m
P
m
m
m
C
m
m
m
m
m
m
m
m
m
m
m
Em
m
m
m
m
A ua men e a e a u a de nves gação nd ca que os e e os a
ongo p a o da v ficação em oóc os e emb ões pe manecem
desconhec dos
Não use nenhum asco em que o emba amen o es e
enha s do comp ome do
ado
UE As med das pad ão pa a p even n eções esu an es do
uso de p odu os med c na s p epa ados a pa
de sangue os
p asma humanos que nc uem a se eção de dado es a aná se de
doações nd v dua s e ag upamen os de p asma pa a ma cado es
espec ficos de n eções e a nc usão de e apas de ab co efica es
pa a a na vação emoção de v us Apesa d sso quando
se adm n s am p odu os med c na s p epa ados a pa
de
sangue ou p asma humanos a poss b dade de ansm ssão
de agen es n ecc osos não pode se o a men e exc u da sso
ambém se ap ca a v oses eme gen es ou desconhec das e
ou os pa ogén cos Não há e a os de ansm ssão comp ovada
com a a bum na ab cada de aco do com as espec ficações da
Fa macope a Eu ope a a avés de p ocessos es abe ec dos
Recomenda se que semp e que se am adm n s ados a doen es
p odu os pa a me o de cu u a da v ne Sc en fic Rep oduc ve
Med a o nome e núme o do o e do p odu o se am eg s ados
pa a man e uma gação en e o doen e e o o e do p odu o
EUA A So ução H a u on dase con ém A bum na Sé ca
Humana HSA – Human Se um A bum n O ma e a de o gem
humana u
ado no ab co des e p odu o o es ado com os
k s ap ovados pe a FDA Food and D ug Admn s a on e o
cons de ado não ea vo pa a os an co pos da Hepa e C HCV
e aos an co pos do V us da munodefic ênc a Humana H V
Human mmunodefic ency V us Con udo nenhum mé odo
de es e o e ece uma ga an a abso u a de que os p odu os
de o gem humana não se am n ecc osos Manuse e odos
os ma e a s de o gem humana como se ossem capa es de
ansm
n eções usando med das de segu ança un ve sa s Os
dado es do ma e a de o gem ambém o am es ados pa a DCJ
CONTRA ND CAÇÃO
O p odu o con ém Su a o de gen am c na Recomenda
se o emp ego de p ecauções adequadas pa a ga an
que o doen e não fica sens b zado a esse an b ó co
ΕΛΛΗΝ ΚΆ
Μ
ΕΕ Προ δοπο ηση
Προσοχη Η
σ σ
σπ
π
ΗΠΑ
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πώ σ
ΠΡΟΤΕ ΝΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ
ψ
V K® π
σ σ
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ΠΕΡ ΓΡΑΦΗ ΠΡΟ ΟΝΤΟΣ
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ΣΥΝΘΕΣΗ
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Ρυθμ σ κό δ άλυμα Αν ο δω κό
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Υποσ ρώμα α
ν ργ ας
Δ
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Πηγή Προ
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ρυοπροσ α υ κό
Δ
Α
Δ
σ
φ
DEUTSCH
EU-VORSICHTSMASSREGEL: Nur für die professionelle Anwendung.
US-VORSICHTSMASSREGEL: Laut US-Bundesgesetz darf dieses Produkt
nur von einem Arzt bzw. auf ärztliche Anordnung verkauft werden.
BESTIMMUNGSZWECK
Das Vit Kit® - Freeze ist für die Verwendung zur Vitrifizierung und Lagerung von
menschlichen Oozyten (MII) und Zygoten im Vorkernstadium (PN) bis hin zu
Embryonen im Tag-3-Teilungsstadium und Blastozystenstadium im Rahmen der
künstlichen Befruchtung vorgesehen. Dieses Kit ist zur Verwendung zusammen
mit dem Irvine Scientific CryoTip® (Katalognr. 40709) und Vitrification Thaw Kit
(Vit Kit® - Thaw) für eine optimale Probengewinnung bestimmt.
PRODUKTBESCHREIBUNG
Equilibration Solution-ES ist eine HEPES-gepufferte Lösung von
Medium-199. Die Lösung beinhaltet Gentamicinsulfat (35 µg/ml), 7,5% (v/v) von
DMSO und auch von Ethylenglykol, und 20% (v/v) Dextran Serum Supplement*.
Vitrification Solution-VS ist eine HEPES-gepufferte Lösung von
Medium-199. Die Lösung beinhaltet Gentamicinsulfat (35 µg/ml), 15% (v/v) von
DMSO und auch von Ethylenglykol, 20% (v/v) Dextran Serum Supplement*, und
0,5 M Saccharose.
Diese zwei Lösungen sollen in Folge nach dem schrittweisen Verglasungsprotokoll
für Microtropfen gebraucht werden.
ZUSAMMENSETZUNG
Salze und Ionen
Natriumchlorid
Natriumphosphat
Kaliumchlorid
Magnesiumsulfat
Natriumacetat
Kalziumchlorid
Eisen(III)-Nitrat
Cholin-Chlorid
DL-Methionin
DL-Phenylalanin
DL-Serin
DL-Threonin
DL-Tryptophan
DL-Valin
L-Cystein
L-Hydroxyprolin
L-Cystine
Puffer
Natriumbicarbonat
HEPES
Antioxidant
Glutathion, reduziert
pH-Indikator
Phenol-Red
Aminosäuren
L-Arginin
Glycin
L-Histidin
L-Lysin
L-Prolin
L-Tyrosin
DL-Alanin
DL-Asparaginsäure
DL-Glutaminsäure
DL-Isoleucin
DL-Leucin
Sonstiges
Guanin
Hypoxanthin
Thymin
Uracil
Xanthin
Adenosin
Adeninsulfat
2-Deoxy-D-Ribose
Ribose
Vitamine und
Mineralien
Ascorbinsäure
P-Aminobenzoesäure
Calciferol
Folsäure
Nicotinsäure
Nicotinsäureamid
Pantothensäure
Riboflavin
Pyridoxin
Thiamin
D-Biotin
Alpha-Tocopherol
Natriumbisulfit
Antibiotikum
Gentamicinsulfat
Energiesubstanzen
Dextrose
Inositol
Proteinherkunft
Menschliches Serum
Albumin
Kryoprotektivum
Sucrose
Dextran
Ethylenglycol
Dimethylsulfoxid
QUALITÄTSSICHERUNG
Die Lösungen im Vit Kit-Freeze werden gemäß validierten Fertigungsverfahren
membranfiltriert und aseptisch verarbeitet.
Jedes Los von Vit Kit-Thaw wird durch Folgendes erprobt:
Lösungen und CryoTips:
Endotoxin nach LAL-Methodik (Limulus-Amöbozyten-Lysat) (≤ 0,6 EU/ml)
Maus-Embryo-Assay (eine Zelle) (≥ 80 % expandierte Blastozyste)
Sterilität gemäß aktuellem USP-Sterilitätstest <71> (Bestanden)
Alle Ergebnisse werden auf einem Los-spezifischen Analysenzeugnis berichtet,
das auf Antrag erhältlich ist.
BENÖTIGTE, ABER NICHT MITGELIEFERTE ARTIKEL
• Irvine Scientific CryoTip (Katalognr. 40709) oder HSV Straw (Katalognr.
25246-25251) oder Cryolock™ (Katalognr. CL-R-CT-B, CL-R-CT-G, CLR-CT-C, CL-R-CT-Y, CL-R-CT-O)
• Irvine Scientific Verbinder (Katalognr. 40736) oder anderer Adapter
• Sterile Petrischalen (50 x 9 mm, Falcon 351006 oder Äquivalent)
• Kryorohre (4.5 mL) oder Becher und Cryocanes (Tieftemperaturstöcke)
• Modified HTF - HEPES (Katalog-Nr. 90126) Kulturmedium mit Protein
• Hyaluronidase (Katalognr. 90101)
• Einmalhandschuhe
• Hamilton GASTIGHT® Spritze (50 µl, Katalog-Nr. 80901) oder anderes
Aspirationswerkzeug
• Transferpipetten (Pipetten aus gezogenem Glas oder Micropipette-Düsen,
deren innerer Durchmesser ~200 µm ist)
•Pinzette
• SYMS Sealer für HSV Straw
• Stoppuhr oder Zeitgeber
• Flüssigstickstoff-Reservoirbehälter (Dewar- oder Styroporbehälter mit
Deckel, Volumen 1 bis 2 Liter)
• Flüssigstickstoff (ausreichend Volumen für eine Tiefe von 4 Zoll (10 cm)
im Reservoirbehälter)
GEBRAUCHSHINWEISE
Komponentenbedarfe des Vit Kit-Freeze (pro Einsatz):
• Equilibration Solution (ES)
60 µl für Verglasungsprotokoll für Oozyten
Oder
50 µl für Verglasungsprotokoll für Embryos
• Vitrification Solution (VS):
50 µl für Verglasungsprotokoll
• 1 CryoTip oder HSV Straw oder Cyrolock (für bis zu 2 Proben)
• 1 Anschlussstück
um schnelle Versetzung zwischen VS-Tropfen zu sichern.
Sehen Siehe Abbildung 6.
9. Nachdem die Äquilibrierung in ES fertig ist, ziehen Sie etwas ES in die
Transferpipette und versetzen Sie für 30 Sekunden mit minimalem Volumen
der Probe(n) Muster vom ES-Tropfen in den Tropfen mit VS.
10. Den CryoTip folgendermaßen laden und hitzeversiegeln
(Siehe Abbildung 7a):
• Schieben Sie die metallische Hülse nach oben, die CryoTip entlang, um
das zerbrechliche Ende der Düse aufzudecken
• Während Sie die CryoTip und Spritze unter dem Mikroskop betrachten,
aspirieren Sie ein kleines Volumen VS bis zum Zeichen #1 auf der CryoTip.
• Während Sie das Verfahren noch unter Mikroskop beobachten, saugen Sie
eine kleine Menge VS in die CryoTip bis zum Zeichen #2.
• Betrachten Sie jetzt die CryoTip direkt und saugen Sie mehr VS ab bis zum
Zeichen #3.
• Versiegeln Sie die CryoTip mit Hitze (Verschluss #1) auf (oder gerade
unter) Zeichen #1, und schieben Sie die Hülse wieder nach unten, um das
zerbrechliche Ende der Düse zu schützen.
• Den CryoTip vorsichtig aus Aspirationswerkzeug und Adapter entfernen
und dann am dicken Ende des CryoTip oberhalb von Markierung Nr. 4
hitzeversiegeln (Versiegelung Nr. 2).
• Tauchen Sie die bedeckte flüssigen Stickstoff unter. (Der Stickstoff sollte eine
Kühlungsmaß von 12.000°C/min haben) (Siehe Abbildung 7b).
Den HSV Straw folgendermaßen laden und versiegeln:
• Mit einer Mikropipette die Probe(n) vorsichtig 1 mm vom Ende entfernt
in die Rinne des Kapillarstabes einbringen. Der Tropfen mit der Probe
muss weniger als 0,5 µl betragen. Maximal 2 Oozyten oder Embryos
für jeden Kapillarstab.
• Den Kapillarstab und die Handhabungsvorrichtung sofort in den
Straw platzieren und eindrücken, bis der rechteckige Teil der
Handhabungsvorrichtung das ausgestellte Ende des Straws berührt.
• Den Straw zwischen Daumen und Zeigefinger zusammendrücken und
die Einführungsvorrichtung entfernen.
• Den Straw weiterhin festhalten und das offene Ende mit einem SYMSVersiegler versiegeln.
• Den Straw mit einer Pinzette im Bereich des Handhabungsstabes
festhalten.
• Den gesamten Straw rasch vertikal in LN2 eintauchen. Den Straw
für einige Sekunden vorsichtig in LN2 rühren, um die Bildung einer
isolierenden Luftblasenschicht um den Straw herum zu vermeiden.
Beladen Sie den Cryolock folgendermaßen:
• Laden Sie mittels einer Mikropipette vorsichtig höchstens 2 Embryonen
auf die konkave Fläche der Spitze (selbe Seite wie das Cryolock-Logo),
ungefähr 3 mm (1/8 Zoll) vom Rand der Spitze entfernt (orientieren
Sie sich an der schwarzen Markierung); entfernen Sie hierbei jegliche
überschüssige Kälteschutzmittel-Lösung und lassen Sie so wenig
Vitrifizierungsmedium wie möglich zurück (≤ 1 μl).
• Option A: Führen Sie unmittelbar vor Eintauchen des Cryolock in den
Flüssigstickstoff (LN2) die Spitze vorsichtig in die Kappe ein und drehen
Sie die Spitze, bis sie fest arretiert ist
• Option B: Tauchen Sie Spitze und Kappe sofort in den Flüssigstickstoff
(LN2) ein. Warten Sie, bis die Blasenbildung aufhört und ein Equilibrium
hergestellt wurde. Führen Sie die Spitze vorsichtig in die Kappe ein und
drehen Sie die Spitze, bis sie fest arretiert ist.
HINWEIS: Option B ist nicht zur Verwendung in den USA zugelassen.
• Tauchen Sie den Cryolock schnell in den Flüssigstickstoff.
HINWEIS: Lagern Sie den Cryolock immer mit der Kappe nach unten.
11. Platzieren Sie den vitrifizierten CryoTip, HSV Straw oder Cryolock in
dem untergetauchten, mit Flüssigstickstoff (LN2) gefüllten Kryoröhrchen
oder Becher (auf dem CryoCane). Befestigen Sie einen Deckel auf dem
Kryoröhrchen (oder Becher) oder befestigen Sie das Röhrchen umgedreht
an einem zweiten nicht verschlossenen Kryoröhrchen, um das vitrifizierte
Gerät im Flüssigstickstoff zu sichern.
12. Bewegen Sie den LN2 Behälter beim LN2 Kryo-Kühlschrank und versetzen
Sie den Cryocane mit Inhalt in den Kryo-Kühlschrank für langfristiges Lager.
B. Verglasungsprotokoll für EMBRYOS
(PN bis zu Blastozysten):
1. Verteilen Sie aseptisch einen- 50 µl Tropfen ES auf einen umgekehrten
Deckel einer Petrischale.
2. Nehmen Sie die Kulturschale mit Embryo(s) aus dem Brutschrank und prüfen Sie
unter dem Mikroskop die Qualität des Musters. Wenn möglich, wählen
Sie für Verglasung nur den (die) Embryo(s) mit höchster
Qualität.
3. Übertragen Sie behutsam, mit minimalem Volumen Nährboden, die Probe
(bis zu zwei gleichzeitig) von der Kulturschale zum ES-Tropfen. Starten Sie
den Zeitgeber. Embryos sollen für 6-10 Minuten langsam durch freien Fall im
ES-Tropfen äquilibrieren. Hinweis: Die Probe wird schrumpfen
und sich dann allmählich zurück zur ursprünglichen Größe
vergrößern. Dies zeigt, dass die Äquilibrierung fertig ist.
VORSICHT: Minimieren Sie Kontakt (die Probe) mit Licht während der
Äquilibrierung in ES- und VS-Tropfen.
4. Während dieser Äquilibrierungszeit in ES:
• Bereiten Sie einen 50-µl-Tropfen VS-Lösung wie in Abb.
8 gezeigt vor und bereiten Sie den CryoTip, HSV Straw,
oder Cyrolock auf das Beladen vor.
Befolgen Sie das oben angegebene Protokoll (Abschnitt
A - Oozyten-Vitrifizierungsprotokoll [MII]) von den Schritten
9 bis einschließlich 12 bezüglich der Exposition gegenüber
VS-Lösungen, Beladung des CryoTip, HSV Straw, oder
Cryolock, Untertauchen in Flüssigstickstoff (LN2) und
langfristiger Lagerung.
Für weitere Einzelheiten zum Gebrauch dieser Produkte sollte das Labor in
seinen eigenen Protokollen nachschlagen, die für die spezifische medizinische
Einstellung spezifisch entwickelt und optimiert worden sind.
AUFBEWAHRUNGSANWEISUNGEN UND STABILITÄT
Die ungeöffneten Ampullen im Kühlschrank bei 2°C
bis 8°C aufbewahren. Bei Aufbewahrung unter diesen
Bedingungen sind die Vitrification Freeze Kit-Lösungen
bis zum Haltbarkeitsdatum, das auf den Ampullen-Etiketten
angegeben ist, haltbar.
Die Medien nach dem Öffnen der Behälter nicht länger als
acht (8) Wochen verwenden.
a blastocisti). Questo kit è destinato all’uso con CryoTip® (cod. cat. 40709) o
HSV Straw (cod. cat. 25246-25251) e il Vitrification Thaw Kit (Vit Kit® - Thaw)
di Irvine Scientific per il recupero ottimale dei campioni
Queste due soluzioni devono essere utilizzate in sequenza secondo un
protocollo di vitrificazione progressiva in microgocce
COMPOSIZIONE
Tampone
Bicarbonato di sodio
Hepes
Indicatore
del pH
Rosso fenolo
Aminoacidi
L-arginina
Glicina
L-istidina
L-lisina
L-prolina
L-tirosina
DL-alanina
Keine Ampullen verwenden, deren sterile Verpackung
beschädigt wurde.
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σορρόπηση ολοκληρώθηκ
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ων σ ο φως κα ά η δ άρκ α ης
σορρόπησης σ ς
σ αγόν ς ES κα VS σ αγόνων
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μ α δόση 50 µL δ αλύμα ος VS όπως
φα ν α σ ο Σχήμα 8 κα προ ο μάσ
ο C yoT p ο
καλαμάκ HSV ή ο Cy o ock γ α φόρ ωση
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ο πρω όκολλο όπως αναγράφ α παραπάνω
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ης δ αυγούς ώνης κα ου π ρ λ κ θ κού χώρου να σο
Τα ωοκύ αρα γκαθ σ αν α σ η βάση ης σ αγόνας ν ός
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Σχήμα 5 γ α η φόρ ωση
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σ 80 110 δ υ ρόλ π α ΠΡΟΣΟΧΗ Η κθ ση δ γμά ων
σ VS θα πρ π να π ρ ορ α γ α ην πρόληψη ης
κυ αρο ο κό η ας Το δ γμα α
ν να π πλ σ ο VS
γ αυ ό προσαρμόσ
ην σ αση μ σω ου μ κροσκοπ ου
ώσ να δ α ηρ α η συν χής οπ κή παφή κα ά ην
κθ ση κα δ α ηρήσ
ην άκρη ης π π ας μ αφοράς
κον ά ώσ να δ ασφαλ σ
ην γρήγορη μ αφορά μ α ύ
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σ ο Σχήμα 6
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ο Σχήμα 7a
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Es dürfen keine Ampullen mit Lösung verwendet werden, die Hinweise auf
Beschädigung, undichte Stellen, Partikel, Trübung oder eine veränderte Färbung
aufweisen. Das Produkt muss in Übereinstimmung mit den entsprechenden
Bestimmungen entsorgt werden.
Behandeln Sie das Produkt mit aseptischen Methoden, um
Kontaminierungsprobleme zu meiden.
Die langfristigen Auswirkungen einer Vitrifizierung auf Oozyten
und Embryonen sind nach aktuellen Stand der Forschung
unbekannt.
EU: Zu den Standardmaßnahmen zur Vorbeugung von
Infektionen bei der Anwendung medizinischer Produkte
aus menschlichem Blut oder Plasma zählen die sorgfältige
Auswahl der Spender, die Untersuchung einzelner
Spenden und Plasmapools auf spezielle Infektionsmarker
sowie die Umsetzung effizienter Herstellungsschritte
zur Inaktivierung/Entfernung von Viren. Dennoch lässt
sich bei der Veabreichung medizinischer Produkte aus
menschlichem Blut oder Plasma die Übertragung von
Infektionskrankheiten nicht vollständig ausschließen.
Dies gilt auch für unbekannte oder neu gebildete Viren
oder sonstige Pathogene. Es liegen keine Berichte
zur nachgewiesenen Übertragung von Viren durch
Albumin vor, das gemäß anerkannter Verfahren und
in Übereinstimmung mit den Spezifikationen der
Europäischen Pharmakopöe hergestellt wurde. Es wird
dringend empfohlen, bei jeder patientenbezogenen
Anwendung eines Kulturmediums von Irvine Scientific
für die Reproduktionsmedizin den Namen und die
Chargennummer des Produkts zu dokumentieren, um
jederzeit eine Verbindung zwischen dem Patienten und
der Produktcharge herstellen zu können.
US: Hyaluronidase-Lösung enthält humanes Serumalbumin
(HSA). Das menschliche Ursprungsmaterial, das bei der
Herstellung dieses Produkts verwendet wurde, wurde mit
FDA-zugelassenen Methoden getestet und für nicht reaktiv
auf Antikörper zu Hepatitis C (HCV) und Antikörper gegen
das humane Immundefizienzvirus (HIV) befunden. Keine
Testmethode kann jedcoh völlig sicherstellen, dass Produkte
aus menschlichem Umrsprungsmaterial nicht infektiös sind.
Alle menschlichen Ursprungsmaterialien müssen als potentielle
Infektionsüberträger behandelt werden, indem allgemein gültige
Vorsichtsmaßnahmen angewendet werden. Die Spender des
Ursprungsmaterials wurden auch auf CJK voruntersucht.
KONTRAINDIKATION
Das Produkt enthält Gentamicinsulfat. Es müssen
Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um zu gewährleisten,
dass der Patient gegenüber diesem Antibiotikum nicht
sensibilisiert ist.
ITALIANO
AVVERTENZA PER L’UE: Esclusivamente per uso professionale.
AVVERTENZA PER GLI USA: La legge federale (U.S.A.) limita la vendita
di questo dispositivo da parte o su prescrizione di un medico.
USO PREVISTO
Vit Kit® - Freeze è destinato all’uso in procedure di riproduzione assistita per
la vitrificazione e la conservazione di ovociti umani (MII) ed embrioni (da zigote
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προφυλά ς θα πρ π να λαμβάνον α γ α να ασφαλ σ ο
ο ασθ νής δ ν να υα σθη οπο ημ νος σ αυ ό ο αν β ο κό
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nc us one d as p odu ve e cac pe
na vaz one
e m naz one de v us Nonos an e c ò quando s
somm n s a un p odo o med c na e p epa a o con p asma
o sangue umano non s può esc ude e comp e amen e
a poss b à d asm ss one d agen n e v C ò va e
anche pe v us e a
pa ogen sconosc u o eme gen
Non sono s a segna a cas con e ma d asm ss one
d v us con a bum na p odo a ne
spe o de e
spec che eu opee d a macopea med an e p oced men
ben conso da
S cons g a v vamen e d eg s a e
nome e nume o d o o de p odo o d u
e en d
co u a v ne Sc en c Rep oduc ve Med a P oduc s
somm n s a a un paz en e n modo da man ene e un
egame a paz en e e
o o de p odo o
USA Ques o p odo o con ene a bum na da s e o umano
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ma e a e d o g ne umana usa o ne a p epa az one
d ques o p odo o è s a o es a o con k au o zza da a
FDA e s è d mos a o non ea vo ag an co p de epa e
C HCV e ag an co p de v us de mmunodefic enza
umana H V Tu av a nessun me odo d es può o
e
a ce ezza asso u a che p odo d o g ne umana s ano
non n e v Man po a e u
ma e a d o g ne umana
come se osse o po enz a men e n e v mp egando
e p ecauz on un ve sa men e ado a e
dona o de
ma e a e so gen e sono s a so opos a sc een ng anche
pe a ma a a d C eu z e d Jakob MCJ
CONTRO ND CAZ ON
p odo o con ene gen am c na so a o Ado a e e
oppo une p ecauz on pe ga an e che paz en e non s a
sens b zza o a ques o an b o co
ESPAÑOL
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POZOR M n ma zu e vys avován vzo ku vzo ků svě u
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oocy u oocy ů v oz oku ES3 e dokončená když
ouš ka meze y mez zona pe uc da a v s vou ko em
ž ou ku pe v e ne e s e ná Oocy y se usad na spodu
kapky během 3 m nu
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Dextrano
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Sulfóxido de dimetilo
Todos los resultados se reflejan en el Certificado de Análisis específico de lote
disponible, el cual se suministra bajo solicitud.
MATERIAL NECESARIO NO INCLUIDO EN EL KIT
• CryoTip (n.º de catálogo 40709) o pajuela HSV (n.º de catálogo 2524625251) o Cryolock™ (n.º de catálogo CL-R-CT-B, CL-R-CT-G, CL-R-CT-C,
CL-R-CT-Y, CL-R-CT-O) de Irvine Scientific
• Conector de Irvine Scientific (n.º de catálogo 40736) u otro adaptador
• Placas de Petri estériles (50 x 9 mm, Falcon 351006 o equivalentes)
• Criotubos (4.5 mL) o “goblets” y cestas de congelación
• Medio de cultivo HTF modificado - HEPES (n.º de catálogo 90126) suplementado
con proteína
• Hialuronidasa (n.º de catálogo 90101)
• Guantes desechables
• Jeringa Hamilton GASTIGHT® (50 µL, n.º de catálogo 80901) u otra herramienta
de aspiración
• Pipetas de transferencia (pipetas de cristal estiradas o puntas de micropipeta
con un diámetro interior de aprox. 200 µm).
• Pinzas o fórceps
• Selladora por impulsos de calor
• Sellador SYMS para la pajuela HSV
• Cronómetro o reloj
• Contenedor de nitrógeno líquido (contenedor Dewar o Styrofoam con tapa, con
capacidad para 1-2 l)
• Nitrógeno líquido (volumen suficiente para conseguir una profundidad en el
contenedor de unos 10 cm)
INSTRUCCIONES DE USO
Componentes del Vit Kit-Freeze necesarios para cada aplicación:
• Solución Equilibrante (ES):
• 60 µL para el Protocolo de Vitrificación de Oocitos
o
• 50 µL para el Protocolo de Vitrificación de Embriones
• Solución de Vitrificación (VS):
• 50 µL para el Protocolo de Vitrificación
• 1 CryoTip o pajuela HSV o Cyrolock (almacena hasta 2 muestras)
• 1 Conector
PROTOCOLO DE VITRIFICACIÓN
NOTA: el proceso debe llevarse a cabo a temperatura ambiente
(20-27ºC). NO utilice la platina calefactora del microscopio para
los pasos descritos a continuación. PRECAUCIÓN: minimice
la exposición de la muestra a la luz durante su equilibrado en
las soluciones ES y VS.
1. Deje la cantidad que vaya a usar de la solución de equilibrado (ES)
y la solución de vitrificación (VS) a temperatura ambiente (20-27 °C).
NOTA: evite dejar los frascos enteros de ES y VS a temperatura ambiente
repetidamente si solamente necesita una parte de la solución cada vez. Es
mejor obtener la parte alícuota de la cantidad que necesite usar y refrigerar
de nuevo los frascos a 2-8 °C inmediatamente después. Para oocitos,
también es necesario preparar HTF modificado (HEPES) con proteína.
2. Llene un contenedor con nitrógeno líquido (suficiente volumen para poder
sumergir en él un criotubo en su cesta y sitúelo cerca del microscopio. Enganche
un criotubo o un “goblet” (destapado) a la abrazadera inferior de una cesta
de congelación y sumérjalo en el nitrógeno líquido como preparación para el
almacenamiento de las muestras vitrificadas.
3. Determine el número de muestras a vitrificar.
4. Etiquete una placa de Petri estéril (o tapa) y dispositivo de crío conservación
con la información necesaria.
5. Antes de usar las soluciones ES y VS, mezcle su contenido con un par de
inversiones suaves de los viales.
6. Prepare las placas con las gotas de soluciones de la siguiente manera para el
proceso de vitrificación:
A. Protocolo de Vitrificación de OOCITOS (MII):
NOTA 1: los oocitos recuperados deben despojarse con hialuronidasa
para confirmar que son MII.
NOTA 2: consulte la sección B para el protocolo de vitrificación de embriones.
1. Dispense asépticamente gotas de 20 µL del medio de cultivo, HTF
modificado - HEPES con proteína, y de ES en proximidad cercana sobre
una placa de Petri invertida estéril tal como se muestra en la figura 1 y
coloque la placa en la platina del microscopio:
• una gota de 20 µL de HTF modificado (HEPES con proteína)
• tres gotas de 20 µL (60µL en total) de ES (ES1, ES2, ES3)
2. Retire del incubador la placa de cultivo con los oocitos MII y compruebe al
microscopio la calidad de las muestras. Siempre que sea posible,
seleccione solo los oocitos (MII) de mejor calidad.
PRECAUCIÓN: minimice la exposición de la muestra a
la luz durante su equilibrado en las soluciones ES y VS.
3. Transfiera el oocito (hasta 2 a la vez) con el mínimo volumen posible del medio
de la placa de cutivo (del incubador) a la gota H de 20µL.
4. Con la punta de la pipeta de transferencia, acerque hasta fusionar la gota H y la
ES1 (ver figura 1, flecha 1) y permita la mezcla espontánea de las 2 soluciones
durante 2 minutos.
5. A continuación, mezcle la gota de ES2 (flecha 2) con las gotas anteriormente
mezcladas y deje reposar durante 2 minutos.
6. Transfiera el(los) oocito(s) con el mínimo volumen posible de solución de la
gota combinada a la gota ES3 por un periodo de 6 a 10 minutos..
NOTA: el equilibrado de los oocitos en ES3 se habrá
completado cuando el grueso de la zona pellucida y el
espacio perivitelino sean iguales. El oocito(s) se asentará
al fondo de la gota en unos 3 minutos.
7. Durante este tiempo de equilibrado en ES3:
Dispense asépticamente una (1) gota de 50 μL de VS 2
minutos antes de completar el equilibrado y prepare el
CryoTip (figura 3), la pajuela HSV (figura 4) o el Cryolock
(figura 5) para la carga:
NOTA: examine cuidadosamente el dispositivo y la punta de vitrificación
antes de iniciar el procedimiento
• CryoTip: conectar a la jeringa Hamilton o a una herramienta
apropiada de aspiración mediante un conector o adaptador para
asegurar un cierre hermético. NOTA: mantenga la cubierta de metal
sobre la punta fina estirada para protegerla hasta que se vayan a cargar
las muestras.
• Pajuela HSV: conectar el extremo más largo del dispositivo de
inserción azul de plástico al extremo de color del manipulador.
• Cryolock: extraer la tapa.
8. Los siguientes pasos (9-13) deben llevarse a cabo en 80110 segundos. PRECAUCIÓN: debe limitarse la exposición
de las muestras a la VS para impedir el efecto citotóxico.
Dado que las muestras tienden a flotar en la VS, ajuste el
microscopio para mantener un control visual continuado
durante la exposición, y mantenga la punta de la pipeta
de transferencia cerca para asegurar una transferencia
rápida entre las gotas de VS. Consulte la figura 6.
9. Al completar el equilibrado en ES, aspire un poco de ES con la pipeta de
transferencia y transfiera la(s) muestra(s) con el mínimo volumen desde la gota
de ES a la gota de VS durante 30 segundos.
10. Cargue y selle térmicamente el CryoTip como se indica a
continuación (Ver figura 7a):
• Deslice la funda de metal hacia arriba a lo largo del CryoTip para
exponer el extremo frágil de la punta.
• Observando bajo el microscopio, manipule el CryoTip y la jeringuilla,
aspire cuidadosamente un pequeño volumen de VS hasta la
marca n. º 1 del CryoTip.
• Continúe observando al microscopio y aspire suavemente la muestra
con VS hasta la marca n. º 2 del CryoTip.
• Observe el CryoTip directamente y aspire más VS hasta
la marca n. º 3.
• La muestra debe situarse entre la marca n. º 2 y la marca n. º 3.
• Termoselle (sello n. º1) el CryoTip sobre (o justo debajo de) la
marca n. º 1, y deslice la funda metálica hacia abajo para tapar y
proteger la punta fina frágil.
• Extraiga con cuidado el CryoTip de la herramienta de aspiración y
del adaptador y a continuación selle térmicamente (sello n.º 2) el
extremo grueso del CryoTip sobre la marca n.º 4.
• Sumergir el CryoTip recubierto con la funda directamente en el
nitrógeno líquido (enfriando a una velocidad de –12000ºC/min) (Ver
figura 7b):
Cargue y selle la pajuela HSV como se indica a continuación:
• Usando una micropipeta, deposite con cuidado la(s) muestra(s) en la
boca del tubo capilar a 1 mm desde el extremo. La mezcla con la(s)
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No utilice el medio durante más de ocho (8) semanas después que los envases
hayan sido abiertos.
Ya que el producto contiene sustancia de origen humano puede desarrollar partículas
durante el almacenaje. No hay evidencia de que partículas de esta clase tengan un
efecto sobre el funcionamiento del producto.
PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS
Este producto debe ser utilizado por personal capacitado en técnicas de
reproducción asistida que incluyan la aplicación prevista para el mismo.
Las instalaciones que utilizan este producto son responsables por mantener
un sistema de rastreo del mismo y deben cumplir los reglamentos nacionales
de control, cuando corresponda.
Como precaución adicional durante la preparación del proceso, recomendamos
que cada CryoTip sea examinado cuidadosamente al sacarlo del envase. Antes
de su uso, el Cryotip debería ser observado al microscopio bajo un aumento
suficiente (40x) para comprobar que no haya sufrido daños (rotura de punta o
grietas) durante el transporte.
No utilice ningún vial de solución que muestre evidencias de daños, fugas,
partículas, turbidez o que haya cambiado de color. Deseche el producto de
acuerdo con la normativa aplicable.
Para evitar problemas de contaminación, utilice técnicas asépticas de
manipulación.
En la actualidad, la bibliografía de investigación indica que
los efectos a largo plazo de la vitrificación de oocitos y
embriones continúan siendo desconocidos.
No usar frascos en los que el envase estéril esté dañado.
UE: las medidas estándar para la prevención de
infecciones resultantes del uso medicinal de productos
elaborados a partir de sangre y plasma humanos
incluyen la selección de donantes, la evaluación de
donaciones individuales y de reservas de plasma para la
identificación de indicadores específicos de infección y
la inclusión de procedimientos de elaboración eficaces
para la inactivación o eliminación de los virus. A pesar
de lo anterior, al administrar productos medicinales
elaborados a partir de sangre o plasma humanos, la
posibilidad de transmisión de agentes infecciosos no
puede ser totalmente excluida. Esto también se aplica
a virus desconocidos o que surjan y a otros patógenos.
No existen informes de transmisión comprobada de virus
con albúmina elaborada según las especificaciones de
la Farmacopea europea para los procesos establecidos.
Se recomienda de manera enfática que cada vez que se
administren a una paciente los productos de medios para
reproducción de Irvine Scientific, se registren el nombre y
número de lote del producto con la finalidad de mantener
la conexión entre la paciente y el lote del producto.
EE.UU.: la solución Hyaluronidase Solution contiene
albúmina de suero humano (HSA). El material de origen
humano utilizado en la preparación de este producto
ha sido evaluado con kits aprobados por la FDA,
comprobándose que no reaccionan con anticuerpos
para la Hepatitis C (HCV) y anticuerpos para el virus de
la inmunodeficiencia humana (HIV). Sin embargo, ningún
método analítico ofrece garantías absolutas de que
los productos derivados de fuentes humanas no sean
infecciosos. Manipule todo material de origen humano
como si fuera capaz de transmitir infecciones, usando las
precauciones habituales. Los donantes también fueron
sometidos a análisis de detección de la enfermedad CJD.
CONTRAINDICACIÓN
El producto contiene sulfato de gentamicina. Es conveniente
tomar las precauciones necesarias para asegurarse de que
el paciente no sea sensible a este antibiótico.
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INSTRUCCIONES DE CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD
Conserve los envases no abiertos refrigerados a una temperatura de 2 º a 8 ºC. Si se
conservan según lo indicado, las soluciones del kit de congelación post vitrificación
son estables hasta la fecha de caducidad indicada en las etiquetas de los envases.
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Para más detalles sobre la utilización de estos productos, consulte los protocolos de
trabajo de su propio laboratorio, los cuales han sido desarrollados y especialmente
optimizados de acuerdo a su programa médico particular.
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B. EMBRIONES (PN a Blastocisto):
Protocolo de Vitrificación
1. En condiciones asépticas dispense 1 gota de 50µL de ES sobre una tapa
invertida de una placa de Petri.
2. Retire del incubador la placa de cultivo con los embriones y compruebe bajo
el microscopio la calidad de los mismos. Siempre que sea posible,
seleccione para la vitrificación solo los embriones de mejor
calidad.
3. Aspire una pequeña cantidad de solución ES (de la gota de ES) en la pipeta
de transferencia y con cuidado transfiera la muestra (hasta 2 a la vez) con el
mínimo volumen de medio de la placa de cultivo a la gota de ES y ponga en
marcha el cronómetro. Los embriones deben equilibrarse lentamente en la gota
de ES cayendo libremente durante unos 6-10 minutos.
Nota: la muestra perderá volumen y a continuación lo
recuperará lentamente volviendo a su forma original
indicando que el equilibrio se ha completado.PRECAUCIÓN:
minimice la exposición de la(s) muestra(s) a la luz durante
la etapa de equilibrio en las gotas de ES y VS.
4. Durante esta etapa de equilibrio:
• Vierta una gota de 50 µL de solución, como se muestra
en la figura 8, y prepare el CryoTip, la pajuela HSV o
el Cyrolock para la carga.
Siga el protocolo descrito anteriormente (Sección A:
Protocolo de Vitrificación de OOCITOS (MII)) desde el paso
9 hasta el paso 12 para la exposición a soluciones VS, carga
del CryoTip, pajuela HSV o Cryolock, inmersión en LN2 y
almacenamiento a largo plazo.
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C yoT p
muestra(s) debe ser inferior a 0,5 µl. Máximo de 2 ovocitos o embriones
por tubo capilar.
• Coloque inmediatamente el tubo capilar y el manipulador en la pajuela y
empuje hasta que la parte rectangular del manipulador esté en contacto
con el extremo ensanchado de la pajuela.
• Pellizque ligeramente la pajuela con el pulgar y el índice y extraiga el
dispositivo de inserción.
• Mientras sujeta la pajuela, selle el extremo abierto usando un sellador
SYMS.
• Sujete la pajuela usando pinzas en la zona del manipulador.
• Empuje rápidamente toda la pajuela en el LN2 de forma vertical. Agite
suavemente la pajuela en el LN2 durante unos segundos para evitar
la formación de una capa de burbujas de aire aislantes alrededor de
la pajuela.
Cargue el Cryolock de la siguiente manera:
• Usando una micropipeta, cargue con cuidado un máximo de 2
embriones en la superficie cóncava de la punta (mismo lado del
logotipo de Cryolock) aproximadamente 3 mm (1/8”) desde el borde
de la punta (utilice la marca negra como referencia), eliminando
cualquier exceso de solución de crioprotector, dejando el volumen
de medios de vitrificación lo más bajo posible (≤ 1 μL).
• Opción A: de forma inmediata y antes de sumergir el Cryolock
en LN2, introduzca con cuidado la punta en la tapa girando
firmemente hasta que quede asegurada
• Opción B: sumerja inmediatamente la punta y la tapa en LN2.
Espere a que deje de burbujear para permitir el equilibrio.
Introduzca con cuidado la punta en la tapa, girando firmemente
hasta que quede asegurada.
NOTA: la opción B no está aprobada para su uso en los EE. UU.
• Sumerja rápidamente Cryolock en nitrógeno líquido.
NOTA: guarde siempre el Cryolock con la tapa hacia abajo.
11. Coloque el CryoTip, la pajuela HSV o Cryolock vitrificados en el criotubo o
frasco sumergido en LN2 (en el vial criogénico). Tape el criotubo (o frasco)
o colóquelo boca arriba con otro criotubo sin tapar para fijar el dispositivo
vitrificado en nitrógeno líquido.
12. Coloque el contenedor de nitrógeno líquido cerca del crio-congelador de
nitrógeno líquido y transfiera la cesta de congelación con su contenido a
dicho congelador para su almacenamiento a largo plazo.
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F
m
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Substratos
energéticos
Dextrosa
Inositol
Cada lote de Vit Kit-Freeze se somete a los siguientes ensayos: Soluciones
y CryoTipsä:
Endotoxinas por el método del Lisado de Amebocitos de Limulus (LAL)
(≤0,6 EU/ml)
Ensayo en embriones de ratón (una célula) (≥ 80 % blastocisto expandido)
Esterilidad de acuerdo al ensayo de esterilidad USP actual <71> (Pase)
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B
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Antibiótico
Sulfato de
gentamicina
CONTROL DE CALIDAD
Las soluciones incluidas en el Vit Kit-Freeze están filtradas a través de
membrana y procesadas en condiciones de esterilidad, de acuerdo con los
procesos de fabricación validados.
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Bisulfito sódico
Antioxidante
Tampón químico Glutatión reducido
Bicarbonato sódico
Otros
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Indicador de pH Hipoxantina
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Rojo de fenol
Uracilo
Xantina
Amino ácidos
Adenosina
L-Arginina
Sulfato de adenina
Glicina
2-desoxi-D-ribosa
L-Histidina
Ribosa
L-Lisina
L-Prolina
Vitaminas y
L-Tirosina
minerales
DL-Alanina
Ácido ascórbico
DL-Ácido aspártico
Ácido paraDL-Ácido glutámico
aminobenzoico
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Calciferol
DL-Leucina
Ácido fólico
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Cloruro sódico
Fosfato de sodio
Cloruro potásico
Sulfato magnésico
Acetato sódico
Cloruro cálcico
Nitrato férrico
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προ όν α προ ρχόμ να από ανθρώπ ν ς πηγ ς να μη
μολυσμα κά Όλα α υλ κά ανθρώπ νης προ λ υσης θα
πρ π να χ ρ ον α ως χον α π θανό η α μ άδοσης
μολύνσ ων λαμβάνον ας μ ρα γ ν κής προφύλα ης Ο
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που παρασκ υά ον α από ανθρώπ νο α μα ή πλάσμα
συμπ ρ λαμβάνουν
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δ αδ κασ α αν χν υσης ων α ομ κών δωρ ών κα ομάδων
πλάσμα ος γ α συγκ κρ μ νους δ κ ς μόλυνσης κα ην
νσωμά ωση απο λ σμα κών βημά ων παρασκ υής γ α
ην αν ν ργοπο ηση αφα ρ ση ών Παρόλα αυ ά ό αν
χορηγούν α φαρμακ υ κά προ όν α που παρασκ υά ον α
από ανθρώπ νο α μα ή πλάσμα η π θανό η α να μ αδοθούν
μολυν κο παράγον ς δ ν μπορ να αποκλ σθ
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Αυ ό σχύ κα γ α αν ρχόμ νους ούς κα άλλα παθογόνα
Δ ν υπάρχουν αναφορ ς ή αποδ δ γμ ν ς αναμ αδόσ ς
ού μ αλβουμ νη παρασκ υασμ νη μ καθ ρωμ ν ς
δ αδ κασ ς σύμφωνα μ ς προδ αγραφ ς ης Ευρωπα κής
Φαρμακοπο ας Συν σ ά α ν ονα να κα αγράφ α ο
όνομα κα ο αρ θμός παρ δας ου προ όν ος κάθ φορά
που χορηγούν α μ σα καλλ ργ ας ης v ne Sc en fic
Rep oduc ve Med a P oduc s σ ασθ νή
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A. Protocollo di vitrificazione di OVOCITI (MII):
NOTA 1: gli ovociti prelevati devono essere denudati con ialuronidasi per
confermare che siano MII.
NOTA 2: consultare la Sezione B per il protocollo di vitrificazione di embrioni.
1. Dispensare con tecnica asettica una goccia da 20 µl di terreno di coltura,
HTF - HEPES modificato proteico, e di ES nelle strette vicinanze di una
piastra di Petri sterile con coperchio capovolto, come mostrato nella
Figura 1, e posizionare la piastra sul tavolino del microscopio:
• una goccia da 20 µl di HTF (HEPES proteico) modificato)
• tre gocce da 20 µl (60 µl in totale) di ES (ES1, ES2, ES3)
2. Togliere la piastra di coltura contenente gli ovociti MII dall’incubatore
e controllare la qualità dei campioni al microscopio. Se possibile,
selezionare solo gli ovociti MII della migliore qualità.
ATTENZIONE: ridurre al minimo l’esposizione dei campioni
alla luce durante l’equilibratura nelle gocce di H, ES e VS.
3. Trasferire l’ovocita (fino a 2 alla volta) con un volume minimo di terreno dalla
piastra di coltura (nell’incubatore) alla goccia da 20 µl di H per un minuto.
4. Unire la goccia di H a ES1 (vedere Fig. 1, freccia 1) con la punta della pipetta
di trasferimento e attendere la miscelazione spontanea delle due soluzioni per
2 minuti.
5. Quindi unire la goccia di ES2 (freccia 2) alle gocce precedentemente miscelate
e attendere 2 minuti.
6. Trasferire gli ovociti con un volume minimo di soluzione dalla goccia miscelata
alla goccia di ES3 per 6-10 minuti. Nota: l’equilibratura degli ovociti
in ES3 è completa quanto lo spessore della zona pellucida
e dello spazio perivitellino sarà equivalente. Gli ovociti si
depositeranno sul fondo della goccia entro 3 minuti.
7. Durante il periodo di equilibratura in ES3:
Dispensare con tecnica asettica una (1) goccia da 50
µl di VS 2 minuti prima per completare l’equilibratura e
preparare CryoTip (Fig. 3), HSV Straw (Fig. 4) o Cryolock
(Fig. 5) per il caricamento:
NOTA: esaminare accuratamente il dispositivo di vitrificazione e la punta
prima di iniziare la procedura.
• CryoTip: collegare il dispositivo alla siringa Hamilton o allo strumento
di aspirazione appropriato mediante un connettore o un adattatore per
garantire la chiusura ermetica. NOTA: tenere la copertura metallica sulla
punta fine estratta leggermente per proteggerla fino a quando non si è
pronti a caricare i campioni.
• HSV Straw: collegare l’estremità più lunga del dispositivo di
inserimento in plastica blu all’estremità colorata dell’asta di manipolazione.
• Cryolock: togliere il tappo.
8. Le fasi seguenti (9-13) devono essere completate
in 80-110 secondi. ATTENZIONE: l’esposizione dei
campioni alla VS deve essere limitata per prevenire la
citotossicità. I campioni tendono a galleggiare nella VS,
per cui è necessario regolare costantemente il fuoco del
microscopio per mantenere la visualizzazione continua
durante l’esposizione e tenere la punta della pipetta di
trasferimento vicina per garantire il rapido trasferimento
tra le gocce di VS. Consultare la Figura 6.
9. Una volta terminata l’equilibratura in ES, aspirare un po’ di ES nella pipetta
di trasferimento e trasferire i campioni con un volume minimo di soluzione
dalla goccia di ES alla goccia di VS per 30 secondi.
10. Caricare e sigillare termicamente CryoTip come segue
(Vedere la Figura 7a):
• Fare scorrere la guaina di copertura metallica verso l’alto lungo CryoTip
per esporre l’estremità fragile della punta fine.
• Manipolando CryoTip e la siringa Hamilton sotto osservazione al
microscopio, aspirare delicatamente un piccolo volume di VS fino al
Segno 1 su CryoTip.•
• Sempre sotto osservazione al microscopio, aspirare delicatamente il
campione con VS fino al Segno 2 su CryoTip.•
• Osservare ora CryoTip direttamente e aspirare ulteriore VS fino al
Segno 3.
• Il campione deve trovarsi tra il Segno 2 e il Segno 3.
V TR F KAČN PROTOKOL
POZNÁMKA P ocedu y e nu né p ovádě p poko ové
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Substrati
energetici
Destrosio
ASSICURAZIONE DI QUALITÀ
Le soluzioni di Vit Kit-Freeze sono filtrate su membrana e trattate con tecnica
asettica secondo procedure di produzione validate.
Ciascun lotto di Vit Kit-Freeze è sottoposto ai seguenti test::
Endotossine con metodologia con lisato di amebociti del Limulus (LAL)
(≤ 0,6 EU/ml)
Mouse Embryo Assay (monocellulare) (blastocisti espansa ≥ 80%)
Sterilità secondo l’attuale USP Sterility Test <71> (esito positivo)
Tutti i risultati sono riportati su un Certificato di analisi specifico per il lotto,
disponibile su richiesta.
MATERIALI NECESSARI MA NON INCLUSI
• Irvine Scientific CryoTip (cod. cat. 40709) o HSV Straw (cod. cat. 2524625251) o Cryolock™ (cod. cat. CL-R-CT-B, CL-R-CT-G, CL-R-CT-C,
• Irvine Scientific Connector (cod. cat. 40736) o un altro adattatore
• Piastre di Petri sterili (50 X 9 mm, Falcon 351006 o equivalenti)
• Provette criogeniche (4,5 ml) o goblet e CryoCane
• Terreno di coltura HTF - HEPES modificato (cod. cat. 90126) con
integrazione proteica
• Ialuronidasi (cod. cat. 90101)
• Guanti monouso
• Siringa Hamilton GASTIGHT® (50 µl, cod. cat. 80901) o un altro strumento
di aspirazione
• Pipette di trasferimento (pipette in vetro o puntali per micropipetta con
diametro interno del puntale ~200 µm)
• Pinzette o pinza
• Sigillatrice termica a impulsi
• Sigillatrice SYMS per HSV Straw
• Cronometro o timer
• Serbatoio con azoto liquido (contenitore dewar o in polistirene espanso
con tappo, volume 1-2 l)
• Azoto liquido (volume sufficiente a ottenere una profondità di 10 cm nel
serbatoio)
ISTRUZIONI PER L’USO
Quantità richieste dei componenti di Vit Kit-Freeze (per applicazione):
• Soluzione di equilibratura (ES):
60 µL for Oocyte Vitrification Protocol
oppure
50 µl per il protocollo di vitrificazione di embrioni
• Soluzione di vitrificazione (VS):
50 µl per il protocollo di vitrificazione
• 1 CryoTip o HSV Straw o Cyrolock (conserva fino a 2 campioni)
• 1 Connettore
PROTOCOLLO DI VITRIFICAZIONE:
NOTA: le procedure devono essere eseguite a temperatura
ambiente (20-27 °C). NON utilizzare un tavolino riscaldante
per microscopio per le procedure seguenti. ATTENZIONE:
ridurre al minimo l’esposizione del campione alla luce
durante l’equilibratura nelle soluzioni ES e VS.
1. Portare a temperatura ambiente (20-27 °C) la quantità di ES e VS necessaria.
NOTA: evitare di portare ripetutamente a temperatura ambiente interi flaconi
di ES e VS se si deve utilizzare ogni volta solo una parte della soluzione.
È preferibile aliquotare la quantità da utilizzare e riportare i flaconi a
2-8 °C subito dopo la suddivisione. Per il protocollo di vitrificazione di ovociti
è necessario anche terreno HTF (HEPES) modificato proteico.
2. Riempire il serbatoio con azoto liquido (sufficiente a ottenere una profondità
di 10 cm o a sommergere completamente la provetta criogenica sul
CryoCane) e porlo vicino al microscopio. Fissare una provetta criogenica o
un goblet (senza tappo) al clamp inferiore di un CryoCane e sommergerla
nell’azoto liquido in preparazione per la conservazione dei campioni vitrificati.
3. Determinare il numero di campioni da vitrificare.
4. Etichettare ciascuna piastra di Petri sterile (o coperchio) e ciascun dispositivo
di conservazione criogenica con le informazioni necessarie.
5. Capovolgere delicatamente ciascun flacone di ES e VS due volte per
miscelarne il contenuto prima dell’uso.
6. Preparare la piastra con delle gocce delle soluzioni per la procedura di
vitrificazione, come segue:
A. OOZYTEN-VITRIFIZIERUNGSPROTOKOLL (MII):
HINWEIS 1: Gewonnene Oozyten müssen mittels Hyaluronidase freigelegt
werden, um MII zu bestätigen.
HINWEIS 2: Das Embryo-Vitrifizierungsprotokoll finden Sie in Abschnitt B.
1. Mit aseptischer Technik 20-µl-Tropfen des Kulturmediums, Modified HTF HEPES mit Protein, und ES, wie in Abbildung 1 gezeigt, in unmittelbarer
Nähe auf einen umgekehrten Deckel einer sterilen Petrischale geben und
die Schale auf den Objekttisch platzieren:
• ein 20-µl-Tropfen Modified HTF (HEPES mit Protein)
• drei- 20 µl Tropfen (60 µl im Total) ES (ES1, ES2, ES3)
2. Nehmen Sie aus dem Brutschrank die Kulturschale, die MII Oozyten
beinhaltet. Prüfen Sie unter Mikroskop die Qualität der Proben. Wenn
möglich, wählen Sie nur die Oozyten (MII) von höchster
Qualität.
VORSICHT: Minimieren Sie Kontakt (der Muster) mit
Licht während der Äquilibrierung in den H-, ES- und VSTropfen.
3. Versetzen Sie mit minimalem Volumen an Nährboden die Oozyten (bis zu
2 jeweils) von der Petrischale (im Brutschrank) in den 20 µl Tropfen Modified
HTF – HEPES.
4. Mischen Sie den Tropfen von H mit ES1 (sehen Sie Fig. 1, Pfeil 1). Gebrauchen
Sie die Düse einer Transferpipette und ermöglichen Sie für 2 Minuten die
spontane Mischung der zwei Lösungen.
5. Dann den Tropfen ES2 (Pfeil 2) mit den zuvor kombinierten Tropfen kombinieren
und 2 Minuten stehen lassen.
6. Die Oozyte(n) mit minimaler Menge der Lösung des Tropfengemisches
auf den ES3-Tropfen übertragen und 6-10 Minuten warten. Hinweis:
Äquilibrierung des (der) Oozyten in ES3 ist fertig, wenn die
Dicke der Zona Pellucida und die Dicke des perivitellinen
Raums gleich sind. Der (die) Oozyt(en) wird (werden)
sich innerhalb 3 Minuten am unteren Ende des Tropfens
sammeln.
7. Während der Äquilibrierungszeit in ES3:
Geben Sie aseptisch einen (1) 50-µl-Tropfen VS 2 Minuten
vorher ab, um die Equilibrierung vorzunehmen und bereiten
Sie den CryoTip (Abb. 3), HSV Straw (Abb. 4) oder Cryolock
(Abb. 5) auf die Beladung vor:
HINWEIS: Untersuchen Sie Vitrifizierungsgerät und -Spitze vor Beginn
des Verfahrens sorgfältig
• CryoTip: Mit Hamilton-Spritze oder geeignetem Aspirationswerkzeug
verbinden und gute Abdichtung mittels Verbinder oder Adapter
sicherstellen.
• HSV Straw: Das längere Ende des blauen Kunststoff-Einführgeräts
mit dem farbigen Ende der Griffstange verbinden.
• Cryolock: Die Kappe abnehmen.
8. Die Folgenden Schritte (9-13) sollen in 80-110 Sekunden
ausgeführt werden. VORSICHT: Kontakt (der Proben) mit
VS soll beschränkt sein, um Zytotoxizität zu verhindern.
Muster neigen dazu, in VS zu schweben; deshalb sollten
Sie die Bildschärfe so einstellen, dass Sie durchgehende
Visualisierung während des Kontakts halten können.
Behalten Sie auch die Düse der Transferpipette nahe bei,
Wenn das Paket geöffnet ist, empfehlen wir als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme,
dass jedes CryoTip sorgfältig überprüft wird. CryoTips sollte mit einem Mikroskop
(lineare Wiedergabe 40x) auf mögliche Beschädigung überprüft wie z. B. beim
Transport entstandene Bruchstellen oder Risse.
Antibiotici
Gentamicina solfato
Altro
Adenina solfato
2-deossi-D-ribosio
Ribosio
Guanina
Uracile
Xantina
Timina
Ipoxantina
Adenosina
Weil das Produkt menschliches Ursprungsmaterial enthält,
können während der Aufbewahrung Partikel entstehen.
Diese Art von Partikeln haben vermutlich keine Auswirkung
auf die Leistung des Produkts.
Die Forschungseinrichtung dieses Produkts ist für die Einhaltung der
Rückverfolgbarkeit des Produkts verantwortlich und muss gegebenenfalls
die nationalen Bestimmungen in Bezug auf die Rückverfolgbarkeit erfüllen.
Vitamine
e minerali
Calciferolo
Acido ascorbico
Acido
P-aminobenzoico
Acido nicotinico
Ammide dell’acido
nicotinico
Acido pantotenico
Riboflavina
Tiamina
D-biotina
Piridossina
Bisolfito di sodio
Alfa-tocoferolo
Antiossidante
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La soluzione di vitrificazione-VS è una soluzione tamponata con
HEPES di Medium-199 contenente gentamicina solfato (35 µg/ml), 15% (v/v)
ciascuno di DMSO e glicole etilenico, 20% (v/v) di Dextran Serum Supplement
e 0,5 M di saccarosio.
DL-acido aspartico
DL-acido
glutammico
DL-isoleucina
DL-leucina
DL-metionina
DL-fenilalanina
DL-serina
DL-treonina
DL-triptofano
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L-idrossiprolina
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La soluzione di equilibratura-ES è una soluzione tamponata con
HEPES di Medium-199 contenente gentamicina solfato (35 µg/ml), 7,5% (v/v)
ciascuno di DMSO e glicole etilenico e 20% (v/v) di Dextran Serum Supplement.
Sali e ioni
Cloruro di sodio
Fosfato di sodio
Cloruro di potassio
Solfato di magnesio
Acetato di sodio
Fosfato di sodio
Cloruro di calcio
Cloruro di colina
Nitrato ferrico
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DESCRIZIONE DEL PRODOTTO
VERGLASUNGSPROTOKOLL:
HINWEIS: Verfahren sollen bei Raumtemperatur (20-27°C)
ausgeführt werden. Gebrauchen Sie KEINEN erhitzten
Objektträger für die folgenden Verfahren. VORSICHT:
Minimieren Sie Kontakt (der Proben) mit Licht während der
Äquilibrierung in ES- und VS-Lösungen.
1. Die zu verwendende Menge Äquilibrierungslösung (ES) oder
Vitrifizierungslösung (VS) auf Raumtemperatur bringen (20-27 °C).
HINWEIS: Es sollte vermieden werden, die gesamten Röhrchen mit ES
und VS wiederholt auf Raumtemperatur zu bringen, wenn jedes Mal nur
ein Teil der Lösung benötigt wird. Es ist besser, die zu verwendende Menge
anteilsmäßig aufzuteilen und die Röhrchen unmittelbar danach wieder
auf 2-8 °C zu kühlen. Modified HTF (HEPES) mit Protein ist auch fürs
Verglasungsprotokoll für Oozyten nötig.
2. Füllen Sie den Behälter für flüssigen Stickstoff mit flüssigem Stickstoff (mit
ausreichendem Volumen, eine Tiefe von 4 Zoll zu erreichen, oder dass ein
Kryorohr auf einem Cryocane untergetaucht werden kann). Stellen Sie den
Behälter zum Mikroskop. Schließen Sie ein Kryorohr oder einen Becher
(entdeckelt) auf die untere Klammer eines Cryocanes an und tauchen Sie beide
in den flüssigen Stickstoff, in Vorbereitung für das Lager der verglasten Muster.
3. Bestimmen Sie die Zahl der Proben, die zu verglasen sind.
4. Jede sterile Petrischale (oder Deckel) und jede Kryovorrichtung für die
Aufbewahrung mit den erforderlichen Informationen beschriften.
5. Drehen Sie behutsam jedes Fläschchen von ES und VS zweimal um, um den
Inhalt vor dem Gebrauch zu mischen.
6. Bereiten Sie die Schale mit Tröpfchen von den Lösungen fürs Verglasungsprotokoll
vor, wie hier angewiesen:
VORSICHTSMASSNAHMEN UND WARNUNGEN
Dieses Produkt ist für die Anwendung durch Personal vorgesehen, das in
Verfahren der assistierten Reproduktion geschult wurde. Diese Verfahren
beinhalten zum Beispiel die vorgesehene Verwendung für dieses Produkt.
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u sp ung som om de vo e sm ö ande med användn ng
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Tas a ecas a u ne nām em va aun em v us em un c em
pa ogēn em Nav aps p nā u z ņo umu pa v usu pā nešanu
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Tomē nev ena pā baudes me ode nesn ed p n gu ga an u
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EU VOORZICHTIG: Alleen voor professioneel gebruik.
US VOORZICHTIG: Volgens de Amerikaanse federale wetgeving mag dit
product alleen door of op voorschrift van een arts worden verkocht.
BEDOELD GEBRUIK
Vit Kit ® - Freeze is bedoeld voor gebruik bij geassisteerde voortplantingsprocedures
voor de vitrificatie en opslag van menselijke oöcyten (MII), pronucleaire (PN)
zygoten tot en met dag 3-embryo’s in de splitsingsfase en embryo’s in de
blastocystfase. Deze kit is ontworpen voor gebruik met de CryoTip® (catalogusnr.
40709) en de Vitrificatie-ontdooikit (Vit Kit® - Thaw) van Irvine Scientific voor
optimale terugwinning van monsters.
PRODUCTBESCHRIJVING
Equilibration Solution-ES is een HEPES gebufferde oplossing
van Medium-199 die gentamicinesulfaat (35 µg/ml), 7,5% (v/v) van elk
dimethylsulfoxide (DMSO) en ethyleenglycol en 20% (v/v) Dextran Serum
Supplement* bevat.
Vitrificatieoplossing-VS is een HEPES gebufferde oplossing
van Medium-199 die gentamicinesulfaat (35 µg/ml), 15% (v/v) van elk
dimethylsulfoxide (DMSO) en ethyleenglycol, 20% (v/v) Dextran Serum
Supplement* en 0,5 M sucrose bevat.
Deze twee oplossingen moeten achtereenvolgens worden gebruikt volgens
het stapsgewijze microdruppelvitrificatieprotocol.
SAMENSTELLING
Zouten & Ionen
Natriumchloride
Natriumfosfaat
Kaliumchloride
Magnesiumsulfaat
Natriumacetaat
Calciumchloride
IJzernitraat
Cholinechloride
Buffers
Natriumbicarbonaat
HEPES
pH-indicator
Fenol rood
Aminozuren
L-Arginine
Glycine
L-Histidine
L-Lysine
L-Proline
L-Tyrosine
DL-Alanine
DL-Asparaginezuur
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DL-Isoleucine
DL-Leucine
DL-Methionine
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es a gse suu use m s nä ab e asakaa us um ne on
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ETTEVAATUST P oov de asakaa us am se ES a VS
kades m n mee ge nende kokkupuude va gusega
4 Se e asakaa us am se a a ES s
seadke üks 50 µ VS ahuse ka oon se 8 nä e a use
a va m s age C yoT p HSV kõ s võ Cy o ock e e
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sāko nē o e umu kas no āda ka s ab zāc a pabe g a
BR D NĀJUMS samaz n e dz m n mumam pa augu
pak aušanu ga smas eda b ba s ab zāc as a kā ES
un VS p enos
La kā kamē no ek nos ab zēšanās ES ve c e ā āk
no ād ās da b bas
ep d e 50 µ p ena AŠ kā pa ād s 8 a ē ā un
saga avo e ev e ošana C yoT p HSV S aw va
Cy o ock
zp d e ep ekš ap aks ā p o oko a A sada a OLŠŪNU
M a kausēšanas p o oko s 9 –12 da b bu eg emdē o
AŠ ev e o o C yoT p HSV S aw va C yo ock kā a
eg emdē o LN2 un nov e o o g e m ņa g abāšanā
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20–27 C ÄRGE kasu age ä gm s e p o seduu de aoks
soo enda ud m k oskoob eseme auda ETTEVAATUST
Lahus e ES a VS asakaa us am se a a m n mee ge p oov
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success v å e gå s n u sp ung ga s o ek v ke ange
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4 Unde denna ekv b e ngspe od ES
p ace a en 50 µL d oppe VS ösn ng som v sas g 8 och
ö be ed C yoT p HSV S aw ö Cy o ock ö be äggn ng
Fö p ocessen som besk v s ovan avsn A Oocy e M
v fie ngs p o oko
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doppad LN2 och ång ds ö va ng
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6–10 m nū es P ez me o šūnas u s ab zāc a
ES3 pabe g a kad šūnas apva ka zona pe uc da un kodo u
e ve ošā e pa pe v e ne space v enādas o šūna as
nos ās es p ena apakšā 3 m nūšu a kā
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a makopean spes kaa o a nouda aen vak n une a
mene e m ä koskev a o eennäy e y ä v us a un o a e o e
apo o u On e ä n suos e avaa e ä oka ke a kun v ne
Sc en fic Rep oduc ve Med a uo e den v e ye a usa ne a
anne aan po aa e uo een n m a e änume o me k ään
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EU Tavanoma s a ke no a o a es e ään n ek o a o ka
oh uva hm sen ve es ä a p asmas a va m s e u en
ääkeva m s e den käy ös ä ova mm uovu a en
va n a e y en n ek on me kk en seu on a yks ä s s ä
uovu e u s a ve
a p asmae s ä a ehokka den
va m s usva he den nouda am nen v us en nak vo m seks
po s am seks Täs ä huo ma a kun anne aan hm sen
ve es ä a p asmas a va m s e u a ääkeva m s e a
aud na heu a en s ym sen mahdo suu a e vo da äys n
su kea po s Tämä koskee myös un ema om a a h a a n
öyde y ä v uks a a mu a pa ogeene a
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p käkes o s a va ku uks a oosy e h n a a k o h n e unne a
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BR D NĀJUMS pa augus d ks pak au ka e obežo a
VS eda b ba a nep e au u c o oks c ā es ašanos
Pa aug em eksme s dē VS ādē p e āgo e m k oskopa
okusu a sag abā u pas āv gu v zua zāc u aps ādes a kā
kā a u e p pe es ga u c eš b akus a nod oš nā u ā u
pā nešanu s a p VS p en em Ska 6 a ē u
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P ep d e un a ka s umu he me ē e C yoT p kā no ād s
u pmāk Ska 7a a ē u
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m k oskopa p ekšme s k ņu BR D NĀJUMS samaz n e
dz m n mumam pa augu pak aušanu ga smas eda b ba
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kokoon me k ks s ä e ä asapa no us on va m s
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va o e sen asapa no uksen a kana ES a VS po ssa
Tämän ES ssä asapa no am sen a kana
va m s e e yks 50 u n ppa VS uos a kuvassa 8
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va o o m n on yhdy ävä sen va m s am seks e ä po as
e o e he k s yny ä e an b oo e
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mu s n o a vo daan sä y ää yh eys po aan a uo een
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Yhdysva a Hya u on daas uos s sä ää hm sen see um n
a bum n a HSA Tämän uo een va m s uksessa käy e y
hm s ähdema e aa on es a u FDA n myyn uvan saane a
a v kesa o a a sen on hava u o evan eago ma on hepa
C HCV vas a a ne den a hm sen mmuun ka ov us H V
vas a a ne den suh een M kään es mene e mä e ku enkaan
anna äyde s ä akuu a s ä e ä hm s äh e s ä pe ä s n
o eva uo ee e vä o e n ek v s ä Käs e e ka kkea
hm sma e aa a n ek ovaa a sena y e s ä va o o m a
nouda aen Lähdema e aa en uovu a a on myös seu o u
CJD n suh een
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P aegused uu ngua uanded v h avad e v fika s oon
p kaa a sed mõ ud oo süü de e a emb üo e e e o e eada
Ä ge kasu age üh eg pude
kah us unud
m e se
ne pakend on
EL n mve es võ p asmas va m s a ud av m e
manus am sega kaasneva n ek s oon ohu enne am seks
kasu a akse s anda dmee me ena mh doono e
se ek ee m s nd v duaa se doono ve e a kokkusega ud
p asma sk n m s spe s
s e n ek s oon ma ke e
suh es n ng se s e oo m sp o sess de akendam s m s
õhusa nak vee ks d võ häv aks d v use d Hoo ma a
se es e saa n mve es võ p asmas va m s a ud av m e
kasu am se ä e ku vä s ada n ek s oosse e agens e
ü ekandm se võ ma us See keh b ka sen undma a võ
uu e v us e a pa ogeen de koh a Puuduvad õend d v use
ü ekande koh a Eu oopa a makopöa spe s fika s oon de e
vas ava oo m sp o sess ga saadud a bum n vahenduse
On ung va soov a av e ga ko d ku v ne Sc en fic
Rep oduc ve Med a P oduc s sa a ku uu söö me d
pa s end e manus a akse eg s ee akse oo e n m n ng
pa numbe e sä ada ühendus ü pa s end a kasu a ud
oo e pa
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USA Hüa u on daas ahus s sa dab n mese see um
a bum n HSA Se e p epa aad oo m se kasu a ud
n mpä o uga äh ema e a on ka se a ud USA o du a
av m ame FDA
sen s ud ka sekomp ek dega n ng on
e ud e need on C hepa d HCV an kehade a n mese
mmuunpuudu kkuse v use H V an kehade vas u
m e eak vsed S sk e paku üksk ka se am smee od
n mpä o uga äh ema e a s oode ud p epa aa de
m enakkus kkuse koh a ä e kku k nn us Käs sege
kõ k n mpä o uga äh ema e a e nakkus edas ada võ va
ma e a na akendades un ve saa se d e evaa usab nõus d
Läh ema e a doono e d on C eu z e d Jakob õve CJD
suh es sk n ud
VASTUNÄ DUSTUS
Toode s sa dab gen amü s nsu aa Tu eb akendada
sob va d e evaa usab nõus d veendumaks e pa s en e
o eks se e an b oo kum vas u ü und k
MAGYAR
EU FIGYELMEZTETÉS: Kizárólag foglalkozásszerû felhasználásra.
VIGYÁZAT: Az Egyesült Államok Szövetségi törvényének értelmében ez az
eszköz kizárólag orvos által vagy rendeletére forgalmazható.
RENDELTETÉS
A Vit Kit® - Freeze berendezést asszisztált reproduktiv eljárásokban a humán
oocyták (MII), pronukleáris (PN) zigóták 3 napos osztódási állapotú embrióinak
és blasztociszta állapotú embriók vitrifikációjára és tárolására. Ezt a készletet
az Irvine Scientific CryoTip® (katalógusszám: 40709) és vitrifikációs olvasztási
készletével (Vit Kit® - Thaw) való használatra tervezték a minták optimális
visszanyerése érdekében.
TERMÉKLEÍRÁS
Az Equilibration Solution-ES a Medium-199-nek egy HEPES-el pufferolt
oldata, amely tartalmaz 35µg/ml gentamicin-szulfátot, 7,5% (v/v) –t mind
dimetil-szulfoxidból (DMSO) mind pedig etilén-glikolból és 20% (v/v) Dextran
Serum Supplementet.
A vitrifikációs oldat-VS a Medium 199 egy HEPES-el pufferolt
oldata, amely tartalmaz: 35 μg/ml gentamicin-szulfátot, 15% (v/v)-t mind
dimetilszulfoxidból (DMSO) mind pedig etilén-glikolból, 20% (v/v)-t Dextran Serum
(v/v)-t Dextran Serum Supplement-ből és 0,5 M szacharózt.
Puffer
Nátrium-Bikarbonát
HEPES
pH indikátor
Fenol vörös
Aminosavak
L-Arginin
Glicin
L-Hisztidin
L-Lizin
L-Prolin
L-Tirozin
DL-Alanin
DL-Aszparaginsav
DL-Glutaminsav
DL-Izoleucin
DL-Leucin
DL-Metionin
DL-Fenilalanin
Antioxidáns
Glutation, Redukált
Antibiotikum
Gentamicin-Szulfát
Egyéb
Guanin
Hipoxantin
Timin
Uracil
Xantin
Adenozin
Adenin-szulfát
2 dezoxi-D-ribóz
Ribóz
Energia szubsztrátumok
Dextróz
Inozitol
Vitaminok és
Ásványi Anyagok
Aszkorbinsav
P-Amino-Benzoésav
Kalciferol
Folsav
Nikotinsav
Nikotinsav-amid
Eiwit
Albumine (humaan)
Vitaminen en
mineralen
Ascorbinezuur
P-aminobenzoëzuur
Calciferol
Nicotinezuur
Nicotinezuuramide
Pantotheenzuur
Riboflavine
Cryobeschermmiddel
Sucrose
Dextraan
Ethyleenglucol
Dimethylsulfoxide
VITRIFICATIEPROTOCOL
OPMERKING: de procedures moeten worden uitgevoerd
op kamertemperatuur (20-27 °C). Gebruik de verwarmde
microscooptrap NIET voor de volgende procedures.
VOORZICHTIG: beperk de blootstelling van monsters aan licht
tijdens equilibratie in ES- en VS-oplossingen tot een minimum.
1. Breng de benodigde hoeveelheid equilibratieoplossing (ES) en
vitrificatieoplossing (VS) op kamertemperatuur (20-27 °C). OPMERKING:
Laat niet de gehele ampullen met ES en VS steeds op kamertemperatuur
komen als u elke keer maar een deel van de oplossing nodig heeft. Het is
beter om de benodigde hoeveelheid te doseren en de ampullen meteen
na dosering opnieuw bij 2-8 °C te bewaren. Gemodificeerd HTF (HEPES)
met eiwit is ook vereist voor het oöcytvitrificatieprotocol.
2. Vul de vloeibare-stikstoftank met vloeibare stikstof (voldoende voor een
diepte van 10 cm (4 inch) of om het cryobuisje aan de cryohouder volledig
onder te dompelen) en plaats deze dichtbij de microscoop. Bevestig een
cryobuisje of beker (zonder dop) aan de onderste klem van een cryohouder
en dompel deze onder in de vloeibare stikstof ter voorbereiding op de opslag
van de gevitrificeerde monsters.
3. Bepaal het aantal te vitrificeren monsters.
4. Plak een sticker met de noodzakelijke informatie op elke steriele petrischaal
(of deksel) en het Cryo-opslagmedium.
5. Keer elke ampul ES en VS twee keer om zodat de inhoud vóór het gebruik
wordt gemengd.
6. Prepareer de schaal als volgt met druppeltjes oplossing voor de
vitrificatieprocedure:
A. OÖCYT (MII) vitrificatieprotocol:
OPMERKING 1: De teruggewonnen oöcyten moeten worden blootgelegd met
Hyaluronidase om te bevestigen dat ze MII zijn.
OPMERKING 2: Raadpleeg Deel B voor het embryovitrificatieprotocol.
1. Pipetteer op aseptische wijze 20 µl druppel van het kweekmedium,
Gemodificeerd HTF - HEPES met eiwit, en ES dicht bij elkaar op een
omgekeerd deksel van een steriele petrischaal zoals afgebeeld in figuur 1,
en plaats de schaal onder de microscoop:
• één 20 µl druppel Gemodificeerd HTF (HEPES met eiwit)
• drie 20 µl druppels (60 µl in totaal) ES (ES1, ES2, ES3)
2. Haal de petrischaal met de MII oöcyten uit de incubator en controleer
de kwaliteit van de monsters onder de microscoop. Kies, indien
mogelijk, uitsluitend het (de) MII-fase-oöcyt(en) van de
hoogste kwaliteit.
VOORZICHTIG: beperk de blootstelling van het (de)
monster(s) aan licht tijdens equilibratie in de H, ES en
VS druppels tot een minimum.
3. Breng de oöcyt (maximaal twee tegelijkertijd) met een minimaal volume
medium over van de petrischaal (in de incubator) naar de 20 µl druppel H
gedurende één minuut.
4. Meng de druppel H met ES1 (zie Fig. 1, pijl 1) met de punt van het transferpipet
en laat de twee oplossingen spontaan mengen gedurende 2 minuten.
5. Meng dan de druppel ES2 (pijltje 2) met de eerder gemengde druppels
en laat 2 minuten staan.
6. Breng de oöcyt(en) met minimaal oplossingsvolume over van de
gemengde druppel naar de ES3-druppel gedurende 6-10 minuten.
OPMERKING: de equilibratie van de oöcyt(en) in ES3 is
voltooid als de dikte van de zona pellucida en perivitelline
ruimte met elkaar overeenkomt. De oöcyt(en) zal (zullen)
zich binnen 3 minuten ophopen in het onderste gedeelte
van de druppel.
7. Tijdens de equilibratietijd in ES3:
Pipetteer op aseptische wijze een (1) 50 μl druppel VS
2 minuten vóór volledige equilibratie en prepareer de
CryoTip (Fig. 3), het HSV-rietje (Fig. 4) of de Cryolock
(Fig. 5) voor het vullen:
OPMERKING: Onderzoek zorgvuldig het vitrificatiehulpmiddel en de punt
alvorens de procedure te starten
• CryoTip: : verbind deze met de Hamilton-spuit of een ander geschikt
zuigapparaatje met behulp van een connector of een adapter om een
goede afdichting te garanderen. OPMERKING: Laat het metalen
afdekhulsje over de fijne geblazen punt zitten om hem te beschermen
tot de monsters erin geplaatst kunnen worden.
• HSV-rietje: verbind het langste uiteinde van de blauwe plastic
inbrenger met het gekleurde uiteinde van het geleidingsstaafje.
• Cryolock: maak de dop los.
8. De volgende stappen (9-13) dienen binnen 80-110
seconden te worden uitgevoerd.
VOORZICHTIG: blootstelling van monsters aan VS dient
te worden beperkt om cytotoxiciteit te voorkomen. Het
(de) monster(s) hebben de neiging om te drijven in VS;
pas de focus van de microscoop dus aan voor continue
Volg het protocol zoals hierboven beschreven (Hoofdstuk
A - Oöcyt [MII] vitrificatieprotocol) van stap 9 t/m 12 voor
blootstelling aan VS-oplossingen, laden van CryoTip, HSVrietje of Crylock, onderdompelen in vloeibare stikstof (LN2)
en langdurige opslag.
Voor aanvullende informatie over het gebruik van deze producten, dient elk
laboratorium zijn eigen laboratoriumprocedures en -protocollen te raadplegen
die speciaal zijn ontwikkeld en geoptimaliseerd voor uw individueel medisch
programma.
BEWAARINSTRUCTIES EN STABILITEIT
Bewaar de ongeopende ampullen gekoeld bij 2 °C tot 8 °C. Als Vitrificatieinvrieskit-oplossingen zoals voorgeschreven worden bewaard, zijn deze stabiel
tot aan de uiterste gebruiksdatum die op de sticker van de ampul is vermeld.
Gebruik de media niet langer dan acht (8) weken nadat de verpakking is
geopend.
Omdat menselijk bronmateriaal in het product aanwezig is, kunnen zich tijdens
de opslag enkele vaste deeltjes ontwikkelen. Van dit soort vaste deeltjes is niet
bekend dat ze gevolgen hebben voor de prestaties van het product.
VOORZORGSMAATREGELEN EN WAARSCHUWINGEN
Dit hulpmiddel is bedoeld voor personeel dat opgeleid is in geassisteerde
voortplantingsprocedures. Tot deze procedures behoort de toepassing waarvoor
dit hulpmiddel is bedoeld.
De instelling waar dit hulpmiddel wordt gebruikt, is verantwoordelijk voor het
behoud van de traceerbaarheid van het product en moet, waar van toepassing,
voldoen aan alle nationale voorschriften met betrekking tot traceerbaarheid.
Als extra voorzorgsmaatregel tijdens de preparatieprocedure raden wij aan elke
Cryotip zorgvuldig te onderzoeken nadat deze uit de verpakking is gehaald.
Vóór het gebruik moeten CryoTips met een geschikte vergroting (40x) worden
onderzocht op mogelijke beschadiging (zoals gebroken of gescheurde punt)
tijdens het transport.
Gebruik geen ampullen met oplossing die tekenen van beschadiging, lekkage,
vaste deeltjes, troebelheid vertoont of van kleur is veranderd. Voer het product
af in overeenstemming met de geldende voorschriften.
Gebruik aseptische methoden om besmettingsproblemen te vermijden.
De onderzoeksliteratuur geeft momenteel aan dat de
langetermijneffecten van vitrificatie voor oöcyten en
embryo’s nog steeds onbekend zijn.
Gebruik geen flessen waarvan de steriele verpakking is
aangetast.
EU: Tot de standaardmaatregelen ter voorkoming van
infecties wegens het gebruik van geneesmiddelen die
bereid zijn uit menselijk bloed of plasma behoren selectie
van donors, screening van individuele bloeddonaties en
plasmapools op specifieke infectiemarkers en toepassing
van effectieve fabricagestappen voor de deactivering/
verwijdering van virussen. Desondanks kan, bij toediening
van geneesmiddelen die zijn bereid uit menselijk bloed of
plasma, de mogelijke overdracht van besmettelijke agentia
niet geheel worden uitgesloten. Dit geldt ook voor onbekende
of toekomstige virussen en andere pathogenen. Er zijn geen
meldingen ontvangen van bewezen virusoverdrachten bij
albumine dat met behulp van gevestigde processen volgens
de specificaties van Europese farmacopee is gefabriceerd.
Wij raden u dringend aan om, telkens als kweekmedium
van Irvine Scientific Reproductive Media Products wordt
toegediend aan een patiënt, de naam en het partijnummer
van het product te documenteren om de relatie tussen de
patiënt en de productpartij te behouden.
VS: Dit product bevat humaan serumalbumine (HSA). Het
humane bronmateriaal dat wordt gebruikt bij de vervaardiging
van dit product is getest met door de Amerikaanse
Inspectiedienst voor Voedings- en Geneesmiddelen (FDA)
goedgekeurde kits. Daaruit is gebleken dat het niet reageert
op de antistoffen voor Hepatitis C (HCV) en antistoffen voor
het menselijk immuundeficiëntievirus (HIV). Geen enkele
testmethode biedt echter volledige zekerheid dat producten
afkomstig van menselijke bronnen niet-besmettelijk zijn. Ga
met al het menselijk bronmateriaal om alsof het infecties
kan overdragen en neem universele voorzorgsmaatregelen.
Donors van het bronmateriaal zijn ook gescreend op de
ziekte van Creutzfeldt-Jakob (CJD).
CONTRA-INDICATIE
Dit product bevat gentamicinesulfaat. Neem passende
voorzorgsmaatregelen om ervoor te zorgen dat de patiënt
niet gevoelig is voor dit antibioticum.
HASZNÁLATI UTASITÁS
A Vit Kit-Freeze fagyasztóhoz szükséges alkotók (alkalmazásonként):
60 µl az oocyta vitrifikálási protokollhoz
Vagy
50 µl az embrió vitrifikálási protokollhoz
• Vitrifikációs oldat (VS):
50 µl a vitrifikációs protokollhoz
• 1 CryoTip, HSV pipetta vagy Cyrolock (legfeljebb 2 minta tárolásához)
• 1 összekötőcső
A
VITRIFIKÁCIÓS PROTOKOLL
MEGJEGYZÉS: Az eljárásokat szobahőmérsékleten (20-27C°)
kell végrehajtani. NE használjon melegített mikroszkóp
állványt a következő eljárásoknál. VIGYÁZAT: Minimalizálja a
minta fénynek való kitettségét az ES és VS oldatokkal történő
ekvilibráltatás alatt.
1. A vitrifikált minták felengedése előtt hozza a felhasználni kívánt egyensúlyi
oldat (ES) és vitrifikációs oldat (VS) mennyiségét szobahőmérsékletre
(20-27 °C). MEGJEGYZÉS: Kerülje a teljes üveg ES és VS ismételt
szobahőmérsékletre hozását, ha egyszerre csak az oldat egy részére van
szükség. Célszerűbb a felhasználni kívánt mennyiséget kimérni, és az üveget
kimérés után rögtön visszatenni 2-8 °C-ra. Az oocyta vitrifikációs protokollhoz
a Modified HTF (HEPES) is szükséges, fehérjével.
2. Töltsön a cseppfolyós nitrogén tartályba folyékony nitrogént (elegendőt ahhoz,
hogy ~10 cm mélységet elérje, vagy hogy a kriocsőtartón lévő kriocső teljesen
alámerüljön) és helyezze a mikroszkóp közelébe.
Illessze a kriocsövet vagy krioampullát (nem bezárva) a kriocsőtartó alsó
szorítóbilincséhez és merítse a cseppfolyós nitrogénbe a vitrifikált minták
tárolásának előkészítésére.
3. Határozza meg a vitrifikálni kívánt minták számát.
4. Címkézzen fel minden steril Petri csészét (vagy a fedőt) és a Cryo
tárolóeszközt a szükséges információkkal.
5. Használat előtt óvatosan fordítson fel minden ES és VS fiolát kétszer, hogy
a tartalmát összekeverje.
6. Készítse elő az edényt az oldatcseppecskékkel a vitrifikálási folyamatra a
következőképpen:
A. OOCYTA (MII) vitrifikálási protokoll:
MEGJEGYZÉS:A visszanyert oocytákat hialuronidázzal kell lefejteni az MII
megerősítése érdekében.
MEGJEGYZÉS:Az embrió vitrifikálási protokolljával kapcsolatban olvassa el a
B szakaszt.
1. Az aszepszis szabályainak betartása mellett mérjen ki 20 µl-t a tápközegből,
a módosított HTF - fehérjével kiegészített HEPES oldatból és az ES-ből
egymáshoz közel egy fordított petricsésze fedélre az 1. ábrán látható
módon, majd helyezze a csészét a mikroszkópállványra:
• egy- 20 µl csepp módosított HTF (HEPES fehérjével)
• három 20 µl-s csepp (összesen 60 µl) ES-ből (ES1, ES2, ES3)
2. Vegye ki az inkubátorból az MII oocytákat tartalmazó tenyésztőedényt, és
ellenőrizze mikroszkóp alatt a minták minőségét. Ahol lehet, válassza
csak a legjobb minőségű MII állapotú oocytá(ka)t.
VIGYÁZAT: Minimalizálja a minta/minták fénynek
való kitettségét a H, ES és VS cseppekben történő
ekvilibráltatás alatt.
3. Vigye át az oocytákat (egyszerre maximum kettőt) minimális médiumtérfogattal
a tenyésztőedényből (az inkubátorban) a H- 20µl-s cseppjébe egy percre.
4. Olvassza be H cseppjét az ES1-be, (lásd a 1. ábra, 1. nyíl) a transzfer pipetta
hegyével, és engedje, hogy a két oldat spontán keveredjen 2 percig.
5. Ezt követően egyesítse az ES2 (2. nyíl) oldatot a korábban egyesített
cseppekkel, majd hagyja állni 2 percig.
6. Vigye át az oocytá(ka)t minimális oldattérfogattal az egyesített cseppből az ES3
cseppbe 6-10 percre. Megjegyzés: Az oocytának/oocytáknak
az ekvilibrációja az ES3-ban akkor teljes, amikor a zona
pellucida vastagsága és a perivitelline tér egyenlő. Az
oocyta(k) 3 percen belül leülepednek a csepp aljára.
7. Ez alatt az ekvilibrációs idő alatt az ES3-ben:
Adagoljon aszeptikusan egy (1) 50 μl-es csepp VS-t 2 perccel
a teljes ekvilibráció előtt és készítse elő a CryoTip-et (3. Ábra)
a HSV pipettát (4. Ábra) vagy a Cryolock-ot (5. ábra) a töltésre:
MEGJEGYZÉS: Az eljárás megkezdése előtt óvatosan vizsgálja meg a
vitrifikációs eszközt és a hegyet.
• CryoTip: csatlakoztassa Hamilton-fecskendőre vagy a megfelelő
felszívó eszközre egy csatlakozó vagy adapter segítségével a szoros
zárás érdekében. MEGJEGYZÉS: Hagyja a fém takarómandzsettát a
finom végen annak védelme érdekében addig, amíg készen nem áll a
minták betöltésére.
• HSV pipetta: csatlakoztassa a kék műanyag behelyező eszköz
hosszabb végét a fogantyú színezett végére.
• Cryolock: vegye le a kupakot.
8. A következő lépéseket (9-14) 80-110 másodpercen belül kell
végrehajtani. VIGYÁZAT: A minta/minták általában úsznak a
VS-ben, ezért úgy állítsa be a mikroszkóp fókuszát, hogy a
kitettség alatt folyamatosan tartani tudja a láthatóságot, és
tartsa a közelben a transzfer pipetta hegyet, hogy biztosítani
tudja VS cseppek közt a gyors transzfereket. Tekintse meg
a 6. ábrát.
9. Miután az egyensúlyba hozatal az ES-ben befejeződött, szívjon fel valamennyi
ES-t a transzfer pipettába és vigye át a mintát/mintákat minimális térfogattal
ES cseppjéből a VS 30 másodpercre.
10. Töltse fel és tömítse hővel a CryoTip eszközt a következők
szerint (Tekintse meg a 7a ábrát):
• Húzza fel a fém takaróhüvelyt a CryoTip mentén, hogy szabaddá tegye
a vékony, törékeny csúcsvéget.
• A CryoTip-t és Hamilton-fecskendőt kezelve, a mikroszkóp alatt figyelve
óvatosan szívjon le egy kis térfogat VS-t a CryoTip-en lévő 1 számú jelig.
• Folytassa a megfigyelést a mikroszkóp alatt, és óvatosan szívja le a
mintát VS-el a CryoTip –en lévő 2. jelig.
• Most figyelje meg a CryoTip-t közvetlenül és szívjon le több VS-t a
3-számú jelig.
• A specimennek a 2. és 3. számú jelek között kell elhelyezkedni.
• Hegesztéssel zárja le (1. lezárás) a CryoTip-t az 1 számú jelnél (vagy
csak épp alatta) és csúsztassa vissza a takaróhüvelyt, hogy fedje és
védje a vékony, törékeny hegyet.
• Óvatosan vegye le a CryoTip eszközt a felszívó eszközről és az
adapterről, majd hővel tömítse (2. tömítés) a CryoTip vastag végét
a 4. jel felett.
• Merítse a befedett CryoTip-t közvetlenül folyékony nitrogénbe (hűtve
-12,000 C°/perc sebességgel) (Tekintse meg a 7b ábrát.)
Töltse fel és tömítse a HSV pipettát a következők szerint:
• Egy mikropipetta segítségével óvatosan tegye a mintá(ka)t a kapillárisrúd
vájatába 1 mm-re annak végétől. A mintá(ka)t tartalmazó cseppnek 0,5
µl-nél kevesebbnek kell lennie. Kapillárisrudanként legfeljebb 2 oocyta
vagy embryo lehet.
• Azonnal tegye a kapillárisrudat és a nyelet a pipettába és nyomja bele
addig, amíg a nyél négyszögletes része érintkezésbe nem kerül a pi
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OSTRZEŻENIE USA: Prawo federalne (Stanów Zjednoczonych) zezwala na sprzedaż
tego wyrobu tylko przez lub na polecenie lekarza.
WSKAZANIA DO UŻYCIA
Zestaw Vit Kit® – Freeze jest przeznaczony do użycia w procedurach wspomaganej
rozrodczości do witryfikacji i przechowywania ludzkich oocytów (MII), zygot (PN) do
zarodków w stadium bruzdkowania w 3 dobie oraz zarodków w stadium blastocysty.
Niniejszy zestaw jest przeznaczony do stosowania ze słomkami CryoTip® (nr kat.
40709) i zestawem Vitrification Thaw Kit (Vit Kit® – Thaw) firmy Irvine Scientific w
celu optymalnego odzyskiwania okazów.
OPIS PRODUKTU
Equilibration Solution (ES) to buforowany środkiem HEPES roztwór
pożywki Medium-199, zawierajacy siarczan gentymycyny (35 μg/ml), 7,5% (v/v)
dimetylosulfotlenku (DMSO), 7,5% (v/v) glikolu etylenowego i 20% (v/v) środka
Dextran Serum Supplement.
Vitrification Solution (VS) to buforowany środkiem HEPES roztwór
pożywki Medium-199, zawierający siarczan gentymycyny (35 μg/ml), 15% (v/v)
dimetylosulfotlenku (DMSO), 15% (v/v) glikolu etylowego, 20% (v/v) środka Dextran
Serum Supplement i 0,5 M sachorozy.
Te dwa roztwory są przeznaczone do użycia kolejno po sobie, zgodnie z etapami
protokołu witryfikacji mikrokropli.
Aminokwasy
L-arginina
Glicyna
L-histydyna
L-lizyna
L-prolina
L-tyrozyna
DL-alanina
DL-kwas
asparaginowy
DL-kwas glutaminowy
DL-izoleucyna
DL-leucyna
DL-metionina
ELLENJAVALLAT
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PROTOKÓŁ WITRYFIKACJI:
UWAGA: Procedury należy przeprowadzić w temperaturze
pokojowej (20–27ºC). NIE używać podgrzewanego
stolika mikroskopu w poniższych procedurach. UWAGA:
Zminimalizować działanie światła na okaz podczas ustalania
równowagi w roztworach ES i VS.
1. Ogrzać potrzebne ilości roztworu równoważącego (ES) i roztworu witryfikującego
(VS) do temperatury pokojowej (20–27°C). UWAGA: Należy unikać
wielokrotnego ogrzewania do temperatury pokojowej całych fiolek z roztworem
ES i VS, jeżeli za każdym razem potrzebna jest tylko część roztworu. Lepiej jest
odmierzyć wymaganą ilość i natychmiast po odmierzeniu umieścić fiolki ponownie
w temperaturze 2–8°C. Zmodyfikowana pożywka HTF (HEPES) z białkiem jest
również wymagana na potrzeby protokołu witryfikacji oocytu.
2. Wypełnić zbiornik na ciekły azot ciekłym azotem (wystarczająco, aby uzyskać
głębokość 4 cali lub całkowicie zanurzyć probówkę kriogeniczną na pręcie)
i umieścić blisko mikroskopu. Dołączyć probówkę kriogeniczną lub kubek
(niezamknięty) do dolnego zacisku prętu kriogenicznego i zanurzyć w ciekłym
azocie w celu przygotowania do przechowywania witryfikowanych próbek.
3. Określić liczbę okazów do zwitryfikowania.
4. Oznakować każdą sterylną szalk (lub wieczko) oraz urządzenie do
przechowywania Cryo i umieścić na etykiecie wszystkie niezbędne informacje.
5. Delikatnie odwrócić każdą fiolkę z roztworem ES i VS dwukrotnie, aby wymieszać
zawartość przed użyciem.
6. Przygotować szalkę z kroplami roztworów do procedury witryfikacji, jak następuje:
A. Protokół witryfikacji OOCYTÓW (MII):
UWAGA 1: Pobrane oocyty należy poddać denudacji z użyciem hialuronidazy, aby
potwierdzić, że są oocytami MII.
UWAGA 2: Informacje na temat witryfikacji zarodków zawiera część B.
1. W warunkach aseptycznych umieścić 20 µl kroplę pożywki hodowlanej,
zmodyfikowanego HTF – HEPES z białkiem, oraz roztworu ES w bliskiej od
siebie odległości na odwróconym wieczku sterylnej szalki Petriego, jak pokazano
na ryc. 1 i położyć szalkę na stoliku mikroskopu:
• jedna 20 µl kropla zmodyfikowanej pożywki HTF (HEPES z białkiem)
• trzy 20 µl krople (60 µl ogółem) roztworu ES (ES1, ES2, ES3)
2. Wyjąć z inkubatora naczynko na posiew zawierające oocyty MII i sprawdzić
jakość okazów pod mikroskopem.
Jeżeli jest to możliwe, należy wybrać tylko najlepszej jakości
oocyty MII.
UWAGA: Zminimalizować działanie światła na okazy podczas
ustalania równowagi w kroplach H, ES i VS.
3. Przenieść oocyty (maks. 2 na raz) z minimalną objętością pożywki z naczynka
na posiew (w inkubatorze) do 20 µl kropli H na jedną minutę.
4. Przy użyciu końcówki pipety transferowej połączyć kroplę H z ES1 (zob. ryc.
1, strzałka 1) i pozostawić te dwa roztwory do samoczynnego wymieszania na
2 minuty.
5. Następnie połączyć kroplę ES2 (strzałka 2) z uprzednio zmieszanymi kroplami
i pozostawić na 2 minuty.
6. Przenieść oocyty z minimalną objętością roztworu z kropli zawierającej
mieszaninę do kropli ES3 na 6–10 minut. Uwaga: Osiąganie stanu
równowagi oocytów jest zakończone, gdy grubość osłonki
przejrzystej i przestrzeni okołożółtkowej są jednakowe.
Oocyty osiądą na dnie kropli w ciągu 3 minut.
7. Podczas czasu osiągania równowagi w ES3:
Aseptycznie przenieść jedną (1) 50 μl kroplę roztworu VS
na 2 minuty przed zakończeniem procesu równoważenia
i przygotować słomkę CryoTip (ryc. 3), HSV (ryc. 4) lub
Cryolock (ryc. 5) do napełniania:
UWAGA: Dokładnie skontrolować wyrób do witryfikacji i końcówkę przed
rozpoczęciem procedury.
• Słomka CryoTip: podłączyć strzykawkę Hamiltona lub odpowiednie
narzędzie aspiracyjne, używając łącznika lub adaptera w celu zapewnienia
szczelnego połączenia. UWAGA: Nie zdejmować osłonki metalowej
z cienkiej, chowanej końcówki, aby chronić ją przed uszkodzeniem, aż do
momentu pobrania próbki.
• Słomka HSV: podłączyć dłuższy koniec niebieskiego plastikowego
urządzenia wprowadzającego do kolorowej końcówki pałeczki
manipulacyjnej.
• Cryolock: odłączyć nasadkę.
8. Poniższe etapy (9–13) należy wykonać w ciągu 80–110
sekund. UWAGA: Należy ograniczyć oddziaływanie roztworu
VS na okazy, aby zapobiec cytotoksyczności. Okazy mają
tendencję do unoszenia się na powierzchni roztworu VS,
dlatego też należy dopasować ostrość mikroskopu, aby
utrzymać ciągłą wizualizację podczas ekspozycji i umieścić
końcówkę pipety transferowej w pobliżu w celu zapewnienia
ŚRODKI OSTROŻNOŚCI I OSTRZEŻENIA
Ten wyrób jest przeznaczony do użycia przez personel przeszkolony do
przeprowadzania procedur wspomaganej rozrodczości. Te procedury obejmują
zastosowanie, do którego przeznaczony jest ten wyrób.
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Obecnie piśmiennictwo naukowe stwierdza, że długotrwały
wpływ witryfikacji na oocyty i zarodki jest nieznany.
Nie używać żadnej butelki, w której doszło do naruszenia
jałowego opakowania.
UE: Standardowe środki zapobiegania zakażeniom,
wynikającym z używania produktów medycznych
przygotowanych z ludzkiej krwi lub osocza, obejmują selekcję
dawców, badania przesiewowe indywidualnych donacji krwi
i puli osocza pod względem specyficznych znaczników
zakażeń oraz zastosowanie skutecznych kroków w produkcji
w celu inaktywacji/usuwania wirusów. Pomimo tego, gdy
podawane są produkty medyczne przygotowane z ludzkiej
krwi lub osocza nie można całkowicie wykluczyć możliwości
przeniesienia czynników wywołujących zakażenie. Odnosi
się to także do nieznanych lub rozwijających się wirusów lub
innych patogenów. Nie istnieją zgłoszenia dokumentujące
przypadki przenoszenia wirusów z albuminą wyprodukowaną
według specyfikacji Farmakopei Euopejskiej, przy użyciu
określonych procesów. Zaleca się, aby przy każdorazowym
podawaniu podłoża do hodowli rozrodczych Reproductive
Media Products firmy Irvine Scientific były zapisywane
nazwa oraz numer partii produktu, aby połączyć informacje
o pacjencie z partią produktu.
USA: Produkt ten zawiera albuminę surowicy ludzkiej (HSA).
Materiał pochodzenia ludzkiego użyty do wyprodukowania
tego produktu był testowany przy użyciu zestawów
licencjonowanych przez Agencję ds. Żywności i Leków,
i określono, że nie wykazuje on reakcji na przeciwciała
przeciw wirusom zapalenia wątroby typu C (HCV) ani na
przeciwciała przeciw wirusom niedoboru odporności
immunologicznej (HIV). Jednakże, żadna z metod testujących
nie oferuje całowitej pewności, że produkty pochodzenia
ludzkiego nie są zakaźne. Ze wszystkimi materiałami
pochodzenia ludzkiego należy tak postępować, jakby były
zdolne do przenoszenia zakażeń, stosując uniwersalne
środki ostrożności. Dawcy tych materiałów źródłowych
zostali także przebadani na obecność choroby CreutzfeldtaJacoba (CJD).
PRZECIWWSKAZANIA
Produkt zawiera siarczan gentamycyny. Należy zastosować
odpowiednie środki ostrożności, aby upewnić się, że pacjent
nie jest uczulony na ten antybiotyk.
ROMÂNĂ
AVERTIZARE PENTRU UNIUNEA EUROPEANĂ: Pentru folosinţa
exclusivă a specialiştilor.
AVERTIZARE: Conform Legilor Federale americane, comercializarea
acestui dispozitiv este autorizată a fi efectuată doar de către un medic sau la
recomandarea unui medic.
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SVENSKA
VARNING – EU: Endast för professionellt bruk.
VARNING - USA: Enligt federal (USA) lag får denna produkt endast
säljas av eller på ordination av läkare.
AVSEDD ANVÄNDNING
Vit Kit® - Freeze är avsett för användning i assisterad reproduktiva processer för
vitrifiering av mänskliga oocyter (MII), pronuclear (PN) zygoter genom 3 dagars
spaltningssteg embryos och blastocyst steg embryos. Detta kit är designat för
användning med Irvine Scientific’s CryoTip® (katalog # 40709), och vitrifiering
Thaw Kit (Vit Kit® - Thaw) för optimal återvinning av prover.
PRODUKTBESKRIVNING
Equilibration Solution-ES är en HEPES-buffrad lösning av Medium-199
innehållande gentamicinsulfat (35 µg/mL), 7,5 % (v/v) av vardera dimetylsulfoxid
(DMSO) och etylenglykol samt 20 % (v/v) Dextran Serum Supplement.
Vitrifieringslösning-VS är en HEPES-buffrad lösning av Medium-199
innehållande gentamicinsulfat (35 µg/mL), 15 % (v/v) av vardera dimetylsulfoxid
(DMSO) och etylenglykol samt 20 % (v/v) Dextran Serum Supplement samt
0,5 M sukros.
Dessa två lösningar skall användas i sekvens enligt det stegvisa mikrodroppevitrifieringsprotokollet.
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MATERIAL SOM KRÄVS MEN INTE MEDFÖLJER
• Irvine Scientific CryoTip (Katalog #40709) eller HSV Straw (Katalog #2524625251) eller Cryolock™ (Katalog #CL-R-CT-B, CL-R-CT-G, CL-R-CT-C,
• Irvine Scientific anslutningsprogram (Katalog #40736) eller annan adaptor
• Sterila petriskålar (50 X 9 mm, Falcon 351006 eller motsvarande)
• Kryorör (4,5 mL) eller rundbottnade rör utan lock samt kryorörhållare
• Modifierad HTF - HEPES (Katalognr 90126) odlingsmedium med tillsats
av protein
• Hyaluronidase (Katalog #90101)
• Engångshandskar
• Hamilton GASTIGHT®-spruta (50 µl, Katalognr 80901) eller annat verktyg
för aspiration
• Överföringspipetter (glaspipetter med tunn spets eller mikropipettspetsar
med en inre spetsdiameter på cirka 200 µm)
• Pincetter eller förlossningstänger
• SYMS-förseglare för HSV-strån
• Stoppur eller tidtagare
• Tank med flytande kväve (dewar eller styrofoam behållare med lock,
1-2 L volum)
• Flytande kväve (tillräcklig volym för att uppnå 4 tum nivå i behållare)
BRUKSANVISNING
Vit Kit Freeze komponenter som krävs (per applikation):
60 µL för vitrifieringsprotokoll för oocyt
Eller
50 µL för vitrifieringsprotokoll för embryo
• Vitrifieringslösning (VS):
50 µL för vitrifieringsprotokoll
• 1 CryoTip eller HSV Straw eller Cyrolock (lagrar upp till 2 provexemplar)
• 1 Koppling
OOCYTE (MII) Vitrifieringsprotokoll:
OBS! Dessa procedurer skall utföras vid rumstemperatur
(20-27 ºC). OBS! Minimera exponering av preparaten för ljus
under ekvilibrering i ES- och VS-lösningarna.
1. Låt den mängd jämviktslösning (ES) och vitrifieringslösning (VS) som
ska användas anta rumstemperatur (20-27 °C) innan de vitrifierade
proverna tinas upp. OBS: Undvik att låta hela ampuller med ES och VS bli
rumstempererade upprepade gånger när endast en del av lösningen behövs
åt gången. Det är bättre att hälla av den mängd som ska användas och
sedan genast sätta tillbaka ampullerna till kylförvaring vid 2-8 °C. Modified
HTF (HEPES) med protein krävs också för vitrifieringsprotokollet för oocyter.
2. Fyll behållaren för flytande kväve med flytande kväve (till ett djup på 10
cm eller så att kryoröret på hållaren är helt nedsänkt) och placera den intill
mikroskopet. Placera ett kryorör eller ett rundbottnat rör (utan lock) på den
nedersta klämman på en kryorörhållare och sänk ned hållaren i flytande
kväve inför förvaring av de vitrifierade preparaten.
3. Bestäm hur många preparat som skall vitrifieras.
4. Märk varje steril petriskål (eller lock) och kryo-lagringssenhet med
nödvändig information.
5. Vänd försiktigt varje ampull ES och VS två gånger så att innehållet blandas
före användning.
6. Preparera skålen med droppar av lösning för vitrifieringsförfarandet på
följande sätt:
A. OOCYTE (MII) Vitrifieringsprotokoll:
ANTECKNING1: Hämtade oocyter ska renas med hyalurondise för att bekräfta
de är MIL.
ANTECKNING 2: Kontrollera med avsnitt B för embryo vitrifieringsprotokoll.
1. Dispensera aseptiskt 20 µl droppe odlingsmedium, modifierad HTF HEPES med protein och ES alldeles intill på ett upp-och-nedvänt lock till
en steril Petriskål så som visas i figur 1 och placera skålen på mikroskopets
objektbord:
• en 20 µl droppe modifierad HTF (HEPES med protein)
• tre 20 µL-droppar (sammanlagt 60 µL) ES (ES1, ES2, ES3)
2. Ta ut odlingsskålen med MII-oocyter från inkubatorn och kontrollera
preparatens kvalitet under mikroskop. Välj endast stadie
MII-oocyt(er) av bästa kvalitet, när så är möjligt.
OBS! Minimera exponering av preparatet(n) för ljus under
ekvilibrering i H-, ES- och VS-dropparna.
3. Flytta över oocyten (högst två i taget) med en minimal volym medium från
odlingsskålen (i inkubator) till 20 µL H-droppen i en minut.
4. Sammanför H-droppen med ES1 (se fig. 1, pil 1) med spetsen på
överföringspipetten och låt de två lösningarna blandas spontant
i 2 minuter.
5. Låt sedan ES2-droppen (pil 2) blanda sig med de redan blandade dropparna
och låt stå 2 minuter.
6. Flytta över oocyten(-erna) med minimal volym lösning från den
sammanförda droppen till ES3-droppen i 6–10 minuter. Obs!
Ekvilibreringen av oocyt(er) i ES3 är fullbordad när zona
pellucida och det perivitellina spatiet har samma tjocklek.
Oocyten(oocyterna) sjunker till botten av droppen inom
3 minuter.
7. Under ekvilibreringsperioden i ES3:
Expediera aseptiskt en (1) 50 µL droppe VS 2 minuter före
för att uppnå jämvikt och förebered CryoTip (Fig. 3), HSV
Straw (Fig. 4), eller Cryolock (Fig. 5) för laddning:
ANTECKNING: Undersök noggrant vitrifieringsenheten och munstycke
innan proceduren startas
• CryoTip: anslut till Hamilton användning eller lämplig utsugningsverktyg
med en anslutning eller adaptor för att säkerställa en tät försegling.
OBS: Låt metallhylsan sitta kvar över den tunna spetsen så att den skyddas
tills det är dags att dispensera proverna.
• HSV Straw: anslut den längre änden av den bå plast infogningsenheten
till den färgade änden på hanteringstråden.
• Cryolock: ta bort hättan.
8. Följande steg (9-13) bör utföras inom 80-110 sekunder.
OBS! För att förhindra cytotoxicitet skall exponering
av preparaten för VS begränsas. Preparat tenderar
att flyta i VS, så justera mikroskopets fokus så att
kontinuerlig visualisering bibehålls under exponeringen,
och ha överföringspipettens spets i närheten så att snabb
överflyttning mellan VS-dropparna säkerställs. Se figur 6.
9. Efter avslutad ekvilibrering i ES, dra upp litet ES i överföringspipetten och
flytta över preparatet(n) från ES-droppen, med minimal volym, till droppen
VS i 30 sekunder.
10. Ladda och värmeförsegla CryoTip enligt följande (Se
figur 7a):
• Skjut upp skyddshylsan av metall längs CryoTip så att den tunna, sköra
spetsänden exponeras.
• Hantera CryoTip och Hamilton-sprutan medan du observerar i
mikroskopet och aspirera försiktigt en liten volym VS till märke nr
1 på CryoTip.
• Fortsätt att observera under mikroskop och sug försiktigt upp preparatet
med VS till märke nr 2 på CryoTip.
• Observera nu CryoTip direkt och aspirera mer VS till märke nr 3.
• Preparaten måste befinna sig mellan märke 2 och märke 3.
• Värmeförsegla (försegling nr 1) CryoTip vid (eller strax nedanför)
märke nr 1 och skjut sedan skyddshylsan tillbaka ned så att den
tunna och sköra spetsen skyddas.
• Avlägsna försiktigt CryoTip från aspirationsverktyget och adaptern och
värmeförsegla sedan (försegling nr 2) vid den tjocka änden av
CryoTip över märke nr 4.
• Sänk ned den täckta CryoTip direkt i flytande kväve (nedkylning vid
en hastighet av -12 000 ºC/min) (Se figur 7b):
Ladda och försegla HSV-strået enligt följande:
• Placera försiktigt provet/proverna med hjälp av en mikropipett i
kapillärröret i rännan 1 mm från änden. Provdroppen måste vara under
0,5 µl. Maximalt 2 oocyter eller embryon till varje kapillärrör.
• Placera genast kapillärröret och hanteringsstaven i strået och tryck på
tills den rektangulära delen av handtaget kommer i kontakt med den
vidgade änden av strået.
• Fatta försiktigt tag i strået med tummen och pekfingret och tag bort
införingsenheten.
• Medan strået fortfarande hålls på plats, försegla den öppna änden med
hjälp av SYMS-försegling.
• Håll strået med pincett nära hanteringsstaven.
• Låt hela strået snabbt falla ner i LN2 vertikalt. Rör försiktigt om strået
i LN2 några sekunder för att undvika att det bildas ett isolerande lager
med luftbubblor runt det.
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C
V TR F KAČNÝ PROTOKOL
POZNÁMKA Pos upy sa mus a vykonáva p zbove ep o e
20 až 27 C P nas edu úc ch pos upoch NEPOUŽ VAJTE
vyh evaný m k oskop cký s o ček UPOZORNEN E Počas
ekv b ác e v oz okoch ES a VS m n ma zu e vys aven e
vzo ky sve u
Z
m
ES VS
C POZNÁMKA V
m
m ES VS
ď
m
ď
m
C P
m
m
m HTF HEPES
m
N
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P
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P
T
fikác u emb y
VS
m
POKYNY NA UCHOVÁVAN E A STAB L TA
C P
V
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K
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K ď
ES
fikác u oocy ov
m
N
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mď
m
m
HSV
m
m
m
VS
T
C T
VS značku č 3
m
značkou č 2 značkou č 3
č 1
C T
značke č 1
Nap ň e za aden e C yo ock nas edu úc m spôsobom
P m
m
m m
m
C
mm
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m m
m
m
m
≤
M
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m
C
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M
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m
D
m
m
POZNÁMKA Možnos B n e e schvá ená na použ e
v USA
R
C
POZNÁMKA Za aden e C yo ock uchováva e vždy
uzáve om nado
Um
C T
HSV
C
N
m
U
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ď
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m
m
P
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m
m
B EMBRYÁ PN až b as ocys a
V TR F KAČNÝ PROTOKOL
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Keď e o možné vybe e
en na kva ne š e emb yá
O
m m
m
m mm
m
ES
Em
m
ES m
m
m
m
Poznámka Vzo ky sa zmenš a a po om pos upne v á a
do pôvodných ozme ov čo znamená že sa ekv b ác a
dokonč a
UPOZORNEN E Počas ekv b ác e v kvapkách ES a VS
m n ma zu e vys aven e vzo ek sve u
Počas e o doby ekv b ác e v oz oku ES
p p av e ednu 50 µ kvapku oz oku VS ako zob azu e
ob 8 a p p av e šp čku C yoT p yč nku HSV a ebo
za aden e Cy o ock na nap nen e
Pos upu e pod a vyšš e uvedeného p o oko u Čas A
V fikačný p o oko p e oocy y M
od k oku 9 po k ok
12 kde ná de e vys aven e oz okom VS nap nen e šp čky
C yoT p yč nky HSV a ebo za aden a C yo ock pono en e
do LN a d hodobé uchovávan e
O
µ
m
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C
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m ne á y
K
K
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C T
m
m u áve č 2
m
C T
značkou č 4
S
C T
Cm
Nap ň e a uzav e yč nku HSV nas edu úc m spôsobom
P m
m
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ď
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C
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n p ezen ce ce ă e nd că ap u că e ec e e pe e men ung
a e v fică ovoc e o ș emb on o ămân necunoscu e
m
m
m
m
m
m
m
S
K
A aş ma e a ü ü v fikasyonun oos e ve emb yo a
üze ndek uzun dönem e k e n n ha haz da b nmed ğ n
gös e mek ed
VS
HTF
HEPES m
m µ ES ES ES ES
m
m
m
H
m
SAKLAMA TAL MAT VE STAB L TE
C
C
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A
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Z
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POTREBNÉ MATER ÁLY KTORÉ N E SÚ SÚČASŤOU DODÁVKY
Š
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B EMBR YOLAR PN den B as ok s e
V fikasyon P o oko ü
B
µ
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m
H
V TR F KASYON PROTOKOLÜ
NOT P osedü e n oda s cak ğ nda 20 27 C uygu anmas
ge ekmek ed Aşağ dak p osedü e ç n s m ş m k oskop
ab as ku anmay n D KKAT ES ve VS so üsyon a nda
denge eme s as nda ö neğ n ş ğa ma uz ye n m n m ze ed n
K
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C NOT
S
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m
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C
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K
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B
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m m m
m
C
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D
ZABEZPEČEN E KVAL TY
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NOT C yo ock he zaman kapağ aşağ doğ u bakacak
şek de sak anma d
V
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C
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V
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NSTRUCŢ UN DE PĂSTRARE Ş VALAB L TATE
m
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m
D
NOT Seçenek B ABD de ku an m ç n onay anmam ş
GEREKL OLAN AMA TEDAR K ED LMEYEN MATERYALLER
S
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K
N
C
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N C R CT B C R CT G C R
S
K
K
S
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m
K
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GAST GHT® Ş
µ K
Cm
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S
HSV P
K
m
S
S N
m
N
m
P
Kryoprotektant
Sukros
Dextran
Etylenglykol
Dimetylsulfoxid
Vitaminer och
mineraler
Askorbinsyra
Paraaminobensoesyra
Alla resultat finns rapporterade på ett lotspecifikt analyscertifikat (Certificate of
Analysis) som fås på begäran.
B
m
D
D
ES ç ndek bu denge enme sü es s as nda
Şek 8 de gös e d ğ g b 50 μL k b dam a VS so üsyonu
haz ay n ve K yo Ucu HSV Paye veya C yo ock u
yük eme ç n haz ay n
≤
A
m
m
U
şa e #4
K
U
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Mühü #2
K
m K
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C
m B Ş
Aşağ da be
en şek de HSV paye n yük ey n ve ya n
B m
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Ö
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P
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G
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m
m
No Ö nek küçü ecek son a no ma boyuna ge dönecek
Bu du um denge enmen n amam and ğ na şa e ede
D KKAT ES ve VS dam a a ç nde denge eme s as nda
ö neğ n veya ö nek e n ş ğa ma uz ye n m n m ze ed n
KAL TE GÜVENCES
V K F
m m
m
P
Protein
Humant serumalbumin
Varje lot Vit Kit - Freeze genomgår följande tester:
Lösningar och CryoTips.
Endotoxin genom Limulus Amebocyte Lysatee (LAL) metod (≤0.6 EU/mL)
Mus embryo analys (en-cell) (≥ 80% expanderad blastocyst)
Sterilitet genom aktuell USP Sterilitetstest <71> (Pass)
N
N A
m
N
K
S
K yoko uyucu
D
S
E
G
Dm
m
C
Energisubstrat
Dextros
Inositol
KVALITETSSÄKRING
Lösningarna i Vit Kit-Freeze är membranfiltrerade och aseptiskt processade i
enlighet med tillverkningsprcessera som är validerade.
B P o oco de V fica e pen u EMBR ON
PN B as oc e
D
µ
ES
P
S
m
m
m
Dacă es e pos b se ec a numa emb on de cea ma
bună ca a e pen u v fica e
T
m
m
mm m
m
S
ES
m
Em
ES
m
m
OBSERVAȚ E Mos e e se vo m cşo a n d ame u a
după aceea vo even ep a a mă mea o g na ă ceea
ce nd că că ech b a ea a os ea za ă cu succes
AVERT SMENT M n ma a expune ea mos e o a
um nă n mpu ech b ă e ec ua e n p că u e de ES
ş VS
4 n mpu aces e ech b ă de mp n ES
pune o p că u ă de 50 µL de so u e de v
ca e așa
cum se a a ă n gu a 8 ș p egă pa e a C yoT p HSV
sau Cy o ock pen u ncă ca e
U ma p o oco u așa cum sc e ma sus sec unea A
P o oco de V fica e Ovoc e M
paș 9 până a 12
pen u expune ea a so u de v fica e ncă ca ea pa e e
C yoT p HSV sau C yo ock scu unda ea n LN ș s oca ea
pe e men ung
C yo ock K
Aşağ dak ad m a 9 13 80 110 san ye a as nda
amam anma d D KKAT S o oks s ey ön emek ç n
ö nek e n VS ye ma u ye s n anma d Ö nek e
VS de yü me eğ m nded do ay s y a ş k ama s as nda
sü ek gö ün ü emey sü dü mek ç n m k oskop an odağ
aya ay n ve VS dam a a n n h
ans e n sağ amak ç n
ans e p pe n n ucunu yak nda u un Şek 6 y nce ey n
ES
m m m
m
ES
30 san ye boyunca
m m m
m ES m
VS
m
m
K yo Ucu aşağ dak g b Bkz Şek 7a yük ey n ve s cak
mühü ey n
m
m
m
K U
M
m
K
U
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VS
m K U
şa e
#1
M
m m
m
VS
K
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Şm
K U
m
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VS
Ö
şa e #2
şa e #3
m
K U
şa e #1
m
m
Mühü #1
m
m
m
S
P oen
A m
B
≤
Antibiotikum
Gentamicin Sulfate
Övrigt
Guanin
Hypoxantin
Tymin
Uracil
Xantin
Adenosin
Adeninsulfat
2-deoxi-D-ribos
Ribos
AmnioAcids
L-Arginin
Glycin
L-Histidin
L-Lysin
L-Prolin
L-Tyrosin
DL-Alanin
DL-Asparaginsyra
DL-Glutaminsyra
DL-Isoleucin
DL-Leucin
m
Kalciferol
Folsyra
Nikotinsyra
Niacinamid
Pantotensyra
Riboflavin
Pyridoxin
Tiamin
D-biotin
Alfa-tokoferol
Natriumbisulfit
Antioxidant
Glutation, Reducerat
pH-indikator
Fenolrött
S
C
OBSERVAȚ E s oca n o deauna pa e a C yo ock cu
capacu n os
P
C T HSV
C
m
N
HSV Paye M
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A
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M
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C
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m
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S
U
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Dextran
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Dimetilsulfoxid
m
Mümkün o duğu du um a da
ya n zca en y ka e M ev es oos e n seç n D KKAT
H ES ve VS dam a a nda denge eme s as nda ö nek e n
ş ğa ma uz ye n m n m ze ed n
M m mm
m m
µ
H m
H m
ES
B Ş
2 dak ka
m
S
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m
m
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O
m
m
ES
m
m m m
m 6 10 dak ka ğ na ak a n
No Zona pe uc da ve pe v e n a an n n ka n ğ eş
o duğunda ES3 ek oos e n denge enmes amam anm ş
Oos e 3 dak ka ç nde dam an n d b ne o u acak
7 ES3 ç ndek denge enme sü ec ç nde
Denge enme amam anmadan 2 dak ka önce asep k o a ak
50 μL b 1 dam a VS koyun ve K yo Uç Şek 3 HSV
Paye Şek 4 veya C yo ock Şek 5 k sm n yük eme ç n
haz ay n
NOT P
m
An b yo k
G
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A
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R
G
H
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A T
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G
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S
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H
D A
D A
D G
D
D
M
F
S
T
T
V
m
SAMMANSÄTTNING
DL-Metionin
DL-Fenylalanin
DL-Serin
DL-Treonin
DL-Tryptofan
DL-Valin
L-Cystein
L-Hydroxiprolin
L-Cystin
Buffert
Natriumbikarbonat
HEPES
N
O
PROTOCOL DE VITRIFICARE
OBSERVAȚIE: Procedurile trebuie executate la temperatura
camerei (20-27º C). NU FOLOSIŢI măsuţa portobiect a
microscopului încălzită pentru procedurile următoare.
AVERTISMENT: Minimalizaţi expunerea mostrei la lumină în
timpul echilibrării în soluţia ES şi VS.
1. Aduceţi cantitatea de soluţíe de echilibrare (ES) şi de soluţie de vitrificare (VS)
ce urmează a fi utilizată la temperatura camerei (20 - 27 ° C). OBSERVAȚIE:
Evitaţi aducerea repetată la temperatura camerei a eprubetelor cu ES şi
VS, atunci când doar o parte din soluţie este necesară de fiecare dată.
Se recomandă să se ia părţi alicote din cantitate în vederea utilizării şi să
puneţi eprubetele din nou la o temperatură de 2 - 8 ° C imediat după luarea
părţilor alicote. Modified HTF (HEPES) cu proteine este de asemenea cerut
la protocolul de vitrificare a ovocitelor.
2. Umpleţi rezervorul cu lichid de azot (suficient să ajungeţi la o adâncime
de 4 inci sau ca să scufundaţi complet criotubul pe tijă) şi puneţi aproape
de microscop. Ataşaţi criotubul sau gobletul (neacoperit) la capătul de jos
a cleştelui criotijei şi scufundaţi în azotul lichid din containerul utilizat în
preparaţia pentru depozitarea mostrelor vitrifiate.
3. Determinaţi numărul de mostre care trebuie să fie vitrificaţi.
4. Puneţi etichete cu informaţiile necesare pe fiecare cutie Petri sterilă (sau
capac) şi pe dispozitivul de păstrare Cryo.
5. Înainte de utilizare, învârtiţi cu grijă şi amestecaţi de două ori conţinutul din
fiolele de ES şi VS
6. Preparaţi vasul cu picături de soluţie pentru Procedura de Vitrificare după
cum urmează:
A. OVOCITE (MII) Protocol de vitrificare:
OBSERVAȚIE 1: Ovocitele extrase urmează să fie denudate cu hialuronidază
pentru a confirma faptul că acestea sunt MII.
OBSERVAȚIE 2: A se vedea secțiunea B pentru protocolul de vitrificare a
embrionilor.
1. Distribuiţi în condiţii aseptice 20 µL picătură de mediu de cultură HTF
modificat - HEPES cu proteină şi ES în imediata apropiere pe un capac
întors al unei cutii Petri sterile, după cum este indicat în Figura 1 şi puneţi
cutia pe platina microscopului:
• O picătură de 20 µL de HTF modificat (HEPES cu proteină)
• Trei picături -20 µL (60 µL total) de ES (ES1, ES2, ES3)
2. Scoateţi cutia de cultură conţinând ovocitele MII din incubator şi verificaţi
calitatea mostrelor sub microscop.
Dacă este posibil, selectaţi numai ovocitele de cea mai
bună calitate, stadiu MII.
AVERTISMENT: Minimalizaţi expunerea mostrei(lor) la
lumină în timpul echilibrarii efectuate în picaturile de H,
ES şi VS.
3. Transferaţi ovocitele (până la 2 în acelaşi timp) cu un volum minim de mediu
de cultură (în incubator) într-o picătură de 20 ųL de H pentru un minut.
4. Amestecaţi picăturile H cu ES1 (vezi Fig.1,săgeta 1) cu vârful pipetei de
transfer până se omogenizează cele două soluţii, timp de 2 minute.
5. Apoi amestecaţi picătura de ES2 (săgeata 2) cu picăturile amestecate anterior
şi lăsaţi timp de 2 minute.
6. Transferaţi ovocitul (ovocitele) cu un volum minim de soluţie din picătura
amestecată în picătura de soluţie de echilibrare ES3 timp de 6-10 minute.
OBSERVAȚIE: Echilibrarea ovocitului(lor) în ES3 este
completă când grosimea zonei pellucida devine egală
cu cea a spaţiului perivitelin. Ovocitul(ele) se va aşeza la
fundul picături în 3 minute.
7. Timpul cât durează echilibrarea în ES3:
Dozați aseptic o (1) picătură de 50 µL de soluție de
vitrificare cu 2 minute înainte de echilibrarea completă și
pregătiți paieta CryoTip (Fig. 3), paieta HSV (Fig. 4) sau
paieta Cryolock (Fig. 5) pentru încărcare:
OBSERVAȚIE: Examinați cu atenție dispozitivul vitrificare și vârful înainte
de a începe procedura
• Paieta CryoTip: conectați la seringa Hamilton sau la instrumentul
adecvat de aspirare utilizând un conector sau adaptor pentru a asigura
închiderea etanșă. OBSERVAȚIE: Menţineţi manşonul capacului metalic
peste vârful fin tras pentru a-l proteja până când acesta este pregătit
pentru încărcarea probelor.
• Paieta HSV: conectați capătul mai lung al instrumentului de inserție
de plastic albastru la capătul colorat al tijei de manipulare
• Paieta Cryolock: detașați capacul.
8. Următoarele trepte (9-13) vor fi efectuate în 80-110
secunde. AVERTISMENT: Expunerea mostrei la
VS trebuie limitată pentru a preveni citotoxicitatea
acestuia. Mostra(rele) tinde să înoate în VS, deci
ajustaţi focalizarea microscopului pentru a menţine
o vizualizare continuă în timpul expunerii şi ţineţi
vârful pipetei de transfer în apropiere pentru a asigura
transferul rapid între picăturile VS. A se vedea Figura 6.
9. După ce aţi terminat echilibrarea în ES, trageţi în pipetă de trasnfer puţin
ES şi transferaţi mostra(ele) cu un volum minim de ES în picături de VS
pentru 30 secunde.
10. Încărcaţi şi etanşaţi la cald CryoTip-ul, după cum urmează
(Vezi Figura 7a):
• Glisaţi manşonul metalic în sus de-a lungul CryoTip- ului pentru a expune
vârful fin şi fragil.
• Manipulaţi CryoTip şi seringa Hamilton în timp ce observaţi sub
m
semnu #1
N m
m
ncă ca pa e a C yo ock după cum u mează
C
m
m m
Proteină
Albumină Umană
Serică
INSTRUCŢIUNI DE UTILIZARE
Kituri de congelare VIT a componenţilor (pe aplicaţie)
60 µL pentru Protocolul de Vitrificare a Oocitelor
Sau
50 µL pentru Protocolul de Vitrificare a embrionului.
• Soluţie de Vitrificare (VS):
50 µL pentru Protocolul de Vitrificare
• 1 paietă CryoTip sau paietă de vitrificare cu grad înalt de siguranță (HSV)
sau paietă Cyrolock (stochează până la 2 probe)
• 1 Conector
K yo Uç S
H m
m
VS
m
SYMS
m
O
MATERIALE NECESARE CARE NU SUNT INCLUSE
• Paietă CryoTip de la Irvine Scientific (Număr de catalog 40709) sau paiete
de vitrificare cu grad înalt de siguranță (Număr de catalog 25246-25251)
sau paiete Cryolock™ (Număr de catalog CL-R-CT-B, CL-R-CT-G, CL-RCT-C, CL-R-CT-Y, CL-R-CT-O)
• Conector de la Irvine Scientific (Număr de catalog 40736) sau alt adaptor
• Cutie Petri Sterilă (50 X 9mm, Falcon 351006 sau echivalent)
• Criotuburi (4.5 ml) sau goblete şi criotije
• Mediu de cultură HTF modificat - HEPES suplimentat cu proteină (Nr. de
catalog 90126)
• Hialuronidază (Număr de catalog 90101)
• Mănuşi disponibile
• Seringă Hamilton GASTIGHT® (50 µL, Nr. de catalog 80901) sau alt
instrument de aspirare
• Transferaţi pipetele (trageţi pipetele de sticlă sau micropipetele cu un vârf
interior cu diametrul de ~200 µm)
• Pensete sau forcepsuri
• Ermetizare la căldură
• Dispozitiv de etanşare SYMS pentru Tubul HSV
• Ceas cu cronometru sau Cronomertru
• Rezervor de azot lichid (container vidat tip Dewar sau din polistiren
styrofoam cu capac, volum 1-2 l)
• Azot lichid (volum suficient pentru a obține o adâncime de 4 inci în rezervor)
Salter och Joner
Natriumklorid
Natriumfosfat
Kaliumklorid
Magnesiumsulfat
Natriumacetat
Kalciumklorid
Ferrinitrat
Kolinklorid
VS
m
Ţ
S
A
ASIGURAREA CALITĂȚII
Soluțiile din Vit Kit-Congelare sunt filtrate membranar și prelucrate în mod aseptic
în conformitate cu procedurile de fabricație care au fost validate.
Endotoxină prin testul limulus amebocit lizat (LAL) (≤0.6 EU/mL)
Analiza embrionului de șoarece (o singură celulă) (≥ 80% blastocist expandat)
Sterilitatea evaluată cu testul de sterilitate din Farmacopeea actuală a Statelor
Unite <71>(Rezultat favorabil)
Toate rezultatele sunt raportate la un lot specific într-un Certificat de Analiză care
este disponibil la cerere.
m
m
m
m
Substraturi
Energetice
Dextroză
Inozitol
Vitamine şi
Minerale
Acid Ascorbic
Acid p-Aminobenzoic
Calciferol
Acid Folic
Acid Nicotinic
m m
semne e #2 ş #3
s g u #1 C T
m
S
Antibiotic
Sulfat de Gentamicină
Altele
Guanină
Hipoxantină
Tiamină
Uracil
Xantină
Adenozină
Sulfat de adenină
2-Dezoxi -D-Riboză
Riboză
Indicator pH
Fenol roşu
TÜRKÇE
ABD UYAR S ABD F
m
Amidă a Acidului
Nicotinic
Acid Pantotenic
Riboflavină
Piridoxină
Tiamină
Biotină D
Alfa Tocoferol
Bisulfit de Sodiu
Antioxidant
Glutation Redus
semnu #1
m
C T
m
Sg un 2
C T
Semnu u n 4
m
C T
Cm
V F
ncă ca ş e anşa ubu HSV după cum u mează
C m
mm
P
µ M m
m
P
m
m
m
COMPOZIŢIE
Tampon
Bicarbonat de Sodiu
HEPES
VS
m
C T
C T
semnu #2
S
Aceste două soluţii vor fi utilizate în succesiune, conform protocolul de vitrificare
de decongelare şi sortare în trepte a micropicăturilor
DL-Fenilalanină
DL-Serină
DL-Treonină
DL-Triptofan
DL-Valină
L-Cisteină
L-Hidroxiprolină
L-Cistină
mm
T
A m
semnu #3
M
Soluţia de Vitrificare-VS este o soluţie tamponată HEPES a mediului-199,
care conţine sulfat de gentamicină (35 µg/mL), 15% (v/v) al f iecãrui dimetilsulfoxid
(DMSO) glicol de etilenã, 20% (v/v) Dextran Serum Supplement şi 0,5 M zaharoză.
Săruri şi ioni
Clorură de Sodiu
Fosfat de Sodiu
Clorură de Potasiu
Sulfat de Magneziu
Acetat de Sodiu
Clorură de calciu
Azotat de Fier
Clorură de Colină
C
C
DESCRIEREA PRODUSULUI
Equilibration Solution-ES este o soluţie tamponantă HEPES a Mediului
-199 conţinând sulfat de gentamicină (35 µg/mL), 7,5% (v/v) dimetilsulfoxidă
(DMSO) 7,5% glicol de etilenă şi 20% (v/v) Dextran Serum Supplement.
KONTRA ND KAC JOS
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nkamų a sa gumo p emon ų s k nan kad pac en as nė a
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UTILIZARE DESTINATĂ
VIT Kit® - Congelare este destinat utilizării în cadrul procedurilor de reproducere
asistată pentru vitrificare și stocare a ovocitelor umane (MII), zigoți pronucleari
(PN) până la embrioni de 3 zile în etapa de scindare și embrioni în stadiul de
blastocist. Acest kit este proiectat pentru a fi utilizat cu paieta CryoTip® de la Irvine
Scientific (Număr de catalog 40709), și Kitul de decongelare a vitrificării (Vit Kit®
-Decongelare) pentru recuperarea în condiții optime a probelor.
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Aby uniknąć próblemów z zanieczyszczeniem, posługując się tym produktem należy
stosować technikę aseptyczną.
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Nie używać żadnej fiolki z roztworem, która wykazuje oznaki uszkodzenia,
nieszczelności, obecności cząstek materii, zmętnienia lub której zawartość zmieniła
kolor. Produkt zutylizować zgodnie z odnośnymi przepisami.
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Jako dodatkowy środek ostrożności podczas procedury przygotowawczej,
zalecamy, aby każda słomka CryoTip została dokładnie zbadana przy wyjmowaniu
z opakowania. Przed użyciem słomki CryoTip należy skontrolować pod odpowiednim
powiększeniem (40x), czy nie posiadają uszkodzeń (takich jak: złamania lub pęknięcia
końcówek), do których może dojść podczas transportu.
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žymos N 4
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Ośrodek używający tego wyrobu jest odpowiedzialny za utrzymanie
identyfikowalności produktu i musi być ona zgodna z krajowymi przepisami
odnośnie identyfikowalności, gdy mają one zastosowanie.
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Ponieważ w produkcie jest obecny materiał pochodzenia ludzkiego, podczas
magazynowania mogą powstać drobne cząstki osadu. Nie wykazano, aby ten typ
cząstek miał wpływ na działanie produktu.
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Nie używać pożywek przez więcej niż osiem (8) tygodni po otwarciu pojemników.
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Aby zapoznać się z dodatkowymi szczegółami użycia tych produktów, każde
laboratorium powinno odwołać się do własnych procedur laboratoryjnych i protokołów,
które zostały specjalnie opracowane i zoptymalizowane dla indywidulanego programu
medycznego.
INSTRUKCJE DOTYCZĄCE
PRZECHOWYWANIA I STABILNOŚCI:
Nieotwarte fiolki przechowywać w chłodziarce w temperaturze 2°C do 8°C. Gdy
przechowywane zgodnie z instrukcją, zestawy do witryfikacji Vitrification Freeze Kit
Solutions są stabilne do upłynięcia daty ważności umieszczonej na etykietach fiolek.
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e ede ű anyagoka a É e m s e és Gyógys e ügynökség
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szybkiego przenoszenia pomiędzy kroplami roztworu VS.
Patrz ryc. 6.
9. Po osiągnięciu stanu równowagi w roztworze ES naciągnąć pipetą transferową
pewną ilość roztworu ES i przenieść okazy z minimalną ilością roztworu z kropli
roztworu ES do kropli roztworu VS na 30 sekund.
10. Napełnić i na gorąco zamknąć słomkę CryoTip w następujący
sposób (Patrz ryc. 7a):
• Przesunąć metalową osłonkę w górę wzdłuż słomki CryoTip, aby odsłonić
cienką, cienką, delikatną końcówkę.
• Prowadząc obserwację pod mikroskopem oraz posługując się słomką
CryoTip i strzykawką Hamiltona, ostrożnie pobrać niewielką ilość roztworu
VS, tak aby sięgał do oznaczenia nr 1 na słomce CryoTip.
• Kontynuować obserwacje pod mikroskopem i delikatnie pobrać okaz
z roztworem VS, tak aby sięgały do oznaczenia nr 2 na słomce CryoTip.
• Obserwując słomkę CryoTip bezpośrednio, delikatnie pobrać więcej VS do
oznaczenia nr 3.
• Okaz musi byc umieszczony pomiędzy oznaczeniem nr
2 i oznaczeniem nr 3.
• Uszczelnić pod działaniem wysokiej temperatury (uszczelnienie nr 1)
słomkę CryoTip na wysokości (lub tuż poniżej) oznaczenia nr 1 i zsunąć
osłonkę pokrywającą w dół, aby przykryć i zabezpieczyć delikatną, cienką,
cienką końcówkę.
• Ostrożnie wysunąć słomkę CryoTip z narzędzia aspiracyjnego i adaptera,
a następnie uszczelnić na gorąco (uszczelnienie nr 2) na grubszym
końcu słomki CryoTip powyżej oznaczenia nr 4.
• Zanurzyć zamkniętą słomkę CryoTip bezpośrednio w płynnym azocie
(z szybkością chłodzenia-12 000°C/min) (Patrz ryc. 7b).
Napełnić i zamknąć słomkę HSV w następujący sposób:
• Za pomocą mikropipety ostrożnie umieścić okazy w rowku pałeczki kapilarnej
w odległości 1 mm od końca. Kropla zawierająca okazy nie może być większa
niż 0,5 µl. Maksymalnie 2 oocyty lub zarodki na każdą pałeczkę kapilarną.
• Niezwłocznie umieścić pałeczkę kapilarną oraz rękojeść w słomce i popychać
do momentu, gdy prostokątna część rękojeści dotknie poszerzonego końca
słomki.
• Lekko zacisnąć słomkę pomiędzy kciukiem a palcem i wysunąć urządzenie
wprowadzające.
• Nadal trzymając słomkę w tej samej pozycji, zamknąć otwarty koniec za
pomocą urządzenia SYMS.
• Za pomocą pincety przytrzymać słomkę w obszarze pałeczki manipulacyjnej.
• Szybko zanurzyć całą słomkę w ciekłym N2 w pozycji pionowej. Delikatnie
mieszać słomką w ciekłym N2 przez kilka sekund w celu uniknięcia powstania
izolującej warstwy powietrza wokół słomki.
Napełnić słomkę Cryolock w następujący sposób:
• Za pomocą mikropipety ostrożnie umieścić maksymalnie 2 zarodki na
wklęsłej powierzchni końcówki (po tej samej stronie co logo Cryolock) ok.
3 mm (1/8”) od krawędzi końcówki (kierować się czarnym oznaczeniem),
usuwając nadmiar krioprotektantu i pozostawiając możliwie jak najmniej
podłoża witryfikacyjnego (≤ 1 μl).
• Opcja A: Niezwłocznie i przed zanurzeniem słomki Cryolock w ciekłym
azocie LN2 ostrożnie umieścić końcówkę w nasadce, lekko obracając,
aż do osadzenia.
• Opcja B: Natychmiast zanurzyć końcówkę i nasadkę w ciekłym azocie
LN2. Poczekać, aż pęcherzyki przestaną się wydobywać, aby umożliwić
zrównoważenie. Ostrożnie umieścić końcówkę w nasadce, lekko
obracając, aż do jej osadzenia.
UWAGA: Opcja B nie jest dopuszczona do stosowania
w USA.
• Szybko zanurzyć słomkę Cryolock w ciekłym azocie.
UWAGA: Słomkę Cryolock należy zawsze przechowywać
z nasadką skierowaną do dołu.
11. Umieścić zwitryfikowaną słomkę CryoTip, HSV lub Cryolock w zanurzonej,
wypełnionej ciekłym azotem LN2 probówce kriogenicznej lub kubku (na pręcie
kriogenicznym). Zamknąć probówkę kriogeniczną (lub kubek) zatyczką lub
połączyć, po odwróceniu do góry dnem, z drugą, niezamkniętą probówką
kriogeniczną, aby zabezpieczyć zwitryfikowany wyrób w ciekłym azocie.
12. Przysunąć zbiornik z ciekłym azotem (LN2) blisko zamrażarki kriogenicznej LN2
i przenieść pręt kriogeniczny z zawartością do zamrażarki kriogenicznej w celu
długotrwałego przechowywania.
B. Protokół witryfikacji ZARODKÓW (PN do blastocysty):
1. Aseptycznie przenieść jedną 50 µl kroplę roztworu ES na odwrócone wieczko
szalki Petriego.
2. Wyjąć z inkubatora naczynko na posiew, zawierające zarodki i sprawdzić jakość
okazów pod mikroskopem. Jeżeli jest to możliwe, należy wybrać
tylko najlepszej jakości zarodki do witryfikacji.
3. Ostrożnie przenieść okaz (maks. 2 na raz) z minimalną ilością pożywki z naczynka
na posiew do kropli roztworu ES i włączyć stoper. Zarodki należy doprowadzić
powoli do stanu równowagi w kropli roztworu ES przez swobodne opadanie
w ciągu 6–10 minut.
Uwaga: Okaz ulegnie skurczeniu, a następnie stopniowo
będzie powracać do swojego oryginalnego rozmiaru, co
będzie oznaczało, że proces osiągania równowagi został
zakończony.
UWAGA: Zminimalizować działanie światła na okazy podczas
ustalania równowagi w kroplach roztworu ES i VS.
4. Podczas tego czasu osiągania równowagi w roztworze ES:
• przygotować jedną 50 µl kroplę roztworu VS, jak pokazano
na ryc. 8, i przygotować słomkę CryoTip, HSV lub
Cryolock do napełniania.
Postępować zgodnie z powyższym protokołem (część A —
Protokół witryfikacji oocytów (MII)) od etapu 9 do 12 dotyczących
poddawania działaniu roztworów VS, napełniania słomki
CryoTip, HSV lub Cryolock, zanurzania w ciekłym azocie LN2
i długotrwałego przechowywania.
WSKAZÓWKI UŻYCIA
Wymagania dot. składników zestawu Vit Kit-Freeze (na jedno zastosowanie):
• równoważący (ES):
60 µl w przypadku protokołu witryfikacji oocytów
Lub
50 µl w przypadku protokołu witryfikacji zarodków
• Roztwór witryfikujący (VS):
50 µl w przypadku protokołu witryfikacji
• 1 słomka CryoTip, HSV lub Cryolock (mieści maks. 2 okazy)
• 1 łącznik
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Witaminy
i minerały
Kwas askorbinowy
Kwas
p-aminobenzoesowy
Kalciferol
Kwas Nikotynowy
Amid kwasu
nikotynowego
MATERIAŁY WYMAGANE, ALE NIEZAŁĄCZONE
• Słomka CryoTip (nr kat. 40709), HSV (nr kat. 25246-25251) lub Cryolock™
(nr kat. CL-R-CT-B, CL-R-CT-G, CL-R-CT-C, CL-R-CT-Y, CL-R-CT-O) firmy
Irvine Scientific
• Łącznik firmy Irvine Scientific (nr kat. 40736) lub inny adapter
• Sterylne szalki Petriego (50 x 9 mm, Falcon 351006 lub odpowiednik)
• Probówki kriogeniczne (4,5 ml) lub kubki i pręty kriogeniczne
• Zmodyfikowana pożywka hodowlana HTF – HEPES (nr kat. 90126) uzupełniona
białkiem
• Hialuronidaza (nr kat. 90101)
• Rękawiczki jednorazowego użytku
• Strzykawka Hamilton GASTIGHT® (50 µl, nr kat. 80901) lub inne narzędzie
aspiracyjne
• Pipety transferowe (pipety szklane lub końcówki mikropipet o średnicy
wewnętrznej końcówki wynoszącej około 200 µm)
• Pinceta lub kleszczyki
• Impulsowa zgrzewarka wysokotemperaturowa
• Urządzenie SYMS dla słomki HSV
• Stoper lub inny odmierzacz czasowy
• Zbiornik na ciekły azot (naczynie Dewara lub pojemnik styropianowy z pokrywą,
pojemność 1–2 l)
• Ciekły azot (ilość wystarczająca do uzyskania 4 cali głębokości w zbiorniku)
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e á ásokka gyá o ak Ha á ozo an avaso hogy m nden
o yan ese ben am ko v ne Sc en fic ep odukc ós közeg
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és é e számá annak é dekében hogy enn a ha ó egyen a
kapcso a o a be eg és a e mék é e száma közö
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Krioprotektant
Sacharoza
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Glikol etylenowy
Dimetylosulfotlenek
Wszystkie wyniki są notowane na specyficznym dla danej partii świadectwie analizy,
które jest dostępne na żądanie.
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e s anda d n ézkedések magukba og a ák a dono ok
k vá asz ásá az egyed m n ák és a p azmakész e szű ésé
e őzés spec kus ma ke e e és ha ékony gyá ás
épések beép ésé a v usok nak vá ásá a e ávo ásá a
M ndezek e ené e az embe vé bő vagy p azmábó készü
gyógy e mékek beadásako a e őző ágensek á v e ének
ehe ősége nem zá ha ó k e esen Ez vona koz k az
sme e en vagy e me ü ő v usok a és kó okozók a s
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Proteina
Albumina (ludzka)
Każda partia zestawu Vit Kit - Freeze jest poddawana następującym testom:
Roztwory i słomki CryoTip.
Test na obecność endotoksyn przeprowadzany metodą LAL (Limulus Amebocyte
Lysate) (≤ 0,6 EU/ml)
Test na zarodku mysim (jedna komórka) (≥ 80% rozrost blastocysty)
Test na sterylność zgodnie z bieżącym testem na sterylność wg USP <71>
(powodzenie)
A ku a ás oda om e en eg az e z hogy az oocy ák és az
emb ók v fiká ásának hosszú ávú ha ása nem sme ek
DĖMES O
Substraty
energetyczne
Dekstroza
Inozytol
KONTROLA JAKOŚCI
Roztwory w zestawie Vit Kit – Freeze są filtrowane membranowo i przetwarzane
aseptycznie zgodnie ze zweryfikowanymi procedurami wytwarzania.
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Antybiotyki
Siarczan
Gentamycyny
Inne
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Tymina
Uracyl
Ksantyna
Adenozyna
Siarczan adeniny
2-dezoksy-D-ryboza
Ryboza
Wskaźnik pH
Czerwień fenolowa
m
m
Kwas pantotenowy
Ryboflawina
Pirydoksyna
Tiamina
D-biotyna
Alfa-tokoferol
Wodorosiarczyn Sodu
Przeciwutleniacz
Glutation
Bufor
Wodorowęglan sodu
HEPES
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m
SKŁAD
DL-fenyloalanina
DL-seryna
DL-treonina
DL-tryptofan
DL-walina
L-cysteina
L-hydroksyprolina
L-cystyny
Sole i jony
Chlorek sodu
Fosforan sodu
Chlorek potasu
Siarczan magnezu
Octan sodu
Fosforan sodu
Chlorek wapnia
Azotan Żelaza
Chlorek choliny
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OSTRZEŻENIE UE: Tylko do profesjonalnego użycia.
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Krioprotektáns
Szacharóz
Dextrán
Etilén-glikol
Dimetil-szulfoxid
SZÜKSÉGES, DE ITT NEM BIZTOSIÍTOTT ANYAGOK
• Irvine Scientific CryoTip (katalógusbeli szám: 40709) vagy HSV pipetta
(katalógusbeli szám: 25246-25251) vagy Cryolock™ (katalógusbeli szám:
CL-R-CT-B, CL-R-CT-G, CL-R-CT-C, CL-R-CT-Y, CL-R-CT-O)
• Irvine Scientific csatlakozó (katalógusbeli szám: 40736) vagy más adapter
• Steril Petri csészék (50 x 9 mm, Falkon 351006, vagy azzal ekvivalens)
• Kriocsövek (4,5 ml) vagy krioampullák és kriocsőtartók
• Módosított HTF - HEPES (katalógusszám: 90126) táptalaj hozzáadott
fehérjével
• Hialuronidáz (katalógusbeli szám: 90101)
• Egyszer használatos kesztyűk
• Hamilton GASTIGHT® fecskendő (50 µl, katalógusszám: 80901) vagy más
felszívó eszköz
• Transzfer pipetták (kihúzott üvegpipetták vagy mikropipetta hegyek ~200 µm
belső hegy átmérővel)
• Csipeszek
• SYMS tömítő a HSV pipetta eszközhöz
• Stopperóra vagy időmérő
• Cseppfolyós nitrogén tartálya (Dewar vagy Styrofoam edény fedővel, 1-2 l
űrtartalmú)
• Cseppfolyós nitrogén (elegendő mennyiség ahhoz, hogy a tartályban kb.
10cm mélységet elérjen)
Overige
Guanine
Hypoxanthine
Thymine
Uracil
Xanthine
Adenosine
Adeninesulfaat
2-Deoxy-D-ribose
Ribose
Alle resultaten worden gerapporteerd op een partijspecifiek Analysecertificaat
dat op verzoek beschikbaar is.
VEREISTE, MAAR NIET MEEGELEVERDE MATERIALEN
• Irvine Scientific CryoTip (catalogusnr. 40709) of HSV-rietje (catalogusnr.
25246-25251) of Cryolock™ (catalogusnr. CL-R-CT-B, CL-R-CT-G, CL-RCT-C, CL-R-CT-Y, CL-R-CT-O)
• Irvine Scientific Connector (catalogusnr. 40736) of een andere adapter
• Steriele petrischalen (50 X 9 mm, Falcon 351006 of gelijkwaardig)
• Cryobuisjes (4,5 ml) of bekers en cryohouders
• Gemodificeerd HTF - HEPES (catalogusnr. 90126) kweekmedium
aangevuld met eiwit
• Hyaluronidase (catalogusnr. 90101)
• Wegwerphandschoenen
• Hamilton GASTIGHT®-spuit (50 µl, catalogusnr. 80901) of een ander
opzuiginstrument
• Transferpipetten (geblazen glazen pipetten of micropipetpunten met een
inwendige puntdiameter van ~200 µm)
• Pincet of tang
• Impuls-heatsealer
• SYMS-afsluiter voor HSV-rietje
• Stopwatch of timer
• Tank met vloeibare stikstof (Dewar- of Styrofoam-container met deksel en
een inhoud van 1-2 L)
• Vloeibare stikstof (voldoende volume voor een tankvulling van 10 cm (4 inch)
GEBRUIKSAANWIJZING
Vit Kit-Freeze componenteisen (per toepassing):
60 µl voor oöcytvitrificatieprotocol
Of
50 µl voor embryovitrificatieprotocol
• Vitrificatieoplossing (VS):
50 µl voor vitrificatieprotocol
• 1 CryoTip of HSV-rietje of Cyrolock (slaat maximaal 2 monsters op)
• 1 Connector
Fehérjeforrás
Albumin (humán)
MINŐSÉGBIZTOSÍTÁS
A Vit Kit-Freeze oldatok membránszűrtek és aszeptikusan készültek validált
gyártási eljárásokkal.
A Vit Kit - Freeze minden egyes tételét ellenőrzik a következő tesztekkel:
Oldatok és CryoTip-k
Endotoxin by Limulus Amebocyte Lysate (LAL) módszer (≤0,6 EU/ml)
Egérembrió-próba (egy sejt) (≥ 80%-kal kibővített blasztociszta)
Sterilitás a jelenlegi USP sterilitási vizsgálattal <71> (Megfelelt).
Antioxidant
Glutathion
Elke partij Vit Kit - Freeze ondergaat de volgende testen:
Oplossingen en CryoTips.
Endotoxine door de Limulus Amebocyte Lysate (LAL)-methode (≤0,6 EU/mL)
Muisembryoassay (eencellig) (≥ 80% geëxpandeerde blastocyst)
Steriliteit volgens de huidige USP Sterility Test <71> (Pass)
ÖSSZETÉTEL
Pantoténsav
Riboflavin
Piridoxin
Tiamin
D-biotin
Alfa-Tokoferol
Nátrium-Biszulfit
Antibioticum
Gentamicinesulfaat
Energiesubstraten
Dextrose
Inositol
De oplossingen in de Vit Kit-Freeze zijn membraangefilterd en op aseptische
wijze bewerkt volgens productieprocedures die gevalideerd zijn.
A
DL-Szerin
DL-Treonin
DL-Triptofán
DL-Valin
L-Cisztein
L-Hidroxi-Prolin
L-Cisztin
Pyridoxine
Thiamine
D-biotine
Alfa-tocoferol
Natriumbisulfiet
KWALITEITSBORGING
Ezt a két oldatot egymást követően kell alkalmazni a lépésekben végrehajtott
mikrocsepp vitrifikációs protokollnak megfelelően.
Sók és Ionok
Nátrium-Klorid
Nátrium-Foszfát
Kálium-Klorid
Magnézium-Szulfát
Nátrium-Acetát
Kalcium-klorid
Vas-Nitrát
Kolin-Klorid
DL-Serine
DL-Threonine
DL-Tryptofaan
DL-Valine
L-Cysteïne
L-Hydroxyproline
L-Cystine
observatie tijdens de blootstelling en houd de punt van
het transferpipet bij de hand om een snelle overdracht
tussen VS druppels te garanderen. Raadpleeg Figuur 6.
9. Zuig, als equilibratie in ES is bereikt, een kleine hoeveelheid ES op in het
transferpipet en breng het (de) monster(s) met minimaal volume uit de
druppel ES over naar de druppel VS gedurende 5 seconden.
10. Vul en heatseal de CryoTip als volgt (Zie Figuur 7a):
• Schuif de metalen beschermhuls omhoog langs de CryoTip zodat het
uiteinde van de fijne, breekbare punt bloot komt te liggen.
• Pak de CryoTip en Hamilton-spuit vast, terwijl u deze onder de
microscoop observeert, en aspireer voorzichtig een klein volume VS
tot markeringnr. 1 op de CryoTip.
• Ga door met de observatie van het monster onder de microscoop en
aspireer het monster voorzichtig met VS tot aan markeringnr. 2 op
de CryoTip.
• Observeer de CryoTip nu rechtstreeks en aspireer meer VS tot aan
markeringnr. 3.
• Het monster moet zich tussen markeringnr. 2 en markeringnr. 3
bevinden.
•Heatseal (sealnr. 1) de CryoTip op (of net onder) markeringnr. 1
en schuif de beschermhuls terug omlaag om de fijne breekbare punt af
te dekken en te beschermen.
• Haal de CryoTip voorzichtig van het zuiginstrument en de adapter af en
heatseal (sealnr. 2) aan het brede uiteinde van de CryoTip boven de
markering markeringnr. 4.
• Dompel de bedekte CryoTip rechtstreeks in de vloeibare stikstof
(koelsnelheid -12,000 º C/min) (Zie Figuur 7b).
Vul het HSV-rietje en sluit het als volgt af:
• Plaats het monster/de monsters met behulp van een micropipet
voorzichtig in de gleuf van het capillaire staafje op 1 mm van het uiteinde.
De druppel die het monster/de monsters bevat moet minder dan 0,5 µl
zijn. Maximaal 2 oöcyten of embryo’s voor elk capillair staafje.
• Plaats het capillaire staafje en de geleider in het rietje en duw tot
het rechthoekige gedeelte van de geleider in contact komt met het
uitlopende uiteinde van het rietje.
• Klem het rietje voorzichtig tussen uw duim en wijsvinger en verwijder
de inbrenger.
• Terwijl u het rietje nog in dezelfde positie houdt, sluit u het open einde
af met behulp van een SYMS-afsluiter.
• Houd het rietje met behulp van een pincet vlakbij het geleidingsstaafje.
• Dompel het hele volledige rietje snel verticaal in LN2 onder. Schud het
rietje zachtjes een paar seconden in LN2 heen en weer om te voorkomen
dat zich een isolerende laag van luchtbellen om het rietje vormt.
Vul de Cryolock als volgt:
• Breng met behulp van een micropipet voorzichtig maximaal twee
embryo’s op het concave oppervlak van de punt (zelfde kant als
Cryolock logo) op ongeveer 3 mm (1/8”) vanaf de rand van de
punt aan (gebruik het zwarte teken als referentie) en verwijder
overtollige cryoprotectantoplossing door zo weinig mogelijk volume
vitrificatiemedium als mogelijk achter te laten (≤ 1 μL).
• Optie A: Breng onmiddellijk, en voordat de Cryolock in LN2 wordt
ondergedompeld, de punt in de dop aan en draai stevig vast tot hij
vast zit
• Optie B: Dompel de punt en de dop onmiddellijk in LN2 onder. Wacht
totdat het borrelen ophoudt om equilibratie toe te staan. Breng de
punt zorgvuldig in de dop aan en draai stevig genoeg vast tot hij
goed vast zit.
OPMERKING: Optie B niet goedgekeurd voor
gebruik in de Verenigde Staten
• Dompel de Cryolock snel in de vloeibare stikstof onder.
OPMERKING: Sla de Cryolock altijd op met de dop
naar beneden gericht.
11. Plaats de gevitrificeerde CryoTip, HSV-buisje of Cryolock in de
ondergedompelde, met LN2 gevulde cryohouder of beker (op het
cryostaafje). Sluit de cryohouder (of beker) af of maak hem ondersteboven
vast aan een andere onafgesloten cryohouder om het gevitrificeerde
hulpmiddel in vloeibare stikstof te verzekeren.
12. Zet de tank met vloeibare stikstof (LN2) dichtbij de LN2 cryovriezer en breng
de cryohouder met inhoud over naar de cryovriezer voor langdurige opslag.
B. EMBRYO’S (PN tot Blastocyst)
Vitrificatieprotocol:
1. Pipetteer op aseptische wijze één 50 µl druppel ES op een omgekeerd
deksel van een petrischaal.
2. Haal de kweekschaal met het (de) embryo(‘s) uit de incubator en controleer
de kwaliteit van het (de) monster(s) onder de microscoop. Kies, indien
mogelijk, uitsluitend het (de) embryo(’s) van de hoogste
kwaliteit voor vitrificatie.
3. Breng het monster (maximaal twee tegelijkertijd) met een minimaal volume
medium over van de kweekschaal naar de druppel ES en start de timer.
Embryo’s moeten langzaam equilibreren in de ES druppel middels vrije
val gedurende 6-10 minuten.
OPMERKING: het monster zal krimpen en dan geleidelijk
terugkeren naar zijn oorspronkelijke grootte; dit betekent
dat de equilibratie voltooid is.
VOORZICHTIG: beperk de blootstelling van het (de)
monster(s) aan licht tijdens equilibratie in ES en VS
druppels tot een minimum.
4. Tijdens deze equilibratietijd in ES:
• plaats een 50 µL druppel van de VS-oplossing zoals
aangegeven in Fig. 8 en maak de CryoTip, het HSVrietje of de Cyrolock gereed voor het vullen.
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V súčasnos
e a ú a uvádza že d hodobé úč nky
v fikác e na oocy y a emb yá n e sú známe
Nepouž va e ž adnu ašu k o á má po ušený s e ný oba
EÚ Š anda dné opa en a na p edchádzan e n ekc ám
spo eným s použ van m med c nskych p oduk ov
p p avených z udske k v a ebo p azmy zah ňa ú výbe
da cov sk n ng edno vých da ov a zd o ov p azmy
oh adom špec ckých ma ke ov n ekc e a za aden e
úč nných vý obných k okov na nak vác u ods ánen e
v usov Nap ek omu keď sa podáva ú p oduk y
p p avené z udske k v a ebo p azmy n e e možné
úp ne vy úč možnos p enosu n ekčných č n e ov To
sa ež vz ahu e na neznáme a ebo eme gen né v usy a
né pa ogény Neex s u ú záznamy o po v denom p enose
v usov s a bum nom vy obeným pod a špec kác
Eu ópskeho ekop su s anoveným pos upm Ve m sa
odpo úča aby sa vždy p podan ku vačných méd
v ne Sc en c Rep oduc ve Med a P oduc s pac en ov
zaznamena názov a č s o ša že aby sa zachova o
spo en e medz pac en om a ša žou p oduk u
USA Ten o p oduk obsahu e udský sé ový a bum n
HSA Ma e á z udských zd o ov použ ý p vý obe oh o
p oduk u bo es ovaný pomocu súp av cencovaných
ú adom FDA a ukáza sa ako ne eak vny voč p o á kam
p o hepa de C HCV a p o á kam voč v usu udského
munodefic u H V Avšak ž adny es neponúka úp nú
zá uku že sú p oduk y vy obené z udských zd o ov
ne n ekčné So vše kým udským ma e á om zobchádza e
ak ako by bo schopný p en es n ekc u použ m
un ve zá nych bezpečnos ných opa en Da cov a
zd o ového ma e á u bo
ež sk novan oh adom
C eu z e d Jakobove cho oby CJD
KONTRA ND KÁC E
P oduk obsahu e gen am c n su á Aby sa za s o že
pac en n e e p ec vený na o o an b o kum e po ebné
použ p s ušné bezpečnos né opa en a

Vitrification Freeze Kit (Vit Kit® - Freeze)

Transcripción

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