Rev Hematol Méx 2015 - Agrupación Mexicana para el Estudio de
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VOLUMEN 16, NÚM. 2, Abril-Junio 2015 Revista de Hematología Volumen 16 abril-junio 2015 volúmen 9 EDITORIAL 105 El seguimiento óptimo de los pacientes con enfermedades de las células plasmáticas Morie A Gertz ARTÍCULOS ORIGINALES 109 115 121 Epidemiología de los linfomas del Centro Estatal de Cancerología de Nayarit Carlos S Ron-Guerrero, Ana Lucía Ron-Magaña, Carmen L Medina-Palacios, Fernando López-Flores Variaciones en los alelos 677 C>T y 1298 A>C en el gen que codifica para la enzima 5,10 metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) y su efecto en la concentración de homocisteína en mestizos mexicanos Israel Parra-Ortega, Margarita Martínez-Arias, Karina López-Valladares, José Luis Sánchez-Huerta, Leticia Barrera-Dávila, Vicencio Juárez-Barreto, Briceida López-Martínez Método cromogénico modificado para medir la actividad anti-Xa en pacientes ictéricos Diana Noemí García-de Paoletti, Mariano Eduardo Paoletti, Eduardo Armando Paoletti, Elisabeth Aloni-Risana, Julio Guillermo Soto, Carlos Alberto Barassi, María Alejandra Pereyra, María Fernanda Cerviño, Lisbbett Suárez-González, Daniel Mielgo ARTÍCULOS DE REVISIÓN 128 143 152 168 Plasma rico en factores de crecimiento plaquetario. Una nueva puerta a la Medicina regenerativa Jesús Alcaraz-Rubio, Antonio Oliver-Iguacel, Juana María Sánchez López Cadenas ligeras: ¿totales o libres? Qué medir y por qué Florencia Delgado FLT3, NPM1 y C/EBPα como marcadores de pronóstico en pacientes con leucemia mieloide aguda Francisco Alejandro Lagunas-Rangel, Víctor Alfredo Pérez-Contreras, Carlos Cortés-Penagos Estado del arte: metformina, cáncer y leucemia Christian Omar Ramos-Peñafiel, Adrián Santoyo-Sánchez, Irma Olarte-Carrillo, Gloria Eugenia Queipo-García, Yonathan Garfias-Becerra, Adolfo Martínez-Tovar IN MEMORIAM 179 Doctor Elías Jiménez Fonseca Rafael Jiménez-Bonilla CARTA AL EDITOR 182 Quimioterapia sin radioterapia en el tratamiento de los estadios iniciales del linfoma de Hodgkin Guillermo J Ruiz-Arguelles REVISTA DE HEMATOLOGÍA Publicación de la Agrupación Mexicana para el Estudio de la Hematología, A.C. 2 2015 Revista de H ematología Rev Hematol Mex 2015;16:abril-junio EDITOR PRESIDENTE Guillermo J. RUIZ-ARGÜELLES. Puebla, México Dr. J. Ramón RIVAS-LLAMAS VICEPRESIDENTE COMITÉ EDITORIAL Dra. Adolfina BERGES-GARCÍA Álvaro AGUAYO. Ciudad de México, México Javier BOLAÑOS-MEADE. Baltimore, EUA Jorge CORTÉS. Houston, EUA Aurora DE-LA-PEÑA. Ciudad de México, México Sergio GIRALT. Nueva York, EUA David GÓMEZ-ALMAGUER. Monterrey, México Renán A. GÓNGORA-BIACHI. Mérida, México Bertha IBARRA. Guadalajara, México José Carlos JAIME-PÉREZ. Monterrey, México Francesco Lo COCO. Roma, Italia Xavier LÓPEZ-KARPOVITCH. Ciudad de México, México Alejandro MADRIGAL. Londres, Inglaterra Carlos MARTÍNEZ-MURILLO. Ciudad de México, México Héctor MAYANI. Ciudad de México, México Rubén A. MESA. Scottsdale, EUA José María MORALEDA. Murcia, España Rubén NIESVIZKY. Nueva York, EUA Guillermo J. RUIZ-DELGADO. Puebla, México Arlette RUIZ-de-SAEZ, Caracas, Venezuela Jesús F. SAN-MIGUEL. Salamanca, España Luz del Carmen TARIN-ARZAGA. Monterrey, México Enrique TORRE-LÓPEZ. San Luis Potosí, México José Francisco TOMAS. Madrid, España Jorge VELA-OJEDA. Ciudad de México, México Luis A. VILLELA. Monterrey, México SECRETARIA Dra. Nidia P. ZAPATA-CANTO TESORERO Dr. Ignacio AGUIRRE-AGUIRRE VOCAL DE ACTIVIDADES ACADÉMICAS Dr. Guillermo J. RUIZ-DELGADO VOCAL DE MEMBRESÍA Dr. Jorge DUQUE-RODRÍGUEZ Coordinadora Académica Q.F.B. Josefa Piedras-Ross Coordinadora administrativa Mayra OVIEDO-PELL Revista de Hematología, año 16, número 2, abril-junio 2015, es una publicación trimestral editada por la Agrupación Mexicana para el Estudio de la Hematología, A.C. San Francisco 1626, Desp. 406, Colonia Del Valle, Delegación Benito Juárez, CP 03100, México, DF. Tel.: 52 (55) 55241112, 52 (55) 5534-1856, www.amehac.org. Editor responsable: Guillermo J Ruiz-Argüelles. Reserva de Derechos al Uso Exclusivo otorgado por el Instituto Nacional del Derecho de Autor, en trámite. ISSN, otorgado por el Instituto Nacional del Derecho de Autor, en trámite. Certificado de Licitud de Título en trámite. Certificado de Licitud de Contenido en trámite, otorgados por la Comisión Calificadora de Publicaciones y Revistas Ilustradas de la Secretaría de Gobernación. Autorización como Publicación Periódica por Sepomex en trámite. Impresa en Roma Color SA de CV. Pascual Orozco 70, colonia San Miguel Iztacalco, CP 08650, México, DF. Este número se terminó de imprimir el 10 de julio de 2015, con un tiraje de 500 ejemplares. Las opiniones expresadas por los autores no necesariamente reflejan la postura del editor de la publicación. Queda estrictamente prohibida la reproducción total o parcial de los contenidos e imágenes de la publicación sin previa autorización de la Agrupación Mexicana para el Estudio de la Hematología, A.C. Editada y distribuida por Edición y Farmacia SA de CV. José Martí 55, Colonia Escandón, Delegación Miguel Hidalgo, CP 11800, México, DF. Tel.: 5678-2811, www.nietoeditores.com.mx. www.nietoeditores.com.mx Volumen 16, Núm. 2, abril-junio, 2015 CONTENIDO CONTENTS EDITORIAL EDITORIAL 105 105 El seguimiento óptimo de los pacientes con enfermedades de las células plasmáticas Morie A Gertz Optimizing the monitoring of patients with plasma cell dyscrasias Morie A Gertz ARTÍCULOS ORIGINALES ORIGINAL ARTICLES 109 109 115 121 Epidemiología de los linfomas del Centro Estatal de Cancerología de Nayarit Carlos S Ron-Guerrero, Ana Lucía Ron-Magaña, Carmen L Medina-Palacios, Fernando López-Flores Variaciones en los alelos 677 C>T y 1298 A>C en el gen que codifica para la enzima 5,10 metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) y su efecto en la concentración de homocisteína en mestizos mexicanos Israel Parra-Ortega, Margarita Martínez-Arias, Karina López-Valladares, José Luis Sánchez-Huerta, Leticia Barrera-Dávila, Vicencio Juárez-Barreto, Briceida López-Martínez Método cromogénico modificado para medir la actividad anti-Xa en pacientes ictéricos Diana Noemí García-de Paoletti, Mariano Eduardo Paoletti, Eduardo Armando Paoletti, Elisabeth AloniRisana, Julio Guillermo Soto, Carlos Alberto Barassi, María Alejandra Pereyra, María Fernanda Cerviño, Lisbbett Suárez-González, Daniel Mielgo 115 121 REVIEW ARTICLES ARTÍCULOS DE REVISIÓN 128 128 143 152 168 Plasma rico en factores de crecimiento plaquetario. Una nueva puerta a la Medicina regenerativa Jesús Alcaraz-Rubio, Antonio Oliver-Iguacel, Juana María Sánchez López Cadenas ligeras: ¿totales o libres? Qué medir y por qué Florencia Delgado FLT3, NPM1 y C/EBPα como marcadores de pronóstico en pacientes con leucemia mieloide aguda Francisco Alejandro Lagunas-Rangel, Víctor Alfredo Pérez-Contreras, Carlos Cortés-Penagos Estado del arte: metformina, cáncer y leucemia Christian Omar Ramos-Peñafiel, Adrián SantoyoSánchez, Irma Olarte-Carrillo, Gloria Eugenia Queipo-García, Yonathan Garfias-Becerra, Adolfo Martínez-Tovar IN MEMORIAM 179 Doctor Elías Jiménez Fonseca Rafael Jiménez-Bonilla 143 152 168 179 Doctor Elías Jiménez Fonseca Rafael Jiménez-Bonilla LETTER TO THE EDITOR 182 182 Platelet-rich plasma in growth factors. A new door to regenerative Medicine Jesús Alcaraz-Rubio, Antonio Oliver-Iguacel, Juana María Sánchez López Light chains. Total or free? Which ones should be measured Florencia Delgado FLT3, NPM1 y C/EBPα as prognosis markers in patients with acute myeloid leukemia Francisco Alejandro Lagunas-Rangel, Víctor Alfredo Pérez-Contreras, Carlos Cortés-Penagos State of the art: Metformin, cancer and leukemia Christian Omar Ramos-Peñafiel, Adrián SantoyoSánchez, Irma Olarte-Carrillo, Gloria Eugenia Queipo-García, Yonathan Garfias-Becerra, Adolfo Martínez-Tovar IN MEMORIAM CARTA AL EDITOR Quimioterapia sin radioterapia en el tratamiento de los estadios iniciales del linfoma de Hodgkin Guillermo J Ruiz-Arguelles Epidemiology of lymphomas in Nayarit, Mexico Carlos S Ron-Guerrero, Ana Lucía Ron-Magaña, Carmen L Medina-Palacios, Fernando López-Flores Variations in alleles 677C>T and 1298A>C in gene encoding 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase and its impact on the value of homocysteine in Mexican mestizos Israel Parra-Ortega, Margarita Martínez-Arias, Karina López-Valladares, José Luis Sánchez-Huerta, Leticia Barrera-Dávila, Vicencio Juárez-Barreto, Briceida López-Martínez Modified chromogenic method to assess anti-Xa activity in jaundiced patients Diana Noemí García-de Paoletti, Mariano Eduardo Paoletti, Eduardo Armando Paoletti, Elisabeth AloniRisana, Julio Guillermo Soto, Carlos Alberto Barassi, María Alejandra Pereyra, María Fernanda Cerviño, Lisbbett Suárez-González, Daniel Mielgo Chemotherapy alone in early stage Hodgkin’s lymphoma Guillermo J Ruiz-Arguelles www.nietoeditores.com.mx Editorial Rev Hematol Mex 2015;16:105-108. Optimizing the monitoring of patients with plasma cell dyscrasias Morie A Gertz Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, MN. El seguimiento óptimo de los pacientes con enfermedades de las células plasmáticas INTRODUCTION In the United States, multiple myeloma is the 14th most common cancer with an estimated 24,050 patients diagnosed in 2014. Myeloma represents 1.4% of all new cancer in the United States with a median age at diagnosis of 69 and a median age at death of 75. The five-year survival for the years 2004 through 2010 is 44.9%. With the introduction of novel agents, deep responses ≥nCR are now approaching 60%. The assessment of patients with multiple myeloma has utilized measurement of either the M-spike or the quantitative heavy chain by nephelometry. These techniques, based on 1960s technology, have major drawbacks. The half-life of IgG is 25.8 days.1 As a consequence, confirmation of a >90% reduction in M protein (VGPR) can take 10 weeks, even when marked cytoreduction of the myeloma population has occurred. This delay is not consistent with an individualized management strategy for myeloma patients. The normal level for IgG in human serum is 15,000 mg/L and for IgM 500 mg/L. The visual detection of a monoclonal peak on a serum protein electrophoresis can occur with levels as low as 2,000 mg/L. However, particularly for IgA monoclonal proteins that migrate in the beta region, transferrin, C3, and beta lipoprotein interfere with the estimates of the Mspike.2 At low levels, immunoglobulin levels cannot distinguish polyclonal from the myeloma immunoglobulin. Immunofixation is ten times more sensitive than serum protein electrophoresis, allowing the recognition of a monoclonal band at 200 mg/L. Unfortunately, this technique is qualitative and not quantitative and can only determine the presence or absence of www.nietoeditores.com.mx Correspondence: Morie A Gertz, MD, MACP Mayo Clinic 200 First Street, SW Division of Hematology Siebens 670 Roland Seidler Jr. Professor Chair, Department of Medicine College of Medicine Mayo Distinguished Clinician Rochester, MN 55905 [email protected] This article must be quoted Gertz MA. Optimizing the monitoring of patients with plasma cell dyscrasias. Rev Hematol Mex 2015;16:105-108. 105 Revista de Hematología a band. The reproducibility of a 24-hour urine requires accurate collection, is dependent on the level of renal function, and is a sample that most laboratories find undesirable for processing. Over the past decade, the introduction of the immunoglobulin free light chain nephelometric assay allows reproducible measurements of the immunoglobulin free light chain down to 10 mg/L, making it 200 times more sensitive than serum protein electrophoresis and 20-fold more sensitive than immunofixation. The coefficient of variation of the test is <3%. The total kappa/lambda light chain quantification in the monitoring of patients with multiple myeloma found that the assay was not more sensitive than immunofixation.3 The immunoglobulin free light chain assay uses an antibody that only recognizes the epitopes present on the internally facing light chain that is not exposed in an intact immunoglobulin molecule. This led to the recognition of light chain monoclonal gammopathy of undetermined significance. It is found in 3.3% of patients who are routinely screened, with a prevalence of 0.8% and a risk of progression to multiple myeloma of 0.3%/100 person years. Light chain MGUS is a particular risk factor for the development of AL amyloidosis as it was found in 11 of 20 patients who ultimately developed AL. Use in MGUS/SMM An abnormal free light chain ratio, when combined with the size of the M-spike, by serum protein electrophoresis (>1.5 g/dL) and immunofixation (IgG or non-IgG) will classify MGUS patients into three distinct categories with an annual risk of transformation of approximately 0.5% per year, 1% per year, and 2% per year. Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 and a serum M protein of >3 g/dL is considered high risk. The International Myeloma Working Group has adopted iFLC/uFLC >100 as a defining feature for active myeloma and an indication for immediate chemotherapy in the absence of CRAB symptoms (hypercalcemia, cast nephropathy, anemia, and bone disease). Light chain assay as a leading indicator of response and relapse The short half-life of the free light chain assay allows rapid assessment of response such that within two weeks of therapy initiation, it is possible to estimate progression-free survival based on the iFLC.4 Other groups have demonstrated the predictive value of free light chains measured after two cycles of chemotherapy. Overall survival could be estimated at the end of eight weeks.5 In one trial, 54 of 520 patients presented with an intact immunoglobulin, myeloma progression was heralded by a rise in the free light chains.6 The sensitivity of the free light chain assay has eliminated the need for regular monitoring of the 24-hour urine in patients with light chain myeloma and has reduced the need for using bone marrow biopsies for assessing patients with multiple myeloma.7 In one trial of 428 patients with a monoclonal gammopathy, discontinuation of urine studies and reliance on an algorithm using serum studies alone failed to detect 0.5% of patients with urinary monoclonal proteins.8 A review of eligibility criteria in clinicaltrials.gov demonstrates that the immunoglobulin free light chain has been incorporated into the eligibility criteria for clinical trials. The frequency of nonsecretory myeloma, previously quoted as high as 5% of myeloma patients,9 has now fallen to 0.5%. Use in solitary plasmacytoma In smoldering multiple myeloma, the light chain ratio also predicts the risk of progression. An iFLC/uFLC ratio >8 with >10% plasma cells 106 An abnormal involved serum free light chain value in the presence of solitary plasma- Editorial cytoma is an important risk factor for the development of multiple myeloma with 64% of patients having an abnormal serum free light chain ratio at diagnosis.10 In a cohort of 116 patients, the risk of progression at five years was 44% in patients with an abnormal free light compared to 26% in those with a normal free light ratio. 11 Amyloidosis The light chain has revolutionized the diagnosis, staging, and monitoring of patients with immunoglobulin light chain amyloidosis. Unlike multiple myeloma, only 40% of patients with amyloidosis have a detectable immunoglobulin heavy chain in the serum. The quantity of heavy chain is small, rarely >3 g/dL, with a median <1 g/dL. Prior to the light chain assay, it was difficult to assess hematologic response. An immunoglobulin free light chain abnormality is found in 98% of patients with amyloidosis, and changes in the light chain have become integrated into the hematologic response criteria. Light chain measurements are also part of the staging system of AL. A dFLC of >180 mg/L, when combined with the cardiac biomarkers NT-proBNP and troponin, create a reliable separation of patients into four groups with markedly different median survivals. The light chain levels are also prognostic for survival, reflecting the size of the plasma cell clone responsible for amyloid protein synthesis. Cast nephropathy Immunoglobulin free light chains in the serum are predictive for the risk of development of myeloma cast nephropathy. It would be uncommon to see cast nephropathy develop if the involved free light chain is <500 mg/L, and patients who have a normal free light chain level have no risk of cast nephropathy.12 Other plasma cell disorders The serum immunoglobulin free light chain was measured in 83 patients with newly diagnosed POEMS syndrome. Sixty-seven percent showed an elevated serum free lambda light chain level. Patients with POEMS frequently have a component of polyclonal hyperglobulinemia, making the measurement of the involved serum free light chain a useful adjunct in assessment.13 The free light chain assay has been used in Waldenström macroglobulinemia, to predict response and progression earlier than changes in the IgM or the M-spike.14 The serum free light chain correlates with tumor burden markers and is capable of differentiating IgM MGUS from Waldenström macroglobulinemia.15 Cost effective use Although a valuable test, it is relatively expensive compared to traditional measures. Although, in large statistical models the ratio has been promoted as the ideal method of monitoring, I actually find the ratio to be confusing. Small changes in the uninvolved immunoglobulin light chain can cause large swings in the ratio, which can be misleading. Renal failure impacts the level of the immunoglobulin light chain. However, when measured serially over time, the involved free light chain level can be utilized to monitor the disease process. When resources are an issue, I believe it is justified to serially measure only the involved free light chain and ignore the uninvolved free light chain. This decreases the cost of the assay by 50%. CONCLUSION The introduction of the immunoglobulin free light chain test has eliminated the need for 24-hour urine protein electrophoresis.16 It is important in assessing prognosis and risk of transformation in 107 Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 Revista de Hematología MGUS and smoldering myeloma. The free light chain assay is now standard for clinical trials in multiple myeloma and has redefined patients who are asymptomatic but for whom immediate therapeutic intervention is indicated.17 The use of the light chain assay will identify patients at risk for the development of light chain amyloidosis; and in AL, it is part of the staging and response criteria. Nonsecretory and oligosecretory disease is now rare. The assay is an important indicator of early response and relapse. It should be routine in all patients with a plasma cell disorder. REFERENCES 1. Mankarious S, Lee M, Fischer S, et al. The half-lives of IgG subclasses and specific antibodies in patients with primary immunodeficiency who are receiving intravenously administered immunoglobulin. J Lab Clin Med 1988;112:634640. 2. Calderon B. Heavy/light chain assay for monitoring IgA multiple myeloma: digging out the IgA from the beta region. Clin Chem 2015;61:317-318. 3. Zamora-Ortiz G, Velazquez-Sanchez-de-Cima S, Hernandez-Reyes J, et al. Poor performance of the total kappa/ lambda light chain quantification in the diagnosis and follow-up of patients with multiple myeloma. Rev Invest Clin 2014;66:314-318. 4. 5. 6. 108 Vij R, Wang M, Jagannath S, et al. Serum free light chain reduction correlates with response and progression-free survival following carfilzomib therapy in relapsed/refractory multiple myeloma. Leuk Lymphoma 2015:1-12. Yagci M, Karakaya F, Suyani E, Haznedar R. Serum free light chain response after 2 courses of induction chemotherapy predicts prognosis in myeloma patients. Clin Lymphoma Myeloma Leuk 2015;15:98-102. Brioli A, Giles H, Pawlyn C, et al. Serum free immunoglobulin light chain evaluation as a marker of impact from intraclonal heterogeneity on myeloma outcome. Blood 2014;123:3414-3419. 7. Dispenzieri A, Kyle R, Merlini G, et al. International Myeloma Working Group guidelines for serum-free light chain analysis in multiple myeloma and related disorders. Leukemia 2009;23:215-224. 8. Katzmann JA, Dispenzieri A, Kyle RA, et al. Elimination of the need for urine studies in the screening algorithm for monoclonal gammopathies by using serum immunofixation and free light chain assays. Mayo Clinic Proceedings 2006;81:1575-1578. 9. Terpos E, Apperley JF, Samson D, et al. Autologous stem cell transplantation in multiple myeloma: improved survival in nonsecretory multiple myeloma but lack of influence of age, status at transplant, previous treatment and conditioning regimen. A single-centre experience in 127 patients. Bone Marrow Transplant 2003;31:163-170. 10. Fouquet G, Guidez S, Herbaux C, et al. Impact of initial FDGPET/CT and serum-free light chain on transformation of conventionally defined solitary plasmacytoma to multiple myeloma. Clin Cancer Res 2014;20:3254-3260. 11. Dingli D, Kyle RA, Rajkumar SV, et al. Immunoglobulin free light chains and solitary plasmacytoma of bone. Blood 2006;108:1979-1983. 12. Hutchison CA, Cockwell P, Cook M. Diagnostic accuracy of monoclonal antibody based serum immunoglobulin free light chain immunoassays in myeloma cast nephropathy. BMC Clin Pathol 2012;12:12. 13. Wang C, Su W, Zhang W, et al. Serum immunoglobulin free light chain and heavy/light chain measurements in POEMS syndrome. Ann Hematol 2014;93:1201-1206. 14. Leleu X, Xie W, Bagshaw M, et al. The role of serum immunoglobulin free light chain in response and progression in waldenstrom macroglobulinemia. Clin Cancer Res 2011;17:3013-3018. 15. Leleu X, Moreau AS, Weller E, et al. Serum immunoglobulin free light chain correlates with tumor burden markers in Waldenstrom macroglobulinemia. Leuk Lymphoma 2008;49:1104-1107. 16. Jenner E. Serum free light chains in clinical laboratory diagnostics. Clin Chim Acta 2014;427:15-20. 17. Rajkumar SV, Dimopoulos MA, Palumbo A, et al. International Myeloma Working Group updated criteria for the diagnosis of multiple myeloma. Lancet Oncol 2014;15:e538e548. Artículo original Rev Hematol Mex 2015;16:109-114. Epidemiología de los linfomas del Centro Estatal de Cancerología de Nayarit RESUMEN Antecedentes: los linfomas son un grupo heterogéneo de malignidades; su incidencia ha aumentado 2 a 3% en las últimas décadas en todo el mundo. El desarrollo molecular y de la inmunogenética ha repercutido positivamente en la clasificación y pronóstico de estas enfermedades. Carlos S Ron-Guerrero1 Ana Lucía Ron-Magaña2 Carmen L Medina-Palacios3 Fernando López-Flores4 Centro Estatal de Cancerología de Nayarit, México. Hospital Civil de Guadalajara Fray Antonio Alcalde. 3 Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Nayarit. 4 Epidemiología de los Servicios de Salud de Nayarit, México. 1 2 Objetivo: describir aspectos epidemiológicos y analizar la tendencia de los linfomas de pacientes atendidos en el Centro Estatal de Cancerología de los Servicios de Salud de Nayarit. Material y método: estudio retrospectivo y analítico en el que se revisaron los expedientes de pacientes con linfoma, de enero de 2011 a diciembre de 2014; los datos se resumieron mediante las medidas de tendencia central, desviación estándar y porcentajes, además, se calculó la supervivencia de los pacientes y la mortalidad acumulada con el método de Kaplan y Meier. Resultados: se obtuvieron 81 casos con linfoma, incidencia de 3.4/100,000/año, 47.7% ocurrió en los varones y 54.3% en las mujeres. Se estimó la supervivencia libre de enfermedad a 60 meses en 73% de los adultos. La edad promedio para ambos géneros fue de 57.8 ± 15.6 años, correspondiendo para las mujeres 59.3 ± 16.18 años y para los hombres 55.51 ± 14.54 años. En relación con los linfomas de células B grandes, en hombres afectó a 16 de 30 con edad media de 57.7 ± 12.9 años y en las mujeres afectó a 14 de 30 con edad media de 56.2 ± 17.2 años. La supervivencia libre de enfermedad a 60 meses fue de 70%. Conclusiones: los linfomas ocurrieron en la misma frecuencia que lo comunicado en la bibliografía mundial; sin embargo, en nuestra casuística fueron más comunes en mujeres. Las edades medias también fueron ligeramente menores en ambos géneros. La supervivencia y curación fueron las mismas que lo reportado en la bibliografía mundial cuando se administra rituximab. Palabras clave: linfomas, epidemiología, Nayarit. Recibido: 10 de diciembre 2014 Aceptado: 30 de enero 2015 Correspondencia: Dr. Carlos S Ron Guerrero Epidemiology of lymphomas in Nayarit, Mexico ABSTRACT Background: Lymphomas are a heterogeneous group of malignancies, its incidence has increased from 2-3% in recent decades worldwide. www.nietoeditores.com.mx Av. Enfermería s/n 63170 Tepic, Nayarit, México [email protected] Este artículo debe citarse como Ron-Guerrero CS, Ron-Magaña AL, Medina-Palacios CL, López-Flores F. Epidemiología de los linfomas del Centro Estatal de Cancerología de Nayarit. Rev Hematol Mex 2015;16:109-114. 109 Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 Revista de Hematología The molecular and immuno-genetic development has a positive impact on the classification and prognosis of these diseases. Objective: To describe and analyze the epidemiological trend of lymphoma patients treated at the Cancer Center of State Health Services of Nayarit, Mexico. Material and method: A retrospective and analytical study in which records of lymphoma patients were reviewed from January 2011 to December 2014 and data were summarized using measures of central tendency, standard deviation and percentages, and also the survival of patients and the cumulative mortality were calculated with the method of Kaplan and Meier. Results: Eighty-one cases with lymphoma, incidence of 3.4/100,000/ year; 39 were males. Diffuse large B-cell lymphoma was the most common (n=30). The average age with standard deviation for both genders was 57.8 ± 15.6 years, corresponding to women 59.3 ± 16.18 years and for men 55.51 ± 14.54 years. Regarding the diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL), there was slight predominance in males (16/30), average age of 57.7 ± 12.9 years, as women (14/30), average age of 56.2 ± 17.2 years. Disease-free survival at 60 months was estimated of 70% . Conclusions: Lymphomas are presented at the same frequency as that reported in the literature; however, in our study they were more common in women. The middle ages are also slightly younger in both genders. Survival and cure were the same as reported in the literature, when rituximab is used. Key words: lymphomas, epidemiology, Nayarit, Mexico. ANTECEDENTES Los linfomas son un grupo heterogéneo de malignidades, que derivan de las células B, células T o de las células NK. Ocupan el quinto lugar de los tumores malignos más frecuentes en Estados Unidos, con 74,490 nuevos casos en 2009.1 La incidencia de los linfomas ha aumentado estadísticamente en las últimas décadas, de 2 a 3% por año. Aproximadamente 85% de los casos son linfomas no Hodgkin y 15% corresponde a linfomas de Hodgkin. Los linfomas no Hodgkin, con una ocurrencia estimada de 65,980 nuevos casos cada año, representan 4% de todos los casos nuevos de cáncer en Estados Unidos.1 La incidencia es 110 mayor en hombres y se incrementa con la edad. Los factores que contribuyen a esa incidencia en aumento de los linfomas incluyen la población con síndrome de inmunodeficiencia humana, quienes están en mayor riesgo de padecer un linfoma. Sin embargo, esa población explica en 50% el aumento de los linfomas; otras razones de ese aumento de los linfomas se desconocen o se entienden escasamente. Las toxinas del medio ambiente probablemente son factores causales importantes. Los linfomas no Hodgkin también afectan a pacientes con estados inmunodepresores y con enfermedades autoinmunitarias.2,3 La infección por el virus de Epstein-Barr está implicada en la mayor parte de las enfermedades linfoproliferativas; además del VIH, otros virus y gérmenes están implicados, como el virus Ron-Guerrero CS y col. Epidemiología de los linfomas en Nayarit linfotrópico de células T humano tipo I, virus de la hepatitis C, Helicobacter pylori, herpes virus humano tipo 8, Borrelia burgdorferi, Chlamydia psittaci y Campylobacter jejuni.4,5 tajes. Además, se calculó la supervivencia de los pacientes y la mortalidad acumulada mediante el método de Kaplan y Meier. RESULTADOS El avance en las técnicas diagnósticas moleculares ha incrementado la precisión del diagnóstico y la identificación de subtipos con diferentes respuestas terapéuticas. Por ejemplo, en el linfoma difuso de células B grandes, solamente una tercera parte de los pacientes se curan con ciclofosfamida, hidroxidaunorubicina, vincristina (Oncovin®) y prednisona (CHOP), y cerca de la mitad se curan cuando se agrega rituximab (CHOP-R).6 Sin embargo, el seguimiento a largo plazo mostró que la supervivencia a 5 y 10 años no era diferente a la del tratamiento con CHOP sin rituximab.7 El objetivo de este artículo es conocer el comportamiento local de la supervivencia y las características epidemiológicas de los pacientes con linfoma atendidos en el Servicio de Hematología del Centro Estatal de Cancerología de los Servicios de Salud de Nayarit, México, en un periodo de cuatro años. MATERIAL Y MÉTODO Estudio en el que se revisaron los expedientes del Servicio de Hematología del Centro Estatal de Cancerología de Nayarit, del 1 de enero de 2011 al 31 de diciembre de 2014, y se analizaron todos los expedientes de los pacientes de todas las edades y géneros que habían ingresado con el diagnóstico de linfoma. Luego se agruparon en dos: mayores de 18 años (adultos) y de 18 años o menos (niños), se separaron por género, tipo y subtipo de linfoma. Análisis estadístico Los datos se resumieron mediante las medidas de tendencia central, desviación estándar y porcen- Se identificaron 81 linfomas, 75 linfomas no Hodgkin y 6 linfomas de Hodgkin. Se encontraron 71 linfomas de células B y 10 de células T (Cuadro 1). De los linfomas, 69 correspondieron a pacientes mayores de 18 años y 22 a menores de 18 años. Con incidencia de 20.2 linfomas por año, corresponde a una incidencia de 3.4 linfomas por 100,000 habitantes por año. Treinta y siete linfomas correspondieron a hombres y 44 a mujeres. El linfoma difuso de células B grandes (LDCBG) fue el más frecuente (n=30), le siguió el linfoma difuso de células B pequeñas con 18 pacientes, 8 fueron linfomas foliculares. No fue posible identificar el subtipo de 7 linfomas. El resto (n=18) correspondió a otros linfomas (Figura 1). La distribución de los linfomas por género fue de 37 en hombres contra 44 en las mujeres. La edad promedio en los adultos en ambos géneros fue de 57.8 ± 15.6 años; en las mujeres fue de 59.3 ± 16.18 años y en los hombres de 55.51 ± 14.54 años. En relación con los linfomas difusos de células B grandes hubo ligero predominio en hombres Cuadro 1. Distribución de los linfomas Tipo de linfoma No Hodgkin De Hodgkin De células B De células T Núm. 75 6 71 10 111 Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 Revista de Hematología 8 7 7 3 1 2 2 2 1 Li n LD CB fo LD G m a CB fo lic P L ula no r id en LC CT LP M C AL B T ga LN s H -T Li n f Bu r ob ki la tt sto m LN a H -A 35 30 30 25 18 20 15 10 5 0 Figura 1. Distribución de los linfomas no Hodgkin. LDCBG: linfoma difuso de células B grandes; LDCBP: linfoma difuso de células B pequeñas; L no iden: linfomas no identificados; LCCT: linfoma cutáneo de células T; LPCB: linfoma plasmocitoide de células B; MALT gas: linfoma asociado con mucosa gástrica (maltoma); LNH-L: linfoma no Hodgkin linfoblástico; LNH-A: linfoma no Hodgkin angiocéntrico. (16 de 30), con edad promedio de 57.7 ± 12.9 años; en cuanto a las mujeres (14 de 30) la edad promedio fue de 56.2 ± 17.2 años (Cuadro 2). Los linfomas afectaron más a adultos que a niños; por cada cuatro linfomas tres correspondieron a un adulto contra un niño, relación de 3:1. Los resultados en relación con la supervivencia de todos los pacientes adultos con linfoma atendidos en el Centro de Nayarit, independientemente del tipo y subtipo, se estimaron mediante la curva de supervivencia de Kaplan y Meier; se obtuvo una mediana del tiempo de supervivencia a cinco años de 73% (Figura 2), correspondiendo a 80% a cinco años de supervivencia libre de enfermedad para los pacientes adultos con linfoma difuso de células B pequeñas, y supervivencia global de 48% (Figura 3). Mientras que para los pacientes con linfoma de células B grandes la supervivencia libre de enfermedad a cinco años fue de 70% y la global de 48% (Figura 4). DISCUSIÓN En 2008, Globocan reportó una incidencia mundial de los linfomas no Hodgkin de 5.1 por 100,000 habitantes por año.8 Los datos estadísticos de cáncer publicados periódicamente en Estados Unidos informan que los linfomas no Hodgkin ocupan el séptimo lugar de todos los cánceres en hombres adultos, Cuadro 2. Distribución de los linfomas en adultos por género y mediana de edad Linfomas 112 Número Edad promedio ± desviación estándar Todos los linfomas Mujeres Hombres 81 44 37 57.8±15.6 59.3±16.8 55.51±14.5 Linfoma difuso de células B grandes Mujeres Hombres Linfoma difuso de células B pequeñas Mujeres Hombres Linfoma folicular 30 14 16 56.95±15.05 56.18±17.23 57.72±12.98 18 10 8 59.78±16.98 64.7±21.56 54.87±12.40 8 32.83±9.54 Supervivencia acumulada 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0 20 40 60 80 Tiempo en meses Función de supervivencia 100 120 Censurado Figura 2. Curva de supervivencia, 73% a cinco años en pacientes adultos con cualquier tipo de linfoma. Ron-Guerrero CS y col. Epidemiología de los linfomas en Nayarit Neoplasias Malignas de 2002 dio a conocer que la tasa de los linfomas no Hodgkin fue de 3.6. La incidencia calculada en nuestros pacientes con linfomas no Hodgkin fue de 3.4 casos por 100,000 habitantes por año. Supervivencia acumulada 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0 10 20 30 Tiempo en meses Función de supervivencia 40 50 Censurado Figura 3. Curva de supervivencia libre de enfermedad, 80% a cinco años en pacientes adultos con linfoma difuso de células B pequeñas. Supervivencia global de 48%. Supervivencia acumulada 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0 10 20 30 40 50 Tiempo en meses Función de supervivencia Censurado Figura 4. Curva de supervivencia libre de enfermedad, 70% a cinco años en pacientes con linfoma difuso de células B grandes. Supervivencia global de 48%. mientras que en las mujeres ocupan el sexto lugar.9 El registro de la Organización Mundial de la Salud, a través del organismo Globocan, en 2002, informó que la tasa ajustada en el mundo en los varones era de 5.6 y en las mujeres de 3.3. En México, el Registro Histopatológico de Los linfomas no Hodgkin son más frecuentes en los varones y se incrementan con la edad, sobre todo a partir de los 50 años. En niños y jóvenes son más raros y agresivos que en los adultos. La incidencia en los niños es poco frecuente y tiene predominio extranodal, 50 a 70% tiene inmunofenotipo B y se cura 70 a 90% de los casos. En los adultos la incidencia es alta, tiene predominio nodal, 70 a 90% corresponde a inmunofenotipo B, el curso clínico es variable y la tasa de curación es de alrededor de 30%.10 Nuestro estudio mostró 90% con inmunofenotipo de células B y 10% de células T. La Sociedad Americana de Cáncer reporta que el promedio de edad al diagnóstico de linfoma difuso de células B grandes es de 65 años, de 60 a 70 años en el caso de los linfomas foliculares, de 60 años en los sujetos con linfomas de células del manto, de 61 años en el caso de los linfomas MALT, con predominio en las mujeres y, respecto a los linfomas de la zona marginal, el promedio de edad es de 60 años, con relación similar hombre a mujer.11 El promedio de edad al diagnóstico de estos linfomas es de 62.2 años. Nosotros encontramos, igual a lo comunicado en la bibliografía mundial, que los linfomas no Hodgkin también son más frecuentes en los adultos (75%), en comparación con los niños (25%). Sin embargo, en relación con el género, encontramos que en las mujeres con linfoma no Hodgkin ocurrieron en 44 y en los varones en 37 de todos los casos con linfoma, con promedio de edad al diagnóstico de 57.8 años. El subtipo más frecuente fue el linfoma difuso de células B grandes con 30 casos, le siguió el linfoma difuso de células B pequeñas con 18 casos, luego hubo 8 casos de linfoma folicular; en 7 casos no 113 Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 Revista de Hematología pudo identificarse el subtipo del linfoma y los 18 restantes fueron otros subtipos de linfoma, como de Burkitt, angioinmunoblásticos, linfoblásticos, enfermedad de Castleman, de células B del manto, primarios de bazo, cutáneos de células B, cutáneos de células T y de MALT. Morton y colaboradores reportaron el siguiente patrón de incidencia: el linfoma difuso de células B grandes predomina en hombres, a diferencia del linfoma de la zona marginal. El linfoma folicular es ligeramente más frecuente en hombres que en mujeres, mientras que el linfoma linfocítico de células pequeñas-leucemia linfocítica crónica (SLL/CLL, por sus siglas en inglés), afecta casi dos veces más a varones que a mujeres.12 En nuestra revisión, igualmente encontramos que el linfoma difuso de células B grandes ocurrió con mayor frecuencia, la misma reportada por la Sociedad Europea de Oncología Médica, ambas con 37% de los casos. Sin embargo, Labardini reportó una frecuencia de 48%.13 El tratamiento de primera línea que prescribimos fue el esquema CHOP; sin embargo, a mediados de 2012 en nuestro centro se tuvo acceso a rituximab, mismo que ahora se agrega al esquema CHOP cuando el inmunofenotipo del linfoma está compuesto por células B CD20+. La supervivencia libre de enfermedad de nuestros pacientes con linfoma no Hodgkin, independientemente del subtipo, se calculó en 73% a 60 meses. Esos mismos reportes se encuentran en la bibliografía mundial, que indica que la supervivencia libre de recaída a 60 meses con CHOP sin rituximab es de alrededor de 65%, mientras que con rituximab es de 75%.14 114 REFERENCIAS 1. Jamal A. Siegel R, Ward E, et al. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J Clin 2009;59:225-249. 2. KnowlesDM. Immunodeficiency-associated lymphoproliferative disorders. Mod Pathol 1999;12:200-217. 3. Zintzaras E, Voulgarelis M, Moutsopoulos HM. The risk of lymphoma development autoimmune diseases: a metaanalysis. Arch Intern Med 2005;165:2337-2344. 4. Dohden K, Kaiszaki Y, Hosokawa O, et al. Regression of rectal mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma but persistence of Helicobacter pylori infection of gastric mucosa after administration of levofloxacin: report a case. Dis Colon Rectum 2004;47:1544-1546. 5. Engels EA, Chatterjee N, Cerhan JR, Davis S, et al. 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Labardini-Méndez J, Cervera-Ceballos E, Corrales-Alfaro C y col. Linfoma no Hodgkin Onco-guía. Cancerología 2001;6:139-152. 14. Coiffier B, Lepage E, Briere J, et al. CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large B-cel lymphoma. N Engl J Med 2002;346:235-242. Artículo original Rev Hematol Mex 2015;16:115-120. Variaciones en los alelos 677 C>T y 1298 A>C en el gen que codifica para la enzima 5,10 metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) y su efecto en la concentración de homocisteína en mestizos mexicanos Israel Parra-Ortega1 Margarita Martínez-Arias1 Karina López-Valladares1 José Luis Sánchez-Huerta1 Leticia Barrera-Dávila1 Vicencio Juárez-Barreto2 Briceida López-Martínez1 Laboratorio Clínico. Servicio de Medicina Transfusional. Hospital Infantil de México Federico Gómez. 1 2 RESUMEN Antecedentes: algunos estudios han descrito la coexistencia en forma heterocigota de las mutaciones C677T y A1298C en el gen que codifica para la enzima MTHFR, que juega un papel importante en la patogenia de algunas enfermedades, como la predisposición a trombosis. Objetivo: identificar la frecuencia de las mutaciones C677T y A1298C en un grupo de mestizos mexicanos. Material y método: estudio transversal descriptivo, en el que se incluyeron 207 voluntarios aparentemente sanos (disponentes sanguíneos) en los que se investigaron, mediante la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, las mutaciones C677T y A1298C en el gen que codifica para la enzima MTHFR para obtener la frecuencia de las variaciones alélicas y comparar las concentraciones de homocisteína sérica. Resultados: de los 207 sujetos sanos estudiados, se identificaron sólo 28 (13.5%) con genotipo normal y 179 (86.5%) con genotipo mutado; las combinaciones identificadas fueron: 14 (7%) con 677 normal/1298 heterocigotos, 74 (36%) con 677 heterocigotos/1298 normal, 67 (32%) con 677 homocigoto mutado/1298 normal, 23 (11%) con 677 heterocigoto/1298 heterocigoto, uno (0.5%) con 677 homocigoto mutado/1298 heterocigotos. Las diferencias entre las medias de homocisteína para todos los grupos de mutaciones fue estadísticamente significativa, p < 0.05. Conclusiones: la frecuencia de la coexistencia en estado heterocigoto compuesto de los polimorfismos C677T y A1298C en la enzima 5,10 metilentetrahidrofolato reductasa en mestizos mexicanos no es infrecuente porque ocurrió en 11% de los sujetos estudiados. La experiencia obtenida en este grupo de estudio confirma la asociación de las variaciones alélicas en MTHFR y el aumento de homocisteína. Palabras clave: alelos 677 C>T, 1298 A>C, gen que codifica para la enzima 5,10 metilentetrahidrofolato reductasa, homocisteína. www.nietoeditores.com.mx Recibido: 3 de diciembre 2014 Aceptado: 29 de enero 2015 Correspondencia: Dra. Briceida López Martínez Subdirección de Servicios Auxiliares de Diagnóstico Hospital Infantil de México Federico Gómez Dr. Márquez 162 06727 México, DF [email protected] Este artículo debe citarse como Parra-Ortega I, Martínez-Arias M, López-Valladares K, Sánchez-Huerta JL y col. Variaciones en los alelos 677 C>T y 1298 A>C en el gen que codifica para la enzima 5,10 metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) y su efecto en la concentración de homocisteína en mestizos mexicanos. Rev Hematol Mex 2015;16:115-120. 115 Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 Revista de Hematología Variations in alleles 677C>T and 1298A>C in gene encoding 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase and its impact on the value of homocysteine in Mexican mestizos ABSTRACT Background: Some studies describe the coexistence in heterozygous form of C677T and A1298C mutations in the gene encoding the MTHFR enzyme, that plays an important role in pathogenesis of some diseases such as predisposition to thrombosis. Objective: To investigate the frequency of mutations in a group of Mexican mestizos. Material and method: A descriptive cross-sectional study including 207 apparently healthy volunteers (blood disponentes), in which, by polymerase chain reaction in real time, it was researched C677T and A1298C mutations in the gene encoding the enzyme MTHFR for frequency included allelic variations and comparing the serum homocysteine. Results: Of the 207 healthy individuals studied, we identified only 28 (13.5%) with a normal genotype and 179 (86.5%) with a mutated genotype; combinations identified were: 14 (7%) with 677 normal/1298 heterozygotes, 74 (36%) heterozygous 677/1298 normal, 67 (32%) mutated homozygous 677/1298 normal, 23 (11%) heterozygous 677/1298 heterozygous, one (0.5%) mutated homozygous 677/1298 heterozygotes. The differences between the means of homocysteine for all groups of mutations were considered significant, p <0.05. Conclusions: The frequency of coexistence compound heterozygote state of polymorphisms C677T and A1298C 5,10 methylenetetrahydrofolate reductase in Mexican mestizos is not uncommon, as it was presented in 11% of those studied. The experience gained in this group of patients confirms the association of allelic variations in MTHFR and increased homocysteine. Key words: alleles 677C>T and 1298A>C, gene encoding 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase, homocysteine. ANTECEDENTES La hiperhomocisteinemia es un factor de riesgo independiente de aterosclerosis y aterotrombosis.1 La homocisteína se forma a partir del 116 metabolismo de la metionina2 por medio de reacciones de transmetilación.3 Las principales enzimas implicadas en este sistema metabólico son la cistationina β sintetasa, la metionina sintetasa y la metilentetrahidrofolato reductasa Parra-Ortega I y col. Variaciones en los alelos 677 C>T y 1298 A>C (MTHFR),3-8 las vitaminas B6 y B12 participan en forma de coenzimas y el ácido fólico como sustrato.9 Se han reportado variaciones genéticas que afectan a las enzimas descritas,6-8 ya sea en su funcionalidad, cantidad o en ambas, lo que resulta en el aumento de la concentración de homocisteína en el plasma y los tejidos. El polimorfismo más frecuente es el 677 C>T en el gen que codifica para la enzima 5,10 metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR),10 que disminuye la actividad enzimática. La existencia del polimorfismo A1298C en la misma enzima disminuye la actividad de la enzima y, por tanto, aumenta la concentración de homocisteína.11-13 En la población caucásica se ha descrito la incidencia de polimorfismos C677T en MTHFR en aproximadamente 40% para los estados heterocigotos y de 10% para los homocigotos.14 En México existen diversas publicaciones del polimorfismo C677T de MTHFR; en 1999, Mutchinick y colaboradores3 realizaron un estudio de la frecuencia de ese polimorfismo y en 2001, Ruiz-Argüelles y su grupo publicaron la primera evidencia de la alta prevalencia del polimorfismo C677T de MTHFR en pacientes mexicanos con estados hipercoagulables.6 La coexistencia de los polimorfismos C677T/A1298C en el gen que codifica para MTHFR se ha descrito en algunos estudios14,15 y su papel en la patogenia de algunas enfermedades no se ha identificado con certeza. Posterior al hallazgo de la coexistencia de los polimorfismos C677T/A1298C en el gen que codifica para MTHFR como único marcador asociado con el evento trombótico en nueve pacientes pediátricos,16 planteamos el objetivo de identificar la frecuencia de la coexistencia de los polimorfismos C677T y A1298C en el gen que codifica para la enzima MTHFR en un grupo de mestizos mexicanos sanos y su relación con la concentración de homocisteína. MATERIAL Y MÉTODO Estudio transversal descriptivo en el que se incluyeron 207 voluntarios aparentemente sanos, 46 del sexo femenino, con edad media de 33 años, límites de 18 y 59 años, a los que se les realizó el protocolo de evaluación para ser disponentes sanguíneos, siguiendo los protocolos de selección y clasificación del servicio de Medicina Transfusional del Hospital Infantil de México Federico Gómez. A todos los voluntarios, previa autorización, se les tomó una muestra de 3 a 5 mL de sangre periférica anticoagulada con EDTA, para la extracción de ácido desoxirribonucleico (ADN). La extracción se realizó con base en la metodología que utiliza perlas magnéticas y el equipo MagNA Pure Compact Roche DiagnosticMR, la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR-RT). Con el uso de sondas FRET (transferencia de energía fluorescente mediante resonancia) investigamos las mutaciones C677T y A1298C en el gen que codifica para la enzima MTHFR con los diseños comerciales: LightMix® for the detection of human MTHFR C677T, número de catálogo 40-0095-16 y LightMix® for the detection of human MTHFR A1298C, número de catálogo 40-0269-16 de TibMolBiol®. Para la medición de homocisteína se utilizó un inmunoensayo automatizado para la determinación cuantitativa de L-homocisteína total en plasma humano citratado por turbidimetría de partículas de látex en los sistemas de analítico ACL TOP 500 de IL Diagnostic®. Los datos de la concentración de plasma de homocisteína se analizaron utilizando el programa IBM SPSS Statistics ver. 22.0.0.0 para Mac OSX. Se realizó un análisis estadístico descriptivo para todas las variables, se realizó prueba de normalidad a las variables con la prueba de Kolmogorov-Smirnov, prueba de t de Student para calcular el nivel de probabilidad entre grupos y se compararon las diferencias entre las 117 Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 Revista de Hematología medias con ANOVA multivariado para todos los grupos de mutaciones; se consideró significativo un valor de p menor a 0.05. RESULTADOS De los 207 voluntarios aparentemente sanos estudiados, se identificaron sólo 28 (13.5%) con un genotipo normal (677CC/1298AA) y 179 (86.5%) con un genotipo mutado; las combinaciones identificadas fueron: 14 (7%) con 677 normal/1298 heterocigotos (677CC/1298AC), 74 (36%) 677 heterocigoto/1298 normal (677CT/1298AA), 67 (32%) 677 homocigoto mutado/1298 normal (677TT/1298AA), 23 (11%) 677 heterocigoto/1298 heterocigoto (677CT/1298AC), uno (0.5%) 677 homocigoto mutado/1298 heterocigoto (677TT/1298AC). Figura 1 y Cuadros 1 y 2 Cuadro 1. Variaciones identificadas en los alelos 677 C>T y 1298 A>C en el gen que codifica para la enzima 5,10 metilenetetrahidrofolato reductasa (MTHFR) Genotipo en 677 de MTHFR Genotipo en 1298 de MTHFR Núm. (%) n=207 Normal Normal Heterocigoto Homocigoto mutado Heterocigoto Homocigoto mutado Normal Heterocigoto Normal Normal Heterocigoto Heterocigoto 28 (13.5) 14 (7) 74 (36) 67 (32) 23 (11) 1 (0.5) de los genotipos: 677CT/1298 AA y 677TT/1298 AA (p=0.019), 677TT/1298 AA y 677CT/1298 AC (p=0.019), 677TT/1298 AA y 677CT/1298 AC (p=0.004), 677CT/1298 AC y 677TT/1298 AA (p=0.004). Cuadro 3 CONCLUSIONES Las diferencias de la concentración de homocisteína entre los diferentes grupos resultó significativa (p=0.022). Las diferencias estadísticamente significativas en las comparaciones entre grupos ocurrieron en las comparaciones 35,00 32,96 29,38 Homocisteína 30,00 25,72 25,00 20,00 15,00 La frecuencia identificada en este grupo de pacientes sugiere que la coexistencia en estado heterocigoto compuesto de los polimorfismos C677T y A1298C en la enzima 5,10 metilentetrahidrofolato reductasa en mestizos mexicanos no es infrecuente, porque ocurrió en 11% de los sujetos estudiados. En un estudio previo describimos un grupo de pacientes pediátricos que tuvieron un evento trombótico, en el que sólo se identificó la coexistencia de estas mutaciones como marcador genético de trombofilia; sin embargo, su existencia en pacientes con estados de trombofilia no excluye la investigación de más factores genéticos y adquiridos asociados.5-10 10,00 67 7 67 7 CC /1 29 8 AA CC /1 29 67 8 7C AC T/ 12 98 67 AA 7T T/ 12 98 67 7C AA C/ 12 98 67 CC 7C T/ 12 98 AC 5,00 Figura 1. Concentración de homocisteína en los diferentes grupos de genotipos encontrados de 5,10 metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR). 118 Los resultados obtenidos al comparar la concentración de homocisteína y el genotipo en los alelos 677 C>T y 1298 A>C en gen que codifica para la enzima 5,10 metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) en mestizos mexicanos muestran un valor significativo (p>0.05). Las características poblacionales que tiene la región centro de nuestro país y la alta frecuencia Parra-Ortega I y col. Variaciones en los alelos 677 C>T y 1298 A>C Cuadro 2. Concentración de homocisteína en los diferentes grupos de genotipos encontrados de 5,10 metilentetrahidrofolato reductasa 95% del intervalo de confianza para la media Genotipo MTHFR Media Desviación estándar Error estándar Límite inferior Límite superior Mínimo Máximo 677CC/1298 AA 677CC/1298 AC 677CT/1298 AA 677TT/1298 AA 677TT/1298 CC 677CT/1298 AC 14.92 13.25 14.44 16.82 21.20 13.22 4.27 3.38 3.93 4.49 3.30 1.23 1.38 0.69 0.71 0.91 12.20 9.69 13.02 15.38 11.23 17.63 16.80 15.86 18.25 15.22 7.82 9.29 8.83 10.56 21.20 7.63 22.31 17.40 25.72 32.96 21.20 17.79 Cuadro 3. Comparación de p en la diferencia de los grupos de genotipos de 5,10 metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) Genotipo MTHFR 677CC/1298 AA 677CC/1298 AC 677CT/1298 AA 677TT/1298 AA 677CT/1298 AC 677CC/1298 AC 677CT/1298 AA 677TT/1298 AA 677CT/1298 AC 0.385 0.740 0.198 0.988 0.740 0.465 0.019 .300 0.198 0.051 0.019 0.004 0.283 0.988 .300 0.004 - Se consideró estadísticamente significativo un valor de p menor de 0.05. de las variaciones alélicas en MTHFR hace imperativo el análisis de los mecanismos bioquímicos en las diversas enfermedades en las que esas variaciones tienen una implicación directa en los pacientes mexicanos.17-21 Se han descrito 29 alteraciones genéticas en MTHFR y su relación con el aumento de homocisteína no se ha definido claramente en los diferentes grupos étnicos.22-25 En diferentes padecimientos se ha investigado la participación de las variaciones alélicas en MTHFR y el aumento de homocisteína con resultados que no revelan una asociación franca.26-29 Además, la distribución geográfica de los genotipos identificados en algunos estudios30-32 expone la necesidad de considerar más aún el análisis y la generación de información respecto de las variaciones alélicas en MTHFR. La experiencia obtenida en este grupo de pacientes confirma la asociación de las variaciones alélicas en MTHFR y el aumento de homocisteína. REFERENCIAS 1. De Veber G, Andrew M, Adams C, et al. Cerebral sinovenous thrombosis in children. N Engl J Med 2001;345:417-423. 2. Schmidt B, Andrew M. Neonatal thrombosis: report of a prospective Canadian and international registry. Pediatrics 1995;96:939-943. 3. Mutchinick OM, López MA, Luna L, Waxman J, et al. High prevalence of the thermolabile methylenetetrahydrofolate reductase variant in Mexico: a country with a very high prevalence of neural tube defects. Mol Gen Metab 1999;461-467. 4. Ruiz-Argüelles GJ. Trombofilia. En: Ruiz-Argüelles GJ, editor: Fundamentos de Hematología. 3a ed. Ciudad de México: Editorial Médica Panamericana, 2003;424-436. 5. Ruiz-Argüelles GJ, González-Estrada S, Garcés-Eisele J, Ruiz-Argüelles A. Primary thrombophilia in Mexico: A prospective study. Am J Hematol 1999;60:1-5. 6. 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Diana Noemí García-de Paoletti1,2 Mariano Eduardo Paoletti 1,2,3 Eduardo Armando Paoletti1 Elisabeth Aloni-Risana2 Julio Guillermo Soto2 Carlos Alberto Barassi1 María Alejandra Pereyra1 María Fernanda Cerviño1,2 Lisbbett Suárez-González3 Daniel Mielgo4 Universidad Fasta, Buenos Aires, Argentina. Laboratorio, Clínica 25 de Mayo, Buenos Aires, Argentina. 3 Hospital Interzonal de Agudos Dr. Allende, Mar del Plata, Buenos Aires, Argentina. 4 Clínica de la Madre y el Niño, Buenos Aires, Argentina. 1 2 Results: The absorbance of each reading was concurrent with the concentration of low molecular weight heparin added in each tube is not modified by the value of bilirubin with the pNA. The adaptation mentioned could be used in jaundice newborn achieving a more exact measurement of blood level of heparin. Conclusions: The modified chromogenic conventional method is an excellent tool to have into consideration to measure anti-Xa in patients with jaundice. Key words: anti-Xa activity, jaundice, modified chromogenic method. Método cromogénico modificado para medir la actividad anti-Xa en pacientes ictéricos RESUMEN Objetivo: proponer una modificación del método convencional cromogénico para usarse en pacientes ictéricos. Material and método: estudio epidemiológico analítico en el que comparamos los valores de la actividad anti-Xa en 40 pacientes con y sin ictericia usando un método cromogénico modificado. Se calculó el coeficiente de Pearson. Resultados: la absorbancia de cada lectura fue concurrente con la concentración de heparina de bajo peso molecular agregada en cada tubo y no se modificó por la concentración de bilirrubina con el pNA. Conclusiones: el método cromogénico modificado es una excelente herramienta a tener en cuenta para medir la actividad anti-Xa en pacientes con ictericia. Palabras clave: actividad anti-Xa, ictericia, método cromogénico modificado. www.nietoeditores.com.mx Received: December 1st, 2014 Accepted: February 4, 2015 Correspondence: Dra. Diana García Clínica del Niño y la Madre Avenida Colón 2749 7600 Mar del Plata, Buenos Aires, Argentina [email protected] This article must be quoted García-de Paoletti DN, Paoletti ME, Paoletti EA, Aloni-Risana E, et al. Modified chromogenic method to assess anti-Xa activity in jaundiced patients. Rev Hematol Mex 2015;16:121-127. 121 Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 Revista de Hematología BACKGROUND The indication of pharmacological thromboprophylaxis fixed-dose with low molecular weight heparin (LMWH) is a standard treatment of numerous clinical conditions and/or surgical procedures with the objective of reducing the venous thromboembolic disease (VTD). LMWH typically does not require laboratory monitoring except in newborn, children, high-risk pregnant, renal failure and obese patients.1-4 The recommended method to check the anticoagulant response of LMWH is the measurement of the activity anti-Xa activity whose peak occurs 4 hour after administration by subcutaneous via. The measurement of the activity anti-Xa using the chromogenic conventional method is often undervalued by the interference with elevated bilirubin levels in newborns with jaundice, for example. The objective of our work is to propose a modification of the chromogenic conventional method (Rotachrom Heparin Stago’s Method)5 to be used in patients with jaundice. MATERIAL AND METHOD An analytic epidemiologic study was done. We analyzed the Pearson correlation coefficient (r) which measures the intensity of the linear relationship between the two quantitative variables. Firstly, we determined and compared the values of anti-Xa activity in anicteric (without jaundice) patients using conventional and modified chromogenic method. Secondly, we determined the values of antiXa activity using only modified chromogenic method in patients with jaundice. Finally, we compared the values of anti-Xa activity using modified chromogenic method in both 122 kinds of patients: without (anicteric) and with jaundice (icteric). Setting/participants This study was made with sample blood obtained from 40 anicteric and icteric newborns (total bilirubin 80mg/L at 200mg/L) patients from CEDEAC Laboratory and 25 de Mayo Clinic at Mar del Plata, City of Buenos Aires Province, Argentina. The blood was collected in plastic tubes with sodium citrate at 3.2% (relationship between anticoagulant/blood 1/9, respectively) to determine and compare the anti-Xa activity in both groups using conventional and modified chromogenic method. Most of them were newborn with jaundice and thrombosis. In such cases the blood collection was made 4 hours after the enoxaparin injection. Measurement Immediately after the blood collection, the blood sample was centrifuged at 2000 G for 10 minutes to avoid the release of platelet factor 4 (PF4), which is a potent inhibitor of heparin. It was established as activity range of anti-Xa prophylactic between 0.2 and 0.6 U/mL, and as therapeutic activity range between 0.6 and 1.0 U/mL.4 If we have into account that the presentation of 1mg of is equivalent to 113 IU anti-Xa; we can say a vial of enoxaparin 20mg contains 0.2 mL, which is equivalent enoxaparin to 2260 UI antiXa and a vial of enoxaparin 40 mg contains 0.4 mL, which is equivalent to 4250 UI anti-Xa. The dosages were performed in citrated plasmas and added different concentrations of enoxaparin used by us in our centers. To obtain the curves, we diluted 10 mL of enoxaparin 20 mg with 14 mL of saline solution. The final concentration of this dilution was 8.0 UI of anti-Xa. Then, we took 0.1 mL of the before dilution of the enoxaparin 20 García-de Paoletti DN, et al. Anti-Xa activity in jaundiced patients (8.0 UI anti-Xa) and added to 0.9 mL of plasma to be analyzed. When we worked with values of the curve greater than 0.8 UI anti-Xa, we made lower dilutions. Variables We performed correlation analysis that studies the relationship between two quantitative variables: anti-Xa activity in anicteric and icteric patients. Chromogenic method We used the conventional chromogenic method of Stago: Rotachrom heparin and modified the conventional method to compare the results of anti-Xa in icteric and anicteric serum. Conventional chromogenic method After the diazotation and coupling the diazoic red colorant is obtained. In the azoic colorants the azo group is the principal chromophore. According to the chromophore we obtain differences in colour and intensity and in acid environment are precipited. To measure concentration through the light absorption, they were dissolved by HOK alkalization. The diazotation reaction takes place between an aromatic primary amine in the presence of NaNO2 and in strong acid medium to form diazonium salt intermediates for the formation of azo pigments. The amount of NaNO2 is stechiometric; acid medium should be in excess to prevent partial diazotation and condensation. Samples + excess of factor Xa + specific chromogen (MAPA-Gly-Arg-pNA). The liberation of pNA is inversely proportional to the concentration of anti-Xa present in patient’s plasma. The acid medium stops the reaction. We read at 405 nm. The curves are made with known data in IU of anti-Xa with LMWH used for the patients and Stago controls with different concentrations of anti-Xa. If the diazotation occurs successfully, the amine must be in aqueous acidic solution. Colouring property is contingent on the presence of molecules of chromophore groups (colour carriers) attached to the azo group (-N = N-). Coupling reaction: diazonium salts react with compound couplers to form AZO derivatives, such as phenol and naphthol ethers. Modified chromogenic method The coupling reaction is carried out at room temperature or 10-20ºC. Diazotation is carried in acidified pNA liberated in Chromogenic Rotachrom method and subsequent coupling. Giving a pink colour allowing its reading at 540nm, without overlapping with the bilirubin. The pNA is released in the reaction is inversely proportional to the heparin activity. The diazonium salt is not isolated and should be used quickly as diazotation reactions are exothermic and the diazonium salts decompose if the system is not cooled and does not react on time. To obtain diazotation it is necessary to maintain the temperature between 0-5ºC. Phenols are dissolved in weak alkaline environment and become phenoxides, since phenols are not reactive enough to attack the diazonium salts. Neither amines nor phenols react moderately in an alkaline medium because the diazonium ion becomes diazohidroxide Ar-N-N-OH. 123 Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 Revista de Hematología Reaction scheme 1) Diazotation reaction (Figure 1),6 2) Coupling reaction (Figure 2).7 The red dye is a red precipitate in acid medium. The pH has to be changed to alkaline medium to be a real solution and coloured. Experimental procedure The reagents are prepared and the reaction is made with stechiometric concentrations to continue with the reactions made with the kit of Rotachrom Heparin chromogenic method. Protocol work a) Diazotation cooling the solution of amine in an acidic medium obtained in the kit, in an ice water bath. The solution is kept at 0ºC (≤ 10ºC) slowly adding with the micropipette and stirring a solution of sodium nitrite to complete, add two or three minutes to finish the reaction. H2N NaNO2 N NO2 N CH3COOH Para-nitroaniline (pNA) NO2 Nitrobencen diazonio Figure 1. Diazotation reaction. NO2 N OH O2N N N NaOH N 1-[(-Nitrophenyl ) Diazenil] Naphthalene n-2 RED DYE OH Figure 2. Coupling reaction. 124 b) Coupling: Add slowly the diazonium salt solution to the alkaline solution of 2-Naphtol solution in ice water bath and with constant stirring. A red precipitate occurs during the addition. When the addition is completed, stir for a minute to finish the reaction. c) After that add 10 µL of solution of 15% KOH to dissolve the precipitate and get a real solution in red colour to be measured in the spectrophotometer to 540nm. Red colour is inversely proportional to anti-Xa concentration. The modified method with a diazotization reaction to paranitroaniline (pNA) and coupling to give a color which allows reading at 540 nm and avoiding interference with bilirubin. Analyses of statistical method This study was designed to calculate the coefficient of correlation of Pearson (r) between the determination of anti-Xa factor in anicteric and icteric patient using conventional and chromogenic method, respectively. The Pearson correlation coefficient (r) measures the intensity of the linear relationship between the two quantitative variables. This coefficient (r) varies between -1 and +1. It´s the same to say -1≤ r ≤ +1. If r =±1; there is a perfect relationship between x and y. We mean, all the points (x and y) they are in a perfect straight line. If we obtain a positive value of r indicates that as you increase the variable makes it the other or to measure that decrease also makes it the other. A negative correlation coefficient indicates that as one variable increases decreases the other and vice versa the opposite. R equal to zero indicates that there is no linear correlation between the variables. After the determination of the coefficient of correlation of Pearson we determined if such García-de Paoletti DN, et al. Anti-Xa activity in jaundiced patients coefficient is statistically different to zero. For this, we applied the test based on the distribution of the t student. We calculated the confidence of interval. After that we proceeded to make the inverse calculate to obtain the confidence intervals of correlation coefficient r that were our main finding before the logarithmic transformation (Figure 3). This test was made to prove if the difference in the measures is zero (anicteric-icteric). The value of r should be different to zero to be sure this job is statistically suitable. Our results reject the null hypothesis which says that the correlation between the two variables is zero. The r was 0.9608273. Also we presented an estimated value and 95 percent confidence interval for the coefficient of correlation of Pearson. Finally we demonstrated that there is strong evidence that the both samples came from the same population by the Kolmogorov-Smirnov test. RESULTS Descriptive data The curves done with different concentration of LMWH used in plasma samples taken for ict 0.8 0.4 0.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 ani 1.0 patients have shown a linear order. The absorbance of each reading was concurrent with the concentration of LMWH added in each tube is not modified by the value of bilirubin with the pNA. The adaptation mentioned could be used in jaundice newborn achieving a more exact measurement of blood level of heparin (Tables 1-3, Figures 4-5). DISCUSSION Current use of LMWH in neonates as an anticoagulant of choice was the starting point to think about a modification of the conventional chromogenic method, which is used to measure values of anti-Xa. The main problem seen was the interference of bilirubin in icteric newborn using this conventional method. That is why we proposed modify this method. First of all, we did not realise differences between the values of anti-Xa in anicteric patients using the conventional and modified chromogenic method. Secondly, we did not observe differences between the values of anti-Xa using modified chromogenic method in anicteric and icteric patients. CONCLUSION The modified chromogenic method above explained can be used in icteric patients achieving a more accurate measurement of the heparinemia. Funding This work was entirely self-funded. Figure 3. Intervals of correlation coefficent r. 125 Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 Revista de Hematología Table 1. Determination of anti-Xa in anicteric patients using conventional and modified method Patients Conventional method Modified method Patients Conventional method Modified method 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 0.3 0.1 0.3 1 0.6 0.55 0.7 0.4 0.8 0.66 0.8 0.9 0.3 0.7 0.8 0.2 0.4 0.7 0.2 0.2 0.3 0.08 0.33 0.98 0.55 0.56 0.69 0.38 0.78 0.7 0.78 0.88 0.3 0.7 0.78 0.15 0.42 0.7 0.23 0.22 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 0.4 0.8 0.5 1.6 0.8 0.2 0.4 0.8 0.4 0.2 0.4 0.8 0.4 0.2 0.8 0.4 0.2 0.35 0.78 0.35 0.4 0.85 0.48 1.5 0.82 0.22 0.4 0.82 0.42 0.22 0.39 0.81 0.39 0.22 0.75 0.38 0.22 0.39 0.81 0.39 Table 2. Values of anti-Xa using modified chromogenic method in patients with jaundice 126 Patients Modified chromogenic method Patients Modified chromogenic method 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 0.28 0.1 0.3 1 0.5 0.55 0.7 0.4 0.75 0.76 0.8 0.85 0.2 0.65 0.8 0.15 0.4 0.65 0.2 0.2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 0.5 0.8 0.45 0.2 0.8 0.22 0.38 0.8 0.4 0.24 0.35 0.78 0.35 0.18 0.78 0.35 0.2 0.35 0.8 0.4 García-de Paoletti DN, et al. Anti-Xa activity in jaundiced patients Table 3. Values of anti-Xa using modified chromogenic method in anicteric and icteric patients Anicteric Icteric Patients Anicteric Icteric 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 0.3 0.08 0.33 0.98 0.55 0.56 0.69 0.38 0.78 0.7 0.78 0.88 0.3 0.7 0.78 0.15 0.42 0.7 0.23 0.22 0.28 0.1 0.3 1 0.5 0.55 0.7 0.4 0.75 0.76 0.8 0.85 0.2 0.65 0.8 0.15 0.4 0.65 0.2 0.2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 0.4 0.85 0.48 0.6 0.82 0.22 0.4 0.82 0.42 0.22 0.39 0.81 0.39 0.22 0.75 0.38 0.22 0.39 0.81 0.39 0.5 0.8 0.45 0.2 0.8 0.22 0.38 0.8 0.4 0.24 0.35 0.78 0.35 0.18 0.78 0.35 0.2 0.35 0.8 0.4 Values of anti Xa Values of anti Xa Patients Number of anicteric patients Conventional method Number of patients Modified method Figure 4. Values of anti-Xa in anicteric patients using conventional and modified chromogenic method. Anicteric patients Figure 5. Values of anti-Xa using modified chromogenic method in anicteric and icteric patients. REFERENCES 1. 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Lide, David R. Handbook of chemistry and physics. 84th ed. Florida: CRC Press, 2003-2004. 7. Mc-Murray J. Reacciones de copulación de las sales de diazonio. Química orgánica. 6th ed. México: Thomson International Group, 2004;920-921. 127 Artículo de revisión Rev Hematol Mex 2015;16:128-142. Plasma rico en factores de crecimiento plaquetario. Una nueva puerta a la Medicina regenerativa Jesús Alcaraz-Rubio1 Antonio Oliver-Iguacel2 Juana María Sánchez-López1 1 Unidad de Hematología, Unión Murciana de Hospitales, Murcia, España. 2 Unidad de Neuroendocrinología, Hospital Rúber, Madrid, España. RESUMEN El uso del plasma rico en factores de crecimiento plaquetario se ha convertido en una técnica cada vez más utilizada en diversas áreas de la Medicina. Desde sus orígenes de uso en Medicina deportiva e implantología dental a mediados del decenio de 1980, progresivamente se ha ampliado su campo de utilización en especialidades clínicas tan diversas como Otorrinolaringología, Cirugía Plástica, Dermatología, Cirugía General, Oftalmología, Obstetricia y Ginecología y Neurocirugía, entre otras. El poder del trofismo celular sobre ciertos tejidos, atribuido a los factores de crecimiento, ha hecho que actualmente se hable de una nueva disciplina médica: Medicina regenerativa. No sólo se ha experimentado un auge cada vez más creciente en distintas especialidades médicas, sino que paralelamente se han incrementado de manera exponencial los tipos de metodología de obtención así como las formas de aplicación incluso contra una misma enfermedad. Tanto es así que actualmente su utilización ha sobrepasado la capacidad científica de producir evidencia para la correcta aplicación clínica. El objetivo de esta revisión es realizar una visión objetiva de lo que se denomina plasma rico en factores de crecimiento plaquetario, más comúnmente conocido como plasma rico en plaquetas (PRP), los métodos más aceptados por la bibliografía científica de producción, así como las principales aplicaciones clínicas en las que se ha observado mayor evidencia científica y los usos donde, si bien aún carecen de base científica sólida, son interesantes desde el punto de vista clínico y preclínico. Palabras clave: plasma rico en plaquetas, Medicina regenerativa. Platelet-rich plasma in growth factors. A new door to regenerative Medicine ABSTRACT The use of platelet-rich plasma growth factors has become increasingly used in various areas of Medicine. Since its origins of use in sports medicine and dental implantology in the mid-1980s, has been progressively expanded its field of application in clinical specialties as diverse as Otorhinolaryngology, Plastic Surgery, Dermatology, General Surgery, Ophthalmology, Obstetrics and Gynecology and Neurosurgery, among others. The power of cellular trophism on certain tissues, attributed to growth factors, has made that currently there is talk of a new medical discipline such as regenerative medicine, not only there has been increasingly booming in various medical specialties, but that at the same 128 Recibido: 10 de diciembre 2014 Aceptado: 26 de febrero 2015 Correspondencia: Dr. Jesús Alcaraz Rubio Carretera de Águilas Buzón 252-B 30800 Lorca, Murcia, España [email protected] Este artículo debe citarse como Alcaraz-Rubio J, Oliver-Iguacel A, Sánchez-López JM. Plasma rico en factores de crecimiento plaquetario. Una nueva puerta a la Medicina regenerativa. Rev Hematol Mex 2015;16:128-142. www.nietoeditores.com.mx Alcaraz-Rubio J. Plasma rico en factores de crecimiento plaquetario time has increased exponentially the types of methodology of obtaining as well as the forms of application even for a same pathology. So much so that its currently use has exceeded greatly the scientific capacity to produce evidence for proper clinical application. The objective of this review is to perform an objective vision about what is known as plasma rich in platelet growth factors, more commonly known as platelet-rich plasma (PRP), the most accepted by the scientific production literature methods, as well as the main clinical applications where scientific evidence and those applications has been where, even though they still lack solid scientific basis, are interesting from the clinical and preclinical point of view. Key words: plasma rich in platelet, regenerative Medicine. Fisiología de la plaqueta y factores de crecimiento Las plaquetas son fragmentos celulares anucleados que derivan del citoplasma de los megacariocitos de la médula ósea. Tradicionalmente su función más conocida es en el proceso de hemostasia primaria, porque son indispensables para la formación del coágulo; sin embargo, también juegan un papel importante en la inflamación, la inmunidad, la progresión tumoral y por supuesto, la trombosis. Por microscopia electrónica se observa que las plaquetas contienen diversos organelos: mitocondrias, peroxisomas, ribosomas, así como glucógeno y gránulos; estos últimos se dividen en tres tipos: 1) alfa: que contienen fibrinógeno, factor de vonWillebrand, factor de crecimiento derivado de las plaquetas, factor de crecimiento ectodérmico, factor de crecimiento endotelial vascular, factor de crecimiento insulínico tipo 1, así como otros factores de crecimiento (Cuadro 1); 2) densos o delta: que contienen ADP, ATP, serotonina, adrenalina, noradrenalina y dopamina y 3) lambda: que son lisosomas que ayudan a disolver el coágulo una vez que ha cumplido su función.1-3 Además de las funciones clásicas descritas de las plaquetas, los descubrimientos recientes en cuanto a su capacidad de síntesis proteica, conteniendo copias de ARNm de casi una tercera parte de las proteínas conocidas en el genoma humano, a pesar de carecer de núcleo, han cambiado totalmente la percepción que se tenía de las mismas, se reconoce su capacidad de poder sintetizar proteínas ante cambios en su ambiente. Además, también se investigan algunas funciones no genómicas de estos factores, como su efecto en las vías de señalización que involucran la activación plaquetaria y su papel en la síntesis de novo de factores pro y antiinflamatorios. La enorme cantidad de factores de crecimiento contenidos en los gránulos alfa plaquetarios, la capacidad de síntesis de novo de proteínas, así como su actividad microbicida y moduladora de la inflamación favorecen la proliferación e inmunomodulación celular y la síntesis de matriz extracelular, promoviendo la cicatrización, la reparación de heridas y otras lesiones tisulares. Estas funciones precisamente han llevado a proponer el uso del plasma rico en plaquetas autólogo para la reparación y regeneración de diversos tejidos.1 Los principales factores de crecimiento plaquetario de los que más se conoce su función son: 129 Revista de Hematología Factor de crecimiento de origen plaquetario (PDGF) Su principal función es promover indirectamente la angiogénesis a través de los macrófagos, por un mecanismo de quimiotaxis. Activa los macrófagos, tiene una importante actividad mitógena en las células mesenquimales, así como en las neuronas, células de la microglía, promoviendo la proliferación y remielinización de los oligodendrocitos y facilita la formación de colágeno tipo 1. Factor de crecimiento de transformación-beta (TGF-beta) Su misión fundamental es la de quimiotaxis. Induce la proliferación y diferenciación de células mesenquimales. Promueve la síntesis de colágeno por los osteoclastos. Es proangiogénico tisular; inhibe la formación de osteoclastos como la proliferación de células epiteliales en presencia de otros factores. Induce la diferenciación de células madre troncales neuronales. Factor de crecimiento fibroblástico (FGF) Activa la proliferación y diferenciación de osteoclastos, fibroblastos e inducción de fibronectina por éstos y células madre troncales neuronales. Inhibe la acción osteoclástica. Tiene una importante actividad proangiogénica por acción quimiotáctica en las células endoteliales. Factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-1) Induce la proliferación y diferenciación de células mesenquimales y de revestimiento; asimismo, tiene un potente efecto mitótico en las celularidad progenitora troncal neuronal. Facilita la síntesis de osteocalcina, fosfatasa alcalina y colágeno tipo 1 por los osteoblastos. 130 Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 Factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) Activa la quimiotaxis y diferenciación de células endoteliales, promueve la hipermeabilidad de los vasos sanguíneos. Factor de crecimiento ectodérmico (EGF) Tiene gran capacidad proapoptótosica, de quimiotaxis y diferenciación de células epiteliales, renales, neuronales, gliales y fibroblastos. Factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) Induce la proliferación, diferenciación y quimiotaxis de celularidad neuronal, microglial y oligodendrocitaria, así como la remielinización de las mismas. Factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) Tiene como principal función la proliferación y diferenciación celular, quimiotaxis, angiogénesis y síntesis de matriz extracelular. En el Cuadro 1 se resumen los tipos de factores de crecimiento que se pueden obtener en el plasma rico en plaquetas, así como su función fisiológica principal en los tejidos. En el Cuadro 2 se reflejan las concentraciones normales de factores de crecimiento que se pueden encontrar en el plasma sanguíneo humano de sangre periférica en comparación con el promedio del conseguido en un plasma rico en plaquetas de calidad. Definición de plasma rico en plaquetas El plasma rico en plaquetas es una concentración autóloga de plaquetas humanas en un volumen pequeño de plasma que representa un aumento de plaquetas respecto de las concentraciones basales normales, por lo que es Alcaraz-Rubio J. Plasma rico en factores de crecimiento plaquetario Cuadro 1. Resumen de las proteínas contenidas en los gránulos plaquetarios alfa Contenido Función Quimiocinas, citocinas Factor plaquetario 4 B-tromboglobina RANTES Proteína inflamatoria de macrófagos 1-alfa Interleucina 1 y 8 Regulación de la inflamación, quimiotaxis Proteínas adhesivas Trombospondina 1 y 2 Fibrinógeno Fibronectina Interacciones celulares y coagulación Factores de crecimiento Factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF) Factor de crecimiento transformante B (TGF-B) Factor de crecimiento epidérmico o epitelial (EDGF) Factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) Factor de crecimiento similar a insulina-1 (IGF-1) Factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) Factor neutrófico derivado del cerebro (BDNF) Proliferación y diferenciación celular, quimiotaxis, angiogénesis, síntesis de matriz extracelular Inmunoglobulinas Ig-A, Ig-E, Ig-M e Ig-G Inmunológica Factores de la coagulación V y VIII Factor de von-Willebrand Inhibidor del activador del plasminógeno P-selectina Producción de trombina Adherencia plaquetaria al colágeno subendotelial Inhibición de la fibrinólisis Interacción leucocito-plaqueta RANTES: regulated on activation normal T-cell expressed and secreted. Cuadro 2. Concentraciones de factores de crecimiento y conteo celular en sangre periférica y plasma rico en plaquetas Sangre periférica Plasma rico en plaquetas PDGF-AB (10-50 pg/mL) TGF-B1 (10-70 pg/mL) VEGF (15-85 pg/mL) IGF-1 (0.5-19.5 pg/mL) Plaquetas (150,000-350,000/mm3) Leucocitos (3,200-9,000/mm3) Granulocitos Mononucleares CD 34+ 45 pg/mL 35 pg/mL 55 pg/mL 13 pg/mL 265,000/mm3 5,600/mm3 60% (3,330/mm3) 35% (1,960/mm3) 0.5/mm3 360 pg/mL 320 pg/mL 560 pg/mL 175 pg/mL 1,250,000/mm3 20.000/mm3 24% (480/mm3) 70% (14,000/mm3) 175/mm3 una fuente de fácil acceso a los factores de crecimiento contenidos en ellas. Tiene un pH entre 6.5 y 6.7. Proviene de la propia sangre del paciente, por lo que está libre de enfermedades trasmisibles y no puede ocasionar reacciones de hipersensibilidad. El conteo de plaquetas de un plasma rico en plaquetas óptimo es discutible. Según la Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios (AEMPS), debe contener una cifra de plaquetas superior a las concentra- 131 Revista de Hematología ciones séricas basales consideradas normales; es decir, entre 200,000 y 450,000 plaquetas/ mm3, pero cada vez más los autores dedicados a esta materia consideran un plasma rico en plaquetas de calidad cuando la cantidad de plaquetas obtenida en el producto final supera 1,000,000/mm3.4,5 Métodos de obtención Los métodos de obtención y preparación del plasma rico en plaquetas son muy diversos, dependen de si se utiliza un único procedimiento o doble de centrifugación, el tiempo de la misma, así como el tipo de filtro utilizado, de los que en la actualidad se dispone de más de 40 en el mercado. 132 Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 No se ha hallado una clara correlación entre la capacidad de mayor concentración plaquetaria y las concentraciones de factores de crecimiento plaquetarios determinados en el producto final con independencia del tipo de filtro y procedimiento utilizado para su elaboración. Tampoco se ha observado diferencia en el producto final obtenido con independencia del tipo de procedimiento y filtro utilizado en relación con la edad y sexo del paciente. Según los estudios realizados más recientes, los plasmas ricos en leucocitos contienen mayores concentraciones de factores de crecimiento tipo VEGF y TGF-B, mientras que en los plasmas ricos en plaquetas sin aprovechamiento de la capa leucocitaria se lograría concentrar mayor cantidad de factores de crecimiento tipo factor de crecimiento de origen plaquetario e IGF-1.6 En cuanto a la temperatura, según la mayoría de expertos consultados, para la producción de un plasma rico en plaquetas adecuado la temperatura óptima de preparación durante el procedimiento debe ser de 16 a 22ºC. Este intervalo de temperatura es el que más capacidad de concentración plaquetaria y factores de crecimiento produce, porque mantiene mayor supervivencia de la plaqueta, independientemente del tipo de procedimiento y filtro utilizados con media de conteo plaquetario de 1,150,000/mm3 (intervalo: 750,000-1,500,000/ mm3), así como concentraciones de factores de crecimiento plaquetarios y plasmáticos entre cinco y siete veces mayor a las concentraciones normales halladas en sangre periférica.6 En cuanto a la parte celular contenida en el plasma rico en plaquetas, en los plasmas ricos en plaquetas ricos en leucocitos con aprovechamiento de la fracción Buffy-Coat del centrifugado final, la concentración leucocitaria se incrementa tres y cinco veces más que en sangre periférica con predominio de mononucleares (90% del total leucocitario, hasta 15% de ellas con marcaje positivo para CD 34). Según el tipo de filtro o pipeteado y procedimiento de centrifugación utilizado, se pueden obtener diferentes componentes plasmáticos; por ejemplo: plasma rico en plaquetas y factores de crecimiento plasmático, plasma rico en plaquetas y escaso en factores de crecimiento plasmático, plasma rico en factores de crecimiento plasmático y escaso en plaquetas o plasma rico en plaquetas y leucocitos. De todos los métodos de obtención, cuatro procedimientos destacan sobre los demás, porque son los más estandarizados y utilizados por la mayoría de autores. Dos de ellos utilizan un doble sistema de centrifugación, mientras que en los otros dos el procedimiento de centrifugación es único. En el Cuadro 3 se especifican estos cuatro métodos y el sistema de centrifugación utilizado en cada uno de Según lo anterior, sería posible la preparación de lo que se denomina un plasma rico en plaquetas a la carta, según la fracción plasmática y celular que se quiera potenciar en función de la aplicación clínica que se le quiera dar.7 Alcaraz-Rubio J. Plasma rico en factores de crecimiento plaquetario Cuadro 3. Métodos de obtención de plasma rico en plaquetas y conteo promedio plaquetario Procedimiento Autores Centrifugado Recentrifugado de plasma Conteo promedio de plasma rico en plaquetas 1 García y col. (2005) 1,800 rpm durante 8 min ininterrumpidamente 1,800 rpm durante 8 min 191% 2 Anitua y Andía (2000) 1,800 rpm durante 8 min ininterrumpidamente No 90% 3 Okuda y col. (2003) Kawase y col. (2003) 2,400 rpm durante10 min ininterrumpidamente 3,600 rmp durante 15 min 32% 4 Deobarrio y col. (2000) Camargo y col. (2002) 5,600 rpm durante 6 min ininterrumpidamente No 5% ellos y el promedio de concentración plaquetaria final obtenido.7,8 Al comparar estos cuatro métodos de obtención de plasma rico en plaquetas podemos observar que el mayor número de plaquetas obtenido equivalente a un promedio de 191% respecto al conteo basal en sangre total corresponde al protocolo de obtención de García y colaboradores (2005), seguido de la técnica estandarizada de Anitua y Andía (2000), con un promedio de conteo plaquetario respecto al basal en sangre periférica de 90%. En tercer lugar se encontraría el procedimiento de centrifugación de Okuda y colaboradores y Kawase y su grupo (2003), con 32% de conteo plaquetario final obtenido respecto al basal y, por último, en torno a 5% estaría el protocolo de obtención de plasma rico en plaquetas diseñado por Camargo y su grupo (2002) y Deobarrio y colaboradores (2000).9 La activación del plasma rico en plaquetas requiere reemplazo del calcio e iniciación de la cascada de la coagulación sanguínea. Para autores como Anitua, esto se logra agregando cloruro cálcico a 1% (1 cc); otros, como Marx, usan conjuntamente con esta solución trombina bovina (1.5 cc); a diferencia de Anitua que no describe su uso, porque existen ciertas controversias con la utilización de la misma porque se han detectado anticuerpos antitrombina en pacientes que han sido tratados activando el plasma rico en plaquetas con este procedimiento.10 Administrar una mayor cantidad de solución activadora, lejos de ser benéfico, es contraproducente, debido a que un mayor volumen de esta solución no acelerará el proceso de activación de la coagulación, sino que reducirá su velocidad de formación o la inhibirá totalmente, diluyendo la concentración de fibrinógeno, factor importante en la formación del coágulo.7,10 Por último, la administración de plasma rico en plaquetas sistémica o endovenosa no precisa de activación previa del producto final obtenido, porque su entrada en el torrente sanguíneo produce la activación natural a través del propio calcio iónico sérico. Marco legal de aplicación del plasma rico en plaquetas En la actualidad, el concentrado final de plasma rico en plaquetas carece de ficha técnica para su aplicación. La prescripción de este concentrado autólogo deben realizarla médicos, odontólogos o podólogos dentro de su campo de acción clínica. Aunque la preparación sea por un tercero, el 133 Revista de Hematología responsable último que garantice las características del mismo será la persona prescriptora. Previo a la obtención del producto, el paciente debe pasar por un control analítico serológico, bioquímico y hematológico para verificar la idoneidad o no del tratamiento. Al respecto, países como Argentina disponen de una normativa concreta para la obtención de plasma rico en plaquetas, así como las distintas fracciones plasmáticas por parte exclusiva y legal de un hemoterapeuta o especialista en Hematología y hemoterapia, aplicando la misma normativa como a cualquier tipo de hemoderivado durante una autotransfusión. Durante el proceso de obtención, si bien existen numerosos protocolos, la normativa vigente distingue entre procedimiento de obtención abierto, donde hay una exposición directa de la sangre o cualquiera de sus componentes durante el proceso de manipulación al medio ambiente, en cuyo caso, y siguiendo la normativa de cada comunidad autónoma, todo el procedimiento debe realizarse de forma estéril y bajo una campana de flujo laminar; o procedimiento cerrado, utilizando unos filtros específicos con obligado marcado CE, en cuyo caso deben seguirse las normas del fabricante en concreto. Campos de aplicación del plasma rico en plaquetas Son numerosos y cada vez más crecientes los campos donde se está aplicando el plasma rico en plaquetas y sus distintas fracciones. Vamos a repasar por especialidades las aplicaciones donde parece que hay más consenso, con hincapié en aquéllas en las que hay evidencia científica de mayor soporte; tarea, por otro lado, no exenta de dificultad debido a la gran controversia existente entre la comunidad médica, incluso para una misma aplicación clínica y la ausencia de estudios de peso científico en forma de ensayos 134 Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 clínicos adecuadamente diseñados para tal efecto; si bien, como veremos, la mayor parte de indicaciones se basa en series de casos clínicos e, incluso, casos clínicos aislados de difícil reproducción por los autores como para diseñar estudios de mayor fuerza científica. Reumatología, Traumatología y Medicina deportiva Éste es, sin duda, el campo de mayor proyección en cuanto a la prescripción de plasma rico en plaquetas, incluso sobrepasa en gran medida la evidencia científica clínica existente. El plasma rico en plaquetas ha demostrado in vitro que regula las citocinas que intervienen en procesos de neovascularización, proliferación de tenocitos, fibroblastos, miocitos y condrocitos, así como el reclutamiento de células inflamatorias con efecto inhibitorio de citocinas proinflamatorias (IL-1) con actividad antiinflamatoria y regenerativa. Epicondilitis. La epicondilitis es una tendinopatía limitante, con clara tendencia a la cronificación y con respuesta aleatoria parcial al tratamiento convencional con infiltraciones de corticoesteroides y rehabilitación. Los estudios del uso de plasma rico en plaquetas en este tipo de pacientes como única infiltración resultaron en mejoría funcional y analgésica significativa en 85% de los casos sin comunicar efecto adverso alguno. De todas maneras, se necesita mayor profundización, debido a que los estudios existentes incluyen un escaso número de pacientes.11,12 Fascitis plantar. Al igual que en el resto de las tendinopatías con tendencia a la cronificación, se revisó un estudio de una serie de casos de pacientes con fascitis plantar resistente a tratamiento con antiinflamatorios no esteroides, inmovilización, fisioterapia e infiltración con corticoesteroides, a quienes se les infiltró plasma rico en plaquetas con mejoría significativa funcional y disminución del dolor en 90% de ellos. También en este caso Alcaraz-Rubio J. Plasma rico en factores de crecimiento plaquetario son necesarios más estudios para objetivar el beneficio en esta enfermedad.13,14 Osteoartritis de rodillas. Es una aplicación relativamente reciente que aglutina en este momento la mayor parte de la investigación clínica actual. Los estudios de series de casos de pacientes en comparación con infiltración simple de ácido hialurónico documentan incluso 35% de respuesta al plasma rico en plaquetas infiltrado, contra 10% al ácido hialurónico. Si bien estos estudios incluyen pocos pacientes, la importancia estriba en que por vez primera se especifican las concentraciones de factores de crecimiento contenidas en el plasma rico en plaquetas infiltrado, subrayando la importancia de reducir la fracción leucocitaria para no potenciar el efecto proinflamatorio del producto final obtenido. En estos últimos años, las series de casos clínicos más extensas comunicaron su éxito al momento de aplicar infiltraciones de plasma rico en plaquetas; quizá la serie más numerosa es la de un grupo español que incluyó 261 pacientes con tres infiltraciones de plasma rico en plaquetas separaradas 15 días entre sí, con seguimiento de un año, con mejoría funcional en 67% de los pacientes, sobre todo los más jóvenes y los que tenían una evolución más incipiente de la enfermedad.15-20 Otras aplicaciones. Se ha visto que el plasma rico en plaquetas es útil en la tendinopatía aquílea crónica, sobre todo cuando se prescriben previamente infiltraciones con ozono,21-23 tendinopatía rotuliana,16-18 en la reparación del manguito de los rotadores,24-26 en la reparación del ligamento cruzado anterior,18 ya sea junto con plastia de isquio-tibiales o injerto con hueso-tendón-hueso, en la reparación meniscal de la articulación de la rodilla,16,17 en la reconstrucción del labrum glenoideo o de la cadera y finalmente en lesiones musculares parciales y totales, realizando en este caso la reparación abierta y reforzando con plasma rico en plaquetas posteriormente.27,28 En el Cuadro 4 se resumen las diferentes aplicaciones del plasma rico en plaquetas en Traumatología y Ortopedia, así como los distintos estudios que lo avalan. Odontología y Cirugía maxilofacial Es quizás otro de los campos en el que el plasma rico en plaquetas ha experimentado un desarrollo más visible. No obstante, existe una fuerte controversia y discusión en cuanto a la utilidad del plasma rico en plaquetas en la recuperación del lecho alveolar dentario junto a plastia de hueso liofilizado; se incrementa el reborde alveolar, mejora la cicatrización de los tejidos blandos y se facilita una mayor cohesividad del injerto particulado, lo que lo haría útil en implantología dental. Otros autores son más pesimistas al momento de reproducir estos resultados debido a las grandes diferencias de factores de crecimiento presentes en el plasma rico en plaquetas, según el método de obtención del producto final aplicado.29-32 Este hecho llevó a pensar que a mayor concentración de esos factores, más eficaz sería la regeneración, promoviéndose la utilización de sistemas que obtenían mayor concentración de factores de crecimiento, sistemas que fueron homologados y que se utilizaron sin pensar en la concentración obtenida de producto final. Lejos de conseguir el efecto deseado, in vitro se observó completamente lo contrario cuando la concentración de factores sobrepasó cierto nivel. De ahí la fuerte polémica surgida en su uso alimentado en muchos casos por la falta de sistematización en la obtención del plasma rico en plaquetas, que puede ser incorrecta. Ginecología Se han usado geles de plasma rico en plaquetas para el tratamiento de heridas quirúrgicas en diversas cirugías mayores, con efectos positivos en aspectos como disminución del dolor poso- 135 Revista de Hematología Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 Cuadro 4. Aplicaciones del plasma rico en plaquetas en Traumatología y Cirugía ortopédica y evidencia científica Estudio Tendinopatía crónica Lesión crónica superior a seis semanas 97% buenos resultados 8% malos resultados Epicondilitis resistente Resultados Tasa de éxito 79% Dolor crónico en el epicondilo lateral 60% de mejoría a 8 semanas, 81% a 6 meses y 93% a 12 meses Tendinopatía aquílea El plasma rico en plaquetas no generó daños y la recuperación fue más rápida Tendinitis rotuliana Progreso de un paciente con rotura aquílea Plasma rico en plaquetas vs infiltración salina Tendinitis crónica resistente, plasma rico en plaquetas vs infiltración salina Regeneración y regreso más rápido a la actividad Mismos resultados aunque menos inconvenientes Sin diferencias significativas Estudio en animales Respuesta inmunogénica mayor sin marcadores anormales Incremento de las concentraciones de colágeno I y II Plasma en tendón rotuliano de ratas Tendinitis del codo Fascitis plantar 20 atletas con tendinitis rotuliana crónica (tres infiltraciones de plasma rico en plaquetas) Tendón rotuliano de 31 pacientes durante seis meses Plasma rico en plaquetas vs otros tratamientos Infiltraciones de plasma rico en plaquetas vs infiltraciones de corticoesteroides El plasma rico en plaquetas fue más eficaz en estados degenerativos 79% de buenos resultados con plasma rico en plaquetas vs 51% con corticoesteroides Uso del plasma rico en plaquetas en Aumenta la angiogénesis, se acelera epicondilitis la cicatrización y hay mayor calidad histológica Infiltraciones de plasma rico en plaque- Beneficios a largo plazo tas vs infiltraciones de corticoesteroides Crónica 6/9 alivio sintomático a 8 semanas y 78% de alivio completo de los síntomas al año Mejor tratamiento para evitar recaídas PRP vs otros tratamientos Fascitis plantar crónica 136 70% total recuperación a seis meses, del resto, 80% con disminución del dolor Mejores resultados y mejor calidad Método seguro y reduce el dolor Acortamiento del retorno a la actividad en 27% No hay consenso, transformación más rápida del LCA con plasma rico en plaquetas 11 deportistas de élite con desgarros Retorno a la competición más rápida y musculares se acortó 30% la recuperación 20 deportistas profesionales Buenos resultados 8 jugadores de futbol americano y 6 Retorno a la competición más rápido de baloncesto Plasma rico en plaquetas en animales Acorta el periodo de recuperación del músculo Autores Gandia y col. Edwards y Calandruccio Mishard y Pavelko Sánchez y col. Filardo y col.16 De Vos y col. De Jonge y col. Taylor y col. Kajikawa y col. Kon y col.15 Filardo y col.23 Van Ark y col.17 Gosens y Perbons Lyras y col. Coombes y col. Barret y Erredge13 Glazer y col.14 Martinelli y col. Lesiones ligamentarias Reconstrucción de LCA agudas Reconstrucción del LCA Sampson y col.20 Lesiones musculares Wright-Carpenter Ventura y col.18 Sánchez y col. Cugat y col. Hammond y col. Alcaraz-Rubio J. Plasma rico en factores de crecimiento plaquetario peratorio con menor requerimiento analgésico convencional. En un estudio de control de casos, la aplicación de geles con factor de crecimiento de origen plaquetario recombinante en dehiscencias de cirugía abdominal mostró un tiempo de cierre significativamente más corto, en comparación con los controles, sin efectos colaterales de importancia.33,34 Asimismo, el plasma rico en plaquetas se ha usado in vitro como “tapón” en el tratamiento de la ruptura prematura de membranas fetales, para sellar de manera impermeable los defectos en membranas biológicas.35 Sin embargo, no se ha informado el efecto del plasma rico en plaquetas en aspectos como la infección o la hemorragia trans y posoperatoria. Cirugía cardiovascular Si bien se ha prescrito para facilitar la cicatrización de heridas quirúrgicas cardiovasculares, existen estudios que no han demostrado un efecto significativo en el tratamiento de éstas.36 Cirugía plástica En un estudio de serie de casos, se observó que la aplicación de un colgajo cutáneo sobre un lecho quirúrgico donde se administró previamente plasma rico en plaquetas redujo cualitativamente el volumen de sangrado capilar del lecho quirúrgico, disminuyó la necesidad de drenajes o vendajes compresivos y el dolor posoperatorio.37 Hay pocos estudios que demuestren firmemente la utilidad del plasma rico en plaquetas en el tratamiento de quemaduras. Los estudios experimentales demostraron que la aplicación de un gel de plasma rico en plaquetas en quemaduras estimula una intensa reacción inflamatoria, con incremento significativo de las proteínas de matriz extracelular, proliferación de fibroblastos, colágeno y tejido de granulación. Sin embargo, no se ha documentado una verdadera aceleración en la epitelización de las heridas. Por tanto, aún no hay evidencia científica fuerte para recomendar el plasma rico en plaquetas en el tratamiento de quemaduras. Hay variables, como tipo de cicatrización, extensión de la quemadura, espesor de la misma, tiempo de aplicación o tasa de infección que aún precisan mayor estudio.38 Cirugía general Se ha postulado que el uso de fibrina rica en plasma rico en plaquetas como pegamento para la colocación de mallas en la corrección de hernias inguinales mejora la tolerancia al material, el dolor posoperatorio y disminuye la cantidad de material de sutura para la fijación de las mismas; no obstante, aún se necesitan estudios mejor diseñados para perfilar esta aplicación clínica.39 Asimismo, su uso parece estar bien fundamentado científicamente en las úlceras diabéticas y en las úlceras por presión; acelera significativamente el cierre de las mismas y disminuye el dolor sin efectos secundarios significativos.40,41 Oftalmología Estudios experimentales in vitro demostraron que el plasma rico en plaquetas incrementa la migración de fibroblastos y queratinocitos conjuntivales. Paralelamente, algunos estudios clínicos han objetivado efectos positivos del plasma rico en plaquetas en úlceras corneales, así como la queratoconjuntivitis seca del síndrome de Sjögren, contra el que actualmente no existe un tratamiento satisfactorio.42,43 En el caso de las quemaduras oculares, la inyección subconjuntival de plasma rico en plaquetas 137 Revista de Hematología en una serie de pacientes mostró significativamente una epitelización más rápida de la córnea y conjuntiva; no obstante, esto no ha podido demostrarse posteriormente.44 Otorrinolaringología Los estudios preclínicos y clínicos de su prescripción en la timpanoplastia tipo 1 de pacientes con perforación timpánica señalan que podría ser útil en el cierre del defecto; no obstante, aún se requieren estudios de mayor evidencia científica para corroborar este hecho, al no contar esos estudios con grupos control.45,46 Dermatología Los estudios experimentales demostraron que las células de las papilas dérmicas expuestas a plasma rico en plaquetas incrementan significativamente su proliferación, lo que se relacionó con aumento de la señalización de Akt y ERK, así como regulación positiva del factor de crecimiento fibroblástico 7 y la B-catenina, que son reconocidos factores de crecimiento del cabello. Aunque aún se necesitan estudios científicos de mayor potencia, el plasma rico en plaquetas abre un abanico de posibilidades en el tratamiento de la psoriasis, vitíligo, alopecia, liquen plano y otras aplicaciones cosméticas.37,47 Neurología y Neurocirugía Los estudios experimentales preclínicos demostraron la capacidad de cicatrización y neurorregeneración con recuperación funcional al aplicar conjuntamente plasma rico en plaquetas y sutura de los bordes del nervio lesionado, debido a un incremento significativo de axones en el segmento distal; sin embargo, estos estudios aún son experimentales, si bien se ha documentado algún caso clínico aislado con resultados positivos. Este hecho abre una puerta a la posibilidad de neuroestimulación 138 Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 en pacientes con tara neurológica sobre todo de origen hipóxico isquémico que siguen programas de neurorrehabilitación activa. Aún se necesitan ensayos clínicos adecuadamente fundamentados en este sentido para valorar el potencial beneficio clínico que el plasma rico en plaquetas puede aportar en este campo.48,49 Otras aplicaciones Desde el punto de vista de la experimentación, la evidencia científica respecto del papel estimulante del plasma rico en plaquetas en la proliferación de diversas líneas celulares epidérmicas y mesenquimales ha llevado a utilizarlo como soporte para el cultivo y expansión clonal in vitro de las mismas en el laboratorio. En el Cuadro 5 se resumen las diferentes aplicaciones clínicas que tiene en la actualidad el plasma rico en plaquetas, así como la evidencia científica existente en cada caso. Efectos colaterales de la aplicación de plasma rico en plaquetas La utilización de esta técnica, siempre que se haga siguiendo la normativa vigente en cuanto a control de calidad y trazabilidad, está exenta prácticamente de efectos colaterales, porque se trata de un producto autólogo. Los efectos comunicados en la mayoría de los casos son banales: pequeño hematoma o eritema en el lugar de la punción o infiltración, así como febrícula durante las primeras 24 a 48 horas debido a los mediadores de la inflamación, controlable con antipiréticos convencionales. Un hecho que tradicionalmente se le ha atribuido al plasma rico en plaquetas es su posibilidad de producir un efecto oncogénico, mediante la actividad de los factores de crecimiento de poder activar ciertas vías antiapoptósicas de clonas tumorales en pacientes predeterminados Alcaraz-Rubio J. Plasma rico en factores de crecimiento plaquetario Cuadro 5. Aplicaciones del plasma rico en plaquetas en distintos campos de la Medicina y evidencia científica Área clínica Aplicaciones Evidencias científicas Padecimientos músculo-esqueléticos Tendinopatías Meniscopatía Lesiones ligamentarias Fracturas óseas Fascitis Desgarros musculares Osteoartritis Estudios preclínicos y clínicos (casos-control) Heridas quirúrgicas Cirugía ginecológica (abdominales) Estudios clínicos (series de casos) Cirugía cardiovascular (esternales y accesos vasculares) Cirugía plástica (colgajo cutáneo) Quemaduras Cutáneas y corneales Úlceras crónicas Diabéticas Vasculares Por presión Oftalmología Úlceras corneales Ojo seco Timpanoplastia Otorrinolaringología Cirugía estética y Dermatología Neurología y Neurocirugía Estudios clínicos (casos clínicos aislados) Estudios clínicos (casos-control) Estudios preclínicos y clínicos (series de casos) Estudios preclínicos y clínicos (serie de casos clínicos) Líneas de expresión facial Estudios preclínicos y clínicos (serie Implantes de cabello de casos clínicos) Sutura de nervios periféricos y neurorrehabili- Estudios preclínicos y clínicos tación (casos clínicos aislados) para ello. Este hecho sólo ha podido corroborarse in vitro explicado por la estimulación del antiportador Na+/K+ que teóricamente podría acelerar un proceso maligno localmente presente e incluso inducirlo de novo; si bien en la práctica médica no existe evidencia alguna que permita pensar que los procedimientos de aplicación de los factores de crecimiento pudieran constituir un peligro de degeneración neoplásica ni influir en la progresión tumoral o la diseminación metastásica en pacientes previamente no diagnosticados de proceso oncológico maligno.50 Contraindicaciones del plasma rico en plaquetas Según la mayoría de los autores consultados, se desaconseja el plasma rico en plaquetas en los pacientes con trastornos de la coagulación, he- mostasia o en tratamiento con anticoagulantes orales o antiagregantes, recuentos plaquetarios en sangre total menores de 100,000/mm 3, embarazo, infección activa o tumores por el efecto de progresión del proceso inflamatorio mediado por la infección, así como de diseminación teórica tumoral en pacientes ya diagnosticados que producirían los factores de crecimiento. CONCLUSIÓN Sin duda, nos encontramos ante una nueva era de tratamiento en el campo novedoso de la Medicina regenerativa con un abanico de posibilidades de aplicaciones clínicas extraordinarias, creciente, pero que precisa un proceso de sistematización científica y médica que permita encauzarlo de manera segura y eficaz en las aplicaciones en que realmente exista una evidencia 139 Revista de Hematología científica de peso suficiente para su administración. Para ello, hay dos requerimientos: primero, el consenso de los autores que se dedican a la producción y aplicación de este tratamiento con el fin de estandarizar los procedimientos de obtención más eficaces y que permitan la adecuada trazabilidad o seguimiento del producto final obtenido, según la aplicación clínica que se le pretenda dar y, por otro lado, el diseño de ensayos clínicos que reproduzcan y establezcan pautas de administración adecuadas a tal efecto. Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 Para establecer una ficha técnica se necesitan estudios científicos adecuados bajo la forma de ensayos clínicos que permitan estandarizar las técnicas de obtención dependiendo de la composición celular y proteica del producto final conseguido y que sea reproducible por todos los autores, así como pautas concretas de administración para cada aplicación clínica donde sea factible su prescripción en la Medicina regenerativa. Agradecimientos Hoy día, aún estamos lejos de conseguirlo, debido a que para las aplicaciones clínicas vigentes la evidencia científica existente es débil, basada en series de casos clínicos o estudios de control de casos en los supuestos más positivos. La existencia creciente de diversos protocolos de obtención, el bajo control sobre el componente del producto final obtenido y la variedad de aplicaciones clínicas dificultan llegar a algún tipo de consenso acerca de la técnica o procedimientos de obtención más fiables y adecuados y, en segundo lugar, la elaboración de ensayos clínicos adecuados que permitan probarlos en los diferentes padecimientos susceptibles de ello. Según lo publicado al respecto, el plasma rico en plaquetas es una técnica bien tolerada, considerada desde hace dos años medicamento, su prescripción está restringida a médicos, odontólogos y podólogos; en la actualidad carece de ficha técnica y no puede considerarse tratamiento estándar contra ninguna entidad médica en que se pretenda administrar, si bien se acepta que pueda prescribirse como tratamiento coadyuvante junto a los convencionales para lograr la mejoría clínica y funcional del paciente. Se precisan estudios básicos y de Medicina traslacional que permitan comprender mejor los mecanismos fisiopatogénicos que subyacen a sus efectos regenerativos. 140 A mi mujer y a mi hijo, por su paciencia y dedicación, por su estímulo y ánimo, sin los que no hubiera sido posible la ejecución de este artículo. REFERENCIAS 1. Klinger, MH. The storage lesion of platelets: ultrastructural and functional aspects. Ann Hematol 1996;73:103-112. 2. González-Villalva A. Sangre. Capítulo 6. En: Fortoul y Castell. Histología y biología celular. México: McGraw-Hill Interamericana, 2010;147-154. 3. Benito L. Aspectos estructurales y vías metabólicas. En: Bioquímica. Benito L, editor. 2a ed. Madrid: Editorial McGraw Hill Interamerica, 1991;2:1207-1226. 4. Beca T, Hernández G, Morante S, Bascones A. Plasma rico en plaquetas. Una revisión bibliográfica. Av Periodon Implantol 2007;19:39-52. 5. Alsousou J, Thompson M, Hulley P, Noble A, Willett K. 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RESUMEN Encontrar el esquema diagnóstico más eficiente para asegurar la mayor sensibilidad y especificidad posible en la detección de proteínas monoclonales en pacientes con mieloma múltiple puede presentar algunas controversias. Es el caso de los inmunoensayos para la cuantificación de cadenas ligeras que sigue generando debate actualmente, aun cuando las evidencias clínicas son muy fuertes. Existen dos tipos de ensayo comercialmente disponibles en la actualidad para la determinación de cadenas ligeras κ y λ. Un tipo de inmunoensayo cuantifica las cadenas ligeras totales κ y λ (libre y unidas a las cadenas pesadas). Otro tipo de inmunoensayo cuantifica solamente las formas libres de κ y λ en forma específica, sin reaccionar con las formas unidas. El uso actual del ensayo de cadenas totales ocurre a pesar de las recomendaciones internacionales que indican que el método no es suficientemente sensible para su uso en la rutina clínica. Por ende, las muestras que contengan grandes cantidades de cadenas ligeras libres pueden ser completamente ignoradas usando la técnica de cadenas ligeras totales. Varios estudios compararon la sensibilidad de los métodos de cadenas ligeras totales y libres, con el fin de evaluar el efecto clínico. El objetivo de este artículo es aclarar algunos conceptos de los fundamentos del ensayo de cadenas ligeras libres en suero, distinguiéndolo del ensayo de cadenas ligeras totales en suero y comparar la utilidad clínica de ambas pruebas. Palabras clave: inmunoensayos para cadenas ligeras en suero, mieloma múltiple, diagnóstico. Light chains: Total or free? Which ones should be measured ABSTRACT Finding the most efficient diagnostic scheme that ensures the highest possible sensitivity and specificity for detection of monoclonal proteins in patients with multiple myeloma may present some controversy. This is the case of immunoassays for the quantification of light chains, which are still generating discussion although clinical endorsements are very strong. There are two types of assays commercially available currently that measure κ and λ light chains in serum. One type measures total (free and bound to heavy chains) light chains. The other type measures only free light chains. The current use of total light chain assay occurs in spite of international warnings that indicate the method is not sensitive enough for routine clinical use. Indeed, samples containing large amounts of free light chains may be completely missed using the total light chain technique. Different studies had compared the sensitivity www.nietoeditores.com.mx Recibido: 22 de enero 2015 Aceptado: 25 de marzo 2015 Correspondencia: Florencia Delgado PhD The Binding Site Inc., 5889 92121 Oberlin Drive, San Diego, CA, USA [email protected] Este artículo debe citarse como Delgado F. Cadenas ligeras: ¿totales o libres? Qué medir y por qué. Rev Mex Hematol 2015;16:143-151. 143 Revista de Hematología Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 between methods, both total and free light chain assays, in order to evaluate the clinical impact. The aim of this review article is to clarify some concepts about the foundations of the free light chain assay, distinguishing it from the total light chain assay and to compare the clinical utility of both tests. Key words: immunoassays for serum light chains, multiple myeloma, diagnosis. GAMMAPATÍAS MONOCLONALES Las gammapatías monoclonales tienen su origen en clones de células plasmáticas con proliferación descontrolada que producen inmunoglobulinas idénticas en exceso, lo que se observa generalmente como un “pico” en la zona gamma de las electroforesis de proteínas en suero. Este pico monoclonal, paraproteína o proteína M, que por lo general, aunque no universalmente se observa en estos pacientes, puede corresponder a un exceso de inmunoglobulina intacta, a un exceso exclusivo de cadenas ligeras κ o λ producidas sin una cadena pesada asociada, o a ambas, tanto la inmunoglobulina intacta como su cadena ligera asociada, secretada de manera libre. Las gammapatías monoclonales más frecuentes incluyen: gammapatía monoclonal de significado incierto, mieloma múltiple y amiloidosis.1 Cualquiera que sea el caso en cada una de estas enfermedades, la evaluación de la proteína monoclonal circulante es un pilar fundamental para diagnóstico, pronóstico y seguimiento y se ha convertido en una herramienta valiosa para el médico porque representa el marcador de producción tumoral. Pruebas de laboratorio recomendadas Con el objetivo de poner en evidencia esta producción de proteínas monoclonales y aclarar 144 el diagnóstico en pacientes con sospecha de mieloma múltiple, además del examen físico y el estudio de la médula ósea se debe realizar un minucioso estudio proteico que permita identificar el tipo y la cantidad de proteína monoclonal producida por el tumor. Los estudios proteicos habitualmente utilizados para este fin incluyen: • Electroforesis de proteínas en suero y orina. • Medición de IgG, IgA e IgM en suero. • Inmunofijación en suero y orina. • Concentración y relación de cadenas ligeras libres en suero. En 2009, el Grupo Internacional de Trabajo de Mieloma (International Myeloma Working Group, IMWG) elaboró un conjunto de recomendaciones acerca del esquema de diagnóstico inicial referido a la evaluación de la producción de proteína monoclonal por parte del paciente.2 En estas guías, actualmente aceptadas y utilizadas en gran parte del mundo, se recomienda la realización de una electroforesis de proteínas en suero junto a la medición de cadenas ligeras libres sobre la misma muestra de suero y como reflejo (es decir, si una o ambas pruebas diera positivo) una inmunofijación en suero para tipificar la gammapatía monoclonal encontrada. Este esquema, que utiliza sólo suero como Delgado F. Cadenas ligeras totales y libres fuente de investigación, ha demostrado ser el más eficiente y simple para cubrir el diagnóstico, considerando los diversos tipos de producción proteica que pudiera tener un potencial paciente con una gammapatía monoclonal. Tiene la ventaja adicional de no requerir análisis de las proteínas en orina de 24 horas a priori en todos los pacientes (excepto los casos de amiloidosis). Una actualización de estas recomendaciones internacionales la publicó recientemente el IMWG,3 dando un paso más hacia la identificación adecuada y temprana de pacientes con mieloma múltiple. En esta actualización, Rajkumar y su grupo sugieren utilizar una serie de biomarcadores de malignidad definidos junto al análisis de médula ósea del paciente para realizar el diagnóstico de mieloma múltiple. Entre estos biomarcadores establecen la relación de cadenas ligeras libres ≥ 100 como criterio de malignidad (relación cadena involucrada-cadena no involucrada). Las guías del IMWG establecen claramente que esa medición se debe realizar con el ensayo de cadenas ligeras libres en suero.3 Éste es el esquema y escenario diagnóstico actual; sin embargo, en algunos laboratorios se plantea la duda acerca del tipo de ensayo a realizar para la determinación de las cadenas ligeras en suero. En los próximos apartados se hablará de los fundamentos de cada uno de los ensayos y de su utilidad clínica. Ensayo de cadenas ligeras libres en suero Las células plasmáticas son las responsables de la producción de inmunoglobulinas intactas (IgG, IgA, IgM, IgD e IgE), además y aun en condiciones fisiológicas, estas células producen y secretan un exceso de cadenas ligeras κ o λ.4 Ambas cadenas, tanto κ como λ, circulan de manera libre, aunque en general, κ circula en forma de monómero (aproximadamente 25 kDa) mientras que λ lo hace como dímero (aproximadamente 50 kDa). Las concentracio- nes en suero de las inmunoglobulinas intactas rondan los g/L; por ejemplo, el valor normal de IgG es de aproximadamente 7 a 17 g/L (o, lo que es igual, 700 a 1,700 mg/dL o 7,000 a 17,000 mg/L), mientras que las cadenas ligeras libres circulan en sangre en condiciones normales en valores muy inferiores, unas 1,000 veces menores (valores de hasta 20 o 25 mg/L o, lo que es igual, 2-2.5 mg/dL). Las concentraciones séricas de cadenas ligeras libres dependen del equilibrio entre la producción por las células plasmáticas y el metabolismo renal. Por ello, en circunstancias normales muy poca cantidad de κ y λ se encontrará en la orina, el riñón es muy eficiente en su función mientras no se vea sobrepasado en su capacidad de reabsorción por una excesiva producción.4 Alrededor de 30 gramos de proteínas pequeñas pueden ser metabolizadas al día por el riñón y, teniendo en cuenta que la producción normal de κ y λ es de alrededor de 0.5-1 gramo diario, es fácil comprender que muy poca proteína aparecerá en la orina.4 Las inmunoglobulinas intactas, por otro lado, tienen otro mecanismo de metabolización que no utiliza al riñón como órgano de filtrado.5 Sin olvidar que κ o λ también formarán parte de las inmunoglobulinas intactas, recordemos que hay enfermedades en las que sólo existe producción monoclonal de estas pequeñas proteínas. El 100% de los mielomas múltiples de cadena ligera,6,7 alrededor de 70% de los llamados mielomas múltiples no secretores8 (cuya denominación actual es mieloma múltiple oligosecretor) y la mayor parte de las amiloidosis producen sólo cadenas ligeras.9 Esto hace que sea fundamental contar con un método de laboratorio adecuado para su detección. La medición de κ y λ ha evolucionado mucho desde su primera aparición en el mundo clínico, que data del año 1845.10 Estas “proteínas de Bence-Jones”, identificadas originalmente en la orina de pacientes con mieloma múltiple, 145 Revista de Hematología han recorrido un largo camino hasta hallar un método confiable, sensible y específico para su medición. La introducción en la última década del inmunoensayo de cadenas ligeras libres en suero que utiliza antisuero policlonal (Freelite, The Binding Site Group, Birmingham, UK) representó un gran avance en el tratamiento de las gammapatías monoclonales. Se trata de un ensayo que utiliza anticuerpos policlonales específicos para detectar cadenas ligeras κ y λ sólo cuando éstas se encuentren en forma libre, no unidas a las cadenas pesadas formando parte de las inmunoglobulinas (Figura 1).11 La alta sensibilidad de este ensayo combinado con la posibilidad de calcular una relación κ/λ proporciona al médico la capacidad de medir la cantidad de cadena ligera libre producida por el tumor, identificar la existencia de la enfermedad monoclonal, evaluar las concentraciones de la cadena no implicada y también proporciona información del estado de recuperación inmunológico del paciente en tratamiento. Al medir directa y específicamente las formas libres se miden las formas clínicamente relevantes de las cadenas ligeras; por tanto, resulta una medición de mayor sensibilidad para la detección de la producción de estas proteínas asociadas con los trastornos de células plasmáticas, en compara- Figura 1. A. Diagrama de una inmunoglobulina intacta que muestra la estructura de las cadenas pesadas y ligeras. B. Diagrama de las cadenas ligeras libres κ y λ, que representa los distintos dominios sobre las cadenas ligeras y los epítopes que son reconocidos por el ensayo de cadenas ligeras libres en suero. 146 Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 ción con los ensayos de cadenas ligeras totales, acerca de los que se discutirá a continuación. Los ensayos de medición de cadenas ligeras totales no son suficientemente sensibles para detectar los trastornos de células plasmáticas asociados con cadenas ligeras Los ensayos de cadenas ligeras totales cuantifican las cadenas κ y λ libres y unidas (Figura 2) y, por tanto, tienen intervalos de referencia mucho mayores en suero que el ensayo de cadenas ligeras libres (Cuadro 1). Se ha reportado que el ensayo de cadenas ligeras totales detecta monoclonalidad de cadenas ligeras en muestras de suero cuando las concentraciones de estas proteínas son mayores a 4 o 5 g/L.12,13 Sin embargo, las mediciones de κ y λ totales y su relación no concuerdan de manera consistente con los resultados de la electroforesis o de la inmunofijación y, por tanto, no es una prueba recomendada para la clasificación o la vigilancia de los pacientes Figura 2. Esquematización de la medición de las cadenas ligeras κ y λ con los ensayos de cadenas ligeras totales y libres. El ensayo de cadenas ligeras totales cuantifica las cadenas ligeras libres y las unidas a las cadenas pesadas formando parte de las inmunoglobulinas. El ensayo de cadenas ligeras libres cuantifica sólo las formas libres de las cadenas ligeras. Delgado F. Cadenas ligeras totales y libres Cuadro 1. Intervalos de referencia y valores límites inferiores de sensibilidad para los ensayos de cadenas ligeras libres y cadenas ligeras totales en suero Sensibilidad kappa (mg/L) Intervalo de referencia lambda (mg/L) Sensibilidad lambda (mg/L) 3.3-19.4 6,290-13,500 1,380-3,750 0.3 111 300 5.7-26.3 3,130-7,230 930-2,420 0.4 300 300 con mieloma.12 Debido a la concentración relativamente alta de inmunoglobulinas policlonales circulantes, la cuantificación de las formas libres monoclonales puede quedar completamente enmascarada. Los ensayos de cadenas ligeras totales son menos sensibles para la detección de trastornos de células plasmáticas asociados con las cadenas ligeras debido a la “interferencia” que ocasionan las inmunoglobulinas intactas cuyo aporte puede ocultar la detección de estas proteínas monoclonales. Uno de los mayores efectos negativos al utilizar el ensayo de cadenas totales se pone de manifiesto durante la vigilancia del tratamiento. El hecho de tener valores normales mayores no permite detectar pequeñas alteraciones de cadenas ligeras, por ejemplo, en una recaída o en la enfermedad residual. La sensibilidad de ambos ensayos (cadenas ligeras libres en suero, Freelite® versus cadenas ligeras totales) se comparó en un estudio donde se evaluaron 16 muestras de suero de pacientes con cadenas ligeras monoclonales.14 Las 16 muestras arrojaron resultados anormales utilizando el ensayo de cadenas ligeras libres en suero, mientras que el ensayo de cadenas ligeras totales sólo detectó una anormalidad en 5 de las 16 muestras. Además, una muestra que contenía proteína monoclonal λ se clasificó erróneamente como κ por el ensayo de cadenas ligeras totales (Figura 3). Estos datos indican que el ensayo de cadenas ligeras totales no es capaz de discriminar de manera consistente muestras con mieloma de muestras normales de suero.14 A B 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 1000.00 NR Relación κ/λ libres Cadenas ligeras libres (The Binding Site) Cadenas ligeras totales (Beckman Coulter) Cadenas ligeras totales (Roche) Intervalo de referencia kappa (mg/L) Relación κ/λ totales Parámetro 100.00 10.00 1.00 NR 0.10 0.01 0.00 Figura 3. Comparación de la relación κ/λ de cadenas ligeras totales en suero (A) y la relación κ/λ de cadenas ligeras libres en suero (B) para la identificación de pacientes con producción de proteínas monoclonales de cadena ligera κ y λ. Triángulos azules: pacientes λ; cuadrados negros: pacientes κ; triángulo rojo: paciente κ mal clasificado como λ por el ensayo de cadenas ligeras totales. NR: valor normal. Significado clínico de cadenas ligeras libres vs totales Las cadenas ligeras libres en suero se pueden detectar en concentraciones tan bajas como 0.3 mg/L (kappa) y 0.4 mg/L (lambda) utilizando el inmunoensayo de cadenas ligeras libres (Freelite®).11 Asimismo, las mínimas concentraciones de cadenas ligeras totales detectadas son 111 mg/L y 300 mg/L (kappa) y 300 mg/L (lambda) con los ensayos de cadenas totales (otras dos compañías). Las cadenas ligeras totales ofrecen poco valor clínico para el diagnóstico y vigilancia de gamma- 147 Revista de Hematología patías monoclonales. Según algunos autores, los beneficios del procedimiento de detección de cadenas ligeras totales son limitados y no se recomienda su uso.15 Se advierte que el método de medición de cadenas ligeras totales para la identificación de pacientes con mieloma múltiple de cadena ligera no es suficientemente sensible para su utilización clínica.15 Las mediciones de cadenas ligeras totales no están incluidas en las guías de criterios de respuesta ni de diagnóstico para pacientes con mieloma múltiple y enfermedades relacionadas.2,3,16,17 Recientemente, un estudio mexicano efectuado de muestras de pacientes con mieloma múltiple mostró la poca capacidad de la cuantificación de cadenas ligeras totales en el diagnóstico y seguimiento de estos pacientes. 18 En este estudio, Zamora-Ortiz y su grupo evaluaron mediante las técnicas serológicas de laboratorio convencionales (electroforesis de proteínas en suero, inmunofijación en suero y determinación de cadenas totales en suero) la existencia de proteína monoclonal durante la presentación (62 pacientes) y el seguimiento (29 pacientes) del tratamiento contra mieloma múltiple. Este estudio encontró que la inmunofijación en suero diagnosticó 92% de los casos, evidenciando la existencia de la proteína monoclonal; en segundo lugar, la electroforesis de proteínas en suero mostró sensibilidad de 58%, mientras que la determinación de cadenas ligeras totales sólo logró identificar 45% de las alteraciones en la producción de proteína monoclonal. La baja sensibilidad diagnóstica de la determinación de cadenas ligeras totales en suero para estos pacientes proporciona una evidencia clínica adicional de la falta de valor clínico de esta prueba, en este caso, evaluada en una población de pacientes mexicanos.18 En este estudio se insiste en que el método usado para la cuantificación de cadenas ligeras (totales) no corresponde al más adecuado debido a que se miden cadenas totales y no libres; la medición de cadenas ligeras libres es considerablemente superior a la medición de 148 Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 cadenas totales.18 Esta evidencia local no hace más que validar la recomendación internacional de desestimar el uso del ensayo de cadenas ligeras totales en el laboratorio de rutina para pacientes con discrasias de células plasmáticas; conclusiones que se avalaron y ampliaron en una carta al editor referida al mismo trabajo mexicano.18,19 Asimismo, la utilidad del ensayo de cadenas ligeras libres en suero para el diagnóstico, pronóstico y vigilancia de gammapatías monoclonales ha sido extensamente estudiada por hematólogos y líderes en mieloma en todo el mundo y se ha incorporado en guías internacionales de manejo de pacientes: Diagnóstico El ensayo de cadenas ligeras libres en suero detecta: • 94% de los pacientes con mieloma múltiple de inmunoglobulina intacta,20 • 100% de los pacientes con mieloma múltiple de cadena ligera al momento de la aparición,6,7,21,22 • 68% de los pacientes con mieloma múltiple no secretor, que no pueden ser diagnosticados por métodos tradicionales de laboratorio,8 • 98% de los pacientes con amiloidosis.1,9,23 El ensayo de cadenas ligeras libres en suero tiene mayor sensibilidad que la inmunofijación en orina de 24 horas para la detección de mielomas.24 Vigilancia El ensayo de cadenas ligeras libres en suero se utiliza para medir la respuesta clínica al tratamiento de mieloma múltiple2,7,25,26 y amiloidosis.2,9,23,27,28 Delgado F. Cadenas ligeras totales y libres El ensayo de cadenas ligeras libres en suero predice recaídas en mieloma múltiple de manera más temprana que la inmunofijación.25 En amiloidosis, una reducción de 50% en la concentración de las cadenas ligeras libres involucradas tiene un importante valor pronóstico y se asocia con mejoría de la función orgánica.9,23 Guías de manejo de pacientes Las mediciones de cadenas ligeras libres en suero se han incorporado en muchas guías internacionales y nacionales en distintos países con directrices generales de manejo de pacientes; algunas de ellas son: ° ° ° ° ° ° ° ° Criterios actualizados para el diagnóstico del mieloma múltiple del Grupo Internacional de Estudio de Mieloma.3 Lineamientos para el análisis de cadenas ligeras libres en suero del Grupo Internacional de Estudio de Mieloma.2 The International Uniform Response Criteria in Multiple Myeloma.17 Criterios de Respuesta en Amiloidosis.16,28 Simposio Internacional en Amiloidosis por un panel de consenso de la Sociedad Internacional de Amiloidosis.28 Guías Hematológicas: Mieloma Múltiple-Sociedad Argentina de Hematología.29 Lineamientos en el diagnóstico y manejo de mieloma múltiple: Asociación Brasileña de Hematología, Hemoterapia y Terapia Celular. Asociación Médica Brasileña.30 Manual de manejo de Mieloma Múltiple-Sociedad Venezolana de Hematología.31 ° Guía de Práctica Clínica. Diagnóstico y Tratamiento del Mieloma Múltiple. México: Secretaría de Salud 32 y Guías mexicanas de diagnóstico y recomendaciones terapéuticas contra mieloma múltiple (2009).33 Las cadenas ligeras totales pueden perder un diagnóstico En los distintos estudios citados se ha demostrado que la sensibilidad del ensayo de cadenas ligeras totales no es suficiente para asegurar la correcta detección de una concentración anómala de las proteínas monoclonales producida por el tumor de células plasmáticas. Esto se debe, en gran parte, a la falta de especificidad de detección, porque en la misma determinación se incluye la detección de grandes masas de proteínas policlonales no implicadas en el proceso tumoral. Este “enmascaramiento” hace que en muchas ocasiones las elevaciones anormales de κ, λ y la alteración de su relación no se detecten a tiempo. Un retraso en el diagnóstico repercutirá de manera negativa en el estado clínico del paciente y sus posibilidades terapéuticas, también podría llevar a profundizar las complicaciones del mieloma en sí, como daño renal, enfermedad ósea, anemias, etc.34 Un estudio comparativo reciente efectuado en Lima, Perú, mostró que 3 de 17 pacientes fueron mal diagnosticados al utilizar el ensayo de cadenas ligeras totales. Por el contrario, el inmunoensayo de cadenas ligeras libres en suero logró identificar correctamente a los 17 pacientes. La existencia de proteína monoclonal se confirmó en todos los casos mediante una inmunofijación en suero (observaciones no publicadas). Esto demuestra, una vez más, que la especificidad y sensibilidad del ensayo de cadenas ligeras totales no son suficientes para la detección de elevaciones anormales de las cadenas ligeras κ y 149 Revista de Hematología λ y que su uso debe desestimarse en la clínica de rutina que comprende las pruebas relacionadas con la búsqueda de un diagnóstico correcto de mieloma múltiple y otras discrasias de células plasmáticas. Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 4. Waldmann TA, Strober W, Mogielnicki RP. The renal handling of low molecular weight proteins. II. Disorders of serum protein catabolism in patients with tubular proteinuria, the nephrotic syndrome, or uremia. J Clin Invest 1972;51:2162-2174. 5. Kim J, Hayton WL, Robinson JM, Anderson CL. Kinetics of FcRn-mediated recycling of IgG and albumin in human: pathophysiology and therapeutic implications using a simplified mechanism-based model. Clin Immunol 2007;122:146-155. CONCLUSIONES La clara necesidad de valorar y cuantificar las cadenas ligeras libres en suero y evaluar la relación κ/λ ha llevado a intensas investigaciones durante más de 150 años. La complejidad de las proteínas monoclonales para identificar y cuantificar ha hecho que sólo recientemente se logre contar con un reactivo de laboratorio capaz de cumplir con estándares de sensibilidad y especificidad necesarios para asegurar la correcta evaluación de los pacientes con discrasias de células plasmáticas, principalmente pacientes con mieloma múltiple. En este contexto, es importante resaltar que el inmunoensayo de cadenas ligeras libres en suero que utiliza un antisuero policlonal es la única prueba recomendada por las directrices del Grupo Internacional de Trabajo en Mieloma para el tamizaje, diagnóstico, pronóstico y vigilancia de pacientes con discrasias de células plasmáticas.2,3 Resulta imperioso, entonces, considerar las alternativas disponibles y utilizar aquéllas que nuestro compromiso profesional dicte como las más adecuadas para realizar nuestro trabajo diario de la manera más eficiente y útil posible para los pacientes. 150 6. Abraham RS, Katzmann JA, Clark RJ, Bradwell AR, et al. Quantitative analysis of serum free light chains. A new marker for the diagnostic evaluation of primary systemic amyloidosis. Am J Clin Pathol 2003;119:274-278. 7. Bradwell AR, Carr-Smith HD, Mead GP, Harvey TC, Drayson MT. Serum test for assessment of patients with Bence Jones myeloma. Lancet 2003;361:489-491. 8. Drayson M, Tang LX, Drew R, Mead GP, et al. Serum free light-chain measurements for identifying and monitoring patients with nonsecretory multiple myeloma. Blood 2001;97:2900-2902. 9. Lachmann HJ, Gallimore R, Gillmore JD, et al. Outcome in systemic AL amyloidosis in relation to changes in concentration of circulating free immunoglobulin light chains following chemotherapy. Br J Haematol 2003;122:78-84. 10. Clamp JR. Some aspects of the first recorded case of multiple myeloma. Lancet 1967;2:1354-1356. 11. Bradwell AR, Carr-Smith HD, Mead GP, et al. Highly sensitive, automated immunoassay for immunoglobulin free light chains in serum and urine. Clin Chem 2001;47:673-680. 12. Laine ST, Soppi ET, Mörsky PJ. Critical evaluation of the serum kappa/lambda light-chain ratio in the detection of M proteins. Clin Chim Acta 1992;207:143-149. 13. Jones RG, Aguzzi F, Bienvenu J, Gasparro C, et al. Use of immunoglobulin heavy-chain and light-chain measurements in a multicenter trial to investigate monoclonal components: II. Classification by use of computer-based algorithms. Clin Chem 1991;37:1922-1926. REFERENCIAS 14. Mariën G, Oris E, Bradwell AR, Blanckaert N, Bossuyt X. Detection of monoclonal proteins in sera by capillary zone electrophoresis and free light chain measurements. Clin Chem 2002;48:1600-1601. 1. Katzmann JA. Screening panels for monoclonal gammopathies: time to change. Clin Biochem Rev 2009;30:105111. 15. Kyle RA. Sequence of testing for monoclonal gammopathies. Arch Pathol Lab Med 1999;123:114-118. 2. Dispenzieri A, Kyle R, Merlini G, Miguel JS, et al. International Myeloma Working Group guidelines for serum-free light chain analysis in multiple myeloma and related disorders. Leukemia 2009;23:215-224. 3. Rajkumar SV, Dimopoulos MA, Palumbo A, Blade J, et al. International Myeloma Working Group updated criteria for the diagnosis of multiple myeloma. 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QJM 2007;100:635-640. 151 Artículo de revisión Rev Hematol Mex 2015;16:152-167. FLT3, NPM1 y C/EBPα como marcadores de pronóstico en pacientes con leucemia mieloide aguda Francisco Alejandro Lagunas-Rangel1 Víctor Alfredo Pérez-Contreras2 Carlos Cortés-Penagos1,2 Facultad de Químico-Farmacobiología, Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Morelia, Michoacán, México. 2 Laboratorios Mendel, Morelia, Michoacán, México. 1 RESUMEN La leucemia mieloide aguda es un grupo de enfermedades fenotípica y genéticamente heterogéneas, originadas por la acumulación de mutaciones en una célula madre hematopoyética o célula progenitora. De manera tradicional, los estudios citogenéticos se han utilizado para estratificar a los pacientes con leucemia mieloide aguda en tres categorías: favorable, intermedio y desfavorable. Sin embargo, la estratificación pronóstica y la decisión del tratamiento para los pacientes que tienen cariotipo normal muestra dificultades debido a la alta heterogeneidad clínica. Recientemente, la identificación de mutaciones genéticas adicionales a los marcadores clásicos permitió generar nuevas entidades en el grupo de leucemia mieloide aguda respecto al tratamiento y seguimiento de esta enfermedad. En 2008, la Organización Mundial de la Salud introdujo las mutaciones en NPM1 y C/EBPα como entidades dentro del grupo de leucemia mieloide aguda con anormalidades genéticas recurrentes, mientras que las mutaciones en el gen FLT3 se han descrito como de mal pronóstico en los pacientes portadores. El conocimiento de estas mutaciones no sólo apoya el seguimiento de esta enfermedad, sino que abre la posibilidad de generar nuevas estrategias de tratamiento. Palabras clave: leucemia mieloide aguda, marcador molecular, pronóstico, proliferación, diferenciación celular. FLT3, NPM1 y C/EBPα as prognosis markers in patients with acute myeloid leukemia ABSTRACT Acute myeloid leukemia (AML) can be described as a group of diseases, phenotypic and genetically heterogeneous originated by multiple mutations in a progenitor or hematopoietic stem cell. Cytogenetics is traditionally used to stratify the patients with AML in three risk categories: favorable, intermediate and unfavorable. However, the forecast stratification and the treatment decision for patients with normal karyotype shows difficulties due to the high clinical heterogeneity. Recently, the identification of several genetic mutations additional to classical molecular markers, have been useful to identify new entities 152 Recibido: 15 de enero 2015 Aceptado: 24 de marzo 2015 Correspondencia: Dr. Carlos Cortés Penagos [email protected] Este artículo debe citarse como Lagunas-Rangel FA, Pérez-Contreras VA, CortésPenagos C. FLT3, NPM1 y C/EBPα como marcadores de pronóstico en pacientes con leucemia mieloide aguda. Rev Mex Hematol 2015;16:152-167. www.nietoeditores.com.mx Lagunas-Rangel FA y col. FLT3, NPM1 y C/EBPα como marcadores de pronóstico in AML. In 2008, the World Health Organization introduced the mutations in NPM1 and C/EBPα as entities within the group of AML with recurrent genetic abnormalities. On the other hand, FLT3 mutations have been associated with poor responses in patients positive to this mutation. The knowledge of these new mutations has been useful to clinical stratification of AML patients and opens the possibility to find new strategies of treatment. Key words: acute myeloid leukemia, molecular marker, prognostic, proliferation, cellular differentiation. ANTECEDENTES La leucemia mieloide aguda es un conjunto de enfermedades hematológicas de progresión rápida, fenotípica y genéticamente heterogéneas, caracterizadas por la expansión clonal de precursores mieloides con capacidad disminuida de diferenciación. Durante la evolución de este tipo de leucemia, la célula madre hematopoyética o célula progenitora sufre una serie de alteraciones genéticas que modifican en algún punto su sistema de señalización celular (receptor-segundo mensajero-proteína efectora), teniendo como consecuencia cambios en la funcionalidad y expresión de proteínas que son clave en procesos como proliferación, muerte y diferenciación celular (Figura 1).1 Se ha postulado que para que ocurra la evolución de la leucemia mieloide aguda deben darse dos clases de mutaciones: las que le confieren una ventaja proliferativa (clase I) y las que bloquean el proceso de diferenciación celular (clase II; Figura 2).1,2 Este modelo propuesto por Gillilland en 2001, conocido como teoría de los dos “hits”, supone que la mayor parte de las leucemias agudas son la consecuencia de al menos dos mutaciones.3-5 La identificación de estas modificaciones genéticas requiere tecnología y metodologías que no son convencionales en los laboratorios de diagnóstico y para muchas de ellas aún no se conoce su asociación con alguna característica clínica de valor diagnóstico o pronóstico. La citogenética clásica y molecular se ha utilizado tradicionalmente para la identificación de algunas alteraciones genéticas asociadas con leucemia mieloide aguda (traslocaciones, eliminaciones, inversiones, etc.), lo que ha permitido estratificar a los pacientes con este padecimiento en tres categorías de riesgo: favorable, intermedio y desfavorable. Así, los pacientes con t(8;21) (q22;q22) [RUNX1/RUNX1T1], inv(16)(p13q22) [CBFB/MYH11] y t(15;17)(q24;q21) [PML/RARA] tienen un pronóstico favorable con buena respuesta al tratamiento y remisiones completas. Por otra parte, los pacientes con t(9;11)(p22;q23) [MLLT3/MLL] se consideran con pronóstico intermedio, y en los pacientes con t(6;9)(p23;q34) [DEK/NUP214], inv(3)(q21q26) [RPN1/EVI1] y t(1;22)(p13;q13) [RBM15/MKL1] el pronóstico clínico es malo debido a la agresividad del padecimiento y la baja respuesta al tratamiento.6,7 Sin embargo, un grupo importante de pacientes con diagnóstico de leucemia mieloide aguda tienen un cariotipo normal; esto es, sin alteraciones cromosómicas evidentes. Estos pacientes se clasifican con pronóstico intermedio, debido a que clínicamente no se tiene un marcador de referencia y su origen biológico aún es desconocido. 153 Revista de Hematología Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 Clase I Ventajas proliferativas o de supervivencia Clase II Alteración de la diferenciación hematopoyética y subsecuente apoptosis FLT3-ITD FLT3-TKD KIT RAS PTPN11 JAK2 PML-RARa RUNX1-RUNX1T1 CBFβ-MYH11 Fusiones de MLL C/EBPa NPM1? LMA Figura 2. Modelo de interacción de las mutaciones asociadas con la aparición de leucemia mieloide aguda. Las mutaciones que confieren ventajas proliferativas se agrupan en la clase I y las que bloquean el proceso de diferenciación se agrupan en la clase II. Modificada de la referencia 43. Figura 1. Esquema general del sistema de señalización celular dependiente de un receptor. Recientemente, con el desarrollo de metodologías de secuenciación masiva, se han identificado nuevas mutaciones genéticas asociadas con la leucemia mieloide aguda. Algunos de los genes identificados incluyen a: c-KIT, FLT3, MLL, NPM1, C/EBPα, RAS, RUNX1, WT1, BAALC, ERG, MN1, DNMT, TET2, IDH, ASXL1, PTPN11 y CBL. De todos ellos destacan los que afectan a los genes FLT3, NPM1 y CEBPα, porque se han asociado con la respuesta al tratamiento y el progreso de esta enfermedad, principalmente de los pacientes con cariotipo 154 normal.2,6-8 En 2008, la Organización Mundial de la Salud publicó la actualización de la clasificación de neoplasias mieloides; uno de los principales cambios en esta revisión es la incorporación de las mutaciones en los genes NPM1 y C/EBPα como entidades dentro del grupo de leucemia mieloide aguda con anormalidades genéticas recurrentes. Las mutaciones en FLT3 no se incluyeron como entidad independiente debido a que éstas se asocian con otros marcadores ya descritos. Sin embargo, su significado no debe subestimarse debido a que su identificación es especialmente valiosa en pacientes con cariotipo normal u otra anormalidad genética recurrente debido a que puede establecer el pronóstico de la leucemia.7 Debido a la importancia que han adquirido estos tres marcadores genéticos en el diagnóstico y pronóstico de la leucemia mieloide aguda, en este trabajo se revisan los datos más relevantes de las mutaciones en los genes FLT3 (FLT3-ITD y FLT3-TKD), NPM1 y las que afectan a C/EBPα; se hace hincapié en su participación en la aparición de la neoplasia y su utilidad clínica. Lagunas-Rangel FA y col. FLT3, NPM1 y C/EBPα como marcadores de pronóstico FLT3 Estructura y función El gen FLT3 (FMS-like tyrosine kinase 3) codifica para un receptor tipo tirosina cinasa (RTK) de clase III, que está relacionado estructuralmente con FMS, KIT, PDGFRα y PDGFRβ debido a que posee cinco dominios tipo inmunoglobulina en la región extracelular, una única secuencia transmembrana e intracelularmente una corta región yuxtamembrana seguida por dos dominios cinasa separados por un sitio de inserción de la enzima cinasa (Figura 3).9-11 La identificación del gen en murinos fue realizada independientemente por dos grupos utilizando diferentes estrategias de clonación en células madre hematopoyéticas de hígado fetal y placenta. El gen humano FLT3 se clonó poco después a partir de células CD34+. Este gen se localiza en el cromosoma 13q12 y originalmente se pensó que contenía 21 exones similar a la relación intrón-exón de KIT, pero en realidad posee 24 exones, donde los tres primeros dominios inmunoglobulina extracelulares están codificados por ocho exones comparado con cinco exones para el caso de KIT.9-14 Figura 3. Mutaciones en el gen FLT3 relevantes en la leucemia mieloide aguda. A. El gen FLT3 posee 24 exones, en el exón 1 se localiza la secuencia señal de inicio de la transcripción (blanco); los exones 2 al 12 codifican los dominios tipo inmunoglobulina (verde); los exones 13 y 14 codifican principalmente la región transmembrana y yuxtamembrana (azul), respectivamente. Los dos dominios cinasa (rojo) están codificados por los exones 15 a 17 y 19 a 22, separados por el sitio de inserción codificado por el exón 18. Finalmente, el extremo C terminal (morado) es codificado por los últimos dos exones. B. La proteína FLT3 es un receptor tirosina cinasa de clase III. La mutación FLT3-ITD ocurre en la región yuxtamembrana, eliminando el impedimento estérico que normalmente bloquea la dimerización, mientras que FLT3-TKD estabiliza la forma activa de la proteína. Los sitios donde ocurren las mutaciones FLT3-ITD y TKD se detallan con estrellas. Modificada de las referencias 18 y 44. 155 Revista de Hematología La proteína FLT3 contiene 993 aminoácidos, con una homología de 85% al compararla con la proteína de ratón. Tiene dos isoformas, la primera de 158 a 160 kDa, unida a la membrana celular y modificada postraduccionalmente por glicosilación, y la segunda de 130 a 143 kDa, que no se asocia con la membrana celular y tampoco es glicosilada. La proteína FLT3 se expresa principalmente en precursores tempranos mieloides y linfoides CD34+, aunque también se ha encontrado en otros órganos linfo-hematopoyéticos, como el hígado, el bazo, el timo y la placenta, así como en las gónadas y el cerebro. La expresión de FLT3 se pierde gradualmente a medida que avanza el proceso de diferenciación celular.9,10,12 FLT3 normalmente reside en la membrana celular de manera monomérica, con una configuración que impide su activación. Al unirse FLT3 a su ligando específico (FL) se produce un cambio conformacional que permite la dimerización y autofosforilación en trans de varios residuos de tirosina en el dominio intracelular, creando sitios de acoplamiento para proteínas transductoras como SHC, GRB2, VAC, GAB2, SHIP, CBL y CBLB, que activan diversas vías de señalización celular. La cascada de señalización involucra la fosforilación y activación de múltiples mediadores secundarios incluyendo PI3K, PLCγ, MAPK y RAS. La actividad de FLT3 es altamente dependiente del tipo celular y otros factores de crecimiento que actúan sinérgicamente en la célula; ejemplos son la IL-3, el G-CSF, el GM-CSF, la EPO y KIT que producen en colaboración con FLT3 una vigorosa respuesta proliferativa. La activación de FLT3 juega un papel crítico en la hematopoyesis y el crecimiento celular, debido a que regula diversos procesos celulares como proliferación, diferenciación y apoptosis celular.2,9,15 Los principales mecanismos autoinhibitorios en FLT3, que permiten su actividad únicamente al unirse a su ligando, son los dominios de cinasa N y C terminal (bilobal kinase fold), el “loop” 156 Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 de activación y el dominio yuxtamembrana. El dominio cinasa N y C terminal se doblan en dirección opuesta, permitiendo que los residuos catalíticos clave de ambos dominios se alineen únicamente después del cambio conformacional que desencadena la unión al ligando. El loop de activación muestra varios residuos tirosina que modifican su conformación al fosforilarse, de una estructura cerrada a una estructura abierta que permite el paso de los sustratos y el ATP. Por otra parte, la región yuxtamembrana estabiliza la conformación autoinhibida mediante diversas interacciones no covalentes de la cinasa; por esta razón, al modificar la estructura con el ligando se induce la fosforilación de diversos residuos tirosina conservados que eliminan estas uniones e inducen la activación de la proteína.14,16-18 Recientemente se describieron diversas mutaciones en el gen FLT3 en pacientes con leucemia linfoblástica aguda (LLA, 1 a 3% de los pacientes), síndromes mielodisplásicos (SMD, 5 a 10%) y leucemia mieloide aguda (LMA, 15 a 35 %), haciendo de FLT3 uno de los genes más frecuentemente mutados en neoplasias hematológicas.9 Notablemente FLT3 es sobreexpresado en 70 a 90% de los pacientes con leucemia mieloide aguda y linfoblástica aguda, y una tercera parte de los pacientes con leucemia mieloide aguda tienen alguna mutación en FLT3. Los pacientes con leucemia linfoblástica aguda con alguna translocación que involucra el gen MLL tienen un perfil genético único que se distingue por la sobreexpresión de FLT3. De acuerdo con la hipótesis de los dos “hits”, las mutaciones en FLT3 pueden cooperar funcionalmente con otras mutaciones genéticas para inducir la transformación leucémica. Dos distintas clases de mutaciones se han identificado en pacientes con leucemia mieloide aguda que involucran la activación constitutiva de FLT3, una en la región yuxtamembrana y otra dentro del “loop” de activación en el dominio tirosina cinasa, denominadas FLT3-ITD y FLT3-TKD, respectivamente.2,9 Lagunas-Rangel FA y col. FLT3, NPM1 y C/EBPα como marcadores de pronóstico Mutaciones en FLT3 FLT3-ITD. La mutación más común en FLT3 involucra una duplicación genética en tándem interna (ITD) entre los exones 14 y 15 correspondientes al dominio yuxtamembrana, que varía en longitud y posición de paciente a paciente.9 FLT3-ITD se describió por primera vez en 1996 cuando al realizar la detección sistemática de la expresión de FLT3 en pacientes con leucemia, se identificaron por PCR productos de amplificación más grandes de lo esperado.19 La mutación FLT3-ITD ocurre cuando un fragmento de la secuencia que codifica el dominio yuxtamembrana se duplica y se inserta. La longitud del ITD varía de 3 a 400 pb, siendo siempre un múltiplo de tres nucleótidos, por lo que se preserva el marco de lectura. Los grupos de Meshinchi y Kayser reportaron de manera independiente que el promedio de los amplificados es de 59 pb, involucrando la duplicación de al menos uno de los siete residuos del codón 591 a 597; este último es el más común. En algunos casos es posible identificar más de cinco diferentes clonas con diferente número de repetidos, puntos de inserción y relaciones alélicas. La causa de la duplicación aún no se conoce; sin embargo, se sugiere que durante la replicación del ADN, una secuencia palindrómica en la cadena retrasada forma una estructura en horquilla, que permite la duplicación, aunado a una falla general en los mecanismos de reparación por mismatch. Otras teorías sugieren un defecto en el proceso de reparación slippage, posterior a la ruptura simultánea de la cadena líder y retrasada.11,17,20-22 Se ha sugerido que el cambio conformacional ocasionado por el segmento de la duplicación de FLT3-ITD es responsable de eliminar el impedimento estérico que normalmente bloquea la dimerización sin estimulación del ligando, exponiendo así diversos sitios dentro de los dominios tirosina cinasa que inducen su autofosforilación. Los experimentos en modelos de trasplante de médula ósea en ratón indican que FLT3-ITD es suficiente para promover un cambio fenotípico asociado con proliferación aumentada, pero es insuficiente para inducir leucemia aguda manifiesta.2,9,15 La incidencia de la mutación FLT3-ITD se correlaciona con la edad de los pacientes con leucemia mieloide aguda; en pacientes pediátricos menores de 10 años ocurre en 5 a 16% de los casos, con aumento significativo en pacientes mayores de 10 años. En pacientes adultos se reporta una incidencia de 25 a 35%, sin incremento con la edad. El efecto más significativo de esta mutación es su asociación con altas cuentas blásticas, incremento del riesgo de recaída y disminución de la supervivencia. Diversos grupos reportaron que FLT3-ITD es uno de los principales marcadores de riesgo debido a que predice un resultado adverso. Las mutaciones FLT3-ITD se han correlacionado con ciertos subgrupos citogenéticos; son especialmente frecuentes en pacientes con un cariotipo normal. Se ha reportado que 30 a 50% de los pacientes con leucemia aguda promielocítica con t(15;17) (q22;q12) [PML-RARA] también tienen alguna mutación en FLT3. Asimismo, se ha reportado una asociación frecuente con la t(6;9)(p23;q34) [DEK-NUP214] (~90%). Otras mutaciones asociadas con FLT3-ITD ocurren en NPM1 y DNMT3a. Estudios retrospectivos sugieren que la existencia de mutaciones en NPM1 pueden disminuir el pronóstico negativo de FLT3-ITD, sólo si la relación alélica de este último es baja.9,15,20,23 En contraste con la proteína FLT3 normal, FLT3ITD activa la vía STAT5 significativamente. La existencia de regiones fosforiladas en la región yuxtamembrana de FLT3-ITD permite que interactúe con proteínas proximales del retículo endoplásmico y el aparato de Golgi, lo que inhibe su procesamiento por las enzimas de estos complejos, resultando en la retención 157 Revista de Hematología del receptor en el citoplasma y aumentando el tiempo de exposición a sustratos como STAT5. La proteína STAT5 induce la expresión de genes como la ciclina D1, c-MYC y p21, que son importantes reguladores de la proliferación celular. Por otra parte, las proteínas Pu.1 y CEBPα, involucradas en la regulación de la diferenciación en células hematopoyéticas, son significativamente reprimidas por FLT3-ITD, lo que sugiere su contribución en el bloqueo de la diferenciación. Además, se ha reportado que FLT3-ITD inicia un ciclo de inestabilidad genómica, incrementando las especies reactivas de oxígeno (ROS) que favorecen fenómenos como el rompimiento de la doble cadena de ADN y errores en la reparación.2,9,15,18,20,24 FLT3-ITD se encuentra con más frecuencia de forma heterocigota y se ha observado que la relación alélica (FLT3-ITD/FLT3) determina en gran medida el pronóstico clínico en pacientes con esta mutación. Varios estudios han indicado que los valores altos de relación alélica tienen peor pronóstico clínico, debido a que la existencia de la proteína FLT3 normal interfiere y bloquea la señalización aberrante de FLT3-ITD. Se ha propuesto que la pérdida de la heterocigocidad (LOH) puede deberse a la recombinación homóloga del alelo FLT3-ITD, creando más copias del alelo mutado que del normal, lo que implica un alto riesgo de recaída y muerte.15,24 Stirewalt y su grupo reportaron que los diferentes tamaños del ITD en el gen FLT3 tienen un importante efecto en el tratamiento y supervivencia. Los pacientes con fragmentos largos del ITD (≥40 pb) tuvieron peor respuesta al tratamiento que aquéllos con fragmentos pequeños (<40 pb), lo que a su vez disminuye el tiempo de supervivencia. Sin embargo, estos resultados contrastan con otros reportes en los que no se observa una asociación; se necesitan más estudios antes de definir una conclusión que pueda ser trasladada al manejo clínico de estos pacientes.25-27 158 Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 Existen diversos métodos experimentales para detectar la mutación FLT3-ITD; la más utilizada es mediante electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida de los productos de PCR generados de la amplificación de los exones 14 y 15. Por lo general, las muestras utilizadas son médula ósea o sangre periférica, de las que indistintamente se realiza la extracción de ácidos nucleicos (ADN o ARN). Libura y colaboradores reportaron que el uso de cDNA, obtenido a partir de ARN, es una a dos escalas logarítmicas más sensible que el ADN. Se sugiere que esta diferencia se debe a que al utilizar ARN se realizan dos amplificaciones: la primera en la transcripción reversa para obtener el cDNA, y la segunda en la reacción de PCR, lo que no ocurre al utilizar ADN, pudiendo así detectar concentraciones más bajas de FLT3-ITD. La relación alélica se puede determinar utilizando marcadores fluorescentes que se unen al ADN, así los productos de PCR se separan de acuerdo con su tamaño mediante electroforesis capilar y se mide la abundancia de cada fragmento por la intensidad de la fluorescencia después de producir la excitación del fluoróforo con láser.9,28 FLT3-TKD. El segundo tipo de mutación en FLT3 son mutaciones puntuales “missense” en el exón 20 del loop de activación en el dominio tirosina cinasa (TKD). La mutación FLT3-TKD se ha encontrado en células malignas de pacientes con leucemia mieloide crónica (1%), leucemia linfoblástica aguda (1-3%), síndromes mielodisplásicos (2-5%) y leucemia mieloide aguda (5-10%). Casi todas estas mutaciones involucran la sustitución de un aspartato por una tirosina en el codón 835 (D835Y) por una mutación puntual (GAT→TAT). El aspartato en la posición 835 pertenece al dominio DFG (aspartato-fenilalanina-glicina) del loop de activación, que juega un papel crítico en la prevención de la unión del ATP, pudiendo adoptar una forma cerrada (inactivo) o abierta (activo). Estas mutaciones producen un cambio Lagunas-Rangel FA y col. FLT3, NPM1 y C/EBPα como marcadores de pronóstico conformacional en la proteína, perturbando el equilibrio energético requerido para estabilizar la forma cerrada y eliminando su función autoinhibitoria que provoca su activación constitutiva. También se han identificado otras sustituciones, eliminaciones e inserciones dentro de este codón y otros aledaños. A diferencia de la mutación ITD, FLT3-TKD no se asocia con altas cuentas blásticas, lo que implica un pronóstico no tan adverso. En modelos animales se ha demostrado que mientras FLT3-ITD provoca inicialmente la evolución de un trastorno mieloproliferativo, FLT3-TKD induce el desarrollo de una alteración linfoide. Un solo paciente puede ocasionalmente tener ambas mutaciones, ITD y TKD en FLT3; sin embargo, la mayoría de los pacientes tiene un solo tipo de mutación.2,15,16 FLT3-TKD se identifica fácilmente debido a que resulta en la pérdida de un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción EcoRV, pudiendo así digerir un producto de PCR por amplificación de esta región mediante un análisis tipo RFLP o, bien, confirmando el cambio puntual mediante secuenciación de ADN.11 NPM1 Estructura y función NPM1 (nucleophosmin) es una proteína que originalmente se identificó como fosfoproteína expresada a concentraciones altas en la región granular del nucléolo. Posteriormente, basados en la observación de que su expresión rápidamente aumentaba en respuesta a estímulos mitóticos y su elevada concentración en células proliferantes y malignas, se pensó que tenía un papel importante en la regulación del crecimiento, proliferación y transformación celular. Sin embargo, a medida que el conocimiento de esta multifuncional proteína ha aumentado, se ha relacionado en muchos procesos celulares.29,30 NPM1 existe como oligómero en dos formas alternativas, designadas como B23.1 y B23.2, que comparten 255 residuos en el extremo N terminal, mientras que los últimos 35 aminoácidos del extremo C terminal de B23.1 están ausentes en B23.2. La isoforma B23.1 es casi exclusimente nucleolar, mientras que B23.2 se localiza en el nucléolo y en el nucleoplasma. La isoforma B23.1 contiene 294 aminoácidos y tiene un peso aproximado de 37 kDa, tiene diversos dominios, iniciando con el extremo N terminal que contiene un segmento hidrofóbico implicado en la oligomerización y en la función como chaperona; le continúan dos dominios ácidos (ricos en ácido aspártico y glutámico) importantes en la unión a las histonas, que se encuentran separados por una región asociada con la actividad ribonucleasa. Esta región, al igual que el extremo C terminal, contiene regiones alcalinas involucradas con la unión a ácidos nucleicos. Las porciones alcalinas son seguidas por una región aromática, que contiene dos residuos triptófano (W288 y W290) requeridos para la localización nucleolar de la proteína. Además, incluye una señal bipartita de localización nuclear (NLS), una señal de exportación nuclear (NES) rica en leucina y diversos sitios de fosforilación que regulan su asociación con los centrosomas y compartimentos subnucleolares. El gen NPM1 contiene 12 exones y se encuentra localizado en el cromosoma 5q35. La isoforma B23.1 es codificada por los exones 1 al 9, 11 y 12, mientras que la isoforma B23.2 solamente contiene los exones 1 al 10 (Figura 4).29,31 La sobreexpresión de NPM1 promueve la supervivencia y recuperación celular frente a condiciones de estrés, mientras que la deficiencia bloquea la traducción proteica y detiene el ciclo celular. La expresión de NPM1 disminuye con la diferenciación celular.30 NPM1 reside principalmente en el nucléolo, aunque se transporta rápidamente entre el nú- 159 Revista de Hematología A Exón 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 3´ GAGGCTATTCAAGATCTCTG----GCAGTGGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG GAGGCTATTCAAGATCTCTCTCTGGCAGTGGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG GAGGCTATTCAAGATCTCTGCATGGCAGTGGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG GAGGCTATTCAAGATCTCTGCCTGGCAGTGGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG NuLS Grupo alcalino Región moderadamente alcalina Región aromática (única en B23.1) NLS Dominio ácido NES Dominio N terminal no polar Región central NLS Normal Variante A Variane B Variane D 1 Dominio ácido 5´ B Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 C N Oligomerización Chaperona molecular Unión a histonas Unión a ADN/ARN Actividad ribonucleasa Figura 4. Mutaciones en el gen NPM1. A. El gen NPM1 posee 12 exones, los exones 1 al 3 codifican el extremo N terminal donde se localiza la señal de exportación nuclear; el exón 4 contiene un dominio de unión a metales (MB). El segmento entre los exones 5 y 7 codifica los dos dominios ácidos y la región de separación, la otra parte del exón 7 y el exón 8 presentan la señal de localización nuclear. Los exones 9 a 12 codifican el extremo C terminal, que contiene la señal de localización nucleolar. Las principales mutaciones asociadas con leucemia mieloide aguda ocurren dentro del exón 12, principalmente las variantes A, B y D. B. La proteína NPM1 es una histona chaperona nucleolar, las mutaciones descritas modifican la señal de localización nucleolar permitiendo que permanezca mayor tiempo dentro del citoplasma. El sitio de mutación se detalla con una estrella. NES: señal de exportación nuclear; NLS: señal de localización nuclear; NuLS: señal de localización nucleolar. Modificada de la referencia 29. cleo y el citoplasma, por lo que forma parte de diversos procesos celulares que incluyen el transporte de partículas pre-ribosomales y biogénesis de los ribosomas, respuesta contra estímulos estresantes como radiación UV e hipoxia, mantenimiento de la estabilidad genómica a través del control de la ploidía celular y la participación en procesos de reparación del ADN, la regulación de la transcripción a través del moldeamiento de los eventos de condensación y descondensación 160 de la cromatina, previene la agregación proteica en el nucléolo y participa en la regulación de la actividad y estabilidad de supresores tumorales decisivos como p53 y ARF. En realidad, NPM1 funciona como histona chaperona, capaz de realizar el ensamblaje de histonas y del nucleosoma, así como promover un incremento de la acetilación dependiente de la transcripción. Los dominios ácidos de NPM1 sirven como sitios de unión de proteínas ribosomales alcalinas, Lagunas-Rangel FA y col. FLT3, NPM1 y C/EBPα como marcadores de pronóstico minimizando interacciones no específicas entre proteínas ribosomales y rRNA durante el ensamblaje ribosomal en el nucléolo.29,32 A través de sus dominios, NPM1 es capaz de unirse a distintas proteínas en diferentes compartimentos celulares, incluidos factores nucleolares (nucleolina, fibrilarina y snoRNPs), factores de transcripción (IRF1, YY1 y NF-κB, histonas H2B, H3 y H4), proteínas involucradas en la proliferación celular (ADN polimerasa α), mitosis (NUMA, NEK2A) y respuesta al estrés oncogénico (ARF y p53), directamente con el ADN y ARN. Además, se ha reportado que NPM1 tiene actividad de endorribonucleasa en el rRNA y forma complejos con segundos mensajeros como PIP3 en respuesta a factores antiapoptósicos (inhibiendo la ruptura del ADN por la caspasa CAD y p53).29,31 Asimismo, NPM1 está frecuentemente sobreexpresada en tumores sólidos de diversos orígenes histológicos, está implicada en traslocaciones cromosómicas o eliminaciones en varios tipos de malignidades hematológicas y tumores sólidos. De manera sorprendente, se ha encontrado que una alta proporción de pacientes con leucemia mieloide aguda (~35%) tienen mutaciones o una localización aberrante de NPM1, lo que hace al gen NPM1 uno de los mutados con más frecuencia en esta enfermedad.29 Mutaciones en NPM1 La mutación más común en NPM1 se localiza en el exón 12, que se manifiesta en 35% de los casos de leucemia mieloide aguda de novo. Las mutaciones en el gen NPM1 son consistentemente heterocigotas, ocurren principalmente en el exón 12, con algunas pocas excepciones reportadas en los exones 11 y 9. El 86% de los pacientes con mutaciones en NPM1 tienen un cariotipo normal, el otro 14% tiene anormalidades cromosómicas probablemente secundarias. Se han descrito aproximadamente 50 variantes genéticas; sin embargo, en 95% de los casos ocurren en la posición del nucleótido 960; la mutación más común es la duplicación de los nucleótidos TCTG en las posiciones 956 a 959 que es conocida como variante A. Las variantes B y D se observan en 10 y 5% de los casos, respectivamente, todas las demás variantes son especialmente raras. Independientemente de la variante de la mutación, todas generan modificaciones en el extremo C terminal de la proteína.31,33,34 En condiciones normales, la importación nuclear de NPM1 predomina sobre la exportación, lo que explica su mayor concentración en el nucléolo. Una de las características distintivas de las mutaciones en NPM1 es su sobreexpresión en el citoplasma de células leucémicas con leucemia mieloide aguda (NPM1c+); esto se debe a dos alteraciones en el extremo C terminal: la primera es la generación de un dominio de exportación nuclear adicional rico en leucina, que aumenta el transporte dependiente de CRM1 y, segundo, la pérdida de los residuos aromáticos 288 y 290 que son decisivos para la localización nucleolar.31,33,34 Las mutaciones en NPM1 son muy estables, generalmente la pérdida de la mutación se asocia con el cambio de cariotipo, de normal a anormal; por esta razón algunos autores (Gorello y su grupo y Chou y colaboradores) sugieren el uso de NPM1 como marcador para vigilar la enfermedad mínima residual en pacientes con cariotipo normal. La existencia de NPM1 se correlaciona significativamente con la de FLT3-ITD, lo que sugiere que las mutaciones en NPM1 son eventos primarios que preceden a la adquisición de FLT3. En contraste, las mutaciones en tándem dentro del gen MLL son usualmente excluyentes con NPM1.30,33-36 La incidencia en las mutaciones en NPM1 se incrementa con la edad, se manifiesta en 2.1 a 6.5% en pacientes pediátricos y en 25 a 35% en pacientes adultos; sin embargo, las variantes menos comunes ocurren principalmente en niños y adultos jóvenes. Notablemente, 80 a 90% 161 Revista de Hematología de los pacientes con leucemia mielomonocítica aguda y leucemia monocítica tienen mutaciones en NPM1. Los casos con NPM1c+ tienen mayor cuenta blástica y elevado número de plaquetas; sin embargo, la mutación en NPM1, en ausencia de FLT3 ITD, se asocia con buena respuesta al tratamiento y supervivencia a cinco años en 60% de los pacientes, lo que resalta el valor de la identificación molecular para establecer una estratificación de riesgo en pacientes con cariotipo normal. La coexistencia de FLT3-ITD y NPM1 se asocia con mal pronóstico clínico; sin embargo, estos pacientes tienen mejor respuesta que los pacientes NPM1 negativos y FLT3-ITD positivos.27,30 Estructura y función de la señalización celular desencadenada por rapamicina y la proteína cinasa R de la siguiente manera: bajo condiciones de crecimiento favorables, los factores de iniciación de la transcripción elF2α y elF4E incrementan su actividad, posiblemente a través del incremento de la actividad de c-MYC; a su vez, éstas actúan promoviendo la transcripción de p30 que desencadena el proceso de proliferación celular. De la misma manera, cuando existen bajas concentraciones de elF2α y elF4E, se promueve la transcripción de p42, que induce diferenciación celular. Las funciones de la isoforma p30 aún no son bien conocidas; sin embargo, Pabst y su grupo demostraron que esta isoforma ha perdido las funciones normales de C/EBPα y tiene un efecto negativo en la variante de 42 kDa. C/EBPα tiene cuatro dominios principales, el extremo C terminal contiene una estructura de cremallera de leucina (bZIP) que media la homo y heterodimerización, así como las interacciones proteína-proteína con otros factores de transcripción (GATA, PU.1, ETS y RUNX1) y factores de crecimiento (c-JUN y E2F), un dominio de unión al ADN (DBD) de carácter alcalino cargado positivamente, capaz de unirse a secuencias específicas del ADN y, por último, dos elementos de regulación y transactivación, denominados TAD1 y TAD (Figura 5).37,38 El gen C/EBPa (CCAAT/enhancer-binding protein α) codifica para dos proteínas que pertenecen a la familia de proteínas potenciadoras de la unión a la secuencia CCAAT, que están implicadas en el equilibrio entre proliferación celular y diferenciación terminal. Este gen se sitúa en el cromosoma 19q13.1 y posee un único exón sin tener intrones. C/EBPα da lugar a dos diferentes transcritos, usando dos diferentes secuencias de inicio AUG dentro del mismo marco de lectura; la primera secuencia de inicio codifica una isoforma de 42 kDa (p42), mientras que la segunda secuencia de inicio codifica otra isoforma de 30 kDa (p30), que pierde los primeros 118 aminoácidos, incluido el dominio funcional TAD1. Las células regulan la relación de p42/p30 a través C/EBPα actúa como factor de transcripción, con un papel determinante durante la diferenciación de varios tipos celulares, que incluyen hepatocitos, adipocitos, enterocitos, queratinocitos, células pulmonares, células de glándula mamaria y células hematopoyéticas. Asimismo, juega un papel fundamental en estados tempranos de la diferenciación mieloide y es particularmente expresado en células mielomonocíticas y específicamente es altamente regulada durante la diferenciación granulocítica.37,39 La isoforma p42 activa directamente promotores de linaje específico y tiene contacto con el aparato de transcripción basal (TBP/TFIIB), actúa sobre acetiltransferasas de histonas (CBP/p300) y recluta el complejo de remodelamiento de la croma- Las mutaciones en NPM1 son fácilmente identificadas por secuenciación y PCR alelo específico o, bien, con la observación de NPM1c+ mediante inmunohistoquímica. La inmunohistoquímica es la primera opción para la detección de NPM1c+, mientras que las pruebas de biología molecular permiten la detección y vigilancia de la enfermedad mínima residual.30 C/EBPα 162 Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 Lagunas-Rangel FA y col. FLT3, NPM1 y C/EBPα como marcadores de pronóstico 118 aa C/EBPa p30 p21 N TAD2 DBD bZIP Represión de E2F SWI/SNF DNA Dimerización TBP/TFIIB CDK2/CDK4 E2F, GATA1, CBP/p300 ETS1, PU.1, c-JUN, RUNX1 C/EBPa N p42 TAD1 R1 TAD2 DBD R2 R3 Región frecuentemente afectada Mutaciones que impiden la transcripción de p42 C bZIP R4 R5 Región frecuentemente afectada Mutaciones que alteran la unión al ADN Figura 5. Mutaciones en C/EBPα. C/EBPα posee dos isoformas diferentes p30 y p42 que difieren en los primeros 118 aminoácidos. p42 tiene cuatro dominios principales, una estructura de cremallera de leucina (bZIP), un dominio de unión al ADN (DBD) y, por último, dos elementos de regulación y transactivación denominados TAD1 y TAD2; este último no aparece en p30. Las mutaciones dentro de C/EBPα se dividen en cinco regiones (R1 a R5), R1 y R4 son las más frecuentes. Modificada de la referencia 37. tina (SWI/SNF). Por otra parte, p30 promueve diferenciación de adipocitos, pero previene la diferenciación terminal y produce arresto del ciclo celular.40 C/EBPα posee múltiples acciones como la regulación negativa de la expresión de c-MYC que permite la diferenciación, regulación directa de la expresión de genes específicos de linaje mieloide y acción sinérgica con otros genes clave en el desarrollo mieloide, incluido el complejo de genes CBF y PU.1. Las principales asociaciones de C/EBPα ocurren con p21, CDK2, CDK4 y E2F. La represión de E2F, dependiente de la transcripción de genes por C/EBPα, es un evento crítico en la supresión de la proliferación celular y también induciendo la diferenciación granulocítica. C/EBPα también inhibe la proliferación celular por activar la transcripción de p21/WAF1, estabilizar a p21 e inactivar a CDK2 y CDK4. La fuerte implicación de C/EBPα en la diferenciación granulocítica apunta a que es un blanco clave en la leucemogénesis; recientemente se reportaron tres mecanismos de inactivación: el primero es la regulación negativa de su transcripción debido a la expresión del gen de fusión RUNX1/RUNX1T1en la t(8;21), el segundo mecanismo es la inhibición de la traducción del mRNA por interacción con hnRNPE2 inducido por la proteína de fusión BCR-ABL1, lo que contribuye a la transición de la fase crónica a la crisis blástica por bloqueo de la diferenciación, y finalmente, el tercer mecanismo es por mutaciones inactivantes, especialmente en leucemia mieloide aguda.37 Mutaciones en C/EBPα El gen C/EBPα está mutado en aproximadamente 6 a 15% de los casos de leucemia mieloide aguda de novo y en 15 a 18% de los pacientes con cariotipo normal, sin asociación con la edad. Esta mutación ocurre principalmente en los subtipos M1 y M2 (según la FAB) donde se observa en 20% de los pacientes; sin embargo, los pacientes con t(8;21), inv(16) y t(15;17) no tienen la mutación. Los pacientes con mutaciones en C/EBPα tienen concentraciones altas de hemoglobina, bajas cuentas plaquetarias, altas cuentas blásticas y difícilmente tienen linfadenopatías o leucemia extramedular comparados con pacientes sin mutaciones en C/ EBPα. Las mutaciones descritas corresponden a mutaciones puntuales que pueden impedir la transcripción de p42, permitiendo la sobreexpresión de p30 o, bien, afectar la región de cremallera de leucina y el DBD, provocando que la estructura de este dominio se modifique e impidiendo así la unión adecuada al surco mayor del ADN. La mayoría de los pacientes tiene más de una mutación en C/EBPα, el escenario más frecuente es la combinación de dos mutaciones en alelos diferentes, una mutación en el dominio N terminal que bloquea la transcripción de 163 Revista de Hematología p42 y otra en el bZIP que altera la unión con el ADN, su dimerización o su interacción con otras proteínas. Hasta ahora se han reportado 146 mutaciones distintas en C/EBPα, de las que cinco son mutaciones missense, 54 corresponden a adiciones o eliminaciones que modifican el marco de lectura y 78 son mutaciones nonsense; además se incluyen nueve mutaciones silenciosas sin efecto transcripcional. Todas estas mutaciones ocurren en cinco regiones de la proteína (R1 a R5), donde R1 corresponde a los aminoácidos situados antes del TAD1, R2 se sitúa en la región entre TAD1 y TAD2, R3 concierne la región anterior al DBD y la parte N terminal de este dominio, R4 corresponde a los aminoácidos en la zona C terminal del DBD y el N terminal de la región con estructura de cremallera de leucina y finalmente R5 lo conforman los aminoácidos del extremo C terminal de la estructura de cremallera. Las mutaciones en C/EBPα ocurren principalmente en R1 y R4 con 76% de las mutaciones no silenciosas; sin embargo, la distribución entre estas dos regiones es heterogénea. De manera interesante, casi todas las mutaciones nonsense (65 de 78) ocurren en la región 5’ del segundo codón de inicio, lo que permite que se aumente la transcripción de la isoforma 30 kDa.6,37,40-42 Las mutaciones en C/EBPα presentes en pacientes que muestran un cariotipo normal se asocian con un pronóstico favorable similar al que ocurre con inv(16)(p13q22) o t(8;21) (q22;q22). La razón del porqué C/EBPα confiere buen pronóstico aún no se conoce; sin embargo, recientemente se sugirió que sólo los pacientes con la mutación doble tienen buen pronóstico, mientras que los pacientes con una mutación única no difieren de los que no exhiben ninguna mutación. La coexistencia de mutaciones en C/EBPα y FLT3-ITD ocurre en 22 a 33% de los casos; sin embargo, aún no es claro si no existe un efecto o si éste es negativo en el pronóstico de estos pacientes.39,41 164 Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 La identificación de las mutaciones dentro del gen C/EBPα se realiza generalmente mediante secuenciación directa del ADN obtenido de células sanguíneas debido a la aleatoriedad con que ocurren las mutaciones. CONCLUSIONES La leucemia mieloide aguda es la más común de las leucemias mieloides con prevalencia de 3.8 casos por 100,000 habitantes, con aumento en la población de 65 años o más hasta 17.9 casos por 100,000 habitantes. Cerca de 55% de los pacientes con leucemia mieloide aguda tiene algún tipo de anormalidad citogenética que permite orientar el tratamiento y pronosticar su evolución en favorable, intermedia o desfavorable. Sin embargo, en el otro 45% de los pacientes, que tienen un cariotipo normal, el pronóstico aún parece incierto.1 Recientemente, el descubrimiento de mutaciones genéticas en varios genes, como FLT3, NPM1, C/EBPα, KIT, MLL, RAS, PTPN11 y CBL en pacientes con cariotipo normal, ha abierto una ventana de posibilidades para definir con mayor precisión la naturaleza de esta enfermedad. En la actualidad, la Organización Mundial de la Salud resaltó la búsqueda intencionada de mutaciones en FLT3, NPM1 y C/EBPα en todos los pacientes con leucemia mieloide aguda, pero principalmente en los que tienen un cariotipo normal, para de esta manera determinar el pronóstico y personalizar más adecuadamente el tratamiento. En el Cuadro 1 se simplifica la descripción de las mutaciones más frecuentes en los genes FLT3, NPM1 y C/EBPα en pacientes con leucemia mieloide aguda. El gen FLT3 tiene dos mutaciones frecuentes asociadas con leucemia mieloide aguda, denominadas FLT3-ITD y FLT3-TKD, que afectan la región yuxtamembrana y el dominio tirosina cinasa de la proteína, respectivamente. La mutación FLT3-ITD es una duplicación en tándem interna que ocurre entre los exones 14 y Lagunas-Rangel FA y col. FLT3, NPM1 y C/EBPα como marcadores de pronóstico Cuadro 1. Mutaciones frecuentes que afectan a FLT3, NPM1 y C/EBPα en pacientes con leucemia mieloide aguda Gen Mutaciones frecuentes Pronóstico clínico FLT3-ITD Involucra una duplicación en tándem interna (ITD) entre los exones 14 y 15 en el Desfavorable dominio yuxtamembrana. La longitud del ITD varía de 3 a 400 pb (múltiplo de tres nucleótidos). El promedio de los amplificados es de 59 pb Intermedio FLT3-TKD Mutaciones puntuales missense en el exón 20 del loop de activación en el dominio tirosina cinasa (TKD). Casi todas estas mutaciones involucran la sustitución de un aspartato por una tirosina en el codón 835 (D835Y), debido al cambio GAT→TAT Duplicación de los nucleótidos TCTG en las posiciones 956 a 959 del exón 12 Adición de los nucleótidos CATG entre las posiciones 956 y 957 del exón 12 Adición de los nucleótidos CCTG entre las posiciones 956 y 957 del exón 12 Región situada antes del TAD1, pudiendo presentar adiciones, eliminaciones y mutaciones missense y nonsense. Principalmente en esta región ocurren mutaciones nonsense que impiden la transcripción de la variante p42 Favorable Favorable Favorable Favorable Región C terminal del DBD y el N terminal del bZIP. Al igual que R1, puede presentar adiciones, eliminaciones y mutaciones missense y nonsense, que provocan una alteración en la unión al ADN y otras proteínas. Favorable FLT3 NPM1 Descripción Variante A Variante B Variante D R1 C/EBPα R4 Tomado de la referencia 7. 15. Se asocia con mal pronóstico clínico debido a que induce cuentas blásticas altas, incremento del riesgo de recaída y disminución de la supervivencia. FLT3-TKD generalmente es una mutación “missense” que modifica el codón 835, cambiando un residuo aspartato por una tirosina (D835Y). Su pronóstico se considera intermedio porque, a diferencia de FLT3-ITD, los pacientes no tienen manifestaciones clínicas adversas; sin embargo, no tienen una respuesta óptima al tratamiento. El gen NPM1 tiene varias mutaciones asociadas con leucemia mieloide aguda dentro del exón 12, existen diferentes variantes; sin embargo, las principales conllevan la duplicación en el caso de la variante A y la adición de cuatro bases en el caso de las variantes B y D entre los nucleótidos 956 y 957. Sólo la existencia de mutaciones en NPM1 se asocia con un pronóstico favorable en ausencia de FLT3-ITD. El gen C/EBPα codifica dos factores de transcripción con diferente secuencia de inicio, p42 y p30. Las mutaciones en este gen pueden ocurrir en cinco regiones diferentes; sin embargo, las regiones R1 y R4 son las afectadas con más frecuencia. Las mutaciones en la región R1 afectan la transcripción de p42, provocando la sobreexpresión de p30. Asimis- mo, las mutaciones en la región R4 modifican el bZIP y el dominio de unión al ADN alterando su interacción con este último y con otras proteínas asociadas. Comúnmente, los pacientes tienen ambas mutaciones en alelos diferentes y se asocian con un pronóstico favorable. REFERENCIAS 1. Estey E, Döhner H. Acute myeloid leukaemia. Lancet 2006;368:1894-1907. Available at: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0140673606697808. Accessed August 29, 2014. 2. Takahashi S. Current findings for recurring mutations in acute myeloid leukemia. J Hematol Oncol 2011;4:36. doi:10.1186/1756-8722-4-36. 3. Deguchi K, Gilliland DG. Cooperativity between mutations in tyrosine kinases and in hematopoietic transcription factors in AML. 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Estado del arte: metformina, cáncer y leucemia RESUMEN Al día de hoy se sabe que en la génesis y mantenimiento efectivo de una célula tumoral participan el mantenimiento de señales de proliferación celular, la evasión de los mecanismos supresores, resistencia a la apoptosis, replicación ilimitada, inducción de la angiogénesis, invasión y metástasis. Recientemente se han postulado también las alteraciones al equilibrio energético celular y la expresión de genes de resistencia a múltiples fármacos. La metformina, un medicamento prescrito durante más de 50 años, es en la actualidad el patrón de referencia en el tratamiento de pacientes diabéticos no insulinodependientes debido a que tiene mecanismos de acción capaces de regular los mecanismos de obtención de energía. A partir de la administración tan difundida de este fármaco en todo el mundo, surgieron diversas cohortes que apuntaban a que metformina era un factor protector contra el cáncer. Esta teoría se ha trasladado de manera exitosa a experimentos in vitro e in vivo, confirmándose las propiedades antitumorales, al parecer, mediadas por la inhibición de la vía LBK1/AMPK/mTOR y del IGF-1R. Por esta razón, en apenas menos de una década es posible encontrar ensayos clínicos de la adición de metformina a los esquemas de quimioterapia contra casi todos los tipos de cáncer. Sin duda alguna, se seguirán generando y consolidando los conocimientos de los efectos de metformina descritos e incluso de otros más inesperados, como los efectos sinérgicos que parece tener con los antibióticos en el tratamiento de la tuberculosis multirresistente. Christian Omar Ramos-Peñafiel1 Adrián Santoyo-Sánchez2 Irma Olarte-Carrillo3 Gloria Eugenia Queipo-García4 Yonathan Garfias-Becerra5 Adolfo Martínez-Tovar3 Servicio de Hematología. Unidad de Medicina Experimental. Laboratorio de Biología Molecular. 4 Servicio de Genética. Hospital General de México Dr. Eduardo Liceaga, México, DF. 5 Unidad de Investigación, Instituto de Oftalmología Conde de Valenciana, México, DF. 1 2 3 Palabras clave: metformina, proteínas cinasas activadas por AMP, serina-treonina cinasas TOR, receptor IGF tipo 1, cáncer, genes MDR. State of the art: Metformin, cancer and leukemia ABSTRACT It is currently known that in the genesis and effective maintenance of a tumor cell they are involved at least the following mechanisms: sustaining proliferative signaling, evading growth suppressors, resisting cell death, enabling replicative immortality, inducing angiogenesis and activating invasion and metastasis. Recently other modifications have also postulated like deregulating cellular energetics and the expression of multidrug resistance genes. Metformin, a drug used for more than 50 years, is currently the leader in the management of non-insulin dependent diabetic patients due it has mechanisms of action to regulate energy production mechanisms. The widespread worldwide use of this drug allowed that various cohorts pointing to metformin was a protective factor against cancer. This theory has been successfully transferred to in vitro and in vivo experiments and all confirm the antitumoral properties 168 Recibido: 9 de enero 2015 Aceptado: 26 de marzo 2015 Correspondencia: Dr. Christian Omar Ramos Peñafiel Hospital General de México Unidad 111-D, 2º piso Dr. Balmis 148 México, DF [email protected] Este artículo debe citarse como Ramos-Peñafiel CO, Santoyo-Sánchez A, OlarteCarrillo I, Queipo-García GE y col. Estado del arte: metformina, cáncer y leucemia. Rev Hematol Mex 2015;16:168-178. www.nietoeditores.com.mx Ramos-Peñafiel CO y col. Metformina, cáncer y leucemia apparently mediated by inhibition of LBK1/AMPK/mTOR and the IGF1R pathways. For this reason it is possible to find many clinical trials in the last decade about adding metformin to chemotherapy regimens for almost all cancers. Knowledge of the described effects of metformin is still being generated and strengthened as well as other more unexpected, such as the possible synergistic effects with antibiotics in the management of multidrug-resistant tuberculosis. Key words: metformin, AMP-activated protein kinases, TOR serinethreonine kinases, receptor, IGF type 1, cancer, MDR genes. ANTECEDENTES En la actualidad el cáncer es una de las primeras causas de muerte en todo el mundo. De acuerdo con el Registro Global de Cáncer (GLOBOCAN), sólo en 2012 se estimó un total de 14.1 millones de casos con 8.2 millones de muertes directas asociadas; los principales tipos de cáncer fueron el de mama y de pulmón.1 Una de las principales limitantes en todo el mundo son los pocos registros disponibles principalmente en países en vías de desarrollo. A pesar de que, de acuerdo con el Instituto Nacional de Cáncer de Estados Unidos, la incidencia global de cáncer va a la baja; la población latina muestra un repunte de algunos tipos de cáncer, principalmente de cuello uterino.2,3 En México, el Registro Histopatológico de Neoplasias Malignas de 2002, estimó un total de 58,599 defunciones asociadas con cáncer, 13% de todas las muertes; del total de los casos registrados entre 1993 y 2002, el cáncer de cuello uterino fue la principal causa (22% de los casos), seguido del cáncer de mama (11%), próstata (6%) y los linfomas (5%). Las leucemias sólo representaron 2% de todos los cánceres de México (16,512 casos).4 Diversos investigadores también han sugerido que las zonas urbanas pobladas son un factor de riesgo de diversos tipos de cáncer. La mayor parte de la población hispana con cáncer está ubicada en ciudades de Estados Unidos, Costa Rica y la Ciudad de México. En población pediátrica, Pérez-Saldivar y colaboradores estimaron la tasa de incidencia anual de leucemias en población pediátrica de hospitales públicos de la Ciudad de México, registraron 57.6 casos por millón de niños; la leucemia linfoblástica fue la principal causa, seguida de la leucemia mieloide aguda con 6.9 casos por millón de niños; concluyeron que la frecuencia de leucemia linfoblástica en la Ciudad de México es la más alta en población hispana.5 González-Salas y su grupo, en 2012, evaluaron en el Hospital General de México la distribución de leucemias agudas en adultos a través de dos periodos con 18 años de diferencia e identificaron que la leucemia linfoblástica aguda fue la variedad más frecuente en los dos periodos con un ligero realce de la leucemia promielocítica.6 En 2009, en México la mortalidad asociada con cáncer hemato-oncológico fue de 18%, en su mayor parte correspondió a leucemias agudas.7 El tratamiento general de la mayoría de los pacientes con neoplasias hemato-oncológicas consiste en un régimen secuencial de quimioterapia, que, en su conjunto, ocupa varios mecanismos de acción; el principal es el bloqueo de la proliferación y diferenciación celular mediante el ciclo celular.8,9 169 Revista de Hematología Mecanismos de génesis del cáncer El cáncer es una enfermedad multifactorial cuya génesis requiere la acumulación de factores de riesgo, como exposición a diversos agentes que condicionan el bloqueo de los mecanismos normales de inducción de la apoptosis. En general, todos los tipos de tumores comparten los mismos mecanismos, pero de manera particular cada uno puede expresar algún mecanismo más que otro.10 En el año 2000, Hanahan y Weinberg realizaron una descripción muy completa de los principales mecanismos presentes en todos los tumores; en general, incluyeron el mantenimiento de señales de proliferación celular, evasión de los mecanismos supresores, resistencia a la apoptosis, replicación ilimitada, angiogénesis y metástasis.11,12 Los avances en el entendimiento de la actividad tumoral permitieron el reconocimiento de otros dos mecanismos: la influencia en el metabolismo y la captación de energía, que puede estar incrementadas en diversos tumores y, finalmente, la evasión de la destrucción de las células tumorales mediante las células del sistema inmunitario.13,14 Otro de los mecanismos implicados en la fisiopatología y progresión de los tumores es su interacción con el microambiente principalmente asociado con los pericitos.15 Las enfermedades como el mieloma múltiple han permitido un mejor entendimiento de la interacción existente entre las células tumorales y su microambiente. 16 La mayor parte del estroma tumoral está compuesto de fibroblastos; éstos pueden ser de dos tipos: aquéllos con características morfológicas semejantes a los fibroblastos que sostienen a las células endoteliales y los denominados miofibroblastos con la capacidad de expresar α-actina.17 Estos últimos se expresan en sitios con actividad inflamatoria elevada, como el hígado, el pulmón y el riñón.18 La aparición de diversas células madre tumorales también se ha implicado en un pronóstico desfavorable en las diversas enfermedades oncológicas. Estas células madre pueden interactuar con el estroma 170 Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 generando plasticidad. Las células tumorales circulantes que se liberan del microambiente y pasan a la circulación también tienen la capacidad de encontrar un nuevo microambiente; estos sitios se conocen como nichos metastásicos, que tienen la capacidad de albergar nuevas células tumorales y son independientes de las señales tumorales iniciales.19 Los mecanismos básicos para la génesis de cualquier tipo de cáncer, descritos en el artículo original de Hanahan y Weinberg, se describen en la Figura 1.11 Metformina y cáncer La metformina es un fármaco antidiabético prescrito ampliamente para el tratamiento de la diabetes melllitus tipo 2. Inicialmente, Galega officinalis (lila francesa) se usó para el tratamiento de la poliuria y la halitosis por diversos herbolarios, pero a finales del decenio de 1950 tres fármacos se sintetizaron a partir de sus ingredientes activos (fenformina, metformina y buformina). Químicamente, la metformina es una biguanida sintética (Figura 2) y es la única biguanida disponible en el Reino Unido y Estados Unidos desde 1995.20 A pesar de su administración tan extensa, aún es poco lo que se sabe de su mecanismo de acción. Al igual que un número importante de fármacos (por ejemplo, aceteminofen, tamoxifeno, simvastatina), la mitocondria es uno de los principales blancos moleculares de metformina.21 Debido a que metformina posee una carga positiva, ésta se acumula en la matriz mitrocondrial inhibiendo al complejo I de la cadena transportadora de electrones. El resultado es la reducción en la oxidación de NADH y finalmente la disminución en las concentraciones de ATP, con la consecuente activación de la proteína AMPK (de las siglas en inglés: adenosine 5´-monophosphate-activated protein kinase), lo que transforma a la célula de un estado anabólico a un estado catabólico, restaurando su equilibrio energético.22 El interés de su administración potencial como medicamentos antitumorales se originó en diversos estudios Ramos-Peñafiel CO y col. Metformina, cáncer y leucemia Figura 1. Mecanismos implicados en la génesis, mantenimiento y perpetuidad de las células tumorales. Imagen traducida de la referencia 11. Figura 2. Estructura química de metformina. epidemiológicos de cohortes de pacientes con diabetes mellitus tipo 2, en los que la administración de metformina sola o en combinación con sulfonilureas disminuía el riesgo de cáncer en comparación con los expuestos a insulina.23 Estos hallazgos se han repetido en una diversidad de ensayos epidemiológicos en todo el mundo y de manera general con resultados constantes.24,25 Por tanto, podemos ubicar los beneficios de la administración de metformina respecto del cáncer en dos escenarios: el primero, pacientes con mayor riesgo de cáncer (por ejemplo, diabéticos) y segundo, los que ya tienen diagnóstico de cáncer y se desea potencializar el tratamiento o evitar las recaídas. 171 Revista de Hematología Estudios en pacientes con riesgo de cáncer La diabetes es uno de los principales factores de riesgo de diversas neoplasias. Uno de los estudios más amplios lo presentaron Baur y colaboradores en Alemania, en colaboración con cerca de 3,188 médicos de atención primaria. La prevalencia de cáncer fue mayor en el grupo de pacientes con diabets mellitus 2 (66/1,242) en comparación con la población sin diabetes (185/6,025: 5.1 versus 3%, p< 0.001). En cuanto al tratamiento, los pacientes con diabetes mellitus tipo 2 que fueron tratados con metformina como monoterapia mostraron menor tendencia a padecer cáncer (OR 1,04; IC 95% 0.46-2.39) en comparación con los que recibieron tratamiento oral sin la adición de metformina (OR 2.26; IC 95% 1.24-4.13). En ese mismo estudio, pero en la cohorte prospectiva, el riesgo de morir por cáncer también fue menor en el grupo de tratamiento con metformina (RR 1.34; IC 95% 0.42- 4.25) en comparación con los que recibieron cualquier otro tratamiento que no incluyera metformina (RR 3.51; IC 95% 2.09-5.88).26 Estos resultados se replicaron en otros países. Zhang y colaboradores reportaron menor riesgo de padecer neoplasias colorrectales en pacientes con diabetes mellitus 2 que fueron tratados con metformina de acuerdo con los hallazgos reportados de cinco ensayos (RR 0.63; IC 95% 0.5-0.79).24 Col y colaboradores diseñaron un metanálisis basado en siete estudios (cuatro cohortes y tres de caso-control), todos los estudios evaluaron metformina versus cualquier otro tratamiento (sulfonilureas, insulina y la combinación con sulfonilurea); la mayor parte consideró solamente cáncer de mama invasor y sólo uno se basó en los subtipos histopatológicos (expresión del receptor de hormona y HER2). Se determinó que metformina tiene un factor protector (OR 0.83; IC 95% 0.71-0.97) en los siete estudios, fue mayor en las pacientes con más de tres años de tratamiento (n=4 estudios, OR 0.75; IC 95% 0.62-0.91).25 En este contexto, el grupo encabezado por Liu describió el efecto de la adición de 172 Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 metformina en la proliferación celular en líneas de cáncer de mama triple receptor negativas.27 Recientemente, Koh y colaboradores describieron sobre esa misma línea celular los efectos de un compuesto derivado de metformina (metformina ácido gamma-aminobutírico (GABA), metformina-pregabalina, metformina-gabapentina) con efectos antitumorales semejantes pero 100 veces mayor.28 Debido a los efectos en la línea celular, diversos investigadores han explorado su efecto en la supervivencia, principalmente en el cáncer de mama HER-2 positivo. En un estudio de cohorte, Kim y colaboradores incluyeron 6,967 pacientes no diabéticas, 202 pacientes diabéticas y 184 diabéticas pero con otro tipo de tratamiento; el brazo de tratamiento con metformina tuvo mejor supervivencia y el grupo que no recibió metformina mostró mayor tendencia a metástasis (RR: 5.37; IC 95% 1.88-15.28).29 Efectos antitumorales de metformina A pesar de una gran diversidad de estudios epidemiológicos, el entendimiento de su efecto antitumoral ha derivado de los diversos ensayos en líneas celulares. En su mecanismo de acción habitual, el clorhidrato de metformina inhibe indirectamente la acción mitocondrial mediante la obstrucción de sus mecanismos de obtención de ATP mediante el bloqueo de la AMPK (AMP proteiína cinasa), incrementando las concentraciones de AMP con el consecuente bloqueo de la expresión de factores de transcripción (llamados factores de Yamanaka: OCT4, KLF4, SOX2, cMyc); también se ha reportado que regula la transcripción de microARNs (miARN) que influyen con diversos factores de transcripción, como FOXO o CREB (Figura 3).30,31 Este efecto en los mARN lo describieron Feng y colaboradores en la línea celular HCT 116 (cáncer de colon) en donde la adición de met- Ramos-Peñafiel CO y col. Metformina, cáncer y leucemia Figura 3. Mecanismos de acción antitumoral de metformina. formina y 5-fluorouracilo (5-FU) incrementó las concentraciones de un gen supresor de tumores denominado Spry2 mediante la supresión del micro RNA-21 (mir-21).32 Su principal mecanismo de acción en las células tumorales se ha centrado en la inhibición de procesos celulares que consumen energía y el principal blanco es la activación vía AMPK. De manera normal AMPK fosforila a TSC2 (complejo de esclerosis tuberosa 2) estimulando la GTPasa y reduciendo la actividad de la vía mTOR (blanco mamario de rapamicina), indispensable para la proliferación celular.30,33,34 Su efecto, a su vez, va más allá de las vías de señalización; de acuerdo con Vazquez-Martin, su efecto puede extenderse hasta en las células que inician cambios oncogénicos.33 Esto lo corroboró Memmott en 2010 en un ensayo en ratones a los que se les expuso al carcinógeno de tabaco 4-metilnitrosamina-1-(3-piridil)-1-butanol y fueron tratados posteriormente con metformina.35 En el hígado, metformina activó a AMPK e inhibió a mTOR, pero en el pulmón metformina inhibió la fosforilación del receptor del factor de crecimiento semejante a la insulina (IGF-1R/1R), Akt y la vía ERK (factor de señalización extracelular).35 La inhibición del IGF-1R también ha sido de beneficio en otras líneas celulares. Xie y colaboradores reportaron el efecto de la adición de metformina en líneas de cáncer de endometrio. La adición del fármaco aumentó la expresión del 173 Revista de Hematología receptor de progesterona, que es regulado por la vía del IGF.36 La fosforilación de mTOR también ha adquirido importancia porque incrementa la traducción de diversas proteínas que codifican reguladores del ciclo celular, como c-myc y la ciclina D1 (Figura 3).37 Otros efectos que se han descrito son en las vías relacionadas con la activación de AMPK, como LKB1 (serina/treonina cinasa 11).38 En otro aspecto cercano a los descritos, Rozengurt y colaboradores describieron en células de cáncer de páncreas que la metformina también inhibe los receptores acoplados a proteínas G asociados con los receptores de IGF-1R. 38 Otra GTPasa que también es blanco de mefformina es la GTPasa Rac1, altamente expresada en cáncer de próstata.39 En el modelo celular de cáncer de próstata de Dirat y colaboradores, metformina inhibió la GTPasa Rac 1 mediante el bloqueo de vías de señalización celular, como P-REX1, AMPc, CXCL12/CXCR4. 39 Recientemente, otra vía de señalización se identificó como blanco de metformina. El grupo lidereado por Nakamura, en la línea de células pancreáticas BxPC3, adicionó metformina, misma que bloqueó la expresión de las proteínas implicadas en la vía de señalización Sonic hedgehog (Shh).40 Asimismo, en cáncer de mama también se describió que metformina inhibió el efecto de la vía Shh mostrando una correlación entre las concentraciones de AMPK.41 Las investigaciones del equipo de Lin en líneas celulares de cáncer de pulmón también evidenciaron que la adición de metformina inhibe la fosforilación de la vía mediada por IL6/STAT3 (transductor de señal y transcriptor activador signal transducer and activator transcriptor, Figura 3), incrementando la toxicidad mediada por cisplatino, pudiendo regularla por la activación de LKB1-AMPK y por este otro mecanismo independiente de la vía mTOR.42 174 Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 Metformina y su asociación con las proteínas que inhiben la apoptosis Entre otros mecanismos implicados está la asociación con otras proteínas implicadas en diversas vías de señalización, como PI3K. Una de las proteínas más complejas es la survivina, que está implicada principalmente entre los mecanismos inhibidores de la apoptosis (Figura 3); son una familia completa de genes que están activos en estado normal y en estados patológicos. Su principal papel es en el mecanismo de mitosis,43 principalmente en la etapa G2/M, inhibiendo la actividad de la caspasa 7.44 Durante el desarrollo tumoral, la relación de la expresión de survivina está expresada de manera inversa, diversas mutaciones sobre la survivina también se han asociado con el crecimiento tumoral.45 Diversos fármacos realizan sinergia con metformina, pero uno en especial muestra un efecto antagónico. Lesan y colaboradores, en la línea celular MKN-45, demostraron que la adición de metformina al cisplatino incrementa las concentraciones de survivina y mTOR. Este efecto antagónico se justifica por la interferencia del cisplatino mediado a metformina, por lo que no es buena opción para el tratamiento de cáncer gástrico.46 En otro modelo de cáncer gástrico, Han y colaboradores evaluaron el efecto en tres líneas celulares de cáncer gástrico (MKN-28, SGC-7901, BGC-823) de añadir metformina, sugiriendo que el efecto de ésta en la apoptosis está mediada por inhibición de la survivina mediada por el efecto en la vía mTOR.47 Metformina en neoplasias hemato-oncológicas La mayor parte de la evidencia obtenida de las líneas celulares sugiere que la vía de señalización celular LKB1/AMPK tiene in papel muy importante en la regulación y protección de los mecanismos de apoptosis. Debido a que Ramos-Peñafiel CO y col. Metformina, cáncer y leucemia metformina actúa mediante la activación de AMPK, se ha sugerido que muestra un efecto potencial en especial en las neoplasias en las que se prescriben antracíclicos como doxorrubicina (cáncer de mama, de ovario, leucemia linfoblástica, melanoma).48 Otros autores sugieren que su potencial antileucémico puede radicar en dos mecanismos; el primero: la disminución de la hiperinsulinemia, limitando la expresión de diversos factores de crecimiento semejantes a la insulina, y el segundo, por el bloqueo de vías de señalización dependientes de AMP, la principal es la vía mTOR.49 Otros autores sugieren que este regulador metabólico puede ser de utilidad en situaciones como la expresión de BCR-ABL1, porque ésta activa vías de supervivencia, como PI3K/AKT/mTOR, que también es bloqueada por los activadores de la AMPK.50 Vakana y colaboradores demostraron en líneas celulares la disminución en la expresión del transcrito BCR-ABL1 [células de leucemia mieloide crónica Ph (+), leucemia linfoblástica aguda] con la adición de metformina a los medios de cultivo, incluyendo líneas celulares con expresión de la mutación T315I.51 Debido a estos efectos, Pan y colaboradores evaluaron el efecto en diversas líneas celulares de la adición de metformina 500 μM o rosiglitazone 10 μM; los autores concluyeron que metformina sensibiliza a la línea celular Reh, mientras la insulina incrementa la quimiorresistencia.8 Otros modelos en líneas celulares de leucemia también han propuesto que la adición de metformina induce apoptosis mediante la sobrerregulación de vías de estrés celular y proteínas que interactúan en la apoptosis (disminución de la expresión de IRE1α y CHOP).52 En nuestra experiencia en la línea celular MOLT-4, también se logró la inhibición en la viabilidad celular, logrando un bloqueo, principalmente en la etapa G0/G1; posteriormente al adicionar además prednisona como estrategia de pretratamiento en pacientes adultos con leucemia linfoblás- tica aguda, se logró incrementar la respuesta favorable a los esteroides.53 Recientemente en un estudio piloto se adicionó metformina a nuestro régimen institucional de tratamiento de leucemia linfoblástica, logrando reducción del porcentaje de recaídas tempranas (25 versus 48%) en comparación con el grupo que sólo recibió quimioterapia; la dosis administrada en este ensayo fue de 850 mg vía oral cada 8 horas.9 Nuevos trucos de la metformina El conocimiento de los efectos antitumorales de metformina es cada vez más complejo y extenso, se centra en la activación de AMPK y el bloqueo de la vía mTOR. Estos efectos antitumorales se han reportado en gran número de líneas celulares de cáncer, pero Singhal y colaboradores evaluaron los efectos de este fármaco en el crecimiento de Mycobacterium tuberculosis. En su modelo, el crecimiento celular de Mycobacterium fue detenido debido a la activación de AMPK, produciendo especies reactivas de oxígeno, al igual que facilitó la fusión lisosomal.54 Estos resultados han impulsado propuestas para incorporarse dentro de los esquemas de tratamiento, en especial en los bacilos multirresistentes.55 CONCLUSIONES En la actualidad, la metformina es la primera línea de tratamiento de los pacientes diabéticos no insulinodependientes en todo el mundo.56 Sus indicaciones se han extendido con el tiempo, como en diabetes gestacional, prediabetes o en el síndrome de ovario poliquístico.57-59 A pesar de que se ha prescrito durante más de 50 años en la clínica, es poco aún lo que se conoce de su mecanismo de acción y más aún de su potencial antitumoral. Los efectos antitumorales de metformina se resumen en la Figura 4 e incluyen un nuevo posible efecto que actualmente está en investigación, que es el bloqueo de la expresión 175 Revista de Hematología Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 Figura 4. Efectos de metformina en los mecanismos fisiopatogénicos de las células de cáncer. Modificada de la referencia 11. de los genes de resistencia a fármacos. A pesar de ser un medicamento tan antiguo, cada vez conocemos más de su real y potencial mecanismo de acción. Agradecimientos Agradecemos el apoyo del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) que apoya los protocolos de investigación (registros 80085 y 162269) que dan origen a esta revisión. De igual manera, agradecemos a la División de Posgrado 176 y la Coordinación de Servicio Social de Pregrado de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Autónoma de México. REFERENCIAS 1. Torre LA, Bray F, Siegel RL, Ferlay J, et al. Global cancer statistics, 2012. 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A sus 17 años, después de la abrupta muerte de su padre por insuficiencia cardiaca, se trasladó con su madre y dos hermanos a la Ciudad de México para cumplir su sueño de estudiar Medicina en la UNAM. Al igual que toda su familia, se hizo mexicano de corazón. Una vez graduado de médico con honores (1961), estudió Pediatría en el Hospital Infantil de México, donde después de conseguir su añorada especialidad (1965), decidió hacerse hematólogo al lado del gran Maestro mexicano, el Dr. Samuel Dorantes Mesa. Luego de 10 años de residir en México, regresó a su tierra natal para ser el primer hematólogo pediatra de Costa Rica. Tuvo la suerte de que en su país acababa de crearse el Hospital Nacional de Niños, al que se incorporó de inmediato como Jefe de Hematología y también a la docencia universitaria en la Universidad de Costa Rica. Poco después, al darse cuenta de que el Hospital Saint Jude de Memphis había establecido la terapia total para el tratamiento de los niños con leucemia, viajó a ese centro para tratar de poner en práctica los novedosos tratamientos. Ahí estableció gran amistad con el Dr. Rhômes Aur, responsable en aquel momento de los tratamientos de niños con leucemia linfocítica. Esto lo convirtió en pionero de las curaciones de los niños leucémicos costarricenses. No satisfecho de sus logros, se incorporó al Grupo Latinoamericano para el Tratamiento de Leucemias y Hemopatías Malignas creado por su entrañable amigo, el Dr. Santiago Pavlovsky, con lo que el Hospital Nacional de Niños obtuvo niveles impresionantes de supervivencia y curación de los pacientes con leucemia, y se transformó en el primer centro que realizó trasplantes de médula ósea en América Central. Dirigió durante más de 30 años los destinos del Hospital Nacional de Niños, ya fuera como director o subdirector, y en 1975 creó el primer Comité Ético Científico del país y de Centroaméwww.nietoeditores.com.mx Correspondencia: Dr. Rafael Jiménez Bonilla Apartado 638-1007 Centro Colón, Costa Rica [email protected] 179 Revista de Hematología rica. Posteriormente fue nombrado Presidente del Seguro Social de Costa Rica, que abarca el cien por ciento de los hospitales del país, donde realizó una magna labor como jerarca de la más grande institución médica costarricense, consiguiendo financiamiento para muchas obras, como el moderno edificio de Especialidades Médicas del Hospital Nacional de Niños. Otro de sus grandes logros fue la creación del primer programa de Hematología en su país, con el que logró formar hematólogos pediatras, no sólo de Costa Rica, sino de varios países de Latinoamérica, que son en la actualidad jefes en sus respectivos hospitales. Al darse cuenta que el voluntariado era necesario para obtener mejores resultados en los niños con cáncer, organizó un grupo de personas que hoy conforman la Asociación de Lucha contra el Cáncer Infantil, sin la cual no se hubiera podido atender a los miles de niños con esos padecimientos. Esta institución mantiene en la actualidad un albergue para los pequeños y sus padres que viajan de zonas rurales para recibir tratamiento en el Hospital Nacional de Niños, y paga el transporte y sepelios, así como personal especializado, equipo médico y medicamentos. Fue presidente y fundador de la Asociación Costarricense de Hematología, vicepresidente de la Academia Nacional de Medicina, presi- 180 Volumen 16, Núm. 2, abril-junio 2015 dente de la Asociación de Investigación Clínica, miembro de múltiples asociaciones médicas internacionales y un asiduo luchador para que en Costa Rica se estableciera una ley específica de investigación biomédica, que convirtió a su país en el primero de Latinoamérica en tener una ley en ese sentido. Sus grandes atributos, que lo hicieron sobresalir del promedio y transformarse en un hombre extraordinario, fueron varios, entre los que cabe citar su preclara inteligencia, que lo hizo conformar grupos multidisciplinarios y delegar funciones en sus subalternos para que descollaran en sus labores. Es común entre los grandes hombres ser sencillos y no tratar de imponer sus ideas a la fuerza, sino a base de convencimiento y basado en los mejores razonamientos y experiencia en el campo; así fue él. No conforme con lo que hacía, siempre buscaba un nuevo sueño por el cual luchar. Las personas superiores emiten una luz constante que irradia a los que se les acercan. Por eso logró establecer diferentes grupos de amigos, que serán los responsables de continuar su obra. Era amante del deporte, la lectura, la música clásica y auspiciador de la Orquesta Sinfónica Nacional. Disfrutó cada momento junto a sus tres hijos, siete nietos y su esposa Cecilia, con la cual estuvo casado 55 años. Jiménez-Bonilla R. Doctor Elías Jiménez Fonseca Nunca perdió su vínculo con la Hematología mexicana. En los congresos de la Agrupación Mexicana para el Estudio de la Hematología y en diferentes foros pediátricos, se hacía presente para disertar sobre distintos temas de su especialidad; últimamente acerca de los problemas de comportamiento en niños que habían tenido anemia por deficiencia de hierro en las primeras etapas de su vida y que lamentablemente quedaron con secuelas permanentes, estudios realizados con la pediatra estadounidense Betzy Lozoff. Entre sus innumerables publicaciones pueden citarse no sólo las de su especialidad hematológica, sino capítulos y libros de Pediatría para médicos y padres. Lamentablemente, en la magna obra de la Hematología: la Enciclopedia Iberoamericana, dirigida por el insigne médico español don Antonio López Borrasca, tuvo que declinar su participación como autor. En aquel momento su hijo varón había muerto en un accidente automovilístico. El Maestro Jiménez fue un ser humano excepcional que supo implantar ideas que prevalecerán por muchísimos años. Nadie de los que estuvo a su lado podrá jamás decir que no fue conmovido por su gran poder de síntesis, por la casta que sacaba ante las emergencias, pero sobre todo, porque valoraba por igual al más humilde de los trabajadores del hospital que a las autoridades superiores. Podría decirse que fue un verdadero caballero andante, por inculcar en sus discípulos la universalización del conocimiento y el uso de principios y valores morales que los convirtieron, sin duda, en mejores seres humanos. Al despedirlo sentimos tristeza, pero a la vez un gran orgullo de haber podido estar a su lado durante más de cuatro décadas. 181 Letter to the editor Rev Hematol Mex 2015;16:182. Chemotherapy alone in early stage Hodgkin’s lymphoma Guillermo J Ruiz-Argüelles MD, FRCP (Glasg), MACP Centro de Hematología y Medicina Interna, Clínica Ruiz Quimioterapia sin radioterapia en el tratamiento de los estadios iniciales del linfoma de Hodgkin The paper by Radford et al clearly shows that treatment with ABVD chemotherapy (CT) is noninferior to treatment with radiotherapy (RT) in early-stage Hodgkin’s lymphoma.1 Equipments which deliver RT worldwide are heterogeneous in its features, efficacy and conditions, and outdated radiotherapy equipments are still operating in underprivileged circumstances, such as those prevailing in developing (middle income) countries.2 With this idea in mind we published a study assessing the efficacy of CT alone in the treatment of early stage Hodgkin’s lymphoma and we found that “it is better a conventional CT than a suboptimal RT in the treatment of early-stage Hodgkin’s disease”.2,3 In certain conditions, therapeutic choices are based not only on scientific data, but also in economic circumstances which lead into differentiated efficacy of the therapeutic approaches.4 The data in the paper by Radford et al, scientifically support the decision to use CT alone in the treatment of early-stage Hogkin’s lymphoma, in circumstances in which RT is less than optimal and in other scenarios. REFERENCES 182 1. Radford J, Illidge T, Counsell N, Hancock B, et al. Results of a trial of PET-directed therapy for early stage Hodgkin’s lymphoma. N Engl J Med 2015;372:1598-1607. 2. Ruiz-Argüelles GJ, Gómez-Almaguer D. Chemotherapy in early stage Hodgkin’s disease. Sem Oncol 1997;24:XIV. 3. Ruiz-Argüelles GJ, Gómez-Almaguer D, Apreza-Molina MG. Chemotherapy alone may be an efficient alternative in the treatment of early stage Hodgkin’s disease if optimal radiotherapy is not available. Leukemia Lymph 1997;27:179-183. 4. Ruiz-Argüelles GJ, Tarín-Arzaga LC, González-Carrillo ML, Gutiérrez-Riveroll KI, et al. Therapeutic choices in patients with Ph1 (+) chronic myelogenous leukemia living in México in the tyrosine kinase inhibitors (TKI) era: Stem cell transplantation or TKI’s? Bone Marrow Transplant 2008;42:23-28. www.nietoeditores.com.mx Normas para autores Los manuscritos deben elaborarse siguiendo las recomendaciones del Comité Internacional de Editores de Revistas Médicas (N Engl J Med 1997;336:309-15) y se ajustan a las siguientes normas: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. El texto debe enviarse por correo electrónico a la atención del Editor: [email protected]. Las secciones se ordenan de la siguiente manera: autores, adscripciones, dirección para envío de correspondencia al editor La extensión máxima de los originales será de 15 hojas, de los casos clínicos 8 hojas y cuatro figuras o cuadros. Las revisiones no excederán 15 hojas. Si todos los autores pertenecen a servicios diferentes pero a una misma institución el nombre de ésta se pondrá una sola vez y al final. La identificación de los autores deberá hacerse con números en superíndice. Todo el material gráfico (cuadros, figuras y fotografías) deberá ser de calidad (nitidez y enfoque) para que su reproducción sea excelente. Se recomienda incluir todo tipo de ilustración enseguida de las referencias bibliográficas. Las gráficas, dibujos y otras ilustraciones deben dibujarse profe sionalmente o elaborarse con un programa de cómputo y adjuntarlas al mismo archivo del texto. Los cuadros (y no tablas) deberán numerarse con caracteres arábigos. Cada uno deberá tener un título breve; al pie del mismo se incluirán las notas explicativas que aclaren las abreviaturas poco conocidas. No se usarán líneas horizontales o verticales internas. Todos los cuadros deberán citarse en el texto. Tipo de artículos: la revista publica artículos originales en el área de investigación clínica o de laboratorio, editoriales, artículos de revisión, biotecnología, comunicación de casos y cartas al editor. Se reciben artículos en los idiomas español e inglés. Resumen no mayor de 250 palabras, y deberá estar estructurado en antecedentes, material y método, resulta dos y conclusiones. Con esta estructura se deberán enunciar claramente los propósitos, procedimientos básicos, metodología, principales hallazgos (datos concretos y su relevancia estadística), así como las conclusiones más relevantes. Al final del resumen proporcionarán de 3 a 10 palabras o frases clave. Enseguida se incluirá un resumen (abstract) en inglés. 9. Abstract. Es una traducción correcta del resumen al inglés. 10. Texto. Deberá contener antecedentes, material y métodos, resultados y discusión, si se tratara de un artículo experimental o de observación. Otro tipo de artículos, como comunicación de casos, artículos de revi sión y editoriales no utilizarán este formato. a) Introducción. Exprese brevemente el propósito del artículo. Resuma el fundamento lógico del estudio u observación. Mencione las referencias estrictamente pertinentes, sin hacer una revisión extensa del tema. No incluya datos ni conclusiones del trabajo que está dando a conocer. b) Material y método. Describa claramente la forma de selección de los sujetos observados o que participaron en los experimentos (pacientes o animales de laboratorio, incluidos los testigos). Identifique los métodos, aparatos (nombre y dirección del fabricante entre paréntesis) y procedimientos con detalles suficientes para que otros investigadores puedan reproducir los resultados. Explique brevemente los métodos ya publicados pero que no son bien conocidos, describa los métodos nuevos o sustancialmente modificados, manifestando las razones por las cuales se usaron y evaluando sus limitaciones. Identifique exactamente todos los medicamentos y productos químicos utilizados, con nombres genéricos, dosis y vías de administración. c) Resultados. Preséntelos siguiendo una secuencia lógica. No repita en el texto los datos de los cuadros o figuras; sólo destaque o resuma las observaciones importantes. d) Discusión. Insista en los aspectos nuevos e importantes del estudio. No repita pormenores de los datos u otra información ya presentados en las secciones previas. Explique el significado de los resultados y sus limitaciones, incluidas sus consecuencias para la investigación futura. Establezca el nexo de las conclusiones con los objetivos del estudio y absténgase de hacer afirmaciones generales y extraer conclusiones que carezcan de respaldo. Proponga nueva hipótesis cuando haya justificación para ello. e) Referencias. Numere las referencias consecutivamente siguiendo el orden de aparición en el texto (identifique las referencias en el texto colocando los números en superíndice y sin paréntesis). Cuando la redacción del texto requiera puntuación, la referencia será anotada después de los signos pertinentes. Para referir el nombre de la revista utilizará las abreviaturas que aparecen enlistadas en el número de enero de cada año del Index Medicus. No debe utilizarse el término “comunicación personal”. Sí se permite, en cambio, la expresión “en prensa” cuando se trata de un texto ya aceptado por alguna revista, pero cuando la información provenga de textos enviados a una revista que no los haya aceptado aún, citarse como “observaciones no publicadas”. Se mencionarán todos los autores cuando éstos sean seis o menos, cuando sean más se añadirán las palabras y col. (en caso de autores nacionales) o et al.(si son extranjeros). Si el artículo referido se encuentra en un suplemento, agregará Suppl X entre el volumen y la página inicial. La cita bibliográfica se ordenará de la siguiente forma en caso de revista: Torres BG, García RE, Robles DG y col. Complicaciones tardías de la diabetes mellitus de origen pancreático. Rev Gastroenterol Mex 1992;57:226-229. Si se trata de libros o monografías se referirá de la siguiente forma: Hernández RF. Manual de anatomía. 2ª ed. México: Méndez Cervantes, 1991;120-129. Si se tratara del capítulo de un libro se indicarán el o los autores del capítulo, nombre del mismo, ciudad de la casa editorial, editor del libro, año y páginas. 11. Transmisión de los derechos de autor. Se incluirá con el manuscrito una carta firmada por todos los autores, conteniendo el siguiente párrafo: “El/los abajo firmante/s transfiere/n todos los derechos de autor a la revista, que será propietaria de todo el material remitido para publicación”. Esta cesión tendrá validez sólo en el caso de que el trabajo sea publicado por la revista. No se podrá reproducir ningún material publicado en la revista sin autorización. Revista de Hematología se reserva el derecho de realizar cambios o introducir modificaciones en el estudio en aras de una mejor comprensión del mismo, sin que ello derive en un cambio de su contenido. Los artículos y toda correspondencia relacionada con esta publicación pueden dirigirse al e-mail: [email protected] Author requirements Manuscripts should be made following recommendations of the International Committee of Medical Journal Editors (N Engl J Med 1997;336:30915) and adjusted to the following guidelines: 1. The document printed in letter size (21 × 27 cm) sheets must be delivered, using double-spacing, along with its with corresponding computer disk data and indicating the article’s title on the label, leading author’s name and computer program with version. (e.g., Estrogen and climaterium. Guillermo Martínez. Word 6.0). Sections are ordered in the following form: page title, structured abstract, summary, introduction, materials and methods, results, discussion, references, tables and captions. 3. The maximum extension of originals will be 15 pages, for clinical cases 8 pages, and four for figures or tables. Reviews will not exceed 15 pages. The first page will contain the full title of the article, not exceeding 85 characters, the names of the authors, services or departments and institution(s) they belong to and the leading author’s address. If all the authors belong to different services of the same institution, their name will be mentioned only once at the end. Authors identification should be done superscript Arabic numbers. 4. For identification, each page of the article should have, on the upper left corner, the initial of the name and last name of the leading author, and on the upper right corner, the consecutive page number. 5. All graphic material should be sent in slides, black-and-white, sharp and clearly defined. In the slide frame write in ink the code word to identify the article, the figure number, last name of the leading author and with an arrow the top part of the figure will be marked. If the slide includes material formerly published, it should come with the written authorization of the copyright holder. 6. Graphs, drawings and other illustrations should be professionally drawn or made by computer and attached in the same disk the text writing is, on the label written the program used. 7. Tables (and non-charts) should be numbered with Arabic numbers. Each should have a brief title; the footnotes will include explanatory notes to clarify abbreviations poorly known. Do not use horizontal or vertical inner lines. All tables should be quoted in the text. 8. Type of articles: the journal publishes original articles in the area of clinical or laboratory research, editorials, review articles, biotechnology, case communications and letters to the editor. Articles are received in Spanish and English languages. 9. Summary. The second page will include a summary, no longer than 250 words and will be structured in background, materials and methods, results and conclusions. Following this structure, purposes, basic proceedings, methodology, main outcomes (hard data and statistical significance), and most relevant conclusions. At the end of the summary there will be 3 to 10 keywords or sentences. Following this, an abstract written in English will be provided. 10. Abstract. This is the right translation of the summary to English. 11. Text. Text should contain introduction, materials and methods, results and discussion, if this is an experimental or observational article. Other articles, like case communications, review articles and editorials will not use this format. a) Introduction. Briefly express the purpose of the article. Summarize the logic grounds of the study or observation. Quote only strictly pertinent references, without making a extensive review of the topic. Do not include data or conclusions of the job you are making known. b) Materials and methods. Describe clearly in the selection the way you selected the observed subjects or those who participated in the experiments (patients or laboratory animals, including controls). Identify methods, devices (name and address of the manufacturer in parentheses) and detailed procedures for others to reproduce the results. Briefly explain formerly published methods which are not widely known, describe new or substantially modified methods, manifesting the reasons why you used them and assessing their limitations. Identify every single medication and chemical product used, with generic name, dose and route of administration. c) Results. Present them following in a logical sequence. Do not repeat data from tables or figures within the text; just emphasize or summarize the pertinent observations. d) Discussion. Emphasize new and important aspects of the study. Do not repeat details in the data or other information previously mentioned in other sections. Explain the meaning of the results and their limitations, including their consequences for future research. Establish the connection of the conclusions with the study objectives and refrain from making general statements and making conclusions without support. Suggest a new hypothesis when it is justified. e) References. Number the references consecutively following the appearance order in the text (identify the references within the text with superscript numbers without parentheses). When the text needs punctuation, the reference will be annotated after the pertinent signs. To refer the name of a journal use abbreviations listed every year in the January number of the Index Medicus. The term “personal communication” should not be used. On the other hand, it is allowed to use the expression “in press” when it refers to an already accepted text by some journal, but when the information comes from texts sent to a journal which has not accepted it yet, it should be referred to as “non-published observations”. All authors should be mentioned when there are six or less, when there are more, add the words and cols. (in the case of national authors) or et al. (if foreigners). If the cited article is located in a supplement, add suppl X between the volume and the initial page. In the case of a journal, bibliographic citations will be ordered in this way: Torres BG, García RE, Robles DG et al. Late complications of diabetes mellitus of pancreatic origin. Rev Gastroenterol Mex 1992; 57:226-229. In the case of books or monographs, reference will be: Hernández RF. Anatomy manual. 2nd edition. Mexico: Méndez Cervantes, 1991; 120-129. In the case of a book chapter, indicate the author(s) in the chapter, the name of the chapter, city of the publishing house, the book’s editor, year and pages. 12. Transfer-of-copyright. Along with the manuscript, deliver a letter signed by all the authors, with the following paragraph: “The undersigned author(s) transfer all copyrights to the journal, which will be the holder of all submitted material for publication”. This transfer will be valid only in the case that the journal publishes the paper. No material can be reproduced without the journal’s authorization. 13. We recommend to include citations from Mexican or Latin American authors in the bibliographic references. Hematologia reserves the right to make changes or include modifications in the study in order of better understanding of such, without modifying its content. Articles and all mailing relating with this publication should be [email protected] dressed to the following e-mail: [email protected]