CARACTERIZACION DE LA ESTRUCTURA Y DINAMICA DE

Transcripción

CARACTERIZACION DE LA ESTRUCTURA Y DINAMICA DE
COMUNIDADES MICROBIANAS DE ECOSISTEMAS ACUATICOS
ASOCIADOS A SISTEMAS PRODUCTIVOS EN LA CUENCA DEL RÌO LA
VIEJA
AYDEE SOFIA MUÑOZ NUÑEZ
BIOLÓGA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
MAESTRÌA EN CIENCIAS BIOLÒGICAS
BOGOTÁ, D.C.
2008
CARACTERIZACIÓN DE LA ESTRUCTURA Y DINÁMICA DE
COMUNIDADES MICROBIANAS DE ECOSISTEMAS ACUÁTICOS
VIEJA
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
MAGISTER EN CIENCIAS BIOLÒGICAS
SANDRA BAENA Ph.D.
Directora
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
MAESTRÌA EN CIENCIAS BIOLÒGICAS
BOGOTÁ, D.C.
2008
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos
en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y
a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona
alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
VIEJA
APROBADO
________________________
Angela Umaña
_______________________
Ivon Venegas
Biólogo
Ph.D. Biólogo-Limnólogo
Jurado
Jurado
________________________
Dr. Rodulfo Ospina
Biólogo
Jurado
VIEJA
APROBADO
_______________________
Ingrid Schuler Ph.D.
Decana Académica
Facultad de ciencias
Pontificia Universidad Javeriana
__________________________
Carlos Corredor Ph.D
Director Postgrado
Pontificia Universidad Javeriana
A Dios por darme la sabiduría y fortaleza en los
momentos más difíciles de mí vida.
A mi madre a quien le debo todo lo que soy, que
con su amor y comprensión me inspiró para
alcanzar mis sueños.
AGRADECIMIENTOS
Deseo mis sinceros agradecimientos a:
La profesora Sandra Baena Garzón, por su profesionalismo, paciencia y afecto
especial. Ella es una verdadera huella a seguir.
Al Doctor Carlos Rivera por su valiosa asesorìa en la parte estadística de la tesis.
Al Centro de Investigación en Estudios de Biodiversidad y Recursos Genéticos
CIEBREG por la oportunidad de permitirme realizar este proyecto de investigación.
A Carolina Díaz por su valiosa asesoría en la parte molecular.
A mi hermanita Tania y a mis hermanos Freddy y Marcos por su apoyo
incondicional, aun en la distancia.
A mis amigas de maestría en especial María Magdalena Gómez Coronel, Marcela
Gómez y Yamile Díaz por su valiosa amistad y apoyo incondicional.
A mis compañeros de laboratorio por hacer amenos los momentos difíciles.
Y en general a todas las personas que de alguna manera contribuyeron para que este
estudio pudiera ser realizado.
CONTENIDO
1. INTRODUCCION
Pág.
1
2. MARCO CONCEPTUAL
4
2.1 BIENES Y SERVICIOS AMBIENTALES
4
2.2 SISTEMAS PRODUCTIVOS
7
2.3 ECOSISTEMAS ACUÁTICOS LÒTICOS
9
2.1.2 Bienes y servicios ambientales derivados de los ecosistemas acuáticos.
2.2.1 Sistemas productivos en la ecorregión cafetera.
2.3.1 Factores ambientales que influyen en los ecosistemas lòticos
6
8
11
2.4 COMUNIDADES MICROBIANAS EN ECOSISTEMAS ACUÁTICOS
14
ecosistemas acuáticos
16
3. METODOLOGÍA
23
2.4.1 Factores que determinan la distribución de comunidades bacterianas en los
2.4.2 Herramientas para el estudio de estructura de comunidades bacterianas
3.1 ÁREA DE ESTUDIO
3.2 IDENTIFICACIÓN DE LOS SISTEMAS PRODUCTIVOS Y ELECCIÓN
19
23
DE LOS SITIOS DE MUESTREO
24
3.4 RECOLECCIÓN DE LA INFORMACIÓN MEDIANTE ENCUESTAS
27
3.3 FASE DE CAMPO
3.5 FASE DE LABORATORIO
3.5.1 Procesamiento de las muestras de sedimentos recolectadas a partir de los
26
28
ríos de estudio
28
microorganismos
28
3.5.2 Fijación de las células de las muestras de sedimento para el conteo total de
i
3.5.3 Separación de las células del sedimento
3.5.4 Recuento total de células por tinción con DAPI
3.5.5 Extracción del ADN de las muestras de sedimento para los análisis de
estructura y dinámica de las comunidades microbianas
3.5.6 Amplificación del gen 16S rRNA
3.5.7 Análisis de la estructura y dinámica de las comunidades microbianas
3.5.8 Relaciones entre la diversidad de las comunidades microbianas y los
28
29
29
29
31
sistemas productivos
32
el DGGE
32
SELECCIONADOS EN EL DGGE
32
3.5.9 Análisis de agrupamiento y similitud de los perfiles de OTUs generados en
3.6 SECUENCIACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LOS OTUS
4. ANÁLISIS DE LOS DATOS
4.1 VARIABLES FISICOQUÍMICAS E HIDROLÓGICAS EN LOS
SISTEMAS PRODUCTIVOS DE LA CUENCA DEL RÍO LA VIEJA
4.2 ÍNDICE DE CALIDAD DE AGUA
4.3 ANÁLISIS DE ORDENACIÓN DE LOS DATOS DE LA COMPOSICIÓN
DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS
4.4 RELACIÓN ENTRE PARÁMETROS FISICOQUÍMICOS, E
HIDROLÓGICOS CON LAS COMUNIDADES MICROBIANAS EN CADA
SISTEMA PRODUCTIVO
5. RESULTADOS
5.1 CALIDAD DEL AGUA Y VARIABILIDAD FÍSICA, QUÍMICA E
HIDROLÓGICA
34
34
34
35
35
37
37
5.2 RECUENTO TOTAL DE CÉLULAS POR TINCIÓN CON DAPI
46
MICROBIANAS
46
5.3 ANÁLISIS DE LA ESTRUCTURA Y DINÁMICA DE COMUNIDADES
ii
5.4 ÍNDICES DE DIVERSIDAD DE LAS MUESTRAS DE LOS
DIFERENTES SISTEMAS PRODUCTIVOS
52
SELECCIONADOS EN EL DGGE
53
SISTEMAS PRODUCTIVOS
57
COMUNIDADES MICROBIANAS
59
5.5 SECUENCIACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LOS OTUS
6. RELACIONES ENTRE LA ESTRUCTURA MICROBIANA Y LOS
6.1 RELACIÓN ENTRE LAS VARIABLES AMBIENTALES Y LAS
7. DISCUSIÓN
7.1 CALIDAD DEL AGUA Y CARACTERÍSTICAS DE LAS VARIABLES
FISICOQUÍMICAS E HIDROLÓGICAS EN LOS DIFERENTES SISTEMAS
62
PRODUCTIVOS, EN LA CUENCA DEL RÍO LA VIEJA
62
MICROBIANAS
63
7.2 ESTRUCTURA Y DINÁMICA DE LAS COMUNIDADES
7.3 RELACIÓN ENTRE LAS VARIABLES AMBIENTALES Y LAS
COMUNIDADES MICROBIANAS PRESENTES EN LOS RÍOS
ASOCIADOS A LOS DIFERENTES SISTEMAS PRODUCTIVOS, EN LA
CUENCA DEL RÍO LA VIEJA
68
9. RECOMENDACIONES
72
8. CONCLUSIONES
70
BIBLIOGRAFIA
73
ANEXOS
88
iii
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Servicios ambientales proporcionados por diversos bienes ambientales
Tabla 2. Ubicación geográfica de las fincas muestreadas y sus respectivos sistemas
productivos en la cuenca del río La Vieja. Ganadería semiextensiva para carne (GC),
Pág.
5
Ganadería semiextensiva para leche (GL) y Cultivos Mixtos (CM)
25
Amplificación del gen 16S rRNA en las muestras de sedimento
31
Tabla 3. Secuencias y número de pares de bases de los iniciadores utilizados para la
Tabla 4. Características morfométricas de los ríos de la Cuenca La Vieja
38
cada tramo de los ríos en estudio en la cuenca del río La Vieja
39
Tabla 5. Resumen de las variables físicas, químicas e hidrológicas registrados en
Tabla 6. Valor promedio del índice de calidad del agua NSFI (Brown et al., 1970)
en los ríos de los diferentes sistemas productivos estudiados en la cuenca del río La
Vieja
42
obtenidos durante el estudio
46
Tabla 7. Conteo de los microorganismos presentes en las muestras de sedimentos
Tabla 8. Valores de diversidad de Shannon (H`), dominancia de Simpson (1/D),
Equitatividad de Pielou (EH) y riqueza de especies (S) en los diferentes sistemas
productivos estudiados. Dominio. Bacteria
Equitatividad de Pielou (EH) y riqueza de especies (S) en algunas muestras para el
52
Domino Archaea, de los diferentes sistemas productivos estudiados
53
Bacteria
55
Archaea
56
significativos
59
variables ambientales. (r>0.5)
59
Tabla 10. Relaciones de parentesco de las bandas secuenciadas del DGGE. Dominio
Tabla 11. Relaciones de parentesco de las bandas secuenciadas del DGGE. Dominio
Tabla 12. Test de Monte Carlo. Correlación especies-ambiente. P<0,05
Tabla 13. Correlación de Pearson con los ejes de ordenación entre los OTUS y las
iv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Ubicación geográfica de la ecorregión eje cafetero y la cuenca del río
La Vieja
Figura 2. Representación esquemática del muestreo (EPA 2000)
Figura 3. Relación de las variables ambientales de los sistemas productivos con
los dos primeros ejes del análisis de componentes principales (ACP)
Figura 4. Ordenación de las variables ambientales mediante el análisis de
Pág.
24
26
44
componentes principales (ACP): a) Ordenación de los ríos respecto al sistema de
producción b) Ordenación de los ríos según la época de muestreo c) ordenación
de los ríos respecto al sistema de producción
Figura 5. Patrón de diversidad bacteriana de cada sistema productivo durante las
45
épocas de muestreo. SanB: finca Santa Bárbara; Son: Finca La Sonora; Des:
Finca El Descanso; Com: Finca La Comarca; TieL: Finca Tierra Labrantía; Porv:
Finca El Porvenir; Flo: Finca La Floresta; VillX: Finca Villa Ximena; TesB:
Finca Tesalia Baja. CM: sistema productivo cultivo mixto; GC: sistema
productivo Ganadería de carne; GL: sistema productivo Ganadería de leche
Figura 6. Agrupamiento de las muestras microbianas de los ríos en la cuenca del
47
río La Vieja en las 2 estaciones climáticas, usando el índice de Jaccard. SanB:
finca Santa Bárbara; Son: Finca La Sonora; Des: Finca El Descanso; Com: Finca
La Comarca; TieL: Finca Tierra Labrantía; Por: Finca El Porvenir; Flo: Finca La
Floresta; VillX: Finca Villa Ximena; Tes: Finca Tesalia Baja. CM: sistema
productivo cultivos mixtos; GC: sistema productivo Ganadería de carne; GL:
sistema productivo Ganadería de leche. 1: muestreo época sequía. 2: muestreo
época de lluvias
v
48
Figura 7. Perfil de bandas generadas en el DGGE de muestras amplificadas del
dominio Archaea sistema productivo durante las épocas de muestreo. SanB:
finca Santa Bárbara; Son: Finca La Sonora; Des: Finca El Descanso; Com: Finca
La Comarca; TieL: Finca Tierra Labrantía; Porv: Finca El Porvenir; Flo: Finca
La Floresta; VillX: Finca Villa Ximena; TesB: Finca Tesalia Baja. CM: sistema
productivo cultivos mixtos; GC: sistema productivo Ganadería de carne; GL:
sistema productivo Ganadería de leche
Figura 8. Agrupamiento de las muestras del dominio Archaea pertenecientes a
49
los ríos de la cuenca del río La Vieja en las 2 estaciones climáticas, usando el
índice de Jaccard. SanB: finca Santa Bárbara; Son: Finca La Sonora; Com: Finca
La Comarca; TieL: Finca Tierra Labrantía; Por: Finca El Porvenir; sistema
productivo cultivo mixto; GC: sistema productivo Ganadería de carne; GL:
sistema productivo Ganadería de leche. 1: muestreo época sequía. 2: muestreo
época de lluvias
Figura 9. (a) Agrupación de los OTUs de acuerdo al sistema de producción. (b)
Agrupación de los datos de acuerdo al periodo. (C) agrupación de las fincas de
50
acuerdo al sistema productivo
58
el ACC realizado a todas las muestras
60
Figura 10. Bioplot que describe la ordenación de los OTUs (banda) obtenida con
Figura 11. Ordenación obtenida con el ACC realizado para las comunidades
microbianas. (a) Ordenación de los OTUs según las variables para cada sistema
de producción. (b) Ordenación de los OTUs según las variables para cada
periodo. c) Ordenación de los ríos según las variables ambientales
vi
61
LISTA DE ANEXOS
Pág.
Anexo 1. Valores medios mensuales obtenidos de series históricas en la estación
Maracay, Departamento Quindío, Municipio Quimbaya perteneciente a la cuenca
del río La Vieja. Cenicafe
88
sistemas productivos en la cuenca del río La Vieja
89
análisis de Componentes principales (ACP)
90
Anexo 2. Encuesta a dueños y/o administradores de las fincas asociadas a los
Anexo 3. Correlación entre las variables ambientales y los ejes explicativos en el
vii
RESUMEN
En la cuenca del río La Vieja, perteneciente a la ecorregión cafetera de Colombia, se
buscó determinar la relación entre los sistemas productivos característicos de la
región: ganadería de carne, ganadería de leche y cultivos mixtos, sobre la calidad del
agua, estructura y composición de las comunidades microbianas. Se muestreó un total
de 9 ríos durante la época de sequía y lluvia respectivamente. Los resultados
obtenidos indican que los sistemas de producción de ganadería de carne y cultivos
mixtos tienen un mayor impacto sobre los ríos al presentar una baja concentración de
oxígeno, mayor concentración de nutrientes y sólidos en suspensión. Por el contrario,
el sistema productivo ganadería de leche presentó la mejor calidad del agua, debido a
las buenas técnicas de manejo como el mantenimiento de la cobertura vegetal y la
utilización de sistemas para el tratamiento del agua residual. La mayor similitud en la
composición microbiana se presentó en cultivos mixtos debida posiblemente a que
los ríos bajo esta influencia tienen condiciones ambientales favorables como
concentración de nutrientes que permiten el establecimiento de ciertas comunidades.
Las variables que se encontraron significativamente relacionadas con las
comunidades microbianas fueron nitrógeno total, sólidos totales, fósforo total y
temperatura. Los ríos bajo la influencia de los diferentes sistemas productivos se
caracterizaron por presentar principalmente comunidades microbianas pertenecientes
a la subclase B-Proteobacteria, representantes importantes en ecosistemas de aguas
dulces.
Palabras claves: Calidad del agua, estructura, composición de comunidades
microbianas, sistemas productivos, variables ambientales, B-Proteobacteria.
ABSTRACT
In the basins of rivers La Vieja belong to the ecorregion the coffee of Colombia, we
studied the relationship between the productive systems characteristic of the region:
Meat cattle raising, milk cattle raising, mixed cultivation, on water quality and
structure and composition of the microbial community. A total of 9 rivers were
sampled during the dry and rainy season. Results show that productive systems based
on meat cattle raising and mixed cultivation have the highest impact on water quality
on the rivers due to the lowest of oxygen concentrations, the high concentrations of
nutrients and suspended solids. By the contrary, productive systems milk cattle
raising most the quality of the water, because to the techniques of handling like the
maintenance of the plant cover and the utilization of waste water treatments. The
highest similarity in the microbial composition occurs in mixed cultivation probably
due to the rivers that are influenced by this type of productive system have favourable
environmental conditions like concentrations of nutrients that allow the establishment
of certain communities. The variables that were significantly related with the
microbial communities were total nitrogen, total solids, total phosphorus and
temperature. The rivers that are influenced by the different productive systems were
composed mainly of the subclass B-Proteobacteria important representatives in the
freshwater ecosystems.
Key words: Water quality, structure, composition of microbial community,
productive systems, environmental variables, B-Proteobacteria.
1. INTRODUCCION
La ecorregión cafetera se encuentra localizada en la región andina de Colombia, entre
la vertiente oriental de la cordillera occidental y el valle del río Magdalena
(CARDER, 2004). Está conformada por los Departamentos de Risaralda, Caldas y
Quindío, y por la región nor-oriental de los departamentos del Valle del Cauca y
Tolima (Chará, 2003). La región se caracteriza por presentar suelos fértiles y una
buena disponibilidad hídrica durante la mayor parte del año. Estas condiciones
favorecen la sostenibilidad de bienes y servicios ecológicos de la región (Ministerio
del Medio Ambiente, 2004).
Uno de los componentes claves de la biodiversidad en los paisajes rurales naturales y
transformados en la ecorregión cafetera, lo constituyen los ecosistemas acuáticos. Sin
embargo, esta zona es una de las regiones de Colombia con mayor presión sobre estos
ecosistemas, debido a la vulnerabilidad de sus cuencas, la alta densidad de población
(IDEAM, 2001), y la intensa transformación que han sufrido sus paisajes naturales
como consecuencia de los cambios en el uso del suelo y del impacto de los diferentes
sistemas productivos (CARDER, 2004). Estas modificaciones sumadas a la baja
capacidad para garantizar una oferta constante de agua, constituyen uno de los
problemas más grandes de la región.
La ecorregión, depende críticamente del mantenimiento de la calidad y la regulación
de la disponibilidad de agua. El desarrollo sostenible de los paisajes rurales de la
región implica un suministro suficiente de agua, e implica agua de la calidad
apropiada para los diferentes usos que tiene en la región (Rivera-Rondón et al.,
2007). Según el Plan de Ordenamiento Territorial de la Cuenca del Río La Vieja
(Amaya et al., 2005), la calidad del agua de la cuenca se ve afectada por el
vertimiento de desechos domésticos y del beneficio del café, por las conexiones de
1
alcantarillado a antiguos aljibes y por el poco mantenimiento de los pozos sépticos.
Así mismo, las diferentes actividades y el impacto de los sistemas productivos han
deteriorado la cuenca afectando la calidad del recurso hídrico, y en algunos casos, la
estructura y composición de los organismos acuáticos (Chará 2003, CARDER, 2004).
Reconociendo la dependencia que tiene la ecorregión cafetera por los bienes y
servicios provenientes de los ecosistemas acuáticos, es necesario evaluar los impactos
de los sistemas productivos en la calidad de sus aguas y en la diversidad de sus
comunidades bióticas, las cuales son importantes para el buen funcionamiento de
estos ecosistemas. Las comunidades microbianas constituyen un componente
imprescindible en los sistemas acuáticos, en los cuales contribuyen a muchos
servicios ambientales esenciales. Su presencia y relevancia se manifiesta en múltiples
formas, siendo su papel imprescindible en los ciclos biogeoquímicos de diversos
elementos (carbono, nitrógeno, azufre y hierro, entre otros), controlan los flujos de
nutrientes a través de la transformación y mineralización de la materia orgánica,
participan en procesos de degradación de sustancias alóctonas y eliminación de
contaminantes derivados de actividades humanas (Azam, 1998; Spring et al., 2000;
Araya et al., 2003). La diversidad de las especies microbianas que existen en un
determinado ecosistema es una consecuencia de la relación entre los organismos y su
ambiente, por esto, desde un punto de vista ecológico es importante conocer como
está organizada esa comunidad microbiana y que valor tiene para la estructura y
función del ecosistema.
Teniendo en cuenta lo anterior, la pregunta de investigación está dirigida a estudiar
cuál es el efecto de los sistemas productivos sobre la calidad del agua y sobre las
comunidades microbianas presentes en los ríos asociados a la cuenca del río la Vieja.
Para responder lo anterior, las hipótesis planteadas fueron: 1) Cada sistema
productivo causa un impacto particular sobra la calidad del agua, y 2) Las
comunidades de microorganismos pueden verse afectados por las actividades que se
realizan en estos ecosistemas. El presente trabajo estudia las variables ambientales
2
Fisicoquímicas, microbiológicas e hidrológicas, el uso y el manejo del recurso hídrico
y la composición, la estructura y la distribución de las comunidades microbianas en
ríos de bajo orden bajo la influencia de sistemas productivos agrícolas ganaderos y
forestales en la Ecorregión Cafetera en dos épocas climáticas.
Este estudio hace parte del proyecto: “Efecto de los sistemas productivos sobre la
calidad, disponibilidad del agua y funcionalidad de los ecosistemas acuáticos de la
Ecorregión Eje Cafetero”, propuesto por el Grupo Aguas dentro del marco del
proyecto general “Valoración de bienes y servicios de biodiversidad para el desarrollo
sostenible de paisajes rurales colombianos complejo Ecorregion Andes del Norte
(CEAN)” del Centro de Investigación en estudios en Biodiversidad y Recursos
Genéticos CIEBREG.
3
2. MARCO CONCEPTUAL
2.1 BIENES Y SERVICIOS AMBIENTALES
Los recursos naturales de un país son un elemento clave para su desarrollo,
especialmente dentro del contexto de manejo y aprovechamiento sostenible de dichos
recursos, que permiten alcanzar el desarrollo económico y social, además, una mejor
calidad de vida de las presentes y futuras generaciones. Los recursos naturales
fundamentales constituyen los bienes ambientales y corresponden a los recursos que
proveen los ecosistemas para beneficio de los seres vivos. De estos bienes
ambientales, se derivan los servicios ambientales que se definen como el conjunto de
condiciones y procesos naturales que ofrecen los ecosistemas por su simple existencia
y que la sociedad puede utilizar para su beneficio, reconociendo a su vez que la
obtención de dichos beneficios implica costos ambientales (Barzev, 2002). Los
recursos naturales son importantes, no sólo para la obtención de alimento (agua para
consumo, agricultura, ganadería, pesca), transporte, refugio de diferentes especies,
industria, sino también por los servicios ambientales, procesos y funciones que
permiten el mantenimiento de la biosfera: Ciclado de nutrientes, ciclos
biogeoquímicos, regulación del clima y la eliminación de contaminantes, entre otros.
Para facilitar el análisis, los bienes y servicios ambientales de un ecosistema
específico pueden ser separados así: los servicios ambientales son las funciones
ecosistémicas y los bienes ambientales son las materias primas que utiliza el hombre
en sus actividades económicas.
La siguiente tabla presenta de manera resumida, algunos de los servicios ambientales
proporcionados por diversos bienes ambientales (Barzev, 2002).
4
Tabla 1. Servicios ambientales proporcionados por diversos bienes ambientales
Servicios Ambientales
Regulación de Gases
Regulación del clima
Funciones
Regulación de composición
Química atmosférica
Regul. de temperatura
global; precipitación y otros
procesos climáticos
Regulación hídrica
Regulación de los flujos
hidrológicos
Oferta de agua
Almacenamiento y retención
de agua
Retención de sedimentos
y control de erosión
Detención del suelo dentro
del ecosistema
Formación suelos
Proceso de formación de
Suelos
Reciclado de nutrientes
Almacenamiento, reciclado
interno, procesamiento de
nutrientes
Tratamiento de residuos
Movimiento de gametos
florales
Refugio de especie
Hábitat para población
residentes y migratorias
Producción de Alimento
Producción primaria
Cultural
Balance CO/O2
Regulación de gases de
efectos invernaderos
Provisión de agua (riego,
agroindustria, transporte
acuático
Provisión de agua
mediante cuencas
reservorios y acuíferos
Prevención de la pérdida
de suelo por viento, etc.,
almacenamiento de agua
lagos y humedales
Meteorización de rocas y
acumulación de materia
orgánica
Fijación de nitrógeno,
fósforo, potasio, etc.
Remoción y descomposición Tratamiento de residuos,
de exceso de nutrientes y
control de contaminación y
compuestos
desintoxificacion
Polinización
Recreación
Ejemplos
Proveer oportunidades para
actividades recreacionales
Proveer oportunidades para
usos no comerciales
5
Provisión de polinizadores
para reproducción de
poblaciones de plantas
Semilleros, hábitat de
especies migratorias,
locales
Agricultura, cultivos,
frutas etc.
Ecoturismo etc
Estética, artística,
educacional, espiritual etc.
Sin embargo, a pesar del incalculable valor que generan los bienes y servicios
ambientales, la actividad humana compromete seriamente la conservación de los
recursos biológicos, provocando la degradación del ambiente y acarreando
consecuencias como la alteración de los ecosistemas y el medio ambiente en general
(Iza & Rovere, 2006).
2.1.2 Bienes y servicios ambientales derivados de los ecosistemas acuáticos. Entre
los ecosistemas más afectados por la actividad humana se encuentran los cuerpos de
agua dulce (ríos, arroyos, lagos, lagunas) y cuencas hidrográficas; paradójicamente
sistemas imprescindibles para el mantenimiento de la vida. Estos ecosistemas son
generadores de servicios ambientales que incluyen los asociados a los usos directos
del agua (agricultura, industria, consumo humano, acuicultura, etc.), eliminación de
contaminantes, generación de hidroelectricidad, regulación de flujos y control de
inundaciones, transporte de sedimentos, mantenimiento de la capacidad productiva
del suelo, control de erosión hídrica. Los asociados a los ciclos biogeoquímicos tales
como almacenaje y reciclaje de nutrientes y materia orgánica, almacenamiento y
fijación del carbono, liberación de oxígeno, y los asociados a la protección biológica,
protección de ecosistemas, creación y mantenimiento de hábitat y de la vida silvestre,
y los asociados a la belleza escénica natural o intervenida para fines recreativos y
turísticos.
La mayoría de los servicios ambientales esenciales (ciclos biogeoquímicos, ciclado de
nutrientes, eliminación de contaminantes), derivados de los ecosistemas acuáticos
dependen de procesos claves que son llevados a cabo por los microorganismos.
Dentro de estos procesos cabe destacar la eliminación de contaminantes por procesos
de autodepuración. El concepto de autodepuración ayuda a entender cómo se
autorregula un medio acuático frente a un caso de contaminación. Se define como un
proceso biológico normal de estabilización progresiva de compuestos complejos y
bioquímicamente inestables que se da en los medios acuáticos y en el que interviene
un número elevado de microorganismos que se encargan de la degradación de
6
contaminantes. En este proceso, las bacterias heterotróficas, desempeñan un
importante papel en la degradación de la materia orgánica, restableciendo el sistema y
permitiendo que aparezcan los organismos autotróficos (Kirchman et al., 2004).
La descomposición de la materia orgánica (MO) es uno de los procesos claves en el
funcionamiento de los ecosistemas acuáticos, donde los procariotas juegan un papel
importante en el reciclado de la materia orgánica e inorgánica. (Azam, 1998;
Sekiguchi et al., 2002; Winter et al., 2006). Los estudios en ecología microbiana en
las últimas décadas han llevado a la idea del llamado “loop microbiano”, que
presupone que una gran cantidad de la producción primaria no es consumida
directamente por herbívoros sino que es aprovechada por los microorganismos
heterotróficos convirtiéndose en biomasa microbiana (Lowell & Konopka, 1985). De
esta forma, los microorganismos propician la reintroducción de compuestos
inorgánicos en el sistema y producen biomasa microbiana susceptible de servir como
alimento a otros organismos. Con esta nueva concepción, el proceso de
descomposición deja de tener un carácter terminal para adquirir uno central en el
control y la dinámica de nutrientes del sistema, y actuando de vía de redistribución de
la energía. Todo esto hace que tenga también importantes efectos en la estabilidad de
los ecosistemas. A su vez, las comunidades bacterianas participan en los ciclos
biogeoquímicos de la mayoría de los elementos. De esta forma, las tasas de reciclado
de nutrientes (C, N, P) son controladas a una escala global por los microorganismos
(Alvarez, 2005).
2.2 SISTEMAS PRODUCTIVOS
Los sistemas productivos corresponden a todas las formas antrópicas de intervenir en
la naturaleza de forma pasiva o activa y que generan algún tipo de impacto o
alteración dependiendo del tipo, intensidad y duración de la actividad humana
(manejo de agroecosistemas o aplicación de tecnologías de mayor o menor
complejidad) (Murgueitio, 2003). El uso del suelo para actividades como la
7
agricultura y pastoreo ha generado alteraciones en los ecosistemas, donde los
principales efectos se relacionan con el uso de fertilizantes en la agricultura, aumento
de plagas, compactación del suelo y erosión, desecación y contaminación de
diferentes cuerpos de aguas (CIEBREG, 2004). Estos procesos de trasformación y
degradación de los paisajes naturales se ven reflejados en sus componentes bióticos y
abióticos en su estructura y en el funcionamiento de los flujos de energía (Etter,
1994), Así mismo, estas actividades generan impactos negativos sobre los
ecosistemas que resultan en la pérdida de biodiversidad y de los servicios ambientales
que proporcionan a la sociedad.
El sistema productivo ganadería, genera impactos ambientales negativos como la
erosión y compactación del suelo, además de esto, genera uniformidad genética del
territorio al privilegiarse el monocultivo de gramíneas mediante quemas estacionales
y eliminación de la sucesión vegetal por la utilización de herbicidas o medios físicos;
así mismo, causa la desecación de humedales, construcción de vías de penetración,
contaminación del agua y el suelo por fertilizantes sintéticos y plaguicidas
(Murgueitio, 2003). Por otro lado, la falta de cobertura vegetal nativa y el libre acceso
de los animales a los cursos de agua corriente, generan mayores sedimentos (sólidos
disueltos en el agua), y el aporte de excretas incrementa los coliformes fecales,
afectando la calidad del recurso hídrico (Chará, 2003).
2.2.1 Sistemas productivos en la ecorregión cafetera.
Sistema productivo
Ganadería: en la región cafetera afectada por la crisis de la broca del café
(Hypothenemus hampei) y los bajos precios internacionales, varios miles de hectáreas
de suelos fértiles, se transformaron en pastizales intensivos con sistemas ganaderos
basados en altas cargas animales (10 a 15 animales/ha) y elevada fertilización
química. Estas actividades causaron serios deterioros en el medio ambiente, como
contaminación de los recursos hídricos, daño en la estabilidad de los agregados del
suelo y pérdida de la diversidad biológica (Sadeghian et al., 1998). Los sistemas
ganaderos de pastoreo están ampliamente dominados por la especie bovina, seguida
8
por la ovina y equina. La Ganadería de leche se encuentra ubicada en altiplanos en
altitudes entre 2000 y 3000 m; mientras la ganadería de doble propósito (carne y
leche) en climas medios entre 1000 y 200 m. Y la ganadería para producción de carne
se presenta en zonas bajas entre los 500 y 100 m (Chará, 2003).
La ganadería de pastoreo sin árboles causa un impacto negativo de mayor magnitud
que la caficultura, principalmente por sedimentación de los cauces y aportes de
materia orgánica, nutrientes y patógenos que deterioran las corrientes de agua
(Murgueitio, 2003), genera mayor impacto en los ecosistemas naturales, debido a su
alta capacidad de expansión y transformación del paisaje (CIEBREG, 2004).
Sistema productivo Agricultura: El sistema productivo agricultura, ha generado de
igual forma efectos negativos sobre los ecosistemas en la ecorregión cafetera. La
producción agrícola se encuentra representada básicamente por los cultivos de café
(tradicional y tecnificado), plátano (solo o en asocio), cítricos, yuca y caña de azúcar
(Amaya et al., 2005). La mecanización del suelo y el uso excesivo de agroquímicos
han causado efectos perjudiciales a los ecosistemas tales como proliferación de
plagas, homogenización del paisaje, erosión del suelo, contaminación edáfica y
acuática por vertimientos puntales y escorrentía superficial, lo cual ha producido
cambios en la calidad y cantidad del recurso hídrico (CIEBREG, 2004; Chará, 2003).
2.3 ECOSISTEMAS ACUÁTICOS LÒTICOS
Los hábitats de las corrientes de agua o lóticos, incluyen todas las partes del curso de
los ríos: los arroyos y manantiales de su cabecera, la zona central del valle, con sus
pozetas o zonas de deposición y sus rápidos, la zona de la llanura aluvial, y los
estuarios en los que vierten sus aguas al mar. Estos sistemas llevan a cabo múltiples
funciones que dependen del clima, área de la cuenca, estructura del hábitat y
diversidad (Ward, 1998; Tockner et al., 2002). Se caracterizan por su flujo
9
unidireccional, forma lineal, morfología del canal, una alta heterogeneidad espacial y
temporal.
Los ríos llevan muchas sustancias disueltas en solución. Estos constituyentes
disueltos incluyen materiales orgánicos e inorgánicos y gases. La materia orgánica y
la energía son producidas dentro del río (al menos o totalmente por procesos
fotosintéticos), o es importada de la zona terrestre o de la interfase agua-tierra y es
usada por los consumidores o almacenada en el ecosistema (Wetzel, 2001). La
materia orgánica, es, en gran parte materia orgánica particulada (MOP) y materia
orgánica disuelta (MOD). Sin embargo dependiendo de la vegetación riparia, tamaño
de la corriente, y la descarga, la producción microbiana autóctona puede también
contribuir con una porción significativa de materia orgánica (Vannote et al., 1980;
Finlay, 2001). La afluencia y presencia de estas diferentes fuentes varían a lo largo
del transporte longitudinal y también con la estación, debido principalmente a las
variaciones espacio temporales en las características químicas. Por tanto los ríos no
solo transportan materia orgánica e inorgánica, sino que participan en la
transformación de estos compuestos, a través de procesos físicos y biológicos.
Las características de los sistemas fluviales, están estrechamente relacionadas con el
tipo de vegetación o de paisaje (Allan, 1995), y su composición química es controlada
directa o indirectamente por diversos factores como la litología y el relieve de la
cuenca de drenaje, las condiciones climáticas, los procesos biológicos y la actividad
antrópica. En este sentido, las vertientes, arroyos y ríos de montaña en contacto con
suelos muy poco desarrollados, están influenciados por las características químicas de
las precipitaciones que los alimentan a diferencia de lo que ocurre en otras cuencas,
con mayor extensión y espesor de suelos (Pasquini et al., 2002).
El estado trófico de un sistema acuático depende del equilibrio de sus características
intrínsecas (morfología del río, geología, tipo de suelo, ciclo de nutrientes, materia
orgánica y sedimentos), que recibe de sus áreas circundantes. Este equilibrio puede
10
verse afectado por el estado de conservación de la vegetación y del suelo de la
cuenca, que son las características extrínsecas mas importantes que pueden provocar
el desequilibrio de los cuerpos de agua dulce.
Un factor de importancia en la dinámica de estos sistemas, lo constituye el
componente ripario, el cual puede influir en el régimen microclimático y en la
estructura trofica de los ríos. Así mismo, puede influir en la penetración de luz y en
las fluctuaciones de temperatura del agua, en la morfología del canal, en la diversidad
de hábitats de los ríos y constituye una fuente de energía alóctona para el ecosistema
(Murgueitio, 2003; Chará, 2003). La eliminación de la vegetación riparia altera el
régimen de flujo y los intercambios de materia y energía con la cuenca de drenaje. En
zonas agrícolas y ganaderas, la eliminación de la vegetación riparia aumenta la
entrada de nutrientes y contaminantes al curso de agua.
2.3.1 Factores ambientales que influyen en los ecosistemas lòticos.
Existen
diversos factores que determinan las condiciones ecológicas de los ecosistemas dulce
acuícolas:
Temperatura: Las propiedades lumínicas y calóricas de un cuerpo de agua están
influidas por el clima y la topografía tanto como por las características del propio
cuerpo de agua: su composición química, sedimentos en suspensión y su
productividad algal. La temperatura del agua regula en forma directa la concentración
de oxígeno, la tasa metabólica de los organismos acuáticos y los procesos vitales
asociados como tasa de crecimiento, reproducción y productividad de las especies
(Margalef, 1983). En lagos, la absorción de energía solar y su disipación como calor
son procesos críticos en el desarrollo de gradientes de temperatura entre la superficie
y las capas más profundas de agua, así como en los patrones de circulación del agua
(Baron et al., 2003). En los ríos, la estratificación vertical de temperatura no se da, no
existen gradientes debido a la acción de mezcla del agua de la corriente. Solamente
los ríos profundos de movimiento lento muestran o exhiben diferencias apreciables de
11
temperatura entre la superficie y el agua de la parte inferior dentro del canal principal.
En estos sistemas usualmente la temperatura varía estacionalmente y a escalas de
tiempo diarias, y entre localizaciones, debido al clima, pero puede ser bastante
constante bajo ciertas circunstancias.
La corriente: Constituye un factor de importancia que caracteriza a los sistemas
lóticos, determinando la distribución ecológica y las adaptaciones de los organismos
del sistema. La velocidad del agua y las fuerzas físicas, colectivamente representan
tal vez, los factores ambientales más importantes que afectan los organismos en estos
sistemas acuáticos.
La velocidad de la corriente influye en el tamaño de las partículas del sustrato, afecta
las fuentes alimenticias a través de la entrega y remoción de nutrientes y alimento
(Allan, 1995). La velocidad se ve afectada por la forma, la pendiente, la anchura, la
profundidad y la rugosidad del lecho, además de la intensidad de las precipitaciones.
La corriente permite el transporte de recursos, alimento y remoción de residuos
(Wetzel, 2001). A medida que la pendiente decrece, y la anchura, la profundidad y el
caudal aumentan, el limo y la materia orgánica en descomposición se acumulan en el
fondo. El carácter del sistema cambia notablemente de las aguas rápidas a las lentas,
con un cambio en las especies que van asociadas.
El oxígeno: Constituye una variable de importancia en los ecosistemas acuáticos. Su
presencia y concentración definen el tipo de especies presentes, de acuerdo con sus
tolerancias y rangos de adaptación, que permiten establecer toda la estructura y
funcionamiento biótico de estos sistemas.
El oxigeno disuelto en aguas no contaminadas esta usualmente cerca de la saturación,
y bajo estas circunstancias su concentración es de poca significancia biológica (Allan,
1995). En los ecosistemas lóticos, esta variable no se considera un factor limitante,
12
debido a que el agua al estar en continuo movimiento, favorece la difusión de
oxígeno y el intercambio de gases entre la atmósfera y el agua (Margalef, 1983).
Sustrato: Una gran variedad de compuestos orgánicos e inorgánicos de diversos
orígenes se encuentran en el sustrato de aguas de corrientes. La composición y
distribución de estos materiales dentro del canal son determinadas por el lavado de
rocas, factores climáticos, y vegetación riparía interactuando con la geomorfología
del canal y variables hidráulicas. Especialmente en ríos pequeños y arroyos, el aporte
de materia orgánica desde la superficie terrestre es una fuente particularmente
importante de energía y nutrientes, y los troncos de árboles y otros materiales leñosos
que caen al agua proporcionan sustratos y hábitats importantes para los organismos
acuáticos, además de proporcionar alimento y protección contra depredadores.
El componente orgánico del sustrato está compuesto primariamente de desechos de
plantas, derivados de plantas acuáticas, o aportes de detritus de plantas terrestres. La
materia orgánica particulada gruesa (MOPG) incluye partículas, como desechos de
hojas y restos de maderas caídas de la vegetación de ribera dentro del canal. Estos
desechos, tienen un importante papel en la estructuración de los patrones de drenaje y
en la determinación de la morfología del canal. La materia orgánica particulada fina
(MOPF), son partículas producidas por floculación y liberación microbiana de
materia orgánica disuelta y por partículas pequeñas de MOPG, que resultan de la
fragmentación física del detritus grueso y las actividades alimenticias de los
detritívoros. La materia orgánica disuelta (MOD) es ubicua en aguas dulces y es
mucho más abundante que MOPG o MOPF (Allan, 1995).
13
2.4 COMUNIDADES MICROBIANAS EN ECOSISTEMAS ACUÁTICOS
Los ecosistemas acuáticos albergan diversos organismos importantes que aportan
servicios ambientales imprescindibles para su mantenimiento y equilibrio. En estos
ecosistemas las comunidades microbianas realizan diferentes procesos ecológicos;
constituyen una pieza funcional básica a través del cual circula una importante
fracción del flujo de energía, exhiben una gran variedad de capacidades metabólicas,
desempeñan un importante papel en la transformación de compuestos orgánicos
complejos y minerales (Tamaki et al., 2004), son necesarios en la transformación
biótica del carbón y de los nutrientes (Winter et al., 2006); son capaces de utilizar la
materia orgánica disuelta (MOD) que deriva de los organismos autótrofos y de la
actividad metabólica de otros organismos heterótrofos y presentan un aporte esencial
en los ciclos biogeoquímicos (Azam, 1998; Sekiguchi et al., 2002). Estas
comunidades, también son responsables de los procesos claves que regulan la función
y productividad de los ecosistemas a través del “microbial loop” (Lindstrom, 2001),
que corresponde a la producción de materia orgánica disuelta (MOD) en las redes
alimenticias acuáticas durante el flujo de materia orgánica particulada hacia
organismos superiores y la reincorporación de esta MOD por las bacterias
heterotróficas (Pernthaler, 2005). El “loop microbial” es regulado por nutrientes y por
la acción depredadora de metazoos, de protozoos, microcrustáceos, que resulta en el
equilibrio dinámico del sistema.
Las bacterias constituyen un grupo heterogéneo y ampliamente distribuido en los
ecosistemas acuáticos. La mayoría se encuentran como células planctónicas libres
constituyendo el bacterioplancton, creciendo en superficies sólidas formando
biopelículas o depositadas en el sedimento (Brümmer et al., 2003). En el
bacterioplanton las comunidades microbianas tienen un importante papel en el flujo
de energía y nutrientes a través de la redes alimenticias del planton, esto es una
consecuencia de su alta abundancia, eficiente toma de nutrientes y un gran
crecimiento potencial (Simek et al., 2006). Las bacterias son una importante parte de
la microflora en el sedimento, por su abundancia, diversidad y la multiplicidad de sus
14
actividades metabólicas (Miskin et al., 1998). El sedimento como hábitat favorece la
acumulación de nutrientes, materia orgánica y altas concentraciones de constituyentes
químicos que proporcionan un ambiente más heterogéneo y estable a los
microorganismos. Allí, las comunidades microbianas participan en procesos de
degradación y transformación de la materia orgánica disuelta y en los ciclos
biogeoquímicos de los principales elementos (carbón, nitrógeno, fósforo, etc), y están
por tanto implicadas en el intercambio de energía y nutrientes (Jurgens et al., 2000;
Tamaki et al., 2004; Schwarz et al., 2006).
La materia orgánica, en el sedimento llega en forma de partículas y está compuesta
principalmente por macromoléculas tales como proteínas, carbohidratos, lípidos y
ácidos nucleicos (Gomes & Mendoça, 2004). La degradación microbiana y
transformación de partículas y materia orgánica disuelta en este hábitat, son procesos
claves con respecto al ciclaje del carbono. Wobus et al. (2003), sugieren que existe
una fuerte conexión entre la deposición de materia orgánica y la actividad bacteriana
en sedimentos de sistemas marinos y de aguas dulces.
Recientes investigaciones han reportado que las comunidades microbianas en aguas
dulces están siendo dominadas por bacterias que están filogenéticamente afiliadas con
la subclase α y β Proteobacteria y miembros de Cytophaga-Flavobacterium
(Pernthaler et al., 1998; Araya et al., 2003; Brummer et al., 2000; Fazi et al., 2005).
Sekiguchi et al. (2002), reportaron que las subclases α, β proteobacteria y Cytophaga
-Flavobacterium, representaron la mayor proporción de la comunidad microbiana.
Así mismo, dominancia del mismo grupo bacteriano ha sido encontrado en estudios
de comunidades bacterianas en lagos (Van der Gucht et al., 2005).
Generalmente, β-Proteobacteria ha sido descrito como el grupo más abundante en
sistemas de aguas dulces. Este grupo de bacterias pueden adherirse más fácilmente a
las superficies durante el desarrollo inicial de una biopelícula que miembros de otros
grupos (Araya et al., 2003). Brummer et al. (2003), sugirieron, que la dominancia de
15
β-Proteobacteria en el río Spittelwasser (Alemania), puede ser explicado por su
toleracia a altas concentraciones de contaminantes y metales presentes. Así mismo,
Brummer et al. (2000), atribuyeron la presencia de una gran fracción de βProteobacteria, por su habilidad de oxidar amonio y participar en la degradación de
contaminantes.
La incidencia de miembros del grupo de Cytophaga-Flavobacterium en sistemas
acuáticos ha sido asociada a compuestos de carbón de alto peso molecular (Crump et
al., 1999). Cottrell & Kirchman (2000), demostraron que la abundancia de Citofaga-
Flavobacterium, estaba asociada con quitina y concentraciones de proteínas en
sistemas marinos.
2.4.1 Factores que determinan la distribución de comunidades bacterianas en los
ecosistemas acuáticos. Las comunidades microbianas en los ecosistemas lóticos
pueden presentar profundos cambios estaciónales y cambios longitudinales que
influyen en la ecología de poblaciones específicas y que pueden producir impactos en
la abundancia, estructura, composición y función de estas comunidades (Liu & Leff,
2002). Estos cambios pueden estar influenciados por numerosos mecanismos o
factores bióticos y abióticos entre los cuales se encuentran: condiciones físicas
(radiación y temperatura), disponibilidad de recursos nutritivos (control bottom-up) y
mecanismos bióticos como la depredación o la infección viral (control top down)
(Manz et al., 1999; Araya et al., 2003; Hullar et al., 2005).
Los ríos y los lagos dentro de una región geográfica comparten ciertas características
climáticas, como temperatura y precipitaciones, que de forma directa o indirecta
influyen en la actividad y la diversidad del bacterioplancton y otros organismos
acuáticos (Crump, 2005).
Entre las condiciones físicas, numerosos estudios han demostrado que la temperatura
controla la abundancia, producción y tasas de crecimiento del bacterioplancton (Shiah
16
& Ducklow, 1994; Simon & Wünsch, 1998; Hullar et al., 2005). Así mismo,
investigaciones recientes muestran una fuerte relación de la temperatura con la
abundancia de ciertos grupos bacterianos (Rubin & Leff, 2007). Sin embargo otros
estudios relacionan la composición bacteriana con otras variables tales como
turbiedad, velocidad del agua, fuente de materia orgánica, tipo de vegetación riparia,
impacto antropogénico y precipitación (Leff et al., 1999; Liu & Leff, 2002; Crump, et
al., 2005; Olapade et al., 2005).
Existen otros factores intrínsecos tales como la concentración de nutrientes y
producción fitoplanctonica que parecen determinar la composición de comunidades
microbianas en ecosistemas acuáticos (Winter et al., 2006). En ecosistemas marinos
y de aguas dulces por ejemplo, se ha encontrado que la abundancia y producción del
bacterioplancton esta positivamente correlacionada con la producción de biomasa del
fitoplancton. Esta relación de acoplamiento se presume que se produce porque las
bacterias heterótrofas obtienen su energía a partir del metabolismo de fuentes
externas de carbono orgánico disuelto liberado por parte del fitoplancton (Fuhrman et
al., 1980; Azam et al., 1983; Brett et al., 1999). Winter, et al., 2006, reportaron que
altos niveles de actividad fotosintética estimularon el crecimiento de algunos
miembros de la comunidad bacteriana en el río Danubio, que fueron capaces de
utilizar el aumento repentino del carbono de manera más eficiente. El fitoplancton
libera hasta un 25% del carbón orgánico total fijado por la fotosíntesis. La materia
orgánica disuelta es entonces rápidamente consumida y remineralizada por la
comunidad bacterial. Por lo tanto, los cambios en la composición de comunidades
fitoplanctonicas pueden influir en la composición de las comunidades bacterianas que
funcionan como parte del “loop microbial”. Sin embargo, diferentes investigaciones
han evidenciado un acoplamiento débil o inexistente entre el crecimiento bacterial y
el crecimiento del fitoplancton, en donde no se encontraron relaciones positivas entre
las dos comunidades (Canosa & Pinilla, 2001). No obstante, es también posible que el
bacterioplancton y el fitoplancton, estén directamente estimulados por la adición de
nutrientes, nitrógeno inorgánico y fosforo (Toolan et al., 1991; Morris & Lewis,
17
1992; Vrede et al., 1999). Así mismo, otros estudios encontraron que el crecimiento
de bacterias heterotróficas es a menudo limitado por nutrientes inorgánicos
(especialmente fósforo) en muchos ecosistemas (Brett et al., 1999; Simek et al.,
2006). De igual forma, en biopelículas acuáticas, se ha encontrado que la abundancia
de ciertos grupos bacterianos varía en respuesta a alteraciones en nutrientes orgánicos
e inorgánicos y a la materia orgánica disuelta (MOD), (Rubin & Leff, 2007).
Algunos experimentos en mesocosmos han demostrado que las comunidades
bacterianas son altamente dinámicas y pueden diferir marcadamente en su respuesta a
la disponibilidad del recursos (carbón orgánico y nutrientes inorgánicos tales como el
nitrógeno y el fósforo), y a la estructura de las redes alimenticias (Kent et al., 2004).
Otros aspectos o funciones de las comunidades microbianas tales como respiración,
biomasa y actividad enzimática extracelular pueden ser limitados por nutrientes
inorgánicos y materia orgánica en las corrientes. Los cambios en la riqueza y
abundancia de las comunidades, pueden resultar en la pérdida de ciertos grupos
responsables para los procesos específicos y por consiguiente el ecosistema puede
experimentar cambios en la utilización del recurso que pueden afectar las
comunidades de los niveles tróficos más altos (Kent et al., 2004).
Otros factores que pueden estar modificando las comunidades bacterianas en los
ecosistemas acuáticos, corresponden a las interacciones con otras comunidades
bióticas. En estos sistemas, las redes alimenticias tienen muchas interacciones con las
comunidades del bacteriplancton. Estas interacciones pueden incluir ataque por
protozoos, metazoa y poblaciones de flagelados que proveen un control “top-down de
la abundancia de las comunidades del bacterioplanton (Simek et al., 1999).
Algunos estudios han revelado el ataque por protistos, como el factor dominante que
controla la mortalidad bacteriana y puede ser un mecanismo que influye en la
dinámica y estructura de la composición de comunidades microbianas. Protistos,
especialmente
nanoflagelados
han
sido
18
reportados,
como
los
principales
consumidores de bacterias en muchos ecosistemas acuáticos (Van der Gucht et al.,
2005). Sin embargo, las comunidades microbianas, han desarrollan morfotipos
resistentes a las altas presiones de los protistos (Hahn & Hofle, 2001). Ciertas
características bacterianas, como motilidad y la forma, pueden influenciar la
selectividad del ataque protista. Los cambios en la morfología celular han sido
sugeridos como un mecanismo de las poblaciones del bacterioplanton contra grandes
fluctuaciones en la abundancia (Hahn & Hofle, 2001; Kent, 2004). Por tanto, la
depredación es un mecanismo que estructura la organización de redes alimenticias
acuáticas, y determina la composición de especies de los diferentes niveles tróficos.
2.4.2 Herramientas para el estudio de estructura de comunidades bacterianas.
El conocimiento actual de la estructura y de la dinámica de comunidades microbianas
naturales ha sido limitado, y la mayoría de los estudios se han basado en los métodos
dependientes de cultivo (Pernthaler & Amann, 2005), aunque hoy sabemos que las
bacterias cultivables son sólo una pequeña parte de las bacterias que existen en la
naturaleza. Varios acercamientos han sido usados para identificar microorganismos
en ambientes naturales sin los requerimientos de métodos de cultivo.
En la actualidad, es el uso de técnicas moleculares han permitido el estudio de la
biodiversidad microbiana. Estas técnicas se basan, en general, en el análisis de las
secuencias que codifican la subunidad pequeña de los ribosomas 16S RNA,
moléculas con regiones altamente conservadas, es decir, que pueden ser encontradas
en todos los organismos vivos; y regiones más variables, que se encontrarían sólo en
organismos relacionados filogenéticamente (Moyer, 2001). Así es como, aplicado a
muestras ambientales, el estudio de genes que codifican el rRNA permite tener una
aproximación a la biodiversidad.
Las técnicas de “fingerprinting” son consideradas como herramientas adecuadas para
un rápido y comparativo análisis de comunidades naturales desconocidas (Ranjard et
al., 2000), permitiendo obtener una visión general de la estructura genética de la
19
comunidad. La estrategia general de estas técnicas de comunidades microbianas,
consiste primero, en la extracción de los ácidos nucleicos, seguido de la amplificación
de genes que codifican el 16S ARNr y el análisis de los productos obtenidos en la
PCR por las técnicas. Estas técnicas son usadas para distinguir entre especies
utilizando solo muestras de su ADN basados en la separación electroforètica que
generan un patrón o perfil de bandas de la diversidad genética en una comunidad
microbiana (Muyzer & Smalla, 1998).
La electroforesis en gel de gradiente denaturante por sus siglas en inglés Denaturing
gradient gel eletroforesis (DGGE), es usada para separar fragmentos de ADN de la
misma longitud pero con diferente secuencia nucleotidíca. La separación es basada en
el decrecimiento de la movilidad electroforética del fragmento de ADN a través del
incremento de un gradiente lineal denaturante (una mezcla de urea y formamida). El
fragmento permanece de doble hebra hasta que alcanza la concentración de
denaturante equivalente a la temperatura correspondiente. Los patrones de bandas
generados en el gel son considerados como una imagen de toda la comunidad
bacteriana y cada banda constituye un tipo de secuencia única, que representa un
OTUs (Unidad taxonomica operacional), o filotipo (Fromin et al., 2002; Hughes &
Bohannan, 2004). Los perfiles se caracterizan por el numero, posición (ausencia o
presencia de bandas particulares) e intensidad relativa de la banda y pueden ser
utilizados en métodos estadísticos para determinar dominancia, frecuencia de
aparición, entre otros indicadores de diversidad bacteriana en estudios de dinámica
poblacional y relacionarlos con varios parámetros biológicos y fisicoquímicos
(Brummer et al., 2003).
La técnica DGGE fue originalmente desarrollada para detectar mutaciones puntuales
en las secuencias del ADN (Muyzer, et al., 1993). Actualmente es utilizada en
estudios de ecología microbiana, permitiendo el análisis simultáneo de múltiples
muestras y la comparación de comunidades basadas en diferencias temporales y
geográficas (Sekiguchi, 2001). Permite el estudio de la estructura de comunidades
20
microbianas y medidas de la diversidad de filotipos y monitorea cambios en la
comunidad. Uno de los puntos mas fuertes de la aplicación del DGGE en ecología
microbiana es la de realizar simultáneos análisis de múltiples muestras, que permiten
monitorear la dinámica compleja de las comunidades microbianas, frente a
fluctuaciones estacionales o perturbaciones ambientales. Esta técnica, se caracteriza
por ser confiable, reproducible, rápida y económica. Además, se puede combinar con
otros métodos diferentes como amplificación de grupos específicos y corte de bandas
para análisis de secuenciación. Sin embargo, hay que enfatizar que al igual que
cualquier otro método, la técnica no es libre de presentar errores y sesgos,
especialmente cuando se aplica a muestras ambientales.
La técnica de DGGE ha sido adaptada como una herramienta para determinar la
diversidad microbiana en muestras ambientales. Los estudios de diversidad se
realizan utilizando diferentes índices de diversidad (Shauer et al., 2000; Fromin et al.,
2002), los cuales pueden ser calculados para describir posibles diferencias entre la
estructura de las respectivas comunidades microbianas. Las medidas de diversidad
tiene en cuenta tanto el numero de especies presentes en una muestra (riqueza) como
su abundancia relativa. Entre estos índices se encuentran:
Riqueza de especies (S): Se define como el número de diferentes organismos
presentes en una muestra (número de bandas presentes en el DGGE). No toma en
cuenta la proporción y distribución de cada especie en la comunidad. Se calcula con
la siguiente ecuación:
S= # de bandas detectadas.
Indice de Shannon–Weaver (H´): Se calcula con base en las bandas de los perfiles
obtenidos del DGGE, toma en consideración el número y la intensidad relativa de las
bandas en una línea individual. Se calcula con la siguiente ecuación:
H`= - Σ Pi. Ln Pi,
21
Donde:
Pi es la intensidad relativa de las bandas en un perfil.
Índice de Equidad de Pielou: mide la proporción de la diversidad observada en
relación con la máxima diversidad esperada. Su valor va de 0 a 1, de forma que 1
corresponde a situaciones donde todas las especies son igualmente abundantes
(Magurran, 1989). Se calcula con la siguiente ecuación:
J´=∑ pi * ln pi/ln s
Donde:
s = Número de especies
pi = Proporción de individuos de cada especie i o de abundancia de cada especie
expresada como una proporción de la cantidad total
ln = log natural
Índice de Dominancia de Simpson: Considera la probabilidad de que dos individuos
tomados al azar de una muestra sean de la misma especie. Se calcula con la siguiente
ecuación:
S= Σ pi2
Donde:
pi = abundancia proporcional de la especie i, número de individuos de la especie i
dividido entre el número total de individuos de la muestra.
22
3. METODOLOGÍA
3.1 ÁREA DE ESTUDIO
La ecorregion eje cafetero se encuentra localizada en la región andina de Colombia.
Se caracteriza por ser un territorio con sistemas naturales prioritarios para la retención
y regulación del agua como son los sistemas de páramo y subparamo de las
cordilleras Central y occidental, y las cuencas altas de los ríos Otún, Consota,
Chinchinà y La Vieja, entre otros (CARDER, 2002). En la actualidad es la región
más poblada del país, tanto en la parte urbana como en la rural, con una gran
explotación agrícola y ganadera. Se ha estimado que un 70% de la cobertura boscosa
de la región ha sido transformada, mientras que el 80% de la tierra deforestada es
ocupada por pasturas (Murgueitio et al., 2003).
Este estudio se llevó a cabo en 9 ríos de la cuenca del río La Vieja, ubicada en el
centro-occidente de Colombia en jurisdicción territorial de los departamentos de
Quindío, Risaralda y Valle del Cauca con un área de aproximadamente 2.925 km2.,
Geográficamente, se encuentra ubicada entre 4º 04` y 49º 49`de latitud norte y 75º 24`
y 75º 57`de longitud oeste. La cuenca presenta una gran heterogeneidad ambiental
evidenciada en sus diferencias climáticas y topográficas (Figura 1).
Con el desarrollo económico y agropecuario, la cuenca se ha posicionado como uno
de los lugares más densamente poblados del país, ocasionando con ello grandes
cambios y presión sobre los recursos naturales de la zona. Además, el vertimiento de
desechos domésticos, agrícolas y pecuarios y la carencia de infraestructuras para el
tratamiento de aguas residuales constituyen uno de los principales problemas que
sufre el recurso hídrico de la cuenca (Amaya et al., 2005).
23
Figura 1. Ubicación geográfica de la ecorregión eje cafetero y la cuenca del río La Vieja.
3.2 IDENTIFICACIÓN DE LOS SISTEMAS PRODUCTIVOS Y ELECCIÓN
DE LOS SITIOS DE MUESTREO
Los sistemas productivos seleccionados en la cuenca fueron establecidos por el
Centro de Investigaciones y estudios en Biodiversidad y Recursos Genéticos
(CIEBREG), con base en información biofísica y geográfica del SIG sobre sistemas
productivos en paisajes naturales y transformados en la ecorregión del eje Cafetero
(CIEBREG, 2004).
A partir de la información anterior, se seleccionaron tres sistemas productivos
predominantes en la cuenca del río La Vieja: (1) Sistema productivo ganadería
semiextensiva con potreros y pastos mejorados para carne (Ganadería de carne).
Corresponde al sistema de mayor predominio en la región, se ubica en bajas altitudes,
algunas de las riberas del sistema no presentan cobertura arbórea y los pastos de
forraje suelen invadir el cauce de los ríos. (2) el sistema productivo ganadería
semiextensiva para producción de leche (Ganadería de leche), el cual se caracteriza
24
por la presencia de pastos mejorados en las fincas y riberas protegidas con vegetación
arbórea nativa y (3) el sistema productivo cultivos Mixtos, dominado por cultivos de
café y cítricos principalmente.
La selección de los ríos y puntos de muestreo en los diferentes sistemas productivos
se realizó en conjunto con los miembros del Grupo de aguas del CIEBREG. En el
grupo de investigación se estudiaron diferentes comunidades acuáticas (peces,
macroinvertebrados, diatomeas y microorganismos), en los sistemas productivos de la
ecorregion cafetera.
En cada sistema productivo se seleccionaron fincas que tuvieran cuerpos de agua con
influencia directa de las actividades características de cada sistema. Se muestreó un
río por cada finca, con un total de 9 fincas (Tabla 2). La selección de los ríos y puntos
muestreados fueron escogidos considerando ciertas características tales como orden
de los ríos (bajo orden), el caudal, la influencia antrópica, tipos de cobertura vegetal,
uso del suelo y accesibilidad.
Tabla 2. Ubicación geográfica de las fincas muestreadas y sus respectivos sistemas
productivos en la cuenca del río La Vieja. Ganadería semiextensiva para carne (GC),
Ganadería semiextensiva para leche (GL) y Cultivos Mixtos (CM).
Dpto
Quindío
Valle
Sistema
productivo
Quindío
Ganadería de
Carne
Quindío
Quindío
Ganadería de
Leche
Quindío
Valle
Quindío
Valle
Cultivos Mixtos
(Cafetales,
naranjos)
Finca
Porvenir
Tierra
Labrantía
La Floresta
Coord
Coord (W)
(N)
4º41’18.7” 75º48’46.8”
Altitud
(msnm)
1203
4º35’11.2” 75º49’43.1”
1195
4º39’10.1” 75º48’48.1”
1145
Villa Ximena 4º35’23.0” 75º40’11.1”
Tesalia Baja 4º35’54.8” 75º39’58.1”
1602
1628
La Comarca
La Sonora
Santa
Bárbara
El Descanso
4º41’44.4” 75º46’23.2”
4º41´54.5” 75º45´36.1”
1226
1285
4º40’51.3” 75º44’51.5”
1346
25
4º35’43.0” 75º46’54.2”
1261
Los muestreos se realizaron durante el inicio de la estación de sequía del 17 al 24 de
julio y durante la estación de lluvias del 3 al 10 de noviembre de 2006 (Anexo1).
3.3 FASE DE CAMPO
Para el estudio de las comunidades microbianas, en cada uno de los ríos
seleccionados en las diferentes fincas, se eligió aleatoriamente un solo tramo de 100 a
500 metros de longitud, para realizar en el mismo lugar todos los muestreos y de esta
manera, tener información específica de cada lugar. A partir de este punto se
seleccionó un transecto de 50 metros, donde se tomaron muestras de sedimentos cada
diez metros a lo ancho del río con seis replicas cada uno, obteniéndose una
submuestra por cada transecto. En total se obtuvieron seis submuestras, las cuales se
mezclaron y transfirieron a una botella estéril de 500 ml conformando una muestra
integrada por sitio de muestreo (Figura 2).
Figura 2. Representación esquemática del muestreo.
26
Las muestras fueron conservadas a 4ºC y transportadas al laboratorio de la Unidad de
Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA), de la Universidad Javeriana en
Bogotá, para su posterior procesamiento.
Además, en cada uno de los ríos se midió in situ, pH, oxigeno disuelto (YSI 52),
conductividad (sonda OAKTON), temperatura del agua (YSI 52). Así mismo, se
recolectó una muestra de 2 litros de agua para los análisis fisicoquímicos y de calidad
de aguas que se realizaron a nivel de laboratorio, donde se determinó la alcalinidad
(titulométrico H2SO4), DBO5 (incubación 5 días, electrométrico), turbiedad
(Nefelométrico), coliformes totales (fijación por membrana), E. coli, silicatos
(Colorimétrico –Molibdosilicato), fósforo total (PT, colorimétrico – cloruro
estañoso), fósforo reactivo soluble (PRS, colorimétrico – cloruro estañoso), nitrógeno
total (NT, titulométrico H2SO4), nitrógeno amoniacal (NH4, colorimétrco -
Nesslerización), nitratos (NO3, colorimétrico), nitritos (NO2, colorimétrico-NEDA),
sólidos suspendidos totales (SS, titulométrico DPD-FAS), sólidos totales (ST,
Gravimétrico -105°C) y color (comparación visual con patrón) según métodos
normalizados (APHA-AWWA_WEF, 2006).
Adicionalmente, se tomaron datos morfomètricos e hidrológicos, como ancho del
canal, profundidad y velocidad de la corriente, con lo cual se calculó el caudal de
cada río. Se determinó el porcentaje de cobertura riparia (0% ausente, 0-25% escasa,
25-50% parcial, 50-100% completa) y el tipo de sustrato, que varió entre fino (limo y
arenoso), rocoso y mixto (sedimento fino, grava particulada y roca).
3.4 RECOLECCIÓN DE LA INFORMACIÓN MEDIANTE ENCUESTAS
Para caracterizar el manejo del recurso hídrico en los sistemas productivos de estudio,
se realizó una encuesta a los dueños y/o administradores de las fincas sobre el uso del
agua, fuentes de abastecimiento, disposición de aguas residuales y posibles fuentes de
contaminación del recurso hídrico (Anexo 2).
27
3.5 FASE DE LABORATORIO
3.5.1 Procesamiento de las muestras de sedimentos recolectadas a partir de los
ríos de estudio. Para el análisis de la estructura de las comunidades microbianas, se
utilizaron técnicas independientes de cultivo como electroforesis en gel de gradiente
denaturante (DGGE) y recuento total de células por tinción con solución 4,6diamidino-2-fenilindol diclorohidrato (DAPI).
Para la obtención de la biomasa microbiana, las muestras de sedimento recolectadas
de los diferentes ríos se centrifugaron a 5000 rpm por 20 minutos obteniéndose un
precipitado homogéneo, el cual se dividió para los posteriores análisis.
3.5.2 Fijación de las células de las muestras de sedimento para el conteo total de
microorganismos. Las muestras de sedimento fueron fijadas para su conservación
en paraformaldehído 4% y procesadas siguiendo el protocolo de Pernthaler et al.,
2004. Posteriormente se realizaron lavados con solución buffer fosfato salino 1X
(PBS), y finalmente las muestras fueron almacenadas en etanol al 96% a -20ºC hasta
su uso.
3.5.3 Separación de las células del sedimento. El paso inicial para el conteo directo
es la separación de los microorganismos presentes en el suelo, que se llevó a cabo,
siguiendo el protocolo propuesto por Battin, (2001), a 0.05 g de sedimento se le
adicionó pirofosfato de sodio 0.1 M (PPS); La mezcla fue macerada y homogenizada
en un agitador orbital (12100; New Science) a 160 rpm por 30 minutos.
Posteriormente la mezcla se sonicó por 5 minutos y se centrifugò por 6 segundos.
Pasado este tiempo se recuperó el sobrenadante en un tubo eppendorf y se lavó con
buffer fosfato salino (PBS) por 30 minutos a temperatura ambiente. Luego se
centrifugó por 20 minutos, se descartó el precipitado y al sobrenadante se le adicionó
nuevamente PBS, se homogenizó la mezcla y con la ayuda de una jeringa se adicionó
en el fondo del tubo una cantidad igual de Percoll (1:1), se centrifugó a 2800 rpm por
28
15 minutos y el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo eppendorf. Se filtraron
100 µl del sobrenadante a través de una membrana de policarbonato de 0.2µm de
tamaño del poro (GTTPO4700, Millipore), con ayuda de una bomba de vacio y
finalmente el filtro se secó a temperatura ambiente.
3.5.4 Recuento total de células por tinción con DAPI. Para el recuento total de
microorganismos, una porción de filtro previamente cortado se incubó en una
solución de 4,6-diamidino-2-fenilindol diclorohidrato (DAPI), según el protocolo de
Schallenberg et al. (1989). El recuento total se llevó a cabo en un microscopio
epifluorescencia (Nikon – Eclipse 50i), donde se leyeron 50 campos visuales por
muestra, si se observaba un número menor de 30 células por campo, y 20 campos
visuales si se observaba un número mayor de células, hasta llegar, como mínimo a
contar 300 células por filtro (Kirchmanm, et al., 1982).
3.5.5 Extracción del ADN de las muestras de sedimento para los análisis de
estructura y dinámica de las comunidades microbianas. Para la extracción del
ADN total, 0.5 g del precipitado homogenizado fue procesado utilizando un kit de
extracción rápida de ADN en suelos (MOBIO), siguiendo las especificaciones del
fabricante. Las extracciones se realizaron por duplicado y el ADN extraído se
resuspendió en 50 µl de agua desionizada estéril y se verificó en gel de agarosa (1.5 %),
teñido con bromuro de etidio. Las muestras fueron preservadas a -20°C.
3.5.6 Amplificación del gen 16S rRNA. A partir del ADN extraído de cada una de
las muestras, se amplificó por PCR la región variable V3 a V5 del gen 16S rRNA,
usando los iniciadores universales del dominio Bacteria F1 GC (Connolly & Patel,
2002) y R4 (Dwivedi et al., 1996), para obtener un producto PCR de
aproximadamente 400 pb (Tabla 3). Antes de la PCR, el ADN fue diluido a diferentes
concentraciones (1:50, 1:100). La reacción se llevó a cabo en un volumen final de 50 µl
que contenía 10 µl de buffer 10X (Promega), 4mM de MgCl2, 0.2mM de cada iniciador,
29
0.2mM de dNTP, 2.5 U de Taq DNA polymerase (Promega) y 2 µl de ADN. Las
muestras fueron amplificadas usando un Termociclador MyCyclerTM (BioRad) con
un programa modificado de “Touch down” (James et al., 2006), bajo las siguientes
condiciones: Una denaturación inicial de 94ºC por 1 min, seguido por 10 ciclos de
denaturación a 94º C por 1 minuto, anillamiento a 65-55 ºC (disminuyendo 1º/ciclo) y
elongación por 1 minuto 30 ciclos. Luego 20 ciclos con una denaturación de 94 ºC por 1
minuto, anillado a 55 ºC por 1 minuto, extensión a 72 ºC por 1 minuto y un paso de extensión
final a 72 ºC por 5 minutos. La amplificación del ADN se verificó en electroforesis en gel
de agarosa (1.5%), teñido con bromuro de etidio, y se visualizó por transiluminacion
UV en un analizador de imágenes GEL-DOC (Biorad). Los tamaños de los productos
amplificados se cuantificaron con el marcador de peso molecular Hyperlader IV
(Bioline), y el análisis del perfil de bandas se hizo en el software Quantity One
(Biorad).
De igual forma, se amplificó por PCR el fragmento V1 a V3 del gen 16S rRNA,
usando los iniciadores universales para el dominio Archaea, A109 (T) f (Grosskopf et
al., 1998) y GC 515R (Lane et al., 1991), (Tabla 3). La reacción se llevó a cabo en un
volumen final de 50 µl que contenía 10 µl buffer 10X (Promega), 4mM de MgCl2, 0.2-0.5
mM de cada iniciador, 0.2mM de dNTP, 2.5 U de Taq polymerase (Promega) y 1 µl de
ADN. Las muestras fueron amplificadas bajo las siguientes condiciones: Una denaturación
inicial a 95 ºC por 2 minutos, seguido por 35 ciclos de denaturación a 95 ºC por 30
segundos, anillamiento a 56 ºC por 40 segundos, extensión a 72 ºC por 1 minuto y un paso
de extensión final a 72 ºC por 5 minutos. Los productos de la PCR fueron verificados en
electroforesis en gel de agarosa (1.5%), y cuantificados con el marcador de peso
molecular Hyperlader IV (Bioline).
30
Tabla 3. Secuencias y número de pares de bases de los iniciadores utilizados para la
Amplificación del gen 16S rRNA en las muestras de sedimento.
Dominios Iniciadores
Bacteria
Archaea
Secuencia
F1-GC
Forward
5’CGCCCCCCGCGCCCCGCGCCCGTCCC3’
R4 Reverse
5’CCGTCAATTCCTTTGAGTTT3´
A109 (T) f
5’ ACTGCTCAGTAACACGT3’
GC 515R
5' CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC
GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAT CGT
ATT ACC GCG GCT GCT GGC AC -3'
Posición
(pb)
respecto
E. coli
339-357
907 -926
109
515
3.5.7 Análisis de la estructura y dinámica de las comunidades microbianas. El
análisis de los fragmentos del gen 16S rRNA amplificados por PCR, correspondientes
a las muestras de los dominios Bacteria y Archaea fueron analizados utilizando la
técnica de huella genética DGGE. El análisis se realizó en un sistema DCodeTM
Universal Mutation Detection System (BioRad) según Muyzer et al., 1998. Todos los
productos de PCR, se ajustaron a una misma concentración y aproximadamente entre
400 a 600 ng de producto PCR fue depositado en un gel de urea –formamida, con
gradiente denaturante 40 a 60% (solución 100% denaturante que contenia 7M de urea
y 40% de formamida) para Bacteria y 45-55% para Archaea. La electroforesis se
realizó a 160 voltios por 13 horas en buffer TAE 0.5X (20 mM Tris, 20 mM de ácido
acético, 1mM EDTA pH: 8.3). Después de la electroforesis, los geles fueron teñidos
con nitrato de plata (AgNO3). Una vez terminado el procedimiento de tinción, los
geles fueron escaneados (escáner Hppsc 1500) y la digitalización de la imagen fue
procesada con el sofware de imagen HP image zone express.
31
Las imágenes de los perfiles de bandas generados por el DGGE de las comunidades
procariotas presentes en muestras de sedimentos fueron analizadas usando el
Software Quantity One (Bio-Rad). Con el fin de determinar la posición e intensidad
de las bandas individuales se establecieron valores equivalentes a la abundancia por
OTUs, utilizando como estimativo el número de píxeles por banda (el número de
OTUs es equivalente al número de especies y el número de píxeles es equivalente al
número de individuos o abundancia), siguiendo la metodología de Boon et al. (2002).
3.5.8 Relaciones entre la diversidad de las comunidades microbianas y los
sistemas productivos.
Se utilizaron índices de diversidad para caracterizar la
estructura de las comunidades de procariotas presentes en las muestras de los
diferentes sistemas de producción estudiados. Se calcularon la riqueza de especies
(S), el índice de dominancia de Simpsom (1/D), el índice de diversidad de Shannon
(H´ en base e) la Equitatividad de Pielou (EH), siguiendo las recomendaciones de
Magurran (1989). Estos análisis se hicieron utilizando el programa Diversity tool.
3.5.9 Análisis de agrupamiento y similitud de los perfiles de OTUs generados en
el DGGE. Los perfiles de OTUs generados por los geles, fueron analizados para
estudiar el grado de similitud de la composición de las muestras microbianas,
mediante análisis de agrupamiento, utilizando el índice de similitud de Jaccard (Diez
et al., 2001), que se basa en presencia o ausencia. Para este análisis se utilizó el
programa PAST (Paleontological software, 2005).
3.6 Secuenciación e identificación de los OTUs seleccionados en el DGGE
Para los análisis de secuenciación, los geles de DGGE fueron procesados bajo las
mismas condiciones anteriormente mencionadas, con la diferencia que estos fueron
teñidos con un colorante diferente al de plata. Se utilizó SYBR Gold (SYBR Gold
Nucleic Acid Gel Stain, 1:10000), en Tampon TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA).
De todas las bandas generadas en el DGGE, se tuvieron en cuenta ciertos criterios de
32
selección para los respectivos cortes, como intensidad de la banda, bandas que
aparecieran en todas o en la mayoría de las muestras y bandas que aparecieran una
sola vez en el gel. Cada banda seleccionada fue cortada cuidadosamente con un
bisturí estéril mientras era visualizada en un transilumidador con luz ultravioleta
(UV). La banda extraída era depositada en tubos eppendorf que contenían 50µl de
agua desionizada estéril; luego las muestras fueron incubados a 80 ºC por 1 hora para
eluir el ADN del gel (Burgmann et al., 2005). Posteriormente, el ADN fue
concentrado para eliminar toda traza de SYBR (SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain).
2 a 5 µl de sobrenadante ADN fue usado para la reamplificación, la cual se hizo bajo
las mismas condiciones anteriormente descritas y se utilizaron el mismo conjunto de
iniciadores. Posteriormente se realizó un nuevo gel de DGGE con tinción con plata
para verificar que la banda cortada apareciera como una única banda, al igual que la
posición
correspondiera
con
la
banda
presente
en
la
muestra
original.
Subsecuentemente, estos nuevos productos de PCR reamplificados fueron enviados
para ser purificados y secuenciados respectivamente, en el laboratorio Macrogen,
Corea.
Las secuencias de nucleótidos obtenidas se analizaron contra las secuencias de
nucleotidos de la base de datos del NCBI (National Centre for Biotechnology
Informati- on) utilizando el algoritmo BLAST.
33
4. ANÁLISIS DE LOS DATOS
4.1
VARIABLES
FISICOQUÍMICAS
E
HIDROLÓGICAS
SISTEMAS PRODUCTIVOS DE LA CUENCA DEL RÍO LA VIEJA
EN
LOS
Para determinar las variaciones entre las condiciones físicas, químicas e hidrológicas
que se presentaron entre los diferentes ríos estudiados, se empleó el Análisis de
Componentes Principales (ACP), que corresponde a una técnica estadística lineal de
simplificación y reducción de la dimensionalidad de un conjunto de datos. Permite
evaluar grandes matrices de registros fisicoquímicos (múltiples estaciones y
variables) y su principal ventaja consiste en conjugar en unas pocas variables
llamadas componentes, alta cantidad de información con base en las correlaciones
existentes (Ramirez & Viña, 1998). Previo al análisis, los datos fueron transformados
con Log (X+1) y ajustados a desviación estándar. El análisis de ACP se realizó
mediante el programa Statistic 6.0 (StarSoft, 1995).
4.2 ÍNDICE DE CALIDAD DE AGUA
La calidad del agua de cada río en los diferentes sistemas productivos estudiados se
determinó mediante el índice de calidad de aguas de la “National Sanitation
Foundation Water Quality Index” NFSI (Brown et al., 1970) el cual utiliza los
parámetros: DBO (mg/l), temperatura (ºC), turbidez (NTU), pH, oxígeno disuelto (%
saturación), coliformes fecales, fosfatos (mg/l), nitratos (mg/l), sólidos disueltos
totales. La escala de valores del índice está entre 0 y 100, con las calificaciones de:
Excelente: 91-100; Buena: 71-90; Regular: 51-70; Deficiente: 26-50; Mala: 0-25. El
procedimiento realizado para determinar la calificación de calidad de agua de cada río
en cada sistema productivo fue el siguiente: a) se determina para cada variable un
valor ponderado según una curva específica y se obtiene el valor Q. b) Este valor se
multiplica por el peso respectivo según la importancia relativa de cada variable (W).
34
c) La suma de los productos (Q*W) d) El resultado obtenido es el valor del NSFI
(Brown et al., 1970).
4.3 ANÁLISIS DE ORDENACIÓN DE LOS DATOS DE LA COMPOSICIÓN DE
LAS COMUNIDADES MICROBIANAS
Para determinar los patrones de distribución de las comunidades microbianas se
realizó un Análisis de correspondencia (ACO), (Hill & Gauch, 1980). El ACO es una
técnica jerárquica aglomerativa que analiza las muestras en forma individual para
fusionarlas sucesivamente en grupos de tamaño creciente, hasta que todas las
muestras son sintetizadas en un sólo grupo. El análisis fue utilizado para observar
patrones en la distribución de las comunidades de microorganismos, y se utilizó el
programa PC-ORD 4.0 (McCune & Mefford, 1999).
4.4
RELACIÓN
ENTRE
PARÁMETROS
FISICOQUÍMICOS,
E
HIDROLÓGICOS CON LAS COMUNIDADES MICROBIANAS EN CADA
SISTEMA PRODUCTIVO
Para estudiar la relación entre los filogrupos u OTUs y las variables ambientales se
realizó un análisis de Correspondencia Canónica (ACC) por medio del programa
PC-ORD 4.0 (McCune & Mefford, 1999). El ACC es una técnica de ordenación
directa y representa además un caso especial de regresión múltiple donde la
composición de especies está directamente relacionada con las variables
ambientales, muestra cómo la composición de la comunidad varía en función del
ambiente (Kent & Coker, 1992).
En el ACC se tuvieron en cuenta variables ambientales fisicoquímicas,
microbiológicas e hidrológicas a partir de los análisis del ACP. Se desarrolló el test
de Montecarlo (999 permutaciones, α=0,05) con el objeto de establecer si los
valores característicos de los primeros ejes de la ordenación y los valores de
35
correlación entre las especies y las variables ambientales obtenidos con el análisis
eran estadísticamente significativos (P< 0.05).
Para graficar los resultados arrojados por los diferentes análisis multivariados
(ACP, ACO y ACC), se utilizó el programa Sigmaplot 6.0 (Brannan, 2000). Los
gráficos se representaron teniendo en cuenta los sistemas productivos y la época
climática.
Los resultados de estos análisis permiten establecer las principales variables que
afectan a la comunidad microbiana en la cuenca estudiada.
36
5. RESULTADOS
5.1 CALIDAD DEL AGUA Y VARIABILIDAD FÍSICA, QUÍMICA E
HIDROLÓGICA
Los ríos estudiados, se caracterizaron por presentar sustratos finos y rocosos de
diverso tamaño desde grava particulada hasta roca (Tabla 4). El sistema productivo
ganadería de carne en particular, presentó un tipo de sustrato fino y cobertura riparia
escasa (menor al 25%), a diferencia del sistema productivo ganadería de leche, en el
cual predominó un tipo de sustrato rocoso y cobertura riparia completa (mayor al
70%). En este sistema se protegen las riberas de los ríos con bosques naturales. La
vegetación ribereña predominante se encontró conformada en su mayoría por
herbáceas, árboles y arbustos, igualmente se encontraron plantaciones de guadua,
jengibre, frutales y heliconias. En el sistema productivo cultivos mixtos en algunos
casos, se protege las riberas de los ríos con vegetación herbácea (Tabla 4).
37
Tabla 4. Características morfométricas de los ríos de la Cuenca La Vieja
Sistemas
productivos
Ganadería
de Carne
Ganadería de
Leche
Río
Sustrato
TieL
Porv
Flor
Fino y raíces
Fino
Fino y raíces
TesB
Roca y fino
Roca, grava
fina y
hojarasca
VillaX
Son
Grava
particulada,
fina y
guijarros
Fino
SanB
Fino y raíces
Des
Guijarros,
grava
particulada
arena
Com
Cultivos
Mixtos
Tipo de
vegetación
riparia
Pastizal
Árboles,
arbustos,
herbáceas
Vegetación
riparia
(%)
25
Herbácea y
guadual
Gramineas
75
Árboles de
naranja
Cafetales
Cafetales
Herbácea y
guadual
Herbácea
Árboles,
arbustos,
herbáceas
Cultivo
dominante
25
Cafetales
En cuanto a las variables químicas, los ríos presentaron pH con una tendencia neutra
y débilmente básica. Los valores de conductividad se encuentran entre los rangos
reportados para otros ríos andinos de bajo orden (Diaz & Rivera 2004) y fueron mas
altos en los ríos del sistema productivo ganadería de carne. El sistema productivo
ganadería de leche, presentó valores altos en la concentración de oxígeno disuelto y
obtuvo los valores más bajos en las concentraciones de los nutrientes nitratos y
fosfatos (Tabla 5), a diferencia de los sistemas productivos ganadería de carne y
cultivos mixtos, los cuales presentaron los mayores valores promedios en turbiedad,
sólidos totales, alcalinidad y temperatura.
Respecto a las características hidrológicas, los mayores valores de caudal, velocidad
de la corriente y ancho del canal se encontraron en el sistema productivo cultivos
mixtos (Tabla 5).
38
Tabla 5. Resumen de las variables físicas, químicas e hidrológicas registrados en cada tramo de los ríos en estudio en la cuenca
del río La Vieja
Ganadería de carne
Variables
Ganadería de leche
TieL
Por
Flo
VillaX
TesB
SanB
Son
Des
Com
Sec lluv Sec lluv sec lluv sec lluv sec lluv sec lluv sec lluv sec lluv sec lluv
Temperatura ºC
23.5
24.3
24
24.3
24.2
22.1 19.9
19
19.3 19.6
Oxigeno disuelto (mg/l)
4.6
2.7
3.8
2.6
7.1
6.3
6.6
7.1
6.9
Conductividad (µS/Cm)
pH
160
210
142
182
118
116
59.6
48.9
7.1
6.1
6.8
6.1
7.3
6.2
7.5
alcalinidad (mg/lCaCo3) 60
Color (UPC)
5
Turbiedad (UNT)
3.5
64
60
58
42
42
10
5
10
5
3.1
6.5
7.4
132
80
104
2.5
2.5
Sólidos Totales (mg/l)
Sólidos Suspendidos
Totales (mg/l)
Cultivos Mixtos
26.9
21.8
24
22
23.9 20.6
21.3
22.9
6.4
6
5.3
6.8
6.4
6.6
7.3
7.8
6.8
65.4
76
72.3
78
75
76.7
58.5
68
78.6
67
7
7.3
7.3
6.9
7.6
7.3
6.1
6.9
6.2
7.7
6.3
22
18
28
22
26
28
28
30
24
26
28
30
10
5
10
5
5
5
15
5
5
5
5
5
5
14
8.3
2.7
2
2.6
2.5
9
8.5
5.4
3.3
3.4
2.7
3.9
5
76
120
72
80
32
24
34
124
44
60
40
44
36
40
52
6
8
25
9
2.5
6
2.5
2.5
26
5
13
2.5
8
2.5
7
13
>2
>2
>2
>2
>2
>2
>2
>2
>2
>2
>2
>2
>2
>2
>2
>2
Demanda Biológica de
Oxígeno (mg/l)
Nitrógeno Total K
(mg/l)
>2
>2
2.24
1.12
3.92 0.56
1.68
0.56 1.12
0.56
2.8
0.56
1.6
0.56
2.2
0.56
1.1
0.56
0.5
0.56
Fósforo Total (mg/l)
0.04
0.06
0.07 0.05
0.05
0.05 0.01
0.02
0.01 0.06
0.02
0.04 0.01
0.02
0.01 0.01
0.02
0.04
39
Ganadería de carne
TieL
Por
Flo
Sec lluv Sec lluv sec lluv
Ganadería de leche
VillaX
TesB
sec Lluv sec lluv
0.15
0.07
0.09
0.01
0.13
0.07
0.04
0.15
0.15
0.2
0.3
0.4
0.1
0.75
0.3
0.44
0.05
Fosfatos PO4
0.1
0.14
0.2
0.12
0.14
0.1
0.02
(mg/l)
20
7.5
24
9.3
17.2
13
(m3s)
0.01
0.02
0.01
0.01
0.06
(cm/s)
0.04
0.11
0.03
0.21
4E
6.1E
3.2E
+03
80
Variables
Amonio NH4
(mg/l)
Nitratos NO3
SanB
sec lluv
Cultivos Mixtos
Son
Des
sec lluv sec lluv
Com
sec lluv
0.07
0.07
0.07
0.11
0.01
0.09
0.07
0.07
0.04
0.1
0.05
0.6
0.05
0.6
0.3
0.5
0.2
2.2
0.05
0.03
0.03
0.14
0.05
0.07
0.03
0.03
0.03
0.02
0.05
0.07
11.2
28
22
29.2
14
36
22
13
13.2
12
12
7.5
0.05
0.003
0.08
0.006
0.006
0.085
0.074
0.039
0.035
0.057
0.06
0.24
0.515
0.08
0.13
0.01
0.14
0.01
0.12
0.19
0.39
0.21
0.22
0.13
0.35
0.2
0.65
1.12E
3.4E
9.6E
1.7E
1.3E
1.4E
7.2E
4.7E
3.4E
6.3E
6.8E
1.8E
7.3E
3.2E
1.6E
+04
+04
+04
+03
+03
+04
+04
+03
+03
+04
+04
+03
+04
+03
+04
+04
90
240
380
160
230
670
270
420
80
1100
160
150
270
340
840
920
Silice (SiO )
Caudal
Velocidad
Coliformes
(UFC/100ml) +04
Ecoli
(UFC/100ml) 150
40
El índice de calidad NSFI osciló entre regular y bueno en todos los sistemas
productivos (Tabla 6), con valores de coliformes fecales <1000 UFC/100 ml y
DBO<2mg/l (Rivera et al., 2007).
El sistema productivo con mejor calidad de agua fue ganadería de leche (durante la
época de lluvia). La menor calidad (calificación regular) la presentaron los sistemas
productivos ganadería de carne y cultivos mixtos respectivamente.
Según la información obtenida de las encuestas realizadas a los dueños y/o
administradores de las fincas, el sistema productivo ganadería de carne utiliza abonos
y fertilizantes en áreas de pastizal y en menor proporción en zonas cultivadas con
cítricos y plátano (Anexo 2). En el sistema productivo cultivos mixtos se realizan
prácticas de manejo donde utilizan agroquímicos para eliminar plagas y malezas y en
algunas fincas se protege de la erosión del suelo (Anexo 2).
El 77% de las fincas asociados a los sistemas productivos implementan pozos
sépticos para el tratamiento de agua residuales. Sin embargo, no existe la práctica de
hacer mantenimiento ni limpieza a los pozos. Las demás fincas, vierten las aguas de
desechos directamente al río.
41
Tabla 6. Valor promedio del índice de calidad del agua NSFI (Brown et al., 1970)
en los ríos de los diferentes sistemas productivos estudiados en la cuenca del río La
Vieja.
Sistema productivo
Ganadería de Carne
Ganadería de Leche
Cultivos Mixtos
Calificación NSFI
Época
Época
Fincas
TieL
Por
Flo
VillaX
Tes
SanB
Son
Des
Com
seca
lluvia
Regular
Regular
Regular
Regular
Regular
Regular
Regular
Buena
Regular
Regular
Regular
Regular
Regular
Buena
Regular
Regular
Regular
Regular
Con relación a la época climática, la calidad del agua de los ríos en la mayoría de los
sistemas productivos no varió; sin embargo, en el sistema productivo ganadería de
leche, el agua disminuyó de buena en el periodo de sequía a regular en la época de
lluvia.
Mediante el análisis de componentes principales ACP se resumieron los patrones
físicos, químicos e hidrológicos de los ríos estudiados. Para el análisis se tuvieron en
cuenta 22 variables ambientales. Los resultados indicaron que la suma de la varianza
acumulada para los dos primeros factores, explicaron el 48 % de la variación entre las
muestras (Figura 3 y Anexo 3).
El primer componente presentó las mayores correlaciones positivas (>0,5) con
conductividad, concentraciones de fosfatos (PO4), fósforo total (PT), sólidos totales
(ST) y turbiedad. Este componente presentó correlaciones negativas con el oxigeno
disuelto y la altitud. (Figura 3). Este comportamiento se encuentra asociado con el
tipo de sistema productivo. De esta forma, el sistema productivo ganadería de leche,
42
presentó una correlación positiva con oxígeno disuelto y altitud, en comparación con
el sistema productivo ganadería de carne, el cual presentó una correlación con los
nutrientes (Figura 3a).
El segundo componente presentó correlaciones positivas con la velocidad. Sin
embargo separa al sistema productivo cultivo mixto de los demás sistemas
productivos. Este sistema, también se caracterizo por presentar mayores valores
relacionados con los nutrientes (Figura 3).
En cuanto a la estacionalidad climática, se encontró una tendencia al aumento en los
valores de variables como velocidad de la corriente, caudal y profundidad en el
periodo de lluvias, en todos los sistemas estudiados. Sin embargo, este periodo
presentó disminuciones en los valores de ciertos parámetros como amonio, nitratos
sólidos totales y sólidos suspendidos totales (Figura 3b).
43
1,0
Veloc
E
Factor 2 : 16.67%
0,5
Temp
Color
Q
N
D
S
H
Cond
Alca
Turb
SST
ST PT
PO4
Ecoli
0,0
NO3
Ancho
Oxi
Altitud
ColiT
-0,5
NTK
Prof
SiO2
NH4
pH
-1,0
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
Factor 1 : 31.12%
4
3
b
3
2
2
1
1
Eje 2
Eje 2
4
a
0
0
-1
-1
-2
-2
Ganaderia Leche
Ganaderia Carne
Cultivos Mixtos
-3
a
-3
Època seca
Època lluvia
b
-4
-4
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
-6
-4
-2
0
5
2
4
6
8
Eje 1
Eje 1
c
4
LaCom2
TieLa2 Porve2
3
LaSon2
ElDes2
Factor 2: 16.67%
2
LaFlo2
StaBa2StaBa1
1
ElDes1
0
LaCom1
LaSon1
ViXim1
TesBa2
-1
-2
LaFlo1
TieLa1
ViXim2
TesBa1
Porve1
-3
-4
c
-5
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
Factor 1: 31.12%
Figura 3. Ordenación de las variables ambientales mediante el análisis de
componentes principales (ACP): a) Ordenación de los ríos respecto al sistema de
producción b) Ordenación de los ríos según la época de muestreo c) Ordenación de
los ríos respecto a las fincas.
44
5.2 RECUENTO TOTAL DE CÉLULAS POR TINCIÓN CON DAPI
Las densidades microbianas variaron entre 3.80x108 y 7.04x109 células/ml, en todos
los sistemas productivos. El máximo valor se registró en sistema productivo
ganadería de carne, en el río Tierra Labrantía con un valor de 7.04x109 células/ml
durante la época de lluvia, seguidos por ganadería de leche, en el río Villa Ximena
con un valor de 9.11x108 células/ml y cultivos mixtos con un valor de 9.05x108 en la
época de sequía. En este sistema, los mayores valores en los recuentos se presentaron
durante la época de sequía (Tabla 7).
Tabla 7. Conteo de los microorganismos presentes en las muestras de sedimentos
obtenidos durante el estudio.
Sistemas
productivos
Ganadería de
Carne
Ganadería de
Leche
Cultivos Mixtos
Conteo de células/ml
Época seca
Época lluvia
8
3.95X10
7.04x109
6.43x107
4.37x108
8
4.11x10
4.60x108
7.70x108
9.11x108
8
7.05x107
8.24x10
4.67x108
4.77x108
5.92x108
4.55x108
8
6.99x10
3.88x108
3.80x108
9.05x108
Fincas
Tiel
Por
Flo
VillaX
Tes
SanB
Son
Des
Com
5.3 ANÁLISIS DE LA ESTRUCTURA Y DINÁMICA DE COMUNIDADES
MICROBIANAS
Los perfiles de DGGE de los fragmentos del gen16S rRNA bacterial amplificados por
PCR son mostrados en la figura (4). Cada banda representa un OTUs o filogrupo y las
flechas indican las bandas que fueron seleccionadas para su secuenciación. En el
análisis del gel un total de 52 bandas fueron detectadas en las 18 muestras procesadas.
El número de bandas por muestras varió entre 19 y 31, de las cuales el 37% se
repitieron en todas las muestras, el 49% aparecieron de 4 a 8 veces en algunas
muestras y un 14% de bandas se presentaron en una o dos muestras.
45
T ie
M
Época Seca
L (G
C)
Por
v( G
C)
F lo
r( G
C)
V il l
X (G
L)
Tes
(G L
)
San
B (C
M)
So
n (C
M)
De
s(C
M)
Co
m (M
C)
T ie
L(G
C)
Po
rv( G
C)
F lo
r( G
C)
V i ll
X(G
L)
Tes
(G L
)
San
B(C
M)
So
n(C
M)
De
s(C
M)
Co
m (C
M)
Época Lluvia
Bv1a1
M
Bv1a2
Bv2a1
Bv3b1
Bv4a1
Bv5a1
Bv6b1
Bv7c
Bv8c2
Bv9a1
Bv1oa
Figura 4. Patrón de diversidad bacteriana de cada sistema productivo durante las
épocas de muestreo. SanB: finca Santa Bárbara; Son: Finca La Sonora; Des: Finca El
Descanso; Com: Finca La Comarca; TieL: Finca Tierra Labrantía; Porv: Finca El
Porvenir; Flo: Finca La Floresta; VillX: Finca Villa Ximena; TesB: Finca Tesalia
Baja. CM: sistema productivo cultivo mixto; GC: sistema productivo Ganadería de
carne; GL: sistema productivo Ganadería de leche.
Según el análisis de similitud de Jaccard se observaron dos grupos bien definidos. Las
muestras tomadas de los ríos Porvenir, Floresta, Villa Ximena y Tesalia Baja de los
46
sistemas productivos ganadería de carne y ganadería de leche durante la época de
sequía, las cuales se agruparon aparte del resto con una similitud de 60%, y el otro
grupo integrado por la mayoría de las muestras de los sistemas productivos ganadería
de carne, ganadería de leche y cultivos mixtos, en la época de lluvia, con una similitud
de 50 %. Dentro de este grupo, se observa un subgrupo aparte, conformado solamente
por muestras de los ríos Santa Barbara, Sonora, El Descanso y La Comarca, asociados
al sistema productivo cultivos mixtos en la época de sequía, las cuales tienen una
similitud de 80% (Figura 5).
Figura 5. Agrupamiento de las muestras microbianas de los ríos en la cuenca del río
La Vieja en las 2 estaciones climáticas, usando el índice de Jaccard. SanB: finca Santa
Bárbara; Son: Finca La Sonora; Des: Finca El Descanso; Com: Finca La Comarca;
TieL: Finca Tierra Labrantía; Por: Finca El Porvenir; Flo: Finca La Floresta; VillX:
Finca Villa Ximena; Tes: Finca Tesalia Baja. CM: sistema productivo cultivos mixtos;
GC: sistema productivo Ganadería de carne; GL: sistema productivo Ganadería de
leche. 1: muestreo época sequía. 2: muestreo época de lluvias.
47
Los perfiles de DGGE de los fragmentos del gen16S rRNA para el dominio Archaea
amplificados por PCR, son mostrados en la figura (6). Debido a que no todas las
muestras amplificaron durante la PCR, en el DGGE solo se cargaron cinco muestras
correspondientes a los sistemas productivos ganadería de carne, ganadería de leche y
cultivos mixtos de la época de lluvia y tres muestras de los sistemas productivos
cultivos mixtos y ganadería de carne de la época de sequía. En el perfil obtenido se
observaron un menor número de bandas u OTUs conformados por tres a ocho por
muestra.
Época seca
Co
m(C
M)
Tes
(GL
)
Vill
X(G
L)
Flo
r(G
C)
Po
rv(
GC
)
So
n(C
M)
Sa
nB
(CM
)
Tie
L(G
C)
Época lluvia
AV2b
AV1a
AV3a1
Figura 6. Perfil de bandas generadas en el DGGE de muestras amplificadas del
dominio Archaea sistema productivo durante las épocas de muestreo. SanB: finca
Santa Bárbara; Son: Finca La Sonora; Des: Finca El Descanso; Com: Finca La
Comarca; TieL: Finca Tierra Labrantía; Porv: Finca El Porvenir; Flo: Finca La
Floresta; VillX: Finca Villa Ximena; TesB: Finca Tesalia Baja. CM: sistema
productivo cultivos mixtos; GC: sistema productivo Ganadería de carne; GL: sistema
productivo Ganadería de leche.
48
En cuanto al índice de similitud de Jaccard para el dominio Archaea, se observaron
dos subgrupos (Figura 7). Las muestras de los ríos Floresta, Santa Bárbara, Sonora,
Comarca y Tierra Labrantía, asociados a los sistemas productivos ganadería de carne
y cultivos mixtos en la época de sequía, con una similitud de 50% y las muestras de
los ríos Tesalia Baja y Villa Ximena del sistema productivo ganadería de leche en la
época de lluvia, con una similitud de 20%. En estas muestras no se observa un patrón
de agrupación con base en la estacionalidad y el sistema productivo.
Figura 7. Agrupamiento de las muestras del dominio Archaea pertenecientes a los
ríos de la cuenca del río La Vieja en las 2 estaciones climáticas, usando el índice de
Jaccard. SanB: finca Santa Bárbara; Son: Finca La Sonora; Com: Finca La Comarca;
TieL: Finca Tierra Labrantía; Por: Finca El Porvenir; sistema productivo cultivo
mixto; GC: sistema productivo Ganadería de carne; GL: sistema productivo
Ganadería de leche. 1: muestreo época sequía. 2: muestreo época de lluvias.
49
5.4 ÍNDICES DE DIVERSIDAD DE LAS MUESTRAS DE LOS DIFERENTES
Los índices de diversidad fueron calculados a partir de los análisis del DGGE en cada
una de las muestras (Tabla 8) y fueron usados para comparar la estructura de la
comunidad microbiana entre las muestras. Los valores de diversidad de de Shannon
(H`) estuvieron entre 3.0 a 3.36 y los de y Simpson (1/D), entre 19.93 y 28.93.
Respecto a la diversidad microbiana, los índices ecológicos de Shannon (H`),
Equidad (EH), Riqueza (S), y Simpson (1/D), presentaron valores similares en las
muestras del sistema productivo ganadería de carne, en las dos épocas de muestreo.
En el sistema productivo ganadería de leche, las muestras colectadas en el rio Villa
Ximena no mostraron diferencias en los valores de los índices, en las dos épocas de
muestreo; Sin embargo, en el rio Tesalia Baja, los valores de los índices
disminuyeron en la época de lluvia. En cuanto al sistema productivo cultivos mixtos,
las muestras tomadas en el rio La Comarca, presentaron una variación notoria en los
índices ecológicos, siendo más altos en la época de lluvias que en época de sequía
(Tabla 8).
En general, el valor máximo de diversidad de Shannon y Riqueza en las muestras de
microorganismos se presentó en cultivos mixtos, mientras que el sistema productivo
ganadería de carne presento valores bajos en estos índices. También se encontró una
alta equidad entre todas las muestras analizadas y no se observó en ninguna muestra
dominancia de especies.
50
Equitatividad de Pielou (EH) y riqueza de especies (S) en los diferentes sistemas
productivos estudiados. Dominio. Bacteria.
H’
1/D
EH
S
Época
Época
Época
Época
Época
Época
Época
TieL
3.21
3.25
24.9
26.0
0.99
1.00
25
26
Por
3.0
3.0
19.93
18.98
0.99
1.00
20
19
Flo
3.13
3.0
22.94
20.0
0.99
1.00
23
20
Leche
VillaX
Tes
3.21
3.33
3.17
3.04
24.97
27.94
24.0
21.0
0.99
0.99
1.00
1.00
25
28
24
21
Cultivos
SanB
3.36
3.36
28.93
29.0
0.99
1.00
29
29
Son
3.29
3.36
26.97
29.0
0.99
1.00
27
29
Des
3.29
3.40
26.98
30.0
0.99
1.00
27
30
Com
3.17
3.43
24.0
31.0
0.99
1.00
24
31
Sistema
productivo
Ganadería de
Carne
Ganadería de
Mixtos
Fincas
seca
lluvia
seca
lluvia
seca
lluvia
seca
Época
lluvia
Respecto al análisis de diversidad realizados a las muestras para el dominio Archaea,
el sistema ganadería de leche presentó los valores mas bajos de diversidad, según los
índices de Shannon (H`), Riqueza (S), y Simpson (1/D). A diferencia, de los sistemas
productivos carne y cultivos mixtos, los cuales presentaron valores similares (Tabla
9).
51
Equitatividad de Pielou (EH) y riqueza de especies (S) en algunas muestras para el
Domino Archaea, de los diferentes sistemas productivos estudiados.
Sistema
productivo
H’
Fincas
TieL
2.59
Por
*
Flo
*
VillaX
Ganadería
de Carne
Ganadería
de Leche
Cultivos
Mixtos
Época
Seca
1/D
Época
lluvia
Época
seca
EH
Época
lluvia
13.29
2.48
Época
seca
Época
lluvia
0.98
*
11.98
*
1.80
*
4.41
*
*
1.09
*
2.99
Tes
*
1.09
*
2.99
SanB
2.07
*
7.99
Son
2.48
*
Des
*
Com
*
S
Época
seca
Época
Lluvi
a
14
0.99
*
12
0.86
*
8
*
0.99
*
3
*
0.99
*
3
0.99
*
8
*
11.97
*
*
0.99
*
12
*
*
*
*
*
*
*
*
2.39
*
10.97
*
0.99
*
11
*Corresponde a las muestras de ADN que no amplificaron para el dominio Archaea
5.5 SECUENCIACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LOS OTUS SELECCIONADOS
EN EL DGGE
Inicialmente, un gran número de bandas fueron cortadas de los geles de DGGE del
domino Bacteria, las cuales se chequearon y con base a los criterios de selección
(aparición de la banda en el nuevo gel de DGGE realizado con tinción con plata),
eran escogidas. 11 bandas prominentes, de diferentes carriles fueron seleccionados
con sus respectivas replicas (entre 4 y 6 replicas). 39 OTUs pertenecientes al dominio
Bacteria y 9 pertenecientes al dominio Archaea fueron secuenciadas.
En total se obtuvieron 48 secuencias de las cuales una vez revisadas, algunas fueron
descartadas por mala calidad de la secuencia. 11 secuencias del dominio Bacteria
52
fueron seleccionadas y analizadas utilizando el servidor BLAST del National Centre
for Biotechnology Information (NCBI), en la base de datos del GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html).
De las secuencias analizadas, 9 pertenecieron a la subclase β-Proteobacteria (BV1a1,
BV6b1 BV1a2, BV5a1, BV3b1, BV7c, BV8c2, BV10a, BV4a1) 1 a la subclase αProteobacteria (BV2a1) y 1 perteneció a la subclase γ-Proteobacteria (BV9a1),
(Tabla 10). Las bandas u OTUs oseleccionados, se escogieron de la mayoría de los
sistemas productivos. A excepción del OTU BV10a, el cual fue obtenido a partir de
muestras asociadas a los sistemas productivos ganadería de carne, durante la época de
lluvia.
En general, el 75% las bandas secuenciadas de las diferentes muestras, pertenecen a
la subclase ß-Proteobacteria, representado por el género Variovorax, Rubrivivax y
Azoarcus, el 17% de las secuencias perteneció a la subclases α-Proteobacteria y el
8% a γ-Proteobacteria (Tabla 10).
Además de las secuencias del dominio Bacteria, se obtuvieron algunas secuencias de
Archaea que presentaron similitud con secuencias de organismos no cultivables en
muestras ambientales (Tabla 11).
53
Tabla 10. Relaciones de parentesco de las bandas secuenciadas del DGGE. Dominio Bacteria.
Ecosistema donde
se aisló el organismo
o clon
mas cercano
a la banda de estudio
Banda
Grupo
Filogenético
Relación
Filogenética
% de
Similitud
Longitud
(pb)
GenBank
Accesión
No
BV1a1
ß-Proteobacteria
Uncultured
bacterium
clon:13C-A5
93%
462
AB205697
BV6b1
ß-Proteobacteria
76%
383
DQ110012
BV1a2
ß-Proteobacteria
93%
464
D16213
Suelos
BV2a1
α-Proteobacteria
Rubrivivax
gelatinosus
Sedimentos
aguas dulces
DQ479388
clon 60GS4
92%
201
ß-Proteobacteria
Variovorax sp.
76%
BV3b1
ß-Proteobacteria
Stappia sp.
87%
438
EF203856
BV7c
ß-Proteobacteria
clon Spb272
94%
BV8c2
ß-Proteobacteria
Rubrivivax
gelatinosus
BV9a1
γ-Proteobacteria
BV10a
ß-Proteobacteria
BV4a1
ß-Proteobacteria
BV5a1
Uncultured
clon 030T7
Osaka et al., 2006
Weber et al., 2006
Gundlapally et al.,
2006
No public.
DQ432053
Suelos
Sherstha et al., 2007
475
AJ422172
Río
Brummer et al.,
2003
92%
458
D16213
Suelos
Hiraishi et al., 1994
Lysobacter sp.
91%
454
AB083480
Miranda et al., 2003
Methylibium
aquaticum
Aguas
Dulces
98%
487
DQ664244
93%
457
AM406670
Suelos
Krause et al., 2007
Azoarcus sp.
460
sistema de
tratamiento de
agua residual
Ref.
54
Lago
Aguas
Dulces
Pfannes et al., 2007
Stackebrandt et al.,
2008
Tabla 11. Relaciones de parentesco de las bandas secuenciadas del DGGE. Dominio Archaea
Banda
AV1a
Grupo
filogenético
Archaea
Relación
Filogenética
Uncultured
archaeon
Clon: TN-1
BV2b
Archaea
Uncultured
archaeon
Clon: SWA05
BV3a1
Archaea;
Crenarchaeota
Uncultured
archaeon
Clon: GRU20
%
similitud
Longitud
(pb)
GenBank
Accesión
No
90%
172
AB107814
93%
240
AB294261
96%
173
AY278087
55
Ecosistema
donde
se aisló
Ref.
No public.
Agua
Suelos
Shimizu et al.,
2007
Ochsenreiter et al.,
2003
6. RELACIONES ENTRE LA ESTRUCTURA MICROBIANA Y LOS
El Análisis de correspondencia (ACO) se empleó con el fin de analizar los patrones
de distribución de las comunidades microbianas respecto a los sistemas productivos.
El primer eje del modelo de ordenación explicó un 48% de la variación, mientras que
el segundo eje explicó el 18%.
Los ríos de los sistemas productivos ganadería de carne y ganadería de leche,
presentaron especies compartidas entre sí. Mientras que el sistema productivo
cultivos mixtos presentó comunidades microbianas especificas de este sistema, donde
se agruparon aparte de los demás sistemas productivos (Figura 8a).
La ordenación por estacionalidad mostró un marcado patrón de asociación en función
de la época (Figura 8b), en muestras de los ríos Comarca, El Descanso, Sonora y
Santa Bárbara, que se encuentran bajo la influencia del sistema productivo cultivos
mixtos (Figura 8c). De igual forma, muestras pertenecientes a los sistemas
productivos ganadería de carne y ganadería de leche presentaron tendencia a agrupase
entre sí.
56
100
100
a
b
80
60
60
40
40
20
Eje 2
Eje 2
80
0
-20
20
0
-20
-40
-40
-60
GanaderìadeLeche
-60
GanaderìadeCarne
Epoca
pocaSeca
eca
Epoca
pocade
deLluvia
Lluvia
Cultivosmixtos
-80
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
Eje1
-80
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
Eje1
500
banda 23
banda 24
banda 37
400
300
200
banda 14
banda 16
banda 51
banda 32
banda 27
banda 29
banda 35
banda 7
banda 40
banda 43
banda 12
banda2
banda1
banda 6
banda 38
banda 20
banda 17
banda 34
banda 45
banda4 banda 36
banda 11
banda 39
banda 28 banda3
banda 47
banda 25
banda 49
banda 42 banda 46
Axis 2
100
banda 18
0
banda 50
-100
banda 8
banda 9
banda 10
banda 44
banda 30
banda 21
banda 15
banda 33
banda 26
banda 19
banda 52
-200
banda 31
banda5
banda 13
banda 22
banda 48
-300
banda 41
-400
-400
-300
-200
-100
0
100
200
300
400
500
Axis 1
Figura 8. (a) Agrupación de los OTUs de acuerdo al sistema de producción. (b)
Agrupación de los datos de acuerdo al periodo. (C) agrupación de las fincas de
acuerdo al sistema productivo.
57
6.1
RELACIÓN
ENTRE
LAS
COMUNIDADES MICROBIANAS
VARIABLES
AMBIENTALES
Y
LAS
El análisis de ordenación ACC de las comunidades microbianas es mostrado en las
figuras 9 y 10. Las variables que explicaron significativamente la variabilidad de los
OTUs fueron fósforo total, nitrógeno total, sólidos totales y temperatura. El primer
eje del modelo explicó el 26.5% de la variabilidad, el segundo eje explicó el 14.1%.
Sin embargo, el primer eje fue el único que explico significativamente la varianza de
los datos, según el test de Monte Carlo con un p<0.05 (Tabla 12).
Tabla 12. Test de Monte Carlo. Correlación especies-ambiente. P<0,05 significativos
Eje Eigenvalues
1
2
0.17
0.10
% Varianza
explicada por
cada eje
26.5
14.1
% Varianza
acumulada
por cada eje
26.5
40.6
p
0.01
0.07
El primer eje se relacionó con sólidos totales (ST) y nitrógeno total (NTK), mientras
que el segundo se relacionó con temperatura y fósforo total (PT), (Figura 9). ST y
NTK, fueron las variables con una mayor explicación de la variabilidad de los
filogrupos (Tabla 13).
Tabla 13. Correlación de Pearson con los ejes de ordenación entre los OTUS y las
variables ambientales. (r>0.5).
Variable
Altitud
T. Agua
NH4
ST
NTK
PT
Eje 1
0.052
-0.236
-0.380
-0.621
-0.784
-0.333
58
Eje 2
-0.166
0.442
0.169
0.186
0.257
-0.423
La ordenación por sistemas productivos indicó que en el sistema productivo
ganadería de carne, la mayoría de los OTUs se relacionaron positivamente con las
variables fósforo total (PT), nitrógeno total (NTK), sólidos totales (ST) y
temperatura. Así mismo, OTUs presentes en el sistema productivo cultivo mixto
presentaron una tendencia a agrupares con estas variables. Sin embargo, otros OTUs
no presentaron relación alguna con ninguna de las variables ambientales. (Figura 9a).
Eje 2: 14.1
banda 24
banda 23
banda 37
banda 45
banda 14
banda 46
banda 36
banda 49
banda 31
banda2
banda 32
banda 51
Temp
banda 16
banda 29
banda
40
NTK
ST
banda 12
banda 43
banda1
banda4
banda 25
banda 34 banda 11
banda 17 banda 42banda 39
banda 35
banda 47
banda 27
PT
banda3
banda 13
banda 22
banda 28
banda 18
banda 50
banda 21
banda 52
banda5
banda 19
banda 44
banda 41
banda 33
banda 30
Eje 1: 26.5
Figura 9. Biplot que describe la ordenación de los OTUs (banda) obtenida con el
ACC realizado a todas las muestras.
59
2
2
b
a
1
Eje 2
Eje 2
1
0
0
-1
-1
EpocaSeca
EpocadeLluvia
GanaderìadeLeche
GanaderìadeCarne
CultivosMixtos
-2
-2
-2
-1
0
Eje1
1
-2
2
-1
0
Eje1
1
2
StaBa1
c
ElDes1
LaSon1
Temp
TieLa1
NTK
ST
ElDes2
TesBa1
LaCom1
LaSon2
LaCom2
ViXim2
Porve2
StaBa2
LaFlo1
TieLa2
PT
ViXim1
LaFlo2
Porve1
TesBa2
Figura 10. Ordenación obtenida con el ACC realizado para las comunidades
microbianas. (a) Ordenación de los OTUs según las variables para cada sistema de
producción. (b) Ordenación de los OTUs según las variables para cada periodo. c)
Ordenación de los ríos según las variables ambientales.
60
7. DISCUSIÓN
7.1 CALIDAD DEL AGUA Y CARACTERÍSTICAS DE LAS VARIABLES
FISICOQUÍMICAS E HIDROLÓGICAS EN LOS DIFERENTES SISTEMAS
PRODUCTIVOS, EN LA CUENCA DEL RÍO LA VIEJA
Las características fisicoquímicas, de los ríos estudiados se encontraron relacionadas
con los sistemas productivos predominantes. Sadeghian et al., 1999, en sus estudios
encontraron que las características químicas e hidrológicas y la calidad química del
agua a lo largo del cauce estaban asociadas al uso del suelo.
En general, los sistemas productivos en la cuenca del río La Vieja, se caracterizaron
por presentar calidad del agua entre regular y buena. Los sistemas productivos
ganadería de carne y cultivos mixtos, presentaron los mayores valores con respecto a
las concentraciones de las variables asociadas con actividades antrópicas como
nutrientes, sólidos disueltos y coliformes. De igual forma, presentaron los mayores
valores de turbiedad y bajas concentraciones de oxígeno disuelto en el agua,
indicando posiblemente mayor carga orgánica.
Junto con las modificaciones en la utilización de la tierra, las principales causas que
afectan la calidad de las aguas de los ríos estudiados, se relacionan con la
contaminación que deriva de los diferentes sistemas productivos. Estas formas de
contaminación obedecen al uso de insumos y fertilizantes en los suelos y a los
vertimientos de origen doméstico y desechos generados por las actividades
agropecuarias. Según Murgueitio (2003), cambios en el uso del suelo (de agrícola a
ganadero) en la ecoregión cafetera, prácticas inadecuadas de manejo y bajos niveles
de tecnificación generan alteraciones en el ecosistema acuático y en la calidad del
agua. Además, la ganadería de pastoreo sin árboles causa un impacto negativo,
principalmente por sedimentación de los cauces y aportes de materia orgánica,
61
nutrientes y patógenos que deterioran las corrientes de agua. Así mismo, estudios
realizados por Chará (2003), relacionan este estado con la falta de cobertura vegetal y
el libre acceso de los animales a los ríos, lo que genera mayores sólidos disueltos en
el agua y aumenta la concentración de coliformes fecales.
El sistema con mejor calidad del agua fue ganadería de leche, este sistema productivo
se caracterizó por presentar cobertura riparia y cercas vivas en los ríos que surten las
fincas. Además presentó los valores más altos en concentración de oxigeno, baja
turbidez y baja contaminación de los cuerpos de agua. La cobertura riparia genera
efectos positivos al regular el exceso de escorrentía (regula caudales), se retienen
nutrientes y contaminantes además de otras funciones como la protección del cauce y
taludes en zonas pendientes y orillas (Charà, 2003). El nivel de tecnificación
presentado por este sistema productivo y la completa cobertura riparia pueden indicar
que el tipo de manejo que se le da al sistema influye en la calidad del recurso hídrico.
Respecto a la época climática, en el periodo de lluvias se observó una tendencia en la
disminución de la concentración de sólidos totales, nitrógeno total y fosfatos en todos
los sistemas productivos, lo cual puede estar asociado con los altos caudales y la
velocidad de la corriente que favorecen el efecto de dilución y mezcla (Margalef,
1983).
7.2 ESTRUCTURA Y DINÁMICA DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS
A partir del análisis multivariado ACO (análisis de correspondencia canónica) y el
análisis de similitud de Jaccard, se observó un patrón de distribución definido de la
estructura de las comunidades microbianas en el sistema productivo cultivo mixtos.
Los ríos de este sistema presentaron una composición microbiana con un similitud del
80%. En este sistema productivo también se observaron los valores más altos de
diversidad de Shannon, riqueza y recuentos de abundancia bacteriana en época seca y
en época de lluvia. Resultados similares fueron evidenciados en estudios realizados
62
en ríos de los sistemas productivos en la ecorregiòn del eje cafetero donde las
diatomeas, peces y macrofitas mostraron una tendencia a presentar valores más altos
de diversidad en los sistemas sometidos a una mayor concentración de nutrientes,
mayor arrastre de sólidos y escasa cobertura vegetal arbórea o arbustiva (RiveraRondón et al., 2007). Estos resultados se pueden relacionar también con la hipótesis
del disturbio medio, donde las comunidades se adaptan a ciertas variaciones.
El establecimiento de especies o grupos de especies en el sistema cultivo mixto
posiblemente está relacionado con las condiciones morfométricas e hidrológicas que
presentaron estos cuerpos de agua. Urbach et al. (2001), plantearon que entre los
factores potenciales que influyen en la composición de la comunidad del
bacterioplancton en cuerpos de agua dulce se encuentra la ausencia de componente
ripario, que permite el transporte de microorganismos terrestres, materia orgánica
terrestre y nutrientes al cuerpo de agua. Algunos de estos factores se relacionan con
los encontrados en los ríos asociados al sistema cultivo mixtos, donde se presentó una
mayor concentración de nutrientes debido en gran medida a la utilización de
fertilizantes para los cultivos y a un mayor arrastre de sólidos por la escasa cobertura
vegetal favoreciendo la disponibilidad de materia orgánica y nutrientes a los cuerpos
de
agua.
Estas
características
ambientales
posiblemente
favorecieron
el
establecimiento de comunidades microbianas similares que pueden utilizar el mismo
recurso y estar adaptadas a estas condiciones. Además, algunos autores sugieren que
los nutrientes inorgánicos presentan un impacto en la dinámica de la comunidades
bacterianas en ecosistemas acuáticos (Schafer et al., 2000; Rejas et al., 2005; Rubin
& Leff, 2007).
Backermans & Madsen (2002), afirman que la composición de las comunidades
microbianas reflejan las características físicas, químicas, geológicas y biológicas de
sus hábitats. Así mismo, Lindstrom et al. (2001), argumentan que las características
del medio ambiente en sistemas lóticos influyen en los organismos y por lo tanto
seleccionan aquellos taxones que puedan sobrevivir y multiplicarse de manera más
63
eficiente. Sin embargo, pueden existir otros factores ambientales tales como
velocidad, temperatura, condiciones de nutrientes, disponibilidad del sustrato,
biomasa del fitoplanton entre otros factores (Sekiguchi, et al., 2002; Hahn, 2006;
Beier, et al., 2008), los cuales pueden tener influencia en la estructura de las
comunidades microbianas que no fueron evaluadas en este estudio. La alta
heterogeneidad temporal y espacial que tienen los ecosistemas lóticos pueden
potencialmente controlar diferentes aspectos de las comunidades bacterianas las
cuales son sensibles a variaciones ambientales, pero estas a su vez, se adaptan y
responden a las condiciones naturales.
También se observó un patrón definido de las comunidades microbianas de los
diferentes sistemas productivos con base a la estacionalidad climática, reflejando la
influencia sobre estas comunidades. De igual forma, las variaciones de los índices en
algunos sistemas productivos en relación a la época, reflejan la dinámica de las
comunidades bacterianas influenciadas probablemente por variaciones ambientales en
los sistemas. Se puede sugerir que las condiciones ambientales a las que se
encuentran sometidos los diferentes sistemas productivos pueden influir en la
diversidad y composición de las comunidades bacterianas, reflejándose en los índices
de diversidad calculados. Es así como una amplia gama de factores como los
nutrientes, química del agua y la estacionalidad climática puede enmascarar el efecto
del uso suelo.
Por otro lado, los ríos Porvenir, Floresta y Tierra Labrantía, asociados al sistema
productivo ganadería de carne y los ríos Villa Ximena y Tesalia baja, asociados al
sistema productivo ganadería de leche, mostraron una asociación de OTUs
compartidos. La similitud observada en estas muestras estuvo relacionada con la
presencia de OTUs y también ausencia de OTUs en las muestras de estos sistemas
productivos. Diferentes investigaciones señalan que existen poblaciones microbianas
cosmopolitas en sistemas de aguas dulces, que se pueden adaptar a diferentes
condiciones ambientales propias de estos ecosistemas acuáticos (Zwart, et al., 2002;
64
Crump & Hobbie, 2005). Zwart et al., (2002), encontró una marcada relación
similitud entre secuencias de rADN recuperadas de lagos diferentes, por lo que es
posible encontrar comunidades similares en sistemas de aguas dulces con condiciones
ambientales diferentes y que pueden ser relativamente cercanas filogenéticamente
(Glockner et al., 2000; Zwart et al., 2002).
Las bandas secuenciadas en este estudio, estuvieron relacionadas con grupos
filogenéticos típicos de aguas dulces correspondiendo con β- Proteobacteria. La alta
detección de filotipos de β- Proteobacteria, sugiere que ellos constituyen un
importante componente de la comunidad bacteriana en los ríos de la cuenca del río La
Vieja. Similares resultados han sido bien encontrados en muchos estudios de
comunidades bacterianas en ambientes de aguas dulces (Araya et al., 2003; Wobus et
al., 2003; Kirchman, et al., 2004; Beier et al., 2008). Secuencias afiliadas a la
subclase β- Proteobacteria, fueron frecuentemente recuperadas de sedimentos de
aguas dulces (Spring et al., 2000) Este grupo de bacterias típicas de aguas dulces
tiene una distribución cosmopolita, ellas aparecen incluso en hábitats localizados en
diferentes zonas climáticas que consecuentemente difieren en sus condiciones
ambientales pudiéndose adaptar a cambios y a nuevas condiciones ambientales
(Winter et al., 2006). Así mismo, varios autores han atribuido la presencia de este
grupo bacteriano en sistemas acuáticos, por su alta afinidad con los nutrientes y
participar en la degradación de contaminantes (Brummer, et al., 2000; Rubin & Leff,
2007). Wobus et al. (2003), indicaron, que el aporte de materia orgánica dendrítica
posiblemente favoreció el crecimiento y la actividad de miembros del la subclase βProteobacteria, en muestras de sedimentos de ríos.
Por otro lado, la presencia de grupos bacterianos similares a secuencias reportadas en
suelos es consistente con lo reportado en otros estudios (Hullar et al., 2005; Beier et
al., 2008). Spring et al. (2000), afirman que la composición de las comunidades
bacterianas en sedimentos de aguas dulces pueden en gran medida estar influenciadas
por interacciones entre el entorno del hábitat acuático y el terrestre. Crump et al.
65
(2005), reportaron la presencia de varios filotipos relacionados con bacterias de
suelos, e indicó la potencial importancia de organismos alòctonos en la diversidad del
río. De igual forma, estudios de análisis comparativos de secuencias del gen 16S
rRNA sugieren que los microorganismos residentes en sistemas lóticos están
compuesto de una mezcla de poblaciones provisionalmente atribuibles a ambientes
acuáticos y terrestres. En los ríos, el carbón y la energía que entra es derivada de
plantas en el ambiente terrestre, por esto seria razonable sugerir que las especies
derivadas del suelo tienen capacidades metabólicas necesarias para degradar el
carbon orgánico en el río. La incorporación de grupos bacterianos derivados del suelo
puede proveer un vínculo biológico entre el ecosistema acuático y el terrestre, que
complementado con varios factores físicos y químicos son importantes en la
estructura y función de estos ecosistemas acuáticos (Hullar et al., 2005).
Además de las secuencias obtenidas del dominio Bacteria, se obtuvieron secuencias
representantes del dominio Archaea, las cuales presentaron similitud con secuencias
de organismos no cultivables en muestras ambientales. Sin embargo, en las muestras
evaluadas para este dominio, se observó una menor riqueza de OTUs comparada con
el dominio Bacteria. Es poco lo que se conoce respecto al dominio Archaea en aguas
dulces y muy pocos estudios se han realizado sobre diversidad y abundancia de este
dominio en estos hábitats acuáticos (Ochsenreiter et al., 2003). En esta investigación,
la mayoría de las muestras no amplificaron en la PCR, inconvenientes similares se
registraron en estudios por Ochsenreiter et al. (2003). Los problemas en los procesos
de amplificación posiblemente estén relacionados con la baja especificidad de los
primers utilizados, o debido a la presencia de agentes contaminantes en el extracto de
DNA cuya concentración alcanza niveles que inhiben o interfieren con la reacción.
7.3
RELACIÓN
ENTRE
LAS
VARIABLES
AMBIENTALES
Y
LAS
COMUNIDADES MICROBIANAS PRESENTES EN LOS RÍOS ASOCIADOS A
LOS DIFERENTES SISTEMAS PRODUCTIVOS, EN LA CUENCA DEL RÍO LA
VIEJA
66
Según el análisis de correspondencia canónica (ACC), las variables que mejor
explicaron la distribución de microorganismos en los ríos de los sistemas productivos
estudiados, fueron NTK, ST, PT y temperatura. Los nutrientes se asocian con el uso
del suelo y el manejo del recurso hídrico en cada sistema productivo. La importancia
de los nutrientes en las comunidades microbianas está relacionada con el papel que
cumplen en la transformación y mineralización de los nutrientes, así como también
para mantener el flujo de energía en las redes alimenticias de los ecosistemas
acuáticos. Relaciones entre los nutrientes y los microorganismos han sido
reconocidas en diferentes ecosistemas acuáticos. Estos resultados concuerdan con los
reportados por otros estudios que indican que las fuentes abióticas como los
nutrientes son los principales factores que determinan la estructura de las
comunidades en sistemas lòticos (Lavrentyev, et al., 1998; Kent, et al, 2004; Rubin &
Leff, 2007; Beier, et al., 2008). Van der Gucht et al. (2005), reportaron, que la
composición taxonómica del bacterioplanton, en el lago Blakaart puede estar
influenciada con altos valores de materia suspendida y altas concentraciones de
nitrógeno disuelto. De igual forma, Rubin & Leff, 2007, reportaron que ciertos
grupos bacterianos (Cytophaga-Flavobacterium) y el recuento total bacteriano
tuvieron un positiva correlación con concentraciones de nitratos y nitritos. Así
mismo, ha sido reportado, Simek y colaboradores (2006), encontraron una relación
significativa, entre la disponibilidad de fósforo (P), y el crecimiento de diferentes
grupos taxonómicos de bacterias en aguas dulces. Otros estudios han mostrado que el
crecimiento bacterial puede ser estimulado por adición de fósforo inorgánico, o
nitrógeno (N) inorgánico, ya sea por si solos, o en combinación con fósforo
inorgánico y carbón orgánico (Vrede et al., 1999; Castillo, et al., 2003).
Los nutrientes inorgánicos como nitrato, amonio o fosfatos son fuente importante
para el crecimiento bacteriano (Castillo et al., 2003; Rejas et al., 2005; Freese et al.,
2007). La disponibilidad de nutrientes inorgánicos en ríos de la cuenca La Vieja,
están asociados, en su mayoría a los efectos generados por el uso agrícola de los
suelos. Además, de la eliminación parcial o total de la cobertura riparia que causa el
67
arrastre de nutrientes (nitratos, ortofosfatos, fósforo total y abonos) y sedimentos.
Estas características se presentaron principalmente en los sistemas productivos
ganadería de carne y cultivos mixtos, en los cuales la distribución de las comunidades
microbianas estuvo asociada con los nutrientes.
La temperatura es otro factor ambiental considerado por varios autores como
importante en la distribución de comunidades bacterianas en ecosistemas acuáticos
(Hahn, 2006; Hullar et al., 2005). Lindstrom et al. (2005), reportaron, que la
temperatura fue una de las variables ambientales que explicaron la variación en la
distribución de grupos bacterianos entre lagos. De igual forma, Hullar y
colaboradores (2005), evidenciaron la correlación de la temperatura con cambios en
la estructura de la comunidad en sedimentos de ríos.
68
8. CONCLUSIONES
Los ríos pertenecientes a los sistemas productivos ganadería de carne y cultivos
mixtos presentaron un mayor impacto sobre la calidad del agua en la cuenca del rio la
Vieja. Estos sistemas se caracterizan por presentar mayores concentraciones de
nutrientes y menores concentraciones de oxígeno.
La eliminación parcial o total de la cobertura riparia, el uso de agroquímicos y el
vertimiento de aguas residual a los cuerpos de agua, tienen un efecto directo sobre la
calidad del recurso hídrico en los ríos de los sistemas productivos ganadería de carne
y cultivos mixtos. A diferencia de sistema productivo ganadería de leche, el cual
presentó la mejor calidad del agua, debido en gran medida a las buenas técnicas de
manejo como el mantenimiento de la cobertura vegetal en los bordes de los ríos y la
utilización de sistemas para el tratamiento del agua residual.
Existe un patrón definido de las comunidades microbianas de los diferentes sistemas
productivos con base a la estacionalidad climática, reflejando la influencia sobre estas
comunidades. Las condiciones ambientales e hidrológicas a las que se encuentran
sometidos los diferentes sistemas productivos de estudio, pueden influir en la
estructura y composición de las comunidades bacterianas. De esta manera, una amplia
gama de factores como los nutrientes, química del agua y la estacionalidad climática
pudieron enmascarar el efecto del uso suelo.
Las comunidades microbianas presentes en los ríos asociados al sistema productivo
cultivo mixto, mostraron en general una diversidad mas alta en comparación con los
demás sistemas, explicado posiblemente por la concentración de nutrientes
incrementado en gran medida por la utilización de fertilizantes para los cultivos y a
un mayor arrastre de sólidos por la escasa cobertura vegetal, lo que permite una
mayor disponibilidad de materia orgánica y nutrientes a los cuerpos de agua. Lo cual
69
indica que posiblemente las condiciones físicas y ambientales del sistema productivo
favorecieron el establecimiento y diversidad de estas comunidades.
Las variables que principalmente explicaron la variabilidad de las especies en los ríos
estudiados fueron, NTK, ST, PT y temperatura. Estas variables están relacionadas con
los impactos de los sistemas productivos.
Los ríos pertenecientes a los diferentes sistemas productivos se caracterizaron por
presentar comunidades microbianas pertenecientes a la subclase B-Proteobacteria,
representantes importantes en los sistemas de aguas dulces.
70
9. RECOMENDACIONES
Para estudios posteriores, se recomienda realizar más muestreos con el fin de
monitorear las comunidades microbianas a lo largo del tiempo y encontrar un mayor
número de correlaciones entre estas comunidades y su ambiente.
Se recomienda realizar estudios posteriores en donde se tengan en cuenta otras
variables que puedan influir en la composición de las comunidades microbianas.
Para estudios posteriores se recomienda el uso de primers específicos, para estudiar la
estructura de las comunidades microbianas seria importante para determinar que
grupos funcionales prevalecen en los ríos y determinar que procesos ecológicos están
llevando a cabo en los hábitats que ocupan.
71
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ANEXOS
Anexo 1. Valores medios mensuales obtenidos de series históricas en la estación
Maracay, Departamento Quindío, Municipio Quimbaya perteneciente a la cuenca del
río La Vieja. Cenicafe
88
Anexo 2. Encuesta a dueños y/o administradores de las fincas asociadas a los
sistemas productivos en la cuenca del río La Vieja
Parámetros
Area (ha)
Tiempo del sistema
productivo (años)
Cuenca del río la Vieja
Ganadería
Ganadería
Carne
Leche
33
25
Cultivos
Mixtos
40
4
15
22
7
10
88
13
44
4
4
3
Compost, urea,
Gallinaza, NPK
Potreros
NPK
NPK15-15-15
Área de cultivo
25-50
0
0
Cultivos
Plátano, cítricos
Uso de herbicida
No utiliza
No utiliza
Uso de
plaguicida/plagas
Hormiga arriera,
mojojoy y palomilla
No utiliza
Tratamiento de agua
residual
No utiliza
Habitantes (N° máximo)
Cabezas de ganado (N°)
Animales (N°)
Área de bosque natural
(ha)
Uso/Tipo de abono
pastos
Protección contra
erosión
57
87
1
No utiliza
89
0
Vegetación
natural
Pozo séptico
0
Café diferentes
variedades y
plátano
Run up, Socar,
Glifosol o estelar
Gota, Broca,
minador, picudo
Cultivos
protectores
Pozo séptico
Anexo 3. Correlación entre las variables ambientales y los ejes explicativos en el
análisis de Componentes principales (ACP).
Variables ambientales
Eje 1
Eje 2
Altitud
-0.57
-0.4
Temperatura
0.53
0.34
Oxigeno
-0.71
-0.35
Conductividad
0.88
0.25
Velocidad
-0.42
0.65
Ortofosfato (PO4)
Turbidez
0.85
0.50
-0.015
Sólidos Totales
0.72
0.04
Alcalinidad
0.86
0.23
Nitrógeno Total
0.37
-0.56
Fósforo Total
0.81
0.05
90
0.17

CARACTERIZACION DE LA ESTRUCTURA Y DINAMICA DE

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