* IBD Plus

*® IBD Plus
Kit de diagnóstico
Uso veterinario
Kit de diagnóstico para la detección de anticuerpos contra el virus de la
Enfermedad Infecciosa de la Bolsa de Fabricio (Gumboro) (IBD) que tiene una
excelente correlación con la prueba de virus neutralización y una capacidad de
detectar respuesta de anticuerpos contra la vacuna recombinante vectorizada
VP2.
Tipo de Prueba
ELISA
Detecta
Anticuerpos el Virus de la Enfermedad
Infecciosa de la Bolsa de Fabricio
(Gumboro).
Beneficios
• Altamente específico para la detección
de anticuerpos contra el virus de la
enfermedad infecciosa de Gumboro (IBD)
incluyendo a cepas clásicas y variantes.
• Detecta la respuesta de anticuerpos contra
IBD inducida por una vacuna vectorizada
con VP2 recombinante.
• Excelente correlación con la prueba de
virus de neutralización (VN) para IBD.
• Excelente coeficiente de variación (CV)
entre pozo y pozo y entre placa y placa que
demuestra una reproducibilidad constante
con diferentes lotes a través del tiempo.
• Autorizado por el Departamento de
Agricultura de los EUA (USDA).
• Vida de anaquel prolongada de 24 meses
para un fácil manejo de inventarios.
Tipo de muestra
Suero
No. de Pruebas por kit
480 pruebas (5 platos con 96 pozos)
Almacenamiento
Refrigerar (2° a 7° C)
Contenido del kit
• 5 platos, recubiertos con antígeno
de IBD, con 96 pozos.
• 1 frasco de solución búfer de 200 mL.
• 1 frasco de 100 mL con Sustrato de
Peróxido de Hidrógeno ABTS.
• 1 frasco de 25 mL con Solución de Paro.
• 1 frasco de 100 mL con Solución para
Lavado.
• 1 vial con Solución de Conjugado de
Peroxidasa IgG (H+L) de cabra anti-pollo.
• 1 vial de suero para Control Positivo
para IBD
• 1 vial de suero para Control Normal.
• Instrucciones de uso.
Tiempo de respuesta
Aproximadamente 2 horas
1/4
FT ProFLOK IBD Plus Rev ER (3 Feb´14)-Final.indd 1
14/03/14 09:04
*® IBD Plus
Preparación de Diluciones
OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS
Para un monitoreo serológico de rutina de las parvadas, se
sugiere obtener al menos 30 (o más) sueros por parvada al azar
a intervalos estándar (cada cuatro semanas). Es necesario aplicar
procedimientos apropiados para la obtención de las muestras, la
cosecha del suero y el almacenamiento de las muestras de suero
(4°C durante un máximo de 4 días o -20°C durante periodos
más prolongados) para que los resultados de las pruebas sean
confiables.
PROCEDIMIENTO DE DILUCIÓN DE LAS MUESTRAS
Diluya las muestras de suero con dilución búfer en una placa
de microtitulación de 96 pozos no recubierta que esté limpia.
Distribuya las muestras y los controles como se indica en la
Figura 1.
Figura 1
PREPARACIÓN DE LA PLACA DE DILUCIÓN DE SUEROS
a) Añada 300 μl de dilución búfer a cada pozo de una placa
de microtitulación de 96 pozos no recubierta. Esta placa es
denominada la placa de dilución de sueros.
b) Añada 6 μl de suero desconocido por pozo como se indica en
la Figura 1 (produciendo una dilución 1:50). Empiece con el pozo
A4 y termine con el pozo H9 (avanzando de izquierda a derecha
fila por fila). Por ejemplo, los pozos 1-30 contienen los sueros
diluidos de la parvada 1, los pozos 31-60 contienen los sueros
diluidos de la parvada 2, etc.
c) Añada 6 μl de Suero de Control Normal (produciendo una
dilución 1:50) a los pozos A2, H10 y H12.
d) Aspire y retire todo líquido que haya en los pozos A1, A3 y H11
de la placa de dilución.
e) Permita que todos los sueros diluidos se equilibren en la
dilución búfer durante 5 minutos antes de la transferencia a una
placa para ELISA recubierta con antígeno de IBD.
f) El suero diluido deberá ser examinado dentro de un periodo
de 24 horas.
Este formato de dilución proporciona cantidades adecuadas de
las muestras de suero diluidas para llevar a cabo cuatro pruebas
ELISA ProFLOK® adicionales (es decir, pruebas para REO, NDV,
IBV e LT) utilizando la misma placa de dilución de sueros.
Preparación del control positivo para IBD
Se suministra un Suero de Control Positivo para IBD con este
kit. Diluya el volumen apropiado de Suero de Control Positivo
para IBD con dilución búfer (produciendo una dilución 1:50) en
un tubo de ensayo de vidrio limpio. Por ejemplo, diluya 6 μl de
Suero de Control Positivo en 300 μl de dilución de búfer. Mezcle
bien. Se necesitan 150 μl de Suero de Control Positivo para IBD
diluido por cada placa para ELISA.
Preparación de la solución de conjugado
El IgG anti-pollo (H+L) conjugado con peroxidasa de rábano
picante se suministra en estabilizador HRP. Diluya 100 μl de
conjugado madre en 10 ml de dilución búfer (dilución 1:100).
Mezcle bien. Esta preparación de 10 ml proporcionará suficiente
conjugado para una placa para ELISA de 96 pozos.
Preparación de la solución de lavado 1X
Diluya 20 ml de solución de lavado concentrada en 380 ml de agua
de grado de laboratorio (destilada o sujeta a ósmosis inversa)
(dilución 1:20). Mezcle bien. Se necesitan aproximadamente 400
ml de solución de lavado diluida para cada placa para ELISA de
96 pozos.
Preparación de la solución de sustrato
La solución de sustrato está lista para usarse. Cada placa requerirá
aproximadamente 10 ml de solución de sustrato. Para los mejores
resultados, se deberá permitir que la solución de sustrato se
equilibre alcanzando la temperatura ambiente antes de su uso.
Preparación de la solución de paro 1X
Diluya 2.5 ml de solución de paro concentrada en 10 ml de agua
de grado de laboratorio (destilada o sujeta a ósmosis inversa)
(dilución 1:5). Mezcle bien. Se necesitan aproximadamente 12.5
ml de solución de paro diluida para cada placa para ELISA de 96
pozos.
NOTA: El almacenamiento de la solución de paro 5X a
temperaturas de refrigeración puede causar que se forme
un sólido de color blanco. Esto no afecta el desempeño del
producto. Entibie la solución hasta que alcance la temperatura
ambiente o una temperatura de 37°C para disolver el sólido antes
de usar la solución.
Procedimiento
PREPARACIÓN DE LA PLACA DE PRUEBA
a) Retire una placa de prueba recubierta con antígeno de IBD
de la bolsa protectora y etiquétela en concordancia con la
identificación de la placa de dilución.
b) Añada 50 μl de dilución búfer a todos los pozos de la placa
de prueba.
c) Añada 50 μl de Suero de Control Positivo para IBD diluido a los
pozos A1, A3 y H11. Deseche la punta de la pipeta.
d) Utilizando una pipeta de 8 ó 12 canales, transfiera 50 μl de
cada una de las muestras de suero diluidas y de las muestras
de Suero de Control Normal de la placa de dilución a los pozos
correspondientes de la placa de prueba recubierta con IBD.
Deseche las puntas de pipeta después de la transferencia de cada
fila de muestras. La transferencia de las muestras a la placa para
ELISA deberá efectuarse tan rápidamente como ello sea posible.
e) Incube la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente.
2/4
FT ProFLOK IBD Plus Rev ER (3 Feb´14)-Final.indd 2
14/03/14 09:04
*® IBD Plus
Kit de diagnóstico
Uso veterinario
PROCEDIMIENTO DE LAVADO
f) Dando golpecitos a la placa, vacíe el líquido de los pozos a
un recipiente apropiado que contenga cloro u otro agente para
descontaminación.
g) Utilizando una pipeta de 8 ó 12 canales (o un dispositivo
de lavado automático comparable), llene cada pozo con
aproximadamente 300 μl de solución de lavado. Deje que
la solución permanezca en los pozos durante 3 minutos y a
continuación deseche el contenido de los pozos vaciándolo a un
contenedor de desechos apropiado (el contenedor de desechos
deberá contener solución de cloro). Coloque la placa boca abajo y
déle golpecitos para asegurarse de eliminar todo líquido residual.
Repita el procedimiento de lavado 2 veces más.
NOTA: El procedimiento de lavado es un paso crítico en todo
procedimiento de ELISA. Siga los pasos anteriores de la manera
señalada.
pozos A2, H10 y H12. Registre ambos promedios.
LA SOLUCIÓN DE CONJUGADO DE PEROXIDASA lgG (H+L) DE
CABRA ANTI-POLLO SE SUMINISTRA EN EL ESTABILIZADOR
HRP.
h) Usando una pipeta de 8 ó 12 canales (o un dispositivo de
transferencia), añada 100 μl de conjugado diluido (preparado de
la manera antes descrita) a cada pozo de prueba. Deseche las
puntas de pipeta.
i) Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.
j) Lave de la manera indicada anteriormente en los pasos f y g.
k) Usando una pipeta de 8 ó 12 canales (o un dispositivo de
transferencia), añada 100 μl de solución de sustrato a cada pozo
de prueba. Deseche las puntas de pipeta.
l) Incube durante 15 minutos a temperatura ambiente
m) Usando una pipeta de 8 ó 12 canales (o un dispositivo
de transferencia), añada 100 μl de solución de paro diluida
(preparada de la manera antes descrita) a cada pozo de prueba.
n) Permita que se disipen las burbujas antes de leer la placa.
LOG10 TÍTULO = (1.172 X LOG10 SP) + 3.614
PROCESAMIENTO MANUAL DE LOS DATOS
a) Lea la placa utilizando un lector de placas para ELISA a 405-410
nm. Asegúrese de ajustar a cero el lector de la manera indicada.
b) Calcule la absorbancia promedio del Suero de Control Positivo
(densidad óptica [OD]) utilizando los valores de absorbancia
de los pozos A1, A3 y H11. Calcule la absorbancia promedio del
Suero de Control Normal utilizando los valores obtenidos para los
c) Reste la absorbancia promedio del control normal a la
absorbancia promedio del control positivo. La diferencia es el
Control Positivo Corregido.
d) Calcule un cociente muestra/control positivo (Sp) restando
la absorbancia promedio del control normal a la absorbancia de
cada muestra. La diferencia es dividida entre el Control Positivo
Corregido.
Utilice la siguiente ecuación:
SP = (ABS MUESTRA) - (ABS PROMEDIO CONTROL NORMAL)
(ABSORBANCIA CORREGIDA DEL CONTROL POSITIVO)
e) El título de ELISA para IBD puede calcularse usando la siguiente
ecuación sugerida:
TÍTULO = ANTILOG DE LOG10 TÍTULO
Ejemplo:
1. Ejemplo de absorbancia de controles positivos:
0.585, 0.610, 0.590
Promedio = (0.585 + 0.610 + 0.590) / 3 = 0.595
2. Ejemplo de controles normales:
0.110, 0.102, 0.112
Promedio = (0.110 + 0.102 + 0.112) / 3 = 0.108
3. Control Positivo Corregido:
(0.595) - (0.108) = 0.487
4. Ejemplo de cálculo del valor SP:
Absorbancia de la muestra = 0.560
(0.560 - 0.108) / 0.487 = 0.928
5. Ejemplo de cálculo del título utilizando el valor SP del punto
anterior:
LOG10 TÍTULO = 1.172 X (LOG10 0.928) + 3.614
TÍTULO = ANTILOG 3.57
TÍTULO = 3767
Resultados
Valores de los controles del ensayo:
Los resultados obtenidos en el ensayo ELISA para IBD son válidos
cuando el valor promedio de OD del Suero de Control Normal
está por debajo de 0.250 y el valor del Control Positivo Corregido
cae dentro de un rango de 0.250 a 0.900. Si cualquiera de
estos valores está fuera del rango, se deberá considerar que los
resultados de la prueba para IBD no son válidos y se deberá volver
a examinar las muestras. Las muestras con un valor SP ≤0.180
recibirán un valor de título de 0 y se considerarán negativas para
anticuerpo contra IBD.
Bajo condiciones óptimas* se deberá buscar cumplir con los
rangos de valores de OD sugeridos de 0.100 a 0.160 para el Suero
de Control Normal para IBD y de 0.400 a 0.850 para el Suero
de Control Positivo para IBD para asegurar la obtención de los
resultados más uniformes en la prueba de laboratorio. Nótese
que el que una placa de prueba presente valores de OD fuera de
los rangos de OD arriba sugeridos no significa que la prueba no
sea válida.
*Las condiciones óptimas se dan a temperatura ambiente [21°
a 24°C]. Puede que las temperaturas ambiente superiores a las
señaladas deriven en valores de OD ligeramente más elevados.
3/4
FT ProFLOK IBD Plus Rev ER (3 Feb´14)-Final.indd 3
14/03/14 09:04
*® IBD Plus
Resultados (cont.)
Interpretación de los resultados
Los valores de títulos de ELISA para IBD obtenidos representan
una comparación entre el nivel de anticuerpos contra IBD
presente en cada muestra de campo de suero de pollo examinada
y los sueros de control (normal y positivo) del kit ProFLOK® IBD.
Por lo tanto, es importante determinar en primer lugar que los
valores obtenidos para los sueros de control (normal y positivo)
del ensayo ELISA para IBD sean válidos de la manera detallada
en la sección “Valores de los controles del ensayo” de este folleto
antes de interpretar los resultados de ProFLOK® IBD.
Un título de ELISA para IBD de “0” representa una muestra de
suero de pollo que contiene un nivel extremadamente bajo a
insignificante de anticuerpos contra IBD por comparación con
los sueros de control (normal y positivo) del kit ProFLOK® IBD.
Un valor de título de ELISA para IBD por encima de “0” indica
exclusivamente que una muestra de suero de pollo contiene
un nivel de anticuerpos contra IBD que es significativo y es
detectable en un ensayo ELISA por comparación con los sueros
de control (normal y positivo) del kit ProFLOK® IBD. Sin embargo,
tales títulos no implican ni garantizan “protección” ni brindan una
distinción serológica entre una respuesta a la vacuna contra IBD
y una infección de campo por IBD.
Las prácticas óptimas de administración de la vacuna contra IBD y
los valores objetivo de títulos para IBD de la parvada considerados
valores “de protección” deberán ser determinados por cada
usuario del kit de ProFLOK® IBD comparando los resultados del kit
de ProFLOK® IBD (es decir, los valores del coeficiente de variación
[%CV] y del título medio geométrico [GMT]) obtenidos para la
parvada antes y después de la vacunación con los parámetros
de desempeño de la parvada (morbilidad, mortalidad, ganancia
de peso corporal de la parvada o uniformidad de peso de la
parvada) a través del tiempo.
Instrucciones/Advertencias
Se suministran indicadores de humedad junto con cada placa. Si cualquiera de los indicadores
exhibe un color rosa, puede que la integridad de la placa esté en riesgo por alguna razón;
descontamine la placa (lávela con solución de cloro) y deséchela.
Maneje todos los reactivos y las muestras como material biológico peligroso.
Evite el contacto de todos los reactivos con la piel y con los ojos. De presentarse
exposición, enjuague inmediatamente las áreas afectadas con agua fría.
INSTRUCCIONES
La solución de lavado, los sueros de control, las placas de prueba, las muestras de
campo y todos los demás reactivos del kit de prueba deberán ser descontaminados
en forma apropiada con cloro u otro agente oxidante fuerte antes de ser desechados.
Los mejores resultados se obtienen cuando se siguen los protocolos que se describen usando
técnicas de laboratorio apropiadas y seguras.
No utilice este kit después de la fecha de caducidad.
Tenga especial precaución de no contaminar los reactivos de la prueba con suero o con
agentes bacterianos.
Jamás pipetee con la boca.
Solo para uso veterinario.
Permita que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiente antes de empezar.
ProFLOK® IBD Plus es una marca propiedad de Zoetis Inc., o alguna subsidiaria.
FT ProFLOK IBD Plus Rev ER (3 Feb´14)-Final.indd 4
www.kitsdediagnosticozoetis.com
4/4
14/03/14 09:04