E-192 - Instituto Politécnico Nacional

Transcripción

Índice de Trabajos en Extenso
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Del 4 al 7 de abril del 2006 en la ciudad de Morelia Mich. México. DETERMINACIÓN DE AUTOFLUORESCENCIA EN CÉLULAS CANCEROSAS
FIJADAS
Jiménez Betanzos Ana María1., García Gómez Fanny Yocelin1, Rosas Flores Lucrecia1,
Ronquillo Arturo 2, De la Rosa Vázquez José Manuel2 y Ramón Gallegos Eva1
1
Lab. de Citopatología Ambiental. Depto. de Morfología Escuela Nacional de Ciencias
Biológicas, IPN. Carpio y Plan de Ayala S/N. Col. Sto. Tomás. México, D.F. CP 11340.
e-mail: [email protected], [email protected]
2
Escuela Superior de Ingeniería Mecánica y Eléctrica. Unidad Profesional Adolfo López Mateos.
Av. Instituto Politécnico Nacional S/N.
Este trabajo fue financiado por el proyecto CGPI No.20040129
RFL es becaria CONACYT, DRJM y RGE son becarios EDI y SNI.
INTRODUCCIÓN
Actualmente en México, el cáncer cervicouterino (CaCu) es un problema de salud
pública que ocupa el primer lugar en frecuencia de todas las neoplasias malignas y en
el 99.7% de éstos, está presente el virus de papiloma humano (VPH) (1). Los tipos de
VPH asociados con esta enfermedad y que se consideran de alto riesgo son: 16, 18,
31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 66, 68, 70 y 74.
Los métodos de diagnóstico disponibles para la detección del virus se clasifican en:
Morfológicos (citología, colposcopía, histopatología e incluso microscopia),
Inmunohistoquímicos (detección del antígeno viral en la lesión) y aquellos que se basan
en la detección del DNA viral mediante hibridación o amplificación.
No existe el método ideal para el diagnóstico de una infección por VPH y su validez
depende de la forma de infección (2). El método debería responder a las cualidades de
ser rápido, económico, sensible, específico, no invasivo y capaz de tipificar el VPH en la
lesión (3).
Debido a esto, en el presente proyecto se pretende implementar un sistema basado en
luz láser que permita estudiar procesos de interacción luz-tejido, debido a la
especificidad, sensibilidad y rapidez, mediante la determinación del espectro de
fluorescencia, ésta ultima se define como un proceso de emisión que ocurre cuando
una molécula es irradiada y pasa del nivel fundamental S0 a un estado de excitación T1,
S1 o S2. Las especies excitadas se relajan al estado basal S0, liberando el exceso de
energía como fotones produciendo, cuando pasan del nivel S1 a S0 fluorescencia y
cuando pasan de T1 a So fosforescencia. Una molécula puede ser excitada por
diferentes tipos de laseres, cada uno con una longitud de onda característica (4). En
este trabajo se utilizó un láser de N2 que emite a una longitud de onda de 337.1 nm
El estudio de fluorescencia permite por lo tanto identificar la composición de materiales,
ya que cada uno posee un espectro de absorción y emisión especifico.
En este trabajo se analizó si la fluorescencia de diferentes líneas celulares teñidas y no
teñidas por las técnicas de Hematoxilina-Eosina y la de Papanicolaou, permite
distinguirlas.
COLEGIO MEXICANO DE INGENIEROS BIOQUÍMICOS, A. C.
Mar del Norte No. 5, Col. San Álvaro Azcapotzalco C.P. 02090, México, D. F.
Tel. y Fax: (01 55) 5623 3088 e-mail: [email protected] y [email protected]
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Del 4 al 7 de abril del 2006 en la ciudad de Morelia Mich. México. OBJETIVO
Implementar un sistema sensible basado en luz láser que permita estudiar procesos de
interacción luz-tejido debido a la emisión de fluorescencia para el apoyo al diagnóstico
del virus del papiloma humano.
MATERIALES Y MÉTODOS
Cultivo celular y preparación de laminillas.
Se cultivaron tres líneas celulares, dos de cáncer cervicouterino y positivas al VPH
(HeLa y CaLo) y una línea no cancerosa y no infectada por el VPH (McCoy), para
mantenerlas se utilizó una mezcla de Medio Eagle Dulbecco/F12 con una concentración
de suero fetal bovino al 7%.
Al obtener una monocapa al 100% de confluencia, las células se disgregaron con EDTA
al 4mM y se sembraron 300,000 células por pozo. Se utilizaron microplacas de 24
pozos a los que previamente se les colocaron cubreobjetos estériles de 1 cm2. Las
microplacas se incubaron a 37ºC en una atmósfera húmeda con C02 al 5%. Al término
del tiempo de incubación se eliminó el medio de cultivo y se fijaron las células con
etanol al 96%.
Los cubreobjetos con células fijadas, con excepción de las laminillas testigo, se tiñeron
con las técnicas de Hematoxilina-Eosina (técnica histológica) y Papanicolaou (técnica
citológica) de acuerdo al siguiente protocolo (5): en la técnica de Papanicolaou se
sumergieron las laminillas en alcohol al 96% (1 min), alcohol al 70% (1 min), alcohol al
50% (1 min), agua destilada (3 min), hematoxilina (4 min), se realizó un lavado con
agua corriente y posteriormente se sumergieron en agua amoniacal (3 min), se lavaron
rápidamente con agua destilada, alcohol al 50% (1 min), alcohol al 70% (1 min), alcohol
al 96% (1 min), Orange G6 (4 min), se lavaron rápidamente con alcohol al 96%, Ea 50
(3 min), alcohol al 96%(1 min), alcohol absoluto (5 min), alcohol absoluto-xilol (10 min),
xilol (10 min) y por último se montaron en portaobjetos con 60 μL de resina sintética y
se dejaron secar por 10 min.
En la técnica de tinción Hematoxilina-Eosina se sumergieron las laminillas en
hematoxilina de Harris (1 min), agua corriente (1 min), alcohol-acido (4 seg), agua
corriente (1 min), agua amoniacal (5 min), se lavaron con agua bidestilada 3 veces, se
les aplicó la eosina (3 min), alcohol al 96% (5 min), xilol (1 min), se montaron en
portaobjetos con 60 μL de resina sintética y se dejaron secar (10 min).
Determinación de fluorescencia
Se determinó la dispersión de luz de las laminillas a una longitud de onda de 337.1 nm
y el espectro de fluorescencia de cinco puntos diferentes por medio de un fluorómetro
desarrollado por De la Rosa y cols. en la Escuela Superior de Ingeniería Mecánica y
Eléctrica del IPN, este equipo utiliza un láser de N2 como fuente de excitación, el cual
emite pulsos a razón de 4 ns los cuales pasan a través de un cilindro de cobre que
contiene un lente biconvexo y un dispersor de luz, el lente biconvexo concentra el pulso
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Del 4 al 7 de abril del 2006 en la ciudad de Morelia Mich. México. láser a la celda, en ésta se colocaron los portaobjetos que se analizaron. La señal de
fluorescencia, fue transmitida hacia un monocromador mediante una fibra óptica,
posteriormente pasó a un fotomultiplicador y al osciloscopio el cual tiene la función de
cambiar las señales eléctricas por señales digitales que fueron recibidas y procesadas
por la PC obteniendo así las espectros de fluorescencia correspondientes para cada
muestra (6).
Análisis estadístico
Cada muestra se realizó por duplicado y a cada una se le midió la fluorescencia en 5
puntos diferentes, se sacó un promedio y se calcularon los intervalos de confianza del
95%. Para determinar si existía diferencia entre los grupos se realizó una ANOVA
unifactorial utilizando el programa estadístico Sigma Stat se consideró que existía
diferencia significativa cuando la p≤0.05.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Las células fijadas teñidas y no teñidas mostraron tener fluorescencia y dispersión de
luz, observe en la figura 1 el barrido de la fluorescencia para cada línea celular y como
sólo con la tinción de HE se observa una tendencia. Probablemente esto se deba a que
la tinción de Papanicolaou utiliza varios colorantes a diferencia de la técnica de HE
(5,7), y ésos colorantes extras aumentan el grado de interferencia para determinar la
fluorescencia.
Analizando el primer armónico de la luz de excitación a 675 nm, y al calcular los
intervalos de confianza para cada línea celular teñida con HE, se logró observar
diferencias que permiten distinguirlas (figura 2). Las principales diferencias entre las
líneas celulares de cáncer cervicouterino son: que fueron aisladas en diferentes
estadios, por ejemplo HeLa fue aislada de un cáncer cervical en estadio IVB (8), y CaLo
en estadio IIB (8), McCoy por su lado además de no ser cancerosa, es de diferente
origen embriológico y de diferencia especie (9). En la figura 2 se puede observar que la
dispersión de luz está relacionada con el tipo de célula, los intervalos de confianza del
95% no se sobreponen, están perfectamente definidos para cada tipo celular.
Obsérvese que la línea McCoy presenta una dispersión mayor que las líneas HeLa y
CaLo, que están infectadas por el VPH tipo 18 (8).
De los colorante utilizados en la técnica de HE, el único que fluoresce es la Eosina (10),
sin embargo su pico de emisión esta entre 515 y 518 nm, la hematoxilina no fluórese
(11) sin embargo podría estar influenciando en la dispersión de la luz, ya que por su
naturaleza química se une a los grupos fosfatos del DNA (7). Por análisis citológico es
posible observar que las células HeLa presentan unos núcleos más hipercromáticos
que los de las células CaLo y McCoy en ése orden. Esto debido al contenido de DNA.
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Votaje (V )
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a)
HeLa HE
0.04
HeLa P
0.02
0
300
-0.02
HeLa T
400
500
600
700
-0.04
-0.06
Longitud de onda (nm)
0.1
0.08
Votaje (V )
0.06
HeLa HE
0.04
0.02
HeLa P
0
HeLa T
-0.02300
400
500
600
700
-0.04
b)
-0.06
0.4
0.35
Voltaje (V)
0.3
0.25
Mc Coy HE
0.2
Mc Coy P
0.15
Mc Coy T
0.1
0.05
0
300
c)
400
500
600
700
Figura 1.- Fluorescencia y dispersión de la luz de la células a)CaLo, b)HeLa y c)Mc
Coy. HE: Hematoxilina-Eosina, P: Papanicolaou, T: Testigo.
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Del 4 al 7 de abril del 2006 en la ciudad de Morelia Mich. México. Dispersión de la luz UV
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0.00
-0.01
McCoy
CaLo
HeLa
Tipo celular
Figura 2.- Intervalos de confianza (95%) de la dispersión de la luz de diferentes tipos
celulares. Los puntos son las X±ZSx.
CONCLUSIONES
Las células fijadas por si solas presentan fluorescencia.
La dispersión de luz UV esta relacionada directamente con el tipo de célula (cancerosa,
infectada y no infectada).
El sistema de detección de fluorescencia desarrollado por De la Rosa y Cols., permite
establecer intervalos de confianza bien definidos que diferencian los tipos celulares.
REFERENCIAS
1. The World Health Report, 1997.
2. Puig-Tintoré LM, Torné A, Ordi J. 2004 Indicaciones clínicas de la determinación del
VPH.
3. Consenso Multidisciplinar del Foro VPH, 2001.
4. Paras N. Prasad (2003).Introduction to biophotonics In:1st (Ed), Fundamentals of
Light-Matter Interactions, Chapter 4, 92-102, Wiley-Interscience, New Jersey, USA,
593 pp. (ISBN 0-471-28770-9).
5. Clark G, Coalson R.E., Nordquist R.E. Methods for general tissue. Clarck G. Editor.
Staining procedures. U.S. the Williams & Wilking Co Baltimore. 417 (1973).
6. De la Rosa J., Bautista F.J.. (2004). Optical properties of paper at 337.1 nm
Rev.
Mex. de Física. 51 (1):110-113.
7. Cox Hayward. (1976). Citotecnología médica en 1ª Ed., Técnicas de tinción, Capítulo
3, 23-33, Ed. Manual moderno, S.A. México D.F. pp 88.
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Del 4 al 7 de abril del 2006 en la ciudad de Morelia Mich. México. 8. Vázquez-Ortiz G., Pina-Sánchez P., Vázquez K., Dueñas A., Taja L., Mendoza P.,
García J. A. and Salcedo M. (2005). Overexpression of cathepsin f, matrix
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10. Conn H.J. (1961). Biological Stains In: 7th (Ed), The Xanthene Dyes, Charpter VII,
175-177, Williams & Wilkins company, Baltimore, Maryland 355 pp.
11. Conn H.J. (1961). Biological Stains In: 7th (Ed), Natural Dyes, Charpter XII, 244-249,
Williams & Wilkins company, Baltimore, Maryland. 355 pp.

E-192 - Instituto Politécnico Nacional

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