ID:1387 ANTICUERPOS CONTRA PEPTIDOS CITRULINADOS

ID:1387 ANTICUERPOS CONTRA PEPTIDOS CITRULINADOS

ID:1387
ANTICUERPOS CONTRA PEPTIDOS CITRULINADOS PARA EL DIAGNOSTICO DE
PACIENTES CON ARTRITIS REUMATOIDEA: PERSPECTIVAS EN CUBA
Martínez Téllez, Goitybell; Feist, Eugen; Pérez Garay, Hilda; Torres Rives, Bárbara; Sánchez
Rodríguez,Vicky, Gómez, Jorge Alexis. Cuba.
RESUMEN
Introducción. La artritis reumatoidea (AR) es una enfermedad inflamatoria crónica y multisistémica
de causa autoinmune. La determinación de anticuerpos anti-péptidos citrulinados con un ensayo realizado en nuestro país contribuirá a mejorar la calidad del diagnóstico, pronóstico y tratamiento de estos
pacientes en Cuba, así como garantizará un acceso a toda la población. El objetivo de este estudio fue
determinar el valor diagnóstico de los anticuerpos anti-péptidos citrulinados en pacientes cubanos con
AR y aportar nuevas herramientas mediante el uso de un péptido citrulinado obtenido en nuestro país
mejorando la perspectiva del inmunodiagnóstico de la AR en Cuba. Materiales y Métodos. Participaron 101 pacientes con AR y 101 controles sanos o con otras enfermedades inflamatorias. Se determinaron los anticuerpos anti-péptidos citrulinados y el factor reumatoideo mediante metodos inmunoenzimáticos comerciales. Se desarrollo un nuevo método de determinación de anticuerpos anti-péptidos
citrulinados mediante predicción antigénica computacional y síntesis química y se evaluó su antigenicidad en pacientes cubanos con AR. Resultados. Los anticuerpos anti-péptidos citrulinados estuvieron
en pacientes con AR y en baja frecuencia en los controles. Con una especificidad de 98%, la sensibilidad fue inferior para el factor reumatoideo. Los autoanticuerpos mostraron asociación con la proteína C
reactiva y correlación con la velocidad de sedimentación globular. El nuevo método desarrollado para
determinar anticuerpos anti-péptidos citrulinados tuvo una discriminación mayor de 10 entre pacientes
y controles. Conclusiones. Los ensayos anti-péptidos citrulinados tienen utilidad diagnóstica en pacientes cubanos con AR. El nuevo ensayo desarrollado en Cuba aumenta las perspectivas del diagnóstico de esta enfermedad.
Palabras clave: Artritis Reumatoidea, péptido ciclico citrulinado, perspectivas diagnósticas.
INTRODUCCIÓN
La artritis reumatoidea (AR) es una enfermedad inflamatoria crónica y multisistémica de causa autoinmune. Se caracteriza por inflamación sinovial con exudados inflamatorios, destrucción del cartílago
articular, erosiones óseas, deformidades articulares en fases posteriores y diversas manifestaciones extra articulares. (1)
En Cuba el diagnóstico de la AR se basa en los criterios de la Asociación Americana de Reumatología
(ARA), con seis criterios clínicos y el factor reumatoideo (FR) como criterio serológico. (2)
El FR no es específico para la AR, ya que está presente en individuos sanos y en pacientes con otras
enfermedades autoinmunes.(1)
Recientemente las proteínas citrulinadas han sido involucradas en los mecanismos patogénicos de la
AR. (3) La citrulinación es una modificación postraduccional capaz de activar la respuesta inmune. (4)
En el tejido sinovial de pacientes con AR se han detectado distintas proteínas citrulinadas con alta especificidad para la AR, como fibrinógeno, enolasa, fibronectina, vimentina y colágeno tipo II. (5-7)
Los métodos de segunda generación de ensayos (anti-CCP2) para la determinación de estos anticuerpos, basados en péptidos citrulinados cíclicos sintéticos altamente inmunogénicos, obtenidos de librerías proteicas han sido los más estudiados. (8) Los anti-CCP2 tienen una sensibilidad de 58 a 80 % y una
especificidad de 93 a 99% en pacientes con AR. (9-11) La tercera generación de ensayos anti-péptidos
citrulinados (anti-CCP3) fue designada mediante ingeniería de péptidos y contiene múltiples epítopes
citrulinados, dispuestos para aumentar la exposición y la immunoreactividad. (8, 12) Ambos ensayos
son basados en mimotopos, (8,13) y se realizan mediante la técnica de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA). (9, 19)
Durante la última década varios estudios sugieren que los anti-CCP2 además de su alta sensibilidad y
especificidad, se presentan en etapas tempranas y discriminan entre AR y otras enfermedades.(10, 13)
Los anticuerpos anti-PC fueron incluidos recientemente como criterios de clasificación para la AR en
el nuevo Colegio Americano de Reumatología/Liga Europea contra el Reumatismo
(ACR/EULAR).(14)
Existe un creciente interés por desarrollar pruebas específicas que mejoren el diagnóstico de la AR así
como su diferenciación temprana respecto a otras enfermedades reumáticas que afectan a las articulaciones y tejido conectivo, sobre todo en pacientes con un peor pronóstico o aquellos con un desarrollo
más temprano de la enfermedad.
En nuestro país no existen ensayos para la determinación de anticuerpos anti-PC, los cuales tienen la
mayor sensibilidad y especificidad en pacientes con AR. Además de su alta sensibilidad y especificidad, se presentan en etapas tempranas de la enfermedad, y discriminan entre AR y artropatías asociadas
a otras enfermedades, por lo que constituyen marcadores novedosos y su utilización se hace cada vez
más necesaria para mejorar la calidad del diagnóstico de esta enfermedad. En la mayoría de los hospitales el diagnóstico de la AR se apoya en la determinación del FR que se realiza por métodos cualitativos, en especial la aglutinación con látex aunque también se realiza por método inmunoturbidimétrico. Estos métodos son menos sensibles y específicos que el ELISA. Además estas determinaciones,
fundamentalmente las que se realizan mediante ELISA, son altamente costosas cuando se utilizan ensayos comerciales internacionales, de ahí la importancia de realizar estos ensayos en nuestro país.
El objetivo de este estudio fue determinar el valor diagnóstico del FR y los anticuerpos contra péptidos
citrulinados en pacientes cubanos con AR, así como aportar herramientas para el diagnóstico de la enfermedad mediante el uso de péptidos citrulinados sintéticos obtenidos en nuestro país mejorando la
perspectiva del inmunodiagnóstico de la AR en Cuba
MATERIAL Y MÉTODO
Diseño.
Se realizó un estudio caso control.
Pacientes.
Participaron en el estudio 101 pacientes provenientes del Centro Nacional de Reumatología con AR y
101 controles (58 controles con otras enfermedades reumáticas e inflamatorias atendidos en el Centro
Nacional de Genética Médica y 43 controles sanos del Banco Provincial de La Habana).
Los pacientes con AR fueron diagnosticados de acuerdo a los criterios establecidos por la ARA 3 y se
subdividieron en AR temprana cuando el tiempo de diagnóstico fue menor e igual a 1 año y AR esta-
blecida cuando el tiempo de diagnóstico fue mayor a 1 año. Los datos se coleccionaron mediante entrevistas individuales, en el momento de la inclusión en el estudio, realizadas por un especialista en
reumatología.
Las muestras de suero fueron almacenadas a -20ºC hasta su utilización posterior.
Para el desarrollo de la investigación se cumplieron los principios enunciados en la Declaración de
Helsinki de la Asociación Médica Mundial, que establece los principios éticos para las investigaciones
médicas en seres humanos.(15) La investigación fue aprobada por el comité de ética del CNGM y del
CNR.
El consentimiento informado de participación fue entregado a los pacientes en la consulta, con tiempo
suficiente para decidir su participación y antes de las extracciones de sangre.
A. Exámenes generales de laboratorio.
Se realizó la velocidad de sedimentación globular (VSG) y la proteína C reactiva (PCR) se determinó
mediante látex (DiagnosticAutomation/Cortez Diagnostics, EUA).
B. Determinación de FR, anticuerpos anti-CCP2.
A todos los pacientes y controles se les determinó mediante ELISA FR IgM (Orgentec Diagnostika,
Germany) y anti-CCP2 (IBL International, Germany), utilizando ensayos disponibles comercialmente
de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para la determinación de anti-CCP2 el valor de corte recomendado fue de 30 U/mL y 20 U/mL para FR IgM.
C. Predicción de epítopes o determinantes antigénicos
Se realizó la predicción de epítopes o determinantes antigénicos de la proteína citrulinadas fibrinógeno
teniendo en cuenta requerimientos estructurales encontrados en la literatura y utilizando los programas
informáticos de predicción de epítopes de célilas B discontínuos: CEP, Discotope y BEPro(PEPITO)
D. Síntesis, purificación y caracterización físico química del péptido
La síntesis del péptido obtenidos con la predicción de epítopes de células B se realizó mediante la técnica de fase sólida. La purificación se realizó con HPLC preparativa para una pureza mayor del 90% y
la caracterización mediante HPLC analítica y espectrometría de masas.
E. Determinación de la antigenicidad del péptido sintetizado
Se realizó mediante ELISA. Se preparó una mezcla con cantidades iguales de los sueros de los
pacientes con AR y una mezcla de los sueros de los controles. Se determinó la constante de
discriminación dividiendo las densidades ópticas de los sueros y los controles.
F. Análisis Estadístico.
Se utilizaron los programas Statistica 7.0 y EPIDAT 3.1. Se determinaron la sensibilidad y especificidad diagnósticas, los valores predictivos positivos (VPP) y negativos (VPN), para cada ensayo a diferentes puntos de corte, así como el Índice de Youden (IY). Se determinó el área bajo la curva (ABC)
de las curvas de característica operacionales del receptor (ROC). El análisis de correlación se realizo
mediante el método de Spearman. Se calculó el estadígrafo χ 2 y se estimó el Odd Ratio (OR) como
magnitud de asociación. El nivel de significación estadística fue 0,05.
RESULTADOS
Las características clínicas y demográficas de los pacientes se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. Características demográficas y clínicas de los pacientes con artritis reumatoidea.
Variable
AR
n=101
AR<1
año
n= 33
AR>1 año
n= 68
F, n (%)
82 (81,2)
24 (72,7)
58 (85,3)
M, n (%)
19 (18,8)
9 (27,2)
10 (14,7)
Edad en años, mediana (RIQ)
51(43-61)
49(38-57)
52(44-61)
Fumadores, n (%)
20 (19,8)
7 (21,2)
13 (19,1)
3(1-8)
1(0,5-1)
7(3-12)
Sexo
Duración de la enfermedad en años, mediana (RIQ)
DAS 28, mediana (RIQ)
Normal: DAS 28≤2,6; n (%)
5,1 (3,76,0)
7 (6,9)
Bajo: DAS 28 >2,6 and ≤3,2, n (%)
5,2 (3,6-6,3) 5,1 (3,7-6,0)
1 (3,0)
6 (8,8)
12 (11,9)
5 (15,2)
7 (10,3)
Moderado: DAS 28>3,2 and ≤5,1, n (%)
33 (32,7)
10 (30,3)
23 (33,8)
Elevado: DAS 28 >5,1, n (%)
49 (48,5)
17 (51,5)
32 (47,1)
VSG en mm, mediana (RIQ)
31 (16-55)
29 (16-55)
Positividad de PCR, n (%)
61 (60,4)
40 (1860)
22 (66,7)
39 (57,4)
DAS 28: Índice de actividad de la enfermedad basado en el conteo de 28 articulaciones, N: Número de
pacientes, RIQ: Rango interquartil, VSG: Velocidad de sedimentación globular, PCR: Proteína C reactiva.
Al analizar la positividad de autoanticuerpos en la población estudiada se observa que las frecuencias
obtenidas en los pacientes con AR fueron similares para los ensayos anti-CCP2 y el FR IgM (Tabla 2).
Tabla 2. Positividad y concentraciones de autoanticuerpos en los pacientes con AR y en los controles sanos y enfermos utilizando los valores de corte recomendados.
Grupo
CCP 2+
N (%)
M (RIQ) (U/mL)
FR IgM+
N (%)
M (RIQ) (U/mL)
AR
49 (48,5)
874,7 (305,3-950,0)*
61 (55,4)
121,7 (60,0-483,3)*
ART
12 (36,4)
891,4 (551,8-1124,3)
16 (48,5)
181,3 (75,0-501,2)
ARE
37 (54,4)
552,5 (146,6-958,8)
45 (66,2)
108,1 (60,0-483,3)
EA
1 (20,0)
30,3
AP
1 (25,0)
50,5
EMTC
4 (40,0)
36,2 (28,1-45,9)
LES
3 (25)
183,4(26,5-235,2)
ECL
1 (16,7)
23,0
P
1 (33,3)
32,5
AND
2 (12,5)
52,2 (36,6-67,9)
CS
2 (4,7)
37,5 (34,7-40,3)
2 (4,7)
38,8 (21,8-55,8)
N: Número de positivos, M: Mediana de la concentración de anticuerpos, RIQ: Rango interquartil
AR: Artritis reumatoidea, ART: Artritis reumatoidea temprana, ARE: Artritis reumatoidea establecida,
EA: Espondilitis anquilosante, AP: Artritis psoriásica, EMTC: Enfermedad mixta del tejido conectivo,
ECL: Esclerodermia, LES: Lupus eritematoso sistémico, P: Polimialgia, AND: Artritis no diferenciada,
CS: Controles sanos, CCP 2: Anti-péptidos citrulinados de segunda generación, FR: Factor Reumatoideo, IgM: Inmunoglobulina M, *Diferencias entre AR y los controles que presentaron positividad de
autoanticuerpos.
Los anticuerpos anti-CCP2 solamente estuvieron presentes en los pacientes con AR y en una baja frecuencia en los controles sanos. El FR IgM estuvieron presentes en pacientes con otras enfermedades
reumáticas e inflamatorias y pero con baja frecuencia y a títulos inferiores en comparación con los pacientes con AR. Solamente los anticuerpos FR IgM estuvieron presentes en los individuos sanos a frecuencias mayores aunque a títulos bajos (Tabla 2).
De los pacientes positivos de FR IgM, 15 no presentaron anticuerpos anti-CCP2. En los pacientes negativos de FR se observaron anticuerpos anti-CCP2 en 3 pacientes. (Tabla 3).
Tabla 3. Positividad de autoanticuerpos en los pacientes con AR utilizando combinación de ensayos.
Ensayos
Número de positivos
FR IgM+CCP215
FR IgM -CCP2+
3
FR IgM -CCP213
AR: Artritis reumatoide, FR: Factor Reumatoideo, IgM: Inmunoglobulina M, CCP2: Anti-péptidos
citrulinados de segunda generación.
Esto demuestra que aunque los ensayos de determinación de anticuerpos anti-PC tienen una alta sensibilidad, todavía existe una proporción de pacientes negativos en este método que son positivos para el
FR, aunque la especificidad sea mucho menor para el FR.
Tabla 4. Desempeño diagnóstico de los ensayos de determinación de FR IgM y de anticuerpos
anti-péptidos cíclicos citrulinados en pacientes cubanos con AR.
Ensayo
VC
Sensibilidad
Especificidad
VPP
VPN
Índice
(U/mL)
(%)
(%)
(%)
(%)
Youden
Anti-CCP2
10
53,5
90,1
84,4
65,9
0,44
20
50,5
94,1
89,5
65,5
0,45
30*
48,5
98,0
96,1
65,7
0,47
10
73,3
39,6
54,9
59,7
0,13
FR IgM
20
60,4
85,2
80,3
68,3
0,46
30
53,3
89,1
83,1
65,7
0,43
70*
40,3
98,0
95,4
62,3
0,39
CCP 2 y FR IgM
30 –
45,5
100
100
64,7
0,58
20**
CCP 2 o FR IgM
30 - 20**
63,4
83,2
79,0
69,4
0,47
VC: Valor de corte, VPP: Valor predictivo positivo, VPN: Valor predictivo negativo, FR: Factor
Reumatoideo, IgM: Inmunoglobulina M, CCP2: Anti-péptidos citrulinados de segunda generación,
*Valor de correspondiente a la especificidad de 98%. **Valor de corte seleccionado en el estudio de
sensibilidad/especificidad.
En la Tabla 4 se observan los valores de sensibilidad y especificidad a diferentes valores de corte de los
ensayos estudiados. Cuando se fija la especificidad al 98%, la sensibilidad obtenida para el ensayo antiCCP2 (48,5%) fue superior a aquella obtenida para el FR IgM (40,3).
El mejor balance de sensibilidad y especificidad de los ensayos individuales, determinado mediante el
IY se obtuvo en el caso del ensayo anti-CCP2 y FR a los valores de corte recomendados por el fabricante. Cuando se utiliza los ensayos anti-CCP2 y FR IgM se obtiene el mayor valor de IY además de
aumentar la especificidad diagnóstica a 100%. (Tabla 4).
Se demuestra en este estudio que cuando se utiliza el FR y la determinación de anti-CCP2 aumenta el
desempeño diagnostico.
El ABC de las curvas ROC para el ensayo anti-CCP2 (0,6642) fue superior a aquellas obtenidas para el
ensayo para el FR (0,6790).
Se observó asociación entre la positividad de PCR y la presencia de FR IgM (p=0,0000, OR=5,4; IC
95%; [2,7-10,7]), anticuerpos anti-CCP2 (p=0,0000, OR=5,7; IC 95%; [2,7-12,3]) y anticuerpos antiCCP3 (p=0,0000, OR=5,4; IC 95%; [2,4-12,0]).
Todos los autoanticuerpos mostraron correlación significativa entre ellos y con la VSG. Solamente los
anticuerpos anti-CCP2 no mostraron correlación con el DAS 28 (Tabla 5). Los ensayos anti-PC y FR
IgM son capaces de orientar acerca de la severidad de la enfermedad ya que mostraron una buena asociación con la PCR y correlación con la VSG.
Tabla 5. Coeficientes de correlación obtenidos con las determinaciones de los autoanticuerpos, la
VSG y el DAS 28.
Anti-CCP2
0,2385; p=0,0160*
FR IgM
0,3494; p=0,0000*
DAS 28
0,5539; p=0,0000*
VSG
(r; p)
0,3086; p=0,0020*
0,1909; p=0,0560
Anti-CCP2
(r; p)
0,2627; p=0,008*
FR IgM
(r; p)
CCP 2: Anti-péptidos citrulinados de segunda generación, Factor Reumatoideo, IgM: Inmunoglobulina M. DAS 28: Índice de actividad de la enfermedad basado en el conteo de 28 articulaciones, VSG:
Velocidad de sedimentación globular, r: Coeficiente de correlación. p: Significación estadística.
*Correlación significativa para p<0,05
El nuevo ensayo desarrollado para la determinación de anticuerpos anti-PC tuvo una constante de discriminación entre los pacientes y los contrales de 12, por lo que es capaz de discriminar entre los pacientes con artritis reumatoidea y los pacientes con otras enfermedades autoinflamatorias y autoinmunes.
CONCLUSIONES
Los ensayos anti-PC tienen utilidad diagnóstica en los pacientes cubanos con artritis reumatoidea mostrando mayor valor discriminativo entre la AR y los pacientes con otras enfermedades reumáticas y
antiinflamatorias. La determinación de FR IgM mediante ELISA mantiene su utilidad para la identificación de pacientes seronegativos de anticuerpos anti-PC. La variación en las características diagnosticas de los ensayos anti-PC confirma la necesidad de que cada centro evalúe los ensayos en su propio
cohorte evitando el riesgo de sobre diagnóstico y el empleo de tratamientos innecesarios.
El nuevo ensayo desarrollado en Cuba aumenta las perspectivas del diagnóstico de esta enfermedad. Su
incorporación en la práctica clínica podría permitir la identificación de aquellos pacientes que requieren
terapias más intensivas desde el mismo momento del diagnóstico de la enfermedad, permitiendo así un
mayor control de ésta y, consecuentemente evitar al máximo la destrucción articular, además de mejorar el pronóstico de la enfermedad.
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