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Instituto de
Biotecnología
Diagnóstico molecular de fitopatógenos
Dra. María Carolina Martínez
Laboratorio de Marcadores Moleculares y Genómica Vegetal
Instituto de Biotecnología. CICVyA. INTA-Castelar
[email protected]
Instituto de
Biotecnología
Técnicas tradicionales para diagnóstico de
fitopatógenos:
Se estudia la sintomatología
-en fases avanzadas de la enfermedad
-consumen cierto tiempo, laboriosas, dificultosas
-poco precisas: no pueden discriminar entre diferencias
leves en los niveles de resistencia
-subjetivas: determinación arbitraria de categorías
discretas
Técnicas de laboratorio:
Ensayos de cultivo en placa; microscopía electónica;
ELISA; tiras reactivas (LFD)
Instituto de
Biotecnología
-económico
-no equipamiento
-mínimo
entrenamiento
-test rápido
Requiere de los Ab
específicos
LFD: Lateral Flow Devices
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Biotecnología
www.pocketdiagnostic.com
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Biotecnología
Técnicas moleculares para diagnóstico de
fitopatógenos:
-Dodds et al. 1984 y Hull 1986: desarrollo de protocolos de
hibridación por dot-blot para detección de virus y
viroides
- 1989: PCR para detección de un patógeno de plantas
(Puchta y Sanger) viroide
-1990: PCR para detección de un virus de plantas
-1994: mas de 40 trabajos
-A mediados de los 90: poco usada como método de rutina.
Solo los labs más grandes (en viroides y fitoplasmas)
-Importante: mayor practicidad (más que sensibilidad y
especificidad)
-A finales de los 90: tecnologías de amplificación en tiempo
real
Instituto de
Biotecnología
A finales de los 90: tecnologías de amplificación
en tiempo real
cuantificar la biomasa de un patógeno
(por ej. en análisis de resistencia)
Técnicas moleculares: PCR “ semi-cuantitativa”
-analiza el producto de amplificación a tiempo final
-se enmascaran las diferencias iniciales de concentración del
templado
-manipuleo post-amplificación
PCR en tiempo real
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Biotecnología
Los productos de amplificación se observan a medida
que transcurren los ciclos de la PCR
Esta basado en:
- la detección y cuantificación de un reporter
fluorescente, cuya señal aumenta en proporción directa
a la cantidad de producto de PCR en la reacción.
- el empleo de un termociclador que tiene acoplado un
sistema de detección que es capaz de adquirir y
cuantificar la señal emitida por el reporter al final de
cada ciclo para cada muestra.
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Biotecnología
Estructura funcional del ABI 7700
(1997)
Observación del proceso de amplificación
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Biotecnología
log view
Las cinco diluciones alcanzan el plateau en el mismo punto aunque cada curva muestra
un recorrido diferente. Esto refuerza el hecho de que si las mediciones fueran tomadas a
lo largo del plateau los datos no representarían la cantidad inicial del target.
Observación del proceso de amplificación
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Biotecnología
Se adquieren los datos cuando la amplificación
está todavía en la fase exponencial. Esto está
determinado por la identificación del número de
ciclo al cual la intensidad de emisión del fluoróforo
aumenta con respecto al ruido de fondo (background)
Este número de ciclo se llama ciclo umbral
(Ct: threshold cycle). El Ct está determinado en la fase
exponencial de la reacción y es más confiable que las
mediciones a punto final convencionales. El Ct es
inversamente proporcional al número de copias del
target templado: a mayor concentración de templado,
menor Ct medido.
Ecuación de la PCR
Xn
Xn = X0(1 + E)n
Xn = producto de PCR luego del ciclo n
X0 = número inicial de copias
E = eficiencia de amplificación
n = número de copias
X0
Número de
ciclos
Eficiencia
La eficiencia de la reacción puede ser calculada por la siguiente ecuación:
E=10(-1/slope). La eficiencia de la PCR debería ser de aprox. 90-100%
(pendiente ideal = 3.32)
Diversos factores afectan la eficiencia como puede ser: el largo del amplicón,
la estructura secundaria y el diseño de primers (entre otros).
Efecto de la eficiencia de amplificación
Caso 1: E = 0.9
Xn = 100 (1+0.9)30
Xn = 2.3 x 1010
Caso 2: E = 0.8
Xn = X0(1+E)n
Xn = 100 (1+0.8)30
Xn = 4.6 x 109
Resultados
Una diferencia de 0.1 en la eficiencia de amplificación resultó en u
número final de copias significativamente menor.
Como interpretar deltaRn?
+Rn
Sample
Rn
Rn
Threshold
No Template
Control
CT
0
10
-Rn
20
Cycle number
30
40
Rn
* Rn+ es el valor Rn de una reacción que contiene todos los componentes
(muestra de interés, GOI, blanco); Rn- es el valor Rn detectado in NTC
(valor de base)
* Delta Rn es la diferencia entre Rn+ and Rn-. Es además un indicador de
la magnitud de señal generada por la PCR
* El gráfico de Delta Rn versus el número de ciclos y muestra las curvas
de amplificación para estimar los valores de Ct
NTC: no template control
GOI: gene of interest
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Pyrenophora teres
Semillas de cebada
Mol. Plant Pathol. 2001. 2:49-57
Fig. Quantification of P. teres genomic DNA amplified with primers ITSFF and ITSR. (a) Shows the
increase in fluorescence with time (cycle number) of accumulated PCR products from four dilutions of
P. teres DNA. The dotted line is a water control. The point at which each curve crosses the band (set
manually) is used to plot the standard curve shown in (b). Unknown sample DNA concentrations are
derived from the standard curve using the LightCycler™ software.
PCR en tiempo real
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La química de la detección está dada por:
Reactivos fluorescentes
Agentes intercalantes fluorescentes (SYBR Green)
Hydrolysis probes (TaqMan)
Hybridization probes (Dual hybridization probes)
Hairpin probes (Molecular Beacons)
Primers modificados (Scorpions y Sunrise primers)
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SYBR greenTM
Es un agente intercalante
que se une al ADN doble
cadena dando un incremento
de la fluorescencia a medida
que aumenta la cantidad de
producto de PCR.
SYBR greenTM
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Ventajas
- simple, económico y fácil de usar
- sensible
- versátil: no se necesitan sondas específicas o primers ad
hoc (aplicación universal)
- permite obtener curvas de melting
Desventaja
- No específico, durante la reacción de PCR puede unirse a
dímeros de primers y a otros productos inespecíficos,
resultando en una sobreestimación de la concentración del
target. No se puede usar en reacciones multiplex.
Funciona muy bien para reacciones de PCR simples con
primers que no generen amplificaciones espurias.
Curva de desnaturalización
Muestra el perfil de denaturalización de los productos
amplificados.
Si un producto presenta un perfil de desnaturalización
diferente (valores de Tm diferentes), significa que es otro
producto (no específico) de amplificación, pueden ser
dímeros.
Curva de desnaturalización de diluciones
(se observan dímeros, de menor temperatura de fusión)
dímeros
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Pa: G. pallida
265pb, GC 52,1%
Ro: G. rostochiensis
434 pb, GC 56,7%
Fig. 1 Melting peaks of PCR products from G. rostochiensis (Ro1, filled circles) and G. pallida (Pa1, crosses; Pa2/3,
open circles) using the Bulman and Marshall (1997) primers in a multiplex PCR. The product lengths are 434 bp for G.
rostochiensis and 265 bp for G. pallida. There is a 4 °C separation of the melting peaks with Tm values of
approximately 93 °C for G. rostochiensis and 89 °C for G. pallida. A no-template control is shown by the dotted line.
Mol. Plant Pathol. 2002. 3:153-161
Hydrolysis probes
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(TaqManTM)
FAM: 6-carboxifluoresceína
TET: tetracloro-6carboxifluoresceína
VIC, HEX, Texas red, etc.
TAMRA: tetrametilrodamida
(a)Cuando la sonda, hibridada o no, está intacta
el fotocromo reporter no emite por acción del
quencher.
(b) La sonda es hidrolizada durante la reacción
de PCR y el reporter fluoresce.
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TaqManTM
Phakopsora pachyrhizi y P. meibomiae
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Real-time polymerase chain reaction (PCR) amplification of DNA from the soybean rust pathogens
Phakopsora pachyrhizi and P. meibomiae by TaqMan PCR using an ABI Prism 7700 Sequence
Detection System. P. pachyrhizi specific primers Ppm1 and Ppa 2 were used with a 50-FAM-labeled
internal probe (Frederick et al. 2002). The left axis (1RQ) is the change in fluorescence that is a
measure of probe cleavage efficiency, and the bottom axis is the PCR cycling stage.
Annu. Rev. Phytopathol. 2003. 41:305-324
1 ng PLRV
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Biotecnología
Detección de PLRV y PVY
en simultáneo
MBPLRV y MBPVY y
distintas cantidades de
ambos virus purificados
Fig. 5: detección
eficiente de RNA de PVY
en presencia de gran
cantidad de PLRV (ídem a
la inversa)
Sensibilidad: PVY 100fg
PLRV 1pg
Detección
Multiplex en
amplio rango de
conc. de targets
J.Virol. Meth. 2001. 93:115-125
1 ng PLRV
+ 1ng PVY
1 ng PVY
1 ng PVY
1 ng PLRV
+ 1ng PVY
1 ng PLRV
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Biotecnología
-1996: detección de PLRV en tubérculos de papa
(Schoen, Phythopathology)
-Hongos (Bohm et al. 1999, Zhang et al. 1999)
-Bacterias
-Virus
(Schaad et al. 1999, Weller et al. 2000)
(Mumford et al. 2000, Eun et al. 2000)
-Viroides
(Boonham et al. 2004)
-Fitoplasmas (Bianco et al. 2004)
También: virus en insectos vectores
(Boonham et al. 2002, Fabre eta al. 2003, Olmos et al. 2005)
Hydrolysis probes
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(TaqManTM)
Ventajas
-alta sensibilidad
- permite detección y/o cuantificación de distintos
amplicones en la misma reacción (multiplex) empleando
distintos fluoróforos reporter.
Desventaja
- sonda costosa (menor costo si es para alto nro. de
muestras)
- la sonda es clivada durante la amplificación
irreversiblemente, no permite hacer curvas de melting
post-amplificación (especificidad y precisión).
Empleadas en muchos trabajos.
Hybridization probes
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Biotecnología
(a) Sondas de oligonucleótidos de secuencia específica, marcadas
con diferentes fluoroforos (3´de donor probe y 5´de aceptor probe).
Las dos sondas hibridan con sus targets específicos en un arreglo
cabeza-cola permitiendo que los dos fluoroforos estén estrechamente
próximos.
(b) La transferencia de la energía de resonancia de fluorescencia sólo
ocurre cuando ambas sondas están hibridadas y muy próximas entre sí
(distancia óptima entre 1 y 5 bases entre las sondas).
Hairpin probes
(Molecular BeaconsTM)
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DABCYL o Dabsyl:
universal, no emite
(a) En ausencia de target específico las repeticiones terminales
invertidas (ITR) en los extremos 3´y 5´ de la sonda forman una
Estructura de hairpin, que mantiene al reporter sin emitir.
(b) En presencia de un target específico se desarma la estructura
de hairpin y el fotocromo reporter fluoresce.
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Molecular beacon
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Scorpions
(Nucleic Acids Res
2000, 28:3752-3761).
Sunrise
primers
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PCR en tiempo real
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Biotecnología
- amplificación robusta y confiable (Taq polimerasas).
- alta especificidad y sensibilidad.
- cuantificación del DNA o RNA molde inicial (hay una alta
correlación entre la señal (Ct) y la cantidad de target).
- alta precisión y exactitud.
- posibilidad de PCR multiplex.
- no requiere de análisis posterior a la PCR (no hay
manipulación post PCR, electroforesis, etc.).
- sistema a “tubo cerrado” (control de contaminación).
- simple y rápida: se puede realizar un mayor número de
reacciones por día.
- amplio rango de aplicación.
- diseño de primers y sondas más exigente
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Aplicaciones de PCR en tiempo real
cuantitativa fitopatología
Detección de hongos y bacterias fitopatógenas
-Cuantificación de progresión de enfermedad provocada por varios
patógenos en Arabidopsis thaliana: Alternaria brassicicola,
Botrytis cinerea, Erwinia carotovora, Perenospora parasitica,
Pseudomonas syringae. SYBR Green I
-Monitoreo del desarrollo fúngico de A. thaliana infectada con A.
brassicicola y B. cinerea. Discriminación entre líneas que presentan
diferencias leves en los niveles de resitencia. Estudio en estadíos
tempranos de la infección. Rápido y práctico. SYBR Green I
-Monitoreo de Heterobasidion annosum en clones de coníferas
(Norway spruce) que difieren en la resistencia a la enfermedad.
Comparan con métodos tradicionales. TaqMan
-Detección de cepas de Ralstonia solanacearum. Multiplex con
sondas TaqMan: una detecta todos los biovares y una específica de
biovar 2A. En cultivos puros y en tubérculos de papa infectados.
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Detección de virus y viroides fitopatógenos
-Detección de Potato spindle tuber viroid. Su RNA no codifica
para proteínas, desarrollo de ensayo con TaqMan.
-Cuantificación simultánea de dos virus de orquídea CymMv y
ORSV. RT-PCR y TaqMan. Sensibilidad y rapidez.
-Detección de TMSWV en distintos cultivos de distintas zonas.
TaqMan. Sensibilidad y rapidez.
-Detección de TMSWV en áfidos individuales. Monitoreo del
insecto vector. TaqMan
-Detección de Barley yellow dwarf virus en áfido. TaqMan
-Detección de Sugarcane yellow leaf virus. Caña se propaga
vegetativamente. TaqMan
-Detección de dos potyvirus de ajo OYDV y LYSV. Propagación
vegetativa. TaqMan
-Detección de PLRV y PVY en tuberculos de papa. TaqMan
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Biotecnología
En estudios de agentes de control biológico: importante
monitorear su liberación, tamaño y dinámica poblacional y
patogenicidad contra su hospedante
-Detección y diversidad cuantitativa del locus de biosíntesis de
pirrolnitrina (gen prnD, Pseudomonas, Serratia, Burkholderia,
antibiótico: supresor de fitopatógenos del suelo, Rhizoctonia
solani) en distintos suelos. TaqMan
-Detección y cuantificación de Plectosphaerella cucumerina,
agente biocontrolador del nematode del quiste de la papa.
Comparación con los métodos tradicionales. Detección en muestras
de suelo. TaqMan
Detección de fitopatógenos en el suelo: Helminthosporium solani,
Colleotrichum coccodes (patógenos de papa)
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Lo más importante:
Disminución en el tiempo requerido para el diagnóstico
Ej: Análisis de virus en papa semilla
6-8 semanas para detección de patógenos por ELISA (en brotes)
Días o menos de 24 hs usando TaqMan (suficiente para detectar los bajos títulos de virus en los
tubérculos)
Cuando los métodos tradicionales fallan
Control de la calidad de la extracción
inhibidores, gen endógeno de la planta)
Ej: viroides
(control interno para detectar
Diseño de ensayo de diagnóstico específico de qPCR para
la mayoría de los patógenos (razas, subespecies) vs. Ab
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Cuantificación de RNA en
fitopatología
En general,
-para estudiar la respuesta de la planta a la infección observando la
expresión diferencial de determinados genes ante el ataque de un
patógeno
-algunos estudios de expresión de genes del patógeno durante la
infección a la planta
- Validación de resultados de microarrays (estudios transcriptómicos)
Desarrollos y aplicaciones
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QRT- PCR: muy útil ya que los métodos tradicionales no permiten
cuantificar o son muy dificultosos o poco sensibles
-monitorear eficacia de las estrategias de resistencia a
enfermedades (variedades mejoradas, transgénicas, rotación de
cultivos, etc)
-monitorear la progresión de la infección en plantas modelo o de
interés agronómico
-diagnóstico de bajos niveles de infección
-correlacionar manifestaciones de la enfermedad con la carga del
patógeno en un rango más amplio
-correlación entre genotipo de la planta y respuesta a la infección
-cuantificar diferentes genotipos que coexisten en una infección
-cuantificación de RNA: niveles de expresión de genes de patógenos
y de hospedadores en respuesta a la infección
-confirmación de resultados de microarrays
etc, etc, etc....
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Biotecnología
Importante contar con métodos confiables para estudiar distintas
enfermedades:
-diagnóstico en el campo
-para servicios de inspección (en el lugar del brote de una
enfermedad, para llevar a cabo las acciones de erradicación)
-para el monitoreo de plantas importadas y productos derivados de
plantas para los organismos de cuarentena en puertos de entrada y
puntos de inspección (en productos perecederos como frutas,
flores, vegetales)
Instituto de
Biotecnología
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Biotecnología
http://www.idahotech.com
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Biotecnología
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Biotecnología
Detección de Xanthomonas citri (Mavrodieva et al. 2004)
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Biotecnología
Otros:
SmartCycler (Cepheid)
Bioseeq (Smith Detection)
RAZOR (Idaho Tecnologies)
Evocycler (Evogen)
Además:
Pre-mixes para real-time PCR
Protocolos cortos y “a campo”
Desafíos
Instituto de
Biotecnología
- detección del patógeno previa a la aparición de la enfermedad
(suelo, para análisis antes de plantar; aire; agua)
-testeo y diagnóstico a gran escala (high troughput)
- desarrollo de métodos genéricos que permitan que una muestra sea
analizada simultáneamente para un gran número de patógenos
- desarrollo de metodologías robustas que eviten depender de
laboratorios centrales bien equipados y que permitan la detección
segura de patógenos a campo o en países menos desarrollados (ej,
LAMP: Loop mediated isothermal amplification)
Microarrays en Fitodiagnóstico
Instituto de
Biotecnología
Boomhan et al. 2007
Microarrays en Fitodiagnóstico
Instituto de
Biotecnología
Boonham et al. 2003
Necesidad de disponer de secuencias, por eso la mayoría de los trabajos
es en virus
www.diagchip.co.uk
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Biotecnología
Abstract:This project will investigate the feasibility of producing a diagnostic chip
for the simultaneous detection of all the plant pests/pathogens present in the EU
Plant Health Directive (77/93/EEC), using quarantine potato pests as a model
system. The project will establish methods for detection of quarantine pathogens in
plant tissue using gene chip technology. Up to 30000 DNA probes (sequences from
each of the organisms to be tested in one assay) can be arrayed on to a microscope
slide - the 'gene chip'. The chip can be exposed to fluorescently labelled nucleic acid
from the sample and fed into a micro-array reader to reveal if any of the pathogens
are present. The project covers the whole process from preparing target genes,
generating gene chips, preparing samples, hybridisation of samples, analysis of
results and finally through to quarantine diagnosticians evaluating the technology.
Instituto de
Biotecnología
Secuenciación de alto desempeño
en Fitodiagnóstico
Primer fitopatógeno secuenciado por tecnologías de 2da generación (2009):
Pseudomona syringae pv. oryzae cepa I-6 (6 Mb)
Fitopatógeno eucariota: Pyremophora teres f. teres (2010, de cebada)
Con las nuevas tecnologías disminuyó el costo de secuenciación (en pocos
días, 1000 u$s o menos). Posibilidad de generar “draft genomes” y
secuencias de RNA (cDNA por RNA seq)
Diagnóstico por identidad de secuencia: nuevos aislamientos, epidemiología
(similar a hacer una hibridación in silico con las bases de datos de sec).
Para detectar nuevas proteínas/secuencias útiles para test de diagnóstico
Diagnóstico por Secuenciación de RNAs específicos de la respuesta al
ataque del patógeno (virus y viroides)
Annu. Rev Phytopath. 2011. Application of High-Trougput DNA Sequencing in Phythopathology
Instituto de
Biotecnología
Fitodiagnóstico x secuenciación
Técnicas anteriores: necesidad de conocer al patógeno para diseñar
primers específicos o generar anticuerpos específicos. El diagnóstico se ve
facilitado si se conoce el origen de la muestra lo cual puede sugerir una
lista menor de potenciales patógenos a testear.
Ej . En humanos pacientes transplantados que mueren, PCR y microarrays
fallaron
en
diagnóstico.
Aproximación
con
secuenciación
metatranscriptómica de cDNA: descartan secuencias humanas, detectan
arenavirus. Validan con PCR.
Plantas presentan comunidades microbianas complejas. Necesidad de:
-métodos para preparación eficiente de la muestra,
-pipelines bioinformáticas para discriminar eficientemente
sec. del
patógeno de las del hospedante,
-asociación funcional entre secuencias candidatas con causantes de
enfermedad,
-conocimiento biológico es esencial para poder interpretar los datos (la
secuenciación sola no revela cual subset de patógenos es el responsable de
la patología)
Instituto de
Biotecnología
Adams eta al. 2009. Next-generation sequencing y aproximación
metagenómica: tomate infectado con Pepino Mosaic Virus.
Gomphrena globosa infectada con un patógeno desconocido aislado de
Liatris spicata (ornamental)  contenía un nuevo cucumovirus
(‘Gayfeather mild mottle virus’). En ambos casos, se secuenció el genoma
viral completo. Descubrimiento de un nuevo virus, identificación y ensayo
de rutina aplicable a nuevos patógenos virales.
Pero: no se cumplen todos los postulados de Koch
Sólo se conoce la secuencia, no se tiene otra información (asociación con
enfermedad, morfología de la partícula, tamaño, vector, rango de
hospedante, etc).
Taxonomía de virus (nombrar con prefijo)
Instituto de
Biotecnología
“It is difficult to predict how the field
of phytopathology will look 10 years
from now, but it will certainly be
radically transformed by the
inevitable flood of sequence data and
the opportunities and challenges that
it affords”.
Studholme, Glover& Boonham. Annu. Rev Phytopath. 2011. Application of High-Trougput DNA Sequencing in Phythopathology
Instituto de
Biotecnología

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