La secuenciación y las tecnologías de alto rendimiento. Hacia

La secuenciación y las tecnologías de alto rendimiento. Hacia

La secuenciación y las
tecnologías de alto
rendimiento
Hacia donde vamos
Juan F. García
•
Evolución de las tecnologías de
secuenciación
•
Entender el problema clínico
•
Evolución de las tecnologías de
secuenciación
•
Entender el problema clínico
El cáncer es una enfermedad genética
• Origen genético-ambiental
• Todos los tumores portan alteraciones genéticas de origen
intrínseco o inducido
• El 85-90% de los tumores son esporádicos
• En el 4-6% de los canceres existe agregación familiar, sin conocerse
un gen responsable
• Únicamente en el ~12% de los canceres, se conoce un gen cuya
mutación o alteración en la expresión/traducción es responsable de
la enfermedad, con patrones de herencia autosómico dominante o
recesivo
• Identificación de las marcas genéticas es IMPRESCINDIBLE para el
diagnóstico, pronóstico y selección de terapia
Algunos hitos en biología molecular
1941 Genes codifican las proteínas
1944 DNA molécula portadora de información genética
1953 Determinación de la estructura del DNA
1956 Enfermedad monogénica: sustitución de un aa cadena β-hemoglobina
1961 Código Genético, RNA mensajero, regulación génica
1972 Janet Mertz y Ron Davis: digestion y ligación del DNA
1974 Demostración directa de deleción génica humana
1975 Southern Blotting
1976 Proto-oncogenes (virales)
1977 Fred Sanger secuenció el virus de ADN Ф X174
1978 Biblioteca génica humana
1979 RFPL para diagnóstico prenatal, identificación oncogenes celulares
1979-81 Diversos genes humanos clonados y secuenciados
1983 Kary Mullis concibe la PCR / Fred Sanger y colegas publican la secuencia del λ
1986 La secuenciación del ADN es automatizada
1987 Inicia el Proyecto del Genoma Humano
1999 Es secuenciado el cromosoma 22 humano
2000 Se presenta 90% borrador genoma humano
2001 Feb 2001 se completa el genoma humano
2012 ENCODE: cerca del 80% del DNA tiene” función”
Nueva era: Secuenciación del genoma
FEBRERO 2001
Consorcio Público
Ohio State University
NOVIEMBRE 2001
Celera Genomics
Proyecto genoma humano
Se concibió en 1990 para:
1.
Identificar cuales son los genes existentes y determinar su localización.
2.
Determinar la secuencia exacta de nucleótidos de cada gen con el objetivo de
conocer la proteína codificada.
Características del genoma humano:
1.
2001, publicación de la primera secuencia del genoma
2.
2003, solo el 2% del genoma contiene genes; es decir, codifican proteínas.
3.
2012, cerca del 80% del DNA tiene” función”
– ENCODE (encyclopedia of DNA elements) : mapeo de regiones de
transcripción, estructura de cromatina, y modificación de histonas: Función
bioquímica en el 80% del genoma
– Identificación de elementos reguladores y RNAs no codificantes
– Asociación con enfermedades
4.
Contiene ~25.000 genes (3.3 x 109 pb), y se desconoce la función de casi la
mitad
Secuenciación del DNA
•
•
La capacidad de “leer” secuencias de DNA: heramienta esencial
Fred Sanger desarrolló un método de secuenciación basado en el uso de la
DNA polimerasa (Premio Nobel en 1980)
Método Sanger:
 DNA polimerasa añade nucleótidos libres a un
molde de DNA.
 Sanger
utiliza
algunas
dideoxinucleótidos
modificados para detener el proceso de
replicación si se incorporan en la cadena de DNA
creciente (terminadores).
 Conjunto de copias de DNA parciales de la
secuencia modelo original, cada una parada en
una base diferente.
 Sanger utiliza 4 diferentes reacciones que cada
contenidas sólo terminadores para una de las
bases.
 Las copias parciales se clasifican por tamaño
mediante electroforesis.
Secuenciación del DNA: Método Sanger
Secuenciación automática del DNA
• 1990s, Leroy Hood desarrolló
un método de secuenciación
en el que se utilizaban
terminadores fluorescentes
• Esto permitió llevar a cabo una
única
reacción
de
secuenciación y electroforesis
• Uso
de
secuenciadores
automáticos y de programas
de análisis (electroferogramas)
Estrategias de secuenciación
a gran escala
• La secuenciación a gran escala persigue la
secuenciación de fragmentos muy grandes de ADN.
• Cortando (con enzimas de restricción) o cizallando
(mediante fuerzas mecánicas) fragmentos grandes
para obtener otros más pequeños.
• El ADN fragmentado se clona en un Vector de ADN,
(BAC) y amplificado.
• Los fragmentos cortos de ADN purificados se
secuencian completamente y se ensamblan
computacionalmente en una secuencia larga y
contigua identificando las secuencias que se
solapan entre ellas
Reeve MA, Fuller CW.
Nature. 1995 Aug 31;376(6543):796-7.
Secuenciación de alto rendimiento "next-generation"
1. Mejora en “química”: amplificación clonal in vitro, se producen muchas
localizaciones físicamente aisladas que contienen cada una muchas copias
de un solo fragmento, para ser más tarde secuenciadas
PCR de emulsión: se aíslan las moléculas individuales de ADN junto con
microesferas recubiertas con cebadores. Posteriormente una amplificación
mediante PCR recubre cada microesfera con copias clonales de la
bliblioteca.
• 454 (Life Sciences, adquirido por Roche)
• SOLiD (desarrollada por Agencourt y adquirida por Applied Biosystems)
PCR “de puente“, soporte sólido: los fragmentos se amplifican a partir de
cebadores unidos a una superficie sólida
• Solexa (Illumina).
Secuenciación de alto rendimiento
"next-generation"
2. Mejora en “tecnología”: sistemas de detección de alta
sensibilidad
Illumina (Solexa): detección mediante fluorescencia de los
nucleotidos incorporados  "secuenciación por síntesis"
Ion Torrent semiconductor: medición eléctrica  detección de
iones de hidrógeno que se generan durante la polimerización del
ADN
454, Roche: pirosecuenciación  detección y cuantificando del
número de nucleótidos añadidos a una determinada localización a
través de la luz emitida por la liberación de los pirofosfatos unidos
SOLiD (Applied Biosystems): secuenciación por ligación 
método enzimático que emplea una ADN ligasa en lugar de una
polimerasa
Alineamiento y localización cromosómica
Cobertura: todas las regiones secuenciadas tienen que
estar cubiertas por fragmentos de DNA solapados
Secuenciación del DNA
1980-1990
Radiactividad - gel
100s bp / día
1990-2005
Fluorescencia - capilar
106 bp / día
> 2005
Next generation
109 bp / día
Flujo de trabajo
Datos
Lecturas no alineadas
Inferencia/Predicciones
Alineamiento
Predicción SNVs
Conocimiento
Confirmed SNVs
Confirmación
somática
Descartar
Polimorfismos
Confirmación
geminal
Falsos
positivos
Descartar
mutaciones
sinónimas o no
codificantes
Relevancia
clínica de
las SNVs
Recurrencia?
Significado
funcional?
Validación!!!
Consideraciones:
• Suficiente cobertura para detectar mutaciones (> 30X)
• Estudio realizado: Exoma/transcriptoma ( ~1% del genoma) / Genoma completo
• Análisis bioinformático extenso
• Mutaciones/reordenamientos requieren validación por otras técnicas
Next generation sequencing: Aplicaciones
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Mezcla de DNAs de diversos ecosistemas, metagenómica
Re-secuenciación de cepas previamente publicadas
Identificación de TODAS las mutaciones/variaciones de un organismo
Validación e identificación de errores de datos publicados
Secuenciación de genomas de TODOS los organismos
Estudios comparativos
Secuenciación de mRNA (exoma): Descifrar los transcritos a nivel de secuencia
sin necesidad de secuenciar todo el genoma
Chip-seq: Identificación de las interacciones DNA-proteína interacciones
proteína-DNA
Epigenomica
Detectar ncRNA
Identificación de variaciones humanas asociados a enfermedades específicas:
SNP, CNV
……..
Detección de TODAS las alteraciones somáticas de un tumor
Cost per Genome.
Collins FS, Hamburg MA. N Engl J Med 2013. DOI: 10.1056/NEJMp1314561
Next generation sequencing: Aplicaciones
1930
1415
>4.800 publicaciones basadas en
next generation sequencing en
humanos (2007- 2013)
814
412
181
4
53
2007
2008
2009
2010
2011
2012
2013
Genome cancer atlas: Understanding genomics
Proyecto: The Cancer Genome Atlas (TCGA) : Septiembre 2009
•
National Cancer Institute (NCI) y el National Human Genome Research Institute
(NHGRI), $300 millones en 3 años
•
Secuenciación de 20 tipos de cáncer: Mama, Gastrointestinales (recto, colon,
estomago, etc), Ginecológicos (ovario, útero), Cabeza-cuello, Hematológicos,
Pulmón, Riñón……. (DIVERSAS HISTOLOGIAS)
•
Selección de un gran número de muestras, con anotación clínica, y
caracterización de:
• TODAS las regiones de perdida y ganancia cromosómica
• TODAS las mutaciones presentes en regiones codificantes de
TODOS los genes
• TODOS los reordenamientos cromosómicos
• TODAS las regiones de metilación
• Expresión de TODOS los genes del genoma
•
Selección de nuevas dianas terapéuticas
Multiple data types
Pilot studies
glioblastoma multiforme
(brain)
squamous carcinoma
(lung)
serous
cystadenocarcinoma
(ovarian)
Biospecimen Core
Resource with more
than 13 Tissue Source
Sites
7 Cancer Genomic
Characterization
Centers
3 Genome
Sequencing
Centers
Data Coordinating
Center
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Clinical diagnosis
Treatment history
Histologic diagnosis
Pathologic status
Tissue anatomic site
Surgical history
Gene expression
Chromosomal copy
number
Loss of heterozygosity
Methylation patterns
miRNA expression
DNA sequence
•
Evolución de las tecnologías de
secuenciación
•
Entender el problema clínico
NEJM 2013;369:11
Additional RAS Testing Changes mandatory
EU approved Amgen VECTIBIX© or Lilly/BMS/Merck Sereno ERBITUX® as first line treatment
only after favorable testing results for all KRAS and NRAS.
RAS Target
Exons
Codons
KRAS
(Current)
CRC
RAScan
KRAS Exon 2
12&13
40%
40%
KRAS Exon 3
59&61
4%
KRAS Exon 4
117&146
6%
NRAS Exon 2
12&13
3%
NRAS Exon 3
59&61
4%
NRAS Exon 4
Total
117&146
<1%
40%
57%
Pitfalls (I)
Research & gene discovery  Diagnosis
• For research purposes, terabase-scale data are generated.
The statistical and bioinformatics analyses are the most
challenging aspects.
• For diagnostic purposes, sequencing just the right regions,
the right amount of times
• Experimental approaches in research and target discovery
are not suitable for diagnostic purposes
http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/
Sorter by
n
Amplifications
16
Chromosome
490
Frameshift Mutations
101
Gene Symbol
490
Germline Mutations
76
Large Deletions
37
Missense Mutations
144
Nonsense Mutations
93
Other Mutations
26
Somatic Mutations
452
Splicing Mutations
63
Translocations
327
La mayor parte de las mutaciones en cancer
afectan de forma recurrente a ciertos
oncogenes y genes supresores
Common cancer pathways and targeted therapy
Activating mutation in the majority of major epithelial tumors
< 100 total mutations in epithelial tumors, < 50% activating,
Many rare (≈ 400) cancer associated mutations total (leukemia, sarcoma, …)
PI3K/AKT
Pathway
RAS/MEK
Pathway
Receptors
Downstream
Effectors
EGFR
CDK4
AKT1, 2, 3
BRAF
FGFR1,2,3
CTNNB1
PIK3CA
HRAS
KIT
FBXW7
PHLPP2
KRAS
VEGF
JAK2
FRAP (mTOR)
MEK1,2
PDGFRA
RET
RICTOR
NRAS
GNAQ
FLT3
PDPK1
RAF1
ERa
IDH1,2
PIK3R1
PRKAG1/2
MET
Dear1
MC1R
ALK
TNK2(ACK1)
Secuenciadores masivos de segunda generación
•
•
•
•
•
•
•
Pre-selección de dianas y rápida secuenciación en cientos de pacientes de forma
simultanea
Un único estudio permite el análisis de cientos de variaciones (mutaciones
puntuales , deleciones, amplificaciones, traslocaciones)
Análisis de 10ng de DNA, incluyendo muestras parafinadas
Estudio informático sencillo
Detección de variaciones representadas en menos de un 5% de los alelos
Mínimo flujo de trabajo: USO CLINICO (diagnóstico)
200 - 300€/muestra= 100Mb de DNA secuenciadas
Cancer panel
Regiones hotspot (sitios recurrentemente
COSMIC) de 50 oncogenes y genes supresores
-
mutados,
Contiene 207 amplicones y se requiere 10 ng de DNA
Identificación de ~2.800 variantes (mutaciones/SNP)
descritas e infinitas no descritas
Selección de marcadores basadas en pronóstico y
predicción
Ion Torrent workflow
1. Extracción de DNA, cuantificación (Bioanalyer): ~2 días
2. Generación de la librería (Ampliseq Cancer Panel,
Custom Panel…): ~8 horas
3. Preparación del DNA molde (PCR en emulsión): ~10 horas
4. Secuenciación: ~8 horas (500 flujos/chip 316)
5. Análisis: la duración depende de muchos factores:
-
Alineamiento de los productos amplificados con el DNA
referencia (genoma humano Hg19) (~5horas)
Localización de la variante (pb)
Detección de variantes (mutaciones, polimorfismos…. > 1 día)
6. Informe: búsqueda de información de las variantes identificadas
(recurrencia, significado funcional, patogenicidad, algoritmos de
predicción, PubMED, información en clinical trials…….)
7. Validación por PCR-SANGER de las variantes (5 días)
Ion Torrent workflow
1. Extracción de DNA, cuantificación (Bioanalyer): ~2 días
2. Generación de la librería (Ampliseq Cancer Panel,
Custom Panel…): ~8 horas
3. Preparación del DNA molde (PCR en emulsión): ~10 horas
4. Secuenciación: ~8 horas (500 flujos/chip 316)
5. Análisis: la duración depende de muchos factores:
Se secuencian
casos de forma
- Alineamiento de los
productos 16
amplificados
con simultanea
el DNA
-
referencia (genoma humano Hg19) (~5horas)
Localización de la variante (pb)
Detección de variantes (mutaciones, polimorfismos…. > 1 día)
6. Informe: búsqueda de información de las variantes identificadas
(recurrencia, significado funcional, patogenicidad, algoritmos de
predicción, PubMED, información en clinical trials…….)
7. Validación por PCR-SANGER de las variantes (5 días)
Resultados
Localización cromosómica
Gen
Chrom
chr2
chr4
chr4
chr4
chr4
chr4
chr5
chr5
chr5
chr5
chr7
chr7
chr10
chr11
chr13
chr13
chr13
chr17
chr22
Position
Gene Sym
212812097 ERBB4
1807894 FGFR3
55141055 PDGFRA
55152040 PDGFRA
55593464 KIT
55980239 KDR
112175676 APC
112175770 APC
149433596 CSF1R
149433597 CSF1R
55249063 EGFR
128851502 SMO
43613843 RET
534242 HRAS
28602292 FLT3
28610183 FLT3
48953823 RB1
7579472 TP53
24176287 SMARCB1
Target ID
Type
CHP2_ERBB4_1
SNP
CHP2_FGFR3_3
SNP
CHP2_PDGFRA_1
SNP
CHP2_PDGFRA_4
SNP
CHP2_KIT_3 SNP
CHP2_KDR_1SNP
CHP2_APC_5SNP
CHP2_APC_6SNP
CHP2_CSF1R_2
SNP
CHP2_CSF1R_2
SNP
CHP2_EGFR_6SNP
CHP2_SMO_5DEL
CHP2_RET_3 SNP
CHP2_HRAS_1SNP
CHP2_FLT3_3SNP
CHP2_FLT3_1SNP
CHP2_RB1_5 SNP
CHP2_TP53_2SNP
CHP2_SMARCB1_4
SNP
Análisis de la variante, cobertura (número
de lecturas de una secuencia….)
Zygosity
Het
Hom
Hom
Het
Het
Hom
Het
Het
Het
Het
Hom
Het
Het
Het
Het
Het
Het
Het
Het
Ref
T
G
A
C
A
C
A
G
T
G
G
GC
G
A
T
A
C
G
G
Variant
C
A
G
T
C
T
G
A
G
A
A
G
T
G
C
G
T
C
A
Var Freq
P-value
Coverage
Ref Cov
Var Cov
HotSp
63.15
3.16E-05
1042
384
658 --99.97
1.00E-10
3205
1
3204 --99.95
1.00E-10
2042
1
2041 --48.36
1.00E-10
4018
2074
1943 COSM
49.72
1.00E-10
5873
2948
2920 COSM
99.64
3.98E-09
835
3
832 --2.89
1.26E-02
1455
1413
42
47.67
3.98E-06
2555
1336
1218
29.81
1.00E-05
2825
1980
842 --31.17
1.00E-10
2660
1831
829 --99.93
3.98E-10
1478
1
1477 --40.1
1.08E-01
2000
1198
802 --49.11
2.00E-06
5760
2928
2829 --52.66
5.01E-06
4273
2022
2250 COSM
64.85
3.98E-06
3474
1221
2253 --53.74
5.01E-06
5143
2379
2764 --52.55
6.31E-05
706
335
371 --63.12
1.58E-05
705
260
445
51.27
7.94E-06
1141
556
585 COSM
Type: SNP* (cambio de un nt), Del/Ins
Heterocigosidad
Cambio del nt (Ref: genoma de referencia, Var: muestra)
Resultados: Tipos de variantes
- Variantes descritas anteriormente (SNP y/o Mutaciones) en exones o en intrones
-
base de datos dbSNP, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/
base de datos COSMIC, http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic)
Otras…..
- Variantes no descritas (intrón/exón): análisis del efecto sobre la proteína
- Cálculo de probabilidad de que una variante tenga o no efecto deletéreo
- Algoritmos de predicción
- Allamut software
- Provean: http://provean.jcvi.org/index.php
Interpretación biológica
Las alteraciones encontradas pueden asociarse a:
- Alteración en genes para los que existe terapia disponible:
- Inhibidores kinasa: ABL1 / ALK /JAK2/ KDR(VGFR2)/ERBB2/PI3K…………
- Inmunoterapia: ERBB2/EGFR/……
- Alteración asociada a vías de señalización concretas: PI3K / AKT/ FLT3,
PDGFRR, CSF1R, ….
- Alteración para las que haya terapias pre-clínica (www.clinicaltrials.gov)
- Alteración en genes sin terapia actual (CDH1,…).
- Alteraciones especificas descritas asociada a resistencia a determinados
fármacos (ej: p53 -taxanos, )
Potenciales dianas terapéuticas
Marcadores predictivos
Resultados de interés biológico
Cancer Panel MDA: Informe
Datos y resumen paciente
Breve descripción del análisis
Cancer Panel MDA: Informe
Resultados mutaciones
Interpretación
de
resultados
incluyéndose la información del efecto
de la variante sobre la proteína, la
existencia o no de terapia
----------------
Se incluye la metodología , el análisis
y los polimorfismos encontrados en la
muestra
Cancer Panel MDA (N=82)
Lesión
Mutaciones
Adenoca. Parótida
FGFR1: p.Asp127Metfs*24
Adenoca. Parótida
C. Epidermoide lengua
Adenoescamoso gland. salival
TP53: p.E285Q / p.E271Q
ERBB4: p.Arg938His
TP53: p.Arg181His / KDR: p.Gln472His
Mucinoso PD ovario
Endometrioide Ovario
Mucinoso Ovario
TP53: p.GLu298* / KRAS: p.Gly12Ser
PTEN: p.Arg130Gln / PI3KCA: p.Glu81Lys
CDH1: p.Ala304Gly (ND)
Leiomiosarcoma
RB1: c.1389+13C>T
EEC primario
PTEN: Del. de la posición splicing exón 8/9
EEC metástasis
PTEN: Del. de la posición splicing exón 8/9 / TP53: p.Pro72Ala
EEC (dif.escamosa)
KDR: p.Gln472His / KRAS: p.Gly12Asp
Seroso Ovario
TP53: p.Arg213*
Melanoma
NRAS: p.Gln61Lys
Adenoca. Páncreas metastásico
TP53: p.D258V / K-RAS: p.G12D / SMAD4: R135*
Ca. urotelial
FGFR3: p.Arg248Cys
Ca. Neuroendocrino (cel. peq)
PI3KCA: p.Glu542Gln / TP53: p.Arg280Thr
Ca. Epidermoide pene
FBW7: p.Ser462Tir / CDKN2A: p.Trp100* / TP53: p.Cys176Phe
Cancer Panel MDA (N=82)
Lesión
Mutaciones
Adenoca. Parótida
FGFR1: p.Asp127Metfs*24
Adenoca. Parótida
C. Epidermoide lengua
Adenoescamoso gland. salival
TP53: p.E285Q / p.E271Q
ERBB4: p.Arg938His
TP53: p.Arg181His / KDR: p.Gln472His
Mucinoso PD ovario
Endometrioide Ovario
Mucinoso Ovario
TP53: p.GLu298* / KRAS: p.Gly12Ser
PTEN: p.Arg130Gln / PI3KCA: p.Glu81Lys
CDH1:
p.Ala304Gly
5/82
casos(ND)
NV (6%)
Leiomiosarcoma
RB1: c.1389+13C>T
SE HAN IDENTIFICADO
MUTACIONES EN 65/77 CASOS (84%)
EEC primario
PTEN: Del. de la posición splicing exón 8/9
25/65 representan potenciales dianas terapéuticas (38,5%)
EEC metástasis
PTEN: Del. de la posición splicing exón 8/9 / TP53: p.Pro72Ala
14/65 representan marcadores predictivos (21,5%)
EEC (dif.escamosa)
KDR: p.Gln472His / KRAS: p.Gly12Asp
19/65 resultados de interés biológico (~30%)
Seroso Ovario
TP53: p.Arg213*
Melanoma
NRAS: p.Gln61Lys
Adenoca. Páncreas metastásico
TP53: p.D258V / K-RAS: p.G12D / SMAD4: R135*
Ca. urotelial
FGFR3: p.Arg248Cys
Ca. Neuroendocrino (cel. peq)
PI3KCA: p.Glu542Gln / TP53: p.Arg280Thr
Ca. Epidermoide pene
FBW7: p.Ser462Tir / CDKN2A: p.Trp100* / TP53: p.Cys176Phe
Carcinoma urotelial estadio IV: FGFR3 (p.Arg248Cys)
74 años- Progresión pulmonar y ganglionar.
FGFR3
IgG
hidrofóbico
Alteraciones en FGFR3 (mutaciones activantes)
- Acondrodisplasias (dwarfism)
- Cáncer: (70%) vejiga, cérvix, otros (próstata, colón)
TyrK
La mutación mas común S249C (exón7)
Activación constitutiva , dimerización independiente de la unión del
ligando
Carcinoma urotelial estadio IV: FGFR3 (p.Arg248Cys)
Tratamiento: www.clinicaltrials.gov (España)
Inhibidores tirosina quinasa (Novartis)
TKI258: Phase II Study of TKI258 in Advanced Urothelial Carcinoma
BGJ398: A Dose Escalation Study in Adult Patients With Advanced Solid Malignancies
Inmunoterapia: R3Mab (fase pre-clínica,
Fase I: noviembre 2013)
170 carcinomas vejiga
Mutaciones >70%: exón 7 y 10
Carcinoma adenoescamoso gland. salival
TP53: p.Arg181His / KDR p.Gln 472 His
69 años, carcinoma
adenoescamoso de alto grado de
posible origen salival, expresión
de receptores de andrógenos,
metástasis óseas
Carcinoma endometrioide de endometrio
54 años , EEC G3
KRAS: p.Gly12Asp / KDR p.Gln 472 His
Recidiva / Met ganglionar
Metástasis ovárica
Tumor primario
PTEN
B-CAT
KDR Kinase insert domain receptor Type III , TK (VEGFR2, FLK1)
PIGF
VEGF-A
VEGFR-1
(Flt-1)
Angiogenesis
VEGF-B
VEGF-C
VEGFR-2
(Flk-1/KDR)
VEGF-D
VEGFR-3
(Flt-4)
Angiogenesis
Lymphangiogenesis
Lymphangiogenesis
Mutaciones en KDR se han asociado a una mayor sensibilidad a: FTI-277,
Sorafenib, Imatinib, Sunitinib, AMG-706
http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/gene/overview?ln=KDR
KDR Kinase insert domain receptor Type III , TK (VEGFR2, FLK1)
Inmunoterapia:
Wadhwa R, et al. Ramucirumab: a novel antiangiogenic agent. Future
Oncol. 2013 Jun;9(6):789-95. doi: 10.2217/fon.13.68.
(Ramucirumab) IMC-1121B, en fase I
Pitfalls (II)
Heterogeneity of cancer
within a site and
between sites
N Engl J Med 2012;366:883-92.
The Sheikh Khalifa Bin Zayed Al Nahyan
Institute for Personalized Cancer Therapy
T9 program (Ten Thousand Tumors,Ten Thousand Tests, Ten
Thousand Therapies)
Coord. Gordon Mills and Stanley Hamilton
Funded: NIH grant (2011)
Objetivo: análisis de alteraciones en biomarcadores moleculares que
pueden ser utilizados para desarrollar nuevas pruebas de diagnóstico y guías
de tratamiento
Pacientes metastásiscos
Cancer Panel (Ion Torrent)
Selección de
terapia dirigida
The Sheikh Khalifa Bin Zayed Al Nahyan
Institute for Personalized Cancer Therapy
T9 program (Ten Thousand Tumors,Ten Thousand Tests, Ten
Thousand Therapies)
1005 pacientes reclutados
Coord. Gordon Mills and Stanley Hamilton
Funded: NIH grant
1000(2011)
Pacientes consentimiento informado
841 Material suficiente para su estudio
Objetivo: análisis de alteraciones en biomarcadores moleculares que
827 Pacientes con alguna alteración (98%)
pueden ser utilizados para desarrollar nuevas pruebas de diagnóstico y guías
de tratamiento
GAP MDA-USA, Abril 2013
Pacientes metastásiscos
Cancer Panel (Ion Torrent)
Selección de
terapia dirigida
MOST
Sponsors and Collaborators:
Centre Leon Berard
National Cancer Institute, France
Summary
MOST is a phase II trial conducted in adult patients with an advanced solid tumor in
progression after at least 1 prior treatment regimen. The study aims to assess
whether a 12-week treatment with a targeted therapy selected based on the
alteration(s) detected in the tumor is sufficient to stabilize the disease compared with
a longer treatment, for all patients presenting this alteration, regardless of the
primary disease site or cancer type. All the targeted therapies administered in MOST
study already obtained a marketing authorization (MA) but will be evaluated in
indications other than those defined in their MA.
Assigned Interventions
• Drug: Nilotinib (400 mg BID)Patients whose tumor harbors mutations of ABL1, KIT, PDGFRA,
PDGFRB, DDR1, DDR2, CSF1R, or amplification/translocation of the genes and/or of the
ligands.
• Drug: Everolimus (10 mg QD)Patients whose tumor harbors mutations of the PIK3CA,
PIK3R1, AKT1, AKT2, mTOR genes, or with TSC1, TSC2 or PTEN loss
• Drug: Sorafenib (400 mg BID)Patients whose tumor harbors mutations of VEGFR1-3,
PDFGRB, FLT3, BRAF (other than V600 mutations), CRAF, KRAS or RET or
amplification/translocation of the genes and/or of the ligands
• Drug: Lapatinib (1500 mg QD)Patients whose tumor harbors mutations or amplifications of
HER2
• Drug: Pazopanib (800 mg QD)Patients whose tumor harbors mutations of VEGFR1-3,
PDGFRA, PDGFRB or KIT or amplification /translocation of the genes and/or of the ligands
Pitfalls (III)
Driver vs. passenger genetic abnormalities
• Mutation can be passenger (sign of genomic instability), even in well known
disease-associated oncogenes.
• Gastrointestinal stromal tumor (GIST)
• CKIT activating mutation  TKI therapy (Imatinib)
• V559D  response
• L576P  Not Response
Antonescu. The GIST paradigm: lessons for other kinase-driven cancers. J Pathol 2011;223(2):251
Conca et al. Activate and resist: L576P-KIT in GIST. Mol Cancer Ther 2009;8(9):2491
From: KIT as a Therapeutic Target in Metastatic Melanoma. Carvajal RD, et al
JAMA. 2011;305(22):2327-2334. doi:10.1001/jama.2011.746
Phase II trial: 28 (of 51) patients whose tumors harbored KIT mutations or amplification were
treated with Imatinib mesylate
None of the patients who were treated had mutations in BRAF , NRAS , or GNAQ
Result:
• Durable responses were observed in 4 patients.
• The predetermined end point (of 5 responses of 25 evaluable patients) was not met.
Date of download: 6/10/2012
Copyright © 2012 American Medical
Association. All rights reserved.
From: KIT as a Therapeutic Target in Metastatic Melanoma. Carvajal RD, et al
JAMA. 2011;305(22):2327-2334. doi:10.1001/jama.2011.746
• Unexpected high rate of failure of targeted therapies
• Even for patients with the Biomarker only subpopulations of patients
benefit, usually short term
• Responses may be limited to tumors harboring KIT alterations of functional
relevance:
•
•
Cases whose tumors harbored
mutations recurrently found in
GIST or melanoma
Mutations associated with a
mutant to wild-type allele ratio of
more than 1 (positive selection
of the mutated allele )
Date of download: 6/10/2012
Copyright © 2012 American Medical
Association. All rights reserved.
Mutaciones Driver vs Passenger
•
•
•
Driver mutation -Mutación somática conductora- produce una ventaja selectiva por
crecimiento diferencial (> oncogenes)
Passenger mutation -Mutación Pasajera- alteraciones neutrales que no
proporcionan ninguna ventaja al tumor (distintas en canceres similares, diferentes
entre individuos).
Algunas mutaciones passenger pueden convertirse en conductoras (resistencia a
terapia, confieren ventaja selectiva frente al tratamiento: recurrencia)
Hay aprox. 1014 células en humanos, que pasan por 1016 divisiones celulares durante
una vida. La frecuencia de mutación espontánea (sin fumar, haciendo vida sana, etc)
es de 10-6 por gen por división celular: 1010 (diez mil millones) ocasiones para mutar
algún gen “esencial”.
CONCLUSIONES
•
El uso clínico de técnicas de secuenciación masiva (NGS) en el diagnóstico
rutinario del cáncer es HOY una realidad.
•
El análisis de rutas (pathways) comunes permitirá una selección más
racional de terapia.
•
“Pitfalls”:
•
Las técnicas, procedimientos y objetivos en investigación son
diferentes a las empleadas en clínica.
•
Heterogeneidad del cancer.
•
Alteraciones driver vs. passenger.
•
Serán necesarios ensayos clínicos académicos que tengan en
consideración esta nueva visión.
•
INTEGRAR: tecnología de Diagnóstico Molecular + análisis racional de
datos + contexto clínico-patológico.
•
Retos futuros:
•
Regulación y acreditación
•
Educación