Detección de leptospiras patógenas en fuentes de agua de la

Detección de leptospiras patógenas en fuentes de agua de la

MICROBIOLOGÍA
DETECCIÓN DE LEPTOSPIRAS PATÓGENAS EN FUENTES DE AGUA DE
LA CIUDAD DE CASILDA, SANTA FE
1
FRANCOIS Silvina; 2AROCENA Gastón; 3PETRAKOVSKY Jessica; 4GATTARELLO
Virginia; 4CORREA David; 1Poli, Georgina; 5BRIHUEGA Bibiana; 5GRUNE Sylvia;
1
ANTHONY Lilian; 4GUALTIERI Catalina; 4ARESTEGUI Mirta.
1
Servicio de Diagnóstico de Leptospirosis, Fac. de Cs. Veterinarias, Univ. Nac. de
Rosario, Bv. Colón y Bv. Spangemberg s/n, Casilda, Santa Fe. 2Dep. de Biología
Molecular, DILAB SENASA, Martinez, Bs. As. 3Laboratorio de Referencia para
Leptospirosis de la OIE, DILAB SENASA. 4Cátedra de Sueros y Vacunas, Fac. de Cs.
Veterinarias, UNR. 5Lab. de Referencia para Leptospirosis de la OIE, Inst. de
Patobiología, CICVyA, INTA Castelar, Bs. As. [email protected]
INTRODUCCIÓN
Las especies del género Leptospira son los agentes causales de la leptospirosis1. En
Argentina reviste carácter endémico. En 1980, las especies patógenas del género
fueron diferenciadas en base a estudios de hibridización ADN-ADN, reclasificándose
en nuevas especies: L. interrogans, L. kirschneri, L. weilii, L. noguchii, L.
borgpetersenii, L. santarosai, L. meyeri, L. inadai, L. faineri y L. alexanderi1.
Mayoritariamente, las infecciones son causadas por cepas de L. interrogans y L.
borgpetersenii2. En los animales de producción, la leptospirosis produce grandes
pérdidas económicas por agalactia, abortos y muerte perinatal. La infección puede ser
transmitida al humano, causando una enfermedad aguda que si no es tratada a tiempo
puede ser mortal. La transmisión de la enfermedad, ocurre tanto por contacto directo
con orina infectada como indirecto por exposición al medio ambiente contaminado. El
agua representa uno de los vehículos más importantes para la transmisión indirecta.
La exposición a las leptospiras puede estar asociada a la aparición de brotes en
temporadas de lluvias e inundaciones en zonas urbanas con condiciones sanitarias
deficientes, a ocupaciones laborales que revisten un alto riesgo de contagio como los
trabajadores rurales, veterinarios, entre otros. También es de gran importancia la
exposición recreacional asociada con turismo aventura en áreas endémicas, han
ocurrido brotes importantes después de eventos atléticos2,3. El agua es un factor clave
para la sobrevida y la transmisión, si presenta un valor de pH entre 7 y 8 las
leptospiras patógenas pueden sobrevivir en ella por varias semanas. Por esta razón,
son necesarios los estudios epidemiológicos para investigar fuentes de agua
medioambientales4. Los métodos moleculares de diagnóstico, basados en la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR), por su alta sensibilidad y especificidad resultan
herramientas útiles para este tipo de investigaciones.
El objetivo fue aislar leptospiras de fuentes de agua que vierten en el canal Candelaria
que atraviesa la ciudad de Casilda, Santa Fe y caracterizarlas mediante métodos
moleculares.
MATERIALES Y MÉTODOS
Toma de muestras
Mediante el uso de elementos cartográficos, se analizó el largo del canal y sus
vertientes. Se midió el pH del agua de las zanjas que desembocan en dicho canal y se
tomaron 6 muestras de agua de diferentes vertientes, que presentaban un valor de pH
superior a 7,5. También se tomaron 5 muestras de agua de diferentes sitios de un
campo de cría de ganado bovino ubicado en el área rural de Casilda. Las muestras se
tomaron de las diversas fuentes de agua, sumergiendo un colector estéril a una
profundidad de 15 cm cerca de las orillas.
Bacteriología
Las muestras se sembraron previa filtración con filtros Millipore de 0,22 µm, en medios
EMJH y Fletcher para aislamiento de leptospiras. Se incubaron en estufa a 30 °C por
un lapso de 20 días, observándolos semanalmente mediante microscopía de campo
oscuro.
Determinación por PCR
Los aislamientos obtenidos se enviaron al Laboratorio de Referencia para
Leptospirosis de la OIE, DILAB - SENASA; donde se procesaron por PCR, para
determinar si se trataba de especies patógenas. La PCR se llevó a cabo bajo
condiciones especificas5. En la reacción de PCR se utilizaron dos juegos de primers,
los cuales amplifican secuencias del genoma de leptospiras patógenas.
Tipificación genotípica
Los aislamientos obtenidos, compatibles con Leptospira spp se enviaron para su
tipificación al Centro de Referencia de Leptospirosis de la OIE, del INTA Castelar,
Buenos Aires, Argentina. La técnica molecular utilizada para genotipificar fue MultipleLocus Variable-number tandem repeats Analysis (MLVA). Esta fue implementada con
un set de primers para la especie patógena Leptospira interrogans sensu stricto. Los
siguientes locus fueron flanqueados para discriminar las cepas, VNTRS: 4, 7, 9, 10,
19, 23 y 31. Para las restantes especies patógenas L. borgpetersenii y L. kirschneri,
los locus flanqueados fueron: VNTR-Lb4, VNTR-Lb5, VNTR-4bis, VNTR-7bis, VNTR10bis.
RESULTADOS
Se obtuvieron 10 aislamientos de Leptospira spp., 5 provenientes de aguas de zanjas
vertientes al canal Candelaria y 5 de agua estancada de los lugares seleccionados
dentro del campo estudiado. De estos, 2 de agua de zanjas y 3 de fuentes de agua
rurales resultaron positivos a la PCR, determinando que se trataba de cepas
patógenas. Mediante la genotipificación por MLVA se pudo observar que uno de los
aislamientos patógenos obtenido de aguas vertientes al canal mostró un patrón
correspondiente a la especie L. borgpetersenii. Los restantes no mostraron un perfil
identificable.
DISCUSIÓN
En este estudio se pudo observar que la metodología empleada para aislar Leptospira
a partir de fuentes de agua contaminada, resultó ser una práctica eficaz. Se observó
además, que estas bacterias son capaces de sobrevivir en aguas servidas con valores
de pH que van de la neutralidad al lado alcalino de la escala. El por qué de la
sobrevida de las cepas aisladas de muestras de aguas tomadas a 15 cm de
profundidad en la zona de las orillas, quizás podría explicarse por razones bióticas y
abióticas del micro medio ambiente, que favorecen la supervivencia de la bacteria,
tales como temperatura del agua, pH, presencia de oxígeno y disponibilidad de
nutrientes.
CONCLUSIÓN
La metodología genotípica implementada, nos permitió identificar aislamientos
patógenos de Leptospira de fuentes de agua urbanas y rurales, e identificar una cepa
de L. borgpetersenii, lo que significa un gran avance para entender la epidemiología de
la leptospirosis en esta ciudad y para brindarle a las autoridades sanitarias la
posibilidad de realizar las tareas correspondientes de prevención y control.
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