Descargar - Asociación Argentina de Microbiología

Transcripción

Nº2
VOL 42
2010
REVISTA ARGENTINA DE
MICROBIOLOGÍA
PUBLICACIÓN
DE LA
ASOCIACIÓN ARGENTINA
DE
MICROBIOLOGÍA
PUBLICACION DE LA ASOCIACION ARGENTINA DE MICROBIOLOGIA
Aparece en Biological Abstracts, Chemical Abstracts, Veterinary Bulletin, Index Veterinario, EMBASE (Excerpta Medica)
Medline (Index Medicus), Tropical Diseases Bulletin, Abstracts on Hygiene and Communicable Diseases, Literatura Latinoamericana en Ciencias de la Salud (LILACS), Periódica, LATINDEX, SciELO y Science Citation Index Expanded.
DIRECTORA
Silvia Carla Predari
Instituto de Investigaciones Médicas Alfredo Lanari - UBA
SECRETARIO DE REDACCIÓN
Gerardo A. Leotta
Facultad de Ciencias Veterinarias - UNLP - CONICET
COMITÉ EDITOR
Alicia I. Arechavala
Claudia I. Menghi
Hospital Francisco J. Muñiz - GCBA
Hospital de Clínicas - Facultad de Farmacia y Bioquímica - UBA
José A. Di Conza
Elsa C. Mercado
Facultad de Farmacia y Bioquímica - UBA - UNL - CONICET
Instituto de Patobiología - INTA
Ana M. Jar
Héctor R. Morbidoni
Facultad de Ciencias Veterinarias - UBA
Facultad de Ciencias Médicas - UNR - CIUNR
ASESORES CIENTÍFICOS
C. Bantar
J. C. Basilíco
M. I. Berría
H. M. Bianchini
N. Binsztein
M. M. Bracco
R. Campos
G. Carballal
A. Cataldi
J. J. Cazzulo
S.R. Costamagna
C. Coto
M. D’ Aquino
R. de Torres
A. H. Frade
A. Gentile
A. Giri
J. E. González
S. González Ayala
N. Leardini
H. Lopardo
W. P. Mac Cormack
D. Masih
M. Mollerach
R. Negroni
F. Nicola
T. Orduna
R. Raya
V. Ritacco
H. R. Rodríguez
A. P. de Ruiz Holgado
A. Schudel
L. Scolaro
F. Sesma
R. Soloaga
H. Terzolo
G. Vaamonde
ASESORES EN EL EXTERIOR
A. Amoroso (Bélgica)
J. Arbiza (Uruguay)
J. A. Ayala (España)
P. Feng (EE.UU.)
E. García López (España)
M. Gottschalk (Canadá)
R. Guerrero (España)
M.J.Mendes Giannini (Brasil)
M. Philipp (EE.UU.)
F. Queiroz Telles (Brasil)
A. Restrepo (Colombia)
G. San Blas (Venezuela)
G. Schmunis (EE.UU.)
A. Steinbüchel (Alemania)
M. Tolmasky (EE.UU.)
J. Vila Estape (España)
Secretaría: Deán Funes 472, C1214AAD Buenos Aires; Tel/FAX: 54-11-4932-8858, 54-11-4932-8948; E-mail: [email protected], http://www.aam.org.ar
Suc. 4 - B
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Registro Nacional de la Propiedad Intelectual Nº 269649.
I.S.S.N. 0325-7541
Correo
Argentino
SUSCRIPCIÓN (cuatro números anuales)
Socios AAM
U$ 120
Argentina no socios U$ 240
América Latina
U$S 100
Otros países
U$S 200
Franqueo Pagado
Concesión Nº 4195
Tarifa Reducida
Concesión Nº 628
AAM INFORMA
CURSOS Y TALLERES
Para mas información visite nuestra pagina web (www.aam.org.ar),
sección Cursos y Talleres
MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS RÁPIDOS: SU VALIDACIÓN
21 de Octubre 2010
Organiza: Subcomisión de Buenas Practicas-DAMyC
TALLER INTERNACIONAL DE RIZOSFERA, BIODIVERSIDAD Y AGRICULTURA SUSTENTABLE (TIRBAS 2010)
21 y 22 de Octubre 2010
Organiza: DiMAyA
ACTUALIZACION SOBRE BOTULISMO DEL LACTANTE Y ALIMENTARIO. USOS DE LA TOXINA BOTULINICA
5 de Noviembre 2010
Organiza: DAMyC
XVIII CURSO DIAGNOSTICO VIROLOGICO RAPIDO
8 al 26 de Noviembre 2010
Organiza: SAV
IX CURSO DE ACTUALIZACIÓN EN INTEGRONES
Organiza: Microbiología General
CURSO BIOSEGURIDAD
Organiza: Filial Rosario
SONRÍELE A LOS PAPERS EN INGLÉS
5-12-19 Y 26 de Abril 2011
Organiza: Comisión Directiva AAM
CONGRESOS Y JORNADAS
Para mas información visite nuestra pagina web (www.aam.org.ar),
sección Congresos y JornadasCongresos y Jornadas
VI REUNIÓN CIENTÍFICA ANUAL DE LA SOCIEDAD ARGENTINA DE BACTERIOLOGÍA,
MICOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA CLÍNICAS: BACTERIEMIAS, FUNGUEMIAS Y PARASITEMIAS
22 de Noviembre 2010
XXX REUNIÓN CIENTÍFICA ANUAL DE SAV 2010
8 al 11 de Diciembre 2010
BRUCELLOSIS 2011
INTERNATIONAL RESEARCH CONFERENCE
21 al 23 de Septiembre 2011
X CONGRESO ARGENTINO DE VIROLOGÍA, III SIMPOSIO DE VIROLOGÍA CLÍNICA
26 al 29 de Septiembre 2011
XIV JORNADA ARGENTINA DE MICROBIOLOGÍA
3ª JORNADA DE MICROBIOLOGÍA E INFECTOLOGÍA DEL NEA - MINEA 2011. RESISTENCIA CHACO
29 de Septiembre al 1 de Octubre 2011
XII CONGRESO ARGENTINO
DE MICROBIOLOGÍA
VI CONGRESO DE LA SOCIEDAD ARGENTINA DE
BACTERIOLOGÍA, MICOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
CLÍNICA (SADEBAC)
I CONGRESO DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y
AMBIENTAL (DiMAyA)
17 al 20 de octubre de 2010
Palais Rouge
Jerónimo Salguero 1433/49 (C1177AFA)
Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina
COMITÉ ORGANIZADOR DEL
XII CONGRESO ARGENTINO
DE MICROBIOLOGÍA
Presidente: Ricardo Negroni
Vicepresidentes: Marta Tokumoto
Jorge Reinheimer
Isabel Bogado
Secretarias Generales: Alicia Arechavala
María Alejandra Picconi
Prosecretaria: Cristina Iovannitti
Tesorera: Adriana De Paulis
Protesorera: Paula Gagetti
Secretaria de Relaciones Institucionales: Daniela Centrón
Secretaria Técnica: Adriana Sucari
Colaboradores Secretaria Técnica: María Soledad Ramírez
María Paula Quiroga
Secretarios Científicos: Liliana Guelfand
Horacio Salomón
Comité Científico
División DiMAyA: Susana Vázquez e Inés García
División DAMYC: Virginia Fernández Pinto y Guillermo Guirín
División SADEBAC: Carlos Vay y Magdalena Pennini
División SAV: Victoria Preciado, Viviana Mbayed y
Oscar Taboga
Vocales: Filial Córdoba: Marina Bottiglieri
Filial Cuyo: Alejandro Sturniolo
Filial NOA: Aída Suárez
Filial NEA:Luis Merino
Filial Sur: Ana Paris de Baeza
Filial Rosario: Perla Hermida Lucena
Filial Santa Fe: Francisco Salamone
Comité Organizador VI Congreso de SADEBAC
Presidente: Jorgelina Smayevsky
Vicepresidente: María I. G. de Fernández
Secretarios Científicos: Horacio Lopardo, Carlos Vay
Comité Científico: Magdalena Penini, Paula Gagetti, Angela Famiglieti,
Viviana Ritaco, Sonia Arduino, Marta Rocchi,
Emilce Ménze, Rodolfo Casero, Gabriela Santiso,
Comité Organizador I Congreso de Microbiología Agrícola y Ambiental
Presidente: Fabricio Cassan
Vicepresidente: Claudio Penna
Comité Científico Asesor: Susana Vázquez, Inés García de Salamone,
Diego Sauka, Lucas Ruberto
XII Congreso Argentino de Microbiología 2010
VII
COMISIÓN DIRECTIVA
ASOCIACIÓN ARGENTINA DE MICROBIOLOGÍA
Presidente
Manuel Gómez Carrillo
Vicepresidente
Marta Rocchi
Secretaria
María Cecilia Freire
Secretaria de actas
María I. G. Fernández
Prosecretaria
María Alejandra Picconi
Tesorera
Adriana De Paulis
Protesorero
Claudio Penna
Vocal Titular 1°
Jorge Santoianni
Vocal Titular 2°
María José Gallego
Vocal Titular 3°
Marta Rivas
Vocal Titular 4°
María Soledad Ramírez
Vocal Suplente 1°
Adriana Sucari
Vocal Suplente 2°
Diego Sauka
Vocal Suplente 3º
Manuel Boutureira
Vocal Suplente 4º
Gustavo Giusiano
VIII
Revista Argentina de Microbiología (2010) 42 - Supl. 1
COMISIÓN DIRECTIVA
SOCIEDAD ARGENTINA DE
BACTERIOLOGÍA,
MICOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
CLÍNICA - SADEBAC
COMISIÓN DIRECTIVA
DIVSIÓN AGRÍCOLA Y
AMBIENTAL - DiMAyA
Presidente
Horacio Lopardo
Presidente
Fabricio Cassán
Vicepresidente
Angela Famiglietti
Vicepresidente
Claudio Penna
Secretaria general
Nora A. Gómez
Secretario
Diego Sauka
Prosecretario
Marcelo Galas
Tesorera
Inés García de Salamone
Secretaria de actas
Patricia Vidal
Secretaria de actas
Susana Vázquez
Tesorera
María Adelaida Rosetti
Vocal Titular 1º
Lucas Ruberto
Protesorera
María José Rial
Vocal Titular 2º
Rosana Massa
Vocal Titular 1º
Adriana Sucari
Vocal Suplente 1º
Mónica Baldini
Vocal Titular 2º
Paula Gagetti
Vocal Suplente 2º
Diego Libkind
Vocal Titular 3º
Magdalena Pennini
Vocal Titular 4º
Gabriela Santiso
Vocal Suplente 1º
Marta Rocchi
Vocal Suplente 2º
Marta Hofman
Vocal Suplente 3º
Patricia Paulin
Vocal Suplente 4º
Ana María Togneri
VOLUMEN 40 O SUPLEMENTO 1 2010
XII Congreso Argentino de Microbiología
VI Congreso de la Sociedad Argentina de
Bacteriología, Micología y Parasitología
Clínica (SADEBAC)
I Congreso de Microbiología Agrícola y
Ambiental (DiMAyA)
INDICE
Comité Organizador
Comisión Directiva de la Asociación Argentina de Microbiología
Comisión Directiva SADEBAC y DiMAyA
Mensaje del Presidente de la Asociación Argentina de Microbiología
Mensaje de la Presidente del VI Congreso de SADEBAC
Mensaje del Presidente del XII Congreso Argentino de Microbiología
Mensaje del Presidente del I Congreso Agrícola y Ambiental
Comunicaciones Orales
Posters
Índice de Autores
Instrucciones para Autores
1
25
263
281
VOLUMEN 42 O SUPLEMENTO 1 2010
VI Congreso de la Sociedad Argentina de
Bacteriología, Micología y Parasitología
Clínica (SADEBAC)
I Congreso de Microbiología Agrícola y
Ambiental (DiMAyA)
INDEX
Conference Organizing Committee
Executive Board of the Argentine Society for Microbiology
Executive Board of SADEBAC and DiMAyA
Argentine Association for Microbiology President’s Message
VI SADEBAC Conference President’s Message
XII Argentine Microbiology Conference President’s Message
I DiMAyA Conference President’s Message
Oral Sessions
Poster Sessions
Author Index
Instructions for Authors
1
25
263
281
I
Mensaje del Presidente
de la Asociación Argentina de Microbiología
Estimados Colegas
Es para mí un gran honor, en nombre de la Asociación Argentina de Microbiología, darles la bienvenida a nuestro XII Congreso Argentino de Microbiología que desarrollaremos en la Ciudad de Buenos Aires.
Como ocurre cada tres años, la AAM organiza un
congreso de carácter nacional de nuestra especialidad
con el firme objetivo de brindar un escenario que permita la expresión de la producción científica y técnica
más destacada de la microbiología.
Fundada en 1948, la AAM incorporó siete filiales
desde 1961, logrando hoy en día una amplia representación en todo nuestro territorio nacional. Al comenzar la década de los ochenta se incorporó como división la Sociedad Argentina de Virología (SAV) y se
crearon las divisiones Sociedad Argentina de Bacteriología Clínica (SADEBAC) y Alimentos, Medicamentos y Cosméticos (DAMyC). Desde el 2005, la microbiología agrícola y ambiental se ve representada en
la división DiMAyA.
La AAM tiene una larga historia en la capacitación
continua de microbiólogos no solo a través de sus cursos y talleres sino también por medio de sus congresos y jornadas. El primer congreso de la AAM, organizado en 1976 tuvo este objetivo y desde ese momento
se viene organizando de manera ininterrumpida.
Para una Asociación que reúne diversas disciplinas
como la nuestra, que crece día a día y que tiene representación en amplias regiones del país, nuestros
congresos deben ser también un marco para conocernos, intercambiar conocimiento y propiciar colaboraciones. Sin duda es una oportunidad de crecimiento y progreso para todos nosotros.
Hace casi tres años la Comisión Directiva confió al
Dr. Ricardo Negroni la presidencia y conformación del
Comité Organizador de nuestro congreso, invitando
además a nuestras Divisiones a sumarse y compartir
este mismo escenario en la medida de sus posibilidades. El interés mostrado por todas las Divisiones, Filiales, Subcomisiones y Grupos de Trabajo, que han
contribuido con la labor de sus integrantes, sus ideas
y participación, ha culminado con la conformación de
un programa científico que no dudo hará de este congreso un encuentro especial.
Quiero agradecer al Dr. Negroni, a las Divisiones
SADEBAC y DiMAyA que están organizando sus congresos de manera conjunta y a todos los miembros que
integran sus Comités Organizadores por haber desarrollado un magnífico marco para alcanzar nuestro
objetivo. Sólo nos queda aprovecharlo.
Manuel Gómez Carrillo
Presidente
Asociación Argentina de Microbiología
IX
Mensaje de la Presidente del VI Congreso de la
Sociedad Argentina de Bacteriología,
Micología y Parasitología Clínica (SADEBAC)
La Sociedad Argentina de Bacteriología, Micología y Parasitología Clínica, división de la Asociación Argentina de Microbiología, convoca nuevamente a los profesionales involucrados en el diagnóstico, tratamiento y prevención de las enfermedades infecciosas a participar de nuestra actividad científica
más importante del año 2010, el VI Congreso de
SADEBAC. Este evento tiene una significación especial ya que se realiza en el marco del XII Congreso de
la Asociación Argentina de Microbiología, con el espíritu de poder brindar a nuestros asistentes una visión
global de la Microbiología en nuestro país. Pese a los
continuos avances de la ciencia, las infecciones continúan siendo en el mundo, una de las causas más frecuentes de morbi-mortalidad. En muchos casos, estas
muertes serían evitables mediante diagnósticos rápidos, certeros, políticas eficientes de prevención y uso
adecuado de los antimicrobianos. Esta función es atri-
buto del microbiólogo clínico integrado en el equipo
multidisciplinario de salud. El comité científico ha planificado un ambicioso programa enfocado desde las
patologías a los microorganismos, en el cual conviven
en un mismo nicho ecológico las bacterias, los hongos, los virus y los parásitos, peleando palmo a palmo con los nuevos y viejos antimicrobianos, los inmunomoduladores, las vacunas y los programas de control de infecciones y de mejora continua de la calidad.
Les agradecemos a todos por acompañarnos a transitar estos primeros 29 años de nuestra sociedad y los
invitamos a participar y colaborar activamente en la
misma. Sus inquietudes y aportes serán bienvenidos
y su invalorable presencia contribuirá al éxito de este
Congreso. Cordialmente,
Jorgelina Smayevsky
Presidente VI Congreso SADEBAC
X
Mensaje del Presidente del XII Congreso
Argentino de Microbiología
La Comisión Directiva de la Asociación Argentina de
Microbiología (AAM) me ha conferido el alto honor de
designarme Presidente del próximo Congreso Argentino de Microbiología, que tendrá lugar en la ciudad de
Buenos Aires entre los días 17 y 20 de octubre de
2010. Es la reunión científica más importante organizada por la AAM y se lleva a cabo cada tres años.
La AAM ha sobrepasado ya las seis décadas de
existencia y su finalidad es mejorar y difundir los conocimientos microbiológicos en las más diversas
áreas. Durante este prolongado lapso su desarrollo ha
sido constante y hoy agrupa a más de 2000 cultores
de las distintas ramas de la Microbiología. La AAM es
una organización federal, que cuenta con siete filiales
en el interior del país y posee cuatro divisiones: la
Sociedad Argentina de Virología, la Sociedad Argentina de Bacteriología Clínica (que recientemente incluyó a micólogos y parasitólogos), la División de Microbiología de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos
(DAMyC) y la nueva División de Microbiología Agrícola y Ambiental. Tanto las filiales como las divisiones
gozan de una cierta autonomía y organizan diversas
actividades científicas propias.
La AAM publica la Revista Argentina de Microbiología que ha editado ya 41 volúmenes, emite cuatro
números por año y su nivel científico ha permitido que
sea citada por las más prestigiosas organizaciones dedicadas a la recopilación de bibliografía como
Chemical Abstract, Science Citation Index Expanded,
Medline (Index Medicus), etc.
Es la segunda vez que me toca organizar un Congreso Argentino de la especialidad. En esta oportunidad, la propia complejidad de la Asociación y la evolución de los conocimientos de la microbiología, ha
tornado indispensable contar con una Comisión Organizadora amplia, laboriosa y capaz, que sirva a la vez
de órgano consultor y de ejecutor de las acciones necesarias para que el Congreso pueda llegar a buen fin.
Es así como he elegido un plantel de colaboradores
que, a primera vista, puede parecer muy extenso, pero
que es representativo de las distintas áreas de nuestra especialidad y cuya capacidad individual y colectiva estoy seguro que será probada en esta oportunidad. Debe tenerse en cuenta además que en esta
oportunidad se llevarán a cabo, simultáneamente
con esta reunión científica general, los Congresos
Argentinos de dos de nuestras divisiones, SADEBAC
y Microbiología Agrícola y Ambiental.
Sobre el Programa Científico, procuramos organizar las actividades de forma tal que no existan sesiones simultáneas de asuntos relacionados, para ello
procuramos que las actividades de cada división estén dispuestas en el tiempo de una forma lineal, sin
superposiciones y que existan a la vez conferencias
plenarias en donde se junten miembros de distintas
divisiones para considerar temas de interés general.
Estas conferencias estarán a cargo de personalidades científicas de reconocido prestigio y procurarán mostrar el impacto social de la microbiología en sus distintas facetas.
La situación económica del país y del mundo, así
como la de la propia AAM, no va a permitir contar con
un número elevado de invitados extranjeros. Hemos
procurado sin embargo, que los expositores locales
sean del más alto nivel y traer al mayor número de personalidades internacionales para las cuales podamos
conseguir financiación de sus gastos.
El local seleccionado para la realización de este
evento científico es cómodo y adecuado a las necesidades de un Congreso de la magnitud del que estamos organizando. Estoy seguro que dejará satisfecho
a los concurrentes en cuanto a la comodidad de sus
ambientes, aislamiento acústico y servicios esenciales.
Deseo agradecer muy especialmente la cooperación del Sr. Presidente de la Asociación Argentina de Microbiología y a su Comisión Directiva durante este proceso de organización del Congreso.
En nombre del Comité Organizador del Congreso
Argentino de Microbiología invito a todos los interesados en la Microbiología a participar de esta Reunión
Científica para contribuir al éxito de la misma.
Por último nuestro reconocimiento las entidades
oficiales de la República Argentina y del exterior,
así como a las empresas comerciales que apoyaron económicamente esta reunión científica, sin
cuya decidida colaboración este Congreso no podría realizarse.
Dr. Ricardo Negroni
Presidente del XII Congreso Argentino de Microbiología
XI
Mensaje del Presidente del I Congreso de
Microbiología Agrícola y Ambiental (DiMAyA)
Estimados colegas:
La Comisión Organizadora del I Congreso Argentino de Microbiología Agrícola y Ambiental, así como la
Comisión Directiva de la División de Microbiología
Agrícola y Ambiental (DiMAyA), quieren darles la bienvenida al primer congreso nacional en la especialidad,
en el Marco del XIII Congreso de Argentino de Microbiología (XIII CAM). Para tal fin, hemos asumido un
altísimo compromiso de trabajo y desde hace más de
dos años hemos esculpido lenta y detalladamente cada
una de las facetas de nuestro Congreso, que esperamos sea de la calidad y del nivel académico-científico
que todos ustedes anhelan. Las actividades que se desarrollarán en el marco de nuestro Congreso fueron
acordadas sobre la base de dos grandes áreas de conocimiento de la Microbiología General, hoy altamente demandantes y en plena emergencia en nuestro
país. Dentro de la especialidad de la Microbiología
Agrícola hemos planificado el desarrollo de dos conferencias plenarias y dos mesas redondas que abar-
caran principalmente las comunidades microbianas en
suelos agrícolas, las bacterias promotoras del crecimiento vegetal y la microbiología dentro de un esquema de agricultura sustentable. En el área de la Microbiología Ambiental, hemos planificado dos conferencias plenarias y cinco mesas redondas que abarcaran
la microbiología de aguas y suelos, la bioremediación
de ambientes contaminados y el estudio de la estructura y funcionalidad de comunidades microbianas en
el medio ambiente. Adicionalmente, hemos considerado la presentación de trabajos científicos seleccionados, que serán expuestos y defendidos por sus autores, en el marco de dos mesas redondas, una de
cada especialidad.
Nuestra joven División les da la bienvenida y los invita a participar de nuestras actividades en el marco del
XIII CAM y permanentemente, en el marco institucional
de la Asociación Argentina de Microbiología.
Fabricio Dario Cassán
Presidente I Congreso de DiMAyA
XII Congreso Argentino de Microbiología - Presentaciones Orales
1
PRESENTACIONES ORALES
LUNES 18/10/2009
ALIMENTOS, MEDICAMENTOS Y COSMÉTICOS
O1 - 27110 INFLUENCE OF GROWTH CONDITIONS AND THE
FOOD MATRIX ON THE FUNCTIONALITY OF Bifidobacterium
animalis subsp. lactis INL1. VINDEROLA, GABRIEL (1);
BOCKELMANN, WILHEM (2); NEVE, HORST (2); ZACARIAS, MARIA FLORENCIA (1); REINHEIMER, JORGE (1); HELLER, KNUT (2)
(1) Instituto de Lactología Industrial (UNL-CONICET), (2) MRI,
KIEL, Alemania
Introduction: Bifidobacterium animalis subsp. lactis INL1 is a
probiotic strain isolated from human breast milk with the capacity of
enhancing the gut defences through the increase of the number of
IgA+ cells in the small and large intestine of mice. Recent studies
suggest that cell viability might not always be a full indicator of cell
functionality when strains undergo technological treatments like
biomass production and drying for storage. Aim: To study, as a criterion of cell functionality, the influence of growth conditions and storage in different food matrixes of Bifidobacterium animalis subsp. lactis
INL1 on its resistance to simulated gastric digestion. Materials and
Methods: The strain was grown in MRS broth in a biofermentor at
37 °C at pH 6.5 and pH 5 for 12 h and 22 h with the influx of CO2.
Cells were harvested, washed twice with PBS buffer, resuspended
in 10% lactose and freeze-dried for 22 h in a Christ Beta 2-16 freezedrier. Scanning electron microscopy studies were carried out for the
freeze-dried cultures obtained. Freeze-dried cultures were added (ca.
108 CFU/ml) to six different commercial dairy and non-dairy food
products: orange juice (1), banana-carrot juice (2), mixed-fruits juice
+ fiber (3), vanilla milk drink (4), apple-banana puree (5) and applepeach puree (6). Samples were kept at 5 °C for 4 weeks. Cell viability and resistance to simulated gastric digestion (pH 2 + 0.5% NaCl
+ 0.3% pepsin, 37 °C for 90 min) was assessed at time 0 and at the
end of the storage period. Results: No significant differences were
observed in cell viability for cultures grown for 12 or 22 h at pH 6.5
or 5. However, cell losses after 90 min of exposure to simulated gastric acidity were higher than 4 log cycles for cultures grown at pH 6.5
compared to the negligible cell losses observed for cultures grown
at pH 5. Scanning electron microscopy studies showed that only cultures grown at pH 6.5 for 22 h presented an exopolysaccharide-like
matrix around freeze-dried cells. No significant differences in cell
counts were observed among food products after 4 weeks of storage compared to counts at zero time. However, resistance to simulated gastric digestion differed among the commercial food products
analyzed by the end of the shelf life: after 90 min of digestion, reductions in cell counts were negligible for products 2 and 4, for products 3 and 6 cell losses were around 1 log order, whereas for products 5 and 1 cell losses were 2 and 3 log orders, respectively. For
the development of functional foods, appropriate conditions for
biomass production must be chosen and a careful selection of food
matrix must be performed in order to preserve not only viability but
also cell functionality of probiotic strains.
O2 - 27124 DISTRIBUCIÓN DE LISOGENIA EN CEPAS COMERCIALES, DE COLECCIÓN Y SALVAJES DE Lactobacillus DEL
GRUPO casei. MERCANTI, DIEGO (1); ROSSETTI, LIA (2);
REINHEIMER, JORGE (1); QUIBERONI, ANDREA (1)
(1) Instituto de Lactología Industrial, UNL-CONICET, (2) CRA-FLC
Antecedentes: La lisogenia se encuentra muy difundida en
cepas de Lactobacillus. Los profagos no son entidades inertes y
pueden contribuir o dar origen a fagos que pueden ser virulentos
aún para la cepa de la cual derivan. En la industria láctea
fermentativa, los ataques fágicos pueden tener consecuencias
muy graves, siendo el impacto económico especialmente alto
contra bacterias probióticas que por sus propiedades específicas
resultan de difícil o casi imposible reemplazo. Objetivo. Determinar la presencia de profagos inducibles por mitomicina C en cepas de Lactobacillus del grupo casei de diverso origen, con énfasis en aquéllas actualmente usadas en la industria láctea. Materiales y Métodos: Se realizó la inducción con mitomicina C de 30
cepas de Lactobacillus del grupo casei: 11 comerciales, 11 de
colección, 7 aisladas de quesos y 1 de heces. Las cepas fueron
reclasificadas mediante reacciones de PCR específicas para cada
especie que conforma el grupo casei (casei, paracasei,
rhamnosus, zeae), y se determinaron sus perfiles de RAPD-PCR
con 3 primers; los perfiles se analizaron construyendo un
dendrograma con el software BioNumerics. De los sobrenadantes
de inducción filtrados se extrajo ADN el cual, en los casos positivos (presencia de profagos), se sometió a restricción con BglII.
Los perfiles se analizaron utilizando BioNumerics, y se compararon con el dendrograma obtenido por RAPD-PCR. Los sobrenadantes de inducción filtrados se enfrentaron con cepas de
Lactobacillus del presente estudio en tests de turbidez, con el fin
de evidenciar fagos virulentos derivados de las cepas lisógenas.
Resultados: Aproximadamente la mitad de las cepas presentaron
muy alta homología (>80% por RAPD-PCR), entre ellas la mayoría de las cepas comerciales. Numerosas cepas de Lb. casei fueron reclasificadas como Lb. paracasei o Lb. rhamnosus. La correlación entre perfiles de RAPD-PCR y especie fue muy buena
considerando la nueva clasificación. En 25 de las 30 cepas estudiadas se encontraron profagos, demostrando su amplia distribución dentro del grupo casei. Además, 10 de las 11 cepas comerciales contenían profagos, con el mismo perfil de restricción para
6 de ellas (5 muy relacionadas y 1 moderadamente por RAPDPCR). Otra cepa comercial homóloga a las anteriores contenía
otro profago con perfil de restricción igual que 3 cepas de colección (2 ATCC y 1 del INLAIN), mientras otras 3 cepas comerciales contenían profagos diversos. Esto señala que los lactobacilos
del grupo casei utilizados en la industria están, en general, muy
emparentados entre sí y poseen profagos de más de un tipo, con
el riesgo de recombinaciones y generación de nuevos fagos virulentos que esto implica. Por otro lado, a partir de los sobrenadantes de inducción se aislaron 2 nuevos fagos líticos que fueron capaces de lisar la mayoría de las cepas comerciales. Los
resultados obtenidos evidencian un factor de riesgo de infecciones fágicas latente pero potencialmente muy peligroso para los
lactobacilos probióticos del grupo casei usados industrialmente en
la actualidad.
O3 - 27231 EVALUACIÓN DE LA DINÁMICA DE LA POBLACIÓN
MICROBIANA DURANTE LA ELABORACIÓN Y MADURACIÓN
DEL QUESO ITALIANO GRANA PADANO. SANTARELLI,
MARCELA; BOTTARI, BENEDETTA; GATTI, MONICA; NEVIANI,
ERASMO
Università Di Parma
Introducción: El Grana Padano (GP) es un queso duro, cocido y de lenta maduración reconocido con la “Denominación de
Origen Protegida”. Es elaborado con leche de vaca cruda y con
2
suero fermento natural compuesto por distintas cepas de bacterias lácticas termófilas fuertemente acidificantes. La microflora
secundaria (NSLAB) originaria principalmente de la leche cruda
y aquella del suero fermento (SLAB) constituyen la compleja
microflora que contribuyen al desarrollo de sus características
organolépticas. Diversos trabajos han estudiado la composición
microbiana de los fermentos naturales, mientras se conoce poco
sobre las dinámicas durante la elaboración y maduración. Objetivos: Estudio de la dinámica de la población microbiana de SLAB
y NSLAB durante la producción y maduración del queso GP a través de un enfoque independiente de cultivo. Materiales y Métodos: Fueron involucradas 6 diferentes queserías de 6 provincias
de la zona de producción del GP (norte de Italia). Por cada quesería fueron colectadas 6 muestras constituidas por: leche cruda,
suero fermento natural, cuajada a las 48 horas y quesos a distintos tiempos de maduración (2, 6 y 9 meses). Cada muestra fue
analizada mediante la técnica “Length heterogeneity-PCR” a través de un analizador genético. Para los quesos de 2, 6 y 9 meses la metodología se desarrolló de manera de distinguir la fracción de células enteras y autolisadas. Resultados y Conclusiones:
La composición de las diferentes muestras de leche cruda resultó ser variable en relación a la composición de especies. L.
delbrueckii subsp. lactis y S.thermophilus fueron identificadas en
todas las muestras. Las especies L. helveticus, L. delbrueckii
subsp. lactis y S.thermophilus fueron identificadas en todos los
suero fermentos, mientras las cuajadas y quesos no dieron la
señal correspondiente a S.thermophilus. En los quesos de 2, 6 y
9 meses L. helveticus y L. delbrueckii subsp. lactis fueron encontradas ya sea como células enteras y lisadas. En algunas muestras de cuajadas se observó la presencia de la especie
heterofermentante L. fermentum, que además fue revelada solo
como células lisadas en la totalidad de las muestras de queso de
2 meses. A partir del segundo mes de maduración se detectó la
presencia de la especie mesófila L. rhamnosus predominante en
la fracción de células enteras. Además algunos quesos de 6 y 9
meses mostraron, en la fracción de células enteras, la presencia
de la especie P. acidilactici. Fue observada una continua evolución de las características de la microflora en examen en el interior de cada matriz analizada. La dinámica de las especies del
suero fermento, L. helveticus y L. delbrueckii subsp. lactis en las
primeras horas de producción y sus permanencias hasta el queso de 9 meses de maduración ya sea como células enteras como
lisadas, evidencia el rol de dicho fermento en la fase de acidificación de la cuajada como en la maduración del queso. El desarrollo y la presencia de células enteras de NSLAB como L.
rhamnosus y P. acidilactici subrayan el aporte de la leche cruda
y del ambiente de producción a la definición del ecosistema
microbiano del GP y por consiguiente a las características del
producto final.
O4 - 27469 VIGILANCIA DE ENFERMEDADES DE TRANSMISIÓN
ALIMENTARIA BASADA EN LABORATORIO: BASE DE DATOS
NACIONAL DE SUBTIPOS DE Salmonella spp. CAMPOS, J;
PICHEL, M; CAFFER, MI; BINSZTEIN, N
Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas - ANLIS “Carlos
G. Malbrán”
Salmonella spp. es uno de los agentes causales de enfermedades de transmisión alimentaria más frecuentes del mundo. El
uso de técnicas de subtipificación molecular permite identificar
grupos de aislamientos relacionados, para la detección y confirmación de brotes desde el laboratorio. En el marco de la Red
PulseNet América Latina y Caribe se ha establecido en Argentina la Base Nacional de Subtipos de Salmonella spp., con 1019
aislamientos de 2005 a 2010. En el Laboratorio Nacional de Referencia se realiza la subtipificación de Salmonella enterica ser.
Typhimurium (STM) y S. enterica ser. Enteritidis (SE), junto con
una selección de aislamientos de otras serovariedades menos frecuentes. El objetivo de este trabajo es presentar la relación
genética y distribución de subtipos de STM y SE circulantes en
Argentina entre 2005 y 2010 contenidos en la Base de Datos
Nacional. Los aislamientos fueron serotipificados siguiendo el
esquema de Kauffmann-White, con antisueros provistos por el
Servicio Antígenos y Antisueros del Instituto Nacional de Producción de Biológicos, ANLIS “Carlos G. Malbrán”. La diversidad
genética se determinó por electroforesis en campo pulsado
(PFGE) con las enzimas XbaI y BlnI según el protocolo de la Red
PulseNet Internacional. Los perfiles obtenidos fueron analizados
con el programa BioNumerics (Applied Maths), aplicando el coeficiente de Dice y UPGMA. Para SE, se identificaron 13 patrones de XbaI-PFGE entre 164 aislamientos de origen humano, de
alimentos y animales, de 16 provincias. El patrón ARJEGX01.0001
agrupó 137 (83,5%) de los aislamientos, encontrándose en todas
las provincias y tipos de muestra y a través de los años. Todos
los brotes estudiados en este período (n=11) fueron causados por
este subtipo, que presentó además un mismo patrón con BlnI.
Entre los subtipos restantes de XbaI-PFGE, 7 se encontraron sólo
en aislamientos de origen humano, 3 en aislamientos humanos y
de alimentos y 1 en alimentos. Para STM, se identificaron 94
patrones de XbaI-PFGE entre 543 aislamientos de 16 provincias.
Se encontraron tres patrones predominantes, distribuidos en todas las provincias: ARJPXX01.0007, con 32 aislamientos (5,9%);
ARJPXX01.0065, con 43 (7,9%) y ARJPXX01.0194, con 19
(3,5%). Estos dos últimos estuvieron asociados a dos brotes cada
uno. De los 94 patrones, 30 se identificaron en los cinco años,
mientras que el resto sólo se presentaron en alguno de los años.
Los aislamientos de STM mostraron una alta diversidad genética.
En el caso de SE, la clonalidad de esta serovariedad es conocida mundialmente y se identificó también en el país. La Base Nacional de PFGE de Salmonella spp. crece continuamente y el
análisis de subtipos circulantes y su distribución provee una herramienta fundamental para la vigilancia basada en el laboratorio, permitiendo identificar cepas emergentes, detectar y confirmar
brotes, fuentes de infección y vías de transmisión. La aplicación
de los protocolos estandarizados de la Red PulseNet permite
además comparar los subtipos circulantes en el país con aquellos identificados en otros países, para la vigilancia de Salmonella
spp. a nivel global.
O5 - 7821 EFECTO DE INTERMEDIARIOS BIOSINTETICOS SOBRE LA PRODUCCION DE VITAMINA B12 EN BACTERIAS
LACTICAS. VANNINI, MV; DE CARVALHO, K; FONT DE VALDEZ,
G; TARANTO, MP; SESMA, F
Centro de Referencia para Lactobacilos - CERELA
La cobalamina (vitamina B12 o CBL) es una macromolécula
no polimérica cuya estructura contiene un anillo tetrapirrólico ligado a un átomo de cobalto, denominado anillo de corrina. Además presenta una base como ligando axial inferior, el dimetilbenzaimidazol (DMB), y un ligando superior (adenosil), ambos ligados al átomo de cobalto. Su síntesis es compleja, e involucra al
menos 25 enzimas diferentes y se halla restringida a ciertas especies bacterianas y arqueas. Estudios previos en nuestro laboratorio demostraron que Lactobacillus (Lb.) reuteri CRL 1098 es
capaz de producir cobalamina (y su variante pseudo-CBL) y se
caracterizó el operón Cob involucrado en su síntesis. Asimismo
los extractos celulares (EC) de Lb. curvatus CRL 1000, Lb.
coryniformis CRL 1001 y Lb. murinus CRL 1104 presentaron actividad de tipo cobalamina. En base a los resultados previos, el
objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de varios intermediarios de la vía biosintética de B12 en su producción, por las diferentes cepas de lactobacilos previamente mencionados. Se evaluó la producción de CBL por las cepas lácticas CRL 1098, CRL
1000, CRL 1001 y CRL 1104, en presencia de diferentes precursores de su síntesis: ac. aminolevulinico (ALA) (25ng/ul), porfobilinógeno (25ng/ul), uroporfirinógeno III (25ng/ul), CoCl2 (25ng/ul),
DMB (20ng/ul) y O-fosfotreonina (50ug/ul) y en medios de cultivo
libres de la vitamina. Una estimación del contenido en B12 se llevó
a cabo inicialmente mediante un ensayo biológico utilizando la
cepa mutante en la enzima metionina sintasa independiente de
cobalamina, Salmonella enterica serovar Typhimurium AR2680
(metE cbiB) y a continuación se cuantificó el nivel de la vitamina
obtenida en cada una de las condiciones ensayadas empleando
un inmunoensayo enzimático (RIDASCREEN-FAST Vitamin B12,
R-Biopharm). Todos los ensayos fueron realizados por triplicado.
Los resultados indican que Lb. reuteri CRL 1098 y Lb. coryniformis
CRL 1001 presentan los mayores niveles de producción de
cobalamina (25-35 ug/L y 20-30 ug/L respectivamente) y con relación a los intermediarios, se observó que la adición de Ofosfotreonina incrementó la producción de la vitamina en ambas
cepas, mientras que el agregado de ALA y CoCl2 afectaron positivamente la producción de este compuesto por CRL 1098. El
porfobilinógeno tuvo un efecto negativo en la síntesis de esta vitamina para ambas cepas. Los demás intermediarios no presentaron efectos significativos sobre la biosíntesis de esta vitamina.
Las cepas Lb. murinus CRL 1104 y Lb. curvatus CRL 1000 presentaron valores de B12 entre 0,5 y 2 ug/L. No se observó diferencia significativa en la producción de vitamina B12 con el
agregado de los intermediarios ensayados, lo cual podría deberse a los bajos niveles en la producción. En vista de los resultados expuestos, podemos concluir que Lb reuteri CRL 1098 y Lb
coryniformis CRL 1001 son cepas potencialmente aplicables en
el desarrollo de alimentos bio-enriquecidos en vitamina B12.
O6 - 27871 PREVALENCIA Y DIVERSIDAD DE Escherichia coli
NO-O157 EN ARGENTINA 2000-2008. CARBONARI, C; CHINEN,
I; DEZA, N; MILIWEBSKY, E; BASCHKIER, A; MANFREDI, E; D
ASTEK, B; RIVAS, M
G. Malbrán”
Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es un patógeno emergente, asociado a enfermedad severa en humanos.
STEC O157:H7 es el serotipo prevalente a nivel mundial, siendo
en Argentina el principal agente causante de síndrome urémico
hemolítico (SUH). Sin embargo, existen más de 200 serotipos
descriptos, y en nuestro país cepas de diferentes serotipos noO157 producen alrededor del 30% de los casos de SUH que se
registran por año. Los serogrupos O26, O103, O145, O111 y O121
han sido reconocidos como un grupo de riesgo para la salud pública ya que poseen el mismo potencial patogénico que O157.
Con el fin de destacar la importancia de los serogrupos de relevancia en el país, se compararon todos los patrones de cepas
STEC no-O157 obtenidos por electroforesis de campo pulsado e
incorporados a la Base de Datos Nacional (n=1203) entre los años
2000 y 2008. En total, más de 50 serogrupos se encuentran incorporados a la Base. Los cinco serogrupos prevalentes fueron
los siguientes: a) O145, con 157 aislamientos que presentaron un
64,9% de similitud. El serotipo prevalente fue O145:NM (95,5%)
y en menor frecuencia a O145:HNT y O145:H25, con el mismo
perfil de virulencia stx2/eae/ehxA. El 97,5% de los aislamientos
correspondieron a casos clínicos, y el resto a reservorios, algunas cepas de ambos orígenes presentaron el mismo patrón. En
Argentina, STEC O145 está generalmente asociado a casos esporádicos. Sin embargo, se describieron dos brotes y un conglomerado de casos asociados a O145:NM. b) O8: con 58 aislamientos con 65% de similitud. El serotipo más frecuente fue O8:H19
(72,4%), seguido de O8:H16, O8:H21, O8:H25, O8:H7 y O8:HNT.
Los aislamientos fueron de origen bovino, alimentos y humanos.
Los perfiles de virulencia en orden de frecuencia fueron stx1/stx2/
ehxA/saa, stx1/stx2/ehxA y stx2/ehxA. c) O26 con 46 aislamientos con 65,7% de similitud. El principal serotipo fue O26:H11
(65,2%), seguido por O26:HNT, O26:NM, O26:H2, y O26:H21. El
perfil genético más frecuente fue stx1/eae/ehxA. Algunas cepas
aisladas de casos de SUH portaron un perfil poco frecuente: stx2/
stx2c(vh-a)/eae/ehxA. Los aislamientos fueron de origen clínico,
alimentos y bovinos. Se describió un brote asociado a O26:H11.
d) O113: con 36 aislamientos con 69,1% de similitud. El serotipo
prevalente fue O113:H21 (83%) seguido por O113:NM, O113:HNT
y O113:H7. Los aislamientos fueron de origen bovino, alimentos
y casos clínicos incluyendo SUH. El perfil genético más frecuente fue stx2/ehxA/saa. e) O103 con 35 aislamientos con 70,5% de
similitud. El principal serotipo fue O103:NM (74%) y le siguen
O103:H2, O103:H25 y O103:HNT. Los aislamientos son de origen bovino y casos clínicos incluyendo SUH. El perfil genético más
frecuente fue stx1/eae/ehxA. Se describió además un brote asociado a O103:H2. Los resultados obtenidos hasta el momento en
cuanto a detección en enfermedad severa, reservorios y alimentos, indicarían que en Argentina los serotipos STEC no-O157 re-
3
presentan un desafío por la magnitud de la prevalencia y la importancia que adquiere este patógeno en Salud Pública.
O7 - 28008 Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens
DE GRÁNULOS DE KÉFIR ARGENTINOS. AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN REOLÓGICA DEL PRODUCTO FERMENTADO. HAMET, MARIA FERNANDA(1,2); LONDERO,
ALEJANDRA(1); PIERMARIA, JUDITH(1,2); GARROTE,
GRACIELA LILIANA(1,2); ABRAHAM, ANALIA GRACIELA(1,2)
(1) Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. (2) Facultad de Ciencias Exactas, UNLP
El gránulo de kefir está constituido en un 8 % por kefiran, un
exopolisacárido (EPS) producido por Lactobacillus kefiranofaciens
subsp. kefiranofaciens. Este EPS posee propiedades funcionales
comprobadas, actúa como gelificante, espesante y forma películas comestibles. Además posee capacidad de proteger el epitelio
y actividad inmunomodulatoria. El aislamiento de Lb. kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens es dificultoso ya que es anaerobio
estricto y de crecimiento lento. El objetivo del trabajo fue aislarlo
de gránulos de kefir argentinos y analizar las propiedades
reológicas de sus cultivos en leche. La presencia del Lb.
kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens en 9 gránulos de kefir se
analizó mediante electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE). Se extrajo ADN de gránulos de kefir y de las
cepas de referencia Lb. kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens
JCM 6985 y subsp. kefirgranum JCM 8572 y se amplificó con los
oligunucleótidos sintéticos 518r y GC-338f. Los productos obtenidos fueron analizados por DGGE (urea/formamida 40-60%, 16
horas, 100 Voltios y 60 °C). Las bandas coincidentes con la cepa
JCM 6985 fueron cortadas, amplificadas y secuenciadas. Luego,
se procedió al aislamiento mediante tres técnicas de disgregación
de los gránulos: ruptura con ultraturrax, congelamiento y corte
mecánico y disolución del gránulo en agua a 40 °C. A partir de
cada una de las suspensiones se realizaron aislamientos directos y con previo enriquecimiento (MRS pH 5 en anaerobiosis). Se
obtuvieron 23 aislados que fueron caracterizados mediantes coloración de Gram, presencia de catalasa, crecimiento en leche,
producción de gas a partir de glucosa y perfil de proteínas totales. En base a los perfiles de proteínas se construyó un dendrograma en el cual 8 aislados provenientes de los gránulos AGK1,
2, 3, 5 y 6 agruparon con el microorganismo buscado. Su identidad se confirmó mediante DGGE, secuenciación y contraste con
una base de datos. Como resultado de su secuenciación se obtuvo una homología de 98 a 100% con Lb. kefiranofaciens subsp.
kefiranofaciens. La distancia relativa recorrida por ambas susbespecies en los perfiles de DGGE es diferente, mostrando todos los
aislados un perfil equivalente a Lb. kefiranofaciens subsp.
kefiranofaciens. La evaluación reológica de las leches fermentadas se realizó en un reómetro Haake Rheostress 600 en modo
rotacional. Todas presentaron un comportamiento pseudoplástico con importantes áreas de histéresis. Los valores de viscosidad aparente a 300s-1 variaron entre 17,82 ± 1,05 y
35,96 ± 10,15 mPa.s y las áreas de histéresis entre 745,2 ± 35,64
y 1861 ± 613,77 Pa/s. Sólo dos de las cepas presentaron viscosidad equivalente a la cepa de referencia. Es importante destacar que es la primera vez que se aisla Lb. kefiranofaciens subsp.
kefiranofaciens de gránulos de kefir argentinos que son capaces de fermentar la leche obteniéndose productos con diferentes características reológicas. Estas cepas podrían presentar potencialidad para su aplicación en nuevos desarrollos tecnológicos.
O8 - 28068 FACTORES DE VIRULENCIA ASOCIADOS A Escherichia coli PRODUCTOR DE TOXINA SHIGA. ANGEL
VILLEGAS, N(1); POLIFRONI, R(2); ETCHEVERRIA, AI(2);
PADOLA, NL(2); PARMA, AE(2); ALBESA, I(1); BECERRA, MC(1);
PARAJE, MG(1)
(1)Departamento de Farmacia. Facultad de Ciencias Químicas,
UNC. (2)Laboratorio de Inmunoquímica y Biotecnología. Facultad
de Ciencias Veterinarias. Universidad Nacional del Centro de la
Provincia de Buenos Aires
4
Introducción: Escherichia coli productor de toxina Shiga
(STEC) se asocia a brotes de diarrea, colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico (SUH). La patogenicidad está asociada con varios factores de virulencia, entre los que se incluyen la
producción de la toxina Shiga (vt1, vt2). Las cepas más virulentas de STEC además poseen otros como enterohemolisina (ehxA)
e intimina (eae). Un nuevo factor de virulencia podría ser la capacidad que poseen las STEC para formar biofilms, lo cual se
encuentra menos caracterizado. Entre los factores importantes
para la formación del biofilms se pueden mencionar a la fimbria
tipo I “curlina”. Objetivo: Determinar genotípica y fenotípicamente
la presencia de distintos factores de virulencia en cepas productoras de toxina Shiga aislada de pacientes con SUH. Materiales
y Métodos: En este estudio se analizaron ocho cepas clínicas (siete E.coli O157:H7 y una O111:H-) provistas por Hospitales
pediátricos de Córdoba y una cepa de referencia (EDL 933). Análisis Genotípico: la presencia de los genes que codifican para los
factores de virulencia (vt1, vt2, ehxA, eae) y para la proteína
curlina (csgD, csgA y crl) se estudiaron mediante la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). Análisis Fenotípico: mediante un
Inmunoensayo óptico (OIA SHIGATOX) se estudió la expresión
de las toxinas Shiga 1 y/o 2. La expresión de la curlina se analizó mediante Rojo Congo. La capacidad de formar biofilms de las
cepas de E.coli se determinó mediante la adhesión a placas de
poliestireno de 96 wells y su posterior coloración con cristal violeta determinando la densidad óptica a 595 nm. Resultados: Mediante el análisis genotípico se observó la presencia de los genes
vt1, vt2, ehxA, eae, csgD, csgA y crl en todas las cepas estudiadas, excepto en la E.coli O111 que no presentó el gen vt2 que
codifica para la toxina Shiga 2. En cuanto al análisis fenotípico,
todas las cepas expresaron ambas toxinas en el sobrenadante de
cultivo, excepto E.coli O111 (solo Shiga 1). Cuando se realizó la
determinación de curlina se apreció el desarrollo de colonias lisas y rosadas, interpretándose este resultado como negativo.
Todas las cepas estudiadas fueron débiles formadoras de biofilms,
presentando valores entre 0,15 y 0,25 de densidad óptica. Conclusiones: las cepas regionales aisladas de pacientes con SUH
presentaron la co-expresión de diversos factores de virulencia,
tanto genotípica como fenotípicamente. En cuanto a la capacidad
de las cepas de formar biofilms, si bien se observó la presencia
de los genes que codifican para la fimbria tipo I, no se obtuvieron
las características colonias negras indicativas de la expresión de
la proteína. Asociado a lo antes mencionado, todas las cepas en
estudio mostraron una débil formación de biofilms in vitro lo que
parece indicar que los genes que codifican la formación necesitan condiciones in vitro no requeridas para que otros factores de
virulencia se expresen.
VIROLOGÍA
O9 - 27088 EFECTO DE LA PROTEÍNA X DEL VIRUS HEPATITIS B (HBV) SOBRE LA SUPERFAMILIA DE TRANSPORTADORES ABC: UN NUEVO ROL EN LA PATOGÉNSIS VIRAL. CUESTAS, ML(1); RIVERO, C(1); ROSSO, N(2); GENTILE, E(3); CASTILLO, A(3); MINASSIAN, ML(1); ANDREETTA, A(1); TRINKS, J(1);
TIRIBELLI, C(2); OUBIÑA, JR(1); MATHET, V(1)
(1) CONICET, (2) Centro Studi Fegato, (3) Laboratorio De Hepatitis
Introducción: Los carcinomas hepatocelulares (HCC) representan el 4% de los tumores de todo el mundo siendo la quinta causa de cáncer en el hombre. Cerca del 80% de los pacientes con
este cáncer se encuentran crónicamente infectados con HBV. La
proteína X de HBV desempeña un rol principal en la oncogénesis
hepática. Las mutantes K130M y V131I exhiben una actividad
transactivadora mayor que la salvaje, contribuyendo significativamente a la hepatocarcinogénesis. Las proteínas ABC son bombas transmembrana que transportan sustratos en contra del
gradiente de concentración, utilizando la hidrólisis de ATP. Su
sobreexpresión está asociada a la resistencia a múltiples drogas,
a la inhibición de la vía intrínseca de la apoptosis y al cáncer.
Objetivo: Analizar el efecto de la expresión de las proteínas X
salvaje y mutada de HBV sobre los niveles de ARNm y sobre los
niveles de expresión de diversas proteínas ABC. Materiales y
Métodos: Se transfectaron transitoriamente células HeLa y Huh7
con plásmidos que codificaban para la proteína X salvaje y mutada
(K130M/V131I) de HBV. Al cabo de 24 h se les evaluó mediante
RT-PCR en tiempo real la variación en la expresión relativa de
los genes que codifican para las proteínas ABC BCRP, MDR1,
MRP1 y MRP2. La detección de la expresión de dichas proteínas
se realizó mediante Western blot utilizando anticuerpos monoclonales específicos. Resultados: En las células HeLa se evidenció: 1) una disminución en la expresión del gen mrp1 debido a la
expresión de la proteína X salvaje; 2) un incremento en la expresión de los genes bcrp y mrp2 debido a la expresión de la proteína X mutada; 3) No se documentó variación en la expresión de
mrp1 debido a la proteína X mutada, ni de bcrp y mrp2 debido a
la proteína X salvaje. En las células Huh7 se evidenció: 1) un
aumento en la expresión de los genes mrp1 y mrp2 debido a la
expresión de la proteína X mutada; 2) un incremento en la expresión del gen bcrp debido a la expresión de la proteína X salvaje;
3) no se observó variación en la expresión del gen mdr1 por la
proteína X salvaje ni por la mutada, ni de bcrp por la mutada ni
de mrp1 y mrp2 por la salvaje. Los resultados en el Western blot
se correlacionaron con los de RT-PCR en tiempo real. Conclusiones: Al estudiar el efecto de las proteínas X salvaje y mutada
sobre los niveles de ARNm correspondientes a los genes bcrp,
mdr1, mrp1 y mrp2 por RT-PCR en tiempo real, se observó un
comportamiento dependiente de la estirpe celular estudiada
(hepatocitaria vs epitelial) y de la naturaleza salvaje o mutada de
la proteína X. Merece especial consideración la observación de
un aumento en los niveles de expresión de los genes mrp1, mrp2
y bcrp en células Huh7, con potenciales nuevas implicancias en
la oncogénesis hepática y en la resistencia a drogas antivirales y
antitumorales.
O10 - 27686 ORIGEN Y DIVERSIFICACIÓN DEL VIRUS DE LA
HEPATITIS C GENOTIPO 2C EN CÓRDOBA, REPÚBLICA ARGENTINA. CULASSO, ACA(1); RE, V(2); CONTINGIANI, M(2);
CAMPOS, RH(1)
(1) Cátedra de Virología Fac. de Farmacia y Bioquímica, UBA. (2)
Instituto de Virología Dr. J. M. Vanella Fac. Ciencias Médicas,
UNC
La infección crónica con el virus de la hepatitis C (HCV) está
asociada a patologías hepáticas severas. El HCV se clasifica
taxonómicamente en genotipos 1 a 6 y subtipos a, b, c, etc. Los
HCV-1, 2 y 3 son cosmopolitas. Los subtipos de HCV-2 son comunes en África occidental y en el sur de Europa. El HCV-2c es
ubicuo como genotipo minoritario pero en Italia es el segundo en
prevalencia (después del 1b). En la provincia de Córdoba se detecta HCV-2c en 50% de las infecciones e incluso en Cruz del Eje
es el principal genotipo (90%). El objetivo de este trabajo es el
estudio del origen y la diversificación del HCV-2c en la provincia
de Córdoba utilizando análisis filogenéticos y de coalescencia. Se
analizaron 92 muestras de suero de personas de Cruz de Eje
(positivas para HCV) en un estudio epidemiológico previo (año
2004) y 53 muestras de suero de pacientes concurrentes al Servicio de Virología del Instituto Dr J. M. Vanella desde distintos
puntos de la provincia de Córdoba. A partir del ARN viral del suero
se realizó una reacción de RT-PCR anidada para amplificar un
fragmento de 367 pb de la región NS5B que luego fue
secuenciado de manera directa. Análisis filogenéticos: las secuencias obtenidas y otras provenientes de África y Europa (Genbank)
se analizaron por métodos de Distancia (MEGA 4), Máxima Verosimilitud (PhyML 3.0) y Parsimonia (TNT). Análisis de Coalescencia: se infirió por métodos Bayesianos la edad del ancestro
común más reciente y la demografía del HCV-2c (BEAST 1.4.8)
calibrando un reloj molecular relajado con una tasa de 5x10-4 sustituciones por sitio por año. Como resultado, los tres métodos
filogenéticos reprodujeron una topología en donde todas las muestras cordobesas junto con las europeas (Francia e Italia, principalmente) y las africanas conforman un único grupo sin subgrupos
internos. El análisis de coalescencia se realizó sobre tres grupos
de secuencias: Cruz del Eje (CdE), otras ciudades cordobesas
(OCC) y Francia. La edad estimada de los ancestros comunes
5
para los tres grupos fue de ~150 años (~1860 D.C.) y en todos
los casos el modelo demográfico presentó su fase exponencial
entre 1890 y 1950. La filogenia sugiere la ausencia de diversidad
asociada al espacio geográfico (no hubo subgrupos de secuencias de CdE, de OCC ni de Francia o de Italia), compatible con
un proceso de diversificación reciente. El crecimiento exponencial
observado en la demografía de los tres grupos de secuencias
analizados coincide con la emergencia mundial de otras infecciones, como HCV-1b y con el proceso de “globalización” de principios del siglo XX (transfusiones, uso de inyectables, migraciones
masivas, tránsito, drogadicción). El análisis filogenético y de
coalescencia, la epidemiología y la historia inmigratoria sugieren
que los HCV-2c detectados en CdE y OCC serían el resultado de
la introducción del virus desde Italia durante el proceso migratorio de 1880-1920. Luego de la migración de los ancestros, se produjo un fenómeno de diversificación simultáneo en cada espacio
geográfico como consecuencia del proceso de “globalización”. Sin
embargo, se observó la falta de identidad geográfica debido a la
intensa corriente migratoria Italia-Argentina o a que aún no se ha
cumplido el tiempo necesario para producir este fenómeno.
ca, indujo respuestas inmunes humorales específicas de tipo IgA
en muestras de lavados nasales y broncopulmonares y de tipo IgG
en muestras de suero. Los virus recombinantes MVA-gDs pueden
ser utilizados como inmunógenos en animales de experimentación con el propósito de desencadenar respuestas inmunes específicas a nivel sistémico y de mucosas. En el futuro, su utilización como vacuna contra el virus BoHV-1 se evaluará en bovinos.
O11 - 27276 DESARROLLO DE UN CANDIDATO VACUNAL
CONTRA HERPESVIRUS BOVINO BASADO EN UN VIRUS
VACCINIA ANKARA RECOMBINANTE. FERRER, M FLORENCIA
(1,2); DEL MEDICO ZAJAC, M PAULA (1); CALAMANTE,
GABRIELA(1)
La relación entre el origen étnico, la infección genital por virus papiloma humano (HPV) y el desarrollo del cáncer cervical ha
sido sugerida por algunos autores. Estudios epidemiológicos en
comunidades multiétnicas de los EEUU atribuyeron estas diferencias a la baja cobertura médica en minoridades socio-culturales
(principalmente afroamericanos y amerindios). Sin embargo estos trabajos clasificaron las pacientes en base a los apellidos, la
coloración de la piel y la auto-denominación étnica. El valor
predictivo de estas características puede ser bajo en poblaciones
mezcladas, como las latinoamericanas. Los marcadores moleculares ofrecen una herramienta útil para identificar el componente
étnico de los individuos, siendo el ADN mitocondrial (ADNmt) uno
de los más ampliamente utilizados. La provincia de Misiones posee una de las tasas de mortalidad por cáncer más altas del país
y una prevalencia de infección por HPV del 40% para población
femenina asintomática. Estas diferencias han sido atribuidas a un
menor acceso al sistema de salud por parte de las mujeres de la
región, y a sus rasgos socio-culturales y demográficos especiales. Sin embargo las características genéticas no han sido exploradas. Con el fin de identificar potenciales marcadores moleculares de susceptibilidad, se procedió a la caracterización genética
(ADNmt) de mujeres caucásicas de la región. Se analizaron 140
mujeres (66 infectadas y 74 negativas) que no manifestaron ascendencia indígena. Los linajes mitocondriales se determinaron
por PCR y secuenciación de la (HVS-1) de la mitocondria. Como
blanco de amplificación se empleó ADN extraído de cepillados
cervicales. El posible rol del ADNmt como factor de riesgo en la
infección por HPV fue establecido mediante análisis de OR. Resultados: Los linajes mitocondriales indicaron un patrón tri-híbrido para la muestra, con un 72% de aporte amerindio; 23% europeo y 5% africano. Las infecciones por HPV fueron más frecuentes en mujeres portadoras de ADNmt amerindio comparadas con
aquellas que presentaban ADNmt europeo (OR 1.8 IC95% 0,84). Los linajes africanos fueron excluidos del análisis debido a sus
bajas frecuencias. Una de las características más significativas de
Misiones es su composición poblacional multiétnica; esto se atribuye a factores diversos, entre ellos su ubicación geográfica, la
presencia de indígenas Guaraníes, las sucesivas corrientes
inmigratorias europeas y más recientemente los fenómenos de
migraciones internas y con países vecinos. Este escenario se
constituye en un modelo epidemiológico particular, que permite
evaluar marcadores genéticos asociados a su población. En este
contexto, la frecuencia de linajes amerindios de ADNmt ha sido
mayor que la reportada para ciudades como La Plata y Córdoba
(40%). La potencial asociación entre el linaje amerindio y la infección cervical por HPV deberá ser confirmada mediante un diseño
de casos y controles. Financiado por ANPCyT (PICTR 311/2).
(1) Instituto de Biotecnología CICVyA-INTA Castelar, (2) CONICET
Los poxvirus se utilizan eficientemente como vacunas seguras y efectivas contra enfermedades infecciosas. En particular, los
poxvirus recombinantes se evaluaron en numerosos ensayos clínicos de vacunas contra el cáncer, malaria, tuberculosis y sida.
La cepa MVA (virus vaccinia Ankara modificado) es una cepa del
virus vaccinia altamente atenuada, que no replica en la mayoría
de las células de mamíferos, siendo un buen candidato para el
desarrollo de vacunas a virus vivo no replicativo. El fenotipo atenuado de MVA es el resultado de numerosas mutaciones que
particularmente afectaron a las proteínas que interactúan con el
hospedador, a los genes con motivos tipo anquirina y a algunas
proteínas estructurales. La infección con herpesvirus bovino de
tipo 1 (BoHV-1) puede producir conjuntivitis, neumonía, desórdenes genitales, abortos y una infección en el tracto respiratorio
superior denominada fiebre del transporte. Para controlar las enfermedades causadas por BoHV-1 es necesario disponer de vacunas efectivas y que permitan diferenciar animales naturalmente infectados de animales vacunados. El objetivo de este trabajo
es la evaluación de un inmunógeno basado en MVA capaz de
expresar in vivo la glicoproteína D de BoHV-1. Primeramente, se
construyó un vector de transferencia (VT) que porta las secuencias de interés (genes gDs y uidA bajo regulación de promotores
tempranos de poxvirus) flanqueadas por regiones correspondientes al gen viral MVA086R. Los virus MVA-gDs se obtuvieron por
recombinación homóloga in vitro entre el VT y el genoma viral, y
se aislaron por su capacidad de formar placas de lisis azules en
presencia del sustrato X-Gluc. Mediante análisis molecular se
confirmó la correcta expresión, antigenicidad y N-glicosilación de
la glicoproteína D expresada a partir de dichos virus. posteriormente, se evaluó la capacidad inmunogénica de los virus MVAgDs en animales de experimentación, determinando la presencia
de anticuerpos específicos anti-gD mediante ELISA. En el modelo de ratón, se observó que los virus MVA-gDs desencadenaron
una respuesta inmune humoral específica que se mantuvo en niveles similares durante un período de siete meses. Además, se
demostró que la síntesis de novo de la glicoproteína D a partir
del vector viral no replicativo MVA-gDs fue la responsable de la
inducción de dicha respuesta. La inoculación de conejos con MVAgDs desencadenó una respuesta inmune humoral específica observándose la máxima respuesta a los 9 días post dosis refuerzo. En un ensayo de desafío de conejos con BoHV-1, se observó
que la inmunización por vía intramuscular con virus MVA-gDs disminuyó la cantidad de animales que excretaron el virus de desafío. Finalmente, se demostró que la inmunización de ratones por
vía intranasal con virus MVA-gDs, combinado con toxina coléri-
O12 - 27596 DETERMINACIÓN DE LINAJES MITOCONDRIALES
EN MUJERES CAUCÁSICAS RESIDENTES DE LA PROVINCIA
DE MISIONES Y SU RELACIÓN CON LA INFECCIÓN POR VIRUS PAPILOMA HUMANO (HPV). BADANO, INES(1);
RUBINSTEIN, SAMARA(2); SCHURR, THEODORE(2); PICCONI,
ALEJANDRA(3); CAMPOS, RODOLFO(4); LIOTTA, JAVIER(1)
(1) Laboratorio de Biología Molecular Aplicada. Universidad Nacional de Misiones; (2) Department of Anthropology, University of
Pennsylvania. EEUU; (3) Servicio Virus Oncogénicos, INEI-ANLIS
“Dr. Carlos Malbran”; (4) Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA.
O13 - 27600 ACTIVIDAD ANTI-HIV DE NUEVAS PRODROGAS
DE DIDANOSINA (DDI). TURK, GABRIELA(1); DECANDIA,
CRISTIAN(1); RAVETTI, SOLEDAD(2); GUALDASI, MARIA SOLEDAD(2); PAMPURO, SANDRA(1); BRIÑON, MARIA CRISTINA(2);
SALOMON, HORACIO(1)
6
(1) Centro Nacional de Referencia para el SIDA, Fac de Medicina (UBA), Bs As. (2) FCQ, UNC.
Introducción. El diseño de nuevos inhibidores del HIV es un
objetivo de interés, considerando el problema de la toxicidad y resistencia a los antiretrovirales existentes. Debido a que el ddI
(2´,3´-dideoxiinosina) presenta algunos efectos indeseados tales
como bajo grado de unión a proteínas plasmáticas (< 5%) y un
tiempo de vida media de eliminación de 1,4 hs., se planteó el diseño de nuevos 5´-O-carbonatos de ddI. De este modo, se esperan propiedades farmacocinéticas más favorables que garantizarán una concentración adecuada del antiviral en el sitio de acción.
Por ello, se sintetizaron prodrogas de ddI por conjugación del
grupo 5´-OH de ddI con n-butanol, n-pentanol y n-hexanol, utilizando N,N-carbonildiimidazol (CDI) en condiciones anhidras.
MÉTODOS. Células: se utilizaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) activadas, cultivadas en RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino. Virus: stock de HTLVIIIB obtenido a partir de células H9 crónicamente infectadas. Se
infectaron PBMC con una moi de 6,45x103 TCID50/106 células. Al
día 7 se cosechó el sobrenadante y se evaluó la producción de
antígeno p24 mediante el ensayo de ELISA para calcular el IC50.
Los ensayos de citotoxicidad se realizaron sobre células no infectadas, mediante recuento de células viables, para calcular la
CCID50. Finalmente se calculó el Índice de Selectividad
(IS=CCID50/ IC50). RESULTADOS. Se obtuvieron nuevas
prodrogas de ddI con buenos rendimientos. Tanto los derivados
obtenidos como su precursor, fueron caracterizados por técnicas
de RMN tales como COSY (homo y heteronucleares) y DEPT. Los
derivados de ddI estudiados mostraron, en PBMC, poseer un IS
similar al de la droga madre excepto el derivado ddIPenta el cuál
mostró un IS 100X mayor, principalmente mediado por su baja
toxicidad.
R
H
-O-C(O)-(CH2)-CH3
-O-C(O)-(CH2)3-CH3
-O-C(O)-(CH2)4-CH3
-O-C(O)-(CH2)5-CH3
-O-C(O)-(CH2)6-CH3
Compuesto
ddI
ddI-Eta
ddI-Buta
ddI-Penta
ddI-Hexa
ddI-Hepta
La introducción de un grupo carbonato (alcoxicarbonilo), en
nucleósidos activos, resulta de interés tanto por su utilidad como
grupo protector como por la capacidad de otorgarle ventajas
fisicoquímicas y farmacocinéticas, lo que redundará en una mayor capacidad para atravesar membranas lipídicas y optimizar su
llegada al receptor. El mejoramiento de estas propiedades es un
aspecto fundamental en el diseño de nuevas prodrogas de compuestos farmacológicamente activos.
O14 - 27662 DINÁMICA DE CUASIESPECIES A NIVEL DEL GEN
DE LA POLIMERASA DEL VIRUS DE HEPATITIS B (HBV) TRAS
11 AÑOS DE SEGUIMIENTO EN UN PACIENTE CRÓNICAMENTE
INFECTADO EXPUESTO A DIVERSAS ALTERNATIVAS TERAPÉUTICAS. CASSINO, L(1); BENETTI, S(2); FAY, F(2); TANNO,
H(3); QUARLERI, J(1)
(1) Centro Nacional de Referencia para el SIDA, Fac de Medicina (UBA), Bs As. (2) Centro de Diagnóstico Médico de Alta Complejidad (CIBIC), Rosario. (3) Servicio de Gastroenterología y
Hepatología del Htal. Provincial de Centenario, Rosario.
Introducción. La infección por HBV es un proceso dinámico en
el que diferentes variantes virales se seleccionan en respuesta a
la presión ejercida por la terapia. Objetivo: Analizar la dinámica
de cuasiespecies virales a lo largo de 11 años (1998-2009) desde un paciente crónicamente infectado que recibió secuencialmente tratamiento con interferón (IFN) como monoterapia, luego
se le adiciona lamivudina (LMV). Se reemplaza por adefovir (ADV)
y, finalmente se trata con entecavir (ETV) solo y asociado a
tenofovir (TDF). Métodos. Se seleccionaron 4 muestras de suero
colectadas a lo largo del período de estudio de un paciente con
historia de infección por HBV, genotipo A2. Para cada punto de
análisis se determinó la expresión del HBeAg (EIA, Roche) y, los
niveles de carga viral plasmática (COBAS TaqMan HBV, Roche
Diagnostics; rango de detección: (2,7x10²-2,7x108 copias/ml) como
medida de la capacidad replicativa. Adicionalmente se dispuso de
parámetros bioquímicos de funcionalidad hepática (ALT, ALT,
GGT). El análisis de la heterogeneidad de cuasiespecies del HBV
a nivel del gen pol implicó la extracción de DNA viral mediante
lisis alcalina, amplificación genómica por PCR, con posterior
clonado y secuenciación nucleotídica de 20 clones. Cada una de
las secuencias nucleotídicas se inspeccionó visualmente para
verificar la presencia de mutaciones de resistencia a análogos
núcleosidos. Resultados. En ausencia de presión por IFN o drogas antivirales, no se observaron mutaciones primarias de resistencia. Tras tres años de exposición a LMV, se detectó la mutante
M204I presente en todos los clones de la población a expensas
de una ostensible pérdida de la capacidad replicativa (carga viral:
5,4x10² copias/ml). Posteriormente y concomitante con el surgimiento de la mutación L180M mayoritaria y sostenidamente en el
tiempo, se advierte una recuperación del fitness viral (carga viral:
4,5 x105 copias/ml). Ambas mutaciones (M204I, L180M) se establecen a pesar del cambio en la terapia. No se evidenciaron mutaciones primarias de resistencia a ADF, ETV o TDF. Desde la
muestra basal, se observa la mutación L217R en todas las
cuasiespecies virales. No se evidencia la presencia de mutaciones primarias de resistencia a ADV, ETV o TDF ante su administración. La expresión del HBeAg evidenció conversión/ reversión
hacia/desde anti-HBe con fluctuaciones paralelas en los niveles
de carga viral, que persisten detectables. CONCLUSIONES. Las
mutaciones primarias a LMV M204I/L180M se establecieron en la
población del HBV aún luego de interrumpido su uso. Se identifica la presencia de la mutación L217R recientemente asociada a
resistencia a adefovir, irrespectivamente de la presión de selección. El estudio de la dinámica de cuasiespecies de HBV por más
de una década deja ver el impacto la composición de
cuasiespecies de HBV ante la presión ejercida por el tratamiento
antiviral y sus implicancias en el perfil serológico y capacidad
replicativa viral.
O15 - 27933 DETECCIÓN DE LOS PRIMEROS PERÍODOS DE
VENTANA EN DONANTES DE SANGRE CON EL ENSAYO
PROCLEIX ULTRIO. ACEVEDO, ME; OTERO, A; FRANCESCHI,
V; PALACIOS, G; NEIROT, R; RODRIGUEZ, E; FERNANDEZ, RJ
F. Hemocentro Buenos Aires
Introducción. La detección de ácidos nucleicos virales en donantes de sangre por NAT disminuye el riesgo residual, acortando el período de ventana serológica. En nuestro centro se testean
por NAT para HIV y HCV todas las unidades a transfundir desde
junio de 2004. A partir de septiembre de 2008 comenzamos a
testear las unidades con el ensayo Procleix Ultrio de Chiron que
detecta simultáneamente HIV-1, HCV y HBV. Objetivo. Detectar
y descartar precozmente las unidades de sangre de donantes con
viremia para HIV, HCV o HBV con pruebas serológicas no
reactivas. Materiales y Métodos. Los ensayos de NAT HIV-1/HCV/
HBV se realizaron en muestras de plasma de donantes en paralelo con las técnicas de serología. La metodología NAT utilizada
detecta simultáneamente ARN de HIV-1 y HCV; y ADN de HBV
en plasma humano. La amplificación de ácidos nucleicos se realizó por TMA (transcription mediated amplification) con reactivos
Procleix Ultrio de Chiron. Todas las unidades reactivas por NAT
fueron estudiadas con ensayo discriminatorio para identificar el
virus presente en la muestra. El ensayo de carga viral de HBV se
llevó a cabo en el Hospital Italiano de Buenos Aires por el método COBAS Taq Man HBV (Real Time). La carga viral de HIV se
realizó en el Centro Nacional de Referencia para el SIDA con
Versant HIV-1 RNA 3.0 ASSAY (bDNA) Bayer. Resultados. Desde la implementación de Procleix Ultrio (Novartis-Chiron, USA) se
testearon por NAT en nuestro centro 68.654 donantes, entre propios y derivaciones externas. Se obtuvieron en este período 5
unidades NAT reactivas con serología no reactiva para los marcadores HBcAc, HBsAg, HCV y HIV/P24. Al realizar los test
discriminatorios correspondientes se detectaron 3 unidades
reactivas para HBV, 1 HCV y 1 HIV. Todas las pruebas serológicas
y moleculares fueron repetidas de bolsa de plasma obteniéndose
idéntico resultado.. Sólo pudimos realizar el seguimiento de dos
donantes NAT HBV reactivos y del donante NAT HIV reactivo. De
los donantes HBV reactivos uno de ellos fue retesteado a los 17
días de la muestra índice con un resultado HBsAg reactivo y
HBcAc negativo. El otro donante a los 28 días tuvo serología no
reactiva, seroconvirtiendo recién 17 días después, pero sólo para
HBcAc y HBsAc. Este donante fue vacunado para hepatitis B entre
la primera y la segunda muestra. Las cargas virales de HBV fueron 30 UI/ml y 146 UI/ml respectivamente. La segunda muestra
del donante NAT HIV reactivo fue no reactiva a los 7 días y la
tercera fue reactiva a los 14 días con ELISA cuarta generación
HIV Ag/Ac. La carga viral de HIV fue de 297 copias/ml. CONCLUSIONES. A partir de estos casos detectados con viremia para
HBV, HIV y HCV y serología no reactiva, toma relevancia la importancia de la inclusión de NAT dentro del testeo de rutina de
unidades a transfundir y la ampliación del screening incluyendo
el HBV para aumentar la seguridad transfusional. Al no tener registros anteriores en nuestro país de HBV en ventana serológica
en donantes de sangre podemos concluir que son los primeros
casos de período de ventana de HBV detectados en Argentina y
que exitosamente se evitó su transfusión gracias a las técnicas
de Biología molecular a pesar de no existir normas para su
implementación en nuestro país.
O16 - 27938 EFECTO DE VARIACIONES ESTRUCTURALES DE
LA PROTEÍNA VPU DE HIV-1 SOBRE LA CAPACIDAD REPLICATIVA VIRAL. DE CANDIA, C; ESPADA, C; TURK, G; SALOMON,
S; CAROBENE, M
Centro Nacional de Referencia para el SIDA, Facultad de Medicina, UBA, Argentina
Introducción. La proteína Vpu de HIV-1 cumple con dos funciones biológicas diferentes durante el ciclo replicativo viral: incrementar la producción de partículas virales e inducir la degradación de CD4. Aunque una gran diversidad de secuencias entre
subtipos virales ha sido extensamente documentada, poco se sabe
acerca de variaciones funcionales relacionadas con esta diversidad y menos sobre la inherente a variantes recombinantes
intersubtipo de dicha proteína. El objetivo del presente estudio fue
evaluar el efecto de variaciones en la proteína Vpu sobre la
replicación viral. Para ello se realizó un ensayo in vitro de evaluación de la capacidad replicativa relativa o fitness de un variante viral quimérica portadora de Vpu recombinante BF, respecto de
una variante viral tipo salvaje subtipo B. Materiales y Métodos. El
vector pNL4-3, que contiene el genoma completo de una variante subtipo B de HIV-1, se utilizó para la generación de una quimera viral portadora de la secuencia codificante para Vpu proveniente de un aislado viral recombinante intersubtipo BF
(CRF_12BF). Mediante mutagénesis sitio-dirigida, se generaron
sitios de restricción en el genoma viral tipo salvaje, lo que permitió el reemplazo de la región codificante para Vpu de un subtipo
por otro. Los stocks virales se prepararon por transfección de
cultivos de la línea 293T y posterior propagación en la línea MT2.
El ensayo de competición in vitro fue realizado infectando cultivos de la línea CEM, con la variante viral subtipo B de referencia
(NL4-3 Vpu B) y la variante quimérica mencionada anteriormente
(NL4-3 Vpu BF), en una relación de MOI 1:1. Las infecciones fueron mantenidas durante 21 días, realizándose toma de muestra
de células y sobrenadante de cultivo a días 1, 12 y 21 post-infección. El DNA genómico celular fue extraído usando un kit comercial, y se amplificó por PCR la región proviral codificante para Vpu.
Se clonó y secuenció el amplicón obtenido, para luego establecer la proporción de cada variante presente en cada muestra, y
la variación de dicha proporción en función del tiempo. Las infecciones fueron realizadas por duplicado. Las diferencias estadísticas fueron calculadas por t-student. Resultado. El análisis de la
composición de la población en cada día analizado mostró un predominio de la variante subtipo B al D1 (relación B/BF: 1.52), sin
embargo dicha relación varió con el tiempo en favor de la variante quimérica portadora de la secuencia Vpu recombinante BF, en
donde la relación a D12 y D21 fue B/BF: 1.16 y B/BF: 0.99, respectivamente. Conclusión. El resultado obtenido en el presente
trabajo proporciona clara evidencia de la relación existente entre
los cambios genómicos introducidos por la recombinación
7
intersubtipo a nivel de la proteína Vpu y la funcionalidad de la
misma. Los cambios presentes en la variante recombinante
intersubtipo BF de Vpu son suficientes para manifestarse a corto
plazo como una ventaja biológica durante la replicación viral en
células susceptibles, sugiriendo que cambios en su estructura
podrían desempeñar un papel fundamental en la diseminación de
una variante recombinante intersubtipo, como se observa en varias regiones del mundo, incluyendo América del Sur.
BACTERIOLOGÍA, MICOLOGÍA Y
PARASITOLOGÍA CLÍNICA
O17 – 27426 - Neisseria gonorrhoeae RESISTENTE A CIPROFLOXACINA EN ARGENTINA ENTRE 1996-2006: UNA COMPARACIÓN DE ANÁLISIS FENOTÍPICO Y GENOTÍPICO. GALARZA,
P (1); VACCHINO, M (1); ENRIQUEZ, R(2); PAGANO, I(1);
ACCARINO, C(1); OVIEDO, C(1); VAZQUEZ, J(2); RED, ITS(3)
(1) Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas -INEI-ANLIS
“Dr. CG Malbrán”, (2) Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), (3) Programa Nacional de Vigilancia de la Sensibilidad Antimicrobiana
de Gonococo (PROVSAG)
En 1996 se detecta la 1ª cepa con sensibilidad disminuida a
ciprofloxacina (Cip). Durante los 10 años posteriores fueron derivados por el PROVSAG 3837 aislamientos (ais) de los cuales 51
presentaron cambios en las regiones determinantes de resistencia a quinolonas (QRDR) mostrando un incremento paulatino, alcanzando el 8% en el año 2006. El objetivo fue caracterizar los
ais con reducida sensibilidad y resistentes a Cip derivados al CNR,
entre 1996-2006 por métodos fenotípicos y genotiípicos de tipeo
y describir la epidemiología de la gonorrea con resistencia a Cip.
Los ais fueron caracterizados por axotipo, serogrupo, sensibilidad
antibiótica, perfil plasmídico, N. gonorrhoeae multiantigen
sequence typing (NG-MAST) y por secuenciación de QRDRs para
gyrA, parC, parE, y mtrR de la bomba de eflujo. En aquellos ais
con CIM a Cip <1µg/ml (n=6) se encontró una única mutación en
gyrA; una sustitución de un aminoácido, de Asp95-Gly en aquellos ais con CIM de 0.12µg/ml (n=4) y en los ais con CIM de
0.25µg/ml (n=2) una sustitución de Ser91-Phe. La presencia de
dos mutaciones en gyrA con o sin alteraciones en parC pueden
asociarse a valores de CIM>1. Las sustituciones más frecuente
en gyrA con 43 ais fueron Ser91-Phe y Asp95-Gly, de las cuales
23 contenían una mutación en parC de Ser87-Arg con valores de
CIM entre 2 y 32µg/ml, seguida por 11 ais con una sustitución de
Asp86-Asn con valores de CIM entre 2 y 16µg/ml. Cabe destacar
que 9 ais con dos mutaciones en parC de Gly85-Asp y Ser87-Arg
presentaron CIM entre 8 y 16µg/ml. Las mutaciones en parC fueron encontradas únicamente en aquellas cepas conteniendo mutaciones en gyrA. Dos ais con mutaciones en gyrA Ser91-Tyr,
Asp95-Asn mostraron una mutación en parE Pro456-Ser sin mutaciones en parC. Se encontraron 28 ST, 16 no descriptos. Estos
últimos abarcan 24 ais (47%). Los ST más prevalentes fueron el
225 (16%), 4444 (10%) y el 292 (8%). Considerando las regiones del país, en la zona centro se detectaron 6 ST distribuidos
en 10 ais; en Buenos Aires y CABA 16 ST en 22 ais; en el NEA
un solo ais con ST característico, todos propios de cada región.
Seis QRNG fueron beta-lactamasa positiva y presentaron el mismo perfil plasmídico 2,6+3,05+24,5 MDal distribuidos en 4 provincias. En la tabla siguiente se muestra la caracterización auxotipo/
serotipo (A/S) según las distintas concentraciones inhibitorias.
A/S
A/IB
NR/IB
NR/IA
P/IB
PA/IB
Total
Nº (%)
de aislamientos
5 (9,8)
17 (33,3)
3 (5,9)
18 (35,3)
8 (15,7)
51 (100)
0.125
2 (11,8)
Nº (%) de aislamientos con CIM (µg/ml) a CIP
0.25
2
4
8
16
2 (11,8)
2 (11,1)
4 (7,8)
2 (3,9)
1 (20,0)
5 (29,4)
1 (33,3)
1 (5,6)
1 (20,0)
1 (5,9) 3 (17,6)
1 (33,3)
4 (22,2) 3 (16,7)
8 (15,7)
7 (13,7) 6 (11,7)
3 (60,0)
4 (23,5)
1 (33,3)
8 (44,4)
5 (62,5)
21 (41,2)
32
Total
5 (100)
17 (100)
3 (100)
18 (100)
3 (37,5) 8 (100)
3 (5,9)
Se observa una gran variedad de ST distribuidos en todo el territorio, si bien se vio predominancia de algunos por regiones. El
ST 225 predominante, se ha descripto en Inglaterra, Escocia,
Francia y Suecia entre otros. Segun el GeneBank, obtuvimos dos
mutaciones no descriptas en parC y parE y una combinacion de
8
mutaciones nunca asociadas. Las mutaciones en parE no se pueden relacionar con el aumento de la CIM. Se descarta que el A/S
PA/IB englobe las CIMs a Cip más elevadas.
O18 – 27471 - Klebsiella pneumoniae PRODUCTORA DE
SERINCARBAPENEMASA TIPO KPC (KPKPC): COMUNICACIÓN DE 4 AISLAMIENTOS. EVALUACIÓN DEL CHROMAGAR
KPC (CHROM) PARA ESTUDIOS DE PORTACIÓN RECTAL.
ERRECALDE, LAURA(1); TUTZER, SILVIA(1); JORDA VARGAS,
LILIANA(1); COGUT, SANDRA(1); CATTANI, EUGENIA(1);
ELBERT, GABRIELA(2); PASTERAN, FERNANDO(3); CORSO,
ALEJANDRA(3); KAUFMAN, SARA(1)
(1)Sección Microbiología y (2) División Infectología- Hospital General de Agudos J. Fernández. (3) Servicio Antimicrobianos. INEIANLIS “Dr C. G. Malbrán”
Introducción: las KpKPC representan un serio problema para
el sistema de salud debido a que presentan pocas opciones terapéuticas y rápida diseminación. Los estudios de colonización rectal
permiten identificar y aislar a los pacientes portadores para prevenir la transmisión. Objetivos: describir los 4 primeros aislamientos de KpKPC en nuestro hospital. Reportar los resultados de los
estudios de vigilancia de colonización rectal. Comparar el desempeño del CHROM con el método propuesto por el Centers for
Disease Control and Prevention (CDC) para el estudio de colonización rectal. Materiales y métodos: los 4 aislamientos fueron
estudiados mediante sistema automatizado Phoenix y difusión en
agar según CLSI. Se realizó la prueba de inhibición de imipenem
con ácido 3-aminofenil borónico (APB) reconocido como inhibidor
de carbapenemasas de clase A. Las cepas fueron caracterizadas
en el INEI para blaKPC por PCR. Para el estudio de colonización
se tomaron 2 hisopados rectales de pacientes de: clínica médica
(37), terapia intensiva e intermedia (29), ginecología (2), cirugía
(12) y cardiología (1) y se sembraron respectivamente en CHROM
(preparado según instrucciones del fabricante) y caldo tripteína
soya (5ml) con el agregado de un disco de meropenem (método
CDC). Se incubaron 24 h a 37°. Se estudiaron las colonias azules del CHROM y se repicó 0,1 ml del caldo a medio Levine. Se
incubó 24 h a 37°. A las 24 h se estudiaron las colonias mucosas
fermentadoras del medio Levine. Resultados: se aislaron 4
KpKPC: 1 en abril, 1 en mayo y 2 en junio de 2010. Los aislamientos sólo presentaron sensibilidad a fosfomicina, tigeciclina,
minociclina y tetraciclina, 2 aislamientos fueron sensibles a
colistina. Todos fueron aislados de orina y pertenecientes a un
hombre y 3 mujeres. Edades: 25, 68, 75 y 88 años. Todos presentaron co-morbilidades: diabetes (2), SIDA (1), hipertensión
arterial (1), hiperplasia prostática benigna (1) y como factores de
riesgo se identificaron: sonda urinaria (4), catéteres (4), tratamiento antibiótico previo (4), postración (1), intervenciones quirúrgicas
(2), internación prolongada (mayor a 1 mes) (4), asistencia respiratoria mecánica (1). Los hisopados rectales fueron positivos en
9/81 (11,1%) pacientes (3 de clínica médica y 6 de terapia intensiva). El CHROM detectó los 9 positivos y el CDC detectó sólo 6/
9. El CHROM presentó 2 falsos positivos por Acinetobacter spp.
y K. pneumoniae sensible a carbapenemes. El CDC tuvo desarrollo de colonias en 29/81 en su mayoría Acinetobacter spp., lo
que dificultó la observación de otras colonias. Describimos la
emergencia de KpKPC en un hospital general de agudos de la
CABA. Los hisopados rectales revelaron que varios pacientes
estaban colonizados lo que permitió aislarlos tempranamente. El
CHROM mostró mejor rendimiento que el método del CDC, menor porcentaje de contaminaciones y una disminución de 24 h para
obtener el resultado.
O19 – 27488 - Proteus mirabilis PRODUCTOR DE AmpC-PLASMÍDICO CON FENOTIPO INUSUAL DE SENSIBILIDAD A
CEFOXITINA. COGUT, SANDRA (1); FACCONE, DIEGO (2);
RAPOPORT, MELINA (2); ERRECALDE, LAURA (1); KAUFMAN,
SARA (1); PASTERAN, FERNANDO (2); CORSO, ALEJANDRA (2)
(1) Hospital Fernández, (2) Instituto Nacional de Enfermedades
Infecciosas-INEI- ANLIS “Dr. CG Malbrán”
Introducción: en las últimas décadas se ha reportado, con creciente frecuencia a nivel mundial, la adquisición de plásmidos
portadores de ß-lactamasas de tipo AmpC en bacterias que naturalmente carecen de dicho mecanismo de resistencia (MR) codificado a nivel cromosomal o lo expresan en muy bajo nivel. La
prevalencia de este mecanismo en enterobacterias de nuestro
país no es bien conocida, en parte por lo dificultoso de su detección. Hasta la fecha, la resistencia (R) a cefoxitina (FOX), era el
principal marcador de la presencia de este MR.
Objetivo: caracterizar el mecanismo de resistencia responsable de un fenotipo inusual en aislamientos de P. mirabilis y evaluar la relación clonal entre estos.
Métodos: entre agosto de 2007 y julio de 2008 se aislaron 8
P. mirabilis de pacientes internados en el Hospital Fernández a
partir de muestras de urocultivo (7) y lavado bronco alveolar (1).
El estudio de sensibilidad por difusión (CLSI) de todos los aislamientos mostró R a cefalotina (CTN) y cefpodoxima (POD), sensibilidad (S) a cefotaxima (CTX) y ceftacidima (CAZ), test confirmatorio de B-lactamasa de espectro extendido (BLEE) negativo
y valores entre 18-20mm para FOX (S=18mm; CLSI). Estos aislamientos fueron derivados al CNR para su caracterización. Se
determinó la concentración inhibitoria mínima (CIM) por dilución
en agar a ß-lactámicos solos y con el agregado de ácido 3aminofenil-borónico (APB). Se realizó ensayo microbiológico con
FOX para evaluar la actividad enzimática de los aislamientos y
se ensayaron sinergias entre los discos de FOX y APB (300ug).
Se empleó una PCR-multiplex para la detección de distintas familias de AmpC-plasmídico. La relación genética de los aislamientos se determinó por electroforesis en campo pulsado (PFGE) con
la enzima de restricción SmaI. Resultados: se confirmó la S a CTX
(1-2mg/l) y CAZ (1-4mg/l) por CIM, el agregado de APB redujo
los valores de CIM entre 3-5 diluciones. En 7 aislamientos la CIM
a FOX fue S (8mg/l) y en el restante intermedio (I) (16mg/l). Los
ensayos microbiológicos fueron positivos para FOX, confirmando
la actividad enzimática y se observó efecto sinérgico entre los
discos de FOX y APB. En todos los aislamientos se obtuvo amplificación para la familia de AmpC tipo CMY-2. Por SmaI-PFGE
se discriminaron 4 clones (n), A (3), B (3), C (1) y D (1). Conclusiones: a pesar de que la presencia de la enzima plasmídica tipo
CMY-2 en enterobacterias confiere usualmente un fenotipo de
resistencia a FOX, estamos reportando los primeros aislamientos
de P. mirabilis portadores de esta enzima con fenotipo inusual de
S a FOX. Frente al fenotipo de alto nivel de resistencia a CTN y
POD, S a CTX y CAZ y test negativo para BLEE, se recomienda
la búsqueda de AmpC plasmídico independientemente de la S a
FOX, empleando los ensayos de sinergia entre los discos de FOX
y APB y el microbiológico para FOX. Este hallazgo estuvo asociado a 4 clones, sugiriendo la diseminación horizontal
intrahospitalaria de los plásmidos involucrados. La aparición de
este MR con un fenotipo inusual requiere de la atención y el seguimiento por parte de los integrantes del sistema de salud.
O20 – 27553 - DISEMINACIÓN DE Enterococcus faecium
CON RESISTENCIA A GLICOPÉPTIDOS (VREFM) DEL COMPLEJO CLONAL 17 EN ARGENTINA. FACCONE, DIEGO (1);
ABEL, SOFIA (1); LOPEZ RUITTI, PAULA (1); GAGETTI, PAULA
(1); CORSO, ALEJANDRA (1)
(1) Servicio Antimicrobianos. Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas. INEI-ANLIS “Dr. CG Malbrán”
Introducción: los enterococos son patógenos causantes de
infección nosocomial que han adquirido resistencia a casi todos
los antibacterianos, incluyendo los glicopéptidos. Las infecciones
nosocomiales por VREfm se han asociado con la diseminación de
aislamientos genéticamente relacionados al complejo clonal 17
(CC17). Actualmente el CC17 está integrado por aislamientos con
diversos Sequence Type (ST) definidos por MLST, pero conserva dos características fuertemente asociadas a este complejo
clonal: i) el alelo 1 del gen purK (según MLST) y ii) la presencia
del gen esp (proteína de superficie). En un estudio previo caracterizamos molecularmente los primeros 189 VREfm de Argentina
y determinamos que la resistencia a VAN estaba mediada primariamente por el gen vanA. Por SmaI-PFGE se discriminaron 35
tipos clonales, sin embargo el 57% de los aislamientos se agrupó en un único clon dominante A. Objetivo: el presente trabajo
tuvo como finalidad evaluar la posible relación genética entre los
clones de VREfm de Argentina y el CC17. Materiales y métodos:
los 189 VREfm estudiados procedían de 30 hospitales, 20 de la
Ciudad Autónoma de Buenos Aires (n: 125/66.1%), 6 de la provincia de Buenos Aires (n: 52/27.5%) y 4 de Córdoba, Santa Fe
y Chaco (n: 12/6.4%). Las cepas fueron colectadas de muestras
de hisopado rectal (n/%) (145 /77), orina (17/9), sangre (9/5) y
otros (18/9); 186/189 aislamientos portaban el gen vanA y los 3
restantes el gen vanB. Los VREfm fueron resistentes: 98%
ampicilina, 100% vancomicina, 98% teicoplanina, 100%
eritromicina, 99% ciprofloxacina, 96% estreptomicina, 77.2%
gentamicina, 6.3% tetraciclina y 3.7% cloranfenicol. El gen esp se
detectó por PCR (Leavis H., et al. JCM 44:1059-64, 2006). La
secuenciación de los genes purK, atpA, ddl, gdh, gyd, pstS y adk
se realizó según el esquema definido para la técnica de MLST
para esta especie. Resultados: analizando un aislamiento representativo del clon mayoritario A y uno de cada uno de los 34 tipos clonales restantes, se determinó que 25 de estos clones portaban el gen esp, representando el 92,3% del total de los aislamientos. Al secuenciar el gen purK de los dos clones mayoritarios A (57%) y B (7%) y comparar con la base de datos de MLST
(http://efaecium.mlst.net/) se confirmó que las secuencias presentaban 100% de homología con la correspondiente al alelo 1, asociada al CC17. Las secuencias de los 6 genes restantes del esquema de MLST en los mismos clones confirmó que ambos pertenecen al ST=17. Conclusión: el análisis de los resultados de los
genes esp y purK en los 2 clones mayoritarios, A y B (64%), sugiere que el CC17 es el principal responsable de la emergencia
y diseminación de VREfm en Argentina. Estos resultados fueron
confirmados al determinar que ambos clones corresponden al
ST=17, genotipo fundador del CC17. En el mismo sentido, la presencia del gen esp en la mayoría de los VREfm (>90%) indicaría
que estos clones hospitalarios tienen como origen común el CC17.
Nuestros resultados concuerdan con la hipótesis de que todos los
aislamientos de VREfm causantes de infección hospitalaria circulantes en la actualidad comparten un origen ancestral con el
CC17.
O21 – 27636 - METICILINO RESISTENCIA Y SENSIBILIDAD
A VANCOMICINA EN Staphylococcus COAGULASA-NEGATIVA (SCN): EVALUACIÓN DE DISTINTAS METODOLOGÍAS.
GAGETTI, P (1); CERIANA, P (1); SOLOAGA, R (2);
RODRIGUEZ, M (1); CORSO, A (1)
(1)Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS “Dr. CG Malbrán”. (2)
Hospital Naval de Buenis Aires
Introducción: SCN ha emergido como agente causal de
bacteriemia en inmunocomprometidos y en niños. El aumento en
la meticilino resistencia (MR) y la resistencia a otras drogas, convirtieron a vancomicina (VAN) en el último recurso para el tratamiento de infecciones por SCN. La detección precisa de MR y
sensibilidad a VAN mediante las pruebas de sensibilidad de rutina en SCN es un desafío desde hace años. En 2004, el CLSI
estandarizó la difusión con disco de cefoxitina (FOX) como
predictor de MR en S. aureus (SAU) y SCN. En 2008 se publicaron los puntos de corte de CIM para FOX en SAU, pero aún no
se han establecido para SCN. En 2009, se eliminaron los puntos
de corte de difusión para VAN en SAU y SCN. A la fecha el disco
de FOX y la CIM a VAN serían los únicos métodos disponibles
en los laboratorios clínicos para evaluar de rutina MR y sensibilidad a VAN en SCN. Los sistemas automatizados podrían evaluar
la sensibilidad a VAN, pero se desconoce el desempeño de los
equipos en la detección de MR en SCN. Objetivos: 1-Evaluar el
desempeño del disco de FOX y el sistema Vitek2 en la detección
de MR en SCN, 2-Establecer puntos de corte para FOX por el
método de agar dilución (AD) en SCN y 3- Evaluar la concordancia de la CIM a VAN entre Vitek2 y AD. Materiales y métodos: se
estudiaron 100 SCN de la colección del INEI, representados por
10 especies: 49 S. epidermidis, 14 S. saprophyticus, 13 S.
9
hominis, 7 S. haemolyticus, 6 S. simulans, 4 S. auricularis, 3 S.
capitis, 2 S. warneri, 1 S. cohnii y 1 S. xylosus. Se incluyeron 54
mecA positivos y 46 mecA negativos. Se realizó difusión con disco de FOX (30 ug), CIM a FOX y VAN por AD según CLSI y sensibilidad por Vitek2 (AST-P577) según recomendaciones del fabricante. Se usó la PCR del gen mecA como método de referencia para MR. Se comparó la sensibilidad a VAN por Vitek2 con
respecto al AD usado como referencia. Las discrepancias con el
método de referencia fueron confirmadas. Resultados: 1-La sensibilidad (SE) del disco de FOX fue 96% (2 cepas con 25mm) y
la especificidad (ES) 100%, con valor predictivo positivo (VPP)
100% y valor predictivo negativo (VPN) 96%. El resultado de
Vitek2 (considerando CIM a oxacilina, screening con FOX y sistema experto) dio una SE y ES de 100% para MR. 2- El mejor
punto de corte para FOX y SCN por AD se estableció en d” 2 para
sensible y e” 4mg/l para MR con SE 94%, ES 91%, VPP 93% y
VPN 94%. 3-El rango de CIMs a VAN fue 0,12-2 mg/l por AD y d”
0,5-4 mg/l por Vitek2. La CIM50 y CIM90 de VAN por ambos
métodos fue 1 mg/l y 2 mg/l, respectivamente. La concordancia
en la categoría de interpretación y la concordancia esencial
(CIM±1dil) entre Vitek2 y AD fue 100% para VAN. De acuerdo a
lo previamente descripto, el disco de FOX presentó muy buena
SE y ES para la detección de MR en SCN. El sistema Vitek2
mostró ser altamente SE y ES para Ia detección de MR en todas
las especies de SCN ensayadas. Si bien se evaluaron SCN con
CIM VAN ≥ 4 mg/l, Vitek2 mostró 100% de concordancia con AD.
El punto de corte de CIM de FOX propuesto para SCN de ≤ 2 y ≥
4mg/l, presentó una buena SE y ES pero no logró superar al disco de FOX en el diagnóstico de MR en SCN.
O22 – 27726 - PREVALENCIA NACIONAL DE Staphylococcus
aureus RESISTENTE A METICILINA (MRSA) ASOCIADO A LA
COMUNIDAD (CA-MRSA) EN ARGENTINA: ESTUDIO 2009.
SOLA, C(1); LAMBERGHINI, R(2); PAGANINI, H(3); GAGETTI, P(4
); EGEA, A L(5); LUCERO, C(4); FACCONE, D(4); GRUPO CA
MRSA, ARGENTINA; BOCCO, JL(5); CORSO, A(4)
(1) CIBICI-CONICET-UNC, (2) Hospital Militar de Córdoba, (3)
Hospital Nacional de Pediatría “Dr. JP Garrahan”, (4) Instituto
Nacional de Enfermedades Infecciosas. INEI-ANLIS “Dr. CG
Malbrán”, (5) CIBICI-CONICET-UNC
En los últimos años, CA-MRSA emergió y se diseminó, produciendo infecciones desde leves a muy graves, en diferentes
países del mundo, con valores de prevalencia variables, alcanzando el 50% o más en algunas regiones. Estas cepas son sensibles a la mayoría de los antibióticos no ß-lactámicos (ANß) además de ser genéticamente distintas a los MRSA asociados al
hospital. En los países de alta prevalencia, estas cepas transmisibles y virulentas, comenzaron a introducirse en los hospitales.
En Argentina, se reportaron valores regionales de CA-MRSA de
16% en Córdoba (2005) y un rango entre 30% y 75% en pediatría, en provincias del norte, este y centro (2007). Objetivo: establecer la prevalencia nacional de MRSA en infecciones asociadas al ámbito hospitalario (HA-MRSA) y a la comunidad (CAMRSA). Materiales y métodos: se analizaron todas las infecciones por S. aureus [MRSA o S. aureus meticilino-sensible (MSSA)]
producidas durante el mes de noviembre del año 2009 en 66
hospitales distribuidos en 21 provincias y CABA. Se definió como
infección de inicio en el hospital (HO), a aquellas que no estaban
presentes al ingreso del paciente y que se diagnosticaron luego
de las primeras 48 h de internación. Se utilizó el criterio microbiológico para diferenciar CA-MRSA (MRSA con resistencia (R)
a no más de un ANß) de HA-MRSA. Resultados: se obtuvieron
591 aislamientos de S. aureus, de los cuales el 54% fueron MRSA,
37% CA-MRSA y 17% HA-MRSA. La prevalencia de CA-MRSA
varió entre el 5% y el 81%, con una tendencia a los valores más
altos en el norte (Formosa, Jujuy, Salta y Catamarca) disminuyendo hacia el centro y sur del país. Se diagnosticaron 373 infecciones de inicio en la comunidad (CO), 53 % producidas por CAMRSA, 5% por HA-MRSA y 44% por MSSA. Las restantes 218
fueron infecciones HO, 37% producidas por HA-MRSA, 11% por
CA-MRSA y 52 % por MSSA. La mayoría (76%) de las infecciones por CA-MRSA fueron de piel y tejidos blandos. El 24%, 60%
10
y 43% de las infecciones por CA-MRSA, HA-MRSA y MSSA respectivamente fueron infecciones invasivas (Iinv). El tipo de muestras en IInv producidas por CA-MRSA/HA-MRSA fue (en %): sangre 55/57, líquido pleural: 12/18, tejido óseo: 18/3 y LCR: 8/1. El
34% de los CA-MRSA presentó R acompañante a un ANß: 21%
ERY-CLI, 1.5% CIP, el 1.2% GEN, 0.6% RFA, y 0.3% CMP. Entre los HA-MRSA la R fue: 84% ERY-CLIN, 90% GEN, 74% CIP,
25% RFA, 8% TMS y 6% CMP. La prevalencia de MRSA en Argentina ha alcanzado el 54%, con predominio del fenotipo CAMRSA (37%) sobre HA-MRSA (17%). Las cepas CA-MRSA están diseminadas por todo el país, alcanzando los valores mayores de prevalencia en las provincias del norte. Una cuarta parte
de las infecciones por CA-MRSA son invasivas. El 11% de las
infecciones de inicio en el hospital son producidas por CA-MRSA.
La epidemiología de las infecciones por MRSA esta cambiando
drásticamente en nuestro país y en el mundo. Evaluar las estrategias para el control de la diseminación de MRSA tanto en el
medio hospitalario como en la comunidad es el gran desafío de
los efectores de salud.
O23 – 27753 - DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE
CARBAPENEMASAS EN Bacteroides grupo fragilis EN ARGENTINA. LITTERIO, M(1); FERNANDEZ CANIGIA, L(1); CEJAS, D(2);
LEGARIA, MC(1); CASTELLO, L(1); PREDARI, SC(1); DI MARTINO,
A(1); ROSSETTI, A(1); ROLLET, R(1); CARLONI, G(1); BIANCHINI,
H(1); RADICE, M(2); GUTKIND, G(2); OTROS PARTICIPANTES
DE LA VIGILANCIA(3)
(1) Subcomisión de Bacterias Anaerobias - SADEBAC (2) Facultad de Farmacia y Bioquímica - UBA (3) Bottiglieri M, Rocchi M,
Márquez MI, Machain M, Mauro MC, Núñez MR, Ballester D.
Introducción: Bacteroides grupo fragilis (BGF) son los bacilos
gram-negativos anaerobios más frecuentemente implicados en
infecciones en humanos. Se destacan del resto de los anaerobios
por su amplia resistencia a los antibióticos de uso habitual. Aunque la actividad de algunos antibacterianos se ha mantenido inalterable a lo largo de los diferentes relevamientos efectuados en
nuestro país, en estudios recientes hemos detectado la emergencia de aislamientos con resistencia o sensibilidad reducida a los
carbapenemes [imipenem (IMI), ertapenem (ERT) y doripenem
(DOR)]. La producción de una metalo-ß-lactamasa codificada por
el gen cfiA ha sido descripta en la literatura como la responsable
de la resistencia a estos antibióticos. Objetivos: evaluar
fenotípicamente la presencia de metalo-carbapenemasas en aislamientos de BGF resistentes o con sensibilidad disminuida a los
carbapenemes (CIM =4 ug/ml) y detectar genotípicamente la presencia de cfiA. Materiales y métodos: se determinó la sensibilidad a ERT, IMI y DOR de 363 aislamientos de BGF por el método de dilución en agar según las normas del CLSI. En los aislamientos que mostraron resistencia o sensibilidad disminuida a IMI,
ERT o DOR (CIM= 4 ug/ml) se determinó la CIM a IMI con el
agregado de EDTA (0,4 mM) para evaluar la posible presencia
de metalo-carbapenemasas del grupo 3 de K. Bush. Se investigó
la presencia del gen cfiA por amplificación por PCR empleando
genes específicos en dichos aislamientos. Resultados: en 20 aislamientos se observó una CIM = 4 ug/ml para los carbapenemes.
El gen cfiA codificante de la metalo-ß-lactamasa se detectó en 8
aislamientos de Bacteroides fragilis: tres de ellos presentaron alta
resistencia a los tres carbapenemes, la cual revirtió por el agregado de EDTA (disminución de la CIM de IMI = 3 títulos). En los
5 restantes, con sensibilidad disminuida a ERT y DOR, pero sensibles a IMP, la inhibición con EDTA sólo se observó en 3 de ellos.
No se detectó la presencia de cfiA en otras especies de
Bacteroides grupo fragilis, ni en una cepa de Bacteroides ovatus/
thetaiotaomicron resistente a los tres carbapenemes en el cuál
tampoco se observó inhibición con EDTA. Conclusiones: el ensayo de detección fenotípica empleando EDTA permitió la detección de metalo-carbapenemasas en 6/8 microorganismos productores de la enzima cfiA (en todos aquellos que presentaron resistencia y en 3/5 que presentaron sensibilidad disminuida). La detección del gen codificante de dicha metaloenzima no siempre
correlaciona altos valores de CIM para los carbapenemes, por lo
tanto, es necesario determinar la presencia de elementos que
regulen la expresión de este gen, la presencia de mecanismos
concomitantes y los mecanismos que median la resistencia en
otras especies diferentes a B. fragilis.
O24 – 27947 - RESISTENCIA A CARBAPENEMES EN Pseudomonas aeruginosa: UN EJEMPLO DE COOPERACIÓN. SANTELLA, GISELA (1); POLLINI, SIMONA (2); GUTKIND, GABRIEL
(1); ROSSOLINI, GIAN MARIA (2); RADICE, MARCELA (1)
1. Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA, Argentina, 2. Dpto.
Biologia Molecolare, Universitá di Siena, Italia
La expresión de carbapenemasas, la sobreexpresión de
enzimas de tipo AmpC, el aumento en la expresión de las bombas de eflujo, la disminución en la permeabilidad de la membrana y la presencia conjunta de estos mecanismos pueden ser
reponsables de la multirresistencia en Pseudomonas aeruginosa
(Pae). En este trabajo se analizó la contribución a la resistencia
de los distintos mecanismos mencionados. Métodos: se incluyeron 20 aislamientos de Pae recuperados en el período 2004–2005,
en un hospital de Buenos Aires. Si bien todos los aislamientos
presentaron el mismo nivel de expresión de la enzima IMP-13 y
pertenecieron al mismo tipo clonal, sólo 5/20 fueron resistentes a
carbapenemes (grupo-R), resultando el resto sensibles (grupo-S).
La identificación de las proteínas de la membrana externa fue
realizada por SDS-PAGE y MALDI-TOF. Se secuenciaron en forma completa OprD y AmpC y se compararon con bases de datos. Se determinaron los niveles de expresión de los genes
codificantes de OprD, de AmpC y de los sistemas de eflujo de tipo
Mex por RT-PCR. Se determinó la frecuencia de obtención de
mutantes resistentes a carbapenemes en el grupo-S, en Pae
ATCC 9027 y en aislamientos clínicos no productores de metalo
beta lactamasas (MBL) por crecimiento en concentraciones crecientes de carbapenemes. Resultados: la ausencia de OprD observada por SDS-PAGE fue confirmada por espectrometría de
masa en todos los aislamientos del grupo-R, sin embargo no se
observaron variaciones en los niveles de expresión de los genes
codificantes. La secuencia de OprD en el grupo-S fue idéntica a
la variante OprD-TS. Por el contrario las secuencias de OprD en
2/5 aislamientos del grupo-R presentaron una deleción puntual
que se traduce en una terminación prematura de la proteína, mientras que 3/5 presentaron una deleción de 27 pb que origina una
proteína de menor tamaño afectando probablemente su conformación funcional. La frecuencia de selección de mutantes resistentes a carbapenemes en los aislamientos del grupo-S fue de 2
x 108 a 1.6 x 107; no se obtuvieron mutantes a partir de Pae ATCC
9027 ni de aislamientos clínicos no productores de MBL. En todos los aislamientos (grupo-S y grupo-R) se observó el mismo
nivel de producción de una enzima de tipo AmpC, PDC-5, que
correspondió a una variante que presenta una débil actividad de
carbapenemasa. Con respecto a la expresión de sistemas de
eflujo sólo se observó un ligero aumento en el sistema de eflujo
MexAB-OprM en el grupo-R. Conclusiones: diversas mutaciones
responsables de la ausencia de OprD en membrana externa, así
como la sobreexpresión de MexAB-OprM y la presencia de la
enzima PDC-5, contribuyen a la resistencia a carbapenemes en
aislamientos productores de IMP-13. El aumento en la frecuencia de selección de mutantes en los microorganismos productores de MBL respecto de los no productores pone de manifiesto el
riesgo de falla terapéutica en presencia de aislamientos productores de IMP-13 categorizados como sensibles de acuerdo a los
puntos de corte del CLSI.
MICROBIOLOGÍA AGRICOLA Y AMBIENTAL
O25 - 27080 DIVERSIDAD Y ABUNDANCIA DE BACTERIAS
PROMOTORAS DEL CRECIMIENTO VEGETAL EN SUELOS
URUGUAYOS CON ROTACIÓN DE CULTIVOS Y SIEMBRA DIRECTA. BAJSA, NATALIA(1,2); AZZIZ, GASTON(1); COUTINHO,
HEITOR DA C(3); ROSADO, ALEXANDRE S(4); ARIAS, ALICIA(1)
(1) Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, Uruguay, (2) Universidad de la República, Uruguay, (3) Empresa
Brasileira de investigación Agropecuária, Brasil, (4) http://
www.ufrj.br/Universidade Federal do Rio de Janeiro
La rotación de cultivos y la siembra directa son prácticas
agrícolas que han sido adoptadas por los productores uruguayos
como alternativas más sustentables que el cultivo continuo y el
laboreo convencional, debido a sus efectos sobre la productividad y parámetros fisicoquímicos del suelo. Sin embargo, poco se
sabe sobre el impacto de estos sistemas de manejo sobre las
bacterias edáficas promotoras del crecimiento vegetal (PGPB). El
objetivo de este trabajo fue evaluar el impacto del cultivo continuo de granos o su rotación con pasturas sobre comunidades de
PGPB. Se utilizó un ensayo de larga duración instalado en INIATreinta y Tres (Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria,
Uruguay), que cuenta con tratamientos con diferentes intensidades de uso del suelo bajo siembra directa. Se tomaron muestras
de suelo en otoño y primavera, durante 2 años y se analizaron
las poblaciones cultivables por técnicas clásicas de recuento, así
como la estructura de la comunidad por métodos moleculares independientes de cultivo. La población de actinobacterias fue más
abundante en campo natural y en las rotaciones con mayor presencia de pasturas que bajo agricultura continua. La abundancia
de Pseudomonas fluorescentes y esporulados aerobios (principalmente Bacillus spp.) no presentó diferencias significativas entre
los tratamientos. Se analizó la diversidad del dominio Bacteria por
DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) de fragmentos
del gen del ARNr 16S. Se observó una clara relación entre la
estructura de la comunidad y el tratamiento agronómico. Las
muestras de campo natural resultaron más similares a las muestras con pasturas que a las de cultivo continuo de granos. Los
patrones correspondientes a las rotaciones fueron intermedios
entre el tratamiento de mejoramiento permanente y el de agricultura continua. Los resultados de este trabajo aportaron conocimiento sobre la abundancia y diversidad de bacterias presentes
en suelos uruguayos, y permitieron establecer que los sistemas
de manejo agrícola alteran la estructura de las comunidades
bacterianas edáficas. Financiación: PDT-DICYT, UNU-BIOLAC,
PEDECIBA.
O26 - 27332 CARACTERIZACIÓN MICROBIOLÓGICA Y MOLECULAR DE Pseudomonas EN SUELO Y RIZOSFERA DE LOTES AGRÍCOLAS CULTIVADOS BAJO SIEMBRA DIRECTA.
ORIGEN DE NUEVOS AISLAMIENTOS PGPR. AGARAS,
BETINA(1); FERNANDEZ, LETICIA A(2); WALL, LUIS G(1);
VALVERDE, CLAUDIO(1)
(1) Universidad Nacional de Quilmes, (2) Universidad Nacional del Sur
Antecedentes: Con el fin de evaluar los efectos de prácticas
agrícolas en siembra directa sobre la biología del suelo y su productividad, se ha constituido el consorcio de investigación público-privado BIOSPAS (Biología del Suelo y Producción Agraria
Sustentable). Entre los microorganismos con reconocidas propiedades promotoras del desarrollo vegetal (PGP), se encuentran
especies del género Pseudomonas. Comprender los efectos de
las prácticas agrícolas, del cultivo, de sitio geográfico y tipo de
suelo sobre la diversidad de Pseudomonas, así como su correlación con otras variables físicas, químicas y biológicas, podría contribuir a la identificación de indicadores biológicos de calidad de
suelo. Por otra parte, estas muestras constituyen fuentes
invaluables de aislamientos adaptados localmente a condiciones
de suelo y a la rizosfera de las variedades cultivadas. Objetivos:
1) Analizar la carga y diversidad de Pseudomonas spp. en muestras de suelo y rizosfera; 2) obtener aislamientos del mismo género con potenciales actividades PGP. Material y Métodos: Muestras de suelo (0-10 cm) y de sistemas radiculares de plantas sanas de lotes con historia de siembra directa y diferentes manejos, y de ambientes naturales vecinos, en Córdoba, Entre Ríos y
Buenos Aires. Se cuantificó la carga de Pseudomonas totales y
fluorescentes por plaqueo en medio selectivo Gould’s S1. La diversidad se analizó mediante PCR-RFLP de marcadores génicos
oprF y gacA. Sobre aislamientos en medio S1, se realizaron ensayos de actividad en placa (antagonismo, producción de
exoproteasas y HCN, solubilización de Ca3PO 4). Por otra parte,
11
diluciones de muestras de suelo se plaquearon en medio NBRIP
para cuantificar y aislar microorganismos con capacidad de
solubilizar Ca3PO4; aquellas colonias con halo que además crecieron en medio S1, se confirmaron como Pseudomonas spp.
mediante PCR-RFLP, y se evaluó su capacidad solubilizadora en
medio líquido. Resultados: Se observó una correspondencia absoluta entre el crecimiento en medio S1 y la detección de los
marcadores oprF y gacA, lo que permite la comparación directa
de recuentos y de diversidad del grupo en las muestras. El análisis conjunto de carga (UFC/g) de Pseudomonas y de diversidad
molecular permitieron revelar: a) efectos cuantitativos y cualitativos de enriquecimiento en rizosfera en comparación a suelo entre
líneas de siembra; b) efectos de las prácticas agrícolas sobre la
diversidad. Se obtuvo un conjunto de aislamientos de Pseudomonas a partir de suelo y rizosfera, con capacidad de inhibir in
vitro el desarrollo de fitopatógenos, y de solubilizar Ca 3PO4 en
cultivo líquido. El monitoreo de los sitios de muestreo a lo largo
de varios ciclos de cultivo mediante estas técnicas microbiológicas
y moleculares, permitirá evaluar la influencia de la estacionalidad
y del manejo agrícola sobre las poblaciones de Pseudomonas y
analizar su correlación con otras variables edáficas y agronómicas
dentro del consorcio BIOSPAS. Asimismo, se comenzó a generar una colección de aislamientos de Pseudomonas spp. con potenciales propiedades PGP que deberán ser evaluados in planta.
O27 - 27566 CONSTRUCCIÓN DE UN NUEVO TRANSPOSÓN
MINI-Tn5 PORTADOR DE UN ORIGEN DE REPLICACIÓN
BACTERIANO PARA SU USO EN ESTUDIOS RIVET EN
RIZOBIOS. SALAS, M EUGENIA; LOZANO, MAURICIO; MARTINI,
CARLA; SALTO, ILEANA; TORRES TEJERIZO, GONZALO;
GIUSTI, ANGELES; DEL PAPA, FLORENCIA; PISTORIO,
MARIANO; LAGARES, ANTONIO
Instituto de Biotecnología y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata
Introducción: Los rizobios son bacterias gram-negativas que
habitan el suelo y se caracterizan por fijar nitrógeno atmosférico
cuando se asocian en simbiosis con plantas leguminosas. Dicha
asociación es el resultado de un conjunto de eventos de señalización cuyos genes asociados no han sido aun del todo caracterizados. La técnica RIVET (Recombination based In Vivo
Expression Technology) permite identificar genes que, en una
condición particular, se expresan de modo diferencial respecto de
una condición fisiológica de referencia. En nuestro laboratorio se
ha desarrollado una variante de la técnica RIVET que usa un
transposón derivado del Tn5 como herramienta para generar fusiones transcripcionales a lo largo del genoma al gen de una
resolvasa (tnpR) localizada en un extremo del transposón. La
expresión de TnpR en clones específicos resultará en la escisión
de un cassette de DNA que cambiará el fenotipo de la bacteria
indicando que el gen fusionado a la resolvasa en dicho clon se
ha expresado. Objetivos: Construcción de un nuevo mini-Tn5 portador de un origen de replicación (oriV) bacteriano funcional en
Escherichia coli que facilite la recuperación de secuencias
flanqueantes al transposón en clones que resulten de interés luego
de la aplicación de la técnica RIVET. Materiales y Métodos: Medios de cultivo complejos TY, LB. Conjugaciones bacterianas siguiendo protocolos clásicos. Técnicas moleculares según Maniatis
et al. (1982). Resultados: Se clonó un origen de replicación funcional en E. coli proveniente del plásmido pSM10 dentro del sitio
NotI presente en un transposón mini-Tn5, haciendo uso de
oligonucleótidos como adaptadores, dando como resultado el
plásmido llamado pRIVET-miniTn5-ori. Teniendo en cuenta que
el vector pRIVET-miniTn5 no posee capacidad de replicarse en
cepas de E. coli que no poseen la proteína pi, la recuperación de
clones que poseen el oriV clonado dentro del sitio NotI del vector
se realizó mediante la selección de aquellos clones que poseían
la capacidad de crecer en un medio selectivo conteniendo
tetraciclina, resistencia codificada por el vector. Los clones obtenidos fueron verificados por su fenotipo, su patrón de restricción
y su secuencia. Para la nueva herramienta RIVET analizamos la
capacidad de transposición en Sinorhizobium meliloti y la funciona-lidad de la resolvasa codificada por el transposón. Conclusio-
12
nes: Hemos construido un nuevo transposón portador de un oriV
funcional en E. coli. Hemos verificado que la nueva construcción
mantiene la capacidad de transponer en S. meliloti y que, como
es esperable, en muchas de sus inserciones da lugar a escisiones del cassette de DNA blanco de TnpR. El sistema presentado
es el primero en su tipo, y constituye una herramienta práctica muy
eficiente para generar fusiones génicas a tnpR para estudios
RIVET evitando la construcción de bibliotecas genómicas de fusión en vectores plasmídicos.
O28 - 27671 ANÁLISIS FENOTÍPICO DE UNA BIBLIOTECA DE
TRANSFORMANTES INSERCIONALES POR ADN-T DEL HONGO MICORRÍCICO MODELO Laccaria bicolor. ALVAREZ CRESPO, M CECILIA; KEMPPAINEN, MINNA J; PARDO, ALEJANDRO G
Laboratorio de Micología Molecular, Departamento de Ciencia y
Tecnología, Universidad Nacional de Quilmes
Laccaria bicolor es el primer hongo micorrícico cuyo genoma
ha sido secuenciado completamente. Contando con esta útil información, es posible desarrollar estudios de análisis funcional en este
organismo modelo, gracias a la aplicación de metodologías previamente desarrolladas en nuestro laboratorio. En estudios previos
realizados sobre la cepa dicariótica S238N, se demostró que L.
bicolor es susceptible a la transformación mediada por
Agrobacterium tumefaciens, obteniéndose un patrón de integración
azaroso en copia única en el genoma fúngico. Por otra parte, no
se encontró homología o microhomología entre las secuencias de
los bordes del ADN-T y los sitios de integración. Si bien, en principio, la integración no parece estar dirigida, se observó que de las
secuencias obtenidas 71% correspondían a genes y 29% a regiones intergénicas. Esto podría sugerir un direcciona-miento de integración hacia regiones génicas o ser un reflejo directo de la alta
proporción de genes que contiene el genoma de Laccaria. A la luz
de estos resultados, surge la posibilidad de utilizar esta metodología para la generación de mutantes por perdida de función en la
cepa monocariótica S238N-H82. Esto permitiría analizar los
mutantes fenotípicos obtenidos, así como evaluar si el patrón de
inserción en el monocarión concuerda o no con el observado en la
cepa dicariótica. Para ello, se construyó una biblioteca de 1000
mutantes insercionales independientes de L. bicolor con la finalidad de caracterizar funcionalmente genes de importancia biológica. El rendimiento obtenido durante la transformación fue del 90%.
La cepas transgénicas fueron obtenidas por transformación con el
vector binario de rescate génico pHg/pBks, lo que permite la posterior recuperación del transgen para analizar el sitio de inserción
en el genoma. Las cepas obtenidas fueron evaluadas en medio
completo y en medio mínimo para la búsqueda de fenotipos. Aquellas cepas que difirieron en su crecimiento respecto a la cepa silvestre (7% de la biblioteca), fueron cruzadas con la cepa compatible S238N-H107 y la suficiencia del dicarión fue evaluada en medio completo y medio mínimo. La transferencia de ADN-T por medio de A. tumefaciens a mono-cariones de L. bicolor permite la
obtención de cepas mutantes fenotípicas.
O29 - 27677 RESPUESTA SISTÉMICA DE Solanum lycopersicum
INOCULACIÓN CON Azospirillum brasilense. RIBAUDO, C(2);
HUESO, G(1); PONDS, C(1); GRANELL, A(1); CURA, J(2);
CANTORE, M(2)
(1) Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas, Valencia,
España, (2) Facultad de Agronomía, Universidad de Buenos Aires
La capacidad de las PGPRs para desencadenar procesos
benéficos para el desarrollo de las plantas o para el gatillado de
mecanismos de resistencia frente a diferentes generadores de
estrés, depende de que las bacterias puedan colonizar a la planta. Para que esta relación benéfica planta/bacteria se establezca
es necesario que la compleja red de reacciones defensivas de la
planta discrimine de alguna forma, no conocida por el momento,
a las PGPRs como no patógenos. Con el objetivo de profundizar
en la comprensión de los mecanismos moleculares y bioquímicos
involucrados en esta interacción se llevó a cabo un análisis global de los transcriptos en la parte aérea de plantas de tomate ino-
culadas con Azospirillum brasilense a los 7 y 14 días después de
la inoculación (DDI). Materiales y Métodos: Se utilizaron semillas
de Solanum lycopersicum CvF36 que se cultivaron en frascos de
vidrio conteniendo 40 mL de medio Hoagland agarizado al 0,8%.
Cada planta se inoculó con 50 µL de la suspensión bacteriana de
A. brasilense (2x105 UFC). Las plantas se mantuvieron en cámara de cultivo a 25 °C hasta el momento de la cosecha para la
extracción de ARN (7 y 14 DDI). Se asignaron 25 plantas a cada
uno de los tratamientos. Para la extracción de ARN, síntesis de
ADNc y marcación e hibridación de micromatrices se siguieron
protocolos detallados en http://ted.bti.cornell.edu/cgi-bin/array/
basicsearch.cgi. Para la amplificación de los genes de interés se
utilizaron los pares de cebadores diseñados en base a secuencias depositadas en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Las muestras se
sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 1% en buffer
TAE. Se utilizaron 8 micromatrices de ADNc Tom 1, Cornell USA.
Resultados: Finalizados los procesos de filtrado y normalización
quedaron para el análisis 5494 ADNcs. De los genes que fueron
estadísticamente expresados en forma diferencial se eligieron algunos que resultaron especialmente interesantes para nuestro
estudio y se confirmó su expresión diferencial por RT-PCR. Se
identificaron 224 genes que fueron diferencialmente regulados al
menos dos veces, en respuesta a la inoculación con A. brasilense.
De estos, 33 aparecieron diferencialmente expresados a los 7 DDI
y 191 a los 14 DDI. Los genes se clasificaron en 10 categorías
funcionales de acuerdo a la similitud de secuencias con genes
conocidos: asociados a pared celular, PRs, relacionados con la
defensa, con el metabolismo, con la biosíntesis de hormonas, con
el transporte, genes de factores de transcripción, genes desconocidos, genes relacionados con la fotosíntesis y con la señalización. En la respuesta de la planta a la inoculación participan
varios genes descriptos en interacciones planta/patógeno como
Pti 4, pero a diferencia de estas interacciones, se ha visto un
apagado en forma secuencial de los genes involucrados en la
repuesta HR. El uso de la técnica de micromatrices permitió el
análisis simultáneo de los genes cuya expresión cambia en plantas de tomate como resultado de la interacción con A. brasilense.
Pese a la respuesta defensiva que la inoculación provocó, tiene
lugar una colonización beneficiosa y fructífera por esta bacteria.
De alguna forma aún no conocida, la planta puede diferenciar un
microorganismo patógeno de otro que no lo es, generando respuestas defensivas más débiles y tardías.
O30 - 27918 INFLUENCIA DE LOS EXUDADOS DE SEMILLAS
DE ALFALFA SOBRE LOS LPS, PROTEÍNAS EXTRACELULARES Y MOLÉCULAS SEÑALES DE DOS CEPAS DEL GÉNERO Pseudomonas. GUIÑAZU, LORENA BELEN(1); ROVERA,
MARISA(1); ROSAS, SUSANA(1); ESPINAR MARCHENA, FRANCISCO(2); BELLOGIN IZQUIERDO, RAMON(2); ESPUNY GOMEZ,
MARIA DEL ROSARIO(2)
(1) Universidad Nacional de Rio Cuarto, Córdoba, (2) Universidad
de Sevilla, España
Numerosas investigaciones reportan un efecto positivo en el
crecimiento de las leguminosas por la inoculación con bacterias
de vida libre del género Pseudomonas. Las cepas P. aurantiaca
SR1, P. putida SP22 fueron aisladas de la rizosfera de soja
(Glycine max L.) y son capaces de solubilizar compuestos insolubles de fósforo, movilizar hierro a través de la producción de
sideróforos e inhibir el crecimiento de diferentes especies fúngicas.
El objetivo de nuestro trabajo fue ampliar el estudio de estas cepas en características claves en el establecimiento de la relación
planta-bacteria y estudiar la influencia de los exudados de semillas de alfalfa (Medicago sativa L.) sobre estas características.
Para ello se realizó el análisis electroforético de lipopolisacáridos
(LPS) de la pared mediante la extracción y análisis de los mismos en medio TY y en medio TY suplementado con exudados de
semillas de alfalfa y con el flavonoides luteolina (característico de
los exudados de alfalfa). El perfil electroforético de proteínas
extracelulares se obtuvo a partir del cultivo de las bacterias en
presencia y ausencia de exudados axénicos de semillas de alfalfa o de luteolina y se determinó la existencia del sistema de se-
creción Tipo III en ambas cepas por hibridación en heterología con
una sonda de genes conservados. En los ensayos de percepción
de quórum se empleó como biosensor Agrobacterium tumefaciens
NT1 pZLR4 y los sobrenadantes de bacterias de 1, 2 y 3 días de
crecimiento en TY (adicionado con flavonoides o exudados de
semillas). Se observó un perfil de LPS en escalera, distinto entre
P. aurantiaca y P. putida, pero similar al que presentan las especies de Salmonella. No se observaron cambios significativos en
este modelo de perfil por la adición de exudado o de luteolina.
No se detectó ninguna alteración significativa en el perfil de proteínas extracelulares de P. putida SP22 cuando fue cultivada en
presencia de exudados de semillas de alfalfa o de luteolina, pero
sí en el caso de P. aurantiaca SR1, donde apareció una nueva
banda y se intensificaron otras dos. La secreción de estas proteínas no se realizaría a través del sistema de secreción de Tipo III,
dado que ninguna de las cepas presentó señal tras la hibridación
con una sonda de genes conservados de este aparato de secreción. Las cepas fueron productoras de señales tipo Acil Homoserino Lactonas (AHL’s), destacándose P. aurantiaca SR1. Cuando se emplearon flavonoides o exudados, no se observaron cambios destacables. La cepa P. aurantiaca SR1 presentó cambios
en los perfiles de secreción de proteínas cuando fue cultivada en
presencia de exudados de semillas de alfalfa. Futuros estudios
nos permitirán determinar si estos han sido propiciados por la
planta hospedadora o sus derivados.
MARTES 19/10/2009
O31 - 27224 DETERMINACION DE LA CAPACIDAD SECUESTRANTE DE AFLATOXINA B1 POR MICROORGANISMOS AISLADOS DE KEFIR. LEON, A(1); GAMBA, R(1); SERNA, C(2);
QUINTERO, E(2); CARASI, P(1); SEDAN, D(1); ANDRINOLO, D(1);
SERRADELL, M(1); GARROTE, G(1); GIANNUZZI, L(1); DE
ANTONI, G(1)
(1) Universidad Nacional de La Plata, (2) UDEA
Las Aflatoxinas (AFs) son metabolitos secundarios de hongos
filamentosos Aspergillus flavus, A.parasiticus y A.nomius que contaminan los alimentos, siendo la aflatoxina AFB1 (AFB1) el
mutágeno y carcinógeno natural mas potente conocido. Se ha
demostrado que las bacterias ácido lácticas (BAL) capturan AFs
de forma cepa dependiente y que esto ocurre en la superficie
celular, donde participan componentes celulares como peptidoglicano, polisacáridos y proteínas. El kefir es una leche fermentada proveniente del Cáucaso euroasiático y se ha demostrado
la capacidad de sus sobrenadantes y de sus microorganismos de
prolongar la fase de adaptación (Lag) de A.flavus a pH entre 3.5
y 3.3 y de inhibir su crecimiento a pH 3.0. El objetivo del presente trabajo fue Investigar la capacidad de captura de AFB1 por
bacterias ácido lácticas y levaduras aisladas de gránulos de kefir
y determinar si la misma varía al cultivar los microorganismos en
dos medios diferentes: caldo MRS® y permeado de suero comercial (Ilolay®) al 5%(PS). Los microorganismos cultivados en MRS
o en PS, por 18 h a 30 °C, se lavaron con PBS y agua bidestilada
y se resuspendieron en PBS. Una mezcla 2.5ml:2.5ml de suspensión de microorganismos y AFB1 se incubó durante 4 h agitando
a 30°C. La mezcla se centrifugó a 2500 g, 10 min y se determinó
la concentración AFB1 en el sobrenadante en un equipo HPLC
Shimadzu LC-20 ATcon detector UV de arreglo de diodos, columna de reparto C18 HYPERSIL flujo:1.2 ml/min de acetonitrilo
30%,metanol 10% y agua 60 %. El % de captura se calculó con
la fórmula: 100%×(1–área del pico del sobrenadante AFB1/área
del pico de AFB1 control). Se evaluaron cepas de Lactobacillus
kefir; L.plantarum; Saccharomyces cerevisiae; Kluyveromyces
marxianus; S. boularddii(comercial) y K. lactis. Resultados: L. kefir
CIDCA 83111,83113 y 8321 capturaron entre 10 y 20% de AFB1;
L. kefir CIDCA 8348, 83115,8325 y L. kefirJCM 5818 capturaron
entre 30 y 40%. S.cerevisiae CIDCA 8112 y K. lactis cultivadas
en MRS capturaron entre 40 y 50%; S.cerevisiae CIDCA 81103 y
8116 capturaron entre 20 y 30%;K .marxianus CIDCA 8154 entre
13
10 y 20%, mientras que no se observó captura por S.boularddii.El
cultivo en PS indujo un cambio en el % de captura, la cual aumentó para S.cerevisiae 81103, 8116 y K.marxianus 8154 (entre
50 y 60%),disminuyó alrededor del 20% para K.lactis y no presentó variación significativa para S.cerevisiae 8112 (p<0.05).
L.plantarum 83114 cultivado en MRS capturó entre 30 y 40% y
en PS secuestró entre 50-60%. Las cepas evaluadas secuestraron AFB1, excepto S.boularddii. La mayor captura en MRS la presentaron L. kefir CIDCA 8348,83115,8325,JCM 5818;L.plantarum
CIDCA 83114;S.cerevisiae CIDCA 8112 y K. lactis y en PS
S.cerevisiae CIDCA 81103, 8116 y K.marxianus CIDCA 8154. La
capacidad de captura de los microorganismos varió significativamente con el medio de cultivo empleado, lo que puede deberse
a cambios a nivel de la expresión de componentes superficiales.
O32 - 27381 PROPIEDADES DE HIDRATACIÓN DE MICELIOS
FÚNGICOS SECADOS BAJO DIFERENTES CONDICIONES.
CANEL, ROMINA; LUDEMANN, VANESA; DE LA OSA, ORLANDO;
WAGNER, JORGE
Universidad Nacional de Quilmes
Una de las líneas principales de trabajo de nuestro grupo, está
vinculada a la caracterización de diversos hongos filamentosos no
tóxicos, aislados de diferentes matrices alimentarias, para su potencial empleo como ingredientes alimentarios nutritivos y funcionales. Si bien existe una vasta bibliografía en el uso de hongos
unicelulares como suplemento dietario, no es difundido el uso de
hongos filamentosos para tal fin. Así, surge una nueva oportunidad para el empleo de hongos filamentosos que se extiende más
allá de su tradicional uso en las fermentaciones alimentarias. El
objetivo del trabajo es evaluar el efecto del secado sobre las capacidades de hidratación de micelios fúngicos, los cuales en trabajos anteriores demostraron ser los mejores respecto a otros
siete géneros evaluados. Se trabajó con cepas de las especies:
Penicilium nalgiovense y Paecilomyces variotii. Los hongos se
cultivaron durante 7 días en YES a 25 °C y 135 rpm. Transcurrido dicho tiempo los micelios se lavaron, se filtraron y fueron expuestos a tres condiciones de secado (50 °C, 80 °C y liofilización).
Las muestras secas fueron molidas y tamizadas por malla de 0,5
mm. A estas muestras se les determinó la capacidad de retención de agua (CRA) y la capacidad de absorción de agua (CAA).
La CAA de los micelios fúngicos liofilizados fue la que presentó
los mejores resultados en comparación con las otras dos condiciones. Las pérdidas relativas fueron de 17% a 50 °C y de 75% a
80 °C para Paecilomyces y para Penicillium de 55% a 50 °C y de
75% a 80 °C. En cuanto a la CRA, los micelios fúngicos secados
a 80 °C en ambos géneros arrojaron valores considerablemente
menores que en las demás condiciones. En cuanto a la liofilización
también fue mejor para Penicillium, no obstante para Paecilomyces el secado a 50 °C obtuvo similares valores a esta. De los
resultados se puede concluir que el método de secado influye en
las capacidades de hidratación. Si bien hubo un comportamiento
generalizado para cada especie analizada, se observan importantes diferencias para cada cepa. Esto podría deberse a la diferencia en contenido proteico y de polisacáridos estructurales, ya que
en la capacidad de hidratación, las proteínas y los beta glucanos
juegan un papel preponderante. Las primeras, una vez desnaturalizadas, pierden en gran proporción esta capacidad. El análisis
por calorimetría diferencial de barrido (DSC) muestra que en los
cultivos frescos, existe una endoterma de desnaturalización proteica a una temperatura promedio de 59 °C, con un rango total
entre 45 y 75 °C. En los termogramas obtenidos para los micelios
secos ésta endoterma tiene una entalpía menor para todas las
condiciones de secado, siendo drástica ésta disminución a 80 °C,
esto explica en parte, el comportamiento obtenido por las muestras en los análisis de CRA y CAA.
O33 - 27393 BROTE DE INTOXICACION ALIMENTARIA EN UN
JARDIN DE INFANTES DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES.
MANFREDI, EDUARDO ALBERTO; RIVAS, MARTA
G. Malbrán”
14
Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) constituyen uno de los principales desafíos para la Salud Pública. En algunos jardines y comedores comunitarios muchas veces personal eventual poco capacitado, contribuye a reforzar el funcionamiento de la cocina, lo que determina un aumento del riesgo de
contaminación de los alimentos. En el presente trabajo se describe la investigación de un brote de ETA ocurrido el 27 de noviembre del 2008 en un Jardín de Infantes de la ciudad de
Hurlingham, Provincia de Buenos Aires. De los 117 niños, docentes y auxiliares que almorzaron ese día, 47 presentaron vómitos
(95%), y diarrea (5%). Las personas afectadas fueron 37 niños
de 2-6 años y 10 adultos. La tasa de ataque fue estimada en 43%,
y el período de incubación en una media de 6 h. Cinco niños fueron internados con signos de deshidratación, y uno de ellos derivado a terapia intensiva del Hospital Posadas. Se tomaron muestras de materia fecal de 5 pacientes, del alimento consumido e
hisopados de nariz y manos de 5 manipuladores. Las cepas aisladas de narinas del manipulador 1 (M1), de manos del manipulador 2 (M2) y 3 (M3), de 4 muestras de materia fecal, y del alimento, fueron tipificadas como Staphylococcus aureus subespecie
aureus, que portaban los genes que codifican para las
enterotoxinas SEA y SED. Los patrones de restricción obtenidos
por SmaI-PFGE presentaron una similitud del 100%. La investigación del brote estableció que durante la preparación del alimento, los manipuladores M1 y M2 fueron los encargados del trozado
y picado del pollo, mientras que M3 trabajó con el producto ya
procesado. M1 y M2 eran personal eventual con baja capacitación, utilizado como refuerzo en la cocina. Hubo además factores que favorecieron el desarrollo del Staphylococcus enterotoxigénico, como ser las altas temperaturas fuera y dentro de la
cocina, y el tiempo que se tardó en completar toda la operación
de picado, mezclado, fraccionamiento y distribución para el consumo. Como consecuencia del brote se extremaron las medidas
de higiene y se realizó la capacitación de todo el personal eventual junto al personal estable, confirmándose que las estrategias
de prevención y control requieren fundamentalmente de la educación de todos los actores relacionados con la preparación de
los alimentos. Además se enfatizó la importancia de la toma de
muestra, y aplicación de técnicas de Biología Molecular como
herramientas básicas no solo para la detección del agente causal, sino también para esclarecer el origen de la fuente de intoxicación con el fin de establecer medidas correctivas.
O34 - 27562 CARACTERIZACIÓN GENOTIPICA DE AISLAMIENTOS DE Yersinia enterocolitica RECUPERADOS EN ARGENTINA MORONI, M; PICHEL, M; VIÑAS, MR; BINSZTEIN, N;
TERRAGNO, R
Servicio Enterobacterias, Departamento Bacteriología, INEI ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”
Introducción: Yersinia enterocolitica (Y.e.) está obteniendo
cada vez más reconocimiento como un patógeno transmitido por
alimentos de importancia para la salud humana. La ubicuidad de
este microorganismo y su capacidad de crecer a temperaturas de
4 °C en carnes y productos lácteos hace que sea un microorganismo de preocupación. Pero no todos los aislamientos causan
enfermedad; las cepas patógenas para el hombre son las portadoras de los factores de virulencia: virF de localización plasmídica
y los factores cromosómicos ail (locus de invasión) y yst (toxina
termoestable). La ubicación en un plásmido del factor virF hace
necesario buscar otros marcadores cromosómicos como ail, y yst
para establecer la virulencia de los aislamientos. Objetivos: Determinar los biotipos de Y.e. circulantes en Argentina y la presencia de factores de virulencia en aislamientos provenientes de humanos y de alimentos. Materiales y Métodos: Se analizaron 47
aislamientos conservados en la colección del Laboratorio Nacional de Referencia, obtenidos entre los años 1982 y 2010, provenientes de humanos (n=22); de alimentos, cerdo y derivados,
pollo, huevo y vacunos (n= 23) y de ambiente (n=2). Estos aislamientos fueron identificados por pruebas bioquímicas y se determinaron los biotipos por las siguientes pruebas: fermentación de
xilosa, trehalosa, sorbita, salicina y sacarosa, hidrólisis de esculina
y producción de indol. Se determinó la presencia de los genes de
virulencia ail, y yst y secuencias de especie 16S rRNA por PCR.
Resultados: La identificación por PCR tuvo buena correlación con
la identificación bioquímica. La mayoría de los aislamientos de origen humano, 20 de 22 (90,9%) perteneció al biotipo 4 y presentó
los genes de virulencia ail, y yst, mientras que los dos restantes
fueron de biotipo 1A, negativo para los genes de virulencia y
biotipo 2, portador de ail y yst. Entre los 23 aislamientos de alimentos, 19 (82,6%) fueron del biotipo 1A y no presentaron los
genes ail y yst; tres, de biotipo 1B portadores del gen ail y uno
del biotipo 2, positivo para ambos genes de virulencia. Los dos
aislamientos ambientales fueron biotipo 1A, negativos para ambos genes de virulencia. En concordancia con otros estudios, los
aislamientos de Y.e. de origen humano fueron mayoritariamente
de biotipo 4 y contenían genes asociados a virulencia, mientras
que aquellos recuperados de alimentos y de ambiente pertenecían predominantemente al biotipo 1A y carecían de los genes ail,
y yst. Los resultados indican la dificultad en recuperar aislamientos virulentos de Y.e. a partir de alimentos. Esto podría deberse
a la posible presencia de inhibidores en los alimentos y/ó a la
presencia de más de una población de Y.e. en dichas muestras,
resultando en la inhibición de las cepas virulentas por acción
bactericida de las no virulentas; o simplemente por la selección
de colonias avirulentas debido a su presencia en mayor número
en los medios de cultivo utilizados para el aislamiento.
O35 - 27564 CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA Y RELACIÓN
CLONAL DE CEPAS DE Escherichia coli O178:H19 DE DISTINTOS ORÍGENES. PALLADINO, M(¹); DASTEK, B(²); CARBONARI,
C(²); BENTANCOR, A(³); RUMI, MV(³); TANARO, J(4); IRINO, K(5);
MASANA, M(¹); RIVAS, M(²)
(1) ITA, CIA, INTA, (2) INEI-ANLIS MALBRÁN, (3) Facultad de
Ciencias.Veteriarias - UBA, (4) Facultad de Bromatología - UNER,
(5) I.A.LUTZ,SP,BRAZIL
Algunos serotipos de Escherichia coli productor de toxina
Shiga (STEC) causan enfermedad humana grave como diarrea,
colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico (SUH). Su
reservorio son los rumiantes, principalmente el ganado bovino,
aunque pueden aislarse de otras especies animales. Los alimentos de origen bovino constituyen su principal vía de transmisión.
STEC O178:H19 ha sido aislado del reservorio animal, de alimentos y casos clínicos, tanto en Argentina como en otros países,
aunque su reconocimiento como patógeno humano es reciente.
El objetivo del presente trabajo fue caracterizar genotípicamente
cepas STEC O178:H19 de diversos orígenes aisladas en Argentina, y establecer su relación clonal. Un total de 50 cepas aisladas de heces bovinas (30), carcasas bovinas en frigoríficos (10),
carne bovina (6), heces caninas (3), y SUH (1), detectadas en
distintos relevamientos, fueron estudiadas. La caracterización
genotípica de las cepas, previamente identificadas como STEC
O178:H19 por serotipificación, pruebas bioquímicas, ensayo de
citotoxicidad en células Vero y Ridascreen ELISA, incluyó la detección mediante PCR de los genes stx1, stx2, ehxA, eae y saa.
Por PCR-RFLP se determinaron las variantes stx1, stx1c, stx2,
stx2c (vh-a), stx2c (vh-b) y stx2dactivable. La relación clonal se
estableció por electroforesis en campos pulsados (PFGE) con la
enzima de restricción XbaI. Todas las cepas fueron eae negativas, y 22 (44%) fueron positivas para ehxA y saa. Treinta (60%)
cepas portaron stx2, y las otras 20 (40%) stx1/stx2. La combinación de los factores de virulencia generó 11 perfiles genotípicos:
stx2c (vh-a) (30%), stx1/stx2/ehxA/saa (22%), stx2d2activable
(18%), stx1/stx2dactivable/ehxA/saa (16%), y stx2/stx2c(vh-a),
stx2NT, stx2c(vh-a)/stx2c(vh-b), stx2c(vh-b), stx2dactivable/
stx2d2activable/ehxA/saa, stx2dactivable/ehxA/saa, stx1/
stx2d2activable/ehxA/saa (2% cada uno). El 22% de las cepas
presentaron genotipos con mayor potencial patogénico, entre ellas
cepas aisladas de SUH (1), materia fecal bovina (6), carcasas bovinas (3) y carne bovina (1). Por XbaI-PFGE, se obtuvieron 32
patrones diferentes con 69% de similitud, 28 cepas se agruparon
en 10 clusters (#I a #X) con 2 a 4 cepas cada uno, mientras que
22 cepas mostraron patrones únicos. En el cluster #III se agruparon dos cepas, una aislada de un caso de SUH y la otra de una
carcasa bovina, que presentaron idéntico perfil genético (stx1/
stx2dactivable/ehxA/saa) y patrón de macrorestricción
(AREXSX01.0157). Los clusters V (AREXSX01.0323), VI
(AREXSX01.0320), VIII (AREXSX01.0326), y IX (AREXSX01.0324)
agruparon cepas aisladas de carne picada y ganado bovino. Las
cepas STEC O178:H19 estudiadas presentaron un perfil de virulencia con potencial patogénico para el hombre, fundamentalmente las cepas portadoras de ehxA y stx2dactivable.La tipificación por
PFGE mostró la clonalidad de aislamientos de distintos orígenes,
evidenciando la importancia que implica su control para las autoridades de Salud Pública no solo a nivel de establecimientos
elaboradores de alimentos sino también en reservorios animales.
O36 - 27582 SELECCIÓN DE LEVADURAS VÍNICAS PROVENIENTES DE LA PROVINCIA DE MENDOZA. BERNARDI,
MARCELA (1,2); SANCHEZ, MARIA LAURA (1,2); MARTINENGO,
NORA(1)
(1) Universidad Nacional de Cuyo, (2) FCA
El uso de levaduras seleccionadas asegura el mantenimiento
de las propiedades sensoriales típicas de los vinos producidos.
Existe una tendencia a seleccionar levaduras provenientes de las
mismas regiones en donde se realizarán las vinificaciones debido a que están preadaptadas al contexto agroclimático. Es por
esto que su uso como iniciadoras de las fermentaciones vínicas
resulta ser una valiosa herramienta para la diferenciación del vino,
a la vez que protege a la biodiversidad microbiana propia de cada
ecosistema vitícola. El objetivo del siguiente trabajo fue seleccionar cepas de levaduras para uso enológico mediante métodos
simples aplicables en laboratorios básicos de enología. La Facultad de Ciencias Agrarias, UNCuyo, cuenta con un cepario de levaduras provenientes de diferentes viñedos de Departamentos
vitícolas de la Provincia de Mendoza: Luján de Cuyo, Tupungato,
Maipú y Junín. Se tomó una muestra representativa de 40 levaduras. En cada levadura se evaluaron características tecnológicas que establecen la eficiencia de la misma en el proceso de
fermentación y cualitativas que ayudan a determinar la composición química y la participación en las cualidades sensoriales de
los vinos. Las primeras incluyen tolerancia al etanol, poder de
fermentación, cinética de fermentación, resistencia el anhídrido
sulfuroso, formación de sedimento, factor killer, preferencia de
fermentación: glucosa y fructosa, producción de espuma, formación de film o anillo, uso de alcohol como fuente de carbono y
dentro de las segundas se evalúa actividad ß-glucosidasa, formación de ácido acético y producción de ácido sulfhídrico. Los ensayos se realizaron por triplicado. Los parámetros estadísticos
descriptivos fueron calculados en el programa InfoStat, para el
agrupamiento de datos se utilizó el programa NTSyS 2.0 mediante
el coeficiente UPGMA. Del análisis de los resultados se concluyó
que la levadura número 523.4 de de Junín, es adecuada para la
producción de vinos tintos ya que presenta escasa producción de
acidez volátil y compuestos sulfurados, baja formación de espuma (menor a 2mm), resiste elevadas concentraciones de alcohol
(15%), asegura fermentaciones limpias debido a su capacidad de
formar sedimento, proporciona fermentaciones alcohólicas elevadas por su alto poder de fermentación (media=22,31), expresa
actividad ß-glucosidasa y tolera 100 ppm de anhídrido sulfuroso.
Las levaduras 9.1, 16.1 y 6.2 de Tupungato son adecuadas para
la obtención de vinos blancos ya que poseen carácter killer, toleran graduaciones alcohólicas mayores a 15%, producen enzimas
glicosidásicas, forman escasa cantidad de compuestos sulfurados,
resisten 100 ppm de anhídrido sulfuroso, no forman film o anillo
y sedimentan rápidamente. La cepa 525.4 de Junín es apta para
fermentaciones lentas o reanudación fermentativa debido a su
preferencia en el consumo de fructosa, además es resistente al
alcohol (15°) y al anhídrido sulfuroso (100 ppm). Solamente cuatro de cuarenta cepas fueron seleccionadas luego de la aplicación de ciertos criterios enológicos para ser utilizadas en fermentaciones a mayor escala. Estas cepas pueden ser empleadas para
lograr objetivos particulares de vinificación como obtener vinos
tintos o blancos aromáticos o como reactivadotes en caso de fermentaciones detenidas.
15
O37 - 27824 DISEÑO DE UN EQUIPO RADIANTE DE UV-C Y
ACCION DE LA RADIACION SOBRE CONIDIOS CON DIFERENTES CONTENIDOS DE MELANINA. BASILICO, JUAN CARLOS;
CHIERICATTI, CAROLINA; BAISETTO, MARIANELA; ZAPATA DE
BASILICO, MARIA L
Facultad de Ingeniería Química, Universida Nacional Del Litoral
Las radiaciones UV-C son comúnmente usadas para control
ambiental, sin embargo se han realizado pocos estudios sistemáticos sobre la influencia de la energía radiante frente a mohos con
diferente contenido de melanina. Se construyó un equipo a escala de laboratorio formado por 2 lámparas de 254,3 nm (TUV15
WT8, Philips) ubicadas en paralelo a 5 cm entre ambas. Se midió la Emitancia radiante expresada en mili watts. cm-2 (mW. cm2) a diferentes alturas, con un radiómetro (IL1700 Inter Light, USA)
con un sensor con filtro NS254 con difusor W Nº11187. El diseño
del equipo permite medir a diferentes distancias de las lámparas
(2-20 cm) la Energía radiante en Joules (J), pudiéndose variar el
factor tiempo y tipo de superficies a irradiar. Se obtuvieron niveles máximos y mínimos de Emitancia radiante (4,02 - 0.50 mW.cm2). Se estudiaron en una primera etapa 2 especies contaminantes frecuentes de la industria alimentaria zonal. Alternaria
alternata, con alto contenido de melanina en las paredes de sus
conidios y Geotrichum candidum, con artroconidios de paredes
finas y hialinas, irradiándolas sobre superficies de plástico (P) y
aluminio (A). Se partió de cultivos en fase exponencial y se prepararon suspensiones de conidios ajustando las concentraciones
a 106 conidios/mL en Tween 20 (0,1% en agua estéril). Se distribuyeron 0,1 mL de las suspensiones en las superficies de P y A
de 5 cm2 c/u, por triplicado, tanto para los controles como para
las superficies a irradiar. Se estudiaron diferentes tiempos (1-40
min) y distancias de la fuente de irradiación (2-20 cm). Para lograr una reducción de 3log10 con una Emitancia de 3,99 mW. cm2, para G. candidum fue necesario irradiarlo 2 min (1,176 J); en
cambio para A. alternata fueron necesarios 40 min (9,576 J). La
acción de UV-C resultó fuertemente dependiente de la presencia
o no de melanina en las paredes conidiales, ya que fue necesario una radiación 20 veces superior, para disminuir el mismo número de log10, para A. alternata que para G. candidum. Por otra
parte no se observó diferencia de comportamiento para los
conidios sobre las superficies plástico y aluminio.
O38 - 28119 ACCION DE AG-MORDENITA SOBRE EL CRECIMIENTO DE HONGOS CONTAMINANTES DE ALIMENTOS. ZAPATA DE BASILICO, MARIA L; CHIERICATTI, CAROLINA(1);
BASILICO, JUAN CARLOS (1); ZAMARO, JUAN MANUEL(2)
(1) Facultad de Ingeniería Química, Universida Nacional Del Litoral, (2) INCAPE CONICET U.N.L
Las zeolitas son aluminosilicatos hidratados cristalinos con
propiedades de adsorción y de intercambio iónico. Se ha reportado actividad antibacteriana de partículas de Ag-zeolita, vinculado probablemente tanto a la hidrofobicidad/hidrofilicidad de la
zeolita, como a las características del ión plata intercambiado. El
objeto de este trabajo es evaluar Ag-zeolitas en el control de hongos habitualmente encontrados en la industria alimentaria. Esto
es una primera etapa en el desarrollo de superficies antifúngicas
basadas en recubrimiento de Ag-zeolitas sobre materiales de uso
habitual en equipos y envases de la industria alimentaria. Se utilizó mordenita (Mor), con una relación Si/Al= 6,5, intercambiada
con Ag+. Para la obtención de Ag-Mor intercambiada (Ag-Mor-I),
se trató la zeolita con solución de AgNO3, lográndose una concentración de Ag de 14% p/p (equivalente a una solución 4mM
de Ag). Posteriormente, con porciones del sólido intercambiado,
se obtuvo Ag-Mor oxidada (Ag-Mor-O) por calcinación a 350 ºC
en flujo de aire y Ag-Mor reducida (Ag-Mor-R) mediante exposición a radiación con UV-C con una emitancia de 3,99 mWcm-2
durante 1 h. En esta etapa se estudiaron Geotrichum candidum,
Zygosaccharomyces rouxii y Debaryomyces hansenii aislados e
identificados a partir de alimentos contaminados. Se estudiaron
16
2 condiciones diferentes de cultivo por las características fisiológicas que presentan estas especies: extracto de malta agar (MEA)
a 28 °C y un medio con menor actividad acuosa (aw) Czapek extracto de levadura 20% sacarosa (CY20S) a 36 °C, cultivados hasta 7 días. Se midió, por sextuplicado, el crecimiento radial de las
colonias de los cultivos sobre ambos medios sin agregado alguno (Controles), con Mor, solución de AgNO3 1, 2 y 4 mM, y con
Ag-Mor-I, Ag-Mor-O y Ag-Mor-R. Se observó que Mor sin plata
incorporada, no presenta actividad antifúngica con los microorganismos estudiados. Para G. candidum (MEA-28° C) se observó
una reducción en el crecimiento de las colonias para el ión Ag+
en solución (1, 2 y 4 mM), del 80, 90 y 95% respectivamente. AgMor-I presentó una inhibición similar a Ag+ 4 mM, mientras que
Ag-Mor-O inhibió el 98% y Ag-Mor-R solo permitió la germinación
del microorganismo. Asimismo Z. rouxii y D. hansenii tuvieron un
comportamiento similar, mostrando una fuerte acción inhibitoria
en todos los casos. En los ensayo con CY20S a 36 °C no se observó efecto inhibitorio ni para las 3 concentraciones de solución
de AgNO3 ni para los 3 estados de Ag-Mor. De acuerdo a los
resultados obtenidos resulta promisorio el uso de Ag-zeolitas (y
en particular Ag-mordenita), para el control de hongos contaminantes de alimentos, pero los resultados obtenidos muestran una
dependencia con la composición del medio de cultivo utilizado.
MICROBIOLOGÍA GENERAL
O39 - 27092 VESÍCULAS DE MEMBRANA EXTERNA DE Brucella
abortus MODULAN LA RESPUESTA MACROFÁGICA. POLLAK,
CORA (1); DELPINO, M VICTORIA (1); BALDI, PABLO (1).
(1) Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral “Profesor Ricardo A. MARGNI” (IDEHU)
Las variantes lisa y rugosa de Brucella spp. liberan espontáneamente vesículas de membrana externa (VME) que contienen
proteínas de membrana, LPS y otros componentes. Las VME son
liberadas por diversas bacterias gram-negativas y consisten en un
subconjunto de la membrana externa y componentes solubles del
periplasma. Este sistema de secreción extracelular participa en
la estrategia utilizada por bacterias patógenas para modular la
respuesta inmunológica y perjudicar la función celular del huésped. Se desconoce si factores de virulencia asociados a VME tienen efectos citotóxicos dentro de las células invadidas. La
interacción de las VME de Brucella spp. con células de mamífero
y su impacto sobre la función celular no han sido abordados. Se
ha demostrado que la línea macrofágica humana THP-1 presenta una reducida producción de TNF-á en respuesta a la infección
con distintas especies del género Brucella y que existe algún factor
liberado por Brucella spp. al espacio extracelular que inhibe la
expresión de TNF-á en macrófagos humanos activados por LPS
de E. coli. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo es comenzar a
caracterizar el efecto de las VME de Brucella spp. vinculado a la
inhibición de la secreción de TNF-á sobre macrófagos estimulados con distintos agonistas de receptores de tipo toll (TLR) (LPS,
Pam3cys, flagelina). También se investigaron efectos similares
sobre otros tipos celulares que pueden ser infectados por Brucella
spp. (células bronquiales humanas). Las VME fueron obtenidas
a partir de la concentración del medio de cultivo en el que crecieron bacterias B. abortus S2308. Luego se les cuantificaron proteínas por el método de Bradford. Las VME fueron analizadas por
SDS-PAGE y western blot revelado con anticuerpos contra LPS
de Brucella spp. y además visualizadas por microscopía electrónica. Los ensayos de inhibición de la secreción de citoquinas fueron realizados mediante la co-incubación de las células (línea
monocítica humana THP-1 y bronquial humana Calu-6) con diferentes concentraciones de VME durante 4 horas, seguido de un
lavado y un estímulo de la secreción de 24 horas de duración con
LPS de E. coli (agonista de TLR-4), Pam3cys (agonista de TLR2) o Flagelina (agonista de TLR-5). La cuantificación de las
citoquinas secretadas fue realizada por ELISAs comerciales. De
acuerdo a la observación de las VME a través de microscopía
electrónica, se calcularon los diámetros de las vesículas, siendo
las más pequeñas de 30 nm y las más grandes de 178 nm, lo
cual concuerda con lo reportado en bibliografía. Por western blot
se detectó la presencia de LPS de Brucella spp. La preincubación
con 10 mg/ml de VME de Brucella spp. inhibió en un 91, 95 y 74
% la secreción de TNF-á en la línea macrofágica humana THP-1
frente a los estímulos de LPS, Pam3cys y flagelina respectivamente y disminuyó levemente la de IL-8 en la línea bronquial humana Calu-6 aunque en esta última las diferencias no alcanzaron
significación estadística. Las VME de Brucella spp. reducen la
secreción de TNF-á inducida por agonistas de TLR en macrófagos
humanos.
O40 - 27226 TRANSLOCACIÓN DEL EFECTOR SOPB DE
Salmonella typhimurium EN EL GANGLIO LINFÁTICO
MESENTÉRICO DURANTE LA SALMONELLOSIS MURINA.
GIACOMODONATO, MONICA (1); NOTO LLANA, MARIANGELES
(1); SARNACKI, SEBASTIAN (1); CERQUETTI, M CRISTINA (1).
(1) Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos (CEFYBO)Depto. Microbilogía, Facultad de Medicina - UBA
Los sistemas de secreción tipo tres (SSTT) de Salmonella
typhimurium codificados por las islas de patogénesis 1 y 2 (SPI-1
y SPI-2) son esenciales para la invasión de células epiteliales y
para la replicación en macrófagos, respectivamente. El SSTT-1
participa en eventos tempranos de la infección (ej: invasión) mientras que el SSTT-2 media procesos post invasivos (ej: replicación).
En contraposición a este modelo, algunos efectores SPI-1 se inducen tardíamente. En este trabajo se analizó la expresión y
translocación de SopB in vitro, en cultivos celulares e in vivo durante los estadios tardíos de la infección sistémica murina. Con
este objetivo, se construyó una cepa de S. typhimurium con el
efector de interés marcado con el epitope FLAG (SopB::3xFLAG)
mediante la técnica de epitope tagging. Dicha cepa se incubó bajo
condiciones de cultivo que imitan el ambiente intestinal (condiciones SPI-1) y bajo condiciones que imitan el ambiente intracelular
(condiciones SPI-2). Los pellets y los sobrenadantes de los cultivos bacterianos se utilizaron para analizar la expresión y secreción de SopB, respectivamente mediante western blot utilizando
anticuerpos anti FLAG. Como era de esperar la expresión de SopB
se observó bajo condiciones SPI-1. Este efector también se sintetizó bajo condiciones intracelulares. Sin embargo, la secreción sólo
tuvo lugar bajo condiciones que imitan el ambiente intestinal. Para
los experimentos in vivo, monocapas de células HEp-2 y ratones
BALB/c fueron inoculados con la cepa SopB-FLAG con una m.o.i
de 10:1 mediante un ensayo de protección a genta-micina e
intraperitonealmente con una dosis de 1E +07 UFC /ratón, respectivamente. Las células infectadas y los ganglios linfáticos
mesentéricos (GLM) murinos fueron procesados a las 24 hs post
infección de manera de obtener una fracción insoluble (proteínas
expresadas en las bacterias infectantes) y una fracción soluble (proteínas translocadas al citosol). El análisis de las proteínas
bacterianas mediante western blot reveló que SopB se expresa en
bacterias que se encontraban infectando las células HEp-2 y el GLM
a las 24 hs post infección. Interesantemente, se observó la
translocación tardía de SopB al citosol de dichas células. En resumen, nuestros hallazgos indican que la expresión y translocación
de SopB in vivo no se encuentra limitada a los primeros estadios
de la infección tal como se ha descripto previamente.
O41 - 27733 Giardia intestinalis INDUCES ALTERATIONS ON
STRUCTURAL AND FUNCTIONAL COMPONENTS, IN A
CULTURED HUMAN ENTEROCYTE-LIKE CACO-2/TC7 CELLS
MODEL. HUMEN, MARTIN(1,2,3); LIEVIN LE MOAL,
VANESSA(1,2); SERVIN, ALAIN(1,2); PEREZ, PABLO(3,4)
(1) INSERM. UMR-S756, París, France, (2) Université Paris-Sud
11, Faculté de Pharmacie. París, France, (3) Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. CIDCA-CCT
La Plata, CONICET, Argentina, 4) Cátedra de Microbiología. Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata.
Argentina.
Giardia intestinalis is the etiological agent of giardiasis, one of
the most frequent intestinal diseases in both developing and de-
veloped countries, leading to severe and protracted diarrhea. The
mechanisms used by G. intestinalis to induce structural and functional alterations in host epithelia still remain unknown. In the
present work, we sought to gain insight in the specific and directed
alterations on structural and functional components induced by the
parasite in host epithelia, and the activation of relevant signaling
pathways. In order to evaluate the cellular damage of infected
enterocytes, we assessed different markers related to cellular architecture (F-actin cytoskeleton and intermediate filaments,
cytokeratin 18), distribution of brush border enzymes (sucraseisomaltase (SI), dipeptidylpeptidase IV (DPP IV) and the fructose
transporter GLUT 5), as well as distribution of intercellular
junctional proteins and adhesion molecules (occludin, claudin-1
and E-cadherin). Transferrin receptor and focal adhesion kinases
(FAK) were also analyzed. Immunofluorescence labeling of fixed
post-confluent Caco-2/TC7 cells was conducted and samples were
examined by confocal microscopy. In addition, we assessed, by a
pharmacological approach, phosphorilation processes and cell
signaling pathways activated upon infection. Cells incubated in the
presence or absence of different inhibitors of signaling pathways,
were lysated and analysed by SDS-PAGE. Detection of occludin,
mitogen-activated protein kinases (ERK1/2, p38 and JNK) and Srckinases was carried out by western blot. Parasite-epithelia interaction promoted the disorganization of the apical F-actin cytoskeleton, and leads to an uneaven distribution of the brush borderassociated sucrase-isomaltase and fructose transporter, GLUT5.
Nevertheless, DDPIV and the transferrin receptor did not modify
their distribution in the surface of the enterocyte. Furthermore, the
epithelial barrier was altered as the result of dramatic
rearrangements in the pattern of tight junction-associated proteins,
occludin and claudin-1. In addition, Giardia infection promoted the
phosphorylation of occludin in Caco-2/TC7 cells. Cytokeratin 18,
FAK and E-cadherins were not modified. G. intestinalis induced a
strong activation of the mitogen-activated protein kinase Erk1/2 in
a PI3-kinase dependent manner, and a moderate activation of JNK
and p38. No activation of Src kinase was observed. Our findings
are relevant to understand the mechanisms associated with Giardia induced intestinal disorders. Noteworthy a generalized cellular damage did not occurred and only specific signalling cascades
are activated. These results disclose novel aspects of the
pathogenesis of Giardia infection that could contribute to improve
our understanding of this parasite in the context of preventive and
therapeutic strategies.
O42 - 28048 CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE AISLAMIENTOS CLÍNICOS ARGENTINOS DE Bordetella pertussis MEDIANTE ESTRATEGIAS INMUNO-PROTEÓMICAS EN COMPARACIÓN CON CEPAS VACUNALES EN USO. HOZBOR, DANIELA
(1); GAILLARD, MARA EMILIA (1); BOTTERO, DANIELA (1); FRITZ,
MARIANA (1); CASTUMA, CELINA (1); GRAIEB, AUGUSTO (1);
FINGERMANN, MATIAS (1).
(1) Instituto de Biotecnologia y Biologia Molecular (IBBM), Facultad de Ciencias Exactas – UNLP
Antecedentes: La tos convulsa o pertussis es una enfermedad
respiratoria agudacausada por Bordetella pertussis. Esta enfermedad inmunoprevenible ha sido fuertemente controlada a partir de
la implementación de planes de inmunización masiva en los años
´50. Sin embargo, en los últimos 20 años se ha detectado un resurgimiento sostenido de la misma aún en poblaciones altamente inmunizadas. Hoy pertussis constituye la 5ta causa de muerte
infantil causada por una enfermedad inmunoprevenible. Para explicar esta resurgencia se han propuesto diferentes causas, entre otras: mejoras en la vigilancia y metodología diagnóstica, pérdida de la inmunidad inducida por las vacunas y disminución de
la eficacia de la vacuna debido a una variación antigénica del
agente causal. Respecto de esta última, se ha demostrado en
distintos países la circulación de bacterias que divergen a nivel
genómico de las cepas vacunales en uso. El conocimiento del
impacto funcional de dicha divergencia, sin embargo es escaso.
Objetivos: Evaluar la relevancia funcional de la divergencia
antigénica a través del análisis de expresión diferencial de proteínas mediante el empleo de estrategias del tipo proteómica com-
17
parativa e inmunoblots. Materiales y métodos: Para la evaluación
de la expresión diferencial de proteínas entre la cepa vacunal
Tohama y un aislamiento circulante representativo de la población bacteriana circulante, se empleó la técnica de electroforesis
2D acoplada a Espectrometría de Masa del tipo Maldi Tof. En base
a los datos obtenidos de la aplicación de esta metodología se
realizaron inmunoblots empleando antisueros obtenidos de las
proteínas diferenciales identificadas. En particular, se empleó el
antisuero anti una proteína efectora del sistema de secreción tipo
III (TTSS), Bsp22. Las determinaciones se realizaron sobre proteínas extracelulares, obtenidas de sobrenadantes de cultivos líquidos de 16 aislamientos clínicos de nuestra colección obtenidos durante el período 1969-2008. Se realizaron ensayos comparativos con las cepas vacunales. Resultados: En los estudios
protéomicos comparativos se detectó la expresión diferencial de
13 proteínas en el aislamiento clínico, ausentes en la cepa vacunal
Tohama I. Entre ellas se detectó una proteína estructural del
TTSS. Mediante ensayos de inmunoblot empleando antisuero
específico se detectó la expresión de una proteína efectora del
TTSS, la proteína Bsp22, sólo en los aislamientos clínicos estando ausente en cepas vacunales y de referencia. Conclusiones: En
este trabajo demostramos la expresión funcional del TTSS en aislamientos clínicos de nuestro país y no en las cepas vacunales.
Dicha expresión parecería ser una característica inherente de los
aislamientos clínicos y podría responder al hecho de que no han
sufrido la adaptación a las condiciones de cultivo prolongado en
el laboratorio. El TTSS permite la liberación de proteínas efectoras
de origen bacteriano dentro de células eucariotas. En patógenos
en particular, dichas proteínas constituyen factores de virulencia
capaces de alterar distintas funciones de las células del huésped.
O43 - 28064 MOTILITY, VIRULENCE AND BIOFILM FORMATION
BY THE HUMAN PATHOGEN Acinetobacter baumannii ARE
AFFECTED BY BLUE LIGHT. MUSSI, ALEJANDRA; GADDY,
JEN(2); CABRUJA, MATIAS(1); VIALE, ALEJANDRO(1); RASIA,
RODOLFO(1); ACTIS, LUIS(2)
(1) Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario- CONICET,
Rosario, Argentina. (2) Miami University, Oxford, USA.
Introduction: Light is a ubiquitous environmental signal that
many organisms sense and respond to by modulating their
physiological responses accordingly. While this is an expected
response among phototrophic microorganisms, the ability of
chemotrophes to sense and respond to light has become a
puzzling and novel issue in bacterial physiology, particularly among
bacterial pathogens. In bacteria, response to light has been
ascribed to the production of photoreceptors, with those harboring
the blue-light sensing using flavin (BLUF), the light, oxygen or
voltage (LOV) or the photoactive yellow protein (PYP) domains
being the most prevalent. Objectives: The unexpected finding
made in our laboratory that A. baumannii strain ATCC 17978
motility is regulated by blue light at 24 °C prompted us to further
characterize the microorganism response to this signal.
Specifically, since motility affects biofilm formation in other bacteria, we decided to study whether blue light also affects biofilm
formation on abiotic surfaces. Moreover, we tested the effect of
blue light on the ability of A. baumannii to interact with eukaryotic
cells using the Candida albicans model. Finally, we evaluated
whether the BLUF domain-containing product of A1S_2225 gene
is involved in photoresponse both by genetics and biophysical
means. Materials and Methods: Motility was evaluated in swimming
plates containing 0.3% agarose, which were inoculated on the
surface with bacteria lifted from LB agar overnight cultures using
sterile sticks, and incubated in the dark or blue light. For biofilm
assays, one milliliter of LB broth was inoculated in glass tubes with
0.01 ml of an overnight shaking culture, and incubated for four
days stagnantly at 24 °C either in darkness or blue light. A
A1S_2225 mutant was generated by insertion of a kanamycin
resistance cassette. Besides, a His6-tagged derivative of the
product of this gene was overexpressed in E. coli, purified and
used to obtain spectra in the dark or light. Results: Motility and
formation of biofilms and pellicles were observed only when
bacterial cells were incubated in darkness, while inhibited under
18
blue light. In contrast, the killing of Candida albicans filaments was
enhanced when co-cultured with bacteria under light. These
bacterial responses depend on the expression of the A. baumannii
ATCC 17978 A1S_2225 gene, which codes for an 18.6-kDa
protein that contains an N-terminal BLUF domain and lacks any
detectable output regulatory signals. Spectral analyses of purified
recombinant protein showed its ability to sense light by a red shift
upon illumination. Therefore, the A1S_2225 gene, which is
conserved among several members of the Acinetobacter genus,
was named blue-light sensing A (blsA). Interestingly, we show that
temperature plays a role in the ability of A. baumannii to sense
and respond to light via the BlsA photoreceptor protein.
Conclusions: This work shows the unexpected ability of the
opportunistic pathogen A. baumannii to sense and respond to blue
light by differentially expressing cellular functions that could play
a role in its virulence properties.
O44 - 28094 EL FACTOR TRANSCRIPCIONAL, ESPECÍFICO DE
LA CÉLULA-MADRE, SPO0A VINCULA LA BIOGÉNESIS DE
MEMBRANA CON LA ASIMETRÍA EN LA EXPRESIÓN GÉNICA
DURANTE LA DIFERENCIACIÓN CELULAR EN Bacillus subtilis.
RAMIREZ, WALTER(1); PEDRIDO, MARIA EUGENIA(1);
LOMBARDIA, ESTEBAN(1); GRAU, ROBERTO(1)
(1) Facultad de Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de
Rosario. Laboratorio de Microbiología Básica y Aplicada.
CONICET-Rosario
La formación de esporas en la bacteria gram-positiva B. subtilis
constituye un modelo para el estudio de la diferenciación celular
en bacterias. Diferentes señales ligadas a la escasez de nutrientes
impactan sobre la actividad de un sistema de dos componentes
expandido, el Phosphorelay, que lleva a la activación, por fosforilación, del regulador de respuesta Spo0A. Una vez formado
Spo0A-Pi la célula encaminada hacia la formación de la espora (el
esporangio) se divide asimétricamente generando dos células de
diferente tamaño y destino celular separadas entre sí por un septum
polar formado por dos membranas (interna y externa). La célula
pequeña (forespora) dará lugar a la espora madura, mientras que
la célula más grande (célula madre) estará encargada del proceso
de maduración y resistencia de la primera. La expresión génica
compartamentalizada es establecida primero en la forespora a través de la activación del factor sigma alternativo de la ARN
polimerasa Sigma F por medio de la fosfatasa SpoIIE ubicada en
el septum asimétrico. La razón por la cual SpoIIE no es capaz de
activar a Sigma F del lado de la célula madre representa un misterio. En este trabajo, mediante ensayos in vitro e in vivo de síntesis
de lípidos a partir de cultivos proficientes y deficientes en la síntesis de Spo0A marcados con acetato-C14, reportamos que Spo0APi re-activa durante la fase estacionaria la síntesis de ácidos grasos,
glicolípidos y fosfolípidos necesarios para la formación de las membranas (interna y externa) de la espora. Spo0A-Pi reactivó, a nivel
transcripcional, la expresión del operón que codifica el componente carboxilasa de la enzima acetil-CoA carboxilasa. Esta enzima
cataliza el paso limitante de la síntesis de novo de ácidos grasos:
la formación de malonil-CoA. La función reguladora del malonil-CoA
como inductor negativo de FapR, el represor global de la síntesis
de lípidos en bacterias gram-positivas, ubica a Spo0A-Pi como el
regulador maestro de la síntesis de lípidos, vinculando los niveles
de malonil-CoA con la actividad de FapR, durante la esporulación.
La síntesis máxima de lípidos durante la esporulación coincidió con
los estadios del desarrollo (T2 a T4) en que se produce la distribución asimétrica de SpoIIE. La exclusión transciente de todos los
genes involucrados en la síntesis de lípidos de la forespora inmediatamente después de la formación del septum asimétrico junto a
la compartamentalización de Spo0A en la célula madre, sugiere que
la síntesis de lípidos durante la esporulación se produce exclusivamente en el compartimiento de la célula madre y que la misma
podría tener un rol regulador. Avalando esta hipótesis descubrimos,
por medio de fusiones reporteras fluorescentes, que la ubicación
de SpoIIE en el septum de esporulación y su actividad fosfatasa
compartamentalizada depende de una síntesis activa y
compartamentalizada de lípidos.
O45 - 28095 ROL DEL FACTOR SIGMA ALTERNATIVO DE LA
ARN POLIMERASA SIGMA B EN LA FORMACIÓN DE BIOFILMS
EN Bacillus subtilis. COSTAS, JUAN PABLO(1); PEDRIDO, MARIA EUGENIA(1); GOÑI, ANIBAL(1); COULLERY, ROMINA(1);
STEIL, LEIF(2); VOLKER, UWE(2); GRAU, ROBERTO(1)
CONICET-Rosario. (2) Greifswald University, School of Medicine,
Germany
El desarrollo de biofilms representa un modo de vida ampliamente utilizado por los microorganismos y la forma más frecuente de crecimiento de los mismos en la naturaleza. Bacillus subtilis,
modelo de estudio de diferenciación celular y adaptación al estrés
en bacterias gram-positivas, es capaz de formar esporas y
biofilms. Para responder a las diversas fluctuaciones del medio,
B. subtilis induce la expresión del factor alternativo de la ARN
polimerasa Sigma B, el cual dirige la expresión de unos 200
genes. La pérdida de Sigma B conduce a un incremento en la
sensibilidad de la bacteria ya que Sigma B le confiere a la misma
una protección general, defensiva y/o preventiva frente a múltiples tipos de estrés. En este trabajo nos formulamos el interrogante sobre ¿qué rol tendría Sigma B en el desarrollo del biofilm
en B. subtilis? Mediante la utilización de fusiones reporteras
transcripcionales lacZ dependientes de Sigma B y el empleo de
fusiones transcripcionales PsigB-gfp y microscopia de fluorescencia, pudo determinarse que sigB es expresado durante la formación del biofilm. La expresión del mismo fue transciente y tuvo
lugar en etapas avanzadas del desarrollo del biofilm. La ausencia de actividad de Sigma B condujo a una notable disminución
en la viabilidad de la población celular del biofilm, lo cual señala
un nuevo e importante rol de esta proteína reguladora para el
mantenimiento de la homeostasis dentro del biofilm maduro. Cepas mutantes en sigB fueron capaces de formar biofilms con dimensiones mayores a las que presentan los biofilms desarrollados por las cepas silvestres, lo cual sugiere que Sigma B está
participando en la regulación negativa del crecimiento y desarrollo del biofilm. Mediante mediciones de actividad ß-galactosidasa
de fusiones reporteras transcripcionales a diferentes promotores
de genes de interés, por su participación en el comportamiento
multicelular de B. subtilis, descubrimos que en cepas deficientes
en Sigma B, la expresión de sinR, que codifica para el regulador
maestro (negativo) del desarrollo del biofilm, se encuentra notablemente disminuida. Debido al rol opuesto (positivo) que SinR
ejerce sobre la motilidad de B. subtilis decimos extender nuestro
estudio y analizar qué ocurre con este fenómeno en cepas sigB.
Ensayos de movilidad sobre placas con agar 0,7% permitieron
descubrir que Sigma B contribuye a regular, positivamente, los
fenómenos de movilidad tipo swarming y sliding en B. subtilis. Es
posible proponer un modelo sobre el desarrollo de biofilms en B.
subtilis, que podría ser extendido a patógenos gram-positivos que
expresan ortólogos a Sigma B, donde Sigma B cumpliría un rol
clave en la elección del momento más adecuado entre dos estilos de vida diferentes para la bacteria: (i) quedarse en el lugar y
formar estructuras comunitarias estables como los biofilms (regulados negativamente por Sigma B) ó (ii) inducir el swarming y/o
sliding para avanzar y colonizar otros hábitats a través de inducción de la movilidad celular (regulada positivamente por Sigma B).
O46 - 28155 MULTILOCUS SEQUENCE TYPING (MLST) PARA
LA TIPIFICACIÓN MOLECULAR DE Anaplasma marginale.
GUILLEMI, ELIANA (1); PRINCIPI, DARIO (1); DELFINO, SANTIAGO (1); WILKOWSKY, SILVINA (1); FARBER, MARISA (1);
RUYBAL, PAULA (1).
(1) Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA).
Para el estudio epidemiológico de Anaplasma marginale (bacteria intraeritrocítica del orden de los Rickettsiales) es necesario
contar con un sistema de tipificación altamente reproducible y
discriminativo. Solo dos marcadores moleculares han sido descriptos y aplicados en este tipo de análisis (filogeográfico MSP4
y de genotipo MSP1). El objetivo de este trabajo fue desarrollar
un esquema MLST para lograr obtener una descripción más precisa de la diversidad genotípica de este patógeno en bovinos infectados. Los genes seleccionados para este esquema fueron:
dnaA, ftsz, groEL, lipA, recA, secY y sucB. Estos genes están distribuidos en el genoma, son de copia única y son selectivamente
neutros de acuerdo a la relación dN/dS menor a uno. Se verificó
la especificidad para A. marginale de todos los iniciadores utilizando ADN heterólogo. La variabilidad fue estudiada a través del
análisis de SNPs (single nucleotide polymorphisms) de estos 7
fragmentos génicos concatenados y se estableció un haplotipo o
“sequence type” (ST) a la combinación única de alelos para estos 7 genes. Se analizaron los 5 secuencias genómicas disponibles (Saint Marie, Mississippi, Puerto Rico, Florida y Virginia), 2
aislamientos de E.E.U.U. (Oklahoma y South Idaho), 5 aislamientos argentinos de referencia (Mercedes, Virasoro, Salta, Rosali y
Quitilipi) y 26 aislamientos de campo del norte argentino. Dichos
aislamientos provienen de bovinos crónicamente infectados
distribuídos en la región enzoótica para la enfermedad. En un total
de 38 aislamientos estudiados se obtuvieron 35 STs diferentes lo
que indica que si bien los genes seleccionados son conservados,
la variabilidad a nivel de SNPs es muy alta. El análisis de los
dendogramas para cada gen por Neighbour-Joining y Máxima
Parsimonia mostró que no existe concordancia en la topología de
los árboles entre sí. Esto sugirió la existencia de eventos de
recombinación intragénica, lo que fue posteriormente confirmado
para los genes ftsz, recA y sucB utilizando el test de Máximo Chi
Cuadrado con un p menor o igual a 0.05. A partir de esta comprobación, se aplicó un estudio de asociación de STs utilizando
el software eBurst V3. Como resultado de este análisis se obtuvieron tres grupos, dos de los cuales se constituyeron con un ST
fundador. Uno de estos dos grupos está conformado por STs de
aislamientos norteamericanos y el otro por STs de aislamientos
argentinos. Estos grupos no incluyeron 7 de los 35 STs obtenidos pudiendo deberse a la dispersión geográfica de los aislamientos. Se estableció un esquema de tipificación por secuenciación
multilocus para A. marginale de alto poder discriminatorio. Por
medio de esta técnica se pudieron establecer dos grupos pertenecientes a dos regiones geográficas distantes. Por otra parte, los
resultados obtenidos concuerdan con el análisis genómico de las
5 cepas secuenciadas en donde se observó que A.marginale posee un core genómico altamente conservado y una alta tasa de
variabilidad a nivel de SNPs. Esto último respalda el uso del esquema MLST para el estudio de la dinámica poblacional de
A.marginale.
O47 – 27117- INFECCIONES POR Streptococcus dysgalactiae
subespecie equisimilis EN PACIENTES ADULTOS EN UN HOSPITAL UNIVERSITARIO: ANALISIS DE 10 AÑOS. ROMERO, V;
MONTERISI, A; AVILES, N; MOLLO, V; CARILLO, N; ROSSO, G;
OCAÑA, V; GASPAROTTO, A; ROCCHI, M
Hospital de Clínicas. Córdoba
Streptococcus dysgalactiae subespecie equisimilis (SDSE)
pertenece al grupo de los estreptococos piogénicos humanos,
referidos comúnmente como estreptococos ß-hemolíticos grupo C
y G. Últimamente, la patogenicidad de SDSE está siendo reconocida ya que causa un espectro de enfermedades que varía de
infecciones superficiales de piel a formas invasivas severas asemejándose a las infecciones causadas por S. pyogenes. El objetivo de este estudio retrospectivo es proveer información
epidemiológica de las infecciones en adultos causadas por SDSE
y estudiar la sensibilidad a los antibacterianos. Entre enero 2000
y diciembre de 2009 se estudiaron 55 aislamientos consecutivos
(uno por paciente) de diferentes muestras clínicas, de 52 pacientes ambulatorios (A) (95%) y 3 hospitalizados (H) (5%), provenientes de 23 mujeres y 32 varones, con edades comprendidas entre
20 y 84 años (media 50). La identificación bioquímica se realizó
19
según R.Facklam (CMR 2002; 15:613-630) en base a: hemólisis
en agar sangre ovina al 5%, sensibilidad a bacitracina, test de
PYR, Voges-Proskawer, ß-glucuronidasa, acidez de manitol y
sorbitol. Se ensayó la sensibilidad a penicilina (PEN), eritromicina,
clindamicina y vancomicina por método de difusión (CLSI). Las
muestras clínicas correspondieron a: sangre 17 (31%), piel y partes blandas (PPB) 15 (27,3%), pie diabético 6 (11%), exudado de
fauces 5 (9,1%), hueso 2 (3,6%), líquido sinovial 2 (3,6%), líquido abdominal 2 (3,6%), absceso de córnea 2 (3,6%), orina 2
(3,6%), otras 2 (3,6%). La infección fue monomicrobiana (MM) en
34 pacientes (62%) y polimicrobiana (PM) en 21(38%). Las comorbilidades asociadas fueron: diabetes (14%), infección por VIH
(7%), neoplasia (9%), otros (25%), ninguna (10%) y desconocido
(35%). De los 17 episodios de bacteriemias (BAC), 16 fueron MM
y 1PM presentaron diagnóstico presuntivo de: sindrome febril 11,
sepsis 3, celulitis 6; sindrome febril+celulitis y/o lesiones de piel
3; sepsis+celulitis 1; mordedura de perro+celulitis1; 14/17episodios correspondieron a pacientes A que ingresaron al servicio de
emergencia. Los tres pacientes H presentaban compromiso severo (neutropenia, carcinoma de próstata y mama, respectivamente). Todos los aislamientos de SDSE fueron sensibles a PEN y
un 5,4% (3/55) presentó resistencia a macrólidos (fenotipo MLSb).
En nuestro medio y en pacientes adultos la mayoría de las infecciones por SDSE: * prevalecen en pacientes A y son MM, pero
en un porcentaje importante son PM; * afectaron de forma similar
en ambos sexos en un amplio rango de edades; * la BAC es la
presentación clínica más frecuente, afecta a pacientes con todo
tipo de co-morbilidades y en especial a los que padecen una enfermedad subyacente severa; * las infecciones de PPB ocupan el
segundo lugar en prevalencia, seguidas por las de pie diabético
y faríngeas. Todas las cepas son uniformemente sensibles a PEN
y la resistencia a macrólidos es baja. Es necesario que se realice
una correcta identificación a nivel de especie de todos los
estreptococos ß-hemolíticos para tener un mejor conocimiento de
los cambios epidemiológicos y patogénicos de las infecciones por
SDSE.
O48 - 27210 - CITODIAGNÓSTICO DE TZANCK, UN ANTIGUO
MÉTODO DIAGNÓSTICO FRENTE A NUEVOS DESAFÍOS.
BIANCHI, MARIO HORACIO; SANTISO, GABRIELA M; LEHMANN,
ERICA; WALKER, LAURA; ARECHAVALA, ALICIA; MAIOLO, ELENA; NEGRONI, RICARDO
Hospital Muñiz. Buenos Aires
Introducción: en 1947 Tzanck publicó un trabajo científico donde se emplea la técnica como método diagnóstico diferencial en
lesiones ampollares. En la actualidad es útil, además, para el diagnóstico en pacientes inmunocomprometidos donde los patrones
de respuesta son aberrantes y desbordan los cánones de la medicina tradicional. Permite el diagnóstico diferencial de enfermedades infecciosas y/o inmunológicas con manifestaciones cutáneas, tales como herpes y las ocasionadas por Molluscum contagiosum, leishmaniosis, histoplasmosis, paracoccidioidomicosis,
malasseziosis, candidiasis, criptococosis, pénfigo, dermatitis de
Duhring, estafilococias, estreptococias, sospecha de sífilis (presencia de células plasmáticas), tuberculosis, etc. También se pueden diagnosticar asociaciones mórbidas como herpes + histoplasmosis, herpes + pénfigo, etc. Objetivo: presentar los resultados
obtenidos utilizando el citodiagnóstico de Tzanck durante un período de 4 años (2006-2009). Materiales y métodos: previo a una
limpieza de la zona con alcohol al 70%, el material se extrae con
bisturí descartable y se extiende sobre 2 o más portaobjetos. En
el caso de vesículas, ampollas o pústulas se realiza una incisión
de la lesión y toma de muestra de la base; si se trata de lesiones
erosivas se remueve la costra y se toma material de la base. Se
colorea con Giemsa, Gram y/o Ziehl-Neelsen. Se observa al microscopio con aumentos de 100, 400 y 1000 X. Resultados: se
realizaron 1304 escarificaciones de las siguientes localizaciones:
piel 930 (71,3%), cavidad oral 185 (14,1%), genital 128 (9,8%) y
perianal 62 (4,8%). Los resultados obtenidos de 1304 citodiagnósticos de Tzanck se presentan en la tabla
20
Resultado
Nº (%)
Resultado
Nº (%)
Malassezia spp.
Histoplasma spp.
Candida spp.
Paracoccidioides spp.
Cryptococcus spp.
Hifas de Eumycete
59 (4,5)
56 (4,2)
18 (1,4)
17 (1,3)
5 (0,4)
3 (0,2)
Sincicios virales
Molluscum contagiosum
Células acantolíticas
Amastigotes de Leishmania spp.
Asociaciones mórbidas
Negativo
170 (12,9)
86 (6,6)
82 (6,3)
17 (1,3)
9 (0,7)
782 (60,0)
Conclusiones: está técnica permitió orientar el diagnóstico en el
40% de los casos, 32,5% correspondieron a infecciones, en tanto que las enfermedades ampollares autoinmunes se evidenciaron en el 6,3% de los casos. La técnica de Tzanck es una herramienta útil como complemento del diagnóstico clínico presuntivo. Es rápida, de fácil implementación y económica y en muchas
ocasiones puede ser el primer hallazgo diagnóstico. Supera en
la relación costo/beneficio a otras técnicas más complejas y
novedosas. Permite minimizar la toxicidad y el costo de la
politerapia antimicrobiana. El requisito más importante es contar
con personal capacitado para realizar la toma y la observación
de las muestras.
O49 – 27316 - ENFERMEDAD CAUSADA POR MICOBACTERIAS
NO TUBERCULOSAS EN LA REGIÓN NORTE DEL GRAN BUENOS AIRES. IMPERIALE, BELEN(1); DI GIULIO, BEATRIZ(2);
ZUMARRAGA, MARTIN(3); MORCILLO, NORA(1)
(1) Hospital Cetrángolo, (2) Hospital Cordero, (3) INTA
Introducción: las micobacterias no tuberculosas (MNT) han
emergido en las últimas décadas como patógenos frecuentemente
asociados a la co-infección por el VIH. El aislamiento y la identificación de especies encontradas en muestras clínicas así como
la relación entre el aislamiento y la enfermedad es muy importante
en sitios donde la prevalencia de enfermedad causada por MNT
es desconocida. Objetivo: describir la carga y la importancia clínica de MNT en pacientes de la región norte del gran Buenos
Aires (BAN), los perfiles de droga-resistencia en relación con los
esquemas terapéuticos aplicados y el grado de éxito de los mismos. Materiales y métodos: aislamientos clínicos de 2205 casos
ocurridos durante el período de estudio 2004-2009. Los aislamientos fueron identificados mediante pruebas bioquímicas y
moleculares (PRA: PCR- RFLP). La sensibilidad bacteriana se
determinó por medio de los métodos colorimétrico y de proporciones en Middlebrook 7H11. Resultados: en total 2118 (96.0%)
casos fueron causados por Mycobacterium tuberculosis y 87
(4.0%) por MNT, 42,0% mujeres, 44,3% co-infectados con el VIH.
La identificación se completó en 74 (85.1%) de los aislamientos
de MNT. Doce pacientes (13,8%) presentaron más de un episodio de micobacteriosis. Las especies predominantemente encontradas fueron: M. avium (35.1%), M. intracelullare (16.2%), M.
gordonae y M. kansasii (5.4%); M. fortuitum (4.1%); M. simiae, M.
sherrissi y M. flavescens (2.7%); M. chelonae, M. vaccae, M.
xenopi, M. nonchromogenicum I, M. scrofulaceum, M. lentiflavum
y M. kumemamotonense fueron encontrados en un caso cada uno.
Seis (8.1%) de los aislamientos mostraron patrón indefinido de
PRA y de 3 no se obtuvieron resultados interpretables. Infecciones
mixtas por micobacterias fueron encontradas en 4 casos; en 3 pacientes diferentes episodios con distintas especies fueron confirmadas. Las pruebas de sensibilidad a drogas mostraron aproximadamente 80.0% de los aislamientos sensibles a macró-lidos, 70,0%
a aminoglucósidos y fluoroquinolonas y 60,0% a rifabutina. La evaluación del tratamiento fue realizada en 62 casos (71.3%): 64.5%
curaron o finalizaron la terapia, 19.4% murieron, 6.5% permanecen todavía bajo tratamiento, 8.0% recayeron y 1.6% de los casos
se perdieron. Estos resultados mostraron que la detección de MNT
como agentes etiológicos es clínicamente importante aun en sitios
con alta incidencia de tuberculosis. Esta enfermedad afecta a pacientes con o sin co-infeccion con VIH y la terapia apropiada pudo
disminuir la muerte y recaída.
O50 – 27410 - LA RESISTENCIA A LAS EQUINOCANDINAS
REDUCE LA VIRULENCIA DE Candida albicans. GAMARRA,
SOLEDAD (1); PERLIN, DAVID S (2); GARCIA EFFRON,
GUILLERMO (1, 3)
(1) Laboratorio de Micología y Diagnóstico Molecular, Facultad
Bioquímica y Ciencias Biológicas, Universidad Nacional del Litoral (2) Public Health Research Institute, University of Medicine and
Dentistry of New Jersey, Newark, USA. (3) CONICET.
Introducción: las equinocandinas (caspofungina, micafungina
y anidulafungina) inhiben la biosíntesis de la pared celular a través de la inhibición no competitiva del complejo 1,3-ß-D glucansintasa (CGS). En C. albicans, la resistencia clínica a estas drogas ha sido asociada a mutaciones en las regiones denominadas
hot spots del gen FKS1, que codifica la fracción catalítica (Fks1p)
del CGS que es la diana de las equinocandinas. La incidencia de
la resistencia a estas drogas aumenta año a año. Objetivos: conocer la capacidad de diseminación de C. albicans resistentes a
equinocandinas en la comunidad mediante el estudio del impacto de las mutaciones en FKS1 en la actividad de la CGS y en la
virulencia. Materiales y métodos: se utilizaron 2 pares isogénicos
de C. albicans identificados por Multilocus Sequencing Typing
(MST). Cada par estaba formado por una cepa sensible (S) y otra
resistente (R) a las equinocandinas con distintas sustituciones de
aminoácidos en Fks1p (S645F y S645P). La evaluación de la
sensibilidad a las equinocandinas se realizó por triplicado siguiendo el protocolo del CLSI M27-A3. La actividad enzimática y las
propiedades cinéticas de los CGS purificados fueron determinadas por un ensayo de polimerización de glucanos y usando gráficos de Lineweaver-Burk, respectivamente. Para determinar si las
mutaciones en FKS1 alteran la virulencia de C. albicans, se utilizó un modelo murino de candidiasis diseminada subletal. Se utilizaron inóculos simples (106 UFC/ratón de las cepas S o R) e
inóculos mixtos (5x105 UFC de la cepa S + 5x105 UFC de la cepa
R/ratón). La carga fúngica total se evaluó a los 4 días post-infección por recuento de UFC/gr riñón. Por último, se utilizó PCR en
tiempo real multiplex con molecular beacons para evaluar cuanti
y cualitativamente las infecciones únicas y mixtas. La extracción
de ADN a partir de cultivos y de riñones infectados por C. albicans
se realizó por el método de fenol cloroformo isoamílico. Los
primers para amplificar y secuenciar los FKS1 y los molecular
beacons utilizados para cuantificar diferencialmente la capacidad
de infección de cada una de las cepas se diseñaron a partir de la
secuencia de GenBank n° XM_716336. Resultados: las cepas R
presentaron CIMs 16 a 64 veces mayores que las cepas S para
todas las equinocandinas. Los CGS aislados de las cepas R mostraron una menor velocidad de catálisis (< Vmax) y necesitaron
al menos 700 veces más droga para ser inhibidas. Las cepas R
presentaron una capacidad de infección in vivo levemente menor
que las S cuando se inocularon individualmente (P = 0.04). En
cambio, cuando se utilizó el modelo de infección mixto, la cepa S
prevaleció claramente sobre la R (P < 0.0001). Estos resultados
demuestran que las mutaciones en FKS1 confieren resistencia
cruzada a las equinocandinas pero que concomitantemente reducen la actividad del CGS. Ésto trae aparejado un costo sobre la
vitalidad y virulencia de las cepas R que podría limitar el impacto
clínico y epidemiológico de estas cepas.
O51 – 27543 - RELACIÓN GENÉTICA DE AISLAMIENTOS DE
Shigella sonnei ASOCIADOS A TRES BROTES COMUNITARIOS
EN RÍO NEGRO. BRENGI, SP(1); VIÑAS, MR(1); NOBILE, M(2);
BLAZQUEZ, N(3); DE BUNDER, S(3); ML, ALVAREZ(4);
ARELLANO, O(5); CAFFER, MI(1); BINSZTEIN, N(1); PICHEL, M(1)
(1) INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, (2) Red de Laboratorios
de Río Negro, (3) Hospital R. Carrillo. Bariloche, (4) Hospital A.
Zatti. Viedma, (5) Ministerio de Salud. Río Negro
Shigella spp. es uno de los principales patógenos bacterianos
asociados a diarrea en Argentina. Se transmite de persona a persona, por ingesta de alimentos o aguas contaminadas o por
vectores, especialmente en condiciones de hacinamiento y falta
de higiene. En el marco de la Red de Laboratorios de Diarreas y
Patógenos Bacterianos de Transmisión Alimentaria, el Laboratorio Nacional de Referencia recibe aislamientos para su caracterización y subtipificación. En 2006 se estableció una Base de Datos Nacional de perfiles genéticos obtenidos por electroforesis en
campo pulsado (PFGE) de aislamientos de S. sonnei de casos
esporádicos y brotes. El objetivo de este trabajo es describir tres
brotes causados por S. sonnei en diferentes localidades de la
provincia de Río Negro en 2008 y las relaciones genéticas entre
los aislamientos de los eventos. La relación genética se determinó por PFGE con las enzimas xbaI y blnI según el protocolo de
PulseNet Internacional. Los perfiles genéticos se analizaron con
el programa BioNumerics (Applied Maths) aplicando el coeficiente de Dice y UPGMA. Se realizaron investigaciones epidemiológicas para cada brote. Brote 1: se estudiaron 4 aislamientos de
S. sonnei recuperados en Maquinchao entre febrero y marzo,
período en que se registró un aumento en los casos de diarrea
de 5 por semana a un máximo de 68. Brote 2: se estudiaron 18
aislamientos recuperados entre marzo y abril en Viedma, donde
se registró un aumento en los casos de diarrea desde la semana
epidemiológica 1. Brote 3: se estudiaron 5 aislamientos recuperados en Los Menucos, donde el número de casos de diarrea
entre marzo y abril se cuadruplicó con respecto a 2007. Los resultados de PFGE permitieron identificar un mismo patrón de XbaIPFGE en 3 de 4 aislamientos de Maquinchao; otro en 11 de 18
aislamientos de Viedma y otro entre los 5 aislamientos de Los
Menucos. Los restantes aislamientos de cada lugar estuvieron
muy relacionados al patrón predominante correspondiente, sugiriendo que también eran parte del brote. A su vez, se encontraron subtipos genéticos compartidos entre las localidades. Estos
resultados se confirmaron por BlnI-PFGE Los resultados de PFGE
señalan que los aislamientos de cada uno de los brotes podrían
derivar de una fuente común de infección. La cercanía temporal
y la presencia de subtipos genéticos iguales o muy relacionados
en las tres ciudades sugieren la posible existencia de fuentes de
infección comunes y/o vías de diseminación del patógeno entre
las localidades. Sin embargo, no se pudieron confirmar, ya que
no se recuperaron aislamientos de posibles alimentos involucrados, incluyendo muestras de agua del Río Negro y agua de
red, que fueron señaladas como posibles fuentes en los estudios
epidemiológicos. Es necesario fortalecer la vigilancia de Shigella
spp. en el país a través del desarrollo de métodos más sensibles
para su detección en agua y alimentos y mediante la investigación oportuna e integrada desde las áreas de laboratorio, clínica
y epidemiología.
O52 – 27549 - COMPLEJO Burkholderia cepacia: FITNESS Y
HEMODIÁLISIS. DE PAULIS, AN (1); FERNANDEZ, DA (1);
SANTOIANNI, JE (1); GUTIERREZ, MA (1); CASTAÑEDA, NC (2);
CENTRON, D (2); PREDARI, SC (1)
(1) Instituto de Investigaciones Médicas A. Lanari-UBA; (2) Facultad de Medicina-UBA.
Introduccion: las genoespecies del complejo Burkholderia
cepacia (CBC) son patógenos oportunistas con capacidad para
sobrevivir en el medio ambiente. Objetivo: ante la recuperación
de genoespecies del CBC en el agua de red, en el agua postósmosis, en el baño de diálisis y en los hemocultivos de algunos
pacientes en hemodiálisis se decidió realizar el estudio del fitness
de 3 aislamientos del CBC. Dos provenientes de pacientes con
bacteriemia intradiálisis: 1 genoespecie B. cepacia RAPD I [A]; 1
genoespecie B. cepacia RAPD II [B] y una genoespecie B. lata
RAPD III [C] aislada del agua post-ósmosis. Se evaluó y comparó el comportamiento de las mismas. Materiales y métodos: para
determinar el fitness se utilizaron los siguientes modelos in vitro:
1. Crecimiento planctónico, 2. Formación de biofilm, 3. Supervivencia a la desecación, 4. Supervivencia en agua post-ósmosis y
5. Supervivencia en el baño de diálisis (Pope y col, 2010). Al
modelo de desecación se adicionó el posterior cultivo en caldo
para evidenciar la bactericidia del proceso. Resultados.1- Crecimiento planctónico: los valores de las constantes de velocidad de
crecimiento (K) y tiempo de generación (G) fueron para [A] = 0,46
y 0,65; [B] = 0,41 y 0,73 y [C] = 0,60 y 0,50 (p > 0,9999, KruskalWallis). 2- Los 3 aislamientos fueron productores de biofilm (p >
0,9999, Kruskal-Wallis). 3- Desecación: se partió de un inóculo
promedio = 2,4 x 1010 UFC/ml. A las 24 h la genoespecie [C] no
resistió el proceso (0 UFC/ml), mientras que las genoespecies [A]
y [B] dejaron de ser viables a las 48 h (p= 0,8693, Kruskal-Wallis).
Sin embargo, la bactericidia se logró recién a los 12 días. 4 y 5-
21
Supervivencia en agua post-ósmosis (AP) y en baño de diálisis
(BD) (conteo de colonias en UFC/ml): genoespecie [A] tiempo 0=
3,85 x 108. A los 21 días en el AP= 4,2 x 108 y en el BD= 1,3 x
107. Genoespecie [B] tiempo 0= 4,3 x 107. A los 21 días en el AP=
8,5 x 107 y en el BD= 1,8 x 10 6. Genoespecie [C] tiempo 0= 3,7 x
108. A los 21 días en AP= 1,2 x 10 9 y en BD= 5 x 10 8. Se observaron diferencias muy significativas en la supervivencia tanto en
el BD (p< 0,0007) como en el AP (p <0,005, Kruskal-Wallis). Se
observó un efecto inhibitorio de las sales en el BD (disminución
de 1 log del inóculo inicial) entre las 4, 8 y 24 h con respecto al
AP. Conclusiones. 1- Se destaca la extraordinaria habilidad de
supervivencia de las 3 genoespecies tanto en condiciones óptimas como en los medios hostiles. 2- La sumatoria de la capacidad de formar biofilm, resistir la desecación sin alcanzar
bactericidia hasta los 12 días y mantener el potencial replicativo
tanto en el agua post-ósmosis como en el baño de diálisis hasta
por lo menos 21 días, permite comprender la permanencia de
estos microorganismos en los distintos componentes de la red de
hemodiálisis. 3- Estos resultados demuestran la necesidad de
mantener un riguroso control de la calidad del agua de todo el
sistema, para minimizar los posibles reservorios de estos u otros
microorganismos.
O53 – 27882 - ESTUDIO MULTICÉNTRICO DE CRIPTOCOCOSIS
EN ARGENTINA – ESTADO DE AVANCE DEL PRIMER AÑO.
BOSCO BORGEAT, ME (1); TAVERNA, CG (1); MURISENGO, O
(1); MAZZA, M (1); CANTEROS, CE (1); DAVEL, G (1); GECA (2)
(1) Departamento Micología, INEI-ANLIS “Dr.C.G.Malbrán”, (2)
Grupo de Estudio de Criptococosis en Argentina
En una encuesta realizada en la Red Nacional de Laboratorios de Micología de Argentina en el año 2004 se observó que la
criptococosis ocupaba el segundo lugar entre las micosis profundas diagnosticadas. Con el objetivo de conocer la frecuencia y
distribución de las especies del complejo Cryptococcus neoformans asociadas a infecciones humanas en Argentina, comenzó
en abril de 2009 un estudio prospectivo de 2 años de duración.
En el presente trabajo se comunican los resultados obtenidos
hasta mayo de 2010. Adhirieron al estudio 102 laboratorios distribuidos en todo el país quienes realizaron los aislamientos, recolectaron los datos clínicos y los derivaron al Laboratorio Nacional de Referencia (Departamento Micología, INEI). Los datos fueron volcados a una base de datos ad hoc para su posterior análisis. Se recolectaron 268 aislamientos provenientes de 190 pacientes. La provincia que registró mayor cantidad de aislamientos fue Buenos Aires (104) seguido de CABA (51), Córdoba (26),
Jujuy (17), Santa Fe (15), Chaco (12), Tucumán (8), Corrientes
(4), Formosa (3), La Pampa (2), La Rioja (2), Catamarca (1) y
Mendoza (1). Diez laboratorios no registraron aislamientos. Los
pacientes fueron en su mayoría VIH positivo (78,4%), en menor
proporción tuvieron enfermedades autoinmunes (5,3%) y otras
enfermedades debilitantes del sistema inmune (13,1%). Sólo 3,2%
no tuvieron enfermedad de base aparente. La edad de los pacientes osciló entre 11 y 86 años (mediana 38). El 65% fue de género masculino. En el laboratorio de referencia los aislamientos fueron fenotipificados y genotipificados mediante PCR-RFLP del gen
URA5 y se determinó el tipo sexual por PCR. De los 268 aislamientos, 264 fueron C.neoformans y 4 C.gattii. Estos últimos se
recuperaron de LCR; 3 de una mujer de 41 años VIH positiva y 1
de un varón de 42 años sin enfermedad de base aparente. Se
genotipificaron 153 aislamientos: el 90,9% fue C.neoformans var.
grubii, 83,7% genotipo VNI (n=128) y 7,2% VNII (n=11). Un aislamiento fue C.neoformans var. neoformans VNIV. Nueve aislamientos (5,8%) fueron híbridos VNIII: 8 de ellos híbridos VNII-VNIV y
el restante VNI-VNII-VNIV. Entre los aislamientos de C.gattii 3
fueron VGI (de un mismo paciente) y uno VGII. De los 155 aislamientos en los que se determinó el tipo sexual 99,3% fue Alfa
(n=154) y uno a/Alfa que correspondió al híbrido VNI-VNII-VNIV.
La distribución de genotipos y tipos sexuales coincide con la
descripta a nivel mundial. Es la primera vez que se encuentra en
Argentina una cepa híbrida VNI-VNII-VNIV, tipo sexual a/Alfa. Esta
podría ser un triploide, sin embargo, otros estudios son necesarios para confirmarlo. La presencia de C.gattii genotipo VGII, den-
22
tro del cual se han descripto cepas hipervirulentas, reafirma la
importancia de vigilar los genotipos circulantes en nuestro país
de manera de poder anticiparnos a la aparición de posibles brotes epidémicos. Estos resultados preliminares nos permiten tener
un panorama de la epidemiología de la criptococosis y de la distribución de especies y genotipos del complejo C.neoformans en
Argentina.
O54 – 28135 - EMERGENCIA DE BACILOS GRAM-POSITIVOS
QUE OCASIONAN INFECCIONES URINARIAS CON UROCULTIVO FALSAMENTE NEGATIVO. CITTADINI, ROXANA (1);
BARBERIS, CLAUDIA (2); MAZZEI, JUAN (1); ALMUZARA,
MARISA (2); RAMIREZ, MARIA SOLEDAD (3); FEINSILBERG,
ALEJANDRO (1); VAY, CARLOS (1,2)
(1) Sanatorio Mater Dei. CABA, (2) Instituto de Fisiopatología y
Bioquímica Clínica. Facultad de Farmacia y Bioquímica. UBA. (3)
Departamento de Microbiología, Inmunología y Parasitología.
Facultad de Medicina. U.B.A.
La litiasis renal o vesical, los procesos neoplásicos (tumor renal, cáncer de vejiga), las anomalías del tracto urinario (obstrucción ureteral o pélvica, estenosis uretral, divertículos uretrales) y
el tratamiento antibiótico previo, entre otras, son causas de piuria
abacteriana; no obstante, la infección urinaria (IU) debida a
microorganismos fastidiosos de muy lento desarrollo, puede simular un cultivo negativo. Se describen 3 casos de IU por bacilos
gram-positivos (BGP) exigentes: dos de los 3 pacientes gerontes
eran de sexo masculino. Los 3 presentaron como antecedente,
IU a repetición y dos o más síntomas tales como disuria, polaquiuria, dificultad en el comienzo de la micción y/o incontinencia.
Los sedimentos de la segunda porción de la micción de dos pacientes y de la orina tomada por cateterismo intermitente en otro,
presentaron marcada leucopiocituria (> 5 leucocitos/campo 40X).
En primera instancia, los cultivos en los medios de CLDE y CPS
resultaron negativos. La coloración de Gram en los 3 casos mostró la presencia de BGP (> 5/cpo 1000x). Las muestras fueron
sembradas en agar sangre y agar chocolate con atmósfera de 5%
de CO2 y en agar sangre en atmósfera anaerobia. Al 5° día desarrollaron en aerobiosis colonias puntiformes mientras que en
anaerobiosis, las mismas presentaban mayor tamaño. Los
microorganismos fueron identificados fenotípica y genotípicamente
como Bifidobacterium/Alloscardovia en 2 de los casos y Actinobaculum schaalii en el otro. Sendos aislamientos fueron sensibles
a penicilina. El tratamiento con amoxicilina fue favorable en los
tres pacientes y los urocultivos de control resultaron negativos. Se
destaca la necesidad de realizar la coloración de Gram sin excepción en orinas con sedimento patológico y cultivo negativo y
la siembra en medios y atmósferas especiales con incubación
prolongada para detectar la presencia de patógenos urinarios
emergentes. Dado el lento desarrollo y las características fenotípicas similares a las de los géneros Lactobacillus/Gardnerella/
Actinomyces es común que estos agente se interpreten como
microbiota genital habitual sin atribuirle su verdadero significado
clínico.
MICROBIOLOGÍA AGRICOLA Y AMBIENTAL
O55 - 27383 UTILIZACIÓN DE HONGOS PARA LA BIODEGRADACIÓN DE HAPs Y FRACCIONES PESADAS REMANENTES
EN SUELOS DESPUÉS DE LA BIORREMEDIACIÓN. MEDAURA,
MARIA CECILIA(1); GUIVERNAU, MIRIAM(2); PRENAFETA
BOLDU, FRANCESC (2); MORENO VENTAS, XABIER(3); ERCOLI,
EDUARDO(1); VIÑAS CANALS, MARC(2)
(1) Universidad Nacional de Cuyo, Mendoza (2) GIRO, (3) Universidad de Cantabria, España
La presencia de compuestos de estructura compleja y concentraciones extremas, así como la diversidad en las condiciones
climáticas y heterogeneidad de características texturales en suelos contaminados con petróleo, hace que muchos de los procesos de biorremediación actuales se vean limitados en su aplica-
ción. Compuestos recalcitrantes como hidrocarburos aromáticos
policíclicos de alto peso molecular (HAPs con más de tres anillos
bencénicos), alcanos pesados (fracción alifática saturada, rango
C30-C40) y fracción saturada no resuelta, suelen permanecer
después de la biorremediación en concentraciones superiores a
los valores límites exigidos por diferentes regulaciones. La utilización de hongos productores de enzimas ligninolíticos constituye una alternativa complementaria para la biorremediación de
suelos con este tipo de contaminantes. En este estudio se presentan resultados de ensayos de bioestimulación y bioaumentación fúngica para evaluar el potencial de la degradación por
hongos sobre un suelo contaminado con una matriz compleja de
hidrocarburos del petróleo, rica en fracciones saturadas pesadas
y HMW-PAHs, previamente biorremediado. Se aislaron e identificaron 19 cepas fúngicas, la mayoría de ellas pertenecientes a la
división Ascomycota, que se emplearon como inóculo fúngico para
bioaumentación. Cepas de Fusarium oxysporium y Alternaria
alternata presentaron actividad polifenoloxidasa (lacasa), capaz
de oxidar compuestos aromáticos sin necesidad de cofactores. Se
realizó una caracterización química (GC-MS y GC-FID),
microbiológica (perfilado de genes ribosomales mediante DGGE)
y ecotoxicológica (Microtox) en diversos ensayos de biorremediación. Usando bioaumentación fúngica se logró una degradación de hidrocarburos totales del petróleo del 39,90% y de HAPs
86,03% a 28,27% en los compuestos de 3 a 6 anillos respectivamente, causando una disminución de la toxicidad de los lixiviados
del suelo (Microtox) y un cambio en las poblaciones eubacteriana
y fúngica, determinada por DGGE. Las diferencias con respecto
a los ensayos de bioestimulación demuestran las potenciales ventajas que ofrece la utilización de hongos para la biorremediación
de suelos con HMW-HAPs.
O56 - 27392 MICROBIODETERIORO DEL PATRIMONIO DOCUMENTAL DE ARCHIVOS DE ARGENTINA Y CUBA. GUIAMET,
PATRICIA(1, 2, 6); LAVIN, PAOLA(1, 3, 6); BORREGO, SOFIA(4);
PERDOMO, IVET(4); GOMEZ DE SARAVIA, SANDRA(1, 5, 6)
(1) INIFTA, Dto. de Química, Facultad de Ciencias Exactas, UNLP,
CCT La Plata-CONICET, (2) Facultad de Ciencias Veterinarias,
CONICET, (3) Facultad de Ciencias Exactas, CONICET (4) Laboratorio de Conservación Preventiva, Archivo Nacional de la
República de Cuba, (5) Facultad de Ciencias Naturales y Museo,
CICBA, (6) Universidad Nacional de La Plata
Introducción: El patrimonio documental está expuesto a factores extrínsecos e intrínsecos, los que pueden causar alteraciones físicas, químicas y/o biológicas, las cuales inciden en su estado de conservación. Entre los daños de carácter biológico, el
microbiodeterioro puede definirse como cambios indeseables en
las características de un material, provocados por la actividad de
microorganismos (bacterias y hongos), los cuales son capaces de
adherir a diferentes sustratos formando biofilms. Estos afectan al
acervo documental, constituido por materiales higroscópicos, como
el caso del papel. En condiciones ambientales óptimas, la microbiota del aire puede coexistir con las colecciones de valor histórico y artístico sin causar grandes daños. Sin embargo, a medida
que se producen cambios en las condiciones ambientales, los
microorganismos pueden ejercer efectos negativos, tanto desde
el punto de vista del microbiodeterioro como de la patogenicidad.
Objetivo: El objetivo de este trabajo fue evaluar el microbiodeterioro del material documental y la calidad del aire en cuatro archivos: i) Archivo Histórico del Museo de La Plata, ii) Archivo del
Colegio de Escribanos de la Provincia de Buenos Aires, iii) Archivo de Geodesia, Ministerio de Obras Públicas, ubicados en La
Plata, Argentina y iv) Archivo Nacional de la República de Cuba
(ARNAC), ubicado en La Habana, Cuba. Metodología: Las muestras del aire fueron obtenidas por la técnica de sedimentación en
agar y mediante hisopado en los documentos. Los recuentos
microbianos, los aislamientos de los microorganismos y su posterior tipificación se realizaron sembrando en medios de cultivo
apropiados. La formación de biofilms fue ensayada sobre el
sustrato (papel) inoculándolo con Bacillus sp., Scopulariopsis sp.,
entre otros, a diferentes tiempos de contacto. Las muestras se
analizaron mediante MET (microscopía electrónica de transmisión)
y MEB (microscopía electrónica de barrido). Resultados: En los
archivos i) ii) y iii), los géneros más comúnmente aislados fueron
Aspergillus y Penicillium. En el ARNAC estos géneros predominaron en los meses secos y Cladosporium prevaleció en los meses más lluviosos. Sobre los documentos el género predominante fue Bacillus sp. Staphylococcus sp. fue detectado en dos de
los cuatro archivos investigados. Ensayos de laboratorio permitieron comprobar a través de MEB y MET la formación de biofilms
y los daños estructurales producidos sobre el papel por los
microorganismos aislados de los archivos. Algunos de los géneros fúngicos aislados, Aspergillus, Alternaria, Fusarium y
Penicillium pueden actuar como alergenos que afectan la salud
de las personas que trabajan en archivos.
O57 - 27420 DESARROLLO DE CULTIVOS HETEROTRÓFICOS
DE MICROALGAS EN ALTA DENSIDAD PARA LA PRODUCCIÓN
DE ACEITE UNICELULAR. SUEN, ELISA(1); MARQUEZ,
VANINA(1); SELUY, EDUARDO(2); BECCARIA, ALEJANDRO(1)
(1) Laboratorio de Fermentaciones, Facultad de Bioquímica y
Ciencias Biológicas, UNL, Santa Fe, Argentina, (2) LESSEL SH,
Gálvez, Santa Fe, Argentina
Introducción: El ácido docosahexaenoico (DHA) es un ácido
graso poliinsaturado (PUFA) omega-3, que posee reconocidos
efectos benéficos para la salud humana. Crypthecodinium cohnii,
microalga marina heterotrófica capaz de acumular aceites con alto
contenido de DHA y bajo contenido de otros PUFAs, es un microorganismo adecuado para su obtención, destinada a la industria alimenticia, farmacéutica y nutracéutica. Objetivos: Optimizar
la composición de un medio de cultivo para la obtención de altas
densidades celulares y la acumulación de aceite unicelular.
Implementar el medio optimizado en el desarrollo de cultivos en
biorreactor. Materiales y métodos: Se realizaron cultivos de C.
cohnii ATCC 30772 en placas policubetas. Se tomaron muestras
a diferentes tiempos para la determinación de biomasa -mediante densidad óptica (DO) a 492 nm- y lípidos totales (LT) intracelulares -por espectroscopia de fluorescencia-. Se aplicaron diseños factoriales completos para la evaluación del efecto y selección de los siguientes factores: sales de mar, hidrolizado de caseína, extracto de levadura y fuentes de carbono (glucosa, glicerol, acetato de sodio y etanol). Para la optimización de la composición del medio se empleó un diseño central compuesto. Además, se realizaron cultivos en un biorreactor tanque agitado (1 L),
operado en modo batch, empleando un medio descripto en la bibliografía (control) y el medio optimizado. Resultados: Para los
rangos de concentraciones estudiados, la glucosa (G) fue la fuente
de carbono que permitió alcanzar mayores DO respecto a las otras
fuentes ensayadas. Este nutriente y el extracto de levadura (YE)
fueron los factores que presentaron efectos significativos (p<0,05)
sobre la DO y la velocidad de crecimiento. Mediante la aplicación
del diseño central compuesto se obtuvieron los modelos que describen los efectos de estos ingredientes para un nivel de confianza del 95%: DO = 2,98 + 0,35 * YE – 0,36 * YE²; LT (µURF/cél) =
0,0005427 + 0,000005433 * G - 0,0001823 * G². Finalmente, aplicando la función deseabilidad se establecieron las concentraciones óptimas de G, YE y sales de mar. En el cultivo realizado en
el medio optimizado se verificaron los valores de DO y LT predichos por el modelo. Además, en este medio, se intensificaron los
rendimientos de biomasa y contenido celular de lípidos respecto
del control, en 6,5 y 1,6 veces, respectivamente; según los resultados obtenidos en el biorreactor. La velocidad específica de crecimiento fue similar: 0,024 y 0,027 1/h, en el medio control y
optimizado, respectivamente. La glucosa resultó ser la fuente de
carbono más adecuada para la obtención de altas densidades
celulares en cultivos de C. cohnii. Tanto esta fuente de carbono
como el extracto de levadura tuvieron una incidencia significativa
sobre el rendimiento de los cultivos. Se pudieron establecer las
concentraciones óptimas de estos componentes con las que se
maximizaron la producción de biomasa y lípidos. Las predicciones de los modelos fueron validadas experimentalmente en los
cultivos. Los resultados obtenidos pudieron reproducirse en cultivos en biorreactor.
23
O58 - 27842 ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA DEL BACTERIOPLANCTON EN AGUAS DEL MAR ARGENTINO MEDIANTE EL
MÉTODO DE PIROSECUENCIACIÓN 454 TAG. PERESSUTTI,
SR(1); HOZBOR, MC(1); COSTAGLIOLA, MC(1); ARTIGAS, F(2)
(1) Instituto Nacional de Investigación y Desarrollo Pesquero
(INIDEP), Mar del Plata, Argentina, (2) Université Lille Nord de
France, Université du Littoral Côte d’Opale, Wimereux, France.
Las técnicas metagenómicas, basadas en el análisis de fragmentos de ADN de microorganismos ambientales, representan
herramientas poderosas para analizar la estructura de los ecosistemas microbianos. Dentro de ellas, la pirosecuenciación
ribosomal tag (tecnología 454, Roche), basada en la secuenciación y análisis de cientos de pequeños fragmentos del 16S
rRNA, brinda información detallada de la diversidad microbiana,
detectando y cuantificando tanto los miembros más abundantes
de la comunidad como aquellos minoritarios, escasamente recuperados por cultivos tradicionales o clonación y secuenciación. El
presente estudio muestra los primeros resultados sobre diversidad y abundancia relativa bacteriana, por pirosecuenciación, en
una estación marina permanente de estudios ambientales
(38°28´S-57°41´W) y en otra del estuario del Río de la Plata
(36°10,9´S-55°23,9´W). En ambos sitios los recuentos bacterianos
determinados por DAPI (4’6- diamino-2fenil-indol) fueron del orden de 106. Dentro del dominio Bacteria se encontraron más de
4.600 secuencias únicas a partir de 36.188 amplicones de tags,
generando 280 filotipos. Además, en el dominio Archaea se detectaron cerca de 2.700 secuencias únicas a partir de más de
47.700 tags, definiendo sólo 5 filotipos diferentes. Las curvas de
rarefacción no alcanzaron totalmente la fase plateau, demostrando la gran complejidad en la diversidad bacteriana. Sin embargo,
el elevado número de secuencias únicas indicó una adecuada
cobertura de muestreo. En arqueas, las curvas se vuelven
asintóticas revelando la eficiencia del muestreo. El índice de similitud de Jaccard fue de 0,6 en bacterias y de 0,2 en arqueas,
indicando mayor diferencia entre las bacterias en ambos sitios.
Los análisis taxonómicos revelaron que la diversidad en el estuario
fue superior que en el ambiente marino. Los filotipos más dominantes en el sitio marino fueron Bacteroidetes, Flavobacteriaceae,
Proteobacteria-Gammaproteobacteria, Proteobacteria Rhodobacteriaceae y Proteobacteria Rickettsiales SAR11; mientras que en
el estuario predominaron Pseudoalteromonadaceae Pseudoalteromonas, Proteobacteria Gammaproteobacteria, Proteobacteria
Shewanella, Proteobacteria Rickettsiales SAR11. Los 2 filotipos
de arqueas encontrados en mayor proporción fueron Archaea
Euryarchaeota y Archaea Crenarchaeota. Las secuencias tag más
numerosas representaron taxones caracterizados previamente,
aunque también se hallaron filotipos de baja abundancia que forman parte de la biosfera “rara”, aún no explorada. Estos microorganismos pueden tener un rol clave, constituyendo un “banco de
reserva” con el potencial de volverse dominantes en respuesta a
cambios ambientales. Este trabajo ha sido importante para determinar la eficiencia del muestreo y la identificación exhaustiva de
comunidades microbianas en estos ambientes acuáticos. Asimismo, brinda una base para futuros estudios dirigidos a detectar
variaciones en la estructura de las comunidades en respuesta a
cambios ambientales locales y globales.
O59 - 27941 ANÁLISIS DE PIROSECUENCIACIÓN PARA CARACTERIZAR LAS POBLACIONES BACTERIANAS EN SUELOS
SOMETIDOS A DIFERENTES CONDICIONES DE MANEJO BAJO
RÉGIMEN DE SIEMBRA DIRECTA. FIGUEROLA, E L M(1); GUERRERO, L D(1); WALL, L G(2); ERIJMAN, L(1)
(1) INGEBI-CONICET, (2) Universidad Nacional de Quilmes - R.
Saénz
El presente estudio se realizó en el marco del proyecto
interdisciplinario BIOSPAS (www.biospas.org), cuyo objetivo general
es identificar indicadores biológicos de calidad de suelo. Los
microorganismos del suelo participan en funciones de vital importancia para la sustentabilidad de los agroecosistemas, tales como
24
la descomposición y mineralización de materia orgánica, el ciclado
de nutrientes y la modificación de la estructura edáfica. Los métodos de secuenciación masiva de fragmentos variables del ADNr 16S
permiten el estudio de la diversidad microbiana con una cobertura
que supera en tres órdenes de magnitud la de los métodos
moleculares tradicionales. El muestreo se llevó a cabo en junio de
2009. Se seleccionaron 4 localidades a lo largo de una línea oeste-este en la zona agrícola más productiva de la Argentina:
Bengolea (Córdoba), Monte Buey (Córdoba), Pergamino (Bs As) y
Viale (Entre Ríos). En cada localidad se tomaron muestras por triplicado de la fracción entre 0-10 cm de profundidad para los 3 tratamientos: 1- Ambiente Natural (AN): ambiente natural con mínima actividad antrópica, Ej.: reserva natural, montes, parques. 2Malas Práctias Agrícolas en Siembra Directa (MP): campos manejados con mínima rotación o monocultivo y deficiente nutrición. 3Buenas Prácticas Agrícolas (BP): Manejo permanente en sistema
de siembra directa con rotación intensiva, fertilización de reposición,
manejo integral de plagas, malezas y enfermedades, incluyendo
conceptos básicos de Agricultura Certificada. Sobre ADN extraído
se amplificaron las regiones variables V1+V2+V3 del ADNr 16S del
dominio Bacteria. Cada uno de los triplicados fue procesado independientemente y mezclados antes del análisis. Las muestras correspondientes a cada sitio y tratamiento fueron etiquetadas por
medio de un fragmento adicional de 12 bases presente ambos
cebadores (27F-538R), con el objeto de secuenciarlas simultáneamente en formato multiplex (GS-FLX Platinum, Macrogen). La
pirosecuenciación generó un total de 398832 secuencias de más
de 100 b (promedio 390 b). El análisis bioinformático se realizó con
los pipelines del Ribosomal Database Project y PANGEA. En todas las muestras los Phyla dominantes resultaron ser
Proteobacteria y Actinobacteria, con abundancias entre 25 y 58%
y 15 y 50% respectivamente. Dentro de estos, las clases predominantes fueron Actinobacteria (13-35%) y Alfaproteobacteria (1138%). A este nivel no se detectaron diferencias significativas (<alpha
0,005) entre tratamientos o entre sitios. Las abundancias obtenidas para Phylum y Clase fueron confirmadas utilizando primers
específicos por PCR cuantitativo. A nivel Familia, el análisis de
correspondencia canónica (CCA) indica un agrupamiento de las
muestras por sitio. Sin embargo, en algunos casos, la presencia y/
o abundancia de ciertos grupos bacterianos a distintos grados de
resolución taxonómica resultan características del régimen de manejo del suelo. Estos resultados, confirmados por PCR cuantitativo utilizando cebadores específicos, indica la presencia de potenciales indicadores bacterianos de calidad de suelo.
O60 - 28028 EFECTO DE LOS EXUDADOS RADICULARES DE
PLANTAS DE MAÍZ EN LA REMOCIÓN DE LINDANO POR LA
CEPA DE ACTINOMYCETES NATIVA Streptomyces sp. M7.
ALVAREZ, A(1,2); BENIMELI, C(1,4); SESTO CABRAL, ME(3);
AMOROSO, MJ(1,3,4)
(1) PROIMI-CONICET. Av. Belgrano y Pje. Caseros. San Miguel
de Tucumán, (2) Facultad de Ciencias Naturales e IML, UNT, (3)
Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia, UNT, (4) Universidad del Norte Santo Tomás de Aquino.
El lindano, uno de los insecticidas más utilizado en el mundo, es un compuesto muy tóxico y persistente que ocasiona graves problemas de contaminación de agua y suelo. Dicho
plaguicida fue detectado en la provincia de Tucumán, en concentraciones superiores a las permitidas. El empleo de
actinomycetes y exudados radiculares de plantas para que lleven a cabo procesos de biorremediación y fitorremediación, son
una buena alternativa para la descontaminación de estos ambientes. En tal sentido, Streptomyces sp. M7 posee capacidad
para crecer en lindano y removerlo del medio de cultivo. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de exudados
radiculares de plantas de maíz, sobre el crecimiento y capacidad de remoción de lindano por Streptomyces sp. M7. Los
exudados radiculares fueron obtenidos desde plantas cultivadas
en solución de Hoagland y agua estéril (Luo et al. 2006) y posteriormente liofilizados. Las determinaciones de carbono orgánico y azúcares totales en las muestras de exudados, fueron
realizadas según la metodología descripta por Mingorance et al.
(2007) y Dubois et al. (1956), respectivamente. Streptomyces sp.
M7 fue cultivada en medio mínimo (MM) (1 g/L), suplementado
con lindano (1,66 mg/L), exudados radiculares y/o glucosa (0,8
g/L). Previamente a la inoculación, los exudados liofilizados fueron resuspendidos en agua bidestilada y esterilizados por filtración. El crecimiento microbiano fue evaluado como peso seco.
La determinación de lindano residual en los cultivos se realizó
mediante cromatografía gaseosa. Resultados. Los exudados de
plantas de maíz presentaron una composición de 40,0 mg de
carbono orgánico y 41,6 mg de hidratos de carbono, por g de
exudado liofilizado, indicando que la mayor parte del carbono
orgánico provenía de azúcares. El crecimiento de Streptomyces
sp. M7 en MM suplementado con diferentes fuentes de carbono
y los porcentajes de plaguicida removido detectados en cada
condición, se observan en la Tabla.
Fuente de carbono
Lindano y exudados
Lindano
Lindano y glucosa
Exudados
Glucosa
Peso seco (mg/L ± DS)
18,4 ± 9,0
5,3 ± 4,8
31,5 ± 7,7
10,8 ± 7,8
41,7 ± 7,1
Lindano removido (% ± DS)
30,7 ± 0,7
18,5 ± 1,7
10,4 ± 1,2
Se puede concluir que Streptomyces sp. M7 fue capaz de remover mayores concentraciones de plaguicida del medio de cultivo, cuando éste fue suplementado con exudados radiculares de
plantas de maíz. Aunque el crecimiento microbiano alcanzó su
valor máximo en glucosa, el porcentaje de lindano removido fue
bajo en esta condición. El empleo de exudados radiculares abre
un nuevo camino en el uso de los actinomycetes en procesos de
biorremediación.
XII Congreso Argentino de Microbiología 2010 - Posters
25
POSTERS
LUNES 18/10/2010
GERBINO, ESTEBAN(1); SOSA, NATALIA(2); SCHEBOR, CAROLINA(2); ILLANES, ANDRES(3); ANDREA, GOMEZ ZAVAGLIA(1)
(1) CIDCA – UNLP, (2) DPTO INDUSTRIAS- UBA, (3) PUCV CHILE
P1 - 27129 EVALUACIÓN DEL EFECTO PROTECTOR DE UN
EXTRACTO ACUOSO DE SOJA FERMENTADO FRENTE AL
DAÑO OXIDATIVO. MARAZZA, JA (1); NAZARENO, MA (2); GIORI,
GS DE(1,3); GARRO, MS(1)
(1) Centro de Referencia para Lactobacilos (CERELA-CONICET)
(2) Instituto de Ciencias Químicas, Facultad de Agronomía y
Agroindustrias, Universidad Nacional de Santiago del Estero. (3)
Cátedra de Microbiología Superior. Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia, Universidad Nacional de Tucumán (UNT)
En condiciones de estrés oxidativo, se generan radicales tóxicos que provocan la oxidación del ADN y proteínas causando
daños en los tejidos. Estos cambios predisponen al desarrollo de
diferentes patologías crónicas como la enfermedad de Alzheimer,
entre otras. El control de la formación de estos radicales libres
mediante el uso de antioxidantes es una estrategia utilizada para
prevenir enfermedades asociadas al estrés oxidativo. Numerosos
antecedentes indican que las isoflavonas (IS), compuestos
fenólicos presentes en soja, poseen propiedades antioxidantes y
atribuyen a la forma agliconada como responsable de la actividad biológica. Sin embargo, la concentración de agliconas en soja
es relativamente baja. El uso de bacterias lácticas con actividad
ß-glucosidasa permite incrementar la disponibilidad de las IS al
hidrolizar el enlace ß-1-4 del glucósido liberando agliconas. El
objetivo del trabajo fue determinar las propiedades antioxidantes
de un extracto acuoso de soja (EAS) fermentado con Lactobacillus
(L.) rhamnosus CRL981 y evaluar su potencial efecto protector
frente al daño oxidativo a nivel del ADN. El EAS fue inoculado
con L. rhamnosus CRL981 e incubado a 37°C durante 24h. Se
tomaron muestras a distintos tiempos (0, 3, 6, 9, 12 y 24h) para
evaluar la hidrólisis de las IS en la forma glucosilada, mediante
HPLC y las propiedades antioxidantes. Las actividades
antiradicalaria (AAR%) y antioxidante (AAO%) se determinaron
espectrofotométricamente empleando el radical libre DPPH y el
sistema ß-caroteno-acido linoleico, respectivamente. El poder reductor (PR) se determinó colorimétricamente. El efecto protector
del EAS frente al daño oxidativo inducido se evaluó a nivel del
ADN usando una mezcla oxidante. El EAS, luego de 24h de fermentación, presentó una AAR% y AAO% máxima de 29,5±0,9%
y 71,2±4,0%, respectivamente; por el contrario el PR incrementó
solo 7% respecto al control (EAS sin fermentar). Sin embargo, el
EAS fermentado fue capaz de inhibir (59,2%) la oxidación del
ADN. Los resultados evidencian que, el EAS fermentado con L.
rhamnosus CRL981 presentó actividad antioxidante siendo capaz
de proteger al ADN del daño oxidativo a través del barrido de los
radicales libres presentes en el medio. El consumo del mencionado EAS, enriquecido en las IS agliconadas con propiedades
antioxidantes favorecería la eliminación de radicales tóxicos previniendo el daño tisular y el desarrollo de enfermedades crónicas
asociadas al estrés oxidativo.
P2 - 27140 EFECTO PROTECTOR DE LOS GALACTOOLIGOSACARIDOS EN LA PRESERVACIÓN DE Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus. YMCZYSZYN, ELIZABETH (1);
Las bacterias lácticas y bifidobacterias probióticas son ampliamente utilizadas en preparaciones farmacéuticas y alimentos funcionales debido a sus efectos benéficos sobre la salud. Por otro
lado, los prebióticos se definen como “ingredientes alimenticios
que favorecen el crecimiento y/o actividad de una bacteria específica o de un número de especies bacterianas que tienen efecto
benéfico en la salud”. Entre ellos se destacan la lactulosa, los
fructooligosacáridos, la inulina y los galacto-oligosacaridos (GOS).
El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto protector de los
GOS en la preservación de Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus CIDCA 333, una cepa particularmente sensible a los
procesos de preservación. Cultivos en fase estacionaria de
Lactobacillus bulgaricus fueron desecados sobre silica-gel o
liofilizados en presencia de 3 diferentes GOS comerciales, en un
rango de concentraciones de 0 a 38% m/m. La capacidad protectora de los GOS se evaluó a través del recuento de bacterias viables antes y después del proceso de deshidratación. La capacidad protectora de cada GOS comercial se correlacionó con su
composición en di, tri y tetrasacáridos, determinada por HLPC, y
con las temperaturas de transición vítrea (Tg) de dichos compuestos a distintas humedades relativas. De acuerdo a los resultados
obtenidos, todos los GOS utilizados demostraron ser efectivos
protectores de L. bulgaricus expuestos a deshidratación. La mayor capacidad protectora se correlacionó con el mayor porcentaje de galacto-oligosacaridos en la mezcla, en particular con el
contenido de trisacaridos, respecto de otros componentes como
la lactosa y monosacáridos. En cuanto a las propiedades físicas
de estos sistemas, la información provista por las isotermas de
sorción de agua y las transiciones de fase indican que se puede
conservar el estado vítreo a temperatura ambiente a humedades
relativas por debajo de 33%. Los GOS son ampliamente conocidos por sus propiedades prebióticas, pero su rol como agentes
protectores y sus propiedades termofísicas no han sido aún estudiada. Este nuevo rol de los GOS como protectores es de gran
importancia para el desarrollo de nuevos alimentos funcionales
deshidratados. La suple-mentación de probióticos con GOS serviría para la elaboración de productos simbióticos, donde los GOS
cumplen la doble función de actuar como prebióticos y como sustancias protectoras de los microorganismos probióticos.
P3 - 27145 IDENTIFICACIÓN, CARACTERIZACIÓN Y SELECCIÓN DE CEPAS DE LEUCONOSTOC PARA FUTURAS APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS. GUGLIELMOTTI, DANIELA;
CARDAMONE, LUISINA; MERCANTI, DIEGO; REINHEIMER, JORGE; QUIBERONI, ANDREA.
Instituto de Lactología Industrial – INLAIN, UNL-CONICET
Introducción: Leuconostoc presenta gran importancia en la
industria láctea fermentativa debido a su capacidad de producir
compuestos de aroma, CO2, entre otros. Sin embargo, la producción de CO2 puede conducir a la formación de ojos en quesos de
masa cerrada, derivando en el detrimento de la calidad del producto. En los últimos años, varias industrias queseras de nuestra
zona informaron graves problemas relacionados al desarrollo
26
indeseado de Leuconostoc. Objetivos: Identificar y caracterizar las
cepas de Leuconostoc previamente aisladas, para conocer la diversidad de las cepas responsables de defectos gasógenos en
quesos, y seleccionar cepas con propiedades beneficiosas para
nuevos alimentos funcionales. Metodología y Resultados: 14 cepas de Leuconostoc fueron aisladas de insumos usados en elaboraciones queseras (leche pasteurizada, concentrado de proteínas de suero, suero de quesería, crema de suero) y de quesos
con defectos gasógenos. Las cepas fueron identificadas mediante técnicas tradicionales y genéticas (RAPD, secuenciación ADNr
16S), clasificándolas como Leuconostoc mesenteroides subsp.
mesenteoides (n=6), L. pseudomesenteroides (n=5), L. garlicum/
lactis (n=2) y L. citreum (n=1). Se estudiaron sus propiedades
tecnológicas (acidificación en leche, desarrollo a 8 °C y 45 °C, resistencia a NaCl, acidez y pasteurización). Algunas cepas fueron
capaces de desarrollar y coagular la leche (32 °C - 24 h). En general, revelaron buen desarrollo en presencia NaCl (3% y 4%),
pero disminuido en medios acidificados (pH 3 y 4). Un porcentaje
importante de la población bacteriana fue capaz de sobrevivir luego de ser sometida a 63 °C durante 30 min (pasteurización), demostrando su elevada termorresistencia. Todas las cepas fueron
capaces de desarrollar a 8 °C (temperatura de refrigeración en
cámara). La actividad antibacteriana contra patógenos fue moderada, y se debió principalmente a la producción de ácidos, aunque una de las cepas demostró elevada capacidad inhibitoria frente a Listeria monocytogenes, mediante la producción de un compuesto con las características de bacteriocina. La presencia de
genes de resistencia a antibióticos es una característica indeseable en cepas usadas en la industria alimenticia, ya que los mismos podrían ser transmitidos a otros microorganismos, incluso a
patógenos. Se testeó la susceptibilidad de las cepas de Leuconostoc frente a un grupo de antibióticos de importancia clínica y
veterinaria. Las cepas demostraron ser sensibles frente a gentamicina, eritromicina y ampicilina. - La elevada termorresistencia
de las cepas de Leuconostoc estudiadas, y su capacidad de desarrollar a bajas temperaturas podrían explicar la existencia y
multiplicación indeseada en ciertos tipos de quesos. - Aquellas
cepas con propiedades interesantes a nivel industrial (desarrollo
en leche, inhibición de bacterias patógenas, sensibilidad a
antibióticos), podrían aprovecharse para constituir fermentos mixtos a ser utilizados en nuevos alimentos funcionales.
P4 - 27147 MUTANTES ESPONTÁNEOS FAGO RESISTENTES
DE LACTOBACILLUS PLANTARUM. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE LA FAGORRESISTENCIA. BRIGGILER MARCO, MARIANGELES; REINHEIMER, JORGE; QUIBERONI,
ANDREA
Introducción: Lactobacillus plantarum es una especie
bacteriana capaz de desarrollar en diferentes matrices
alimentarias, y para algunas cepas han sido demostradas propiedades probióticas. Sin embargo, su empleo como starter/
probiótico en la elaboración de alimentos funcionales podría ser
afectado por infecciones fágicas, lo cual podría generar productos de baja calidad además de importantes pérdidas económicas. Entre las estrategias disponibles para disminuir los ataques
fágicos, la obtención de mutantes espontáneos fagorresistentes
se plantea como una excelente alternativa, simple y natural, ya
que no presenta restricciones reglamentarias para su uso en
alimentos. Objetivos: Obtener mutantes espontáneos fagorresistentes a partir de cepas sensibles de Lactobacillus
plantarum, utilizando dos metodologías diferentes. Caracterizar
el fenotipo fagorresistencia de dichos mutantes. Materiales y Métodos: cepas y fagos utilizados: se utilizaron dos cepas de
Lactobacillus plantarum (ATCC 8014 y PLN), dos fagos de colección (ATCC 8014-B1 y ATCC 8014-B2) y un fago aislado de
gránulos de kefir (f3). Aislamiento de mutantes espontáneos
fagorresistentes: fueron ensayadas dos metodologías: aislamiento en medio agarizado y a partir de cultivos secundarios,
utilizando los fagos individualmente o cócteles de ellos. Caracterización del fenotipo fagorresistencia en los mutantes:
estabilidad de la fagorresitencia: repiques sucesivos de las va-
riantes con el agregado de nuevas dosis de fagos. Nivel de
fagorresistencia (EOP - efficiency of plaquing): relación entre el
título fágico logrado sobre el mutante resistente y el correspondiente a la cepa sensible. Nivel de adsorción fágica: determinación de la tasa de fagos adsorbidos luego de 30 min a 37°C sobre las variantes fago resistentes, en comparación con la cepa
sensible. Liberación espontánea de fagos: centrifugación de un
cultivo de los mutantes, y posterior titulación del sobrenadante
(fagos potencialmente liberados) sobre la cepa sensible. Resultados: - La técnica de aislamiento en medio agarizado permitió
mayor recuperación de mutantes. - El comportamiento durante los
ensayos de estabilidad fue variable dependiendo del sistema estudiado. - Los mutantes presentaron resistencia media (<10-4) y
elevada (<10-7) de acuerdo a los valores de EOP obtenidos. - En
general los mutantes fueron resistentes por bloqueo en la etapa
de adsorción. - Se observó liberación espontánea de fagos para
7 mutantes. Este estudio demostró que es posible obtener variantes resistentes a fagos a partir de cepas sensibles de L. plantarum.
P5 - 27179 ADSORCIÓN DE FAGOS TEMPERADOS SOBRE
CEPAS DE LACTOBACILLUS DELBRUECKII Y FAGO RESISTENCIA LIGADA A HETEROGENEIDAD MORFOLÓGICA.
TRUCCO, VERONICA; BINETTI, ANA; REINHEIMER, JORGE;
QUIBERONI, ANDREA; SUAREZ, VIVIANA.
Los fagos temperados perturban el normal proceso de fermentación superando la inmunidad lisogénica de la cepa que lo liberó, atacándola, o encontrando otras cepas sensibles constituyentes del fermento utilizado. Por otra parte, la heterogeneidad morfológica en cultivos puros, particularmente de Lactobacillus delbrueckii, es bien conocida, pero no existen reportes que relacionen esta diversidad morfológica con la fago resistencia en
mutantes con buenas propiedades tecnológicas. Los objetivos de
este trabajo fueron: a- estudiar la etapa de adsorción de dos fagos
temperados (Cb1/204 y Cb1/342) de L. delbrueckii, en función de
distintas variables. b- aislar mutantes con buenas propiedades
tecnológicas y relacionarlos con variantes morfológicas obtenidas
para cada cepa sensible. Caracterización de la Adsorción: a-Influencia del Ca2+: cultivos de las cepas se llevaron hasta una DO
560nm aprox. 0.5 y el pellet se resuspendió en Caldo MRS, con
y sin el agregado de Ca2+ (10mM). Las células se infectaron con
el fago y se incubaron a 37 °C. Se graficaron las cinéticas de
adsorción para cada caso. b-Influencia del pH: los pellets se suspendieron en Caldo MRS-Ca llevado a diferentes valores de pH
(3, 4, 5, 6, 7 y 8). Las tasas de adsorción se midieron a los 30
min. c-Influencia de la temperatura: los pellets se suspendieron
en Caldo MRS-Ca y se incubaron a distintas temperaturas (0, 10,
20 30 y 40 °C). Las tasas de adsorción se midieron a los 30 min.
d-Influencia del estado fisiológico celular: Idem a-, utilizando células viables y no viables, estas últimas obtenidas sometiéndolas
10 min a 100 °C. Se graficaron las cinéticas de adsorción para
cada caso. Mutantes fago resistentes y variantes morfológicas: Se
aislaron variantes morfológicas de ambas cepas sensibles, obteniéndolas de Agar MRS. Se obtuvieron mutantes fago resistentes utilizando el método del cultivo secundario. A los mutantes
estables (resistentes hasta 7 repiques en presencia de alta concentración del fago) se les estudió la actividad acidificante (pH en
LDR 10%, 24h a 37°C) y proteolítica (OPA Test). La influencia del
calcio dependió del fago estudiado ya que Cb1/204 no necesitó
de este ión en esta etapa del ciclo lítico, mientras que Cb1/342
si. Ambos fagos resistieron bien los pHs ácidos (hasta 3), pero
no los alcalinos (pH 8). El proceso de adsorción de ambos fagos
dependió de la temperatura de incubación, y los valores máximos
se observaron entre 30 y 40 °C (85-99%). La viabilidad celular
modificó el nivel de adsorción solamente para el fago Cb1/342
(menor para células no viables). Para cada variante morfológica
obtenida (dos para cada cepa sensible), se obtuvo un 100% de
mutantes fago resistentes verdaderos. Algunos presentaron muy
buenas propiedades tecnológicas y se los pudo correlacionar
siempre con una de las variantes morfológicas encontradas. Se
caracterizó la etapa de adsorción de los primeros fagos
temperados de L. delbrueckii aislados en el país. Se aislaron
mutantes fago resistentes con buenas propiedades tecnológicas
y se relacionaron estos mutantes con las variantes morfológicas
encontradas.
P6 - 27180 ESTUDIOS IN VIVO DE LA SEGURIDAD Y
FUNCIONALIDAD DE UN ADITIVO ALIMENTARIO EN POLVO
OBTENIDO POR FERMENTACIÓN CONTROLADA DE SUERO
DE MANTECA. HAAG, ELIANA; REINHEIMER, JORGE;
BECCARIA, ALEJANDRO; PAEZ, ROXANA; VINDEROLA,
GABRIEL; BINETTI, ANA
Ciertas fracciones libres de células de leches fermentadas
contienen componentes bioactivos capaces de estimular la respuesta inmune intestinal y de prevenir infecciones entéricas. En
trabajos previos determinamos que el suero de manteca, un
subproducto de bajo costo de la industria láctea, es adecuado para
el desarrollo de bacterias lácticas en diferentes condiciones (concentración de sustrato, tiempo de fermentación, agente neutralizante). El objetivo de este trabajo fue desarrollar un aditivo funcional en polvo (secado spray) a partir de la fracción libre de células de suero de manteca fermentado. Se utilizó la cepa L.
delbrueckii subsp. lactis 209 (altamente proteolítica, aislada a
partir de un fermento natural de suero y perteneciente a la colección INLAIN) para fermentar suero de manteca (16% p/v) a pH
6,0 controlado (Ca(OH)2 como control externo de pH) en un
biorreactor de tanque agitado, durante 48 h. A partir del suero de
manteca fermentado se recuperó la fracción libre de células (FLC)
por centrifugación. Una fracción del mismo se acidificó (pH 3,6,
ácido láctico) para estudiar (HPLC fase reversa) la presencia de
fracciones peptídicas en el sobrenadante. Se determinó el contenido de sólidos totales, lactosa residual, Na y Ca. La otra fracción, sin acidificar, se secó en un secadero spray Buchi de laboratorio (T de entrada: 119 °C, T de salida: 64 °C). Ratones BALB/
c recibieron (intubación intragástrica, 3, 6 y 10 días) la FLC (200
µl/día/ratón) o el equivalente del polvo secado spray disuelto en
agua. Al final de cada período de alimentación, los animales fueron anestesiados y sacrificados por dislocación cervical. Se aislaron macrófagos peritoneales para determinar su capacidad
fagocítica. Los hígados se sembraron en agar ABRV (determinación de la seguridad, estudio de translocación). En cortes
histológicos de intestino delgado se determinó el N° de células
productoras de IgA (inmunohistoquímica) como indicador de la
funcionalidad (capacidad de aumentar las defensas innatas). El
aditivo en polvo desarrollado demostró poseer capacidad de aumentar la capacidad fagocítica de macrófagos peritoneales (16 ±
5%, control 9,5 ± 2%) y el número de células productoras de IgA
(279 ± 42, control 195 ± 34 cél. IgA+/10 campos) en intestino
delgado al ser administrado durante 10 días consecutivos. A partir de la fermentación controlada de suero de manteca se obtuvo
un polvo de origen lácteo, con bajo contenido en Na y lactosa y
alto contenido en Ca, enriquecido con péptidos liberados por fermentación controlada y con seguridad oral y funcionalidad demostradas en un modelo animal. El producto desarrollado podría ser
agregado a alimentos que no aptos para ser vehículos de bacterias probióticas (barras de cereal, galletitas, bebidas, etc.) de forma tal de conferirles propiedades benéficas hacia la salud y expandir así el mercado de alimentos funcionales.
P7 - 27198 BACTERIOCIN PRODUCTION BY Pediococcus
acidilactici ST3HA, ISOLATED FROM NORWEGIAN SMOKED
SALMON AND SOME ASPECTS OF ITS MODE OF ACTION
AGAINST Listeria monocytogenes AND Enterococcus faecium.
SVETOSLAV, TODOROV(1); MONICA, WACHSMAN(2);
MANUELA, VAZVELHO (3); BERNADETTE, FRANCO(1)
(1) U.S.Pharmacopeia; (2) Universidad de Buenos Aires (UBA);
(3) ESTG
Introduction: Bacteriocins of lactic acid bacteria (LAB) are
ribosomally synthesized antimicrobial peptides. Studies on their
mode of action indicate that bacteriocins must first be attracted to
27
bacterial surfaces likely via an electrostatic interaction leading to
pores formation and dissipation of the proton motive force,
resulting in an efflux of amino acids, potassium ions and inorganic
phosphate. Objective: The aim of this study was to isolate
bacteriocinogenic LAB from commercial smoked salmon samples
and characterize the bacteriocin produced by one of the strains,
and check for its antibacterial and antiviral properties. Materials
and methods: Bacteriocinogenic strains were isolated using the
triple layer and agar spot tests. Strain ST3Ha produced bacteriocin
and was identified using biomolecular techniques (PCR). The
strain was tested for antimicrobial activity against a variety of LAB,
Listeria spp, human and food pathogens and HSV-1 virus. Some
aspects of the mode of action against Listeria ivanovii subsp.
ivanovii ATCC19119 were also studied. The synergetic effect of
the bacteriocin with sub-lethal doses of ciprofloxacin was
evaluated. The genetic determinants for known bacteriocins in the
genomic DNA of strain ST3Ha were also investigated. Results:
Strain ST3Ha was identified as Pediococcus acidilactici. This strain
produced a pediocin-like bacteriocin with activity against several
LAB, Listeria spp, and some human and food pathogens and
remarkably against HSV-1 virus. Bacteriocin ST3Ha was produced
at high levels in MRS broth at 30 °C and 37oC and had reached,
after 27h, its maximum production (1640000 AU/ml) against
Listeria ivanovii subsp. ivanovii ATCC19119, a surrogate of
pathogenic strain L. monocytogenes. Addition of bacteriocin
ST3Ha to a 3-h-old culture of L. ivanovii subsp. ivanovii
ATCC19119 has severely inhibited growth of this strain for 24 h.
The molecular weight of this bacteriocin was estimated to be 4.5
kDa according to tricine-SDS-PAGE data. Strain ST3Ha harbours
a 1.044 kb DNA fragment fitting in size and DNA homology to
pediocin PA-1/AcH (98 %). The combined application of low levels
(below MIC) of ciprofloxacin and bacteriocin ST3Ha resulted in a
synergistic effect in the inhibition of target strain L. ivanovii subsp.
ivanovii ATCC19119. The antiviral activity of bacteriocin ST3Ha
against HSV-1, presented CE50 (50% effective concentration) of
800 µg/mL and CC50 (50% cytotoxic concentration) of 4030 µg/
mL. Significance: To the best of our knowledge, this is the first
report on P. acidilactici, producer of pediocin-like bacteriocin with
activity against HSV-1.
P8 - 27199 EVALUATION OF THE PROBIOTIC POTENTIAL OF
BACTERIOCINOGENIC Lactobacillus sakei subsp. sakei 2A.
SVETOSLAV, TODOROV; DANIELLE, FURTADO; MATHEUS,
BARBOSA; MARTHA, VILLARREAL; BERNADETTE, FRANCO.
U.S. Pharmacopeia
Introduction: According to the definition of the World Health
Organization, probiotics are live microorganisms which, when administrated in adequate amounts, confer health benefits to the host
such as reduction of gastrointestinal infections and inflammatory
bowel disease, and modulation of the immune system. Production
of bacteriocins is considered an advantage for the probiotics
strains because facilitates their competitiveness in the human
gastrointestinal tract. Bacteriocins are ribosomally synthesized
antibacterial peptides and are usually active against genetically
related species. Objective: This work aimed to evaluating the
probiotic features of the bacteriocin producing L. sakie subsp. sakei
2a strain and determination of some aspects of bacteriocin mode
of action. Effect of selected commercial drugs from different generic groups and antibiotics on growth of L. sakei subsp. sakei 2a
was also determined. Material and methods: Mode of action of
bacteriocin produced by L. sakei subsp. sakei 2a against L.
monocytogenes ScottA was studied. Aggregation and co-aggregation properties of L. sakei subsp. sakei 2a were explored. The
effects of ox-bile, pH, presence of commercial drugs and antibiotics on growth of L. sakei subsp. sakei 2a were determined. Results: The bacteriocin produced by L. sakei subsp. sakei 2a is
active against L. monocytogenes ScottA, L. innocua and different
serological types of L. monocytogenes. Addition of bacteriocin
produced by L. sakei subsp. sakei 2a to a 3 h-old culture of L.
monocytogenes repressed cell growth in the following 8h. Treatment of stationary phase cells of L. monocytogenes (7 – 8 logCFU/
ml) by the bacteriocin resulted in growth inhibition. Good growth
28
of L. sakei subsp. sakei 2a was recorded in MRS broth supplemented with 0.2% or 0.4% (w/v) ox-bile or in MRS broth adjusted
to pH 5.0 - 9.0. Auto-aggregation of L. sakei subsp. sakei 2a was
62.59%. Different levels of co-aggregation were recorded between
L. sakei subsp. sakei 2a and E. faecalis ATCC 19443, Lactobacillus sakei ATCC 15521 and L. monocytogenes ScottA. Growth
of L. sakei subsp. sakei 2a was not inhibitetd by commercial drugs
from different generic groups. The inhibitory effect on growth of
L. sakei subsp. sakei 2a was recorded only in presence of Arotin
[selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI) antidepressant] Minimal Inhibition Concentration (MIC) 1.0 mg/ml, Atlansil [Antiarrhythmic] MIC 0.625 mg/ml, Diclofenac potassium [Nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID)] MIC 2.5 mg/ml and
Spidufen [NSAID] MIC 15.0 mg/ml. Only two antibiotics tested in
this study (Amoxil and Urotrobel) inhibited growth of L. sakei
subsp. sakei 2a with a MIC of < 0.5 mg/ml and 5.0 mg/ml respectively. Significance: Besides being active against L. monocytogenes from different serological types and showing high co-aggregation properties with this foodborne pathogen, the survival of
L. sakei subsp. sakei 2a in presence of ox-bile and low pH and
resistance to several drugs used in human therapeutics evidences
the probiotic potential of this bacteriocinogenic strain.
P9 – 27200 APPLICATION OF BACTERIOCINOGENIC STRAINS
Enterococcus mundtii CRL35 AND Enterococcus faecium
ST88CH FOR CONTROL OF Listeria monocytogenes IN MINAS
CHEESE. ESTEBAN, PINGITORE(1); DANIELLE, FURTADO(2);
SVETOSLAV, TODOROV(2); FERNANDO, SESMA(1);
BERNADETTE, FRANCO(2)
(1) Centro de Referencia para Lactobacilos - CERELA, (2) U.S.
Pharmacopeia.
Introduction: Bacteriocins are antimicrobial peptides produced
by several lactic acid bacteria. For control of Listeria monocytogenes in foods, they can be supplemented with bacteriocins, or
inoculated with bacteriocinogenic strains for in situ production of
bacteriocins. Objective: The aim of this study was to evaluate the
capability of two bacteriocinogenic strains Enterococcus mundtii
CRL35 (bac+) and Enterococcus faecium ST88Ch (bac+), isolated
from cheeses, to control the growth of Listeria monocytogenes 426
in experimentally contaminated Minas cheese over 10 days of storage at 8°C. The study included an evaluation of some aspects of
bacteriocins mode of action against L. monocytogenes 426. Material and methods: Cheeses were prepared with pasteurized bovine milk, lactic acid, calcium chloride and commercial rennet. Four
sets were prepared: two made with milk containing one of the two
bac+ strains (6 logCFU/ml), one with milk containing a bac- strain
(E. faecium ATCC19443) and one added of nisin (12,5mg/l). Other
appropriate control cheeses were also prepared. L. monocytogenes 426 was added to cheeses during the manufacturing, in order to obtain 3 logUFC/g. Counts of lactic acid bacteria and L.
monocytogenes in the cheeses stored at 8 °C were done every
other day for 10 days. Effect of temperature, pH and selected
chemicals on adsorption of bacteriocins produced by E. mundtii
CRL35 and E. faecium ST88Ch to L. monocytogenes was determined. Results: Low pH and temperature favored the adsorption
of bacteriocins CRL35 and ST88Ch to L. monocytogenes. The
adsorption depended on presence of milk and NaCl. After 10 days
at 8 °C, counts of L. monocytogenes 426 in the cheeses containing the bac+ and the bac- strains of E. faecium decreased in a
similar manner (2.63-log and 2.87-log, respectively), showing that
inhibition might have occurred due to another factor than the production of bacteriocin. In the cheeses prepared with E. mundtii
CRL35 bac+, the counts of L. monocytogenes decreased 4.69-log,
and in those containing nisin, only a 0.75-log reduction was observed. Significance: The study showed that the strain E. mundtii
CRL35 bac+ was more effective than E. faecium ST88Ch bac+ for
the control of growth of L. monocytogenes in cheeses stored at 8
°C. E. mundtii CRL35 bac+ was even more effective than nisin.
This research underlines the potential of application of different
bacteriocins in the control of nisin-resistant variants of L.
monocytogenes in cheese.
P10 - 27208 EFECTO DEL SECADO SPRAY Y EL PERÍODO DE
ALMACENAMIENTO SOBRE LA CAPACIDAD FUNCIONAL DE
Bifidobacterium animalis subsp. lactis INL1. ZACARIAS, MARIA FLORENCIA; BURNS, PATRICIA; BINETTI, ANA; VINDEROLA,
GABRIEL; REINHEIMER, JORGE.
Bifidobacterium animalis subsp. lactis INL1 es una cepa aislada de leche materna con tolerancia a procesos tecnológicos de
la industria láctea, particularmente el secado spray (SS). Esta cepa
sobrevive al SS en leche 20% sin pérdidas de viabilidad celular
durante el SS y conservación a 5 °C. Sin embargo, existen estudios que sugieren que los recuentos celulares garantizan sólo
parvialmente la funcionalidad de una cepa sometida a tratamientos tecnológicos de uso común en alimentos. Objetivo: estudiar
el efecto del SS y del almacenamiento en la capacidad de esta
cepa de activar la respuesta inmune en intestino delgado (ID) y
grueso (IG) y tejido bronquial. Ratones BALB/c recibieron (de forma intragástrica por 3, 6 y 10 d), 5x10Exp(7) UFC de la cepa en
estudio como cultivo fresco (overnight 18 hs, 37 °C) resuspendido
en leche descremada al 20% o como cultivo secado spray (SS) e
inmediatamente administrado o SS y almacenado 6 meses a 5°C
antes de su administración oral. El SS fue realizado en leche
descremada al 20% en un mini-secadero Buchi. El grupo control
recibió, de igual forma, leche descremada al 20%. Al finalizar los
períodos de alimentación, los animales fueron anestesiados y
sacrificados por dislocación cervical. El hígado homogeneizado se
plaqueó en agar ABRV (estudio de traslocación). El ID e IG y los
pulmones se incluyeron en parafina. El N° de células productoras de IgA (cél.+) se determinó en cortes histológicos mediante
inmunohistoquímica. La administración oral de B. animalis subsp.
lactis INL1, tanto como cultivo fresco, SS fresco y SS almacenado durante 6 meses fue segura (ausencia de traslocación) e indujo un aumento significativo en el número de células productoras de IgA en IG respecto al control (327 ± 17 cél.+/10 campos),
sin diferencias significativas entre las condiciones en que la cepa
fue administrada (cultivo fresco, SS fresco o SS y almacenado 6
meses a 5 °C) ni para los diferentes períodos de administración
(los valores se ubicaron en el rango de 414 a 476 cél.+/10 campos). Sin embargo, el ID fue capaz de poner en evidencia diferencias en la capacidad funcional de la cepa por el SS aplicado.
Para el cultivo fresco se observó aumento significativo (control 289
± 29 cél.+/10 campos) para todos los períodos de administración,
con un máximo para 10 d (494 ± 27 cél.+/10 campos). Para el
cultivo SS fresco se observó aumento sólo para los 10 d de administración (389 ± 27 cél.+/10 campos) mientras que para el
cultivo SS y administrado luego de 6 meses de almacenamiento
a 5 °C el aumento significativo se observó sólo para el período
de 6 d de administración (377 ± 39 cél.+/10 campos). No se observaron diferencias en el N° cél. IgA+ en tejido bronquial respecto
al control. B. animalis subsp. lactis INL1 demostró capacidad
inmunomoduladora in vivo, siendo esta fuertemente influenciada,
a nivel de ID, por el SS y el almacenamiento por 6 meses. El tratamiento térmico y el almacenamiento podrían haber ejercido
modificaciones en los determinantes antigénicos de la superficie
celular, lo que resultó en los diferentes perfiles de inmunoestimulación observados.
P11 - 27212 ANTIMICROBIAL SPECTRUM OF Bifidobacterium
animalis subsp. lactis INL1 AND THE INFLUENCE OF DRYING
ON FUNCTIONALITY. COSTA SOUZA, TASSIA(1); ZACARIAS,
MARIA FLORENCIA(2); CARMONA, DENISE; VIEIRA, LEDA;
NICOLI, JACQUES; REINHEIMER, JORGE; VINDEROLA,
GABRIEL.
(1) ICB UFMG BRASIL, (2) INLAIN, UNL-CONICET.
Introduction: Bifidobacterium animalis subsp. lactis INL1 is a
strain isolated from human breast milk with resistance to technological processes of interest for the dairy industry such as freezing, freeze-drying, spray-drying and mild heating (50 °C). The functional properties of this strain to be considered as a probiotic
(immunomodulation capacity, antimicrobial activity, etc.) are under study. Recent studies suggest that technological treatments
like those described above could modify cell functionality of
probiotic bacteria without affecting cell viability. Aim: To study the
in vitro antimicrobial capacity of B. lactis INL1 against enteropathogenic indicators and the in vivo effect of freeze-drying and spraydrying on its immune properties, estimated as the capacity to enhance s-IgA production in intestinal fluid and proliferation of Küpffer
cells in liver. Materials and Methods: For the study of antimicrobial activity, the well-diffusion and agar-spot assays were compared using the following pathogens: Salmonella enterica subsp.
enterica serovar Typhimurium FUNED, Vibrio cholerae LEFM,
Shigella sonnei ATCC 11060, Shigella flexneri LEFM, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Listeria monocytogenes ATCC 15313,
Escherichia coli ATCC 25922 and Clostridium perfringens type A
ATCC 3624. Swiss NIH mice received, by daily gavage and for
10 consecutive days, 10% skim milk (control group) or 10Exp(8)
CFU of B. lactis INL1 as fresh, spray-dried or freeze-dried cultures
in 10% skim milk. Liver was removed for Küpffer cells count by
histological examination and small intestinal fluid was used for
determination of s-IgA contents by capture-ELISA. Results: An
antimicrobial activity against V. cholerae, S. flexneri and E. coli
was detected using the agar-spot assay but not by well-diffusion
assay. Only the oral administration of bifidobacteria as fresh culture significantly increased (P < 0.05) the number of Küpffer cells
(45.9±8.6 cel.+/100 hepatocytes) when compared to control mice
(30.2±2.5 cel.+/100 hepatocytes). Administration of bifidobacteria
as fresh (59.9±16.7 pg/ml), freeze-dried (29.3±3.1 pg/ml) and
spray-dried (25.6±0.7 pg/ml) cultures significantly increased the
concentration of s-IgA in the intestinal fluid when compared to
control mice (18.6±1.1 pg/ml). Conclusions: In vitro antimicrobial
activity against some pathogenic bacteria was detected for the
strain studied only by the agar-spot assay. The reason why one
methodology was effective compared to the other one remains
unknown but should be taken into account for other studies. B.
lactis INL1 displays in vivo immunomodulatory properties, being
this capacity significantly modified by the technological treatments
applied to the strain. It was confirmed that plate counts may offer
just a partial view of cell functionality since technological treatments affected the immunomodulating capacity of the strain without this fact being noticed by the enumeration of viable cells by
plate counts.
P12 - 27240 CARACTERIZACIÓN TECNOLÓGICA, BIOLÓGICA
Y PROBIÓTICA DE MUTANTES ESPONTÁNEOS FAGORRESISTENTES DE Lactobacillus casei/paracasei. CAPRA, MARIA
LUJAN; TIBALDO, MAXIMILIANO M; REINHEIMER, JORGE A;
QUIBERONI, ANDREA
Los mutantes espontáneos fago-resistentes son opción válida
para reemplazo de cepas sensibles originales y especialmente
significativa para bacterias probióticas con características únicas.
Para ser candidatos útiles, los mutantes deberán presentar además características tecnológicas, biológicas y probióticas similares a la cepa de origen. En este trabajo se evaluaron características tecnológicas, biológicas y probióticas de mutantes fago-resistentes, obtenidos de las cepas sensibles Lactobacillus
paracasei ATCC 27092 y Lactobacillus casei ATCC 27139. Sobre diez mutantes, resistentes al fago MLC-A (primero de L.
paracasei en Sudamérica, aislado en industria argentina) específico de la cepa comercial L. paracasei A, se estudió: desarrollo
en distintos medios, actividad proteolítica y acidificante y uso de
prebióticos. Se simuló elaboración de un producto fermentado
usando cepas sensibles y un mutante por cada una, con y sin
fago, y se monitoreó viabilidad celular y fágica en el tiempo durante el almacenamiento refrigerado (12 °C) del producto. Para
todas las cepas, se investigó in vitro la capacidad de inhibir
patógenos y naturaleza del inhibidor, hidrofobicidad, deconjugación de sales biliares, resistencia a barreras biológicas y actividades enzimáticas (API Zym). Las cepas mostraron muy escasa actividad proteolítica y fueron ineficientes en el uso de los
prebióticos ensayados. Los mejores desarrollos se obtuvieron en
29
medio comercial BTC12 obteniéndose (24h) valores de acidez
Dornic (°D) superiores a 110 °D y en general, similar comportamiento de mutantes y su cepa sensible. Durante las elaboraciones, el crecimiento del mutante infectado y sin infectar fue similar al de la cepa sensible sin fago, lográndose (7,5h) recuentos
superiores a 10e8 ufc/ml e inferiores a 10e6 ufc/ml para cepas
sensibles infectadas, que propagaron al fago (10e7-10e8 ufp/ml).
La viabilidad del fago propagado sobre ATCC 27092 se mantuvo
(1 mes, 12°C), y los recuentos celulares de la cepa sensible y el
mutante infectado y sin infectar, disminuyeron 1,4; 0,8 y 1 órdenes logarítmicos, respectivamente. Todas las cepas mostraron
cierto poder inhibitorio sobre los patógenos usados, especialmente
para Salmonella. La hidrofobicidad fue baja para ATCC 27092 y
mutantes (1,5±1,2% y 7,5±2,5%, respectivamente). No se produjo deconjugación de las sales biliares ensayadas, observándose
en algunos casos parcial o total inhibición en el crecimiento. Los
mutantes mostraron entre sí ciertas diferencias en la resistencia
a las barreras biológicas. Para ambas familias, la pérdida de viabilidad celular más notable (en torno a 4 órdenes log) se registró
luego de la incubación con pepsina a pH 2,5. Las cepas madres
y sus mutantes, mostraron prácticamente idénticas actividades
enzimáticas: elevada actividad ß-galactosidasa en general y en
todos los casos, reacción negativa para ß-glucuronidasa (participa en la formación de carcinógenos). Los estudios realizados revelaron similitud de comportamiento dentro de cada familia estudiada lo cual, sumado a la fagorresistencia, posiciona a los
mutantes como cultivos alternativos a sus cepas probióticas de
origen.
P13 - 27301 EFECTO PROTECTOR DE Lactobacillus fermentum
L23 EN VAGINA DE RATONES BALB/C FRENTE A
Streptococcus agalactiae. RUIZ, F; GERBALDO, G; ASURMENDI,
P; GARCIA, M; PASCUAL, L; BARBERIS, I
Universidad Nacional de Río Cuarto
Streptococcus agalactiae o estreptococos del grupo B (SGB)
de acuerdo a la clasificación de Lancenfield es un reconocido
microorganismo patógeno humano involucrado principalmente en
enfermedades perinatales. Si bien la penicilina es el antibiótico
de elección para la profilaxis y el tratamiento de infecciones producidas por SGB, en los últimos años se ha registrado un aumento
en la resistencia a este antibiótico como así también a otros grupos de agentes antimicrobianos. Es sabido que los lactobacilos
colaboran en el mantenimiento de un ecosistema estable, en la
protección y prevención del ingreso de patógenos, incluyendo
aquellos que causan infecciones genitourinarias, por ello podrían
constituirse en una alternativa biológica para el control de procesos infecciosos. Objetivo: Evaluar el efecto preventivo y curativo
de L. fermentum L23 sobre la colonización de SGB en vagina de
ratones BALB/c. Métodos. Se estudió la microbiota vaginal de 20
ratones hembras BALB/c. La cepa con características benéficas
L23 (GenBank accession no. GQ 455406) y el SGB seleccionado, se cultivaron en agar MRS y agar sangre de carnero al 5%
respectivamente y fueron incubados en óptimas condiciones. Para
los ensayos de colonización, efecto preventivo y curativo se inoculó en la vagina de los ratones una concentración de lactobacilos
de 108 UFC/ml y para los estudios de infección y curativo se inoculó SGB a una concentración de 107 UFC/ml. Se tomaron muestras de la vagina de los ratones diariamente durante 8 días (t0t8), se realizaron recuentos diarios en placas con el medio de
cultivo adecuado para cada microorganismo y las UFC/ml se transformaron a log10. El estudio del efecto preventivo de L23 se realizó inoculando una única dosis de lactobacilos, a las 48 h posteriores se reinoculó cada animal con SGB. En el efecto curativo,
primero se inoculó el SGB y 48 h pos-inoculación se administró
L23 a una concentración de 108 UFC/ml. Todas las experiencias
se realizaron por triplicado. Resultados. La microbiota vaginal de
los ratones BALB/c mostró una biota heterogénea variando entre
cocos Gram positivos y bacilos Gram negativos del tipo enterobacterias. Es de destacar en estos lotes de animales estudiados
la ausencia de SGB y lactobacilos. La colonización de L23 se logró con una única dosis a t0 de 8,40 (log10UFC/ml) permaneciendo en vagina al t8 con valores de logaritmo superiores a 2,96, in-
30
dicando óptima colonización. Mientras que SGB en cada grupo de
ratones se mantuvo a 2,08 a los 8 días de haber comenzado el
estudio. En el efecto preventivo de L23 no se observó desarrollo
de SGB a las 96 h de ser inoculado este último microorganismo,
mientras L23 permaneció en vagina hasta el final de la experiencia con un log10UFC/ml de 2,73. De igual modo en el ensayo del
efecto curativo L23 eliminó a SGB al cuarto día de inoculada la cepa
de lactobacilo. Conclusiones. Los resultados demostraron que la
cepa L. fermentum L23 fue capaz de colonizar el nicho ecológico
vaginal de ratones y eliminó a SGB en las experiencias de efecto
preventivo y curativo muy eficazmente. Estos hallazgos promisorios
tienen mucha importancia en mujeres embarazadas como una forma de prevención a la colonización de SGB evitando de esta manera una posterior infección neonatal.
P14 - 27306 ACTIVIDADES AMINOTRANSFERASA Y GLUTAMATO DEHIDROGENASA EN CEPAS DE LACTOBACILOS AISLADAS DE QUESO. PERALTA, GUILLERMO; BERGAMINI,
CARINA; SUAREZ, VIVIANA; HYNES, ERICA
Instituto de Lactología Industrial – INLAIN – UNL / CONICET
La generación de aroma y sabor en el queso está relacionada al catabolismo de los aminoácidos que se produce fundamentalmente por acción de las bacterias lácticas, las cuales ponen
en juego actividades enzimáticas clave, tales como la aminotransferasa (AT) y la glutamato dehidrogenasa (GDH). La caracterización de dichas capacidades enzimáticas es una herramienta útil para la selección de fermentos adjuntos para quesos. En
efecto, se ha demostrado que el perfil de especificidad de las
AT hacia los diferentes aminoácidos influye en los compuestos
de aroma producidos en queso. Asimismo, la GDH cataliza la
reacción que produce á-cetoglutarato, utilizado como aceptor de
grupo amino en la reacción de transaminación. En el presente
trabajo, ocho cepas de bacterias lácticas, previamente aisladas
de queso Tybo de buena calidad e identificadas como
Lactobacillus plantarum 33, 87 y 91, L. rhamnosus 73, 75, 77 y
78 y L. casei 90, fueron evaluadas por sus actividades GDH y
AT. Se estudiaron las AT específicas hacia ocho aminoácidos:
Asp, Met, aminoácidos ramificados (Leu, Ile, Val) y aromáticos
(Tyr, Phe, Trp). Las actividades enzimáticas fueron estudiadas
en extractos libres de células. Para ello, cultivos en fase
logarítmica tardía de las cepas en estudio se sometieron a
disrupción mecánica con el uso de perlas de vidrio en un
disruptor celular. Las actividades GDH y AT fueron determinadas acoplando las reacciones enzimáticas correspondientes a un
ensayo colorimétrico. Todas las cepas estudiadas presentaron
actividad GDH, siendo las cepas L. rhamnosus 73, 75 y 77, L.
plantarum 87 y 91 y L. casei 90 las que mostraron los mayores
niveles. Asimismo, las cepas de lactobacilos ensayadas demostraron actividad AT hacia todos los aminoácidos en estudio, presentándose algunas diferencias en los niveles hacia los distintos aminoácidos. Todas las cepas demostraron una mayor especificidad hacia el Asp, siendo las cepas L. casei 90, L.
rhamnosus 73 y L. plantarum 33, 87 y 91 las que presentaron
los mayores niveles. La única excepción a esta situación fue la
cepa L. rhamnosus 78, que se caracterizó por niveles similares
de actividad AT hacia tres aminoácidos: Asp, Phe y Trp. Además de su especificidad hacia Asp, las cepas L. rhamnosus 73
y L. casei 90 demostraron los mayores niveles de AT hacia otros
aminoácidos. En particular, L. casei 90 mostró especificidad para
los aminoácidos ramificados, mientras que la actividad AT de L.
rhamnosus 73 fue más elevada para Leu, Phe, Met y Trp. Por
su parte, L. rhamnosus 77 y L. plantarum 87 mostraron valores
intermedios para las AT específicas para aminoácidos distintos
de Asp, observándose los mayores niveles hacia los aromáticos
y Leu. Finalmente, las cepas L. rhamnosus 75 y L. plantarum 33
y 91 exhibieron bajos niveles de AT frente a otros aminoácidos
distintos de Asp. Las cepas de lactobacilos estudiadas demostraron capacidades enzimáticas de gran interés para su uso
como cultivos adjuntos en queso, que variaron de una cepa a
otra. Esta diversidad permitirá seleccionar fermentos adjuntos en
vistas al incremento de determinados compuestos de aroma en
el queso.
P15 - 27315 EFECTO DEL SECADO SPRAY Y LA MATRIZ SOBRE LA VIABILIDAD Y RESISTENCIA GÁSTRICA DE
LACTOBACILOS PROBIÓTICOS. PAEZ, ROXANA (1);
VINDEROLA, GABRIEL (2); LAVARI, LUISINA (1); ZARITZKY,
NOEMI (3); REINHEIMER, JORGE (2)
(1) INTA, Rafaela, (2) Instituto de Lactología Industrial – INLAIN,
UNL-CONICET, (3) CIDCA, UNLP-CONICET
El secado spray (SS) de lactobacilos probióticos en leche
descremada (LD) permite obtener polvos con altos recuentos de
células viables que se mantienen hasta 1 año a 5 °C. Estos polvos poseen además baja humedad y adecuada dispersabilidad en
agua, siendo una alternativa de menor costo respecto a la
liofilización para desarrollar cultivos probióticos deshidratados. En
nuestro laboratorio fue también comprobado que los recuentos
celulares brindan sólo información parcial sobre la funcionalidad
de una cepa sometida a tratamientos tecnológicos como el SS.
El objetivo del trabajo fue estudiar el efecto del SS en diversas matrices alimentarias sobre la viabilidad y resistencia gástrica
(RG), considerada como indicador de funcionalidad, de
lactobacilos probióticos. Se emplearon cultivos frescos de lactob.
comerciales probióticos (L. paracasei Nad y A13, L. acidophilus
A9) suspendidos en LD al 20% (L), LD 10% + proteínas de suero
de leche 10% (L-WPC) y LD 10% + almidón 10% (L-A). Las suspensiones se secaron en un mini-secadero spray (Buchi B-290,
T ent. 170 °C, T sal. 85 °C flujo: 600 lt/h). Se controló viabilidad
antes y después del SS. Se fotografiaron los polvos obtenidos (sin
rehidratarse) por microscopía electrónica de barrido (SEM) y trasmisión (TEM). Las cepas SS en L se sometieron a digestión
gastrointestinal simulada (pH = 2,5, 90 min y exposición a 0,5%
de bilis, 60 min, 37 °C). Se realizó también esta digestión
gastrointestinal para L.p. Nad SS en las 3 matrices ensayadas.
No se observaron diferencias en viabilidad antes y después del
SS para las cepas en las 3 matrices. La microscopia electrónica
evidenció la formación de glóbulos que entramparon a las cepas,
sin observarse células fuera de éstos (SEM), sino células enteras dentro de los glóbulos, inmersas en una matriz proteica (TEM).
No se observaron diferencias en la resistencia gastrointestinal de
L.a. A9 como cultivo fresco o SS, obteniéndose una reducción de
viabilidad de 5,84 ± 0,70 y 5,25 ± 0,19 órdenes log., respectivamente, luego de la exposición a acidez gástrica y bilis. Sin embargo, para L.p. A13 se observó un aumento de RG debido al tratamiento térmico experimentado durante el SS. La cepa experimentó una pérdida de viabilidad celular de 6,61 ± 1,03 órdenes
log como cultivo fresco, mientras que para el cultivo SS en LD
este valor fue de 5,27 ± 0,13 ord. log. Para L.p. Nad se observó
aumento de RG debido al tratamiento térmico experimentado
durante el SS y debido también a la matriz en la cual se llevó a
cabo este proceso. El recuento final (luego de la digestión
gastrointestinal) de esta cepa como cultivo fresco fue de 2,0 log
UFC/ml, mientras que para el cultivo SS en LD fue de 3,84 ± 0,35
log UFC/ml y para el mismo cultivo secado en L-A fue de 5,3 log
UFC/ml. El SS produjo efectos cepa-dependientes sobre la RG en
función de la matriz empleada, induciendo una mayor RG en L.p.
Nad cuando fue secado en L-A respecto a LD. Se confirma la necesidad de realizar pruebas de funcionalidad para poner en evidencia el efecto de tratamientos tecnológicos sobre parámetros de interés (RG) en probióticos, más allá del recuento de células viables.
P16 - 27611 EFECTO DEL AGREGADO DE ADITIVOS SOBRE
LAS POBLACIONES MICROBIANAS DE SANGRE DE MATADERO AVIAR. BONANSEA, EMANUEL(1); ALTINA, MELISA(1);
ZBRUN, VIRGINIA(1); SOTO, LORENA(1); FRIZZO, LAUREANO(1); ROSMINI, MARCELO (1); SIGNORINI, MARCELO(2)
(1) Facultad de Ciencias Veterinarias, UNL, (2) INTA, EEA Rafaela
Introducción: la sangre animal representa una fuente potencial de aminoácidos esenciales que le confieren a sus proteínas
un alto valor biológico, razón por la cual podría ser incorporada
en la formulación de alimentos para consumo humano y animal.
Actualmente los mataderos desechan la mayor parte, convirtiéndose en un efluente altamente contaminante debido al elevado
número de bacterias aerobias presente en ella. El uso de bacterias ácido lácticas (BAL) como cultivo protector representa una
interesante alternativa para la conservación de la sangre, en razón de su capacidad de producir sustancias inhibitorias. Para
mejorar el desarrollo de las BAL en sangre, es factible agregar
sustancias que favorezcan el crecimiento de las mismas evitando que aquellas deteriorantes puedan provocar la putrefacción del
producto. Objetivos: Evaluar el efecto del agregado de aditivos a
la sangre de matadero aviar, sobre los recuentos de los principales grupos microbianos que conforman la población de dicho producto. Materiales y métodos: Se analizaron microbiológicamente
tres muestras de sangre obtenidas de un frigorífico de aves. Cada
muestra fue fraccionada en cuatro tubos: un control refrigerado
(CR) a 5 °C, un control (CT) incubado a 22 °C (ambos sin el agregado de aditivos), otro con el agregado de Citrato de amonio,
extracto de carne, lactosa, Na2HPO3 y NaH2PO3 (T1) y otro con
ClNa, extracto de carne, lactosa, Na2HPO3 y NaH2PO3 (T2)
ambos conservados a 22 °C. Los aditivos fueron seleccionados
con base a la formulación de medios de cultivos que favorecen
el desarrollo de las BAL y podrían evitar el crecimiento de los
alterantes. De cada tubo se realizaron diluciones en Ringer 1/4 a
tiempo 0h y 24h para estudiar las distintas poblaciones. Para el
recuento de mesófilos totales se utilizaron placas de agar PCA,
para enterobacterias totales y coliformes se utilizaron placas de
agar VRBG y VRBL respectivamente. La población fúngica fue
evaluada utilizando agar HyL y se utilizaron dos medios para el
estudio de las BAL, agar MRS y agar LAMVAB. La evaluación del
efecto de los aditivos se analizó utilizando un análisis factorial de
los recuentos mediante el software estadístico SPSS. Resultados:
Se hallaron diferencias significativas (p<0.05) en los recuentos de
mesófilos totales donde el CR y el T2 fueron los que presentaron
menores recuentos de dicha población durante el ensayo (CR:
5.08 UFC/ml; T2: 6.57 UFC/ml, T1: 6.95 UFC/ml y CT: 7.68 UFC/
ml). Lo mismo sucedió con los coliformes donde CR y T2 se diferenciaron (p<0.05) del resto de los tratamientos (CR: 3.95 UFC/
ml, T2: 5.34 UFC/ml, T1: 6.06 UFC/ml y CT: 6.42 UFC/ml). En la
población de BAL estudiada en agar MRS también hubo diferencias significativas (p<0.05) del CR respecto al resto (CR: 4.65
UFC/ml, T1: 5.54 UFC/ml, T2: 5.74 UFC/ml y CT: 6.15 UFC/ml).
Conclusiones: De acuerdo con los valores hallados, el T2 produjo una disminución significativa en el recuento de mesófilos totales y coliformes sin alterar de manera sustancial el recuento de
BAL. Podríamos considerar a los aditivos utilizados en el T2 como
adecuados en nuestra estrategia para favorecer el desarrollo de
un cultivo protector en sangre de matadero aviar.
P17 - 27625 INICIADORES LÁCTICOS SELECCIONADOS PARA
FERMENTACIÓN DE ACEITUNAS VERDES. ETAPA III: IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS GASIFICANTES.
SFREDDO, ELIZABETH SUSANA; DEDIOL, CORA; NACIF, NORMA; ANDRE, SILVIA; SANCHEZ, ML
Universidad Nacional de Cuyo
Durante el proceso de producción de aceitunas verdes fermentadas es posible que ocurran desvíos en la fermentación o que
aparezcan zonas en los recipientes con condiciones favorables
para el desarrollo de microorganismos gasificantes que suelen
llevar a la pérdida total o parcial de la producción como fruto entero. Los microorganismos pueden crecer en las lenticelas de los
frutos como colonias visibles o no y producir la rasgadura en varios sitios por acumulación de gas entre la epidermis y la pulpa.
El objetivo del presente trabajo fue identificar a los microorganismos causantes del deterioro de aceitunas verdes fermentadas de la variedad Arauco, conocido en la industria como
“anillado”, que se presenta en las primeras etapas de fermentación y en la época de primavera donde se reactivan las fermentaciones por efecto del aumento de la temperatura del medioambiente. Se tomaron muestras de aceitunas anilladas de establecimientos olivícolas de distintos orígenes de la provincia de
Mendoza, se lavaron con agua estéril, y basados en las referen-
31
cias bibliográficas existentes, se aislaron bacterias coliformes,
bacterias lácticas heterofermentativas y levaduras fermentativas,
a partir de las rajaduras de los frutos. Las bacterias coliformes se
aislaron y purificaron en agar eosina azul de metileno, adicionado de pimaricina, a 37 °C. Las bacterias lácticas heterofermentativas se aislaron en agar MRS con pimaricina, a 28 °C; el carácter heterofermentativo se investigó en caldo MRS con tapón
de vaspar y se verificó que fueran catalasa negativo. Las levaduras fermentativas se aislaron en medio para levaduras y mohos
(Britania) a 28 °C; el carácter heterofermentativo se investigó en
caldo levadura glucosado con campana de Durham. Las mismas
muestras de aceitunas anilladas se enriquecieron en caldo
lactosado o caldo MRS con 6% NaCl a 28 °C. Se aislaron las cepas enriquecidas en los medios de cultivo diferenciales antes
mencionados. Las cepas purificadas se sembraron en aceitunas
enteras en salmuera esterilizadas obtenidas al inicio de la temporada de producción, en abril de 2010, y se incubaron a 28 °C
para comprobar que los microorganismos aislados fueran los
agentes causales del deterioro. Del primer aislamiento se obtuvieron 10 cepas de bacterias coliformes y 8 cepas de bacterias
lácticas heterofermentativas. De las muestras de aceitunas enriquecidas se aislaron 3 cepas de levaduras fermentativas. Las
bacterias coliformes o lácticas sembradas no reprodujeron el fenómeno de rasgado de los frutos en esta variedad de aceitunas
mientras que las cepas de levaduras aisladas de los enriquecimientos causaron múltiples lesiones a los frutos inoculados. Se
identificaron a dos de las cepas de levaduras como Cryptococcus
albidus de acuerdo a los criterios bioquímicos y morfológicos de
Kurtzman and Fell (1998).
P18 - 27646 SECADO EN SPRAY DE LACTOBACILOS AISLADOS DE KEFIR: EFECTO SOBRE LA MEMBRANA
PLASMÁTICA, ACTIVIDAD METABÓLICA Y PROPIEDADES
PROBIÓTICAS. GOLOWCZYC, MARINA A(1); GEREZ, CARLA
L(2); SILVA, JOANA(3); PAULA, TEIXEIRA(3); DE ANTONI,
GRACIELA L(1); ABRAHAM, ANALIA G(1)
(1) CIDCA, (2) Centro de Referencia para Lactobacilos - CERELA,
(3) ESB, Portugal.
El secado en spray (SD) es una tecnología que produce grandes cantidades de producto deshidratado a bajo costo, estos productos pueden ser transportados fácilmente y almacenados por
largos períodos de tiempo de forma estable. Esta metodología se
ha empleado para deshidratar y conservar bacterias lácticas para
ser usadas como cultivos starters (para yogurt o queso), cultivos
productores de bacteriocinas y cultivos probióticos. La principal
limitación de esta metodología es la pérdida de viabilidad que
ocurre durante el proceso y el posterior almacenamiento de los
productos deshidratados debido a stress por calor, osmótico u
oxidativo. Se seleccionaron tres lactobacilos con conocidas propiedades probióticas: L. kefir CIDCA 8321, L. kefir CIDCA 8348 y
L. plantarum CIDCA 83114. El objetivo de este trabajo fue estudiar el impacto del SD sobre la membrana plasmática, la actividad metabólica y ciertas propiedades probióticas de estos
microorganismos. Los microorganismos fueron cultivados en MRS
a 30 °C, se lavaron y se resuspendieron en leche en polvo
reconstituida (11%). Los microorganismos fueron secados en un
atomizador de pequeña escala (T° salida 70 °C, T° de entrada 160
°C y presión 3 Bar). Se estudiaron los microorganismos luego del
secado en spray mediante los siguientes ensayos: evaluación del
daño en la membrana a través de la resistencia a lisozima, sales
biliares, cloruro de sodio y penicilina; capacidad de adhesión a
células intestinales en cultivo Caco-2/TC-7; capacidad de producción de ácidos en MRS y leche y capacidad de inhibición de la
invasión de Salmonella en células en cultivo. Los tres microorganismos mostraron resistir muy bien el proceso de SD. La resistencia a los distintos agentes antes y después del SD se mantuvo inalterada, esto indicarían que no se produce daño en la
membrana durante el proceso de secado. La capacidad de producción de ácidos de L. plantarum 83114 deshidratada no mostró diferencias significativas comparada con la cepa fresca en
ambos medios, mientras que las dos cepas de L. kefir mostraron
32
un retraso en la acidificación en MRS. Los resultados de adhesión a células en cultivo de las cepas deshidratadas no mostraron diferencias significativas con respecto al control, excepto la
cepa L. kefir 8348. L. kefir 8321 mantuvo la capacidad de inhibir
la invasión de Salmonella a células luego del proceso de secado
aunque en menor medida que la cepa fresca. En conclusión, los
microorganismos seleccionados sobrevivieron bien al proceso, no
demostraron sufrir daños en la membrana, mantuvieron su actividad metabólica y su capacidad de adhesión a células en cultivo
así también como su antagonismo frente a Salmonella. Estos resultados indicarían que estos microorganismos aislados de kefir
deshidratados mediante SD podrían ser aplicados como starters
o comercializados como un producto deshidratado probiótico.
P19 - 27660 EVALUACIÓN DE LA MEJORA AL PROCESO DE
ELABORACIÓN DE ACEITUNAS VERDES POR AGREGADO DE
UN INICIADOR LÁCTICO EN CONDICIONES QUE PERMITAN
ASEGURAR LA CALIDAD DEL PRODUCTO. FARRANDO,
SILVINA; SFREDDO, E; STOCCO, A; ENGLER, S; HERRERA, C;
MIRABILE, M; DA SILVA, S.
Universidad Nacional de Cuyo
Para mejorar la calidad de aceitunas verdes estilo Español se
propone la utilización de un cultivo iniciador, cuyos requisitos incluyen rápido y predominante crecimiento, metabolismo
homofermentativo, desarrollo a bajas temperaturas, tolerancia a
la sal, al ácido y a los polifenoles. En la bibliografía hay poca información sobre el momento oportuno de inoculación en la variedad Arauco. Las características físico-químicas iniciales de la
salmuera influyen en el desarrollo de la fermentación y en la selección de los microorganismos que la conducen. A nivel industrial, para inhibir a microorganismos alterantes, es frecuente el uso
de sal a alta concentración, a pesar que esto puede favorecer el
predominio de levaduras sobre bacterias lácticas. El objetivo del
trabajo es evaluar el efecto de un inoculante láctico sobre el proceso fermentativo de aceitunas verdes variedad Arauco y establecer las condiciones que aseguren su implantación y la calidad
del producto final. Se escogieron 4 cepas de Lactobacillus
plantarum (L199, L256, L259 y L310) del cepario regional de la
Cátedra de Microbiología, según sus propiedades competitivas
tales como producción de inhibición sobre un gran número de
bacterias lácticas cohabitantes, alta velocidad de crecimiento, producción de ß-glucosidasa, entre otras. Se realizó control de pureza, Gram y catalasa. Se determinó la capacidad de crecimiento en concentraciones crecientes de sal en caldo MRS en un rango
de 5 a 11% de sal. Se evaluó el efecto del NaCl sobre la viabilidad bacteriana en frascos con caldo MRS a 8, 9 y 10% de sal. El
número de células viables se obtuvo por cultivo en placa en agar
MRS a las 48 y 120 hs. Se analizó el efecto simultáneo del pH
(5, 6 y 7), NaCl (7, 8 y 10 %) y temperatura (15 y 20 °C) sobre el
crecimiento y acidificación de las cepas bacterianas. El seguimiento se realizó midiendo pH, acidez titulable (% ácido láctico) y número de bacterias viables (ufc/ml) en agar MRS a 28 °C; al 4° y
10° día de incubación. Todos los análisis se hicieron por triplicado. Se observaron bastones Gram positivos, catalasa negativos.
Ninguna cepa creció a 11% de sal y L199 no lo hizo a 10%, por
lo que fue descartada. El recuento de bacterias viables fue
<100000 ufc/ml a pH 10 y de las 3 cepas analizadas L259 presentó los menores recuentos, por lo que también se descartó. Se
halló diferencias significativas (p<0.05) en el crecimiento y porcentaje de acidificación en las condiciones ensayadas para cada
cepa respecto al contenido de sal y al pH. El porcentaje de acidificación fue mayor a 7% NaCl, pH 5 y a 25 °C para ambas cepas. El recuento fue mayor a 8% y pH 7 para L256 y a 7% y pH 5
para L310. El número de bacterias fue mayor para L310 que L256.
Se escogió L310 como inoculante láctico, por su mayor capacidad de multiplicación y mejor adaptación a las condiciones de la
salmuera a nivel industrial.
P20 - 27694 PRODUCCIÓN DE BACTERIOCINAS EN PRESENCIA DE NACL POR DOS CEPAS DE Enterococcus faecium AISLADAS DE QUESOS ARTESANALES DE LECHE OVINA. RIVAS,
FRANCO(1,2); VALLEJO, MARISOL(3); MARGUET, EMILIO(3);
CASTRO, MARCELA(1,2); CAMPOS, CARMEN(2,4)
(1) Universidad Nacional del Chaco Austral. (2) CONICET.(3) Fac.
de Ciencias Naturales, Universidad Nacional de la Patagonia
Chubut.(4) Depto. Industrias, FCEN, UBA
Las bacterias ácido lácticas (BAL) pueden ser utilizadas en la
bioconservación de alimentos debido a su capacidad de producir
varias sustancias antimicrobianas incluidas las bacteriocinas. El
género Enterococcus, perteneciente a las BAL, se encuentra presente en varios alimentos fermentados de elaboración artesanal,
tal como los quesos de leche de oveja. En este trabajo se utilizaron dos cepas de Enterococcus faecium, aisladas de estos productos artesanales, con el objetivo de caracterizar la producción
de bacteriocinas en presencia de distintas concentraciones de
NaCl. Las cepas utilizadas fueron E. faecium ETw15 y E. faecium
ETw20. Los sistemas en estudio se constituyeron con caldo MRS,
agregando 0, 3 ó 6% p/v de NaCl en cada caso. El pH inicial de
los mismos se ajustó a 6,2 previo a la esterilización. Cada sistema estéril se inoculó con un cultivo activo de la cepa en estudio
al 1% v/v y se almacenó a 30 °C por un período de 36 h. Durante
el almacenamiento se tomaron alícuotas a intervalos definidos a
fin de determinar el crecimiento microbiano, la producción de
bacteriocinas y la acidificación del medio. El crecimiento
microbiano se monitoreó midiendo la absorbancia de los sistemas
a 600 nm. La producción de bacteriocinas se determinó mediante el método de la dilución crítica, por difusión en agar, empleando Listeria innocua ATCC 33090 y Staphylococcus aureus FBUNT
como microorganismos indicadores. La acidificación del medio se
determinó mediante lecturas de pH. Las velocidades de crecimiento se determinaron por ajuste de los datos experimentales a la
ecuación de Gompertz modificada y se compararon estadísticamente mediante análisis de varianza. La velocidad de crecimiento decreció significativamente en el siguiente orden, correspondiente a las concentraciones de NaCl: 3%, 0% y 6% p/v. Consecuentemente, ambas cepas presentaron un perfil de acidificación
mayor en los sistemas que contenían 3% NaCl. Las sustancias
del tipo bacteriocina producidas por las dos cepas ensayadas
presentaron una marcada inhibición contra L. innocua con títulos
superiores a 3000 unidades arbitrarias por ml (UA/ml) en los sistemas sin NaCl, mientras que estos valores fueron ocho veces
menores frente a S. aureus para los mismos sistemas. El agregado de 3% NaCl produjo una reducción en la producción de
bacteriocina. Este fenómeno se observó frente a los dos
microorganismos indicadores. La presencia de 6% NaCl invalidó
completamente la producción de bacteriocinas para la cepa
ETw15, mientras que la cepa ETw20 produjo inhibición frente a
L. innocua (200 UA/ml) pero no así frente a S. aureus. Los resultados presentados dan cuenta de la significativa influencia del
NaCl sobre el crecimiento de las cepas estudiadas y permitieron
establecer que la presencia de 3% de NaCl, si bien optimiza las
velocidades de crecimiento y el perfil de acidificación, afecta la
producción de bacteriocinas en el medio estudiado.
P21 - 27707 IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS ACIDO LÁCTICAS
AISLADAS DE SANGRE DE MATADERO AVIAR. ZBRUN, M VIRGINIA; ALTINA, MELISA; BONANSEA, EMANUEL; FRIZZO,
LAUREANO; SOTO, LORENA; ROSMINI, MARCELO; SIGNORINI,
MARCELO
Facultad de Ciencias. Veterinarias, UNL.
Introducción: la sangre es una materia prima muy rica en proteínas de alto valor biológico que puede aprovecharse por una
gran variedad de industrias. Por otra parte, la sangre siempre ha
sido un grave problema para los mataderos ya que es uno de los
residuos con mayor poder contaminante. El principal inconveniente
que presenta este subproducto es la calidad microbiológica, debido a que es colectada usando sistemas abiertos de recolección.
Una posibilidad para conservar la sangre podría ser mediante
cultivos bioprotectores, es decir, aprovechar la capacidad de bacterias ácido lácticas (BAL) presentes en dicho medio para inhibir
o controlar el crecimiento y actividad potencial de microorganismos
deteriorantes o patógenos. Objetivo: estudiar la diversidad de las
BAL presentes en sangre aviar para la posterior selección de
cepas que conformarán un cultivo bioprotector. Materiales y métodos: se analizaron microbiológicamente 8 muestras de sangre
aviar obtenidas de dos mataderos las cuales fueron recolectadas
en recipientes estériles durante la faena. De cada muestra se
realizaron diluciones en Ringer ¼ para efectuar el aislamiento de
BAL. Se utilizaron dos medios: agar MRS y agar LAMBAV. La
siembra se realizó en superficie y se incubaron 48 h a 37 °C en
anaerobiosis. Las colonias aisladas se repicaron en caldo MRS e
incubaron a 37 °C por 24 h. Para estudiar los distintos microorganismos aislados se llevaron a cabo pruebas fenotípicas como:
tinción de gram, morfología, prueba de la catalasa, forma y cantidad de crecimiento en caldo, prueba de homo-heterofermentación
e hidrólisis de arginina. Luego se realizaron pruebas genotípicas
mediante la extracción de ADN y amplificación del gen 16S. El
producto amplificado de 1500pb fue digerido con tres enzimas de
restricción: Hinf I, Msp I y Hae III. Las cepas con patrones distintos fueron secuenciadas para su identificación. Resultados: Se
aislaron 98 cepas catalasa negativa y gram positivas, de las cuales se seleccionaron 46 que presentaron distinta morfología y
características de crecimiento en caldo. La combinación de la
presencia de homo/heterofermentación, hidrólisis de arginina y la
digestión enzimática permitió detectar 13 patrones distintos dentro de las 46 cepas. Los resultados de la secuenciación e identificación de dichos microorganismos mediante comparación de sus
secuencias en el BLAST (NCBI) fueron los siguientes: 2 cepas de
Lactobacillus salivarius, 2 cepas de Lactobacillus reuteri,
Lactobacillus brevis, Lactobacillus crispatus, Pediococcus acidilactici, 2 cepas de Enterococcus faecium, 2 cepas de Enterococcus
faecalis, Enterococcus durans, Weissella paramesenteroide. Estos resultados demuestran la presencia de una compleja diversidad de BAL en sangre de matadero aviar, dentro de las cuales
podrían surgir cepas con potencialidad bioprotectora. Las mismas
aplicadas en la sangre reducirían los costos de procesamiento
mejorando sus características microbiológicas.
P22 - 27813 ANÁLISIS DEL ESPECTRO ANTIMICROBIANO Y
DE LA INOCUIDAD DE BACTERIAS LÁCTICAS CON POTENCIAL TECNOLÓGICO DE DOS CUENCAS LECHERAS
CAPRINAS. TORRES, NANCY (1); AUDISIO, M CARINA (2);
CHAVEZ, MONICA (1)
(1) INTA EEA SALTA, (2) CONICET-INIQUI, FAC.
Introducción. Las bacterias lácticas son ampliamente utilizadas para la fermentación y preservación de una gran variedad de
productos lácteos ya que no solo condicionan su aroma, sabor y
textura, sino que también pueden prevenir el desarrollo de
microorganismos contaminantes. El grupo de trabajo seleccionó
previamente cepas de bacterias lácticas por su capacidad tecnológica. Estas, provenientes de dos cuencas de ecosistemas diferentes: Amblayo y Valle de Lerma (Salta), produjeron compuestos de aroma y generaron propiedades deseables para la elaboración de quesos. Objetivo. Determinar el espectro antimicrobiano
y la inocuidad de bacterias lácticas seleccionadas para la elaboración de fermentos. Materiales y Métodos. Se estudiaron 40 cepas de bacterias lácticas con interés tecnológico, aisladas de leche de cabra de dos cuencas lecheras (Valles Templados y Valles Áridos y Quebradas). La presencia de sustancias
antimicrobianas se detectó mediante la técnica de difusión en agar
frente a cepas de Listeria monocytogenes, Stpahylococcus aureus
y Bacillus cereus como bacterias indicadoras. La inocuidad de las
cepas se determinó según las siguientes pruebas: susceptibilidad
a vancomicina, actividad hemolítica e hidrólisis de gelatina. La
respuesta a diferentes concentraciones de vancomicina (20 mg/
ml a 1,2 µg/ml) se analizó por el método de difusión en agar de
acuerdo con las indicaciones de CLSI y los resultados se evaluaron dos de acuerdo con los patrones de prueba de susceptibilidad antimicrobiana M2-A7 de la agencia NCCLS. La actividad
hemolítica se analizó en agar Columbia adicionado con 5% (v/v)
de sangre ovina, las placas se incubaron durante 48 h a 37 °C y
la producción de ß-hemólisis se visualizó mediante la presencia
33
de halos de inhibición alrededor de las colonias. El ensayo de
gelatinasa se realizó en agar Todd-Hewitt, suplementado con
gelatina (30 g/l). Luego de 48 h de incubación a 37°C se determinó si eran gelatinasa positiva por la pérdida de turbidez alrededor de las colonias al revelar las placas con la solución de desarrollo (15%v/v HgCl2 en HCl 20%v/v). Resultados: Los resultados obtenidos mostraron que el 95% de las cepas estudiadas fueron sensibles a vancomicina, y solo dos cepas presentaron resistencia. De las 40 cepas analizadas sólo 3 presentaron actividad
hemolítica. El ensayo de gelatinasa arrojó resultados negativos.
El análisis de la síntesis de sustancias antimicrobianas reveló que
de ambas cuencas lecheras se aislaron y seleccionaron cepas
productoras de sustancias con efecto inhibitorio sobre L.
monocytogenes, S. aureus ATCC29213 y B. cereus C1. Cabe
destacar que las cepas con mayor potencial antimicrobiano procedieron de la cuenca lechera del Valle de Lerma (8 cepas) y en
menor cuantía (3) de Amblayo. Ninguna de ellas presentó algunos de los factores de virulencia analizados. Conclusión: Los resultados obtenidos permitirán realizar una selección de cepas con
potencial tecnológico e inocuas, útiles para diseñar un fermento
lácteo cuidando la salud humana.
P23 - 27853 CO-APLICACIÓN NASAL DE UN ANTÍGENO DE
NEUMOCOCO Y UNA CEPA PROBIÓTICA: EFECTO PROTECTIVO FRENTE A UNA INFECCIÓN RESPIRATORIA POR S.
pneumoniae. VINTIÑI, ELISA (1,2); MEDINA, MARCELA (1,3)
(1) CERELA, (2) Facultad de Agronomía - UNT, (3) Facultad
de Bioquímica, Química y Farmacia - UNT.
Streptococcus pneumoniae continúa siendo causa de una elevada morbi-mortalidad a nivel mundial a pesar de la existencia de
antibióticos y de vacunas. Las vacunas disponibles, a polisacárido23 valente (PPV) y conjugadas (PCV, 7 ó 13 valente), no constituyen una solución definitiva debido a su baja inmunicidad (PPV)
o a su elevado costo (PCV).La vía de ingreso del patógeno es a
través de mucosa nasal, por ello las vacunas de mucosas representan una alternativa promisoria para lograr una protección efectiva del huésped. El empleo de proteínas serotipo independientes constituye una interesante opción para el desarrollo de nuevas vacunas contra el neumococo. La proteína protectora A
(PppA) es una proteína conservada en varios serotipos que demostró ser efectiva en la prevención de una infección respiratoria por el patógeno en ratones inmunizados nasalmente. El empleo de adyuvantes asociados a proteínas es necesario para lograr una protección adecuada. Las bacterias lácticas con propiedades inmunomoduladoras podrían ser empleadas como
adyuvantes y, en combinación con proteínas específicas, resultarían efectivas en la prevención de infecciones neumoccócicas.
Objetivo: Evaluar la inmunidad específica a nivel nasal y pulmonar
y el efecto protectivo inducido por la co-administración nasal de
PppA y Lactobacillus casei (Lc) frente a una infección respiratoria con S. pneumoniae. Ratones (r) albino-suizos de 3 semanas
fueron inmunizados por vía nasal (N) con Lc (109UFC/d/r)+PppA,
en 3 dosis sucesivas con intervalos de 2 semanas entre sí. Los
días 0, 28, 42, 58 y 73 se tomaron muestras de lavado
broncoalveolar (BAL) y nasal (LN).Los controles recibieron PBS,
PppA y Lc. Determinaciones:1) Detección de anticuerpos específicos anti-PppA de tipo IgA e IgG. 2) Citoquinas:IL-4 e INF-gamma
por ELISA.3) Colonización nasal, pulmonar y sistémica: Ratones
inmunizados con Lc+PppA fueron desafiados por vía nasal con
neumoccoco serotipo 14 a los 15 días posteriores a la 3° inmunización. Al cabo de 48 h los animales fueron sacrificados y se
evaluó la colonización nasal (CN) y pulmonar (CP) con el patógeno; además se realizaron hemocultivos. Resultados: La co-administración de PppA+Lc redujo la CN y CP y evitó el pasaje a
sangre del neumococo. Ello estaría asociado a los niveles de
anticuerpos anti-PppA en LN y BAL significativamente mayores
en el grupo PppA+Lc en comparación con el control que recibió
PppA sola (Día 42=IgA:BAL:p<0,01;NAL:p<0.01; IgG:BAL p<0,01;
NAL:p<0.05). Además, PppA+Lc incrementó la producción de IL4 (respuesta Th2) e INF-gamma (respuesta Th1) en BAL y LN en
comparación a los controles (BAL:día42, pg/ml=IL-4: PBS:
65,4±4,2;PppA:89,5±5,7; PppA+Lc:278,2±15,3;Lc:115,9±7,9; INF-
34
gamma: PBS:70,4±3,8; PppA:78,45±4,8; PppA+Lc: 245,4±17,2;
Lc:123,8± 6,5). Conclusiones: La co-aplicación nasal de una cepa
probiótica con la proteína PppA de neumococo, induce la
estimulación de la respuesta inmune adaptativa a nivel de mucosa respiratoria con producción de anticuerpos protectores y activación de células Th1 y Th2. La combinación de PppA con Lc
como adyuvante de mucosas, resultaría una alternativa efectiva
para el desarrollo de vacunas nasales destinadas a la prevención
de las infecciones por neumococo
P24 - 27854 LIOFILIZACIÓN Y PROPIEDADES BENÉFICAS DE
CEPAS POTENCIALMENTE PROBIÓTICAS, PARA SU INCLUSIÓN EN EL DISEÑO DE PRODUCTOS PARA PREVENCIÓN DE
MASTITIS EN BOVINOS. ESPECHE, M CAROLINA; NADER
MACIAS, M ELENA
Centro de Referencia para Lactobacilos – CERELA - CONICET
Mastitis (MB) es una de las enfermedades de mayor relevancia y consecuencias económicas que afectan al ganado bovino.
Su prevención y tratamiento se basan principalmente en el uso
de antimicrobianos, lo que lleva a la aparición de sus residuos
en leche y a un incremento de resistencia cruzada. Una alternativa novedosa frente al uso de antibióticos es la aplicación de
productos probióticos (PP) conteniendo microorganismos benéficos. En el diseño de un PP, además del estudio de las propiedades benéficas (PB) y funcionales de las bacterias probióticas,
es necesario evaluar sus propiedades tecnológicas, que incluyen la obtención de biomasa, la resistencia a la liofilización y la
conservación de las PB luego de la aplicación de los diferentes
procesos. Por ello, los objetivos del presente trabajo fueron determinar la resistencia al proceso de liofilización de cuatro cepas potencialmente probióticas aisladas de glándula mamaria
usando tres lioprotectores diferentes y determinar si se mantienen sus PB luego del proceso. Lactococcus lactis CRL1655 (productor de nisina) Enterococcus mundtii CRL1656 (productor de
mundticina), Lactobacillus plantarum CRL1716 y L. perolens
CRL1724 (cepas hidrofóbicas) aisladas previamente de muestras de leche cruda y seleccionadas en base a sus propiedades
fueron subcultivadas en caldo MRS a 37 °C. El grado de hidrofobicidad se determinó por partición en hexadecano y el título de las bacteriocinas por difusión en placa de los sobrenadantes de L. lactis y E. mundtii usando como indicadoras L.
plantarum CRL691 y L. innocua 7 respectivamente. El pellet
obtenido por centrifugación de los cultivos activos fue lavado con
agua destilada estéril, y resuspendido en los lioprotectores (volumen 10 veces menor que el original). Los protectores usados
fueron leche descremada 6%, leche descremada 6% con 12%
de lactosa (LL) y concentrado proteico lácteo (CPL) 10%. Se usó
agua destilada como control. Las suspensiones fueron luego
liofilizadas y se registró el peso y las características físicas de
los productos. Los liofilizados se resus-pendieron en agua
peptona durante 10 minutos y fueron subcul-tivados en MRS a
37 °C durante 24h para cuantificar el grado de hidrofobicidad de
las cepas y el título de bacteriocina. El número de microorganismos se determinó antes y después de la liofi-lización por
el método de diluciones sucesivas y plaqueo en MRS agar. Los
ensayos se realizaron por duplicado. El número de microorganismos después de la liofilización fue diferente según la cepa
y el lioprotector empleado, registrándose diferencias de entre una
y cuatro unidades logarítmicas. No se detectaron cambios en las
PB evaluadas después del proceso de liofilización. Las mejores
características de los sólidos fueron obtenidas con LL y CPL. Los
resultados obtenidos permiten avanzar en el diseño de un PP
preventivo de MB y seleccionar las mejores condiciones de
liofilización de cada microorganismo, lo que resulta característico de cepa. Se evaluará su sobrevida durante periodos más
prolongados de tiempo y a diferentes temperaturas de conservación, a fin de disponer de un producto aplicable en el campo.
P25 - 27857 EFECTO ANTAGÓNICO DE CEPAS Lactobacillus
kefir SOBRE LA ACCIÓN CITOTÓXICA DE Bacillus cereus SOBRE CÉLULAS EN CULTIVO. ROLNY, IVANNA(1,2); CARASI,
PAULA(1); MINNAARD, JESSICA(1); PEREZ, PABLO(1,2);
SERRADELL, MARIA(1)
(1) Cátedra de Microbiología, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata. (2) CIDCA - CCT CONICET.
El kefir es una leche fermentada probiótica que contiene
microorganismos de diferentes géneros y especies. Nuestro laboratorio cuenta con cepas de Lactobacillus kefir aisladas de gránulos de kefir, las cuales están siendo estudiadas desde el punto
de vista de sus características probióticas, entre las que se encuentra la capacidad de inhibir la acción de microorganismos
patógenos. Bacillus cereus es un patógeno que produce tanto
infecciones intestinales como extra intestinales y parte de su virulencia se debe a la secreción de factores extracelulares que
afectan la estructura y función de las células eucarióticas. El objetivo del presente trabajo fue estudiar la capacidad de diferentes cepas de L. kefir (CIDCA 83115, CIDCA 8345 y CIDCA 8348)
de inhibir la acción de los factores extracelulares de B. cereus
sobre células en cultivo. Los ensayos de citotoxicidad se realizaron sobre monocapas de células Vero (fibroblastos de riñon de
mono) y Caco-2 (células epiteliales intestinales humanas), empleando el sobrenadante estéril de cultivo de la cepa T1 en fase
estacionaria temprana. El mismo fue preincubado en presencia o
no de las 3 cepas de L. kefir (DO=4.0 y 8.0) durante 1 hora a 37
°C. Posteriormente las bacterias fueron separadas por centrifugación 10 min a 13000 rpm. Diluciones seriadas de los sobrenadantes fueron incubadas sobre las células durante 1 h a
37°C. El efecto citotóxico se evaluó cuantificando el desprendimiento celular mediante la técnica de tinción con cristal violeta.
Los sobrenadantes de B. cereus preincubados con L. kefir presentaron una menor actividad biológica. Este efecto fue dependiente de la cepa de L. kefir estudiada y de la concentración de
bacterias presentes. Las tres cepas estudiadas mostraron efecto
antagónico de la acción de los sobrenadantes sobre ambas líneas
celulares, siendo mayor la inhibición al emplear suspensiones
bacterianas de DO=8.0. En estas condiciones, las cepas CIDCA
8345 y CIDCA 8348 mostraron un efecto antagónico mayor que
la cepa CIDCA 83115 (aumento de entre el 75-90% en la concentración de sobrenadante necesaria para producir el 50% de
desprendimiento celular). Los resultados obtenidos hasta el momento sugieren que estas cepas de L. kefir interactúan con los
factores de virulencia extracelulares de B. cereus de manera de
disminuir el efecto nocivo sobre las células eucarióticas. El efecto podría deberse a la adsorción de toxinas o a la modificación
de la actividad debido a componentes o actividades metabólicas
bacterianas.
P26 - 27891 EFECTO INHIBITORIO DE PROTEÍNAS DE CAPA-S
DE Lactobacillus kefir SOBRE LA ACCIÓN IN VITRO DE TOXINAS DE Clostridium difficile. CARASI, PAULA (1); TREJO, FERNANDO(2); DE ANTONI, GRACIELA(1,2); PEREZ, PABLO(2);
SERRADELL, MARIA(1)
La Plata, Buenos Aires, Argentina
La Capa-S es una estructura cristalina macromolecular (glico)proteica que recubre la superficie de bacterias de diferentes géneros y especies. Se le han atribuido diferentes funciones, entre
las que se encuentra la participación en procesos de adhesión y
en la protección contra patógenos. Nuestro laboratorio cuenta con
cepas potencialmente probióticas de Lactobacillus kefir, cuyas
proteínas de Capa-S muestran una gran heterogeneidad estructural y confieren diferentes propiedades superficiales a las células enteras. Clostridium difficile es un bacilo Gram-positivo causante de diarreas asociadas al uso de antibióticos, y sus principales factores de virulencia son las toxinas A y B. El objetivo del
presente trabajo fue estudiar la capacidad inhibitoria de proteínas
de Capa-S provenientes de cepas de Lactobacillus kefir sobre la
acción de las toxinas de Clostridium difficile sobre células en cultivo. Se realizaron ensayos de citotoxicidad sobre monocapas de
células Vero (fibroblastos de riñón de mono), empleando el
sobrenadante de cultivo de una cepa de C. difficile como fuente
de toxinas A y B. Las células fueron incubadas con diluciones
seriadas del sobrenadante de C. difficile durante 16 h a 37 °C y
5% de CO2 en presencia o no de proteínas de Capa-S provenientes de 4 cepas de L. kefir (0,05-0,15 mg/ml) o de las respectivas
bacterias enteras (DO=4 y 8). El efecto citotóxico se determinó
cuantificando el desprendimiento celular mediante la técnica de
tinción con cristal violeta. Se evaluó la influencia de la
preincubación sobrenadante C. difficile - Capa S/bacteria durante 1 hora a 37 °C sobre la capacidad inhibitoria. La capacidad de
unión de toxinas por las bacterias enteras se analizó mediante dotblot con anticuerpos específicos anti-toxinas A y B. En primer lugar, sólo las proteínas de Capa-S fueron capaces de ejercer un
efecto antagónico, mientras que no se observó inhibición al realizar los ensayos de citotoxicidad con las bacterias enteras. Sin
embargo, se observó interacción entre las bacterias y las toxinas
A y B mediante dot-blot. De las 4 proteínas de Capa-S estudiadas, la cepas CIDCA 83115 y CIDCA 8348 fueron las que ejercieron un efecto antagónico mayor (se duplica la concentración
de sobrenadante necesaria para producir el 50% de desprendimiento celular), mientras que las proteínas provenientes de las
cepas CIDCA 8321 y CIDCA 8345 no fueron capaces de inhibir
significativamente el efecto citotóxico. A su vez, la preincubación
del sobrenadante de C. difficile con las proteínas de Capa-S potenció el efecto inhibitorio ejercido. Estos resultados sugieren que
las proteínas de superficie (Capa-S) están implicadas en los mecanismos de inhibición de la acción citotóxica de C. difficile por
cepas probióticas de L. kefir, los que a su vez dependen de la
estructura de dichas proteínas.
P27 - 27893 LA HAPTOGLOBINA COMO MARCADOR DE LA
HABILIDAD DE LAS BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS PARA INTERFERIR FRENTE A LA INFECCIÓN DE Salmonella Dublin
EN UN MODELO HIPERAGUDO EN TERNEROS JÓVENES.
FRIZZO, LAUREANO SEBASTIÁN; SOTO, LORENA PAOLA;
ZBRUN, MARIA VIRGINIA; MARTI, LUIS ENRIQUE; SEQUEIRA,
GABRIEL JORGE; DALLA SANTINA, RODOLFO; ROSMINI,
MARCELO RAUL
Facultad de Ciencias Veterinarias - UNL
El uso de los microorganismos indígenas con propiedades
probióticas es una alternativa preventiva y terapéutica frente a las
enfermedades de los animales. El modelo experimental de enfermedad intestinal puede ser utilizado para evaluar el efecto
probiótico frente a la acción de un patógeno. La haptoglobina
podría ser un indicador apropiado para medir el efecto probiótico
y aunque su utilidad como marcador de severidad de infección ha
sido estudiada en modelos experimentales de Salmonella, el beneficio que puede tener en los terneros suplementados con bacterias ácido lácticas (BAL) y desafiados con Salmonella no ha sido
estudiado. El objetivo de este estudio fue evaluar la utilidad de la
haptoglobina como marcador de la habilidad de las BAL y la
lactosa para interferir frente a una infección de Salmonella dublin
en un modelo hiperagudo en terneros jóvenes. Se utilizaron 15
terneros divididos en 3 grupos: un grupo control (G-C), un grupo
inoculado con BAL (G-BAL) y un grupo inoculado con BAL y
lactosa (G-BAL-L). El inóculo probiótico experimental formado por
Lactobacillus casei DSPV 318T, L. salivarius DSPV 315T y
Pediococcus acidilactici DSPV 006T fue administrado junto con
el sustituto lácteo. Los dos grupos inoculados con BAL recibieron una dosis diaria de 109 UFC/kg de peso vivo de cada una de
las cepas a lo largo del experimento. La lactosa fue otorgada al
G-BAL-L a una dosis de 100 g/d. El patógeno fue administrado a
todos los animales al día 11 del experimento a una dosis única
de 2 1010 UFC. Se realizaron determinaciones de Salmonella en
heces al inicio del experimento, antes de la infección con el patógeno y en los órganos diana (hígado, bazo, nódulo linfático
mesentérico e ileocecal). Después de 10 días de administradas
las BAL y antes de la infección con el patógeno los animales de
todos los grupos tuvieron niveles de haptoglobina dentro de los
valores normales (<100 ng/ml). Aunque 2 d después de la introducción del patógeno los terneros de todos los grupos tenían niveles anormales de haptoglobina en suero, fueron encontradas
35
diferencias significativas entre el G-C y los grupos inoculados con
BAL. Así, durante el día 13 del experimento, el G-C mostró un promedio de 520,6 µg/ml, mientras el G-BAL mostró 159,3 µg/ml y el
G-BAL-L 109,4 µg/ml. La concentración de haptoglobina mostró un
pico después de 2 d de la inoculación con el patógeno reflejando
así la severidad de la infección. Todos los terneros fueron negativos a Salmonella en heces tanto antes de comenzar el ensayo
como antes de la infección. La detección de Salmonella en los órganos del medio interno no estuvo relacionada con la administración del inóculo probiótico. La haptoglobina fue una buena herramienta para discriminar entre los grupos experimentales. Aunque
la administración del probiótico no fue capaz de retrasar la llegada
del patógeno a los órganos diana, es evidente que el inóculo alteró la respuesta de los animales frente al ataque del patógeno debido a la menor severidad de la infección indicada por los valores
menores de haptoglobina en los grupos tratados con BAL.
P28 - 27903 ISOLATION OF BACTERIOCIN-PRODUCING
Lactobacillus sakei WITH ANTI-LISTERIAL ACTIVITY FROM
ITALIAN TYPE SALAMI. SOUZA BARBOSA, MATHEUS;
JUNQUEIRA DE CAMARGO, RITA; DIMITROV TODOROV,
SVETOSLAV; D G M FRANCO, BERNADETTE
Universidad de San Pablo
Introduction: Bacteriocins produced by lactic acid bacteria
(LAB) are ribosomally-synthesized peptides usually active against
closely related species. They have been applied for control of
pathogenic bacteria such as Listeria monocytogenes, isolated from
a wide range of sources, including meat products, in particularly
dry-fermented products. Application of bacteriocinogenic LAB can
be an alternative to increase the safety of products, as they are
normally consumed raw. Objective: The purpose of this work was
to isolate new bacteriocin producing LAB from Italian type salami
with activity to L. monocytogenes. Materials and methods:
Bacteriocinogenic strains were isolated using the triple layer and
agar spot tests. Strains MBSa1 and MBSa4 were identified using
biomolecular techniques (PCR). Both strains were tested for
antimicrobial activity against a variety of LAB, Listeria spp, human
and food pathogens. Stability of produced bacteriocins were
studied in presence of enzymes, 1% Tween 20, Tween 80, Triton
X-100 or urea, 1% to 10% NaCl, various pH and temperatures
levels. Results: Two isolates named MBSa1 and MBSa4 were
isolated from Italian type salami produced in Brazil and identified
as Lactobacillus sakei based on 16S rDNA sequencing. For both
strains the complete inactivation of antimicrobial activity were
observed after treatment of the cell-free supernatant with
proteinase type XIV, a-chymotrypsin and pepsin, but not when
treated with 1% Tween 20, Tween 80, TritonX-100 or urea. No
changes in bacteriocins activity were recorded after 1h or 2h of
incubation in the temperatures of 4°-100° C or at 121° C by 15
min. The values of pH 2.0 to 6.0 did not influence the activity, but
the two bacteriocins were affected when exposed to pH 8.0 and
10.0. The presence of 1% to 10% NaCl did not influence the
antimicrobial activity of bacteriocins produced by MBSa1 and
MBSa4. The bacteriocins produced by L. sakei MBSa1 and L.
sakei MBSa4 inhibit the growth of Listeria welshimeri, L.
monocytogenes, Enterococcus faecalis, Enterococcus hirae,
Enterococcus faecium and Lactobacillus sakei subsp. sakei 2a, in
addition bacteriocin MBSa4 inhibited the growth of Staphylococcus
aureus. Maximal production (1600 AU/mL) was obtained at 25° C
in MRS broth after 20 h and after 22 h of incubation for MBSa1
and MBSa4, respectively. Conclusion: Results suggest that this
strain has a potential application as an additional hurdle for
ensuring the safety of salami. Further purification of the produced
bacteriocins will help to evaluate its effectiveness for the control
of pathogens in this product.
P29 - 27942 PROCEDIMIENTOS PARA DETECCIÓN DE PRODUCCIÓN DE EXOPOLISÁCARIDOS MICROBIANOS. APLICACIÓN A SELECCIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS DE USO
ALIMENTARIO. ARZAC, MARCELA ALEJANDRA; ERASO, JOSE
ALBERTO; GONZALEZ, RUBEN DARIO
36
Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba
Los microorganismos pueden sintetizar y almacenar polisacáridos en su citoplasma, para formar parte de la estructura de la
pared, o secretarlos por fuera de la membrana como cápsula o
dispersos a partir de ésta hacia el medio. Estos polímeros
microbianos tienen interés industrial como espesantes, gelificantes, agentes de suspensión o coloides protectivos. Los exopolisacáridos (EPS) producidos por bacerias lácticas (BAL) son utilizados en la industria alimentaria como aditivo, a fines de otorgar características reológicas deseables. Algunos EPS merecen
también atención por sus efectos benéficos a la salud humana.
En este trabajo se ensayaron técnicas cualitativas y cuantitativas
para selección de cepas BAL como potenciales productoras de
EPS, a los fines de una posible aplicación a la selección de cepas. Se utilizaron 39 aislados, que se incubaron en medio APTGm
(24 h; 37 °C) y se inocularon en medio leche (48 h; 37 °C). Los
ensayos se efectuaron por triplicado. Se ensayaron los siguientes procedimientos: detección de cápsula con la coloración de
Muir, tinción de colonias crecidas en APTG con rojo Rutenio,
tinción de biopelícula con cristal violeta y observación de sinéresis, consistencia o filancia en cultivos en leche. Estos precedimientos se compararon respecto al resultado de producción de
EPS expresado como peso seco, mediante el procedimiento de
precipitación alcohólica y secado a 37 °C, de muestras de cultivos en leche, previamente desproteneizadas con solución de TCA
10%. Este procedimiento se consideró de referencia dado su carácter cuantitativo. A los fines de la comparación con los ensayos cualitativos, los valores obtenidos de concentración EPS fueron distribuídos en las siguientes categorias: < 20, 21 a 40 y > 40
mg/ml. Cada una de las metodologías ensayadas se correlacionó
con los valores obtenidos con el procedimiento de referencia,
aplicándose análisis estadístico de Chi Cuadrado con un nivel de
significancia de 0,05 y valor de p de 0,45. El mayor número de
cepas tuvo un valor de EPS menor que 20 mg/ml (92,5% del total). Se concluye que para los aislados ensayados no hubo correlación entre la concentración de EPS expresado como peso
seco y el resultado de los procedimientos de detección mencionados y los cambios reológicos de los cultivos en leche. A los fines prácticos de aplicación a screening, se propone realizar el
cultivo de los aislados en leche para observar la formación de
filancia, seguido de determinación cuantitativa de EPS usando el
procedimiento de referencia mencionado.
P30 - 27944 ESTUDIO DE LA POTENCIALIDAD PROBIOTICA
DE LEVADURAS AISLADAS DE KEFIR. ROMANIN, DAVID(1);
DIOSMA, GABRIELA(2); RUMBO, MARTIN(1); GARROTE,
GRACIELA(2)
(1) Laboratorio de Investigaciones del Sistema Inmune (LISIN). (2)
Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos (CIDCA, UNLP-CONICET)
Las levaduras han sido utilizadas por el hombre durante miles de años para la fabricación de pan y bebidas alcohólicas, antes
que se supiera que eran microorganismos y se conocieran las
particularidades del proceso de la fermentación. En la actualidad,
constituyen uno de los grupos de microorganismos más empleados en la industria alimentaria y farmacéutica. Existe experiencia
en el uso de levaduras como suplemento alimentario con el fin
de mejorar el crecimiento y salud de animales, sin embargo, la
utilización de levaduras como probióticos es un concepto relativamente nuevo. Se conoce que los probióticos pueden actuar por
diversos mecanismos pero al momento de seleccionar nuevas
cepas se establecen dos condiciones importantes: debe sobrevivir en el ambiente gastrointestinal y presentar por lo menos una
función beneficiosa. Entre estas, pueden mencionarse producción
de compuestos antimicrobianos, competencia con patógenos por
los nutrientes, modulación de células inmunes, efectos antimutagénico y/o antitumoral, reducción del colesterol sérico y adsorsión de micotoxinas. El objetivo del presente trabajo fue estudiar
la potencialidad probiótica de una colección de 40 levaduras aisladas de kefir e identificadas previamente en nuestro laboratorio.
Se estudió in vitro la capacidad de los aislados de mantener su
viabilidad luego de ser sometidos a condiciones ácidas (pH 2,5)
durante 2 hs a 37 °C, resultando 28 de ellos capaces de mantener el 60% de su concentración inicial. A estas cepas se las desarrolló en presencia de sales biliares (bilis de buey al 1%) y el
75% mostraron ser altamente resistentes. En base a estas características, que le permitirían resistir el pasaje por el tracto
gastrointestinal se seleccióno Kluyveromyces marxianus CIDCA
8154 y se realizaron ensayos in vivo que demostraron que dicha
levadura se recupera viable después de atravesar el tracto
gastrointestinal tanto de ratones BALB/c como de hámsters. Se
estudió la capacidad de modulación de la respuesta innata en
mucosas. Se demostró que distintas especies inhiben el efecto
de la activación de células Caco-2 con flagelina, la cual usualmente genera una respuesta proinflamatoria. Esta observación fue
realizada tanto en un sistema reportero (Caco-2 ccl20:luciferasa),
como por determinación de la expresión del mRNA de las
quemoquinas CCL20, CXCL-8 y CXCL-2. Se analizó la capacidad
de sobrenadantes de cultivo de K. marxianus CIDCA 8154 y
Saccharomyces cerevisiae CIDCA 8112 y CIDCA 81103 para inhibir el desarrollo de Clostridium diffícile, no observándose disminución del crecimiento del patógeno. Sí pudo detectarse que la
preincubación de enterocitos en cultivo con las levaduras disminuye entre un 55-75% la capacidad de adhesión del patógeno.
Se observó también una disminución del daño producido en células Vero en cultivo al ser tratadas con sobrenadantes de C.
difficile desarrollado en medio condicionado por el crecimiento de
levaduras. Conclsión: En función de los resultados obtenidos podemos afirmar que dentro de las colección de cepas de levaduras aisladas de gránulos de kefir, existen candidatos con cualidades interesantes para ser empleados como microorganismos
probióticos.
P31 - 27951 ANALISIS DE CEPAS AISLADAS DE FERMENTACION NATURAL DE ACEITUNAS. SEGUIMIENTO DE FERMENTACION CONTROLADA. DE LA FUENTE, AC(1); FONT DE
VALDEZ, G (1,2); GARRO, MS(1)
(1) Centro de Referencia para Lactobacilos (CERELA-CONICET),
(2) Cátedra de Microbiología Superior. Facultad de Bioquímica,
Química y Farmacia, Universidad Nacional de Tucumán (UNT)
La fermentación de aceitunas es una práctica tradicional en
diferentes regiones de nuestro país. La fermentación natural ocurre espontáneamente por las bacterias lácticas (BAL) presentes
en la epidermis de los frutos, la microflora es muy variada en la
primera etapa de fermentación, por lo cual la proliferación de
microorganismos no deseados atentarían contra la calidad del
producto final y una considerable proporción de la producción
podría terminar deteriorándose debido a éstos microorganismos
y a una fermentación láctica incompleta. En Argentina prácticamente no se usan cultivos iniciadores y los escasamente disponibles son extranjeros, los cuales no se adaptan favorablemente
al ecosistema, por lo que es de gran importancia el desarrollo de
fermentos regionales. En estudios previos aislamos cepas de BAL
de diferentes fases de fermentaciones naturales de aceitunas provenientes de La Rioja; seleccionamos seis cepas de lactobacilos
en base a criterios tecnológicos. El objetivo de este trabajo fue
identificar las cepas seleccionadas, evaluar compatibilidad entre
ellas, producción de enzimas (beta-glucosidasa) y comportamiento
en diferentes medios económicos con el objeto de diseñar y aplicar un fermento en la producción de aceitunas de mesa. Para la
identificación se usaron métodos bioquímicos y moleculares. La
producción de enzimas fue evaluada por el test de API Zym y betaglucosidasa mediante el test de arbutina en placas agarizadas.
Se evaluó el comportamiento de las cepas en medio de cultivo
con diferentes fuentes de carbohidratos. Se formularon y evaluaron distintos medios de cultivos económicos teniendo en cuenta
los nutrientes necesarios para el desarrollo de las cepas seleccionadas y la obtención de mayor biomasa. El fermento seleccionado fue inoculado en un cultivo en lote tamaño laboratorio, usando una proporción de aceituna /salmuera de 62,5% / 37,5%. Se
midieron parámetros fisicoquímicos (pH, NaCl, temperatura, azúcar residual, acidez titulable y combinada (o lejía residual) y
microbiológicos (microscopía directa de la salmuera y recuento de
la microbiota presente) durante el tiempo de fermentación. Cuatro cepas fueron identificadas como Lactobacillus (L) pentosus, y
las otras dos como L plantarum y L paracasei subsp paracasei.
Las cepas de L pentosus y L plantarum fueron las que presentaron mayor actividad beta-glucosidasa. Todas las cepas fueron
compatibles entre si. La evaluación de los cultivos en diferentes
fuentes de carbono y el diseño de diferentes medios de cultivos
para la producción de biomasa permitió seleccionar un cultivo iniciador. La evolución de los microorganismos durante la fermentación fue similar en el ensayo y en el control, los parámetros físico-químicos mostraron un mayor ajuste en el caso del cultivo
inoculado. El uso de un cultivo iniciador y condiciones controladas de fermentación permitió obtener un producto fermentado con
mejores características físico-químicas y microbiológicas que el
control sin inocular.
P32 - 27980 MASAS ÁCIDAS DE TRIGO-CENTENO. INFLUENCIA DE LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDOS DE Pediococcus
pentosaceus Y Lactobacillus fermentum SOBRE EL GLUTEN.
SAIZ, IVONE; IURLINA, MIRIAM; FRITZ, ROSALIA
Universidad Nacional Mar del Plata
La utilización de bacterias lácticas en la elaboración de masas panificables a través del método conocido como “sourdough”
o masa ácida mejora las características organolpéticas y propiedades de preservación. La producción de ácidos láctico y/o acético es la característica principal de la flora láctica, y se sabe del
impacto que puede tener sobre la conformación de las proteínas
del gluten. El medio ácido favorece la reducción de enlaces
disulfuro intra e intermoleculares y contribuye a solubilizar las
proteínas del gluten. Pediococcus pentosaceus y Lactobacillus
fermentum fueron evaluados en su capacidad para afectar la red
de gluten. Se preparó una masa harina de trigo-harina de centeno 50:50% y se fermentó durante un período de 19 horas. A intervalos de tiempo de 6 horas fueron extraídas muestras de masa.
Se midieron el pH y la acidez titulable (TTA) por potenciometría
y las concentraciones de ácidos láctico y acético y de etanol por
cromatografía gaseosa con detector de ionización de llama (FID)
y columna polar ECTM1000 (Alltech). Las modificaciones sobre
el gluten al final de la fermentación fueron evaluadas usando
microscopía electrónica de barrido (SEM). Pediococcus pentosaceus fue el acidificador más rápido alcanzando un pH de 4,5 a
las 6 horas de fermentación, en tanto Lactobacillus fermentum
alcanzó este pH luego de 12 horas. Las cantidades de ácidos láctico y acético fueron respectivamente 4,17 y 0,297 g/kg de masa
para Pediococcus pentosaceus y 5,86 y 1,04 g/kg de masa para
Lactobacillus fermentum. Las micrografías mostraron que las
masas fermentadas con Pediococcus pentosaceus tuvieron una
matriz de gluten con una conformación estructural tridimensional
en forma de hebras. Las masas fermentadas con Lactobacillus
fermentum en cambio no mostraron una matriz cohesiva observándose una película de gluten sin continuidad. Las características de acidificación de diferentes bacterias lácticas favorecen distintas conformaciones de gluten. El descenso rápido de pH y una
producción de ácidos moderada promueven una matriz de gluten
cohesiva con mayores propiedades de elasticidad.
P33 - 28041 CRECIMIENTO Y FERMENTACIÓN DE OLIGOSACÁRIDOS CON POTENCIAL PREBIÓTICO POR PROPIONIBACTERIAS LÁCTEAS. ZARATE, G (1); PALACIOS, J(1);
VALENZUELA AVILA, A(2); GENTINA, JC(2); POIRRIER, P(2);
ZUÑIGA HANSEN, ME(2); PEREZ CHAIA, A(2)
(1) Centro de Referencia para Lactobacilos - CERELA, (2) Escuela
de Ingeniería Bioquímica - PUCV
En las últimas décadas el desarrollo de alimentos prebióticos,
probióticos y simbióticos ha crecido significativamente debido a
la alta demanda de “alimentos saludables”. El Laboratorio de
Ecofisiología Tecnológica de CERELA cuenta con una extensa
trayectoria en el estudio de microorganismos probióticos para
consumo humano y animal. En este sentido, hemos demostrado
37
el potencial probiótico de cepas lácteas del género Propionibacterium usadas comúnmente como cultivos iniciadores para la
industria quesera. El Centro Regional de Estudios en Alimentos
Saludable (CREAS) y la EIB-PUCV, estudian actualmente la recuperación de compuestos bioactivos y extractos de oligosacáridos con potencial prebiótico a partir de diferentes tipos de
berries propios de la región, buscando desarrollar un proceso
biotecnológico innovador para la recuperación de estos compuestos a partir de los descartes de su procesamiento industrial. En
este contexto, el objetivo del trabajo fue evaluar el efecto de
oligosacáridos usados comercialmente como prebióticos y extractos de berries de la industria chilena a los fines de desarrollar un
posible simbiótico. La obtención de extractos se realizó usando
como materia prima, pomasa de berries (frambuesa), la cual corresponde al residuo generado en el proceso de extracción del
jugo (comprende restos de pulpa, semillas, cáscara). La composición proximal de esta materia se determinó mediante los ensayos establecidos por la AOAC. Extractos hemicelulósicos y
pectínicos se obtuvieron a partir de este material mediante tratamientos secuenciales con diferentes enzimas (amiloglucosidasa,
tripsina, pectinasa). El crecimiento y fermentación de estas fracciones y otros polímetros con potencial prebiótico (inulina,
polidextrosa, goma) por P. freudenreichii CRL 757 y P. acidipropionici Q4 y ATCC 4875 fue determinado turbidimétricamente, por recuento de microorganismos en placa y cromatografía gaseosa respectivamente. Los microorganismos ensayados, fueron capaces, en diferente medida, de fermentar fibras
dietarias insolubles (hemicelulosa) y fibras solubles de cadena
corta (polidextrosa, inulina) y de cadena larga (pectina, goma). En
todos los casos la mayor biomasa final se obtuvo en presencia
de glucosa (control), seguido por un buen crecimiento en los
medios adicionados con inulina y pectina (aprox 109 UFC/mL). Un
crecimiento más bajo y similar en ambos, se observó a expensas
de polidextrosa y hemicelulosa (aprox 108 UFC/mL). La menor
biomasa final se observó para todos los microorganismos en presencia de goma como fuente de carbono. En cuanto a la fermentación, las proporciones de ácidos propiónico y acético producidos variaron en función del sustrato; observándose una relación
aproximada de 2-2,5:1 para la fermentación de polidextrosa y
goma, pero una mayor proporción de propiónico: acético cuando
se consumió glucosa (4:1); pectina (3,5:1) hemicelulosa e inulina
(3:1). En base a los resultados obtenidos se estudia actualmente
el efecto de pectinas de otros frutos sobre propionibacterias y
componentes de la flora intestinal.
P34 - 28090 EL FACTOR TRANSCRIPCIONAL SPO0A DE
Bacillus subtilis POSEE UN ROL CENTRAL EN LA ACTIVACIÓN
DEL SISTEMA DEL COMPLEMENTO Y EXCLUSIÓN COMPETITIVA DE PATÓGENOS BACTERIANOS. GOÑI, ANIBAL; SABALL,
ESTRE; SALVARREY, MARCELA; ROVETTO, ADRIAN; GRAU,
ROBERTO
Facultad de Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de
Rosario. Laboratorio de Microbiología e Inmunología. CONICETRosario.
El interés en las esporas bacterianas, más allá de los aspectos básico y clínico, se ha orientado recientemente a su utilización como probióticos no-refrigerados para humanos y animales.
La bacteria Gram positiva, formadora de esporas, categoría
GRAS, Bacillus subtilis representa el paradigma de estudio en
estos aspectos. En nuestro laboratorio tratamos de elucidar el
mecanismo molecular del efecto probiótico de B. subtilis, en particular su rol en la activación de la inmunidad innata. En este trabajo presentamos los resultados obtenidos in vitro en cultivos
celulares y modelo animal (rata y pollo) sobre la regulación del
sistema del complemento y exclusión de patógenos por B. subtilis.
La medición in vitro de la actividad de las tres vías (clásica, alternativa y lectinas) del complemento evidenciaron que el regulador
transcripcional Spo0A es esencial para la activación del complemento por cualquiera de sus vías. Mutantes spo0A de B. subtilis
(obtenidas por transformación con ADN genómico de células competentes) fueron incapaces de activar C3, primer evento bioquímico de la activación del complemento. Por su parte cepas de B.
38
subtilis proficientes en la producción de Spo0A activaron las 3 vías
del complemento llegando hasta la instancia de la formación del
complejo C5-convertasa pero no a la unión de la proteína C9 ni
del complejo de ataque. Estos resultados sugieren que B. subtilis
es opsonizado e incorporado en macrófagos como células presentadoras de antígenos (APC) para inducir una protección
inmunológica. Estudios in vitro de cultivo celular con macrófagos
peritoneales de ratas e in vivo, en modelo animal, pollos y ratas,
alimentados con y sin suplementos de esporas de B. subtilis
(1x1010 esporas/kg de alimento), confirmaron el rol de esta bacteria como promotora del crecimiento (mayor aumento en peso,
menor morbi-mortalidad, mejor conversión alimentaria) y estimuladora del sistema inmunológico (mayor producción de
anticuerpos naturales). Células de B. subtilis proficientes en la
producción de Spo0A, pero no aquellas deficientes en Spo0A,
fueron capaces de excluir competitivamente la adherencia a proteínas de la matriz extracelular (fibornectina, colágeno, mucina) de
diversos patógenos de relevancia médica: S. aureus, S. enterica,
V. cholerae, P. aeruginosa, L. monocytogenes. Estos resultados de
exclusión competitiva de patógenos fueron corroborados por la
medición in vitro de las constantes de disociación a fibronectina
utilizando anticuerpos monoclonales anti-Fn y técnicas de ELISA.
Este estudio señala por primera vez el rol fundamental del regulador transcripcional bacteriano Spo0A sobre la activación del sistema del complemento sugiriendo un rol clave del mismo en la comunicación intercelular bacteria (probiótico) -hospedador (mamífero). Asimismo se ha puesto de manifiesto la importancia de Spo0A
en la expresión de las propiedades de superficie que permiten la
exclusión competitiva de la adherencia de patógenos bacterianos
a proteínas de matriz extracelular, un evento temprano en el desarrollo de la infección y colonización por patógenos.
P35 - 28123 APLICACIÓN DE SONDAS FLUORESCENTES PARA
EL RECUENTO DE PROPIONIBACTERIAS LÁCTEAS EN CULTIVOS MIXTOS Y MUESTRAS AMBIENTALES MEDIANTE UN
PROTOCOLO DE FISH. BABOT, JAIME DANIEL(1); APELLA,
MARIA CRISTINA (1,2); PEREZ CHAIA, ADRIANA(1,2)
(1) Centro de Referencia para Lactobacilos – CERELA CONICET, (2) Universidad Nacional de Tucumán
Antecedentes: las propionibacterias clásicas cumplen un importante papel en la industria láctea. Algunas especies, principalmente Propionibacterium freudenreichii, se usan como cultivos
iniciadores en la producción de quesos de tipo suizo como
Gruyère y Emmental. En dichos quesos, son las principales responsables de la formación de los “ojos” por la liberación de CO2
y del flavor característico por la producción de ácidos grasos volátiles tales como ácido propiónico y ácido acético, productos de
su fermentación. La enumeración de propionibacterias mediante
métodos tradicionales es lenta y requiere incubación en anaerobiosis estricta, lo que dificulta el proceso. La Hibridación Fluorescente In Situ (FISH) combina la precisión de la genética
molecular con la información visual de la microscopía que permite la identificación y recuento de microorganismos en su micro
hábitat natural. Objetivo: Determinar la eficiencia de sondas
oligonucleotídicas marcadas fluorescentemente en la detección y
enumeración de propionibacterias de una suspensión mixta con
lactobacilos y muestras de queso Gruyère comercial. Materiales
y métodos: Se mezclaron partes iguales de cultivos activos de P.
acidipropionici CRL1198 y Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus CRL958 y se determinó el número de UCF/mL mediante su recuento en medios de cultivo sólidos. La suspensión de
células fue fijada con paraformaldehído. Posteriormente, se llevó
a cabo la hibridización utilizando las sondas Pap446 y Lb158,
específicas para P. acidipropionici y el género Lactobacillus, respectivamente. Para determinar si la matriz compleja de un queso
interfiere en el recuento por la técnica de FISH, se realizó la determinación de propionibacterias en suspensiones de queso
Gruyère filtradas, fijadas con paraformaldehido e hibridizadas con
la sonda Pfr435. Paralelamente se estudió el número de estas
bacterias en el mismo queso mediante el método tradicional de
recuento en medios de cultivo sólidos, comparándose finalmente
los resultados obtenidos por ambos métodos. Resultados: Los
recuentos de P. acidipropionici y L. bulgaricus determinados mediante FISH mantuvieron la misma proporción que la obtenida por
el método tradicional de recuento en medios sólidos. Por otro lado,
las concentraciones de P. freudenreichii en queso obtenidas mediante FISH y por crecimiento en medio sólido (1,42 ± 0,1 × 109
bacteria/g y 1,02 ± 0,4 × 109 UFC/g, respectivamente) no presentaron diferencias significativas, encontrándose tales resultados en
el mismo orden que los reportados previamente por otros autores. Conclusión: El método de FISH con las sondas usadas permite la enumeración precisa de propionibacterias en queso
Gruyère, a pesar de constituir una matriz sumamente compleja,
disminuyendo el tiempo para obtener resultados y evitando además la incubación en anaerobiosis estricta.
P36 - 28140 EVALUACIÓN POR CITOMETRÍA DE FLUJO DE LA
VIABILIDAD DE BACTERIAS LÁCTICAS VÍNICAS EXPUESTAS
A UNA FRACCIÓN INHIBITORIA PEPTÍDICA DE Saccharomyces
cerevisiae. MENDOZA, LUCIA(1); FARIAS, MARTA(1,2)
(1) Centro de Referencia para Lactobacilos - CERELA, (2) Universidad Nacional de Tucumán
La fermentación maloláctica (FML) en vinos es conducida por
bacterias lácticas (BL), siendo Oenococcus oeni la principal especie involucrada. Esta fermentación secundaria es importante en
la elaboración de vinos por disminuir la acidez, lograr la estabilidad microbiana y mejorar el sabor del producto fermentado. La
FML generalmente ocurre al finalizar la fermentación alcohólica
conducida por Saccharomyces cerevisiae. Aún cuando diversas
cepas de O. oeni están adaptadas a crecer y sobrevivir en los
vinos, la viabilidad de la bacteria depende de su capacidad para
tolerar factores de estrés como acidez, etanol, SO 2 y otros
metabolitos producidos por las levaduras. En estudios previos
determinamos que S. cerevisiae mc2 ejerce una marcada actividad antagónica sobre el crecimiento de O. oeni X2L y Lactobacillus hilgardii 5w, a través de un efecto sinérgico del etanol,
SO2 y compuestos peptídicos de peso molecular 3-10 kDa. Objetivo: Evaluar mediante análisis por citometría de flujo el efecto de
los compuestos peptídicos inhibitorios producidos por S. cerevisiae
mc2 sobre la integridad celular de BL vínicas. La levadura se
cultiva en medio jugo de uva durante 6 días a 25 °C. El
sobrenadante se utiliza como medio fermentado y como control
se usa medio sin fermentar. Las BL se cultivan (10^6 ufc/ml) a
30 °C en medios sin fermentar y fermentados hasta alcanzar la
fase exponencial (24 h para O. oeni X2L y 12 h para L. hilgardii
5w). Asimismo, las BL se exponen a la fracción inhibitoria
peptídica de S. cerevisiae, obtenida por fraccionamiento y concentración (membranas Amicon de 3 kDa) de los caldos fermentados por la levadura. El recuento de células vivas, dañadas y
muertas se realiza por citometría de flujo empleando el kit de viabilidad BD mediante el cual se obtiene una tinción diferencial de
acuerdo a la integridad de la membrana celular (sonda naranja
de tiazol (TO): tinción de células totales y una solución de ioduro
de propidio (PI): colorea las células muertas). El porcentaje de
células dañadas y muertas de ambas BL es mayor en los medios
fermentados en relación al control. Sin embargo, la intensidad de
los fluorocromos varía de acuerdo a la especie de BL, presentando
O. oeni mayor número de células teñidas con PI en relación con
L. hilgardii. Cuando las células se exponen a la fracción inhibitoria
peptídica, se observa un efecto más pronunciado (el número de
células vivas disminuye 66,5 y 34,2% para O. oeni y L. hilgardii,
respectivamente). La mayoría de las células de O. oeni se tiñen
con PI, indicando un predominio de células muertas; mientras que
el tamaño de la sub-población de células en un estado intermedio de daño de membrana (células con doble tinción TO-PI) es
mayor para L. hilgardii, indicando que el compuesto inhibitorio
peptídico ejerce una alteración progresiva del estado fisiológico
de esta bacteria. La heterogeneidad de las subpoblaciones de
células observada entre O. oeni y L. hilgardii podría revelar diferentes respuestas fisiológicas de acuerdo a la especie bacteriana
a los compuestos peptídicos antimicrobianos producidos por S.
cerevisiae.
P37 - 28153 EVALUACIÓN DE PROPIEDADES PROBIÓTICAS
EN PROPIONIBACTERIAS DE ORIGEN AVIAR. ARGAÑARAZ
MARTINEZ, ELOY(1); APELLA, MARIA CRISTINA(1,2); PEREZ
CHAIA, ADRIANA(1,2)
(1) Centro de Referencia para Lactobacilos - CERELA, CONICET
(2) Universidad Nacional de Tucumán
Antecedentes: tradicionalmente, los antibióticos han sido usados como promotores de crecimiento en aves de corral, cerdos y
otros animales de granja para incrementar la producción, con el
beneficio adicional que, en dosis subterapéuticas, tienen efectos
preventivos frente a patógenos. Esto ha llevado a su uso indiscriminado, generando así la aparición de cepas resistentes, por lo
que esta práctica fue recientemente prohibida. Debido a ello, nuevas áreas de investigación se han enfocado en el estudio de la
microbiota de estos animales, centrándose en la búsqueda de
microorganismos probióticos como una alternativa a los promotores de crecimiento. En los últimos años, el género Propionibacterium ha sido centro de numerosas investigaciones, siendo
algunas especies estudiadas como potenciales probióticos para
humanos y animales. Objetivo: Evaluar diferentes propiedades
probióticas para la selección de cepas de propionibacterias aisladas del tracto gastrointestinal de gallinas ponedoras y
reproductoras. Materiales y Métodos: Nueve cepas de propionibacterias aisladas del tracto gastrointestinal de gallinas fueron
identificadas a través del análisis del ADNr 16S. Las mismas,
denominadas consecutivamente LET101 a LET109, fueron estudiadas en relación a: viabilidad luego de su exposición a condiciones de acidez (3 h a 37 °C, pH igual a 3); crecimiento en presencia de sales biliares (0,1 y 0,4% de Oxgall, medio LAPTg a
37 °C, 24 y 48 h); capacidad de adhesión a fragmentos de tejido
intestinal en presencia y ausencia de mucus. En todos los ensayos el número de células viables se determinó por recuento en
medio LAPTg agar (5 días, 37 °C, condiciones anaeróbicas). Los
resultados fueron analizados estadísticamente (ANOVA). Resultados: Todas las cepas de propionibacterias toleraron la acidez,
siendo LET101, LET106 y LET108 las cepas más sensibles, las
cuales disminuyeron su viabilidad en 2 unidades logarítmicas. La
resistencia a sales biliares fue variable. Todas las cepas fueron
capaces de tolerar 0,1% de Oxgall durante 24 h y 48 h de
incubación. En presencia de 0,4% de Oxgall y 24 h de incubación,
el número de microorganismos viables disminuyó en promedio, 2
unidades logarítmicas. Sin embargo, a las 48 h las cepas LET102,
LET103, LET105, LET107 y LET109 mostraron recuentos semejantes a su control, indicando así su capacidad de adaptación al
ambiente. Todas las cepas mostraron un aumento significativo de
la habilidad de adhesión en presencia de mucus. Conclusión: Este
trabajo representa un avance en la búsqueda de propionibacterias
específicas de huésped con propiedades probióticas para su uso
en la industria avícola.
P38 - 28161 PRODUCCIÓN DE ÁCIDOS ORGÁNICOS POR FERMENTACIÓN DE MEZCLAS DE CARBOHIDRATOS DIETARIOS
EN HOMOGENATOS CECALES DE RATÓN SUPLEMENTADOS
CON Propionibacterium acidipropionici CRL1198. LORENZO
PISARELLO, MARIA JOSE(1,2); ZARATE, GABRIELA(1); PEREZ
CHAIA, ADRIANA(1,2)
(1) Centro de Referencia para Lactobacilos - CERELA, CONICET
(2) Universidad Nacional de Tucumán
Antecedentes: el intestino grueso contiene más de 1011 bacterias por gramo de contenido, predominando las anaeróbicas. El
principal sustrato para el crecimiento bacteriano son los carbohidratos de la dieta que escapan a la digestión en el tracto
gastrointestinal superior. Los productos finales de esta fermentación incluyen ácidos grasos de cadena corta (AGCC), especialmente acetato, propionato y butirato, y menor cantidad de otros
ácidos orgánicos. Los AGCC son absorbidos rápidamente, estimulando la absorción de agua y sodio y actuando como combustibles oxidativos de las células colónicas. También disminuyen el
pH colónico, ejercen control de enzimas perjudiciales, inhiben
39
bacterias potencialmente patógenas y pueden estimular el crecimiento de flora benéfica en el colon. Por este motivo, se han ideado diferentes estrategias para influir sobre los niveles de las poblaciones intestinales autóctonas y sus productos de fermentación.
Estas tácticas se basan en la administración de cepas probióticas
y/o de carbohidratos no digeribles que favorezcan el desarrollo
específico de la flora deseable. En este sentido, resulta atractivo
el uso de propionibacterias clásicas, productoras naturales de
AGCC por fermentación, un adecuado balance de fibras dietarias
o una combinación de ambas estrategias. Objetivo: Evaluar el
crecimiento y actividad metabólica de Propionibacterium acidipropionici CRL1198 en agua cecal estéril y en homogenatos
cecales de ratones con su microbiota autóctona, utilizando en
ambos casos, suplementos de mezclas de carbohidratos dietarios.
Materiales y Métodos: El contenido cecal de ratones Balb/C se
obtuvo en condiciones de asepsia y se suspendió al 5% en PBS
estéril. Para la obtención de agua cecal, algunas suspensiones
cecales se centrifugaron y esterilizaron por filtración. Tanto a
homogentos como muestras de agua cecal se les adicionó
Propionibacterium acidipropionici CRL1198 (10^9 bacterias/mL) y/
o carbohidratos (oligofructosa, polidextrosa, goma arábiga) al 1%
final. Los mismos se ensayaron individualmente, o en combinaciones (2 ó 3 en iguales proporciones). Las muestras se incubaron a 37 °C en anaerobiosis durante 10 h y la producción de
AGCC se evaluó por HPLC. Resultados: Propionibacterium
acidipropionici CRL1198 no utilizó ninguno de los hidratos de
carbono ensayados en agua cecal. Sin embargo, se observaron
modificaciones en la fermentación en homogenatos cecales. Las
muestras suplementadas con polidextrosa u oligofructosa mostraron la mayor producción de ácido láctico en ausencia de propionibacterias y de ácidos propiónico y acético, en presencia de las
mismas. Las muestras con mezclas de hidratos de carbono y
bacterias lograron producción equilibrada de todos los ácidos orgánicos durante la fermentación. En el caso particular de mezclas con polidextrosa y goma la producción de ácido propió-nico
fue significativamente diferente. Conclusión: un balance en la producción de ácidos orgánicos en el intestino se puede lograr mediante la incorporación en la dieta de mezclas equilibradas de
carbohidratos y bacterias productoras de AGCC.
VIROLOGÍA
P39 - 27059 PROPAGACIÓN DE EPIDEMIAS EN UN MODELO
ESTOCÁSTICO DE AUTÓMATAS CELULARES GUALTIERI,
ARIEL FELIX; HECHT, JUAN PEDRO
Facultad de Odontología. UBA
Los modelos de autómatas celulares son diseños computacionales dinámicos que brindan representaciones espaciales
explícitas. Se visualizan como grillas de celdas, que evolucionan
en el tiempo de acuerdo a reglas preestablecidas. En los modelos epidemiológicos, cada una de estas celdas representa el área
ocupada por un conjunto de individuos. A diferencia de los modelos deterministas, los modelos estocásticos consideran la influencia del azar en la dinámica de propagación, esto los hace
más adecuados para el estudio de poblaciones pequeñas. Recientemente, hemos investigado un modelo epidemiológico de autómatas celulares determinista. En el presente trabajo, nuestro objetivo ha sido desarrollar y explorar un modelo original de autómatas celulares estocástico. Diseñamos el modelo en plataforma
de programación visual. El sistema se basa en una grilla de 900
celdas. Se representa una dinámica general de tipo SIR, donde
se consideran tres estadios sucesivos: susceptible (S), infectado
(I) y recuperado con inmunidad (R). El esquema SIR es utilizado
frecuentemente para representar la propagación de algunas enfermedades virales, como la influenza. En cada celda se consideran los siguientes procesos: infección, recuperación, natalidad,
mortalidad y desplazamiento hacia celdas vecinas. Cada uno de
estos procesos depende de un parámetro fijo y de un componente aleatorio introducido por método Monte Carlo. El programa
permite fijar el número inicial de individuos en cada estadio por
celda. Exploramos la dinámica del sistema mediante simulacio-
40
nes. El programa proporciona un registro del número de individuos en cada estadio, para cada celda y en la población total, en
función del tiempo. También brinda representaciones visuales de
la dinámica de propagación sobre la grilla mediante mapas de bits.
Los resultados obtenidos muestran como la prevalencia aumenta
exponencialmente hasta llegar a un pico máximo a partir del cual
comienza a descender, esto coincide con el comportamiento esperado para un esquema SIR. También pudimos observar como
la disminución del parámetro fijo de infección reduce y retrasa el
pico de prevalencia. Además, se observa como la dinámica de
todo el sistema y de cada celda dependen de la distribución inicial de infectados y de los parámetros fijos de desplazamiento
poblacional entre celdas. Para un mismo conjunto de condiciones
iniciales y parámetros fijos, de acuerdo a lo esperado por la incorporación de efectos aleatorios, los resultados obtenidos por
diferentes simulaciones no presentan coincidencia exacta. Este
modelo permitiría capturar la dinámica de propagación de epidemias en un escenario espacial influenciado por factores estocásticos. Por otro lado, de la misma manera que nuestro modelo previo de autómatas celulares determinista, resalta la importancia de
considerar la movilidad y la distribución espacial de la población
en modelos epidemiológicos dinámicos. Estudios futuros se orientarán a complejizar este modelo básico.
P40 - 27163 PREVALENCIA DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS
PARA VIRUS DE SARAMPIÓN EN MUJERES EMBARAZADAS
DE LA CIUDAD DE CÓRDOBA. ZITTA, MARIA EUGENIA; NATES,
SILVIA VIVIANA; ISA, MARIA BEATRIZ
Instituto de Virología – Universidad Nacional de Córdoba
El sarampión es una enfermedad viral altamente contagiosa
y distribuida mundialmente. Actualmente, Argentina es un país en
el que se ha reducido drásticamente el número de casos de sarampión. Este cambio epidemiológico comienza con la creación
del Programa de Control, Eliminación y Erradicación del sarampión en el año 1993. Dicho Programa implementó una serie de
acciones que permitieron alcanzar una inmunidad poblacional
superior al 95%, como consecuencia de altas coberturas de vacunación. En nuestro país el esquema establece la primera dosis
a los 12 meses y un refuerzo a los 6 años de edad. Se sabe que,
luego del nacimiento, los niños están protegidos por anticuerpos
(Acs) maternos específicos. No obstante, en la actualidad, debido a que casi la totalidad de las mujeres en edad gestacional se
encuentran vacunadas y en general la fuente vacunal induce
menores títulos de Acs que la infección natural, se espera que
una menor cantidad de Acs específicos sean transferidos pasivamente al hijo y que su caída sea rápida en el tiempo. Como consecuencia de ello, existiría la posibilidad de que estos niños presenten un período de susceptibilidad a la infección por el virus
antes de ser vacunados por primera vez. Es por ello que sería
importante conocer el estado inmune de las mujeres embarazadas frente al virus de sarampión. Objetivo. Determinar la
seroprevalencia y el tÍtulo de Acs específicos para el virus del
sarampión en embarazadas de la Clínica Reina Fabiola de Córdoba. Material y Método. Se analizaron 243 muestras de suero
de embarazadas de la Clínica Reina Fabiola de Córdoba. Las
muestras séricas se dividieron en tres grupos etarios: grupo 1: 16
- 25 años, 48 muestras, se presume inmunidad por fuente vacunal;
grupo 2: 26 - 30 años, 80 muestras, se presume inmunidad por
fuente natural o vacunal; grupo 3: 31 - 41 años, 115 muestras,
se presume inmunidad por infección natural. Prueba de laboratorio: técnica de seroneutralización viral. Se realizaron diluciones
seriadas desde 1:2 hasta 1:128. La reacción se consideró válida
cuando los sueros problemas fueron enfrentados a una suspensión viral con 100 DICC ± 0,5 log. Se consideraron positivos los
sueros con títulos iguales o mayores a 1:2. Análisis estadístico:
se aplicó el test de Student considerándose diferencia significativa una p< 0,05 y con un nivel de confianza del 95%. Resultados.
Se detectó una seroprevalencia global del 93,0% (90,0 – 96,0%).
El porcentaje de seropositividad y Media Geométrica de los Títulos (MGT) de Acs anti sarampión para cada grupo fue el siguiente: Grupo 1: 98.0% (92,0 – 100%), MGT 20,9 (19,1 - 22,7); Grupo 2: 95% (90 – 100%), MGT 14,3 (12,8 – 15,8); Grupo 3: 89,6%
(85,6 – 93,6%), MGT 13,1 (11,5 – 14,7). La elevada seroprevalencia encontrada en el total de la población estudiada sería un
indicador de la alta inmunidad poblacional. Los porcentajes de
seropositividad y las MGT obtenidas no muestran una diferencia
estadísticamente significativa (p>0,05). Por lo tanto se considera, que en el grupo analizado, la edad no es una variable que
influye en la seropositividad de la población a pesar que los grupos estén integrados por mujeres que han adquirido sus Acs
específicos por inmunización o por padecer la infección natural.
P41 - 27334 BROTE DE DENGUE EN EL AREA OPERATIVA XI
(ORAN-SALTA AÑO 2009). CACACE, ML(1); ISABEL, I(1);
REYNOSO, X(2); DIAZ, O(2); GEREZ , M(3); CORTADA, P(4); DIAZ,
L(1); PARADA, R(1)
(1)Laboratorio, (2) Residencia Pediátrica, (3) Residencia Medicina Familiar, (4) Epidemiología - Hospital San Vicente de Paul Orán-Salta
El dengue es un serio problema de salud pública en muchos
países de América Latina. En Argentina los primeros casos se
detectaron en Salta en 1997, siendo DEN-2 el virus circulante. En
Orán (Pcia. de Salta), distante 50 Km de la frontera con Bolivia y
280 Km de Salta se reportan los primeros casos autóctonos de
DEN-2 en 1998 y durante el período 1998-2008 han circulado los
serotipos DEN 1,2 y 3. A mediados de enero 2009, se producen
casos de dengue en Orán como consecuencia de una epidemia
que comenzó en Bolivia los últimos meses del año 2008. Objetivos. El objetivo del presente trabajo, fue estudiar el brote de dengue que se produjo en el área operativa XI (Orán-Salta) durante
el período 1/1/09 al 30/05/09. Materiales y Métodos. Se estudiaron los casos probables de dengue que concurrieron al Laboratorio del Hosp de Orán (1/1-30/5/09). Se analizaron las fichas clínico- epidemiológicas y se incorporaron al programa SIVILA. Se
determinaron los casos de infección reciente a partir de Elisa de
captura de Ig M (UMElisa) para lo cual se tomaron muestras a
partir de 5 días de evolución y se conservaron los sueros a -20°C
hasta su procesamiento. Los sueros de muestras de pacientes de
hasta 4 días de evolución se tomaron en crioviales estériles y se
derivaron al INEVH para aislamiento viral y PCR. Resultados. Se
recibieron 1280 muestras de casos probables de dengue correspondientes a la ciudad de Orán. Se derivaron 43 muestras tempranas al INEVH. De la prueba de UMElisa se obtuvo el 76,4%
de positividad. Por aislamiento viral y PCR se caracterizó el
serotipo circulante como DEN-1. Se observó que el mayor número
de casos se dio en la población mayor de 15 años (81%) y 53%
sexo femenino. La población analizada presentó: cefalea, fiebre,
artromialgias, dolor retroocular, rash cutáneo; algunos casos con
manifestaciones hemorrágicas y otros con diarrea. Se observaron
por primera vez casos de dengue hemorrágico y un caso de dengue congénito. De los parámetros hematológicos, la mayoría presentó leucopenia con plaquetopenia. La epidemia se extendió de
enero a mayo alcanzando un pico en marzo. Los primeros casos
estuvieron vinculados a pacientes que concurrieron a Santa Cruz
de la Sierra (Bolivia) donde se inició el brote. Durante el brote del
2009 circuló el serotipo DEN-1 y se produjo un caso de dengue
congénito y casos de dengue hemorrágico. Esto último era previsible dado que ya habían circulado en la región tres serotipos. Con
la aparición de este brote, nuestra región tuvo acceso directo al
análisis serológico de dengue. Es fundamental contar con esta
herramienta diagnóstica en zonas endémicas a fin de detectar
precozmente los casos y tomar las acciones preventivas.
P42 - 27448 ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ANTIVIRAL DE LA
DEHIDROEPIANDROSTERONA (DHEA), LA ANISOMICINA Y EL
UO126 FRENTE A VIRUS DE IMPORTANCIA SANITARIA. TORRES, NICOLAS IGNACIO; CASTILLA, VIVIANA; WACHSMAN ,
MONICA BEATRIZ
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA
La dehidroepiandrosterona (DHEA) es una de las hormonas
esteroidales más abundantes en el torrente sanguíneo producida
por la glándula adrenal. Se ha demostrado que DHEA presenta
una gran variedad de actividades biológicas tales como: actividad
antitumoral, reducción de las complicaciones del envejecimiento,
prevención de la diabetes y del estrés, así como actividad antiviral.
La anisomicina es un antibiótico producido por Streptomyces
guiseolus que inhibe síntesis de proteínas y actúa como activador
del sistema de señalización de las MAPKs (mitogen-activated
protein kinase) de la célula, mientras que el UO126 es un inhibidor
de ERK (extracellular signal regulated kinase) perteneciente a la
cascada de las MAPKs. En este trabajo hemos estudiado la actividad antiviral de la DHEA, la anisomicina y el UO126, frente a
virus con genoma a DNA (adenovirus (AdV), herpes simplex tipo
1 (HSV-1)) y RNA (sarampión (MV), poliovirus (PV), dengue
(DENV)). Se determinó la concentración citotóxica 50 de los compuestos, utilizando el método del MTT en células A549, Vero o
BHK-21 dependiendo del virus utilizado. Los porcentajes de inhibición se calcularon para cada virus y cada compuesto, por el
método de reducción del rendimiento viral. Dado que se sabe que
algunos virus requieren la activación y otros la inhibición de la
cascada de MAPKs y que DHEA modula este sistema de señalización, se decidió analizar si existe alguna relación entre la actividad antiviral de DHEA y su capacidad de inhibir o activar la vía
de señalización mediada por ERK. Para ello, se estudió el efecto
del UO126 y de la anisomicina, sobre la multiplicación de los distintos virus ensayados. UO126 (50 µM) produjo una inhibición de
alrededor del 98% de la multiplicación de AdV y MV semejante a
DHEA (150 µM). El tratamiento combinado de UO126 y DHEA
mostró también un efecto inhibidor de la replicación viral. Por el
contrario, UO126 no afectó la multiplicación de PV y DENV, mientras que la anisomicina (0,1 µM) produjo una inhibición superior
al 90 % para ambos virus. El tratamiento combinado con DHEA
no revirtió la inhibición producida por anisomicina. En el caso de
DENV los resultados son controvertidos dado que UO126 no
inhibe la multiplicación del virus a diferencia de DHEA y
anisomicina que producen una inhibición superior al 98%. Hemos
encontrado también que la acción de DHEA, UO126 y anisomicina
depende del sistema celular utilizado especialmente en el caso
de HSV-1. Por otro lado se determinó que los tres compuestos
no presentan actividad virucida para ninguno de los virus ensayados. El análisis mediante la técnica de Western blot, mostró una
disminución de la síntesis de proteínas virales en las células infectadas y tratadas con DHEA para AdV, MV y DENV. Es posible
que la acción de DHEA sobre el sistema de las MAPKs de la célula huésped sea la responsable de la disminución de la síntesis
de proteínas virales en células infectadas y tratadas con DHEA.
Este efecto sobre las vías de señalización explicaría su amplio
espectro de actividad antiviral.
P43 - 27456 LAS OPORTUNIDADES Y DEBILIDADES QUE MOSTRÓ LA PRIMER PANDEMIA DEL SIGLO XXI EN EL SISTEMA
DE SALUD DE NEUQUÉN: EXPERIENCIA 2009 HOSPITAL “DR.
HORACIO HELLER” NEUQUÉN. GONZÁLEZ CAPÓ, DIEGO
Hospital “Dr. Horacio Heller” Neuquén
El 2009 fue un año, desde un punto de vista científico y social, lleno de incertidumbre marcado por la primera pandemia del
siglo XXI generada por el virus influenza A nuevo sub tipo (H1N1).
La Organización Mundial de la Salud adoptó políticas y medidas
sanitarias para controlar y contener la propagación viral. Las mismas permitieron, entre otras cosas: 1.Estudiar el comportamiento de los distintos grupos etarios respecto a la definición de caso
de IRAG (insuficiencia respiratoria aguda grave) e IRAB (insuficiencia respiratoria aguda baja) emitida por el Ministerio de Salud de Argentina y conocer los periodos de mayor circulación en
relación a los virus respiratorios más frecuentes: adenovirus, virus sincicial respiratorio (VSR), influenza A (FLUA), influenza B
(FLUB), parainfluenza 1, 2 y 3 (PARA), 2. Aplicar nuevas técnicas y herramientas diagnósticas, 3.Comparar metodologías y definir sus eficiencias. El Laboratorio Referente en Virus Respiratorios de la Provincia de Neuquén, cita en Hospital Horacio Heller,
procesó las muestras respiratorias obtenidas por aspiración e
hisopado de nasofaringe de todos los grupos etarios que cumplieran la definición de caso, mediante la técnica de Inmunofluores-
41
cencia Directa (IFD) y conjuntamente los casos sospechados de
gripe (en paralelo) por la técnica de PCR en Tiempo Real (rt RT
PCR). Los datos fueron obtenidos del Sistema de Vigilancia de
Laboratorios (SIVILA). El registro 2009 mostró: total de muestras
respiratorias analizadas 3706, de las cuales 81,89% fueron menores de 4 años. Total de muestras con resultados positivos 1530
(41%). La mayor circulación viral respecto a positivos/muestras
analizadas fue: FLUA entre el 20 de junio y 10 de julio (165/669);
para RSV desde 8 de agosto a 25 de setiembre (531/1073), y en
el caso de PARA desde 12 de setiembre al 2 de octubre (43/391).
A partir del 13 de julio los casos sospechados de gripe fueron
procesados además por rt RT PCR para la detección del H1N1
en el Laboratorio Central de la provincia de Neuquén, total muestras procesadas 857 con 56 positivos (6,5%) mientras que por IFD
sólo 21 lo fueron. Si bien conforme transcurrían los meses se
confirmaba que, globalmente, el virus tenía consecuencias moderadas y que su tasa de mortalidad era menor a la de la gripe
estacional, nos permitió a pesar de tratarse de un muestreo sesgado dado que cerca del 80% eran menores de 4 años, conocer
la distribución temporal de los virus en donde el RSV fue el de
mayor duración, el FLU A pandémico presentó un pico agudo para
luego desaparecer bruscamente y el aumento del PARA que coincidió con la tendencia en baja del RSV, además posibilitó incorporar y poner a punto técnicas de biología molecular en el diagnostico primario. El estudio comparativo IFD vs rt RT PCR, concluyó que la sensibilidad de IFD fue baja (44,4%), inferior a las
informadas en Argentina sobre metodologías similares de detección del virus A H1N1 fuera del período pandémico. Como corolario queda mostrar la relevancia de la Salud Pública, quien asumió un rol protagónico en el diagnóstico y tratamiento de los casos que cumplieran la definición de caso optimizando la razón
costo/beneficio.
P44 - 27510 VACUNA A PARTÍCULAS VIRALES SINTÉTICAS:
RESULTADOS PROMISORIOS EN EL MODELO SARS-COV.
MORTOLA, EDUARDO(1); ROY, POLLY(2)
(1) Facultad de Ciencias Veterinarias – Uiversidad Nacional de La
Plata, (2) LSHTM, UK.
Introducción. Las vacunas a partículas virales sintéticas (PVS)
imitan la estructura general de la partícula viral y de esta manera
preservan la conformación antigénica nativa de las proteínas estructurales. Las PVS se han desarrollado en una amplia variedad
de virus y poseen una distintiva ventaja en términos de seguridad e inmunogenicidad sobre otras vacunas tradicionales. El síndrome respiratorio agudo severo (SARS) es una enfermedad
zoonótica emergente causada por un coronavirus (SARS-CoV)
que provocó un brote epidémico global en el año 2003. Una vacuna efectiva contra el virus del SARS, necesita inducir anticuerpos neutralizantes. La proteína S del virus es la proteína de unión
al receptor, y por lo tanto el principal objetivo para una respuesta
inmune humoral y obviamente de elección para una potencial
vacuna. Sin embargo, una protección eficiente es difícil de obtener con una vacuna a subunidades formada por una sola proteína, por eso combinando la proteína S con otras dos proteínas
estructurales del virus (M y E) en una vacuna a subunidades
múltiple debería inducir una mejor y más efectiva respuesta inmune de protección. Objetivo. En la actualidad el SARS no posee una vacuna ni un tratamiento efectivo, por lo tanto, el objetivo del presente trabajo fue la utilización de partículas virales sintéticas del virus de SARS para inducir una respuesta inmune de
protección. Para tal fin, desarrollamos PVS no replicativas al carecer de material genético, para su uso como inmunógeno. Materiales y Métodos. Estas partículas fueron realizadas en el sistema de expresión de baculovirus mediante la creación de un solo
baculovirus recombinante que expresa, en forma conjunta, las tres
proteínas estructurales más importantes del virus del SARS (S,
M y E). Resultados. El nivel de expresión y la autenticidad de las
proteínas, analizados por técnicas de SDS-PAGE y Western blot,
demostraron que las proteínas virales que conforman la PVS se
expresaron en las células de insecto en niveles eficientes, que
conservaron la proporción molecular y mantuvieron sus características inmunogénicas intactas. La purificación de la PVS a par-
42
tir de las células de insectos por gradientes de sucrosa y su posterior caracterización morfológica por microscopía electrónica
demostraron que conservaban las características del virus entero. Los anticuerpos policlonales generados por la inoculación de
PVS a animales de laboratorio, fueron utilizados en pruebas de
seroneutralización con resultados muy promisorios, observándose títulos neutralizantes significativos comparados con los controles. Conclusiones. Utilizando como modelo al virus SARS, las PVS
carentes de material genético y sin representar un riesgo para la
salud humana, podrían representar no sólo un exitoso método
para el diseño de una vacuna contra el SARS, sino también como
biotecnología de punta extrapolable a otras virosis de interés.
P45 – 27869 ANÁLISIS DE INTEGRONES CROMOSÓMICOS EN
AISLAMIENTOS DE Vibrio cholerae O1 DE ARGENTINA.
QUIROGA, MP(1); VIÑAS, MR(2); PICHEL, M(2); GONZALEZ
FRAGA, S(2); CENTRON, D(1)
(1) Facultad de Medicina – Universidad de Buenos Aires, (2) Servicio Enterobacterias, INEI- ANLIS “Carlos G. Malbrán”
Entre 1992 y 1999 se produjeron siete brotes de cólera en
Argentina. Vibrio cholerae O1 (VC O1), el agente etiológico del
cólera posee integrones cromosómicos que son estructuras
genéticas localizadas en el genoma del microorganismo, que codifican un sistema de recombinación compuesto básicamente por
el gen intI4 que codifica una integrasa que es una recombinasa
sitio específica capaz de insertar y escindir genes cassettes en
el integrón, un sitio de recombinación attI4, y una serie de cassettes compuestos por un marco de lectura abierto y un sitio de
recombinación VCR. La integrasa IntI4 reconoce al gen cassette
por su VCR y cuando lo inserta en la primera posición del integrón,
este queda localizado adyacente al attI4. Los integrones
cromosómicos de Vibrio cholerae pueden contener más de 150
cassettes, algunos otorgándole resistencia a antibióticos, funciones adaptativas y otros incluso con funciones aun desconocidas.
El objetivo de este trabajo fue caracterizar aislamientos de VC O1
recuperados durante los períodos epidémicos a través del estudio de los genes cassettes localizados en primera posición en los
integrones cromosómicos y sus variaciones en el sitio attI4. Se
tomaron 14 cepas representantes por caracterización previa por
electroforesis en campo pulsado (PFGE), del clon epidémico asociado a los brotes de cólera y de otros aislamientos de diferentes
subtipos, no productores de toxina de cólera (CT). Se realizó la
extracción de ADN genómico total y la amplificación de los primeros cassettes de los integrones cromosómicos por PCR utilizando un primer específico para intI4 y otro degenerado con sitio
blanco en los VCR. Posteriormente se purificó la banda de menor peso molecular de cada cepa y se secuenciaron. El análisis
de las secuencias se realizó utilizando Los programas Bioedit,
BLASTN y CLUSTALW2. Se observaron diferentes ordenamientos
de genes cassettes en las cepas analizadas, encontrándose en
primera posición los genes cassettes VC_A0294, VC_A0302,
VC_A0437, VC_A0411, VC_A0325, qacE-like; algunos de los
cuales no se habían descripto anteriormente e incluso se evidenció la presencia de genes cassettes que no habían sido encontrados anteriormente asociados a los integrones cromosómicos de
Vibrio cholerae. Los aislamientos toxigénicos asociados a los brotes de cólera se agruparon principalmente en el perfil VC_A0294.
A partir del estudio de los sitios attI4, se observó que había variaciones entre los aislamientos estudiados y que se encontraban
asociados a diferentes genes cassettes. Los aislamientos de VC
O1 analizados presentaron una variedad de ordenamientos de
genes cassettes e incluso algunos nunca antes asociados a los
mismos y presentaron variaciones en sus sitios attI4, encontrándose la mayor variabilidad entre las cepas CT-negativas, en concordancia con el agrupamiento observado por PFGE. Se evidenció una vez más la plasticidad genómica de esta especie que la
hace tan versátil.
P46 - 27919 INFLUENCIA DE LA MUTACIÓN NATURAL D240G
EN EL PERFIL DE RESISTENCIA CONFERIDO POR CEFOTAXIMASAS PERTENECIENTES AL GRUPO CTX-M-1. GHIGLIONE, BARBARA(1); DI CONZA, JOSE(1); RADICE,
MARCELA(1); RODRIGUEZ, MARIA MARGARITA(1); POWER,
PABLO(1); GUTKIND, GABRIEL(1)
(1)Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos
Aires
Introducción: A diferencia de otras ß-lactamasas de espectro
extendido (BLEE), las cefotaximasas hidrolizan ceftazidima de
manera menos efectiva que otras enzimas de espectro extendido
(TEM, SHV o PER, por ejemplo). Varias sustituciones aminoacídicas en las ß-lactamasas de tipo CTX-M se han propuesto como
responsables del aumento en la tasa de hidrólisis frente a
ceftazidima (ej.: D240G), denominandolas “ceftazidimasas”. Objetivos: El objetivo de este trabajo fue evaluar el papel de la mutación D240G en el perfil de resistencia de las mutantes naturales CTX-M-15 y CTX-M-96, frente a sus respectivas enzimas
parentales CTX-M-3 y CTX-M-12. Materiales y Métodos: Los
genes codificantes de las ß-lactamasas fueron amplificados por
PCR a partir de aislamientos salvajes, clonados en pK19 y transformados en E. coli DH5á. Las construcciones obtenidas fueron
verificadas por secuenciación. El screening de BLEE y los ensayos de susceptibilidad fueron realizados por difusión y dilución
según recomendaciones del CLSI. Resultados: Se obtuvieron
clones portadores de los genes parentales blaCTX-M-3 y blaCTXM-12 y de sus respectivas mutantes naturales blaCTX-M-15 y
blaCTX-M-96, todos en un mismo entorno genético y con idéntico péptido señal. Se observó sinergia con ácido clavulánico en
todos los clones recombinantes obtenidos. Los clones productores de CTX-M-15 y CTX-M-96 mostraron valores de CIM a
ceftazidima 8 veces mayores que sus respectivos clones productores de CTX-M-3 y CTX-M-12, si bien los valores de CIM no superaron a aquellos obtenidos para cefotaxima. No se observó diferencia en los valores de CIM frente a cefotaxima en los clones
analizados. Conclusiones: Aunque la mutación D240G lleva a un
aumento en los valores de CIM frente a ceftazidima en cepas productoras, el incremento en la afinidad de las variantes enzimáticas
por dicho antibiótico debería ser confirmado por estudios cinéticos.
Dado que los valores de CIM a cefotaxima fueron al menos 8
veces mayores que los correspondientes a ceftazidima, el término “ceftazidimasas” acuñado actualmente para estas nuevas variantes de CTX-M debería ser aplicado cuidadosamente y posiblemente reservado solo para aquellas variantes (de existir) en
las que la cinética de hidrólisis de ceftazidima y cefotaxima sean
al menos equivalentes.
P47 - 27984 ANTIGENICIDAD DE PROTEÍNAS DE MEMBRANA
EXTERNA DE Acinetobacter baumannii EN EL HOSPEDADOR
HUMANO. MUSSI, A(1); GUARDATI, C(2); LIMANSKY, A(1);
CABRUJA, M(1); HEREDIA, O(2); GARCIA, M(2); JUANIZ, A(2);
ROSSIGNOL, G(2); ESTERLIZZI, R(2); PITTET, C(2);
BECHERUCCI, A(3); RONDINA, C(3); VIALE, A(1)
(1) IBR (CONICET), FCByF, UNR; (2) Lab Microbiol “Hospital
Emergencias Clemente Alvarez” (HECA), Sec Salud Pública,
Municipalidad de Rosario, (3) Terapia Intensiva, HECA, Rosario
Acinetobacter baumannii (A. baumannii) es reconocido en la
actualidad como uno de los patógenos oportunistas más frecuentemente asociado a infecciones nosocomiales. La emergencia de
cepas de A. baumannii con resistencia a múltiples antimicrobianos
complica el tratamiento debido a las limitaciones resultantes en
las opciones terapéuticas, derivando así en una elevada morbimortalidad de los pacientes infectados. Poco se conoce aún sobre mecanismos de virulencia, factores de interacción con el
hospedador humano, y estrategias de persistencia exhibidas por
este microorganismo. Tampoco han sido reconocidos al presente antígenos candidatos para el desarrollo de vacunas útiles para
el control de infecciones causadas por este microorganismo. El
objetivo de este trabajo ha sido determinar la capacidad de proteínas de membrana externa (PME) de A. baumannii de constituirse como antígenos principales de este patógeno. Se estudiaron 5 pacientes que reunieron los siguientes criterios de inclusión:
i) internados en UTI del HECA, ii) mayores de 12 años, iii) que
presentaron infección de tejidos blandos (post-cirugía y quemados) y hemocultivos positivos para A. baumannii. Todos los aislamientos de A. baumannii fueron multirresistentes. Fracciones de
membrana externa de distintas cepas de A. baumannii fueron
separadas en geles SDS-PAGE y transferidas a membranas de
nitrocelulosa a fin de ser utilizadas como antígenos. La presencia de anticuerpos contra las mismas en muestras de suero de
cada paciente extraídas a los 30 días de cultivo positivo por A.
baumannii fue determinada mediante inmunodetección, utilizando como segundo antisuero anticuerpos anti-IgG humanos conjugados con fosfatasa alcalina. Los ensayos de inmunodetección
efectuados mostraron bandas inmunoreactivas para al menos una
PME en sueros de 4 de los 5 pacientes incluidos en el estudio,
indicando la presencia de anticuerpos específicos capaces de
reconocer ciertos epitopes de las mismas. Globalmente, el análisis reveló que PME de 95, 75 y 40 kDa presentaron los epitopes
prevalentes en las cuatro muestras de suero mencionadas. La
PME mayoritaria de 40 kDa fue identificada como el homólogo de
OmpA, cuya funciones propuestas en A. baumannii abarcan desde la interacción con el hospedador, formación de biofilm e inducción de apoptosis. Por su parte CarO, PME también mayoritaria
propuesta como canal de carbapenemes y aminoácidos básicos
en este patógeno, no resultó un antígeno relevante a juzgar por
los datos obtenidos. Estos resultados demuestran la capacidad de
ciertas PME de A. baumannii de inducir respuesta inmune en el
hospedador humano durante la infección. La incorporación de una
cantidad significativa de sueros de pacientes infectados contribuirá
a aportar evidencias sobre los antígenos prevalentes de A.
baumannii, los cuales podrían brindar herramientas de utilidad en
la prevención de infecciones por este patógeno.
P48 - 28029 ESTUDIO DE VIABILIDAD FRENTE AL CONGELAMIENTO DE UN AISLAMIENTO DE Corynebacterium pseudotuberculosis. ALVAREZ, LAURA A; ESTEVAO BELCHIOR, SILVIA
Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco (UNPSJB)
- Centro Regional de Investigaciones y Desarrollo Científico-Tecnológico (CRIDECIT)
Corynebacterium pseudotuberculosis es un bacilo Gram positivo no esporulado causante de linfoadenitis caseosa (LAC) en
pequeños rumiantes. Pertenece al grupo de los actinomicetes y
se han descripto, al igual que para otros miembros del grupo, largos períodos de supervivencia en condiciones de estrés ambiental, como desecación y bajas temperaturas. La resistencia del
microorganismo frente a condiciones ambientales adversas, le
permitiría permanecer viable para infectar a animales susceptibles.
Dado que en la Patagonia durante los meses de invierno se alcanzan temperaturas bajo cero, el objetivo de este trabajo fue
estudiar la supervivencia de una cepa de C. pseudotuberculosis
autóctona frente al congelamiento. Los ensayos se realizaron bajo
condiciones controladas de laboratorio. Se trabajó con una cepa
identificada como C. pseudotuberculosis biovar ovis, aislada de
un ovino de la zona de Rio Gallegos, Santa Cruz. Se realizó una
suspensión de la cepa en solución fisiológica, y se distribuyó en
alícuotas que se conservaron a -20 °C. Se determinó a distintos
tiempos el número de unidades formadoras de colonias (UFC)
mediante la técnica de diseminación en superficie en agar Tripteína Soya. Los recuentos se realizaron por triplicado y se obtuvieron los porcentajes de supervivencia con sus respectivas desviaciones estándar (DS). Se observó que la cepa sobrevivió durante 178 días en estas condiciones. Durante los primeros 14 días
mostró una disminución de aproximadamente un 30% en la supervivencia; luego los recuentos se mantuvieron relativamente
constantes hasta el día 178, con un porcentaje de supervivencia
final de 66,6% respecto del inoculo inicial. Estos resultados permitirían demostrar que frente al enfriamiento, se generaría una
adaptación en los microorganismos, en la que conservarían cier-
43
ta actividad metabólica que les permitiría sobrevivir hasta tanto
cese el estado de estrés. Se determinó in vitro que la cepa de C.
pseudotuberculosis permaneció viable por al menos 178 días frente al congelamiento. El estudio de la resistencia frente a bajas
temperaturas resulta importante debido a que estas condiciones
son características de la región patagónica.
P49 - 28069 CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE ISABA825,
UNA SECUENCIA DE INSERCIÓN ACTIVA QUE MODULA LA
PLASTICIDAD GENÓMICA EN Acinetobacter baumannii.
RAVASI, P; LIMANSKY, A; VIALE, A; MUSSI, MA
Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR,
CONICET), FBIOyF, UNR, Rosario, Argentina
Introducción: Hemos reportado recientemente que la pérdida
del canal de membrana externa para aminoácidos básicos de A.
baumannii, CarO, como resultado de la inactivación insercional
natural de su gen codificante por secuencias de inserción (IS), se
correlaciona con la susceptibilidad reducida a carbapenemes. Una
de estas IS, ISAba825, previamente no reportada y recientemente asignada a la familia IS982, generó una duplicación de 7-pb
(ATCGTTA) en el sitio blanco de inserción en el gen carO. Objetivos: Evaluar la funcionalidad de ISAba825 así como su potencial rol modulador de plasticidad genómica en A. baumannii. Materiales y Métodos: A fin de evaluar la funcionalidad de ISAba825,
generamos una nueva IS recombinante (ISAba825:Kn) conteniendo un gen de resistencia a kanamicina. Los eventos de transposición fueron evaluados utilizando como hospedadores las cepas
de A. baumannii ATCC 17978, E. coli DH5á y Acinetobacter baylyi
ADP1, las cuales fueron transformadas con un plásmido suicida
conteniendo ISAba825::Kn. Los eventos de transposición se evaluaron mediante selección de clones resistentes a kanamicina,
PCR usando cebadores específicos y confirmación de la presencia de la IS mediante secuenciación. Resultados: ISAba825::Kn
presentó un estrecho rango de hospedador para la transposición,
detectándose este tipo de eventos sólo en A. baumannii ATCC
17978. En esta bacteria, el blanco preferencial de ISAba825::Kn
resultó ser el plásmido endógeno pAB2, encontrándose en todos
los casos insertada en un sitio AACCCT. Por otra parte, encontramos en la cepa clínica Ab880 la presencia de ISAba825 corriente arriba del gen blaOXA-58, el cual codifica para una
oxacilinasa capaz de hidrolizar carbapenemes. Estudios de
southern blot y secuenciación mostraron que ISAba825- blaOXA58 se encontraba en una sola copia en un plásmido al que denominamos pAb880. Estudios de RACE 5´ indicaron en esta cepa
la expresión de un transcripto resultante de la generación de un
promotor híbrido alternativo entre ISAba825 y secuencias
flanqueantes al sitio de inserción corriente arriba de blaOXA-58.
La transformación de la cepa ATCC 17978 con pAb880 mostró
el aumento de 32 veces el valor de CIM a imipenem, y de 16 veces
a meropenem en relación a la cepa sin transformar. Finalmente,
el análisis de la distribución de ISAba825 dentro del género
Acinetobacter mostró la presencia de la misma sólo en cepas resistentes a carbapenemes de A. baumannii. Conclusiones: La
presencia de ISAba825 en cepas resistentes a carbapenemes,
sumado a su proximidad al gen blaOXA-58, y la inactivación de
carO mediada por ISAba825, nos lleva a proponer un rol para
ISAba825 en la modulación del incremento de la resistencia a
carbapenemes en A. baumannii.
P50 - 28088 IDENTIFICACIÓN DE NUEVOS FACTORES BACTERIANOS REGULADOS POR EL SISTEMA DE DOS COMPONENTES BVGAS DE Bordetella spp. FERNANDEZ, JULIETA (1);
SISTI, FEDERICO (1); ORMAZABAL, MAXIMILIANO (1); HOZBOR,
DANIELA (1)
(1) Instituto de Bioquímica y Biología Molecular
Introducción: Dentro del género Bordetella se encuentran tres
especies bacterianas, B. pertussis, B. parapertussis y B.
bronchiseptica que son capaces de inducir enfermedades respiratorias con relevancia epidemiológica en diferentes huéspedes
44
incluido el hombre. En estas especies un sistema de dos componentes denominado BvgAS regula la expresión de los factores
indispensables para el desarrollo del proceso infeccioso inducido
por ellas. La actividad de este sistema involucra no sólo la activación de la expresión de ciertos componentes denominados de
virulencia sino también la represión de otros denominados de
avirulencia. Frente a determinadas señales del entorno el sistema BvgAS está activo mientras que frente a otras como lo son la
baja temperatura, el ácido nicotínico y el sulfato de magnesio, el
sistema deja de estar activo por lo que la expresión de los factores de virulencia no se activa mientras que sí lo hacen los factores de avirulencia. Así BvgAS está involucrado en el cambio de
estado de virulencia/avirulencia del microorganismo. La represión
de los factores de avirulencia durante la fase virulenta se realiza
a través de la proteína BvgR. Si bien ya han sido identificados
numerosos factores de virulencia cuya participación en la infección ha sido ampliamente demostrada, la identificación y el rol de
los factores de avirulencia aún no ha sido determinado de manera acabada. Objetivo: Identificar nuevos factores reprimidos por
el sistema BvgAS. Materiales y Métodos: Para la identificación de
factores regulados por el sistema de dos componentes se empleó
la estrategia del tipo proteómica comparativa empleando geles 2D
asociados a espectrometría de masa del tipo Maldi Tof sobre extractos bacterianos de la cepa parental de Bordetella
bronchiseptica y de un mutante defectivo en la expresión de BvgR
obtenido en nuestro laboratorio (BbBvgR-), ambos en fase virulenta. Resultados: De la aplicación de la estrategia proteómica
sobre los extractos bacterianos de la cepa parental y del mutante
defectivo BbBvgR- hemos detectado una proteína diferencial identificada como una probable hidrolasa (BB0826) presente únicamente en la cepa BbBvgR-, y ausente en la cepa parental. Con
el fin de corroborar este resultado decidimos clonar y purificar a
la proteína BB0826 para obtener un suero específico y enfrentarlo
a preparaciones proteicas correspondientes a diferentes fases
fenotípicas. Los ensayos de western blot así diseñados permitieron verificar la expresión única de BB826 en la fase avirulenta.
Más aún, mediante ensayos de RT PCR pudimos corroborar que
los niveles de RNA de BB0826 son superiores en la cepa BbBvgRque en la cepa parental (2.86 ± 0.22 vs. 1.00 ± 0.07). Conclusiones: Hemos identificado un nuevo factor característico de la fase
avirulenta de Bordetella, BB0826, probable hidrolasa cuyo peso
molecular estimado es 32,7 kDa y su pI es de 5,62.
P51 - 28133 ESTUDIO DEL SISTEMA DE TRASLOCACIÓN DE
PROTEÍNAS “TAT” EN BACTERIAS INTRACELULARES Y SU
RELACIÓN CON LA FRAGMENTACIÓN DE OPERONES EN
GENOMAS REDUCIDOS. NUÑEZ, PABLO(1); SORIA,
MARCELO(2); ROMERO, HECTOR(3); FARBER, MARISA(1)
(1) INTA-CONICET, (2) UBA, (3) UDELAR-URUGUAY
El sistema “Twin Arginine Translocation (Tat)” es un sistema
de secreción de proteinas plegadas a través de la membrana interna de las bacterias gram negativas. El sistema está constituido por 3 genes (tat A, B y C) que se encuentran en forma de
operón en la mayoría de los organismos. En la clase aproteobacterias, analizando la organización y el orden de los
genes (sintenia), identificamos diferentes patrones: mientras la
mayoría de los órdenes presenta la organización de operón, el
orden Rickettsiales presenta una organización dispersa de los
componente en el genoma. El objetivo de este trabajo fue identificar y caracterizar funcionalmente el sistema tat para estudiar su
potencial rol biológico en el orden Rickettsiales. Seleccionamos
organismos con diferentes patrones (Anaplasma marginale,
Brucella abortus 2308) con el objetivo de estudiar si la desorganización de la estructura de operón afecta la funcionalidad del
sistema. Utilizando RT-PCR verificamos la transcripción de tatA,
B y C en ambos organismos y la transcripción policistrónica en el
caso de B. abortus. La complementación con los genes tatA y tatB
de A.marginale en cepas E. coli sin tatA/tatE y sin tatB, respectivamente, restauró la funcionalidad del sistema; a diferencia de
TatC. En el caso de B. abortus, las tres subunidades restauraron
la funcionalidad. Utilizando qRT-PCR con el objetivo de estudiar
las tasas de transcripción, se verificó una relación de 23:1:1 para
los genes tatA, B y C en A. marginale; mientras que para B.
abortus fue de 1:1:1, consistente con la transcripción policistrónica.
Estos resultados sugieren que independientemente de la organización de los genes tat, el sistema conserva la funcionalidad. Por
otra parte, la relación estequiométrica de las tasas transcripcionales en A. marginale coinciden con la relación estequiométrica
propuesta para el complejo proteico en membrana; esto podría
sugerir la existencia de mecanismos alternativos de regulación en
organismos con un patrón disperso. El proceso de fragmentación
de operones fue descripto previamente en bacterias con genomas
reducidos. Estudiando la distribución de operones en genomas de
la clase a-proteobacterias encontramos una correlación positiva
entre el número de operones y el tamaño del genoma. Sin embargo, la proporción de genes que se encuentran en organización
de operón se mantiene constante en los organismos (60-80%) independientemente del tamaño. Por otro lado observamos que
genomas reducidos poseen mayor proporción de operones pequeños (=2 genes) respecto a los demás genomas (= o más 3 genes).
Considerando que la pérdida masiva de genes y los rearreglos
genómicos son fenómenos frecuentes en el proceso de reducción
genomica de las bacterias intracelulares, proponemos que estos
procesos afectan de manera directa los patrones de organización
de genes en el grupo de las bacterias del orden Rickettsiales. Esto
pone de manifiesto la importancia de estudiar en profundidad los
casos de fragmentación y su impacto en la conservación de la
funcionalidad de los sistemas, a fin de comprender los mecanismos biológicos de patogénesis e interacción con hospedadores y
su evolución, de modo de fortalecer el conocimiento en este grupo de patógenos.
P52 - 28160 ELEVADA FRECUENCIA DE MOVILIZACIÓN DEL
INTRÓN DE GRUPO II BACTERIANO S.MA.I2 DE Serratia
marcescens. QUIROGA, MP(1); NARDELLI, M(1); QUIROGA, C(2);
CENTRON, D(1)
(1) Facultad de Medicina – Universidad de Buenos Aires, (2)
MCGILL UNIVERSITY
Los intrones del grupo II son ribozimas capaces de autoescindirse mediante el mecanismo de splicing y movilizarse a
nuevas regiones de un genoma. Los intrones del grupo II codifican en su secuencia una proteína que actúa como cofactor. Esta
proteína, conocida como IEP, posee tres actividades: maturasa,
transcriptasa reversa y endonucleasa. La IEP se asocia al ARN
del intrón formando el complejo ribonucleoproteico (RNP), el cual
reconoce nuevas regiones de un genoma mediante el apareamiento de los sitios EBS en el intrón con los sitios IBS en el ADN.
Una vez apareados las RNPs con el ADN, el intrón del grupo II
se introduce en el ADN blanco utilizando un mecanismo ARN
dependiente. El intrón del grupo II de la clase C-attC S.ma.I2 fue
encontrado en un integrón de clase 1 del aislamiento clínico
Serratia marcescens SCH909. S.ma.I2 interrumpe el sitio de
recombinación, o attC, del cassette de resistencia a antibióticos
aadB localizado en la región variable del integrón. Estudios previos realizados en nuestro laboratorio demostraron que S.ma.I2
invade diferentes attCs mediante un mecanismo de recombinación
sitio específica ARN dependiente. Este mecanismo no solo requiere de los sitios de unión EBS y los sitios de unión IBS si no que
también necesita de la estructura secundaria provista por el attC.
Por otro lado, estudios evolutivos sugieren que el intrón S.ma.I2
comparte un ancestro con intrones de la clase C-attC localizados
en el genero Shewanella, el cual reconoce estructuras secundarias similares a los attCs. El objetivo de este trabajo es comparar
la capacidad de movilización del intrón S.ma.I2 a sitios blanco
provenientes de diferentes entornos genéticos mediante ensayos
de movilidad realizados in vivo. Se seleccionaron como sitio blanco a diferentes attC y estructuras secundarias y se realizaron
ensayos de movilidad in vivo para el intrón S.ma.I2 mediante PCR
de colonia. Los productos obtenidos fueron secuenciados. Se
observó que el intrón S.ma.I2 invade los sitios blanco propuestos
pero a muy diferentes frecuencias. Para el attCsat2 se obtuvo una
frecuencia de invasión del 1% mientras que para el sitio shSAR1, encontrado en el genoma de Shewanella spp., se alcanzó una
frecuencia del 15%. Nuestros resultados demuestran que el intrón
S.ma.I2 no sólo reconoce diferentes sitios attC sino que también
es capaz de invadir sitios en los que se habían encontrado insertos otros intrones del GII de clase C-attC y los reconoce con frecuencias muy dispares. Asimismo, la elevada frecuencia de invasión al sitio shSAR-1 aporta nuevas evidencias que sugieren que
el intrón S.ma.I2 está ligado desde el punto de vista evolutivo a
los intrones del género Shewanellaceae.
P53 - 27143 INTI1 PROVISTA EN TRANS POSEE LA CAPACIDAD DE ESCINDIR TODOS LOS CASSETTES, INCLUYENDO A
LOS CASSETTES INUSUALES ATTC-CATB2-ATTI2 Y ORFXYBFA-YBFB-YBGA, ENCONTRADOS EN EL INTEGRÓN DE
CLASE 2 IN2-8. RAMIREZ, MARIA SOLEDAD; QUIROGA, MARIA
PAULA; CENTRON, DANIELA.
Facultad de Medicina – Universidad de Buenos Aires
El transposón Tn7::In2-8, contiene un integrón de clase 2 el
cual posee un arreglo inusual siendo su estructura: sat2-aadBcatB2attI2-dfrA1-sat2-aadA1-orfX-ybfA-ybfB-ybgA. Dicho integrón
tiene la particularidad que río abajo del codón de terminación del
gen catB2, el sitio attC esperado ha sido reemplazado por una
secuencia de 244 pares de bases (pb) 100% idéntica a una porción del sitio de recombinación de los integrones de clase 2 denominado attI2, convirtiéndolo así en un cassette inusual al cual
indicaremos como attC-catB2-attI2. Asimismo, localizada río abajo
del gene ORFX se encuentra una secuencia parcial del attI (13
bp). Con el propósito de explorar desde un punto de vista funcional cuales cassettes y/o cassettes inusuales podían ser movilizados por la integrasa de tipo 1, se llevaron a cabo ensayos de
recombinación in vivo según lo descripto por Gravel et al, de todas las posibles estructuras movilizables encontradas en el In2-8
utilizando los diferentes plásmidos recombinantes construidos para
dicho fin. Todos los cassettes y cassettes inusuales localizados
en el In2-8 pueden ser movilizados por la IntI1 provista en trans
arrojando valores variables de frecuencia de escisión. La región
que contiene attC-catB2attI2-dfrA1-attC es reconocida por la IntI1
como un cassette fusionado, pero también IntI1 posee la capacidad de escindir al cassette inusual attC-catB2-attI2 con alta eficiencia. Para confirmar la escisión del cassette inusual, se diseñaron cebadores específicos para poner en evidencia la presencia del cassette circularizado, obteniendo amplificación positiva
para dos productos, lo cual esta indicando que la IntI1 reconoce
dos sitios para mediar la escisión. El análisis de secuencia mostró que los sitios de reconocimiento de la IntI1 para mediar dicha
movilización se corresponden uno de ellos a la G del propuesto
sitio core GTTAACC del attI2, mientras que el otro sitio es la G
de la secuencia GTTATGA localizada a 62 pb del TAA del gen
catB2. Resultados experimentales también revelaron que la estructura ORFX-ybfA-ybfB-ybgA es un elemento movilizable. La
escisión del ORFX y del ybfB fueron identificadas. A su vez la
estructura ORFX-ybfA-ybfB-ybgA puede ser movilizada por la IntI1
reconociendo dos sitios diferentes. Tanto la escisión del attCcatB2-attI2, como de los elementos contenidos en el modulo
ORFX-ybfA-ybfB-ybgA, muestran la plasticidad del sistema de
recombinación mediado por la integrasa de tipo 1.
P54 – 27144 EL PLÁSMIDO PDCMSR1, AMPLIAMENTE DISTRIBUIDO EN LOS AISLAMIENTOS DE ENTEROBACTERIAS DE
ARGENTINA, PUEDE SER ADQUIRIDO Y REPLICAR ESTABLEMENTE EN Acinetobacter baumannii (AB). RAMIREZ, MARIA
SOLEDAD; MERKIER, ANDREA KARINA; QUIROGA, MARIA
PAULA; CENTRON, DANIELA.
Facultad de Medicina - Universidad de Buenos Aires
Introducción: Ab es considerado un patógeno intrahospitalario
importante no solo en nuestro país sino en todo el mundo. Es bien
conocida su capacidad de evolucionar hacia la multiresistencia
antibiótica, existiendo reportes de aislamientos resistentes a todos los antibióticos disponibles para su tratamiento. Entre uno de
los mecanismos mas importantes para la adquisición de determinantes de resistencia antibiótica se encuentra la transferencia
45
horizontal de genes. Estudios previos de nuestro laboratorio han
identificado la alta dispersión del integrón In35 portador del gen
blaCTX-M-2, localizado en el plásmido pDCMSR1, en aislamientos de enterobacterias, no encontrándose presente en los aislamientos de Ab estudiados. Nuestro objetivo fue clarificar el resultado arriba mencionado evaluando la capacidad de Ab A118, aislamiento de Ab competente natural, de adquirir y mantener la
replicación del plásmido pDCMSR1. Materiales y Métodos: Los
ensayos de competencia natural y estabilidad plasmídica fueron
realizados según Ramírez et al. 2010. La expresión fenotípica de
blaCTXM-2 se evidencio mediante la realización de la CIM utilizando tiras de E-test en medio sólido. Se llevo a cabo la extracción plasmídica utilizando el kit QIAfilter midi kit (QIAGEN). Se
determinó la presencia de los genes e integrones presentes en
pDCMSR1 a través de diferentes PCRs utilizando primers específicos. Resultados: Ab A118 mostró la capacidad de adquirir y
replicar establemente al plásmido pDCMSR1, al menos hasta la
generación 40. Los resultados de CIM mostraron un aumento en
la CIM a CTX en aquellas células que portan el plásmido (32-48
µg/ml vs 8 µg/ml), la determinación de la CIM a CAZ también
mostró un aumento de 3 diluciones. Se confirmó por PCR la presencia del In35 como así también se identificó otro integrón portador de los cassettes aadB-aadA1. Conclusiones: Ab es capaz
de adquirir y mantener al plásmido responsable de la adquisición
del principal mecanismo de resistencia a cefalosporinas de 3era
generación en enterobacterias en nuestro país. Asimismo se demostró que la adquisición de dicho plásmido aumenta tanto la CIM
a CTX como a CAZ. Una posible explicación que justificaría los
estudios epidemiológicos donde no se encuentra dicho plásmido
en los aislamientos de Ab podría deberse a que el nicho ecológico
que comparten no es propicio para la transferencia y adquisición
de dicho determinante de resistencia.
P55 - 27156 DISPERSIÓN DE INTEGRONES DE CLASE 1 Y CLASE 2 EN CLONES MULTIRESISTENTES DE Acinetobacter
baumannii (AB). RAMIREZ, MARIA SOLEDAD(1); STIETZ, MARIA SILVINA (1); VILACOBA, ELIZABET (1); JERIC, PAOLA (1);
LIMANSKY, ADRIANA(2); CATALANO, MARIANA (1); CENTRON,
DANIELA(1)
(1) Facultad de medicina - Universidad de Buenos Aires, (2) Universidad de Rosario
Ab es un patógeno oportunista de importancia clínica en nuestro medio hospitalario, siendo en nuestro país una problemática
de larga data. En los últimos años ha comenzado a tomar destacada relevancia a nivel internacional dado que ha ocurrido un incremento de aislamientos de Ab multirresistentes (AbMR) en todo
el mundo. Los integrones de clase 1 (In1) y clase 2 (In2) se encuentran directamente vinculados con cassettes de resistencia en
aislamientos clínicos multiresistentes. Resultados previos de nuestro laboratorio relevaron una dispersión particular de In2 en dicha
especie. Es importante mencionar que los aislamientos utilizados
en dicho estudio provenían todos de centros localizados en Buenos Aires. En el presente trabajo se estudió la presencia de In1
e In2 en 20 aislamientos de AbMR recolectados durantes los años
2005-2009 en diferentes centros de la ciudad de Rosario a fin de
contribuir en la epidemiología de dichos elementos en nuestro
País. El gen intI1 fue evidenciado en 11 aislamientos, estando presente el gen intI2 en 14. En contraste a resultados previos de
nuestro laboratorio, en los cuales pocos aislamientos resultaron
portadores de ambos genes, 7 aislamientos poseían intI1 e intI2.
Se empleó la técnica de PFGE para identificar la clonalidad de
los aislamientos, evidenciando la presencia de 4 clones diferentes, indicando una diseminación policlonal de dichos elementos.
El clon III resultó ser el predominante, lo cual es otra característica distintiva con respecto a las aislamientos previamente analizados donde los clones más predominantes son el clon I y IV. Se
llevó a cabo la caracterización de los In1 mediante el empleo de
la técnica de cartografía por PCR y posterior secuenciación evidenciando que la estructura predominante entre los In1 encontrados (8/11) es el arreglo correspondiente a los cassettes aacC1orfP-orfQ-aadA1, arreglo ampliamente distribuido entre los AbMR
documentados en la literatura. Se ha encontrado una elevada dis-
46
persión de In1 e In2 en los diferentes clones de AbMR estudiados, resultando 7 de ellos ser portadores de ambos integrones y
mostrando el predominio del clon III entre los aislamientos estudiados. Este resultado muestra una característica distintiva de
dichos aislamientos recuperados en la ciudad de Rosario respecto
a nuestros resultados previos documentados. Dado que la mayoría de los aislamientos son portadores de integrones, consideramos que es importante el estudio constante y el conocimiento de
la frecuencia de diseminación de dichos elementos como también
de los genes de resistencia asociados a ellos a fin de contribuir
en el control de infecciones de dicha especie.
P56 - 27194 Corynebacterium pseudotuberculosis: PERFIL
ENZIMÁTICO DE CEPAS AISLADAS DE PEQUEÑOS RUMIANTES. GALLARDO, ADRIANA(1); AZEVEDO, VASCO(2); ESTEVAO
BELCHIOR, SILVIA(1)
1-Centro Regional de Investigaciones y Desarrollo Científico-Tecnológico (CRIDECIT), Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco (UNPSJB).
Comodoro Rivadavia, Chubut, Argentina. 2-Dto. de Biologia General, Instituto de Ciencias Biologicas-Universidad Federal de
Minas Gerais, ICB/UFMG. Brasil.
Corynebacterium pseudotuberculosis es el agente etiológico
de linfoadenitis caseosa (LC), una enfermedad crónica que afecta a cabras y a ovejas, ocasionando inflamación de los nódulos
linfáticos, anorexia y muerte. Esta patología causa pérdidas económicas importantes, en la industria ganadera a nivel mundial. Las
propiedades invasoras, de esta bacteria, son atribuidas a la elaboración de enzimas extracelulares y al contenido lipídico de su
pared celular. El objetivo del presente trabajo fue analizar y comparar los perfiles enzimáticos y la actividad hemolítica entre aislamientos de C. pseudotuberculosis provenientes de distintos lugares geográficos. Se estudiaron 38 cepas, 6 de origen caprino y
32 de ovinos, aislados de distintos sitios de lesión y procedentes
de la Región Patagónica (desde la provincia de Tierra del Fuego
hasta la provincia de Río Negro) y Brasil (estado de San Pablo Aracatuba y estado de Bahía). Para determinar la producción
enzimática, se empleo agar base adicionado con diferentes
sustratos de acuerdo a la prueba a desarrollar. La actividad
proteolítica se demostró en agar tripteína soya (TS) adicionado
con 20% de leche descremada y en medio gelatina. Para actividad lipolítica se adicionó 1% Tween 80 en agar TS, para lecitinasas un 5% de solución yema de huevo y para amilasas un 1%
de almidón. El agar yema de huevo permitió evidenciar además
actividad proteolítica y lipolítica. La coagulasa libre se determinó
mediante la prueba en tubo y DNAsas en agar-DNA. Además, se
ensayo la hidrólisis de urea y fenil alanina. Por otra parte se observó la capacidad hemolítica en medios de cultivo utilizando agar
TS suplementado con 5% de sangre de carnero, de caballo y
humana. Todas las pruebas se incubaron a 37°C hasta 10 días
con observaciones diarias. Las cepas estudiadas mostraron actividad proteolítica en agar yema de huevo (100%) y agar leche
descremada (65%); actividad lipolítica en agar yema de huevo y
Tween 80 (100%) y ureasa (100%). Todas las cepas fueron débilmente positivas para la producción de amilasas. El 98% de los
aislamientos mostraron hemólisis en agar sangre humana y el
100% en agar sangre de carnero. Fueron negativas para la producción de coagulasas, DNAsas, lecitinasas, gelatinasas, fenil
alanina deaminasas y capacidad hemolítica en sangre de caballo. Los aislamientos estudiados, de diferentes zonas geográficas,
presentaron un perfil enzimático semejante a excepción de la producción de caseinasas y la actividad hemolítica en agar sangre
humana que determinaron diferentes biotipos entre las cepas.
P57 - 27233 SILENCIAMIENTO DEL GEN ftsZ MEDIANTE TECNOLOGÍA ANTISENTIDO: IMPLICANCIAS EN EL DESARROLLO
DE NUEVAS ESTRATEGIAS TERAPÉUTICAS. DAVIES SALA,
CAROL G (1); SOLER BISTUE, ALFONSO J C (1); ZORREGUIETA,
ANGELES (1); TOLMASKY, MARCELO E (2)
(1) Fundación Instituto Leloir – UBA, (2) California State University
Fullerton (CSUF), USA.
La proteína FtsZ es un análogo bacteriano de la tubulina, altamente conservada en el dominio bacteria y cuyo correcto dosaje
es clave para la división celular. Una disminución del mismo es
suficiente para imposibilitar la supervivencia de la célula. La
ARNasa P es capaz de mediar el corte de una molécula de ARN
en presencia de un oligorribonucleótido complementario, conocido como External Guide Sequence (EGS). Para que cumpla dicha función, el EGS debe poseer ciertas características que determinan la estructura adecuada cuando interacciona con el ARN
blanco. La tecnología EGS se ha empleado con éxito para silenciar diversos genes bacterianos. Recientemente, hemos determinado que oligonucleótidos híbridos que contienen residuos de
ADN y ácidos nucleicos cerrados (LNA) son resistentes a nucleasas bacterianas pero de todas maneras son capaces de inducir la actividad de ARNasa P. Estas propiedades les permiten
generar el silenciamiento del gen de resistencia a amikacina
aac(6’)Ib en células naturalmente permeables cuando son administrados exógenamente. La aplicación de dicha tecnología al
silenciamiento de ftsZ podría llevar a la identificación de EGSs con
la capacidad de actuar sinérgicamente con antibióticos existentes o, si el efecto es lo suficientemente potente, de constituirse
en antimicrobianos de acción independiente. A partir de un modelado in silico (mfold webserver) se diseñaron EGSs complementarios a regiones potencialmente accesibles. Estos EGSs marcados radiactivamente en el extremo 5’ fueron analizados para determinar su capacidad de unión al ARNm ftsZ así como de inducir su degradación. La unión se determinó por ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA) y la capacidad de inducir
degradación se ensayó por incubación del mensajero radiactivamente marcado con las dos subunidades de la ARNasa P
(ARN M1 y la proteína C5). Se diseñaron EGSs complementarios
a las dos regiones más extensas predichas como simple cadena.
De los dos EGSs diseñados se determinó que sólo el dirigido
contra una de dichas regiones (EGS2) fue capaz de unirse al ARN
mensajero ftsZ y de inducir el corte en presencia ARNasa P. Dado
que pequeñas diferencias en la posición relativa del EGS pueden
resultar en grandes diferencias de actividad, se llevó a cabo un
estudio de optimización generando EGSs de la misma longitud,
pero corridos solapadamente en una, dos o tres bases hacia cada
extremo con respecto a la secuencia de EGS2. Se determinó que
todos los EGSs fueron capaces de unirse con alta eficiencia y de
inducir el corte in vitro del mensajero, uno de ellos con una eficiencia superior al resto. Nuestros resultados indican que existe
al menos una región en el mensajero ftsZ capaz de interactuar
productivamente con EGSs. Los ensayos de optimización en el
diseño de los EGSs permitieron identificar una secuencia con
actividad lo suficientemente alta para llevar a cabo futuros estudios de silenciamiento de ftsZ in vivo.
P58 - 27353 EMPLEO DE MICROSCOPÍA DE FUERZA ATÓMICA PARA CUANTIFICAR PROPIEDADES ELÁSTICAS DE SUPERFICIE DE Bordetella pertussis. RELACIÓN CON LA EXPRESIÓN DE FACTORES DE VIRULENCIA A NIVEL DE MEMBRANA. ARNAL, LAURA(1); VELA, M ELENA(2); SERRA, DIEGO O(1);
CATTELAN, NATALIA(1); SALVAREZZA, ROBERTO(2);
YANTORNO, OSVALDO M(1)
(1) Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales (CINDEFI), (2) Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas (INIFTA).
La tos convulsa o pertussis es una enfermedad altamente infecciosa del tracto respiratorio causada por Bordetella pertussis
(Bp), un patógeno estrictamente humano. En el siglo XX pertussis
fue una de las enfermedades más comunes en niños. Se ha reportado que los adolescentes y adultos constituyen un nicho donde
estas bacterias persisten y desde el cual se transmiten a infantes. Recientemente hemos reportado que este organismo puede
crecer como biofilm adherido a superficies (1) y que el biofilm
podría constituir la forma en que B. pertussis persiste en su
hospedador. Las propiedades adhesivas y viscoelásticas de las
bacterias tienen un rol importante en las distintas etapas del desarrollo en biofilm. La microscopía de fuerza atómica (MFA) constituye una nueva herramienta para caracterizar propiedades físi-
cas de células microbianas, posibilitando cuantificar propiedades
namomecánicas de bacterias creciendo en biofilm (2). En el presente estudio nosotros reportamos el uso de MFA para cuantificar
el modulo de elasticidad de superficie de distintas cepas de B.
pertussis. Se estudiaron una cepa salvaje de referencia B. pertussis
Tohama I, y dos mutantes, uno deficiente en el factor de virulencia
hemaglutinina filamentosa (FHA) (FHA-), y otro avirulento (Bp539),
el cual no expresa ningún factor de virulencia conocido. Para determinar las propiedades elásticas de estas bacterias se realizaron
curvas de fuerza sobre su superficie y luego se transformaron en
curvas de fuerza vs. indentación. Estas se ajustaron posteriormente con un modelo de Hertz apropiado y a partir de estos datos se
calculó el módulo de Young o módulo de elasticidad para las distintas cepas. Los valores encontrados fueron: 0.24 ± 0.03, 0.14 ±
0.02 y 0.07 ± 0.03 MPa para Tohama I, Bp FHA- y Bp 539 respectivamente. Los resultados obtenidos permiten relacionar propiedades de elasticidad de la cubierta bacteriana con el nivel expresión
de proteínas en su superficie. La MFA demostró ser una metodología adecuada para cuantificar la contribución de factores de virulencia a las propiedades elásticas de las células bacterianas. Esta
tecnología se está aplicando para monitorear cambios en las propiedades viscoelásticas durante la formación del biofilm de B.
pertussis, tratando de relacionar las mismas con la persistencia de
la población en su hospedador.
P59 - 27373 EFECTO DE ALTAS TEMPERATURAS SOBRE UN
AISLAMIENTO DE Corynebacterium pseudotuberculosis.
ALVAREZ, LAURA ALEJANDRA; GALLARDO, ADRIANA A;
ABALOS, ANDREA; ESTEVAO BELCHIOR, SILVIA
Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco (UNPSJB)
- Centro Regional de Investigaciones y Desarrollo Científico-Tecnológico (CRIDECIT).
Corynebacterium pseudotuberculosis es un bacilo gram-positivo causante de linfoadenitis caseosa (LAC) en ovejas y cabras. El
contagio entre animales suele producirse por vía cutánea, principalmente durante la esquila. El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto antibacteriano de altas temperaturas sobre una cepa
autóctona de C. pseudotuberculosis. Se trabajó con un aislamiento, en cultivo puro, identificado metabólica y genéticamente como
C. pseudotuberculosis biovar ovis, recuperado de un absceso en
un ganglio de un ovino de la zona de Río Gallegos, Santa Cruz. El
mismo se sometió a temperaturas comprendidas entre 40 y 65 °C
en tres sistemas de distintas características: en suspensión en solución fisiológica estéril; en agua dura con presencia de materia
orgánica y sobre la superficie de peines de esquila de acero inoxidable. En los dos primeros ensayos se llevó a cabo un recuento
de colonias por triplicado a distintos tiempos y se calculó el tiempo
de reducción decimal (D); el último ensayo se realizó de manera
cualitativa debido a la superficie irregular de los peines. La recuperación de la cepa se realizó en agar Tripteína Soya, a 37 °C por
48 hs. Se observó que al cabo de 3 min a 65 °C la cepa fue
inactivada efectivamente en condiciones limpias. Para los ensayos
con materia orgánica se emplearon altos niveles de sustancias
interferentes para asemejarse a las condiciones de campo, observándose que su incorporación prolonga el tiempo de contacto hasta 5 min. Se presentan en la tabla los tiempos D obtenidos para
las suspensiones. En los soportes contaminados con la cepa la
inactivación térmica se produjo en las mismas condiciones. A temperaturas inferiores el tratamiento fue inefectivo.
Temperatura
Condiciones
50°C
Limpias
Tiempo D (min)
21,74
50°C
con materia
orgánica
39,7
65°C
Limpias
0,61
65°C
con materia
orgánica
0,93
La aplicación de temperaturas de 65°C por tres minutos sobre superficies y/o líquidos contaminados con C. pseudotuberculosis permitiría eliminar el microorganismo. En caso de encontrarse materia orgánica los tiempos de contacto deben aumentarse. El uso de altas temperaturas se considera una herramienta apropiada y de fácil aplicación para la disminuir la trasmisión
de C. pseudotuberculosis, evitando los perjuicios en la producción
ganadera por LAC.
47
P60 - 27593 IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS PERIPLASMÁTICAS INVOLUCRADAS EN LA BIOGÉNESIS DE MßLS EN
BACTERIAS GRAM-NEGATIVAS. BRAMBILLA, LUCIANO(1);
VIALE, ALEJANDRO(1)
(1) Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR,
CONICET), Departamento de Microbiología, FCByF, UNR, Rosario, Argentina.
La producción de metalo-ß-lactamasas (MßL) por parte de
bacterias gram-negativas es uno de los mecanismos de resistencia a antibióticos ß-lactámicos mas comunes. GOB-18 es una MßL
dependiente de zinc (Zn) identificada en el patógeno oportunista
Elizabethkingia meningoseptica. Una vez sintetizada en el citoplasma bacteriano es secretada de manera desplegada al espacio
periplasmático donde ocurre la adquisición del ión Zn (II) y su
plegado final al estado nativo. Nosotros estamos estudiando factores proteicos que intervienen en la biogénesis/ensamble de
MßLs y recientemente hemos determinado que la secreción de
GOB en Escherichia coli requiere la cooperación del sistema DnaK
con la maquinaria de secreción Sec. Hemos identificado también
que la ausencia de la proteína periplasmática DacD disminuye la
resistencia a cefotaxima sugiriendo que DacD coopera en la
biogénesis de GOB en el periplasma. El objetivo de este trabajo
ha sido elucidar el rol de DacD en este proceso. Con este fin se
obtuvieron a través de shock hiposmótico las fracciones de proteínas periplasmáticas de las cepas parental de E. coli y mutante
por deleción en dacD y se analizaron por western blot con antiGOB lo cual reveló menores cantidades de la enzima en la cepa
mutante. Utilizando fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) como
inhibidor de proteasas se observó un aumento en las cantidades
de GOB en los extractos así como la restitución de los niveles de
resistencia en la mutante, señalando a la degradación como destino final de GOB secretada en la cepa mutante. Estos resultados sugieren que DacD participa en la estabilidad de la MßL GOB
en el periplasma bacteriano.
P61 - 27644 EFECTO INHIBITORIO DE LIPOSOMAS SOBRE EL
CRECIMIENTO DE Trypanosoma cruzi. DIBLASI, LORENA(1);
HERMIDA, LAURA(2); PAVETO, CRISTINA(3); ROSI, PABLO(1) (4)
(1) Departamento de Ciencia y Tecnología - Universidad Nacional de Quilmes; (2) Laboratorio de Liberación Controlada - INTI;
(3) Instituto de Investigación en Ingeniería Genética y Biología
Molecular - CONICET; (4) Facultad de Farmacia y Bioquímica IQUIFIB - UBA.
Introducción: El protozoario flagelado Trypanosoma cruzi en
su estadío de epimastigote posee actividad endocítica, además
esta forma replicativa puede cultivarse en condiciones de laboratorio en medio líquido por lo que es la más adecuada para estudiar la acción de liposomas (LP) en el crecimiento celular. Los LP
son estructuras lipídicas capaces de encapsular diversos compuestos. Son ampliamente utilizados para vehiculizar compuestos polares a través de la membrana celular. Objetivo: Evaluar el
efecto de liposomas con distintas composiciones lipídicas y distintos tamaños como inhibidores del crecimiento de epimastigotes,
células endocíticas de Trypanosoma cruzi. Materiales y Métodos:
Se prepararon suspensiones de fosfatidilcolina de huevo (EPC)
y fosfatidilcolina de soja (SPC) a concentraciones finales de 13
mg/ml en búffer HEPES 10 mM pH=7,4 conteniendo: 100% SPC,
100% EPC y 50% EPC-50% SPC. Cada suspensión fue sometida a los siguientes tratamientos sucesivos: 1) disolución en
HEPES; 2) sonicado por 60'; 3) extrusión 5 veces por membrana
de acetato de celulosa de 800 nm de diámetro de poro (dp); 4)
idem 400 nm dp; 5) idem 200 nm dp; 6) idem 100 nm dp; además se hizo una extrusión por membrana de 800 nm dp, sin
sonicación previa. Luego de cada tratamiento se tomaron alícuotas
de 2 ml para su uso en cultivos celulares. En todos los casos estas
alícuotas fueron conservadas en atmósfera de N2 y a 8 °C. El tamaño de partícula en las suspensiones se determinó por Dynamic
Light Scattering en un Malvern Zetasizer NanoS. Resultados Y
Conclusiones: Se observó que el origen de la fostatidilcolina utilizada en la obtención de los LP influye en la inhibición del creci-
48
miento de epimastigotes. En el caso de la suspensión 100% EPC
se observó un claro efecto inhibitorio correlacionado positivamente
con el aumento de la concentración de LP. Por el contrario, los
LP formados a partir de 100% SPC muestran un efecto inhibitorio máximo a concentraciones determinadas (0,16 mg/ml), por
encima y por debajo de las cuales el efecto es menor. Los LP
obtenidos a partir de 50% EPC- 50% SPC presentaron efectos
sinérgicos positivos con un comportamiento similar al de LP 100%
SPC. Cuando la suspensión original de los lípidos, sin sonicar ni
extrudar, es probada, tanto 100% EPC, como 50% EPC-50% SPC
muestran una clara actividad inhibitoria, mientras que 100% SPC
no muestra actividad inhibitoria alguna en el rango de concentraciones evaluadas. La máxima acción inhibitoria fue detectada para
LP de 100 nm de diámetro de composición 50% EPC-50% SPC.
P62 - 27734 ANÁLISIS POR MAPEO ÓPTICO DE LAS REGIONES RELEVANTES AL FENOTIPO DE SUSCEPTIBILIDAD A
ANTIBIÓTICOS EN Acinetobacter baumannii A118. RAMIREZ,
MARIA SOLEDAD; CENTRON, DANIELA (1); TOLMASKY,
MARCELO E(2)
(1) Depto. Microbiología, Facultad de Medicina – UBA, (2)
California State University of Fullerton, CSUF, USA.
Acinetobacter baumannii (Ab) es un patógeno oportunista
emergente responsable de un creciente número de infecciones
nosocomiales. Los aislamientos de Ab son usualmente multirresistentes, siendo en algunos casos resistentes a todos los
antibióticos disponibles para su tratamiento. Dicha característica
no solo complica su tratamiento y erradicación sino que también
crea dificultades para el desarrollo de estudios genéticos. La cepa
A118, aislada de una muestra de hemocultivo de un paciente internado en la unidad de cuidados intensivos de un hospital de la
Ciudad de Buenos Aires, es susceptible a un gran numero de
antibióticos por lo cual fue propuesta como un modelo ideal para
estudios genéticos. El objetivo del presente trabajo fue identificar
la presencia y/o ausencia de regiones relevantes al fenotipo de
susceptibilidad evidenciado en Ab A118 mediante el empleo de
mapeo óptico. El mapa óptico de Ab A118 se realizó en OpGen,
Inc. Se utilizó el software MapSolver software 2.1.para llevar a
cabo la comparación y análisis del mapa óptico de Ab A118 con
los generados electrónicamente a partir de los genomas de Ab
conocidos. Se realizó amplificación por PCR utilizando primers
apropiados para confirmación del análisis. Se encontró una
deleción de alrededor unos 300 pb en un gen que codifica para
un proteína transmembrana, la cual se encuentra presente en
todos los genomas de Ab secuenciados. Dicha proteína pertenece a la superfamilia de transportadores y actuaría como bomba
de eflujo de drogas. El gen que codifica para la PBP2 presentó
una deleción de aproximadamente 240 pb. Asimismo, la región
de resistencia denominada AbaR, que normalmente se encuentra insertada en el gen comM de un gran numero de Ab
multirresistentes, esta ausente en el Ab A118. En cambio se observó que el gen comM está intacto. La susceptibilidad del Ab
A118 podría ser explicada, al menos en parte, por las ausencia o
deleción de las regiones estudiadas, que son parcialmente responsables de los fenotipos de multiresistencia observados en la
mayoría de las cepas de Ab.
P63 - 27849 ESTUDIO DE LA VARIABILIDAD DEL GEN intI1 Y
EL SITIO attI1 PRESENTES EN AISLAMIENTOS CLÍNICOS Y
LA DISPERSIÓN DE ESTE ÚLTIMO EN LOS GENOMAS
BACTERIANOS. QUIROGA, MP; NARDELLI, M; RAMIREZ, MS;
CENTRON, D.
Depto. Microbiología, Facultad de Medicina – UBA.
Los integrones de clase 1 son elementos genéticos que contienen los componentes de un sistema de recombinación sitio
específico y generalmente están asociados a multirresistencia
antibiótica en aislamientos clínicos. Están compuestos por el gen
intI1, que codifica la recombinasa IntI1, el sitio de recombinación
attI1, y la región promotora Pc que permite la expresión de los
genes cassettes. Los genes cassettes consisten de un marco de
lectura abierto y un sitio de recombinación attC, que es reconocido por la integrasa para escindir del integrón el gen cassette e
insertarlo en el attI1 o en otro attC. En nuestro laboratorio, encontramos ordenamientos atípicos dentro de la región variable de
integrones de clase 1 y 2, donde los sitios attC esperados fueron
reemplazados por una deleción de los sitios de recombinación
attI1 o attI2, generando genes cassettes inusuales. El objetivo de
este trabajo fue evaluar la variabilidad del gen intI1 y del sitio attI1
de aislamientos clínicos e investigar la dispersión del attI1 en los
genomas bacterianos. Utilizamos el algoritmo Blastn del programa de herramientas de búsqueda de alineamiento básico local
(BLAST) del sitio web PubMed [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
pubmed/]. Cuando fue necesario, se utilizó la base de datos de
microbios BLAST, optimizando la búsqueda incluyendo sólo los
genomas completos y ajustando los parámetros del algoritmo.
Encontramos que dentro de las 212 muestras clínicas que presentaban el gen intI1 completo y el sitio attI1 en la base de datos
GenBank, hay 16 alelos del gen intI1, con mutaciones puntuales.
El sitio attI1 también mostró mutaciones puntuales pero en pocos
casos y no siempre asociadas con el mismo intI1. De la búsqueda del sitio attI1 en los genomas, encontramos que en su versión
completa siempre se encontró asociado al gen intI1. También
encontramos deleciones, comprendiendo la porción de 13 pares
de bases de este sitio que fue encontrada previamente asociada
a algunos genes cassettes inusuales y en este estudio fueron identificadas en 115 de 696 genomas analizados. Mientras que hay
una variedad de alelos de intI1 entre las muestras clínicas, el attI1
muestra una estabilidad remarcable mostrando que esta asociación fue seleccionada y está bien establecida. La dispersión de
las deleciones del attI1 (comprendiendo la porción que se encontró
asociada a algunos genes cassettes inusuales) en los genomas
bacterianos pertenecientes a grupos bacterianos distantes, mostró que la integrasa IntI1 tiene numerosas oportunidades de
recombinar en la naturaleza.
P64 - 27875 COLECCIONES DE CULTIVOS MICROBIANOS EN
ARGENTINA. DAVEL, GRACIELA(1); MARTOS, GLADYS(1);
TERRAGNO, RAQUEL(1); FLOCCARI, MIRTHA(1); LEVIS,
SILVANA (1); LEARDINI, NELIDA(1); PERTICARI, ALEJANDRO(1);
SFREDDO, ELIZABETH(1)
(1) Subcomisión de Colecciones de Cultivos Microbianos,
S.C.C.M., Asociación Argentina de Microbiología.
A lo largo de décadas, distintas instituciones científicas se
avocaron con dedicación y mucho esfuerzo a la conservación ex
situ de una amplia variedad de microorganismos. El desconocimiento de la situación y el número de las mismas, ha impulsado
a la Subcomisión de Colecciones de Cultivos Microbianos perteneciente a la Asociación Microbiológica Argentina, a realizar un
relevamiento de colecciones de cultivo en Argentina. Hasta el
momento, se han registrado 25 centros, de los cuales 15 están
registrados en la Federación de Colecciones de Cultivos
Microbianos para América Latina y El Caribe (FELACC), ocho
solamente en la WFCC y 3 en ambas federaciones. Las colecciones argentinas incluyen microorganismos de variados orígenes
y aplicaciones: de interés biomédico, tales como la colección de
hongos miceliales y levaduras, las de bacterias de origen humano, alimentario y ambiental del Instituto Malbrán. Algunas colecciones conservan microorganismos aislados de nichos específicos de interés agrícola, industrial o alimentario como las colecciones de las universidades de Cuyo, de Buenos Aires y del
Comahue; de bacterias simbióticas y microorganismos promotores de crecimiento agrícola, de hongos miceliales y levaduras de
las universidades de Buenos Aires, Rosario y La Plata; de bacterias de interés veterinario como INTA-EEA. Otras mantienen grupos taxonómicos únicos aislados de distintos nichos como la colección de CERELA, exclusiva de bacterias lácticas. Algunos centros se dedican a la preservación de hongos comestibles y medicinales en institutos del CONICET, o de hongos entomopatógenos,
en la Universidad de La Plata, o bacterias de ambientes extremos en PROIMI, Tucumán. La mayoría de estas colecciones surgieron como resultado de proyectos de investigación de universi-
dades o centros pertenecientes a organismos oficiales con atención a problemas específicos en diferentes áreas como agricultura, salud, medio ambiente, industria, alimentación, etc. El estado
de conservación de las colecciones es variable y depende de la
disponibilidad de recursos financieros en la institución, o de fondos secundarios derivados de proyectos de investigación, excepto las que realizan servicios a la industria o trabajan con entidades privadas. No hay financiamiento oficial específico. Muchas
cuentan con personal capacitado en gestión de calidad pero muy
pocas lo aplican. En general, no cuentan con personal específico
designado y el trabajo de mantenimiento lo realizan investigadores, docentes o profesionales como actividad secundaria a la que
desempeñan habitualmente. Estas colecciones constituyen un
registro de la biodiversidad microbiana de nuestro país, son fuente
potencial de germoplasma y materia prima indispensable para
investigación y el desarrollo biotecnológico de Argentina.
MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y AMBIENTAL
P65 - 27055 NUEVOS MICROORGANISMOS RIZOSFÉRICOS,
CON POTENCIALIDAD COMO COINOCULANTES DEL GÉNERO Bradyrhizobium EN SOJA. MANEIRO, MARIA LAURA(1);
GONZALEZ, NORMA(2); ANDREOLI, YOLANDA(2)
(1) FCA, Universidad Nacional de Mar del Plata, (2) Unidad
Integrada Balcarce
Se buscaron microorganismos capaces de promover el crecimiento y/o nodulación del cultivo de soja (PGPR y NPR, respectivamente), en suelos sin historia de cultivo de soja (SS) y con
historia sojera, bajo siembra directa (SD) y convencional (LC). Los
muestreos fueron realizados en los estadios V1 y V4. Se aislaron
616 microorganismos de la rizosfera de plántulas de soja a partir
de tres medios de cultivo: Plate Count Agar (PCA), King B (KB),
para aislamiento de Pseudomonas y medio de cultivo adicionado
con Rojo Congo (RC), para el aislamiento de Azospirillum. Cincuenta y cuatro aislamientos fueron seleccionados y evaluados en
ensayos de compatibilidad con Bradyrhizobium japonicum cepa
E109, in vitro; ninguno de ellos resultó antagonista de E109. Se
probó su crecimiento en medio de cultivo con 1 amino
ciclopropano 1 ácido carboxílico (ACC) como única fuente de N,
donde los aislamientos 10, 11, 13, 16, 17, 19, 32. 33 y 34 mostraron un considerable crecimiento, que evidenció la presencia de
la enzima ACC deaminasa, responsable, en los organismos, de
la descomposición del ACC, que es precursor del etileno; esta
característica les confiere, eventualmente, propiedades PGPR.
Asimismo, se los evaluó por su capacidad de promover la
elongación de radícula de colza, en ocho experimentos según
diseños completamente aleatorizados con n=60, resultando mejorar significativamente el comportamiento del testigo los aislamientos 6, 10, 13, 33, 36, 38 y 40. Se seleccionaron los siete de
mejor y dos de peor comportamiento, según su capacidad de promoción de crecimiento de radícula de colza y se los integró a un
experimento de coinoculación de plantas de soja en condiciones
controladas, en cámara de cría. En el mismo se incluyeron, además, un testigo inoculado solamente con B. japonicum E109, un
testigo absoluto (sin inocular) y un tratamiento con Azospirillum
brasilense Az39, como referencia. Se empleó un diseño completamente aleatorizado con diez repeticiones. Se midieron número de
nódulos en corona, número y peso de nódulos totales, largo de
raíz principal y laterales, número de raíces laterales, peso total
de raíces, peso de parte aérea y peso total de planta. Los resultados fueron sometidos al análisis de la varianza empleando
INFOSTAT versión 2005 e.1. No se encontraron diferencias significativas entre los nueve aislamientos probados, excepto para
número total de nódulos, variable para la cual, el aislamiento 10
superó significativamente a la cepa de referencia A. brasilense
Az39 y a los aislamientos 6 y 36. Este aislamiento exhibió, asimismo, crecimiento positivo en un medio con ACC como única
fuente de N. Los siete aislamientos seleccionados por promover
la elongación de la radícula de colza fueron analizados por el
método rápido API BioMerieux, con el cual se identificó que el
aislamiento 13 corresponde a Pseudomonas fluorescens, los res-
49
tantes aislamientos no pudieron ser identificados con precisión
mediante este método y se consideraron como desconocidos.
P66 - 27128 RESPUESTA AL ESTRÉS SALINO Y EXPRESIÓN
DE ACUAPORINAS EN PLANTAS DE CEBADA INOCULADAS
CON Azospirillum. ZAWOZNIK, M; AMENEIROS, M; BENAVIDES,
M; GROPPA, M
Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA
Azospirillum es una PGPR que incrementa el rendimiento de
diversos cultivos a través de distintos mecanismos. Se ha documentado que las plantas inoculadas con esta PGPR exhiben
mayor tolerancia a estreses abióticos, como el hídrico y el
osmótico. En el contexto de los mecanismos de resistencia al
estrés hídrico y salino, se ha informado que la regulación de la
expresión de las acuaporinas sería un mecanismo para evitar la
pérdida de agua de las células. Sin embargo, hasta el momento
no hay trabajos en los que se haya investigado la expresión de
acuaporinas en raíces de plantas colonizadas por Azospirillum. El
objetivo de este trabajo fue investigar la respuesta al estrés salino y la expresión de acuaporinas en plantas de cebada inoculadas con Azospirillum. Para ello se cultivaron plantas de cebada
sin inocular o inoculadas con la cepa de A. brasilense Az39 (A1)
o con una cepa presente en un inoculante comercial (A2). Todas
ellas se hicieron crecer en vermiculita. Al quinto día de la emergencia se inició el tratamiento salino adicionando a la solución de
riego 200 mM NaCl. A los 0, 3, 7, 12 y 19 días de tratamiento se
evaluó la biomasa total y de raíces, la altura de las plantas, el peso
seco de la parte aérea y el contenido relativo de agua. Asimismo, se determinó el contenido de poliaminas y el nivel de expresión del gen que codifica la acuaporina de raíz de cebada
HvPIP2,1. También se midió la concentración de sodio y de
potasio. El tratamiento salino produjo en todas las plantas una
significativa reducción de la biomasa total, atribuible fundamentalmente a la caída de la biomasa radical; sin embargo, en las
plantas inoculadas con la cepa A1 esta merma fue significativamente inferior que en las plantas sin inocular y que en las plantas inoculadas con A2. A los 12 días de tratamiento salino, la
biomasa de la parte aérea disminuyó 57%, 52% y 31% en las plantas sin inocular, inoculadas con A2 o con A1, respectivamente. A
ese tiempo, la biomasa radical de las plantas expuestas a estrés
salino e inoculadas con A1 fue 20% mayor que la del testigo sin
inocular. El tratamiento salino ocasionó un aumento de la
putrescina a partir del día 12 sólo en las plantas no inoculadas.
Los niveles de espermina de las plantas inoculadas se mantuvieron por debajo de los niveles de las plantas control. La espermidina no mostró mayores variaciones. No se encontró cadaverina
en ninguna de las muestras analizadas. En las plantas control no
se detectaron transcriptos del gen HvPIP2,1 a ninguno de los tiempos evaluados. Tanto el tratamiento salino como la inoculación con
Azospirillum indujeron la expresión del gen citado. La cantidad de
transcripto detectada fue significativamente mayor en las raíces
de plantas inoculadas con la cepa A1. De hecho, las raíces de
las plantas inoculadas con esta última cepa y sometidas a estrés
salino fueron las que presentaron el mayor nivel de expresión. Los
resultados obtenidos nos permiten concluir que las plantas inoculadas con la cepa A1 fueron más tolerantes al tratamiento salino que las plantas sin inocular y que las plantas inoculadas con
la cepa A2. Esa mayor tolerancia podría estar relacionada con un
menor aumento de putrescina desencadenado frente a la exposición a la sal, como así también con la síntesis de novo de
acuaporinas en la raíz.
P67 - 27214 SUPERVIVENCIA DE BACTERIAS EXPUESTAS A
LA RADIACIÓN SOLAR Y MODELOS APLICABLES A SU ESTUDIO. OPPEZZO, OSCAR JUAN
Comisión Nacional de Energía Atómica - Centro Atómico Constituyentes
En el desarrollo de técnicas para mejorar la calidad microbiológica de aguas utilizando luz solar, la interpretación de curvas
de supervivencia mediante modelos teóricos permitiría evaluar
50
mejor la eficacia de los procedimientos ensayados. En este campo se han empleado modelos empíricos, de aplicación general.
El objetivo de este trabajo fue poner a prueba el uso de un modelo alternativo, ampliamente aplicado en el estudio de efectos
biológicos de radiaciones ionizantes, para interpretar curvas de
supervivencia de bacterias expuestas a la radiación solar. Suspensiones de Salmonella enterica serovar Typhimurium
ATCC14028, burbujeadas con aire o nitrógeno, se irradiaron en
celdas de cuarzo colocadas en un dispositivo que permitió mantenerlas orientadas hacia el sol y a temperatura constante durante las exposiciones. En distintos momentos se determinó el número de bacterias viables. Los parámetros de las ecuaciones
correspondientes a los modelos en estudio se ajustaron por regresión no lineal a las curvas de supervivencia obtenidas mediante
este procedimiento. Estas curvas parecieron seguir una función
exponencial, pero para las bacterias burbujeadas con aire la velocidad de muerte aumentó cuando la fluencia superó los 7 megaJ/
m², resultando el modelo exponencial inadecuado para este caso.
Estos resultados podrían explicarse asumiendo que: i) en las bacterias existen al menos dos tipos de blancos que son afectados
la luz solar, ii) en uno de estos tipos de blanco el efecto de la
radiación es independiente del oxígeno y produce pérdida de viabilidad con una cinética típica de procesos que requieren un único impacto en un único blanco por célula, iii) afectando otro tipo
de blanco la radiación lleva a la pérdida de viabilidad por acumulación de daño dependiente de oxígeno con una cinética semejante a la esperable en procesos que requieren impactos únicos
en múltiples blancos por célula. El primer tipo de blanco daría
lugar a la caída exponencial observada con nitrógeno y al inicio
de las irradiaciones con aire, y el segundo al cambio de pendiente observado en las irradiaciones con aire. Con este modelo, que
permite asignar sentido físico a los parámetros estimados, el ajuste fue mejor que el obtenido con el modelo de caída exponencial
precedida por un hombro o el de tipo Weibull para curvas convexas, previamente aplicados al análisis de la supervivencia de
ATCC14028 durante exposiciones a la luz solar. Los modelos
sencillos muestran limitaciones cuando se los aplica al estudio de
los efectos de la luz solar en bacterias. Es necesario identificar
estructuras blanco y eventuales mecanismos de fotoprotección
para elaborar modelos capaces de describir, y en lo posible predecir, estos efectos. Las técnicas empleadas en este trabajo, aplicadas a mutantes deficientes en el control de stress ambiental,
podrían contribuir a este fin.
P68 - 27229 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN ÓPTIMA DE Azospirillum brasilense CO-INOCULADO CON Bradyrhizobium japonicum EN SOJA [Glycine max (L.) MERR]. PUENTE, MARIANA(1); ZAWOZNIK, MYRIAM(2); PERTICARI, ALEJANDRO(1); CARLETTI, SUSANA(3)
(1) BPCV INTA CASTELAR, (2) Facultad de Farmacia y
Bioquímica, UBA, (3) Universidad Nacional de Luján
Un gran número de bacterias no simbióticas promueve la
nodulación en cultivos de leguminosas cuando son co-inoculadas
con bacterias del género Rhizobium. La producción de fitohormonas por parte de Azospirillum modifica la morfología vegetal,
la captación de agua y nutrientes minerales por la planta huésped, promueve la nodulación y el contenido de leghemoglobina
en nódulos. El objetivo de este trabajo fue evaluar la concentración óptima de Azospirillum brasilense Az39 capaz de promover
el crecimiento vegetal, la nodulación y contenido de leghemoglobina en los nódulos de soja cuando se co-inocula con Bradyrhizobium japonicum. Los microorganismos utilizados fueron B.
japonicum cepa E109 y A. brasilense cepa Az39. La cepa E109
se cultivó en medio YEM y la cepa Az39 en medio líquido de
Sadasivan y Neyra, en un agitador rotatorio de 180 rpm a 30°C
durante 4 días. Para los tratamientos se combinaron tres concentraciones de Az39 (105, 107, 109 UFC/semilla) con E109 a una
concentración de 105 UFC/semilla, se incluyeron un testigo absoluto (T), un testigo inoculado con E109 105 y un testigo inoculado
con Az39 autoclavada. La semilla utilizada fue DM 4670 (DON
MARIO Semillas). Las semillas se sembraron en macetas plásticas con vermiculita estéril. El diseño fue de 4 bloques completos
al azar con 3 repeticiones. Los datos se analizaron mediante un
ANOVA y las medias se compararon por el test de Duncan
(p=0,05) utilizando INFOSTAT. Se evaluó: altura, peso seco (PS)
y longitud de parte aérea, peso fresco (PF) y PS radicular y área
de superficie radicular, número, PF y PS de nódulos y contenido
de leghemoglobina a los 20 y 45 días después de la siembra (dds).
Los resultados indican que a los 20 dds la concentración de coinoculación E109 105 + Az39 107 fue la que presentó mejor respuesta en la longitud total del sistema radical (61% más que el
T) y contenido de leghemoglobina en nódulos (47% más que el
tratamiento E109 10 5) siendo éstas significativas. En volumen
radicular también presentó la mejor respuesta (14,8% más que
el T) pero sin llegar a ser significativa. No se observaron diferencias entre tratamientos en PF radicular, PS de parte aérea y todas las variables medidas en nodulación. A los 45 dds el tratamiento que mejor respuesta presentó fue E109 105 + Az39 105
observándose diferencias significativas con respecto al T en los
parámetros PF de parte aérea (25%), nodulación en raíz primaria (133%), volumen radicular (42%), contenido de leghemoglobina
(42%) y PF de nódulos totales (8%) siendo la diferencia significativa sólo en los primeros cuatro parámetros evaluados. En longitud y PS de parte aérea el tratamiento que mejor performance
tuvo fue E109 105 + Az39 107, siendo esta diferencia significativa
con respecto al T sólo en el primer parámetro evaluado (24%).
El resto de los parámetros evaluados no mostró diferencias significativas entre tratamientos. El efecto de la co-inoculación pudo
observarse cuando se utilizaron dosis bajas a medias de
Azospirillum modificando positivamente gran parte de los
parámetros medidos en ambos momentos del muestreo.
P69 - 27245 EFECTO DEL COBRE EN LA SECRECIÓN DE
ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS DE Ganoderma applanatum CEPA
A DE IMPORTANCIA BIOTECNOLÓGICA. TEJERINA, MARCOS
R; FONSECA, MARIA I; VILLALBA, LAURA L; ZAPATA, PEDRO D
Laboratorio de Biotecnología Molecular, Módulo de Bioquímica y
Farmacia. Facultad de Ciencias, Exactas, Químicas y Naturales,
Universidad Nacional de Misiones
Introducción: Ganoderma applanatum, es un hongo ligninolítico, que presenta un amplio espectro de enzimas como, la
lacasa (Lac) y manganeso peroxidasa (MnP), aplicables en diversos procesos como lo son el bioblanqueo, biopulpado y generación de biocombustible. Objetivo: Analizar el efecto del cobre sobre la actividad enzimática (Lac y MnP), el crecimiento en biomasa
y la secreción de proteínas totales en G. applanatum. Materiales
y métodos: la cepa A de G. applanatum BAFC1168 fue inoculada en medio de cultivo líquido (extracto de malta 12,7 g/L y extracto soluble de maíz 5 g/L) durante 7, 10 y 14 días; con 0,2 mM,
0,5 mM y sin CuSO4. La cuantificación de la actividad enzimática
de Lac y MnP fue determinada por espectrofometría, utilizando
como sustrato DMP (2,6-dimetoxifenol) y MnSO4 respectivamente. Las proteínas totales se cuantificaron mediante la técnica de
Bradford, utilizando como solución patrón la albúmina sérica bovina. El crecimiento en biomasa se determinó como peso seco del
micelio. El análisis estadístico se realizó mediante el programa
estadístico GraphPad Prism 5. Para la detección de isoenzimas
Lac fueron sembrados 20 µg de proteína por muestra en
zimogramas no desnaturalizante (ND-PAGE al 7,5%). El revelado se realizó sumergiendo el gel en una solución conteniendo
DMP 5 mM en buffer acetato 0,1 M, pH 3,6 hasta la aparición de
bandas. El peso molecular de las isoenzimas fue determinado en
geles desnaturalizante SDS-PAGE. Resultados: el efecto del cobre fue significativo (p<0,001) tanto en el crecimiento en biomasa
como en la secreción de proteínas, produciendo un efecto negativo con el transcurso de los días. El cobre produjo un incremento de actividad enzimática Lac (p<0,001) en concentraciones de
0,2 mM, mientras que en la actividad MnP no produjo un efecto
significativo (p>0,05). Se determinó que el cobre induce
isoenzimas Lac que van desde los 70 hasta los 127 kDa. Conclusiones: el cobre produjo un efecto negativo en el crecimiento en
biomasa y secreción proteica, mientras que produjo un efecto
positivo en la actividad enzimática Lac, no así en la actividad MnP.
El agregado de cobre también produjo la inducción de isoenzimas
Lac. Estos resultados motivan a profundizar los estudios incluyendo otras variables para obtener producción enzimática a gran
escala y aplicarlas biotecnológicamente a la industria celulósicapapelera o a la primera fase de fabricación de biocombustible.
P70 - 27252 EFECTO DE INDUCTORES SOBRE LA ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA Y LA EXPRESIÓN DE ISOENZIMAS DE LACASA.
FONSECA, MARIA(1); RAMOS H, ANA(1); FARIÑA, JULIA(2);
VILLALBA, LAURA(1); ZAPATA, PEDRO(1)
(1) Facultad de Ciencias, Exactas, Químicas y Naturales, Universidad Nacional de Misiones, (2) PROIMI-CONICET-T4001,
Tucumán
Introducción: los hongos de pudrición blanca son los únicos
organismos capaces de degradar eficientemente la lignina debido
a que poseen un sistema enzimático oxidativo que ataca la molécula de lignina, una de las más importantes es la Lacasa (Lac). Se
sabe que, factores tales como metales pesados o compuestos aromáticos, influyen en la producción de Lac, esto ha sido estudiado
en varias especies. Con la utilización de estos sistemas enzimáticos,
manipulados para su sobreexpresión, la industria celulósico-papelera podría favorecerse logrando optimizar los procesos tecnológicos con un menor impacto ambiental. Objetivo: detectar y cuantificar la producción de Lac inducida tanto por sulfato de manganeso
(MnSO4) como por ácido sinápico y el efecto de dichos compuestos sobre el crecimiento y la secreción proteica en Peniophora sp
BAFC 633. Materiales y métodos: el hongo se cultivó a 29 °C, pH
4,5 en 50 mL de medio (extracto de malta 12,7 g/L, extracto soluble de maíz 0,5 %) suplementado al día cero con MnSO4 y al tercer día de cultivo con ácido sinápico, ambos a concentraciones finales de 0,3 mM, 0,1 mM y de 0,02 mM, en ensayos por separado
durante 7, 10 y 14 días, en presencia de un control sin inductor.
Cada día especificado se separó el micelio, para determinar
biomasa, del sobrenadante utilizado para cuantificar proteínas
mediante el método de Bradford. Además con el sobrenadante se
cuantificó actividad Lac por espectrofotometría a 469 nm usando
como sustrato 2,6–dimetoxifenol (DMP). La enzima se caracterizó
mediante geles de poliacrilamida desnaturalizantes y no
desnaturalizantes revelados con DMP. Con el programa GraphPad
Prism 5.0 se realizó el análisis estadístico. Resultados: en los ensayos con MnSO4, no se observaron diferencias significativas
(p>0,05) sobre la biomasa, secreción proteica y la actividad
enzimática de Lac en ninguno de los tratamientos. Sin embargo,
se detectaron dos isoenzimas, una constitutiva de 60 kDa que aparece en todos los tratamientos y otra inducida de 75 kDa presente
únicamente en el ensayo con 0,1 mM de MnSO4 del día 14 de cultivo. Respecto a los tratamientos con ácido sinápico, el máximo
crecimiento se produjo el día 14 en los ensayos con 0,02 mM y 0,3
mM de ácido sinápico (p<0,01). En cuanto a la secreción proteica,
no se observó diferencias significativas en ninguno de los tratamientos (p>0,05). Por otro lado, no se observaron diferencias significativas en la actividad enzimática en ninguno de los tratamientos
ensayados (p>0,05) y fue posible detectar una isoenzima constitutiva de 60 kDa en todos los tratamientos y otra inducida de 75 kDa
presente únicamente en el ensayo con 0,02 mM de ácido sinápico
en el día 14 de cultivo. Conclusiones: en los ensayos con MnSO4,
los resultados obtenidos parecen indicar que dicho compuesto no
actuaría como inductor enzimático. Aunque la presencia de
isoenzimas inducibles podría indicar otro tipo de regulación. En el
caso del inductor aromático, el ácido sinápico podría estar
involucrado en la inducción de Lacasa, aunque no es posible conocer el mecanismo subyacente. Por lo que es fundamental avanzar sobre el conocimiento de la regulación a nivel genético de la
transcripción y la traducción de enzimas ligninolíticas.
P71 - 27292 DESARROLLO DE UN MÉTODO MOLECULAR BASADO EN REAL TIME PCR PARA EL DIAGNÓSTICO DE
Campylobacter fetus venerealis. IRAOLA, GREGORIO;
HERNANDEZ, MARTIN; CALLEROS, LUCIA; CARRETTO, LUIS;
PEREZ, RUBEN
Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Uruguay
51
Introducción: La campylobacteriosis bovina es una enfermedad infecciosa causada por la épsilon-proteobacteria Campylobacter fetus. Existen dos subespecies de esta bacteria:
Campylobacter fetus fetus, que causa abortos esporádicos y
Campylobacter fetus venerealis, que infecta el aparato genital
causando infecciones crónicas que provocan infertilidad. Objetivo: el objetivo de este trabajo fue el desarrollo de un método
molecular, basado en Real Time PCR, para el diagnóstico de la
subespecie de C. fetus venerealis. Materiales y métodos: para este
estudio se utilizaron aislamientos de ambas subespecies obtenidas de ganado bovino uruguayo. Estos aislamientos fueron previamente tipificados como C. fetus venerealis o C. fetus fetus por
métodos bacteriológicos tradicionales (ensayos de crecimiento en
1% de glicina y producción de SH2 en medio TSI), según las recomendaciones internacionales de detección de este patógeno. Además se usó ADN de Escherichia coli, Campylobacter sputorum
bubulus y Campylobacter jejuni como controles negativos. El desarrollo del ensayo de Real Time PCR se basó en el diseño de una
sonda de hidrólisis (TaqMan) y un par de cebadores que hibridan
en una región de 103 pares de bases en el gen virB11. Se seleccionó este gen debido a que se encuentra dentro de una isla de
patogenicidad presente en C. fetus venerealis y no en C. fetus fetus,
lo que hace de virB11 un buen blanco de diagnóstico. Todas las
reacciones de Real Time PCR se llevaron a cabo en un equipo
ABI7500. Resultados: en el ensayo desarrollado sólo se observaron amplificaciones en las cepas caracterizadas como C. fetus
venerealis. En las cepas identificadas como C. fetus fetus no se
observó un resultado positivo, como era de esperarse. Además,
tampoco se observaron amplificaciones cuando se utilizó ADN de
E. coli, Campylobacter sputorum bubulus y Campylobacter jejuni
como controles negativos. Los resultados obtenidos sugieren que
la metodología funciona correctamente, aunque es necesario el
análisis de un mayor número de cepas para confirmar su aplicabilidad a nivel clínico. De todas formas, la aplicación de Real Time
PCR para la detección de éste patógeno es un paso importante,
debido a que esta tecnología, una vez estandarizada, aventaja en
rapidez y confiabilidad a otras metodologías de diagnóstico.
P72 - 27307 INDUCCIÓN DE LA HEMOOXIGENASA EN DOS
ESTADIOS DE CRECIMIENTO DE PLANTAS DE SOJA INOCULADAS CON Bradyrhizobium japonicum Y SU RELACIÓN CON
EL ESTRÉS OXIDATIVO. ZILLI, CARLA G(1); SANTA CRUZ,
DIEGO M(1); TOMARO, MARIA L(1); BALESTRASSE, KARINA B(1)
(1) Departamento de Química Biológica, Facultad de Farmacia y
Bioquímica, UBA
La hemooxigenasa-1 (HO-1) es una de las principales enzimas
inducidas por diversas condiciones de estrés. Sus productos finales en plantas, la biliverdina y el monóxido de carbono, pueden actuar como antioxidantes fisiológicos ya que el primero es
un eficiente atrapante de especies reactivas del oxígeno (ROS) y
el segundo un conocido modulador en la producción de ROS. En
nuestro laboratorio hemos demostrado por primera vez que la HO1 es inducida en hojas y nódulos de plantas de soja sometidas a
estrés oxidativo provocado por el tratamiento con cadmio y radiación UV-B. En el presente trabajo analizamos la inducción de la
HO-1 en los estadios iniciales de crecimiento de plantas de soja
y su relación con el estrés oxidativo y posteriormente su ubicación histológica en nódulos de soja sometidos a estrés salino.
Acorde al modelo experimental 1 se inocularon las plantas con
Bradyrhizobium japonicum , y siete días después se observo en
raíz un 70% de incremento en sustancias reactivas al ácido
tiobarbitúrico, junto con un marcado aumento en los niveles de
expresión génica, proteica y actividad de HO-1. Por otro lado se
analizó la expresión génica de la catalasa y superóxido dismutasa,
consideradas ambas enzimas antioxidantes clásicas, observándose un patrón similar al anteriormente descripto. En trabajos previos utilizando como material de estudio nódulos de plantas de
soja sometidas a estrés salino (modelo experimental 2) observamos resultados igualmente concordantes con el anterior modelo
en cuanto a la peroxidación lipídica y expresión génica de HO-1.
Recientes estudios realizados mediante estrategias inmunológicas
52
(inmunogold-microscopía electrónica) demostraron que la HO-1 se
encuentra solo presente en la membrana peribacteroide de los
nódulos. Materiales y métodos: Modelos experimentales: las semillas de soja fueron esterilizadas superficialmente con hipoclorito
de sodio, se germinaron en vermiculita y se inocularon con
Bradyrhizobium japonicum. Modelo experimental 1: las plántulas
se transfirieron el día 3 a recipientes hidropónicos y se cosecharon las radículas día 7 post inoculación. Modelo experimental 2:
las plantas fueron regadas con medio nutritivo Hoagland sin nitrógeno. El día 30 fueron regadas durante 10 días con una solución de NaCl (100mM). Determinación de sustancias reactivas al
ácido tiobarbitúrico (TBARS): Se determinó según el método de
Heath and Packer, 1968. Extracción de RNA y RT-PCR: se realizó según Yannarelli et al. 2006. Actividad y expresión de proteína HO-1: se realizó según Yannarelli et al. 2006. Inmunodetección
de la HO-1: Cortes delgados de los tejidos se utilizarán según fue
descripto por Marchalonis y col., 2001; Anderson y col., 2003. De
acuerdo con los resultados obtenidos en ambos modelos experimentales podemos concluir en primer lugar que la HO-1 se induce en dos estadios del crecimiento de la planta consistentes con
situaciones de estrés oxidativo y en segundo lugar que la
hemooxigenasa se ubica en el tejido vegetal del nódulo y no así
en el simbionte bacteriano.
P73 - 27340 RESPUESTA DE Azospirillum brasilense A LA DEFICIENCIA DE HIERRO Y EL ROL DEL OXIDO NÍTRICO COMO
REGULADOR DE ESTE PROCESO. ARRUEBARRENA DIPALMA,
ANDRES(*1,3); AMENTA, MELINA(*1,3); LAMATTINA, LORENZO(2,3); CREUS, CECILIA(1)
(1) Área Biomolecular, FCA, Universidad Nacional de Mar del Plata, (2) IIB, FCEyN, Universidad Nacional de Mar del Plata, (3)
CONICET, (*) ex aequo
El hierro (Fe) es un nutriente esencial para todos los organismos. A pesar de su gran abundancia en el suelo, la biodisponibilidad de este micronutriente en ambientes aeróbicos y a pH
neutro es limitada. Los microorganismos han desarrollado diversos
mecanismos para obtener Fe, siendo la producción de sideróforos
y la actividad Fe3+-reductasa de membrana o extracelular los más
importantes. El oxido nítrico (NO) es una molécula gaseosa presente en animales, plantas y bacterias, involucrada en la regulación de numerosos procesos fisiológicos. Se ha demostrado que
el NO modifica la actividad de fur, regulador transcripcional global
de la absorción del Fe en bacterias, aunque el rol exacto de esta
molécula señal sobre los sistemas de adquisición y almacenaje de
Fe aun no ha sido dilucidado. El objetivo de este trabajo fue caracterizar el crecimiento, la producción de sideróforos, la actividad
Fe3+-reductasa y el contenido total de Fe en la bacteria promotora
del crecimiento vegetal Azospirillum brasilense Sp245 y en una
cepa mutante isogénica en la nitrato reductasa periplásmica (A.
brasilense Faj164) que produce un 95% menos de NO en presencia de NO3- como única fuente de nitrógeno. Ambas cepas fueron
cultivadas en medio NFB suplementado con NO3- y con tres niveles de Fe: 1) suficiencia (37 µM FeCl3), 2) deficiencia (3 µM FeCl3)
y 3) ausencia (sin FeCl3). Se realizaron curvas de crecimiento para
las dos cepas, se analizó la producción de sideróforos en medio
indicador NFB-CAS y la respuesta frente a dadores y secuestrantes
de NO, GSNO y cPTIO, respectivamente. Se estudió la actividad
Fe reductasa in vivo utilizando el reactivo ferrozina y se determinó
el contenido total de Fe por el método Fish. En presencia de Fe,
no se observaron diferencias en el crecimiento entre ambas cepas.
Sin embargo, en ausencia total de Fe ambas cepas presentaron
una disminución similar en el crecimiento. La producción de
sideróforos en la cepa salvaje fue mayor que en la mutante y disminuyó con el agregado del secuentrante de NO (cPTIO). Por el
contrario, la cepa mutante no respondió en la producción de
sideróforos frente al agregado de dadores de NO, o del intermediario NO2- que puede ser metabolizado a NO. La actividad Fe Fe3+reductasa fue mayor en la cepa mutante para las tres condiciones
de disponibilidad de Fe. El contenido de Fe total de ambas cepas
fue similar para los tratamientos de suficiencia y deficiencia, pero
en ausencia de Fe la cepa salvaje mostró un mayor contenido de
este metal. Los resultados presentados indican que la deficiente
producción de NO en la cepa mutante Faj164 altera las respuesta
frente a la deficiencia de Fe en A. brasilense. Por otro lado, se reporta por primera vez la presencia de actividad Fe Fe3+-reductasa
en esta bacteria. Estos resultados se apoyan además en el hallazgo in silico de una Fe Fe3+-reductasa putativa en el genoma de A.
brasilense Sp245. La mayor actividad Fe Fe3+-reductasa observada en la mutante Faj164 podría constituir un mecanismo compensatorio a la deficiencia en la síntesis de sideróforos en esta cepa.
P74 - 27355 POLIAMINAS Y ÓXIDO NÍTRICO PARTICIPAN EN
LA FORMACIÓN DE BIOPELÍCULAS EN Azospirillum brasilense. PEREYRA, CINTIA(*1,2); ARRUEBARRENA DIPALMA,
ANDRES(*1,2); PEREYRA, ALEJANDRA(1); CREUS, CECILIA(1)
(1) Área Biomolecular, FCA, Universidad Nacional de Mar del Plata, (2) Becarios CONICET, (*) ex aequo
Las biopelículas bacterianas se definen como un conjunto
mono- o multi- específico de microorganismos unidos a una superficie biótica o abiótica. Tanto las poliaminas (PAs) como el
óxido nítrico (NO) modulan la formación de biopelículas en diferentes especies bacterianas y participan en la regulación de importantes procesos fisiológicos en plantas, animales y bacterias.
En el caso de las bacterias promotoras del crecimiento vegetal
(PGPR), la formación de la biopelícula es necesaria para una
exitosa colonización de las raíces y posterior promoción del crecimiento. Azospirillum brasilense constituye una de las PGPR más
estudiadas, posee la capacidad de formar agregados y produce
PAs y NO. Los objetivos de este trabajo fueron: a) estudiar la formación de agregados celulares en A. brasilense Sp245 wt y la
cepa mutante isogénica Faj164 (nitrato reductasa periplásmica
negativa) que produce 95% menos NO que la wt en presencia de
NO3-; b) determinar la capacidad de formar biopelículas para cada
cepa; c) analizar la producción de PAs por la biopelícula y el efecto
del agregado exógeno de PAs. La formación de agregados se
estudió en medio OAB con fructosa y NO3- o NH4+. Los cultivos
fueron crecidos 16 h a 32 °C y 100 rpm. La formación de biopelículas fue estudiada en placas de cultivo multipocillo por tinción
con cristal violeta. Se usó medio NFB con NO3-o NH4+ como fuente
nitrogenada, con o sin agregado de 1 mM de putrescina,
espermidina (Spd) o espermina (Spm). Los cultivos crecieron sin
agitación por 120 h a 32 °C. Los sobrenadantes fueron utilizados
para la determinación de PAs libres por HPLC. Los resultados
mostraron que la cepa mutante formó más agregados celulares
que la cepa salvaje al crecer en NO3-, sin observarse diferencias
en medio con NH4+. La formación de biopelícula en el tratamiento
control NH4+ fue similar en ambas cepas, mientras que en NO3- la
cepa wt produjo menos biopelícula. El agregado de las tres PAs
redujo notablemente la formación de biopelícula en la cepa wt y
en menor medida en la mutante. Las diferencias observadas en
el proceso de agregación entre las cepas wt y mutante, ponen en
evidencia que la deficiente producción de NO podría modificar la
síntesis de EPS, principal factor que afecta la formación de agregados. Por otro lado, se demostró por primera vez la producción
de Spd (~1,5 µg/mL cultivo) en ambas cepas tanto en medio con
NO3- como con NH4+. En suma, los resultados presentados indican que en A. brasilense Sp245 tanto las PAs como el NO poseen un rol en la formación de biopelículas in vitro.
P75 - 27418 PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO POR INOCULACIÓN CON ß-RIZOBIOS DE Parapiptadenia rigida, UNA LEGUMINOSA NATIVA CON ALTO POTENCIAL FORESTAL.
ZABALETA, MARIA(1); TAULE, CECILIA(1); ROSCONI, FEDERICO(1); MAREQUE, CINTIA(1); SANJURJO, LUCIA(1);
RODRIGUEZ, ANDREA(2); SICARDI, MARGARITA(3); FRIONI,
LILIAN(2); BATTISTONI, FEDERICO(1); FABIANO, ELENA(1)
(1) Laboratorio de Bioquímica y Genómica Microbiana,IIBCE-MEC,
(2) Cátedra de Microbiología, Facultad de Agronomía, (3) Laboratorio de Microbiología de Suelos, CIN, Montevideo, Uruguay
La leguminosa arbórea uruguaya Parapiptadenia rigida
(angico) es una de las especies más promisorias para la agroforestación como integrante de “montes multipropósito”. Su madera pesada, de alto contenido energético, es apreciada en trabajos de carpintería fina. Muy poco se conoce sobre el comportamiento de nuestras leguminosas nativas arbóreas a nivel de vivero con fines de propagación masiva o industrial. Numerosos
microorganismos han sido descriptos como promotores del crecimiento vegetal, entre ellos los rizobios, quienes contribuyen a
captar el nitrógeno atmosférico. En nuestro laboratorio se generó
una colección de 53 rizobios aislados de nódulos de angico, pertenecientes al género Burkholderia, Cupriavidus y Rhizobium. Algunas de estas cepas fueron evaluadas en su capacidad de promover el crecimiento vegetal de cultivos de angico en solario e
invernáculo. A partir de los resultados obtenidos se seleccionaron las cepas Burkholderia sp. 4.13 y Cupriavidus sp. 5V12 para
ser evaluadas en ensayos de campo, en los departamentos de
Rivera y Lavalleja. El objetivo de este trabajo es lograr establecer una simbiosis efectiva planta-rizobio en condiciones de vivero que permita una implantación exitosa del angico en campo. Se
sembraron semillas de angico en macetas conteniendo tierra: arena: compost (1:1:1). Las plantas se inocularon con aproximadamente 1x107 UFC de la cepa Burkholderia sp. 4.13 o de la cepa
Cupriavidus sp. 5V12. Como testigo positivo se agregó KNO 3
0,05% (p/v). Se realizaron 60 repeticiones por condición. También
se inocularon 60 plantas con una mezcla de las 2 cepas anteriores y otras 60 plantas con la mezcla bacteriana y micorrizas. Como
control negativo se usó agua. Las plantas se mantuvieron en el
invernáculo durante aproximadamente 3 meses. En cada una de
las localidades se plantaron 300 plántulas de angico, 30 de ellas
inoculadas previamente con la cepa Burkholderia sp. 4.13, 30
plantas con Cupriavidus sp. 5V12, 30 plantas con una mezcla de
estas dos cepas de rizobio, 30 plantas con la mezcla de rizobios
y con hongos micorrícicos, 30 plantas fertilizadas en invernáculo
con KNO3 y 150 plantas testigo sin ningún tratamiento de fertilización. Los parámetros de crecimiento evaluados en las plantaciones fueron el diámetro basal y la altura del vástago. Los resultados obtenidos hasta la fecha, indican que las plantas inoculadas con la cepa Cupriavidus sp 5V12 muestran un crecimiento
significativamente mayor en altura y en el diámetro del tallo a la
base con respecto a los valores obtenidos para las plantas testigo, indicando que estos aislamientos pueden ser considerados
como potenciales inoculantes comerciales. Se observó que el diámetro es un indicador más confiable que la altura ya que se
correlaciona mejor con el crecimiento global de la planta. Financiación: INIA-FPTA (216), PDT S/C/OP/67/03 y PEDECIBA
P76 - 27419 EFICACIA DEL INÓCULO HIMENIO-ESPORAL DE
UNA ESPECIE DE HONGO ECTOMICORRÍCICO PARA LA
MICORRIZACIÓN CONTROLADA EN VIVERO DE Eucalyptus
grandis HILL EX MAIDEN. BORRAS, MARIA MACARENA; ALE,
MARIA; BRANDAN, CELIA; GARCIA, DANIEL; ORTIZ, NELIDA;
WEHT, SEBASTIAN
FAZ, Universidad Nacional de Tucumán
Introducción: Eucalyptus grandis se asocia a hongos
formadores de endo (MA) y ectomicorrizas (ECM). Éstas son importantes para las plantas ya que mejoran la nutrición y su supervivencia. Antecedentes de ECM en eucaliptos en Tucumán
motivaron los siguientes objetivos: identificar los hongos ECM,
inocularlos y evaluarlos en vivero. Materiales y métodos: en marzo-abril de 2009 se recolectaron esporocarpos de bosques con
E. grandis de Villa Padre Monti (VPM) y Finca El Manantial (FEM).
La identificación de los hongos se realizó con claves taxonómicas.
El inoculo se preparó con esporocarpos desinfectados superficialmente; se licuaron en agua corriente estéril lográndose una suspensión de himenios y esporas. Se contaron esporas/mL con cámara de Neubauer; se determinó la densidad óptica (D.O.) en
espectrofotómetro. Los tratamientos fueron: T0 (testigo agua corriente 10 mL); T1 (inóculo puro 10 mL); T2 (inoculo diluido1/
100,10 mL); T3 (inoculo puro 20 mL); T4 (inoculo diluido1/100, 20
mL); los plantines se mantuvieron en invernadero cinco meses.
A los 30 y 60 días, en muestras de raicillas, se determinaron pre-
53
sencia-ausencia de estructuras características del hongo
micorrícico y el avance de la colonización fúngica. Se evaluó: peso
seco y peso fresco de parte aérea y raíces, longitud de parte aérea y de raíces, diámetro de tallo, porcentaje de micorrización y
el estado fitosanitario. Se realizó análisis de varianza al 5% de
significación para la comparación de medias entre los tratamientos generados a partir de la suspensión inoculante. Resultados:
en VPM y FEM se identificaron hongos ECM asociados a E.
grandis pertenecientes al género Scleroderma bovista Fr. La cantidad de esporas/mL en la suspensión inoculante himenio-esporal
fue de 17,75x106. La densidad óptica (D.O.) del inoculante diluido (1/100) promedió en 0,2776. A los 30 días de la inoculación
se observó en ápices: ramificación pinada monopodial, predominante, retorcida, de textura aterciopelada; la inserción del cordón
miceliar perpendicular; raicillas con hifas eflorescentes, todas
características de hongos ECM. Los porcentajes de colonización
en T2 y T4 fueron de 64% y 72% (elevados) respecto a T0 no
colonizado. Los parámetros de relevancia estadística fueron: peso
seco de parte aérea, longitud de parte aérea y radical. En invernadero, Aleurotripxus floccosus (de baja incidencia) fue controlado con tiametoxan 25% y con Bacillus circulans. No se detectaron patogenias fúngicas. La presencia de S. bovista Fr. en los dos
sitios de estudio, refleja la ubicuidad del mismo y la elevada compatibilidad con E. grandis. Se aconseja la alternativa al uso del
inoculo himenio-esporal siempre y cuando los esporocarpos sean
jóvenes y bien desinfectados. La suspensión himenio-esporal de
S. bovista Fr. como inoculante, se perfila potencialmente como
alternativa biotecnológica para E. grandis, cultivo en expansión
en la provincia, por los aportes en nutrición, protección contra
patógenos (frecuentes) en raicillas en vivero y por promover su
adaptación local a esta exótica.
P77 - 27429 OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE CULTIVO DE Escherichia coli RECOMBINANTE PARA LA PRODUCCIÓN DE GLICEROL DESHIDROGENASA. PARCERISA,
IVANA(1); PIATTONI, VANESA(1); IGLESIAS, ALBERTO(1);
BECCARIA, ALEJANDRO(1)
(1) Instituto de Agrobiotecnología del Litoral, Universidad Nacional del Litoral-CONICET, Santa Fe
Introducción: actualmente el auge por el empleo de biocombustibles permite disponer de abundantes cantidades de glicerol
(Gro), subproducto del proceso de elaboración del biodiesel. Además, está establecido el uso del Gro como fuente de carbono en
cultivos de microorganismos productores de proteínas recombinantes y también su utilidad como sustrato precursor para la
síntesis de valiosos metabolitos. Un ejemplo es la dihidroxiacetona
(DHA), usada extensamente en la industria cosmética como bronceador artificial. La síntesis de DHA a partir de Gro es catalizada
por la enzima glicerol deshidrogenasa (GroDHasa) producida,
entre otros microorganismos, por Escherichia coli. Objetivo: El
objetivo de este trabajo fue determinar las mejores condiciones
de crecimiento y expresión de GroDHasa en una cepa de E. coli
recombinante; ensayando distintos medios de cultivo suplementados con Gro y distintas condiciones de inducción e incubación.
Materiales y métodos: se empleó la cepa E. coli BL21(DE3) transformada con la construcción plasmídica [pET 221b/EcgldA], que
contiene el gen que codifica para la GroDHasa de E. coli. Se evaluó el crecimiento de la cepa recombinante en medios suplementados con Gro (LB’ y A1), cuya base se diseñó considerando la
formulación del medio LB, el que se empleó como control. Los
cultivos se realizaron a 30 °C y 200 rpm, y fueron inducidos con
concentraciones variables de lactosa (0-20 g/L) al alcanzar una
DO (600 nm) de 0,6-0,8. Luego de la inducción, se evaluaron diferentes temperaturas (20, 30 y 37 °C) y tiempos de cosecha (2,
4, 6 y 19 h). Como controles se realizaron cultivos inducidos con
IPTG. Las células obtenidas se resuspendieron y sonicaron. La
proteína recombinante se recuperó con alto grado de pureza a
partir del sobrenadante libre de restos celulares, por choque térmico (10 min a 60 °C). Se cuantificaron las proteínas totales obtenidas por el método de Bradford y la enzima expresada mediante densitometría en SDS-PAGE, empleando una curva patrón de
albúmina sérica bovina. La determinación de la actividad
54
enzimática se realizó por espectroscopía cinética del NADH producido, comprobando la generación de DHA mediante una técnica colorimétrica con resorcinol (reacción de Seliwanoff). Resultados: en todos los medios ensayados, el rendimiento de producto
en base a biomasa (Yp/x), se incrementó conforme aumentó la
concentración de lactosa agregada como inductor. Por otro lado,
un incremento en el tiempo de cosecha o de la temperatura de
incubación, maximizaron el Yp/x. Los mayores Yp/x determinados
fueron 0,033, 0,028 y 0,026 g de GroDHasa por g de biomasa,
en los cultivos realizados en LB’, A1 y LB, respectivamente. La
enzima obtenida fue capaz de transformar Gro crudo de biodiesel
en DHA. La formulación de medios de cultivo con Gro permitió
intensificar los rendimientos específicos de GroDHasa. La lactosa
resultó ser un sustituto económico y efectivo del IPTG en la inducción de los cultivos. La adecuada selección de la concentración de inductor, temperatura y tiempo de cosecha, permitió
optimizar hasta 50 veces el proceso de producción de una enzima clave en la bioconversión de Gro a DHA.
P78 - 27522 INFLUENCIA DE LA APLICACIÓN DE AGROQUÍMICOS SOBRE LOS MICROORGANISMOS DIAZÓTROFOS EN
EL ÁREA MANISERA DE CÓRDOBA. ANGELINI, JORGE; GHIO,
SILVINA; TANIA, TAURIAN; FABRA, ADRIANA
Es conocido que la mayor biodiversidad del planeta se encuentra en el suelo. Estos son frágiles, y muchas de las actividades
del hombre han producido su degradación. Sin embargo, en los
últimos años se ha renovado el interés por el estudio del suelo,
reconociendo que los procesos que ocurren en el mismo
influencian numerosos aspectos relacionados a la conservación
de la tierra y el agua. El objetivo del presente trabajo fue evaluar
el efecto de la aplicación de agroquímicos sobre la comunidad de
bacterias fijadoras de nitrógeno presente en un suelo cultivado con
maní. Los agroquímicos aplicados fueron: herbicida pre-emergente
S-metolacloro (1 l/ha) y Diclosulam (20 g/ha), para controlar las
malezas emergidas se aplicó Glifosato (3,5 l/ha) y para el control
de malezas pre y post–emergentes se usó Imazetapir 1 (l/ha),
insecticidas gammacialotrina (30 mL/ha) y lambdacialotrina (25
mL/ha). Las muestras de suelo se tomaron antes y después de
la aplicación de agroquímicos y a los 12 meses posteriores a la
primera aplicación de fitosanitarios. La abundancia de diazótrofos
de vida libre se determinó por el número de colonias que crecieron en los medios NFB (Dôbereiner, 1980) y JNF (Baldani y col.,
1992) y cuyo gen nifH pudo ser amplificado por PCR. Para el recuento de rizobios se contaron las colonias que desarrollaron en
medio YEMA (Vincent, 1970) y cuyo gen nodC fue detectado por
PCR. La actividad nitrogenasa total en suelos con y sin el agregado de agroquímicos se determinó midiendo en un cromatógrafo
de gases equipado con un detector de ionización de llama de hidrógeno, los niveles de etileno acumulado luego de 15 días de
incubación con acetileno (Caton, 2007). El presente trabajo permitió demostrar que el número de diazótrofos totales y rizobios
presentes en suelos maniseros de la provincia de Córdoba sometidos a prácticas fitosanitarias convencionales, se ve afectado
observándose una disminución del 15% en los diazótrofos y del
30% en los rizobios. También se demostró que dicho efecto no
se revierte aún luego de transcurridos 12 meses de la primera
aplicación de agroquímicos. La actividad nitrogenasa del suelo
sometido a prácticas fitosanitarias convencionales se ve reducida en un 20%, con respecto a la parcela control. Financiado por
SECYT-UNRC, CONICET, MinCyt.
P79 - 27528 INOCULACIÓN DE SEMILLAS DE LECHUGA CON
Azospirillum brasilense: EVALUACIÓN DE LA GERMINACIÓN
EN CONDICIONES DE SALINIDAD. FASCIGLIONE, G (BECARIA
CONICET); CASANOVAS, EM(1); SUELDO, R(1); BARASSI, CA(1)
(1) FCA, Universidad Nacional de Mar del Plata, Unidad Integrada Balcarce: FCA-EEA INTA
La salinidad tanto de los suelos como del agua de riego constituye uno de los principales estreses abióticos limitantes de la
producción, con especial impacto en regiones áridas y semiáridas
y en aquellas dedicadas a cultivos hortícolas. Los problemas en
la germinación de la semilla son la principal limitación al establecimiento de las plántulas en condiciones de salinidad, ya que esta
afecta tanto el porcentaje como la tasa de germinación. Las tendencias alimenticias actuales posicionan a los vegetales de hoja,
principalmente a la lechuga, como una parte importante de la dieta, siendo esta una especie medianamente sensible a la salinidad.
Como estrategia paliativa para incrementar la tolerancia de las
plantas al estrés se presenta la utilización de bacterias promotoras
del crecimiento vegetal (PGPB) especialmente las del género
Azospirillum. El objetivo del presente trabajo fue evaluar los efectos de la inoculación con A. brasilense Sp245 sobre la energía y
el poder germinativo de semillas de lechuga en condiciones de
salinidad y determinar la concentración óptima de bacteria para
maximizar el efecto promotor. Semillas de Lactuca sativa cv. Elisa
se dividieron en siete lotes a cada uno de los cuales se lo inoculó con alguna de las siguientes concentraciones de inóculo: 0 (control), 106, 107, 108, 109, 1010 ó 1011 células de A. brasilense Sp245.
semilla-¹. Cada lote se subdividió en cuatro grupos de semillas y
se sembraron en cajas de Petri sobre papel de germinación embebido con alguna de las siguientes soluciones: 0, 40, 80 ó 120
mM de NaCl. Las placas se incubaron a 23°C y fotoperíodo de 8
hs. A los 4 y 7 días se determinaron la energía (EG) y el poder
germinativos (PG), respectivamente. La EG de las semillas control disminuyó a medida que se incrementó el nivel de salinidad,
siendo esta reducción estadísticamente significativa en los niveles de 80 y 120 mM de NaCl. En la condición sin salinidad la inoculación con exp9 bacterias.semilla-¹ incrementó la EG en un 34%
con respecto a las semillas control. Para el nivel de 40 mM de
NaCl la inoculación con exp8 o con exp11 incrementó significativamente la EG en un 35%, mientras que la inoculación con exp9
y exp10 la incrementó un 46 %. El PG de las semillas de lechuga
sin inocular disminuyó en los niveles 80 y 120 mM de salinidad
en un 43% y un 93% respectivamente. La inoculación con exp9 y
exp10 bacterias.semilla-¹ incrementó el PG de las semillas de lechuga cuando la salinidad en el medio fue de 80 mM, revirtiendo
en un 59 % y en un 57% respectivamente, el efecto negativo causado por el estrés salino sobre el PG. La inoculación de semillas
de L. sativa cv. Elisa con A. brasilense Sp245 incrementó la EG
y el PG especialmente en condiciones de salinidad, siendo la
concentración de exp9.células bacterianas.semilla-¹ la que evidenció un mayor efecto promotor. Esto permitiría revertir los problemas asociados a la heterogeneidad en la germinación y el crecimiento inicial observados en condiciones de estrés, favoreciendo
el establecimiento de las plántulas y, en consecuencia, el posterior desarrollo del cultivo.
P80 - 27544 COMPETITIVIDAD DE Rhizobium leguminosarum
D70 COMO INOCULANTE DE Vicia sativa FRENTE A CEPAS
NATIVAS. GUZMAN ARRAUSI, FRANCISCO; PAGLIERO,
FABIOLA; CASTAÑO, CAROLINA; LORDA, GRACIELA
Universidad Nacional de La Pampa
La mayoría de los suelos de la Región Semiárida Pampeana
de la Argentina, presentan limitantes para la producción
agropecuaria, siendo las más importantes el nitrógeno y el agua.
La posibilidad de encontrar formas alternativas de fertilización
permitiría mantener o aumentar la producción, mientras se conforma una reserva de nutrientes, y se disminuyen riesgos de
lixiviación y emisión de gases de efecto invernadero. Dentro de
estas alternativas se incluye la introducción de leguminosas inoculadas con fijadores de nitrógeno. Con el fin de aprovechar la
fijación biológica de nitrógeno, la utilización de cultivos de cobertura como vicia, durante los meses de invierno, que posteriormente son incorporados y conocidos como “abonos verdes”, permiten mejorar las propiedades físicas y químicas de los suelos para
su uso posterior. El objetivo de este trabajo fue determinar la efi-
ciencia, infectividad y competitividad de la cepa de referencia para
vicia, Rhizobium leguminosarum D70, frente a cepas nativas en
muestras de suelo de la Región Semiárida Pampeana, en distintas condiciones de fertilización. Se efectuó la inoculación de la
leguminosa Vicia sativa con Rhizobium leguminosarum D70, en
macetas con suelos de la zona, en condiciones de invernadero.
Se desarrolló un tratamiento control no inoculado, otro tratamiento donde se evaluó la cepa, inoculada al momento de la siembra,
y en cada caso las macetas fueron fertilizadas con fósforo, nitrógeno, azufre ó nitrógeno más azufre. Se determinó porcentaje de
nodulación, número de nódulos, materia seca (65 °C), contenido
de nitrógeno (método Kjeldahl) y volumen radicular, para cada
tratamiento. Los resultados fueron analizados estadísticamente
mediante análisis de la diferencia de medias según Duncan, con
un nivel de significancia del 5% (p<0,05). El análisis de los resultados mostró diferencias significativas en los tratamientos en los
que se inoculó frente a los tratamientos sin inocular, en los
parámetros: porcentaje de nodulación, número de nódulos, materia seca y contenido de nitrógeno, destacándose los valores de
número de nódulos, resultado que indicaría especialmente que los
microorganismos introducidos son más competitivos que las cepas nativas, en las condiciones estudiadas. Acerca del parámetro
volumen radicular, no hubo diferencia entre los tratamientos inoculados y sin inocular. Con respecto a los resultados obtenidos
con las diferentes fertilizaciones dentro de cada tratamiento, no
se observaron diferencias significativas en los distintos parámetros
analizados. Podría suponerse que las dosis de fertilización utilizadas fueron insuficientes. Estos ensayos permiten concluir que
los microorganismos introducidos de la cepa de R. leguminosarum
D70, específica para una nodulación efectiva en vicia forrajera,
son más efectivos, eficientes y competitivos que las cepas nativas, tanto en condiciones de escases de nutrientes como en disponibilidad de los mismos, en las dosis ensayadas. Por otra parte, estos resultados deben ser validados en condiciones de campo para la obtención de abonos verdes altamente portadores de
nitrógeno al sistema productivo, considerando que su uso práctico dependerá también de aspectos económicos, dentro del marco de una agricultura sustentable.
P81 - 27545 INMOBILIZACIÓN DE SULFATOS POR RIZOBACTERIAS REGULADORAS DE LA HOMEOSTASIS VEGETAL AISLADAS DE Prosopis strombulifera. SGROY, VERONICA (1);
CASSAN, FABRICIO (1); FARIAS, FRANCO(2); LUNA, VIRGINIA(1)
(1) Universidad Nacional de Río Cuarto, (2) AGLAB
En nuestro país, cerca de 34.000.000 ha están sometidas al
exceso de agua y sales minerales. En los suelos salinizados del
sur de la provincia de Córdoba y San Luis, existen relaciones
equivalentes de sales sódicas como el NaCl y el Na2SO 4, siendo
esta última particularmente tóxica incluso para especies vegetales del tipo halofíticas como la leguminosa Prosopis strombulifera,
que puede tolerar concentraciones cercanas a 700 mM de NaCl
pero no potenciales equivalentes de Na2SO 4. Nuestra hipótesis
sostiene que la asociación de la leguminosa P. strombulifera con
rizobacterias reguladoras de la homeostasis vegetal o PSHR podría mejorar la respuesta vegetal a estrés salino generado por
Na2SO4 y que parte de la esta regulación dependería de la capacidad bacteriana de inmovilizar selectivamente el anión SO42- durante su crecimiento. Para probar esta hipótesis fueron utilizados
3 aislamientos endofíticos de P. strombulifera obtenidos previamente en condiciones de salinidad extrema y denominados
Brevibacterium halotolerans cepa Ps9, Achromobacter xyloxosidans cepa Ps27 y Pseudomonas putida cepa Ps30. Los microorganismos fueron reproducidos en un medio químicamente definido, deficiente en fuentes de sodio o azufre (MM) y modificado por
la adición de NaCl (400 mM) o Na2SO4 (303.3 mM) en concentración suficiente para obtener potenciales osmóticos de -1.53 MPa.
Adicionalmente, fueron generados tratamientos control del medio
sin salinizar y del medio modificado por la adición NaCl o Na2SO 4
pero sin inocular. Los cultivos bacterianos fueron incubados por
72 horas a 30 ° C y 120 rpm y posteriormente se colectaron submuestras con el objeto de evaluar su crecimiento (como produc-
55
ción de biomasa (DO600) y viabilidad celular (UFC/mL)) y la concentración residual de los elementos azufre (S) y sodio (Na) en
sobrenadantes filtrados de cada cultivo. Para cumplir este objetivo fue utilizado el método de Espectrometría de Emisión Atómica
(ICP) en un sistema acoplado a plasma o ICP-AES (SHIMATZU,
ICP-9000). Nuestros resultados demuestran que en medio de
cultivo químicamente definido modificado por la adición de Na2SO4
e inoculado individualmente con las cepas Ps27, Ps30 y Ps9 las
concentraciones de los elementos S y Na disminuyen entre un 30
y un 40%, con respecto al medio salinizado sin inocular. Por otro
lado, en medio de cultivo modificado por adición de NaCl, las
concentraciones de Na residuales fueron similares a los controles salinizados sin inocular. Esta respuesta diferencial determinaría que los microorganismos asociados a la especie vegetal serían capaces de acumular azufre (S) pero no sodio (Na) durante
el crecimiento y que parte de la respuesta a salinidad de la planta dependería de la inmovilización o captura biológica de compuestos de alta toxicidad, tal como el anión SO42- lo que podría
considerarse un mecanismo alternativo de rizoremediación.
P82 - 27550 AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE UN
MUTANTE SENSIBLE A LA ACIDEZ DE Rhizobium sp. LPU83.
MARTINI, MARIA CARLA; SALTO, ILEANA PAULA; SALAS, MARIA EUGENIA; TORRES TEJERIZO, GONZALO ARTURO; GIUSTI,
MARIA DE LOS ANGELES; LOZANO, MAURICIO JAVIER;
PISTORIO, MARIANO; LAGARES, ANTONIO; DEL PAPA, MARIA
FLORENCIA
Instituto de Biotecnología y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Exactas, UNLP
Introducción. La simbiosis Medicago sativa (alfalfa)-rizobio es
en general muy específica, siendo el simbionte natural de esta
planta Sinorhizobium meliloti. Sin embargo, se han caracterizado
otros rizobios capaces de nodular alfalfa; entre ellos la cepa
LPU83, aislada en suelos de Argentina, y estrechamente emparentada con la cepa Or191, aislada previamente en Oregón, Estados Unidos. En particular, estos aislamientos resultaron de gran
interés debido a su capacidad para nodular un amplio rango de
plantas, su ineficiencia para fijar nitrógeno y su tolerancia a la
acidez. Esta última característica convierte a la cepa LPU83 tipo
Or191 en una importante herramienta para el estudio de los mecanismos involucrados en la tolerancia a la acidez en rizobios,
dado que la acidez de los suelos es uno de los principales factores que limitan crecimiento de la alfalfa cuando el nitrógeno es
aportado por microorganismos fijadores. Objetivo. En este trabajo, describimos la generación y caracterización de un mutante sensible a la acidez obtenido a partir de una mutagénesis generalizada por transposición en R. sp. LPU83. Materiales y Métodos.
Medios de cultivo: LB (Sambrook et al., 1989), TY (Beringer, 1974)
y GS (Del Papa et al., 1999). Las técnicas moleculares se realizaron según Sambrook et al., 1989. Resultados. Para identificar
genes asociados con la tolerancia a la acidez, se realizó una
mutagénesis generalizada sobre la cepa LPU83 con el transposón
Tn5. De los mutantes generados, identificamos uno que se vio
disminuido en su capacidad de crecer a pH 5.0. Mediante clonado
de la inserción, secuenciamiento y comparación con bases de
datos se encontró que dicho mutante contenía interrumpido el
extremo carboxilo terminal de un marco de lectura abierto (ORF1)
situado río arriba de un gen homólogo a ubiH (codifica para una
hidroxilasa interviniente en la biosíntesis de ubiquinona). Considerando el posible carácter polar de la mutación, se construyeron dos mutantes sitio específico para los genes ORF1 y ubiH.
Ambos mutantes desarrollaron en medio mínimo en condiciones
ácidas una menor velocidad específica de crecimiento. También
presentaron una competitividad para la nodulación nula frente a
la cepa salvaje LPU83, tanto en M. sativa como en P. vulgaris.
Además, en los dos mutantes observamos una tolerancia disminuida a la presencia de ascorbato (condiciones reductoras) y a
concentraciones elevadas de Zn2+. Conclusiones. Los resultados
que hemos obtenido muestran que el gen ubiH participa en la tolerancia de las cepas tipo R. sp. LPU83 a la acidez y a otros
estreses. Asimismo, alteraciones en el mismo gen mostraron dis-
56
minuir muy fuertemente la competitividad de los rizobios para la
nodulación de M. sativa y P. vulgaris.
P83 - 27561 EFECTO DE LA INOCULACIÓN DE BACTERIAS
ASIMBIOTICAS FIJADORAS DE NITRÓGENO EN EL CRECIMIENTO DEL ROBLE (Tabebuia rosea) EN FASE DE VIVERO
EN SUELOS DEL VALLE DEL CESAR (COLOMBIA). ZAMBRANO, CORINA; SANCHEZ, LIGIA(1); OBANDO, MELISSA(2);
BONILLA, RUTH(2)
(1) Universidad de La Sabana, Bogotá, Colombia, (2) CORPOICA,
Colombia
Las bacterias fijadoras de nitrógeno presentes en diferentes
cultivos pueden estimular el crecimiento de las plantas a través
de diversos mecanismos, tales como, la síntesis de sustancias
reguladoras del crecimiento vegetal, la fijación de nitrógeno y la
solubilización de nutrientes. Se realizó el aislamiento y caracterización de bacterias de los géneros Azotobacter sp. y Azospirillum
sp. asociadas naturalmente con raíces de árboles de roble
(Tabebuia rosea) con el fin de evaluar su eficiencia como principio activo de biofertilizantes que complementen la aplicación de
fertilizantes nitrogenados de síntesis en fase de vivero. Las muestras de suelo fueron tomadas en Codazzi (Cesar-Colombia) y
transportadas al laboratorio de microbiología de suelos del Centro de Biotecnología y Bioindustria de Corpoica para su análisis.
Para el aislamiento de bacterias diazotróficas se emplearon medios semiselectivos según los métodos descritos por Novo (1993)
y Döbereiner et al. (1995) en suelo rizosférico, raíces y hojas. Una
vez obtenidos los aislamientos presuntivos de los dos géneros de
interés en el estudio, se seleccionaron las cepas con potencial
biofertilizante por su capacidad de reducción de acetileno (Valero,
2002) y la producción de ácido indolacético (Rodrígues et al.,
2008). Los experimentos de invernadero se llevaron a cabo en el
Estación Experimental Motilonia en el municipio de Codazzi (Cesar-Colombia). En los tratamientos evaluados se incluyó un tratamiento testigo (roble sin inocular y sin fertilizar) y un control (roble sin inocular y fertilizado con nitrógeno químico), dos cepas
presuntivas de Azotobacter sp. y dos de Azospirillum sp., aplicando un diseño de bloques completamente al azar con 6 tratamientos y 15 repeticiones por tratamiento. Las plántulas de todos los
tratamientos fueron colocadas en imbibición en los inoculantes
durante media hora. Se incluyó un tratamiento testigo (roble sin
inocular y sin fertilizar) y un control (roble sin inocular y fertilizado
con nitrógeno químico). El muestreo se realizó de tipo destructivo
en 4 plantas tomadas al azar por cada tratamiento, luego de haber
transcurrido 30, 60 y 90 días después de la inoculación; las variables evaluadas fueron las siguientes: altura de la planta (cm), peso
fresco de la planta (g), peso fresco de las raíces (g), longitud de
raíz (cm), diámetro de la base del tallo (cm) y número de rebrotes.
Fueron aisladas 8 cepas de las cuales se seleccionaron 4 (AZR1,
AZR2, ACR1 y ACR4) por su capacidad de producción de ácido
indolacético (10,2, 0,00, 7,86 y 4,12 µg/mL) y reducción de acetileno (3,63, 4,08, 18,64 y 26,84 nmol C2H4.hr-1/mL) y fueron evaluadas en la prueba de invernadero. Las diferencias obtenidas entre
tratamientos no fueron significativas (P>0,05), las plántulas inoculadas con la cepa AZR2 presentaron una tendencia de incremento
en la altura y peso fresco de la planta y diámetro de la base del
tallo. Los resultados permiten inferir que las cepas del género
Azospirillum sp. tienen un potencial biofertilizante sobre plantas de
roble (Tabebuia rosea) en la fase de vivero.
P84 - 27565 EVALUACIÓN DE AISLAMIENTOS CON EFECTO
PROMOTOR DE CRECIMIENTO VEGETAL Y ALTO POTENCIAL
BIOTECNOLÓGICO, DE REGIONES DE LA PROVINCIA DE LA
PAMPA. MARTIN, PEDRO; GARCIA, PATRICIA; AZCARATE,
SILVANA; FILIPPI, MAURO; SCARONE, JORGE; RONCHI, ANA LIA
El agotamiento de los suelos es una manifestación de complejos desequilibrios funcionales, sólo superable con la utilización
de mecanismos de análisis y propuestas de acción que se
efectivizan a través del conocimiento científico alcanzado en la
materia. Las pasturas en base a leguminosas que es necesario
establecer, resultan fuertemente limitados por dos factores, la disponibilidad hídrica y la fertilidad natural de los suelos. En el primer caso, técnicas de barbechos, rotaciones y prácticas culturales apropiadas harán factible un mejor aprovechamiento del agua
disponible. En el segundo, la aplicación de fertilizantes parece la
solución de mayor viabilidad, pero éstos pueden ser contaminantes y además su alto costo, pueden ser una limitante a la hora de
decidir sobre la conveniencia de su utilización, por lo que la fertilización biológica es una alternativa superadora desde lo ambiental y de notable menor costo. La región semiárida pampeana, ha
tenido un ciclo rico en lo que hace al aporte de precipitación pluvial
a lo que ha sucedido, inmediatamente después, un período de
escasas lluvias. Es así que muchos productores, tienen en sus
establecimientos necesidad de implantar cultivos de cosecha o
pasturas en área que estuvieron anegadas durante el tiempo necesario para la salinización de sus tierras, otrora muy aptas para
agricultura o ganadería. El objetivo del presente trabajo es evaluar microorganismos PGPR (promotores de crecimiento) con alto
potencial para la producción de inoculantes específicos para las
mismas. Para su cumplimiento se emplearon técnicas microbiológicas, analíticas, bioquímicas, biotecnológicas y agronómicas.
Se seleccionaron 4 regiones, las que se muestrearon en otoño y
primavera, se realizaron en ambos momentos los análisis de los
suelos y con diluciones de los mismos se: a) aislaron bacterias
solubilizadoras de fósforo por siembra en medio selectivo; a los
aislamientos obtenidos se le realizaron ensayos de caracterización, seguimiento de la variación de pH y cuantificación de la
solubilización de fósforo en medio líquido por la técnica de Fiske
y Subbarow modificada, se seleccionaron seis aislamientos por
su mayor capacidad solubilizadora, los valores de ppm de fósforo disponible en algunos casos llegaron a superar las 400 ppm a
las 72 horas de crecimiento de los cultivos y b) inocularon plantas de alfalfa y planta de soja, colocadas en una cámara de cultivo con control de luz y temperatura. Al cabo de un mes se levantó el ensayo, no se encontraron nódulos en las plantas de soja
pero si se recolectaron 450 nódulos de las plantas de alfalfa, se
aislaron los rizobios, se purificaron y se caracterizaron mediante
su aspecto morfológico, coloración de Gram, electroforesis de
isoenzimas e IER realizado a 45 aislamientos que mostraron una
semejanza del 70% por el método UPGMA. Se puede comprobar que hay rizobios nativos con una eficiencia superior a la de
las cepas comerciales, por lo que con los dos aislamientos más
promisorios de cada región se formularon inoculantes sólidos
combinados (rizobios y bacterias solubilizadoras de fósforo), que
actualmente están siendo evaluados.
P85 - 27570 ALTERNATIVAS TECNOLÓGICAS PARA OPTIMIZAR LA RESPUESTA A LA INOCULACIÓN EN SOJA – INFLUENCIA DEL USO DE BIOPROTECTORES Y MÉTODO DE INOCULACIÓN. MONTELEONE, MARIA EMILIA(1); RUIZ, DANTE(1);
MACARONI, LUCAS(1)
(1) Departamento de Investigación y Desarrollo Nitrasoil Argentina S.A.
Introducción: la inoculación es la práctica mediante la cual se
aporta un elevado número de bacterias específicas, efectivas e
infectivas, con el objetivo de que éstas se asocien exitosamente
con la raíz y así lograr una rápida y adecuada nodulación. Cuando la inoculación se hace sobre las semillas, que es el método
más utilizado, las bacterias se ven severamente afectadas por la
desecación y la temperatura. Desde hace ya algunos años, se han
empezado a implementar diferentes alternativas para aportar un
alto número de bacterias y disminuir dichos efectos adversos. Dos
de estas prácticas son la incorporación de bioprotectores a la tecnología usual de aplicación del inoculante a la semilla y la inoculación al surco de siembra. Objetivos: evaluar la respuesta a la
inoculación, comparando aplicación del inoculante a la semilla con
y sin bioprotector vs inoculación al surco de siembra. Materiales
y Métodos: el ensayo se implantó en la localidad de 9 de Julio, el
día 10 de noviembre de 2009. El cultivo antecesor era soja de
primera y la variedad sembrada Don Mario 3700 en hileras espa-
ciadas a 35 cm. Métodos de inoculación empleados: inoculación
sobre semillas dosis simple y doble (150 y 300 mL/50 Kg de semillas de soja, respectivamente) y chorreado en el surco de siembra (600, 750 y 900 mL de inoculante + 40 l agua/Ha). La dosis
de bioprotector fue de 50 mL/50 Kg de semillas de soja. El diseño del ensayo fue en bloques completos al azar con cuatro repeticiones. Inoculantes empleados: Nitrasoil-L x 7,5 lt (Bradyrhizobium japonicum) concentración 9 x 10E+9 riz/mL para la inoculación al surco y Nitrasoil-L x 2,4 lt con turba en suspensión
(Bradyrhizobium japonicum), concentración 5,3 x 10E+9 riz/mL
para la inoculación a la semilla. Se evaluó nodulación en estado
R5.3 y rendimiento de grano al finalizar el ciclo del cultivo. A los
resultados se les realizó análisis de varianza (ANOVA). Resultados: Los datos de rendimiento se detallan en la siguiente tabla:
Tratamientos
Rendimiento
Diferencia sobre testigo (Kg/Ha)
Testigo
I. Semilla (simple)
I. Semilla (simple) + Biopr
I. Semilla (doble)
I. Surco (600 mL)
I. Surco (750 mL)
I. Surco (900 mL)
4814
5383
5652
5140
4889
4840
5248
———569
838
326
75
26
434
c
ab
a
abc
bc
bc
abc
Todos los tratamientos inoculados, en valores absolutos, rindieron más que el testigo sin inocular. Dentro de los tratamientos
inoculados se destacaron los que fueron aplicados a la semilla, y
el tratamiento que incluyó bioprotector (con dosis simple de
inoculante) fue el que mayor rendimiento presentó (+838 Kg respecto al testigo), con diferencias estadísticamente significativas
respecto al testigo sin inocular.
P86 - 27572 BIOFERTILIZACIÓN CON Azospirillum brasilense
EN HÍBRIDOS DE MAÍZ (Zea mays) EN SANTIAGO DEL ESTERO. ALBANESI, ADA; ANRIQUEZ, ANALIA; SILBERMAN, JUAN;
GARAY, FERNANDO
FAYA, Universidad Nacional de Santiago del Estero
El objetivo del trabajo fue determinar el efecto de la inoculación con Azospirillum brasilense cepas AZ39 y Cd en la materia
seca de raíz y parte aérea del estadio V2 y en los componentes
del rendimiento de dos híbridos de maíz (Zea mays): Pioneer
30T17 (MT) y 30F35H (MH) en el área de riego del Río Dulce,
Santiago del Estero. Dos ensayos se realizaron en el campo de
la FAyA–UNSE, (Santiago del Estero), en bloques al azar (n=4),
durante la campaña 2008-2009, en maíz MT y MH; en un suelo
Haplustol éntico. Los tratamientos fueron: T. Sin nada, F. Fertilizado con 200 kg ha-1 de N urea; NP Fertilizado con 200 kg ha-1
de N NPK, Az39 DS. Inoculado con A. brasilense (Ab) cepa Az39
en dosis simple (1 L ha-1); Cd DS. Inoculado con Ab cepa Cd en
dosis simple; Az39 DD. Inoculado con Ab cepa Az39 en dosis
doble (2 L ha-1); Cd DD. Inoculado con Ab cepa Cd en dosis
doble. Los títulos de los inoculantes fueron: 2x10 8 UFC/mL y
3,5x109 UFC/mL de las cepas Az 39 y Cd, respectivamente. Se
realizó análisis de la variancia y test de diferencia de medias
(Duncan, a = 0,05) de las variables en V2 y de los componentes
del rendimiento. En el estadío V2, la materia seca de raíces y
tallos con hojas en ambos ensayos no presentaron diferencias
significativas, aún cuando se registraron aumentos en la MS de
tallos en los tratamientos inoculados con dosis doble. El rendimiento medio (kg grano ha-1) y el número de semillas m-2 en MH
y MT, no evidenciaron diferencias estadísticas (p=0,1 y p=0,18)
entre tratamientos. Aún cuando los tratamientos fertilizados superaron a los inoculados, Cd DD en MH y Cd DS en MT registraron el mayor valor de los tratamientos inoculados en ambas variables, evidenciando que las variaciones en el número de granos están estrechamente asociadas a variaciones en el rendimiento. La MS de raíces (datos usados para calcular IC) aumentó en
los tratamientos Az39 DD y Cd DD en maíz MH y Cd DS en maíz
MT. Se destaca la mayor eficiencia en la partición de materia seca
a los granos de Cd DD en maíz MH con relación a T, reflejándose en los rendimientos finales. La MS total en Cd DD de MT fue
significativamente mayor que T, con IC c/raíz = 0,43, contribuyendo con un 57% de materia seca que se recicló en el sistema como
57
necromasa, aumentando la materia orgánica del suelo, contribuyendo a la fertilidad y a la estructura del suelo. La biofertilización
con A. brasilense en los híbridos de maíz MT y MH no influyó en
la materia seca de raíces y tallos con hojas en el estadio V2 ni
en los componentes del rendimiento. MH inoculado con A. brasilense cepa Cd DD presenta mayor tasa de eficiencia en la partición de materia seca a los granos; MT inoculado con A. brasilense
cepa Cd DD presenta mayor acumulación de materia seca total
promedio en planta y menores índices de cosecha logrando una
menor extracción desde la materia orgánica del suelo.
P87 - 27639 AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE LIPASAS A PARTIR DE DIFERENTES SUSTRATOS. MAZZUCOTELLI, CINTIA; PONCE,
ALEJANDRA; ROURA, SARA; MOREIRA, MARIA DEL R
CONICET-Grupo de Investigación en Ingenieria en Alimentos,
Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional de Mar del Plata
Introducción: en los últimos años ha habido un creciente interés en el estudio de microorganismos productores de lipasas, que
podrían ser potencialmente aplicados para la reconversión de
residuos industriales sólidos e insolubles, dentro de las llamadas
“tecnologías limpias” que harían más sustentable la actividad industrial. Algunos bacterias, hongos y levaduras son capaces de
secretar lipasas durante su crecimiento en diferentes sustratos.
Objetivo: el objetivo de este trabajo fue realizar un screening de
microorganismos productores de lipasas, realizando su aislamiento a partir de diferentes sustratos alimenticios ricos en lípidos
(maní, girasol, almendras, emulsión agua/aceite). Materiales y
métodos: se realizó una optimización respecto de los medios de
cultivo más adecuados, donde los microorganismos evidenciaran
su patrón lipolítico luego de incubar a 28-30°C durante 7 días. Se
utilizó el agar con Tween 80 con y sin agregado de CaCl2, el agar
con aceite de oliva y la combinación Tween/oliva en distintas proporciones. La presencia de actividad lipásica fue determinada en
un medio mínimo de crecimiento en presencia de rodamina que
permite evidenciar lipasa positiva frente a la producción de fluorescencia a la luz UV a 350 nm. Resultados y conclusión: los
medios de cultivos ensayados permitieron aislar 35 cepas
presuntivas las cuales fueron repicadas en agar con rodamina en
diferentes proporciones, verificando la producción de colonias
anaranjadas con fluorescencia a consecuencia de la actividad
lipásica. Del screening realizado encontramos que sólo 5 cepas
mostraron actividad lipásica. Estas cepas presentaron una actividad enzimática significativa que fue cuantificada a través del
método de titulación, usando tributirina como sustrato, titulando
con NaOH los ácidos grasos libres. Este trabajo es un estudio
preliminar tendiente a transformar los residuos agroindustriales en
productos de mayor valor agregado. Este trabajo es un estudio
preliminar tendiente a transformar los residuos agroindustriales en
productos de mayor valor agregado.
P88 - 27643 LA HETEROGENEIDAD ESPACIAL DE LA FISIOLOGÍA DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS ASOCIADAS
AL CULTIVO DE TRIGO REDUCE LA RESPUESTA A LA INOCULACIÓN CON Azospirillum brasilense. DI SALVO, L P(1);
PERDOMENICO, P(1); GARCIA DE SALAMONE, I E(1)
(1) Cátedra de Microbiología Agrícola y Ambiental, Facultad de
Agronomía, Universidad de Buenos Aires
La aplicación de inoculantes con PGPR en cultivos es una
práctica cada vez más habitual. Sin embargo, el efecto del agregado de inoculantes sobre las comunidades microbianas rizosféricas (CMR) no ha sido bien estudiado. Los objetivos de este
trabajo fueron caracterizar, en condiciones de campo, la diversidad funcional microbiana de la rizosfera de plantas de trigo inoculadas con Azospirillum brasilense, así como también evaluar los
parámetros determinantes del rendimiento. Para ello, se realizó
un ensayo de trigo (Klein Castor) en la localidad de Villa Moll
(Navarro, Buenos Aires) con un diseño en bloques completamente
aleatorizados con cuatro repeticiones, cuya superficie total fue de
58
2600 m2. Los factores evaluados fueron dos: inoculación (I0, I1,
I2 e I3) y fertilización nitrogenada (0 y 30 kg N/ha). Los muestreos
de rizosfera se realizaron en encañazón y llenado de grano, mientras que la biomasa aérea se determinó en encañazón, llenado
de grano y madurez fisiológica, donde se estimó el rendimiento
del cultivo. Además, se estudió la diversidad funcional de las CMR
mediante la obtención de perfiles de uso de fuentes carbonadas
(CLPP). Los resultados de biomasa y rendimiento mostraron que
el efecto de la inoculación no fue estadísticamente significativo y
fue variable según el inoculante aplicado y el momento de
muestreo. En encañazón, los tratamientos inoculados en conjunto presentaron mayor biomasa aérea con respecto al testigo. En
madurez fisiológica, la inoculación con I2 sin fertilización incrementó 7% la biomasa aérea y 9% el rendimiento respecto al testigo no fertilizado. La fertilización, por su parte, generó un aumento
estadísticamente significativo en la producción de biomasa aérea,
solamente en encañazón. Para este muestreo, los tratamientos
fertilizados presentaron un 13% más de biomasa aérea que los
tratamientos sin fertilizar. En etapas posteriores, las diferencias
encontradas no fueron significativas. Los CLPP de las CMR no
difirieron significativamente entre tratamientos, para ninguno de
los muestreos. Sin embargo, tanto para encañazón como para llenado de grano, la fisiología de las CMR presentó diferencias entre bloques, poniendo de manifiesto la heterogeneidad espacial
presente en el sitio del ensayo. Se sabe que el manejo diferencial de insumos según la productividad de los ambientes a nivel
lote favorece la sustentabilidad de los agroecosistemas. Los resultados encontrados en este trabajo demuestran que los CLPP
de las CMR podrían llegar a ser utilizados como indicadores de
la heterogeneidad ambiental a nivel de lote. Los resultados encontrados en este trabajo demuestran que las variables ambientales en el sitio del ensayo, tales como disponibilidad de nutrientes
y variación en la fisiología de las comunidades microbianas nativas presentes en distintos ambientes, predominaron por sobre los
factores evaluados en este estudio y condicionaron la respuesta
a la inoculación.
P89 - 27650 DIVERSIDAD DE BACTERIAS ASOCIADAS AL CULTIVO DE COLZA (brassica napus). VALETTI, LUCIO(1); IRIARTE,
LILIANA(2); FABRA, ADRIANA(1)
(1) Universidad Nacional Río Carto; (2) INTA
Introducción: Numerosas especies de bacterias del suelo pueden crecer alrededor, o en los tejidos de las plantas, estimulando
su crecimiento mediante una gran variedad de mecanismos. Dichos microorganismos son conocidos colectivamente como Plant
Growth Promoting Rhizobacteria (PGPRs). El estudio de dichas
bacterias es importante no sólo para el entendimiento de su rol
ecológico en su interacción con plantas sino también para la aplicación biotecnológica de las mismas en áreas tales como la promoción del crecimiento vegetal. Objetivo: Aislar bacterias de la
rizósfera de plantas de colza identificarlas y evaluar su capacidad de fijar nitrógeno y solubilizar fosfatos. Metodología: Se recolectaron plantas de campos ubicados en Río cuarto (Córdoba)
y Tres arroyos (Bs As). Para el aislamiento de epifitos las raíces
se lavaron con solución salina bufferada (PBS). Diluciones de esta
solución fueron sembradas en placas conteniendo medio TSA al
10% suplementado con cicloheximida. Para el aislamiento de
endófitos, se esterilizaron las raíces superficialmente con hipoclorito de calcio al 3%. Luego fueron cortadas y homogenei-zadas
en 1mL de agua estéril por cada gramo de tejido fresco. Diluciones de esta solución fueron sembradas en las mismas condiciones descriptas anteriormente. Se determinaron las características
morfológicas y tintoriales de las bacterias provenientes de colonias morfológicamente diferentes y se identificaron a partir de
pruebas bioquímicas según el manual Bergey. En cada aislamiento se evalúo la capacidad de solubilizar fosfato en los medios
descriptos por Frioni (1999) y fijación de nitrógeno atmosférico en
los medios semisólido libre de nitrógeno JNFb, NFb y JMV. Resultados: Se aislaron 40 morfotipos: 28,2% bacilos esporulados
Gram (+); 35,9% bacilos no esporulados Gram (+); 5,1% cocos
Gram (+) y 30,8% bacilos Gram (-). La proporción de morfotipos
obtenidos fue similar tanto para aislamientos endófitos como para
epífitos, a excepción de los cocos Gram (+) que no fueron aislados en asociación endófita. El 10,8% de los morfotipos obtenidos
no presentaron ninguna de las dos actividades PGPR evaluadas.
El 37,8% del total de los aislamientos fue capaz de solubilizar
fosfato, en su mayoría epífitos y, el 62,1% fue capaz de fijar nitrógeno en medios libres de nitrógeno. A partir de las características fenotípicas y fisiológicas evaluadas se lograron identificar los
géneros Pseudomonas, Serratia, Aeromonas, Enterobacter,
Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus y Staphylococus. En este
trabajo, asociados a la rizosfera de Brassica napus, se describen
por primera vez los géneros bacterianos Aeromonas, Corynebacterium, Lactobacillus y Serratia. En base a los resultados obtenidos se concluye que existe una gran diversidad de bacterias
asociadas a Brassica napus que poseen un gran potencial en
cuanto a promoción del crecimiento vegetal. Esto motiva a continuar los estudios con el objetivo de encontrar nuevas alternativas para mejorar la producción y el desarrollo del cultivo de colza.
Financiado por: SECyT-UNRC, CONICET, MinCyT
P90 - 27666 EFECTO DEL ESTRÉS SALINO EN RIZOBIOS
SIMBIONTES DE lotus tenuis. SANNAZZARO, ANALIA(1);
CASTAGNO, LUIS N(1); PIECKENSTAIN, FERNANDO(1);
CASSAN, FABRICIO(2); SANJUAN, JUAN(3); RUIZ, OSCAR(1);
ESTRELLA, MARIA J(1,4)
1-IIB-INTECH. UNSAM. Chascomús, Argentina, 2-Laboratorio de
Fisiología Vegetal. y de la Interacción Planta-Microorganismo.
UNRC. Córdoba, Argentina, 3-Dpto. de Microbiología del Suelo y
Sistemas. Simbióticos, EEZ, CSIC, España, 4-Comisión de Investigaciones Cientificas, (CIC).
Introducción: La Pampa Deprimida del Salado es la zona de
cría vacuna más importante de la República Argentina, pero sus
suelos son de baja fertilidad y heterogéneos en términos de
salinidad y pH, lo que afecta la adaptación y el desarrollo productivo de las especies vegetales utilizadas como forraje, como el
trébol o la alfalfa. Lotus tenuis es una leguminosa exótica adaptada a estas condiciones, y por ello es el principal recurso forrajero
para la producción de pasturas destinadas a la ganadería en esta
región. La optimización de la simbiosis mutualista entre Lotus y
rizobios nativos es una estrategia que permite incrementar la productividad y calidad de esta leguminosa. Es por ello que el objetivo del presente trabajo se centra en el estudio de la eficiencia
simbiótica y la tolerancia al estrés salino, en rizobios de L. tenuis
aislados de suelos de esta región. Métodos: Se utilizó como material de estudio una colección de aislamientos obtenidos de plantas de L. tenuis recolectadas de distintos tipos de suelos de la
Pampa Deprimida del Salado (media lomas, bajos salino-alcalinos,
bajos-dulces). Se estudió la tolerancia a salinidad en vida libre
(crecimiento de cada aislamiento en medio de cultivo agarizado
suplementado con NaCl 0, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500 mM).
La eficiencia simbiótica se evaluó en plantas de L. tenuis cv Esmeralda, en condiciones control y de estrés salino por aclimatación a 150mM NaCl, mediante la determinación de peso seco de
parte aérea y peso seco y número de nódulos. Resultados: aproximadamente la mitad de los aislamientos evaluados son capaces
de tolerar hasta 200mM NaCl y un 25% toleran hasta 500mM
NaCl. También se encontraron algunos aislamientos provenientes de bajos salinos capaces de crecer hasta 1M NaCl. En los tres
tipos de suelos se aislaron rizobios con mayor o igual eficiencia
simbiótica que la cepa tipo para L. tenuis (M. loti NZP2213, procedente de Nueva Zelanda). Algunos de estos aislamientos fueron seleccionados para su posterior evaluación en condiciones de
estrés salino. Se observó que la salinidad no disminuyó
significativamente la eficiencia simbiótica de la mayoría de las
cepas provenientes de bajos salinos alcalinos. Por otra parte, el
estrés salino afectó el comportamiento simbiótico de rizobios provenientes de la media loma y bajo dulce. A pesar de ello, se detectaron aislamientos que mostraron una eficiencia simbiótica
superior a la cepa tipo, aún en condiciones de salinidad. No se
pudo establecer ninguna correlación entre las cepas más eficientes bajo estrés salino y la tolerancia de las mismas a altas concentraciones de NaCl en condiciones de vida libre. Los resultados sugieren que la adaptación rizobiana a ambientes con altos
contenidos de sales no necesariamente se traduce en un mejor
comportamiento simbiótico. Por lo tanto la evaluación de eficiencia simbiótica sería más conveniente que la tolerancia a la
salinidad en estado de vida libre a la hora de elegir un criterio para
seleccionar cepas que vayan a ser utilizadas como inoculantes
de L. tenuis en suelos salinos
P91 - 27673 RENDIMIENTO DE LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA EN VINOS CABERNET SAUVIGNON. ROMERO, JOSE;
CARRILES, PEDRO (1); LOPEZ, LUIS (2); NOVOA, MARIA JOSE(2)
(1) LALLEMAND Inc. Chile, (2) Universidad de Chile
La fermentación maloláctica (FML), transformación del ácido
L- málico en ácido L- láctico por medio de bacterias malolácticas
logra la desacidificación, estabilidad biológica y modificaciones en
las características sensoriales del vino. Para evaluar el rendimiento del proceso y las características de los vinos con FML se realizó ésta en vinos elaborados con mostos Cabernet sauvignon
empleando cepas chilenas de Saccharomyces cerevisiae UCHM3
y UCHM4 autóctonas del valle del Maule. Para ello se inoculó
Oenoccocus oeni (1 g/Hl) al comienzo y al finalizar la fermentación alcohólica (FA) y se evalúo determinando la concentración
de ácido málico en los mostos y en los vinos, empleando como
control vinos sin FML. Los vinos se elaboraron realizando
microvinificaciones en 800 mL de mosto (23°Brix) con 0,1 g/l de
fosfato diamónico y 20 mg/L de metabisulfito de potasio, se fermentó a sequedad a 20°C controlando la producción de CO2 y
consumo de azúcar. En los vinos obtenidos con ambas cepas de
levaduras se determinó, grado alcohólico, azúcar residual, SO2
total y SO2 libre, acidez total y acidez volátil. En los vinos con
FML, el grado alcohólico, azúcar residual, SO2 libre y total se
mantuvieron sin variación, determinándose una disminución en la
acidez total de 5,4 a 4,4 g/L ácido tartárico para UCHM3 y de 4,8
a 4,3 g/L ácido tartárico para UCHM4 y un aumento en la acidez
volátil de 0,3 a 0,7 g/L ácido acético para UCHM3 y de 0,3 a 0,8
g/L ácido acético para UCHM4. En los vinos obtenidos con ambas cepas, la concentración de ácido málico inicial 2,5 g/l, disminuyó en 98,8% al realizar la FML en forma simultánea a la FA y
en un 99,9% al realizarla al término de la FA. De acuerdo a estos valores el factor de rendimiento para la conversión de ácido
málico en ácido láctico (Yp/s) resultó ser 0,70. Los vinos con FML
se evaluaron sensorialmente para identificar si hubo diferencias
significativas respecto a un vino control sin FML, los resultados
mostraron que no existen diferencias significativas para los
descriptores: color, astringencia y aromas mantequilla, miel y nuez.
Se detectaron diferencias significativas (p<0,05) para la densidad
o fluidez, acidez y aromas frutales y florales, siendo éstas de carácter positivo. Los vinos con FML resultaron más fluidos, con
aromas frutales y florales disminuidos y menos ácidos al paladar.
Los resultados obtenidos señalarían que la FML es aplicable en
la producción de vinos tintos Cabernet sauvignon, reduciendo la
concentración de ácido málico y otorgando así características
sensoriales mejoradas en boca.
P92 - 27701 AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN
FENOTÍPICA DE RIZOBIOS NATIVOS ASOCIADOS A Acacia
decurrens EN CUATRO MUNICIPIOS DE CUNDINAMARCA (COLOMBIA). BONILLA, RUTH; CRIOLLO, PAOLA; GARRIDO, MARIA FERNANDA
CORPOICA
La acacia negra (Acacia decurrens) es una de las especies
arbóreas que se encuentra en los sistemas silvopastoriles del altiplano cundiboyacence y ha sido empleada como suplemento
alimenticio para el ganado; por esta razón, la inoculación con
rizobios nativos en los sistemas que incluyan leguminosas, se
convierte en una herramienta para la recuperación de suelos. El
objetivo del presente estudio fue: aislar, seleccionar y caracterizar cepas nativas de rizobios asociadas a A, decurrens, en los
municipios de Mosquera, Susa, Cucunuba y Ubaté (Cundinamarca). Se colectaron nódulos y posteriormente se llevaron al Labo-
59
ratorio de Microbiología de Suelos del Corpoica (CI Tibaitatá) para
su procesamiento (esterilización con Alcohol-Hipoclorito de Sodio
al 3%, y siembra en medio de cultivo YMA con Rojo Congo); para
la determinación de la fijación de nitrógeno, las raíces noduladas
fueron llevadas a recipientes cerrados herméticamente sustituyendo el 10% de la atmosfera por acetileno; después de una hora se
procedió a medir la reducción del acetileno a etileno por cromatografía de gases. Para la determinación de compuestos indólicos
las cepas fueron crecidas en medio Luria-Bertani (LB) durante
24h, y luego fueron cultivadas en medio K-lactato suplementado
con triptófano durante 72h a 150rpm. Posteriormente se tomó una
alícuota de 1.2mL, se centrifugó a 10000rpm y el sobrenadante
de cada tubo se llevó a reacción con 1mL del reactivo de
Salkowsky durante 30min. Cumplido el tiempo de reacción se leyó
la absorbancia de cada muestra en espectrofotómetro (540nm).
Se obtuvieron dieciséis aislamientos y se evaluaron teniendo en
cuenta los criterios de: capacidad de nodulación en la planta huésped, fijación de nitrógeno, y producción de compuestos indólicos
(AIA). El medio de cultivo YMA con Azul de Bromotimol fue
alcalinizado por las cepas: RM01, RM04, RM05, RCC01, RCC02,
RCC03, RCC05 Y RU01, y las cepas RM02, RM03, RM06, RS01,
RS02, RS03, RS04 y RCC04 presentaron acidificación en el mismo medio. El análisis macroscópico determinó la morfología típica de rizobios: mucosas de bordes lisos con poca o no absorción
del indicador. La caracterización microscópica demostró bacilos
Gram negativos. Los aislamientos obtenidos fueron eficientes en
ARA, sin embargo, la cepa RS01, presentó el valor mayor
(1154,40 nmolC2H4h-1mL-1) seguida por RCC02 con un valor de
1127 nmolC2H4h-1mL-1. En cuanto la producción de índoles los
aislamientos RU01 y RM02 presentaron los valores más altos
(22,19 y 20,13ug de indoles/mL respectivamente) con respecto al
testigo C50 (10,76ug de indoles/mL). De acuerdo con las pruebas de nodulación realizadas, no se encontraron diferencias significativas (P=0.05); sin embargo los aislamientos: RM02 presentaron la mejor respuesta en las variables: peso fresco de la parte
aérea (1,79g), peso seco de la parte aérea (0,649g) y longitud de
la parte aérea (17,87cm); RCC01 en el porcentaje de materia seca
(39, 57%) y longitud de la raíz (24,67cm); con respecto a las cepas de referencia utilizadas (C50 y UFLA 1) y el testigo absoluto
y químico.
P93 - 27740 CARACTERIZACIÓN FILOGENÉTICA DE AISLAMIENTOS DE CRECIMIENTO LENTO NODULANTES DE MANÍ
NATIVOS DE LA PROVINCIA DE CÓRDOBA. MUÑOZ, VANINA;
IBAÑEZ, FERNANDO; FABRA, ADRIANA
Universidad Nacional de Río Cuarto, Córdoba
Antecedentes: Arachis hypogaea L. (maní) es una leguminosa de gran importancia agronómica y económica. Argentina es uno
de los principales productores de maní en el mundo, y el 92% de
su producción se concentra en la provincia de Córdoba. Históricamente, se ha considerado que esta leguminosa es capaz de
establecer una asociación simbiótica fijadora de nitrógeno con
rizobios de crecimiento lento del género Bradyrhizobium. Objetivo: Realizar la caracterización filogenética de aislamientos de crecimiento lento nodulantes de maní nativos de Córdoba, en base
al estudio de genes y regiones del genoma básico y accesorio.
Materiales y métodos: Se utilizaron los aislamientos nativos PI237
y CH81, obtenidos a partir de nódulos de plantas cultivadas en la
provincia de Córdoba. Se realizó la amplificación y posterior
secuenciación del gen dnaK, la región espaciadora 16S-23S (ITS)
y el gen simbiótico nodA utilizando el servicio de secuenciación
de la Université Laval (Canadá). El análisis filogenético y
molecular de las secuencias fue realizado con los programas
BioEdit, MEGA 4 y PhyML. El modelo de sustitución más adecuado fue seleccionado con la herramienta jModeltest 0.1.1. Resultados: El análisis filogenético del gen dnaK permitió concluir que
los aislamientos nativos pertenecen al género Bradyrhizobium. Sin
embargo, la utilización de este gen como única herramienta ha
demostrado ser insuficiente para resolver las relaciones filogenéticas dentro del género. Por el contrario, el análisis de la región ITS permitió discriminar los 10 linajes descriptos para el género Bradyrhizobium. Además, este análisis indicó que los aisla-
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mientos nativos CH81 y PI237 están filogenéticamente relacionados con las especies B. yuanmingense y B. iriomotense, respectivamente. El análisis filogenético correspondiente al gen nodA,
permitió distinguir los siete Clados previamente descriptos para
bradirizobios y designados I-VII. De manera interesante, el análisis reveló que existe un elevado grado de diversidad entre los
alelos nodA correspondientes a los aislamientos analizados y los
existentes en la base de datos. La filogenia construida a partir de
este gen sugiere que los alelos nodA de los aislamientos nativos
podrían representar un nuevo Clado (propuesto como VIII). Además, la comparación de las filogenias obtenidas a partir de genes
housekeeping y simbióticos indica que la transferencia lateral de
genes es importante para la evolución de esta población de
microorganismos, ya que los aislamientos nativos analizados poseen alelos nodA idénticos a pesar de que los genes del metabolismo básico son diferentes. Tomados en conjunto, los resultados de este trabajo indican que los aislamientos nativos B. sp.
CH81 y B. sp. PI237 representan variantes localmente adaptadas
de B. yuanmingense y B. iriomotense, cuyos genes simbióticos
han sido moldeados por eventos de transferencia lateral de genes.
P94 - 27743 EVALUACIÓN A CAMPO DE GRAMINOSOIL-L TRIGO BAJO DIFERENTES NIVELES DE FERTILIZACIÓN
NITROGENADA. RUIZ, DANTE(1); MONTELEONE, EMILIA(1);
COURETOT, LUCRECIA(2); FERRARIS, GUSTAVO(2)
(1) Departamento de Investigación y Desarrollo Nitrasoil Argentina S.A. (2) Área de Desarrollo Rural INTA EEA Pergamino
Introducción: La aplicación de inoculantes es una práctica con
probada eficiencia en el incremento de los rendimientos. En el
caso de Azospirillum spp. queda descripta mediante una acción
directa sobre la planta permitiéndole tener mayor eficiencia en el
uso de los recursos a través del estímulo en el desarrollo radicular.
Los efectos más observados son una rápida implantación, mayor
crecimiento radicular y acumulación de biomasa. Objetivos: 1.
Cuantificar el efecto sobre la implantación, vigor inicial, acumulación de biomasa y rendimiento de trigo de un inoculante en base
a Azospirillum spp. 2. Evaluar la interacción de la inoculación con
la fertilización nitrogenada. Métodos: Se realizó un ensayo a campo sobre un suelo Serie Pergamino, Argiudol típico, donde se
evaluó el inoculante Graminosoil-L Trigo aplicado a la semilla,
combinado con tres niveles de fertilización nitrogenada. Éste
inoculante está formulado en base a Azospirillum spp. y contiene
1x109 bacterias/mL a la fecha de elaboración. Los tratamientos
evaluados surgen de la combinación de semilla sin inocular o inoculada y tres niveles de fertilización nitrogenada, el diseño fue en
bloques completos al azar. Se determinó el número de plantas
emergidas a los 10 dde, biomasa de planta entera en Z25 y Z89,
vigor en Z39 y Z89, cobertura del cultivo sobre el suelo en Z89
por imágenes procesadas con el software Cob Cal 2.0. y rendimiento en grano. A los resultados se les realizó análisis de
varianza (ANVA), comparaciones de medias y análisis de regresión. Resultados: Se observaron diferencias tempranas en vigor
y acumulación de materia seca en Z25, relacionadas con los tratamientos de fertilización, aunque fueron sutiles y aleatorias, sin
predominar una tendencia central. A cosecha, las diferencias en
materia seca y rendimiento fueron pronunciadas; ambas dosis de
N superaron al testigo sin diferencias estadísticas entre sí, aunque el diferencial entre ambos tratamientos de fertilización fue
agronómicamente relevante. Las diferencias por inoculación no
fueron significativas para materia seca final y rendimiento, pero
la magnitud fue considerable en relación al costo del tratamiento
y se encontró cercana al máximo esperable. Los análisis de resultados indicaron que la respuesta a Azospirillum spp. es independiente de la dosis de N agregada. La diferencia media en rendimiento en grano alcanzó los 427 Kg/ha. Si bien las diferencias
no resultaron estadísticamente significativas, se observó una tendencia positiva al uso de Graminosoil-L Trigo en condiciones de
campo sobre determinados parámetros de crecimiento del cultivo y rendimiento en grano. No se determinó una interacción entre el efecto de la inoculación y los niveles de fertilización
nitrogenada evaluados, lo que sugiere que la respuesta a la aplicación de Graminosoil-L Trigo es independiente de la dosis de N
agregada. Esto permitiría una aplicación exitosa del producto evaluado en una variedad de situaciones productivas.
P95 - 27748 PRODUCCIÓN DE ÁCIDO ACÉTICO A PARTIR DE
EFLUENTES LÍQUIDOS DE LA INDUSTRIA CERVECERA. ISLA,
MIGUEL(1); BENZZO, MARIA T(1); AGUER, FERNANDO (2);
JACOB, PAULINA(2)
1 Facultad Ingeniería y Ciencias Hídricas-Universidad Nacional del
Litoral. 2 Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas- Universidad Nacional del Litoral
Introducción: Uno de los principales subproductos de la producción de cerveza es la corriente que se genera al separar las
levaduras excedentes luego de la fermentación. El efluente así
obtenido puede considerarse prácticamente cerveza, y se conoce con el nombre de “corriente de fondo” o “levadura líquida”.
Dada su alta carga orgánica, su tratamiento acarrea problemas
en los reactores UASB (Upflow Anaerobic Sludge Blanket) que se
utilizan en este tipo de industrias. El contenido de etanol (4-7 %
m/v) de esta corriente es responsable de un 70% de su DQO
(Demanda Química de Oxígeno). En el presente trabajo se analizó la posibilidad de producir vinagre de cerveza a partir de la
corriente de fondo, mediante un proceso de fermentación utilizando bacterias acéticas. Objetivos: a) Analizar la factibilidad de producir ácido acético a partir de efluentes de cervecerías con alto
tenor de etanol, utilizando bacterias acéticas. b) Diseñar un protocolo de reposición de etanol que permita superar el valor mínimo de la concentración de ácido acético (4% m/v) exigido por el
CAA (Código Alimentario Argentino) para la comercialización del
producto como vinagre de cerveza. c) Explorar la posibilidad de
utilizar la fermentación acética como método alternativo al tratamiento convencional de los efluentes cerveceros. Materiales y
métodos: Se utilizó cerveza comercial como materia prima, con
un tenor de etanol de 5% m/v en reemplazo de la corriente de
fondo, a fin de tener repetitividad en el medio de inoculación.
Acetobacter spp. y Gluconobacter spp. se inocularon (concentración inicial: 1x107 UFC/mL) en dos reactores tipo batch, diseñados a escala banco, con agitación mecánica y aireación adecuada, imitando el método de cultivo sumergido utilizado en la industria vinagrera. Se adicionó ácido acético hasta alcanzar un pH
inicial de 4,00 y alícuotas de etanol, cuando se detectó la primera disminución de ácido acético producido. El tiempo de estudio
para cada corrida fue de aproximadamente 10 días, realizándose
un seguimiento diario del pH, oxígeno disuelto, y concentración
de ácido acético y etanol. Resultados: se demostró que, luego de
la aclimatación, Acetobacter presentó mayor velocidad de acetificación que Gluconobacter, aunque ambas especies produjeron
valores similares de acético, aproximadamente 3,5% m/v. Por otra
parte, tras la reposición de etanol, se superó el 4% m/v de acético requerido por CAA para ser comercializado como vinagre de
cerveza. En cuanto al protocolo de reposición de etanol, el método cuasi-continuo, utilizando Acetobacter y manteniendo la concentración de alcohol cercana al 3% m/v, logró los mejores rendimientos: 0,7 g de ácido acético/g etanol. Mediante los procedimientos ensayados, puede producirse vinagre de cerveza con un
rendimiento muy satisfactorio, siendo aplicable como alternativa
al tratamiento convencional de los efluentes cerveceros. Los
efluentes con altos tenores de etanol pueden considerarse como
materia prima para la obtención de otros productos con muy buen
valor de mercado.
P96 - 27750 ESTUDIO DE LA SIMBIOSIS LOTUS TENUISMESORHIZOBIUM LOTI, COMO ALTERNATIVA DE APLICACIÓN
A SUELOS CON LIMITANTES ABIÓTICAS. ECHEVARRIA,
ROMINA; GARCIA, PATRICIA; RONCHI, ANA LIA; GRASSANO,
ALICIA ESTER
La FBN en los cultivos de leguminosas resulta cada vez más
importante en vista a los esfuerzos de desarrollar una producción
agrícola más económica y sostenible. Para lograr un alto rendi-
miento de los cultivos es necesario el conocimiento y manejo de
distintas variables tales como los aspectos genéticos de las especies vegetales implantadas, la disponibilidad de nutrientes o su
introducción por técnicas eficaces y no contaminantes, la presencia de microorganismos beneficiosos de la rizósfera y la incidencia de los factores abióticos (salinidad, sequía, etc.) y bióticos
(presencia de microorganismos de alta competitividad y/o
patógenos) (Pankhurst and Lynch, 1995) Es por ello que se debe
abordar su estudio, comprendiendo la complejidad de los mismos
y jerarquizando cuales son las posibles vías de ganancia o pérdida de los nutrientes más importantes para cada uno de los cultivos. (Nannipieri y col. 2003). En este trabajo se estudia el Lotus
tenuis (glaber), por su gran tolerancia a la sal y a los suelos pobres lo que hace a esta planta muy útil para repoblar terrenos
marginales. El objetivo es analizar la simbiosis Mesorhizobium lotiLotus glaber y la acción de efectos promotores de bacterias, con
el fin de su aplicación como cultivo alternativo para regiones
agropecuarias con condiciones límites. En este contexto se buscaron suelos, donde existía L. tenuis, en praderas naturales con
distintos grados de salinidad y pH. De los mismos se aislaron
rizobios, para ello se realizaron inoculaciones de solución de los
suelos en tubos con medio Jensen y plántulas de Lotus tenuis,
aislándose nódulos. En esta etapa se estudió el comportamiento
de cuatro de esos aislamientos frente a cepas recomendadas para
la producción de inoculantes (LL32). Los aislamientos de Mesorhizobium loti estudiados corresponden a suelos de pH 7,35, 7,05
y 7,87 de marcada salinidad y levemente sódico, respectivamente. Además, se tomó en cuenta comparando los perfiles de
enzimas metabólicas para a y ß esterasas, que presentaron diferencias entre sí y respecto de la cepa patrón recomendada LL32. Para los aislamientos mencionados se determinó que a las
40 hs, presentaron valores de UDO de 8,29 (S53), 6,15 (S54) y
7,35 (S92), con tiempos de duplicación de 4 h. 16 min, 4 h. 41
min y 4 h. 36 min y velocidad específica de 0,162 h-1; 0,147 h-1 y
0,151 h-1, respectivamente. En ensayos en cámara climatizada se
evaluaron parámetros de rendimiento de los rizobios, frente a testigos sin inocular y fertilizados con nitrógeno, del análisis de los
resultados se determinan diferencias significativas entre todos los
tratamientos y el testigo sin inocular, excepto con S96 y entre los
tratamientos inoculados con S35 y S54 respecto a la cepa patrón
LL32. Además se detectó que la inoculación realizada con el aislamiento S96 produjo un efecto promotor significativo al inicio del
desarrollo de las plántulas, sin que luego se produjera nodulación.
Por esta razón se están realizando pruebas, que ya han dado
positivo para la producción de AIA. Se puede concluir, de esta
etapa, que en condiciones controladas los aislamientos de
Mesorhizobium loti muestran frente a la variedad de Lotus usada
una mejor respuesta que la cepa patrón.
P97 - 27773 ROL DE LA OXIDACIÓN PERIPLASMÁTICA DE
ALDOSAS EN LA SOLUBILIZACIÓN DE FÓSFORO POR Gluconacetobacter diazotrophicus. CRESPO, J; BOIARDI, J; LUNA, F*
CINDEFI (UNLP; CCT-La Plata, CONICET) La Plata, Argentina,
*CIC PBA
El fósforo (P) es, después del nitrógeno, el nutriente más importante para plantas y microorganismos y, a pesar de ser muy
abundante en suelos, su disponibilidad es muy limitada. La
solubilización de distintas fuentes de P inorgánico por microorganismos es una alternativa para incrementar la cantidad de P
disponible para las plantas. El principal mecanismo de solubilización de P es a través de la acción de ácidos orgánicos sintetizados por los microorganismos. El ácido glucónico, producido a
través de la ruta periplasmática de oxidación de aldosas, es el
agente más frecuentemente reportado para llevar a cabo esta
solubilización. Gluconacetobacter diazotrophicus es una bacteria
considerada de gran importancia para su uso en agricultura, no
sólo por solubilizar compuestos insolubles de P, sino también por
otras características que lo enmarcan dentro del grupo de bacterias promotoras del crecimiento vegetal. Con el objetivo final de
lograr la utilización de microorganismos como biofertilizantes en
cultivos de interés comercial, en este trabajo se evaluó la capacidad de G. diazotrophicus PAL 5 de solubilizar compuestos inso-
61
lubles de P y se determinó la incidencia de la ruta de oxidación
periplasmática de aldosas en este proceso. El cultivo batch es el
más simple para realizar estos estudios fisiológicos, no obstante,
un ambiente de crecimiento constante en el tiempo y bien definido puede lograrse empleando la técnica de cultivos continuos. En
este sistema los microorganismos crecen bajo limitación por algún nutriente, una situación usualmente encontrada en los
ecosistemas naturales. En este trabajo se llevaron a cabo cultivos batch y cultivos continuos bajo diferentes limitaciones. Se
tomaron muestras líquidas y gaseosas que fueron procesadas
para obtener parámetros como consumo de O2, producción de
CO2, consumo de sustratos, rendimiento en biomasa y en producto, y se obtuvieron los siguientes resultados: -En cultivos batch
con glucosa, independientemente de la fuente de Nitrógeno empleada, los niveles de P solubilizado a lo largo del cultivo se
correlacionaron directamente con la producción de ácido glucónico. G. diazotrophicus fue capaz de crecer y solubilizar fosfatos
de calcio insolubles empleados como única fuente de P, sólo
cuando se utilizaron azúcares que fueran sustratos de la glucosa
deshidrogenasa periplasmática. -En cultivos continuos, independientemente de la limitación, la condición de Fijación Biológica de
Nitrógeno (FBN) fue aquella donde el microorganismo fue más
eficiente para producir biomasa, no obstante, en la condición de
limitación por P bajo FBN se registró mayor producción extracelular de ácido glucónico. -La producción de ácidos mediada por
la glucosa deshidrogenasa periplasmática fue indispensable para
llevar a cabo la solubilización de compuestos insolubles de P.
-La condición de crecimiento que más se asemeja a la encontrada en el ambiente natural, en este caso la rizosfera, fue aquella
donde se reguló el flujo de carbono hacia una mayor producción
de ácido al espacio extracelular capaz de producir una mayor
solubilización de compuestos insolubles de P.
P98 - 27779 SECRECIÓN DE UNA PIOCINA TIPO FAGO POR LA
CEPA RIZOSFÉRICA Pseudomonas sp. SF4C. FISCHER, SONIA;
GODINO, AGUSTINA; CORDERO, PAULA; PRINCIPE, ANALIA;
JOFRE, EDGARDO; MORI, GLADYS
Introducción: Las bacteriocinas son compuestos con un espectro de acción estrecho. Las bacterias productoras de estos metabolitos tienen una ventaja competitiva, y pueden colonizar nuevos nichos. Las bacteriocinas de P. aeruginosa, denominadas
piocinas, son clasificadas en R, F y S, en base a su estructura.
Las piocinas S son solubles y R y F son colas de fagos que se
han especializado como bacteriocinas. Los genes del sistema lítico
hol y lys y el represor prtR han sido encontrados en todas las
piocinas R y F; mientras que los genes que codifican para proteínas responsables del ensamble de la cola del fago son diferentes en cada cepa. La producción de piocina es inducida por agentes que causan daños al ADN, tales como la mitomicina C
(Nakayama y col., 2000). El genoma de algunas P. fluorescens
PGPR (promotoras del crecimiento vegetal) contiene profagos,
similares a las piocinas F o R de P. aeruginosa (Mavrodi y col.,
2009). Sin embargo, estas piocinas no han sido caracterizadas
genéticamente en estas Pseudomonas. Pseudomonas sp. SF4c
es una PGPR nativa aislada de trigo. Previamente, se obtuvo un
mutante de la cepa SF4c deficiente en la producción de
bacteriocina (ptm::Tn5-B20). El gen ptm codifica para una proteína que determina el largo de la cola del fago (piocina). Objetivo:
caracterizar genéticamente la bacteriocina producida por
Pseudomonas sp. SF4c. Materiales y métodos: Complementación
del mutante ptm::Tn5-B20: El gen ptm de la cepa Pf0-1 fue amplificado con primers específicos. El producto de PCR fue purificado, digerido y ligado en pFAJ1709. Posteriormente, se transformaron competentes de E. coli DH5á. El plásmido recombinante
(pFAJptm) fue transferido al mutante por electroporación. Amplificación de genes del sistema lítico y de regulación: a partir de
regiones conservadas de los genes hol, lys y prtR de Pseudomonas productoras de piocinas R y F, se diseñaron primers para
la amplificación de dichos genes en la cepa SF4c. El producto de
PCR fue secuenciado. Purificación de la piocina: La bacteriocina
de la cepa SF4c fue purificada del sobrenadante de cultivos in-
62
ducidos con mitomicina C y sin inducir. La actividad fue analizada en ambas condiciones. Resultados: Se amplificó del genoma
de la cepa SF4c los genes del sistema lítico y de regulación del
cluster de piocina. La secuencia de nucleótidos obtenida mostró
un alto porcentaje de identidad con los genes hol, lys y prtR de
Pseudomonas productoras de piocinas tipo fago. La producción
de bacteriocinas no se restableció en el mutante ptm::Tn5-B20 que
lleva el plásmido recombinante pFAJptm. Esto posiblemente se
debe a efectos polares de la inserción del Tn5-B20 sobre otros
genes del cluster. La actividad de la piocina secretada por la cepa
SF4c fue mayor en los cultivos con mitomicina C, lo que demuestra que la misma es inducida por agentes que causan daños en
el ADN. A partir de los resultados obtenidos podemos concluir que
el genoma de Pseudomonas SF4c contiene los genes líticos y de
represión encontrados en todos los cluster de piocinas tipo fago.
La caracterización a nivel molecular de una bacteriocina producida por una Pseudomonas PGPR permitirá dilucidar el rol de estos metabolitos en la competitividad de la cepa.
P99 - 27792 OPTIMIZACIÓN SIMULTÁNEA DE LA PRODUCCIÓN
DE PROTEASA Y BIOMASA DE Pseudomonas spp. MEDIANTE
LA METODOLOGÍA DE SUPERFICIE DE RESPUESTA. AGüERO,
MARíA VICTORIA; KOTLAR, CATALINA; ROURA, SARA
Introducción: La optimización del medio de cultivo y condiciones de operación es una etapa crítica en el diseño de procesos
de fermentación. Esto requiere evaluar primero cuáles son los
factores que impactan significativamente sobre la variable de interés y, luego, determinar el nivel óptimo para cada uno de ellos.
La técnica de superficie de respuesta (RSM) es una herramienta
ampliamente utilizada para realizar estos estudios. En un trabajo
previo a través de un diseño estadístico de Plackett-Burman se
encontró que para la cepa Pseudomonas sp. los factores que afectan el crecimiento microbiano (CREC) y la producción de proteasa
(ACT) son diferentes: Temperatura (T), agitación (agit) y concentración de sal (NaCl) para la producción de proteasa; y T, concentración de glucosa (glu) y pH para el crecimiento microbiano.
Objetivos: (1) Optimizar la producción de proteasa; (2) Optimizar
el crecimiento microbiano; (3) Evaluar el comportamiento de la
cepa en una fermentación bifásica (condiciones óptimas para
CREC y luego óptimas para ACT). Materiales y Métodos: La cepa
Pseudomonas sp. fue aislada de repollo e identificada en CERELA
(CONICET, Tucumán, Argentina). Las optimizaciones de ACT y
de CREC se realizaron mediante la metodología RSM con diseño de Box-Benkhen. Se realizaron 15 corridas experimentales en
las que cada uno de los factores se combinaron en diferentes
niveles (alto, medio, bajo) dado por el diseño. Para cada corrida
se midió ACT en unidades proteasa (PU) y CREC en OD a 600nm.
A partir de los resultados para cada corrida, se ajustaron modelos polinomiales de 2do orden. Para el experimento bifásico, las
células fueron incubadas primero en el medio óptimo para CREC
y luego de 10 horas, se transfirieron a un medio óptimo para ACT.
El estudio se realizó por triplicado. Se utilizó el software SAS para
el análisis de los resultados. Resultados: Para ambas variables
(CREC y ACT), se encontró una superficie acampanada con un
máximo en función de los factores particulares para cada una. El
ajuste de ambos modelos fue muy bueno, con valores de R2 de
0.94 y 0.97, respectivamente. El óptimo de CREC se encontró en
T=25.29 °C, pH=7.45 y glu=3.35 g/L, con valores de CREC y ACT
de 1.637OD y 0.1023PU, respectivamente. Por otra parte, la superficie para optimizar ACT presentó su máximo en T=20.07 °C,
agit=47.61rpm y (NaCl)=2.07% w/v, con valores asociados de
CREC y ACT de 0.8139OD y 0.1869PU, respectivamente. Finalmente, la fermentación bifásica no arrojó buenos resultados encontrándose menor ACT al final de la fermentación comparada con
la fermentación en condiciones óptimas para ACT. Conclusiones:
En este trabajo se aplicó RSM para optimizar diferentes variables
relativas a una cepa de Pseudomonas. La optimización ACT arrojó
los mejores resultados ya que permitió la obtención de una máxima producción enzimática asociada a una baja producción de
biomasa, dando valores relativos de ACT/CREM altos lo que resulta muy interesante desde un punto de vista industrial.
P100 - 27797 CARACTERIZACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LIPASA
PRODUCIDA POR UNA NUEVA CEPA MUTANTE DE Yarrowia
lipolytica A PARTIR DE SUBPRODUCTOS DE LA INDUSTRIA
DEL BIODIESEL. BIANCHI, JORGELINA(1); CERRUTTI,
PATRICIA(1); GALVAGNO, MIGUEL(1,2)
1) Lab. de Microbiología Industrial, Facultad de Ingeniería, UBA;
2) IIB-CONICET
La elaboración de biodiesel produce cantidades importantes
de glicerol (GLI) que pueden aprovecharse para el desarrollo de
cepas con múltiples aplicaciones industriales, tal como la levadura GRAS Yarrowia lipolytica. Objetivo: Caracterizar la actividad de
lipasa extracelular (LIP) obtenida en medios conteniendo GLI y
ácidos grasos provenientes de la producción de biodiesel usando una mutante de Y. lipolytica, para mejorar la aptitud comercial
del proceso. Materiales y métodos: La cepa mutante Y. lipolytica
BAFC 3852 se obtuvo por mutagénesis de Y. lipolytica NRRL 1095
con N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina. La concentración de
biomasa de levadura se determinó como masa seca (MS, g/L), y
la viabilidad por recuento en placa agar Sabouraud + 0.3% de
extracto de levadura. La LIP (U/mL) se determinó por titulación
de los ácidos grasos liberados y el contenido de ácidos grasos
por cromatografía gaseosa. Resultados: La mutante duplicó la
producción de LIP de la cepa parental. En estudios previos se
determinó la necesidad de inducir la producción de LIP de la cepa
por agregado de compuestos tales como el aceite de oliva (AO),
cuando se usaba GLI como fuente de C. En el presente trabajo,
se estudió el reemplazo del AO por ácidos grasos separados durante el pretratamiento del GLI. La producción de LIP por unidad
de MS con el agregado de 2,4% p/v de ácidos grasos, fue el 61%
de la obtenida con el agregado de AO, pero se obtuvo paralelamente un 10% más de biomasa. Se estudió además la resistencia al congelado de la cepa de Y. lipolytica cultivada en un medio con 2% p/v de GLI en lugar de glucosa, encontrándose 93%
de supervivencia al cabo de 2 ciclos de congelado a-20 °C. La
cepa mutante produjo el 30% más de ácidos grasos totales por
unidad de MS que la cepa parental. Los perfiles de ácidos grasos
fueron también distintos ya que, por ej., la cepa mutante cultivada en un medio conteniendo glicerol como fuente de C no produjo ácido palmitoelaidico (16: 1, 9-trans), a diferencia de la parental.
Se evaluó además la estabilidad de la LIP obtenida en presencia
de solventes de distintas polaridades (n-hexano y etanol). La actividad de LIP aumentó 1.8 veces después del tratamiento con nhexano con respecto de los controles en ausencia de solventes,
mientras que disminuyó marcadamente después del tratamiento
con etanol. La cepa mutante fue capaz de crecer 1 ciclo logarítmico en presencia de n-hexano. La producción de biomasa de
esta nueva cepa mutante de Y. lipolytica utilizando un subproducto
industrial, permitió, además de su conversión en productos de
mayor valor agregado, obtener células con mayor contenido de
ácidos grasos, más aptas para la producción de “aceites unicelulares”. Los ácidos grasos provenientes del biodiesel podrían
usarse como inductores para la producción de LIP y también como
materia prima para la obtención de biomasa de Y. lipolytica, en
beneficio de la economía del proceso. La levadura cultivada en
GLI mostró muy buena tolerancia al congelado, y la enzima obtenida fue resistente frente a un solvente no polar como n-hexano,
lo que la haría además adecuada para su utilización en otros
medios no acuosos.
P101 - 27803 SELECCIÓN DE LAS VARIABLES FISICOQUÍMICAS Y OPERATIVAS CON SIGNIFICANCIA EN LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS PROTEOLÍTICAS Y BIOMASA MICROBIANA
DE Pseudomonas sp. AGÜERO, MARíA VICTORIA; KOTLAR,
CATALINA; ROURA, SARA
Introducción: El uso potencial de proteasas microbianas a escala industrial requiere de la selección de los nutrientes adecuados y las variables operativas para mejorar tanto la producción
de enzimas como la biomasa microbiana. Tradicionalmente esta
optimización requería el ensayo de un factor a la vez; hoy la aplicación de diseños estadísticos permite la investigación conjunta
de más de cinco factores. El diseño de Plackett-Burman (PB) es
utilizado como paso previo a la optimización y permite estudiar la
significancia estadística de los factores (variables) con efecto en
la productividad enzimática. Sin embargo un paso crítico es la
selección de los límites máximos y mínimos para cada factor
involucrado a la hora de aplicar este diseño y esto se requiere
cada vez que una nueva cepa microbiana sea caracterizada.
Objetivos: (1) Caracterizar la cinética de crecimiento y producción
enzimática de Pseudomonas sp. conjuntamente con su especificidad de sustrato, morfología y efectos antimicrobianos; (2) determinar de forma rápida los límites inferiores y superiores de los
factores con impacto en la producción de enzimas y biomasa; y
(3) aplicar el diseño de PB para seleccionar los factores que afectan significativamente la producción enzimática y crecimiento
microbiano. Materiales y Métodos: La bacteria Pseudomonas sp.
fue aislada de repollo fresco por Pérez Borla y col. e identificada
en CERELA (CONICET, Tucumán, Argentina; 2008). En el prescreening se utilizaron placas con medio mínimo basal donde se
modificó la variable a ensayar, cubriendo un amplio rango y se
evaluó la habilidad del microorganismo para liberar proteasas
extracelulares. Se trabajó con el SN libre de microorganismos
como fuente enzimática y la actividad se determinó espectrofotométricamente (Folin-Ciocalteau, a 660 nm) con caseína como
sustrato. Ocho factores (temperatura, velocidad de agitación, pH,
glucosa, peptona, NaCl, Ca2+ y Mg2+) fueron analizados a través
del diseño de PB para evaluar la importancia relativa de cada uno
en la producción enzimática y de biomasa microbiana. Los datos
fueron estadísticamente analizados usando el procedimiento REG
del software SAS version 8.0 (SAS Inst. Inc., Cary, N.C., U.S.A.
1999). Resultados: A partir de la combinación (prescreening-PB)
se encontró que la temperatura, velocidad de agitación, NaCl y
pH son factores determinantes de la expresión de la actividad
proteolítica de Pseudomonas sp., mientras que la temperatura,
glucosa, pH, peptona y velocidad de agitación son necesarios para
el crecimiento del microorganismo. El pre-screening permitió la
determinación rápida y sencilla de los límites máximo y mínimo
de los factores analizados. Conclusiones: La identificación realizada de los factores con mayor impacto en la producción de enzima y la biomasa microbiana es un paso necesario y previo a la
optimización de los componentes del medio y las condiciones
operativas.
P102 - 27823 CAPACIDAD SOLUBILIZADORA DE FOSFATO DE
AISLAMIENTOS NATIVOS ASOCIADOS A PLANTAS DE MANI.
ANZUAY, MARíA SOLEDAD; TAURIAN, TANIA; FABRA, ADRIANA
Introducción: En la región manisera de la provincia de Córdoba, que concentra el 92% de la producción nacional, se han determinado bajos niveles de fósforo asimilable para las plantas.
Este nutriente, después del nitrógeno, es el elemento más requerido por plantas y microorganismos. Sin embargo, menos del 5%
del fósforo contenido en el suelo es asimilable por la planta. La
baja disponibilidad de este elemento es atribuida a que el fósforo
soluble reacciona con iones de calcio, hierro o aluminio que provocan su precipitación. Uno de los mecanismos directos mediante el cual las bacterias promueven el crecimiento vegetal es la
solubilización de fosfatos insolubles. El principal mecanismo microbiológico por el cual los compuestos fosforados inorgánicos son
movilizados involucra la liberación de ácidos orgánicos de bajo
peso molecular. Objetivo: Evaluar la capacidad solubilizadora de
fosfato de bacterias nativas del área manisera de Córdoba mediante un análisis cuantitativo. Materiales y métodos: Se estudió
un grupo de 18 bacterias aisladas de plantas de maní de Córdoba que fueron seleccionadas a partir de una colección de 433
bacterias por producir los mayores halos de solubilización de
fosfato en medio sólido suplementado con fósforo insoluble (Frioni,
1999; Nautiyal, 1999). Se incluyó una cepa comercial de Pseudomonas fluorescens solubilizadora de fosfato empleada como
inoculante para trigo y maíz en Argentina. Se determinó cuantitativamente el fosfato solubilizado mediante la técnica de Fiske y
63
Subbarow (1925) modificada. Las bacterias fueron crecidas en
medio NBRIP-BPB con y sin el agregado de soluciones tampón
y en el sobrenadante se midió el fósforo soluble a las 24, 48 y 72
horas y 7 días de crecimiento. Paralelamente, se midió el pH del
sobrenadante y se determinó el número de células viables (UFC/
mL) (Somasegaran y Hoben, 1994). Las soluciones tampones
empleadas fueron: Tris-HCl y MES, ambas en una concentración
de 100 mM. Resultados: Se observó que la capacidad de
solubilización de fosfato fue variable en los diferentes aislamientos analizados. En medio NBRIP-BPB, sin el agregado de solución tampón, se alcanzaron valores de fósforo soluble que
variaban aproximadamente entre 190-545 µg/mL. Resultados similares fueron observados cuando se agregó buffer Tris-HCl al
medio NBRIP-BPB. Por otro lado, se observó para todos los
aislamientos, que el agregado de buffer MES disminuyó significativamente los niveles de fósforo soluble (aproximadamente 70%)
siendo los valores alcanzados entre 41-68 µg/mL. En todos los
casos, el pH del sobrenadante descendió hasta valores aproximados a 3 en medio NBRIP-BPB y NBRIP-BPB con Tris-HCl. En
cambio, cuando fue agregado el buffer MES al medio de cultivo,
los valores se mantuvieron cercanos a pH 6. Conclusión: Si bien
la cantidad de fosfato solubilizado en medio NBRIP fue variable
entre los aislamientos, todos ellos produjeron un descenso del pH
del medio, lo que indicaría la producción de ácidos como posible
mecanismo de mineralización de fosfato insoluble. El agregado
de buffer Tris-HCl no modificó dicha capacidad; mientras que el
buffer MES la afectó significativamente. Es posible sugerir que
existiría una correlación entre la disminución en el pH del medio
de cultivo y la cantidad de fósforo solubilizado.
P103 - 27837 EFECTO DEL FÓSFORO EN EL MECANISMO DE
SOLUBILIZACIÓN DE FOSFATO DEL AISLAMIENTO M91
(Pantoea eucalypti). CASTAGNO, LUIS N(1); ESTRELLA, MA
JULIA(1,2); SANNAZZARO, ANALIA I(1); RUIZ, OSCAR A(1)
(1) IIB-INTECH; (2) INV CIC
La capacidad de las bacterias solubilizadoras de fosfato de
liberar fosfato soluble a partir del fosfato insoluble presente en el
suelo, es de vital importancia para el desarrollo de nuevas tecnologías de fertilización, especialmente en suelos áridos y semiáridos. Existe una relación mutualista entre estas bacterias y
las plantas; las primeras proporcionan fosfato soluble y las plantas aportan compuestos carbonados que promueven el crecimiento bacteriano. El mecanismo de solubilización de fosfato mineral
está asociado a la liberación de ácidos orgánicos de bajo peso
molecular. Los ácidos glucónico (GA) y 2-cetoglucónico (2KGA)
parecen ser los principales responsables de dicha solubilización.
GA es generado por la vía directa de oxidación de la glucosa,
mediada por la enzima glucosa deshidrogenasa (GDH), y luego
es oxidado por la enzima gluconato deshidrogenasa (GaDH) para
dar 2KGA. Ambas enzimas se sitúan en la cara externa de la
membrana citoplasmática, por lo que los ácidos se forman en el
espacio periplásmico, dando como resultado la acidificación de
esta región y, en última instancia, del entorno del microorganismo. En el presente trabajo se utilizó el aislamiento M91 por ser
una de las cepas que mostró mayor actividad solubilizadora in vitro
e in vivo y también por haber sido identificada (por amplificación
del ARNr 16s) como Pantoea eucalypti, una especie novedosa en
términos de bacterias promotoras del crecimiento vegetal. Objetivo: Estudiar el efecto del fosfato soluble en la secreción de ácido glucónico y en la actividad de las enzimas involucradas en su
metabolismo en un aislamiento con alta capacidad solubilizadora
de fosfato. Metodología: Se cultivó la cepa M91 en medio NBRIP
con distintos niveles de fosfato soluble (0-50 mM K2HPO4). Se
tomaron muestras a distintos tiempos y se evaluaron los siguientes parámetros: pH, fosfato solubilizado, ácido glucónico y actividad enzimática de GDH y GaDH. Resultados: La liberación de GA
mediada por M91, a las 24 y 72 h postinoculación (p.i.), fue significativamente superior cuando la cepa fue cultivada bajo condiciones deficientes de fósforo (0 mM de K2HPO4), comparado con el
valor obtenido a 50 mM. Esto se correlaciona con los niveles de
actividad GDH y GaDH de dichos tratamientos. Bajo deficiencia
de fósforo, el nivel de GA liberado alcanza su máxima concentra-
64
ción a las 24 h p.i y decrece a las 48 y 72 h Sin embargo, la actividad GDH se mantiene constante a lo largo del experimento.
Por otro lado, la actividad GaDH presenta el mismo patrón que
la liberación de GA y ambos tienen una correlación negativa con
la concentración de fosfato solubilizado en el medio. Cuando el
medio fue suplementado con K2HPO4 (10 a 50 mM), la actividad
de las enzimas GDH y GaDH se mantuvo a nivel basal a lo largo
del tiempo. El aislamiento M91 es capaz de solubilizar fosfato
mediante la liberación de GA y su posterior conversión en 2KGA,
lo cual se ve inducido en deficiencia de fósforo. Esta inducción
se revierte una vez alcanzado un nivel adecuado de fosfato soluble en el medio.
P104 - 27839 INFLUENCIA DEL GEN ntrc EN LA SIMBIOSIS
Bradyrhizobium japonicum-SOJA. LOPEZ, M F; ALTHABEGOITI,
M J; COVELLI, J M; PEREZ GIMENEZ, J; QUELAS, J I; LODEIRO,
A R; LOPEZ GARCIA, S L
Instituto de Biotecnologia y Biologia Molecular (Facultad de Ciencias Exactas – Universidad Nacional de La Plata)
Introducción: Bradyrhizobium japonicum fija N2 en simbiosis
con plantas de soja sólo en ambientes con escaso N asimilable
para la planta, por lo que debería estar adaptada a sobrevivir bajo
escasez de esta fuente. Cuando se cultiva a B. japonicum en esta
condición, hemos observado un marcado efecto estimulatorio de
la simbiosis. Un elemento clave en la regulación del metabolismo de N de diversas bacterias Gram-negativas es el sistema de
dos componentes NtrBC. Este sistema se activa en condiciones
de limitación de N, permitiendo la expresión de genes necesarios
para la asimilación del mismo como los de la glutamino sintetasa
(glnA y glnII) o los genes nif, entre otros. En algunas especies
fijadoras de N en vida libre se ha reportado que la mutación del
gen ntrC afecta la fijación de N2. En el caso de los rizobios, estudios en Sinorhizobium meliloti han demostrado que ntrC no afectaría la fijación de N 2. NtrBC ha sido poco estudiado en B.
japonicum, y aún se desconoce su posible influencia en la simbiosis con soja. Objetivos: Obtención de un mutante en el gen ntrC
en B. japonicum y evaluación de su influencia sobre la fijación de
N2 en la simbiosis con soja. Materiales y Métodos: La obtención
del mutante se realizó por mutagénesis insercional sitio específica. El fragmento amplificado se clonó en un vector suicida en
rizobios, y luego se realizó una conjugación biparental con la cepa
USDA 110. Se determinó la cinética de crecimiento (DO 500nm
y UFC/mL) de esta cepa y de la salvaje, utilizando el medio de
Götz, con y sin el agregado de la fuente de N. Los ensayos con
plantas de soja se realizaron utilizando como inóculos ambas
cepas cultivadas en medio Götz con y sin su fuente de N. Luego
de 60 días se evaluó la cantidad de nódulos, el peso seco de los
mismos y el peso seco de la parte aérea. Resultados: El análisis
de las cinéticas de crecimiento muestra que cuando el N es suficiente, si bien ambas cepas alcanzan el mismo número de UFC/
mL a la entrada de la fase estacionaria, la cepa mutante exhibe
una abrupta caída en más de un orden de magnitud hasta alcanzar un valor estable. Sin embargo, no se observan diferencias
cuando ambas cepas son cultivadas bajo limitación de N. Respecto a los ensayos en plantas, se observó un mayor número de
nódulos en las plantas inoculadas con la cepa mutante limitada
en N, aunque el peso seco por nódulo para estas plantas fue
menor que para la salvaje. Sin embargo, no hubo diferencias significativas en el peso seco de la parte aérea para todas las plantas inoculadas. Ninguno de estos parámetros mostró diferencias
para las plantas inoculadas con ambas cepas cultivadas en suficiencia de N. La mutación en ntrC estudiada en este trabajo sugiere un posible efecto de este gen en el crecimiento de este
rizobio, que resulta más marcado en condiciones de suficiencia
de N. Por otra parte, podríamos inferir que esta mutación no tiene influencia en el rendimiento (peso seco) de las plantas en simbiosis. Sin embargo, la cepa mutante muestra una disminución de
la fijación de N2 por nódulo cuando es cultivada con limitación de
este nutriente, lo que pondría en evidencia la posible participación de ntrC en este proceso.
P105 - 27845 EFECTO DE LA INOCULACIÓN CON Achromobacter xylosoxidans Y Bacillus pumilus SOBRE GIRASOL EN
LA LOCALIDAD DE MANFREDI. TORRES , J (1); CASTILLO , P
(1); ALVAREZ , D (2); MASCIARELLI , O (1); ALEMANO , S (1);
ABDALA , G (1)
(1) Universidad Nacional de Rio Cuarto; (2) INTA EEA MANFREDI
En Argentina, el girasol (Helianthus annus L) es la segunda
oleaginosa de importancia económica, el mismo ha sido desplazado por la soja a zonas marginales principalmente con características semiáridas, ello implica que la planta no solo esté expuesta
a estrés hídrico cuando es adulta sino también en el establecimiento de la misma. Nuestro grupo de trabajo aisló de raíces de
plantas de girasol cultivadas a campo con irrigación y sequía, las
bacterias Bacillus pumilus (Bp: cepa SF4) y Achromobacter
xylosoxidans (Ax: cepa SF2). Ambas cepas presentaron capacidad de promover el crecimiento de las plantas en condiciones de
estrés hídrico in vitro, además presentaron actividad ACCdeaminasa y produjeron fitohormonas como ácido indol-3-acético, ácido salicílico, jasmónico y abscísico (Forchetti y col., 20072010), lo cual podría contribuir a la defensa frente a patógenos y
a la promoción del crecimiento del girasol en condiciones de
estrés. A partir de ello se planteó como objetivo evaluar el efecto
de las dos cepas a campo. Los ensayos de inoculación se realizaron durante 2 ciclos agrícolas consecutivos, en el campo de la
Estación Experimental del INTA Manfredi, utilizándose un
germoplasma comercial de girasol (Paraíso 24). La inoculación se
realizó con el agregado de 1 mL de cultivo bacteriano (108 -109
UFC/mL) disueltos en 0,16 mL de adherente cada 100 gramos de
semillas de girasol. Los tratamientos realizados fueron: T, Testigo, Nit, plantas sin inocular y con 280 Kg de urea x ha-1; Ax, plantas inoculadas con cepa SF2; Bp, plantas inoculadas con cepa
SF4; AZO, plantas inoculadas con cepa comercial de Azospirillum;
Nit+Azo, plantas inoculadas con Azospirillum y urea; Nit+Ax, plantas inoculadas con cepa SF2 y urea; Nit+Bp, plantas inoculadas
con cepa SF4 y urea. Los resultados obtenidos muestran que las
plantas inoculadas con las 2 cepas bacterianas nativas del girasol, si bien no presentaron diferencia significativa con respecto al
control, presentaron una mejora en el rendimiento de granos de
alrededor de 300Kg.ha-1 en las plantas inoculadas, lo que implica un incremento del rendimiento de granos por hectárea de alrededor del 15% al 17% para las plantas inoculadas con las bacterias Ax y Bp respectivamente. En cuanto al rendimiento de
materia grasa, aunque no hubo diferencia estadísticamente significativa entre los tratamientos, las plantas inoculadas con la cepa
SF4 fueron las que mejor resultado presentaron, siendo este
parámetro similar para aquellas plantas inoculadas con la cepa
SF2 y Azospirillum. Los ensayos aquí descriptos evidencian una
favorable respuesta del cultivo frente a la inoculación con las bacterias nativas para su aprobación como prueba experimental.
Podemos decir que la influencia de las inoculaciones con estas
estirpes bacterianas sobre el rendimiento del cultivo supera a los
de los cultivos fertilizados químicamente y en algunos casos a los
inoculados con bacterias no nativas. Estos nuevos productos podrían mejorar la eficiencia del cultivo en condiciones agroecológicas marginales desde un punto de vista agrícola y presentar además la ventaja de ser amigables con el medio ambiente.
P106 - 27851 INTERACCIONES PRE-SIMBIÓTICAS Y SIMBIÓTICAS ENTRE GLOMUS INTRARADICES Y DOS ESPECIES DE
Paenibacillus ASOCIADAS A MICELIO INTRARRADICAL Y ESPORAS. FERNANDEZ, LAURA; SILVANI, VANESA; COLOMBO,
ROXANA; MARIANA, PERGOLA; BOMPADRE, JOSEFINA;
GODEAS, ALICIA
Laboratorio de Microbiología del Suelo, DBBE-FCEN-UBA
Introducción: Las comunidades microbianas en la rizósfera
subordinadas a las especies vegetales y reguladas por la composición de los exudados radicales, se modifican luego de la co-
lonización con hongos MA (HMA). Sus estructuras crean un hábitat
adicional con características propias para los microorganismos del
suelo, diferente al de las raíces no micorrizadas, ejerciendo su
propia influencia sobre las comunidades microbianas. Las bacterias asociadas, de manera casual o permanente, a los HMA en
la micorrizósfera, podrían representar un tercer componente en
la simbiosis, promoviéndola de algún modo. Estas bacterias se
denominan: mycorrhization helper bacteria. Objetivo: Evaluar el
efecto de cepas productoras de indoles de Paenibacillus asociadas a HMA sobre el desarrollo pre-simbiótico y simbiótico de
Glomus intraradices en cultivo con raíces transformadas de soja
(RTS). Examinar si estas interacciones ocurren también en la riz
ósfera de soja bajo condiciones de invernadero. Materiales y
Métodos: Se emplearon TGX5E de P. rhizosphaerae (GenBank
GU830879) obtenida del ambiente endófito de raíces de tomate
colonizadas por G.intraradices, y TG1R2 de P. favisporus
(GenBank GU937424) recuperada a partir de esporocarpos de
G.mosseae. Identificadas mediante análisis del 16SrRNA y comparadas con secuencias existentes. En ambas se cuantificó el AIA
producido en los sobrenadantes del cultivo. El desarrollo presimbiótico y simbiótico en respuesta a la presencia directa de las
células bacterianas y sus sustancias difusibles se cuantificó como:
%de esporas germinadas, recrecimiento de micelio intrarradical,
longitud de micelio extrarradical y %de RTS colonizada. En el
ensayo en invernadero se cuantificaron además los efectos de las
inoculaciones microbianas sobre la biomasa seca de soja y cantidad de suelo rizosférico adherido. Resultados: Las bacterias afectaron a G.intraradices dependiendo de su estado de desarrollo y
de las condiciones del ensayo. La germinación no fue afectada
por la inoculación, más allá de la producción de AIA. Pero ambas causaron una clara promoción del crecimiento pre-simbiótico
del micelio. La inoculación con TGX5E, que produjo menos cantidad de AIA que TG1R2, no mostró nunca un efecto deletéreo
sobre el desarrollo de G.intraradices, incrementándolo significativamente durante la fase simbiótica, y en el ensayo in vivo.
Aunque tuvo un efecto promotor sobre la infectividad, este incremento no se correlacionó con un aumento en la producción de
biomasa seca de soja. El efecto de TG1R2 sobre G. intraradices
en pre-simbiosis fue claramente deletéreo, pero no suprimió los
parámetros simbióticos In Vitro, y mostró un efecto promotor de
la colonización y producción de biomasa en las plantas de soja
en invernadero La interacción G. intraradices Paenibacillus no
estaría directamente relacionada con la producción bacteriana de
AIA. La complejidad de las interacciones HMA-bacterias asociadas incluye efectos benéficos y detrimentales. La compatibilidad
en diversas condiciones y los posibles efectos sobre el crecimiento
de los vegetales debe ser profundamente investigado, estas
interacciones sinérgicas son de gran importancia para una agricultura más sustentable
P107 - 27859 EFECTO DE LA COMBINACIÓN DE ENMIENDAS
VERDES Y MICROORGANISMOS BENÉFICOS SOBRE EL RENDIMIENTO DE PAPA EN CÓRDOBA (ARGENTINA). VIVIANA,
YOSSEN(1); ROJO, RODRIGO(2); BARRERA, VIVIANA(2);
CHIESSA, GUIDO(2); ZUMELZU, GUILLERMO(1); COZZI, JORGE(2); KOBAYASHI, KIROKU(2); GASONI, LAURA(2)
(1) Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de
Córdoba; (2) Instituto de Microbiología y Zoología Agrícola, INTA.
Introducción: El cultivo de papa (Solanum tuberosum L.) es
tradicional en la provincia de Córdoba (Argentina). Si bien los fertilizantes químicos son de uso habitual, las tendencias actuales
conducen a la utilización de alternativas naturales para evitar efectos adversos sobre la salud humana y el medio ambiente. El
empleo de enmiendas verdes y de microorganismos benéficos son
dos alternativas ampliamente investigadas. Sin embargo, no existen antecedentes sobre su aplicación combinada para aumentar
el rendimiento del cultivo de papa. Objetivo: Determinar el efecto
de la combinación de enmiendas verdes y microorganismos benéficos sobre el rendimiento de papa en ensayos de campo. Materiales y Métodos: Se realizaron dos ensayos en años consecutivos, 2002 y 2003, en un campo de producción comercial de Villa Retiro (Córdoba). El diseño experimental seleccionado consistió
65
en bloques completos aleatorizados, con 5 tratamientos y 4 repeticiones. Cada tratamiento se llevó a cabo en una parcela de
4,5 m de largo y 1,60 m de ancho. Cada parcela tenía dos hileras con entresurco de 0,8 m. Se utilizó avena silvestre (Avena
strigosa cv Hayoats) como cultivo previo y fue incorporada al suelo
tres meses después con labranza. Se dejó descansar un mes y
medio antes de la siembra de papa. Se aplicaron dos microorganismos benéficos: Bacillus pumilus (B-235) y Trichoderma
harzianum (Th-1) (colección IMyZA, INTA). Se desarrollaron en
caldo líquido BASE M y BASE S respectivamente. La siembra de
papa se realizó en septiembre. En cada hilera se sembraron quince tubérculos del cultivar Spunta, distanciados cada 0,3 m. Las
hileras fueron regadas con los microorganismos inmediatamente
después de la siembra y fueron cubiertas con suelo. La cosecha
se realizó en diciembre. Los tratamientos fueron: T1) Suelo y tubérculos sin tratamientos; T2) Avena silvestre (AS); T3) AS + TH1; T4) AS + B-235; T5) AS + TH-1 + B-235. Se evaluó el rendimiento de papa (expresado en kg/ha), números de tubérculos por
planta y peso promedio de tubérculos (g). Los dos ensayos se
consideraron réplicas y se evaluaron en conjunto, utilizando el
procedimiento GLM (SAS). Las medias aritméticas fueron comparadas con el test de Tukey (P = 0.05). Resultados: El rendimiento de papa aumentó con el uso de avena silvestre (T2) respecto
a T1 (31.396 versus 18.368 kg/ha) mientras que los tratamientos
con microorganismos no se diferenciaron de T2. El número de
tubérculos por planta aumentó cuando se aplicó B-235 (T4), respecto a T1 y T2 (6,99 versus 4,37 y 4,97). El peso promedio por
tubérculo aumentó cuando se aplicó T2 (152,34 g) y aumentó
menos con T3, T5 y T4 (139,59; 128,31 y 123,80 g) respecto a
T1 (100,77 g). La incorporación al suelo de AS aumentó el peso
de cada tubérculo, elevando el rendimiento, mientras que la incorporación de B-235 aumentó el número de tubérculos por planta.
La combinación de ambas tácticas podría ser una estrategia alternativa natural para elevar el rendimiento del cultivo.
P108 - 27886 ENSAYOS DE COINOCULACIÓN DE UNA CEPA
SOLUBILIZADORA DE FOSFATO Y Bradyrhizobium sp. SEMIA
6144 EN PLANTAS DE Arachis hypogaea L. EN CONDICIONES
DE MICROCOSMO. TAURIAN, TANIA; FABRA, ADRIANA
Universidad Nacional de Rio Cuarto, Córdoba
En la región manisera de Córdoba se han determinado bajos
niveles de fósforo asimilable para las plantas. A ello se suma que,
en la interacción maní-rizobios, al igual que en las demás simbiosis con leguminosas, el fósforo es el principal factor nutricional
que limita la fijación biológica del nitrógeno. Un gran interés reviste en la actualidad la investigación sobre microorganismos que
ejercen efectos benéficos sobre el crecimiento de las plantas.
Estos estudios apuntan a la formulación de productos biológicos
que permitan mejorar el rendimiento de los cultivos. Un aspecto
interesante es que en las prácticas de inoculación, la mezcla de
dos o más especies microbianas ha demostrado producir mejores beneficios en el crecimiento de las plantas que el uso de una
sola bacteria. El objetivo del presente estudio fue: Analizar el efecto benéfico de la coinoculación de una bacteria nativa solubilizadora de fosfato con una cepa recomendada como inoculante
para maní en ensayos de microcosmo. Se realizaron ensayos de
inoculación con el aislamiento nativo Pantoea sp. J49 solubilizador
de fosfato así como de coinoculación con la cepa Bradyrhizobium
sp. SEMIA 6144 recomendada como inoculante para maní. Se
utilizó como soporte suelo estéril deficiente en fósforo asimilable.
Para dicho ensayo se incluyó como control una cepa comercial
de Pseudomonas fluorescens recomendada como fertilizante
fosforado para maíz y trigo. Las coinoculaciones fueron realizadas en una proporción 1:1 de cada bacteria en fase estacionaria
de crecimiento. Los controles fueron: plántulas de maní sin inocular, fertilizadas con P, fertilizadas con N o inoculadas con
Bradyrhizobium sp SEMIA 6144. Las plantas fueron mantenidas
en condiciones controladas y cosechadas en los estadios
reproductivos R1 y R4. Para determinar el efecto benéfico de la
inoculación se analizaron peso seco aéreo y radical de las plantas, longitud aérea, número y peso seco de nódulos y número de
cajas en el estadio R4. A partir de los ensayos de microcosmo
66
se determinó que la inoculación de Pantoea J49 resultó en un
incremento en el peso seco aéreo y radical de las plantas en los
dos estadios analizados. Por otro lado, la coinoculación de este
aislamiento y la cepa simbiótica SEMIA 6144 sólo incrementó el
peso seco aéreo de las plantas en el estadio R1. Si bien no se
observó un aumento en el número de nódulos en plantas coinoculadas, se determinó un incremento en el peso seco de los mismos en los dos estadíos analizados. Además, el número de cajas de las plantas fue mayor tanto en aquellas inoculadas sólo con
J49 como en las coinoculadas, aunque su peso seco aéreo no
mostró diferencias con el de plantas inoculadas sólo con SEMIA
6144. Las plantas de maní inoculadas con la cepa de P.
fluorescens tanto en inoculo mixto como individual no mostraron
variaciones en los parámetros analizados respecto a las plantas
inoculadas con SEMIA e incluso con el control negativo. La
coinoculación de plantas de maní con una bacteria solubilizadora
de fosfato y una bacteria simbiótica fijadora de nitrógeno
incrementó algunos parámetros de crecimiento en dicho cultivo.
P109 - 27887 PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO TEMPRANO E
INCREMENTOS EN EL RINDE COMBINANDO Azospirillum
brasilense CON OTRAS BACTERIAS SOBRE EL CULTIVO DE
TRIGO A CAMPO. PICCINETTI, CARLOS; GARCIA, JULIA E;
PUENTE, MARIANA L; RUBIO, ESTEBAN; VALLEJO, DANIELA;
PERTICARI, ALEJANDRO
Instituto de Microbiología y Zoología Agrícola, INTA
Los efectos benéficos de la inoculación con Azospirillum sobre los cultivos pueden ser mejorados por medio de la
coinoculación con otros microorganismos, ya que le provee a las
plantas una nutrición más balanceada y una mejora en la absorción de nitrógeno, fósforo y otros nutrientes minerales. El presente
trabajo tuvo como objetivo evaluar el efecto de diferentes
microorganismos promotores en combinación con Azospirillum
brasilense sobre la productividad de trigo a campo. Los
microorganismos utilizados fueron: Az39 (Azospirillum brasilense),
AT19 (Azotobacter sp.), A25 (Rhizobium leguminosarum bv.
trifolii), Z1 (Azorhizobium caulinodans) y NRRL4317 (Paenibacillus
polymyxa), depositadas en la colección del Laboratorio BPCV,
IMYZA, INTA Castelar. Para la preparación de los inoculantes se
utilizaron los medios líquidos de Sadasivan & Neyra para Az39;
Burks para AT19; YEM para A25 y Z1, y BM para P. polymyxa
NRRL4317. Los inoculantes de A25 y Z1se elaboraron en base a
turba estéril empleando un volumen de caldo necesario para obtener una humedad final del 40%. La concentración de los
inoculantes se ajustó a 1x109 excepto el de P. polymyxa que se
ajustó 1x107 UFC/mL. Con los cultivos axénicos de cada uno de
los microorganismos se inocularon las semillas de trigo previo a
la siembra. El ensayo se realizó en el campo experimental del
INTA Castelar durante la campaña 2008/09. La variedad utilizada fue Baguette Premium 11. Los parámetros de productividad
que se midieron fueron: biomasa aérea verde y seca a fin de
macollaje y biomasa aérea seca total y rendimiento en grano a
cosecha. Los tratamientos fueron: 1- Testigo, 2- Az39, 3Az39+A25, 4- Az39 +Z1, 5- Az39 + AT19, 6- Az39 + NRRL4317.
En la inoculación simple la dosis fue de 10 mL/kg de semilla y
para los tratamientos coinoculados 5 mL/kg de semilla de cada
inoculante, el tratamiento testigo recibió 10mL de agua por kg de
semilla. El diseño del ensayo fue en bloques completos al azar
con 5 repeticiones. Los resultados se analizaron por medio de un
ANOVA y las medias se compararon por el test de Duncan
(p=0.05). En todos los parámetros evaluados la combinación de
A. brasilense Az39 con P. polymyxa NRRL4317 produjo incrementos significativos con respecto al testigo. En rendimiento el incremento fue del 20%. Comparado con la inoculación simple de A.
brasilense Az39, la coinoculación con P. polymyxa incrementó
significativamente la biomasa verde en 22%, la biomasa seca a
fin de macollaje en 19% y el rendimiento en 16%. Con la combinación de A. brasilense Az39 con Azotobacter AT19 también se
incrementó el rendimiento significativamente respecto al testigo
(13%), sin embargo este tratamiento no difirió respecto a la inoculación simple. La inoculación simple presentó un incremento en
rendimiento con respeto al testigo del 3.11%, sin embargo, éste
no fue significativo. Según nuestros resultados las combinaciones
de Azospirillum con Paenibacillus y Azotobacter produjeron efectos sinérgicos sobre el cultivo de trigo. Futuros ensayos deberían
tener en cuenta el estudio de las dosis óptimas para las combinaciones con el resto de los microorganismos evaluados.
P110 - 27888 EFECTO DE Azospirillum brasilense CD EN LA
MICROPROPAGACIÓN DE FRUTILLA. LARRABURU, EZEQUIEL;
SCHIAFFINO, GABRIELA; EGEA, CLARISA; LLORENTE, BERTA
Universidad de Luján
Introducción: La frutilla (Fragaria x ananassa Duch) es propagada por estolones, división de coronas o micropropagación. La
propagación in vitro es recomendada para conservar germoplasma
y producir plantas durante todo el año. Además, el uso de meristemas como explantos permite obtener plantas libres de virus.
Aromas es el cultivar más productivo de día neutro, se adapta a
zonas costeras y es tolerante a cambios climáticos; produce frutos de gran firmeza, color rojo intenso uniforme y buen sabor. El
cultivar de gran aceptación en el mercado internacional es el
Albion que produce frutos de buen sabor y gran tamaño.
Azospirillum brasilense, rizobacteria que promueve el crecimiento y desarrollo de determinadas plantas, ha sido aislada de algunos cultivares de frutilla. Se ha descrito en otras especies que la
inoculación con esta bacteria reduce las alteraciones inducidas por
las condiciones de cultivo in vitro. Objetivos: El objetivo de este
trabajo es estudiar el efecto de A. brasilense Cd en la rizogénesis
de dos cultivares de frutilla micropropagada. Métodos: Brotes terminales de los cultivares Aromas y Albion fueron desinfectados
con hipoclorito de sodio comercial 10% y enjuagados tres veces
con agua estéril. Se aislaron meristemas (0,3-0,5mm) bajo microscopio estereoscópico (5X) en condiciones de esterilidad y se cultivaron en el medio Murashige-Skoog (MS) suplementado con 3%
sacarosa, 0,7% agar, 4,44µM bencilamino purina, 0,49µM ácido
indolbutírico y 0,58µM ácido giberélico. Los brotes producidos se
multiplicaron en el mismo medio con repiques cada 4 semanas.
El enraizamiento se realizó en MS con sales a mitad de concentración libre de fitohormonas inoculando con A. brasilense Cd (107
UFC). Los controles fueron plantas sin inocular. Se evaluaron
pesos fresco y seco de parte aérea y de raíces, número de hojas
y raíces, absorción y longitud radicular a las 3 semanas de cultivo. Los datos fueron analizados mediante ANOVA y comparación
múltiple de medias utilizando el programa SPSS. Resultados:
Cultivar Aromas: Se logró el desarrollo aséptico del 75% de las
yemas con una tasa de multiplicación mensual de 4,6. El 74,5%
de las microestacas inoculadas enraizaron a los 7 días de cultivo
superando a los controles en el mismo período de tiempo (37,8%)
y durante todo el ensayo. Además, la inoculación con A. brasilense
Cd produjo incrementos significativos en el peso fresco (32%) y
seco (16%) de parte aérea, número de hojas (12%) y número de
raíces (23%) respecto a los controles. Cultivar Albion: Se obtuvo
el establecimiento y desarrollo de 75,6% de las yemas y una tasa
de multiplicación mensual de 4,5. Si bien la inoculación con A.
brasilense Cd produjo un mayor porcentaje de plantas enraizadas
(80%) respecto a los controles (44%), no se detectaron diferencias estadísticamente significativas en los otros parámetros evaluados. En ambos cultivares de frutilla se observó que la inoculación con A. brasilense Cd produce mayor porcentaje de enraizamiento aunque solo en el cultivar Aromas produce incrementos significativos en pesos fresco y seco de parte aérea y número de hojas y de raíces.
P111 - 27900 ENRAIZAMIENTO IN VITRO DE Simmondsia
chinensis “JOJOBA” BAJO CONDICIONES DE ESTRÉS SALINO INOCULANDO CON AZOSPIRILLUN BRASILENSE. GONZALEZ, ANA JULIA; BUSUSCOVICH, ANDREA; LARRABURU,
EZEQUIEL; LLORENTE, BERTA.
Universidad Nacional de Luján
Introducción: Jojoba es un arbusto dioico cuya importancia
económica radica en la producción de cera líquida. Se propaga
por medio de semillas generando una alta variabilidad o median-
te estacas con dificultades en el enraizamiento. El cultivo in vitro
permite clonar ejemplares con características deseables y estudiar el efecto de la salinidad. Se ha comprobado que Azospirillum
brasilense promueve el enraizamiento in vitro de jojoba y sobrevive bajo condiciones de salinidad, pero no se ha encontrado bibliografía sobre la interacción entre esta bacteria y jojoba bajo
estrés salino. Objetivos: El objetivo de este trabajo es estudiar el
efecto de las cepas Cd y Az39 de A. brasilense en la rizogénesis
in vitro de jojoba bajo condiciones de estrés salino. Métodos: Se
utilizó un pool clonal de estacas cultivadas en el medio MurashigeSkoog, vitaminas de Gamborg, 3% sacarosa, 0,7% agar (MB) y
4,44 µM bencilamino purina. Para inducir la formación de raíces,
brotes de 2 cm se cultivaron en MB con sales a mitad de concentración (MR) y 49,2 µM ácido indolbutírico durante 6 días. Posteriormente, se transfirieron a MR libre de hormonas con diferentes concentraciones de NaCl (0; 80 y 160mM). Luego del
transplante se inoculó la base de los brotes con 107 UFC de A.
brasilense Cd o Az39. Los controles fueron plantas sin inocular.
Durante 45 días de cultivo se evaluó el porcentaje de enraizamiento. Al final del ensayo se realizó el aislamiento de las bacterias y se determinaron pesos fresco y seco de parte aérea y de
raíces, presencia de callo basal, absorción y longitud radicular.
Los datos fueron analizados mediante ANOVA y comparación
múltiple de medias utilizando el programa SPSS. Resultados: Las
microestacas inoculadas con las cepas Cd y Az39 de A.brasilense
en ausencia de NaCl incrementaron significativamente el porcentaje de plantas enraizadas a partir del día 20 para Az39 (45%) y
del día 25 para Cd (55%) respecto de los controles que enraizaron
31%. En todos los tratamientos inoculados en ausencia de NaCl
se redujo significativamente el porcentaje de brotes con presencia de callo basal. Esta diferencia se mantuvo también en los brotes inoculados con la cepa Cd en el medio con 80 mM de NaCl,
el resto de los tratamientos tuvieron porcentajes similares de brotes con callo. Por otra parte, la inoculación con A. brasilense no
incrementó significativamente los otros parámetros evaluados respecto a los controles en ninguno de los tratamientos con NaCl.
De los tratamientos inoculados se aislaron ambas cepas bacterianas indicando su sobrevida en las concentraciones de NaCl
utilizadas. La inoculación con A.brasilense Cd y Az39 estimula la
rizogénesis in vitro de jojoba y reduce la formación de callo basal
en ausencia de sal. No se observaron diferencias significativas en
la los parámetros de desarrollo evaluados en medios de enraizamiento con 80 o 160mM NaCl. Estos resultados podrían ser
consecuencia de la dispersión de datos generada por la variabilidad inherente al pool clonal o que las altas concentraciones de
NaCl modifiquen la interacción A.brasilense-jojoba.
P112 - 27953 CARACTERIZACIÓN DEL COMPORTAMIENTO
SIMBIÓTICO Y FISIÓLOGICO DE AISLAMIENTOS DE RIZOBIOS
QUE NODULAN Vigna unguiculata “COWPEA”, RECUPERADOS DE SUELOS DEL NOROESTE ARGENTINO (NOA).
VIDEIRA, L; SALVUCCI, D; PASTORINO, G; DIOSMA, G;
BALAGUE, L; MARTINEZ ALCANTARA, V; BALATTI, P
Cátedra de Microbiología Agrícola- Facultad de Ciencias Agrarias
y Forestales-Universidad Nacional de La Plata
El “cowpea” Vigna unguiculata (Phaseolae), es una especie
que se adapta a diferentes condiciones edafoclimáticas, tiene un
alto valor nutricional (20-28% de proteínas), siendo una planta
promiscua, se asocia estableciendo una simbiosis con bacterias
del género Rhizobium y Bradyrhizobium. Esta leguminosa nodula
con aproximadamente 42 especies que se conocen como rizobios
“cowpea”. Los suelos prístinos en los que crecen leguminosas
nativas que se encuentran en distintos ambientes del Noroeste
Argentino (NOA), son potenciales refugios de estos rhizobios. Por
ello a partir de muestras de suelos provenientes del NOA se aislaron rizobios utilizando a Vigna unguiculata como planta trampa, los que se caracterizaron fisiológicamente. Estos resultados
se analizaron en un análisis multivariado con el coeficiente de
similitud DICE y la técnica UPGMA, observándose que la mayoría de los aislamientos se asociaron en un cluster con un valor
de similitud de 0.7. El objetivo de este trabajo fue confirmar la
identidad de estos aislamientos y evaluar la capacidad simbiótica
67
de los mismos. Con este fin se cultivaron plantas de cowpea en
condiciones controladas bajo un diseño experimental completamente aleatorizado (DCA). Al cabo de 30 días se determinó el
peso seco del tejido aéreo (PSA), de los nódulos (PSN) y la actividad nitrogenasa por el método de reducción de acetileno. El
análisis estadístico consistió en un ANOVA, contrastándose las
medias por medio del test de Tukey al 5%. Los análisis de la
varianza mostraron que el PSN y el PSA de las plantas fueron
afectados significativamente por el aislamiento inoculado (F= 7.92,
p<0.01; F= 17.70, p<0.01 respectivamente). Se diferenciaron 3
grupos con una capacidad de nodulación, alta, media y baja. Se
observó una correlación significativa entre el PSA y PSN (r= 0.49,
p<0.01). Mientras que la mayoría de los aislamientos mostraron
una capacidad media de reducción de acetileno, esta fue alta en
sólo dos aislamientos. Las pruebas fisiológicas permitieron diferenciar a los rizobios del grupo cowpea y agrupar separadamente a estos de los aislamientos que nodulan soja. Por otro lado el
potencial de fijación de nitrógeno de estas estirpes fue bajo, mostrando solo dos con alta capacidad de fijación. Los resultados
sugieren que muchos de estos rizobios si bien nodulan cowpea
son bacterias simbióticas de otras leguminosas, entre las que
prevalecen probablemente especies nativas.
P113 - 27956 CARACTERIZACIÓN DE UN AISLAMIENTO REALIZADO EN UN SUELO CON CULTIVO DE ALGODÓN A PARTIR DE COLONIAS MORFOTÍPICAS DE Azotobacter sp.
COSSOLI, MARCELA R.; IGLESIAS, MARIA C
Facultad de Ciencias Agrarias –Universidad Nacional del Nordeste
La actividad algodonera es una de las más significativas del
Nordeste Argentino. Históricamente ha sido el principal cultivo en
la región NEA. En el 2008 se realizó un ensayo de biofertilización
en algodón utilizando macetas con suelo proveniente de la localidad de Las Breñas-Chaco (pH: 5,74; P: 36.25 ppm; Ca: 9.7 meq/
100 g), uno de los inóculos utilizados fue aislado a partir del mismo suelo, considerando las características morfotípicas de
Azotobacter sp., es decir que, las colonias eran marrones oscuras
cuya población pertenecían a bacterias Gram (-) y el morfotipo
celular correspondía a cocos. El inoculante generado contaba con
una población de 0,9.101 microorganismos por mL. A partir de lo
expuesto se plantea como objetivo del presente trabajo, continuar
los análisis, incorporando técnicas moleculares, que posibiliten
confirmar que los microorganismos que se utilizaron eran fijadores
de nitrógeno. Para ello, en este trabajo se utilizaron 4 muestras de
suelo pertenecientes a las macetas del ensayo antes descripto. Se
realizó el cultivo de microorganismos fijadores libres de nitrógeno
aplicando 2 técnicas: 1) Placa de suelo moldeado y 2) Siembra de
suelo en medio líquido, utilizando en ambas la solución salina standard de Winogradsky, como medio de cultivo, y como fuente carbonada, glucosa y manitol. Una vez que se produjo el crecimiento
en las placas y tubos se procedió al repique de los mismos a tubos con medio de cultivo. En relación a las técnicas moleculares
utilizadas, se realizó la extracción del DNA de los suelos y de los
cultivos logrados. Estos fueron amplificados mediante dos análisis
de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), la primera utilizando primers universales para bacterias (DNA de suelo) y, la segunda, utilizando primer específicos para genes nif-H (DNA de
suelos y cultivos). Luego, los productos obtenidos en ambas PCR
fueron separados mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%
y teñidos con bromuro de etidio. Estos análisis fueron realizados
en el Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular (INGEBI-CONICET). Cuando se realizaron los cultivos de microorganismos fijadores de nitrógeno, estos dieron positivos para todas las muestras, en ambas técnicas utilizadas. También fue positiva la amplificación del DNA de suelo con primers
universales. Cuando se utilizaron primers específicos para genes
nif-H, las amplificaciones del DNA de suelo y de los repiques de
las placas de suelo fueron positivas, no así las amplificaciones del
DNA extraído de los cultivos en medios líquidos. De esta forma se
concluye en que los microorganismos que se lograron aislar mediante cultivo en placas de suelo, cuyas colonias tenían el morfotipo
característico de Azotobacter, corresponderían a fijadores libres de
nitrógeno.
68
P114 - 27959 DIVERSIDAD DE LOS RIZOBIOS QUE NODULAN
LA SOJA EN LOS SUELOS DE LA PAMPA HÚMEDA E IDENTIFICACIÓN DE CEPAS PARA LA FABRICACIÓN DE
INOCULANTES COMERCIALES. PASTORINO, G(1); LOPEZ, S
M Y(2); BALATTI, P(1, 2, 3)
(1) Cátedra de Microbiología Agrícola, Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, Universidad Nacional de La Plata; (2) Comisión de Investigaciones Científicas de la Provincia de Buenos Aires; (3) Centro de investigaciones en Fitopatología, Facultad de
Ciencias Agrarias y Forestales, Universidad Nacional de La Plata
Las poblaciones bacterianas exóticas en suelo son dinámicas
y permanentemente se producen modificaciones a nivel genético
que resultan en la aparición de poblaciones con características
alteradas o con propiedades diferentes de la estirpe de origen.
Esto es particularmente frecuente cuando se inoculan bacterias
en ambientes exóticos como es el caso de la inoculación de las
leguminosas, en donde la cepa inoculada muta con celeridad
adquiriendo con frecuencia capacidades de sobrevivencia en el
suelo pero perdiendo eficiencia en la fijación de nitrógeno. El
objetivo del presente trabajo es evaluar el efecto de las labranzas sobre las poblaciones de los rizobios del suelo como resultado de los distintos ambientes que se generan. En este contexto
el objetivo es identificar aislamientos de cepas con aptitudes
simbióticas superiores a las cepas parenterales que se utilizan en
los inoculantes comerciales. A partir de muestras de suelo de la
llanura pampeana provenientes de un lote bajo labranza convencional y antecesor maíz y otro con siembra directa y antecesor
soja, se realizó una serie de diluciones con el fin de determinar
el número de rizobios por el número más probable y aislar rizobios
con capacidades simbióticas superiores a las estirpes parenterales. Los aislamientos se caracterizaron mediante pruebas fisiológicas como la producción de ácido Indol acético (AIA) y la
producción de exopolisacáridos. Por otro lado se evaluó la supervivencia de rizobios sobre semillas y la eficiencia de fijación de
nitrógeno en condiciones controladas. La caracterización molecular de los aislamientos se basó en reacciones de PCR con
primers específicos y BOX. La caracterización molecular con la
reacción de multiplex PCR confirmó que los aislamientos pertenecen al género Bradyrhizobium. Más aún, los patrones de amplificación obtenidos con el primer BOX agruparon a los aislamientos en dos clusters, unos con patrones similares a las cepas de
B. japonicum (E109, SEMIA5079 y SEMIA5080) y otros con las
de B. elkanii (SEMIA587 y SEMIA5019), lo que sugiere que los
suelos contienen cepas de ambas especies. Las estirpes de B.
elkanii produjeron, tal cual, era de esperar mayor cantidad de AIA
que las estirpes de Bradyrhizobium que no producen esta hormona o lo hacen en baja cantidad. Además, las estirpes difieren en
su capacidad de fijación de nitrógeno. Todos estos resultados
confirman que las cepas naturalizadas en los suelos analizados
derivan de inoculantes comerciales formulados en base a B.
japonicum y B elkanii y que algunos de esos mutantes naturales
tienen capacidades simbióticas que superan a las cepas
parenterales.
P115 - 27966 DETERMINACION DE PECTINASAS EN VINIFICACIONES LLEVADAS A CABO POR UNA CEPA Saccharomyces cerevisiae DE INTERES ENOLOGICO. RODRIGUEZ
ASSAF, LETICIA ANAHI(1 , 2); MATURANO, PAOLA(1); TORO,
MARIA EUGENIA(1); C DE FIGUEROA, LUCIA INES(3, 4);
VAZQUEZ, FABIO(1)
(1) IBT-FI-Universidad Nacional de San Juan - San Juan. (2) Departamento de Biología-FCEFyN – Universidad Nacional de San
Juan- San Juan. (3) PROIMI-CONICET- Tucumán. (4) FBQyFUniversidad Nacional de Tucumán - Tucumán.
Introducción: la fermentación del jugo de uva que resulta en
vino es un complejo proceso microbiológico, en el cual las levaduras juegan un rol central. La principal especie involucrada en
dicho proceso es Saccharomyces cerevisiae. El vino puede ser
considerado como un producto derivado de reacciones enzi-
máticas que ocurren mientras el mosto es fermentado. Varias
actividades enzimáticas pueden mejorar el proceso de elaboración de vino y así su calidad. Las pectinasas cumplen importantes funciones en el proceso de elaboración del vino. Incrementan
la extracción de sustancias que contribuyen al color y al aroma,
mejoran la clarificación y facilitan la filtración del vino. Objetivos:
a) comparar perfiles analíticos correspondientes a fermentaciones
de 2 años consecutivos llevadas a cabo con la cepa Saccharomyces cerevisiae BSc562; b) determinar la actividad pectinolítica
en dichas fermentaciones. Materiales y Métodos: se llevaron a
cabo microvinificaciones con mosto de uva sin prensar perteneciente al varietal “Pedro Gimenez” (3 lts en envases de 5 lts de
capacidad). El inóculo inicial fué de tres millones de células por
mililitro. Se determinaron los siguientes valores finales (g/l): azúcares reductores y totales, acidez total y volátil, glicerol, densidad,
etanol (% v 20°C) y viscosidad (Pa s). Durante el transcurso de
las fermentaciones 2008 y 2009 se extrajeron muestras y se cuantificó la actividad pectinolítica. Los datos fueron analizados
estadísticamente mediante el test de ANOVA de medidas repetidas - Programa SPSS (versión 17.0). Resultados: las concentraciones iniciales de azúcares fueron de 30° y 23°Bx respectivamente. Se encontraron diferencias significativas en todos los valores
finales de los perfiles analíticos cuando se compararon ambas
fermentaciones. Los registros obtenidos en la actividad pectinolítica fueron fluctuantes a lo largo de las vinificaciones. Este comportamiento en los niveles enzimáticos pueden deberse a las características propias del medio fermentante (no homogéneo) el
cual puede influir en la posibilidad de acceso de las enzimas a
sus sustratos específicos. La actividad pectinolítica determinada
en la fermentación 2009 fue significativamente superior en los 2
primeros días. La fermentación del 2008 produjo la mayor actividad entre el tercer y sexto día. En ambas vinificaciones, a partir
del día 9 dicha actividad comenzó a disminuir y se mantuvo con
valores bajos hasta el final del proceso. Conclusiones: se detectaron los valores máximos de actividad pectinolítica en la primera etapa de las fermentaciones, donde las concentraciones de
azúcares son más elevadas, lo cual difiere con antecedentes en
el tema. Los resultados obtenidos sugieren que la cepa Saccharomyces cerevisiae BSc562 puede realizar un aporte positivo en
cuanto a la degradación de polímeros presentes en el mosto,
posibilitando su empleo como cultivo starter.
P116 - 27973 EFECTO DEL ESTRÉS ABIÓTICO SOBRE LA
INTERACCIÓN MANÍ-RIZOBIO: PAPEL DEL METABOLISMO DE
TREHALOSA. DARDANELLI, MARTA SUSANA; BUENO, MIGUEL
ANGEL; FUMERO, MARIA VERONICA; MEDEOT, DANIELA BEATRIZ; PAULUCCI, NATALIA SOLEDAD; WOELKE, MARIELA
ROSANA; VICARIO, JULIO CESAR; GARCIA, MIRTA BEATRIZ
Universidad Nacional de Rio Cuarto
En la agricultura, la fijación simbiótica del nitrógeno es relevante en leguminosas que establecen asociaciones con bacterias
que reciben el nombre de rizobios. Esa interacción es crucial para
evitar problemas derivados del uso de fertilizantes de origen industrial y permitir el desarrollo de sistemas agrícolas sustentables
respetuosos del medio ambiente así como cubrir las futuras necesidades de alimentación. El cultivo de maní localizado en Córdoba, concentra el 96% de la producción nacional con un alto
impacto socio-económico. A fin de lograr mayor sustentabilidad,
es necesario acrecentar los conocimientos científico-tecnológicos
existentes para lograr que el maní desarrolle en nuevas áreas de
siembra que muestran condiciones adversas. Para ello este estudio tiene como objetivo estudiar el papel que tiene el metabolismo de trehalosa, en plantas de maní noduladas por diferentes
rizobios simbiontes en situaciones de estrés salino e hídrico. Los
rizobios recomendados para inoculantes comerciales, TAL1000
(NifTAL, USA) y SEMIA6144 (MIRCEN/FEPAGRO, Brasil), fueron
crecidos en medio YEM a 28 °C (Dardanelli et al 1997), en diferentes condiciones experimentales: tratamiento control, tratamientos salino (100 mM NaCl) e hídrico (20 mM PEG6000). Las semillas de Arachis hypogaea (maní) cultivar PEPE cedidas por el
INTA Manfredi (Córdoba) fueron tratadas según Dardanelli et al
(2009). Los ensayos de nodulación se realizaron inoculando con
una suspensión de 108 rizobios viables/mL, crecidos en diferentes condiciones experimentales. Los sistemas de nodulación fueron colocados en cámara de plantas por un mes y regados con
solución de Yensen libre de nitrógeno (tratamiento control), con
100 mM NaCl o 20 mM PEG6000 (tratamiento salino e hídrico).
Se determinó la cinética de nodulación, parámetros de crecimiento
de las plantas y de los nódulos y contenido de carbohidratos por
cromatografía gaseosa (Streeter y Strimbu 1998). En diferentes
extractos vegetales se determinó la actividad trehalasa (Müller et
al 1994), trehalosa-6 fostato sintasa (Salminen y Streeter 1986)
y trehalosa-5 fostato fostasa (Bartlett 1958). Ambos rizobios fueron capaces de nodular plantas controles y tratadas con 20 mM
de PEG6000 pero solamente SEMIA6144 fue capaz de nodular
en estrés salino. El estudio de cinética de nodulación no mostró
diferencia en el día de aparición de los nódulos pero si una reducción el número de los mismos cuando el ensayo se realizó en
estrés salino. El peso seco de los diferentes órganos vegetales
fue menor cuando el estrés aplicado fue el salino, no siendo la
diferencia significativa en estrés hídrico. Todos los tejidos vegetales mostraron sacarosa, maltosa, glucosa y fructosa pero la
trehalosa solo fue detectada en nódulos, siendo mayor su contenido en los obtenidos de plantas con sal. En las tres condiciones
experimentales se determinaron actividades de síntesis de
trehalosa con una mayor actividad de trehalasa en nódulos controles. En conclusión la trehalosa puede tener un papel importante
en la tolerancia de plantas de maní noduladas en estrés salino,
siendo menor su acción cuando el estrés es hídrico.
P117 - 27975 IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE HONGOS DSE AISLADOS A PARTIR DE PLANTAS DE TRIGO.
ROTHEN, CAROLINA; CISNEROS, GABRIELA; LO, TAI EN;
FERNANDEZ, LAURA; MARTINEZ, ALICIA; RODRIGUEZ, ALEJANDRA
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires.
Los hongos DSE (Dark Septate Endophytes) son un grupo
heterogéneo de endofitos que habitan las raíces de una gran variedad de plantas, colonizándolas a través de hifas intercelulares
y estructuras intracelulares melanizadas. Poco se conoce acerca
de la biología de estos hongos y del papel que desempeñan en
el ecosistema, contándose, en la mayoría de los casos con trabajos realizados en el hemisferio norte. Por otra parte, no siempre pueden identificarse por medio de caracteres morfológicos,
debido a la ausencia de estructuras reproductivas en muchas de
las cepas. Las asociaciones de los hongos DSE con la planta
hospedante, tal como ocurre con las micorrizas arbusculares,
pueden ser incluídas en un amplio rango que abarca desde el
mutualismo al parasitismo. El objetivo de este trabajo es identificar y caracterizar morfológica y fisiológicamente cepas autóctonas
de hongos DSE obtenidas a partir de plantas de trigo de la provincia de Buenos Aires y evaluar sus efectos en el hospedante.
Para ello, se determinó la dinámica de crecimiento de 8 cepas de
hongos DSE en dos temperaturas (4° y 25°C) y tres medios de
cultivos (Agar malta, AM; Agar papa glucosado, APG; Agar harina de maíz, CMA) a lo largo de 20 días. Además, en cada caso,
se realizaron observaciones al microscopio óptico con el fin de
realizar la identificación a través de caracteres morfológicos y/o
determinar la formación de estructuras particulares. Para la caracterización fisiológica, se determinó la producción de enzimas
hidrolíticas mediante ensayos cualitativos en medio sólido y la
producción de indoles en medio líquido. Las cepas evaluadas pudieron agruparse como rápidas o lentas según la velocidad de
crecimiento, pero presentaron una gran diversidad tanto morfológica como fisiológica entre ellas. Sólo una presentó actividad
celulolítica, mientras que otra fue la única con actividad proteolítica. La mitad de ellas produjeron lipasas y la mayoría amilasas.
En ningún caso se detectaron actividades pectinasas, xilanasas
y quitinasas. En el testeo de la producción de indoles, 5 de las
cepas mostraron resultados positivos. Cuatro cepas pudieron ser
identificadas mediante caracteres morfológicos como Aureobasidium pullulans, Dreschlera dyctioydes, Dreschlera coycis y
69
Periconia macrospinosa. Con el fin de determinar los efectos sobre plantas de trigo, dos de las cepas, A. pullulans y la cepa 15,
aún no identificada, fueron inoculadas en este hospedante. Los
resultados mostraron que en ningún caso las cepas ocasionaron
efectos promotores significativos, evaluados como peso seco y
longitud de vástagos, sin embargo, tampoco fueron observados
efectos inhibitorios. Por otra parte, 30 días después de la inoculación, los porcentajes de colonización fueron superiores al 30%
para A. pullulans y al 40% para la cepa 15, alcanzando el 60% y
70%, respectivamente, 75 días después de la inoculación. Se está
realizando la evaluación del efecto en plantas de trigo de las cepas restantes, así como la identificación, a través de técnicas
moleculares de aquellas que no mostraron formación de estructuras reproductivas.
P118 - 28034 PRODUCCIÓN DE DIACETILO, ACETOÍNA Y 2,3BUTILENGLICOL DURANTE EL CRECIMIENTO DE Oenococcus
oeni DE VINOS EN PRESENCIA DE ÁCIDOS ORGÁNICOS, JUGO
DE UVA Y/O DIÓXIDO DE AZUFRE. MATURANO, CARMEN;
SAGUIR, FABIANA
Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia. Universidad Nacional de Tucumán.
En vinificación, Oenococcus oeni cumple un papel beneficioso conduciendo la fermentación maloláctica, la cual produce la
desacidificación del vino dando un producto más agradable. Además ocurren otros cambios beneficiosos, uno de los más evidentes es el desarrollo de un carácter mantecoso debido a la formación de diacetilo, que en concentración inferior a 5-7 mg/l y combinado con otros componentes le proporciona al vino un aroma a
nueces y tostado. En un trabajo previo seleccionamos las cepas
de O. oeni MS10, MS21 y MS49 con elevadas actividades
glucosidasas. Investigamos el comportamiento y la producción de
diacetilo, acetoína y 2,3-butilenglicol en las citadas cepas en presencia de sustratos encontrados en el medio natural y SO2 en
MRS + jugo de tomate 15%, pH 4,8 (control) y adicionado individualmente o combinado con ácidos L-málico (2g/l) y cítrico (0.7
g/l), SO2 (80 mg/l) y jugo de uva 10% en lugar de jugo de tomate. Diactetilo, acetoína y 2,3 butilenglicol se determinaron
espectrofotometricamente como valor combinado. Ácidos L-málico
y cítrico por métodos enzimáticos. En el control, las cepas MS10,
MS21 y MS49 alcanzaron una concentración celular final de
3,98x108, 6,02x107 y 1,17x107, respectivamente. En general, los
ácidos orgánicos y jugo de uva estimularon los parámetros de
crecimiento, siendo el efecto más marcado en el medio adicionado con los sustratos de manera combinada. En esta condición, la
cepa MS21 mostró el mayor efecto estimulatorio de 27% sobre
la concentración celular final con respecto al control. Dióxido de
azufre presento un efecto inhibitorio de 25,3% sobre la concentración celular final solamente en la cepa MS10. En presencia de
ácido L-málico el pH incremento alrededor de 1,5 unidades en las
primeras horas de fase exponencial. A este tiempo el ácido orgánico fue casi completamente consumido. Por el contrario, el ácido cítrico fue utilizado con una velocidad menor, consumiéndose
totalmente al final del crecimiento. La producción de diacetilo,
acetoína y 2,3-butilenglicol varió en función de la cepa, condiciones de cultivo. En el control, la cepa MS49 produjo la máxima
concentración de los compuestos aromáticos (5,58±0,15 mg/l). En
general, la adición de los sustratos al medio estimuló su producción. La cepa MS10 alcanzo un valor máximo de 4,98 ±0,21 mg/
l en presencia de citrato y/o jugo de uva. Las cepas MS49 y MS21
en presencia de ácido L-málico y SO2 produjeron las máximas
concentraciones de 6,49±0,35 y 6,87±0,32 mg/l, respectivamente, superando el límite aceptable en vino. En conclusión, las cepas ensayadas desarrollaron favorablemente en presencia de los
ácidos orgánicos y jugo de uva y en general, su crecimiento no
fue inhibido por el dióxido de azufre. La producción de los compuestos aromáticos varió en función de la cepa y condiciones de
cultivo, indicando la importancia de su caracterización como criterio para la selección de cepas de O. oeni que actúen en condiciones de vinificación.
70
P119 - 28062 INTERACCIÓN DE GENOTIPOS DE ARROZ CON
AISLAMIENTOS DE BACTERIAS MICROAEROFILICAS
FIJADORAS DE NITRÓGENO. ANZOVINI, M B; ESCOBAR ORTEGA, J; DI SALVO, L P; GARCIA DE SALAMONE, I E
Cátedra de Microbiología Agrícola y Ambiental, Facultad de Agronomía, Universidad de Buenos Aires (FAUBA)
La inoculación con bacterias microaerofílicas fijadoras de nitrógeno (N) constituye una alternativa para aumentar la productividad de los cultivos reduciendo el aporte de insumos y favoreciendo la sustentabilidad agrícola. El objetivo de este trabajo fue
estudiar las rizosferas de plantas de arroz en situación de cultivo
e incluidas en un experimento de inoculación con Azospirillum
brasilense. Utilizando muestras de raíces en dos momentos del
ciclo ontogénico del cultivo (antesis y madurez fisiológica), se realizó el recuento del número más probable (NMP) de microorganismos microaerofílicos fijadores de N sobre un medio semisólido
libre de N (NFb). Además, se evaluó la diversidad fisiológica
mediante la obtención de perfiles de utilización de fuentes carbonadas (CLPP). A partir de los tubos de NMP se obtuvieron aislamientos de bacterias microaerofilicas fijadoras de N. De un total
de 15 aislamientos obtenidos, cinco fueron estudiados en dos tipos de ensayos: de germinación y en condiciones de invernáculo. Se utilizaron tres variedades de arroz (Camba INTA, Supremo
I y Yerua) las cuales fueron incluidas en ensayos con diseño
factorial con los cinco aislamientos y un control, permitiendo evaluar la interacción “cepa bacteriana x genotipo vegetal”. Se determinó el porcentaje de germinación a los 4 días y la longitud
del tallo y de la raíz, peso húmedo y seco de las plántulas luego
de 7 días desde el inicio de cada ensayo. El análisis de CLPP en
antesis y madurez fisiológica permitió observar que la fisiología
de las comunidades microbianas rizosféricas de plantas inoculadas presentó diferencias con respecto al control. La incorporación
de un microorganismo exógeno generó un impacto en la microflora
nativa en antesis. Sin embargo dichas diferencias no se observaron en madurez fisiológica, comprobándose que el impacto generado fue reversible. No se observaron efectos en el porcentaje
de germinación de las tres variedades cuando fueron inoculadas
con las cepas seleccionadas. La inoculación de semillas con las
cepas aisladas permitió observar una interacción significativa entre las cepas y los genotipos utilizados. Para todas las variables
estudiadas, los genotipos vegetales fueron significativamente diferentes. Las cepas 4 y 5 de mejor comportamiento, incrementaron, significativamente respecto al testigo sin inocular, la longitud de la raíz, del tallo de las plántulas. En estas dos variables
se observaron interacciones significativas. La cepa 3 fue la que
provocó el mayor incremento en el peso seco de las plántulas de
las tres variedades de arroz pero no se diferenció de las cepas 4
y 5. Los resultados demuestran que la práctica de inoculación con
bacterias microaerofilicas fijadoras de N en el cultivo de arroz tiene
un alto potencial en programas de agricultura sustentable.
P120 - 28091 EFECTO COMBINADO DE LA TEMPERATURA,
PH Y TIEMPO DE INCUBACION SOBRE LA PRODUCCION DE
ENDOGLUCANASAS EN EL HONGO DE PUDRICION BLANCA
Coriolus versicolor var antarcticus. GIORGIO, ERNESTO MARTIN (1); FONSECA, MARIA ISABEL(1); ZALAZAR, CINTIA (1);
CONIGLIO, ROMINA(1); ABATE, CARLOS(2); VILLALBA,
LAURA(1); ZAPATA, PEDRO(1)
(1)Laboratorio de Biotecnología Molecular. Módulo de Farmacia
y Bioquímica. Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales, Universidad Nacional de Misiones. (2)Departamento de
Ecología Microbiana, PROIMI/CONICET. San Miguel de Tucumán.
Los hongos de pudrición blanca presentan una elevada capacidad degradativa sobre los materiales lignocelulolíticos, debido
a la presencia de un espectro de enzimas que secretan al medio.
Se han descripto una amplia variedad de enzimas hidrolíticas y
oxidativas con capacidad de liberar productos monómericos de la
celulosa y hemicelulosa, así como de oxidar la lignina y otros
compuestos policíclicos. Sin embargo, no se han descripto hasta
el momento las condiciones óptimas de crecimiento para algunos
de estos hongos. Estas condiciones de cultivo, juegan un importante rol en la formación y secreción de endoglucanas (EGs),
enzimas implicadas en la hidrólisis de la celulosa. En este sentido, el objetivo de este trabajo fue investigar el efecto combinado
de distintas temperaturas, pHs y tiempos de incubación, sobre la
producción de EGs en Coriolus versicolor var antarcticus. El hongo fue cultivado a 25, 29 y 33 °C, a pH 3,5; 4,5 y 5,5 en 50 mL
de medio conteniendo 12,7 g/L extracto de malta y 0,5% extracto
soluble de maíz durante 7, 10 y 14 días. En estos días, se recolectaron los sobrenadantes para la cuantificación enzimática. La
actividad EG fue determinada por el método del ácido dinitrosalicílico mediante la liberación de azúcares reductores. Las
reacciones se realizaron con 0,1 mL de carboximetilcelulosa al 2%
preparada en buffer acetato de sodio (0,05 M) pH 4,8 y 0,1 mL
del extracto enzimático. Las mismas fueron incubadas a 50 °C por
60 min. Los análisis estadísticos se realizaron con el programa
Statgraphics Plus. Se observaron diferencias estadísticamente
significativas, con un nivel de confianza del 95% entre las distintas condiciones ensayadas. La mayor actividad enzimática se
observó al décimo día de incubación a la temperatura de 25 °C y
pH 4,5 en el medio de cultivo. De acuerdo a los resultados obtenidos, las condiciones antes mencionadas favorecen la mayor
producción de EGs en C. versicolor var antarcticus. Estos resultados preliminares son de gran importancia y sientan las bases
para continuar con el proceso de optimizar las condiciones de
producción de EGs a escalas industriales.
P121 - 28141 COINOCULACIÓN DE SOJA CON Bradyrhizobium
japonicum Y Azotobacter chroococcum. DE FALCO, P(1);
PENON, E(1); DI CIOCCO, C(1); CORREA, O(2); DIAZ ZORITA,
M(3); GALVAN, M(1); GIMENEZ, L(1); HEREDIA, J(1)
(1) Universidad Nacional de Luján; (2) Facultad de Agronomía,
Universidad de Buenos Aires; (3) CONICET
Introducción: Las bacterias como Azotobacter chroococcum
podrían elevar la fijación de nitrógeno reduciendo la pérdida de
nitrógeno de los suelos y mejorar la eficiencia de absorción de
agua y nutrientes de soja al aumentar el desarrollo radicular.
Objetivo: Evaluar el efecto de la coinoculación sobre el rendimiento, el número, peso de nódulos y la fijación de nitrógeno de soja.
Métodos: Se realizaron dos ensayos en el campo experimental
de la Universidad Nacional de Luján, en un suelo Argiudol Típico
donde se evaluó en parcelas experimentales la coinoculación de
soja con Bradyrhizobium japonicum cepa E 109 + A. chroococcum
cepas BNM272 y BNM273 frente a la inoculación de Bradyrhizobium japonicum cepa E 109. En el 1° ensayo se sembró
el cultivar Don Mario 4600 el 11-12-2008 y se cosechó el 3-042009 en R7. Se midió el número y peso de nódulos, el rendimiento
y la fijación de nitrógeno. En el segundo ensayo se implantó el
cultivar Don Mario 3700 el 13-1-2010 y se cosechó el 20-04-2010.
Las condiciones experimentales fueron semejantes al primer ensayo, siendo la principal diferencia el nivel de precipitaciones: de
siembra a cosecha en el primer ensayo llovieron 275 mm y en el
segundo: 712 mm. En el 2° ensayo no se evaluó fijación de nitrógeno. Los datos se analizaron por ANVA y las diferencias se
compararon por LSD (a = 0,05). Resultados: En los dos ensayos
el rendimiento no varió entre los tratamientos ni entre las campañas (tabla). La coinoculación con A. chroococcum + B. japonicum
aumentó el peso seco de los nódulos (2008-2009). En 2009-2010
fue mayor el peso de nódulos (g m-2) que en el ciclo anterior sin
observarse diferencias entre los tratamientos. La cantidad de N fijada evaluada en el 1° ensayo no mostró diferencias significativas.
Tabla. Rendimiento, peso seco, número de nódulos y fijación de N de soja
según el tipo de inóculo. Promedios ± desvío estándar con la misma letra en
cada columna no difieren significativamente según DSM (P<0,05).
B j: Bradyrhizobium japonicum. A c: Azotobacter chroococcum
Ciclo agrícola Inóculo
2008-2009
2008-2009
2009-2010
2009-2010
Bj
Bj+Ac
Bj
Bj+Ac
Granos
(Kg ha-¹)
2055±961a
1972±1183a
2106±640a
1889±515a
Peso nódulos N° nódulos
(g m-²)
m-²
0,82±0,52a
1,55±1,16b
4,06±2,76c
3,81±1,44c
498±359a
684±245a
522±217a
639±311a
N fijado
(Kg ha -¹)
47,06a
44,76a
no evaluado
no evaluado
La soja no presentó diferencias significativas entre tratamientos ni
en el rendimiento ni en el número de nódulos en las dos campañas. En el 1° ensayo la fijación de nitrógeno no mostró diferencias
significativas entre los tratamientos posiblemente debido a que la
principal limitante fue la falta de agua y no el nitrógeno, el peso de
nódulos en las plantas coinoculadas superó a las inoculadas. En
el ciclo agrícola 2009-2010 la lluvia caída durante el cultivo fue casi
tres veces superior y las situaciones de anegamiento temporal
sucedidas pueden haber limitado el desarrollo del cultivo.
P122 – 27120 - RIESGO BIOLÓGICO EN EL AMBIENTE DE UNA
UNIDAD DE TERAPIA INTENSIVA. FERNANDEZ, M; MANGIATERRA, M; GIUSIANO, G
Universidad Nacional del Nordeste
El incremento de las infecciones fúngicas causadas por hongos ambientales es preocupante en los hospitales de todo el
mundo. Estos hongos producen micosis invasoras con alta
morbimortalidad y la mayor gravedad se presenta en salas con
pacientes de alto riesgo, como las Unidades de Cuidados Intensivos (UCI). El monitoreo del aire en los hospitales es un elemental
mecanismo de prevención de estas infecciones. Dado el aumento detectado en las infecciones causadas por hongos ambientales en la UCI del Hospital Pediátrico “Juan Pablo II” de Corrientes, el objetivo de este estudio fue conocer y monitorear la
microbiota presente en dicha Unidad. Durante la primavera y otoño
de 2009, cada 15 días, utilizando el colector de aire Surface Air
Sampler, P.B.I. Intenational super 100 (SAS), se tomaron muestras del aire de la UCI y del área de acceso, o área contigua a la
misma, considerada como ambiente control. Simultáneamente, por
el método del hisopo, se tomaron muestras de las superficies de
mesadas y de los aparatos biomédicos de la sala (Sup). Se calculó el número de unidades formadoras de colonias por metro
cúbico de aire (UFC/m³), se identificaron los hongos a nivel de
especie. La correlación estadística de variables discretas se estudió mediante test de Student y Chi cuadrado (p<0,05). Para el
estudio de diversidad se aplicó el índice de Shannon-Wiener. El
número de UFC/m³ hallado excedió considerablemente los
parámetros establecidos internacionalmente para este tipo de
ambiente. El recuento promedio de colonias en otoño fue de 557
UFC/m³ y en primavera de 336 UFC/m³. En ambas estaciones la
frecuencia de aislamientos fue considerablemente mayor dentro
de la UCI que en el área tomada como control. El índice de diversidad fue alto en todos los casos y mostró mayor diversidad
en el aire de la UCI (2,0) que en el área control (1,2). ShannonWiener en las Sup fue de 1,5. Se aislaron 324 colonias de las que
se distinguieron 47 levaduras y se identificaron 20 géneros y 57
especies de hongos filamentosos. Los géneros de hongos
filamentosos más frecuentes en el aire y Sup fueron Cladosporium,
Penicillium y Aspergillus, seguidos por Acremonium, Fusarium,
Curvularia y Chrysonilia. Su sola presencia no representa riesgo
para el hombre, si bien, cargas elevadas de estos agentes como
las halladas en la UCI, pueden generar situaciones riesgosas. Se
hallaron especies consideradas inaceptables en ambientes cerrados, algunas potencialmente patógenas y otras productoras de
toxinas, como Aspergillus fumigatus (A. fumigatus), Stachybotrys
atra, A. flavus, A. niger complex, Acremonium strictum complex,
Fusarium oxysporum y Trichoderma harzianum. Teniendo en
cuenta que una UCI es un ambiente que debe permanecer libre
de cualquier contaminación microbiana y que los resultados obtenidos demuestran una importante contaminación ambiental, por
la alta concentración fúngica y la presencia de especies inaceptables en una ambiente interno, la estudiada es un área de riesgo para sus habitantes. Conociendo el agente, el ambiente y los
reservorios, es posible aplicar medidas de prevención y control
que contribuyan de manera directa a disminuir las tasas de infección nosocomial por hongos. La vigilancia epidemiológica en los
hospitales es de vital importancia para implementar medidas efectivas de control de infecciones.
71
P123 – 27152 - ESTUDIO COMPARATIVO DE LA SENSIBILIDAD A ONCE ANTIBIÓTICOS EN NEUMOCOCOS AISLADOS
DE PACIENTES PEDIÁTRICOS CON OTITIS MEDIA AGUDA Y
CON INFECCIONES INVASIVAS. REIJTMAN, VANESA;
HERNANDEZ, CLAUDIA; PINHEIRO, JOSE LUIS; BERNALDEZ,
PATRICIA; SOMMERFLECK, PATRICIA; LOPARDO, HORACIO
Hospital Nacional de Pediatría “Dr. Juan P.Garrahan”
Introducción: Streptococcus pneumoniae es un microorganismo prevalente tanto en infecciones invasivas (INV) como en otitis media aguda (OMA) y sinusitis aguda. El conocimiento de su
resistencia a los antibióticos permite establecer tratamientos empíricos iniciales, elegir alternativas para pacientes alérgicos y seleccionar el antibiótico indicado para cada caso. Objetivo: (1)
Comparar la sensibilidad a once antibióticos [penicilina (PEN),
cefotaxima (CTX), eritromicina (ERY), clindamicina (CLI), rifampicina (RIF), trimetoprima-sulfametoxazol (TMS), tetraciclina (TET),
cloranfenicol (CLO), vancomicina (VAN), levofloxacina (LEV) y
ofloxacina (OFL)] en neumococos aislados de pacientes pediátricos con OMA, con la observada en niños con INV. Materiales y
métodos: a lo largo de un año (mayo de 2009-abril de 2010) se
estudiaron los pacientes que consultaron por OMA al Servicio de
ORL del hospital y los que fueron atendidos por INV como pacientes ambulatorios o se internaron en este hospital. Las muestras de oído fueron obtenidas por punción timpánica. Los pacientes, sus padres o tutores acordaron la realización de los procedimientos mediante la firma de una planilla de consentimiento informado. La identificación a nivel de especie se realizó mediante
las pruebas de catalasa, hemólisis en agar sangre ovina, optoquina y solubilidad en bilis. La sensibilidad a PEN y CTX fue estudiada por Etest. Para los otros antibióticos se empleó el método de difusión con discos según recomendaciones del Clinical and
Laboratory Standards Institute (CLSI). Para PEN se utilizaron los
puntos de corte para el tratamiento por vía oral y para CTX los
recomendados para “no meningitis”. Resultados: se estudiaron 99
aislamientos provenientes de niños con OMA y 65 de niños con
INV obtenidas de materiales normalmente estériles: hemocultivos
(50), líquidos cefalorraquídeos (2), articulares (3), pleurales (6),
biopsias pulmonares (1), punciónes orbitarias (1), abscesos (1) y
punciones de tejidos blandos (1). En la tabla se muestran los
porcentajes de aislamientos con sensibilidad intermedia (I) y resistencia (R) a PEN, ERY, CLI, TMS y TET para aislamientos de
OMA y de INV. Todos los neumococos resultaron sensibles a CTX,
RIF, CLO, VAN, LEV y OFL. La CIM50 y la CIM90 para PEN y
CRO fueron idénticas (OMA: 0,016 y 0,19 µg/ml; INV: 0,023 y 0,38
respectivamente).
ATB
PEN
ERY
CLI
TMS
TET
OMA (I)
OMA (R)
INV (I)
INV (R)
32,3
0
29,2
0
1
23,2
0
20
0
6,1
0
3,1
2
20,2
3,1
29,2
0
22,2
0
7,7
Los niveles de resistencia resultaron comparables entre los
neumococos aislados de INV y de OMA. Solamente se observó
una diferencia significativa en la resistencia a TET (p = 0,01). Los
valores bajos de CIM de PEN y CTX garantizan el uso empírico
de amoxicilina para el tratamiento de OMA y el de CTX para INV.
P124 – 27162 - ANÁLISIS DE LAS PROPIEDADES ANTIMICROBIANAS DE DIFERENTES COMPUESTOS DERIVADOS DE
NARINGINA. CELIZ, GUSTAVO (1, 2,3); DAZ, MIRTA (1,2);
AUDISIO, CARINA (1, 2, 3)
(1)Universidad Nacional de Salta (UNSA), (2) INQUI, (3) CONICET
Introducción: existen muchos antecedentes sobre las propiedades biológicas de naringina y en general se ha informado que
no posee una actividad antimicrobiana relevante. La modificación
estructural en una molécula puede alterar su carácter hidrofílico:
hidrofóbico y se espera que el nuevo compuesto posea propiedades diferentes. Resulta interesante entonces determinar si
modificando la estructura de naringina se pueden obtener com-
72
puestos que posean además de sus conocidas propiedades biológicas, actividades antimicrobianas. Objetivo: estudiar el espectro antimicrobiano de flavonoides derivados de naringina y la relación entre actividad antimicrobiana y estructura química. Materiales y métodos: se siguieron 2 vías de modificación estructural.
Hidrólisis de naringina (naringenin-7-ramnoglucósido) para obtener naringenina y prunina (naringenin-7-glucósido) y transesterificación enzimática de prunina para obtener 6’-O-acil-ésteres de
prunina con cadenas lineales entre 2 y 18 átomos de carbono.
Se determinó la concentración inhibitoria mínima (CIM) de los
compuestos sobre 10 cepas bacterianas de acuerdo al método de
microdilución del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI
2003). En particular, para la cepa Listeria monocytogenes 99/287R
(clon resistente a bacteriocinas) se cuantificó el efecto antagónico de los compuestos por contacto directo mediante recuento en
placa luego de 120 min a 37 °C. Para ello se prepararon suspensiones de bacterias en solución fisiológica (0,85% p/v NaCl) a las
que se le agregaron los compuestos en una concentración de 0,25
mM. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. Resultados:
naringina, prunina y naringenina se comportaron como los controles al no presentar efecto antagónico sobre ninguna de las
cepas estudiadas. Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Salmonella enteritidis y Escherichia coli O157:H7 no fueron inhibidas por
ninguno de los compuestos. En relación a los ésteres de prunina
se observó un aumento del efecto inhibitorio a medida que se
incrementó la longitud de cadena. Para algunas cepas se observó una sensibilidad máxima para los ésteres con cadenas de longitud intermedia. Es el caso de Bacillus cereus, Bacillus subtilis
C4, Listeria monocytogenes 99/287S, 01/155 y el clon resistente
a bacteriocina, 99/287R las cuales se vieron más inhibidos por
los ésteres de C8-C12 con CIMs entre 0,100 y 0,010 mM. Frente
a Enterococcus faecium CRL1385 y Staphylococcus aureus
ATCC29213, la máxima actividad la presentó el éster de mayor
longitud (estearato de prunina, C18), con una CIM de 0,025 mM.
La cuantificación del efecto inhibitorio de los ésteres de prunina
sobre L. monocytogenes 9/287R mostró una disminución de casi
4 órdenes de magnitud con respecto al control para ésteres con
C entre 8 y 12. La naringenina y sus derivados glicosilados
(prunina y naringina) no inhibieron el crecimiento de ninguna de
las cepas por lo que la modificación estructural con azúcares
parece no tener efecto sobre la actividad antimicrobiana. Sin
embargo, la introducción de cadenas hidrofóbicas lineales sí modificó la actividad antimicrobiana. La longitud de la cadena del
éster con máxima actividad dependió de la cepa en estudio.
P125 – 27170 - ESTUDIO MICOLÓGICO Y PROSPECTIVO DE LAS
ONICODISTROFIAS EN ESQUEL, PATAGONIA ARGENTINA.
NAZAR, JAVIER (1); GEROSA, PAULA (1); DIAZ, OSVALDO (2)
(1) Laboratorio Gerosa, (2) IM Los Alerces
Introducción: la onicomicosis representa la principal causa de
onicodistrofia. Es una de las micosis superficiales con mayor dificultad de diagnóstico y tratamiento. Objetivos: determinar agentes causales, frecuencia de onicomicosis según edad, sexo y localización y evaluar los métodos de diagnóstico microbiológico.
Materiales y métodos: se utilizaron 2 métodos: 1) examen microscópico directo (EMD): se definió positivo cuando se observó cualquiera de los siguientes elementos micóticos: filamentos compatibles con dermatofitos, filamentos hialinos y levaduras. 2) cultivo, en Sabouraud y Lactrimel de Borelli: se consideró positivo
cuando se obtuvo desarrollo en forma seriada del agente causal.
Se definieron 2 criterios para el diagnóstico de onicomicosis: 1)
EMD positivo, independientemente del desarrollo en el cultivo y
2) EMD negativo y cultivo seriado positivo. Resultados: de marzo
2007 a enero 2010 se estudiaron prospectivamente 309 pacientes. La prevalencia de onicomicosis de pie fue 78% y de mano
59%. La frecuencia mayor de onicomicosis se ubicó en el rango
etáreo de 31-40 años En hombres la prevalencia de onicomicosis
de pie fue 90% y de mano 70%, mientras que en mujeres 70%
en pie y 46% en mano. Se destaca en hombres vs mujeres: mayor frecuencia de Trichophyton rubrum en uña de pie (43% vs
23%, p=0,0005), mayor positividad del EMD en uña de mano (65%
vs 23%, p=0,007) y pie (89% vs 65%, p=0,00002) y del cultivo en
onicopatías de pie (60% vs 41%, p=0,004). En mujeres vs varones, hubo mayor frecuencia de cultivos negativos en uña de pie
(46% vs 25%, p= 0,0006). Los agentes causales en uña de pie
fueron: 66% dermatofitos, 7% levaduras, 4% hongo micelial no
dermatofito (HMND) y 2% infección micótica mixta; en mano: 33%
dermatofitos y 25% levaduras. No se detectó onicomicosis de
mano por HMND ni afección mixta. Los pacientes con onicodistrofia de pie mayor vs menor al 50% de la tabla ungueal presentaron mayor positividad en los cultivos (p=0,01). No hubo diferencia en los cultivos según la cronicidad de la lesión ungueal. El
desarrollo de dermatofitos en cultivo de uña de pie fue mayor que
en mano (38% vs 16%, p=0,005). En uña de mano fue más común el aislamiento de Candida spp.vs uña de pie (25% vs 6%,
p=0,0004). Conclusión: la onicomicosis constituyó el 75% de las
onicodistrofias y fue más prevalente en varones que mujeres. En
uña de pie la forma clínica más común fue OSDL y en mano OT.
Los principales agentes fúngicos fueron: T. rubrum 93 casos,
Candida spp. 30, T. mentagrophytes 21, HMND 7 e infección mixta
5. En uña de pie, dermatofitos y HMND representaron el 86% de
las onicomicosis, mientras que en mano, Candida spp, 60%. En
onicomicosis por levaduras predominaron especies de Candida
diferentes de C. albicans. El EMD vs cultivo resultó el método más
sensible para el diagnóstico de onicomicosis de pie, mientras que
el rendimiento de ambos métodos fue similar en onicomicosis de
mano. La correlación entre EMD y cultivo fue: 62% y 57% en uña
de pie y mano. Las principales discrepancias fueron: a) observación en EMD de filamentos compatibles con dermatofitos con cultivo negativo o contaminado y b) EMD negativo y cultivo positivo
para Candida spp.. La positividad del cultivo se asoció directamente al tamaño de la lesión ungueal y no tuvo relación con la
cronicidad de la onicodistrofia.
P126 – 27173 - SARNA NORUEGA EN UNA PACIENTE AÑOSA.
MADEO, CECILIA (1); DURANTE, GABRIELA (1); IOVANNITTI,
CRISTINA (2); KOPCOW, ELENA (1); BUSTAMANTE, JUAN (1);
RONCHETTI, INES (1); FERNANDEZ BLANCO, GRACIELA (1)
(1) Hospital Tornú, (2) Centro de Micología-UBA
Introduccion: la sarna Noruega es una enfermedad parasitaria de la piel producida por un ácaro llamado Sarcoptes scabiei
var. hominis. Fue descubierta por Danielssen y Boeck en 1848
en Noruega en pacientes con lepra lepromatosa. Esta patología
aparece en pacientes inmunocomprometidos y en aquellos que
utilizan en forma crónica corticoides de alta potencia. A partir de
la década del 80 esta patología se incrementó por la asociación
con SIDA. En estos pacientes la sarna Noruega es de peor pronóstico ya que aumenta el riesgo de adquirir otras infecciones.
En relación a los síntomas se caracteriza por ausencia o disminución de prurito, erupción generalizada eritemato-escamosa
descamativa con zonas hiperqueratósicas en manos y pies y fisura de los mismos. En estas zonas hiperqueratósicas puede
haber miles de parásitos y huevos por lo que esta patología es
altamente contagiosa. De hecho a partir de un caso de sarna
Noruega surge con frecuencia un brote epidémico local en instituciones y hospitales. Caso clínico: enfermedad actual. Paciente
de sexo femenino de 88 años de edad, institucionalizada en un
hogar para ancianos, es traida a la guardia de nuestro hospital
presentando mal estado general, esnutrición y deshidratación.
Como antecedente presenta un Ca de colon con colostomía permanente en FII. Examen clínico: paciente en muy mal estado
general en flexión permanente de miembros superiores e inferiores, poliescarada. En piel presenta erupción generalizada
eritematodescamativa con zonas de hiperqueratosis en cuero
cabelludo, cara, manos y pies. Se realiza escarificación de cuero
cabelludo y pabellon auricular y se visualiza en fresco por MO un
ácaro compatible con Sarcoptes scabiei. Tratamiento: medidas
higiénicas, ivermectina 12 mg/semanales, un unguento a base de
urea para acelerar la descamación de las zonas hiperqueratósicas.
La paciente mejora clínicamente en relación a las lesiones de piel,
pero fallece a las dos semanas por su mal estado general. La
sarna Noruega ha experimentado un aumento de su incidencia
debido a la aparición de determinadas patologías que afectan el
sistema inmune como el SIDA. Esta patología no debe conside-
rarse sólo como una enfermedad oportunista sino tambien como
via de entrada de otras posibles infecciones de mayor riesgo para
el paciente. Es imprescindible el diagnóstico precoz debido a su
alta contagiosidad, especialmente al volar las escamas. Es importante instaurar tratamiento profiláctico con ivermectina (única
toma) a contactos próximos y personal sanitario.
P127 – 27181- HISTOPATOLOGÍA DE LA INFECCIÓN POR
Cryptosporidium spp. EN RATONES INMUNOSUPRIMIDOS
CON DEXAMETASONA. DEL COCO, VF (1,2); CORDOBA, A (1,3);
SIDOTI, A (1); DRUT, R (1); BASUALDO, JA (1)
(1) Facultad de Medicina, Universidad Nacional de La Plata; (2)
CONICET; (3) Comisión de Investigaciones Científicas de la provincia de Buenos Aires (CIC)
Cryptosporidium spp. es un protozoo entérico que afecta a
mamíferos. La infección se cronifica en inmunocomprometidos y
puede ser mortal. La infección intestinal por Cryptosporidium spp.
es diagnosticada habitualmente mediante estudio coproparasitológico. El estudio histopatológico permite el diagnóstico de certeza de la infección. Objetivo: evaluar mediante estudio histopatológico la infección intestinal y extraintestinal por Cryptosporidium
spp. en modelo murino. Materiales y métodos: materia fecal de
terneros fue utilizada como fuente de ooquistes de Cryptosporidium spp.. Éstos fueron concentrados por técnica de agua éter,
purificados por gradiente discontinuo de sacarosa y suspendidos
en antibiótico. Ratones Swiss machos de 1 mes de edad (n=30),
inmunosuprimidos (IS) con 200 µg/día de dexametasona (DXM)/
oral, fueron inoculados al día 8 del inicio de la experiencia con
1x106 ooquistes. Ratones inmunocompetentes e inoculados con
ooquistes fueron el grupo control. La infeccion es evaluó mediante:
1) score de salud diario; 2) estudio coproparasitológico: la materia fecal fue recolectada los días 7, 14, 21, 28 y 35 post-infección,
procesada por técnica de agua éter y coloreada por Ziehl- Neelsen
modificada, estableciéndose por muestra un promedio del número de ooquistes en 20 campos observados a 1000X; 3) estudio
anatomopatológico: 3 ratones por grupo fueron sacrificados los
días 7, 14, 21, 28 y 35 post-infección. Muestras de intestino, hígado, vías biliares, páncreas y pulmones fueron extraidas por
necropsia. Éstas fueron fijadas en formol al 10%, incluidas en
parafina, seccionadas, coloreadas con hematoxilina y eosina y
examinadas a 400X. Para evaluar infección intestinal y apoptosis
secundaria, un score fue establecido: I: una unidad criptovellositaria (UCV) comprometida; II: 2 ó 3 UCV comprometidas;
III: varias UCV comprometidas; IV: gran número de UCV comprometidas. Resultados: el análisis de materia fecal demostró que los
ratones IS e inoculados con ooquistes resultaron infectados. El
score de salud indicó gran deterioro físico de los ratones infectados. Al cuantificar el número de ooquistes en heces, se detectaron 2 picos de excreción, los días 14 y 35 post-infección. La excreción persistió durante toda la experiencia. No hubo evidencias
de infección extraintestinal. Cryptosporidium spp. predominó en
ileon; seguido de yeyuno distal y en menor proporción en duodeno, yeyuno proximal, ciego y colon. La presencia del parásito se
correlacionó con apoptosis de células epiteliales vecinas. Conclusión: el presente estudio demuestra el desarrollo de criptosporidiosis intestinal crónica en ratones inmunosuprimidos con
DXM, con marcada morbilidad y escasa mortalidad. El intestino
se vio afectado en su totalidad lo cual se asemeja a la infección
en humanos con inmunocompromiso severo. No hubo evidencia
de infección extraintestinal. Este modelo podrá ser utilizado en
futuros ensayos para evaluar el efecto de diversos agentes
terapeúticos sobre la infección intestinal por Cryptosporidium spp.
P128 – 27196 - OPTIMIZACIÓN DE PARÁMETROS MUESTREALES PARA EL ESTUDIO DE BACTERIAS EN EL AIRE DE
AMBIENTES HOSPITALARIOS. MERINO, LUIS; GOMEZ, MARIA
VERÓNICA; FERNANDEZ, MARIANA; GIUSIANO, GUSTAVO
Facultad de Medicina, Universidad Nacional del Nordeste
El aire atmosférico no tiene una microbiota autóctona pero es
un medio para la dispersión de microorganismos (bacterias, virus
73
y hongos). Las bacterias dispersadas por el aire pueden producir
infecciones, especialmente en pacientes con factores predisponentes, siendo la microbiota aérea de ambientes hospitalarios
objeto de diversos estudios, como una causa potencial de infecciones nosocomiales. El objetivo del presente trabajo fue optimizar
las condiciones de muestreo para realizar estudios sobre la presencia de bacterias anemófilas en diferentes ambientes hospitalarios. El estudio se realizó en dos hospitales de las ciudades de
Resistencia y Corrientes. Como muestreador se utilizó un colector de aire Surface Air Sampler Super 100 (PBI®). Se tomaron
muestras de diferentes salas en volúmenes de 100, 200, 300 y
400 litros de aire, colocando el colector a alturas de 50 y 150 cm
cada vez. Adicionalmente se muestreó, en iguales condiciones,
el ambiente contiguo o exterior a la sala en estudio, considerándose éste como ambiente control. Todas las muestras fueron recogidas sobre placas de agar tripteína soya, las que fueron incubadas durante 3 días a 35 °C. Las colonias bacterianas fueron
contadas e informadas como unidades formadoras de colonias por
metro cúbico de aire (UFC/m3). De cada morfotipo colonial se realizó una resiembra y posterior coloración de Gram registrándose
la tinción, morfología y disposición bacteriana. Los cocos grampositivos fueron resembrados en agar manitol salado e identificados por pruebas bioquímicas clásicas. Las colonias de
Staphylococcus aureus fueron repicadas sobre agar cromogénico
para detección de cepas resistentes a meticilina. Luego de evaluar la totalidad de las placas en los diferentes muestreos se seleccionaron las condiciones que permitieran el mejor recuento e
individualización de colonias, siendo las óptimas aquellas con un
promedio de 30 UFC/placa (5 a 50 UFC/placa), colocando el aparato a 150 cm y tomando volúmenes de 400 litros para aquellas
áreas más limpias (quirófano, neonatología, oncología), 300 litros
para áreas intermedias (salas de espera, pasillos, oficinas de
enfermería) y 200 litros para el aire exterior. La frecuencia de
aparición de bacterias en orden decreciente entre las gram-positivas fue: bacilos, cocobacilos difteromorfos, cocos en racimos,
cocos en tétradas y bacilos ramificados; solo en una muestra por
hospital desarrollaron bacilos gram-negativos. S. aureus sensible
a meticilina fue detectado en 8 salas diferentes. Ante la ausencia
de parámetros estrictos para la realización de este tipo de estudios, las pruebas realizadas indican que deben utilizarse diferentes volúmenes según la supuesta calidad del aire a muestrear y
una altura media de muestreo. La presencia de S. aureus en áreas
críticas de los hospitales amerita la inclusión de placas con medios selectivos para monitorear la calidad del aire especialmente
en salas que alberguen pacientes con factores predisponentes.
La escasa presencia de bacilos gram-negativos no justifica el uso
de medios selectivos excepto cuando se realice un muestreo dirigido como consecuencia de brotes de infecciones nosocomiales
debidos a este grupo bacteriano.
P129 – 27213 - ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE QUITOSANO:
EFECTO SOBRE LA INTERNALIZACIÓN DE Staphylococcus
aureus EN CÉLULAS EPITELIALES DE GLÁNDULA MAMARIA
BOVINA. FELIPE, VERÓNICA (1); MORGANTE, CAROLINA (1);
ICELY, PAULA (2); CORREA, SILVIA G(2); PORPORATTO,
CARINA(1)
(1) Universidad Nacional de Villa María (UNVM), (2) Centro de
Investigaciones Bioquímica Clínica (CIBICI)
La mastitis bovina causada por Staphylococcus aureus es una
de las infecciones mas importantes del ganado y afecta tanto a
la calidad como la cantidad de la producción lechera. Esta bacteria tiene la habilidad de evadir la respuesta inflamatoria generando una supresión de la respuesta inmune mediada por diferentes
mecanismos. Las células epiteliales de la glándula mamaria (GM)
bovina actúan como primera línea de defensa frente a una infección y contribuyen a la respuesta inflamatoria de la ubre mediante la secreción de factores quimiotácticos para células inmunes.
El bloqueo de la adhesión bacteriana a las células epiteliales y
colonización de las superficies mucosas en la infección por S.
aureus podría ser una estrategia efectiva para prevenir la infección. Quitosano (Q) es un polisacárido de acetil-glucosamina
deacetilada obtenido de la quitina y uno de los polímeros más
74
abundantes en la naturaleza. Presenta efectos antibacterianos,
propiedades mucoadhesivas naturales y capacidad de modular la
respuesta inmunológica. Dada las propiedades de Q, en el presente trabajo se evaluó la actividad antimicrobiana del polisacárido
y la capacidad de controlar la adherencia de S. aureus a células
epiteliales de GM bovina. En el presente estudio se utilizó la cepa
S. aureus V329. Se observó una disminución de la DO y recuento de UFC/ml en forma dosis dependiente en presencia de concentraciones crecientes de Q, en cultivos de medio TSB crecidos
durante 16h a 37 °C. Conjuntamente, V329 mostró un retraso en
la fase de latencia y exponencial de crecimiento en presencia de
100 y 400 ug/ml de Q. Se evaluó la capacidad de modificar la
adherencia e internalización de la cepa V329 a las células
epiteliales de GM, utilizando la línea celular de epitelio de GM
bovina MAC-T. La capacidad de adherencia de V329 a las MACT se encontró disminuida en presencia del polisacárido Q en forma dosis dependiente evaluado mediante recuento de las UFC
(p<0,05). Se realizaron cultivos celulares de MAC-T con distintas
concentraciones de Q (0.01 a 100 ug/ml) por 24 h. Luego, las
MAC-T fueron lavadas e incubadas con V329-FITC por 1 h. Se
evaluó por citometría de flujo la internalización de V239 en estas
células. Se observó una disminución del porcentaje de bacterias
internalizadas al aumentar la dosis del pre-tratamiento con Q. Se
evaluó el efecto de Q sobre la respuesta inmune generada por
las células epiteliales de GM luego de la infección con V329, determinando la producción de citoquinas y quimioquinas. Por RTPCR se determinó un incremento en la expresión de mARN de
TNF-a, IL-8 y CCL-2 en células MAC-T estimuladas con Q + V329
(p<0,05). El polisacárido Q presenta actividad bacteriostática en
las primeras fases del crecimiento de cepas de S. aureus, e inhibe
la internalización y adherencia en cultivos de células epiteliales
mamarias. Además este polisacárido estimula una respuesta
inflamatoria por parte del epitelio de la GM, lo cual podría favorecer la eliminación del patógeno.
P130 – 27223 - VULVOVAGINITIS EN NIÑAS Y ADOLESCENTES. GIUGNO, S; RUBINSTEIN, A; OCAMPO, D; RAHMAN, G;
FALLENSEN, S; BORSA, A
Hospital Nacional de La Plata, Sor María Ludovica
La vulvovaginitis (Vv) constituye un motivo de consulta frecuente en niñas y adolescentes. En las distintas etapas del desarrollo
se producen cambios en la flora endógena y predisposición a la
multiplicación de distintos agentes, influenciados por las variaciones del pH y el contenido de glucógeno determinados por los niveles de estrógenos. El carácter inespecífico de la Vv, determinado por el hecho de hallar una flora bacteriana mixta constituida por los gérmenes habituales de la vagina, en algunas situaciones puede mostrar un germen predominante. En el caso de las
específicas, los microorganismos no forman parte de la flora
endógena vaginal. Nuestro objetivo fue determinar la prevalencia
de los agentes etiológicos más frecuentes en niñas y adolescentes con Vv que concurrieron al Servicio de Ginecología del Hospital de Niños Sor Maria Ludovica durante el año 2009. Se estudiaron 163 pacientes con diagnóstico de Vv. Las muestras fueron extraidas con hisopo y remitidas al Laboratorio de Microbiología. Se realizó examen en fresco, coloración de Gram, cultivo y
TIF para clamidias y herpes. Los resultados se muestran en la
tabla. Abreviaturas: Haemophilus spp. (Hi), Shigella flexneri (Sf),
Candida albicans (Ca), Streptococcus pneumoniae (Sp), Gardnerella vaginalis (Cv), Ureplasma urealyticum (Uu), Moraxella
catarrhalis (Mc), Trichomonas vaginalis (Trich), inespecíficas
(inesp), estreptococo grupo B (e grupo B), Chlamydia trachomatis
(Chla). En el grupo de 0-11 años en menor proporción se aislaron Mc n=1 (1.1 %), Sp n=1 (1.1 %) y en el caso de 12-17 años
Candida no albicans en 3 (3.9 %) y e grupo B n=1 (1.3)
Grupo
etáreo
Hi n
(%)
Sf n
(%)
Ca n
(%)
Trich n
(%)
Uu n
(%)
Chla n
(%)
Gv n
(%)
Inesp n
(%)
0-11 años
(n=87)
12-17 años
(n = 76)
5
(5.7)
0
5
(5.7)
0
5
(5.7)
10
(19.7)
0
2
(2.39)
20
(26.3)
1
(1.1)
3
(3.9)
2
(2.3)
15
(19.7)
49
(56.3)
37
(48.7)
4
(5.3)
Existe una diferencia significativa entre los gérmenes aislados
entre los dos grupos etáreos. La piel vulvar de las niñas
prepúberes se daña facilmente por falta de higiene y la proximidad al ano, esto hace que sean importantes la Vv inespecíficas.
Las infecciones específicas se deben más a gérmenes de la vía
respiratoria. El patógeno entérico más común aislado es Sf. Ca
no es causa importante de Vv en niñas. Gv en niñas, ha sido relacionada por algunos autores con abuso sexual infantil (ASI);
afecta sobretodo a adolescentes como en el caso de Uu. Este
último también puede ser un alerta ASI. En los casos de Chla es
muy importante la evaluación del ASI, al igual que trichomonas.
No hubo ningún aislamiento de Neisseria gonorrhoeae, ni TIF
positivo para herpes. La Vv por cuerpo extraño, pólipos, tumor,
enfermedades sistémicas, etc. se ve en niñas. En las adolescentes las infecciones específicas y las relacionadas con transmisión
sexual son las más importantes, la leucorrea también se relaciona con los cambios cíclicos en el nivel de estrógenos. La Vv es
el motivo de consulta más frecuente en ginecología infanto juvenil, y si bien no es una afección grave, los resultados terapéuticos no son siempre buenos. Por lo tanto en ocasiones es necesario realizar un estudio cuidadoso para poder resolver el cuadro
en forma adecuada.
P131 – 27244 - SEROPREVALENCIA DE TOXOCARIASIS ASOCIADA A POSESIÓN DE GATOS EN NIÑOS DE UNA POBLACIÓN RURAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES. MOLINA,
NORA (1); PEZZANI, BETINA(1); CIARMELA, LAURA(1); ORDEN,
BIBIANA(2); ROSA, DIANA(3); APEZTEGUIA, MARIA(4);
MINVIELLE, MARTA(1)
(1) Facultad de Medicina – UNLP, (2) CONICET, (3) Facultad de
Veterinaria – UNLP, (4) CIC Provincia de Buenos Aires.
Toxocariasis es el término clínico que se aplica a la infección
causada principalmente por Toxocara canis o T.cati en el huésped humano. Ambos parásitos son ascáridos cuyos huéspedes
definitivos son el perro y el gato respectivamente. Diferentes estudios en el mundo y en nuestro país, han demostrado que los
paseos públicos de lugares urbanos y suburbanos se encuentran
contaminados con huevos de T. canis y T. cati, dado que estos
ambientes son frecuentados por mascotas y animales abandonados. De este modo, los niños que al jugar realizan geofagia, presentan mayor riesgo de infectarse y adquirir esta zoonosis. Trabajos previos del grupo han demostrado la asociación de serología
antitoxocara y tenencia de caninos. Pero, en la literatura se menciona también el rol del gato como transmisor de esta infección
parasitaria. El objetivo de este trabajo fue evaluar la relación entre seroprevalencia de toxocariasis y variables demográficas,
ambientales y socioculturales en niños pertenecientes a una población rural (Atalaya, partido de Magdalena) de la provincia de
Buenos Aires, Argentina. Dentro del marco del PROCOPIN (Programa de Control de las Parasitosis Intestinales y Nutrición) se
llevó a cabo un estudio transversal descriptivo en escolares de
Atalaya, partido de Magdalena durante el año 2009. La determinación serológica de anticuerpos antitoxocara en 78 niños (3-11
años de edad) fue realizado en el laboratorio de Parasitología de
la Cátedra, usando el kit Toxocara Microwell Serum ELISA (IVD
Research Inc. Carlsbad, USA). Se realizó un frotis sanguíneo por
persona para cuantificación de eosinófilos en sangre periférica.
Los padres/tutores de los niños fueron entrevistados para registrar datos demográficos, ambientales y socioculturales mediante
una encuesta estructurada y cerrada. Estos padres/tutores firmaron el consentimiento para la extracción sanguínea de sus hijos
y presenciaron la misma. Se registró desarrollo pondo-estatural
y concentración de hemoglobina y micronutrientes en sangre. Para
determinar las asociaciones se usaron las pruebas de X2 y Fisher.
Se utilizó el Software SPSS (Statistical Programme Social
Science) versión 11.5. La seroprevalencia de toxocariasis fue de
26,9% (21/78). No se registraron diferencias estadísticamente significativas según sexo y edad. Se detectó eosinofilia en 12/21
(57,1%) personas seropositivas, y en 10/57 (17,5%) seronegativas
(p = 0,001; OR= 6.267). Quince de 21 niños (71,4%) con serología
positiva tenían perros en sus domicilios respecto a 41/57 (71,9%)
niños seronegativos (p = 0,965) mientras que 9/21 (42,8%) niños
seropositivos tenían gatos respecto a 8/57 (14,0%) seronegativos
(p = 0,006, OR= 4.594). También resultó significativa la asociación entre niños con serología positiva y vivienda precaria (p
=0,022, OR= 3.438). En función del registro de las variables que
se asociaron a la prevalencia de toxocariasis en esta población,
se recomendó la implementación de programas de Salud Pública
dirigidos especialmente al tratamiento antiparasitario de los gatos y educación de la población.
P132 – 27248 - EMERGENCIA DE blaOXA-48 EN AISLAMIENTOS DE Shewanella putrefaciens, EN UN HOSPITAL DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES. MERKIER, ANDREA KARINA (1);
RAMIREZ, MARIA SOLEDAD (1 ); ALMUZARA, MARISA(2); VAY,
CARLOS (2); CENTRON, DANIELA(1)
(1) Facultad de Medicina – UBA (2) Hospital de Clínicas.
Introducción: las infecciones causadas por Shewanella spp.
son poco frecuentes, sin embargo en los últimos años S. algae
(Sa) y S. putrefaciens (Sp) han sido reconocidas como agentes
causales de una amplia variedad de infecciones humanas, siendo las más comunes las infecciones óticas, así como también las
infecciones asociadas a piel y partes blandas. El objetivo del
presente trabajo fue estudiar la dispersión de ß-lactamasas asociadas a la transferencia horizontal de genes, las cuales han sido
reportadas en aislamientos de bacilos gram-negativos, en 12 aislamientos intrahospitalarios de Shewanella spp., con el fin de
pesquisar la presencia de dichos mecanismos como reservorio
intrahospitalario de genes. Materiales y métodos: se estudiaron
5 aislamientos de Sp y 7 de Sa, provenientes del servicio de Bacteriología de un hospital de la Ciudad de Buenos Aires durante
los años 2005-2009. Los aislamientos fueron identificados por las
pruebas bioquímicas convencionales y confirmados por secuenciación del gen ADNr 16S. Se realizó la CIM a los anti-bióticos
ß- lactámicos según normas del Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI). La identificación de los genes codificantes para
ß-lactamasas se realizó por PCR y posterior secuenciación. Resultados: si bien Shewanella spp. es naturalmente sensible a la
mayor parte de los antibióticos ß-lactámicos, se identificó la presencia de una variante del gen blaOXA-48 en los 5 aislamientos
de Sp. Aunque se encontró por PCR el elemento IS1999, el cual
fue descripto asociado a la expresión del gen blaOXA-48, no se
pudo demostrar su asociación con el gen codificante para la
carbapenemasa presente en nuestros aislamientos. Nuestros resultados muestran la presencia de una variante del gen blaOXA48 en aislamientos de Sp de nuestro país, siendo el primer reporte de la presencia de dicho gen en bacilos gram-negativos no
fermentadores de la glucosa. La presencia del elemento IS1999
y su posible asociación a la variante del gen blaOXA-48, en aislamientos de origen hospitalario, podrían beneficiar una mayor y
rápida diseminación de dichos mecanismos tanto intra como
interespecie. Se evidenció la presencia de un mecanismo de resistencia potencialmente transferible en un microorganismo que
si bien, su incidencia a nivel intrahospitalario es baja, podría actuar como reservorio para la posible emergencia de cepas resistentes a carbapenemes.
P133 – 27263 - DETECCIÓN MEDIANTE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA DE Helicobacter pylori EN BIOPSIAS
GÁSTRICAS Y SU CORRELACIÓN CON VARIABLES CLÍNICOEPIDEMIOLÓGICAS. MEDINA, MARCELO (1); MEDINA, MYRIAM
(1); LOSCH, LILIANA (1); PICON, SANTIAGO (2); MARTIN,
GRACIELA (3); MERINO, LUIS (1)
(1) Instituto de Medicina Regional, (2) Hospital J. C. Perrando, (3)
Hospital A. Castelan
Helicobacter pylori (Hp) está asociado a enfermedades
gastroduodenales de diferente gravedad dependiendo de las características del huésped, las condiciones ambientales y la presencia de alguno o todos los factores de virulencia bacteriana
(cagA, vacA y babA2). El objetivo de este trabajo fue estudiar la
presencia de Hp en muestras de biopsias gástricas mediante re-
75
acción en cadena de la polimerasa (PCR) y su correlación con
variables clínicas y epidemiológicas. Se estudiaron prospectivamente 51 pacientes que consultaron por transtornos dispépticos
entre octubre de 2009 y mayo de 2010 en el Hospital “Dr. Julio
C. Perrando” de la ciudad de Resistencia (Chaco). Bajo consentimiento informado de los pacientes se confeccionaron las fichas
epidemiológicas, se realizó el examen clínico y se procedió a la
toma de muestras de biopsias gástricas de cuerpo y antro mediante endoscopía. La detección de Hp en las muestras se realizó mediante PCR amplificando el gen que codifica para la ureasa
(ureA), según técnica previamente descripta. Los datos fueron
registrados en Excel 5.0 y procesados mediante el programa Epi
Info 2002. Sobre 51 pacientes, en 10 se detectó Hp mediante PCR
de muestras de biopsias endoscópicas gástricas. Cinco pacientes eran varones y 5 mujeres, con una edad media de 41 años y
un promedio de 3,5 personas por habitación. Ocho pacientes provenían de la zona urbana, 6 contaban con agua potable y baño
instalado. En cuanto a los datos clínicos más frecuentes, el dolor
abdominal estuvo presente en 8 pacientes y el reflujo gastroesofágico, en 6. La técnica de PCR posee alta sensibilidad y especificidad para la detección de la infección por Hp, la cual se
comporta de manera particular en diferentes regiones geográficas existiendo discrepancias entre los factores predisponentes, los
determinantes de patogenicidad de la bacteria y las condiciones
de vida de los individuos. Es por ello que se hace necesario completar el estudio clínico y epidemiológico con la caracterización
de los genes de virulencia bacteriana presentes en cada caso a
fin de comprender mejor la presentación clínica y la evolución de
los pacientes.
P134 – 27293 - EFICACIA DE Duddingtonia flagrans EN UN
BLOQUE ENERGÉTICO PARA EL CONTROL DE NEMATODOS
GASTROINTESTINALES EN OVINOS. SAGUES, FEDERICA (1);
FUSE, LUIS (1); FERNANDEZ, SILVINA (2); PURSLOW, PETER
(2); IGLESIAS, LUCIA (1); MORENO, FABIANA (3); SAUMELL,
CARLOS (1)
(1) Universidad del Centro de la provincia de Buenos Aires
(UNICEN), (2) UNIV.GUELPH, (3) INTA Balcarce
Se evaluó la eficacia de un aislamiento del hongo nematófago
Duddingtonia flagrans incorporado en un bloque energético contra nematodos gastrointestinales de ovinos y su capacidad para
disminuir el número de larvas en heces y por consiguiente en el
pasto. Con el objetivo de contaminar pasturas libres de larvas con
huevos de nematodos gastrointestinales y con hongos nematófagos, se colocaron en cada una de dos parcelas contiguas 2
ovinos naturalmente infectados y con un promedio de 2.320 huevos por gramo de heces. El grupo tratado (T1) recibió diariamente un bloque energético conteniendo clamidosporos de D. flagrans,
y el grupo control (C1) recibió un bloque energético libre de
clamidosporos. La dosis de clamidosporos administrada a cada
animal con el bloque fue de 200.000/kgPV/d. Los animales recibieron el bloque durante un mes, eliminando durante este período clamidosporos de D. flagrans por heces. Pasado este período
se retiraron de las parcelas y éstas fueron ocupadas por 12 ovinos
previamente desparasitados, divididos aleatoriamente en dos grupos de 6 animales cada uno, tratado (T2) y control (C2). Los animales del grupo T2 se alojaron en la pastura conteniendo D.
flagrans y los animales del grupo C2 fueron alojados en la pastura libre de este hongo. Luego de un mes de pastoreo, se retiraron de las pasturas y se colocaron en corrales techados donde
se alimentaron con alimento balanceado durante 15 días. Finalizado este período se sacrificaron para determinar el número y las
especies de nematodos presentes en el abomaso, intestino delgado e intestino grueso. El porcentaje de eficacia del hongo sobre el total de la población parasitaria susceptible fue del 92%.
La eficacia en el grupo T2 fue del 100% contra Haemonchus
contortus y Teladorsagia circumcincta, 87,5% contra Cooperia
oncophora y 90% contra Trichostrongylus axei. La administración
del bloque energético conteniendo clamidosporos de D. flagrans
redujo significativamente (p< 0,0001) el número de nematodos
adultos presentes en el tracto gastrointestinal de ovinos en este
ensayo a campo en pequeña escala. La acción predadora del
76
hongo sobre las larvas en las heces redujo el número de larvas
en la pastura y, por ende, fue capaz de reducir la carga de la
mayoría de los géneros parasitarios del tracto gastrointestinal
estudiados con la dosis de clamidosporos utilizada. Los bloques
minerales como forma de administración del agente de control
biológico podrían utilizarse en producciones extensivas donde los
animales son criados a pasto y su administración podría realizarse en los momentos en que la contaminación de la pastura es un
riesgo para la salud animal.
P135 – 27300 - Strongyloides stercoralis EN PACIENTE INMUNOSUPRIMIDO CON ANTECEDENTE DE GLIOBLASTOMA MULTIFORME. ALVAREZ, VERONICA; PIDONE, JUAN; GUEL-FAND,
LILIANA; SOLOAGA, ROLANDO; CARRION, NATALIA; SALINAS,
ANDREA; SUAR, MARIA BEATRIZ; MARGARI, ALEJANDRA
Hospital Naval Buenos Aires
Strongyloides stercoralis es un nematode intestinal transmitido por la tierra, de gran importancia en zonas tropicales y
subtropicales. La infección se adquiere por vía cutánea. La larva
filariforme (infectiva) atraviesa la piel entrando a la circulación y
es transportada pasivamente hasta alcanzar los capilares
pulmonares y alvéolos. Progresa hasta la tráquea y llega finalmente al tracto digestivo, donde en intestino delgado se transforma
en adulto y deposita sus huevos que eclosionan a larvas rhabditiformes que son eliminadas con las heces. Esta infección es
única en el ser humano por la capacidad de reproducirse dentro
del huésped y persistir en forma indefinida. En el caso de inmunosupresión la estrongiloidiosis actúa como enfermedad oportunista. El objetivo fue describir la detección de larvas de S.
stercoralis en heces de un paciente inmunosuprimido con antecedente de glioblastoma multiforme. Caso clínico: paciente masculino de 19 años de edad oriundo de la ciudad de Corrientes con
antecedente de glioblastoma multiforme, que recibió tratamiento
con corticoides, cirugía y quimioterapia. Ingresó a guardia médica por episodios diarreicos de 15 días de evolución (8 deposiciones diarias líquidas y mucosanguinolentas) con fiebre, náuseas,
vómitos, tos seca, alteración del coagulograma, leucocitosis y
abdomen doloroso al examen físico. Presentó hemoptisis, descompensación hemodinámica y melena. Inició tratamiento antibiótico con ceftriaxona+metronidazol y se le tomaron cultivos. Pasó
a Unidad de Cuidados Intensivos, donde fue transfundido, entró
en asistencia respiratoria mecánica y soporte inotrópico. Por posible foco abdominal, rotó a pipercilina-tazobactama+amikacina.
Continuó con melena, se le realizó FEDA (fibro-endoscopía digestiva alta) hallándose esofagitis erosiva + candidiasis esofágica +
antritis + duodenitis. Todos los cultivos y la serología para VIH
fueron negativos. Infectología solicitó coproparasitológico en
muestra seriada. Por método de Telemann modificado (centrifugación con éter), en una muestra seriada recogida en solución
formolada al 5%, al sedimento se le realizó coloración húmeda
con una gota de lugol y al microscopio óptico se observaron larvas compatibles con Strongyloides stercoralis. El paciente fue tratado con albendazol x 7días + ivermectina x 3 días presentando
mejoría clínica. Completó tratamiento antiparasitario hasta su
externación. En conclusión y según la bibliografía, este nematode
debe sospecharse y buscarse en los pacientes inmunosuprimidos
pues actúa como agente oportunista. La terapia con corticoides
o con citotóxicos disminuye las defensas del huésped y puede
haber implantación de las larvas en todo el intestino delgado,
yeyuno y pulmones causando diarrea, náuseas, vómitos, hemorragias intestinales y esofagitis. La estrongiloidiosis se caracteriza por la irregularidad en la salida de las larvas dificultando su
diagnóstico, de allí que se sugiera su búsqueda en muestras
seriadas de materia fecal.
P136 – 27312 - PRODUCCIÓN Y EVALUACIÓN DE UN REACTIVO
DE LÁTEX PARA EL DIAGNÓSTICO RÁPIDO DE CRIPTOCOCOSIS MENÍNGEA. TROVERO, ALICIA(2); ROGE, ARIEL(2);
BORDAGORRIA, XIMENA(2); BOSCO BORGEAT , M EUGENIA(1);
MAZZA, MARIANA(1); REFOJO, NICOLAS(1); IACONO,
RUBEN(2); BRUNO, SUSANA(2); DAVEL, GRACIELA(1)
(1)Departamento Micología, INEI y (2)Servicio antígenos y
antisueros, INPB - ANLIS “Dr. C. G. Malbrán”
La criptococosis meníngea ocupa el cuarto lugar dentro de las
complicaciones infecciosas que comprometen la vida de los infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana. En Argentina, la incidencia en los pacientes con SIDA oscila entre 6-15 %.
Los métodos utilizados para el diagnóstico de esta enfermedad,
son el examen microscópico del líquido cefalo-raquídeo (LCR) con
tinta china, el cultivo y la detección de antígeno capsular por la
prueba de aglutinación de látex. Esta última técnica permite una
detección semicuantitativa del antígeno polisacáridico capsular de
Cryptococcus neoformans presente en el LCR y suero de pacientes. Dicho reactivo no se produce en el país y su costo es elevado. El objetivo de este trabajo fue la obtención y purificación de
anticuerpos anti C. neoformans para la producción del reactivo de
látex. Los sueros anti-C. neoformans se obtuvieron mediante la
inmunización de conejos neozelandeses, con dosis de 3 x 108
células de las cepas de referencia de C. neoformans ATCC 62067,
WM148 y WM628 inactivadas con formalina. El esquema de inmunización consistió en una dosis cada 4 días durante el primer
mes, una por semana el segundo mes, un mes de descanso y un
refuerzo final. Para la purificación de los anticuerpos se evaluaron los métodos de precipitación con sulfato de amonio y
cromatografía de afinidad con Montage Antibody Purification Kit
(Millipore), Protein A HP SpinTrap (GE Healthcare) y DEAE-AffiGel® Blue (BIORAD), para obtener mejor rendimiento y pureza de
los anticuerpos específicos. Se establecieron las condiciones óptimas para la producción del reactivo de látex, variando el tamaño de las partículas y la concentración de las inmunoglobulinas
durante el proceso de adsorción. El antisuero de mayor título (1/
1024) fue obtenido inmunizando con la cepa WM148. El método
que brindó mejores resultados para la purificación de anticuerpos
específicos fue la cromatografía con DEAE affi-Gel® Blue. Las
condiciones óptimas de adsorción se obtuvieron con 0,1 mg/ml
de anticuerpos y partículas de látex de 0,8 µm al 1% (p/v). El límite de detección del reactivo preparado fue de 31 ng/ml de
antígeno capsular purificado de C. neoformans serotipo A. Los
resultados obtenidos son promisorios, sin embargo debemos determinar la sensibilidad y especificidad diagnóstica para establecer su utilidad en la rutina de los laboratorios de microbiología.
La producción nacional de este reactivo permitirá asegurar su
provisión continua y gratuita a los laboratorios de la Red.
P137 – 27313 - DETERMINACIÓN DE LA SENSIBILIDAD ANTIFÚNGICA DE ESPECIES DE Malassezia. APLICACIÓN AL LABORATORIO MICOLÓGICO DE RUTINA. SORTINO, M (1);
RAMADAN, S (1); BULACIO, L (1); MAROZZI, M L (1); LOPEZ, C
(1); RAMOS, L (1)
(1) CEREMIC-Facultad de Ciencias Bioquímicas y FarmacéuticasUNR
Introducción: las levaduras lipofílicas del género Malassezia
pueden encontrarse integrando la microbiota habitual de la piel
humana o causando patologías como pitiriasis versicolor, dermatitis seborreica y foliculitis, entre otras. Los estrictos requerimientos nutricionales y la baja viabilidad en cultivos del género han
dificultado el desarrollo de técnicas para definir sus perfiles de
sensibilidad. Objetivos: determinar in vitro perfiles de sensibilidad
de cepas de Malassezia aplicando un método de microdilución en
caldo recomendado por el Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI), adaptada a los requerimientos del género y evaluar la factibilidad de su realización en el laboratorio micológico
de rutina. Materiales y métodos: se utilizó la metodología descripta
en el documento M27-A3 del CLSI, usando el medio de cultivo
RPMI 1640 modificado, ya que el mismo fue diseñado para la
evaluación de sensibilidad antifúngica de especies no lipofílicas.
Éste fue suplementado con los nutrientes requeridos por el género Malassezia. Para obtener inóculos homogéneos se utilizaron perlas de vidrio y Tween 20. Se probaron las siguientes drogas: fluconazol, ketoconazol, terbinafina e itraconazol, a las concentraciones finales establecidas por el método. Se ensayaron 7
cepas de referencia y 10 aislados clínicos, de las siguientes es-
77
pecies: M. pachydermatis, M. slooffiae, M. sympodialis, M.
globosa, M. furfur, M. restricta y M. obtusa. Se colocaron en
microplacas las soluciones de los antifúngicos y los inóculos,
incubándose a 32 °C por 48-72 h. Las pruebas fueron realizadas
por triplicado para evaluar reproducibilidad del método. Las lecturas de las placas se realizaron en lector para placas de ELISA,
determinándose la concentración inhibitoria mínima (CIM), considerada como la menor concentración que produjo una disminución del 90% del crecimiento en comparación con el control de
crecimiento. Resultados: los rangos de sensibilidad obtenidos fueron: terbinafina (CIM: 0,007-0,03µg/ml), fluconazol (CIM: 0,130,50µg/ml), itraconazol (CIM: 0,015-0,50µg/ml) y ketoconazol (CIM:
0,015-0,06µg/ml). Estos resultados coinciden con los perfiles de
sensibilidad encontrados por otros grupos de investigadores. En
general, se pudo observar que todas las cepas evaluadas son
marcadamente sensibles a itraconazol, ketoconazol y terbinafina,
mientras que son de moderadamente a poco sensibles frente a
fluconazol. La metodología empleada requiere una gran laboriosidad, entrenamiento técnico, así como costosos insumos y
equipamiento. No obstante, obtuvimos un adecuado ajuste de las
variables que inciden en la buena reproducibilidad del método,
tales como magnitud del inóculo, suplementos del medio utilizado, temperatura y tiempo de incubación. Esto nos permitió la obtención de resultados cuantitativos acerca de la sensibilidad
antifúngica frente a drogas comerciales. Consideramos de vital
importancia continuar en el desarrollo de técnicas más sencillas
como las que emplean medios sólidos, a los efectos de facilitar
la implementación de estos estudios en el laboratorio de rutina.
P138 – 27325 - FUNGEMIAS Y COLONIZACIÓN POR LEVADURAS EN NEONATOS DE UNIDADES DE CUIDADOS INTENSIVOS. ROJAS, FD; CATTANA, ME; SOSA, MA; MANGIATERRA,
ML; GIUSIANO, GE
Instituto de Medicina Regional - UNNE
La fungemia por levaduras es un problema cada vez más frecuente en neonatos en unidades de cuidados intensivos neonatales (UCIN). Las condiciones predisponentes más importantes
para desarrollar candidemia son la neutropenia, los defectos en
la inmunidad celular y la alteración de la biota microbiana. En
neonatos la colonización ha sido claramente identificada como
factor de riesgo independiente que los hace susceptibles para
adquirir candidemia. Diversos estudios enfatizan que la colonización de 2 o más sitios anatómicos no contiguos se correlaciona
con el aumento del riesgo de mortalidad. Aproximadamente, el
70% de las infecciones son de origen endógeno y se adquieren
a partir de la colonización del tracto digestivo y de la piel. Las
levaduras del canal de parto son la principal fuente exógena. El
objetivo fue conocer la frecuencia de aislamiento de especies
levaduriformes como agentes colonizantes y de fungemias en
neonatos en UCIN. Se analizaron los aislamientos levaduriformes
de muestras clínicas obtenidas de neonatos en UCIN privadas de
la ciudad de Resistencia, entre los años 2005-2009. La identificación se realizó según la metodología de Kreeger van-Rij y el
sistema API ID 32C (bioMérieux).
Especies
Candida
parapsilosis
C. tropicalis
C. albicans
C. glabrata
C. famata
Total
Sangre
Catéter
Orina
Mat. fecal
Total
9 (64,3%)
1 (33%)
7 (27%)
4 (21%)
21 (34%)
2 (14,3%)
2 (14,3%)
0
1 (7,1%)
14 (100%)
2 (67%)
0
0
0
3 (100%)
6 (23%)
9 (35%)
4 (15%)
0
26 (100%)
7 (37%)
5 (26%)
3 (16%)
0
19 (100%)
17 (27%)
16 (26%)
7 (11%)
1 (2%)
62 (100%)
C. parapsilosis es comensal de piel y tiene capacidad de colonizar catéteres, instrumental plástico, látex, soluciones antisépticas, etc. El alto porcentaje obtenido en todos los tipos de muestras evidencia la importante transmisión horizontal de este agente y la necesidad de aplicar medidas de higiene y control. C.
tropicalis aislada en 2° lugar es comensal del tracto gastrointestinal y una importante causa de infección por su capacidad invasora y alta tendencia al desarrollo de resistencia a los azólicos.
Es llamativo el alto porcentaje de C. glabrata encontrado. La
prematurez y la profilaxis favorecen la infección por C. glabrata.
Esta especie desarrolla resistencia secundaria al fluconazol, una
de las pocas opciones terapéuticas en neonatos. C. famata aislada de hemocultivo es un importante patógeno emergente y ha
sido informada con sensibilidad decreciente a la anfotericina B.
El control de la colonización del tracto urinario y gastrointestinal
en neonatos se considera importante para prevenir diseminaciones. Conclusión: nuestros resultados sugieren un cambio en
el reconocido predominante rol de C. albicans como causa de
candidemia o agente colonizador en neonatos. La diversidad encontrada y la detección de especies con tendencia al desarrollo
de resistencia antifúngica enfatizan la importancia de realizar una
continua vigilancia en estos pacientes.
P139 – 27352 - INFECCIONES DE TRANSMISIÓN SEXUAL EN
NIÑOS CON SOSPECHA DE ABUSO SEXUAL. KIGUEN, ANA
XIMENA (1); VENEZUELA, FERNANDO (1); FRUTOS, MARIA
CELIA (1); MONTANARO, PATRICIA (2); MIRAS, MIRTA (2); MOSCA, LILIANA (2); CUFFINI, CECILIA (1)
(1) Instituto de Virología “Dr. José M. Vanella” (INVIV), FCM, UNC,
(2) Hospital de Niños, Córdoba
Introducción: la presencia de una infección de transmisión
sexual (ITS) en un niño, siempre nos debe hacer pensar en un
abuso. Se cree que, aproximadamente, el 5% de los niños abusados contrae alguna ITS como consecuencia del mismo. Según
la Academia Americana de Pediatría (AAP), la detección de
Neisseria gonorrhoeae (Ng), Treponema pallidum (Tp) y Chlamydia trachomatis (Ct) es considerada diagnóstico de certeza de
abuso sexual, siempre y cuando se compruebe que la infección
no es perinatal, mientras que el hallazgo de Trichomonas vaginalis
(Tv) y virus papiloma humano (HPV) nos da alta sospecha del
mismo. La presencia de Mycoplasma genitalium (Mg) todavía es
controvertido. Objetivo: establecer la presencia de infecciones de
transmisión sexual en niños con sospecha de abuso sexual en la
ciudad de Córdoba. Pacientes y métodos: se estudiaron muestras
de 20 niños de 2 a 14 años, que fueron evaluados en el Servicio
de Endocrinología del Hospital de Niños de “la Santísima Trinidad” de la Ciudad de Córdoba, con sospecha de abuso sexual. A
los mismos se les tomaron muestras de hisopado faríngeo y orina para la detección mediante métodos de biología molecular, de
Ct, HPV y Mg. Para ello, se utilizaron los siguientes primers: A1,
A2 y pCTM3 dirigidos contra MOMP de Ct; My09/ My11 y GP5+/
GP6+ para las PCR de HPV y Mgpa1/Mgpa3 para Mg. A las muestras que resultaron positivas para HPV, se las sometió a RFLP
para conocer el genotipo del virus. Además, se tomó muestras de
flujo vaginal en las niñas (N=18) y secreción uretral o anal en los
niños (N=2), en las cuales se efectuó un examen directo para la
detección de Tv y se cultivaron en medio de Thayer Martin para
el aislamiento de Ng. Por último, se realizó extracción de sangre
para VDRL. Resultados: del total de pacientes estudiados, 3 muestras de hisopados faríngeos de niñas resultaron positivos para Ct
(15%). En 5 muestras de hisopado faríngeo y 1 de orina, correspondientes a 6 pacientes, se detectó ADN de HPV (30%) ya sea
utilizando My09/My11 o GP5+/GP6+ y los genotipos encontrados
fueron de bajo riesgo (6 y 11). Dos hisopados faríngeos de niñas
resultaron positivos para Mg (10%). La observación de Tv y el
cultivo para Ng, sólo se practicó en 14 de los 20 niños, resultando negativo en todos los casos al igual que la VDRL que se realizó en 7 pacientes. Sólo en una paciente se diagnosticó coinfección de HPV y Mg en la muestra de hisopado faríngeo. Conclusiones: el aislamiento de un microorganismo de transmisión
sexual en un niño, puede ser el primer indicio de abuso sexual.
Teniendo en cuenta que el 50% de estas infecciones son asintomáticas en los niños, es de gran importancia realizar el diagnóstico y tratamiento precoz para evitar las complicaciones propias
de estas infecciones, permitiendo una mejor calidad de vida en
estos pacientes. Por lo expresado anteriormente, consideramos
que sería necesario profundizar las investigaciones en este tema,
a los fines de aportar datos que sirvan a la implementación de
futuros programas de diagnóstico de ITS en este grupo etáreo.
78
P140 – 27375 - MICROBIOLOGÍA DE LA PERI-IMPLANTITIS.
TOMAS, LEANDRO JUAN
Facultad de Odontología de la U.N.L.P. (Cátedra de Microbiología y Parasitología)
Los implantes dentales oseointegrados, utilizados cada vez más
en nuestro medio, permiten ofrecer a nuestros pacientes prótesis
confortables y funcionales, mejorando así su calidad de vida. La
peri-implantitis se define como un proceso inflamatorio que afecta
a los tejidos que rodean un implante oseointegrado en función y
que produce una pérdida del soporte óseo. El objetivo de este trabajo es mostrar, valorar y discutir los resultados del estudio microbiológico del exudado o del tejido peri-implantario de implantes con
peri-implantitis. Todos estos implantes ya habían sido cargados con
sus respectivas prótesis. De los 16 implantes estudiados, en 14 se
obtuvieron muestras de exudado con puntas de papel estériles que
se introdujeron en la bolsa peri-implantaria. En 2 implantes las
muestras fueron de tejido de granulación peri-implantario. A continuación, las muestras se colocaron en placas de agar-chocolate
con Brain Heart Infusion. Las placas de Petri se introdujeron en un
frasco de vidrio diseñado especialmente para su transporte en un
medio anaerobio. Se realizaron cultivos de anaerobios y de
aerobios para determinar las bacterias predominantes en cada
muestra, practicándose también un antibiograma para establecer
el tratamiento antibiótico de elección en cada paciente. Los
antibacterianos estudiados fueron: amoxicilina, metronidazol y la
combinación de amoxicilina con ácido clavulánico o con
metronidazol. Una vez tomada la muestra, se procedía al tratamiento del implante infectado con la descontaminación de la superficie
del implante, o bien con la extracción del implante afectado si la
pérdida ósea era muy importante. Las bacterias aisladas fueron:
Stomatococcus sp., Prevotella oralis, Peptostreptococcus spp. y
Fusobacterium nucleatum. En 9 muestras fue imposible aislar una
bacteria predominante debido a la complejidad de la flora. Respecto
al resto de muestras, la bacteria predominante fue Stomatococcus
sp. (3), Prevotella oralis (1), Peptostreptococcus spp. (1) y
Fusobacterium nucleatum (2). Los antibiogramas mostraron una
mayor sensibilidad a la asociación de amoxicilina con el ácido
clavulánico, comparada con amoxicilina, metronidazol o una combinación de estos dos últimos antibacterianos. En este trabajo las
bacterias asociadas más frecuentemente a la peri-implantitis fueron: Stomatococcus sp., Prevotella oralis, Peptostreptococcus spp.
y Fusobacterium nucleatum. En ningún caso se aislaron cepas de
Actinobacillus actinomycetemcomitans. Los posibles factores de
riesgo asociados a peri-implantitis en nuestra serie fueron los implantes recubiertos con hidroxiapatita, implantes de 3,25 mm de diámetro y la localización más distal del implante en las prótesis que
rehabilitaban extremos libres edéntulos superiores. El mejor tratamiento de la peri-implantitis es su prevención. Esto se consigue
siendo muy rigurosos durante la fase quirúrgica y protésica. Se
debe realizar previamente un diagnóstico y plan de tratamiento
correctos para determinar el número y la posición ideal de los implantes, según las características y posibilidades de cada paciente. El diseño de la prótesis debe presentar un ajuste pasivo y permitir una buena higiene bucal y un buen control de la placa
bacteriana. Si el paciente presenta alguna parafunción debe tratarse previamente. También es muy importante efectuar controles
periódicos de los pacientes, tanto clínica como radiológicamente.
P141 – 27382 - INFORME PRELIMINAR: FLUCTUACION EN LA
SEROPREVALENCIA DE LEPTOSPIROSIS EN CANINOS EN LA
VILLA 20 DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES. TEALDO, MARTA; FURFARO, ALEJANDRA; GENTILE, ADRIAN; MARIA, NAVARRO OCONNOR; DURE, FRANCISCO; BRAMBATI, DIEGO;
VIDAL, JIMENA; SICCARDI, FERNANDO; DEL RIO, AMANDA;
CAPRA, SILVANA; CALDEVILLA, CECILIA; DE GENNARO, MARIA F; GURY DOHMEN, FEDERICO
Instituto de Zoonosis Luis Pasteur (IZLP)
Introducción: la leptospirosis es una zoonosis que puede afectar a diversos mamíferos, incluido el hombre. En zonas margina-
les existen características favorables para la diseminación de esta
enfermedad: deambular constante de caninos en vía pública, calles de tierra inundadas, acúmulos de basura y presencia de roedores. Objetivo: demostrar la existencia de una mayor prevalencia de leptospirosis canina en barrios carenciados respecto al resto
de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires (CABA) y estudiar su
fluctuación entre 2007 y 2009. Materiales y métodos: se realizó
la prueba de microaglutinación (MAT) en 131 sueros de caninos
extraídos en 2007 y 55 extraídos en 2009, ingresados de enero
a diciembre de 2007 e igual período en 2009. La disminución del
tamaño muestral se debió a que las acciones emergentes del IZLP
se centralizaron en las acciones de foco de lucha contra el dengue, durante la epidemia de dicha enfermedad en 2009. Las
muestras provinieron del “Centro de Salud y Acción Comunitaria
(CeSAC) 18”, localizado en la Villa 20 de la CABA (situada entre
Av. Cruz, Larraya, B y Ordóñez, Miralla, FF. Belgrano y Av. Escalada), visitado regularmente por profesionales de la residencia
de veterinaria en Salud Pública del IZLP. Las muestras del resto
de la CABA se obtuvieron a partir de caninos atendidos en consultorios externos del IZLP y de sueros remitidos por veterinarios
de la actividad privada. Las diferencias estadísticas se establecieron por prueba de X2. Resultados: P (CeSAC 18 2007 vs Resto CABA 2007) < 0,000001, P (CeSAC 18 2009 vs Resto CABA
2009) = 0,037, P(CeSAC 18 2007 vs CeSAC 18 2009) = 0,043,
P(Resto CABA 2007 vs Resto CABA 2009) = 1
Año
Procedencia
Muestras
Muestras
Prevalencia
2007
2007
2009
2009
CeSAC 18
RESTO CABA
CeSAC 18
RESTO CABA
52
38
13
29
79
272
42
205
39,69%
12,26%
23,64%
12,39%
Los resultados demostraron que existe una mayor prevalencia de
la enfermedad en los barrios carenciados, sin duda condicionado
por la particular situación ambiental que padecen. También se
observó una declinación en la prevalencia de leptospirosis en la
Villa 20 en el año 2009, que podría ser explicada, por un lado,
por el menor número de muestras tomadas, y por otro, por el
menor volumen de precipitaciones pluviales durante 2008, lo cual
pudo influir en la disminución de la circulación del agente
etiológico y por lo tanto, influyó probablemente en un menor número de infecciones en caninos. Así, considerando la tasa de
decaimiento de los anticuerpos anti Leptospira interrogans (1 año
de vida media) y el ambiente menos propicio para el mantenimiento y difusión del agente, puede explicarse la reducción de la
seroprevalencia en caninos en la villa 20.
P142 – 27396 - ANÁLISIS DE LAS DERMATOFITOSIS EN UNA
POBLACIÓN PEDIÁTRICA. TURCATO, GABRIELA; VESCINA,
CECILIA; GUIGNO, SILVINA; BETTIOL, MARISA; GATTI, BLANCA MARIA
Hospital de Niños de La Plata. Sor María Ludovica
Introducción: las dermatofitosis o tiñas son infecciones de los
tejidos epidérmicos causados por un grupo de hongos queratinofílicos denominados dermatofitos que se encuentran distribuidos
taxonómicamente en tres géneros: Microsporum (M) Tricho-phyton
(T) y Epidermophyton (E). Estos hongos penetran y parasitan las
estructuras córneas de la piel, pelo y uñas provocando diferentes
presentaciones clínicas que motivan la consulta médica. Objetivo:
analizar la etiología de estas infecciones fúngicas, su localización y
la relación con la edad y el sexo. Metodología: se realizó un estudio
retrospectivo, observacional y descriptivo de 303 muestras de piel,
pelo y uñas,obtenidas de pacientes atendidos en el Servicio de Dermatología del Hospital de Niños de La Plata desde enero de 2008 a
diciembre de 2009. Para el procesamiento de las muestras se utilizaron métodos convencionales realizándose la tipificación de las
colonias obtenidas por macro y micro morfología. Resultados: de las
303 muestras analizadas, en 134 (44.0%) se obtuvieron cultivos
positivos. El 59,7% correspondió al sexo masculino y 40.3% al sexo
femenino. El análisis por edades reveló que el 13.4% de los niños
que adquirieron dermatofitosis eran menores de 3 años, el 29.8%
de 3-5 años, el 37.3% de 5-12 años y el 19.4% mayores de 12 años.
Respecto a la etiología, el 38.0% fue M.cannis, 16.8% T.rubrum, 7.0%
M. gypseum ,7.0% T. mentagrophytes, 6.1% T.verrucosum y 4.4%
T. tonsurans. La localización de las lesiones fue de 48.4% en pelo y
cuero cabelludo, 32.2% en piel lampiña, 15.3% en uñas de pie y 4%
en uñas de mano. M cannis fue el principal agente etiológico de las
dermatofitosis en la población pediátrica, seguido por T. rubrum para
el período 2008-2009. La localización predominante fue el pelo y
cuero cabelludo. Fue mayor el porcentaje de aislamientos en varones que en mujeres. Las dermatofitosis fueron más frecuentes en el
grupo entre 3-12 años, coincidiendo con sus hábitos de juego.
P143 – 27409 - CANDIDIASIS GRANULOMATOSA DE HERIDA
QUIRÚRGICA, POST CIRUGÍA CARDÍACA. MAIOLO, ELENA;
NEGRONI, RICARDO; BIANCHI, MARIO; LEHMANN, ERICA;
ARECHAVALA, ALICIA; SANTISO, GABRIELA; WALKER, LAURA
Hospital Muñiz
Introducción: la cirugía cardiovascular a cielo abierto puede
presentar complicaciones infecciosas. En el caso de reemplazos
de válvulas cardíacas, las más frecuentes son las infecciones de
las válvulas protésicas, las de las heridas quirúrgicas y la mediastinitis, esta última, cuando en producida por candida, se acompaña de deterioro del estado general con una tasa de mortalidad
que varía entre el 40% y 60% y suelen cronificarse cuando comprometen el esternón, los cartílagos costales o presentan cuerpos extraños como los alambres. Objetivos: dar a conocer un caso
de candidiasis de la herida quirúrgica en un paciente diabético que
presentó una mediastinitis como complicación post-quirúrgica.
Pacientes y métodos: paciente del sexo masculino, 67 años, diabético tipo II, con antecedentes de endocarditis bacteriana de
válvula mitral, en 8/2008 se le realizó reemplazo de la misma y
colocación de un marcapasos en un nosocomio de España. Durante su internación recibió muchos tratamientos antibióticos y
hemodiálisis, fue dado de alta en 12/2008 y viajó a la Argentina.
Presentó una mediastinitis post-cirugía, con fístulas, granulomas
para-esternales y osteocondritis, recibió múltiples tratamientos con
antibióticos. En 2/2009 las lesiones se habían cronificado, presentaba febrícula y mal estado general, además había adelgazado
30 kg de peso. Los exámenes de laboratorio fueron: eritrosedimentación 120 mm/h, PCR positiva, glucemia 178 mg%, hemoglobina 11,5 mg%, el resto de los resultados estaba dentro de
parámetros normales. Se realizó un análisis micológico de las
secreciones para-esternales y se aisló Candida albicans. Este
hallazgo fue corroborado por una toma biopsia donde se observaron levaduras y pseudohifas. Se determinó el perfil de sensibilidad mediante Etest con los siguientes resultados: anfotericina B
0,09 µg/ml, fluconazol 0,25 µg/ml, itraconazol 0,01 µg/ml,
voriconazol 0,004 µg/ml y caspofungina 0.25 µg/ml. Resultados:
se comenzó el tratamiento con itraconazol 400 mg/día y a los 45
días se rotó a fluconazol 400 mg/día, por presentar involución
lenta de los granulomas. Evolucionó favorablemente, pero como
no había cicatrizado completamente, se realizó cirugía estética
reparadora pare extraer los alambres de la primera internación en
8/2009. Continuó con fluconazol hasta 2/2010 cuando fue dado
de alta. Conclusiones: una causa frecuente de infecciones postesternotomía son las producidas por levaduras del género
Candida, principalmente cuando se realiza cirugía cardíaca y se
unan los huesos con cerclaje de alambre. Debido a lo no característico de las manifestaciones clínicas, el diagnóstico suele demorarse y evoluciona crónicamente, es recomendable en estos casos,
realizar un examen micológico además del bacteriológico. Para el
tratamiento se eligió itraconazol debido a su buena penetración
ósea y a que la cepa aislada presentó una baja CIM a los azólicos.
Luego de un mes se rotó a fluconazol por presentar una lenta involución de las lesiones. Este antifúngico y la eliminación de los
alambres permitieron una completa recuperación del paciente.
P144 – 27425 - BOTULISMO POR ESCABECHE DE VIZCACHA
EN MENDOZA, ARGENTINA. PAREJA, VIRTUDES; DE JONG,
LAURA I T; FERNANDEZ, RAFAEL A
FCM – Universidad Nacional de Cuyo
79
El botulismo alimentario (BA) es hoy la forma fisiopatogénica
menos frecuente de botulismo humano, posiblemente por ser la
más conocida y las medidas de prevención más populares. En
Mendoza, después de 18 años sin registros, en 2009 se produce
un único caso por ingestión de escabeche de vizcacha (Lagostimus maximus) de elaboración casera. El paciente, masculino de
44 años, manifestó los primeros síntomas 16 h 30 min después
de la ingestión. El alimento tóxico no presentó signos de deterioro que pudieran impedir su consumo. Se recibieron restos del alimento consumido (RAC) y 8 frascos sin abrir y del paciente se
recibieron suero, hisopado rectal (HR) y contenidos gástrico (CG)
e intestinal (CI) (enema). Se investigó toxina botulínica (TBo) en
todos los materiales excepto en HR, y esporas de Clostridium
botulinum (Cb) en todos excepto en suero. Los alimentos
(homogeneizados con su propio líquido), el CI y el CG, se centrifugaron a 10.000xg, 4 °C, 20 min. Los sobrenadantes se reservaron para detección de TBo (bioensayo en ratón por vía IP y
tipificación preliminar por neutralización con antitoxinas polivalentes [ABF] y monoespecíficas [A, B y F]), y el sedimento para la
investigación de Cb (medio de carne picada, inubado a 31°C, 5
días, e investigación de TBo en el sobrenadante centrifugado). De
los cultivos tóxicos se procedió al aislamiento de Cb en medios
sólidos y con las cepas aisladas a producción, titulación y tipificación definitiva de la TBo a nivel de 2.000 DL50/ratón. Resultados: ver Tabla (Ref: NR no realizado). Se detectó TBo A en: RAC,
suero y CI. Se aisló Cb A de: RAC, CI e HR. El pH en el RAC fue
5,04 y en los otros frascos 5,07 a 6,07. El título de TBo fue muy
elevado en RAC (13.632 DL50/ml) y en suero (26 DL50/ml).
Resultados
Alimento
Consumido
Investigación
Toxina
C. botulinum
A
A
No
consumidos
Neg
Neg
Paciente
Suero Contenido Contenido Hisopado
intestinal
gástrico
rectal
A
NR
A
A
Neg
Neg
NR
A
Este es el segundo brote en la historia del botulismo en la
provincia de Mendoza en que un médico se autodiagnostica la
intoxicación al inicio de los síntomas e identifica al alimento responsable. La sospecha precoz, la confirmación rápida por el laboratorio, la instalación inmediata del tratamiento específico con
antitoxina botulínica y el tratamiento de soporte adecuado, son
fundamentales para la recuperación del paciente. En este caso,
no obstante el rápido diagnóstico, la demora en la disponibilidad
de la antitoxina motivó que su administración comenzara aproximadamente a las 40 h de iniciados los síntomas. Aunque la recuperación de la tonicidad muscular fue lenta, la evolución fue
favorable, debiendo necesitar traqueotomía y fisioterapia prolongada. Las buenas prácticas de manufactura para elaborar conservas caseras disminuye la incidencia del BA y el estado de alerta
permanente y la disponibilidad y administración precoz del suero
antitóxico disminuyen la tasa de letalidad.
P145 – 27430 - CEPAS DE INFECCIONES DEL TRACTO URINARIO DE LA COMUNIDAD CON FENOTIPO BLEE EN VILLA MARÍA, CÓRDOBA: UN PROBLEMA EMERGENTE. AIMARETTO,
CLAUDIA(1); RAIMONDI, KARINA(2); CHEGUIRIAN, LAURA(3);
TOLEDO, CRISTINA(4); PEIROTTI, MARIA GABRIELA(5)
(1) Hospital Pasteur, (2) Clínica San Martin CL Esp, (3) Sanatorio Cruz Azul, (4) Laboratorio Gorniz, (5) Clínica G. Marañon
Los bacilos gram-negativos productores de beta-lactamasa de
espectro extendido (BN-BLEE) han sido considerados patógenos
nosocomiales con un alto potencial de diseminación. Sin embargo, desde los años´90 comenzaron a comunicarse aislamientos
procedentes de la comunidad principalmente de infecciones del
tracto urinario (ITU), que constituyen uno de los principales motivos de consulta ambulatoria, por lo que debería realizarse su
búsqueda de manera sistemática. Los objetivos del presente trabajo fueron: determinar la prevalencia y perfil de sensiblidad de
BN- BLEE aislados de ITU de pacientes ambulatorios y documentar su emergencia en la comunidad. Se estudiaron en forma
prospectiva-descriptiva todos los urocultivos procedentes de pa-
80
cientes ambulatorios de 6 instituciones de salud de la ciudad de
Villa María: 1 pública y 5 privadas, durante el período comprendido entre noviembre de 2009 hasta abril de 2010. El procesamiento se llevó a cabo por métodos convencionales. A los aislamientos jerarquizados se les realizó pruebas de sensibilidad
antibacteriana por el método de difusión con disco que se interpretaron según normas del Clinical Laboratory Standards Institute
(CLSI). La confirmación de BLEE se determinó por método de
doble disco. El análisis estadístico de los datos se realizó utilizando tests de chi cuadrado y U de Mann-Whitney. De un total de
2812 urocultivos se jerarquizaron 653 (23%), de los cuales 19
fueron cepas productoras de BLEE con una prevalencia del 2,9%.
Del total de BN- BLEE, 17 correspondieron a enterobacterias (11
Escherichia coli, 4 Klebsiella pneumoniae, 1 Enterobacter spp., 1
Proteus mirabilis) y 2 Pseudomonas aeruginosa. La resistencia a
ciprofloxacina (CIP) fue significativa en los BN-BLEE (p=0,038)
mientras que para nitrofurantoina y cotrimoxazol no se obtuvo
diferencia estadística (p=0,804 y p=0,534 respectivamente). Este
es el primer estudio multicéntrico sobre prevalencia de BLEE en
la comunidad de Villa María. Los laboratorios participantes nuclean
a un sector mayoritario de la población de la ciudad y zona de
influencia. Detectamos una prevalencia del 2,9% de BN-BLEE, con
una resistencia acompañante a CIP estadísticamente significativa. La emergencia y diseminación de estos microorganismos en
la comunidad es un hecho inevitable. Por lo que una adecuada
detección de los mecanismos de resistencia es responsabilidad
del laboratorio de microbiología, siendo esencial para conocer la
verdadera dimensión del problema que representan, limitar su diseminación y adecuar las opciones terapéuticas.
P146 – 27432 - SEROVARIEDADES DE Salmonella spp. EN ARGENTINA, 2007-2009. CAFFER, MI (1); ALCAIN, A (1); PANAGOPULO, M (1); MORONI, M (1); BRENGI, S (1); TERRAGNO, R (1)
(1) Servicio Enterobacterias, INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”
La salmonelosis es una zoonosis de importancia en salud
pública, debido al impacto socioeconómico que ocasiona tanto en
países en desarrollo como en los desarrollados. Su distribución
es mundial, con variaciones en las serovariedades entre países,
porque se encuentra influenciada por factores como: clima, densidad poblacional, prácticas agroganaderas, técnicas de elaboración de los alimentos y hábitos de consumo. El objetivo de esta
comunicación, continuando con la vigilancia desde el laboratorio,
es presentar los datos de prevalencia de Salmonella spp. en aislamientos de origen humano, animal, de alimentos para consumo de ambos y del medio ambiente, en el trienio 2007-2009. En
este período, en el Laboratorio Nacional de Referencia, se estudiaron 2814 aislamientos de Salmonella spp., siendo el número
superior en un 19.7 %, al del trienio anterior (n=2350). Del total
de aislamientos recibidos 1460 (51.9%) fueron de origen humano, 420 (14.9%) de animales, 506 (18.0%) de alimentos, 344
(12.2%) de alimentos para animales, 84 (3.0%) del ambiente.
Todos fueron confirmados por pruebas bioquímicas y la determinación de las serovariedades se realizó por serotipificación utilizando antisueros provistos por el Servicio Antígenos y Antisueros,
del Instituto Nacional de Producción de Biológicos. Las tres
serovariedades prevalentes en humanos fueron: S. Typhimurium,
n=559, seguida por S. Enteritidis, n=338 y S. Newport, n=121, lo
que significó un cambio en el orden de frecuencia respecto del
período 2004-2006, en que el mismo fue: S. Enteritidis, S.
Typhimurium y S. Infantis. En animales las serovariedades aisladas con mayor frecuencia, fueron S. Typhimurium, n=75 y S.
Enteritidis, n=35; en alimentos S. Typhimurium, n=125 y S.
Anatum, n=51; en alimentos para animales S. Montevideo, n=40
y S. Agona, n=27 y en el ambiente S. Livingstone, n=30 y S.
Mbandaka, n=14. En este período, se tipificaron 109 serovaridades
diferentes considerando todas las fuentes y por primera vez en
Argentina S. Brandenburg, S. Benfica, S. Bareilly, S. Coeln, S.
Irumu, S. Oslo, S. Sundsvall, S. Stanleyville, S. subespecie IV
43:z4:z23:-.y S. subespecie IV 21:z4, z23:- En este trienio se registraron 11 brotes causados por Salmonella spp.: 6 fueron por
S. Enteritidis, 2 por S. Newport, 2 por S. Typhimurium y 1 por S.
Thompson. De los resultados obtenidos, podemos concluir que S.
Typhimurium fue la serovariedad que se aisló con mayor frecuencia en humanos, en animales y en alimentos, desplazando a S.
Enteritidis del primer lugar en aislamientos de origen humano,
como lo venía haciendo desde 1987. Mientras que en alimentos
para animales la serovariedad prevalente fue S. Montevideo y en
el ambiente S. Livingstone. Merece destacarse que aunque estos datos no representan la totalidad de los aislamientos de
Salmonella spp. en Argentina, tienen importancia para el monitoreo de esta zoonosis, ya que a pesar de la necesidad creciente
de mejorar la calidad de los alimentos, aún no se logra su control
a nivel mundial.
P147 – 27437 - HEMOCULTIVOS AUTOMATIZADOS: EVALUACION DE DIEZ MESES. DECCA,L; RIVAROLA,M; MORENO,
G;SACHETTA, M; MARINO, M; RIERA, F
Clínica del Sud. Córdoba
Las infecciones del torrente sanguíneo tienen una alta tasa de
morbi-mortalidad. El hemocultivo (HC) seriado es una de las
muestras más importantes remitidas al laboratorio de microbiología, por su valor diagnóstico y su implicancia en el posterior manejo del paciente. El objetivo de este trabajo fue evaluar el rendimiento del sistema automatizado de monitoreo continuo utilizado, conocer la frecuencia de aislamiento de los microorganismos
(MO) causantes de bacteriemias y fungemias, y los patrones de
resistencia (R) a los antimicrobianos (ATM) habitualmente usados.
Se realizó un estudio observacional descriptivo en el que se incluyeron todos los hemocultivos realizados a pacientes pediátricos
y adultos que concurrieron a nuestro sanatorio entre agosto de
2009 y mayo de 2010. Las muestras fueron procesadas en el sistema automatizado Bactec 9050 (Becton Dickinson), los aislamientos se identificaron según esquemas de pruebas bioquímicas convencionales y los estudios de sensibilidad se realizaron por métodos de difusión y/o dilución según normas del Clinical Laboratory
Standars Institute (CLSI). Se analizaron en total 1176 botellas
correspondientes a 618 pacientes (13% pediátricos). Del total de
HC, 203 (17.3%) fueron positivos, 60% de los frascos dió señal
positiva antes de las 15 h y 75% antes de las 20 h de incubación.
Del total de los aislamientos, 115 (56.6%) correspondieron a cocos gram-positivos, 58 (28.6%) a enterobacterias (EB), 14 (6.9%)
a bacilos gram-negativos no fermentadores (BNF), 6 (3.0%) a levaduras y 10 (4.9%) resultaron ser contaminantes. Dentro de los
gram-positivos el MO más frecuente fue Staphylococcus aureus
(Sau) (n=71, 35%), seguido por estafilococos coagulasa-negativa (n=12, 5.9%), Streptococcus pneumoniae (n=12, 5.9%),
Enterococcus faecalis (n=10, 4.9%), estreptococos grupo viridans
(n=8, 3.9%) y estreptococos beta hemolítico (n=2, 1.0%). En las
enterobacterias el primer lugar correspondió a Escherichia coli
(n=38, 18.7%), seguido por Enterobacter cloacae (n=10, 4.9%),
Klebsiella pneumoniae (n=6, 3.0%), otras enterobacterias (n=4,
2.0%). Pseudomonas aeruginosa (n=14, 6.9%) fue el único representante de los bacilos no fermentadores. Dentro de las levaduras, Candida albicans (n=5, 2.5%) y Candida tropicalis (n=1,
0.5%). En Sau se observó 42% de R a meticilina. S. pneumoniae
mostró 100% de sensibilidad a penicilina. El 35.5% de las EB fue
productor de beta lactamasa de espectro extendido. Pseudomonas
aeruginosa tuvo 33.3% de R a carbapenemes. La rapidez en la
detección de positividad en el HC automatizado es una de las
principales ventajas del sistema de monitoreo continuo. El porcentaje de HC positivos hallado en nuestro trabajo es similar a lo
reportado en bibliografía. En esta serie los cocos gram-positivos
fueron los MO aislados con mayor frecuencia y dentro de éstos
Sau fue el más prevalente. Destacamos la importancia y utilidad
de conocer la epidemiología de cada lugar, como así también los
patrones de sensibilidad de los MO involucrados, a fin de poder
instaurar de manera temprana un esquema antimicrobiano empírico orientado.
P148 – 27444 - CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE AISLAMIENTOS DE Echinococcus spp. (SENSU LATO) OBTENIDOS
DE HOSPEDADORES INTERMEDIARIOS EN LA PROVINCIA DE
NEUQUÉN, ARGENTINA. SORIANO, SV (1); PIERANGELI, NB
(1); PIANCIOLA, LA (2); MAZZEO, M (2); LAZZARINI, LE (1);
KOSSMAN, AV (1); BERGAGNA, HFJ (3); CHARTIER, K (4);
BASUALDO, JA (5)
(1) Facultad de Ciencias Médicas – UNCO, (2) Subsecretaría de
Salud de Neuquén (3) Zoonosis Municipalidad de Neuquén, (4)
Municipalidad Chos Malal, (5) Facultad de Ciencias Médicas UNLP
Introducción: la echinococcosis quística es una zoonosis altamente endémica en Neuquén, Argentina, a pesar de existir un
programa provincial de control desde 1970. Echinococcus granulosus sensu lato existe como un complejo de diferentes variantes
genéticas (G1 a G10) que en la actualidad se ha propuesto agrupar en: E. granulosus sensu stricto (G1 a G3), E. equinum (G4),
E. ortleppi (G5), y E. canadensis (G6 a G10). Estos genotipos pueden diferir en características fenotípicas que son importantes en
las estrategias de control. Si bien la cepa G1 es predominante en
infecciones humanas, estudios previos han demostrado que la
infección humana por cepa G6 es frecuente en Neuquén. El objetivo de este trabajo fue analizar quistes hidatídicos (QH) de diferentes hospedadores intermediarios para identificar los posibles
reservorios locales de cepa G6. Materiales y métodos: se obtuvieron QH de oveja (n=16), cabra (n=23) y cerdo (n=18) en mataderos provinciales. Se investigó la fertilidad (definida como presencia de protoescólices) de cada QH y el porcentaje de viabilidad en los QH fértiles (por coloración vital de protoescólices con
Azul Tripán al 0,4%). Se definió como aislamiento a protoescólices
o membrana germinal de cada QH individual. Se extrajo el ADN,
se amplificó por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
una región del gen de citocromo oxidasa (cox1) y se secuenció
por métodos standard. Resultados: fertilidad: 78,6%; 90,5%;
94,4% y viabilidad: 45,0%; 73,9%; 81,5% para los QH de origen
ovino, caprino y porcino respectivamente. Genotipos: oveja=G1
(15/16) con algunas microvariantes y G3 (1/16); cabra=G6 (21/23)
y G1 (2/23); cerdo=G7 (18/18). Discusión: se detectaron 4
genotipos diferentes correspondientes a E. granulosus sensu
stricto (G1 y G3) y E. canadensis (G6 y G7) lo cual indica una
compleja epidemiología para el género Echinococcus en nuestra
región. El genotipo G3 fue identificado por primera vez en Argentina y en Sudamérica. La distribución de los genotipos sugiere
asociación con la especie de hospedador intermediario involucrado. Considerando que E. canadensis (genotipo G6) fue detectado solamente en cabras, que la fertilidad y viabilidad de los QH
caprinos fue elevada y que la cría de este ganado es la principal
actividad económica en zonas rurales de la provincia podemos
concluir que el ganado caprino actúa como reservorio del genotipo
G6 en la provincia de Neuquén. Estudios posteriores que
involucren mayor número de ejemplares y otros potenciales hospedadores intermediarios como bovinos y animales autóctonos
serían necesarios para determinar si otra especie puede también
cumplir el rol de reservorio local de E. canadensis genotipo G6.
P149 – 27445 - UTILIDAD DE LA DETERMINACIÓN DE ADENOSINA DEAMINASA EN EL DIAGNÓSTICO DE TUBERCULOSIS
PLEURAL. ZAPATA, ALEJANDRA; SUAU, MATILDE; ASQUINEYER, YANINA; BALDINI, MATIAS; LUQUE, GRACIELA
Hospital Posadas
Introducción: la tuberculosis (TBC) pleural es la principal forma de TBC extrapulmonar en nuestro medio. Durante el periodo
2007 a 3/2010 sobre un total de 690 muestras con cultivo positivo para Mycobacterium tuberculosis (pulmonares y extrapulmonares) la localización pleural represento un 8,1% (n= 56). Las dificultades en la confirmación bacteriológica de TBC pleural debido a la baja sensibilidad del cultivo del líquido pleural (LP ) y la
demora del mismo que aun con métodos rápidos es de aproximadamente 20 días, nos han llevado a implementar métodos diagnósticos complementarios, como es el dosaje de adenosina deaminasa (ADA) en líquidos pleurales. La adenosina deaminasa es
una enzima liberada por linfocitos durante la etapa de modulación de la respuesta inmune inflamatoria. El nivel de ADA en el
LP refleja la presencia de células en el compartimiento pleural,
81
principalmente de linfocitos T activados. Objetivo: evaluar la utilidad del dosaje de ADA en líquidos pleurales por el método de
Galanti Giusty, como herramienta diagnóstica de TBC pleural en
nuestro medio. Materiales y métodos: en el período 4/2007 a 4/
2010 se procesaron 238 muestras de LP de pacientes con derrame pleural y diagnóstico presuntivo de TBC pleural. Las muestras fueron centrifugadas 15min a 3000rpm, el sedimento fue sembrado en medio líquido (MB/Bact) e incubadas a 37° durante 45
días. Los cultivos positivos se detectaron en un tiempo promedio
de 20 días e identificados por NAP test. El sobrenadante se almacenó a -20° para el dosaje de ADA por el método de Galanti
Giusty (se procesaron todas las muestras por duplicado) utilizándose un valor de corte de 60 u/l. Resultados: pacientes (n): ADA
+ cultivo+ 43, ADA + cultivo- 23, ADA- cultivo + 5, ADA- cultivo167. En el grupo de pacientes con ADA+y cultivo-, 8 de ellos tuvieron confirmación diagnóstica, ya sea por anatomía patológica
o por la evolución favorable tras instaurar el tratamiento antituberculoso. En los 15 pacientes restantes los diagnósticos definitivos fueron: linfomas: 5, empiemas: 6, NMN: 2. Otros 2 casos
tenían epidemiología para TBC (1 contacto, otro TBC previa), con
abandono de tratamiento, por lo que se excluyeron de este análisis. Sobre el total de 238 pacientes la confirmación bacteriológica
se obtuvo en 48 casos (20%) (LP y/o BP). 1) ADA+TBC + 51 2)
ADA+TBC- 13 3) ADA-TBC + 5 4) ADA-TBC- 167. Sensibilidad:
91%, especificidad: 93%, VP +: 80%, VP -:97%. En el grupo de
pacientes con ADA- y cultivo+ (falsos negativos) los valores de ADA
fueron: 1) 51 2) 46 3) 25 4) 17 5) 41. La determinación de ADA en
LP es un método sensible y específico que contribuye al diagnóstico de TBC pleural. Las principales ventajas son: rapidez, bajo costo, fácil ejecución, destacándose su alto valor predictivo negativo
(VPN). En el caso de valores positivos es necesario hacer un diagnóstico diferencial con otras enfermedades que también producen
una elevación de la enzima (ej: neoplasias, empiemas).
P150 – 27446 - COMPLEJO Burkholderia cepacia Y HEMODIÁLISIS. PREDARI, SC (1); CASTAÑEDA, NC (2); DE PAULIS, AN
(1); SANTOIANNI, JE (1); GUTIERREZ, MA (1); AGUIRRE, C (1);
CENTRON, D (2)
(1) Instituto de Investigaciones Médicas A. Lanari-UBA; (2) Facultad de Medicina-UBA.
Introducción: el complejo Burkholderia cepacia (CBC) está
constituido por 17 genoespecies. Son patógenos oportunistas de
distribución ubicua, sobreviven en el suelo, en el agua y se multiplican en medios con requerimientos nutricionales mínimos.
Objetivo: partir del aislamiento de genoespecies del CBC en los
hemocultivos (HEM) de pacientes con bacteriemia intradiálisis, en
el agua tratada y en el baño de diálisis, se investigó si existía alguna relación clonal o algún clon predominante que permitiese
detectar el/los reservorios para establecer estrategias de prevención y control. Materiales y métodos: en el período 2006-2009, se
identificaron 36 aislamientos del CBC, a. Fenotípicamente: bacilos gram-negativos, móviles, oxidasa y catalasa (+), oxidadores
de glucosa y manitol, LDC y ONPG (+). En el medio Reasoner
presentaron un característico color verde limón. b. Tipificación
molecular: se realizó extracción de ADN, PCR del gen recA y
secuenciación del fragmento de 385 pb; análisis de las secuencias por alineamiento en la base de datos BLAST y el análisis
genotípico por RAPD. Cebadores: Bur3 y Bur4. Resultados: de
los 36 aislamientos del CBC, en el período 2006-7, 10 correspondieron a la genoespecie B. cepacia, RAPD I (6), II, XI y XVI aislados de HEM y del agua tratada. A partir de 09-2007 se detectaron 7 combinaciones B. cepacia + B. contaminans en los HEM de
4 pacientes, en el baño de diálisis y en el agua tratada. Burkholderia spp.: 8 aislamientos del agua tratada y 1 de HEM. B.
contaminans: 5 aislamientos, 2 de HEM, RAPD III y XVI; 2 de agua
tratada, RAPD II y V y del hisopado de la válvula del tanque de
almacenamiento chico, RAPD V. B. lata: 2 aislamientos a partir
de 04-2008, provenientes de HEM y del hisopado del tanque chico, ambos RAPD III. B. cenocepacia: 2 aislamientos a partir de
05-2009, del agua tratada RAPD VII y del baño de diálisis, RAPD
VIII. B. stabilis: de 1 HEM, RAPD XX. Conclusiones: 1. A través
del tiempo se detectó la aparición de nuevas genoespecies. 2. Si
82
bien las bacteriemias intradiálisis fueron esporádicas, durante 3
años se detectaron las mismas genoespecies y patrones RAPD
relacionados en los pacientes, en los baños de diálisis, en el agua
tratada y entre algunos pacientes. 3. Las genoespecies halladas
en los hisopados del tanque de almacenamiento chico fueron: B.
cepacia, B. contaminans y B. lata. 4. Luego de desactivado, no se
volvieron a detectar bacteriemias intradiálisis por ninguna genoespecie de Burkholderia. 5. Probablemente, el reuso y el lavado
de los filtros de diálisis con el agua tratada haya sido uno de los
factores responsables de las bacteriemias intradiálisis, asociado a
la extraordinaria capacidad de supervivencia de las genoespecies
de Burkholderia en el agua tratada y en el baño de diálisis. 6. Se
destaca la importancia del monitoreo permanente de la calidad del
agua de las centrales de hemodiálisis (agua de red, agua tratada
y de los baños de diálisis), minimizar los tanques de almacenamiento de agua y extremar los procesos de desinfección.
P151 – 27449 - EMERGENCIA DE Klebsiella pneumoniae RESISTENTE A COLISTINA (KPN-R-COL) EN UN HOSPITAL
INTERZONAL DE AGUDOS. TOGNERI, ANA (1); FACCONE,
DIEGO (2); PODESTA, LAURA (1); PEREZ, MARCELA (1); CORSO, ALEJANDRA (2)
(1) HIGA EVITA, (2) Instituto INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”
La prevalencia de Kpn-R-COL en 376 aislados del Htal. EVITA entre 2007 y 2009 fue: 0(2007), 0.7 (2008) y 3.6 (2009). Entre octubre de 2009 y enero de 2010 se detectaron 8 aislados de
K. pneumoniae (Kpn) con halos de inhibición para colistina (COL)
<9mm (Kirby-Bauer), confirmados como resistentes por E-Test
(CIM90 = 48µg/ml). Debido a que los casos se detectaron en un
corto periodo de tiempo, se quiso establecer el nexo epidemiológico y la relación genética entre las Kpn-R-COL. Objetivos: evaluar la relación genética de los Kpn-R-COL aislados, establecer
el vínculo epidemiológico y analizar el posible impacto del uso de
COL en esta emergencia. Materiales y métodos: ante la sospecha de trasmisión horizontal de Kpn-R-COL, se analizó retrospectivamente las información disponible en los registros bacteriológicos de las Kpn desde enero/2007 a enero/2010, se revisaron
las solicitudes de antibióticos de uso restringido de 2009, la documentación microbiológica en los pacientes tratados con COL y
el consumo de COL durante 2009, calculando la dosis diaria definida (DDD). Seis de 8 Kpn-R-COL estuvieron disponibles para
estudios de tipificación molecular. Se empleó la técnica de
electroforesis en campo pulsado (PFGE) con XbaI. Resultados:
las 8 Kpn-R-COL, correspondientes a 5 pacientes, se aislaron de
(n): sangre (2), aspirado traqueal (2), orina (3) y absceso de partes blandas (1). Por medio de PFGE los 6 aislados estudiados se
pudieron diferenciar en 2 tipos clonales: A y B. El clon A fue dominante en la muestra remitida, representando 4/6 Kpn. Dentro
del clon A se diferenciaron 4 subtipos clonales genéticamente
relacionados: A1, A2, A3 y A4. Al investigar la existencia de vínculo epidemiológico, los 4 pacientes con aislados del clon A compartieron facilidades hospitalarias durante su internación en terapia intensiva y clínica médica. Los 2 aislados del clon B, provenían de muestras de partes blandas y orina del mismo paciente
que procedía de otra institución. Durante 2009, 54 pacientes recibieron COL: 28 con documentación microbiológica para el uso
(52%) por infecciones nosocomiales (IN) por Acinetobacter
baumanii o Pseudomonas aerugniosa multirresistentes y 26 (48%)
administrado en forma empírica. De estos últimos, en 13 pacientes (50%) se confirmó posteriormente a la administración de COL,
el aislado de gérmenes multirresistentes que avalaron su uso. En
el otro 50% no se obtuvo rescate microbiológico o el uso de COL
no estaría justificado. En 41%(22/54) de los pacientes medicados
con COL se documentaron aislados naturalmente resistentes al
antibiótico posteriores al inicio del tratamiento (n): Serratia
marcescens (4), Proteus vulgaris (6), Morganella morganii (1),
Enterococcus faecium (5), Staphylococcus aureus (4), más dos
casos con Kpn-R-COL. El uso de COL en los trimestres de 2009
expresado en n° de DDD/días/trimestre fue: 1.4, 0.7, 2.1 y 1.8 respectivamente. El aumento de Kpn-R-COL en 2009 y la detección
de un brote cronológicamente posterior al incremento del uso de
CO, deben ser tomados como marcadores de la presión de se-
lección causada por este antibiótico. Se hace necesario optimizar
el uso de COL y maximizar las medidas de prevención y control
de IN para evitar la emergencia y diseminación de estos gérmenes multirresistentes.
P152 – 27457 - ESPECIES DE Malassezia EN LA BIOTA NORMAL
DE PIEL Y EN DERMATITIS ATÓPICA. SOSA, M A (1); ROJAS, F D
(1); BLANCO, N S (1); MANGIATERRA, M L (1); GIUSIANO, G E (1)
Instituto de Medicina Regional - UNNE
El género Malassezia es miembro de la microbiota cutánea
normal humana. Bajo la influencia de ciertos factores puede volverse patógeno y asociarse a distintos desórdenes dermatológicos. En algunos casos actúa como factor exacerbador, por ejemplo en la dermatitis atópica (DA). La DA es considerada una
reactividad cutánea anormal a alergenos, favorecida por una predisposición genética. Los objetivos de este estudio fueron: comparar la prevalencia de las especies de Malassezia en DA y en
biota normal de piel (BN) y establecer la distribución de las especies de acuerdo al sitio de la lesión. Las muestras fueron obtenidas por raspado de piel de cara (ca), cuero cabelludo (cc) y tronco (tr). Se sembraron en medio de Agar Dixon y se incubaron
durante 7 días a 32 °C. Se aislaron 91 cepas de Malassezia, 41
provenientes de lesiones de DA (ca: 14, cc: 7, tr: 20) y 50 de BN
(ca: 4, cc: 14, tr: 32). La tipificación de las especies de Malassezia
se realizó por la técnica PCR-RFLP. La extracción de ADN de las
levaduras aisladas se llevo a cabo por shock térmico. El ADN
obtenido se amplificó con los cebadores descriptos por Mirhendi
et al. (5´-TAA CAA GGA TTC CCC TAG TA -3´ y 5´-ATT ACG
CCA GCA TCC TAA G -3´). El programa de amplificación incluyó
una desnaturalización inicial a 94 °C (5 min), seguida por 30 ciclos de 94 °C (45 seg), 55°C (45 seg) y 72 °C (1 min), con una
extensión final a 72°C (7 min). Los productos de la PCR fueron
sujetos a RFLP (análisis del polimorfismo en la longitud de los
fragmentos de restricción) usando las enzimas de restricción Cfo
I (Promega) y Mbo I (Fermentas). Los fragmentos digeridos fueron separados por electroforesis en gel de agarosa al 2,5 % a 96
V durante 90 minutos y revelados con bromuro de etidio (0.5 µg/
ml). De las lesiones de DA se obtuvieron 37 cepas como agente
único y 4 cepas distribuidas en 2 asociaciones. La distribución de
las especies fueron: M. globosa (39%), M. furfur (29.3%), M.
sympodialis (19.5%), M. restricta (4.9%), M. slooffiae (4.9%) y M.
pachydermatis (2.4%). De piel sana se obtuvieron 50 cepas como
agente único. La distribución de las especies fueron: M. globosa
(36%), M. furfur (18%), M. sympodialis (42%), M. restricta (4%).
Nuestros resultados sugieren: a) que las condiciones de la piel
atópica favorecen a una mayor diversidad de especies de
Malassezia, especialmente en zonas de tronco b) que M. globosa
encuentra un nicho ecológico propicio en ambos tipos de piel siendo la cepa dominante en cuero cabelludo c) que el desequilibrio
inmunológico cutáneo favorecería el establecimiento de M. furfur
y d) que las condiciones de la piel sana favorecen el desarrollo
de M. sympodialis. Es destacable el aislamiento de M. pachydermatis en una lesión de DA ya que esta especie es primariamente
zoofílica. La ecología del género Malassezia y el rol que cumple
cada especie en alteraciones de la piel se encuentra todavía en
estudio. Este trabajo es una contribución a este conocimiento.
P153 – 27459 - EPIDEMIOLOGÍA DE LOS BACILOS GRAM-NEGATIVOS NO FERMENTADORES DE GLUCOSA RESISTENTES
A CARBAPENEMES EN UN HOSPITAL POLIVALENTE DE LA
CIUDAD DE CÓRDOBA. MINOLI, M J (1); MUÑOZ, M S (1);
TOMASINI, A (1); AIASSA, M S (1); PERLO, O E (1)
Hospital de Córdoba
En los últimos años, la atención médica se ha enfocado en los
bacilos gram-negativos no fermentadores de glucosa (bnnf) por
su frecuencia cada vez mayor en las infecciones nosocomiales.
El excesivo uso de carbapenemes ha provocando brotes con
microorganismos con resistencia natural y otros bacilos gram-negativos con resistencia adquirida a carbapenemes por presión
selectiva. Esta fuerte presión antibiótica en áreas críticas, así como
medidas deficientes o ausentes de control de infecciones
intrahospitalarias son importantes factores de riesgo para la adquisición de resistencia llevando a un gran impacto clínico y
epidemiológico. Nuestro objetivo fue analizar la situación en nuestra institución en los últimos años para conocer el perfil de
microorganismos resistentes a los carbapenemes, porcentaje de
resistencia, el perfil de resistencia a todos los antibacterianos (atb)
ensayados en cada año en la especie predominante, fenotipos de
resistencia y sitios de aislamiento, para ayudar a elegir terapias
empíricas que ofrezcan mayor cobertura antibiótica hasta tener el
informe microbiológico final. Materiales y Métodos: se realizaron
tres cortes de prevalencia para analizar los bnnf resistentes a
carbapenemes aislados de muestras clínicas y ambientales en el
hospital: año 2007, 2008 y 2009. Fueron identificados por el Sistema Automatizado Vitek (bioMérieux) y por pruebas bioquímicas
manuales. La sensibilidad antibiótica fue determinada por Vitek y
método Kirby-Bauer de difusión en agar. La especie predominante
que presentó resistencia a ambos carbapenemes fue Acinetobacter baumannii complex (abc) encontrándose también otras
como Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Acinetobacter spp., Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia,
Cryseobacterium indologenes. El porcentaje de resistencia anual
representa el 46.39%, 53.40% y 79% del total de los aislamientos de abc en los respectivos años. La frecuencia de resistencia
anual a todos los atb ensayados a lo largo de los tres períodos
fué 49%, 77% y 81% para imipenem y 47%, 77% y 83% para
meropenem. Trimetoprima-sulfametoxazol sigue la misma tendencia llegando a 93% de resistencia, ciprofloxacina, cefepima,
ceftacidima, piperacilina-tazobactama, ampicilina-sulbactama y
amicacina se mantienen en porcentajes altos. Minociclina, colistina
y tigeciclina oscilan alrededor de 0%. No se detectaron metalo ßlactamasas por el método de doble disco con EDTA, tampoco de
carbapenemasas tipo oxa. Estos microorganismos se aislaron
predominantemente en orinas, puntas de catéter y muestras respiratorias. La resistencia a carbapenemes muestra un aumento,
por lo que estamos frente a la pérdida de una excelente opción
de amplio espectro. Minociclina y tigeciclina son buena elección.
No tenemos confirmada la presencia de ninguna MßL por métodos fenotípicos, tampoco de carbapenemasas tipo oxa. Estos
microorganismos aparecen predominantemente en orinas, puntas
de catéter y muestras respiratorias, lo que demuestra la necesidad de vigilar factores de riesgo conocidos como sondas vesicales, catéteres y asistencia respiratoria mecánica y tomar medidas de control hacia ellos.
P154 – 27463 - PREVALENCIA DE ENTEROBACTERIAS EN UN
HOSPITAL DE ADULTOS. RANTICA, NOELIA (1); MUÑOZ,
VERÓNICA (1); AGUIRRE, ALINA (1); PINO, GLADYS (1); D’
ANDREA, ELENA (1)
Nuevo Hospital San Roque. Córdoba
La diarrea es una de las causas más comunes de morbilidad
y mortalidad en países subdesarrollados constituyendo un verdadero problema de salud pública. Los estudios epidemiológicos
permiten implementar medidas de control y prevención. Se realizó un estudio retrospectivo en pacientes adultos en el Nuevo
Hospital San Roque de Córdoba, Argentina, que presentaron gastroenteritis entre octubre del 2007 y mayo del 2010 con el propósito de establecer la prevalencia de enteropatógenos; observar la
relación entre la reacción inflamatoria y agentes etiológicos aislados y evaluar la resistencia antimicrobiana. Mediante el análisis directo de muestras de materia fecal diarreicas se determinó
la presencia de polimorfonucleares, hematíes, parásitos y levaduras. La coloración de los extendidos con fucsina básica al 0.1%
permitió detectar formas compatibles con Campylobacter spp.. Se
cultivaron en agar Mac Conckey, caldo selenito y medio selectivo
para salmonella y shigella tipificando los aislamientos sospechosos por pruebas convencionales. Las materias fecales sanguinolentas se cultivaron en Mac Conckey sorbitol para buscar
Escherichia coli enterohemorrágica. Se llevaron a cabo antibiogramas según normas CLSI y se derivó a centros de referencia
para la serotipificación correspondiente. Del total (n=491) de las
muestras de materia fecal analizadas 38.3% (n=188) tuvieron res-
83
puesta inflamatoria (recuento de leucocitos mayor a 5/c 400X), de
los cuales 34.6% (n=65) presentaron enterobacterias patógenas.
El 12% (n=57) del total tuvieron cultivo positivo para agentes
causales de diarrea, que se repartieron entre Shigella spp. 61%
(n=35), Salmonella spp. 37% (n=21) y por último un 2% (n=1) E.
coli enteroinvasiva. La investigación de Campylobacter spp. se
efectuó a través de examen directo debido a que no se realiza
cultivo de rutina para este germen. Se observaron formas compatibles con Campylobacter spp. en un 5% (n=25) de los casos.
Se detectaron 29 cepas con algún tipo de resistencia antimicrobiana, en el 90% (n=26) fueron Shigella spp. resistente a
ampicilina (AMP) y trimetoprima-sulfametoxazol (TMS) y solo dos
cepas de Salmonella spp. a AMP, TMS, ácido nalidíxico y cloranfenicol. De las cepas de Salmonella spp. encontradas, dos hicieron bacteriemia con evolución fatal. El 80% de las muestras con
enteropatógenos presentaron respuesta inflamatoria y un 5% formas compatibles con Campylobacter spp. El principal agente
etiológico encontrado en las diarreas procesadas fue Shigella spp.,
predominando la especie Shigella sonnei 34% (n=12) sobre la
especie Shigella flexneri 20% (n=7); los serotipos del género
Salmonella spp. recuperados con mayor frecuencia fueron
Salmonella Enteritidis y Salmonella Typhimurium 10% (n=2), sobre Salmonella Amatum y Salmonella Cervallis 5% (n=1). Si bien
en el paciente adulto, generalmente, los casos de diarrea se resuelven sin complicaciones, consideramos importante pautar
lineamientos en el manejo terapéutico, los cuales ayudarían a
mejorar la calidad sanitaria en el manejo hospitalario.
P155 – 27472 - AISLAMIENTO DE Paracoccidiodes brasiliensis
EN UN PACIENTE PORTADOR DEL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA. ERBIN, MARIANA (1); TUTZER, SILVIA
(1); BOZANO, CLAUDIA (1); BERMEJO, VERONICA (2); ELBERT,
GABRIELA (2); KAUFMAN, SARA (1); GUELFAND, LILIANA (1)
(1) Sección Microbiología y (2) División Infectología del Hospital
General de Agudos J.A. Fernandez
La paracoccidioidomicosis (PM) es una micosis sistémica endémica producida por un hongo dimorfo el Paracoccidiodes
brasiliensis (Pb). La distribución geográfica de esta micosis es
restringida a América latina, en particular a Sudamérica. Afecta
fundamentalmente a pobladores rurales de regiones de clima
subtropical y no presenta asociación con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), de acuerdo a la baja frecuencia publicada. Presentación del caso clínico: paciente de sexo masculino de 27 años, oriundo de Paraguay, VIH + desde enero de 2009
en tratamiento con antirretrovirales, pero con seguimiento irregular. Consultó por fiebre, dolor abdominal de dos meses de evolución y dificultad respiratoria. Al examen físico se observó adelgazamiento, adenopatías generalizadas a predominio de región
latero cervical derecha, escasas lesiones de piel de tipo pápulas
umbilicadas, hepatoesplenomegalia y su radiografia de tórax reveló infiltrado nodulillar bilateral. Los datos de laboratorio mostraron: CD4: 10 células /mm3, anemia normocítica normocrómica,
transaminasas, FAL y LDL elevadas, VSG 75 mm, HBV, HCV,
VDRL, CHAGAS negativos. Se solicitó estudio microbiológico para
gérmenes comunes, micobacterias y micológico de punción de
ganglio, escarificación de lesiones de piel y esputo. En los exámenes en fresco se visualizaron elementos esféricos de tamaños
variables con paredes gruesas y doble refringencia, algunos presentaron brotes múltiples con aspecto de “rueda de timón” y otros
en cadenas, patognomónicos de Pb. En la coloración de Giemsa
se observaron estructuras similares pero coloreadas en forma irregular. El cultivo fue positivo para Pb sólo en la punción de ganglio y en el resto de los materiales no se obtuvo desarrollo. La
inmunodifusión para Pb fue positiva mostrando las bandas de
precipitación características. Se inició el tratamiento con anfotericina B con buena respuesta. Por episodios de suboclusión intestinal requirió alimentación parenteral. El paciente evolucionó
con mejoría general y tolerancia de la vía oral por lo que se rotó
a itraconazol luego de un mes de tratamiento con anfotericina B.
Las micosis sistémicas y oportunistas son patologías que aumentaron su frecuencia en pacientes inmunocomprometidos, pero los
casos publicados en la bibliografía internacional de asociación
84
entre PM y SIDA siguen siendo bajos, sin embargo debe tenerse
en cuenta su diagnóstico en individuos provenientes de zonas
endémicas. El polimorfismo de las lesiones debe alertar al médico al diagnóstico diferencial de las micosis oportunistas.
P156 – 27477 - FUNGEMIAS DIFERENTES A CANDIDEMIAS
EN HOSPITALES DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES
SCHIJMAN, M (1); BIANCHI, M (1); GUELFAND, L (1); LOPEZ
MORAL, L (1); TIRABOSCHI, I (1); LOPEZ, M (1); E INTEGRANTES DE LA RED MICOLOGIA. CABA
(1) Hospitales de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires
Introducción: las levaduras del género Candida son los hongos más frecuentemente recuperados en el laboratorio, pero otros
géneros fúngicos tienen relevancia, especialmente cuando en la
población hospitalaria la frecuencia de patología relacionada al
VIH es alta. Objetivos: conocer la incidencia y la etiología de las
fungemias por géneros diferentes a Candida spp., en hospitales
de la ciudad de Buenos Aires (CABA). Establecer si hubo modificaciones en la incidencia en los 4 años analizados. Conocer el
tiempo de detección de los hongos recuperados, de hemocultivos
automatizados (AU) y por lisis centrifugación (LC). Evaluar la correlación de los hallazgos con el sexo, edad y enfermedad de base
de los pacientes. Metodología: se realizó un estudio multicéntrico
de las fungemias basado en datos de laboratorio entre enero de
2005 y diciembre de 2008 en 16 hospitales de la Red de Micología
de CABA. Se registró: la especie recuperada, el tiempo de desarrollo, la metodología del hemocultivo y se recabaron datos demográficos y antecedentes de los pacientes en el momento de
detección de la fungemia. Resultados: se procesaron 190.820
hemocultivos: 182.050 AU y 8.870 por LC. De 1020 hemocultivos
se recuperaron elementos fúngicos. En 683 (68%) desarrollaron
levaduras del género Candida y en 325 (32%) otros hongos: 214
Cryptococcus spp., 105 Histoplasma spp. y otros agentes fúngicos
en 18, entre los que se detectaron 7 fungemias por Rhodotorula
spp., 5 por Trichosporon spp., 2 por Pichia spp., 2 por Acremonium
spp., 1 por Saccharomyces spp. y 1 por Fusarium spp. Fungemias por Cryptococcus spp.: hubo 214 episodios: 211 por
C.neoformans, 2 por C.albidus y 1 por C.laurentii. La incidencia
del período fue de 0,36/1000 ingresos (0,35 en 2005, 0,27 en
2006, 0,39 en 2007 y 0,4 en 2008, p=0,2). El 70% de los pacientes fueron varones. La mediana de edad fue de 34 años (de 0 a
95) y el 93% de 209 pacientes eran VIH +. Se registró el tiempo
de detección en 209 hemocultivos (111 AU y 98 por LC). En los
hemocultivos AU el desarrollo fue detectado en un 40% en los
primeros 2 días de incubación, el 71% al día 3 y el 98% al 5° día
de incubación. La visualización en los cultivos por LC fue registrada un 18% al 2° día, 36% el 3° día y 80% al 6° día. Fungemias
por Histoplasma sp.: hubo 105 fungemias por H. capsulatum. La
incidencia del período fue de 0,18/1000 ingresos (0,21 en 2005,
0,20 en 2006, 0,13 en 2007 y 0,17 en 2008, p=0.38). El 82% de
los pacientes eran varones y la mediana de edad fue de 33,5 años
(de 14 a 63 años). Todos los pacientes eran VIH +. Los episodios fueron diagnosticados sólo en 7 de los 16 hospitales participantes y el 78% de ellos en el Hospital de Infecciosas “F.J Muñiz”.
El 87 % de los histoplasmas pudieron ser visualizados entre el
día 10 y 17 de incubación (rango: día 8 a 25). De los episodios
de fungemias diferentes a candidemias, predominan los causados por Cryptococcus spp. e H. capsulatum. La incidencia se ha
mantenido estable en el período estudiado. La recuperación de
estos hongos en los hemocultivos, está fuertemente asociada a
la atención de pacientes VIH reactivos.
P157 – 27480 - CANDIDEMIAS EN LA CIUDAD DE BUENOS AIRES. LOPEZ MORAL, L (1); TIRABOSCHI, I (1); SCHIJMAN, M
(1); PEREDA, R (1); GARBASZ, C (1); E INTEGRANTES, RED
MICOLOGIA CABA
(1) Hospitales de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires
Introduccion: Candida spp. ha emergido como un patógeno
fúngico predominante en el hospital, ocupando en muchas series
el cuarto lugar dentro de los microorganismos recuperados en los
hemocultivos; pero tanto la incidencia como la distribución de las
especies varía en cada región. Objetivos: conocer la incidencia
de las candidemias en los hospitales de la ciudad de Buenos Aires, las especies involucradas y establecer si hubo modificaciones en el curso de 4 años. Conocer el tiempo de desarrollo de
Candida spp. en los hemocultivos. Evaluar sexo, edad, sala de
internación, tiempo de internación hasta la candidemia, la enfermedad de base de los pacientes, el antecedente de catéteres y
antibioticoterapia previa. Materiales y métodos: se realizó un estudio multicéntrico observacional de las candidemias basado en
datos de laboratorio, entre enero de 2005 y diciembre de 2008,
en 16 hospitales integrantes de la Red de Micología la Ciudad de
Buenos Aires. Se consignó la especie recuperada, el tiempo de
desarrollo, y la metodología del hemocultivo. Se recabaron los
datos demográficos y antecedentes de los pacientes. Resultados:
se procesaron 190.820 hemocultivos (182.050 automatizados y
8.870 por lisis centrifugación), de los que se recuperaron elementos fúngicos en 1020; 683 (68%) correspondieron a candidemias.
La incidencia global del período fue de 1,15 /1000 ingresos, pero
con amplia variación entre los centros (de 0,35 a 2,65) y no mostró diferencias significativas a través de los 4 años (1,08 para el
2005; 1,20 para el año 2006 y 2007 y 1,12/1000 ingresos el año
2008, p=0,7). Las especies de Candida recuperadas fueron: C.
albicans 41,3%, C. parapsilosis 24,3%, C. tropicalis 19,9%, C. glabrata 6,3%, seguidas por 1,8% de C. guilliermondii y 0,6% de C.
krusei. Hubo 1,5% de episodios mixtos donde la asociación más
frecuente fue C. albicans y C.parapsilosis. El 97% de las levaduras se detectaron en los primeros 2 días de incubación, pero C.
albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis tuvieron su pico de detección en el primer día, el de C. glabrata fue entre los días 3 y 4. El
51% de las candidemias se detectaron en varones y el 17% de
estas, en menores de 1 año. La mediana de edad fue de 48 años
(0 a 99 años). El 98% de los pacientes estaba internado en el momento de la candidemia (46% en terapia intensiva, 39% en clínica y 15% en cirugía), con un promedio de 24 días de internación.
El 57% de los menores de 1 año tenían como antecedente más
importante la prematurez. Para el resto de los pacientes los antecedentes más frecuentes fueron cirugía (29 %), enfermedades
oncohematológicas o tumorales (26%) e insuficiencias funcionales o metabólicas (17%). Se registró el uso de catéteres en 443/
518 episodios y de antibióticos en 439/515. No hubo diferencias
en la incidencia de las candidemias a través de los años analizados. C. albicans se recuperó en menos de la mitad de los episodios. La gran mayoría de las candidemias se detectó en los primeros 2 días de incubación. Se usaron catéteres y antibióticos
en el 85% de los episodios donde este dato estuvo consignado.
La prematurez, la cirugía, enfermedades onco - hematológicas,
tumorales y las alteraciones metabólicas y funcionales fueron los
antecedentes más frecuentes.
P158 – 27490 - TUBERCULOSIS EN UN HOSPITAL REFERENCIAL DURANTE EL PERÍODO 2007-2009. RODRIGUEZ, MÓNICA;
RIZZOTTI, VIVIANA; PATALLO, CLAUDIA; MOSCOLONI, MARIA;
BALLESTER, DANIELA
Hospital Piñero
En Argentina se notifican 11000 nuevos casos de tuberculosis por año, con una tasa de incidencia de 30 por 100.000 habitantes. La incidencia en la Ciudad de Buenos Aires durante el
2009 fue de 36.9 por 100.000 habitantes y en nuestro hospital y
su área programática de 133.8 por 100.000 habitantes, constituyéndose así como la zona geográfica de mayor tasa de esta enfermedad en la ciudad. Objetivos: analizar las características
epidemiológicas y clínicas de los pacientes con tuberculosis atendidos en nuestro hospital durante el período 2007 -2009. Evaluar
los porcentajes de resistencia de las cepas aisladas en dichos
pacientes. Materiales y métodos: se realizó un análisis retrospectivo y descriptivo. De un total de 5628 muestras para cultivo de
micobacterias, 720 (13%) fueron positivas e identificadas como
complejo Mycobacterium tuberculosis. A 391 (54%) se les realizó
la prueba de sensibilidad a estreptomicina (S), isoniazida (H),
rifampicina (R) y etambutol (E) con los sistemas semiautomatizado
Bactec 460(Becton Dickinson) y automatizado MGIT 960 (Becton
Dickinson) por presentar factores de riesgo: pacientes con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), pediátricos, inmunosuprimidos, contacto con pacientes portadores de cepas multirresistentes, mala evolución y personal de salud según normas del
Programa Nacional. Resultados: nacionalidad: argentinos 389
(54%), sin especificar 50 (7%) y extranjeros 281 (39%), representados estos últimos por: paraguayos, peruanos, uruguayos y
mayoritariamente oriundos de Bolivia. En relación al sexo: femenino 310 (43%) y masculino 410 (57%). En cuanto a las formas
de presentación clínica: 468 (65%) fueron muestras pulmonares
y 252 (35%) de localización extrapulmonar: pleural, cervical,
genito-urinaria, meníngea, ósea y sangre. Las asociaciones
mórbidas más frecuentes fueron: VIH, inmunosuprimidos, diabéticos, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, embarazo/puerperio. Los porcentajes de resistencia a las drogas antituberculosas
probadas fueron: S 11%, H 6%, R 4% y E 3%. En la notificación
del año 2007 se reportaron en Argentina 85% de casos de localización pulmonar, un 13% tuvo localización exclusivamente
extrapulmonar y un 2% de formas mixtas. En el presente estudio
se obtuvieron un 65% de cultivos positivos provenientes de muestras pulmonares pero cabe destacar que por tratarse de una de
las zonas de mayor pobreza y marginalidad, muchos pacientes
con patología pulmonar llegan a la consulta en un estado muy
avanzado de la enfermedad con marcada sintomatología clínica
y evidencia radiológica y epidemiológica compatible con tuberculosis a los que se solicita sólo baciloscopía para diagnóstico, por
lo tanto no estaríamos evaluando un importante grupo de cultivos positivos de muestras pulmonares. Las localizaciones
extrapulmonares más frecuentes fueron pleurales y ganglionares.
La mayoría de los pacientes evaluados son argentinos pero las
zonas aledañas a nuestro hospital cuentan con un importante
asentamiento de extranjeros afectados por tuberculosis. Si bien
el porcentaje de cultivos positivos de la zona resulta alto, afortunadamente los niveles de resistencia observados en nuestra población son bajos, obteniendose mayormente aislamientos de
cepas sensibles a drogas tuberculostáticas de primera línea.
P-159 – 27491 - AISLAMIENTO DE Acremonium blochii EN PACIENTE FIBROQUÍSTICO EN LA CIUDAD DE ROSARIO. RAMOS,
LAURA (1); BELMONTE, ADRIANA (1); DALMASO, HERNAN (1);
VILA, FERNANDO (2)
(1) Instituto de Estudios Bioquímicos IDEB; (2) Estación de la
Infancia
Inroducción: el género Acremonium comprende especies oportunistas siendo poco frecuentes las infecciones producidas por las
mismas. No obstante, dado que se suelen presentar en pacientes debilitados, por su frecuente resistencia a los antifúngicos, se
constituyen en un problema terapéutico. Objetivo: comunicar el
aislamiento de una cepa de Acremonium blochii en un paciente
de 11 años con diagnóstico de fibrosis quística desde los 3 meses, con insuficiencia pancreática. Caso clínico: desde los 7 años
se aisló con frecuencia Pseudomonas aeruginosa, variedad mucosa, tratada vía oral sin ser erradicada, lo que llevó a su tratamiento con expectorante mucolítico de bromhexina, como profilaxis. En los próximos dos años no se obtuvo más rescate de P.
aeruginosa variedad mucoide, pero si el desarrollo de Staphylococcus aureus y otras bacterias como Acinetobacter spp. Material y método: se realizaron esputos micológicos seriados durante fines del año 2008, realizándose exámenes directos con azul
de lactofenol e KOH al 20%, coloración de May Grunwald Giemsa
y Gram Nicolle. Los materiales fueron sembrados en agar
Sabouraud glucosa, agar Sabouraud glucosa cloramfenicol y
Mycosel e incubados a 28 °C y en agar Sabouraud glucosa, agar
Sabouraud glucosa cloramfenicol y agar sangre a 37 °C durante
30 días. Resultados: en los exámenes directos y coloración de
May Grunwald Giemsa se observaron filamentos hialinos, aislándose en todos los medios sembrados, un hongo filamentoso que
por sus características macromorfológicas presentó una colonia
blanca, algodonosa y su micromorfología mostró fialides, poco
diferenciadas, conidias ovoides, de paredes lisas, aisladas y en
cadenas por lo que se lo clasificó como Acremonium blochii. Dicho hallazgo coincidió con un empeoramiento de la función res-
85
piratoria, presentando espectoración mucopurulenta y eliminación
de tapones mucosos con estrías sanguinolentas, por lo que se decide tratamiento antifúngico. Se inició tratamiento con voriconazol
200 mg/dia (100 cada 12 hs.) y a la semana presentó notable
mejoría clínica. A los 10 días se encontraba asintomático. Se realizan dosajes del antifúngico en suero, laboratorio de rutina con
hepatograma normal y reiterados análisis micológicos de secreción bronquial que hasta el presente nunca se negativizaron.
Conclusiones: comunicamos el primer aislamiento de A. blochii en
la ciudad de Rosario y probablemente, a nivel mundial, en un
paciente fibroquístico ya que la literatura relata, dentro de este
género, un caso por A. strictum. Los hongos aislados comúnmente
son: Aspergillus spp., Candida spp., Paecilomyces spp., Scedosporium apiospermum y Exophiala dermatitidis. Creemos que es
conveniente realizar análisis micológicos en estos pacientes para
poder instaurar un correcto y rápido tratamiento antifúngico.
P160 – 27523 - CANDIDURIA. IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES
DE Candida Y SENSIBILIDAD A FLUCONAZOL. PERETTI, SILVIA
TERESA; NARDIN, MARIA ELENA; RAMOS, CLAUDIA FABIANA;
MENDEZ, EMILCE DE LOS A
Hospital JM Cuyen, Santa Fe
Introducción: la definición de candiduria es enigmática. El consenso general es que la candiduria es muy común en pacientes
hospitalizados y su incidencia depende de la población estudiada. Se asocia a anormalidades del tracto urinario, cirugía abdominal, diabetes, uso de antibióticos, etc. El objetivo de este trabajo fue: a. determinar la prevalencia de esta infección, b. identificar las especies de Candida spp, c. determinar su sensibilidad
a fluconazol. Materiales y métodos: se estudiaron 3640 urocultivos
en la Sección Microbiología del laboratorio Central del Hospital
José Maria Cullen de Santa Fe, durante el período 1° de setiembre de 2009 y el 1° de junio de 2010. Se recolectaron los siguientes datos: edad, uso de sondas, administración previa de antibióticos, presencia de catéteres periféricos, enfermedad de base y
diagnóstico probable. Se identificaron las especies de Candida
mediante las siguientes pruebas: formación de tubo germinativo,
fermentación de carbohidratos (glucosa, maltosa, sacarosa,
lactosa, galactosa, trehalosa y rafinosa) y cultivo en medio
cromogénico (CHROMagar Candida). Luego se determinó la sensibilidad por el método de difusión con tabletas de fluconazol (25
ug) Neo-Sensitabs (Rosco), usando agar Mueller-Hinton con 2%
de glucosa y 0,5 µl/ml de azul de metileno. Para confirmar la
candiduria se pidió una segunda muestra de orina y se repitió la
identificación de especie. Resultados: del total de urocultivos,
1.011 resultaron positivos, en 69 desarrolló Candida spp.. La prevalencia de candiduria fue del 1,9% del total de urocultivos y 6,8%
de los positivos. La edad media de los pacientes con candiduria
fue de 45 años. Un 90,5% eran pacientes hospitalizados y el 41%
de los mismos en unidad de cuidados intensivos. Los factores
predisponentes observados fueron uso de sonda y/o catéter urinario (72,5%), presencia de catéteres periféricos (55,1%),
antibioticoterapia (39,1%), anormalidades del tracto urinario
(17,4%), politraumatismos (23,2%), diabetes mellitus (8,4%),
sepsis (2,8%) y otras entidades clínicas (11,6%). Las especies de
Candida aisladas fueron Candida tropicalis (68,0%), Candida
albicans (14,5%), Candida glabrata (11,6%), Candida guillermondii
(4,5%) y Candida krusei (1,4%). La sensibilidad a fluconazol resultó ser del 95,6%. La especie predominante en orina fue
Candida tropicalis y fluconazol sigue siendo la terapia adecuada
en nuestro hospital. Candiduria se asocia fundamentalmente a instrumentación de las vías urinarias, dispositivos médicos invasivos,
uso de antibióticos o un incremento en la permanencia hospitalaria por enfermedades inhabilitantes. En pacientes de alto riesgo
es importante identificar la especie involucrada y determinar su
sensibilidad a los antifúngicos habitualmente usados en la práctica médica.
P161 – 27556 - INFECCIÓN NOSOCOMIAL POR EL COMPLEJO
Burkholderia cepacia EN PACIENTES DE LA UNIDAD DE CUIDADOS INTENSIVOS DEL HOSPITAL DEL NIÑO JESÚS –
86
TUCUMAN. GONZALEZ, MARIA LAURA; ALVAREZ, CHRISTIAN(1); DELGADO, GABRIELA(2); RUBIO MAS, MIGUEL (1);
TREJO , ANA(1)
(1) Hospital del Niño Jesús, (2) Universidad Nacional de Tucumán
El complejo Burkholderia cepacia (BCC) es reconocido como
un importante patógeno oportunista que causa infecciones respiratorias severas en pacientes fibroquísticos o en inmunodeprimidos. Además tiene el potencial de causar brotes hospitalarios, siendo éstos cada vez más frecuentes, donde están íntimamente relacionados a la contaminación de desinfectantes, soluciones de nebulizadores y dispositivos médicos, que incluyen los
respiradores mecánicos. El BCC puede diseminarse fácilmente
entre pacientes de una misma o diferentes salas presentando
resistencia innata a antibióticos de amplio espectro llevando al
fracaso de los tratamientos y complicaciones clínicas de los pacientes. El objetivo de este trabajo es reportar la infección del BCC
en niños con compromiso respiratorio internados en la Unidad de
Cuidados Intensivos del Hospital del Niño Jesús. Se realizó un
estudio retrospectivo entre octubre 2009 y junio 2010. Se procesaron 89 muestras respiratorias en el laboratorio de microbiología, provenientes de 45 pacientes pediátricos hospitalizados en
la UCIP, con diferentes causas predisponentes. Las muestras se
sembraron por la técnica semicuantitativa (cuatro cuadrantes), en
medios de cultivos comunes y selectivos e incubaron a 37°C durante 24 a 72 h. Las colonias del BCC se identificaron por propiedades bioquímicas convencionales y el método API 20NE
bioMérieux®. Se determinó la sensibilidad in vitro según las normativas del CLSI. La muestras se confirmaron por la técnica de
PCR con primers específicos para el gen recA del BCC; para ello
se extrajo ADN genómico bacteriano a partir de las cepas aisladas por el método de fenol-cloroformo. Además, se estimó el tiempo insumido para la identificación del BCC por las técnicas convencionales y la molecular. Resultados: en 9 (10,1%) de las muestras procesadas se identificó el BCC, las mismas correspondían
a pacientes que se encontraban bajo asistencia respiratoria mecánica (ARM). El primer caso de infección por el BCC fue detectado en diciembre 2009 en una paciente fibroquística, seguido de
la infección de 3 pacientes en la 2ª semana de febrero 2010, 1
en marzo 2010 y un último caso registrado fue en abril 2010. En
todos los casos las cepas fueron sólo sensibles a trimetoprimasulfametoxazol y minociclina. El tiempo necesario para la confirmación por PCR no superó las 36 hs, mientras que para la identificación fenotípica se requirió entre 4 a 7 días. a) los resultados demuestran un brote por el BCC en la UCIP del Hospital del Niño
Jesús de Tucumán entre diciembre/09 a abril/10. b) consideramos
que existió mayor riesgo de contraer esta bacteria patógena en
niños bajo ARM. Por lo cual, es necesario desarrollar un sistema
de vigilancia continua en estos pacientes a fin de evitar colonización y/o infección por BCC mediante estudios ambientales periódicos. c) la identificación del BCC por métodos convencionales resultó más laboriosa, a diferencia de la PCR que fue lo suficientemente rápida, sensible y específica para el diagnóstico y confirmación del BCC. lo cual permitió instaurar un adecuado y oportuno
tratamiento y evitó complicaciones clínicas en nuestros pacientes.
P162 – 27583 - GENOTIPO ST5-IV: PRINCIPAL CAUSA DEL INCREMENTO DE LAS INFECCIONES INVASIVAS POR Staphylococcus aureus RESISTENTE A METICILINA ASOCIADO A LA
COMUNIDAD (CA-MRSA) EN PEDIATRÍA, ARGENTINA, 20052008. SOLA, C (1); PAGANINI, H (2); LOPARDO, H (2); EGEA, A L
(1); GRUPO CA-MRSA, PEDIATRIA (MULTICENTRICO 2007);
BOCCO, JL (1)
(1) CIBICI–CONICET-UNC, (2) Hospital Nacional de Pediatría “Dr
JP Garrahan”
En la década de 1990, Staphylococcus aureus resistente a
meticilina (MRSA) emergió como un patógeno asociado a la comunidad (CA-MRSA) produciendo infecciones desde leves a muy
graves. La mayoría de estas cepas portan el tipo IV o V de
SCCmec y los genes para la toxina Panton-Valentine-leukocidin-
(PVL). En un período de tres meses del año 2005 en Córdoba se
reportó una prevalencia de 33% de infecciones por CA-MRSA en
pediatría. En el año 2007 en un estudio anual multicéntrico-(9
centros pediátricos distribuidos en Bs As, CF, CABA, Corrientes,
Chaco, Jujuy y Santa Fe) se reportó una frecuencia promedio del
62% (rango 30%-75%). Objetivo: analizar la epidemiología clínica y molecular de las infecciones por CA-MRSA en la población
pediátrica del centro, norte y este del país durante el año 2007 y
su evolución en el tiempo con respecto a los resultados anteriores. Materiales y métodos: se estableció la prevalencia y características clínicas de las infecciones por CA-MRSA en Córdoba
durante los años 2007-2008 y se analizó molecularmente una
muestra representativa de cepas (n: 219) del estudio multicéntrico2007 (n: 281) y 99 cepas de CA-MRSA de pacientes pediátricos
de Córdoba durante los años 2007-2008. Para la caracterización
molecular de las cepas se realizó: PFGE, MLST, tipo spaA, tipo
de SCCmec y detección de genes de virulencia por PCR. Resultados: en Córdoba durante los años 2007 y 2008, los porcentajes de CA-MRSA en pediatría fueron 38% (36 /94) y 47% (60/127)
respectivamente, estableciéndose un incremento significativo tanto
en esta proporción de infecciones totales (p=0.04) como en la de
infecciones severas e invasivas (ISIn) [10%, (2/22) vs 25% (25/
99)] (p=0.009) por CA-MRSA entre los años 2005 y 2007-2008.
No hubo diferencias significativas entre estos valores y aquellos
obtenidos en el estudio multicéntrico-2007 (28% de ISIn) que
abarcó las demás regiones del país. Los focos de infección más
frecuentes fueron: osteomielitis (29%), artritis (17%), empiema
pleural (17%) y neumonía (15%). El análisis molecular demostró
que el 76% del total de infecciones y el 78 % de las ISIn por CAMRSA en el centro, norte y este del país fueron producidas por
un clon: pulsotipo I, t311, ST5, SCCmec IVa, PVL y enterotoxina
A positivo, previamente reportado en Córdoba y en el este del país
en los años 2005-2006. El 11 % de los casos fueron asociados
al clon caracterizado como pulsotipo N, t019, ST30, SCCmec IVc,
PVL positivo, ya diseminado en Uruguay y 4 cepas presentaron
el genotipo USA300, t008, ST8, SCCmec IVc, PVL positivo. Los
resultados demuestran que la diseminación del clon ST5-IV PVL
positivo fue la principal causa del incremento significativo tanto
del número total de infecciones como del número de ISIn por CAMRSA durante los años 2005-2008 en una amplia región del país.
Además se reportan los primeros casos en Argentina del clon altamente epidémico USA 300. La vigilancia continua de este tipo
de infecciones es importante para el diseño de estrategias efectivas para su control.
P163 – 27585 - INFECCIONES INVASIVAS HUMANAS PRODUCIDAS POR Streptococcus dysgalactiae. SPARO, M (1);
LISSARRAGUE, S (1); TACHELLA, E (2); RANNO, G (1); PSENDA,
L (2); SCHELL, C (3); DELPECH, G (1); BASUALDO, J(3)
(1) Hospital R. Santamarina, (2) Hospital H. Cura, (3) FCM-UNLP
Introducción: estudios epidemiológicos han demostrado un
incremento en el número de infecciones invasivas en el hombre
producidas por distintas subespecies de Streptococcus dysgalactiae, afectando sobre todo a pacientes inmunosuprimidos. Objetivo: caracterizar las infecciones invasivas humanas producidas por
Streptococcus dysgalactiae y estudiar aspectos fenotípicos de las
cepas recuperadas. Materiales y métodos: se diseñó un estudio
no experimental, prospectivo y transversal durante enero 2008diciembre 2009 en dos Hospitales Municipales de adultos (Ramón
Santamarina, Tandil y Dr. Héctor M. Cura, Olavarría). Fue documentado en los pacientes: edad, género, enfermedad de base,
síndromes clínicos y muerte relacionados con la infección. Se incluyeron todas las cepas de S. dysgalactiae provenientes de sitios estériles. Para la identificación fenotípica se efectuó: serología
de grupo (Slidex Strepto-kit, bioMérieux, Francia), hemólisis en
agar sangre ovina (5%), sensibilidad a bacitracina (0,04U), presencia de pirrolidonil aril amidasa, reacciones de CAMP y VogesProskauer, hidrólisis de hipurato, esculina y almidón, producción
de ácido en caldo con sorbitol, trehalosa y ribosa, desaminación
de arginina. Se utilizaron pruebas enzimáticas: á-galactosidasa,
ß-galactosidasa y ß-glucuronidasa (Rapid ID 32 Strept System,
bioMérieux, Francia). Se realizó concentración inhibitoria mínima
(CIM) a penicilina, eritromicina, vancomicina y clindamicina por
microdilución en caldo Mueller-Hinton suplementado con 3% de
sangre lisada de caballo (CLSI, 2007). Resultados: doce pacientes (4 mujeres, 8 varones) presentaron enfermedad invasiva por
S. dysgalactiae. Los pacientes ingresaron con el cuadro infeccioso desde la comunidad. El intervalo de edad fue de 24-87 años
(promedio: 48 años). Las enfermedades de base fueron:
cardiovascular (2), diabetes mellitus (4), trastornos dermatológicos
crónicos (3), etilismo crónico (1). Los síndromes clínicos fueron
bacteriemia sin foco (4), celulitis (3), artritis séptica (5). Dos pacientes con bacteriemia primaria fallecieron. Las cepas fueron
identificadas como S. dysgalactiae subsp. equisimilis. Todas presentaron ß-hemólisis; 8, fueron grupo C y 4 grupo G de Lancefield.
Se observó sensibilidad a bacitracina en dos cepas. Todas fueron sensibles a los antimicrobianos ensayados: penicilina (CIM
≤ 0,016 µg/ml), eritromicina (CIM ≤ 0,12 µg/ml), clindamicina (CIM
≤ 0,12 µg/ml) y vancomicina (CIM ≤ 0,25 µg/ml). Los focos
osteoarticulares, de partes blandas y las bacteriemias primarias
fueron las formas de presentación clínica en las infecciones
invasivas. No se observaron enfermedades malignas como patologías de base. La sensibilidad a bacitracina en dos cepas ratifica la necesidad de realizar en todos los aislamientos con ßhemólisis la serotipificación y las pruebas bioquímicas. S.
dysgalactiae subsp. equisimilis es uno de los agentes a investigar en las infecciones invasivas provenientes de la comunidad.
P164 – 27586 - DETECCIÓN DE VISA Y h-VISA: MÉTODO DE
PREDIFUSIÓN CON TABLETAS COMO SCREENING DE SENSIBILIDAD REDUCIDA A VANCOMICINA (SR-VAN) EN AISLAMIENTOS CLÍNICOS DE Staphylococcus aureus. CERIANA, P
(1); GAGETTI, P (1); RODRIGUEZ, M (1); ERRECALDE, L (2);
GRECO, G (3); CORSO, A (1)
(1)Servicio Antimicrobianos. Instituto Nacional de Enfermedades
Infecciosas INEI-ANLIS “Dr. C. G. Malbrán”; (2) Sección Microbiología. Hospital General de Agudos J. A. Fernández, (3) Sección
Microbiología. Hospital Italiano Bs As.
Introducción: vancomicina (VAN) es terapia empírica inicial en
pacientes donde se sospecha Staphylococcus aureus meticilinoresistente (SAMR). Se han descripto tres fenotipos de resistencia o SR-VAN: 1) VISA: CIM VAN 4-8mg/l (intermedio), 2) h-VISA:
CIM VAN ≤ 2 mg/l (sensible) pero capaces de seleccionar
subpoblaciones VISA y 3) VRSA: CIM VAN ≥ 16mg/l (resistente)
por adquisición del gen vanA. El método de difusión por discos
detecta VRSA, pero no diferencia VISA y h-VISA de las cepas
VAN sensibles (VSSA). En 2009, el CLSI eliminó los puntos de
corte de difusión para VAN en Staphylococcus spp. La técnica de
predifusión con tabletas Neo-Sensitabs (t-NST) permitiría diferenciar mejor los fenotipos VISA, h-VISA y VSSA por extensión del
tiempo de difusión de los antimicrobianos. Objetivo: evaluar el
método de predifusión con tabletas t-NST como screening de VISA
y h-VISA en aislamientos clínicos. Materiales y métodos: se evaluaron 50 SAMR: 30 cepas de referencia representantes de distintos clones internacionales y 20 de origen clínico derivadas al
INEI para evaluación de sensibilidad a VAN. La CIM por dilución
en agar se usó como método de referencia (CLSI). Las cepas
presentaron la siguiente distribución de CIMs a VAN en mg/l(n):
0,5 (13), 1 (31), 2 (3), 4 (3). Las tres cepas de CIM 2 mg/l fueron
h-VISA (ITA1, FER1 y Mu3) y las tres de CIM 4mg/l VISA (ITA2,
FER2 y Mu50). Los VISA y h-VISA se confirmaron por macro Etest
y GRD VAN/TEI+S (bioMèrieux). Se realizó la técnica predifusión
2+18 h con t-NST (ROSCO Diagnostica) según instrucción del
fabricante. Brevemente, se coloca una t-NST de VAN (30 µg) y
una de TEI (30 µg) en una placa de agar Mueller-Hinton. Después
de 2 h a temperatura ambiente (predifusión1: 2h) se sacan las tNST y las placas se mantienen a temperatura ambiente por 18 h
(predifusión2: 18h). Luego se hisopa la cepa a evaluar con inóculo
0,5 McFarland y se incuba a 35 °C. Zonas de inhibición de TEI <
20mm y/o VAN ≤ 22 mm se interpretan como VISA o h-VISA.
Resultados: la t-NST VAN detectó 5/6 SAMR [sensibilidad (S)
83%] con CIM ≥ 2mg/l: 3 VISA y 2 h-VISA, y fue 100% específica
(E) para cepas con CIM ≤ 1mg/l. La t-NST TEI identificó los 6 hVISA/VISA (S: 100%) con CIM ≥ 2mg/l, pero fue 95% E para CIM
87
≤ 1mg/l. La S y E utilizando ambas tabletas fue 100%. El rango
de zonas de inhibición de la predifusión VISA/h-VISA estuvo entre 9-23 mm para VAN y 9-19 mm para TEI. Las cepas con CIM
VAN ≤ 1mg/l presentaron halos entre 23 y 29 mm para VAN y 17
a 26 mm para TEI. El método de predifusión con t-NST de
VAN+TEI es altamente S y E para diferenciar los SAMR VISA y
h-VISA con CIM VAN ≥ 2mg/l, de las cepas con CIM ≤ 1 mg/l. Si
bien la S fue evaluada con solo seis VISA/h-VISA, la técnica de
predifusión promete ser un método de screening confiable y al
alcance de los laboratorios clínicos de rutina para la detección de
VISA/h-VISA. Cualquier resultado positivo por este screening debe
indefectiblemente confirmarse por CIM y otras metodologías más
específicas.
P165 – 27589 - EFECTOS DEL ACEITE DE TOMILLO Y ALGUNO
DE SUS COMPONENTES EN LA MOVILIDAD Y VIABILIDAD DE
Leishmania mexicana. GOMEZ COLUSSI, ANDREA (1);
MARQUEZ, VANINA (1, 2); IGLESIAS, ALBERTO (3); BECCARIA,
ALEJANDRO (2); GUERRERO, SERGIO (1)
(1) Laboratorio de Bioquímica Microbiana, (2) Laboratorio de Fermentaciones, (3) Laboratorio de Enzimología Molecular. Facultad
de Bioquímica y Ciencias Biológicas, UNL. Santa Fe, Argentina.
Introducción: la leishmaniosis es una zoonosis transmitida en
América fundamentalmente por hembras de insectos dípteros del
género Lutzomia. Puede presentarse bajo diferentes formas clínicas. Leishmania mexicana es agente etiológico de la forma cutánea localizada, la presentación clínica más común en nuestro
país. Los compuestos organometálicos derivados de antimonio
pentavalente, entre otros, son los agentes quimioterapéuticos de
elección. La relación beneficio/riesgo obtenida en los tratamientos de esta enfermedad justifican la caracterización de nuevas
alternativas terapéuticas. Objetivo: evaluar el efecto del aceite de
tomillo y alguno de sus principales componentes sobre la movilidad y viabilidad de promastigotes de L. mexicana cultivados
axénicamente. Materiales y métodos: se realizaron cultivos de
promastigotes de L. mexicana en frascos T en medio BHI suplementado con 20% SFB inactivado, inoculados a una densidad
inicial de 1.000.000 parásitos/ml. Diferentes cultivos fueron tratados con: aceite de tomillo (T) (18,72 µg/ml), carvacrol (C) (19,72
µg/ml) y la mezcla de ambos (C+T) en iguales proporciones. Se
realizaron cultivos control, adicionados de dimetilsulfóxido, también utilizado para preparar las diluciones de los aceites. Se tomaron muestras de los cultivos para determinación de su viabilidad por reducción de resazurina y cuantificación colorimétrica del
producto formado. Se evaluó la movilidad de los parásitos en
cámara de Neubauer. Resultados: se observaron diferencias
estadísticamente significativas (p<0,05) en la viabilidad de los
cultivos tratados con C y la mezcla C+T. A las 24 h de exposición la densidad de células viables del control fue 1,4 y 1,6 veces la del cultivo tratado con C y C+T, respectivamente y a las
48 h de 1,3 y 1,4 veces respectivamente. No se observaron diferencias significativas en los cultivos tratados con T respecto del
control. Efectos similares se observaron sobre la movilidad: se
encontraron diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) en
los cultivos tratados con C (88% y 67% a las 24 y 48 h de exposición) y la mezcla de C+T (55% y 66% a las 24 y 48 h de exposición), con respecto al control (96% tanto a las 24 como a las 48
h de exposición). Además se evidenció, entre C y T, un efecto
sinérgico significativo sobre la movilidad del parásito en relación
al C o al aceite por separado (p<0,05). El carvacrol y la mezcla
de carvacrol y tomillo en las concentraciones establecidas afectan la viabilidad y movilidad de promastigotes de L. mexicana in
vitro. El aceite de tomillo actuaría sinérgicamente con carvacrol
en la inhibición de la movilidad de los parásitos, lo que los convierte en compuestos a analizar en profundidad por su potencial
como agentes leishmanicidas.Trabajo realizado con fondos del
proyecto PICT 2007 668.
P166 – 27602 - LA PREEXPOSICIÓN A CONTAMINANTES AMBIENTALES ALTERA LA RESPUESTA INMUNE A LA INFECCIÓN PULMONAR POR Mycobacterium phlei EN UN MODELO
MURINO IN VIVO. DELFOSSE, VERONICA (1); PALMIERI,
88
MONICA (2); FERRARO, SEBASTIAN (1); TASAT, DEBORAH (1,
3); GIOFFRE, ANDREA (4)
(1) Centro de Estudios en Salud y Medio Ambiente (CESyMA),
Escuela de Ciencia y Tecnología (ECyT), UNSAM, (2) DTO.
RADIOBIO, CNEA, (3) FO-UBA, (4) IB, Centro de Investigacion
en Cs. Veterinarias y Agronómicas (CICVyA), INTA
Es conocido que las micobacterias ambientales (MA) son
patógenos oportunistas. Sin embargo, en pacientes inmunocomprometidos la incidencia de las infecciones aumenta. Por otra
parte, el aumento de los contaminantes ambientales aéreos, material particulado (MP) en suspensión y gases, inducen un drástico incremento en el porcentaje de las enfermedades ambientales. Dado que la exposición al humo del cigarrillo y la contaminación asociada al uso del carbón como combustible han sido identificadas como factores de riesgo para la infección y el desarrollo
de enfermedades, la contaminación aérea no debería ser subestimada en la incidencia y/o evolución de las mismas. Hasta el
momento no se han descripto estudios que evalúen el efecto del
MP sobre la respuesta del sistema inmune innato a micobacterias.
Por ello, seleccionamos a Mycobacterium phlei, una especie
usualmente no patógena en el hombre y a ROFA (Residual Oil
Fly Ash) como MP para estudiar en ratones BALB/c la susceptibilidad a la infección en pulmón. Los animales se dividieron en 4
grupos (n=16): controles (Co), expuestos intranasalmente a 30 µg
ROFA (R), infectados con 8.106UFC M. phlei (I) y expuestos e
infectados (RI). Previamente la identidad de la micobacteria se
confirmó a través de la secuencia parcial del gen hsp65. La respuesta al tratamiento se evaluó en pulmón a través del recuento
de unidades formadoras de colonias y en el BAL mediante los
siguientes parámetros biológicos: 1) recuento de células totales
(RCT), 2) análisis de la composición celular (CD) mediante tinción
con hematoxilina y eosina, 3) cuantificación de la producción del
anión superóxido mediante el test del NitroBlue Tetrazolium (NBT),
4) cuantificación de la producción de IFN-gamma e IL-10 mediante
la técnica de ELISA. Si bien el RCT no mostró diferencias significativas entre los grupos (Co: 1,2±0,4.106; R: 1,2±0,3.106; I:
2,1±0,6.106; RI: 1,6±0,7.106) el CD, reveló para todos los tratamientos una reducción en el porcentaje de macrófagos alveolares
respecto del control (R: 17%; I: 53%; RI: 36%). La producción de
anión superóxido aumentó significativamente para todos los tratamientos respecto del grupo Co (Co: 21,5±1,4; R: 34,2±0,3; I:
52,9±3,1; RI: 47,8±1,9). Aunque la producción de IFN-gamma se
mantuvo constante (13±0,5pg/ml), la de IL-10 disminuyó en el
grupo R (16,7±2,4pg/ml) y aumentó en los dos grupos infectados
(I: 54,8±2,1pg/m; RI: 47±9,6pg/ml) respecto del Co (35,7±4,7pg/
ml). Llamativamente, la carga bacteriana en pulmón fue mayor en
los animales del grupo RI (1,6±1,08.109 UFC) respecto del grupo I (5,04±0,05.108 UFC). Estos resultados muestran que la preexposición a ROFA altera la composición del BAL, aumenta la
generación de anión superóxido e inhibe la actividad antimicobacteriana. Si bien esta última observación no se ve reflejada en los
valores de las citoquinas analizadas, los resultados señalan a la
contaminación ambiental como un factor potencialmente decisivo
en la progresión de la infección.
P167 – 27610 - MASTITIS BOVINA: IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES DE ESTAFILOCOCOS COAGULASA-NEGATIVA. GENTILINI E, CUNDÓN C, PUIGDEVALL T, DENAMIEL G.
Microbiología. Facultad de Ciencias Veterinarias. UBA
Introducción: en los últimos años en todo el mundo, los
estafilococos coagulasa- negativa (ECN) han adquirido importancia por su relación con la mastitis clínica y subclínica en bovinos.
Existen más de 44 especies y subespecies de las cuales 39
(Euzèby 2007) son ECN reconocidos dentro del género. La correcta identificación a nivel de especies es difícil y costosa, sin
embargo es necesaria para comprender el potencial patogénico
de las mismas. En la mayoría de los estudios y durante la rutina
del diagnóstico bacteriológico en el laboratorio, la identificación
se realiza por el análisis de las características fenotípicas. Objetivo: identificar aislamientos de ECN a nivel de especies prove-
nientes de bovinos lecheros con mastitis subclínicas y clínicas,
mediante API Staph (bioMèrieux, France) comparado con el método fenotípico de referencia Kloos and Schleifer (1975) y
Bannerman (2003). Materiales y métodos: se estudiaron 97 aislamientos de ECN provenientes de leche de 374 bovinos con
mastitis subclínica y clínica, de 19 establecimientos de la provincia de Buenos Aires. Los aislamientos fueron analizados con Api
20 Staph y el método fenotípico de referencia. Con Apiweb software, se determinó como correctamente identificados, aquellos
aislamientos que presentaron un resultado con una probabilidad
del 90%. La denominación de ECN incluye a todos los estafilococos aislados de mastitis bovina que no son Staphylococcus
aureus, incluyendo coagulasa variable como S. hyicus. Análisis
estadístico: se consideró falsos positivos a los ECN encontrados
diferentes en comparación con el método de referencia. Se determinó la sensibilidad (S), especificidad (E) y el valor predictivo
positivo (VPP) para cada especie. Resultados. Según el método
de referencia se identificaron 96 ECN (98,9 %), correspondiendo
a 13 especies diferentes: S. chromogenes (25), S. epidermidis
(11), S. simulans (12),S. xylosus (14), S. hyicus (10), S.
haemolyticus (4), S. hominis (4), S. sciuri (5), S. saprophyticus (3),
S. caprae (1), S. cohnii subsp. urealyticus (2), S. warneri (3), S.
capitis (1). Con API Stapth: 49 ECN (50,4%) fueron correctamente identificados, 40 (41,6%) falsos positivos y 8 (8,7%) no identificados. S. chromogenes fue la especie con menor S (20%), E
(88%) y VPP (44%), mientras que S. hyicus fue la especie con
mayor S (90%), E (100 %) y VPP (100 %). Conclusiones. Por el
método fenotípico de referencia fueron resueltos casi todos los
aislamientos (96), mientras con Api Staph sólo la mitad (49). Api
Staph, es un test propuesto para identificar estafilococos en el
hombre. Sin embargo, nuestros estudios reflejan una insuficiente
respuesta para los patógenos veterinarios. Esto probablemente
obedece a un bajo número de aislamientos veterinarios en la base
de datos. Subsidio UBACyT V011. 2008-2011 (Comunicación preliminar).
P168 – 27612 - ONICOMICOSIS: ESTUDIO CLÍNICO, EPIDEMIOLÓGICO Y MICOLÓGICO MULTICÉNTRICO. RELLOSO, SILVIA(1); ARECHAVALA, A(2); GUELFAND, L(3); MALDONADO, I(4);
WALKER, L(2); AGORIO, I(5); REYES, S(5); GIUSIANO, G(6);
ROJAS, F(6); FLORES, V(7.); CAPECE, P(8); POSSE, G(8);
NICOLA, F(1); BIANCHI, M(9)
(1) CEMIC, (2) Hospital Muñiz, (3) Hospital Fernández, (4) Hospital Alemán, (5) Hospital Británico, (6) universidad Nacional del
Nordeste, (7) Hospital Italiano – Dermatología, (8) Hospital Posadas, (9) Laboratorio M. Bianchi
Introducción: las onicomicosis son patologías de las uñas que
afectan al 2 - 13% de la población mundial y representan aproximadamente el 50% de las onicopatías, pueden ser causadas por
dermatofitos (D), levaduras (L) y/u hongos filamentosos no
dermatofitos (HFND). Objetivos: la Subcomisión de Micología de
SADEBAC planificó un estudio piloto prospectivo multicéntrico
para: - Evaluar la prevalencia de onicomicosis. - Analizar los resultados de los estudios micológicos. - Conocer los agentes
causales y las formas clínicas más frecuentes. - Analizar la presencia de diferencia entre formas clínicas y agentes etiológicos
en uñas de mano (UM) y uñas de pies (UP) y su relación con el
sexo de los pacientes. Materiales y métodos: se convocó a 9
centros asistenciales para el estudio: Hospitales Alemán, Británico, Fernández, Italiano, Muñiz, Posadas, CEMIC, Universidad del
Nordeste y Laboratorio Mario Bianchi. Se confeccionó una planilla para la toma de muestra donde se asentaron los datos y antecedentes del paciente y las características de las lesiones. Se
evaluaron todas las muestras de lesiones en UP y UM en el período: marzo 2009- febrero 2010. Los exámenes microscópicos
directos se realizaron con KOH al 20-40% o calcofluor; los cultivos en medios de agar: Sabouraud-miel, Lactrimel, Sabouraud con
cicloheximida y/o Dermatophyton Test Medium. Los aislamientos
se identificaron según los procedimientos de cada centro participante. Resultados: se procesaron un total de 5970 muestras, de
las cuales 82,4% correspondieron a UP y 17,6 % a UM. La edad
promedio fue de 49,7 años (rango: 1 m-94 años) y el 66% era de
sexo femenino. El 96% de las muestras correspondieron a pacientes adultos. Se evidenció la presencia de hongos en el 61% de
los casos. En los pacientes adultos las UP presentaron un 61%
de exámenes directos positivos y los cultivos fueron positivos en
un 47,9%. Las especies predominantes pertenecen al grupo de
los D (82,6%) y la forma clínica más frecuente fue la distal
subungueal. En UM la positividad del examen directo fue de 59%
y los cultivos fueron positivos en un 56%, las especies predominantes correspondieron a las levaduras del género Candida y la
forma clínica más frecuente fue la onicolisis. Conclusiones: se
encontró 61% de positividad en el examen micológico directo,
valor superior al de otras investigaciones. En las UP prevalecieron las dermatoficias en ambos sexos por igual y en UM se evidenció un predominio de levaduras en el sexo femenino y D en
los varones. Los HFND se aislaron en 2,2% de lesiones de UP y
3,2% en UM.
P169 – 27614 - MICROBIOTA VAGINAL (MV) Y SU CONFORMACIÓN COMO BIOPELÍCULA (BP). FARINATI, ALICIA; MIQUELARENA, AMADEO; VAZQUEZ, GUSTAVO
Cátedra de Microbiología y Parasitología. Facultad de Medicina.
Universidad del Salvador. CABA
Los microorganismos (MOs) viven habitualmente en forma
planctónica y en biopelículas (BP) o biofilms. La MV es un ejemplo de BP mixta. Sin embargo se desconoce su dinámica y cómo
interviene en ciertos procesos sobre todo los denominados crónicos y/o recurrentes. Objetivo: conocer la dinámica del establecimiento de la MHV de la mujer en edad reproductiva (ER). Pacientes y métodos: se estudiaron 21 mujeres en ER que consultaron
por flujo genital (FG):12 con MH y 9 con infecciones endógenas:
3 vaginosis bacteriana (VB), 4 candidiasis vulvovaginal (CVV) y
2 con vaginitis aeróbica (VA). Cada muestra de FG se procesó
en forma habitual (pH, prueba de aminas, examen en fresco,
coloraciones y cultivos). Para la formación de las BP in vitro se
utilizó la técnica descrita previamente y el FG se inoculó en
tripteína soja caldo (TSC) y Man Rogosa Sharp (MRS) para LB.
Se introdujo el dispositivo de vidrio en 2 de cada uno. Se extrajeron 2 a las 24 y 2 a las 48 h. Las lecturas se efectuaron previa
coloración de Gram. Se realizaron extendidos para análisis de los
MOs planctónicos a partir de cada tubo. En tres casos (2 de MHV
y 1 de CVV) se realizó el estudio directo de la BP sobre el FG
(BPD). Resultados: se observó, en todas las BP in vitro que las
especies de cocos gram-positivos (CGP) son los que inician la
adherencia para su formación. LB aparece tardíamente e inicialmente forman BP separados de los CGP. En las CVV hay BP
mixtas integradas por Candida spp y por los cocos no así por LB
que tienden a permanecer aislados. Esta BP mixta aparece después de las 24h. En las VB los MOs que podrían corresponder a
Gardnerella vaginalis aparecen a las 48 h. En las VA por
Streptococcus agalactiae, se observó la BP monomicrobiana pero
fue notoria su alteración morfológica. En el estudio planctónico se
observaron coagregados bacterianos en los casos de VA y VB.
En la MHV los LB desarrollan bien a partir de las 24 h siendo
notoria la diferencia entre este desarrollo y la BP correspondiente. En las CVV hubo coagregados de hifas y cocos y a las 48 h
también con LB. En las BPD se formaron inicialmente BP de CGP
sobre la superficie de las células epiteliales. A las 48 h observamos en la MHV el desarrollo de BP pequeñas de LB pero no
yuxtacelulares. En las BPD de CVV observamos a las 24 h LB
filamentosos y blastosporos, pero no hifas. Este aspecto difiere a
las 48h en que se observan LB con su morfología habitual. Conclusiones: si bien LB es la microbiota predominante en mujeres
en ER con MHV, no parecen ser los que inician la formación de
las BP mientras que si lo hacen las especies de CGP. Esto indicaría la importancia de la concentración lactobacilar para dar lugar a la constitución de la microbiota como BP ya que en estado
planctónico no ocurre lo mismo. Es importante considerar que para
que los lactobacilos ejerzan su función protectora podría ser necesario que se constituyan como BP. El distinto comportamiento
de LB a las 24 y 48 h en las BP directas y en estado planctónico
sugiere que esta formación de BP por parte de LB puede ser especie dependiente.
89
P170 – 27621 - MASTITIS BOVINA: HEMAGLUTINACIÓN DE
ESTAFILOCOCOS COAGULASA-NEGATIVA Y SU RELACIÓN
CON LAS MASTITIS SUBCLÍNICA Y CLÍNICA. GENTILINI E (1),
TESTORELLI MF (1), CUNDÓN C (1) Y DENAMIEL G (1).
(1) Microbiología. Facultad de Ciencias Veterinarias. UBA. Subsidio UBACyT V011
Introducción: la hemaglutinación (HA) es la agregación de
eritrocitos causada por la adherencia de las bacterias a dos o más
eritrocitos. La presencia de hemaglutininas en las bacterias se ha
relacionado con la capacidad de adhesión. Es reconocido que la
adherencia es el primer paso en la patogénesis de las infecciones intramamarias. Objetivo: determinar la capacidad hemaglutinante de los estafilococos coagulasa-negativa (ECN) aislados de
mastitis subclínica y clínica. Materiales y métodos: se estudiaron
97 ECN de los cuales 18 fueron de mastitis clínica y 79 de mastitis
subclínica. Técnica: 3 a 4 colonias de cada ECN de un cultivo de
24 horas en agar tripteína soja con sangre desfibrinada de bovino al 5 %, se sembraron en caldo tripteína soja e incubaron 18 h
a 35 °C. Posteriormente cada cultivo se centrifugó a 500 g y se
lavó tres veces consecutivas descartando el sobrenadante y
resuspendiendo el pellet en PBS pH 7,2. La suspensión bacteriana
se ajustó al estándar N° 3 del nefelómetro de Mc Farland que se
correlacionó aproximadamente con 108 bacterias/ml (valor determinado por el recuento de unidades formadoras de colonias en
placa). Las suspensiones bacterianas se diluyeron 1:10 en PBS
pH 7.2. Glóbulos rojos: se obtuvieron por el sangrado de un carnero con solución de Alsever en una relación 1:4 (Alsever: sangre). La sangre se centrifugó a 500g 15 minutos, el sedimento se
lavó dos veces consecutivas con PBS pH 7,2 y resuspendió en
PBS al 1%. Prueba: se realizó en microplacas de 96 pocillos. Se
colocó 25 µl por pocillo de cada suspensión bacteriana con 25 µl
de la suspensión de eritrocitos de bovino, obteniendo un volumen
total de 50 µl. Las placas se sellaron con celofán y se mantuvo el
ensayo en movimiento a una velocidad 75-80 (Rondina, Industria
Argentina) durante 2 horas a temperatura ambiente. Controles: (+)
y (–) de HA y de glóbulos rojos. Lectura: (+) pellet pobre con un
halo alrededor de HA, (++) una HA difusa con una pobre sedimentación organizada de eritrocitos y (+++) para una sedimentación difusa. La prueba de HA se consideró negativa cuando se
observó un botón compacto en el fondo del pocillo. Resultados:
del total de los ECN (97) hemaglutinaron el 25,7% (25/97). De
mastitis clínica el 100% (18/18) de los ECN hemaglutinó; mientras que sólo el 8,8% (7/79) de los ECN de mastitis subclínica.
Conclusión: estudios realizados con Staphylococcus epidermidis
en el hombre, demuestran una alta correlación entre adherencia
a biomateriales y hemaglutinación. En las mastitis clínica, encontramos correlación entre HA y ECN, esto permitiría inferir que las
hemaglutininas podrían jugar un rol muy importante en la
patogénesis de las infecciones intramamarias o servir como un
marcador para ECN con potencial adherente.
P171 – 27630 - EVALUACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN INHIBITORIA MÍNIMA (CIM) A VANCOMICINA (VAN) POR DILUCIÓN
EN AGAR, VITEK2, ETEST Y MICE EN Staphylococcus aureus.
CERIANA, P(1); GAGETTI, P(1); SOLOAGA, R(2); RODRIGUEZ,
M(1); CORSO, A(1)
(1) Servicio Antimicrobianos. Instituto Nacional de Enfermedades
Infecciosas INEI-ANLIS Dr. C. Malbrán; (2) Hospital Naval de Bs. As.
Introducción: Staphylococcus aureus es una de las causas más
comunes de infección hospitalaria y de la comunidad. VAN es la
terapia de elección en pacientes con S.aureus meticilino-resistente
(SAMR). Debido a la falta de correlación entre el método de difusión y la CIM a VAN, a partir del 2009 el CLSI eliminó los puntos
de corte de difusión para VAN en Staphylococcus spp. Recientemente, se ha demostrado que cepas con CIM VAN ≥ 2mg/l responden pobremente al tratamiento con VAN, por lo que se hace
imprescindible evaluar la sensibilidad por CIM en pacientes donde esta droga vaya a ser utilizada. Actualmente se dispone de
métodos alternativos a los de referencia para evaluar la CIM a
90
VAN: tiras de gradiente de antibiótico Etest (bioMèrieux) o MICE
(OXOID) y sistemas automatizados. Objetivos: evaluar la correlación entre la CIM a VAN por dilución en agar (DA) y métodos
de Etest, MICE y Vitek2 en aislamientos de S. aureus. Materiales
y métodos: se evaluaron 50 SAMR: 30 cepas de referencia representantes de distintos clones internacionales y 20 de origen
clínico derivadas al INEI para evaluación de sensibilidad a VAN.
La CIM por DA se usó como método de referencia (CLSI). La distribución de CIMs a VAN en mg/l (n) de las cepas fue: 0,5 (13), 1
(31), 2 (3), 4 (3). Las tres cepas de CIM 2mg/l fueron h-VISA
(ITA1, FER1 y Mu3) y las tres de CIM 4 mg/l VISA (ITA2, FER2 y
Mu50). Los VISA y h-VISA se confirmaron por Macro Etest y GRD
VAN/TEI+S (bioMèrieux). Se realizó la CIM a VAN por Etest, MICE
y Vitek2 (AST-P577) según instrucciones del fabricante. Las discrepancias con el método de referencia fueron confirmadas. Resultados: la concordancia esencial (CE) con el método de referencia (CIM±1dilución) fue 92% para MICE, 98% para Etest y
100% para Vitek2. La concordancia en la categoría de interpretación (CI) fue 98% para Etest y MICE y 100% para Vitek2. Hubo
1 error minor (Mi) por Etest y MICE (h-VISA FER1). Los rangos
de CIMs a VAN fueron: 0,5 - 4 mg/l para DA, MICE y Vitek2 y 0,5
- 8 mg/l para Etest. La CIM50 para VAN fue (mg/l): 1 por DA y
Vitek2, 1,5 por Etest y 2 por MICE. La CIM90 fue 2 mg/l por los
cuatro métodos. Se observó un desplazamiento hacia CIMs mayores entre ½ (n: 27) ,1 (n: 4), ≥ 1 (n: 1) log para Etest y entre ½
(n: 13), 1 (n: 19), ≥ 1 (n: 4) log para MICE con respecto a DA.
DA, Etest, MICE y Vitek2 detectaron las tres cepas VISA. Los 3
h-VISA con CIM de 2 mg/l dieron CIMs (mg/l): 2 con Vitek2, 2-3
por Etest y 1,5-2 por MICE. La CE y la CI fue superior a 90% para
Etest, MICE y Vitek2. Las CIMs por Etest y MICE tienden a ser ½
log y 1 log mayor, respectivamente, por lo que se deben interpretar
con precaución las CIMs de 2mg/l. Los métodos evaluados detectaron el mecanismo VISA, emergente en nuestro país, por lo
que serían apropiados para evaluar la sensibilidad a VAN en aislamientos clínicos de S. aureus.
P172 – 27638 - VULVOVAGINITIS EN NIÑAS PREPÚBERES:
AGENTES ETIOLÓGICOS. ZURBRIGGEN, MARIA LAURA (1);
BARONI, MARIA ROSA (1); MENDOSA, MARIA ALEJANDRA (2);
RAGOGNA, GABRIELA (1,2); ROLDAN, MARIA LILIANA (2)
(1) Hospital de Niños “O. Alassia”, (2)Instituto Médico de la Mujer. Santa Fe
Introducción: en la niña prepúber existen condiciones anatómicas, fisiológicas e higiénicas diferentes a la de la adolescente
y de la mujer adulta, que contribuyen al desarrollo de la vulvovaginitis (VV). El estado hipoestrogénico deja a la mucosa vaginal
susceptible a agentes irritativos e infecciosos tales como microorganismos de origen intestinal, respiratorio, dérmico y de transmisión sexual. La vulvovaginitis con o sin descarga vaginal es el
desorden ginecológico más común en la práctica pediátrica. Dado
que la fisiopatología de este cuadro clínico es controvertida, reconocer los agentes que la producen, su frecuencia, la condición
socioeconómica y hábitos higiénicos contribuirían a establecer
programas de prevención, educación y control de las mismas.
Objetivo: establecer la frecuencia de aislamientos de agentes
etiológicos de vulvovaginitis en niñas prepúberes. Pacientes y
métodos: se estudiaron 35 niñas prepúberes con diagnóstico clínico de vulvovaginitis (VV) que concurrieron al consultorio externo de Ginecología del Hospital de Niños “Dr. Orlando Alassia” y
al Instituto Médico de la Mujer, ambos de la ciudad de Santa Fe
durante el período 1 de noviembre de 2009 al 30 de abril de 2010.
Las edades de las niñas estuvieron comprendidas entre 2 y 12
años. Se excluyeron los casos con sospecha de abuso sexual. Las
muestras vaginales fueron extraídas con hisopo especial (tipo
uretral). Se realizó observación en fresco y coloración de Gram.
Se cultivaron en agar sangre al 5%, agar chocolate, agar CLDE
y agar Sabouraud glucosado. En los casos de ginecorragia se
agregó en el procesamiento agar Salmonella – Shigella. Resultados: del total de la población, el 62% correspondió a VV inespecíficas sin agente etiológico demostrado y el 38% a VV específicas. En este último caso, los aislamientos correspondieron:
20% a patógenos respiratorios (Streptococccus pneumoniae,
Haemophilus influenzae y Streptococcus pyogenes), 9% a
enterobacterias (Shigella flexneri y Proteus mirabilis) y 9% a
Gardnerella vaginalis. No se obtuvo ningún aislamiento de
Candida spp. La etiología inespecífica fue la más frecuente en
estas pacientes prepúberes, lo que coincide con lo publicado por
otros autores. Estos resultados avalan la utilización de tratamientos sintomáticos empíricos sin necesidad de antibióticos. Por lo
tanto a la hora de decidir un tratamiento antimicrobiano, se hace
necesario el estudio microbiológico, teniendo en cuenta que las
VV específicas fueron debidas principalmente a patógenos respiratorios.
P173 – 27648 - SALMONELOSIS EXTRAINTESTINAL EN PACIENTES PEDIÁTRICOS. SPADA, ROMINA; BARONI, MA ROSA;
OCHOTECO, MA CRISTINA; ZURBRIGGEN, MA LAURA;
LANDOLT, NOELIA; VIRGOLINI, MA STELLA
Hospital O. Alassia. Santa Fe
Introducción: Salmonella entérica no typhi (SNT) es uno de los
enteropatógenos que suele aislarse en los coprocultivos de los
pacientes con gastroenteritis, además puede localizarse en cualquier tejido del cuerpo causando abscesos y otro tipo de manifestaciones. Es bien conocida su relación con las enfermedades
de transmisión alimentaria. Los serotipos predominantes en Argentina son: Salmonella Typhimurium y Salmonella Enteritidis.
Objetivo: evaluar retrospectivamente las características microbiológicas y epidemiológicas de aislamientos extraintestinales de SNT
y la resistencia antibiótica entre enero 2004 a diciembre 2009,
estudiados en el Hospital de Niños “Dr Orlando Alassia” de la ciudad de Santa Fe. Pacientes y métodos: se analizaron retrospectivamente los datos de 12 pacientes pediátricos en los cuales se
halló SNT en muestras clínicas diferentes al coprocultivo, siendo
éste positivo o negativo. Resultados: el rango de edad de los
pacientes fue de 4 meses a 16 años. Del total de casos estudiados, SNT fue aislada en diez muestras de hemocultivo (10/12),
en una muestra de líquido articular (1/12) y en una de empiema
subdural (1/12). En sólo 3 de los pacientes que presentaron
bacteriemias a Salmonella entérica no typhi, la misma fue aislada del coprocultivo en forma conjunta al aislamiento del
hemocultivo (3/12). Los serovares implicados con mayor frecuencia en las infecciones extraintestinales fueron Salmonella
Enteritidis (5/12) y Salmonella Typhimurium (3/12). El resto de los
ailamientos correspondieron a Salmonella Infantis (2/12),
Salmonella Brandenburg (1/12) y Salmonella spp. (1/12). Todos
los aislamientos resultaron sensibles a cefalosporinas de tercera
generación. Cuatro presentaron resistencia a ampicilina (4/12) y
conjuntamente, tres de ellos también fueron resistentes a
trimetoprima – sulfametoxazol. En este estudio los casos de
salmonelosis extraintestinal no fueron frecuentes, no obstante,
deben ser sospechados en pacientes con fiebre y diarrea, aunque el coprocultivo sea negativo para esta bacteria. El hemocultivo
fue el principal sitio de aislamiento de SNT. Salmonella spp resultó altamente sensible a los antibióticos ensayados.
P174 – 27649 - MUESTRAS PARA CONTROL DE CALIDAD EXTERNO EN MICROBIOLOGÍA: EVALUACIÓN DE ETAPAS DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS. EXPERIENCIA DE 6 AÑOS. ZÁRATE, MARIELA SOLEDAD; SMAYEVSKY,
JORGELINA; CARRIZO, CAROLINA; DADAMIO, JESICA; ABALLAY,
DANIELA; QUIROGA, SILVIA; TORRES, MARTA
Centro de Educación Médica e Investigaciones Clínicas “Norberto
Quirno” (CEMIC)
El análisis microbiológico requiere el control de calidad en cada
una de sus etapas. La evaluación externa (CCE) es una herramienta necesaria para respaldar dichos procedimientos. Nuestro
objetivo fue evaluar las etapas de aislamiento e identificación de
microorganismos (mo) a partir de muestras clínicas liofilizadas.
Entre 2004 y 2009 se realizaron seis “pruebas piloto” (PP1 a 6),
con laboratorios públicos y privados participantes del ProgBA (Programa Buenos Aires). Materiales clínicos utilizados: líquidos de
diálisis peritoneal (LDP) (2), líquido ascítico (LA) (1), lavado
bronqueoalveolar (BAL) (1), exudado de fauces (EF) (1) y orina
(1). En PP4 se envió simultáneamente un frotis de LA con abundantes bacilos gram-negativos (BGN) y en PP6 un frotis de
hemocultivo con cocos gram-positivos (CGP) en racimo. Las
muestras se liofilizaron según el protocolo del ProgBA, cumpliendo con los requisitos de validación interna que demostró que el
proceso de liofilización no alteró la morfología y viabilidad de los
mo provenientes de muestras clínicas. Los laboratorios recibieron también una planilla de instrucciones para el manejo e informe de resultados. En todas las PP realizadas se evaluó concordancia en los morfotipos bacterianos observados en la coloración
de Gram, porcentajes de aciertos en la recuperación e identificación de mo. Además, en la PP1, PP2 y PP3 se evaluó la visualización microscópica de la coloración de Gram a partir de la muestra y en la PP5 se evaluó la detección de antígeno para Streptococcus grupo A. Se enviaron un total de 197 muestras: 34 en la
PP1, 22 en la PP2, 38 en la PP3, 26 en la PP4, 36 en la PP5 y
41 en la PP6. Los porcentajes de respuestas y aciertos en la recuperación e identificación de mo se observa en la tabla 1. El
porcentaje de aciertos para BGN y CGP en la visualización microscópica fue del 100% y 79% en la PP1, 94% y 80% en la PP2
y de 41% y 100% en la PP3, respectivamente. En la PP4 el 87 %
observó la presencia de BGN y PP6 el 94% de CGP en racimo
en la coloración de Gram. En la PP5 el 77% realizó la detección
del antígeno para S. grupo A.
P
Tasa de Materiales
Piloto respuesta clínicos
(%)
liofilizados
PP1
44
LDP
PP2
68
LDP
PP3
71
BAL
PP4
PP5
PP6
89
86
89
LA
EF
Orina
mo aislados
en la
recuperación
de mo
Escherichia coli
Streptococcus
agalactiae
Klebsiellap
neumoniae
Estafilococos
coagulasa-negativa
Staphylococcus
aureus
Acinetobacter
baumannii
E. coli
S. pyogenes
E. coli
Enterococcus
faecalis
% de aciertos
en la
identificación
de mo
% de aciertos
100/70
100/70
93/80
93/66
100/59
93/52
100
100
100/50
95
100
100/50
91
hinchamiento capsular con antisueros Statens Seruminstitut (Dinamarca) se realizó en el Instituto Nacional de Enfermedades
Infecciosas Carlos G. Malbrán. Resultados. Se identificaron 48
serotipos y 25 cepas fueron no tipables. La cobertura para los
serotipos incluidos en las dos vacunas conjugadas disponibles 10
valente (v) y 13v, según período de estudio, es la que se presenta en la Tabla. Cobertura para la enfermedad invasiva neumocócica / serotipo, según período, Hospital de Niños Sup Sor María Ludovica.
Período
n°
10V n (%)
13V n (%)
1994-2008
1994-1998
1999-2003
2004-2008
722
229
288
205
548
181
224
143
598 (82,8)
194(84,7)
247(85,8)
157(76,6)
(75,8)
(79)
(77,8)
(69,8)
La vigilancia clínica y microbiológica son los pilares fundamentales para el conocimiento de la incidencia y la circulación de los
serotipos de S. pneumoniae. Estos datos contribuyen al sustento
de la meta de desarrollo de vacunas (con amplia cobertura por
serotipos) para ser incluídas en el Calendario de Vacunación desde temprana edad.
P176 – 27688 - ESTUDIO DEL SULBACTAM COMO AGENTE
ESTRESANTE SOBRE AISLAMIENTOS NOSOCOMIALES DE
Acinetobacter baumannii. TORAN, JOSEFINA; MIQUELARENA,
AMADEO; DORRONZORO, ANDRES; VAZQUEZ, GUSTAVO;
FARINATI, ALICIA
Cátedra de Microbiología y Parasitología. Facultad de Medicina.
Universidad del Salvador. CABA
Observamos un fuerte incremento en la tasa de respuesta de los
laboratorios participantes en el transcurso de los años. Los CCE
en la visualización microscópica del frotis permitieron evidenciar
un buen porcentaje de aciertos. La alta tasa de aciertos en la recuperación e identificación de mo permitió evaluar las etapas iniciales del análisis microbiológico
P175 – 27674 - ENFERMEDAD INVASIVA NEUMOCÓCICA: PROFILAXIS ACTIVA EN NIÑOS. VESCINA, CM (1); GATTI, BM (1);
AGOSTI, MR (2); REGUEIRA, M (3); GONZALEZ AYALA, SE (2)
(1) Sala de Microbiología, laboratorio Central y (2) Servicio Enfermedades Infecciosas, Hospital de Niños Superiora Sor María
Ludovica, La Plata. (3) Departamento Bacteriología, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas “Dr. Carlos G. Malbrán”
Introducción: la enfermedad invasiva neumocócica es la causa más importante de morbi-mortalidad en los niños < 5 años. Han
sido identificados 91 serotipos de Streptococcus pneumoniae de
los cuales 40 provocan la enfermedad. El conocimiento de los
serotipos causales es necesario para definir la constitución de una
vacuna y asesorar sobre el beneficio de la profilaxis activa universal con las vacunas conjugadas disponibles. Materiales y métodos: para conocer la distribución de los serotipos aislados de
niños con enfermedad invasiva se realizó el estudio longitudinal
prospectivo (Protocolos SIREVA-CARIBE, OPS/OMS) de 722
cepas aisladas de niños de 0-5 años internados en el Hospital de
Niños Sor María Ludovica en el período 1994-2008, La Plata. Las
cepas fueron cultivadas a partir de sangre, líquido cefalorraquídeo,
pleural, peritoneal y/o articular. La serotipificación por técnica de
Acinetobacter baumannii (Ab) es una bacteria gram-negativa,
de morfología cocobacilar, no fermentadora, oxidasa negativa y
de amplia distribución en el ambiente, principalmente en el medio intrahospitalario. Este microorganismo que suele ser multirresistente (MR) se caracteriza por producir infecciones severas,
particularmente en pacientes inmunocomprometidos y formar
biopelículas (BP) sobre superficies bióticas y abióticas. El sulbactam (Sb), antibiótico beta-lactámico, ha demostrado tener actividad sobre estos aislamientos y en las biopelículas pueden funcionar como agentes estresantes. Objetivo: estudiar la actividad
de Sb sobre el desarrollo de BP de aislamientos nosocomiales
de Ab. Materiales y métodos: se usaron Ab MR: 6 aislamientos
con rango de CIM para Sb de 64-128mg/l (Grupo A) y 6 aislamientos con rango de CIM de 2-4 mg/l (Grupo B). Para los diferentes
experimentos, se crecieron los Ab MR en caldo Mueller-Hinton.
Las biopelículas de Ab grupo A se desarrollaron con Sb: 32 mg/l
(condición subCIM) y 2048 mg/l (condición supra CIM). Los del
grupo B se desarrollaron con 0.5 mg/l y 10 mg/l como sub CIM y
supra CIM respectivamente. En el grupo A el Sb se agregó junto
con el inóculo o 24 h posteriores a la inoculación. En el grupo B
el Sb se agregó en el momento de la inoculación de los aislamientos. Las biopelículas se visualizaron microscópicamente
creciéndolas en dispositivos de vidrios especiales. Resultados: la
observación microscópica de los dispositivos demuestra que los
aislamientos controles sin Sb formaron biopelículas integradas por
cocobacilos, pero cuando se agrega Sb en el momento de la inoculación del microorganismo todos los aislamientos mostraron
morfología o disposición alterada. En condiciones subCIM se observaron microcolonias formadas predominantemente por estructuras filamentosas. Por otra parte cuando el Sb se agregó después de la inoculación, sólo 4 Ab MR del grupo A formaron
biopelículas de menor densidad que las desarrolladas sin Sb. Se
observó una marcada tendencia a la formación de agrupamientos
espiculares. Los del grupo B en condiciones supraCIM demostraron un desarrollo poco denso y con concentraciones subCIM se
observaron formas filamentosas predominantes, en forma similar
a lo que ocurrió en el grupo A. Comprobamos que al aplicar el
agente estresante después de la formación de las BP, Ab sufre
alteraciones en su morfología. También es interesante destacar
que independientemente de la CIM frente al Sb que presente Ab,
la presencia del mismo produce marcadas deformaciones estructurales y en la forma de desarrollo y agrupación del microorganismo dentro de la BP.
92
Esto permitiría que el Sb deje las BP más accesibles a los
mecanismos inmunes en el caso de infecciones por Ab adquiridas en el hospital y a su vez permitir que otras sustancias utilizadas en los procedimientos de limpieza y desinfección hospitalaria puedan actuar de manera más eficiente. Este modelo permite
inferir que el uso de agentes estresantes sobre las BP de Ab sean
un camino viable para poder disminuir la colonización ambiental
y de elementos de uso intrahospitalario que se observa con este
microorganismo.
P177 – 27711 - COMPARACIÓN DEL MÉTODO DE HEMOCULTIVO AUTOMATIZADO CON BOTELLAS MYCO F LYTIC VS
LISIS CENTRIFUGACIÓN PARA EL DIAGNÓSTICO DE
FUNGEMIAS. TUTZER, SILVIA (1); GENTILINI, ANTONELA (1);
GUELFAND, LILIANA (1); FIGUEROA, VIRGINIA (1); BONNEU,
BEATRIZ (1); KAUFMAN, SARA (1)
(1) Sección Microbiología, Laboratorio Hospital J.A. Fernandez,
CABA. Argentina
En los pacientes inmunocomprometidos, especialmente por el
virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), las fungemias son
una causa frecuente de infección oportunista. El objetivo del trabajo fue comparar la recuperación de hongos productores de micosis sistémicas en pacientes VIH+, por método automatizado
BACTEC (Becton Dickinson) en botellas Myco F-Lytic (MFL) y el
convencional de Lisis Centrifugación (LC) con saponina. Entre el
1/1/2006 al 1/9/2009, se estudiaron en forma retrospectiva 905
cultivos de pacientes VIH+, con muestras procesadas por ambos
métodos (LC y MFL) en forma simultánea. En las botellas MFL,
utilizadas además para la búsqueda de micobacterias, se inocularon entre 3-5 ml de sangre, se incubaron a 35 °C por 44 días
en el equipo de lectura automatizada BACTEC 9050. De los 905,
en 39 desarrolló micobacterias por lo que se excluyeron de la
serie. Para la LC se emplearon tubos con EDTA (BD) y con el
agregado de 0,5 ml de saponina al 5%. Se inocularon con 9.0 ml
de sangre, se centrifugaron durante 30 minutos a 3000 rpm; del
sedimento se sembraron 4 tubos (0.25 ml/tubo): 2 Sabouraud (SB)
y 2 agar cerebro corazón (BHI) con cloramfenicol y se incubaron
a 28°C y 37 °C durante 3 semanas. Se consideró el gold standard al cultivo positivo para hongos por cualquiera de ambos
métodos. Se diagnosticaron 41 fungemias. Los hongos aislados
en total por LC fueron 38 y por MFL 25. Por LC se obtuvieron 17
cultivos positivos para Cryptococcus neoformans (Cn), 825 cultivos negativos, 3 falsos negativos y 1 falso positivo. Por MFL resultaron 17 cultivos positivos para Cn, 817 cultivos negativos, 2
falsos negativos, y 8 falsos positivos (contaminaciones con bacterias). De los cultivos positivos solo 14 fueron detectados por
ambos métodos. Respecto a la detección de Histoplasma
capsulatum (Hc), por LC se aislaron 21 cultivos positivos, ningún
falso negativo, 1 falso positivo y 825 cultivos negativos. Por MFL,
se obtuvieron 8 cultivos positivos, 6 falsos negativos y 15 falsos
positivos (contaminaciones con bacterias, o sin desarrollo en
subcultivos agar chocolate). Los cálculos de sensibilidad (S) y
especificad (E) para Cn e Hc arrojaron los siguientes resultados:
para Cn tanto por la técnica de LC como por MFL, la S y E fueron del 85% y 99%, respectivamente. Para Hc por LC la S fue
100% y 99.8% la E, en cambio por MFL la S y E fueron del 57.1%
y 98.2% respectivamente. Conclusiones: ambos métodos fueron
igualmente sensibles y específicos para la detección de Cn, no
así para la detección de Hc, donde la LC superó notablemente al
MFL. Para la detección de hongos filamentosos, la LC sigue siendo la técnica indicada. Hubo un porcentaje de falsos positivos más
alto al esperado en MFL, probablemente por ser un medio líquido muy enriquecido, lo que aumenta las probabilidades de contaminación bacteriana. Habría que realizar estudios futuros de
sensibilidad y especificidad con igual volumen de sangre para
ambos métodos, ya que con MFL se utilizó la mitad de volumen
de sangre.
P178 – 27716 - HISTOPLASMOSIS DISEMINADA EN PACIENTES CON SIDA. MACHAIN, M (1); RODRIGUEZ, F (2); FERREIRO,
D (1); FONTANAZZA, A (1); CEREGIDO, E (1); IDOIPE, J (2)
(1) Unidad Microbiología, (2) Infectología. Hospital Interzonal
General de Agudos “Dr. Abraham Piñeyro”
Introducción: la histoplasmosis (H) es una micosis sistémica
endémica producida por un hongo dimórfico Histoplasma
capsulatum (Hc). Su hábitat es el suelo húmedo y sombrío de
zonas templadas, rico en heces de aves y murciélagos. En Argentina la mayoría de los casos se registran en la provincia de
Buenos Aires. En individuos inmunocompetentes puede ser
asintomática, provocar enfermedad pulmonar aguda o diseminada crónica con lesiones en la mucosa oral. Las formas diseminadas agudas y subagudas han aumentado su frecuencia en zonas
endémicas, relacionado con la infección por VIH, originando procesos graves con compromiso pulmonar y extrapulmonar. Objetivo: en este trabajo se presentan las características clínicas y
microbiológicas de 15 casos de H diseminada (HD) en pacientes
con SIDA diagnosticadas en el HIGA Junín (Buenos Aires) desde el 2002 al 2009, sobre un total de 173 pacientes atendidos en
ese período. Materiales y métodos: se evaluaron en forma retrospectiva los episodios de HD a partir de los registros del laboratorio de microbiología y de 14/15 historias clínicas. Las muestras
de sangre y punción de médula ósea fueron procesadas por lisis
centrifugación con saponina y cultivadas en agar Sabouraud
glucosado y agar infusión cerebro corazón, incubados a 28°C y
35°C respectivamente durante 40 días. A las muestras de esputo, lesiones de piel obtenidas por escarificación y ganglio se les
realizó coloración de Giemsa y cultivo en las condiciones mencionadas. Las cepas fueron identificadas mediante observación
microscópica y confirmadas en el Departamento de Micología del
INEI-ANLIS “Dr.CG Malbrán”. Los pacientes recibieron tratamiento
con itraconazol, requiriendo algunos inducción previa con
anfotericina B desoxicolato. A los 30 días comenzaron tratamiento antirretroviral (TARV). Resultados: los síntomas más frecuentes fueron los constitucionales (pérdida de peso, anorexia, astenia y fiebre) 13 pacientes, seguidos por los respiratorios (tos con
expectoración, disnea y radiografía de tórax con predominio de
infiltrados bilateral) 12 pacientes. Nueve presentaron compromiso de piel (úlceras y costras) y 4 afección en la mucosa oral. En
14/15 casos fue la enfermedad marcadora de SIDA. El nivel de
CD4 fue menor 100 células/mm3. Se observaron elementos compatibles con Hc y/o desarrollo en 13/15 muestras de sangre, 7/7
de esputo, 7/9 de piel, 3/3 de médula ósea y 1/1 de ganglio. Sólo
en 2 pacientes el cultivo de sangre fue la única muestra positiva,
en 1 el examen directo de esputo y en 1 el examen directo de
piel. Conclusiones: la prevalencia de H en nuestra población con
VIH fue 8%, superior a la estimada en la literatura. En áreas endémicas debe considerarse la H dentro de los diagnósticos diferenciales en pacientes VIH+ con severo deterioro inmune, síntomas constitucionales, respiratorios y lesiones de piel. El cultivo de
sangre por lisis centrifugación fue el principal método diagnóstico.
El estudio de lesiones cutáneas resultó una herramienta muy útil
para el diagnóstico rápido de esta infección, así como el examen
directo de esputo. El tratamiento antimicótico más el TARV favoreció la reconstitución inmune, la sobrevida y evitó la recaída.
P179 – 27725 - ESTUDIO DE LA FRECUENCIA DE APARICIÓN
DE LEVADURAS EN UÑAS DE MANO EN EL HOSPITAL MUÑIZ.
LEHMANN, ERICA; WALKER, L; ARECHAVALA, A; SANTISO, G;
REYES, S; BIANCHI, M; MAIOLO, E
Hospital Muñiz. CABA
Introducción: las onicomicosis representan el 50% de las enfermedades de las uñas y son las más frecuentemente observadas en el mundo. En su mayoría son producidas por dermatofitos,
pero las lesiones ungueales con aislamiento de levaduras han sido
motivo de controversia durante mucho tiempo, pues se cuestiona
el rol patógeno de las mismas. Objetivo: conocer la frecuencia de
especies aisladas de uñas de mano en un período de 14 meses,
desde el 1/10/08 al 31/12/09. Definir las formas clínicas que se
relacionan con el aislamiento de levaduras. Materiales y métodos:
se consignó el sexo, la edad y el tipo de lesión ungueal de los
pacientes. Se tomaron escamas por raspado con sindesmótomo
estéril y se aclararon con KOH 40%. Se observaron al microsco-
pio óptico con 200 y 400 aumentos (examen directo) y se sembraron en Sabouraud-miel y Lactrimel. Se realizaron subcultivos
en medios cromogénicos (CHROMagar Candida®) y se registró el
color, aspecto y presencia de más de un tipo de colonias. A partir de una colonia aislada se realizó la identificación a nivel de
especie por métodos macro y micromorfológicos (agar leche, agar
harina de maíz) y pruebas de asimilación (API ID 32 C
bioMèrieux®). Resultados: se estudiaron 101 cepas provenientes
de 84 pacientes. Hubo un claro predominio del sexo femenino,
65 mujeres (77,4 %) y 19 hombres (22,6 %) con una edad promedio de 51,2 años. El 40,6% de los aislamientos correspondió
a Candida parapsilosis (41), el 19,8% a Candida albicans (20) y
el 18,8% a Candida tropicalis (19). El 20,8% restante correspondieron a Candida glabrata (8), Candida famata (3), Trichosporon
spp. (7) y un aislamiento de Candida magnoliae, Geotrichum sp.
y Cryptococcus sp. Entre las formas clínicas observadas, predominó la onicolisis pura (41 casos, 48,8%), seguida por la onicolisis
asociada a otra lesión (19 casos, 22,6%). En el 28,6 % restante
se observaron otras formas clínicas, como la distal subungueal
12 (14,3%), distrofia ungueal total 6 (7,1%) y 7,2% de: paroniquia
3, cromoniquia 1, onixis 1 y formas combinadas de paroniquia con
cromoniquia 1. En nuestro hospital se atendieron 884 consultas
por onicopatías en un período de un año, de las cuales solo 52
(5.9 %) fueron debidas a levaduras (datos no publicados). Por otra
parte en un estudio realizado en un centro privado, de un total
de 353 onicodistrofias de manos, 107 (30,3%) fueron por levaduras. Por lo que la importancia de esta patología varía enormemente con la población estudiada. Ambos estudios encuentran un
predominio del sexo femenino en la afectación de uñas de mano.
A diferencia de otros trabajos que hablan de un gran predominio
de C. albicans, nosotros observamos más de un 40% de C.
parapsilosis, C. albicans y C. tropicalis se aislaron aproximadamente en el 20% cada una. Más del 70% de las lesiones correspondieron a onicolisis, en tanto las formas clínicas típicas observadas en las onicomicosis por dermatofitos (distal subungueal y
distrofia ungueal total), sólo se observaron en el 21%. También
cabe resaltar que 17 pacientes tuvieron infecciones mixtas que
sólo pudieron detectarse por la presencia de colonias de distinto
color en CHROMagar.
P180 – 27736 - ACTIVIDAD IN VITRO DEL FLUCONAZOL: MÉTODO DE DIFUSION EN DISCOS VS TABLETAS NEOSENSITABS SOBRE LEVADURAS DEL GÉNERO Candida.
GONZALEZ, GUILLERMO; PALACIOS, NICOLAS; ALCORTA,
MALENA; ALVAREZ, CHRISTIAN
Hospital del Niño Jesús. Tucumán
Introducción: el método de microdilución, estandarizado por el
CLSI (documento M27-A2), para determinar la sensibilidad de las
levaduras a los antifúngicos, es muy laborioso para incluirlo en la
rutina en el laboratorio. Sin embargo, el método de difusión en
agar con discos de papel (M44-A), estandarizado para fluconazol,
ofrece mayor facilidad. Según el estudio realizado por EspinelIngroff y col. en el 2007 las tabletas Neo-SensitabsTM de FCZ,
tienen halos de inhibición reproducibles y presentan buena correlación con los discos de dicho antifúngico al realizar el método
(cualitativo) por difusión. Objetivo: comparar el uso de discos y
tabletas Neo-Sensitabs para la determinación de la sensibilidad
in vitro al FCZ de especies del género Candida. Materiales y
métodos: se incluyeron en el estudio un total de 154 aislamientos del cepario del laboratorio de Micología del Hospital del Niño
Jesús correspondiente a levaduras del género Candida; (70 C.
albicans, 44 C. tropicalis, 21 C. parapsilosis, 8 C. krusei, 6 C. famata, 3 C. glabrata y un aislado de C. dubliniensis y C. lusitaneae
y 2 aislados de referencia C. parapsilosis ATCC 22019 y C. krusei
ATCC 6258 (cepa documentada como resistente al FCZ). El análisis se realizó en dicho laboratorio usando placas de Agar MuellerHinton suplementado con 2% de glucosa y 0.5 ug/ml de azul de
metileno. A partir del cultivo se realizó un inóculo de turbidez 0.5
McFarland, se estrió el mismo sobre la superficie de la placa con
hisopo, y posterior incubación a 35 °C-15 minutos. Luego, se colocaron tabletas Neo-Sensitabs (Rosco Diagnóstica) y discos de
FCZ (Malbrán) [25ug] y nuevamente se incubo a 35 °C-24 h. Los
93
halos de inhibición se midieron en milímetros en el punto en el
cual hubo una reducción prominente del crecimiento (80%) a las
24 y 48 h. Se utilizaron los siguientes puntos de corte. Sensible
=16; sensible dosis dependiente 9 a 15 y resistente = 8. Resultados: al comparar los diámetros de inhibición entre los discos y
tabletas, no encontramos diferencias significativas. Tampoco entre el tiempo necesario para clasificar como S, SDD o R a un aislamiento, obteniendo un 100% de correlación. Detectamos 126
(81,8%) aislamientos sensibles al FCZ, 10 (6,5%) sensibles dosis dependientes y 18 (11,7%) resistentes al FCZ. El 100% de las
C. krusei (resistente natural al FCZ) incluida la cepa ATCC6258
dieron halos de = 8 mm a las 24 h; al igual que 3 cepas de C.
tropicalis; mientras que se pudo corroborar la resistencia a las 48
h en otras 2 cepas de C. tropicalis, 2 C. parapsilosis, 2 C. glabrata
y 1 C. lusitaneae. Nuestros resultados indican que pueden utilizarse indistintamente discos o tabletas Neo-Sensitabs por el método de difusión en agar para determinar la sensibilidad in vitro
al FCZ en la práctica diaria. Además, la aparición de resistencia
al FCZ en especies del género Candida y la recuperación de C.
krusei refuerzan la necesidad de contar con estos métodos de
sensibilidad antifúngica in vitro, reproducibles, que ayuden como
guía terapéutica en la toma de decisión y proporcionen un medio
para monitorizar el desarrollo de resistencia en estudios
epidemiológicos.
P181 – 27737 - TIÑA CAPITIS: EXPERIENCIA DE 11 AÑOS EN
UN HOSPITAL DE PEDIATRÍA DE TUCUMÁN, ARGENTINA.
ALCORTA, MARÍA ELENA; PALACIOS, NICOLAS; ALCORTA,
MARIA MALENA; ALVAREZ, CHRISTIAN
Introducción: la tiña capitis es una infección causada por hongos queratinofílicos denominados dermatofitos, los cuales son
capaces de invadir el estrato córneo y colonizar estructuras
queratinizadas (cuero cabelludo y pelos). Es más frecuente en la
infancia y constituye un problema sanitario importante, cuya incidencia y agentes causales varían según la ubicación geográfica,
el clima y las características socioeconómicas. Los niños pueden
adquirir la enfermedad por contacto directo con animales, personas, tierra o a través de las escamas vehiculizadas por la ropa u
otros objetos. Objetivo: establecer la prevalencia de las diferentes especies de dermatofitos en niños de 0 a 14 años de edad,
con diagnóstico presuntivo de tiña capitis en nuestro medio. La
población infantil estudiada comprende a pacientes de un estrato
social especial que solamente puede tener acceso a la consulta
médico-asistencial gratuita hospitalaria. Materiales y métodos: se
estudiaron 468 muestras provenientes de pacientes internados o
ambulatorios del Hospital del Niño Jesús entre enero de 2000 a
junio de 2010, cuyas edades comprendían entre 0 a 14 años de
edad, de ambos sexos (281 varones y 187 mujeres). Las muestras de escamas de piel se recogieron mediante raspado con bisturí estéril y la extracción de pelos parasitados se efectuó con
pinza de depilación. Los exámenes micológicos directos se realizaron por digestión alcalina en caliente con KOH 20% entre porta y cubreobjetos. Los cultivos, en medio de agar Sabouraud glucosa adicionado con antibióticos fueron incubados a 28 °C durante
15 días y la identificación de los dermatofitos se realizó siguiendo las claves de Rebell y Taplin. Resultados: el estudio, arrojó 392
(83,7%) resultados positivos. La mayor prevalencia la presentaron los individuos del sexo masculino 227 (57,9%) correspondiendo 165 (42,1%) al género femenino. El grupo etario de mayor incidencia fue el de 0 a 3 años seguido del grupo de 4 a 6 años de
edad. El porcentaje de resultados negativos totales obtenidos en
los cultivos fue del 16,3%. El orden de frecuencia de los dermatofitos aislados a partir de muestras clínicas fue: Microsporum
canis (91,6%) seguido por Trichophyton tonsurans (4,3%),
Microsporum gypseum (3,3%) y Trichophyton mentagro-phytes
(0,8%). 1) se observó un marcado predominio de la tiña capitis
en niños del sexo masculino (57,9%) de nuestro medio y en el
grupo de menor edad (0 a 3 años). 2) M. canis (91,6%) fue el
dermatofito que presentó mayor incidencia. 3) por último, es necesario resaltar que el diagnóstico de certeza (aislamiento e identificación del agente causal de la tiña capitis) requiere de la asis-
94
tencia de un laboratorio de micología, ya que la clínica sólo arriba a un diagnóstico presuntivo, el cual debe ser siempre corroborado en el laboratorio.
P182 – 27755 - IDENTIFICACIÓN DE DERMATOFITOS POR PCR
FINGERPRINTING CON (GACA)4, (GTG)5 O M13. SPESSO,
MARíA FLORENCIA; NUNCIRA, TANIA (1); DIB, MOISES (1);
MASIH, DIANA(2); CHIAPELLO, LAURA(2)
(1) Hospital Pediátrico, Córdoba (2) FCQ-UNC-CBA
Objetivo: estandarizar la técnica PCR fingerprinting para identificar especies de dermatofitos utilizando primers que hibridan con
secuencias mini y microsatélites dispersas en el genoma. Materiales y métodos: se recolectaron muestras de pacientes con sospecha clínica de dermatofitosis concurrentes al Servicio de Dermatología del Hospital Pediátrico del Niño Jesús de Córdoba
Capital. Las muestras fueron procesadas para examen directo con
KOH 40% y cultivadas en medio de Sabouraud y agar papa dextrosa. Luego de 20 días, se procedió a la tipificación de los cultivos positivos por las características macro y microscópicas de las
colonias. Para la extracción de material genético se seleccionaron los siguentes dermatofitos: Microsporum canis (n=40), Microsporum gypseum (n=5), Trichophyton rubrum (n=13), Trichophyton
mentagrophytes var. mentagrophytes (n=12) y Trichophyton
tonsurans (n=1). Se obtuvo el ADN genómico a partir del micelio
crecido en las colonias puras en pico de flauta, por pulverización
con mortero y aire líquido y la posterior extracción con fenol-cloroformo. Las reacciones de amplificación se realizaron utilizando
los siguientes primers: (GACA)4 (5´-GACA GACA GACA GACA3´), (GTG)5 (5´-GTG GTG GTG GTG GTG-3´) o M13 (5´GAGGGTGGCGGTTCT-3´). Luego de la amplificación, se corrieron gel de agarosa al 2% con el agregado de SybreSafe (Invitrogen) para la visualización, a 50 V por 75 minutos en buffer TAE
1x. La reproducibilidad de las técnicas con los diferentes primers
se evaluó realizando extracciones de ADN por duplicado y amplificando las muestras en reiteradas ocasiones. El análisis de las
imágenes se realizó con el programa GEL-PRO ANALIZER
3.1.00.00. Resultados: en general, se observaron bandas con
pesos moleculares en el rango de 300 a 1300 pb y de complejidad variable luego de la amplificación del ADN fúngico utilizando
PCR con cualquiera de los tres primers. La PCR con (GACA)4
mostró los perfiles de bandas más sencillos y reproducibles (entre 1 y 5 bandas dependiendo del hongo) con patrones característicos y distintivos para M. canis, M. gypseum y T. rubrum. Sin
embargo, la PCR con (GACA)4 no permitió diferenciar T.
mentagrophytes de T. tonsurans, ya que ambas especies mostraron perfiles genéticos idénticos. La PCR con (GTG)5 mostró patrones de bandas más complejos que los observados con
(GACA)4 pero se obtuvo un perfil de bandas característico para
cada una de las especies fúngicas analizadas. Finalmente, la PCR
con M13 mostró perfiles de bandas más complejos que los observados con (GACA)4 y con patrones distintivos para M. canis,
M. gypseum y T. rubrum, pero no permitía diferenciar T. mentagrophytes de T. tonsurans. La PCR fingerprinting con (GACA)4
es un método simple, rápido y reproducible para identificar M.
canis, M. gypseum y T. rubrum. Los perfiles constituidos por un
gran número de bandas obtenidos con la PCR fingerprinting con
(GTG)5 dificultan la reproducibilidad de la técnica, por lo cual se
lo propone como un segundo paso, cuando la especie hallada no
puede ser distinguida utilizando (GACA)4.
P183 – 27761 - APLICACIÓN DE MODELOS ESTADÍSTICOS A
LA DETECCIÓN DE BROTES DE SHIGELLOSIS. GALAS, M(1);
VIÑAS, M(1); PICHEL, M(1); STELLING, J(2); YIH, K(3); TUDURI,
E(1); KULLDORFF, M(3); VAN DER PLOEG, C(4); MIDAS ARGENTINA, GRUPO(5); TERRAGNO, R(1)
(1) INEI-ANLIS “Dr CG Malbrán”, (2) Brigham and Women’s Hospital, (3) Harvard Pilgrim Health Care, Harvard Medical School,
(4) INPB-ANLIS “Dr CG Malbrán, (5) La Pampa, LP; Neuquén, NQ
y Río Negro, RN.
El proyecto MIDAS (Models of Infectious Disease Agent Study)
para la detección de brotes de enfermedad se implementó en
Argentina desde 2007. Con modelos estadísticos (Kulldorff spacetime permutation scan statistic) de análisis espacio-tiempo,
SaTScan (STS) recorre bases de datos de laboratorio comparando
la situación actual con la histórica del lugar y lo que ocurre en
tiempo real a nivel local, regional o nacional buscando excesos
de casos en áreas/períodos determinados dando alarmas que
luego hay que confirmar por métodos habituales. Objetivo: evaluar la utilidad de incluir STS en la base nacional de datos de laboratorio de la Red WHONET-Argentina de Vigilancia de la Resistencia a los Antimicrobianos para la sospecha temprana de
brotes de shigellosis a través de la detección de clusters en tiempo real. 1ª etapa: se realizó un estudio retrospectivo con los laboratorios de la Red (70) para la detección de clusters con datos
de 2006-2007 comparando los resultados con los brotes informados al Sistema de Salud (MS) desde julio 2006-junio 2007. Con
los resultados y las capacidades provinciales en salud, se diseñó
la 2ª etapa: estudio prospectivo piloto, enero 2009-marzo 2010 con
7 hospitales de LP, NQ y RN. Estos cargaron y enviaron a ANLIS
cada miércoles datos de shigellosis, por semana epidemiológica
indicando género, especie, serotipo y antibiotipo, N= 762 aislamientos. Los jueves se unificó la información y se buscaron señales STS. Los viernes se analizaron los resultados e informaron
a los participantes para hacer la investigación epidemiológica y
enviar los aislamientos incluidos en las señales para evaluar su
relación genética por Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE). El
estudio retrospectivo mostró que 4 de los 6 brotes informados al
MS tenían buena concordancia con alguno de los 19 eventos
detectados por STS. De los 2 brotes restantes no hallados por
STS: i) la provincia no tenía datos históricos para el análisis ii)
brote de 4 casos en ciudad grande escapó a la sensibilidad del
sistema. En el estudio prospectivo se detectaron 15 señales de
Shigella flexneri y S. sonnei, 9 de las cuales fueron estudiadas
por PFGE obteniéndose correlación entre la señal y los perfiles
moleculares de los aislamientos. Cuatro de ellas tuvieron estudio
epidemiológico a nivel local, coincidente con la señal de STS. La
mediana del tiempo entre la aparición de la señal y el primer aislamiento de la misma fue de 14 días (rango 0-29). Hubo excelente correlación entre las señales y la relación clonal de las cepas
dentro de ellas. STS integrado con WHONET detectó eficiente y
tempranamente brotes de shigellosis y ofrece al MS la oportunidad de actuar en el control del mismo. Todas las señales incluyeron cepas relacionadas genéticamente y las estudiadas por el
MS fueron confirmadas como brotes, reforzando la necesidad de
la investigación epidemiológica confirmatoria. La aplicación de
STS a datos de laboratorio fue una herramienta novedosa que le
dio al diagnóstico individual un valor agregado para el estudio y
monitoreo de la epidemiología de la shigellosis.
P184 – 27764 - PERFIL DE SENSIBILIDAD DE AISLAMIENTOS
DE Cryptococcus neoformans DE PACIENTES CON CRIPTOCOCOSIS DISEMINADA ASOCIADA AL SIDA A 5 ANTIFÚNGICOS. SANTISO, GABRIELA ; ARECHAVALA, A; BIANCHI, M;
LEHMANN, E; WALKER, L; MAIOLO, E; NEGRONI, R
Hospital Muñiz. CABA
Introducción: Cryptococcus neoformans es una levadura
capsulada que produce meningitis en huéspedes inmunocomprometidos. En nuestra institución se observa actualmente que entre el 7 y el 8% de los pacientes con sida internados presenta
criptococosis diseminada. Dado que la erradicación de C.
neoformans implica la utilización de antifúngicos por un período
prolongado, esto podría favorecer la selección de cepas resistentes. Objetivo: determinar la CIM a 5 antifúngicos, de aislamientos
de C. neoformans provenientes de pacientes con criptococosis
diseminada asociada al SIDA, con el fin de estudiar el perfil de
sensibilidad en nuestra institución. Materiales y métodos: se estudiaron 280 aislamientos provenientes de 152 pacientes, a los
que se le realizó CIM (concentración inhibitoria mínima) por
microdilución a fluconazol, anfotericina B, voriconazol, albaconazol
y posaconazol, siguiendo la técnica del Documento M27-A2 del
CLSI. Se usaron como control de calidad 3 cepas de referencia
ATCC de sensibilidad conocida: Candida parapsilosis 22019,
Candida krusei 6258 y C. neoformans 90112. Los aislamientos de
C. neoformans fueron identificadas como tales por su capacidad
de desarrollar a 37 °C, la producción de fenol-oxidasa en el medio de girasol, la actividad de ureasa, presencia de cápsula en
preparaciones con tinta china y su diferenciación de Cryptococcus
gattii utilizando los medios de glicina-canavanina-azul de
bromotimol y glicina-cicloheximida-rojo fenol. Resultados:
Antifúngico
Anfotericina B
Fluconazol
Voriconazol
Posaconazol
Albaconazol
CIM50 µg/ml
CIM90 µg/ml
Rango µg/ml
0,5
4
0,06
0,03
0,03
1
8
0,06
0,12
0,06
0,03-2
0,12-32
0,03-025
0,03-0,25
0,03-0,12
De acuerdo con este estudio todos los aislamientos mostraron CIM
muy bajas para los fármacos ensayados. Solamente 10 aislamientos fueron sensibles dosis-dependeiente frente a fluconazol y 5
tuvieron CIM de 2 frente a anfotericina B. Estos datos son coincidentes con los encontrados en otras investigaciones. Se observó
que los nuevos azólicos demuestran gran actividad in vitro frente
a C. neoformans.
P185 – 27775 - MASTITIS BOVINA: CONCENTRACIÓN INHIBITORIA MÍNIMA DE PENICILINA, ERITROMICINA Y LINCOMICINA DE Streptococcus agalactiae. DENAMIEL, G (1);
PUIGDEVALL, T (1); TESTORELLI, F (1); ALBARELLOS, G (2);
GENTILINI, E (1)
Cátedras de Microbiología (1) y Farmacología (2). Fac. Cs. Veterinarias. UBA. Subsidio UBACyT V011.
Introducción: la mastitis es la enfermedad del ganado lechero
que mayores pérdidas económicas produce. Streptococcus agalactiae es una de las bacterias relacionadas con la infección
intramamaria (IIM) en los bovinos. La principal causa del uso de
antibacterianos en tambos es para prevenir o tratar IIM mediante
administración sistémica o local. En nuestro país, la mayoría de
las drogas utilizadas en los rodeos lecheros pertenecen a los grupos de ß-lactámicos, lincosamidas, eritromicina, aminoglucósidos
y rifamicinas, utilizándolos solos o asociados. El objetivo de este
estudio fue determinar la concentración inhibitoria mínima de penicilina, eritromicina y lincomicina frente a aislamientos de
Streptococcus agalactiae provenientes de mastitis bovina. Materiales y métodos: se estudiaron 43 aislamientos de S. agalactiae
obtenidos a partir de muestras de leche de animales con signos
clínicos de mastitis que provenían de establecimientos ubicados
en la provincia de Buenos Aires. Las muestras fueron procesadas por técnicas habituales de laboratorio. La caracterización de
los aislamientos se realizó a través de pruebas fenotípicas
(Facklan 2003), serológicas (Diagnostic Reagents Streptococcal
Grouping Kit, Oxoid, Basingstoke, Hampshire, England) y API 20
Strep bioMèrieux Argentina S.A. La concentración inhibitoria mínima (CIM) frente a penicilina, eritromicina y lincomicina se realizó por el método de macrodilución, según recomendaciones del
CLSI 2008 documento M31-A3. Se utilizó como cepa control
Streptococcus pneumoniae ATCC® 49619. Resultados: los valores obtenidos para CIM50 y CIM90 fueron respectivamente: penicilina: 0,0625 µg/ml y 0,125 µg/ml. Rango: 0,0156 - 0,5 µg/ml.
Eritromicina: 0,0625 µg/ml y 0,0625µg/ml. Rango: 0,0625 - 1 µg/
ml. Lincomicina: 0, 25 µg/ml y ≥ 4 µg/ml. Rango: 0,125 - ≥ 4 µg/
ml. Los perfiles de sensibilidad de S. agalactiae encontrados en
este estudio respecto a penicilina y eritromicina, se encuentran
dentro del rango de sensibilidad. Diferente es para lincomicina,
cuyos valores son ligeramente superiores a los esperados como
respuesta para esta droga. Esto podría deberse a que el control
de la mastitis en los rodeos lecheros se realiza mediante el uso
permanente de algún antibacteriano. Seguramente, esto ejerce una
sostenida presión de selección que puede inducir a cambios en la
expresión de los perfiles de sensibilidad de los microor-ganismos
con el consiguiente impacto en la salud pública y animal.
95
P186 – 27795 - MUCORMICOSIS CUTÁNEA PRIMARIA ASOCIADA A LA CONTAMINACIÓN DE FÉRULAS DE FIJACIÓN Y CINTAS ADHESIVAS DE TELA. PALACIOS, NICOLAS; GONZALEZ,
GUILLERMO; ALCORTA, MARIA ELENA; ALVAREZ, CHRISTIAN
Introducción: la mucormicosis cutánea primaria (MCP) es una
infección infrecuente causada por hongos no tabicados del orden
Mucorales, cuya característica es la invasión vascular por hifas,
lo que determina trombosis, infarto y necrosis tisular. Entre febrero
de 2008 a abril de 2009 hubo un brote de MCP en nuestro hospital que afecto a pacientes inmunodeprimidos (3 con leucemia
linfoblástica aguda, 1 con linfoma no Hodgkin y 1 con enfermedad granulomatosa crónica). Cabe destacar, que las lesiones
necróticas en piel de los pacientes, coincidían con el sitio de fijación de las vías. Por otro lado, reportes a nivel mundial de brotes
intrahospitalarios se asocian al contacto de la piel con gasas,
vendas, productos adhesivos usados en su ajuste y baja-lenguas
de madera contaminados. El objetivo del presente trabajo fue
determinar la posible asociación del brote de MCP con el uso de
férulas de fijación (FF) y cintas adhesivas de tela (CAT) usadas
rutinariamente en nuestro hospital. Materiales y métodos: un total de 10 FF y 10 CAT utilizadas en las salas donde fueron diagnosticados los casos de MCP, fueron procesadas en el laboratorio de Micología del Hospital del Niño Jesús en marzo de 2008.
Las FF (fabricadas en dicho hospital) estaban compuestas por
trozos de madera de 30x10x2cm, con extremos recubiertos con
goma espuma, una 1ª cubierta con plástico y una 2ª con tela; por
lo cual se realizó la siembra de los componentes por separado
en agar glucosa Sabouraud (SAG) a 28 °C. Además se cortaron
trozos de las CAT y se sembraron e incubaron de idéntica forma.
Las colonias vellosas se transplantaron en SAG y se identificaron a nivel de género en base a las claves de Hoog & Guarro
(2000). Resultados: en el 70% del total de FF y en el 60% de las
CAT, se aislaron hongos del género Mucorales, en el resto de
muestras no se aislaron hongos filamentosos no tabicados. A partir
de todos los componentes de las FF y de las CAT se recupero
gran proporción de hongos del género Rhyzopus y Mucor. El orden de frecuencia encontrados de las 10 FF fue: 5/71,4%
Rhyzopus spp., 1/14,3% Mucor spp. y 1/14,3% con mezcla de
ambos géneros. Solamente se aisló Mucor spp. de las CAT positivas. a) los resultados obtenidos en este estudio promovieron el
reemplazo de los dispositivos usados para fijar vías en el nospital,
no observándose ningún otro caso de MCP hasta el día de la fecha. b) la contaminación de los elementos de las férulas de fijación y cintas adhesivas de tela concordaba con los aislamientos
hallados durante el brote. (2 casos Rhyzopus spp. y 3 de Mucor
spp.). c) en base a estos datos, creemos que el uso de las FF y
CAT (contaminadas) en estos niños inmunodeprimidos fueron los
causantes de la infección por estos hongos oportunistas d) por
último, sería necesario confirmar esta hipótesis por estudios
moleculares de las cepas recuperadas de las FF, las CAT y de
los pacientes.
P187 – 27806 - DERMATOMICOSIS EN POBLACIÓN PEDIÁTRICA. VELAZQUEZ, ERNESTO (1); MERELES RODRIGUEZ,
BEDA E (1); CHADE, MIRIAM E (1); MEDVEDEFF, MARTHA G
(1); VEDOYA, MARIA C (1); SOSA, VANESA (1); VILLALBA, CECILIA (1)
(1) Servicio del Laboratorio de Micología, Facultad de Ciencias
Exactas, Químicas y Naturales, Universidad Nacional de Misiones
Las dermatomicosis son infecciones de la piel, pelo y uñas,
causadas por hongos queratinolíticos. Son muy frecuentes en la
consulta dermatológica. Dentro de estas, las más comunes son
producidas por hongos dermatofitos de los géneros: Epidermophyton, Trichophyton y Microsporum; hongos levaduriformes
del género Candida y levaduras lipofílícas del género Malassezia.
Este trabajo tuvo como finalidad contribuir al diagnóstico de cer-
96
teza y perfil epidemiológico regional de las dermatomicosis en la
población pediátrica. La población en estudio consistió en pacientes pediátricos de ambos sexos, del área metropolitana de la ciudad de Posadas y otras localidades de la Provincia de Misiones,
con diagnóstico presuntivo de dermatomicosis, derivados al servicio del laboratorio de Micología. Las muestras clínicas obtenidas de las lesiones, fueron sometidas a examen microscópico
directo (KOH 20%), cultivadas en medios micológicos de rutina e
incubadas a temperatura ambiente, con controles periódicos semanales. La diferenciación en géneros y especies de los hongos
aislados se realizó según sus características macroscópicas, microscópicas y fisiológicas. Desde febrero de 2000 a mayo de 2009,
se procesaron 611 muestras de pacientes pediátricos, de las cuales 53,5% resultaron positivas para hongos; 286 fueron de pacientes masculinos, con 54,4% de positivas y 325 de femeninos, donde
45,6% fueron positivas. La frecuencia en pacientes de 0 a 4 años
fue de 54,6%; 56,7% en los de 5 a 9 años y 45,9% en los de 10
a 14. Se analizaron 355 muestras de lesiones en cuero cabelludo, 65,6% fueron positivas; 222 de piel con 34,7% positivas y 34
de uñas, resultando 50% positivas. Microsporum canis representó 62,4% de los agentes fúngicos aislados, Trichophyton
mentagrophytes, 12,5%, T. rubrum, 5,8%, M. gypseum, 4,6%, Malassezia spp., 3,1%, Trichophyton spp. 2,8%, Trichosporon spp.
y Candida albicans 1,8% y otros agentes representaron menor
frecuencia. Se determinó alta frecuencia de dermatomicosis en la
población pediátrica estudiada, principalmente de infecciones en
cuero cabelludo producidas por M. canis. No se observó diferencias significativas con respecto a edad y sexo.
P188 – 27814 - PREVALENCIA DE LAS MICOSIS HUMANAS EN
ARGENTINA. DAVEL, GRACIELA (1); MAZZA, MARIANA (1);
REFOJO, NICOLAS (1); RIVAS, CRISTINA (1); CANTEROS, CRISTINA (1); GRUPO, ENCUESTA 2008 (2)
(1) Departamento Micología, INEI, ANLIS “Dr. C. G. Malbrán”. (2)
Red Nacional de Laboratorios y Programa Nacional de Control de
Calidad en Micología
Los cambios en la epidemiología de las micosis generaron la
necesidad de desarrollar en Argentina una Red Nacional de Laboratorios (RNLM) y un Programa Nacional de Control de Calidad en Micología, con el objetivo de mejorar la calidad del diagnóstico en los hospitales. El trabajo coordinado de estos laboratorios permitió realizar en 2004, una encuesta retrospectiva de
micosis diagnosticadas, en la cual participaron 72 laboratorios de
19 provincias y Ciudad de Buenos Aires, los que notificaron 23.600
casos. El objetivo de este trabajo fue conocer la prevalencia de
las micosis diagnosticadas en 2008, realizando una nueva encuesta retrospectiva y analizar los cambios de frecuencias detectados
respecto de la encuesta de 2004. En 2008, se notificaron 23.904
casos de micosis en 109 laboratorios distribuidos en todo el país.
La prevalencia global fue 60,1 cada 100.000 habitantes (micosis
superficiales: 31,2 cada 100.000 habitantes, candidiasis de las
mucosas: 24,0 cada 100.000 habitantes, micosis subcutáneas: 0,1
cada 100.000 habitantes y micosis sistémicas: 4,8 cada 100.000
habitantes). Las dermatofitosis fueron las micosis más prevalentes
(22,0 cada 100.000 habitantes), seguidas de las candidiasis
vaginales y vaginitis por levaduras (21,4 cada 100.000 habitantes). Entre las micosis profundas, las más prevalentes fueron las
candidemias y otras infecciones por levaduras (1,4 cada 100.000
habitantes), seguidas de criptococosis (1,2 cada 100.000 habitantes), aspergilosis broncopulmonar crónica (0,5 cada 100.000 habitantes), histoplasmosis (0,4 cada 100.000 habitantes), neumocistosis (0,4 cada 100.000 habitantes), paracoccidioidomicosis (0,2
cada 100.000 habitantes) y coccidioidomicosis (0,03 cada 100.000
habitantes). La comparación de las frecuencias de micosis notificadas en ambas encuestas mostró que en 2008 aumentaron las
micosis superficiales (p<0.05), disminuyeron las vaginales y endémicas (p<0.05), no se observaron cambios en las micosis subcutáneas (p>0,05) y se incrementaron las sistémicas oportunistas, especialmente la criptococosis que aumentó de 328 casos en
2004 a 487 en 2008 (p<0,05). A pesar de la baja prevalencia de
la coccidioidomicosis, los casos aumentaron de 5 en 2004 a 11
en 2008. Los resultados obtenidos muestran que las micosis
prevalentes continúan siendo las dermatoficias, las candidiasis
vaginales y las micosis sistémicas oportunistas, seguidas de las
endémicas. La notificación de las micosis diagnosticadas en los
laboratorios de la RNLM en 2004 y 2008, permitió centralizar información consolidada y estructurada; posibilitando, por primera
vez, la estimación de la prevalencia de las micosis humanas en
Argentina. Estos resultados representan sólo las micosis notificadas por los laboratorios hospitalarios que constituyen la RNLM. El
sistema de vigilancia epidemiológica laboratorial (SIVILA) que está
siendo implementado desde el Ministerio de Salud de la Nación,
permitirá en un futuro conocer más sobre la epidemiología de las
micosis en todas las jurisdicciones sanitarias de Argentina.
P189 – 27827 - INFECCIONES FÚNGICAS SUPERFICIALES Y
CUTÁNEAS EN PACIENTES DIABÉTICOS. SANCHEZ, ANDREA
(1); MERELES RODRIGUEZ, BEDA E (1); CHADE, MIRIAM E (1);
MEDVEDEFF, MARTHA G (1); VEDOYA, MARIA C (1); THEA, ANA
E (1); JAQUET, BELEN (1)
(1) Servicio del Laboratorio de Micología, Facultad de Ciencias
Exactas, Químicas y Naturales, Universidad Nacional de Misiones
En los últimos años se incrementó el número de diagnóstico
de micosis en el mundo entero. Las micosis superficiales y cutáneas son las de mayor prevalencia y constituyen un importante
problema sanitario. El paciente diabético al tener alteradas las
cifras de glucemia se convierte en un “terreno abonado” para la
propensión y padecimiento de las infecciones. La diabetes mellitus
se asocia con una alta incidencia de infecciones bacterianas y
micóticas (25%) en la piel y anexos, en especial onicomicosis. El
objetivo del presente trabajo fue evaluar la frecuencia de infecciones fúngicas superficiales y cutáneas en pacientes diabéticos,
su relación con edad, sexo, localización topográfica, valores de
glucemia y agentes etiológicos involucrados. Se realizó un estudio prospectivo y transversal en 35 pacientes diabéticos
ambulatorios, que concurrieron al laboratorio de Micología. Se
estudiaron 23 pacientes de sexo femenino y 12 de sexo masculino con edades de 19 a 72 años (media aritmética 51.15), 33 con
diabetes mellitus tipo II y 2 con diabetes mellitas tipo I. Se confirmó el diagnóstico clínico de micosis en 20 pacientes (57%; 20/
35). Las localizaciones más frecuentes fueron en uñas de pies (11/
23) y manos (8/23). No se observaron diferencias significativas
en los valores de glucemia promedio de los pacientes en los que
se diagnosticó micosis y aquellos en los que no se demostró infección fúngica (p> 0,05). Pudo observarse que en uñas de pies
los agentes etiológicos aislados con mayor frecuencia fueron los
dermatofitos: Trichophyton rubrum (5/11) y Trichophyton mentagrophytes (2/11), mientras que en uñas de manos se aislaron levaduras del género Candida. Otro género involucrado en lesiones de uñas de pies fue Fusarium sp. (1/11), hongo filamentoso
no dermatofito con capacidad queratinofílica. Se concluye que estas infecciones son de alta frecuencia en pacientes diabéticos mayores de 47 años sin diferenciación de sexo. No existe diferencia
significativa entre la adquisición de estas micosis y los valores promedio de glucemias. Las localizaciones de dermato-micosis predominantes son las de uñas de pies y manos. Los agentes
etiológicos más frecuentes en lesiones podales son T. rubrum y T.
mentagrophytes, mientras que en onicomicosis de manos son C.
parapsilosis, C. tropicales y C. albicans. Es imprescindible el diagnóstico precoz en los pacientes diabéticos debido a la alta frecuencia de dermatomicosis observada, para implementar un tratamiento especifico y evitar complicaciones posteriores.
P190 – 27838 - BÚSQUEDA DE Candida dubliniensis MEDIANTE PRUEBAS FENOTÍPICAS. NARDIN, MARIA ELENA (1);
MORANO, SUSANA (1); ARO, CAROLINA (1); MENDEZ, EMILCE
DE LOS A (1)
(1) Sección Microbiología-Laboratorio Central-Hospital J.M.Cullen.
Santa Fe
Introducción: en 1995 se describió Candida dubliniensis como
una nueva especie patógena, responsable de cronicidad y resis-
tencia a algunos antimicóticos. Presenta una estrecha relación
filogenética con Candida albicans ya que ambas poseen la capacidad de adherirse a la superficie epitelial, de secretar proteinasas,
de producir tubo germinativo y clamidoconidios; por lo que se hace
difícil diferenciarla a nivel de laboratorio clínico. Objetivo: identificar C. dubliniensis con metodología sencilla, aplicable a un laboratorio público. Materiales y métodos: se estudiaron 90 colonias
de levaduras-tubo germinativo positivo (en suero humano, en tres
horas, a 37 °C) aisladas de exudado genitales femenino que concurrieron al Hospital J.M. Cullen en el período 1 de marzo a 14
de junio del 2010. Se realizaron las siguientes pruebas fenotípicas:
color en medio cromogénico (CHROMagar Candida) (verde
claro:C.albicans; verde oscuro: C. dubliniensis), crecimiento a 45
°C en agar glucosado Sabouraud (AGS), producción de clamidoconidios (CL) en agar harina de maíz (AHM), producción de CL,
observación de morfología y color de las colonias en agar tabaco
(AT) y asimilación de D-xilosa (tabletas Rosco). Se utilizaron como
control cepas de referencia C. albicans ATCC 90028 y C.
dubliniensis (primer aislamiento realizado por Sullivan en Dublin
en 1995). Resultados: en el medio cromogénico no se pudo observar diferencia en la tonalidad del color verde para la identificación presuntiva y la asimilación de D- xilosa resultó el 100%
positiva. Tabla. Resultados de las pruebas de los 90 aislamientos estudiados. En AT observamos que de los 24 aislamientos que
producían CL, todos presentaron bordes festoneados sin poder
distinguir los colores. Tres de ellas no desarrollaron a 45°C, por
lo que los consideramos sugestivos de C. dubliniensis. A estos
se les realizó la prueba fisiológica API ID 32 C que los identificó
como C. albicans.
Crec. 45°C
Pos.n (%)
82
(91,11%)
Crec. 45 °C
Neg.n (%)
8
(8,89%)
CL en AHM
Pres. n (%)
70
(77,78%)
CL en AHM
Aus. N (%)
20
(22,22%)
CL en AT
Pres. n (%)
24
(26,67%)
CL en AT
Aus. N (%)
66
(73,33%)
En este trabajo concluimos que todas las cepas estudiadas fueron C.albicans. Ninguna de las pruebas fenotípicas resultó contundente para la diferenciación como sostienen diferentes autores. Consideramos importante reevaluar y mejorar la caracterización fenotípica para la correcta identificación.
P191 – 27840 - MENINGITIS POR Cryptococcus neoformans
DESDE ENERO 2009 A MAYO 2010- HOSPITAL PERRANDOCHACO. TRACOGNA, MARIA FERNANDA; GARIBOGLIO
VAZQUEZ, MARIA LUCRECIA; CAROL REY, MARIANA CARINA;
MARQUES, ISABEL ANA
Hospital Perrando – Chaco
Cryptococcus neoformans (C. neoformans) es una levadura
encapsulada que puede afectar a individuos sanos, pero con
mayor frecuencia se presenta en individuos inmunocomprometidos
generando infecciones oportunistas, aumentando la morbi-mortalidad de pacientes con Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida
(SIDA). La principal manifestación clínica de la criptococosis es
la meningitis, aunque en pacientes con inmunosupresión grave se
puede diseminar ampliamente en piel, hígado, bazo, glándulas
suprarrenales y huesos. Se realizó un estudio retrospectivo de
líquidos cefalorraquídeos (LCR) de pacientes adultos que ingresaron al Servicio de Microbiología del Hospital “Julio C. Perrando”
desde enero de 2009 a mayo de 2010. Los pacientes estuvieron
internados en distintas salas del Hospital (principalmente en unidad de terapia intensiva, unidad de aislamiento y clínica médica).
La punción lumbar se realizó en base a la presencia de síntomas
meníngeos (cefaleas, vómitos, alteración del sensorio, rigidez de
nuca, fiebre y en algunos casos convulsiones). El análisis
micológico de los LCR consistió en: examen directo en fresco y
con tinta china, coloraciones de Gram y May Grunwald Giemsa.
El test de látex para detección de antígeno de Cryptococcus spp.
(Latex-Cryptococcus Antigen Detection System Inmuno Mycologic)
se ensayó únicamente en aquellos líquidos con expresa solicitud
médica. Fueron sembrados en medios agar chocolate y 4 tubos
de agar Sabouraud adicionado con cloramfenicol, incubados a 28°
y 35°. Las cepas de levaduras que desarrollaron en agar
Sabouraud y agar chocolate fueron identificadas mediante la prue-
97
ba de urea de Christensen, observación de la morfología en agar
arroz y el kit comercial API ID32C (bioMèrieux). De 188 pacientes estudiados con diagnóstico presuntivo de meningitis en 9
muestras de LCR se diagnosticó Cryptococcus spp. (4,8%). Todas ellas dieron pruebas de látex positivo, 8 se recuperaron en
los cultivos y se identificaron mediantes pruebas bioquímicas
manuales y comerciales, 6 cepas fueron confirmadas a nivel de
especie como C. neoformans por la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) por el Instituto INEI-ANLIS “Dr. Carlos G.
Malbrán” y el Instituto de Medicina Regional, Universidad Nacional del Nordeste. De los nueve pacientes, seis presentaban
serología positiva para VIH, dos pacientes cursaban enfermedades inmunosupresoras (artritis reumatoidea y leucemia linfoblástica crónica) y a uno no se le detectó enfermedad de base alguna. La edad promedio de los pacientes con diagnóstico de
criptococosis meníngea fue de 37 años, con una relación varónmujer de 3,5. Si bien las infecciones por C. neoformans son más
frecuentes en pacientes VIH, debe tenerse en cuenta su hallazgo en un paciente inmunocompetente. Ademas, el aumento de la
incidencia de pacientes con compromiso del sistema inmune debe
alertar al microbiólogo e incluir de rutina la búsqueda de C.
neoformans en todos los LCR.
P192 – 27881 - BROTE DE SÍNDROME URÉMICO HEMOLÍTICO
ASOCIADO A LA INFECCIÓN POR Escherichia coli O157:H7
EN UN JARDÍN MATERNAL DE LA CIUDAD DE CÓRDOBA.
MILIWEBSKY, E(1); DEZA, N(1); BASCHKIER, A(1); DASTEK, B(1);
CARBONARI, C(1); MANFREDI, E(1); CHINEN, I(1); SUAREZ,
ME(2); ESQUIVEL, P(3); RIVAS, M(1)
(1) INEI-ANLIS “Dr. CG MALBRÁN”, (2) Laboratorio Central, Córdoba, (3) EPI, Córdoba
Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) O157, es
un patógeno emergente asociado a casos esporádicos y a brotes
de diarrea (D) con o sin sangre (DS) y síndrome urémico hemolítico (SUH). La transmisión persona a persona por la vía fecaloral ha sido señalada como una vía importante de transmisión.
Los niños y adultos que asisten a jardines maternales o de infantes constituyen grupos de riesgo, debido a fallas en los hábitos
de higiene que pueden producirse en estos centros. El riesgo
aumenta debido a la baja dosis infectiva del patógeno. En la semana epidemiológica 38 del año 2009 se notificaron a Epidemiología de Córdoba dos casos de SUH. El primer caso informado fue el de una niña de 33 meses que comenzó con síntomas
de D el 22/09/09, continuó con DS el 24/09 y falleció por SUH el
25/09. El segundo caso fue un niño de 21 meses que comenzó
con D el 14/09, continuó asistiendo al jardín hasta presentar DS
el 24/09 y fue internado con SUH el 28/09. Según la investigación se estableció que los niños asistían al mismo jardín maternal de la Ciudad de Córdoba. El jardín contaba con dos salas para
los más pequeños: A (hasta 24 meses) y B (>24 meses). Los niños con SUH compartieron las actividades de la sala A desde el
14 al 18/09. Cinco niños (3 de la sala A y 2 de la sala B) presentaron D durante el período del 18 al 23/09. El objetivo de este trabajo fue realizar el estudio bacteriológico del brote y establecer
el tiempo de excreción del patógeno. Muestras de materia fecal
del niño con SUH, contactos familiares (n=2), niños de las salas
A (n=18) y B (n=16) y de tres maestras fueron procesadas para
la identificación de STEC. Las muestras fueron sembradas en
forma directa y luego del enriquecimiento en caldo tripticasa de
soja suplementado con cefixima y telurito de potasio, en agar Mac
Conkey-sorbitol. La detección de los genes stx1, stx2 y rfbO157
se realizó por PCR múltiple. En aquellas muestras que por el primer tamizaje por PCR no se recuperó E. coli O157, se aplicó la
técnica de separación inmunomagnética (SIM). Los aislamientos
stx-positivos fueron caracterizados por técnicas feno-genotípicas
y de subtipificación. Por PCR se detectó señal positiva para los
genes stx2 y rfbO157 en seis muestras. En dos de estas muestras y en otra PCR-negativa, solo se aisló la bacteria luego de la
SIM. Se identificó E. coli O157:H7, stx2/stx2c (vh-a)/eae/ehxA en
el caso de SUH, en 5 niños con D y en un asintomático (sala B).
Por Xba I-PFGE, todas las cepas presentaron el mismo patrón de
restricción correspondiendo a un único clon. Seis niños infecta-
98
dos excretaron la bacteria por un período entre 15 y 49 días. Estos resultados indican la necesidad de implementar medidas de
control en los hábitos de higiene en instituciones de cuidado diario. También se enfatiza el cumplimiento de la normativa que establece la prohibición de asistencia de personas infectadas, hasta no tener dos coprocultivos negativos con un intervalo de 48 h.
P193 – 27907 - DETECCIÓN DE Histoplasma capsulatum EN
PEQUEÑOS MAMÍFEROS SILVESTRES EN LA PAMPA HÚMEDA ARGENTINA. IBARRA CAMOU, BELEN (1); TORANZO,
ADRIANA (1); SUAREZ ALVAREZ, ROBERTO O (1,2); DAVEL,
GRACIELA (1); LEVIS, SILVANA (3); CANTEROS, CRISTINA E (1)
(1) Departamento Micología, Instituto Nacional de Enfermedades
Infecciosas, ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”. (2) Departamento de
Microbiología y Parasitología, Facultad de Medicina, Universidad
Nacional Autónoma de México, México DF. (3) Instituto Nacional
de Enfermedades Virales Humanas “Dr. Julio I. Maiztegui” Pergamino.
Histoplasma capsulatum es el agente causal de la histoplasmosis, micosis de amplia distribución en la República Argentina. La principal área endémica es la región denominada Pampa
Húmeda y es de donde provienen la mayoría de los casos clínicos. En esta región geográfica se han detectado porcentajes de
infección en humanos de aproximadamente 30 % a través de
pruebas de intradermorreacción con histoplasmina. Las técnicas
moleculares fueron utilizadas por diversos autores para establecer las áreas endémicas de diferentes micosis. Estas técnicas
permiten detectar ADN fúngico en el ambiente o en animales silvestres los que pueden actuar como reservorios y dispersores de
hongos de importancia médica. Se conoce que diferentes animales silvestres son capaces de infectarse con H. capsulatum y desarrollar la enfermedad, entre ellos los pequeños mamíferos terrestres. El objetivo de este trabajo fue detectar infección por H.
capsulatum en pequeños mamíferos terrestres autóctonos de la
Pampa Húmeda Argentina. Se analizaron los órganos (hígado o
bazo) obtenidos por necropsia de 34 mamíferos terrestres silvestres capturados en diferentes localidades de la Pampa Húmeda
Argentina, entre los paralelos de 33°-34° de latitud sur y 59°-61°
longitud oeste. Las especies estudiadas fueron: 17 Calomys laucha (laucha pequeña), 6 Calomys musculinus (ratón maicero), 5
Akodon azarae (ratón del pastizal pampeano), 3 Monodelphis
dimidiata (colicorto pampeano), 2 Didelphis albiventris (comadreja overa) y 1 Cavia aperea (cuis). Para detectar la presencia de
ADN fúngico en los órganos analizados se utilizó una PCR anidada que amplifica un fragmento del gen hcp100 específico de
H. capsulatum. El ADN de H. capsulatum fue detectado en tres
especies de roedores (4/17 C. laucha; 2/6 C. musculinus y 1/5 A.
azarae) y en dos especies de marsupiales (1/3 M. dimidiata y 1/2
D. albiventris). Los resultados sugieren que tanto roedores como
marsupiales pueden actuar como reservorios y convertirse en
potenciales dispersores del hongo en el ambiente. Éste es el primer estudio que registra infección por H. capsulatum en C. laucha, C. musculinus y M. dimidiata.
P194 – 27937 - PRIMER AISLAMIENTO DE Candida pseudorugosa EN HEMOCULTIVO. TAVERNA, CG(1); BOSCO BORGEAT,
ME(1); TIRABOSCHI, IN(2); FERNANDEZ, N(2); GARCIA, S(2);
CORDOBA, S(1); MURISENGO, O(1); VIVOT, W(1); CANTEROS,
CE(1); DAVEL, G(1)
1 INEI-ANLIS “Dr.C.G.Malbrán”, 2 Hospital de Clínicas “José de
San Martín”
Candida pseudorugosa fue descripta por primera vez en 2006,
aislada de una muestra de esputo. Desde esa fecha no se informaron otros aislamientos de esta especie a partir de materiales
clínicos. El objetivo de este trabajo es informar el primer aislamiento de C. pseudorugosa recuperada de hemocultivo. En 2008, ingresó al hospital una mujer de 49 años con diagnóstico de gioblastoma multiforme, que presentaba cefalea y síndrome vertiginoso. La paciente fue intervenida quirúrgicamente por una recidi-
va tumoral. En el acto quirúrgico se extrajo material purulento de
la duramadre, que se envió para estudios microbiológicos. En el
mismo se recuperó Propionibacterium acnes por lo que se inició
tratamiento antibiótico y se colocó un catéter venoso central
(CVC). A los 20 días, la paciente presentó síndrome febril, por lo
que se realizaron 2 hemocultivos y se retiró el CVC. En los
hemocultivos y en la punta de catéter desarrollaron levaduras. Dos
colonias de cada material se reaislaron en CRHOMagar Candida
y se identificaron por métodos fenotípicos y genotípicos. La identificación fenotípica se realizó por el método comercial API 32C y
por la metología de referencia. Los resultados de esta última, fueron analizados en la base de datos del Centraalbureau voor
Schimmelcultures (CBS). Se determinó la concentración inhibitoria
mínima (CIM) para diferentes antifúngicos utilizando el micrométodo según el documento E. Def. 7.1 del EUCAST. Los estudios moleculares se realizaron por técnicas de PCR con los
primers fúngicos universales NL1-NL4 e ITS1-ITS4 que amplifican el dominio variable D1/D2-26S y la región ITS1-5.8S-ITS2 del
ADN ribosomal, respectivamente. Los productos de PCR fueron
secuenciados para ambas hebras. Las secuencias fueron editadas en el programa BioEdit y se realizó una búsqueda de
homología con las secuencias depositadas en el GenBank utilizando el programa BLAST. La identificación por API 32C fue
Candida rugosa para todos los aislamientos, mientras que los
resultados del método de referencia fueron ambiguos y orientaban a C. rugosa o C. pararugosa con porcentajes >94%. Las secuencias obtenidas tanto del dominio D1/D2 como de la región
ITS1-5.8S-ITS2 fueron idénticas para todos los aislamientos. El
análisis comparativo arrojó un porcentaje de similaridad de 99%
para el dominio D1/D2 y de 94% para la región ITS1-5.8S-ITS2
con C. pseudorugosa. Los valores de la media aritmética de CIM
en mg/l fueron: 0,67 anfotericina B; 0,71 fluconazol; 0,022
itraconazol; 0,025 voriconazol; 0,063 anidulafungina y 0,13 5fluorocitosina. Este es el primer aislamiento de C. pseudorugosa
en Argentina y el primero recuperado de hemocultivo en el mundo. Las técnicas fenotípicas no fueron concluyentes, probablemente porque ésta especie, recientemente descripta, no se encuentra en la base de datos utilizada para el análisis fenotípico. Los
valores de CIM obtenidos no coincidieron con los descriptos para
la especie. Las técnicas moleculares permitieron determinar con
certeza la identidad del aislamiento, resaltando la importancia de
la utilización de estas técnicas en los centros de referencia.
P195 – 27979 - DETECCION DE Mycoplasma genitalium Y
Chlamydia trachomatis EN HOMBRES VIH POSITIVOS SIN
URETRITIS, CÓRDOBA ARGENTINA. VENEZUELA, FERNANDO;
KREMER, LUIS EMILIO (1); KIGUEN, XIMENA (2); FRUTOS, M
CELIA (2); CUFFINI, CECILIA (2)
(1) HNC, (2) Instituto de Virología “Dr. José M. Vanella” (INVIV)
Introducción: Mycoplasma genitalium (M.g.) fue aislado por
primera vez en 1980 y si bien han transcurrido más de 30 años y
algunos estudios lo han asociado con uretritis no gonocócica
(UNG), su rol patológico aún no es del todo claro. Debido a que
su crecimiento en medios de cultivo es lento, el diagnóstico se
realiza por técnicas moleculares como la amplificación del ADN
mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Chlamydia trachomatis (C.t.) es una de las infecciones de transmisión sexual más frecuente. En el hombre es la responsable del
50% de las UNG y de la mayoría de las uretritis post-gonocócica.
Se encuentra asociada a epididimitis, prostatitis, pudiendo producir
estenosis de los conductos y orquitis. Objetivo: evaluar la frecuencia de las infecciones por M.g. y C.t. en pacientes VIH (+) sin síntomas de uretritis. Pacientes y métodos: se tomaron muestras de
hisopado uretral a 29 hombres (23 VIH positivos), sin síntomas
de uretritis, que asistieron al Servicio de Infectología del Hospital
Nacional de Clínicas, Córdoba. Se realizó, por PCR, la detección
de M.g. (genes ARNr 16s MgPa1/3), y C.t. (genes OMP1 A1/A2/
PCTM3 y plásmido CTP1/2). Para el análisis estadístico se utilizó el programa EPI INFO, versión 3.5.1, 2008. Resultados: en 5
(21,73%) de los 23 pacientes VIH (+) y en 3 (25%) de los 12 en
estado de VIH-SIDA, se detectó M.g. De los 6 pacientes VIH (-),
2 (33,3%) arrojaron resultado positivo para M.g. Entre los 29 pa-
cientes, sólo 2 VIH (-) (33,33% - 2/6) fueron positivos para C.t.
En uno de ellos se detecto el genotipo L2 y ambos presentaron
coinfección con M.g. Se debe destacar que, el 66, 67% (2/3) de
los bisexuales, el 12,5% (2/16) de los homosexuales, el 30% (3/
10) de los heterosexuales, el 28,57% (6/21) de los que tuvieron
más de 3 parejas sexuales en el último año (media 6,66) y el
12,5% (1/8) de los que tuvieron menos de 3 parejas, fueron positivos para M.g. Conclusión: si bien no se evidenció asociación
estadísticamente significativa entre la presencia del M.g. y el uso
de preservativo, el número de parejas sexuales en el último año,
la presencia de VIH y la preferencia sexual (HsH, HsM y
bisexualidad), la detección de C.t. estuvo asociada a la presencia de M.g (p=0,0110 IC 95% p<0.05). En nuestro estudio la detección de M.g. fue superior a la informada en otros trabajos: 5,8%
en VIH-positivos asintomáticos y 7,1% en VIH-positivos con UNG.
De acuerdo a los resultados obtenidos, debería considerarse el
estudio de M.g en aquellos diagnósticos de C.t, por encontrarse
éstos en estrecha relación. El valor hallado (25%) en aquellos
pacientes con SIDA, sin patología del tracto genital inferior, denota la necesidad de realizar estudios prospectivos, para monitorear la carga de M.g. a fin de determinar su valor patológico.
P196 – 27983 - DETECCIÓN DE Tritrichomonas foetus MEDIANTE LAMP. GRACIA MARTINEZ, FLORENCIA (1); FUCHS, LUMILA
(2); FORT, MARCELO(2); BRECCIA, JAVIER(1); OYHENART, JORGE(1,3)
(1) Universidad Nacional de La Pampa (UNLPAM), (2) INTA, (3)
CONICET
Introducción: la tricomonosis bovina es una enfermedad venérea causada por Tritrichomonas foetus. La enfermedad es causa
de vaginitis, placentitis, aborto prematuro, flujo uterino y piómetra
en la hembra y cursa sin síntomas en el macho. El diagnóstico
temprano y la eliminación de animales positivos es la única medida eficaz para el control de la tricomonosis. La prueba diagnóstica más empleada es el cultivo durante 5 a 7 días y la visualización microscópica. La sensibilidad de un muestreo prepucial
no supera el 70% y la especificidad es cuestionada por la aparición de protozoos indistinguibles de T. foetus. La reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) permite aumentar la sensibilidad
y especificidad en este diagnóstico, pero los costos de equipamiento y reactivos hacen difícil su generalización. La amplificación isotérmica mediada por bucles (loop mediated isothermal
amplification, LAMP) es una técnica desarrollada para la amplificación específica de secuencias de ADN conocidas. La misma es
rápida, altamente específica y no requiere equipamiento costoso.
Objetivo: diseñar y optimizar una prueba de LAMP para la detección específica de T. foetus. Materiales y métodos: ADN genómico
de T. foetus, distintos protozoos (T. vaginalis, Tetratrichomonas
spp, Pentatrichomonas spp, Toxoplasma gondii) y bacterias
(Brucella abortus, Campylobacter fetus, Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus) se obtuvo por
tratamiento con proteinasa K. Los primers para LAMP se diseñaron con PrimerExplorer (Eiken Chemical Co). Cantidades variables de ADN se incubaron 40 minutos a 65°C en 25 ul de reacción con 0.2-0.8 µM de primers FIP y BIP, 0.1-0.4 µM de primers
LF y LB, 0.05-0.1 µM de primers F3 y B3, 125 µM de dNTPs, 0.8
M betaína, 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM
(NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% Triton X-100 y 4U de polimerasa
Bst (N. Engl. Biolabs). El resultado se juzgó por observación directa o fluorescencia tras adición de SYBR Green I (Molecular
Probes) y mediante electroforesis en gel de agarosa. La especificidad se confirmó por secuenciado directo. Resultados: hemos
diseñado una prueba de LAMP, basada en la secuencia del gen
sod1, para la detección específica de T. foetus. La amplificación
se optimizó y permitió detectar rápidamente ADN de T. foetus. La
reacción se mostró negativa ante una serie de parásitos y bacterias así como ADN bovino y humano. El tiempo mínimo de
incubación para obtener una reacción positiva fue de 35 minutos.
El límite de detección obtenido fue de 1 genoma/reacción. Conclusiones: hemos diseñado un test para la amplificación específica de ADN de T. foetus. La rapidez, sensibilidad y especificidad
demostradas permitirían sortear muchos inconvenientes del culti-
99
vo tradicional. El método desarrollado no depende de equipamiento costoso y podría adaptarse sin mayor esfuerzo a laboratorios de baja complejidad en áreas rurales.
P197 – 28001 - VALORACIÓN DE FACTORES DE PATOGENICIDAD DE Candida albicans DE UNA POBLACIÓN INFANTIL
CON ALTO RIESGO CARIOGÉNICO. ESTUDIO PRELIMINAR.
LEVIN, BEATRIZ CLARA; MANTO, MARIA DEL CARMEN; BOZZA,
FLORENCIA LUCIA; JEWTUCHOWICZ, VIRGINIA MARTA;
MOLGATINI, SUSANA LILIANA
Facultad de Odontología – UBA
Introducción: el género Candida se encuentra como comensal en la cavidad bucal además de otros nichos ecológicos. La
caries dental produce una acidificación del medio bucal dando
lugar a la selección de microorganismos acidófilos. Candida
albicans posee capacidad acidógena y acidúrica. El objetivo de
este trabajo fue evaluar in vitro la capacidad de producir fosfolipasas y proteinasas de cepas de Candida albicans aisladas de
la mucosa bucal de niños con alto riesgo cariogénico. Materiales
y métodos: el estudio se realizó con 10 aislamientos de Candida
albicans obtenidos de mucosa bucal de niños con alto riesgo
cariogénico cuyas edades estaban comprendidas entre los 7 y 12
años y que no presentaban manifestaciones clínicas de candidosis
La identificación a nivel de especie se realizó en base al color
desarrollado en medio cromogénico, micromorfología en agar leche1%-Tween y sistema comercial ID32C. La actividad de
fosfolipasa se ensayó por el método de placa con agar malta y
agar Sabouraud con yema de huevo y la proteasa en medio conteniendo albúmina sérica bovina. Los ensayos se realizaron por
duplicado y los resultados se expresaron mediante el índice Pz,
que es la relación entre el diámetro de las colonias y de las mismas más el halo de opacidad producido por la actividad enzimática, clasificando los aislamientos en altamente, moderados,
bajos o no productores (Price 1982 y Ozcan S 2005). Se utilizaron controles: positivo (C. albicans ATCC 10231) y negativo (C.
glabrata ATCC 90030). Resultados: el 60% de los aislamientos
presentaron actividad de proteasas. El agar Malta evidenció un
70% de producción de fosfolipasas comparado con el 90% en
medio Sabouraud, siendo el 80% de estos de moderada o alta
producción. Conclusiones: estos estudios preliminares permiten
evidenciar la portación de C. albicans con moderada o alta actividad enzimática en una población de niños con alto riesgo
cariogénico. Esto podría deberse a las condiciones ambientales
generadas en este hábitat por la acidificación del medio causada
por el alto riego cariogénico, lo que podría favorecer la producción de enzimas en los aislamientos estudiados. Este trabajo fue
financiado con el subsidio UBACyT O409.
P198 – 28009 - CONOCIMIENTO DE AGENTES O INFECCIONES
DE TRASMISIÓN SEXUAL EN ESTUDIANTES DE DOS CARRERAS UNIVERSITARIAS. LUCIANO, MARIA I; ARLETTAZ, DAIANA;
CASALEGNO, MARIA L; COLMEGNA, EMILIANO; EZCURRA,
GERARDO; FERNANDEZ, JUAN M; GOMEZ BALTAR, MIGUEL
A; PAZ, NATALI; NOTARIO, RODOLFO
Facultad de Medicina – UNR
Introducción: las infecciones de transmisión sexual (ITS) representan una problemática importante en la salud. No se dispone de datos sobre el conocimiento de la población del tema, particularmente en estudiantes de medicina y ciencias sociales. Considerar esto es fundamental para poder efectuar educación en
prevención y consulta precoz. Objetivos: evaluar el conocimiento
que tienen los estudiantes de 1° y 3° año de Medicina y Ciencias
Sociales (Psicología y Ciencia Política) sobre ITS. Determinar el
orden de las enfermedades y/o agentes citados por los
encuestados. Utilizar la información obtenida para diseñar estrategias de promoción y prevención en relación a ITS. Materiales y
métodos: se realizaron encuestas semiestructuradas entre los
meses de marzo a mayo de 2010 sobre una población total de
580 estudiantes universitarios. Los estudiantes escribieron de
100
puño y letra las enfermedades o agentes. Se analizaron los datos obtenidos en tablas de Microsoft Excel. Resultados: 1) conocimiento de ITS: del total de encuestas se desprende que un
98,1% menciona a VIH en primer lugar, sífilis en segundo (75,5%),
hepatitis en tercero (52%), gonorrea en cuarto (49%) y HPV en
el quinto (44,6%). Se encontraron similitudes en las enfermedades o agentes nombrados por alumnos de 1° año de las carreras
elegidas, siendo que en 3° año de Medicina el espectro de enfermedades fue superior. Treinta y tres personas de 1° de Ciencias
Sociales citaron dos o menos ITS; mientras que 28 personas de
3° no completaron más de dos; un 50% de los estudiantes de 1°
de medicina no respondieron más de 2 ITS mientras que sólo 5
de 3° de medicina completaron 2 o menos. 2) orden jerárquico
de ITS que se realizó en función de las respuestas brindadas por
los alumnos de las distintas carreras:
1° Cs
sociales
1°
nombrado
VIH
Sífilis
Hepatitis
HPV
Gonorrea
–
N (%)
134 (97.8)
111 (81.0)
57 (41.6)
55 (40.2)
52 (37.96)
3° Cs.
sociales
1°
nombrado
VIH
Sífilis
Hepatitis
HPV
Gonorra
–
N (%)
122 (100)
81 (66.4)
72 (59.0)
52 (42.6)
50 (41.0)
1°
medicina
1°
nombrado
VIH
Sífilis
Sin Rta
Hepatitis
Gonorrea
–
N (%)
158 (96.9)
110 (67.5)
82 (50.3)
60 (36.8)
56 (34.4)
3°
medicina
1°
nombrado
VIH
Sífilis
Gonorrea
hepatitis
HPV
–
N (%)
155 (98.1)
136 (86.1)
129 (81.7)
115 (72.8)
107 (67.7)
El número de alumnos que conocía sólo 2 o menos disminuyó
discretamente en 3° de Ciencias Sociales respecto de 1°, mientras que en medicina disminuyó drásticamente de 50 a 5% en 1°
y 3° respectivamente. Las enfermedades o agentes conocidos por
más del 33% de los estudiantes fueron VIH, sífilis, gonorrea y
hepatitis. Menos de un tercio de los alumnos conocía HPV, herpes o ladilla llegando a que sólo 1 ó 2 alumnos en cada grupo
mencionó clamidia o tricomonas, muchos de ellos desconociendo incluso la trasmisión por vía sexual, lo que revela un serio
desconocimiento aún en el nivel universitario y amerita planificar
un sólido programa de educación por parte del poder político y
de extensión de las universidades.
P199 – 28012 - INFECCIÓN POR Geotrichum capitatum EN UN
PACIENTE CON LINFOMA ANAPLÁSICO. AMIGOT, SUSANA;
CLEMENTI A, ALEJANDRA(1); TOSELLO , MARA ELENA(2);
BIASOLI, MARISA (2); BOBATTO , A(1); TSCHAGGEY, S(1);
ANCHART, EDUARDO(3)
(1) Laboratorios-Redes Bioquímicas de Santa Fe (SAMCo-San
Jorge), (2) CEREMIC- Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas – UNR, (3) CEMAR-DSLAC. Municipalidad de Rosario
Los individuos con algún nivel de inmunocompromiso son susceptibles a las infecciones por algunos hongos oportunistas.
Geotrichum capitatum es un hongo ubicuo en la naturaleza y en
el hombre capaz de colonizar la mucosa gastro-intestinal y respiratoria. El objetivo del presente trabajo es comunicar un caso de
Geotricosis spp. en un paciente de sexo masculino de 58 años
de edad, trabajador de un molino harinero y con antecedentes de
tabaquismo (38años), con diagnóstico de linfoma anaplásico de
células grandes en abril de 2006 y recaída de grado III en 2009 y
que recibió quimioterapia con vincristina, doxorrubicina, ciclofosfamida y meprednisona. En mayo de 2010, luego de reincorporase
a su trabajo sin autorización médica, presenta síndrome febril, en
los 15 días posteriores a quimioterapia ingresa con foco infeccioso, neumonía del lóbulo superior derecho. Se inicia tratamiento
antibacteriano y antiviral. Se solicita: hemocultivo, urocultivo,
hisopado nasofaríngeo para gripe A H1N1, esputo para gémenes
comunes. Los estudios para H1 N1 resultaron negativos por lo que
se suspende oseltamivir. El paciente presenta progresión en el
infiltrado pulmonar. Al tratamiento anterior se le agrega vancomicina. Presentando mejoría clínica y posterior descompensación
respiratoria, febril persistiendo la condensación bilateral. Se solicita serología para citomegalovirus (CMV) y hongos, todas negativas. No obstante, se inicia tratamiento con anfotericina B (AMB).
Luego del 5° día de tratamiento con AMB y luego de una mejoría
leve, evoluciona con insuficiencia respiratoria. Se realiza TAC de
tórax que muestra infiltrado de tipo alvéolo-intersticial en todo el
pulmón derecho y en el lóbulo inferior del lóbulo izquierdo con
derrame pleural bilateral a predominio derecho. Se realiza
toracocentesis para examen bacteriológico y micológico, se toman
nuevas muestras de esputo para examen directo y cultivo y se
realiza fibrobroncoscopía observándose edema inflamatorio del
parénquima bronquial y abundantes secreciones espesas y blanquecinas compatible con micosis profunda. En 2 muestras de
esputo y 1 de líquido pleural se observaron hifas hialinas. A las
24-48 h se obtuvo desarrollo de colonias color crema y aspecto
rugoso que fueron identificada por re-aislamiento en CHROMagar
Candida y micromorfologia en agar harina de maíz-Tween80; actividad ureasa y perfil de asimilación en sistema ID API 32C como
Geotrichum capitatum utilizando. Se realiza tratamiento antifúngico
con AMB + fluconazol. El paciente ingresa a UTI a asistencia respiratoria mecánica. Evoluciona neutropénico con shock séptico
refractario al tratamiento y fallece. La infección fúngica por
Geotrichum capitatum, patógeno oportunista, se vio favorecida por
la inmunosupresión y por el desequilibrio de la flora indígena del
paciente. La imposibilidad de corregir el cuadro de inmunocompromiso y la falta de respuesta al tratamiento antifúngico desencadenaron rápidamente su fallecimiento.
P200 – 28017 - ACTIVIDAD DE FOSFOLIPASA Y PROTEINASA
DE Candida dubliniensis PROVENIENTES DE BIOFILM
SUBGINGIVAL. JEWTUCHOWICZ, VIRGINIA; LEVIN, BATRIZ
CLARA; CUESTA, ALICIA; MOLGATINI, SUSANA LILIANA
Facultad de Odontología – UBA
Las enfermedades periodontales se asocian a una compleja y
diversa microbiota, la cual interactúa entre sí y con el hospedero y
cuyos mecanismos patogénicos no son conocidos íntegramente.
Candida dubliniensis coloniza el biofilm subgingival constituyendo un
reservorio favorable para su multiplicación. Objetivo: determinar si
la producción de enzimas de C. dubliniensis procedentes de bolsa
subgingival de individuos inmunocompetentes se encuentran exacerbados. Materiales y métodos: se incluyeron aislamientos de C.
dubliniensis de mucosa bucal y de biofilm subgingival recuperados
a partir de 240 pacientes con enfermedad periodontal inmunocompetentes y no fumadores. La identificación a nivel de especie se realizó en base al color desarrollado en medio cromogénico, micromorfología en semillas de alpiste (Staib 1999), PCR con iniciadores
específicos y secuenciación. La actividad de fosfolipasa se ensayó
por el método de placa con agar malta y agar Sabouraud con yema
de huevo y la proteasa en medio conteniendo albúmina sérica bovina. Los ensayos se realizaron por duplicado y los resultados se expresaron mediante el índice Pz, que es la relación entre el diámetro
de las colonias y de las mismas más el halo de opacidad producido
por la actividad enzimática, clasificando los aislamientos en altamente, moderados, bajos o no productores (Price 1982 y Ozcan S 2005).
Se utilizaron controles: positivo (C. albicans ATCC 10231) y negativo (C. glabrata ATCC 90030). Resultados: la prevalencia de C.
dubliniensis en la mucosa bucal y el biofilm subgingival fue del 5%
(12/240) y del 4.4% (11/240) respectivamente. El 50% de los aislamientos presentaron actividad de fosfolipasas, siendo la mayoría de
bajo o moderada producción, en los dos medios ensayados. No hubo
diferencias significativas en la actividad enzimática en ambos nichos
ecológicos. (ANOVA). Ninguno de los aislamientos mostró actividad
de proteasa. Conclusiones: los aislamientos de C. dubliniensis del
nicho ecológico subgingival no presentaron actividad enzimática
exacerbada en los individuos inmunocompetentes. Lo que podría
hacernos inferir que esta levadura puede ser considerada saprófita
por su baja capacidad de virulencia, ya que las enzimas estudiadas
son consideradas importantes factores de patogenicidad para otras
especies como Candida albicans. Este trabajo fue financiado por el
subsidio UBACyT 0409.
P201 – 28024 - POTENCIA IN VITRO DE EQUINOCANDINAS
VERSUS SIETE ANTIFÚNGICOS EN AISLAMIENTOS CLÍNICOS
DE Aspergillus spp.. CORDOBA, SUSANA; VIVOT, WALTER;
ISLA, GUILLERMINA; ABRANTES, RUBEN; WANDA, SZUSZ;
DAVEL, GRACIELA
INEI-ANLIS “Dr. CG MALBRÁN”
En las últimas décadas se observa un aumento en las tasas
de morbi-mortalidad por infecciones causadas por Aspergillus
fumigatus y distintas especies de A. no fumigatus. El tratamiento
con antifúngicos de uso habitual no siempre es eficaz. La aparición las equinocandinas y su aprobación para el uso en humanos hacen necesario el conocimiento del perfil de sensibilidad de
estas nuevas moléculas antifúngicas frente a estos microorganismos. El objetivo de este trabajo fue evaluar y comparar la
actividad in vitro de dos equinocandinas versus siete antifúngicos
frente a aislamientos clínicos de Aspergillus spp.. Materiales y
métodos: se estudiaron 187 cepas de distintas especies de
Aspergillus pertenecientes a la colección de cultivos del Departamento Micología del INEI-ANLIS “Dr. CG Malbrán”. Las cepas
fueron obtenidas de muestras clínicas durante el período 19982009. La identificación de las especies se realizó mediante el
estudio de las características micro y macromorfológicas. Las
concentraciones de los antifúngicos testados fueron: 0,03-16 mg/
l para anfotericina B (AB), itraconazol (IZ), voriconazol (VZ),
ketoconazol (KZ), caspofungina (CAS) y anidulafungina (AN) y de
0,25-128 mg/l para fluorocitosina (5FC), terbinafina (TB) y
fluconazol (FZ). La determinación de la concentración inhibitoria
mínima (CIM) se realizó según el documento M38-A2 del CLSI.
La incubación se realizó a 35°C durante 24-48 h. La lectura fue
visual. La CIM de AB, IZ, VZ y TB se consideró cuando no se
observó crecimiento discernible (e”95% de inhibición). La CIM para
5FC se determinó como la menor concentración que produjo prominente disminución del crecimiento comparado con el control
(e”50%). Para las equinocandinas se determinó la concentración
mínima efectiva (MEC), definida como la menor concentración que
produce cambios morfológicos evidentes en el crecimiento apical
de la hifa. Resultados: las especies identificadas fueron: A.
fumigatus (n=66); A. flavus (n=42); A. terreus (n=28); A. niger
(n=20); Aspergillus sección Fumigati (n=18); A. parasiticus (n=2);
A. sydowii (n=2); otros (n=9). La media geométrica y el rango de
la CIM en mg/l fue: AB 1,11 (8,0-0,13); 5FC 7,63 (256,00- 0,13);
FZ 225,03 (256,00- 64,00); IZ 0,32 (2,00- 0,01); KZ 0,97 (8,000,06); TB 0,11 (4,00- 0,01); VZ 0,33 (4,00- 0,02). La MEC y el
rango de la CIM en mg/l fue: CAS 0,06 (1,00-0,02) y AN 0,03
(4,00-0,01). Las equinocandinas fueron los antifúngicos más eficaces in vitro frente a las especies de Aspergillus testadas, inclusive en aquellas resistentes a la anfotericina B. El 95% de las
especies fue sensible a anfotericina B (CIM ≤ 2 ug/mL), mientras
que el 21,4% de los A. terreus tuvo una CIM ≥ 4 ug/mL. Fluconazol fue inactivo frente a todas las especies evaluadas. Se observó un amplio rango de CIM dependiente de las especies en
estudio, por lo que es esencial realizar la identificación a nivel de
especie y evaluar su perfil de sensibilidad.
P202 – 28039 - Sporothrix schenckii. DETERMINACIÓN DE LA
SENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS POR DILUCIÓN Y POR
DIFUSIÓN EN AGAR. UN ESTUDIO DE CEPAS DE CINCO PAÍSES DE LATINOAMÉRICA. CORDOBA, SUSANA (1); VIVOT,
WALTER (1); ISLA, GUILLERMINA (1); SZUSZ, WANDA (1);
BALLESTE, RAQUEL (2); PANIZO, MERCEDES (3); MATOS,
DULCILENA (4); MESA, ANA C (5); DAVEL, GRACIELA (1)
(1) Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas “Dr. CG
Malbrán”, Argentina. (2) Departamento de Laboratorios de Salud
Pública, Uruguay. (3) Instituto Nacional de Higiene R. Rangel,
Venezuela, (4) Instituto A. Lutz, Brasil. (5) Universidad Antioquia,
Colombia.
Antecedentes: Sporothrix schenckii es el agente causal de la
esporotricosis, una micosis endémica en países de Latinoamérica.
El tratamiento indicado es con itraconazol para la forma linfocutánea o anfotericina B para la forma diseminada. Estas drogas,
son generalmente efectivas, pero no siempre llevan a la cura de
la enfermedad, por lo que es necesario conocer la sensibilidad in
vitro de otros agentes antifúngicos. A la fecha no existe un
estándar para hongos dimórficos y los métodos de referencia disponibles, tanto del EUCAST como del CLSI, son de limitada aplicación en los laboratorios clínicos por ser onerosos y muy laboriosos. Existen técnicas comerciales, de simple realización, que
permitirían obtener resultados comparables a los de los métodos
101
de referencia. Nuestro objetivo fue evaluar y comparar la actividad in vitro de siete antifúngicos frente a cepas de S. schenckii
en su fase levaduriforme utilizando un método de referencia por
microdilución y uno de difusión en agar con tabletas. Materiales
y métodos: se estudiaron 72 cepas clínicas de S. schenckii obtenidas de pacientes de Colombia (n=20), Venezuela (n=20), Uruguay (n=17), Brasil (n=11) y Argentina (n=4). Las concentraciones de los antifúngicos testados fueron: 0,03-16 mg/l para
anfotericina B (AB), itraconazol (IZ), voriconazol (VZ), ketoconazol
(KZ), y de 0,25-128 mg/l para terbinafina (TB), 5-flucytosina (FC)
y fluconazol (FZ). La determinación de la concentración inhibitoria
mínima (CIM) se realizó según el documento M27-A3 y la difusión en agar con tabletas Neo-Sensitabs Rosco (T). Para ambos
métodos, el inóculo se preparó en medio agar cerebro corazón
más 5% de CO2 a 35C° y se ajustó a 0,5 McFarland (1- 5 x 106
UFC/ml) en solución salina estéril. La incubación se realizó a 35°C
más 5% de CO2 durante 72 h. La lectura fue visual para ambos
procedimientos. Resultados: los valores de la media geométrica
en mg/l y en mm de la CIM/T fueron para AB 1,17/14,66; TB 0,09/
61,37, KZ 0,17/36,48; IZ 0,35/24,25; VZ 0,31/17,85; FZ 74,59/
12,56 y 5FC 4,19/13,47. Los errores very major fueron: 26, 15, 2,
21 y 3, para AB, FZ, 5FC, IZ y VZ en ese orden. La concordancia
entre ambos métodos fue para AB 47,22%; FZ 45,83%, 5FC
52,78%, IZ 47,22% y VZ 63,89%. Los antifúngicos más eficaces
in vitro fueron terbinafina, ketoconazol, itraconazol y voriconazol.
La concordancia general entre el método de referencia y el de
difusión en agar con tabletas fue del 51,38%. El método de difusión en agar con tabletas no sería un método recomendable para
determinar la sensibilidad en cepas de Sporothrix schenckii.
P203 – 28049 - Mycobacterium fortuitum: BROTE DE INFECCIONES EN IMPLANTES MAMARIOS. SANTANATOGLIA,
SANDRA (1); MIGLIORANZA, CRISTINA; HUALDE, MARIANA;
FRANCIONI, SILVIA (2); KAUFMAN, SARA (2)
(1) FARES TAIE INSTITUTO, (2) Laboratorio HUÉSPED
Introducción: las infecciones asociadas a la colocación de prótesis mamarias son raras, Staphylococcus aureus es el agente
etiológico más común. Existen pocos reportes asociados a
micobacterias de crecimiento rápido, siendo la más frecuente
Mycobacterium fortuitum. Objetivo: comunicar un brote de
M.fortuitum post cirugías de implantes mamarios. Materiales y
métodos: luego de un caso índice en una Institución con un
quirófano exclusivo para cirugías limpias se realizó la investigación de brote, identificación de casos secundarios, búsqueda de
fuente común y se implementaron medidas para control del mismo. El período de estudio fue del 10-3-2009 al 12-6-2009. Se
recibieron para cultivo materiales del sitio quirúrgico y en algún
caso el implante mamario. Se inocularon en agar sangre ovina al
5%, agar chocolate y caldo cerebro corazón. Los extendidos de
las muestras se colorearon con Gram visualizándose bacilos gramlábiles; Ziehl-Neelsen observándose bacilos ácido-alcohol resistentes largos. Se siembra en medio de Lowenstein - Jensen. A
las 72 horas desarrollan en los medios habituales y específicos
colonias blancas, secas, de borde irregular. La baciloscopía de
las colonias revela bacilos ácido-alcohol- resistentes, identificándose con pruebas convencionales como Mycobacterium fortuitum.
La CIM por Etest fue: imipenem 3 ug/ml; linezolid 3 ug/ml;
amikacina 0.5 ug/ml; ciprofloxacina 0.032 ug/ml; claritromicina 8
ug/ml; trimetoprima- sulfametoxazol > 32 ug/ml. Se revisaron todos los pacientes sometidos a cirugía en el mismo período, no
hallándose otros casos. Se realizó hisopados nasofaríngeos del
equipo quirúrgico resultando negativos. Estudio microbiológico del
quirófano: al término de una cirugía se tomaron 52 muestras con
el objetivo de buscar una fuente común de contaminación o propagación de Mycobaterium fortuitum, aislándose M. fortuitum con
igual sensibilidad en 2 de las 4 bocas del aire acondicionado del
quirófano. Resultados: se detectaron 6 casos con similar modo de
presentación. El motivo de consulta en todos fue induración, eritema o secreción purulenta en el sitio quirúrgico. Sexo: femenino. Edad: 22 a 47 años. Ninguno de los casos con enfermedad
de base. Todos requirieron retiro del implante, 5 evolucionaron
favorablemente con claritromicina 500 mg/12 h y ciprofloxacina
102
500 mg/12 h por 6 meses, 1 sin seguimiento, 1 se reimplantó posttratamiento y reincidió. Medidas de control del brote: se revisaron procedimientos de higiene del quirófano, normas de lavado
de manos, limpieza y esterilización del material. Se suspendieron cirugías y se convocó al equipo de seguridad e higiene para
controlar el sistema de ventilación hallándose que la toma de aire
exterior no se realizaba correctamente. Se cambió toda la instalación según recomendaciones vigentes. No hubo reportes de
nuevos casos. Conclusión: Mycobacterium fortuitum debe considerarse en el diagnóstico diferencial en las infecciones post-implante mamario. Es importante identificar las especies de
micobacterias aisladas a los fines epidemiológicos y conocer su
sensibilidad antibiótica porque los tratamientos suelen ser prolongados.
P204 – 28053 - MAL DE POTT. REPORTE DE UN CASO CLINICO. PATALLO, CLAUDIA (1); RODRIGUEZ, MONICA (1);
RIZZOTTI, VIVIANA (1); COSTA, MIRTA (2); BALLESTER,
DANIELA (1)
(1) Hospital Piñeiro, (2) Hospital Penna
El término espondilodiscitis, indica un proceso inflamatorio,
generalmente infeccioso, del espacio intervertebral y los cuerpos
vertebrales adyacentes. La tuberculosis (TB) de columna vertebral es la localización más frecuente de las tuberculosis osteoarticulares. Sir Percival Pott, en 1779, reconoció la giba dorsal, el
absceso osifluente y los trastornos neurológicos como del mismo
origen etiológico, lo que se conoce como Mal de Pott. Actualmente, estas tres situaciones se consideran más bien como complicaciones de la TB de columna. Posteriormente, el origen tuberculoso fue establecido a comienzos del Siglo XIX por Delpech.
La patología se produce como consecuencia de la diseminación
hematógena desde focos alejados, focos contiguos o la diseminación linfática de TB pleural. La tomografía axial computarizada
y la resonancia magnética nuclear (RMN) pueden ser útiles para
identificar lesiones óseas tempranas y sobre todo la RMN para
evidenciar lesiones intramedulares, pero el diagnóstico definitivo
se alcanza a través de la confirmación histológica-microbiológica
de las muestras de absceso o lesiones óseas. El tratamiento contempla la inmovilización, la administración de antimicrobianos y
la cirugía en casos avanzados. Caso clínico: paciente de 20 años,
boliviana, que trabaja en el mercado de compras “La Salada”.
Ingresa por intenso dolor en zona lumbar, como antecedente refiere caída de su propia altura ocurrida un año y medio atrás,
consultando en diversos centros por dolor agudo que fue progresando, con parestesia de sus cuatro miembros e impotencia funcional. Al examen físico se observa cifosis dorsal. El laboratorio
al ingreso informó Hto. 33%; Hb10.8 g/dl; GB7200; VSG 52mm,
funcionalidad hepática y renal normales y serología negativa para
VIH y VDRL. Se realiza RMN informándose fractura y aplastamiento del cuerpo vertebral D10 con importante componente de partes blandas que se expanden dorsalmente al canal raquídeo comprimiendo la médula espinal. Por sospecha de mal de Pott se inicia tratamiento con rifampicina, isoniazida, pirazinamida y etambutol y analgésico, con diclofenac por dolor y se decide conducta
quirúrgica con el objetivo de drenaje del absceso, descompresión
neurológica y estabilización de la columna. Se envía muestra de
material purulento para estudio histopatológico y cultivo resultando
positivo para complejo Mycobacterium tuberculosis. Debido a la evolución post-quirúrgica satisfactoria se decide alta hospitalaria y continuación de tratamiento en forma ambulatoria y rehabilitación
kinésica. Posteriormente se recibe el informe de la sensibilidad del
aislamiento que reporta la resistencia a isoniacida y rifampicina por
lo cual, pese al buen estado general de la paciente se cambia el
esquema inicial por etiona-mida moxifloxacina, cicloserina además
de estreptomicina y pirazinamida. Actualmente, continúa el tratamiento antitubercu-loso, recobró la movilidad de sus miembros y se recupera con pocas secuelas neurológicas. El diagnóstico de
espondilodiscitis tuberculosa depende de un alto grado de sospecha, especialmente en zonas de alta incidencia como la de nuestro
medio. La asociación entre un cuadro de dolor axial prolongado con
o sin compromiso neurológico o fiebre y una eritrosedimentación
elevada, continúan siendo el eje diagnóstico inicial de estos cuadros.
P205 – 28066 - SENSIBILIDAD DE LAS CEPAS DE Salmonella
spp. A LOS ANTIBACTERIANOS UTILIZADOS EN EL TRATAMIENTO DE LA DIARREA NEONATAL DE TERNEROS. BILBAO,
GLADYS (1); MONTEAVARO, CRISTINA(1); BIGATTI, CECILIA(1);
PINTO DE ALMEIDA CASTRO, ALDANA(1); SOTO, PEDRO(1)
(1) Facultad de Ciencias Veterinarias – UNCPBA
Introducción: la salmonelosis es una de las causas de mortalidad en terneros, especialmente cuando no se realiza un tratamiento apropiado; es decir que además de realizar una adecuada fluidoterapia se debe elegir el antibiótico correcto. Objetivo:
evaluar la sensibilidad a los antibióticos utilizados en el tratamiento
de la diarrea neonatal, de cepas de Salmonella spp. aisladas de
terneros con y sin signos diarreicos de crianza artificiales. Materiales y métodos: se estudiaron un total de 39 cepas de Salmonella
spp. provenientes de 20 establecimientos lecheros ubicados en
la Cuenca Mar y Sierras durante los años 2008-2009. Los antibacterianos utilizados fueron: enrofloxacina, florfenicol, gentamicina,
neomicina, penicilina G, Estreptomicina, trimetoprima-sulfametoxazol, tetraciclina. La metodología empleada y el criterio de interpretación se realizó de acuerdo al método de Kirby-Bauer. Resultados: de los ocho antibióticos analizados sólo gentamicina,
enrofloxacina y trimetoprima-sulfametoxazol presentaron sensibilidad en la totalidad de las cepas. Los antibióticos restantes mostraron resistencia; es así que penicilina G manifestó resistencia
en la totalidad de las cepas y tetraciclina junto con neomicina, florfenicol y estreptomicina presentaron cepas resistentes entre el 2,5
y 15,4 %. Además las cepas exhibieron un 25,6 y 10,25% de sensibilidad intermedia a neomicina y florfenicol respectivamente.
Antibiótico
Enrofloxacina
Florfenicol
Gentamicina
Neomicina
Penicilina G
Estreptomicina
Trimetoprima-sulfametoxazol
Tetraciclina
Sensible
Intermedio
Resistente
39
34
39
26
38
39
33
4
10
-
1
3
39
1
6
Conclusiones: de acuerdo a lo observado en el presente trabajo,
es de elección enrofloxacina, trimetoprima-sulfametoxazol y
gentamicina para un adecuado tratamiento antimicrobiano de la
salmonelosis como causa de diarrea neonatal en terneros. Penicilina G debe descartarse y tener precaución en el uso de tetraciclina, neomicina y florfenicol. De acuerdo al comportamiento de
las cepas de Salmonella spp., estos resultados deben cotejarse
periódicamente.
P206 – 28127 - INFLUENCIA DEL MÉTODO ANTICONCEPTIVO
EN EL PERFIL DE LA FUNCIÓN VAGINAL EN UN MICROAMBIENTE SOCIAL DE LA PROVINCIA DE SANTA FE (ARGENTINA). FOSCH, SONIA (1); YONES, CRISTIAN (2); TROSSERO,
MARTA (1); GROSSO, OMAR (1); ROLDAN, LILIANA (3)
(1) Laboratorios-Redes Bioquímicas de Santa Fe (SAMCo-SA
PEREIRA), (2) Facultad de Ingeniería y Ciencias Hídricas (FICHUNL), (3) Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas (FBCB-UNL)
Introducción: la vagina es un órgano autónomo, de importancia funcional crítica en salud sexual y reproductiva. Existen evidencias parciales de la influencia del método anticonceptivo utilizado sobre estados de disfunción vaginal (DV). Objetivo: a) evaluar la función vaginal de mujeres en edad fértil asintomáticas que
asistieron a controles de planificación familiar, de dos centros de
salud públicos semirrurales y b) analizar su relación con el uso
de anticonceptivos orales (ACO), dispositivo intrauterino (DIU),
preservativos (PRE), método del ritmo (RIT) y sin anticoncepción
(SA). Pacientes y métodos: se estudiaron 210 mujeres: edad entre 17 a 45 años, sexualmente activas, sin tratamiento inmunosupresor y/o con antimicrobianos, ni duchas vaginales. La práctica anticonceptiva fue utilizada con un mínimo de 6 meses previos al estudio. Se aplicó el estudio microscópico BACOVA (Ba-
lance del Contenido Vaginal) (www.fba.org.ar/prosar consensos)
definiendo cinco estados vaginales básicos (EVB): microbiota
normal (MN), microbiota normal más reacción inflamatoria vaginal
(MN+RIV), microbiota intermedia (MI), vaginosis bacteriana (VB),
vaginitis microbiana inespecífica (VMI). Se agregan a los cinco
EVB la detección morfológica de levaduras (Le), tricomonas (TV)
con ausencia y presencia de RIV, obteniendo una distribución final de nueve estados vaginales (EV) que fueron relacionados con
los métodos anticonceptivos y procesados mediante el programa
EPI-INFO 6. Resultados: las prácticas anticonceptivas se utilizaron con la siguiente frecuencia: ACO (n 98) 47%, DIU (n 48)
22,8%, PRE (n 20) 9,5%, RIT (n 15) 7,1% y SA (n 29) 13,6%. El
75% del total de las mujeres estudiadas mostró indicadores de
DV. La prevalencia de los EV definidos fue: MN 25%, MN+RIV
5%, MI 4%, VB 12%, VMI 8%, Le 15%, Le+RIV 17%, TV 4% y
TV+RIV 10%. Vaginosis bacteriana se asoció con Le (1,4%) y TV
(0,5). Analizando la influencia de los métodos anticonceptivos y
sin anticoncepción se detectaron asociaciones estadísticamente
significativa de: ACO con: MN (43/73 p 0,009), MN+RIV (9/31 p
0.03), VB (6/25 p 0,02), Le (20/32 p 0.05) y TV+RIV (5/22 p 0,02);
DIU con: VB (17/25 p 0,0002); PRE con: MN (3/73 p 0,05) y
MN+RIV (11/31 p 0,0000); RIT con MN (13/73 p 0,0000) y SA con:
MN (2/73 p 0,0006) y TV+RIV (14/22 p 0,0000). Conclusión: la prevalencia de estados anormales del 75% del total de casos es superior a la mayoría de los datos publicados (alrededor de 50%) para
DV en mujeres en edad fértil asintomáticas. Es de destacar a) la
asociación de ACO con MN señala una tendencia positiva de protección, b) DIU genera un incremento de riesgo para VB, mientras
que ACO reduce la frecuencia y c) si bien el número de casos es
reducido, la práctica de ritmo genera el valor más alto de MN encontrado en todas las series estudiadas por nuestro grupo.
P207 – 28132 - DISTRIBUCIÓN DE GENOTIPOS DE Candida
dubliniensis PROCEDENTES DE MUCOSA BUCAL DE PACIENTES INFECTADOS Y NO INFECTADOS POR VIH.
JEWTUCHOWICZ, VIRGINIA; LOPEZ DANERI, GABRIELA;
POLA, SANTIAGO; IOVANNITTI, CRISTINA ADELA; BENDEZU,
KARLA; LANDABURU, FERNANDA; MUJICA, MARIA TERESA
Facultad de Medicina – UBA
Introducción: Candida dubliniensis, es una especie de levaduras identificada como patógeno oportunista asociado a candidiasis
orofaríngea, particularmente en individuos infectados con el virus
de inmunodeficiencia humana (VIH). Gee et al. (Gee SF 2002),
han clasificado esta especie en 4 genotipos basado en el análisis de las secuencias nucleotídicas del ADN ribosomal fúngico.
El análisis del polimorfismo del ADN amplificado con cebadores
arbitrarios (RAPD) es una técnica molecular que ha sido muy utilizada para estudiar clonalidad en aislamientos clínicos de levaduras. Objetivos: estudiar la distribución de genotipos de C.
dubliniensis de mucosa bucal en individuos infectados y no infectados por VIH. Materiales y métodos: se incluyeron aislamientos
de C. dubliniensis procedentes de 125 muestras de hisopado de
mucosa bucal de pacientes VIH y de 240 individuos VIH negativos. Se registraron lesiones clínicas, tratamientos previos con
antifúngicos y el tratamiento antirretroviral. Las colonias de color
verde en medio CHROMagar Candida se seleccionaron y se observaron la formación de clamidoconidios en agar alpiste (medio
de Staib) y PCR específica. Los ADN se obtuvieron mediante
acción enzimática con zymolasa (Scherer-Stevens) y se amplificó una región de ADN ribosomal con los cebadores ITS1 e ITS4.
Los productos fueron purificados, secuenciados y analizados.
También se realizó con la técnica de RAPD-PCR con los
cebadores OPA 02, OPA 09, M13F y M13R. Los patrones de
bandas obtenidos permitieron relacionar a las cepas mediante el
coeficiente de similitud (CS) de Jaccard y el algoritmo UPGMA.
Resultados: la prevalencia de levaduras fue del 77.6% (97/125)
y 39.2% en individuos VIH positivos y negativos respectivamente, con una diferencia significativa (Chi2 test p<0.001). La prevalencia de C. dubliniensis fue 15.2% (19/125) IC95%: 9.6-23), y
4.2% (10/240) IC95%: 2.7-8.8 en VIH positivos y negativos respectivamente, (Chi2 test p<0.001). Las 19 C. dubliniensis provinieron de 7 pacientes con candidiasis orofaríngea, 7 tratamien-
103
tos previos con antifúngicos y 9 con tratamiento antirretroviral. No
se observó una distribución de genotipos relacionados con la infección por VIH, el recuento de linfocitos TCD4+, la presencia de
síntomas, el hospital del cual provenía la muestra, el tratamiento
antirretroviral, el haber padecido episodios previos de candidiasis
orofaríngea o el tramiento antifúngico pasado o actual. Conclusiones: existe una mayor colonización por C. dubliniensis en pacientes con VIH. Los métodos de RAPD-PCR y la secuenciación
del rADN permitieron detectar la variabilidad genética entre los
aislamientos. No se detectó un clon predominante asociado a la
manifestación clínica, al tratamiento antifúngico o la procedencia
del paciente. Este trabajo fue subsidiado por UBACYT M426.
P208 – 28147 - EVALUACIÓN DEL RIESGO SANITARIO DE RESIDUOS LÍQUIDOS HOSPITALARIOS. NUÑEZ, LIDIA (1);
TORNELLO, CARINA(1); PAZ, MARTA(1); DE GROSSI, JOSE(1);
MANTOVANO, JULIAN(1); MORETTON, JUAN(1)
1) Higiene y Sanidad. Facultad de Farmacia y Bioquímica. UBA
Introducción: los centros de salud eliminan grandes volúmenes de residuos líquidos contaminados con materia orgánica,
antibióticos, antisépticos, detergentes, solventes, medicamentos
a los que se suman excretas y secreciones humanas contaminadas por diferentes tipos de patógenos. En general estos residuos
líquidos se vierten sin tratamiento previo, a la red cloacal urbana.
Si bien las aguas cloacales reciben un tratamiento previo a su
disposición final, varios autores han demostrado que los productos eliminados por hospitales representan un riesgo potencial para
el ser humano y el ambiente lo que se traduce en un impacto para
la salud pública. La magnitud de dicho impacto ha comenzado a
evaluarse en los últimos años en ámbitos científicos. Los efluentes
del sistema municipal de cloacas de la ciudad de Buenos Aires
se eliminan con un mínimo tratamiento previo, en el Río de la
Plata. Este río es la principal fuente de abastecimiento de agua
potable para una población de aproximadamente 10 millones de
habitantes; por este motivo es de suma importancia efectuar aportes para el estudio de los riesgos que pueden producir los agentes biológicos liberados por distintos tipos de efluentes. Objetivo:
analizar las características microbiológicas de las aguas residuales
del Hospital de Clínicas con el fin de obtener datos para el estudio del riesgo infeccioso del residuo líquido hospitalario. Materiales y métodos: para realizar este trabajo se seleccionó el líquido
residual proveniente de un centro hospitalario de alta complejidad, el Hospital de Clínicas José de San Martín, Hospital Escuela de la Universidad de Buenos Aires. Se tomaron muestras mensuales durante siete días al mes (marzo a septiembre). Se determinó el número de indicadores bacterianos como, coliformes,
Escherichia coli, enterococos e indicadores virales como fagos
somáticos. También se realizó el recuento de patógenos: Pseudomonas spp. y Staphylococcus spp., Salmonella spp. y la investigación del complejo Burkholderia cepacia en las muestras del
residuo líquido hospitalario. Resultados y conclusiones: todos los
microorganismos indicadores fueron detectados en las muestras
ensayadas. Se observó una gran variabilidad en los recuentos
microbianos. Entre los microorganismos indicadores, los coliformes totales se detectaron en mayor concentración. Los valores
de Escherichia coli variaron entre 1,3 x 107 a 2,5 x 104 UFC/100ml,
con un valor medio de 2,0 x 105 UFC/100 ml. Con respecto a
enterococos, se obtuvo un valor medio de 1,6 x 105 UFC/100ml.
Todos los patógenos ensayados fueron detectados. Se observó
presencia del complejo Burkholderia cepacia y se detectaron valores medios de Pseudomonas spp. y Staphylococcus spp. de 71
UFC/ml y 1,6 x 102 UFC/ml respectivamente. Se registraron valores de Salmonella spp. de 5 bacterias/100ml. La caracterización
biológica de los líquidos residuales hospitalarios es una de las
etapas iniciales en los procesos de gestión para encarar acciones que eviten vertidos inadecuados al medio ambiente.
P209 – 28148 - PRESENCIA DE BACTERIAS RESISTENTES A
ANTIBIÓTICOS EN RESIDUOS LÍQUIDOS HOSPITALARIOS.
NUÑEZ, LIDIA (1); PUENTES, NOEL (1); TORNELLO, CARINA (1);
MORETTON, JUAN (1)
104
1) Higiene y Sanidad. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires
Introducción: los residuos líquidos hospitalarios están constituidos por una mezcla de materia orgánica, antibióticos, antisépticos, detergentes, solventes, medicamentos a los que se suman
excretas y secreciones humanas contaminadas por diferentes tipos de patógenos. En los hospitales se utilizan cantidades importantes de antimicrobianos para prevenir y tratar infecciones, esto
promueve que los ambientes hospitalarios sean fuertemente selectivos, dando lugar a la proliferación de bacterias multirresistentes que son liberadas a los líquidos residuales hospitalarios, los
que pueden ser un riesgo sanitario por la liberación de bacterias
multirresistentes, provenientes del ambiente hospitalario, hacia el
sistema cloacal. Los efluentes del sistema municipal de cloacas
de la ciudad de Buenos Aires se eliminan con un mínimo tratamiento previo, en el Río de la Plata. Este río es la principal fuente de abastecimiento de agua potable para una población de
aproximadamente 10 millones de habitantes; por este motivo es
de suma importancia efectuar aportes para el estudio de los riesgos que pueden producir la diseminación de bacterias resistentes. Objetivo: evaluar la presencia de bacterias resistentes a los
antibióticos en residuos líquidos hospitalarios. Materiales y métodos: se utilizó un líquido residual proveniente de un centro hospitalario de alta complejidad, el Hospital de Clínicas José de San
Martín, Hospital Escuela de la Universidad de Buenos Aires. Se
tomaron muestras mensuales durante siete días al mes (marzo a
septiembre). Se determinó el número de bacterias resistentes a
ampicilina, cefalotina, ceftriaxona, ciprofloxacina, ceftacidima,
gentamicina y tetraciclina en tripteína soja agar. Se evalúo la prevalencia de enterococos vancomicino resistentes y de estafilococos meticilino resistentes, como también la prevalencia de bacterias coliformes y de bacilos gram-negativos no coliformes resistentes a antibióticos beta-lactámicos. Las pruebas frente a los
antibacterianos se realizaron por el método de dilución en agar.
La categoría de resistente fue asignada de acuerdo a los valores
de corte según las normas del CLSI. Resultados y conclusiones:
en todas las muestras se observaron bacterias heterotróficas resistentes a los antibióticos ensayados. Se encontró una alta prevalencia de cepas de bacterias viables resistentes a ampicilina
(40%), cefalotina (49%), gentamicina (32%) y ciprofloxacina (21%).
Con respecto a los coliformes, un 32 % de estas bacterias presentes en las muestras demostraron ser resistentes a ampicilina
y 27% a cefalotina. Se observó la presencia de enterococos
vancomicino resistentes en 73% de las muestras en un valor
medio del 4 % del número total de enterococos presentes en las
muestras. Se detectó la presencia de estafilococos meticilino resistentes en un valor medio del 2%. De acuerdo, con los resultados de este trabajo, se puede inferir que los efluentes hospitalarios eliminan al sistema cloacal municipal bacterias patógenas y
saprófitas con distintos grados de resistencia a los antibacterianos.
Estos microorganismos podrían producir un desequilibrio en el
ecosistema aumentando la proporción de bacterias resistentes en
aguas superficiales.
P210 – 28166 - DISTRIBUCIÓN DE ESPECIES Y SENSIBILIDAD
DE Candida spp. EN PACIENTES DE UN CENTRO DE DIÁLISIS.
MERKT, MARIELA (1); IOVANNITTI, CRISTINA (2); PENNINI,
MAGDALENA (1); CARRION, SILVINA(1); BIONDI, ESTEFANIA(3);
OCHIUZZI, MARIA EUGENIA(3); SUCARI, ADRIANA(1)
(1) Stamboulian Laboratorio, (2) Centro de Micología, Facultad de
Medicina – UBA, (3) NEFROLAB
Introducción: la diálisis es una alternativa de tratamiento en
pacientes en los que el deterioro de la función renal se hace irreversible; la misma puede ser de dos tipos: diálisis peritoneal (DP)
o hemodiálisis (HD) y consiste en la separación de los elementos
tóxicos de la sangre por difusión a través de una membrana
semipermeable. En los últimos años, Candida parapsilosis un
colonizante habitual de la piel con manifiesta capacidad de adherencia a materiales sintéticos, se ha asociado a infecciones en
pacientes en diálisis, en ocasiones en igual o mayor proporción
que Candida albicans. Objetivo: evaluar la distribución de espe-
cies aisladas en una población de pacientes adultos en diálisis y
su perfil de sensibilidad a antifúngicos. Materiales y métodos: en
el período comprendido entre agosto de 2008 y junio de 2010 se
estudiaron 17 aislamientos de Candida spp. provenientes de pacientes adultos en diálisis, que correspondieron a las siguientes
muestras clínicas: 7 hemocultivos periféricos, 4 retrocultivos y 6
líquidos peritoneales. Para realizar la identificación a nivel de
especie de las levaduras aisladas, se sembraron en agar
Sabouraud glucosado, agar cromogénico Candida (Oxoid) y se
realizó identificación micromorfológica en agar harina de maíz con
Tween 80. Para completar la identificación se utilizó la galería API
ID 32 C (bioMèrieux). Se determinó la sensibilidad a fluconazol,
itraconazol, voriconazol y anfotericina por método de difusión (tabletas ROSCO) y CIM a fluconazol y anfotericina por método de
Etest. Los resultados se interpretaron de acuerdo a los criterios
del CLSI. Se utilizó como control Candida parapsilosis ATCC
22019. Resultados: de los aislamientos estudiados se obtuvo la
siguiente distribución de especies: hemocultivo: 6 C. parapsilosis,
1 C. guilliermondii; retrocultivo: 3 C. parapsilosis, 1 C. albicans;
líquido peritoneal: 3 C. parapsilosis, 2 C. guilliermondii, 1 C.
albicans. Todos los aislamientos estudiados fueron sensibles a
fluconazol, itraconazol, voriconazol y anfotericina. Comentarios: se
resalta el mayor predominio de especies de Candida no albicans,
de las cuales la más prevalente fue C. parapsilosis. Todos los
aislamientos analizados fueron sensibles a fluconazol, por lo cual,
este análisis puede contribuir a realizar un tratamiento empírico
inicial dirigido y precoz, lo que reduce de forma significativa la
mortalidad. Es importante tener presente la sensibilidad al resto
de los antifúngicos como alternativa de tratamiento en casos de
reacciones adversas.
P211 – 28178 - ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DE Syngonanthus
nitens (Eriocaulaceae) SOBRE Candida albicans AISLADAS DE
EXUDADOS VAGINALES. ENSAYOS DE TOXICIDAD SOBRE
CÉLULAS HeLa. ARAUJO, MARCELO G F(1); ICELY, PAULA
ALEJANDRA(2); HILARIO, FELIPE(3); SANTOS, LOURDES C(3);
VILEGAS, WAGNER(3); SOTOMAYOR, CLAUDIA E(2); BAUAB,
TAIS M(1)
(1) Facultad de Ciencias Farmacéuticas-Universidade Estadual
Paulista (FCFAR-UNESP), (2) FCQ-UNC, (3) IQ-UNESP
Syngonanthus, género perteneciente a la família Eriocaulaceae, posee 200 especies, la mayoría endémica en Brasil. La
especie Syngonanthus nitens es conocida también como Capim
dourado. Sus escapos son utilizados como materia prima en la
confección de objetos de ornamentación, que son exportados a
países europeos. Estudios químicos de esta especie muestran la
presencia de compuestos fenólicos, principalmente flavonoides.
Es conocido que los extractos ricos en flavonoides presentan una
importante actividad antimicrobiana. En nuestro laboratorio demostramos que el extracto de escapos de S. nitens (ESn) poseen
actividad antifúngica frente a la cepa ATCC 18804 de Candida
albicans y que la concentración inhibitoria mínima (CIM) frente a
esta cepa fue de 250 µg/ml. Dos fueron los objetivos planteados
para el presente trabajo: el primero, fue evaluar la efectividad de
la actividad antifúngica de ESn sobre C. albicans provenientes de
aislados clínicos de pacientes con candidiasis vaginal. El segundo, fue determinar si el ESn en CIM es capaz de ejercer efecto
tóxico sobre células epiteliales humanas. El extracto de escapos
de S. nitens fue obtenido por percolación, utilizando metanol como
líquido extractor. La actividad antifúngica y las respectivas CIM
fueron evaluadas de acuerdo a la norma M27-A2 (NCCLS, 2002),
sobre C. albicans (NCPF 3153) y sobre 14 aislados clínicos
tipificados. Los extractos fueron disueltos en metanol al 25% con
una concentración inicial de 2000 µg/ml y diluídas seriadamente
en medio RPMI 1640 hasta 7,8 µg/ml en microplacas de 96 wells.
Se utilizó el inóculo a una concentración de 2,5 x 10³ UFC/ml.
Como control positivo se incluyó anfotericina B. Las placas fueron incubadas en estufa a 37°C durante 48 horas. Las CIM fueron definidas como la menor concentración donde no hubo crecimiento fúngico, detectándose con la adición de cloruro de
trifeniltetrazolio al 2%. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. Para la evaluación de la actividad citotóxica se emplearon
células epiteliales humanas de línea HeLa. Las células fueron
cultivadas en presencia de diferentes concentraciones de ESn
(125, 250, 500 µg/ml) durante 24h a 37 °C y en atmósfera de CO2.
La viabilidad celular fue evaluada mediante el ensayo de reducción de MTT. Todos los ensayos se realizaron por triplicado y cada
experiencia repetida al menos 3 veces. Los resultados obtenidos
en los diferentes ensayos mostraron que todas las cepas de C.
albicans de origen clínico fueron sensibles a la acción fungicida
de ESn, presentando valores de CIM entre 62,5 y 250 µg/ml.
Interesantemente, el tratamiento de las células HeLa con el ESn
a la dosis efectiva no resultó tóxico para las células. Estos resultados muestran la efectividad del extracto de escapos de S. nitens
y sugieren el posible uso de esta especie como fuente para el
aislamiento e identificación de nuevos agentes antifúngicos.
MARTES 19/10/2010
P212 - 27098 CEPAS HIPERVIRULENTAS DE Escherichia coli
O157:H7: DETECCIÓN EN NEUQUÉN DE UN LINAJE ASOCIADO A PATOLOGÍAS MÁS SEVERAS. PIANCIOLA, LUIS(1);
NAVELLO, MARIANO(1); FERNANDEZ, CLAUDIA(1); GONZALEZ,
GLADYS(2); DI RUSSO, VIRGINIA(2); AMARILLA, NOEMI(2);
MAZZEO, MELINA(1)
(1) Laboratorio Central, (2) Hospital Heller
Introducción: Escherichia coli O157:H7 está asociada a casos
esporádicos y brotes de diarrea acuosa y sanguinolenta, colitis
hemorrágica y síndrome urémico hemolítico (SUH). Estudios comparativos han revelado una gran diversidad genómica relacionada a la estructura, posición y contenido genético de bacteriófagos
y variabilidad en los genes putativos de virulencia incluyendo los
que codifican adhesinas, toxinas Shiga y proteínas efectoras.
Mediante análisis de 96 polimorfismos de nucleótido único (SNP)
se han identificado 39 genotipos agrupados en 9 clades. La emergencia del clade 8 en brotes recientes ocurridos en EE UU, ha
sido relacionada con un elevado número de internaciones y casos de SUH. En Argentina el SUH es endémico y en Neuquén la
incidencia se mantiene en valores muy altos de 25,0 a 30,0 casos cada 100 000 menores de 5 años. En un estudio realizado
por nuestro grupo en Neuquén entre 2006 y 2008, en una muestra de 908 pacientes con diarrea, encontramos una sorprendente-mente baja proporción de ellas causadas por E. coli O157:H7.
Esto nos permite hipotetizar sobre la circulación en la zona de
clones hipervirulentos que cuando infectan a la población, causan patologías que evolucionan rápidamente a formas graves. Por
esta razón, no se encontrarían porcentajes significativos de infecciones leves o moderadas causadas por este patógeno. Objetivo: Implementar en el Laboratorio Central de Neuquén, una metodología de PCR en tiempo real para caracterizar los aislamientos de E. coli O157 por genotipificación basada en SNP. Investigar en aislamientos provenientes de muestras clínicas, la presencia de cepas del clade 8, caracterizado por su hipervirulencia y
capacidad para causar patologías severas. Materiales y métodos:
Se estudiaron aislamientos provenientes de casos clínicos de SUH
y de diarreas acuosas y sanguinolentas. Las cepas conservadas
en caldo glicerinado a -80 °C, se repicaron en agar Mac Conkey
Sorbitol. A partir de este crecimiento se realizó la extracción y
purificación de DNA empleando el equipo QIAamp DNA mini kit
(Qiagen, Hilden, Alemania).Se utilizó una PCR en tiempo real que
utiliza cebadores en horquilla (hairpin primers) dirigidos contra el
SNP 539 ubicado en el marco de lectura ECs2357, característico
del Clade 8. Se usó un equipo de real time PCR CFX96 (BioRad,
Hercules, CA, USA). Resultados: Se estudiaron 40 cepas clínicas,
37 (92,5%) de ellas pertenecieron al clade 8. Conclusiones: se
implementó una metodología para detectar SNP, con buenos resultados. Los hallazgos demuestran una circulación muy predominante del clade 8 hipervirulento. Estos primeros datos podrían
explicar la particular epidemiología del SUH en nuestra provincia.
Tal vez la presencia casi exclusiva del clade hipervirulento está
105
marcando una rápida progresión a SUH en los pacientes infectados. Por esta razón, no detectamos el agente mientras está causando patologías más leves. Es imprescindible profundizar estas
investigaciones, para aclarar debidamente las causas de la alta
incidencia de la enfermedad en nuestro medio y poder actuar
sobre ellas más eficientemente.
P213 - 27154 ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE CEPAS DE
Bacillus spp. AISLADAS DE ALIMENTOS VEGETALES. FANGIO,
MARIA FLORENCIA; ROURA, SARA INES(1,2); FRITZ,
ROSALIA(1)
(1) Universidad Nacional de Mar Del Plata, (2) CONICET
Introducción: La creciente demanda de los consumidores por
obtener alimentos más naturales y la conciencia de los riesgos a
la salud de algunos conservantes químicos ha llevado a los investigadores a examinar la posibilidad de utilizar bacteriocinas
como bioconservantes, así como la aplicación directa de las cepas productoras de estas sustancias. Las bacteriocinas son
péptidos sintetizados ribosómicamente por bacterias que presentan propiedades antimicrobianas contra otras bacterias, a menudo estrechamente relacionadas con la cepa productora. Han sido
frecuentemente encontradas como metabolitos secundarios de
varios microorganismos entre los cuales se encuentra el género
Bacillus. Objetivo. El objetivo del presente estudio fue analizar la
actividad antimicrobiana de cepas de Bacillus spp. y géneros relacionados aisladas de alimentos de origen vegetal, con el fin de
identificar cepas potencialmente productoras de sustancias tipo
bacteriocinas. Materiales y métodos: Los microorganismos se aislaron a partir de muestras de zapallo (Cucurbita moschata), papa
(Solanum tuberosum subsp. tuberosum), arroz crudo (Oryza género L), y harina de trigo (Triticum vulgare). Las cepas fueron identificadas de acuerdo a sus características morfológicas, bioquímicas y moleculares. Se prepararon extractos crudos libres de
células a partir de cultivos en caldo Mueller-Hinton que se emplearon para la evaluación de su actividad antimicrobiana por el
método de difusión en agar frente a bacterias indicadoras (distintas especies de Bacillus spp. y Paenibacillus spp., Staphylococcus
aureus y Escherichia coli). Para analizar la naturaleza peptídica
de las sustancias antimicrobianas, se midió la actividad antimicrobiana de los extractos incubados previamente con y sin tripsina.
La actividad antimicrobiana de las cepas frente a cada bacteria
indicadora se comparó mediante análisis de varianza (ANOVA)
con las pruebas de Tukey. Resultados: Aproximadamente 100
cepas bacterianas aisladas a partir de alimentos vegetales fueron analizadas para la detección de sustancias tipo bacteriocinas.
Veinte cepas pertenecientes a Bacillus spp. y al género Paenibacillus presentaron actividad antimicrobiana contra B. cereus (16
cepas), B. pumilus, (2 cepas), B. subtilis (14 cepas), P. larvae (10
cepas), P. polymyxa. (7 cepas) y S. aureus (3 cepas). E. coli ATCC
25922 fue resistente a todas las cepas aisladas. En muchos casos para una cepa indicadora dada, algunos aislamientos mostraron una actividad antimicrobiana significativamente mayor (P
<0,05) a los demás aislados. La actividad antimicrobiana de los
extractos fue sensible a la acción proteolítica de la tripsina. Esto
sugeriría que las sustancias antimicrobianas producidas corresponderían a bacteriocinas. Dos de las cepas que mostraron un
amplio espectro de inhibición podrían ser considerados como
agentes antimicrobianos con potenciales aplicaciones en la seguridad alimentaria e implicaciones importantes para el control biológico de microorganismos patógenos y alterantes.
P214 - 27184 CALIDAD MICROBIOLÓGICA DE HIERBAS AROMÁTICAS: SALVIA (Salvia officinalis L.) Y MENTA (Mentha
piperita). DECONTAMINACIÓN POR RADIACIÓN GAMMA.
MARUCCI, PATRICIA LILIANA; CROCI, CLARA ANA
Universidad Nacional del Sur
La mayor parte de la microbiota en muchas especias está integrada por bacterias aerobias mesófilas formadoras de esporas
provenientes de la tierra. Las esporas pueden ser más del 50%
106
del recuento de aerobios mesófilos. El porcentaje de bacterias
formadoras de esporas anaerobias estrictas suele ser insignificante. Con frecuencia se encuentran coliformes pero no Escherichia
coli. Aunque los mohos pueden variar en gran medida con la especia, por lo general predominan Aspergillus glaucus, Aspergillus
niger y Penicillium spp. De los métodos propuestos para la
decontaminación de hierbas aromáticas y especias, el tratamiento con radiaciones ionizantes ha demostrado ser el más eficaz y
seguro. La dosis de irradiación máxima aceptada en la Unión
Europea es de 10 kGy, mientras que algunos países, como Argentina y Estados Unidos, han aumentado ese nivel hasta 30 kGy
sin observar efectos perjudiciales. El objetivo de nuestro trabajo
fue evaluar el efecto de diferentes dosis de radiación gamma sobre la decontaminación microbiana de menta y salvia. Las muestras frescas fueron provistas por Profam Cultivos Alternativos de
la localidad de Médanos, Provincia de Buenos Aires, Argentina.
Se secaron en estufa a 37°C hasta que alcanzaron un peso constante. Fueron fraccionadas e irradiadas en la Planta de Irradiación Semi-industrial del Centro Atómico Ezeiza, de la Comisión
Nacional de Energía Atómica. Se utilizó una fuente de rayos
gamma de cobalto-60 con una velocidad de dosis 0.13 kGy/min
en aire (determinado por dosimetría Fricke). Se aplicaron dosis
de radiación de: 1.0, 3.0, 6.0, 10.0 y 30.0 kGy. Se trabajó en paralelo con una muestra control sin irradiar. Se determinó el recuento de bacterias aerobias mesófilas y sus esporas, enterobacterias,
mohos y levaduras, clostridios sulfito reductores y la presencia de
Escherichia coli según normativas de la International Commission
on Microbiological Specifications for Food. En nuestro trabajo la
aplicación de 10 kGy produjo un grado de decontaminación cercano al límite de detección del método utilizado (< 100 UFC/g)
para todos los grupos fisiológicos buscados. Escherichia coli no
estuvo presente en 0.1g en ninguna de las muestras analizadas.
Podemos concluir que la dosis recomendada para la decontaminación de hierbas aromáticas estaría comprendida entre 6 y 10
kGy, valores que se encuentran en el rango de dosis permitido
para el control microbiano en nuestro país.
P215 - 27216 CALIDAD SANITARIA DEL AGUA DE BEBIDA EN
UN CRIADERO INTENSIVO DE POLLOS PARRILLEROS DE LA
ZONA DE BAHÍA BLANCA. ESPERANZA, X; SALERNO, C;
RODRIGUEZ GANDUGLIA, H; ARENAZ, F; PEREZ, M
Universidad Nacional del Sur
La contaminación bacteriana del agua de bebida en criaderos intensivos de pollos parrilleros facilita el ingreso de bacterias
patógenas, causando diarreas, problemas respiratorios y articulares. Dicha situación afecta los parámetros productivos, acarreando pérdidas económicas para el productor. Objetivo: determinar
la sanidad bacteriológica del agua de bebida proveniente de una
perforación que abastece al establecimiento. Las investigaciones
se realizaron en un criadero a 25 Km de Bahía Blanca. Se seleccionaron dos galpones, uno destinado a la cría de pollitos y el otro
a pollos adultos, efectuándose cuatro muestreos mensuales durante el año 2008. En todas las fechas se tomó una muestra de
cada tanque colector y tres muestras de los bebederos. Ambos
galpones presentaban bebederos de modelo abierto. Se realizaron recuentos de bacterias heterotróficas (RHP), coliformes totales (CT) en VRBA y pseudomonas en Pseudomonas agar F y P.
El recuento de enterococos fecales (EF) se estableció por Número
Más Probable (APHA). Para la búsqueda de salmonelas se usó
caldo selenito y los medios agar Salmonella Shigella y MacConkey.
A las colonias sospechosas, se les efectuaron las pruebas de TSI,
LIA, SIM, ONPG y ureasa. El diseño estadístico fue un ANOVA
doble mixto desbalanceado proporcionalmente. No existe una
normativa para el agua de bebida del ganado. Algunos autores
proponen posibles parámetros microbiológicos. En la Tabla se
observa que los RHP y los CT superaron las 100 y 50 UFC/mL,
respectivamente, según Waggoner y Good. Se confirmó la presencia de P. aeruginosa; según Watkins, una sola UFC/mL hace
al agua no apta para las aves. Los valores de los EF superaron
las 5 UFC/100mL propuestas por el Labovet-Reseau Cristal. Hubo
diferencias significativas en todos los recuentos entre bebederos
y tanques en ambos tipos de galpones (p<<0,01). Sólo para CT y
pseudomonas se hallaron diferencias entre las fechas de muestreo
(p<<0,01) para ambas edades. No se detectaron salmonelas. Se
observaron bacterias gram-variable de los géneros Corynebacterium, Arthrobacter y actinomicetes.
Sitio de Muestreo
Bebederos
Bebederos
Tanques
Tanques
Galpones
N° muestras
RHP (UFC/mL)
CT (UFC/mL)
Pseudomonas (UFC/mL)
EF (UFC/100 mL)
Salmonella spp.
Pollitos
12
2400x10²
200
2100x10²
67x10²
ausencia
Adultos
12
2200x10²
280
1300x10²
62x10²
ausencia
Pollitos
4
15x10²
11
8
420
ausencia
Adultos
4
20x10²
10
14x10²
230
ausencia
El modelo de bebederos favorecería el elevado recuento de bacterias debido al ingreso de suciedad, pollinaza y polvo en suspensión. Estos resultados podrían vincularse con deficiencias en el
manejo sanitario de la granja. La ausencia de salmonelas y el
predominio de bacterias gram-positivas estarían relacionados con
los antibióticos adicionados al agua.
P216 - 27218 EFECTO DE LA INFECCIÓN DE Mycobacterium
avium subsp. paratuberculosis SOBRE LA PRODUCCIÓN Y
COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LA LECHE DE CABRAS. ZEDDE,
AINARA(1); FIORENTINO, MARIA ANDREA(2); VECHIARELLI,
MARIA SOL(1); CIRONE, KARINA(2); MORSELLA, CLAUDIA(2);
MENDEZ, LAURA(2); PAOLICCHI, FERNANDO(2,1);
GAGLIOSTRO, GERARDO(2)
(1) Universidad Nacional de Mar del Plata, (2) INTA
Introducción: La paratuberculosis es una enfermedad crónica
de los rumiantes producida por Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis (Map) que afecta a bovinos, ovinos, caprinos y
otros pequeños rumiantes. Se caracteriza por provocar enteritis
crónica que conlleva pérdidas en la producción. Estudios previos
demostraron que Map reduce la producción de leche en vacas
infectadas con y sin signos clínicos, sin efectos claros sobre el
contenido de grasa y proteínas. La información del efecto de la
infección con Map sobre la producción y composición de la leche
de caprinos a nivel nacional o internacional es a nuestro conocimiento inexistente. Objetivos: Determinar si existe variación de la
producción láctea y la composición química de la leche de cabras
naturalmente infectadas con Map. Materiales y métodos: El trabajo se realizó en un tambo caprino de 200 animales de la raza
Saanen, situado en la provincia de Buenos Aires con diagnóstico
previo de paratuberculosis. Se seleccionaron 20 cabras de 3-4
años de edad, paridas durante el mes de septiembre, las cuales
fueron divididas en dos grupos: A) Grupo infectado (n=9), animales con tinción de Ziehl Nielsen (ZN) positivo en materia fecal y
ELISAi positivo (Do > 0,35), B) Grupo sano (n=11), animales ZN
de materia fecal y ELISAi ambos negativos (Do < 0,17). Ningún
animal mostraba signos clínicos de la enfermedad al inicio del trabajo. La duración del ensayo fue de 15 días. La producción láctea individual se determinó registrando los litros producidos durante el único ordeñe de la tarde durante 8 días no consecutivos.
Se determinó el contenido de grasa butirosa, proteínas totales y
lactosa a través de un autoanalizador infrarrojo (MilkoScan 300)
en 4 oportunidades. Resultados: El grupo infectado tuvo una disminución en la producción de leche que varió del 54,2% al 42%
en los diferentes ordeñes registrados. Al culminar el trabajo el
grupo de animales infectados produjo 37,830 L de leche menos
que el grupo sano, pero esta diferencia no fue significativa. Para
el contenido de grasa, de lactosa y de proteínas totales, no se
encontró una diferencia significativa entre los grupos infectado
(4,72%; 4,94%; 3,92%) y sano (4,17%; 4,10%; 3,45%). Este estudio muestra que la infección subclínica con Map en cabras no
produce un efecto negativo sobre el tenor graso, de lactosa y de
proteínas resultado que coincide con estudios realizados en ganado bovino. Por otro lado aunque la diferencia encontrada en la producción láctea no es estadísticamente significativa, si es importante desde el punto de vista económico para el productor, ya que una
disminución en la producción significa una menor ganancia.
P217 - 27269 PORTACIÓN DE Staphylococcus aureus EN MANIPULADORES DE ALIMENTOS. JORDA, GRACIELA BEATRIZ;
MARUCCI, RAUL SALOMON; GUIDA, ADRIANA MARCELA;
PIRES, PATRICIA
Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales – Universidad Nacional de Misiones
Las enfermedades transmitidas por los alimentos se encuentran entre los principales problemas de salud pública en el mundo. El patógeno aislado con mayor frecuencia en casos de
intoxicaciones alimentarias es Staphylococcus aureus (S. aureus)
Su presencia en los alimentos se asocia a una inadecuada manipulación o al empleo de materias primas contaminadas. La
portación nasofaríngea de S. aureus es común en la población y
para los manipuladores de alimentos y personal hospitalario constituye un serio problema. El objetivo de este estudio fue investigar la presencia de S. aureus en el personal que elabora y
expende alimentos en reconocidos restaurantes y panaderías de
la ciudad de Posadas y determinar la susceptibilidad a antibióticos
en las cepas aisladas. Se obtuvieron 88 muestras de hisopado
nasal y manos de manipuladores que intervienen en las distintas
etapas del proceso de elaboración. Las muestras se sembraron
en Agar Manitol Salado y se incubaron a 37°C por 24 - 48 h. Se
identificaron las colonias de S. aureus mediante las pruebas
bioquímicas de catalasa, coagulasa, DNAsa y susceptibilidad a la
novobiocina. El estudio de susceptibilidad a antibióticos se efectuó mediante el método de difusión en agar aplicando la metodología recomendada por el CLSI. Se utilizaron discos de oxacilina
1 ug, clindamicina 2 ug, vancomicina 30 ug, eritromicina 15 ug y
cefoxitina 30 ug, teicoplanina 30 ug, rifampicina 5 ug, gentamicina
10 ug. Del total de las muestras estudiadas resultaron positivas
33 (37,5%), discriminadas de la siguiente manera: 2 en manos y
fosas nasales y 31 en fosas nasales solamente. El estudio de
susceptibilidad a antibióticos de las 33 cepas de S. aureus aisladas mostró 26 (78,7%) cepas sensibles a todos los antibióticos
ensayados y 2 resistentes a eritromicina y clindamicina. Cabe
destacar que se encontraron 5 (15%) cepas meticilino resistente
(MRSA). De los resultados obtenidos se puede concluir que este
microorganismo esta presente en un elevado porcentaje de los
manipuladores, lo que puede alterar la calidad de los alimentos
y/o producir enfermedades transmitidas por los alimentos cuando se contaminan y se los consume. Los resultados de los estudios realizados se entregaron a los dueños de las empresas, con
el objeto de concientizar a su personal de la importancia de la
aplicación de las buenas prácticas de manufactura.
P218 - 27321 CALIDAD MICROBIOLÓGICA DEL AGUA EN UN
SISTEMA CERRADO DE RECIRCULACIÓN PARA CULTIVO INTENSIVO DE TRUCHA ARCO IRIS (Oncorhynchus mykiss).
MARUCCI, PATRICIA(1); BRUGNONI, LORENA(1,2); SICA, MARIA GABRIELA(1); LOPEZ CAZORLA, ANDREA(1,2); CUBITTO,
MARIA AMELIA(1)
(1) Universidad Nacional del Sur, (2) CONICET
Los sistemas cerrados de recirculación de agua para acuicultura (SCRA) presentan un creciente interés debido al enorme
potencial que exhiben para reducir los requerimientos de agua en
estas actividades, ahorrando hasta un 90% de agua comparado
con los sistemas abiertos tradicionales. La piscicultura requiere
de una óptima calidad del agua, y los SCRA tienen la ventaja de
permitir el control del ambiente y los parámetros fisicoquímicos y
microbiológicos de la misma, obteniéndose así un adecuado crecimiento de los animales y una prevención en sanidad. El objetivo de nuestro trabajo fue evaluar la calidad sanitaria de un SCRA
durante un ensayo de cultivo de trucha arco iris. El sistema incluyó 2 unidades de tres estanques circulares de auto limpieza cada
una, con un volumen de agua de 400 L, dos tanques de fibra de
vidrio con biofiltros y dos unidades de luz ultravioleta. El caudal
en los estanques de producción fue de 250 litros/hora y la máxima carga de biomasa fue estimada en 15 kg/m³. Se utilizaron
animales de 4 meses de edad (25 animales distribuidos aleato-
107
riamente en cada tanque) con un peso promedio inicial de 97.29
± 21.89 g. La temperatura del agua se mantuvo entre 14-16°C.
Los cambios de agua, de aproximadamente 15% del volumen del
sistema, se realizaron semanalmente. La evaluación de la calidad
sanitaria del sistema se realizó mediante estudios semanales de
la calidad microbiológica y fisicoquímica del agua. Los parámetros
microbiológicos registrados durante el periodo fueron: Recuento
de bacterias heterótrofas mesófilas aerobias y anaerobias facultativas totales (RHP), coliformes totales, Escherichia coli y Pseudomonas del grupo fluorescente. Quincenalmente, los peces se pesaron para calcular la tasa específica de crecimiento (TEC) y el
factor de conversión del alimento (FCA). El RHP no superó las
2150 UFC/ml en el transcurso de la experiencia, y no se evidenció presencia de coliformes en 100 ml en ninguna de las muestras. A partir de la segunda semana de iniciada la experiencia,
en las muestras se detectó presencia de Pseudomonas del grupo fluorescente en 100 ml, sin embargo, no se evidenciaron patologías por causa de dicho grupo en los animales. El pH de las
aguas se mantuvo en el rango de 7.8 ± 0.1, los valores de amonio
no superaron los 0.5 mg/L y los de nitritos presentaron una media de 1 mg/L. La ganancia de peso de los animales fue de 94.73
± 21.76 g. A lo largo de la experiencia se obtuvo una supervivencia del 95%, sin observarse mortandad debido a enfermedades
de origen microbiano. Los indicadores de crecimiento muestran
una utilización eficiente del alimento en el SCRA: la biomasa se
incrementó en un 200% con un FCA ≤ 0.74 y una TEC ≥ 0.86.
Se puede concluir que el sistema de recirculación mantiene la
calidad del agua y que es adecuado para sustentar la cría de la
trucha arco iris en condiciones de sanidad.
219 - 27323 PORTACION DE Staphylococcus aureus COAGULASA POSITIVO EN MANIPULADORES DE ALIMENTOS.
GRUMELLI , YANINA(1); ALIVERTI, FLORENCIA(2); BROCARDO,
M SILVINA(2); ALIVERTI, VIRGINIA (2); BRUSA, VICTORIA(2);
COPES, JULIO A(2); LEOTTA, GERARDO A (2)
(1) FCQYA UCC, (2) LAMA Facultad de Ciencias Veterinarias –
Universidad Nacional de La Plata
La presencia de Staphylococcus aureus en alimentos representa un riesgo potencial para la salud pública y su principal factor de virulencia son las enterotoxinas. Entre los alimentos implicados en intoxicaciones causadas por S. aureus se encuentran
carnes, lácteos, huevos y vegetales. La contaminación por este
microorganismo ocurre durante y después del procesamiento de
los alimentos. El objetivo del trabajo fue determinar la portación
de S. aureus en las manos de operarios de una empresa productora de alimentos listos para el consumo y caracterizar los aislamientos por técnicas fenotípicas y genotípicas. Entre el 04/10/2009
y 18/12/2009 se tomaron muestras a todos los operarios de una
planta elaboradora de alimentos listos para el consumo (N=120),
en diferentes turnos operacionales y en las condiciones de trabajo en que se encontraban los manipuladores. Se utilizaron 250
mL de agua peptonada en bolsas estériles. Las manos de cada
operador fueron sumergidas en una bolsa. Las muestras fueron
procesadas inmediatamente según la metodología para determinar presencia/ausencia (ICMSF, 2000). De cada bolsa se tomó 1
mL y se incubó en 9 mL de caldo Giolitti Cantoni a 37°C por 24
h. Se sembró una ansada de cada caldo en agar Baird Parker
incubándose a 37 °C por 48 h. De cada placa se realizó el reaislamiento de las colonias típicas y atípicas en agar Baird Parker.
Las colonias aisladas fueron identificadas por pruebas bioquímicas
(DNAsa, VP, reducción de nitrato y fermentación de maltosa,
lactosa, manitol, trehalosa y manosa), ELISA (TECRA Staph, 3M)
y PCR (Manfredi, 2008). Sobre un total de 120 muestras analizadas, 46 (38,3%) fueron positivas presuntivas en caldo Giolitti
Cantoni, de las cuales 38 (31,6%) presentaron colonias típicas y/
o atípicas en agar Baird Parker. Se caracterizó un aislamiento de
cada muestra. Sobre un total de 24 (20%) aislamientos coagulasa
positivo, 22 (18,3%) fueron identificados como S. aureus subespecie aureus. Catorce (11,7%) aislamientos fueron positivos para
el pool de enterotoxinas SEA, SEB, SEC, SED y SEE por ELISA,
de las cuales 12 (10%) fueron positivas por PCR. Seis aislamientos fueron portadores del gen sea y 6 aislamientos fueron porta-
108
dores del gen sec. Durante el período de muestreo la empresa
elaboradora de alimentos listos para el consumo realizó el análisis microbiológico de los productos terminados y todos los alimentos fueron aptos para el consumo (CAA, Art. 151). Sin embargo,
el 20% de los manipuladores fue portador de Staphylococcus spp.
coagulasa positivo y el 10% fue portador de S. aureus enterotoxigénico. Las causas de este hallazgo podrían ser desde la buena
aplicación del sistema de HACCP, BPM y POES, hasta un insuficiente muestreo de producto terminado. Se considera adecuado
implementar y optimizar el sistema de HACCP, BPM y POES en
las empresas elaboradoras de alimentos, como así también
implementar la detección de S. aureus coagulasa positivo en los
manipuladores para tomar medidas de intervención adecuadas y
minimizar los riesgos de contaminación alimentaria por manipuladores.
P220 - 27326 EVALUACIÓN DE UN SISTEMA DE PCR EN TIEMPO REAL PARA LA DETECCIÓN DE Escherichia coli O157:H7
A PARTIR DE CARNE BOVINA MOLIDA. BRUSA, VICTORIA(1);
PALACIOS, MAURO(2); LOUP, VERONICA(3); COPES, JULIO(1);
PINEDA, GLORIA(3); BROCARDO, SILVINA(1); ALIVERTI, VIRGINIA(1); ALIVERTI, FLORENCIA(1); GALLERI, DELFINA(1); PERAL GARCIA, PILAR(4); PELLICER, KAR
(1) LAMA Facultad de Ciencias Veterinarias – Universidad Nacional de La Plata, (2) MEDICATEC, (3) SENACSA Paraguay, (4)
IGEVET Universidad Nacional de La Plata-CONICET
La infección por Escherichia coli O157:H7 es causa de diarrea
con o sin sangre, colitis hemorrágica y síndrome urémico
hemolítico (SUH) en humanos. El principal reservorio animal de
E. coli O157:H7 son los bovinos y la carne bovina molida es una
potencial fuente de infección. El objetivo de este trabajo fue evaluar un sistema comercial de PCR en tiempo real para la detección de E. coli O157:H7. Se contaminaron experimentalmente 50
muestras de carne molida bovina con 10 cepas de E. coli O157:H7
(10, 100 y 1000 UFC/25 g) y 20 cepas de bacterias E. coli noO157:H7 (1000 UFC/25 g). Como tamizaje se utilizó el sistema
de PCR en tiempo real R.A.P.I.D. LT Food Security System y el
kit comercial E. coli O157:H7 LT Test Kit (Idaho Technologies Inc.,
Utah, EE.UU.), siguiendo las instrucciones específicas del fabricante. Se determinó límite de detección, selectividad y robustez.
Todas las muestras contaminadas con diferentes concentraciones
de E. coli O157:H7 fueron positivas. El límite de detección dependió de la cepa analizada y la concentración bacteriana con la que
se contaminaron las muestras, el valor mínimo fue 6,1 UFC/25 g.
Se obtuvo un 100% de inclusividad y un 100% de exclusividad.
Todos los resultados fueron reproducibles al analizar las muestras contaminadas con 10 cepas de E. coli O157:H7 en 3 días
consecutivos y por 3 operadores. El sistema evaluado en este trabajo se basa en PCR en tiempo real y utiliza sondas específicas
marcadas con fluorógenos para la detección de los amplicones
generados en el proceso. La técnica evaluada es una alternativa
apropiada para la detección de E. coli O157:H7 a partir de carne
bovina molida. Si bien este sistema de PCR en tiempo real cuenta con la validación de AOAC International (AOAC N° 100901),
en el presente trabajo se demostró su utilidad para la detección
de cepas de E. coli O157:H7 circulantes en Argentina.
P221 - 27328 COMPARACIÓN ENTRE LOS TESTS ROSA DE
BENGALA, 2-MERCAPTOETANOL Y FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO PARA EL DIAGNOSTICO SEROLÓGICO DE LA
BRUCELOSIS PORCINA. MEIRELLES BARTOLI, RAPHAELLA;
SILVA, TALITA; BLANKENHEIM, THALITA; SILVA, FELIPE JORGE; MATHIAS, LUIS ANTONIO
Universidad Estatal Paulista - UNESP
El diagnóstico es una de las herramientas de un programa de
combate de la brucelosis animal, pues permite identificar las fuentes de infección, evitando su circulación y reduciendo el riesgo de
diseminación del agente etiológico. Cuando se trata de la brucelosis porcina, el diagnóstico es particularmente problemático, por-
que difícilmente un solo test serológico logre identificar todos los
animales infectados. Esta investigación tuvo por objetivo comparar los resultados de tres tests aplicados para el diagnóstico
serológico de la brucelosis porcina. Fueron comparados la prueba del rosa de Bengala (RB), la prueba del mercaptoetanol (ME),
realizado simultáneamente a la prueba de aglutinación en tubos,
siendo que la interpretación fue realizada según la legislación
brasileña, y la prueba de fijación de complemento (FC), utilizando la microtécnicas 50% de hemólisis con incubación a 37 °C en
la dos fases de la reacción, considerando positivos los sueros con
por lo menos 25 de fijación de complemento en la dilución 1/4.
Se analizaron 333 muestras de suero de cerdos de un rebaño
comprobadamente infectados por Brucella suis y 1.100 muestras
de suero de cerdos de rebaños libres de la infección, obtenidas
en un frigorífico. La concordancia en los resultados de los testes
fue analizada con el indicador kappa. De los 333 animales del
rebaño infectado, RB presentó 276 (82,9%) resultados positivos
y 57 (17,1%) resultados negativos, el ME presentó 265 (79,6%)
resultados positivos, 7 (2,1%) inconcluyentes y 61 (18,3%) negativos, y la FC presentó 271 (81,4%) resultados positivos y 62
(18,6%) resultados negativos. De los 1.100 sueros animales del
frigorífico, 8 (0,7%) fueron positivos en el RB y todos fueron negativos en los otros dos tests. En la comparación entre los resultados del RB con los del ME, el indicador kappa fue 0,97 cuando
los resultados inconcluyentes del ME fueron desconsiderados,
0,93 cuando los inconcluyentes fueron considerados positivos y
0,95 cuando ellos fueron considerados negativos, indicando, en
las tres situaciones, concordancia óptima entre los testes. En la
comparación entre RB y la FC, fue notado una proporción de 98,7%
de resultados concordantes y un indicador kappa 0,96, mostrando
concordancia óptima entre los tests. Cuando la FC fue comparada
con el ME, fue verificado kappa 0,98 cuando los inconcluyentes del
ME fueron desconsiderados y kappa 0,97 cuando fueron considerados positivos y cuando fueron considerados negativos, o sea,
concordancia óptima. Los resultados obtenidos permiten concluir
que, en la situación analizada, todos los tests presentaron un bueno desempeño en el diagnóstico serológico de la brucelosis porcina
y que la concordancia entre ellos fue óptima.
P222 - 27330 ESTUDIO PRELIMINAR SOBRE EL AISLAMIENTO
Y LA IDENTIFICACIÓN DE Salmonella enterica EN CERDOS DE
LA REPÚBLICA DEL PARAGUAY. COPES, JULIO(1); CARDOZO,
LUZ(2); ALVAREZ, MERCEDES(3); SUZUKI, KUNIAKI(4);
GIMENEZ, GUILLERMO(2); WEILER, NATALIE(3); NUÑEZ,
LORENA(2); ZARATE, NOEMI(3); LOPEZ, DALILA(2); LEOTTA,
GERARDO(2)
(1) LAMA Facultad de Ciencias Veterinarias – Universidad Nacional de La Plata, (2) FCV UNA PARAGUAY, (3) LCSP MSPBS
PARAGUAY, (4) JICA JAPÓN
La salmonelosis es una de las enfermedades transmitidas por
alimentos (ETA) más importantes de América del Sur, que puede
ser transmitida por una gran variedad de alimentos. En Paraguay,
se observa un aumento en la producción de cerdos para consumo. El objetivo de este trabajo fue determinar la frecuencia de
Salmonella enterica y sus diferentes serotipos presentes en cerdos en crecimiento de doce distritos de la República del Paraguay.
Se recolectaron 1000 muestras de materia fecal en 33 granjas de
cerdos en crecimiento. Las muestras fueron pre-enriquecidas en
agua peptonada a 37 °C durante 24 h, enriquecidas en caldo
tetrationato a 42 °C por 24 h y finalmente fueron sembradas en
medios de cultivo selectivos y diferenciales. Las colonias sospechosas fueron caracterizadas por pruebas bioquímicas y
serotipificación. Se obtuvieron 189 (18,9%) muestras positivas, de
las cuales se aislaron 189 cepas de S. enterica. Se identificaron
28 serotipos, entre los que predominaron S. Typhimurium (16%),
S. Schwarzengrund (13%), S. Derby (11%), S. Anatum (7%), S.
Cerro (7%), S. Stanley (5%), S. Saintpaul (4%) y S. Rissen (4%).
De los 12 distritos estudiados, Tablada y Capiata presentaron los
porcentajes de aislamiento más altos (26%). El porcentaje de S.
enterica (18,9%) indica una alta contaminación en los sistemas
de explotación estudiados. Dentro de la totalidad de las granjas,
se observaron resultados muy dispares que oscilaron entre 3,3%
y 63,3%. Estos resultados pueden asociarse a deficiencias identificadas en las condiciones edilicias y en la aplicación de las
buenas prácticas de manejo en los establecimientos muestreados.
Por lo tanto, es importante continuar con este tipo de estudios,
ya que el conocimiento de las características fenotípicas y
genotípicas de las cepas de S. enterica circulantes en el reservorio
animal permitirá mejorar el sistema de vigilancia de las ETA en
la República del Paraguay. Desde el punto de vista de la salud
pública, es interesante desatacar que el serotipo más frecuentemente aislado fue S. Typhimurium, uno de los serotipos más
prevalentes en casos de ETA en el mundo, como así también en
Paraguay. Los datos obtenidos en este trabajo son los primeros
en la República del Paraguay.
P223 - 27398 AISLAMIENTO DE Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis A PARTIR DE LECHE DE CABRAS NATURALMENTE INFECTADAS. ZEDDE, AINARA(1); FIORENTINO, MARIA ANDREA(2); VECHIARELLI, MARIA SOL(1); CIRONE,
KARINA(2); MORSELLA, CLAUDIA(2); MENDEZ, LAURA(2);
PAOLICCHI, FERNANDO(1,2)
(1) Universidad Nacional de Mar del Plata, (2) INTA
Introducción: La paratuberculosis es una enfermedad crónica
de los rumiantes producida por Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis (Map) que afecta a bovinos, ovinos, caprinos y
otros pequeños rumiantes. Actualmente es vinculada con la Enfermedad de Crohn en humanos, una inflamación crónica del intestino, por lo que se la puede considerar una posible zoonosis.
La fuente de infección para humanos más importante es la leche,
ya que la pasteurización no lograría eliminar las células de Map
viables. Map ha sido detectado en leche cruda y pasteurizada y
en quesos de vacas, en diferentes países. En la India, Map se
aisló por cultivo de leche cruda de cabras que tenían signos clínicos de la enfermedad. Sin embargo existen pocos estudios realizados en cabras. Objetivo: Investigar la presencia de Map en
leches de cabras serológicamente positivas. Materiales y métodos: el trabajo se realizo en un tambo caprino con 200 animales
de raza Saanen, situado en la provincia de Buenos Aires, con
diagnóstico previo de paratuberculosis por cultivo de materia fecal. Se seleccionaron 9 cabras (3-4 años de edad) con Ziehl
Neelsen de materia fecal y ELISAi positivos, sin presencia de signos clínicos de la enfermedad. Se tomaron muestras de materia
fecal (MF) y de leche individuales en dos oportunidades separadas por un periodo de tiempo de 30 días, durante el ordeñe de la
tarde. Las muestras de MF se decontaminaron con hexadecilpiridinium (HPC) al 0,75% durante toda la noche. Para las muestras de leche se utilizaron dos métodos de descontaminación: 1)
con (HPC) al 0,75% durante toda la noche y 2) con ácido oxálico
(AO) al 5% durante 2 horas. Luego cada muestra de MF y de leche se cultivó en tres tubos: a- Herrold, b- Herrold con micobactina
y piruvato, c- Herrold con micobactina, piruvato y antibióticos
(HMPA). Se observaron los tubos semanalmente durante 8 meses
y las colonias sospechosas fueron confirmadas por PCR IS900.
Resultados: De las 9 cabras muestreadas, solo en 4 se aisló Map
de materia fecal, en los medios HMP y HMPA. Por otro lado se
observaron, en el medio HMP colonias de Map en una de las muestras de leche decontaminada con AO al 5%. Las colonias fueron
confirmadas por PCR. Este trabajo demuestra que Map puede ser
excretado en la leche de cabras que no presentan signos clínicos
de la enfermedad. Esta situación podría representar un riesgo para
la salud pública en caso de que esta enfermedad sea confirmada
como una zoonosis ya que Map resiste las condiciones de
pasteurización de leche y de maduración de quesos.
P224 - 27497 EVALUACIÓN DEL DESARROLLO DE Clostridium
botulinum EN QUESOS UNTABLES, CON CARACTERÍSTICAS
FÍSICO-QUÍMICAS DETERMINADAS Y EN DIFERENTES CONDICIONES DE CONSERVACIÓN. FARACE, MARIA ISABEL (1);
CASTELLI, EDGARDO (1); DIAB, ALEJANDRO (2); RAMPONE,
HORACIO (2)
(1) Instituto Nacional, (2) SANCOR Cooperativa
109
Botulismo es una enfermedad caracterizada por parálisis
fláccida, causada por neurotoxinas (NTBo) de Clostridium
botulinum y en ocasiones por Clostridium baratii y Clostridium
butyricum. La forma alimentaria se presenta con alta mortalidad,
por lo que resulta una emergencia y debe ser reportada en forma inmediata Se caracteriza por siete tipos de neurotoxinas, de
la A a la G. Los tipos A, B, E y eventualmente el F, afectan al
humano, C y D a animales y el G se encontró en suelos. Los aspectos físico químicos como aw (water activity), pH, temperatura
y conservantes pueden inhibir o favorecer el desarrollo de
Clostridium botulinum y la producción de sus toxinas. Los valores y concentraciones de los mismos pueden minimizar los riesgos para la producción de una toxoinfección. El objetivo es evaluar la producción de toxina botulínica en quesos untables, a diferentes temperaturas, con características físico químicas determinadas, durante un periodo de tiempo establecido. Las características físicas químicas para el ensayo fueron las siguientes:
Humedad: 70%, pH: 5,2, aw: 0,98, ClNa: 1,2% Sal fundente: 0,7%.
Se conformaron para el ensayo grupos de tres muestras en diferentes condiciones. Un pote se conservó a temperatura ambiente sin modificaciones, los otros dos fueron inoculados con
Clostridium botulinum Tipo A, en una concentración de 15 x 105
UFC/ml, uno se mantuvo a temperatura ambiente y el otro a 4°C.
Se realizaron ensayos cada 15 días durante 4 meses. El diagnóstico se realizó investigando la neurotoxina (NTBo) por bioensayo,
a partir de extractos de los alimentos con tripsina y por cultivo en
caldo Tarozzi, con el fin de identificar la presencia de esporas en
el alimento sin inóculo, y su existencia en las muestras inoculadas para darle sustentabilidad al ensayo. Los resultados obtenidos mostraron ausencia de esporas y neurotoxina en las muestras originales (sin inóculo) lo que permite inferir sobre buenas
prácticas de manufactura. En las muestras inoculadas, no se demostró la formación de neurotoxina en ninguna de las muestras
analizadas y puso en evidencia la presencia del microorganismo
y su capacidad toxigénica por cultivo y bioensayo, lo que refuerza
la potencial situación de riesgo y la validez de las prueba. Se concluye que las condiciones físico químicas del producto del ensayo resultaron favorables para la inhibición de la producción de
neurotoxina, durante el tiempo del estudio, para esa concentración inoculada y a las temperaturas probadas. Es necesario realizar futuros ensayos, utilizando mayores concentraciones del
inóculo y variando parámetros físicos químicos, definiendo posibles límites de riesgo para la producción de toxina y una potencial toxoinfección.
P225 - 27536 DETECCIÓN DE Campylobacter spp. EN HAMBURGUESAS DE POLLO POR MÉTODOS BACTERIOLÓGICOS
Y MOLECULARES. HOFFER, ALICIA; CORREA, CRISTINA;
FARACE, MARIA
Instituto Nacional
Introducción: Los Campylobacter termotolerantes son reconocidos como una de las causas mas frecuentes de gastroenteritis
de origen alimentario. El alimento de mayor riesgo es la carne de
ave mal cocida, dado que esta especie es portadora sana del
microorganismo en su intestino, contaminando la carcasa durante la faena. Por ello es importante su detección en alimentos en
forma precoz. Objetivo: comparar métodos bacteriológicos y
moleculares para la detección de Campylobacter spp. en muestras de hamburguesas de pollo de elaboración artesanal, tomadas al azar de bocas de expendio, a fin de comparar sensibilidad
y rapidez de las diferentes metodologías. Materiales y métodos:
Se empleó la técnica del Bacteriological Analytical Manual (March
2001) partiendo de 25 g de hamburguesa. Se le realizó un lavado con solución fisiológica estéril, y se sembró 10 ml en caldo
Bolton con antibióticos, se incubó 24 h a 42 °C,en microaerofilia.
A partir del caldo de enriquecimiento, se sembraron placas de agar
mCCDA y agar sangre por filtración a través de membrana de nitrocelulosa. Simultáneamente se realizaron templados de los lavados y de los caldos de enriquecimiento, utilizando resina Chellex
para eliminar inhibidores. Se efectuó la extracción del DNA por
calentamiento y se realizaron: una PCR multiplex para Campylobacter jejuni y C. coli y otra para Campylobacter termotolerantes
110
incluyendo a Campylobacter lari, método validado por Josefsen y
col. y utilizado en hamburguesas de pollo. Resultados: Se procesaron 39 muestras por bacteriología, 18 (46%) resultaron positivas. Por caracterización bioquímica: 11(61%) resultó C. jejuni y 7
(39%) C. coli. Por tipificación molecular (PCR múltiplex): 11 (61%)
C. jejuni, 3 (17%) C. coli y 4 (22%) coinfección C. jejuni / C. coli.
Los estudios de sensibilidad en 25 g mostraron: Límite de detección: por método bacteriológico: 104 -105ufc/25 g. Por métodos
moleculares: PCR multiplex: 106 ufc/25 g y por PCR termotolerante: 105 ufc/25 g. Conclusiones: Se obtuvo un elevado porcentaje
de muestras positivas. El método de filtración resultó efectivo para
obtener aislamientos puros sin el uso de antibióticos. La PCR
arrojó resultados significativos, permite identificar la presencia de
dos especies en la misma muestra (coinfección), cuando fenotípicamente no fue posible por bacteriología y pruebas bioquímicas.
El uso de resina chellex mejoró la sensibilidad, en especial en la
detección previa al enriquecimiento (lavados) con resultados positivos, siendo negativos por métodos bacteriológicos. Se adaptó
la PCR múltiplex, de uso habitual para caracterización de aislamientos, al estudio de alimentos. Sin embargo, mostró mayor
sensibilidad la PCR que incluye C. lari, siendo además más
abarcativa
P226 - 27588 INCREMENTO EN LA DETECCIÓN DE Listeria
monocytogenes EN ALIMENTOS DURANTE EL AÑO 2009 EN
LA CIUDAD DE BUENOS AIRES. EPSZTEYN, SERGIO;
MINGORANCE, SANTIAGO; MELAMED, CELIA; SILVIA,
SPIOUSSAS; MAREY, EDITH; STEFANINNI, CARLA; DI LORENZO, LUCILA
Dirección General Higiene y Seguridad Alimentaria -GCBA
Objetivos: Establecer comparaciones entre las tasas de prevalencia de Listeria monocytogenes en alimentos en la ciudad de
Buenos Aires en diferentes muestreos anuales. Mostrar el incremento detectado de la prevalencia de Listeria monocytogenes en
el año 2009. Remarcar la necesidad de una base de datos
epidemiológicos que permita correlacionar los datos clínicos con
los aumentos registrados en los últimos años. Materiales y métodos: Todas las muestras fueron analizadas utilizando el método
horizontal para detección y enumeración de Listeria monocytogenes en muestras de alimento ISO 11290-1, con un enriquecimiento primario en Caldo Fraser/2, enriquecimiento secundario en
Caldo Fraser y Aislamiento en Agar MOX y Agar Palcam. Las
colonias sospechosas se confirmaron por movilidad a 22° C,
Tinción de Gram, Hemólisis, Movilidad (Tumbling), Producción de
ácido a partir de Ramnosa y Xilosa y Test de Camp. Resultados:
durante el período comprendido entre el 2006 al 2008 la taza de
prevalencia promedio de Listeria monocytogenes fue de 0,13%,
se registraron en promedio 2 detecciones por año y el total de
muestras analizadas promedio fue de 1200. Estos datos se mantuvieron sin mostrar grandes variaciones en los muestreos correspondientes a los años 2006, 2007 y 2008. En el año 2009, se
registró un aumento en la tasa de prevalencia de Listeria
monocytogenes que alcanzó el 1,04% (casi 10 veces más alta que
la observada en el período 2006-2008) con un total de 16 muestras positivas en un total de 1543 muestras analizadas. De las 16
muestras positivas, 4 (25,6%) correspondieron a salchichas, 1
(6,25%) a embutido seco, 2 (12,5%) a sandwiches y 7 (56,25%)
a comidas listas para consumo. Todos los aislamientos fueron
confirmados por el laboratorio de Bacteriología especial del
ANLIS- INEI Dr. Carlos Malbrán, donde además fueron subtipificados. Los resultados de los seroagrupamientos determinaron
que: un 75% de las cepas aisladas correspondieron al serotipo
1/2b, 12,5% fueron identificados como pertenecientes a la
serovariedad 1/2c, el grupo 4b presento la misma prevalencia que
el 1/2a (6,25%) las proporciones observadas entre los diferentes
serotipos son consistentes con los reportados en el resto del
mundo. Si bien es un análisis rutinario, la búsqueda de Listeria
monocytogenes en alimentos sólo se lleva a cabo sobre productos listos para ser consumidos (fiambres, salchichas y quesos,
sándwiches y alimentos tipo vianda) que, en su gran mayoría, no
requieren tratamiento térmico que pudiera eliminar o reducir la
carga del microorganismo, razón por la cual, los datos que se
reportan son aún más preocupantes. La falta de datos epidemiológicos sobre brotes de listeriosis en nuestro país hace imposible
establecer ningún tipo de correlación entre estos datos con los
provenientes de casos clínicos del Ministerio de Salud a nivel
municipal o nacional. Sin embargo, en el mismo período de tiempo se registraron en Chile dos importantes brotes relacionados al
consumo de queso y fiambre, que alcanzaron un nivel importante de difusión en los medios nacionales
P227 - 27624 PREVALENCE OF Salmonella spp. IN THE
PRODUCTION CHAIN OF BOVINE MEAT FOR EXPORT. LOPES,
JANAINA THAIS; LANDGRAF, MARIZA; DESTRO, MARIA TERESA; FRANCO, BERNADETTE D G M
Universidad de San Pablo, Brasil
Introduction and Objective: The bovine meat faces a common
problem that is latent zoonoses, caused by pathogenic microorganisms present in animals called “reservoirs”, in which these
microorganisms don’t cause any pathology. Once present in the
animal, these microorganisms can contaminate the whole meat
production chain. Beef is exposed to contamination at all stages
of meat processing technology, particularly in operations where it
is more manipulated and where no special precautions are taken
in relation to Good Hygiene Practices. The most relevant
pathogenic microorganism present in animals and man is
Salmonella spp, the major causative organism of foodborne
diseases in Brazil and other countries. This study aimed to
evaluate the prevalence the Salmonella spp, in a bovine meat
production chain. Material and Methods: Surface samples were
collected from 200 animals in a slaughterhouse that produces
bovine meat for export, located in São Paulo, Brazil. The sampling
was done at three points of the slaughtering process, i.e, hide right
after bleeding (CO), carcass of the same animal after removal of
the hide (CA1) and carcass of the same animal after cleaning but
before chilling (CA2). Samples were collected using a swab
applied to a surface area of 400 cm² per sample. The ISO
6579:2002 method was used for detection of Salmonella spp., and
PCR, using primers ST11 and ST15, was used for confirmation.
Results: Salmonella spp. was found in 31 (15.5%) animals at the
point CO, 7 (3.5%) animals at the point CA1 e 6 (3.0%) animals
at the point CA2. Two animals were positive at two points
simultaneously (CO and CA2), and only one animal was positive
at three points simultaneously. Conclusion: Results indicate that
Salmonella spp. is present in the studied slaughterhouse, and
Good Hygiene Practices are necessary to avoid dissemination of
the pathogen in the production chain. Financing: FAPESP; Capes; CNPq.
P228 - 27632 PELÍCULAS COMESTIBLES DE QUITOSANO: UN
SISTEMA INHIBITORIO PARA CONTROLAR LA MICROFLORA
NATIVA Y LA SOBREVIDA DE E. coli O157:H7 INOCULADA.
PONCE, ALEJANDRA; ROURA, SARA; MOREIRA, MARIA DEL R
Consejo Nacional de Investigación Científica y Tecnológica/
CONICET. Grupo de Investigación en Ingeniería en Alimentos,
Introducción: La aplicación de películas comestibles con propiedades antimicrobianas tendientes a asegurar la inocuidad y
prolongar la vida útil del alimento está en pleno desarrollo. Los
films de quitosano han mostrado ser efectivos para la preservación de diferentes alimentos, con una significativa actividad
antimicrobiana sobre microorganismos patógenos y deteriorantes.
Objetivos: evaluar el efecto antimicrobiano de películas comestibles de quitosano sobre la microflora nativa (bacterias mesófilas
totales, psicrófilas, hongos y levaduras, lácticas y coliformes) de
brócoli mínimamente procesado y almacenado a 5 °C durante 20
días. Además, evaluar el efecto del quitosano sobre la sobrevida
y crecimiento de E. coli O157:H7 inoculado en brócoli. Materiales y Métodos: La aplicación del film se realizó sumergiendo las
flores de brócoli en la solución de quitosano durante 180 s a 20
°C, luego fueron secadas en una cámara con condiciones controladas (aire a 30 °C y 60% humedad relativa durante 60 min).
Para la inoculación, 100 ul de suspensión bacteriana se aplicaron
en forma de spray (concentración final de E. coli O157:H7 3-4 log
UFC/g) sobre las flores de brócoli. La inoculación se llevó a cabo en
dos momentos, inmediatamente después de aplicar el film y 24 h
después de aplicado. El brócoli tratado se colocó en bolsas (3 a 4
flores por bolsa) poliméricas de 25 um de espesor (PD960,
CRYOVAC) que fueron luego selladas y almacenadas en una cámara refrigerada. Se tomaron muestras a los 0, 4, 7, 10, 14 y 20 días,
realizando las determinaciones de las diferentes poblaciones
microbianas y del patógeno. Resultados y Conclusiones: Los resultados indican que el uso de coberturas antimicro-bianas de quitosano
es una buena alternativa para controlar las diferentes poblaciones
microbianas presentes en flores de brócoli mínimamente procesado, mostrando reducciones significativas (2,0-2,5 log) en los recuentos de mesófilas totales y psicrófilas durante todo el almacenamiento. Los hongos y levaduras fueron la microflora dominante al final
del almacenamiento. Además el quitosano mostró un efecto
bactericida sobre E. coli endógeno y una significativa reducción sobre los recuentos de E. coli totales (endógeno y exógeno). En base
al concepto de tecnologías de obstáculos, el uso de quitosano podría contribuir a mejorar la seguridad de brócoli mínimamente procesado prolongando a su vez su vida útil.
P229 - 27640 PREVALENCE OF O26, O103, O111, O145 AND
O157 SHIGA TOXIN-PRODUCING Escherichia coli SEROGROUPS IN REFRIGERATED BEEF AND CHICKEN MEATS
SOLD IN SAO PAULO, BRAZIL. ALVARES, PRISCILA PEDULLO;
FRANCO, BERNADETTE DGM; DESTRO, MARIA TERESA;
LANDGRAF, MARIZA
Universidad de San Pablo, Brasil
Introduction: Shiga toxin-producing E. coli (STEC) are foodborne
pathogens that can cause since mild or severe and bloody diarrhea
to serious complications, such as hemorrhagic colitis, hemolyticuremic syndrome and thrombotic thrombocytopenic purpura. These
microorganisms have been associated with numerous outbreaks
and several sporadic cases of worldwide infections due to consumption of contaminated food. E. coli O157 is considered the main
serogroup involved in disease outbreaks of STEC, however, many
cases have been occurred worldwide due to strains of non-O157
STEC, such as O26, O103, O111 and O145. Objectives: The aims
of the present research were to determine the prevalence of O26,
O103, O111, O145 and O157 STEC serogroups in refrigerated beef
and chicken meats sold at retail in Sao Paulo, Brazil; identify the
genes that code for the virulence factors stx1, stx2, eaeA and ehxA
and detect E. coli O157: H7 strains using uidA, rfbO157 and flicH7
primers. Material and Methods: Samples were collected from 100
beef and 100 chicken meats sold in Sao Paulo butcheries and supermarkets. The detection of E. coli O157 samples were conduced
according to the ISO methodology (16654) and to detection nonO157 E. coli was used Surveillance Group for Diseases and Infections of Animals methodology. Suspected isolates were submitted
to PCR for virulence factors identification and for search O157:H7
serotype. Results: O157 serogroup was identified in twelve beef and
19 chicken samples, however, none of them produced genes encoding virulence factors of this bacteria group. Therefore, O26,
O103, O111, O145 and O157 STEC serogroups were not detected
in beef and chicken meat samples. Conclusions: Considering that
O26, O103, O111, O145 and O157 STEC serogroups were not isolated, eating beef and chicken meat sold in retail establishments of
Sao Paulo cannot be considered a risk for population, and the
search of rfbO157 gene can be considered a good marker for the
identification of serogroup O157. Although STEC detection has not
occurred, the presence of O157 serogroup can serve as an alert
for the presence of these microorganisms, since this serogroup is
the most involved in cases of STEC foodborne outbreaks. Financing: FAPESP; Capes; CNPq.
P230 - 27690 EFECTO DE LA INMERSIÓN EN SOLUCIÓN DE
LACTATO DE SODIO SOBRE LA FLORA NATIVA DE FILETES
DE MERLUZA. SCHELEGUEDA, LAURA I (1,2); GLIEMMO, MARIA F(1,2); CAMPOS, CARMEN A(1,2)
111
(1) Departamento de Industrias, Facultad de Ciencias Exactas y
Naturales, Universidad de Buenos Aires (2) CONICET
La conservación de los productos de la pesca es problemática debido al rápido deterioro que se produce tras su muerte como
consecuencia de una serie de mecanismos de degradación
bioquímica y microbiológica. Para retrasar los mecanismos
involucrados en el deterioro de la calidad, se refrigera inmediatamente después de la captura y luego se aplica algún método de
preservación, en este marco, el uso de antimicrobianos en combinación con otros factores ha demostrado ser una opción
promisoria para extender la vida útil. En base a lo comentado, el
objetivo del trabajo fue evaluar el efecto del tiempo de inmersión
y de la concentración de soluciones de lactato de sodio sobre el
desarrollo de la flora nativa presente en filetes de merluza. Para
ello se realizó un diseño factorial, en dos bloques, siendo la concentración de lactato y el tiempo de inmersión las variables estudiadas. Los niveles de las mismas fueron: lactato de sodio (0,
2%m/m) y tiempo de inmersión (2, 10 minutos). Se incluyó un
punto central (lactato de sodio 1%m/m y tiempo de inmersión 6
minutos). Los filetes se cortaron en trozos de 4,5 cm de lado, se
sumergieron en las distintas soluciones, se dejaron escurrir 5
minutos bajo flujo laminar, se colocaron en bolsas estériles de
polietileno (Nasco Whirl-Pak, USA) y se almacenaron en una cámara de temperatura constante a 3 °C durante 7 días. Paralelamente, se almacenaron muestras control sin tratamiento de inmersión. Se realizó el recuento de bacterias psicrófilas en agar PCA
incubado a 4 °C durante 7 días. La flora proteolítica se enumeró
en agar Caseína al cabo de 48 h de incubación a 30 °C. Los
recuentos se realizaron al inicio y al final del almacenamiento. La
inmersión de los filetes de merluza en solución de lactato de sodio
2%m/m redujo significativamente (P < 0,05) tanto el recuento de
bacterias psicrófilas como el de proteolíticas. El recuento final de
los microorganismos no fue afectado significativamente por el tiempo de inmersión. Tampoco se observó una interacción significativa
entre las dos variables. Al cabo de 7 días, el recuento de las bacterias psicrófilas y proteolíticas de las muestras que fueron sumergidas en lactato de sodio, aumentó, en promedio, 3 ciclos
logarítmicos, mientras que el aumento fue de 4 ciclos en las muestras que no fueron tratadas con el conservante. En las muestras
control sin tratamiento de inmersión, los recuentos de bacterias
psicrófilas y proteolíticas aumentaron 4 y 5 ciclos, respectivamente. Los resultados obtenidos muestran que la inmersión en soluciones de lactato al 2%m/m durante 2 minutos permite disminuir el
desarrollo de la flora nativa presente en filetes de merluza y que el
uso combinado de refrigeración y de agentes antimicrobianos permitiría extender la vida útil de productos de la pesca.
P231 - 27698 EFECTO DEL LACTATO DE SODIO Y DEL
SORBATO DE POTASIO SOBRE LA INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS DETERIORATIVOS Y
PATÓGENOS PRESENTES EN PRODUCTOS DE LA PESCA.
SCHELEGUEDA, LAURA I(1,2); GLIEMMO, MARIA F(1,2); CAMPOS, CARMEN A (1,2)
(1) Departamento de Industrias, Facultad de Ciencias Exactas y
Naturales, Universidad de Buenos Aires (2) CONICET
El uso de antimicrobianos junto con otros factores de preservación es empleado para controlar el deterioro de productos de
la pesca. El conocimiento del efecto de distintos antimicrobianos
sobre la capacidad de inhibición de la flora permite optimizar su
aplicación. El objetivo del presente trabajo fue determinar el efecto
del lactato de sodio (LS) y del sorbato de potasio (SK) sobre la
inhibición del crecimiento de microorganismos representativos del
deterioro de productos de la pesca. Se eligió Listeria innocua
como alternativa al patógeno Listeria monocytogenes, cuyo desarrollo se verifica a temperaturas de refrigeración, Pseudomonas
fluorescens como representante de la microflora gram-negativa
presente en el almacenamiento en condiciones aerobias y
Lactobacillus plantarum como representante de bacterias ácido
lácticas, gram-positivas, presente en el almacenamiento bajo atmósferas modificadas. Se determinaron las mínimas concentraciones inhibitorias (MCI) y las mínimas concentraciones bacte-
112
ricidas (MCB) de LS y de SK a pH 5.5 sobre el crecimiento
microbiano, y se evaluó la existencia de interacciones entre ambos preservadores mediante la construcción de isobologramas. Se
aplicó la técnica de dilución en microplacas. Se prepararon soluciones de LS y SK de 20000 y 10000 ppm, respectivamente, en
caldo Mueller-Hinton. Se les ajustó el pH a 5.5 con ácido cítrico
al 10%m/m y se esterilizaron. Se hicieron sucesivas diluciones de
las soluciones con caldo Mueller-Hinton ajustado a pH 5.5. Se
adicionó un inóculo de 105 UFC/ml de cada microorganismo a
microplacas conteniendo las distintas diluciones de los antimicrobianos. Las MCI se obtuvieron después de incubar las microplacas
a 30 °C, durante 24 horas. Para determinar las MCB, se tomaron
35 µl de cada pocillo donde no hubo crecimiento y se sembraron
en agar PCA. Se incubaron a 30 °C por 48 horas. Los ensayos
se realizaron por quintuplicado, obteniendo en todos los casos,
iguales resultados. La MCI del LS frente a L. innocua fue de 18000
ppm, mientras que para el SK fue de 4500 ppm. La presencia
conjunta de ambos preservadores mostró un comportamiento
sinérgico sobre la inhibición a altas concentraciones de SK, que
se vuelve aditivo cuando la concentración de SK se acerca a las
1000 ppm. Para P. fluorescens, la MCI del LS fue de 13500 ppm,
y la del SK, 4500 ppm. El uso conjunto de los conservantes mostró un comportamiento sinérgico en todo el rango de concentraciones ensayado. La MCI del SK para L. plantarum fue de 9000
ppm, y la del LS fue mayor a las 18000 ppm. Además, no se observó interacción entre los preservadores. En todos los casos, las
MCB fueron mayores a las máximas concentraciones de LS y de
SK ensayadas, 18000 y 9000 ppm, respectivamente. Los resultados obtenidos muestran que el uso conjunto de LS y SK, al presentar un comportamiento sinérgico, permite inhibir el desarrollo
de L. innocua y P. fluorescens, de esta manera, se emplearían
menores concentraciones de cada uno de los antimicrobianos.
P232 - 27729 COMPARACIÓN DE PERFILES DE RESTRICCIÓN
DE ADN DE CEPAS DE Salmonella anatum AISLADAS DE EMBUTIDOS FRESCOS EN SAN LUIS, ARGENTINA. FAVIER,
GABRIELA; LAZARTE OTERO, VALERIA; LUCERO ESTRADA,
CECILIA; SALINAS, ANGEL; ISAGUIRRE, ANDREA; VELAZQUEZ,
LIDIA
Universidad Nacional de San Luis
La electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) es una técnica muy útil y valiosa para la subtipificación molecular de
microorganismos. Permite comparar patrones de restricción de
ADN y así establecer con mucha precisión las relaciones clonales
entre aislamientos de la misma especie bacteriana. El objetivo de
este trabajo fue comparar los perfiles de restricción de ADN y
determinar la posible relación genética entre cepas de S. anatum
aisladas de embutidos frescos destinados al consumo humano.
Se utilizó PFGE para la subtipificación de cinco cepas de S.
anatum aisladas de 90 chorizos destinados al consumo en la ciudad de San Luis, Argentina. La extracción de ADN cromosomal
se realizó según el protocolo estandarizado de PulseNet (Centers
for Disease Control and Prevention, CDC, EE.UU.), utilizando la
cepa estándar Salmonella braenderup H9812. Las cepas fueron
aisladas en agar Mueller Hinton y resuspendidas en buffer TE (10
mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8), ajustando la concentración a DO
610: 1,00. Un volumen de 200 µl de cada una de las suspensiones fue mezclado con igual volumen de agarosa Seakem Gold
(Cambrex) al 1% (p/v) y colocado en moldes. Una vez formados
los moldes de agarosa se incubaron en buffer de lisis (20 mg/ml
proteinasa K, 50 mM tris-EDTA, y 1% de lauril sarcosina, pH 8) a
37° C por 18 h. Los moldes fueron lavados cuatro veces con agua
ultrapura estéril y buffer TE. Trozos de estos moldes, de aproximadamente 2 mm de espesor, fueron digeridos con 10 U de la
enzima de restricción XbaI (Fermentas) durante 2 h a 37°C y sembrados en gel de agarosa para PFGE al 1 % (BioRad) en buffer
TBE 0,5 X (45 mM Tris - borato, 1 mM EDTA). La electroforesis
se realizó en equipo CHEF DR III (BioRad) a 6 V/cm y 14° C, por
20 h con tiempo de pulso inicial: 2,2 s y tiempo de pulso final:
63,8 s. La tinción del gel fue realizada con Gel Red (Biotium) 3 X
en agua ultrapura por 30 min y se visualizó en transiluminador con
luz ultravioleta (UVP). Las cepas locales de S. anatum mostraron
patrones de restricción idénticos, constituidos por catorce bandas
cada uno. La similitud entre los perfiles de restricción de estas
cepas sugiere una fuente de contaminación común que podría
localizarse en algún punto del proceso de producción: criaderos,
frigoríficos, plantas de procesamiento o sitios de comercialización.
P233 - 27739 EVALUACIÓN DEL EFECTO CITOPÁTICO EN AISLAMIENTOS DE Bacillus megaterium PROVENIENTES DE MIEL.
LOPEZ, ANA C(1); MINNAARD, JESSICA(1); PEREZ, PABLO F(2);
ALIPPI, ADRIANA M(1)
(1) CIDEFI-Universidad Nacional de La Plata, (2) Facultad de
Ciencias Exactas – Universidad Nacional de La Plata
La calidad de la miel esta influenciada por la presencia de
microorganismos que afectan sus características. El efecto combinado derivado de las propiedades naturales antimicrobianas de
la miel más la adopción de prácticas higiénicas de procesamiento resulta generalmente en un producto apto para el consumo
humano directo, con bajos niveles de contaminación microbiana.
Las bacterias del género Bacillus son las especies esporuladas
introducidas en la miel por las abejas con mayor frecuencia. Dentro de este grupo, Bacillus megaterium ha sido citado como productor de amilasas, proteasas, citoquinasas, y compuestos con
actividad bactericida y se encuentra en diversos hábitats tales
como suelo, agua marina, arroz, pescado, miel y alimentos secos. Dado que a través del consumo de miel se podrían ingerir
estas bacterias y/o sus productos metabólicos, se planteó estudiar el efecto citopático sobre enterocitos humanos en cultivo (línea Caco-2) de cepas de B. megaterium aisladas de miel. Para
ello se utilizaron células Caco-2 cultivadas durante 15 días a 37
°C en 5% de CO2 en medio DMEM suplementado con 10 % de
suero fetal bovino en placas de 24 fosas. El desprendimiento se
evaluó, mediante tinción con cristal violeta de las células remanentes luego de la incubación de las monocapas con los
sobrenadantes de cultivo previamente filtrados. Asimismo, se infectaron las monocapas con suspensiones bacterianas en ausencia de sobrenadantes. Los resultados se analizaron utilizando el
test de Student. Se evaluaron los sobrenadantes de 50 cepas de
B. mega-terium de los cuales el 18% desprendió el 100% de la
monocapa de enterocitos y 8% desprendió menos de la mitad de
la monocapa; mientras el resto de las cepas no produjo alteración de la misma. Con las cepas que provocaron el mayor desprendimiento se evaluó la dosis respuesta (dosis de sobrenadante
vs. porcentaje de desprendimiento) observándose una respuesta
asintótica en la mayoría de los casos. Se observó una alta dependencia del efecto biológico con la concentración. La infección
de las monocapas dio como resultado que sólo una cepa desprendió la totalidad de la monocapa para cultivos de 3 hs de desarrollo y ninguna desprendió los enterocitos para cultivos de 16 hs de
desarrollo. También se evaluó el título de hemólisis de glóbulos
rojos de origen animal con los sobrenadantes filtrados incubando
2 hs a 37 °C y 16 hs a 4 °C. El título varió desde 4 hasta 16 luego de la incubación a 37 °C. Todos los títulos aumentaron una
dilución luego de la incubación a 4°C. Los resultados demuestran
que los factores extracelulares de B. megaterium poseen efecto
citopático, así como las bacterias en estado vegetativo (aunque
en menor proporción). Este es el primer trabajo donde se estudió
el efecto citopático sobre enterocitos en cultivo de este microorganismo. Esta trabajo fue subsidiado por la ANPCyT.
P234 - 27771 CAPACIDAD PROTEOLÍTICA DE LEVADURAS Y
BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS PRESENTES EN PRODUCTOS
LÁCTEOS Y EMBUTIDOS DE LA REGIÓN PATAGÓNICA.
RUSSELL WHITE, KAREN; CARRASCO, MARTA; SIMONETTA,
ARTURO
Facultad de Ingeniería Química – UNL
Las características sensoriales que se generan en los quesos
durante el proceso de maduración, tienen estrecha relación con
la actividad bioquímica de la microbiota presente en el interior de
la masa casearia. Estos microorganismos participan en la maduración de los quesos por metabolizar el ácido láctico, fermentar
la lactosa y producir proteasas y lipasas características. Es necesario, por lo tanto, conocer la microbiota participante en la
maduración de los quesos, identificando las bacterias lácticas
provenientes del fermento y las levaduras que pudieran estar presentes en la materia prima, o ser producto de la contaminación
ambiental. El conocimiento de los aspectos bioquímicos de cada
grupo microbiano y de cada cepa en particular permitirá utilizarlas, a ellas y/o a sus sistemas enzimáticos, con los fines tecnológicos más adecuados. El objetivo de este trabajo ha sido conocer la biota típica de levaduras presentes en leches ovinas, quesos y embutidos producidos en la región patagónica, caracterizarlas y estudiar las posibles interacciones con las bacterias
lácticas presentes en fermentos artesanales. Se estudiaron 37
aislados de levaduras, determinando su distribución taxonómica,
y 94 de bacterias ácido lácticas. En cultivos puros y mixtos
(cocultivos), se determinó cualitativamente la actividad proteolítica
en Agar Leche, y la actividad proteolítica exocelular sobre caseína total y sobre las fracciones a y b-caseína, utilizando el método electroforético “Tricina-SDS-PAGE”. Entre los aislados de levaduras se detectó un neto predominio del género Candida. Los
resultados del estudio cualitativo de la actividad proteolítica indicaron que todas las levaduras poseen capacidad para hidrolizar
la caseína de leche, generando halos de proteólisis de 4,3 a 8
cm de diámetro, mientras que sólo un 12,8% de las bacterias
lácticas presentaron esta actividad. La hidrólisis de los patrones
caseínicos evaluada mediante electroforesis mostró un comportamiento heterogéneo. Si bien todas las levaduras fueron capaces de hidrolizar totalmente la caseína patrón, sólo una hidrolizó
de manera total los patrones de a y ß-caseína; el resto dejó bandas que corresponderían a péptidos de menor peso molecular,
resultantes de la degradación sólo parcial de a y ß-caseína luego de 15 horas de contacto con los sobrenadantes libres de células. A diferencia de las levaduras, todas las bacterias lácticas
tuvieron un comportamiento similar entre sí. La mayoría hidrolizó
la caseína total, escasamente la a-caseína y medianamente la ßcaseína. Cuando se trabajó con cultivos mixtos, la actividad
proteolítica resultó inferior comparada con la de las levaduras,
pero igual o levemente superior a la de las bacterias lácticas ensayadas. Estos resultados indican que es indispensable conocer
la biota levaduriforme participante en la maduración de cada variedad de queso, para poder predecir su participación en las características estructurales y sensoriales de las mismas.
P235 - 27783 LA MICROBIOLOGIA COMO HERRAMIENTA DE
FORMACIÓN AL PERSONAL DE UN FRIGORÍFICO. MONITOREO DE SU APLICABILIDAD. JAQUET, BELEN(1;2); MEZA
THOMAS, RICARDO(1); MOREIRA, MARCELO(1); VEDOYA,
CELINA(2); MEDVEDEFF, MARTHA(2); THEA, ANA(2)
(1) Laboratorio de Control de Calidad de COFRA, Misiones, (2)
Laboratorio de Micología, Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales – Universidad de MIsiones
Los centros para el control de enfermedades estiman que alrededor de 5.000 personas mueren cada año por enfermedades
transmitidas por alimentos. Un hecho común en todos estos casos es el deficiente lavado de manos. En el cumplimiento de las
buenas prácticas de manufactura (BPM) y en la formación del
personal manipulador, es básico hacerlos partícipes activos del
monitoreo y aplicación de los conocimientos adquiridos. El trabajo se realizó con el fin de concientizar y evaluar a los operarios
de la Cooperativa Frigorífica L. N. Alem (COFRA), sobre la importancia del correcto lavado de manos como indicador de higiene, a través de la aplicación de técnicas microbiológicas y monitoreo constante. Para ello, se dictó un curso obligatorio a todo el
personal de planta sobre BPM y manipulación de alimentos. Se
resaltó la importancia del lavado de manos y técnica correcta de
hacerlo. Se efectuaron muestreos de manos al personal de
desposte y empaque (sectores claves para la contaminación),
mediante hisopados de las mismas antes y después de la capacitación en BPM, como también antes y después del adiestramiento en la técnica de lavado de manos. Se explicó a los operarios
la técnica microbiológica aplicada, para que ellos mismos puedan
113
evaluar los resultados obtenidos. Posteriormente se realizaron
muestreos en forma sorpresiva para evaluar el cumplimiento de
las normas de higiene. La técnica utilizada consistió en frotar
hisopos estériles en las palmas de las manos de los operarios,
los que posteriormente se transfirieron a tubos con buffer Letheen.
De dichos tubos se tomaron alícuotas de 1 ml y se sembraron en
placas Petrifilm 3 M para recuento de coliformes totales. Se incubaron por 24 hs a 37 °C. Se realizó el recuento, considerando el
área promedio de las manos de 220 cm² (calculado para los operarios de la planta). Los resultados fueron evaluados en el Laboratorio de Control de Calidad de COFRA, Misiones (1) y el laboratorio de Micología, Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y
Naturales de la Universidad Nacional de Misiones (2). Para evaluar la efectividad de la capacitación y de la aplicación de la técnica de lavado se aplicó un test de comparación de medias pareadas de Student. Se observaron diferencias estadísticamente
significativas en los resultados del recuento de coliformes totales
antes y después de la capacitación en BPM, ésto demuestra la
efectividad de la concientización del personal para una buena
calidad alimentaria (p< 0,05). Al evaluar las diferencias en los
recuentos de coliformes totales en manos lavadas de los operarios antes y después del adiestramiento en la técnica correcta para
esta práctica se encontraron diferencias estadísticamente significativas (p< 0,05) por lo que debemos insistir en la constante capacitación del personal para garantizar la calidad de los productos elaborados. Podemos concluir que la capacitación fue efectiva, ya que tanto la aplicación de las BPM y de la técnica de lavado de manos se mantienen en el tiempo. El involucrar activamente
al personal en este estudio logró que monitoreos sucesivos arrojen valores similares en cuanto al decrecimiento de la carga
microbiana. Además se constituye en un parámetro indicador de
la concientización del personal y la valoración de las BPM.
P236 - 27833 USO DE UN CONTROL DE AMPLIFICACIÓN INTERNO EN LA DETECCIÓN DE Escherichia coli PRODUCTOR
DE TOXINA SHIGA POR PCR MÚLTIPLE, EN HECES DE ORIGEN PEDIÁTRICO. SALINAS, AG(1); ZARATE, JM (2); CHIALVA,
C(2); JURI AYUB, M(2); LUCERO ESTRADA, C(1); CHINEN, I (3);
ESCUDERO, ME(1)
(1) Microbiología General, (2) Area Biología Molecular, FQBF,
Universidad Nacional de San Luis, (3) Servicio Fisiopatogenia,
Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, INEI-ANLIS, “Dr.
Carlos G. Malbrán”.
Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) causa colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico (SUH) en la población infantil de nuestro país. El empleo de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) para la detección de este microorganismo directamente en heces de los pacientes presenta la ventaja, sobre las técnicas de cultivo, de acortar los tiempos de diagnóstico permitiendo adoptar medidas terapéuticas y epidemiológicas más efectivas. Por la naturaleza de la muestra, se corre el
riesgo de obtener falsos resultados negativos debido a inhibición
de la PCR. El uso de un control de amplificación interno (CAI)
resulta útil para diferenciar entre resultados negativos verdaderos y falsos. CAI es una secuencia de ácido nucleico adicionada
a la mezcla de reacción para PCR con el objeto de ser co-amplificada en el mismo tubo por el par de cebadores dirigidos a la
secuencia de ADN blanco y que se distingue de ésta por una diferencia en el tamaño molecular detectable por electroforesis. En
este trabajo se propuso la detección de STEC directamente en
heces pediátricas mediante el protocolo de PCR múltiple (PCRm)
para los genes stx1, stx2 y rfbO157, diseñado en el Servicio
Fisiopatogenia de INEI-ANLIS (Buenos Aires, Argentina) utilizando un CAI de 280 pb, correspondiente a una deleción interna de
la secuencia stx2 original de 349 pb, y flanqueada por el mismo
par de cebadores. Se contaminó 1 g de heces de niño sano con
10E9 y 10E7 ufc/ml de la cepa local (CL) E. coli O157:H7 stx2+
aislada de un paciente pediátrico con SUH, en 9 ml de caldo EC.
Se realizó extracción de ADN por el método de boiling y se preparó la mezcla de reacción incorporando CAI en concentración
0,143 pg/µl. El mismo protocolo fue aplicado en heces no conta-
114
minadas, y en diluciones de CL y de la cepa de referencia E. coli
O157:H7 EDL 933 stx1+/stx2+. El límite de detección de E. coli
O157:H7 fue de 1,3 x 10E4 ufc/25 µl de reacción de PCR en heces y de 13 ufc/25 µl de reacción de PCR en las cepas puras.
Cuando la secuencia blanco (SB) se amplificó pero CAI no, se
asumió que SB estaba presente en mayor proporción que el CAI
y el resultado fue válido. Cuando SB no se amplificó pero el CAI
sí, se asumió que SB no estaba presente o lo estaba en menor
proporción que el CAI. Para evitar falsos negativos, se recomienda usar el CAI en concentración mínima para que en la competencia gane SB, y suficiente para ser detectado cuando SB no está
presente. Cuando el CAI y SB no son amplificados, se asume que
la muestra contiene inhibidores de la reacción, existe una incorrecta preparación de la mezcla de reactivos o mal funcionamiento
del equipamiento, y por lo tanto el ensayo no es válido. La detección de E. coli STEC se puede realizar por PCRm, directamente
en heces de pacientes pediátricos, en un tiempo no mayor a 4 h,
utilizando CAI en reacción competitiva con el ADN blanco para
evitar el riesgo de informar falsos resultados negativos.
P237 - 27862 EVALUACIÓN DE UN BACTERIÓFAGO PARA LA
PREVENCIÓN DE Salmonella gallinarum EN AVES DE POSTURA. PROSDOCIMO, F; ANSELMO, R; OLIVETTO, N; GOMEZ, I;
VIORA, S; DE FRANCESCHI, M; BARRIOS, H
Universidad Nacional de Lujan
El control y prevención de especies de Salmonella tíficas y
paratificas es de gran importancia en la producción avícola. Los
medicamentos profilácticos y terapéuticos más usados son los
antibióticos con la precaución de no comercializar la producción
cuando son aplicados. Existen evidencias que estos incrementaron
la resistencia de cepas bacterianas, siendo actualmente restringido su uso por las consecuencias en salud pública. Como alternativa natural y preservando la seguridad de los alimentos se plantea el uso de bacteriófagos en avicultura, por ser específicos para
una bacteria, abundan en el ambiente y son inofensivos para
humanos y animales. Este trabajo consistió en evaluar el efecto
de un bacteriófago en aves de postura infectadas experimentalmente con Salmonella gallinarum (SG). De la vesícula biliar de
una gallina ponedora con tifosis se aisló y se identificó bioquímica
y antigénicamente SG. La materia fecal de esa ave se colocó en
caldo nutritivo y se inoculó con el cultivo de SG, incubando a 35°C
por una noche. Una alícuota del enriquecimiento se descontaminó
con cloroformo, se agitó y conservó a 4 °C. La presencia de fagos
se comprobó por el método de la doble capa de agar y se conservó en caldo nutritivo más cloroformo. Para evaluar la eficacia
del fago se utilizaron en cada tratamiento: 1 gallina de color de
una granja comercial; 2 gallos y 2 gallinas blancas de 24 semanas criadas experimentalmente sin vacunar. Todas las aves se
criaron en jaulas experimentales y estaban produciendo huevos.
El tratamiento A testigo no recibió desafío; el tratamiento B fue
inoculado con 0,1ml x 109 unidades formadoras de placas (ufp)
del fago y luego de 2 horas se infectó con 0,1ml de 4,4x103 unidades formadoras de colonias (ufc) de SGINTA 90 y el tratamiento
C fue infectado con 0,1 ml de 4,4 103 ufc de SG. Diariamente se
registró la postura y a los 10 días de la inoculación se necropsiaron y se tomaron muestras de distintos órganos y materia fecal para aislar SG con la marcha bacteriológica convencional. En
el tratamiento C la infección alcanzó el 100% y en el tratamiento
B solamente el 80%. Los testigos resultaron negativos. El día
posterior a la infección las gallinas del tratamiento C dejaron de
poner huevos, en cambio las demás continuaron con su
ovoposición. Al realizar las necropsias las aves del tratamiento B
no presentaron sintomatología y no se aisló SG en sus órganos
reproductivos, en cambio las del tratamiento C no evidenciaron
formación de huevos, sólo una presentó un huevo con deficiencias de formación de cáscara. En el intestino, corazón y bazo se
encontró un menor porcentaje de aislamientos en el tratamiento
B lo contrario ocurrió en hígado. En ambos tratamientos se aisló
SG en materia fecal.
Tratamiento
A
B
C
Aves
Materia Sist.
infectadas
fecal reproductor
%
%
%
0
80
100
0
80
60
Intestino Higado
0
0
60
Bazo
Corazón
%
%
%
%
0
40
60
0
60
20
0
20
60
0
40
60
Estos datos podrían indicar que el fago disminuye el desarrollo
de la infección bacteriana y permite la ovoposición normal
P238 - 27865 YERBA MATE EN SAQUITOS: CALIDAD
MICROBIOLÓGICA. CASTRILLO, MARIA LORENA; TAYAGUI,
AYELEN; JERKE, GLADIS; HORIANSKI, MARTA AURELIA;
MARTINEZ, MIRIAN LILIANA; SERPP, CARINA INES
Laboratorio de Microbiología, Módulo de Bioquímica y Farmacia,
Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales, Universidad
Nacional de Misiones, Posadas, Misiones, Argentina
La yerba mate en saquitos es la yerba mate molida y envasada en bolsitas o saquitos. Es el producto utilizado para preparar
el mate cocido, la infusión que se consume en taza. La elaboración del mate cocido en saquitos es prácticamente igual a la de
la yerba mate común, con la diferencia de que en la molienda se
eliminan el polvo y los palitos, clasificando y procesando solamente las hojas de yerba mate. Los alimentos deshidratados o secados como yerba mate, no suelen ser estériles; sin embargo, debido a su baja actividad acuosa pueden permanecer estables
microbiológicamente durante mucho tiempo, sólo cuando se humedecen podría comenzar la alteración. Por lo general el rango
de humedad, temperatura e higiene empleados en el procesamiento de vegetales como yerba mate varían ampliamente, generando condiciones favorables para la proliferación de hongos y
bacterias contaminantes; los cuales pueden modificar su calidad
bromatológica, microbiológica y comercial. La calidad microbiológica de los productos alimenticios se determina estableciendo
límites cuantitativos para los parámetros microbianos evaluados.
En Argentina no contamos con normas que establezcan el perfil
microbiológico para yerba mate en saquitos. El objetivo del presente trabajo fue realizar el control de la calidad microbiológica
de muestras de yerba mate en saquitos obtenidas de diferentes
comercios céntricos y periféricos de la ciudad de Posadas, Misiones. Se analizaron un total de 22 muestras de yerba mate en
saquitos. El perfil microbiológico se realizó según la Norma IRAM
20517:2007 el cual incluye: recuento de bacterias aerobias
mesófilas totales (BAMT), recuento de hongos y levaduras (RHL)
recuento de coliformes totales (RCT), recuento de coliformes
fecales (RCF), y detección de Escherichia coli. Los resultados de
los recuentos microbianos obtenidos se sometieron a análisis
estadísticos hallándose los valores que se muestran en la tabla:
BAMT
(UFC/g)
Promedio
11000
Mediana
640
Valor máximo 140000
Valor mínimo
23
RHL
(UFC/g)
RCT
(NMP/g)
RCF
(NMP/g)
Detección de E. coli
2400
1200
21000
250
450
15
1100
<3
3.6
3.6
3.6
<3
negativo
negativo
negativo
negativo
Comparando estos resultados con los obtenidos en estudios locales previos de control de calidad microbiológica en yerba mate
elaborada, se observan valores similares en todos los parámetros
evaluados, no evidenciándose diferencias significativas. El rango
de contaminación microbiológica de cada uno de los parámetros
analizados presentó valores del mismo orden de magnitud.
P239 - 27868 CALIDAD HIGIÉNICO-SANITARIA EN LA CADENA DE PRODUCCIÓN DE UNA PLANTA ELABORADORA DE
PASTAS FRESCAS RELLENAS PASTEURIZADAS. GARCIA,
MARIA JOSE; GAMBERO, MARIA LAURA; LOMBARDO, DANIELA;
FRIGERIO, CECILIA; BETTERA, SUSANA
El procedimiento básico de elaboración de pastas alimenticias
incluye la preparación de una mezcla amasada de derivados del
trigo con agua, que luego se procesa para obtener las dimensiones y formas finales del producto. Esta mezcla constituye un
medio adecuado para la multiplicación microbiana. El procedimiento de pasteurización se realiza con el fin de disminuir el número
de microorganismos, eliminar los patógenos y aumentar el periodo de vida útil. Este procedimiento tiene particular importancia
cuando se trata de pastas frescas rellenas. El objetivo de este
trabajo fue analizar la carga microbiana de pastas frescas rellenas pasteurizadas, a lo largo de la cadena de producción, para
determinar posibles fallas en procedimientos que pongan en riesgo la calidad higiénico-sanitaria del producto terminado. Se realizó la búsqueda de microorganismos indicadores de calidad higiénica: recuento de microorganismos aerobios totales (RAT) (ISO
4833:2003), enterobacterias (ISO 7402:1993) y anaerobios sulfito
reductores (APHA). En las muestras correspondientes al producto terminado, se realizó además el recuento de hongos y levaduras (H y L) (ISO 7954:1987) y de Staphylococcus aureus (UNEEN ISO 6888:1999) para verificar el cumplimiento de las especificaciones microbiológicas establecidas por el Código Alimentario
Argentino (CAA). Se tomaron 90 muestras, correspondientes a dos
líneas de producción: ravioles de pollo - verdura y capellettis de
carne, en cinco etapas de producción: antes y después de pasteurizado, preenfriado, salida del enfriador y producto terminado.
Antes de la pasteurización del producto, se observó que los valores de RAT oscilaron entre 2 x 106 y 8 x 107 u.f.c./g . La
pasteurización disminuyó el RAT en todos los casos, pero sólo
en el 33% de las muestras hasta niveles inferiores a 1 x 105 u.f.c/
g. El 44% de las muestras antes de pasteurizar presentaron recuentos de enterobacterias en valores que superaron 1 x 103
u.f.c./g .Luego del tratamiento térmico no se observó desarrollo
en ningún caso. El 33% de las muestras presentó recuentos de
anaerobios sulfito reductores mayores a 103 ufc/g. En la mitad de
las muestras la pasteurización redujo el recuento de este indicador hasta los valores permitidos por el CAA. El 67% de las muestras correspondientes al producto terminado fueron aptas para consumo. El 44% evidenció crecimiento de H y L pero sólo el 5% superó el límite permitido. No se observó desarrollo de S. aureus en
ningún caso. De acuerdo con los resultados obtenidos podemos
concluir que la aplicación del proceso de pasteurización permitió
obtener productos de adecuada calidad microbiológica para el consumo y que sólo con un seguimiento continuo estricto de las condiciones de procesamiento, manipulación y almacenamiento sumado a un control microbiológico periódico de las pastas frescas rellenas es posible garantizar la producción de un alimento inocuo.
P240 - 27878 DETECCIÓN DE Escherichia coli VEROCITOTOXIGÉNICA EN HORTALIZAS DE CONSUMO DIRECTO.
COLELLO, R(1,2); PADOLA, NL(1,2); ETCHEVERRIA, AI(1,2);
PARMA, AE(1,2)
(1)Lab de Inmunoquímica y Biotecnología. FCV-UNCPBA. (2) CICPBA
Escherichia coli verocitotoxigénica (VTEC) es considerado un
patógeno emergente transmitido por alimentos, asociado a casos
esporádicos o brotes de diarrea, colitis hemorrágica o síndrome
urémico hemolítico. La principal característica de VTEC es su
capacidad de producir y liberar verocitotoxinas (VT1 y VT2). Presenta también otros factores de virulencia como la intimina, codificada en el gen eae que media la adherencia de la bacteria al
enterocito y un megaplásmido que contiene los genes para la síntesis de enterohemolisina (codificada en el gen ehxA), fimbrias de
adhesión y adhesina autoaglutinante codificada por el gen saa.
La mayoría de los casos de infección en el hombre se produce
por ingestión de alimentos y agua contaminados. Los alimentos
comúnmente asociados a brotes son: carne picada, salame, le-
115
che no pasteurizada, brotes de alfalfa, lechuga y sidra. Los brotes recientemente producidos por el consumo de hortalizas contaminadas por microorganismos patógenos, demuestran la vulnerabilidad de estos productos a la contaminación. El consumo de
hortalizas se ha incrementado a raíz de las recomendaciones
médicas que insisten en la necesidad de comer más hortalizas
para prevenir enfermedades y para mejorar la salud personal.
Objetivos: debido a la patogenicidad y morbilidad de VTEC para
el hombre, y especialmente para la población infantil, y conociendo
que las hortalizas pueden estar contaminadas, nos propusimos
investigar la presencia de VTEC en hortalizas de consumo directo y caracterizar por técnicas de biología molecular las cepas
VTEC aisladas. Materiales y Métodos: se trabajó con 18 muestras de lechuga, repollo y remolacha procedentes de quintas de
2 ciudades de la Provincia de Buenos Aires. Se tomaron 10 gr
de cada muestra y se cultivaron en 90 ml de agua de peptona
(37 °C durante 18 hs con agitación). De cada cultivo de enriquecimiento se tomaron 1750µl que se centrifugaron a 2300 rpm, 4
min. Se tomaron 1350µl del sobrenadante y se centrifugaron a
13000 rpm, 3 min. El pellet se resuspendió en 34µl de agua
bidestilada y 250 µl de chellex, se incubó 30 min a 65 °C, se agitó con vórtex 10 seg y se hirvió 10 min para la extracción del ADN.
Esta suspensión se utilizó para la detección de genes de virulencia de VTEC mediante la técnica de PCR-multiplex para la detección simultánea de los genes vt1-vt2. Los productos de amplificación de PCR se analizaron por electroforesis en geles de
agarosa. Resultados: una muestra de repollo y una de remolacha
fueron positivas para vt1-vt2. La materia fecal de animales se usa
como fertilizante del suelo mejorando la calidad a nivel nutricional
de las hortalizas. La aplicación de materia fecal sin tratar puede
presentar un riesgo de contaminación de hortalizas de consumo
directo. Existe documentación limitada sobre la contaminación de
hortalizas debido a la aplicación directa de materia fecal o abono
derivado a los campos sembrados con éstas. Estos resultados
representan un alerta en las prácticas de fertilización del suelo de
las huertas e higiene y/o cocción de hortalizas ya que pueden ser
potenciales vehículos de patógenos que implican un riesgo para
la salud pública.
P241 - 27883 EVOLUCIÓN DEL RECUENTO DE Clostridium
GASÓGENOS, DESDE LA LECHE HASTA EL QUESO MADURADO GIECO, A; GERVASONI, L; DELLA GIUSTINA, Z;
ETCHEVERS, F; LOPEZ, G
FCA – Universidad Nacional de Entre Ríos
Existen productores lecheros entrerrianos que producen quesos de pasta dura y uno de los problemas comunes es la hinchazón tardía causada por ciertos microorganismos que actúan cuando las condiciones del medio son apropiadas. Se atribuye como
principal responsable a las esporas de Clostridium, dentro de ellos
C. butyiricum y C. tyrobutyricum; que desarrollan produciendo
deformación de las hormas y pérdidas de la producción. El mayor riesgo de este tipo de bacterias está dado por su aptitud para
esporular que los hace resistentes a la pasteurización, para luego germinar en los quesos maduros, donde su actividad
degradativa sobre los lactatos produce ácido butírico, alcohol,
dióxido de carbono e hidrógeno; con la consiguiente formación de
grandes ojos de forma irregular, cavernas o esfolias y aroma o
sabor desagradables. El objetivo del trabajo fue determinar la
evolución del recuento de Clostridium butyricum y C. tyrobutyricum
desde la leche hasta los quesos madurados. Iniciamos seleccionando el establecimiento proveedor de leche, bajo determinadas
pautas. Efectuada la selección se realizaron las elaboraciones con
leche entera y descremada (total 24) y su correspondiente maduración. Se fijó un plan de muestreo en 8 puntos: leche cruda
(LC), leche pasteurizada (LP), cuajada cortada (S+C), masa de
queso y quesos al 1° día, al 1° mes, a los 3 meses y a los 6 meses de maduración. A cada muestra se le realizaron: recuento de
Clostridium totales, C. butyricum y C. tyrobutyricum por método
número más probable (NMP) en Weirzirl modificado por Annibaldi;
y sobre los quesos madurados se realizó evaluación organoléptica. Los resultados se procesaron estadísticamente, previa con-
116
versión logarítmica de los datos, usando InfoStat V.2008. Grupo
InfoStat, FCA, UNC, Argentina. La evaluación sensorial de los
quesos, permitió observar defectos más marcados, con gustos y
aromas no característicos en las elaboraciones de leche
descremada. Los resultados obtenidos nos permiten inferir que en
ambas elaboraciones, el recuento de esporulados butíricos y C.
tyrobutirícum presentan similar evolución; en tanto que realizada
la comparación estadística de las medias de cada tipo de bacterias y en cada uno de los puntos de muestreo, se comprobó que
en ningún caso hubo diferencias significativas, de sus medias a
un nivel de significancia del 95%. Además la presencia de defectos organolépticos marcados presenta correspondencia directa
con los casos de mayor recuento de C. tyrobutyricum dado en
quesos descremados. Disminuir el recuento inicial es clave para
bajar el recuento final y el potencial riesgo de deterioro de la calidad del queso.
P242 - 27935 DETECCIÓN DE Escherichia coli VEROCITOTOXIGÉNICA (VTEC) EN TERNEROS RECIÉN NACIDOS EN DOS
TEMPORADAS DE PARICIÓN. FERNANDEZ, D(1,3); PADOLA,
N L(1,2); PARMA, A E(1,2)
(1) Laboratorio de Inmunoquímica y Biotecnología, (2) CIC, (3)
CONICET, Dpto. de Sanidad Animal y Medicina Preventiva, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del Centro,
Tandil.
Introducción: VTEC causa en el hombre colitis hemorrágica y
síndrome urémico hemolítico mediante la producción de verocitotoxinas (VT1 y VT2), y factores de virulencia adicionales como
intimina (codificada en el gen eae), enterohemolisina (EhxA), y una
adhesina (Saa) en cepas eae-. El bovino es el principal reservorio
de la bacteria siendo eliminada con sus heces y pudiendo transmitirla al hombre a través de la ingestión de alimentos o agua
contaminada con heces de animales o por medio del contacto
directo con estos animales o con su medio ambiente. Los terneros pueden incorporar VTEC del canal del parto y de las heces
de su madre, mientras que las colonizaciones posteriores son
debidas a la ingestión de los alimentos contaminados con esta
bacteria. Objetivo: detectar VTEC en hisopados rectales de terneros dentro de las 12 horas de su nacimiento y caracterizar
genotípicamente las cepas aisladas de los mismos. Materiales y
métodos: se tomaron 378 muestras de terneros de tambo de
menos de 12 h de vida en dos temporadas de parición. En la
parición de verano-otoño se obtuvieron 186 muestras y en la
parición de invierno-primavera se obtuvieron 192 muestras. Las
muestras de hisopados rectales se sembraron en agar MacConkey
y posteriormente una alícuota de la zona de crecimiento confluente
se cultivó en caldo Luria Bertani. Una alícuota de este cultivo se
utilizó para extracción de ADN por lisis celular en caliente. Se
utilizó PCR multiplex para identificar los genes vt1 y vt2 y para la
caracterización genotípica de los aislamientos (vt1, vt2, eae, ehxA,
saa). Resultados: noventa y cuatro (25%) terneros recién nacidos
resultaron positivos a VTEC, observándose una mayor prevalencia en terneros nacidos en la parición de verano/otoño (33%) comparado con los terneros nacidos en invierno/primavera (17%). Se
obtuvieron 26 cepas y en 18/26 (75%) de los aislamientos se
encontró el gen vt2, 6/26 (25%) presentaban el gen vt1 y ninguna de las cepas portaban vt1 + vt2. Los genes ehxA, saa y eae
fueron detectados en 21/26 (81%), 3/26 (11%) y 17/26 (65%) de
los aislamientos, respectivamente. Ninguno de los aislamientos
positivos a saa portaban el gen eae, y el 49% de las cepas positivas a ehxA presentaban el gen saa. Quince de los 26 aislamientos (58%) mostraron el perfil de virulencia vt2, eae, ehxA. Conclusión: la alta prevalencia de VTEC detectada en terneros recién
nacidos indica que están expuestos a esta bacteria desde el nacimiento permitiendo de esta manera la permanencia de la bacteria en el rodeo. El aislamiento en terneros de cepas portadoras
de genes de virulencia relacionados con enfermedad en el hombre podría indicar un rol importante en la transmisión vertical de
VTEC, principalmente en pariciones de verano/otoño.
P243 - 27940 UTILIZACIÓN DE LECHE FERMENTADA CON
BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS PROBIÓTICAS PARA LA
ESTIMULACIÓN DEL CONSUMO DE TERNEROS LACTANTES.
SOTO, LORENA; FRIZZO, LAUREANO; ZBRUN, MARIA;
BONANSEA, EMANUEL; ALTINA, MELISA; SEQUEIRA, GABRIEL;
ROSMINI, MARCELO
Departamento de Salud Pública. Facultad de Ciencias Veterinarias, UNL
El desarrollo del rumen de los terneros abarca una serie de
procesos que deben comenzar en la primera etapa de vida del
ternero si se pretende realizar un destete precoz con alimento
sólido a una edad temprana. Los cambios iniciales dependen
básicamente del consumo de alimento seco junto con la fermentación microbiana de la materia orgánica en ácidos grasos volátiles. El desarrollo de los preestómagos y de las papilas absortivas
responde al consumo de granos y fibra, por lo que se debe estimular el consumo de alimento seco a una edad temprana. Por lo
tanto, cuanto antes llegue el animal a consumir entre 0,7 y 0,9
kg de alimento seco, antes será realizado el destete, con los consecuentes beneficios económicos. Por lo dicho anteriormente,
podríamos esperar que la alimentación con leche fermentada
estimule el consumo de los animales y por lo tanto acelere el
desarrollo ruminal. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la alimentación con leches fermentadas con bacterias ácido lácticas (BAL) probióticas sobre la estimulación del consumo
de terneras. Se utilizaron 30 terneras Holstein con una edad promedio de 20 d, separadas en 3 grupos de 10 animales: grupo
inóculo A (A), grupo inóculo B (B), grupo control (C). Las terneras permanecieron en experimentación durante 21 días. Fueron
alimentados con la amamantadora automática de terneros
DeLaval CF150, con un máximo de 6 litros diarios de leche y alimento concentrado ad libitum. Se determinó el consumo de leche y balanceado para cada animal diariamente. El inóculo
probiótico A estaba compuesto por: Lactobacillus casei
DSPV318T, Lactobacillus salivarius DSPV315T y Pediococcus
acidilactici DSPV006T. El inóculo probiótico B estaba compuesto
por la cepa Lactobacillus plantarum<i/> DSPV354T. Se adicionaron 30 ml de inóculo/l de leche. La dosis diaria para cada ternero
fue de aproximadamente 10 log UFC. Se tomó una muestra de
leche semanalmente para determinar el pH y la población de
Lactobacillus totales y cepas del inóculo. El análisis estadístico
fue realizado mediante un ANOVA y test de Duncan. La carga de
Lactobacillus totales fue menor (P<0,05) en la leche del grupo C
que en la leche de los grupos suplementados con los probióticos.
Esta alta carga de BAL en la leche de los grupo A y B, ocasionó
una producción de ácidos suficiente para llevar la leche a un pH
significativamente menor (P<0,05) al de la leche control. Por otro
lado, se pudo confirmar, en las leches inoculadas, que un gran
porcentaje de los Lactobacillus presentes eran las cepas integrantes de los inóculos administrados. El consumo promedio, tanto de
leche como de balanceado fue significativamente mayor (P<0,05)
en los 2 grupos inoculados con las BAL. Esta estimulación del
consumo puede ser atribuida a la acidez ocasionada por la fermentación de la leche. La suplementación de la leche para terneros con ambos inóculos probióticos incrementó el consumo precoz de balanceado, lo cual facilitaría un rápido desarrollo ruminal.
Todo ello permitiría un destete anticipado de los animales y mejoraría los índices de producción de la guachera.
P244 - 27961 DOS ADITIVOS ALIMENTARIOS INDUCEN MULTIPLE RESISTENCIA A ANTIMICROBIANOS EN AISLAMIENTOS DE
Escherichia coli DE ORIGEN CLÍNICO Y ALIMENTARIO. AQUILI,
V; CASABONNE, C; PEREZ, J; ABECASIS, C; BALAGUE, C
Facultad de Ciencias Bioquímicas, Bacteriología - UNR
El fenotipo de múltiple resistencia a antimicrobianos (Mar) se
caracteriza por una disminución en la susceptibilidad a múltiples
antimicrobianos debido a la reducción de la expresión de porinas
(OmpF) y al incremento en la expresión de sistemas de expulsión
(AcrAB-TolC). Se sabe que concentraciones sub-inhibitorias de
diferentes fármacos y compuestos químicos como benzoato de
sodio (conservante alimentario) inducen el fenotipo de Mar por
activación de la expresión del operón marRAB en aislamientos de
Escherichia coli (E. coli). Existe una relación entre aislamientos
de E. coli de determinados materiales, las E. coli uropatógenas y
enteropatógenas provienen generalmente de agua y alimentos
contaminados. El objetivo de este trabajo fue determinar si otros
dos conservantes de uso alimentario, propionato de sodio y
sorbato de potasio, inducen el fenotipo Mar y/o modifican factores de patogenicidad en aislamientos de E. coli, recuperados de
materia fecal, orina y alimentos, sometidos a estas situaciones de
estrés químico. Se seleccionaron 32 aislamientos de E. coli recuperadas de alimentos, materia fecal y orina. Como cepas controles se utilizaron E. coli ATCC 43895 y la cepa sensible AG100.
Se evaluó el efecto de concentraciones 1/2, 1/4, 1/8 de la concentración inhibitoria mínima (CIM) de propionato de sodio y
sorbato de potasio sobre la CIM de cloranfenicol, tetraciclina,
norfloxacina y ácido nalidíxico. El eflujo activo fue evidenciado por
el efecto del carbonilcianuroclorofenilhidrazona (CCCP) inhibidor
de sistemas de expulsión dependiente de protones y por el incremento en la tolerancia al Ciclohexano. Se analizó el perfil de proteínas de membrana externa por SDS-PAGE. La producción de
entero hemolisina fue detectada en agar sangre de carnero con
y sin cloruro de calcio 10mM y la hidrofobicidad con sulfato de
magnesio 2 M, ambas se realizaron en ausencia y presencia de
los dos conservantes. Dichos ensayos se realizaron con las mismas concentraciones de benzoato de sodio, inductor ya caracterizado del operón marRAB. En presencia de los conservantes
alimentarios se evidenció una disminución de 4 a 16 veces en la
CIM a cloranfenicol, tetraciclina, ácido nalidíxico y norfloxacina,
se observó que dicha susceptibilidad aumentaba en presencia del
CCCP. Además se evidenció un incremento en la tolerancia a
solventes orgánicos como ciclohexano en presencia de los dos
inductores. Dichos resultados sugieren la presencia de sistemas
de eflujo dependiente de protones. En el perfil de proteínas de
membrana externa observamos una disminución de la expresión
de la porina OmpF en las cepas inducidas. Los factores de
patogenicidad estudiados no disminuyeron su expresión en presencia de las diferentes concentraciones de dichos aditivos. Los
dos aditivos alimentarios, propionato de sodio y sorbato de
potasio, inducen el fenotipo de múltiple resistencia en los 32 aislamientos de E. coli ensayados en este estudio, al igual que lo
observado con benzoato de sodio, un inductor ya caracterizado.
No se evidenció la pérdida de la expresión fenotípica de los factores de patogenicidad en dichas situaciones de estrés químico.
P245 - 27993 DETECCIÓN DE Escherichia coli ENTEROPATOGÉNICO (EPEC) EN DIFERENTES ETAPAS DEL PROCESO
DE FAENA EN UN ESTABLECIMIENTO AVÍCOLA. ALONSO,
MZ(1,2); PADOLA, NL(1,3); LUCCHESI, PMA(1,2); PARMA, AE(1,3)
(1) Lab. Inmunoquímica y Biotecnología. FCV. UNCPBA. (2)
CONICET. (3) Comisión de Investigaciones Científicas PBA
Introducción EPEC produce diarrea acuosa, dolores abdominales y fiebre moderada en niños y adultos. El principal factor de
virulencia es una proteína llamada intimina, codificada por el gen
eae, que participa en la lesión A/E (“attachment and effacement”)
que se caracteriza por el borrado de las vellosidades y permite
una adherencia íntima entre la bacteria y el enterocito. Dado que
la detección de eae en una muestra no es indicadora exclusivamente de la presencia de EPEC, ya que existe otro patotipo (E.
coli verocitotoxigénico) que también puede portar este gen, es
importante diferenciarlos. Objetivo: el objetivo de este trabajo fue
detectar la presencia EPEC en las distintas etapas del procesamiento de pollos en un establecimiento avícola. Materiales y métodos: se realizaron tres muestreos en abril, septiembre y diciembre de 2009 en diferentes etapas del proceso de faena: animales
vivos, carcasas evisceradas sin lavar y carcasas lavadas. En cada
una de las visitas se tomaron con hisopos 100 muestras de cloacas de pollos antes de la faena, 50 muestras de carcasas lava-
117
das (superficie de la piel (S) y cavidad torácica y abdominal (C)).
Además, en el 2° y 3° muestreo se tomaron en total 41 muestras
de la cavidad torácica y abdominal de carcasas evisceradas sin
lavar (CSL). Cada hisopo se procesó individualmente en 10 ml de
agua de peptona a 37°C en agitación ON. A partir del cultivo se
tomaron 10µl que se hirvieron para la liberación de ADN. Luego
se utilizó una PCR multiplex para detectar los genes vt1, vt2 y eae.
La reacción se visualizó mediante electroforesis en gel de agarosa
con bromuro de etidio. Las muestras eae+ pero vt- se consideraron contaminadas con EPEC. Resultados: se detectó EPEC en
el 1er muestreo en 6 cloacas y 2 carcasas lavadas (una de ellas
en S y C, y la otra solo en S); en el 2° muestreo, en 28 cloacas,
13 carcasas sin lavar y 29 lavadas (6 en S, 15 en C y 8 en S+C)
y en el 3°, en 22 cloacas, 7 carcasas sin lavar y 19 lavadas (6 en
S, 5 en C y 8 en S+C). Conclusiones: en todos los muestreos se
detectó el gen eae en ausencia de genes vt, lo cual indicaría la
presencia de EPEC. Los resultados obtenidos sugieren, por un
lado, que el pollo sería reservorio de las mismas, y por otro, que
la contaminación se mantiene en las distintas etapas del proceso, aún después del lavado, por lo cual es necesario implementar
otras medidas de control para disminuir la carga de EPEC de
modo que llegue a los consumidores un producto seguro.
P246 - 27996 EFECTO DE Oenococcus oeni SOBRE LAS ACTIVIDADES ANTIHIPERTENSIVA Y ANTIOXIDANTE EN UN MEDIO SINTÉTICO ADICIONADO DE LA FRACCIÓN MACROMOLECULAR DE VINOS TINTOS. AREDES FERNANDEZ, PA(1);
STIVALA, MG(1); RODRIGUEZ VAQUERO, MJ(1,2); FARIAS,
ME(1,2)
(1) Centro de Referencia para Lactobacilos, CERELA, (2) Universidad Nacional de Tucumán, UNT
Durante el proceso de vinificación, una vez concluida la fermentación alcohólica (FA) conducida por Saccharomyces
cerevisiae, se produce la autolisis de la levadura con la consecuente liberación de compuestos nitrogenados, entre ellos
péptidos con actividades biológicas beneficiosas (antihipertensiva
y antioxidante). Asimismo, los compuestos fenólicos presentes en
vinos tintos, se relacionan con estas actividades biológicas. La FA
es generalmente seguida por una fermentación maloláctica, llevada a cabo por Oenococcus oeni. Determinamos que la cepa X2L
de O. oeni expresa un sistema proteolítico con actividad sobre las
proteínas del vino y jugo de uva, liberando péptidos que podrían
ejercer actividad biológica y/o potenciar la ya existente. Objetivo:
evaluar la modificación de las actividades antihipertensiva y
antioxidante por O. oeni X2L inoculado en medio vino sintético
(MVS), en el cual se induce la autolisis de S. cerevisiae mc2, y
se suplementa con la fracción macromolecular (FM) de vino tinto
(constituida por compuestos nitrogenados y polifenoles). A partir
de un precultivo en fase exponencial en medio YPD, S. cerevisiae
mc2 se inocula en MVS (10^7 cél/ml), y se induce su autolisis
acelerada. Después de 24 h, se separan las células, se adiciona
FM al medio, se ajusta a pH 4, se esteriliza e inocula con O. oeni
X2L (10^7 cél/mL). A diferentes tiempos de incubación se determina viabilidad microbiana, proteínas (Bradford); péptidos,
aminoácidos y actividad proteolítica (Doi). Se evalúan las actividades antihipertensiva: inhibición de la enzima convertidora de
angiotensina (% IECA); antioxidante: FRAP (reducción del hierro
férrico) y DPPH (captura del radical 2,2-difenil-1-picrilhidracilo) y
los compuestos fenólicos: Folin Ciocalteu. La autolisis de la levadura se evidencia por disminución del 40% en peso seco e incremento en la concentración de proteínas, péptidos y aminoácidos
en 16,0; 3,6 y 6,3 mg N/L respectivamente. Se detecta incremento en la actividad I-ECA (48,4%) y antioxidante por FRAP (600
µmol/L FeSO4). Cuando se adiciona la FM, se observa un incremento de 3,6 veces en la concentración de proteínas y péptidos
y se incorporan 1000 mg GAE/L de polifenoles. En estas condiciones se detecta mayores actividades biológicas (IECA= 76,4%;
FRAP= 6200 µmol/L FeSO4 y DPPH= 35%). Cuando O. oeni se
inocula en MVS adicionado de la FM, el microorganismo mantiene su viabilidad celular durante la incubación y expresa una actividad proteolítica extracelular con liberación de 4,9 mg N/L de
péptidos. Si bien se observa incremento de la actividad I-ECA
118
(83,2%), no se modifica significativamente la actividad antioxidante, indicando que esta última propiedad estaría relacionada
principalmente a péptidos y compuestos fenólicos presentes en la
fracción macromolecular. Este estudio provee información sobre la
importancia de la actividad proteolítica de O. oeni X2L en condiciones similares a las de vinificación, con respecto a la liberación
y/o producción de péptidos con actividad antihipertensiva a partir
de compuestos nitrogenados presentes en el medio natural y destaca las propiedades beneficiosas del producto fermentado.
P247 - 28002 EVALUACIÓN DE CINÉTICA DE CRECIMIENTO Y
ACIDIFICACIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS CON POTENCIAL
APLICACIÓN EN LA INDUSTRIA CÁRNICA. PALAVECINO,
NOELIA(1,2); CAYRE, ELISA(2); VIGNOLO, GRACIELA(1,3);
GARRO, OSCAR(1,2)
(1) CONICET, (2) Universidad Nacional del Chaco Austral UNCAUS, (3) Centro de Referencia para Lactobacilos - CERELA
Los productos cárnicos fermentados elaborados en la provincia del Chaco se obtienen mediante fermentación espontánea lo
que conlleva a un alto grado de heterogeneidad en la calidad del
producto terminado. El proceso se podría controlar mediante la
adición de cultivos starters específicamente seleccionados a partir de la flora autóctona de tales productos a fin de mantener la
tipicidad de los mismos. El primer paso en el diseño de un starter
cárnico consiste en caracterizar las cepas de bacterias ácido
lácticas (BAL) aisladas de estos productos para seleccionar las
que presenten mejores propiedades tecnológicas. La inmediata y
rápida formación de ácido al comienzo del proceso de fermentación, y la producción de suficientes cantidades de ácidos orgánicos que permitan reducir el pH debajo de 5,1 son requerimientos
esenciales para las BAL a ser utilizadas como cultivos iniciadores. Es por ello que el objetivo del presente trabajo fue evaluar la
cinética de crecimiento y acidificación de BAL asiladas de productos cárnicos fermentados elaborados en la provincia del Chaco.
A partir de productos cárnicos fermentados elaborados por los 4
establecimientos habilitados de la provincia, se aislaron 63 BAL
que se caracterizaron por tinción de Gram, catalasa, oxidasa, crecimiento a 15 °C y 45 °C en caldo MRS, y producción de gas a
partir de glucosa. La cinética de crecimiento y acidificación de los
aislados homofermentativos (58), se evaluó en medio SB a 15 °C,
mediante monitoreo de la densidad óptica (DO) a 600 nm y del pH
a distintos intervalos de tiempo durante 48 h. Los datos obtenidos
se utilizaron para ajustar modelos matemáticos y estimar los siguientes parámetros cinéticos: fase de latencia y velocidad asociados tanto al crecimiento bacteriano como a la acidificación, DO600
y pH a las 48 h, y profundidad de la acidificación, definida como la
diferencia entre el valor inicial de pH y el final estimado. Un análisis de componentes principales (ACP) se aplicó a los datos cinéticos
con el objeto de seleccionar aquellos que presenten las mejores
propiedades. Los valores estimados de los parámetros cinéticos
presentaron una gran variabilidad lo cual evidencia la heterogeneidad de la población de BAL asociada a los productos. El ACP presentó una correlación cofenética de 0,925 indicando que la matriz
de datos estandarizados representó adecuadamente los datos originales. El componente principal 1 explicó el 47% de la variabilidad total. El gráfico biplot obtenido permitió identificar un grupo de
9 aislados que presentaron las mejores propiedades cinéticas. El
valor medio de la velocidad de crecimiento en ese grupo particular
fue de 0,14±0,03 generaciones por hora, la de acidificación 0,07±
0,01 unidades de pH por hora, la DO final de 0,41 ±0,15 (log
DO600) y el pH final 4,3 ± 0,2. El estudio realizado permitió seleccionar un grupo de BAL autóctonas, con propiedades cinéticas útiles para el diseño de cultivos iniciadores. Otras propiedades de
interés tecnológico serán evaluadas en posteriores ensayos.
P248 - 28097 EVALUACION DE LA CALIDAD MICROBIOLÓGICA
Y DE LOS PARÁMETROS FISICOQUÍMICOS DEL QUESO FRESCO (ARTESANAL) DISTRIBUIDO EN LA CIUDAD DE TUNJA
(COLOMBIA). PIñEROS, OSCAR; USECHE, YERLY;
RODRIGUEZ, DEYCI; HUERTAS, LUISA; CASTELLANOS, ERIKA;
PEÑA, ALEXANDRA; BENAVIDES, YEIMY; BOTERO, IMELDA
Universidad Boyacá
Introducción. Estudios realizados en Colombia han determinado que el mayor riesgo de adquirir una enfermedad transmitida
por alimentos está asociado a las malas prácticas de manufactura de los alimentos, siendo el queso artesanal un producto de alto
valor nutricional que provee las fuentes necesarias para el desarrollo de organismos indeseados causantes de focos de infección
y vehículo de patógenos principalmente Listeria monocytogenes,
Salmonella sp., Staphylococcus aureus, Escherichia coli, etc, que
afectan la salud de la población. Las deficientes condiciones higiénicas de la cadena productiva, y de comercialización del queso fresco, junto a las prácticas artesanales y culturales de obtención de este producto son motivo para la realización del presente
estudio. Objetivo. Determinar la calidad microbiológica y
parámetros fisicoquímicos del queso fresco (artesanal) elaborado y comercializado en la ciudad de Tunja-Colombia. Materiales
y Métodos. Se analizaron microbiológica y fisicoquímicamente 46
muestras de queso fresco, recolectadas entre julio/2009 y abril/
2010 en las dos principales plazas de mercado de la ciudad de
Tunja (Colombia). Los análisis microbiológicos realizados fueron:
recuento de coliformes totales (método de número más probableNMP), identificación de coliformes fecales (E.coli) mediante el
método NMP en caldo Fluorocult (Merck®, EUA) y agar
Chromocult (Merck®, EUA). Recuento de Staphylococcus aureus
coagulasa positivo; detección presuntiva de Listeria
monocytogenes y Salmonella sp. (25gr/producto), mediante la
prueba rápida Singlepath (Merck®, EUA) y sistema API
(bioMérieux®) y recuento de Clostridium sp. y de bacterias ácido
lácticas. Los análisis fisicoquímicos realizados fueron: % humedad, % cenizas, cloruros (mg/100gr), pH, calcio (mg/100gr) y proteína total. Resultados. Los coliformes totales y fecales fueron
detectados en las 46 muestras analizadas (100%), S. aureus
coagulasa positivo >1x10^3 UFC/gr (40/46, 87%), Listeria
monocytogenes (9/46, 20%), Salmonella sp. (16/46, 35%), bacterias lácticas (>10^4UFC/g) en las 46 muestras (100%). No fue
detectado Clostridium sp. Otros patógenos detectados fueron
Shigella sonnei, Pantoea sp., Enterobacter cloacae y Citrobacter
sp. (4/46, 7%). Los parámetros fisicoquímicos de los quesos fueron: humedad (55,5±4,77), cenizas (3,41±0,6), cloruros (897±263),
pH (5,49±0,34), calcio (760,8±229) y proteína total (15,5±3,15).
Conclusión: en conformidad con la norma técnica colombiana 750
para productos lácteos (quesos), los 46 productos analizados no
cumplen con los parámetros microbiológicos y fisicoquímicos, representando un alto riesgo para la población de toxi-infecciones
alimentarias. Los elevados recuentos se deben a las bajas condiciones higiénicas de manipulación de los alimentos, empacado
inadecuado, largos períodos de almacenamiento sin refrigeración
y otros factores culturales.
VIROLOGÍA
P249 - 27590 EXPRESIÓN DE LOS TRANSCRIPTOS RPMS1 DE
LA REGIÓN BAMHI-A DEL VIRUS EPSTEIN-BARR (EBV) EN
AMÍGDALAS DE PACIENTES TRASPLANTADOS Y NO TRASPLANTADOS. FELLNER, MD(1); DURAND, K(1); BERNALDEZ,
P(2); BALBARREY, Z(2); BOSALEH, A(2); SOLERNOU, V(2);
NUÑEZ, S(1); CAMPOS, J(1); ALONIO, V(1); TEYSSIE, AR(1);
PICCONI, MA(1)
(1) INEI-ANLIS MALBRÁN, (2) Hospital Garrahan
El virus Epstein-Barr (EBV) se asocia a una variedad de
neoplasias, entre ellas Desórdenes linfoproliferativos post-trasplante (PTLDs), que abarcan y pueden progresar desde linfoproliferaciones benignas hasta linfomas. Luego de la primoinfección
el EBV persiste a través de fases de latencia y replicación en
linfocitos B de tejido linfoideo y sangre periférica. En la región
BamHI-A del genoma de EBV se han detectado transcriptos
(BARTs) con splicings heterogéneos de sus hexones y en algunos se han descripto marcos abiertos de lectura con la posibilidad de actuar como ARNm. Entre las especies más abundantes
está el transcripto RPMS1, cuya proteína expresada artificialmente
demostró antagonizar a Notch 1, actividad que podría ser relevante en el rol del virus en cáncer. Hasta el momento se ha detectado la expresión del transcripto RPMS1 en líneas celulares EBV
positivas de origen epitelial y linfoide asociadas a todo tipo de
latencia y replicación, en linfocitos B periféricos (Lat 0) y en patologías neoplásicas asociadas a EBV (latencias 0/1, 2, 3). Todavía no ha sido esclarecida su expresión durante la infección natural, ni su contribución al desarrollo de procesos neoplásicos.
Objetivo. Determinar la expresión del transcripto RPMS1 en amígdalas de pacientes trasplantados y no trasplantados y analizar su
asociación con las fases de latencia y replicación de EBV en distintas situaciones clínicas. Materiales y Métodos. Se estudiaron
muestras de amígdalas de 33 pacientes infectados con EBV, 17
trasplantados (Tx) y 16 no trasplantados (No-Tx). Se aplicaron
ensayos de RT-nPCR para determinar la expresión de RPMS1 y
de genes marcadores de Lat 0: EBERs; Lat 2: LMP1; Lat 3:
EBNA2 y replicación: BcLF1.
Resultados. Se detectó RPMS1 en el 70,6% de Tx y 11,8%
de No-Tx, siendo la expresión significativamente mayor en Tx vs
No-Tx (p< 0,001). De acuerdo al diagnóstico histológico, 16 Tx
presentaron PTLDs y 1 hiperplasia linfoide folicular (HLF). En los
Tx-PTLDs se detectó: en el 12,5% Lat 0 con 50% de expresión
de RPMS1; en el 37,5% Lat 2 con 50% expresión de RPMS1; en
el 12,5% Lat3 con 50% de expresión de RPMS1 y en el 37,5%
replicación con 100% de expresión de RPMS1. El Tx-HLF mostró Lat 0 con expresión de RPMS1. En No-Tx, se diagnosticó HLF
en todos los casos, observándose: en el 50,0% Lat 0 sin expresión de RPMS1; en el 18,8% Lat 2 con 33,3% de expresión de
RPMS1; en el 6,2% Lat 3 sin expresión de RPMS1 y en el 25,0%
replicación con 25% de expresión de RPMS1. No se observaron
diferencias significativas en la expresión de RPMS1 entre las distintas fases de latencia y replicación (p>0,05) en Tx ni en No-Tx.
La expresión de RPMS1 en Tx-PTLDs fue significativamente
mayor que en pacientes con HLF (p<0,05). Los transcriptos
RPMS1 se expresan en amígdalas de individuos infectados con
EBV. Su expresión en amígdalas se asocia a todo tipo de latencia
y a fase de replicación. En individuos trasplantados con PTLDs,
la alta expresión de RPMS1 podría indicar un rol en el desarrollo
de esta linfoproliferación.
P250 - 27620 DESARROLLO DE UNA METODOLOGÍA DE DIAGNÓSTICO Y GENOTIPIFICACIÓN POR REAL-TIME PCR DEL
VIRUS DE GUMBORO. TOMÁS, GONZALO; HERNANDEZ, MARTIN(1); PANZERA, YANINA(1); VILLEGAS, PEDRO(2);
HERNANDEZ, DIEGO(1); PEREZ, RUBEN(1)
(1) Facultad de Ciencias, Uruguay (2) Universidad de Georgia
El virus de la enfermedad infecciosa de la bursa (IBDV) es el
causante de una enfermedad inmunosupresora que afecta a pollos de engorde y postura, generando cuantiosas pérdidas económicas a la industria avícola mundial. IBDV es un virus no envuelto perteneciente al género Avibirnavirus de la familia Birnaviridae. Su genoma consiste en dos segmentos de RNA doble
hebra (A y B) que codifican cinco proteínas virales. Existen tres
cepas del virus: clásicas, variantes e hipervirulentas. Las dos primeras son consideradas de baja patogenia, ya que provocan una
enfermedad sub-clínica inmunodepresora que favorece la entrada de otros agentes patógenos oportunistas. Este hecho hace que
las infecciones causadas por IBDV de baja patogenia sean difíciles de detectar, ya que frecuentemente se ven camufladas por los
signos clínicos causados por otras enfermedades co-infectantes.
Por otro lado, las cepas hipervirulentas son consideradas de alta
patogenia, y provocan una enfermedad inmunosupresora grave
y con tasas de mortalidad elevadas. En este caso, si bien la infección provocada causa signos clínicos detectables, es importante realizar un rápido diagnóstico para tomar las medidas necesarias lo antes posible. En este trabajo se desarrolló una metodología de diagnóstico y genotipificación de IBDV mediante real-time
PCR. La misma permite diferenciar las cepas de alta patogenia
de las de baja patogenia. Se diseñó un juego de primers que
amplifica una región altamente conservada del segmento A del
virus, específicamente la región solapada del gen vp5 y la región
119
codificante de VP2. En la región amplificada se encuentra un
polimorfismo de nucleótido simple (SNP) que diferencia entre las
cepas de alta y baja patogenia. Este SNP fue detectado con un
procedimiento basado en el uso de sondas Taqman-MGB específicas para cada variante alélica y marcadas con los fluorocromos
FAM y VIC. La metodología se aplicó sobre cepas de referencia
y muestras de campo uruguayas, clasificadas previamente como
de baja y alta patogenia por el análisis de su secuencia nucleotídica. La caracterización realizada por real-time PCR mostró una
coincidencia total con la obtenida por la secuenciación de las diferentes cepas analizadas. IBDV es un virus que causa cuantiosas pérdidas económicas en la industria avícola mundial. Las
cepas de alta y baja patogenia tienen marcadas diferencias en
cuanto a sus signos clínicos y nivel de patogenia, pero ambos tipos virales deben ser rápidamente detectados para poder tomar
las medidas necesarias y así controlar la infección. En este trabajo se logró el desarrollo de una metodología de diagnóstico y
genotipificación de IBDV que permite acelerar los tiempos de respuesta frente a brotes de este virus y constituye un ejemplo de
incorporación de tecnología de punta con alto grado de aplicación
al sistema productivo avícola.
P251 - 27675 PREVALENCIA ELEVADA DE CITOMEGALOVIROSIS CONGÉNITA EN UN HOSPITAL PÚBLICO DE LA CIUDAD DE RESISTENCIA, CHACO. MARIN, H; DELUCA, G;
GIUSIANO, G
Hospital Julio C. Perrando – Resistencia - Chaco
La infección por citomegalovirus (CMV) es considerada de elevada morbi-mortalidad en los neonatos que la adquieren durante
el período fetal. El CMV es la causa más frecuente de infección
congénita en el ser humano, con una incidencia mundial que varía entre 0.2 y 2.2 %. Los síntomas sólo se presentan aproximadamente en un 10% de los neonatos infectados in-útero, en el
resto la infección pasa inadvertida. Aproximadamente el 80% y
el 15% de las poblaciones sintomáticas y asintomáticas respectivamente, desarrollará secuelas durante la infancia. La detección
por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en sangre seca
de tarjetas metabólicas, cobró importancia en estudios retrospectivos desarrollados en todo el mundo, con sensibilidad y especificidad comparables al aislamiento viral por cultivo celular. No existen a la fecha datos epidemiológicos moleculares concretos acerca
de infección congénita por citomegalovirus en el Nordeste argentino. El objetivo de este estudio fue determinar la prevalencia de
esta patología en una ciudad de la región mencionada considerándose la importancia de instaurar una terapia oportuna a partir
del diagnóstico temprano a fin de disminuir la morbilidad y evitar
secuelas progresivas en casos de infección subclínica. Durante
el periodo 2007-2009 se estudiaron 277 muestras seleccionados
al azar, correspondientes a recién nacidos del Servicio de
Neonatología del Hospital “Julio C. Perrando”.Se recolectaron
dentro de los diez primeros días post nacimiento. Treinta y cuatro neonatos presentaron algún signo o síntoma de infección viral
congénita y el resto fue asintomático. La detección del DNA viral
se efectuó en muestras de sangre seca de tarjetas metabólicas,
mediante la técnica de nested PCR utilizando primers GB que
amplifican un segmento de 150 pb. La prevalencia encontrada fue
del 3,97%, detectándose CMV en 11 muestras, de las cuales 5
pertenecieron a recién nacidos sintomáticos y 6 a neonatos
asintomáticos. Los positivos fueron confirmados por repetición de
la PCR y 2 de ellas pertenecieron a neonatos con madres con
antecedente de IgM específica durante el embarazo. Las principales manifestaciones clínicas fueron bajo peso, púrpura,
hepatoesplenomegalia, ictericia y nivel elevado de transaminasas.
El valor de prevalencia encontrado en este estudio puede considerarse elevado en comparación con los resultados (0.2% - 2,2%)
de Demmler y col. (1988), Barbi y col (1998) y Griffiths y col
(1991), los cuales utilizaron técnicas serológicas y moleculares,
aportando los primeros datos epidemiológicos mundiales. En
nuestro país los relevamientos de Distéfano y col. coinciden con
la casuística mundial antes mencionada. En otras regiones del
mundo (Japón, Finlandia, Hungría), encontraron prevalencias elevadas (aprox. 16%). Mientras que en San Pablo (Brasil) hallaron
120
un 2,6%, valor aproximado al de nuestra población. Las manifestaciones clínicas encontradas en los neonatos coincidieron con
trabajos nacionales principalmente. La cifra elevada de prevalencia en nuestra población, podría deberse a una baja condición
socioeconómica de los pacientes que asisten al Hospital público
en la ciudad de Resistencia. La técnica de PCR permitió estudiar
una población silente de recién nacidos, con riesgo de desarrollar secuelas progresivas en un futuro cercano, sin un tratamiento oportuno.
P252 - 27685 EFECTO DE LA INFECCIÓN CON VIRUS JUNÍN
SOBRE LA EXPRESIÓN Y EL TRANSPORTE NÚCLEOCITOPLASMÁTICO DE LA RIBONUCLEOPROTEÍNA HETEROGÉNEO-NUCLEAR A1. KNOTT, MARIA ELENA; MAETO ,
CYNTHIA A; LINERO , FLORENCIA N; GARCIA , CYBELE C;
ELLENBERG , PAULA C; SCOLARO , LUIS A; CASTILLA , VIVIANA
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales-UBA
Las ribonucleoproteínas heterogéneo-nucleares del grupo A/
B (hnRNPs A/B) normalmente intervienen en el procesamiento,
transporte y traducción de ARN mensajeros y su transporte núcleo-citoplasmático está relacionado con la regulación de la supervivencia celular. En trabajos previos se comprobó que las
hnRNP A/B participarían en la replicación del virus Junín (JUNV),
agente causal de la fiebre hemorrágica argentina, habiéndose
demostrado que el silenciamiento de estas proteínas inhibe la
replicación viral. El objetivo de este trabajo consistió en analizar
las características de la expresión de las hnRNPs del grupo A/B
en cultivos celulares de distinto origen infectados con JUNV o
transfectados con vectores que permiten la expresión transitoria
de proteínas virales. Mediante la técnica de western blot se analizó la expresión de proteínas hnRNPs A/B en células Vero, BHK21 y HeLa infectadas con JUNV en forma aguda o células Vero
persistentemente infectadas con JUNV (células V3). La infección
aguda en Vero, BHK-21 y HeLa no provocó cambios en los niveles de expresión de las hnRNPs A/B. En células V3, durante la
primera etapa de la persistencia los niveles de hnRNPs A/B no
se modificaron pero en una etapa tardía, en la cual no se detecta
producción de virus, se observó una marcada reducción en los
niveles de estas proteínas. Mediante ensayos de inmunofluorescencia indirecta, se analizó el efecto de la infección viral o de la
expresión de proteínas virales sobre la localización intracelular de
hnRNP A1 en células transfectadas con el plásmido T7-hnRNP
A1 que permite la expresión de esta proteína. Se determinó que
mientras la infección en células Vero promueve la acumulación
de hnRNP A1 en el citoplasma, la infección en células BHK-21,
HeLa o V3 no altera la localización predominantemente nuclear
de la misma. La sobreinfección con JUNV de células V3 no modificó el patrón de distribución nuclear de hnRNP A1. Asimismo,
la sobreexpresión de hnRNP A1 no provocó alteraciones en la
producción de virus infeccioso por parte de estos cultivos. Finalmente, se observó que la sobreexpresión conjunta de hnRNP A1
y la proteína viral N indujo la relocalización de hnRNP A1 al citoplasma en células Vero pero no en células V3. Sin embargo, la
co-expresión de hnRNP A1 con las proteínas virales GPC o Z no
alteró su localización predominantemente nuclear. Mientras que
la infección aguda en diversos sistemas celulares no alteró los
niveles de expresión de las hnRNPs A/B, dichos niveles se encontraron marcadamente disminuidos durante la persistencia viral
en células Vero. En aquellos sistemas en los cuales el virus no
produce efecto citopático (células BHK-21, HeLa y V3) la localización de hnRNP A1 fue principalmente nuclear. Sin embargo, la
infección aguda o la sobreexpresión de la proteína viral N en células Vero indujo la relocalización de hnRNP A1 al citoplasma.
Esto sugiere la participación de la proteína de nucleocápside viral
en la alteración del patrón de distribución de hnRNP A1 que podría estar relacionada con una modulación del efecto citopático
de JUNV.
P253 - 27108 INFLUENCIA DE LA SUPERPOSICIÓN DE GENES
EN LA EVOLUCIÓN DEL VIRUS DE HEPATITIS B. TORRES, C(1);
CAMPOS, RH(1); MBAYED, VA(1)
(1) Cátedra de Virología, Fac. de Farmacia y Bioquímica, UBA
El virus de hepatitis B (HBV) es un agente etiológico de enfermedad aguda y crónica. Su genoma es una molécula de ADN
de 3,2 kb que contiene 4 marcos de lectura abiertos (P, preS-S,
X y preC-C), parcialmente superpuestos. Desde el punto de vista
evolutivo, el HBV presenta dos características particulares: una
elevada tasa de mutación derivada del proceso de retrotranscripción del genoma y una fuerte restricción evolutiva producto del
solapamiento de sus genes. El HBV ha sido clasificado principalmente en 8 genotipos (A-H). El objetivo de este trabajo fue estudiar la influencia de la superposición de marcos de lectura en el
comportamiento evolutivo del HBV y los mecanismos virales implicados, mediante el estudio de la tasa de variación de las tres
posiciones del codón, las presiones de selección y el uso de
aminoácidos y de codones. Para ello, se analizaron 611 genomas
completos de los genotipos principales del HBV. Los análisis se
realizaron sobre cada genotipo en forma separada y sobre una
matriz de datos con representación equilibrada de cada uno (n
total=150). La tasa de variación de las tres posiciones del codón
fue estudiada por máxima verosimilitud (Baseml, PAML v4.2). La
presión de selección sobre los distintos genes se evaluó mediante el cálculo de las tasas de sustituciones sinónimas por sitios
sinónimos (dS) y de sustituciones no sinónimas por sitios no sinónimos (dN) (método SLAC, HYPHY v2.0). Por último, el uso de
aminoácidos y de codones se evaluó mediante el cálculo de la
frecuencia de ocurrencia (DAMBE v5.0.7). Los resultados mostraron que en la región de superposición P/preS-S, la posición más
variable fue la 1ra posición del marco de P que representa la 3ra
del marco del preS-S (1p/3s). Para otras regiones, la 3ra posición
de P fue la más variable, especialmente en P simple codificación.
Por otro lado, los genes en simple codificación presentaron siempre una dS mayor que en doble codificación, sin mostrar diferencias entre las dN. Las regiones de simple codificación, a pesar
de ser las más variables a nivel nucleotídico, resultaron más conservadas a nivel aminoacídico. Además, se observó que las regiones de P simple codificación, P/X y P/S presentaron dS>dN
(patrón conservativo en P), mientras que P/preS1 y P/C mostraron dN>dS (patrón no conservativo en P). En cambio, cuando la
superposición se analiza desde los marcos de lectura superpuestos del preS1 y C, éstos mostraron una dS>dN, sugiriendo que el
virus evoluciona hacia la conservación aminoacídica del preS y
del C, por sobre la variación de P. Por lo tanto, distintas regiones
de P presentan distinta tolerancia a los cambios no sinónimos, lo
cual está de acuerdo con la diferente funcionalidad de los dominios de esta proteína. Además, se observaron diferencias entre
la frecuencia de aminoácidos y de codones entre los genes en
simple y doble codificación del genoma del HBV. El proceso de
sustitución en las regiones de superposición de marcos de lectura en el genoma del HBV estaría dirigido por las restricciones
selectivas que operan sobre uno de los genes, más que sobre los
dos genes en cuestión, mientras que el uso diferencial de
aminoácidos y de codones constituiría una de las herramientas
utilizadas por este virus para tolerar los cambios en el marco superpuesto y evolucionar.
P254 - 27699 DIAGNÓSTICO Y CARACTERIZACIÓN GENÉTICA
DEL VIRUS DE LA BRONQUITIS INFECCIOSA AVIAR EN URUGUAY. MARANDINO, ANA EUGENIA; HERNANDEZ, MARTIN;
PANZERA, YANINA; HERNANDEZ, DIEGO; PEREZ, RUBEN
Facultad de Ciencias - Uruguay
El virus de la bronquitis infecciosa aviar (IBV) pertenece al
género Coronavirus de la familia Coronaviridae. IBV es un virus
pleomórfico, envuelto, con un genoma de ARN simple hebra (27,6
kb) de polaridad positiva. Este virus es el agente causal de la
bronquitis infecciosa (IB), una enfermedad respiratoria aguda que
afecta exclusivamente a aves de corral, generando cuantiosas
pérdidas económicas a la industria avícola mundial. Los brotes de
esta enfermedad se registran incluso en lotes de aves correctamente vacunados debido a que las vacunas empleadas no siempre proporcionan inmunidad cruzada ante los variados serotipos
existentes. El diagnóstico molecular de IB tiene gran relevancia
ya que la enfermedad suele confundirse con otras patologías
aviares respiratorias que provocan síntomas clínicos similares. En
el presente trabajo se realizó el diagnóstico y caracterización de
IBV en un brote ocurrido en una granja uruguaya durante el año
2009. La metodología de diagnóstico implementada se basó en
la detección del genoma viral mediante la amplificación por RTPCR de un fragmento de 437 pb del gen que codifica para la
Nucleoproteína. La caracterización genética se realizó mediante
el análisis de la secuencia completa del gen que codifica para la
Glicoproteína de Superficie (1670 pb), principal sitio antigénico del
virus. Los análisis comparativos de las secuencias mostraron que
existe divergencia entre el aislado uruguayo y la vacuna utilizada
actualmente a nivel nacional para prevenir la enfermedad. Esta
vacuna está confeccionada en base al serotipo Massachussets,
única cepa de uso comercial autorizada en Uruguay. En el presente trabajo se implementó, por primera vez en Uruguay, una
metodología de diagnóstico molecular para la detección de IBV.
Este ensayo constituye un método rápido, específico y sensible,
por lo que brinda competitividad frente a otras técnicas de diagnóstico alternativas. La aplicación del ensayo estandarizado en
muestras de campo de animales con sintomatología presuntiva de
IB logró detectar una cepa de campo de IBV uruguaya. La caracterización genética de esta cepa permitió ver una clara divergencia con la cepa vacunal utilizada en Uruguay para prevenir la IB.
Nuestros resultados fundamentan un estudio más profundo de caracterización de las cepas presentes en la región con el objetivo
de evaluar los niveles de protección cruzada entre las cepas
vacunales existentes y las variantes virales circulantes. De esta
manera se podrá seleccionar el plan de vacunación más adecuado a las características antigénicas de los virus de campo locales.
P255 - 27760 APLICACIÓN DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL
DIAGNÓSTICO DE VIRUS DE INFLUENZA A EN SALTA, ARGENTINA. POMA, RAMIRO(1); RASKOVSKY, VIVIANA(2);
GENTILE, ALBERTO(3); RAJAL, VERONICA(1,4)
(1) Instituto de Investigaciones para la Industria QuímicaCONICET, (2) Hospital del Milagro, (3) Departamento de Epidemiología, (4) FOGARTY Center
Introducción. Hasta inicios del año 2009 los virus influenza que
circulaban en nuestro país fueron cepas de influenza A subtipos
H1N1 y H3N2 estacionales. En el año 2009 surgió un nuevo virus influenza A con material genético de diferentes orígenes, al
que se lo llamó influenza A (H1N1) pandémico. Ante la rápida
propagación de esta nueva especie viral, la Organización Mundial de la Salud declaró la pandemia, lo que significó un gran
desafío a nivel mundial para desarrollar técnicas rápidas, sensibles y específicas en el diagnóstico que permitieran tomar medidas sanitarias oportunas. Objetivo: Realizar el diagnóstico de Influenza A (H1N1) empleando métodos sensibles, rápidos y específicos en Salta, Argentina. Materiales y Métodos. Se analizaron
muestras (hisopados y aspirados nasofaríngeos) de pacientes
ambulatorios y hospitalizados, incluyendo todos los grupos etarios,
de la provincia de Salta. A partir de la semana epidemiológica 35
del año 2009 se aplicó la siguiente metodología de trabajo. Panel de virus respiratorios (influenza A, influenza B, adenovirus,
virus sincicial respiratorio, virus parainfluenza) utilizando técnicas
de Inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos monoclonales
específicos para cada tipo de virus, según se venía trabajando en
años anteriores en la Unidad Centinela (Hospital del Milagro). La
totalidad de las muestras de las semanas epidemiológicas 35 y
36 fue también analizada mediante RT-PCR en tiempo real (qRTPCR) para identificación de Influenza A (H1N1) pandémico. Los
ácidos nucleicos fueron extraídos empleando kits comerciales
(Invitrogen) y el protocolo empleado para qRT-PCR fue el publicado por el Center of Disease Control (USA, Abril 2009). Las actividades se dividieron coordinadamente en dos estaciones de trabajo: recepción, toma de muestras y extracción de ácidos
nucleicos en Hospital del Milagro y diagnóstico molecular en Laboratorio de Aguas de la Universidad Nacional de Salta, empleando un equipo GenAmp Sequence Detection 5700 (Applied
121
Biosystems). Resultado. De las 157 muestras analizadas en Salta en las semanas epidemiológicas 35 y 36, 141 (89%) dieron negativas por IFI y 16 (11%) positivas para influenza A. Por qRTPCR 74 muestras (47%) dieron positivas para A y en 83 (53%)
muestras no se detectó genoma de influenza A pandémico. De
las 74 muestras positivas para influenza A, 43 (58%) fueron virus
influenza A (H1N1) pandémico y 31 no se pudieron subtipificar.
Conclusiones. La aplicación de qRT-PCR ha resultado exitosa
para realizar el diagnóstico del virus de influenza A (H1N1)
pandémico, permitiendo recuperar un gran porcentaje de muestras que fueron IFI negativas. El contar con resultados rápidos y
específicos permitió tomar decisiones adecuadas minimizando el
impacto en salud pública.
P256 - 27921 EFECTO DE MACRÓFAGOS SOBRE EL METABOLISMO OXIDATIVO DE BIOFILMS DE Candida albicans. ARCE
MIRANDA, JULIO EDUARDO(1); BARONETTI, JOSE LUIS(1);
SOTOMAYOR, CLAUDIA ELENA(2); ALBESA, INES(1); PARAJE,
MARIA GABRIELA(1)
(1) Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias Químicas,
Universidad Nacional de Córdoba, (2) Departamento de
Bioquímica Clínica, CIBICI, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba.
Introducción: Candida albicans es el principal patógeno fúngico
aislado en humanos, causando un gran número de infecciones
intrahospitalarias. Muchas de éstas, están asociadas al uso de
dispositivos biomédicos, tales como catéteres, sondas y dispositivos intrauterínos, donde Candida posee la capacidad de formar
biofilms sobre la superficie. Estudios previos de nuestro grupo de
trabajo han demostrado que el tratamiento de biofilms de C.
albicans con macrófagos (MØ), por períodos de tiempos cortos,
resulta en una modificación de la biomasa probablemente asociada al metabolismo oxidativo del mismo. Objetivo: En el presente
estudio, nuestro objetivo fue evaluar la presencia de diferentes
metabolitos oxidativos en biofilms maduros de C. albicans expuestos a tratamientos prolongados con MØ, lo que podría estar relacionado con el nivel de biomasa presente en el sistema. Materiales y métodos: *Modelo experimental: C. albicans fue incubada
en microplacas de polipropileno de 96 pocillos por 48 hs para
formar el biofilms maduro. Posteriormente, a este biofilms se le
agregó Mø (línea celular de ratón -RAW-) o medio (RPMI). La
determinación de biomasa, especies reactivas del oxigeno (ERO)
y especies reactivas del nitrógeno (ERO) fue realizada luego de
24 hs de la co-incubación. *Determinación de Biomasa: La
biomasa fue cuantificada a través de la coloración con cristal violeta, y una Unidad de Biomasa de Biofilm (UBB) fue definida arbitrariamente como una densidad óptica de 0,1 leída a 595 nm
(DO595) (1 UBB = 0,1 DO595). *Especies Reactivas del Oxigeno
y Nitrógeno: Las ERO fueron detectadas por reducción de Azul
de Nitro Tetrazolio (NBT) a Azul de Formazán, mientras que la
presencia de ERN (nitritos) fue evaluada mediante la técnica de
Griess. Resultados: La adición de MØ a los cultivos resultó en un
incremento de la biomasa de biofilms maduro con respecto a los
cultivos controles (RPMI). Además, este incremento en la formación de biofilms fue acompañada de una disminución en los niveles intra y extracelulares de ERO. En contraste, la producción
de ERN en biofilms co-cultivados con MØ no fue significativamente
modificada con respecto a la observada en cultivos sin tratamiento.
Nuestros resultados muestran que el cultivo prolongado de
biofilms maduros de C. albicans con MØ es capaz de generar
reacciones que se traducen en alteraciones de biomasa
microbiana y del metabolismo oxidativo del sistema; indicado por
un aumento de la relación ERO/ERN con respecto a UBB. Por lo
tanto, el modelo in vitro diseñado resultó apropiado para observar que los MØ pueden interactuar con biofilms ya formados, generando modificaciones metabólicas. No obstante, futuros estudios son necesarios para dilucidar el mecanismo por el cual estas células inducen estos fenómenos.
122
P257 - 27988 ANÁLISIS DE COMPLEJOS DE NEUROTOXINA
BOTULÍNICA TIPO A PRODUCIDOS A DISTINTOS TIEMPOS DE
CULTIVO. CABALLERO, PA(1); DE JONG, LIT (1); SOSA, MA(2);
PAREJAS, V (1); FERNANDEZ, RA (1).
(1) Facultad de Ciencias Médica, Universidad de Cuyo, (2) Instituto de Histología y Embriología (IHEM).
Las neurotoxinas botulínicas (NTBo) son proteasas Zn”´2+”
dependiente de 150 kDa, asociadas a componentes proteicos no
tóxicos hemaglutinantes y no hemaglutinantes, formando complejos de 300, 600 y 900 kDa (moléculas M, L y LL). Nuestros estudios preliminares realizados con NTBo A en cultivos de 4 días,
purificada por precipitación tanto ácida como salina
(NH”<4>”SO”<4>”) mostraron electroforeticamente bandas del
complejo L (˜500 kDa) de alta pureza, pero nó el complejo LL.
Nuestro objetivo fue determinar la producción de los distintos complejos neurotóxicos a diferentes tiempos de incubación del cultivo. Se seleccionó la cepa prototipo A-Hall de Clostridium
botulinum. Se produjo toxina en medio de cultivo líquido: 2,4%
triptycase, 0,5% proteosa peptona, 0,5% extracto de levadura,
0,5% glucosa, pH 7,2 final incubado 72 h a 34°C en atmósfera
aeróbica. Se tomaron alícuotas de 200 ml a las 14, 24, 48 y 72 h.
Se centrifugaron a 10.000 rpm, 30 min, 4°C, descartándose los
sedimentos. Los sobrenadantes se precipitaron con ácido
tricloroacético (ATa) al 10%, 30 min en baño de hielo y
centrifugaron a 13.000 rpm,10 min a 4°C. Los sedimentos
alicuotados en dos se redisolvieron en: a) 1 ml de buffer fosfato
(RBF) 30 mM y b)1 ml Nonidet P40® (RNP) al 10%. Se midió su
concentración proteica por Lowry (mg/ml) y se analizaron por
PAGE-nativa (6% acrilamida), con NTBo B (cepa William Hooper)
como marcador de PM (˜600 kDa) durante 6 h, 25 mV x gel y revelado con Azul de Coomassie. Se detectó NTBo en el cultivo de
14 h por inoculación intraperitoneal. Los sedimentos de la precipitación con ATa resultaron muy poco solubles RBF y parcialmente solubles en RNP. La concentración proteica en las cuatro muestras del RBF fue muy baja y en valor a la mitad que en el RNP
(Tabla 1). En la electroforesis, en el gel 1 (RBF): No se observaron bandas en ninguna de las muestras para los distintos tiempos de incubación. En el gel 2 (RNP): todas las muestras presentaron una única banda débil y todas de semejante intensidad,
correspondientes estimativamente a un PM ˜500 kDa (complejo
L de la NTBo A).
Tiempo de
incubación (h)
14
24
48
72
Concentración de proteínasmg/ml (Método Lowry)
Buffer fosfato 30 mM
NP40 10%
0,55
0,67
0,79
0,48
1,25
1,31
1,55
0,98
En conclusión, el precipitado fue soluble sólo parcialmente en
NP40, e insoluble en buffer RBF. No hubo variaciones significativas en la concentración proteica (NTBo A) para los distintos tiempos de incubación. En los geles del RNP sólo se observaron complejos correspondientes a la forma L (˜500 kDa), la ausencia de
la LL (900 kDa) puede deberse a inestabilidad del complejo en
las condiciones experimentales o a una alta insolubilidad que
impediría su ingreso al gel. La ausencia de bandas con el RBF
evidencia la insolubilidad de la proteína en el buffer fosfato.
P258 - 28032 FORMACIÓN DE BIOFILM DE Enterococcus
faecalis EN CONDUCTO RADICULAR DE DIENTES. MARTN, G
(1); ARCE MIRANDA, J (2); ANGEL VILLEGAS, N (2); RAVETTI, S
(2); VISVISIN, C (1); PARAJE, MG (2)
(1) Facultad de Odontología, UNC, (2) Facultad de Ciencias Químicas, UNC
Introducción: la cavidad bucal posee aspectos ecológicos que
facilitan el establecimiento y crecimiento de una gran variedad de
microorganismos como bacterias, hongos y virus. La placa dental (o biofilm dental) es un conjunto de microorganismos aerobios
y anaerobios localizados en la cavidad oral que se adhieren a la
superficie dentaria, espacios interdentarios u otras superficies,
formando una comunidad estructurada y heterogénea de células
sésiles rodeadas por una matriz exopolisacárida de origen salival
y microbiano. La formación de este bioiflm incluye una serie de
pasos que comienzan con la colonización inicial de la biopelícula
y termina con la compleja formación de un biofilm maduro generalmente mixto. Dentro de la placa los microorganismos sobreviven con fenómenos de sinergismos y cooperación, produciendo
sustancias necesarias para otras especies vecinas, sustancias
adherentes que se entremezclan y conservan el biofilms intacto
sobre la superficie dental pudiendo producir infecciones. En el
conducto radicular de infecciones endodónticas primarias predomina Enterococcus faecalis. Esta especie necesita escasa cantidad de nutrientes para su desarrollo y no necesita de sinergias
con otros microorganismos. Objetivo: Desarrollar un modelo de
infección con formación de biofilms en conductos radiculares de
dientes y en superficies abióticas por E. faecalis. Materiales y
Métodos: Se realizó la infección de los dientes (n=20) con un
cultivo over night de E. faecalis ATCC 29212 en el conducto
radicular y posterior incubación durante 60 días a 37 °C. La formación de biofilms in vitro de se cuantificó mediante la adhesión
a placas de poliestireno de 96 wells, coloración con cristal violeta, elución con alcohol/acetona y posterior cuantificación
espectrofotométrica para determinar la densidad óptica (D.O.) a
595 nm. La expresión del curli característico de especies
formadoras de biofilm se analizó mediante la técnica de rojo congo. Por microscopía confocal de exploración láser (MCEL) y coloración diferencial con dos marcadores fluorescentes con ioduro
de propido/isotiocianato de fluoresceína (FITC) se estudió la formación de biofilm en el conducto radicular en los dientes infectados. Resultados: E. faecalis ATCC 29212 aislada del conducto
radicular, posterior a su infección, mostró alta formación de biofilm
(D.O.: 3,365 ± 0.021) estudiada por microtécnica en superficies
poliméricas. Con la técnica del rojo congo se visualizaron las características colonias negras de cepas formadoras de biofilms.
MCEL se pudo observar la formación de biofilm en el conducto
radicular, obteniendo información de la estructura en 3 dimensiones y la diferenciación entre la matriz extracelular coloreada de
verde por FITC y las células sésiles teñidas de naranja por el IP.
El modelo de infección diseñado resultó apropiado para evaluar
la formación de biofilms de E. faecalis tanto en el conducto
radicular del diente como en superficies poliméricas. Este modelo podría ser útil para estudios posteriores de la acción de
irrigantes o antibióticos para el control de las enfermedades infecciosas de la cavidad bucal.
P259 - 28057 EXPRESIÓN DE GENES PRO Y ANTI-APOPTÓTICOS EN MACRÓFAGOS PERITONEALES DE RATÓN INFECTADOS CON Clostridium septicum. VILLA, CECILIA (1);
CACERES, CLAUDIA (1); RODRIGUEZ, YAMILA (1); ORTIZ,
RODOLFO (1); VEGA, ALBA (1); SOTOMAYOR, CLAUDIA (2);
CORTIÑAS, TERESA (1).
(1) Universidad Nacional de San Luis (UNSL), (2) CIBICICONICET Facultad de Ciencias Químicas Universidad Nacional
de Córdoba.
Clostridium septicum es un bacilo anaerobio agente causal del
edema maligno en los animales de sangre caliente y gangrena
traumática y no traumática en el hombre. Estas enfermedades
mionecróticas evolucionan con un alto índice de mortalidad. Una
de las características mas sobresalientes de la mionecrosis producida por este microorganismo es la ausencia de células
fagocíticas en el sitio de infección. Tanto la inducción de apoptosis
o de necrosis son considerados mecanismos de evasión del sistema inmune innato que pueden producir algunos microorganismos, ya que logran la destrucción de células claves del sistema inmune. El objetivo de este trabajo fue evaluar la capacidad
de C. septicum de inducir la expresión de moléculas pro y antiapoptóticas en macrófagos peritoneales de ratón a diferentes
multiplicidades de infección (MDI) y tratados con proteínas
extracelulares secretadas por este patógeno durante su cultivo.
Macrófagos peritoneales de ratón fueron infectados a diferentes
MDI=3:1, 30:1, 100:1, empleando células de C. septicum ATCCC
10092 y sobrenadantes libres de células al 10%, obtenidos en fase
logarítmica de cultivo. La presencia de apoptosis fue determinada mediante cambios morfológicos observados por microscopía
óptica, Annexin VCY3 y presencia de ladder del DNA. La expresión de genes pro y anti-apoptóticos se determinó por RT-PCR.
El RNA total fue obtenido mediante el empleo del reactivo de trizol.
Para la realización de la RT-PCR,el RNA fue transcripto a cDNA
y usado para la amplificación de los genes bax, bcl2 y gpdh como
gen constitutivo, usando inciadores específicos. Las bandas resultantes fueron semicuantificadas mediante el software Scion
Image. La expresion bax fue 2.5 veces mayor con respecto al
control a bajas MDI (3:1) y tratado con el sobrenadante de cultivo, y de 1.7 veces a la MDI 30:1 y prácticamente no se expresó
a MDI=100:1. La máxima expresión de gen anti-apoptótico bcl2
se observó en el control sin infectar, y disminuyó dos y tres veces a MDI 3:1 y 100:1 respectivamente. La expresión de genes
pro-apóptícos y anti-apoptóticos varía de acuerdo a la MDI ensayada . Bajas MDI al igual que bajas concentraciones de los
sobrenadantes inducen la expresión del gen pro-apoptótico en
concordancia con la inducción de apoptosis observada en
macrófagos murinos.Por el contrario cuando se infecta a altas MDI
de C. septicum los macrófagos no expresan el gen pro-apotótico
e inducen muerte celular por necrosis. El número de bacterias es
probablemte baja al comienzo de la infección, por lo que la evasión del sistema inmune empleando el mecanismo de apoptosis,
podría ser importante para el establecimiento de la enfermedad
mionecrótica. Este es el primer trabajo dirigido a comparar la regulación de estos dosgenes en macrófagos infectados con C.
septicum a bajas y altas MDI.
P260 - 28092 REPRESIÓN CATABÓLICA DE LA PRODUCCIÓN
DE TOXINAS EN LA BACTERIA ANAEROBIA PRODUCTORA
DE GANGRENA GASEOSA Clostridium perfringens. MENDEZ,
MARCELO(1); RAMIREZ, WALTER(1); GRAU, ROBERTO(1)
CONICET-Rosario.
La bacteria anaerobia, gram-positiva formadora deesporas
Clostridium perfringens es responsable de la producción de severas lesiones gastrointestinales e histo-tóxicas siendo la de mayor importancia médica la gangrena gaseosa. Una vez iniciada su
avance es rápido y devastador aún en presencia de terapia con
antibióticos. Para el desarrollo de la gangrena en humanos, C.
perfringens debe producir y secretar diversas exo-toxinas siendo
las más relevantes las toxinas alfa (PLC) y theta (PFO). Pese a
que C. perfringens solo es capaz de desarrollar en hábitats extremadamente ricos en nutrientes (como el cuerpo humano) poco
es lo que se conoce, a nivel molecular, sobre las señales ambientales y nutricionales que impactan sobre la virulencia y producción de toxinas por parte de este patógeno. En este trabajo decidimos estudiar qué conexión existe entre la disponibilidad de carbono (regulación catabólica por C) y la producción de toxinas relevantes para el desarrollo de la gangrena. A partir de extractos
celulares de C. perfringens se comprobó que la actividad
hemolítica (PFO) y lipasa (PLC) se ve notoriamente disminuida
cuando la bacteria es crecida anaeróbicamente en presencia de
azúcares fácilmente metabolizables (glucosa, fructosa, sacarosa,
etc.). Mediante ensayos de actividad beta-glucuronidasa de fusiones reporteras transcripcionales a los promotores de los genes
codificantes para dichas toxinas (plc-gusA y pfo-gusA) introducidas por electropora

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