estudio de la variabilidad epigenética y de expresión transcripcional

Transcripción

Alumno Expositor: Vicente Paul Armenta Pérez
Líder: Dra. en C. Clara Patricia Ríos Ibarra
ESTUDIO DE LA VARIABILIDAD EPIGENÉTICA Y DE EXPRESIÓN TRANSCRIPCIONAL
INDUCIDA POR CETUXIMAB EN CÁNCER DE COLON: EGFR Y SOCS-1 COMO
BIOMARCADORES DIAGNÓSTICO
Arvizu-Gutierrez LA1, Peña-Diaz JA1, Ortiz-Lopez R2, Salinas-Santander M3, Armenta-Perez VP1, Patiño-Valenzuela S1,
Rios-Ibarra CP1. 1Departamento de Bioingenierías del Tecnológico de Monterrey, campus Guadalajara. 2Centro de
Investigación y Desarrollo en Ciencias de la Salud de la Universidad Autónoma de Nuevo León. 3Facultad de Medicina de
la Universidad Autónoma de Coahuila.
RESUMEN
ANTECEDENTES. El cetuximab es un anticuerpo IgG1 monoclonal quimérico cuyo blanco es el
receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). La sobre-expresión del EGFR está
relacionada con un pobre pronóstico para cáncer de colon, reduciéndose la supervivencia y
aumentando el riesgo de metástasis. Aproximadamente el 65 % de los tumores colorrectales
tienen un genotipo KRAS no mutado, pero desafortunadamente sólo el 60-70 % de ellos presentan
una respuesta al tratamiento efectiva. Lo anterior, hace resaltar la importancia de analizar otros
genes que pudiesen estar involucrados en la respuesta al tratamiento anti-EGFR, como las vías de
señalización intracelular alternativas tales como PIK3 y JAK. Con lo anterior, se precisaría un
conjunto de biomarcadores que permitieran seleccionar adecuadamente a los pacientes que son
más sensibles a los tratamientos anti-EGFR. Lo anterior, se traduciría en una medicina
personalizada de menor costo y mayor efectividad.
OBJETIVOS. Analizar el efecto epigenético y transcripcional de cetuximab sobre EGFR y SOCS-1 en
Cáncer de Colon (in vitro).
MATERIAL Y MÉTODOS. Se cuantificaron los niveles de RNA de SOCS-1 (supresor de tumor) y EGFR
(oncogen) en células CaCo-2 tratadas con Cetuximab, para determinar si existe un del tratamiento
sobre la expresión de los blancos génicos seleccionados y el patrón de metilación a nivel de su
promotor génico.
RESULTADOS Y CONCLUSIONES. A las 72 horas post-tratamiento con cetuximab, el marcador
positivo representado por EGFR disminuye su expresión a nivel de RNA (~99%, p<0.001) al igual
que SOCS-1 (~76%, p=0.008); adicionalmente, hemos realizado el procesamiento de las muestras
de DNA con bisulfito de sodio (control vs tratamiento), para evaluar si existe un cambio
epigenético en presencia del cetuximab; a la fecha contamos con los resultados derivados de
secuenciación correspondientes para EGFR (fragmento de la región promotor), cuyo resultado
presenta la metilación en un único nucleótido a las 72 hr post-tratamiento.
INTRODUCCIÓN
El cáncer colorrectal es la tercera malignidad más común en hombres y la segunda más común en
mujeres. Es el tercer tipo de cáncer con mayor número de fallecimientos, con un 8% del total (Wu,
2010). Actualmente, se han desarrollado terapias dirigidas molecularmente a los receptores que
promueven el desarrollo de este padecimiento, tal es el caso del Cetuximab. El Cetuximab es un
anticuerpo monoclonal IgG1 químerico que se une al dominio extracelular de EGFR (Epidermal
Growth Factor Receptor)(Garrett & Eng, 2011) (Figura 1). Cetuximab tiene mayor afinidad que los
ligandos naturales (EGF, TGF-α, anfirregulina y epirregulina) del EGFR, por lo que inhibe de forma
competitiva los efectos de activación y mecanismos de señalización Gomez et al., 2013).
Figura 1. Estructura de Cetuximab. Está compuesto por las cadenas pesadas y ligeras IgG1 humanas (barras rojas) y las regiones Fv antiEGFR murino (barras azules).
Se ha demostrado que un 60-80% de los pacientes con CCR tienen mayor expresión del receptor
EGFR, también conocido como HER-1 o ErbB1 (Chee & Sinicrope, 2010). Esto debido a que la
activación del receptor promueve la proliferación celular, diferenciación, migración y adhesión,
por lo que su sobrerregulación fomenta procesos relativos al crecimiento tumoral, como la
angiogénesis, inhibición de apoptosis, invasividad y metástasis (Wu, Charabaty, Pishvaian &
Marshall, 2010). Tras su aprobación la FDA en 2004, Cetuximab ha sido usado para tratar el cáncer
colorrectal metastásico ya que se ha reportado una mayor supervivencia en las pruebas clínicas
(Brand, Iida & Wheeler, 2011). Sin embargo, el anticuerpo no es activo en todos los pacientes, ya
que estudios recientes demuestran que los pacientes con mutaciones en KRAS generan
resistencia (Misale et al., 2012).
MECANISMO DE ACCIÓN
Tras la unión de Cetuximab al EGFR, se bloquea la señalización intracelular y disminuye la
proliferación, angiogénesis y diferenciación. Además de estimular la apoptosis y bloquear la
liberación de proteasas y sus inhibidores, por lo que inhibe a su vez la metástasis. También inhibe
la producción de factores angiogénicos y estimula la inmunidad antitumoral a través de la
activación del complemento y la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (Holubec et al., 2012)
(Figura 2).
En ausencia de Cetuximab, los ligandos naturales se unen a EGFR y permiten la formación de
homodímeros o heterodímeros con los demás miembros de la familia ErbB (ErbB2/neu,
ErbB3/HER3 y ErbB4/HER4, lo cual permite la autofosforilación del dominio intracelular a través de
actividad tirosina cinasa que posteriormente activan dos principales rutas de señalización:
KRAS/RAS/ERK y PI3K/AKT, las cuales son responsables de estimular la actividad cancerígena
(Mlcochova, Faltejskova, Nemecek, Svoboda & Slaby, 2013).
Figura 2. Principales rutas de señalización oncogénicas de EGFR. Entre las vías metabólicas reguladas por EGFR se encuentran
Angiogénesis, Antiapoptósis, Proliferación Celular y Metástasis.
Como se mencionó, la activación de EGFR conlleva a la estimulación del oncogén KRAS que
siguiendo su cascada de señalización, activa el oncogén BRAF, una cinasa que una vez activada
fosforila la también cinasa MEK1/2 (mitogen-activated protein-kinase kinase). Ésta última a su vez
activa ERK (extracelular signal-regulated kinase), la cual tiene mayor variedad de sustratos, en su
mayoría factores de transcripción que participan en la respuesta génica (Roskoski, 2012).
La otra ruta PI3K, puede ser activada por KRAS o por el mismo EGFK. PI3K activa las cinasas AKT (Vakt murine thymoma viral oncogene homolog 1) y posteriormente a mTOR (mammalian target of
rapamycin), la cual activa proteínas relacionadas con el ciclo celular y factores de transcripción que
participan en el proceso de tumorigénesis. La desregulación de esta ruta lleva a inhibición de
apoptosis, proliferación celular, angiogénesis y migración (Sood et al., 2012). En esta ruta, PTEN es
un supresor de tumores importante ya que inhibe la función de PI3K y regula de forma negativa la
fosforilación de AKT (Roock, Vriendt, Normanno, Ciardiello & Tejpar, 2011). Otras rutas
secundarias que promueven el cáncer son las de la PKC (protein kinase C) y (STAT Signal
Transducer and Activator of Transcription); por otra parte, cabe señalar que SOCS-1 es un supresor
de tumor, cuyos cambios epigenéticos han sido asociados a efectos anti-tumorales en otros tipos
de cáncer como hepatocarcinoma (Chu,2010).
DOSIS Y EFECTOS SECUNDARIOS
Normalmente el medicamento se administra una vez a la semana, las dosis máxima aprovada por
el FDA es de 400 mg/m2 en infusiones que duran aproximadamente dos horas. Para las siguientes
semanas la dosis se debe reducir hasta 250 mg/m2. (DrugBank, 2011). No obstante, Hubbard, M.
(2013) determinó que las dosis óptima libre de toxicidad se alcanza a una concentración de 500
mg/m2. Es importante notar que el tiempo máximo que un paciente puede recibir este
tratamiento es de 16 semanas, una vez pasado este tiempo; el paciente debe suspender el
tratamiento, y se debe asesorar para una cirugía con objetivo de liberar los tumores en el hígado.
Cabe destacar que antes de iniciar el tratamiento, es necesario realizar un estudio para verificar
que no existan alergias o reacciones secundarias al medicamento, para ello se utiliza una dosis de
20 mg. También se recomienda que cada individuo se suministre con 50 mg de difenhidramina por
vía intravenosa a manera de pretratamiento, ya que actúa como antihistamínico, sedante,
antiemético (previene vómito), antitusivo (previene la tos) y anticolinérgico (inhibe el
neurotransmisor acetilcolina). Después de una dosis, la concentración en el suero de Cetuximab es
aproximadamente de 184 g/mL, y la vida media del mismo es de aproximadamente 97 horas. Para
las sesiones de refuerzo de 250 mg/m2 la concentración máxima fue de 140 g/mL. A partir de la
tercera semana, ya se pueden observar concentraciones del medicamento en estado estable en
valores aproximados de 41 y 85 g/mL (DrugBank, 2011).
En una investigación se comparó la eficacia que podría tener el Cetuximab como terapia de cáncer
colorrectal, para ello se realizó un muestreo con 7,954 pacientes; donde aproximadamente la
mitad tuvo un tratamiento sin Cetuximab mientras que la otra sí lo tenía. Los resultados obtenidos
indican que el tratamiento puede mejorar la supervivencia en 11% y reduce la progresión del
tumor en por lo menos 29% (Liu, 2010). También se ha demostrado que tiene un efecto
potenciado contra la formación de tumores cuando se usa junto a un fármaco citotóxico en líneas
celulares de cáncer de colón (Correale, 2010). Se analizaron 4 líneas celulares de cáncer colorrectal
bajo tratamiento de Cetuximab en conjunto con Rapamicina, los resultados indicaron que el
cotratamiento con ambos fármacos potencia la citotoxicidad del Cetuximab, al inhibir las cascadas
de señalización de mTOR. (Chen, W. 2014).
En un estudio realizado por Ocvirk (2010) se analizaron 31 pacientes con cáncer colorrectal
metastásico que fueron tratados con Cetuximab en combinación con quimioterapia. Los
resultados referentes a la evaluación de efectos secundarios mostraron que 6 pacientes
presentaron erupciones cutáneas de grado 3, 16 pacientes con grado 2 y 9 pacientes con
erupciones de grado 1. También se observó en un grupo de pacientes la presencia de piel seca,
prurito, fisuras cutáneas, paroniquia y conjuntivitis.
Otro efecto secundario del medicamento es la paroniquia, la cual es una infección que se
caracteriza por rodear a la uñas con inflamación y daño a la cutícula. Este sólo se presenta en
aproximadamente 12% de los casos y se manifestó durante todo el periodo que duraba el
tratamiento (Rodríguez-Murphy et al., 2011).
El 3.5% de la población tiene predisposición a presentar reacciones alérgicas severas, donde se
recomienda parar la terapia, estas se caracterizan por la anafilaxia la cual es una reacción
inmunitaria rápida y potencialmente mortal, y uno de los principales síntomas es salpullidos,
inflamación de la garganta, caída de presión y comezón. Otros efectos secundarios de los cuales se
deben cuidar los pacientes con este padecimiento es que el tratamiento pude causar
hipersensibilidad a tratamientos como adrenalina, antihistamínicos y corticosteroides. Por último,
también se ha reportado efectos secundarios como fiebre, nausea, vómitos, dolores de cabeza,
mareo y disnea (dificultad para respirar). Si se recibe el tratamiento de Cetuximab en conjunto con
otras terapias y en combinación con otros tratamientos como el 5-fluoracil (5-FU), ácido folínico u
oxiplatino, los efectos secundarios pueden incrementar dependiendo del fármaco utilizado. Por
ejemplo, si se utiliza alguna terapia basada en platino puede haber reducción del conteo de
glóbulos blancos, lo cual puede ocasionar infecciones que pueden llegar a ser mortales,
inflamación, diarrea, reacciones en la piel, fiebre, cansancio; en caso de presentar la mayoría de
estos síntomas, es vital reportar al médico lo antes posible (NICE, 2012). Asimismo, la conjugación
de Cetuximab con nanopartículas de oro de 14 nm promueve e incrementa la actividad citotóxica y
antitumoral al bloquear las vías de señalización de EGFR, pero incrementa la tasa apotótica en
células sanas. (Joseph M.M., 2013).
MATERIAL Y MÉTODOS
Cultivo Celular y Tratamiento con Cetuximab
Se incubó a 37°C y 5% CO2 hasta obtener 90% de confluencia. Para realizar la exposición al
tratamiento, se sembraron 40,000 células Caco-2 de cáncer de colon en placas de 24 pozos con
ADMEM y 2 % de SBF, a una concentración de 20 ug/mL de cetuximab.
Extracción de RNA Total
Se realizó la extracción del RNA total de las células Caco-2 post-tratamiento con cetuximab,
utilizando Trizol y cloroformo; posteriormente se precipitó el RNA con isopropanol, se lavó con
etanol al 70% y recosntituyó con H20-DEPC+inhibidores de RNAsas para ser finalmente
almacenado a -80°C hasta su conversión a cDNA.
Retrotranscripción (RT-PCR)
Se retrotranscribieron las muestras de RNA utilizando MMLV, previo a su análisis cuantitativo
mediante PCR en tiempo real; los productos de cDNA se almacenaron a -20°C.
PCR en Tiempo Real (qPCR)
En las tablas se presenta los reactivos en la reacción y las condiciones de ciclos de la PCR.
Reactivo
Sybr Green
Agua DEPC
Primer foward 40 mM
Primer reverse 40 mM
cDNA 10 ng/uL
Paso 1
Paso 2
Paso 3
Paso 4
Cantidad (μL)
10
7
1
1
1
Ciclos de PCR
50°C - 2´
95°C - 10´
95°C - 15”
60°C - 1´
Repetir 45 veces paso 3 y 4
ANÁLISIS EPIGENÉTICO: transformación de citocinas en uracilos y secuenciación
Se extrajo el DNA total de células Caco-2 post-tratamiento con cetuximab y posteriormente fue
tratado con bisulfito de sodio y analizado por secuenciación para identificar los cambios de
metilación en la región del promotor de EGFR y SOCS-1.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los experimentos se realizaron por triplicado y las variables fueron evaluadas mediante ANOVA de
una vía y la prueba de Dunnet. Las diferencias se consideraron significativas con valor de p ≤0.05.
RESULTADOS
VIABILIDAD CELULAR. Mediante un ensayo de azul alamar se confirmó que no existiera un efecto
citotóxico con 20 ug/uL de cetuximab en células de cancer de colon, de acuerdo a la literatatura y
encontrando equivalencia en nuestros resultados (Figura 3).
Figura 3. A una concentración de 20 ug/mL no se observa efecto citotóxico de cetuximab en células de
cáncer de colon a los 3 distintos tiempos de exposición (24, 48 y 72 hr).
CUANTIFICACIÓN DE LOS NIVELES DE EXPRESIÓN DE RNA DE EGFR Y SOCS-1. Para llevar a cabo la
cuantificación de la expresion mediante PCR en tiempo real del RNA para EGFR y SOCS-1 en células
Caco-2, se estandarizó el método realizando una curva logarítmica con 10, 100 y 1000 ng de cDNA,
para seleccionar la candidad necesaria de éste para la reacción; posteriormente se verificó la
especificidad de los oligonucleótidos validando las curvas de disociación (melting curve) (Figura 4).
Figura 4. Curvas de disociación para la validación de la especificidad de los oligonucleótidos utilizados
en la reacción de PCR en tiempo real con Sybr Green.
Nosotros observamos un descenso estadísticamente significativo para EGFR y SOCS-1 a las 72 hr
post-tratamiento con cetuximab (Figura 5) (Figura 6).
Figura 5. SOCS-1 disminuye su expresión a nivel de RNA (~76%, p=0.008) a las 72 hr post-tratamiento
con cetuximab vs el control negativo.
Figura 6. EGFR disminuye su expresión a nivel de RNA (~99%, p<0.001) a las 72 hr post-tratamiento con
cetuximab vs el control negativo.
SECUENCIACIÓN DE EGFR-PROMOTOR
Al llevar a cabo la secuenciación de un fragmento correspondiente a una región del promotor
génico de EGFR, a partir de DNA aislado de células expuestas a cetuximab durante 72 hr, se
observó la metilación de una única citosina:
Negativo 121 GTGGAA -TGCGTTCGGCGGCGGTCGTCGTCGTTTAGACGAAATTT--GTTTWT--GGTGCGACRK
Cetuxibab 121 GTGGAAATGCGTTCGGCGGCGGTCGTCKTCGTTTAGACGAA-TTTTTGTTCTTTCGGTGCGTCKG
CONCLUSIONES PRELIMINARES
En la línea celular CaCo-2, cetuximab no es citotóxica a una concentración de 20 ug/mL. Para
corroborar la especificidad de cada oligonucleótido, se obtuvo la curva de fusión (melting curve)
de la cual se derivaron picos únicos para EGFR, SOCS-1 y Actina (gen constitutivo, con el cual
fueron normalizados los resultados de PCR en tiempo real para obtener los valores de ΔΔCt).
Con respecto a la literatura, CaCo-2, es una línea celular con respuesta positiva al tratamiento con
cetuximab; en nuestro estudio, a las 72 hr post-tratamiento, el marcador positivo representado
por EGFR disminuye su expresión a nivel de RNA (~99%, p<0.001) al igual que SOCS-1 (~76%,
p=0.008); adicionalmente, hemos realizado el procesamiento de las muestras de DNA con bisulfito
de sodio (control vs tratamiento), para evaluar si existe un cambio epigenético en presencia del
tratamiento; a la fecha contamos con los resultados derivados de secuenciación correspondientes
para EGFR (fragmento de la región promotor), cuyo resultado presenta la metilación en un único
nucleótido a las 72 hr post-tratamiento.
Analizar diferentes genotipos en pacientes con cáncer de colon y correlacionar su perfil de
expresión transcripcional con el perfil de metilación, para implementar herramientas de
pronóstico de respuesta al tramiento a cetuximab y transferirlas a cualquier otro agente
farmacológico con capacidad hipo o hipermetilante.
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