Comportamiento fisiológico del basidiomicete marino Nia vibrissa

Comportamiento fisiológico del basidiomicete marino Nia vibrissa

Serie Oceanológica. No. 10, 2012
ISSN 2072-800x Comportamiento
fisiológico
del
basidiomicete
marino
Nia
vibrissa
(Basidiomycota: Agaricales) en presencia de hidrocarburos aromáticos
policíclicos
Physiologic behavior of the marine basidiomycete Nia vibrissa (Basidiomycota:
Agaricales) in presence of polycyclic aromatic hydrocarbons
Ayixón Sánchez Reyes*, Yessica Delgado Rodríguez*, Ramón Alberto Batista García*, Erisbel
Samón-Legrá**, Diana Enríquez Lavandera**, Silvia Acosta Díaz*, Ana Luisa Martínez Cruz*
*
Centro de Investigaciones del Petróleo. Churruca # 481, e/ Vía Blanca y Washington,
Cerro, La Habana, Cuba, CP 12 000, Teléf.: (537) 640 3560. Correo: [email protected]
**
Instituto de Oceanología. Ave. 1ra No.18406 e/184 y 186, Rpto. Flores, Playa, CP 11600, Ciudad de La
Habana, Cuba, Telef.: (537) 271 6008.
Resumen
Las potencialidades fisiológicas de los hongos ligninolíticos, se consideran una alternativa para la
restauración ecológica de ecosistemas impactados con petróleo crudo y sus derivados. Nia vibrissa, un
basidiomicete marino aislado recientemente en playas del litoral sur oriental de Cuba, constituye una
especie promisoria para la remoción de compuestos orgánicos persistentes. Como objetivo fundamental
de este trabajo se planteó caracterizar fisiológicamente el cultivo sumergido de Nia vibrissa en medio
líquido de sabouraud, suplementado con pireno y dibenzotiofeno, dos hidrocarburos aromáticos
policíclicos de notable impacto ambiental. Se evaluó la biomasa fúngica como medida de crecimiento y
los parámetros pH, conductividad, y consumo de la fuente de carbono durante 15 días. Se comprobó que
Nia vibrissa creció en el medio seleccionado en presencia de pireno y dibenzotiofeno a una concentración
de 0,01%, evidenciando tres fases de crecimiento. En los cultivos suplementados con ambos
hidrocarburos como tratamientos independientes, así como en el control sin tratar, se evidenció un
aumento significativo de la conductividad. El pH inicial se incrementó con el tiempo de fermentación hasta
valores cercanos a la alcalinidad. Este trabajo constituye el primer estudio fisiológico de Nia vibrissa en
Cuba y representa un importante aporte al conocimiento de la ecología y fisiología de hongos marinos.
Abstract
The physiologic potentialities of ligninolytic fungi are considered an alternative for the ecological
restoration of ecosystems impacted by crude oil and its derivatives. Nia vibrissa, a marine white rot
basidiomycete, recently isolated in Cuban south-eastern beaches, constitutes a promissory species for
the removal of persistent organic compounds. The fundamental objective of this work was the
physiological characterization of submerged cultures of Nia vibrissa in liquid Sabouraud medium, enriched
with pyrene and dibenzothiofhene, two aromatic polycyclic hydrocarbons with significant environmental
impact. Fungal biomass was evaluated as growth measure, and parameters like pH, conductivity, and
carbon source consumption were assessed during 15 days. It was verified that Nia vibrissa grew in the
selected medium in presence of pyrene and dibenzothiofhene at a concentration of 0,01%, evidencing
three growth phases. In the cultures enriched with both hydrocarbons as independent treatments, as well
as in the untreated control, a significant increase in conductivity was confirmed. Initial pH increased with
the fermentation time until near-alkalinity values. This work constitutes the first physiologic study of Nia
vibrissa in Cuba and it represents an important contribution to marine fungi ecology and physiology.
Palabras Claves: Dibenzotiofeno, hongos marinos, restauración ambiental, pireno.
Keywords: Dibenzothiofhene, marine fungi, environmental restoration, pyrene.
INTRODUCCIÓN
En la actualidad la creciente demanda energética ha incrementado la utilización del petróleo
y sus derivados, y con ello la aparición de zonas contaminadas ya sea por derrames de buques
u operaciones del proceso de perforación, extracción, refinación y transporte. La actividad
petrolera impacta directamente el ambiente, teniendo consideración especial las emisiones
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Serie Oceanológica. No. 10, 2012
ISSN 2072-800x atmosféricas, los residuales sólidos y los efluentes líquidos, los cuales arrastran cantidades
apreciables de hidrocarburos (Tanaka, Matsui, Konishi, Maruhashi & Kurane, 2002; Baldi, Pepi
& Fava, 2003). Los efluentes líquidos inciden sobre los ecosistemas acuáticos y terrestres
provocando la ruptura del equilibrio natural de los mismos.
Entre los hidrocarburos con mayor impacto ambiental se consideran los policíclicos
aromáticos (HAP). Se definen como especies recalcitrantes para los ecosistemas terrestres y
acuáticos. Actualmente la comunidad científica internacional apela a la búsqueda de soluciones
para atenuar su efecto ambiental y las graves consecuencias para el planeta y la salud humana
en particular (Castaño, Errico, Malats & Kogevinas, 2004).
Los microorganismos y en especial los hongos se consideran imprescindibles para las
acciones de restauración ecológica en ambientes contaminados con compuestos orgánicos
persistentes. Los hongos filamentosos poseen patrones de excreción enzimáticos que
favorecen la degradación parcial o completa de numerosos sustratos (Esser & Lemke, 2001).
Los basidiomicetos sobresalen entre los representantes fúngicos de mayor atracción para estas
actividades (Dávila & Vázquez-Duhalt, 2006). Ellos expresan y excretan eficazmente al medio
extracelular, enzimas inespecíficas de gran interés en acciones de biodegradación y
biotransformación de xenobióticos (Higuchi, 2004; Martínez et al., 2005).
Nia vibrissa, basidiomicete de podredumbre blanca aislado en playas del litoral sur oriental
de Cuba, constituye un representante fúngico de gran importancia ecológica (Samón-Legrá &
Enríquez, 2010). No hay referencias bibliográficas sobre la fisiología de este hongo marino, ni
sobre sus potencialidades en la biodegradación de hidrocarburos, de manera que la
prospección de sus enzimas y metabolitos con este fin resulta interesante y novedosa.
El pireno y el dibenzotiofeno (DBT) se utilizan como compuestos modelos en los estudios de
biodegradación de compuestos aromáticos condensados y aromáticos azufrados (Kanaly &
Harayama, 2000; Li, Zhang, Feng, Cai & Xu, 2007). Numerosos estudios publicados en la
literatura especializada apuntan la utilidad de dichos sustratos en la evaluación de sistemas
biológicos, con el fin de detectar nuevas cepas microbianas con potencialidades biotecnológicas
para la microbiología e ingeniería ambientales (Zheng & Obbard, 2002; Zahra, Gili & Sharareh,
2006; Kim et al., 2007). Para la realización de este trabajo se definieron como objetivos los
siguientes: caracterizar fisiológicamente el cultivo sumergido del basidiomicete marino Nia
vibrissa atendiendo a su crecimiento en medio líquido de Sabouraud suplementado con pireno y
dibenzotiofeno; así como analizar las modificaciones que este provoca en la conductividad y el
pH del medio, como factores de relevancia para el adecuado desarrollo de un microorganismo
in vitro.
MATERIALES Y MÉTODOS
Microorganismos
Se utilizó una cepa del basidiomicete marino de podredumbre blanca Nia vibrissa, aislada de
restos de madera de deriva colectados a lo largo de la zona intermareal de la playa Imías,
provincia Guantánamo, Cuba. La identificación de esta cepa se realizó en el Instituto de
Oceanología del Ministerio de Ciencia Tecnología y Medio Ambiente (Samón-Legrá & Enríquez,
2010), y su aislamiento se garantizó mediante el método indirecto de incubación de sustratos
vegetales en cámara húmeda (Volkmann-Kohlmeyer & Kohlmeyer, 1993).
Inóculos
Los inóculos que se utilizaron fueron obtenidos en placas Petri de 10 cm de diámetro sobre
medio agar extracto de malta (BioCen, 2004). Los cultivos se incubaron a 28ºC durante 7 días,
bajo condiciones de luz natural. Para la inoculación de las fermentaciones se utilizaron
porciones de micelio de 5 mm de diámetro del borde exterior de la colonia.
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ISSN 2072-800x Medios de cultivo
Para la conservación e inóculo se empleó el medio agar extracto de malta (BioCen, 2004). El
medio líquido de Sabouraud (BioCen, 2004) se utilizó para la fermentación sumergida. Este
medio se suplementó con pireno y dibenzotiofeno comercial, grado analítico, sustratos
certificados por la Norma Internacional de Calidad ISO 9001 (Laboratory Chemicals Riedel-de
Haën) a concentración fija para cada ensayo.
Caracterización fisiológica de Nia vibrissa en medio líquido de Sabouraud
Se utilizaron matraces erlenmeyers de 250 mL de capacidad que contenían 50 mL de medio
líquido de sabouraud suplementado con 0,01% de pireno y DBT como tratamientos
independientes. Los matraces fueron inoculados con cinco porciones de micelio de 5 mm de
diámetro del borde de crecimiento activo de la colonia, e incubados en zaranda orbital (modelo
GFL 3300) a 150 r.min-1 durante 15 días a 28ºC. Los controles abióticos se prepararon en
erlenmeyers que contenían medio de cultivo suplementado con los sustratos seleccionados.
Como controles bióticos se utilizaron erlenmeyers con medio de cultivo inoculado con la cepa
de estudio, sin la adición de los hidrocarburos aromáticos policíclicos. Se realizaron dos réplicas
por cada variante. Se determinaron a los tratamientos y controles experimentales los
parámetros pH, conductividad y peso seco de la biomasa como medida del crecimiento fúngico
a los 3, 6, 9, 12 y 15 días de incubación. Se estimó la concentración de glúcidos totales para el
monitoreo del consumo de la fuente de carbono según el método fenol/sulfúrico descrito por
Dubois, Gilles, Hamilton, Rebers & Smith (1956).
Determinaciones analíticas
pH y conductividad
Las determinaciones de pH y conductividad se realizaron a la temperatura óptima
recomendada para el ensayo (250C), con pH metro/conductímetro digital (ORION, Thermo
Scientific) para los tratamientos con pireno y DBT, control biótico y medio de cultivo sin tratar.
Peso Seco
La biomasa se estimó mediante método gravimétrico. Se colocó papel de filtro (Filter-Lab) a
60°C en la estufa por 24 h, después se enfrío el papel en el desecador por 20 min y se pesó en
balanza analítica (Sartorius BL210S). Se separó el micelio de los extractos crudos mediante
filtración en un embudo Buchner y un matraz kitazato con ayuda de una bomba de vacío. Se
lavó la biomasa con agua destilada y el papel de filtro se colocó en la estufa a 60°C durante 24
h. Se dejó enfriar en un desecador por 20 min y se pesó el papel secante junto con la biomasa
(Castro, 2008). El cálculo del peso de la biomasa se realizó según la ecuación siguiente:
Glúcidos totales
La determinación de la concentración de glúcidos totales presente en los tratamientos se
realizó según el método fenol/sulfúrico descrito por Dubois et al. (1956). En tubos sumergidos
en baño de agua-hielo se adicionó 0,5 mL de muestra; 0,5 mL de fenol 5% (p/v) y 2,5 mL de
H2SO4 concentrado. Se colocaron todos los tubos en baño María durante 15 min a temperatura
de ebullición y luego se enfrió hasta temperatura ambiente. El monitoreo de la absorbancia a
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ISSN 2072-800x 490 nm se realizó mediante método continuo durante 30 s. Se obtuvo una curva de calibración
con medio líquido de Sabouraud empleando una concentración inicial de 5,0 mg.mL-1 para la
interpolación de los datos.
Procesamiento estadístico
Para el procesamiento estadístico de los datos se consideró un diseño completamente
aleatorizado, empleándose el paquete estadístico StatGraphics Plus 5.1. La normalidad de los
datos se comprobó mediante el test de Shapiro-Wilks, y la homogeneidad de varianza se
evidenció por el test de Cochran-Haltley-Bartlet. En la determinación de diferencias entre las
medias se aplicó un procedimiento de comparación múltiple de medias. El método utilizado
consistió en el análisis de las menores diferencias significativas de Fischer (LSD -siglas en
inglés-). Los datos que no se ajustaron a una distribución normal, se analizaron mediante
métodos no paramétricos empleando el paquete estadístico Statistic 6.0.
RESULTADOS
Caracterización fisiológica de Nia vibrissa en Medio Líquido de Sabouraud
Biomasa
En la figura 1, se presentan los datos de biomasa producida por los tratamientos con DBT,
pireno y el control biótico a los 3, 6, 9, 12 y 15 días de fermentación. La cepa en estudio mostró
la capacidad de crecer en el medio de cultivo seleccionado y en medio suplementado con DBT
y pireno a la concentración 0,01% como tratamientos independientes, sin que se identificaran
afectaciones morfológicas visibles en la biomasa respecto al control. El análisis de varianza
para la determinación de las diferencias existentes en la variable analizada para los distintos
niveles, permitió establecer que el crecimiento alcanzado por el hongo fue significativo respecto
a los valores de biomasa al inicio de la fermentación para un nivel de significación α< 0,05.
La curva de crecimiento correspondiente al control biótico mostró un comportamiento típico
para hongos filamentosos en medio líquido agitado. Entre los días 0 y 9 se manifiestan dos
fases importantes del crecimiento: fase de adaptación y fase de crecimiento rápido. En el día 9
de fermentación se obtuvo el máximo valor de biomasa (13,68 g.L-1), y después la velocidad
específica de crecimiento disminuye hasta entrar en la fase de crecimiento neto o autolisis.
Figura 1.Crecimiento del hongo Nia vibrissa durante 15 días de fermentación en erlenmeyers de 250 mL
de capacidad con 50 mL de medio líquido de sabouraud, suplementado con 0,01% de pireno y DBT como
tratamientos independientes a 28ºC y 150 r.min-1 (….. Pireno; _ _ _ DBT; ___ Control Biótico).
Figure 1. Growth of the fungus Nia vibrissa during 15 days of fermentation in 250-mL Erlenmeyers with 50
mL of liquid Sabouraud medium, enriched with 0,01% pyrene and DBT as independent treatments, at
28ºC and 150 r.min-1(….. Pyrene; _ _ _ DBT; ___ Biotic Control).
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ISSN 2072-800x El tratamiento con DBT reveló un perfil de crecimiento caracterizado por tres etapas: una
fase de adaptación de 3 días, fase de crecimiento rápido comprendida entre los días 3 y 6, con
el máximo valor de biomasa para este tratamiento (11,55 g.L-1), seguido de una disminución en
los valores de peso seco correspondiente a una etapa de autolisis aparente, puesto que
después del día 12 el crecimiento del microorganismo revierte su tendencia hacia el aumento
de la biomasa. El tratamiento con pireno reflejó una larga fase de adaptación con duración de 6
días, posteriormente se evidenció un aumento del crecimiento (etapa de crecimiento rápido)
hasta el día 12 de fermentación, con un máximo valor de peso seco (12,48 g.L-1),
manifestándose durante los próximos 3 días una disminución de la biomasa no significativa
estadísticamente. Aunque se detectaron diferencias estadísticamente significativas entre los
grupos analizados respecto al crecimiento para un nivel de significación α<0,05; los valores
máximos de peso seco alcanzado en las variantes no muestran diferencias significativas entre
sí.
pH y conductividad
En las figuras 2 y 3, se muestran los resultados de las determinaciones de pH y
conductividad para los tratamientos con DBT y pireno, control biótico y medio de cultivo. El
medio de cultivo sin tratar no reflejó variaciones significativas en los valores de pH y
conductividad iniciales: 5,2 y 1850,5 µS.cm-1 respectivamente, durante los 15 días de
fermentación. Se notó una ligera disminución de los valores de pH en los grupos estudiados.
Este fenómeno para el DBT y pireno ocurre hasta el tercer día, mientras que para el control
biótico se alarga hasta el día 6. Para los tratamientos y control biótico se manifestó un aumento
en los valores de pH a partir de los límites mencionados anteriormente, alcanzándose niveles
máximos al día 15 de fermentación (7,51 para DBT; 7,81 para pireno; 8,62 para control biótico).
El análisis estadístico demostró que no existen diferencias significativas entre las variantes
analizadas, respecto a los valores de pH registrados a los diferentes días (ANOVA no
paramétrico: test de Kruskal-Wallis: H (14, N= 30) =13,99933; p= 0,4498).
Figura 2.Variación del pH en los tratamientos, control biótico y medio de cultivo, durante 15 días de
fermentación en erlenmeyers de 250 mL de capacidad con 50 mL de Medio Líquido de Sabouraud,
suplementado con 0,01% de pireno y DBT como tratamientos independientes a 28ºC y 150 r.min-1 (…..
Pireno; _ _ _ DBT; ___ Control Biótico; __..__.. Medio de Cultivo).
Figure 2. pH variation in the treatments, biotic control and culture medium, during 15 days of fermentation
in 250-mL Erlenmeyers with 50 mL of liquid Sabouraud medium, enriched with 0,01% pyrene and DBT as
independent treatments, at 28ºC and 150 r.min-1(….. Pyrene; _ _ _ DBT; ___ Biotic Control; __..__.. Culture
Medium).
Los valores de conductividad para el tratamiento con pireno y control biótico poseen un
comportamiento similar entre sí, el cual se caracteriza por un aumento exponencial a partir de
los días 6 y 9 respectivamente, alcanzando valores máximos al día 12 (4030 µS.cm-1 para
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ISSN 2072-800x Conductividad µS.cm ‐1
Pireno y 4407,5 µS.cm-1 para control biótico). Estos valores difieren estadísticamente con los
niveles de conductividad evaluados durante los primeros 6 y 9 días de fermentación,
respectivamente; sin embargo no se detectaron diferencias entre ambas variantes.
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
0 3 6 9 12 15 18
Tiempo (Días)
Figura 3. Variación de la conductividad (µS.cm-1) en los tratamientos, control biótico y medio de cultivo,
durante 15 días de fermentación en erlenmeyers de 250 mL de capacidad con 50 mL de Medio Líquido
de Sabouraud, suplementado con 0,01% de pireno y DBT como tratamientos independientes a 28ºC y
___
DBT; ___ Control Biótico; __..__.. Medio de Cultivo).
150 r.min-1 (….. Pireno;
Figure 3. Variation in the conductivity (µS.cm-1) in treatments, biotic control and culture medium, during 15
days of fermentation in 250-mL Erlenmeyers with 50 mL of liquid Sabouraud medium, enriched with
0,01% pyrene and DBT as independent treatments, at 28ºC and 150 r.min-1(….. Pyrene; _ _ _ DBT; ___
Biotic Control; __..__.. Culture Medium).
El tratamiento con DBT mostró un aumento con tendencia lineal a partir del tercer día de
fermentación, obteniéndose un punto de máxima conductividad al día 15 (5242,5 µS.cm-1). Este
tratamiento mostró los niveles más elevados de conductividad durante todo el proceso
fermentativo. A partir del día 12 los valores de conductividad observados en este tratamiento
difieren estadísticamente de los estimados durante los 9 primeros días de incubación. En la
gráfica se aprecia como permanecen sin variación los valores de conductividad para el medio
de cultivo sin tratar durante toda la fermentación.
Concentración de glúcidos totales
La concentración de glúcidos totales presentes en los tratamientos y el control biótico
permitió estimar el consumo de carbohidratos por la cepa objeto de estudio (Fig. 4). El
tratamiento con DBT y el control biótico durante los seis primeros días de fermentación,
mostraron una rápida y significativa disminución en la concentración de glúcidos totales, en un
rango entre 20 mg.mL-1 hasta 1,18 mg.mL-1 y 2,29 mg.mL-1 respectivamente. El perfil de estas
curvas se caracteriza por una pendiente abrupta. A partir del día seis estos grupos no
mostraron variaciones significativas manteniéndose prácticamente constante hasta el día 15 de
fermentación.
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ISSN 2072-800x Figura 4. Concentración de glúcidos totales en los tratamientos y control biótico, durante 15 días de
fermentación en erlenmeyers de 250 mL de capacidad con 50 mL de Medio Líquido de Sabouraud,
suplementado con 0,01% de pireno y DBT como tratamientos independientes a 28ºC y 150 r.min-1 (…..
Pireno; _ _ _ DBT; ___ Control Biótico). Los valores están referidos como mg.mL-1 de dextrosa.
Figure 4. Total glucide concentration in the treatments and biotic control during 15 days of fermentation in
250-mL Erlenmeyers with 50 mL of liquid Sabouraud medium, enriched with 0,01% pyrene and DBT as
independent treatments, at 28ºC and 150 r.min-1 (….. Pyrene; _ _ _ DBT; ___ Biotic Control). Values are
referred as mg.mL-1 of dextrose.
El análisis estadístico entre estas dos variantes no mostró diferencias intraespecíficas
significativas. El tratamiento con pireno reflejó un perfil que asemeja una diauxia invertida,
compuesta por tres fases: fase inicial de consumo de carbohidratos (3 días de duración; 10,85
mg.mL-1), fase de adaptación corta con una concentración al día 6 de 9,03 mg.mL-1, seguido de
una abrupta disminución de la concentración de glúcidos totales hasta el día 9 (1,38 mg.mL-1), a
partir del cual los valores presentan poca variación hasta el final de la fermentación (1,05
mg.mL-1). Este tratamiento solamente mostró diferencias significativas con el control biótico y la
variante con DBT al día 6 de fermentación.
DISCUSIÓN
Caracterización fisiológica de Nia vibrissa en Medio Líquido de Sabouraud
Comparado con otros microorganismos, los hongos marinos han sido pobremente
investigados, aunque en general el interés por el estudio de la microbiota asociada a hábitats
marinos y estuarinos aumenta considerablemente (Liberra & Lindequist, 1995). Los hongos
marinos que habitan entre los granos de arena de las playas se conocen como hongos
arenícolas. Este grupo posee una importancia ecológica relevante porque sus miembros
desempeñan importantes funciones como descomponedores primarios de muchos sustratos
orgánicos, principalmente lignocelulósicos, por lo que contribuyen a mineralizar y reciclar los
nutrientes en ese ambiente (Hyde et al., 1998). En este grupo se encuentra la especie Nia
vibrissa, basidiomiceto recientemente aislado en playas de Cuba.
Adecuadas condiciones de cultivo, constituyen un requisito indispensable para la máxima
producción de micelio y la síntesis continua de sustancias biológicamente activas, factores de
singular relevancia en la remoción de estructuras orgánicas recalcitrantes en el ambiente. De
acuerdo con estudios realizados por Helmholz, Etoundi & Lindequist (1999), N. vibrissa
constituye un hongo marino que puede ser cultivado in vitro fácilmente en medios sintéticos y
complejos. Muestra adecuado crecimiento bajo condiciones estándar comparado con otras
especies fúngicas marinas y terrestres, de manera que no es un evento raro el crecimiento
mostrado en medio líquido de sabouraud de la cepa relativa a nuestro estudio.
Como se constata, la adición al medio de cultivo de concentraciones de 0,01% de pireno y
DBT, no afectó el crecimiento de forma significativa en sus términos más generales, debido a
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ISSN 2072-800x que en ambos tratamientos se observó un curso temporal del crecimiento que incluyó las fases
principales en que se divide la progresión de la biomasa fúngica en medio líquido agitado.
Además, no se observó afectación en la morfología de los pellets formados respecto al control
biótico. Ambos resultados apoyan la idea de que la concentración de hidrocarburos aromáticos
seleccionada, no resultó letal para el crecimiento del hongo en las condiciones en que se realizó
la fermentación.
El tratamiento con DBT muestra una fase de adaptación de igual duración respecto al
control, aunque su fase de crecimiento rápido es mucho más corta con solo 3 días de duración
en comparación con los seis que muestra el control biótico. Esta reducción se puede entender
como una respuesta fisiológica del hongo a los efectos de toxicidad del hidrocarburo, que
resultan más evidentes en la extensa etapa de autolisis aparente que experimenta este
tratamiento. Esta fase, caracterizada por el desequilibrio que genera la muerte de un mayor
número de células en el cultivo, se interpreta también como una etapa que el microorganismo
utiliza para reajustar su maquinaria metabólica bien en favor del crecimiento o del
mantenimiento celular en condiciones de estrés; lo cual se sustenta en la reanimación de este
parámetro a partir del día 12 de incubación.
Sin embargo, los efectos de toxicidad del pireno pudieran explicarse solo en la primera fase
del crecimiento del hongo, en la cual, el valor mínimo de peso seco alcanzado difiere
significativamente del control, y se evidencia una fase de adaptación más extendida que en el
resto de las variantes. Una vez superada esta barrera fisiológica por el microorganismo, el curso
temporal del crecimiento se manifiesta sin graves desviaciones.
Gómez-Bertel et al. (2008) en trabajos realizados con la especie Phanaerochaete
chrysosporium, plantean la existencia de mecanismos adaptativos asociados a tolerancia
genética, que pueden surgir en hongos terrestres por la exposición prolongada a compuestos
orgánicos persistentes. Durante el tratamiento, la cepa desarrolla de manera paralela varios
mecanismos inmediatos o progresivos que permiten adquirir tolerancia a diferentes entidades
moleculares como son: derivados fenólicos, metales pesados y colorantes sintéticos. Los
mecanismos son disímiles: engrosamiento de la pared celular que favorece la biosorción de
mayor cantidad de xenobióticos, síntesis de sustancias activas como las melaninas y la
producción de ácidos orgánicos. El efecto cooperativo de estos mecanismos probablemente se
relacione con el aumento de la biodisponibilidad, disminuyendo la tensión superficial entre los
hidrocarburos y el medio acuoso, lo que proporciona mayor accesibilidad al microorganismo.
Nuestros resultados concuerdan con los informados por Castro (2008) en la degradación de
fenantreno por cepas de hongos terrestes (Aspergillus sp., Phanaerochaete chrysosporium y
Penicillium pinophillum), quien evidenció que no se manifestaron efectos de toxicidad del
hidrocarburo empleado sobre el crecimiento fúngico en el rango de concentraciones 0,05 – 0,5
g.L-1. Asimismo D´Annibale, Rosetto, Leonardi, Federic & Petroccioli (2006) informaron el
crecimiento y desarrollo de especies de basidiomicetos terrestres (Allescheriella sp., Phlebia
sp.) en presencia de hidrocarburos aromáticos policíclicos como el naftaleno, antraceno y
derivados de estructura análoga, alcanzando tasas máximas de 12 g.L-1, con las que nuestros
resultados son comparables. Salmanov, Aliyeva, Veliyev & Bekrashi (2008) mostraron un amplio
estudio donde comprobaron el crecimiento de varios géneros fúngicos (Aspergillus sp., Mucor
sp., Fusarium sp.) en matrices petrolizadas (Keroseno, Diesel, Petróleo crudo), demostrando
que estos microorganismos utilizan las fracciones aromáticas como fuente de carbono y
energía, con lo cual encausan el metabolismo de las mismas hacia el aumento de la biomasa.
Dos razones resaltan la importancia de este estudio: las diferencias significativas en el
crecimiento alcanzado por N. vibrissa entre el inicio y final de la fermentación, así como con los
picos máximos de producción de biomasa - la producción de cantidades significativas de
biomasa aumenta el área superficial disponible para la remoción (Kaćar et al., 2002; Qingbiao et
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ISSN 2072-800x al., 2004; Iqbal & Saeed, 2007) - y el hecho de que no se encontraron informes referentes a la
aplicación de N. vibrissa en la degradación de los hidrocarburos seleccionados.
pH, conductividad y glúcidos totales
Entre los factores que influyen en el cultivo de un microorganismo en condiciones de
laboratorio se encuentran el pH y la salinidad del medio. Nia vibrissa fue cultivado durante 15
días en medio líquido agitado con valores iniciales de pH y conductividad fijos, durante este
tiempo y producto de la actividad metabólica del microorganismo, las condiciones del cultivo
están sujetas a múltiples variaciones que pueden influir significativamente en su
comportamiento fisiológico (Jones, 2000).
Contrario a lo esperado, el pH del medio de cultivo sometido a tratamiento con
microorganismo tanto en presencia de HAP como en el control biótico, tiende a aumentar. Al
inicio de la fermentación se manifiesta en todos los casos una leve disminución de los valores
de pH, la cual puede estar relacionada con el metabolismo oxidativo inicial de aquellos
componentes del medio que constituyen la fuente de carbono más accesible, y con el rápido
consumo de glúcidos en los primeros 6 días de crecimiento, lo que conlleva a una acumulación
de ácidos orgánicos en el cultivo. Toda vez que el basidiomiceto supera la fase de crecimiento
lento, el pH aumenta progresivamente hasta alcanzar valores cercanos a los límites de la
alcalinidad.
La especie objeto del estudio fue cultivada a pH inicial 5,7. Curran (1980) planteó que
muchos hongos marinos crecen mejor a pH ligeramente ácidos. Este hecho también es una
realidad aceptada para la mayoría de los hongos terrestres. Sin embargo, el hábitat natural
donde este tipo de microorganismos desarrolla su nicho ecológico, muestra niveles de pH en el
rango de la neutralidad. Helmholz et al. (1999) mostraron que Nia vibrissa cultivado en medio
sintético, con glucosa como fuente de carbono a pH 7,5, incrementaba su crecimiento cerca de
19 veces en términos de peso seco de la biomasa. De este modo el atípico aumento en los
niveles de pH en la medida que avanzó la fermentación pueden ser explicados teniendo en
cuenta lo planteado por Damare, Raghukumar, Muraleedharan & Raghukumar (2006a y b),
quienes afirmaron que a pesar de que los hongos terrestres generalmente muestran óptimo
crecimiento a pH entre 4,5 - 6,0, los hongos marinos facultativos, crecen y producen muchas
de sus enzimas extracelulares a pH entre 7-8. Además es probable que el microorganismo
modifique su metabolismo, en la dirección de establecer condiciones semejantes a las del
medio natural en que se desarrolla, así los valores de pH 7,5 para DBT; 7,8 para pireno; 8,6
para el control biótico, se encuentran más cercanos al pH del agua de mar, que al pH inicial del
medio de cultivo en que se inoculó nuestro modelo biológico.
Una última razón se relaciona con el consumo de la fuente de carbono. El carbohidrato
predominante en el medio de cultivo utilizado es la dextrosa. Según muestra la curva de
glúcidos totales, desde el inicio de la fermentación hasta el sexto día tiene lugar una rápida
disminución de este parámetro en todas las variantes, aunque en el tratamiento con pireno se
alarga hasta el noveno día. Se puede considerar entonces, que la fuente de carbono más
sencilla y asequible, se encuentra prácticamente agotada en un estadío temprano del
crecimiento, con lo cual el microorganismo comienza a metabolizar oxidativamente las peptonas
del medio de cultivo, generando amonio como producto final, que contribuye a alcalinizar el
medio.
Otro importante factor para el cultivo de hongos marinos lo constituye el nivel de salinidad
del medio. Una característica primordial de los anteriores, respecto a los hongos terrestres, es
su alta tolerancia respecto a este factor. Muchos microorganismos que habitan las costas
exigen condiciones de salinidad estrictas para su crecimiento. Nia vibrissa se considera
facultativo en cuanto a salinidad. Sin embargo, al igual que sucedió con el pH, la conductividad
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ISSN 2072-800x en el medio de cultivo experimentó un abrupto aumento de sus niveles en todas las variantes.
Este comportamiento puede deberse a varios factores. La presencia de altas concentraciones
de iones sodio en el agua de mar, confiere propiedades únicas a las células de los organismos
marinos. El sodio, incluso en pequeñas concentraciones, resulta tóxico a la mayoría de las
células vivientes en ambientes de agua dulce. La evolución ha resuelto este inconveniente en
los organismos marinos por medio de un eficiente funcionamiento de una ATPasa responsable
del eflujo de sodio (Benito, Garcia- Deblás & Rodriguez-Navarro, 2002), con la cual la cepa
evaluada regula los niveles iónicos del medio en que se encuentre.
Por otro lado, los organismos marinos necesitan mantener un potencial de agua menor que
la del medio circundante, que permita a sus células la entrada de agua mediante ósmosis. Los
hongos marinos mantienen este gradiente debido a la acumulación de osmolitos como glicerol,
manitol, polioles y trealosa (Blomberg & Adler, 1992). Es posible que esta retención osmótica
interna, se acompañe con una mayor actividad en los transportadores que controlan el bombeo
hacia el exterior celular de iones eléctricamente cargados, que contribuirían al aumento de la
conductividad en el medio extracelular.
Otro aspecto a considerar sería el efecto de la adición de los HAP. Probablemente la presión
selectiva que ejerce el medio de cultivo sobre el microorganismo, permite que se potencie la
actividad de varios transportadores iónicos en el sentido del eflujo, como alternativa para
establecer condiciones más adecuadas para el crecimiento o la degradación de los
hidrocarburos. Aunque en este último caso, el hecho que el control sin tratar muestre similar
aumento de la conductividad, hace que nos inclinemos por una razón ecológica: el
microorganismo altera las condiciones del medio de acuerdo a potencialidades genéticas
seleccionadas evolutivamente o bien adecua su dotación genética en el sentido de la
supervivencia.
CONCLUSIONES
Estos resultados constituyen un aporte científico novedoso a la ecología y fisiología de
hongos marinos, resulta la primera investigación fisiológica de Nia vibrissa en Cuba, en el cual
se comprobó el crecimiento de la cepa estudiada en presencia de hidrocarburos aromáticos
policíclicos, así como el aumento significativo del pH y la conductividad en un medio complejo
en condiciones de laboratorio.
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