1 caracterización histopatológica de nervios
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1 caracterización histopatológica de nervios
2do Congreso Virtual de Ciencias Morfológicas. 2da Jornada Científica Virtual de la Cátedra Santiago Ramón y Cajal. CARACTERIZACIÓN HISTOPATOLÓGICA DE NERVIOS ISQUIÁTICOS DE RATONES TRANSGÉNICOS CON ATAXIA ESPINOCEREBELOSA TIPO 2. Virginia Villanueva Espinosa1, Andrés Dovale Borjas2, Melvis Taylín Zumeta Dubé3, María de la C. García Barceló4, Yamila Rodríguez Cruz5, Mónica Fernández Jiménez6, Julio César García Rodríguez7. 1- Residente de 4to año de Histología. ICBP: “Victoria de Girón”. La Habana. Cuba. 2- MsC. Profesor Titular y Consultante. Especialista de segundo grado en Histología, ICBP: “Victoria de Girón”. La Habana. Cuba. 3- Profesora Auxiliar. Especialista de primer grado en MGI e Histología, ICBP: “Victoria de Girón”. La Habana. Cuba. 4- MsC. Profesora Auxiliar. Especialista de segundo grado en Histología, ICBP: “Victoria de Girón”. La Habana. Cuba. 5- Profesora Asistente. Especialista de primer grado en MGI e Histología, ICBP: “Victoria de Girón”. La Habana. Cuba. 6- Profesora Auxiliar. Especialista de segundo grado en Histología, ICBP: “Victoria de Girón”. La Habana. Cuba. 7- Dr. CS. Profesor titular de Bioquímica. Investigador titular. Correo electrónico: e-mail: [email protected] RESUMEN Introducción: Las enfermedades neurodegenerativas, constituyen un grave problema de salud. Entre ellas la ataxia espinocerebelosa tipo 2 (SCA2) es la más común en Cuba. Sin embargo con relación a los cambios histológicos de los nervios periféricos, en particular los nervios isquiáticos, resultan insuficientes las investigaciones realizadas y las reportadas por la literatura; a pesar de que los estudios electrofisiológicos plantean que en el sistema nervioso periférico una de las estructuras que primero se afectan son los nervios periféricos. Objetivo: determinar las alteraciones de las histológicas de los nervios isquiáticos en ratones transgénicos con SCA2. 1 características Material y métodos: Se utilizaron como modelo biológico ratones machos, transgénicos y homocigóticos de la línea FO66. Se conformaron dos grupos uno control y otro de ratones transgénicos. Se efectuó el estudio histológico de los nervios, los que fueron procesados por el método de la parafina. Se realizó el estudio histoquímico e inmunohistoquímico de estos nervios. Resultados: En los nervios isquiáticos de los ratones transgénicos con SCA2, se observaron alteraciones histológicas como fibras con internodos mielinizados más cortos y de diámetro menor, incremento en el número de células (células de Schwann y macrófagos), así como adelgazamiento del endoneuro y el perineuro; mientras que en los ratones controles las características histológicas de estos nervios fueron normales. Conclusiones: Las alteraciones histopatológicas observadas son compatibles con desmielinización segmentaria y degeneración axonal del nervio periférico estudiado. INTRODUCCIÓN Las enfermedades neurodegenerativas constituyen un grave problema de salud. Se caracterizan por ser discapacitantes al provocar un deterioro neurológico progresivo, acompañado de una disminución en la funcionalidad e independencia personal. Entre ellas se encuentran las ataxias espinocerebelosas 1. El término ataxia es referido a un estado patológico en la coordinación de los movimientos. Se utiliza para describir un trastorno de la marcha caracterizado por inestabilidad e incoordinación motora, que afecta fundamentalmente las manos, los brazos, las piernas, el habla y los movimientos oculares; así como hipotonía e hipotrofias dístales, pudiendo ser causada por varias condiciones médicas o neurológicas 2. Las ataxias hereditarias se distinguen en dos grandes grupos, las ataxias cerebelosas autosómicos recesivas (ARCA) y las ataxias cerebelosas autosómicas dominantes (ADCA); que resultan de una disfunción a nivel del cerebelo y de sus vías aferentes y eferentes, así como alteración en la médula espinal, nervios periféricos o una combinación de estas tres condiciones 2. Las autosómicas dominantes se conocen como ataxias espinocerebelosas (SCA), caracterizadas por una gran variedad clínica, patológica y molecular2-8. Estudios epidemiológicos indican que la SCA2 es la segunda entre las ataxias espinocerebelosas con mayor frecuencia mundialmente; representa el 15% de todas las SCA, y el 33% de las SCA 7. El comportamiento epidemiológico a nivel mundial de la SCA2, está estimado en 5 a 7 casos por cada 100 000 habitantes, aunque en poblaciones particulares, esta puede ser elevada como consecuencia de la procedencia de sus 2 fundadores 2, 3, 5, 6. Anualmente nacen 22 niños portadores del gen, enferman 35 nuevos casos y fallecen 15 enfermos 6. La ataxia espinocerebelosa tipo 2 (SCA2), es la más común en Cuba 2-8 . Las más elevadas tasas de incidencia y prevalencia a nivel mundial han sido encontradas en la provincia Holguín, donde radica el 70% de los individuos enfermos con SCA2 en el país 7, 8 . La edad de inicio varía desde 3 a 79 años, no reportándose diferencias significativas en la edad de inicio entre masculinos (media 32,1 ± 13,6) y femeninos (media 32,7 ± 13,4) 6, 7 . La edad de inicio de la enfermedad disminuye de generación en generación como consecuencia del fenómeno de anticipación genética 9. La SCA2 tiene un fenotipo clínico muy variable6, 7, 9. El síntoma inicial más frecuente es la alteración de la marcha en el 94,28 % de los enfermos 6, mientras que en el 5,72% son la disartria cerebelosa, la dismetría, la adiadococinesia y los movimientos oculares enlentecidos2, 6, 9 . El curso clínico hasta la incapacidad para caminar se extiende por 4 a 10 años, ocurriendo la muerte entre los 12 y 25 años después de la manifestación de los primeros síntomas2, 5, 7, 10 . La enfermedad progresa rápidamente cuando se inicia antes 2 de los 20 años . En la SCA2, se han encontrado alteraciones estructurales en el cerebelo, tronco encefálico y médula espinal, en estudios electrofisiológicos realizados existen alteraciones presintomáticas en los nervios medianos y tibiales. Lo que sugiere que el mecanismo no está solo confinado al sistema nervioso central (SNC) 2, 10 y que el sistema nervioso periférico (SNP) pudiera estar severamente comprometido, sin embargo resulta escasa la literatura que argumente alteraciones histológicas de sus componentes. En ensayos preclínicos desarrollados en especies animales como ratas y ratones, el ratón ha sido considerado el biomodelo ideal. Estos estudios han sido de gran importancia para el esclarecimiento de los mecanismos moleculares implicados en el proceso patológico y para la evaluación de estrategias terapéuticas potenciales 9. En ellos se han realizado estudios de habilidad y aprendizaje motor11, 12. En Cuba también se ha generado un modelo transgénico de ratón de SCA2, con el que se realizan estudios de coordinación motora e inmunohistoquímica en neuronas de Purkinje, células cerebrales, hepáticas, musculares, pulmonares y renales 13, 14 . No obstante, el estudio de las características histológicas de los nervios periféricos, en particular de los nervios isquiáticos, aún resulta incipiente, a pesar de la comprobada alteración funcional observada en humanos y ratones transgénicos, de la hipotonía e hipotrofias dístales, y de la alta incidencia y prevalencia de SCA2 en el país. La presente investigación constituye un estudio que se propone describir las características histológicas los nervios periféricos en ratones transgénicos con SCA. Los 3 hallazgos de la presente investigación contribuirán a un mejor conocimiento de esta entidad nosológica, lo que sería de gran importancia pues permitiría incidir con mayor efectividad sobre este serio problema médico social. Estudiar esta enfermedad y encontrar vías de solución al mismo constituye uno de los problemas de la salud pública, en el cual también participa nuestro país. Objetivo: Determinar las alteraciones de las características histológicas en los nervios isquiáticos de ratones transgénicos con SCA2. MATERIAL Y MÉTODOS Se realizó un trabajo experimental sobre la base de un estudio prospectivo y descriptivo, donde se utilizaron ratones machos, transgénicos y homocigóticos de la línea FO66 como modelo biológico, que se obtuvieron del cruce de ratones OF1 ♂ y B6D2F1 ♀. Las crías fueron proporcionadas por el Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB). Se emplearon ocho ratones FO66, a razón de tres o cinco animales/caja según grupo. Los animales se conservaron en las instalaciones para roedores del CENPALAB y se mantuvieron en adecuadas y similares condiciones higiénicas y ambientales, según las normas establecidas para animales de experimentación regidas por los Procedimientos Operacionales de Trabajo (POT) afines establecidas en el CENPALAB. Se conformaron dos grupos con ratones híbridos FO66 cada uno, un grupo control constituido por tres animales y un grupo de ratones transgénicos atáxicos formado por cinco animales. Los animales del grupo de ratones transgénicos atáxicos eran homocigóticos dominantes para el gen SCA2, y los del grupo control eran producto del mismo cruce parental, pero carentes del gen. Los animales fueron destetados a los 21 días de vida postnatal y al año de vida se practicó la eutanasia. Procesamiento del material Los ratones fueron anestesiados con pentobarbital sódico por vía intraperitoneal, a una dosis de 40 mg/Kg de peso corporal. Para la eutanasia e inicio de la fijación se realizó la perfusión intracardiaca con formalina al 12 %, después de muertos los animales, se colocó al ratón en decúbito supino y ubicando una de las extremidades posteriores por encima de la otra se realizó una incisión desde la cresta ilíaca hasta la articulación de la rodilla. Se separó la piel para observar el rafe aponeurótico de los músculos bíceps femoral y semitendinoso, a 0.5 cm por debajo de este, se abordó el nervio isquiático por disección, obteniendo un segmento de aproximadamente 2 cm del mismo Estudio histológico 4 15 . Los nervios fueron fijados en formalina tamponada neutra al 12%. Posteriormente fueron 16 lavados en agua corriente y se procesaron por el método de la parafina . Se realizaron cortes de 6 μm de grosor en un micrótomo vertical marca Spencer. Las Láminas fueron coloreadas con Hematoxilina y Eosina (H/E) y con la técnica tricrómica de Mallory siendo observadas en un microscopio NIKON COOLSCOPE con objetivo de 40x de magnificación. Se analizaron las características morfológicas de los nervios periféricos (las fibras nerviosas y las vainas envolventes de tejido conectivo), dentro de las que se exploraron: signos de desmielinización segmentaria (lesión que afecta algunas zonas con sus correspondientes internodos y respeta otras), signos de degeneración axonal, signos de fibrosis del endoneuro y perineuro, o la presencia de reacción inflamatoria17. Estudio inmunohistoquímico Para identificar la naturaleza de las células observadas en los cortes de nervios de ratones del grupo experimental, coloreadas con Hematoxilina y Eosina, a las muestras tomadas y procesados por el método de la parafina se le realizaron cortes histológicos de 6 μm de grosor en un micrótomo vertical marca Spencer. Se procesaron mediante inmunohistoquímica por el método Avidina-Biotina Inmunoperoxidasa 18 . Se utilizó como anticuerpo primario un monoclonal para detectar subpoblaciones de macrófagos: CD68 18 . Los cortes fueron contrastados con Hematoxilina de Mayer por 1 min y observados en un microscopio NIKON COOLSCOPE. Se consideraron como positivas las células que presentaban el citoplasma coloreado de rojo parduzco18. y se tuvo en cuenta la intensidad de la inmunotinción para CD68, esta fue clasificada semicuantitativamente usando cuatro puntos según escala 18 , la cual fue ajustada para este estudio: 0= no hay inmunotinción, 1= inmunotinción débil, 2= inmunotinción moderada, 3= inmunotinción fuerte o intensa. RESULTADOS Al analizar el grupo control, se observó que en las muestras teñidas con hematoxilina y eosina y con la coloración especial de Mallory, los nervios mostraron un aspecto normal. Los nervios seccionados en cortes transversales, mostraron el sitio ocupado por la mielina como un pequeño espacio vacío y se constató la presencia del axón en posición central o algo desviado hacia alguno de los lados. En la superficie exterior del espacio que ocupaba la mielina, se observaron los núcleos de las células de Schwann. El endoneuro, perineuro y epineuro no mostraron alteraciones (figura 1). En ninguno de los animales del grupo control se observaron signos de desmielinización segmentaria, degeneración axonal, fibrosis del endoneuro ni del perineuro, ni reacción inflamatoria en ninguno de los nervios estudiados. 5 Al examinar el grupo de ratones transgénicos atáxicos, se observó que en todos los animales algunas fibras de los nervios seccionados transversalmente y coloreados con hematoxilina y eosina, no mostraban el sitio ocupado por la mielina de forma precisa y regular (figura 2). En algunos casos el axón se encontró ausente dentro de la fibra. Fig. 1. Fotomicrografías de nervios de ratones del grupo control en corte longitudinal (A) y transversal (B) que muestran el endoneuro (flechas) y el perineuro (*). Se observan características histológicas normales. Coloración Tricrómica de Mallory. Magnificación: 1000 X (A), 540X (B). Fig. 2. Fotomicrografía de un nervio de un ratón atáxico donde se observan fibras nerviosas en cortes transversal y longitudinal que muestra los sitios ocupados por la mielina de forma irregular (flechas). Coloración H/E. Magnificación 1140X. En las muestras de cortes oblicuos y en las de corte longitudinal, impresionó que en cuatro animales, la mayor parte de las fibras presentaban los internodos mielinizados más cortos y su diámetro más delgado que los observados en el grupo control, rodeados 6 por fibras con apariencia normal. En ellos además se percibió la presencia de numerosas células, las que parecían corresponder con células de Schwann y macrófagos entre las fibras nerviosas. El estudio inmunohistoquímico para macrófagos con el anticuerpo primario monoclonal CD68, mostró inmunotinción débil ante la presencia de abundantes células en los nervios periféricos de los ratones transgénicos atáxicos (figura 3). Fig. 3. Fotomicrografía de un corte transversal de un nervio periférico en un ratón del grupo de ratones transgénicos atáxicos que muestra la presencia de macrófagos (flechas). Técnica Inmunohistoquímica para CD 68. Magnificación 2700 X. En las láminas teñidas con la coloración especial de Mallory, al corte longitudinal se observó el perineuro, rodeando al fascículo del nervio, más delgado que el observado en el grupo control, y en el interior del mismo cada fibra revestida por escaso tejido conectivo laxo del endoneuro (figura 4A). 7 Fig. 4. Fotomicrografías de nervios de ratones transgénicos atáxicos en corte longitudinal (A) y transversal (B). En A se observa el escaso endoneuro y el perineuro delgado (flechas). En B se muestran anillos acidófilos concéntricos en el espacio ocupado por la mielina (flechas). Coloración Tricrómica de Mallory. Magnificación: 1000 X (A), 540X (B). Las fibras de los nervios seccionados en cortes transversales, mostraban el sitio ocupado por la mielina como un pequeño espacio vacío e irregular, y en cuatro de estos animales se observó, en numerosas fibras, este espacio ocupado por un anillo acidófilo concéntrico, en presencia o no del axón (figura 4B), rodeados por fibras con apariencia normal. En ninguno de los animales del grupo de ratones transgénicos atáxicos se observaron signos de degeneración axonal del tipo de tumefacción, ni fragmentación del axonal con presencia de ovoides de mielina. Tampoco fueron observados fibrosis del endoneuro ni del perineuro, ni vasos sanguíneos dilatados. DISCUSIÓN Las características histológicas observadas en los nervios isquiáticos del grupo control fueron normales. No mostraron signos indicativos de daños en su estructura histológica, tales como desmielinización segmentaria, degeneración axonal, fibrosis del endoneuro ni del perineuro, ni reacción inflamatoria en ninguno de los nervios de los animales de este grupo. Sin embargo en la presente investigación, en el estudio histológico de los nervios isquiáticos de ratones transgénicos atáxicos, se observó que en algunas fibras nerviosas el sitio correspondiente a la mielina era impreciso e irregular, en la mayoría de las fibras el axón se localizó en posición central o algo excéntrico, y en algunos casos no se observó la presencia del axón, lo que coincide en algunos aspectos con lo descrito por la literatura para diferentes enfermedades neurodegenerativas 17 . La existencia de internodos más cortos y de diámetros más delgados, observados en los cortes oblicuos y longitudinales de los nervios de animales transgénicos atáxicos, sugiere la presencia de signos de remielinización descritos en la literatura 17 . Y la presencia de anillos acidófilos concéntricos localizados en los pequeños espacios que corresponden a los ocupados por la mielina, pudieran estar en relación con el citoplasma de las células de Schwann e indicar los signos de desmielinización y remielinización que se han planteado en diferentes estudios 17, 20, 21 . Se considera que la acumulación de prolongaciones de las células de Schwann, observados al corte transversal, se presentan como ovillos de citoplasma celular que rodean el axón, a lo que se le ha denominado “bulbos de cebolla”, modificaciones 8 estructurales que forman parte de las que ocurren en la desmielinización segmentaria 17 . La desmielinización primaria puede exhibir detritus de mielina en el citoplasma de las células de Schwann, con separación, vacuolización o con ambos fenómenos de las vainas electrondensas de mielina; el axón puede estar desnudo de mielina pero ser normal 17, 21 . Los resultados del presente trabajo mostraron que en ninguno de los animales del grupo de ratones transgénicos atáxicos, se observó tumefacción, ni fragmentación del axonal con presencia de ovoides de mielina, sin embargo si se percibió la presencia de numerosas células, las que parecían corresponder con células de Schwann y macrófagos entre las fibras nerviosas. El reclutamiento de macrófagos ha sido considerado por numerosos autores como signo de degeneración axonal walleriana 17, 20, 21. La atrofia axonal, que es uno de los cambios degenerativos, se reconoce por el tamaño menor del axón en relación a la vaina de melina circundante, la cual puede mostrar un aspecto corrugado compensatorio; asimismo, la célula de Schwann exhibe un engrosamiento del citoplasma, que puede extender una lengüeta de dicho citoplasma y separar el axón 22 . Las alteraciones de la mielina observadas como pequeños espacios vacíos e irregulares y anillos acidófilos concéntricos, en cuyo interior se visualiza o no el axón, pudiera indicar signos de degeneración axonal de tipo degeneración walleriana, donde los axones se disuelven y la mielina se rompe e invade el sitio del axón; formando ovoides de mielina La no 17, 21 apreciación . de tumefacción, ni fragmentación axonal con presencia de compartimentos ovalados pequeños (ovoides de mielina), pudiera estar en relación con la técnica histológica empleada, pues las muestras se procesaron por el método de la parafina, se obtuvieron cortes de 6 um y fueron observados en un microscopio fotónico de campo brillante. La presencia de células que parecen corresponder con macrófagos, entre numerosas fibras nerviosas, sugiere una posible lesión, ya que la apreciación de estas células inflamatorias en esta localización es una de las características reportadas en biopsias y necropsias de humanos y animales con nervios periféricos lesionados o dañados 17, 20, 21 . La respuesta macrofágica en la degeneración walleriana es clave para la iniciación del proceso de regeneración 21 . El endoneuro es invadido por macrófagos que penetran la membrana basal de la célula de Schwann (que permanece intacta) para ejercer su trabajo de limpieza de detritus celulares 17, 21 . Los macrófagos liberan interleucinas que estimulan a la célula de Schwann (probablemente también a fibroblastos) para la producción del factor de crecimiento nervioso y factor 1 similar a insulina. Así, una fibra degenerada es remplazada por varias yemas axonales 21 . Y por otra parte también en la desmielinización segmentaria las fibras nerviosas pueden tener macrófagos que fagocitan y eliminan los restos de mielina 21 . 9 Sin embargo, el marcaje ligero que se observó en el análisis inmunohistoquímico para macrófagos pudiera estar en correspondencia con que el anticuerpo utilizado no era específico de la especie. Y por otra parte, debe tenerse en consideración que se trate de otro tipo celular, pues en algunos tipos de enfermedades neurodegenerativas espinocerebelosas se ha descrito que el núcleo de las células en muchos órganos, como las células de Schwann en las raíces de los ganglios posteriores y los nervios periféricos, muestran agrandamiento del núcleo de la célula entre dos y cinco veces del tamaño normal y gliosis 23 . Por lo que este hallazgo pudiera corresponderse con células de Schwann que también tienen función fagocítica en el proceso de degeneración. Otra característica que ha sido observada en las enfermedades degenerativas espinocerebelosas, es la degeneración de neuronas sin cambios histológicos significativos que se produce en las zonas afectadas 23 . Aspecto que parece corresponderse con el hecho de que en uno de los animales de la presente investigación, se apreciaron axones con características histológicas de apariencia normal. En el presente estudio tampoco fueron observados fibrosis del endoneuro ni del perineuro, sin embargo si se apreció un aparente adelgazamiento del perineuro y del endoneuro de los nervios de los ratones transgénicos atáxicos, lo que es atribuido por algunos autores a enfermedades neurodegenerativas 17, 21 . CONCLUSIONES En los nervios isquiáticos de los ratones transgénicos atáxicos con SCA 2, se encontraron alteraciones histológicas tales como fibras nerviosas con internodos mielinizados más cortos y su diámetro más delgado, e incremento en el número de macrófagos en el endoneuro, elementos que son compatibles con desmielinización segmentaria y degeneración axonal. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Layzer RB. Enfermedades degenerativas del sistema nervioso: Ataxias cerebelosas hereditarias y trastornos relacionados. En Bennett JC, Plum F, eds. Cecil Tratado de Medicina Interna. México: McGrawHill Interamericana; 1998. p. 236870. 2. Velásquez L. Ataxia Espinocerebelosa tipo 2: principales aspectos en el diagnóstico, pronóstico y evaluación de la enfermedad. 1era ed. Holguín (Cuba):20 Aniversario; 2008. p 17. 3. Velázquez Pérez L, Sánchez Cruz G, Santos Falcón N, Almaguer Mederos LE, Escalona Batallan K, Rodríguez Labrada 10 R, et al. 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