Regulación de la respuesta inflamatoria inducida por ácidos grasos

Regulación de la respuesta inflamatoria inducida por ácidos grasos

Regulación de la respuesta inflamatoria inducida por ácidos grasos
en macrófagos: papel de la lipina-2
Martín Valdearcos Contreras
Instituto de Biología y Genética Molecular, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC),
Universidad de Valladolid, 47003 Valladolid, España
April 15, 2011
El tipo de vida impuesto por la sociedad moderna caracterizado por abundancia calórica, actividad física reducida y
aumento de la esperanza de vida, ha disparado durante las últimas décadas la incidencia de obesidad a proporciones
epidémicas, especialmente en paises desarrollados, siendo particularmente alarmante en la población infantil [1]. El
incremento en obesidad lleva asociado un abanico de patologías metabólicas que incluyen la diabetes mellitus tipo 2 y
diferentes enfermedades cardiovasculares, que han motivado la investigación dedicada a esclarecer los mecanismos
que las desencadenan [2]. Aunque los resultados de tales esfuerzos han permitido el desarrollo de nuevas opciones
terapéuticas, estas condiciones permanecen como las causas primordiales de mortalidad y morbilidad mundial,
enfatizando la necesidad de desarrollar medidas preventivas y terapéuticas más efectivas. Hasta el momento, se han
identificado agentes genéticos, dietéticos y factores ambientales que contribuyen al aumento de la incidencia de
obesidad. Sin embargo, los mecanismos por los cuales el exceso de nutrientes y adiposidad pueden en último témino
producir una o varias enfermedades crónicas está aún por elucidar.
El primer paso que realiza el organismo en respuesta a la abundancia nutricional es el almacenaje del exceso de fuel en
los adipocitos. Sin embargo, la excesiva acumulación de lípidos en el tejido adiposo supone un aumento en el riesgo de
padecer enfermedad metabólica. Se sabe que a partir de cierto nivel de almacenamiento lipídico, el adipocito comienza
a tener signos de estrés que incluyen hipoxia, disrupción de la función mitocondrial, producción de especies reactivas
de oxígeno, apoptosis, incremento en la liberación de ac. grasos, inflamación y estrés de RE. Muchos de estos procesos
están interconectados, tienen influencia unos sobre otros, y se han asociado últimamente a la disfunción y enfermedad
metabólica. Por su parte, los lípidos tambien han sido recientemente asociados a un incremento en la señalización tanto
inflamatoria como de estrés.
La asociación entre metabolismo, inflamación y estrés de retículo endoplásmico (RE) no es sorprendente si se tiene en
cuenta como la función de uno de ellos influye en la de los demás. Los tres procesos son respuestas adaptativas
rigurosamente reguladas, fundamentales para la supervivencia, y que dependen de la disponibilidad de suficiente
energía para funcionar adecuadamente. Es por tanto lógico que los tres procesos se integren para regular
satisfactoriamente la distribución de los recursos disponibles y aumentar el bienestar general del organismo bajo
diversas condiciones ambientales. Por ejemplo, durante el curso de una infección, la capacidad del sistema inmune para
derivar energía para sí mismo en respuesta a un patógeno es fundamental para terminar de forma satisfactoria con dicha
amenaza. Por tanto, los requerimientos metabólicos de un organismo y la demanda de energía de las células inmunes
deben estar apropiadamente coordinados. De la misma manera, la producción de proteínas tiene lugar en el RE y está
acoplado a la disponibilidad de energía y las necesidades energéticas celulares. Además tanto los procesos metabólicos
1
como las rutas de respuesta inmune deben comunicarse con los procesos de producción y control de calidad proteica
para asegurar la generación apropiada de numerosas proteínas que serán requeridas en dichas respuestas. Como
resultado, es lógico que se hayan desarrollado mecanismos de integración y comunicación entre estos procesos.
Durante el desarrollo de los sistemas de utilización de energía en mamíferos superiores, la deprivación nutricional era
muy habitual. Desafortunadamente, el tipo de vida actual ha ocurrido demasiado deprisa como para que estos
mecanismos evolutivos se ajusten a él. Como consecuencia, existe un desequilibrio entre cómo nuestro organismo
responde a los sustratos generadores de energía y a patógenos, la evolución de nuestras respuestas adaptativas, y
nuestras necesidades metabólicas e inmunes actuales. Aunque un aumento nutricional a corto plazo no produce daño,
nuestros mecanismos para manejar altos niveles calóricos no están equipados para manejar una exposición crónica a un
gran exceso nutricional. La presencia de sustratos altamente energéticos durante largo tiempo produce la alteración de
las rutas que controlan la eliminación o almacenamiento del exceso de energía, produciéndose una desregulación de la
homeostasis de la glucosa y los lípidos.
La presente memoria de tesis se centra en el estudio del papel de ciertas proteínas señalizadoras y a la vez involucradas
en el almacenamiento lipídico, las lipinas, y más concretamente, la lipina-2, en la modulación de la respuesta inmune
en un contexto de alta disponibilidad de ac. grasos, especialmente ac. grasos saturados, que es característico de los
estados de obesidad.
1.1. Conexión entre sistema inmunológico y metabólico
El descubrimiento hace ya casi dos décadas, de que la citoquina proinflamatoria conocida como factor de necrosis
tumoral alfa (TNFα), tenía una elevada expresión en el tejido adiposo de ratones obesos, fue la primera indicación de
que los mediadores inflamatorios estaban asociados a la obesidad [3, 4]. Posteriormente se ha aceptado en la
comunidad científica que los cambios en la señalización inflamatoria de los adipocitos y la infiltración del tejido
adiposo por parte de las células inmunes son características primordiales en la resistencia a la insulina inducida por
obesidad y la enfermedad metabólica asociada, tanto en modelos animales como en humanos.
En el año 2003 se descubrió que tanto en ratón como en humanos, el tejido adiposo está infiltrado por macrófagos,
hecho que suposo un gran avance en la comprensión de cómo la obesidad propaga la inflamación [5, 6]. En estos
estudios se observó que el tejido adiposo contenía macrófagos derivados de médula ósea, y que el contenido en
macrófagos correlacionaba con el grado de obesidad. De hecho, más del 40% del total de células del tejido adiposo en
roedores y humanos obesos eran macrófagos, lo que contrasta con el 10% en animales y sujetos delgados. Además, los
macrófagos eran los responsables de la mayor parte de la expresión de TNFα en el tejido adiposo y contribuía
significativamente a la producción de interleuquinas proinflamatorias como la IL-6.
Además de los macrófagos, otras células inmunes tales como los neutrófilos, los mastocitos, las células “natural killer”
(NK) y los linfocitos infiltran el tejido adiposo durante la obesidad o en respuesta a dietas altas en grasas. El momento
exacto en el que estas infiltraciones ocurren, y por ello, si son consecuencia o causa del proceso inflamatorio que
ocurre durante la progresión de la enfermedad está aún por determinar. Por ejemplo, hay resultados contradictorios en
torno a si las células T son reclutadas inicialmente al tejido adiposo tras someter ratones a dietas altas en grasa, o si es
un proceso que ocurre después, una vez que la inflamación ya ha comenzado [7, 8]. Sin embargo, resultados recientes
han demostrado que otros tipos celulares inmunes tienen un activo papel en la desregulación metabólica,
independientemente de que sean reclutados al tejido adiposo o no. Este es el caso de los mastocitos y las células NK,
ya que su eliminación en ratones reduce la inflamación del tejido adiposo, mejora la respuesta a insulina y la
homeostasis de la glucosa en ratones [9, 10].
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El incremento en la exposición a ac. grasos, bien por un aumento en el contenido de grasa de las dietas modernas o por
una lipolisis aberrante de los adipocitos, se ha propuesto como un factor importante, tanto en la desregulación del
metabolismo, como en la señalización inmune durante la inflamación [11]. Incluso, algunos autores definen con el
término de “metainflamación” a la respuesta inmunológica modulada por nutrientes y metabolitos [12].
1.1.1. Los macrófagos y su papel en obesidad
Los macrófagos (del griego makros “grande” y phagein “comer”; gran célula comedora”) son los fagocitos más
eficientes, Estas células reconocen y eliminan elementos como bacterias, virus, hongos, parásitos o células propias
dañadas o muertas, como es el caso de las céluas apoptóticas y tumorales. En los tejidos, los macrófagos específicos de
órganos se han diferenciado a partir de las células mieloides presentes en la sangre, denominadas monocitos. La
diferenciación del macrófago incluye una elevada expresión de receptores implicados en el reconocimiento de los
patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs), entre los que destacan, los receptores tipo toll (TLRs), las
proteínas tipo NOD (acrónimo de nucleotide-binding oligomerization domain), el receptor de manosa (RM) y los
receptores “scavenger”, dectina-1 y endo-180 [13]. Todos estos receptores son necesarios para la realización de sus
funciones, principalmente aquellas relacionadas con la eliminación de agentes patógenos.
Los macrófagos juegan un papel crítico en el desarrollo de la respuesta inmunitaria (fig. 1) a través de la producción de
citoquinas y quimioquinas, la presentación antigénica y la activación y diferenciación de los linfocitos T. Por otro lado,
también están involucrados en la resolución de la inflamación, promoviendo directamente la reparación de los tejidos
dañados [14]. En este contexto, son capaces de inducir la síntesis de proteínas de la matriz extracelular.
Los macrófagos pueden ser activados para producir citoquinas proinflamatorias, tales como TNFα IL-1 e IL-6,
citoquinas quimioatrayentes como IL-8 y MIP-1α/β (macrophage inflammatory protein) y MCP-1 (monocyte
chemotactic protein-1) promoviendo el reclutamiento de células inmunes hacía el punto de inflamación. Además,
también secretan productos proinflamatorios del metabolismo del ac. araquidónico (AA), especies reactivas del
óxigeno y óxido nítrico[15, 16].
Por otro lado, y gracias al receptor scavenger A, los macrófagos reconocen gran variedad de lípidos y lipoproteínas
favoreciendo la absorción de lipoproteínas acetiladas de baja densidad (LDLs) y contribuyendo así al metabolismo del
colesterol. Estos receptores, también están implicados en la fagocitosis de células apoptóticas y bacterias y en procesos
cómo la adhesión celular [17].
La activación de los macrófagos es heterogénea, lo que refleja la plasticidad y versatilidad de estas células en respuesta
a distintas señales. Esto se conoce como polarización de los macrófagos (fig. 2). Los términos M1 y M2 han sido
utilizados para definir dos extremos del posible espectro de activación de los macrófagos. La respuesta M1 es la
“activación clásica” proinflamatoria, mientras que la respuesta M2 es la “activación alternativa” antiinflamatoria.
La activación clásica (M1), es producida por los PAMPs como el lipopolisacárido (LPS) de la pared de bacterias gram
negativas, o determinadas citoquinas como el TNFα. Estos macrófagos se caracterizan por producir citoquinas
proinflamatorias como, IL-1, IL-6 y TNFα así como agentes antiproliferativos y microbicidas como la lisozima o el
óxido nítrico (NO). Paralelamente, las citoquinas secretadas por los linfocitos Th1, como el IFNγ promueven el
fenotipo M1, aumentando los niveles de expresión del complejo de histocompatibilidad (MHC) de clase II y de CD86,
potenciando su capacidad presentadora de antígenos a los linfocitos T. Estos macrófagos a su vez activan la respuesta
Th1 a través de la expresión de IL-12 [18].
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En presencia de citoquinas secretadas por linfocitos Th2, como la IL-4 o la IL-13, se induce en el macrófago una
activación “alternativa” característica de los macrófagos M2 [19]. A diferenta de la activación clásica, estos
macrófagos no son capaces de producir NO a partir de L-arginina y tampoco consiguen controlar el crecimiento de
patógenos intracelulares [20]. Sin embargo, son capaces de producir una elevada cantidad de arginasa 1, enzima que
metaboliza la L-arginina para producir prolina, glutamato y poliaminas favoreciendo la reparación tisular. La prolina
actúa como precursora del colágeno [21] y las poliaminas han sido ampliamente relacionadas con procesos de
proliferación y diferenciación [22]. Dentro de este contexto antiinflamatorio, los macrófagos también pueden producir
TGF-β (transforming growth factor-beta) que inhibe la generación de especies reactivas de oxígeno e intermediarios
del nitrógeno [23, 24].
La producción diferencial de citoquinas es un factor clave en la polarización de los macrófagos. El fenotipo M1 se
caracteriza por producción alta de IL-12 y baja de IL-10, mientras que en los macrófagos M2 ocurre lo contrario,
producción baja de IL-12 y alta de IL-10. Los macrófagos humanos M1 también producen altos niveles de IL-23. Los
componentes del sistema de IL-1 se encuentra regulado diferencialmente por la polaridad de los macrófagos. IL-4 e IL13 incrementan la expresión del receptor IL1-RII e inducen el antagonista del receptor de IL-1, el IL-1Ra [26],
mientras que el IFN-γ y el LPS aumentan la expresión de IL-R e IL-RI, inhibiendo la expresión de IL1-RII [27].
En determinadas situaciones fisiopatológicas, la polarización de los macrófagos es trascendental. Los macrófagos
constituyen el principal componente de los leucocitos infiltrados en tumores [28, 29], conocidos como TAMs (tumorassociated macrophages) y su interacción con las células neoplásicas podría contribuir a la progresión del tumor [28,
29]. Se conoce que estos TAMs, son macrófagos M2 que poseen poca citotoxicidad frente las células tumorales,
promueven la proliferación y son pobres productores de óxido nítrico [30]. Los TAMs expresan altos niveles de
receptor de manosa, y en relación a las citoquinas, tienen gran cantidad de IL-10 y bajos niveles de IL-12. Estos
macrófagos son un componente clave en la tumorogénesis, angiogénesis y metástasis [29, 31].
Por otro lado, la polaridad también es importante en los macrófagos infiltrados en el tejido adiposo, ATMs (adipose
tissue macrophages) durante la obesidad [32]. En ratones delgados, los macrófagos residentes están polarizados hacia
un estado M2 (altos niveles de IL-10 y de arginasa) que mantiene la función del adipocito, promueve la reparación
tisular y produce angiogénesis. Cuando hay un exceso de nutrientes, los adipocitos aumentan de tamaño e incrementan
la secreción de quimioquinas reclutando monocitos CCR2+, que posteriormente se diferencian a macrófagos M1,
generando altos niveles de TNFα, IL-6, etc. La activación “alternativa” de los macrófagos, podría prevenir la
acumulación de macrófagos M1 [33], y proteger a los adipocitos frente a los efectos perjudiciales del TNFα y ciertas
citoquinas. En concordancia con este modelo, en estudios realizados en ratones knock out CCR2-/- y CCL2(MCP-1)-/con obesidad, se ha observado que sus ATMs poseen una reducida capacidad inflamatoria [34, 35].
Existe un alto nivel de coordinación entre los procesos metabólicos e inflamatorios, donde los macrófagos y los
adipocitos adquieren gran importancia. Se ha descrito que, el 30% de los genes que se expresan en el tejido adiposo
blanco son genes proinflamatorios y “específicos” de macrófagos [5]. Bajo condiciones metabólicas normales, los
adipocitos son las células encargadas de almacenar lípidos y mantener la homeostasis metabólica, mientras que los
macrófagos tienen una función puramente inflamatoria. Sin embargo, la aparición de obesidad está asociada a un
estado de inflamación crónica de bajo grado, donde el tejido adiposo presenta una gran infiltración de macrófagos (Fig.
3). En estas condiciones, tanto los adipocitos como los macrófagos infiltrados generan citoquinas proinflamatorias que
mantienen el estado inflamatorio [5]. Por otro lado, tanto en situaciones de obesidad como en dislipidemias, los
macrófagos son capaces de almacenar lípidos para formar células espumosas (“foam cells”) que pueden producir daños
importantes. Un ejemplo de ello es la ateroesclerosis [9].
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Los macrófagos y los adipocitos comparten la expresión de determinadas moléculas implicadas en inflammación,
como son los receptores nucleares activadores de la proliferación de los peroxisomas (PPARs), y los receptores LXRs
(“liver X receptors”) [7]. Además, también tienen en común las proteínas de unión de ac. grasos, aP2 (FABP4, “fatty
acids binding protein”) [36] y determinadas citoquinas, como TNFα, IL-6 y MMP (metaloproteasa de matriz) [37].
Por su lado, los adipocitos secretan altos niveles de adipoquinas, tales como leptina [39, 40], adiponectina [41],
visfatina [42] y resistina [43], que regulan la función de células inmunológicas como monocitos y macrófagos. Existe
una correlación entre los niveles de leptina en suero y el recuento leucocitario [44]. La capacidad fagocítica de los
macrófagos peritoneales de ratones deficientes en leptina (ob/ob) está disminuida, y mejora tras la administración de
dicha adipoquina. La adiponectina tiene propiedades antiinflamatorias, particularmente en relación con la
ateroesclerosis. En experimentos “in vitro” se ha comprobado que la adiponectina inhibe la adhesión de monocitos a
células endoteliales inducida por TNF
disminuyendo la expresión de VCAM-1, ICAM-1 y selectina [45]. Además, la
adiponectina inhibe la expresión del receptor Scavenger A (SR-A) en macrófagos y reduce la formación de la placa
ateroesclerótica, lo que demuestra que los valores plasmáticos elevados de adiponectina pueden suprimir el desarrollo
de la ateroesclerosis in vivo [45]. En humanos, la resistina se induce en la diferenciación de monocitos a macrófagos
[46, 47]. Citoquinas tales como TNFα e IL-6 inducen la producción de resistina en macrófagos [48]. Por otro lado, la
visfatina también induce la producción de citoquinas proinflamatoria (IL-6, TNFα e IL-1β) en monocitos humanos
[42]. Además, se ha observado que los preadipocitos pueden diferenciarse a macrófagos, lo que supone un vínculo
añadido entre el tejido adiposo y la respuesta inmune innata [49].
Por último, cabe destacar que tanto preadipocitos como adipocitos expresan diferentes tipos de TLRs. Estudios de cocultivos entre adipocitos y macrófagos procedentes de ratones deficientes del receptor TLR4, han demostrado que
existe un bucle paracrino entre TNFα, ácidos grasos saturados y TLR4, que conduce a la activación de NF-κB [50]
(fig. 4). Los ac. grasos saturados, tales como el ac. esteárico o el ac. palmítico, procedentes de la lipolísis de los
adipocitos, pueden inducir la activación de NF-κB en macrófagos a través de TLR4, dando lugar a la secreción de
citoquinas y quimioquínas proinflamatorias [51]. Este tema es de gran importancia, y será abordado con mayor
profundidad en el próximo apartado.
1.1.2. Papel de los TLRs en la activación por ácidos grasos
Los TLRs son una familia de proteínas transmembrana que forman parte del sistema inmune innato. Son los
responsables de identificar diversos patrones de reconocimiento de patógenos (PAMPs) expresados por un amplio
espectro de agentes infecciosos [52]. Se denominan toll porque el primer miembro descrito fue la proteína Toll en
Drosophila Melanogaster [53]. Al menos 13 proteínas de la familia toll han sido descritas en mamíferos y sus ligandos
específicos han sido identificados [54]. Los TLRs 1-9 se expresan tanto en humanos como en ratón, mientras que los
TLRs 10-13 sólo se expresan en ratón [55].
Uno de los TLRs más estudiados es el TLR4, que es el receptor del LPS de la pared celular de las bacterias gram
negativas y con cuya interacción desencadena una cascada de señalización que da lugar a la activación de varios genes
proinflamatorios [56]. En los últimos años también se le ha atribuido al TLR4, una función adicional como “sensor” de
lípidos endógenos que podría contribuir a la patogénesis de la resistencia a insulina inducida por lípidos [57]. Estudios
“in vivo” en modelos animales han reforzado estos conceptos. El incremento de ac. grasos circulantes por infusión de
lípidos, produce resistencia a insulina en ratones wild-type, y sin embargo, en ratones knock-out de TLR4 este effecto
no tiene lugar [57]. Además, los ratones knock-out de TLR4 ganan menos peso que los ratones control cuando son
alimentados con una dieta rica en grasas [58].
5
Los macrófagos infiltrados en el tejido adiposo (ATMs) se encuentran en un ambiente enriquecido en lípidos, y
numerosos estudios han demostrado que los ac. grasos pueden modular la respuesta inflamatoria en macrófagos [11,
59]. Tanto TLR4 como TLR2 juegan un papel fundamental en esta respuesta [57, 60]. La expresión de TLR4 en
macrófagos aumenta con la obesidad mientras que una disminución en su expresión conlleva una reducción en la
respuesta inflamatoria inducida por ac. grasos saturados, tanto en macrófagos como en adipocitos y células del músculo
esquelético [57, 60, 61]. Por otro lado, estudios realizados con animales transplantados con médulas óseas previamente
tratadas con vectores lentivirales que codificaban para secuencias inhibidoras de la expresión de TLR4, han demostado
que la mera eliminación de este receptor en la estirpe hematopoyética es suficiente para disminuir la resistencia a
insulina en animales alimentados con una dieta alta en grasas [62]. Asimismo, en estos animales el reclutamiento de
macrófagos al tejido adiposo y la producción de genes proinflamatorios como IL6, TNF-α e IL12p70 estaban
disminuidos con respecto a los animales que habían recibido un transplante control bajo condiciones hipercalóricas
[62].
No sólo las células inmunes expresan TLRs; tanto los preadipocitos como los adipocitos maduros de ratón expresan
diferentes TLRs (desde TLR1 a TLR9), que responden a diferentes estímulos, como LPS produciendo citoquinas,
como IL-6, TNFα, IL-8, etc. Actualmente se conoce que la respuesta inflamatoria inducida por lípidos depende de la
naturaleza de éstos. Así por ejemplo, los ac. grasos saturados inducen una potente respuesta proinflamatoria, los ac.
grasos poliinsaturados producen una respuesta leve y, por el contrario, los ac. grasos omega-3 son antiinflamatorios y
resolutorios de la inflamación [60, 61, 63-65]. Se desconoce por el momento cómo afecta la composición de los
diferentes ac. grasos a la activación de los TLRs y a la respuesta que se desencadena posteriormente. Además, y a pesar
de todos los estudios expuestos anteriormente, todavía no se ha determinado con absoluta seguridad si los ac. grasos
activan directamente los TLRs, o si hay otros factores involucrados.
1.2. Estrés de RE y respuesta UPR
La inflamación y el estrés de RE están muy relacionados a diferentes niveles. Ambos sistemas son respuestas a corto
plazo necesarias para la función y supervivencia del organismo, y ambas son perjudiciales cuando se activan
crónicamente. En los últimos años, varios trabajos han atribuido un papel importante al estrés de RE en la inflamación
producida durante obesidad y otras alteraciones metabólicas [12]. El RE juega un papel esencial en la biosíntesis de
proteínas destinadas a la secreción o inserción en membranas en células eucariotas. Este orgánulo unido a la membrana
nuclear puede reclutar ribosomas para la traducción de ARN en proteínas, translocar péptidos a su lumen, promover
una amplia variedad de modificaciones postraduccionales y facilitar eventos de ensamblaje proteico facilitado por
proteínas chaperonas. El RE es el lugar donde las proteínas, todavía inmaduras, penetran al compartimento secretor
donde completarán su ensamblaje. Estos procesos son supervisados por diversos sistemas de control y las proteínas
incapaces de plegarse adecuadamente son translocadas al citosol, donde son degradadas por el proteosoma en un
proceso denominado ERAD (endoplasmic reticulum-associated degradation) [66]. El RE es considerado como la
fábrica productora de proteínas en mamíferos, pero además tiene la característica de ser un importante sensor de
sobrecarga metabólica celular (estrés).
Las agresiones biológicas tales como las infecciones, la deprivación nutricional y la exposición a toxinas químicas o un
exceso de lípidos, pueden alterar la homeostasis del RE, provocando un mal ensamblaje proteico y causando una
acumulación de estas proteínas mal ensambladas, dando como resultado una sobrecarga proteica (estrés). Para combatir
esta sobrecarga, el RE inicia un programa transcripcional denominado respuesta a mal ensamblaje proteíco (unfolded
6
protein response o UPR) diseñado específicamente para disminuir o detener la síntesis de proteínas y para promover su
rápida degradación restableciendo de esta manera la homeostasis celular [67].
Este complejo sistema de respuestas a la sobrecarga del RE se compone de 3 rutas distintas, controladas por proteínas
transmembrana presentes en el propio RE (fig. 5): la proteína dependiente de inositol 1 ( inositol requiring enzyme 1 o
IRE-1), la quinasa de eIF2α (PKR-like endoplasmic reticulum kinase eIF2α o PERK) y el factor de transcripción
activador 6 (activating transcription factor 6 o ATF6).
El RE contiene varias chaperonas para facilitar el plegamiento correcto de las proteínas, incluyendo la proteina de
unión a inmunoglobulina BiP (binding Ig protein), también conocida como GRP78 (glucose regulated protein 78), que
es un miembro de la familia de estrés calórico 70 (hsp70, heat shock 70 protein), y que se une de modo transitorio a
proteínas sintetizadas [68]. En condiciones normales, BiP se encuentra también unido a los dominios del lumen
reticular de IRE1, ATF6 y PERK, pero cuando en el RE aumentan las proteínas mal ensambladas, BiP se une
preferentemente a ellas, liberando los dominios de las proteínas mencionadas y permitiendo su activación. En
levaduras y determinadas células de mamíferos se ha observado que la sobreexpresión de BiP reduce la respuesta
UPR, mientras que su disminución activa esta respuesta [69].
La ruta de PERK en la UPR media la inhibición de la traducción proteica mediante la fosforilación del la subunidad α
del factor de transcripción eIF2α [66]. Esto produce una disminución de la producción celular de proteínas en un
intento de reducir la carga de ensamblamiento proteico en el RE. Además, esta vía incrementa la producción del factor
de transcripción ATF4, que a su vez está involucrado en la inducción de genes de la respuesta antioxidativa y en el
transporte de aminoácidos. La activación de PERK también aumenta la expresión de CHOP, un factor de transcripción
de la familia C/EBP. En condiciones normales, la expresión basal de CHOP es baja; sin embargo, su expresión
aumenta notoriamente cuando el estrés de RE persiste y no es eliminado [70]. La expresión de CHOP da lugar a
apoptosis celular por diferentes mecanismos, como la inhibición del factor de protección frente a la apoptosis Bcl-2, la
activación de caspasas y la translocación de la proteína proapoptótica Bax desde el citosol hacia la mitocondria. La
inducción de CHOP se realiza a través de ATF4, de modo dependiente de la fosforilación de eIF2α [71]. Mientras que
el aumento de la expresión de CHOP promueve muerte celular [72], la inhibición de CHOP protege a las células de la
muerte por estrés de RE [73]. Estas observaciones indican que CHOP es un elemento fundamental en la activación de
la maquinaria de muerte celular producida por estrés de retículo.
La activación de IRE-1 supone su dimerización y aumento de su actividad endorribonucleasa, produciendo un
procesamiento alternativo del ARN mensajero de XBP-1, que cambia su marco de lectura ribosómico, lo que da lugar a
la forma activa XBP1s, que se transloca al núcleo activando la expresión de chaperonas de RE y proteínas involucradas
en la ERAD.
La tercera via canónica de la respuesta UPR está formada por el factor de transcripción ATF6 que, al activarse, se
transloca al Golgi donde es cortada para producir un fragmento amino-terminal activo que viaja al núcleo donde regula
la expresión de proteínas chaperonas.
1.2.1. Estrés de RE y la respuesta inflamatoria
Uno de los mecanismos por los que se ha propuesto que el estrés de RE impacta de forma negativa sobre la
homeostasis metabólica es a través de la inducción de vías de señalización inflamatoria. Así por ejemplo, cualquiera de
las tres rutas de la respuesta UPR (IRE1, PERK y ATF6) puede activar las vias de señalización de JNK y NF-κB
implicadas en la inducción de múltiples genes proinflamatorios [10]. Durante el estrés de RE, IRE1α desencadena una
7
respuesta inflamatoria uniéndose a TRAF2 (TNF receptor associated factor) y activando la ruta de JNK, el cual puede
regular la expresión de muchos genes inflamatorios [74]. IRE-1 puede también activar las rutas de p38, ERK y NF-κB
a través de su interacción con la proteina adaptadora Nck (non catalytic region of tyrosine kinase). Por su parte, PERK
al producir una disminución en la producción proteica, disminuye tambien los niveles de IκB y con ello, incrementa la
activación de NF-κB. Se ha propuesto que la activación de la via de señalización de JNK y NK-κB inhibe a a su vez la
acción de la insulina mediante la fosforilación de IRS-1[61, 75]. En este sentido, se ha observado que en los ratones
knock-out de JNK, la expresión de citoquinas proinflamatorias como el TNFα, la IL-6 y la MCP-1, inducidas por dietas
altas en grasa está reducida y contribuye a la protección de estos animales a la aparición de resistencia a insulina y
diabetes tipo 2 [3, 76, 77].
La respuesta UPR producida por el estrés de RE y la respuesta inflamatoria están interconectadas por diferentes
mecanismos que han sido objeto de estudio en trabajos recientes [10, 78, 79]. Experimentos realizados tanto “in vitro”
como “in vivo” sugieren que el estrés de RE podría incrementar la respuesta inflamatoria. Por ejemplo, los macrófagos
tratados con agentes farmacológicos que inducen estrés de RE como la tunicamicina, presentan una mayor activación
por agonistas de TLR2 (Pam3CSK4) y de TLR4 (LPS) [80, 81]. Por otro lado, estudios en macrófagos de ratones
deficientes en XBP-1 han mostrado que la expresión de mediadores inflamatorios como la IL-6, el TNFα, y el IFNγ
está reducida en respuesta a agonistas de TLR2 y TLR4 (incluyendo la bacteria intracelular Francisella tularensis), lo
que apoyaría la idea de que el estrés de RE aumenta la respuesta inflamatoria [80].
Una activación prolongada de UPR también podría causar estrés oxidativo, provocando la acumulación de especies
reactivas de oxígeno (ROS, reactive oxygen species), que puede desencadenar una respuesta inflamatoria, lo que
supondría otro vínculo potencial entre estrés de RE e inflamación [82]. Por otro lado, estudios recientes sugieren que la
generación de óxido nítrico (NO) también podría estar relacionado con el estrés de RE [83].
La conexión entre el estrés de RE e inflamación supone un avance importante en el estudio de la integración entre la
función del RE y la homeostasis metabólica, debido al papel crucial que desempeña la inflamación en enfermedades
tales como la obesidad, la resistencia a insulina o la diabetes tipo 2 [12].
2.2.2. Estrés de RE producido por lípidos
El RE es un orgánulo esencial para la síntesis y procesamiento de proteínas y lipidos. Varias enzimas implicadas en la
síntesis de colesterol, fosfolípidos y TAG se localizan en la membrana del RE. Además, el metabolismo de
carbohidratos también ocurre en el lumen del RE. De este modo, este orgánulo puede actuar como un gran sensor del
estado nutricional de la célula [84].
Estudios recientes han mostrado que la acumulación intracelular de ac. grasos saturados y colesterol que tiene lugar en
enfermedades de alta incidencia como la obesidad, la diabetes y la aterioesclerosis, produce estrés de RE. Así por
ejemplo, la acumulación de colesterol en el RE de los macrófagos produce estrés [85]. Del mismo modo, el ac.
palmítico produce estrés de RE en macrófagos [86], células β pancreáticas [87], hepatocitos [88, 89] y cardiomiocitos
[90].
Por otro lado, la respuesta UPR esta activada en los macrófagos de lesiones ateroescleróticas tanto en ratones como en
humanos [91, 92], lo que lleva a la idea de que existe un gran vínculo entre estrés de RE y aterosclerosis [93]. La
disminución de el estrés de RE en macrófagos, a través de la chaperona 4-PBA (ácido 4-fenil butírico) conlleva una
mejora la aterosclerosis [86]. Además, el estrés de RE induce la expresión de los receptores “scavenger” CD36 y SR-A
en macrófagos. Puesto que estos receptores están relacionados con la captación de lipoproteínas por los macrófagos y
8
generación de células espumosas, estos estudios sugieren que el estrés de RE podría favorecer la formación de células
espumosas presentes en las lesiones ateroscleróticas [91, 94].
El mecanismo por el cual los lípidos producen estrés de RE e incrementan la inflamación no esta bien definido por el
momento y, por todo lo expuesto anteriormente, la identificación de las vías moleculares que conectan la acumulación
intracellular de ac. grasos, el estrés de RE y la inflamación tiene una gran relevancia biomédica.
1.3. El factor de transcripción NF-κB
El factor nuclear NF-κB ha sido objeto de muchas investigaciones en las dos últimas décadas y durante este periodo ha
habido un importante progreso en la caracterización de su función y regulación. NF-κB desempeña una función
primordial en la coordinación de la expresión de una amplia variedad de genes que controlan la respuesta inmunitaria
[95], regulando la expresión de citoquinas, factores de crecimiento y enzimas implicadas en la activación de receptores
implicados en inmunidad como los receptores de las células T y células B, receptores del factor de necrosis tumoral
(TNFR), TLRs, etc. Además NF-κB también regula la expresión de genes que no pertenecen al sistema inmunológico,
siendo importante en determinados procesos como el desarrollo embrionario y el sistema nervioso central [96].
1.3.1. La familia de proteínas NF-κB
En mamíferos, la familia de proteínas NF-κB comprende cinco proteínas, p65 (RelA), RelB, c-Rel, p105/p50 (NκB1) y
p100/52 (NκB2) [97] que se asocian entre sí formando homodimeros y heterodimeros que actúan como complejos
transcripcionales activos (fig. 6). En el extremo amino terminal, presentan un dominio muy conservado de 300
aminoácidos, que se denomina dominio de homología Rel (RHD, Rel homology domain) y es necesario para la
dimerización, unión al ADN e interacción con sus inhibidores IκB.
En la mayoría de células sin estimular, los dímeros NF-κB permanecen de forma inactiva en el citosol debido a la
interacción con las proteínas IκB. La degradación de estos inhibidores a través de su fosforilación por el complejo IκB
quinasa (IKK), desencadena la translocación de NF-κB al núcleo, induciendose la expresión de determinados genes.
Aunque la actividad NF-κB es inducible en la mayoría de las células, también puede estar activa de forma constitutiva
en determinados tipos celulares, tales como células maduras B, neuronas y en gran número de tumores.
Existen dos clases de complejos de quinasas de IκB (IKK); unos que están regulados por el modulador NEMO (NF-κB
essential modulator) y otros que requieren tanto IKKα como la quinasa NIK ( NF-κB inducing kinase), pero que son
independientes de NEMO [99].
La familia de proteínas NF-κB también puede clasificarse en función de su potencial de transactivación, debido a que
sólo p65, RelB y c-Rel contienen el dominio carboxi terminal de transactivación TAD (transactivation domains). Rel B
es la única proteína que requiere una región de “cremallera de leucina” LZ (“leucine zipper”) en el extremo amino
terminal, además del TAD, para ser completamente activa [101] (fig. 7).
Las proteínas p50 y p52 son generadas por procesamiento de las proteínas p105 y p100 respectivamente. El extremo
amino terminal de estos precursores contiene las regiones RHDs de p50 y p52, seguidos de una región rica en glicina
(GRH, glycine rich region) y múltiples copias de repeticiones de anquirina [98].
9
Todas las proteínas de la familia ΙκB se caracterizan por la presencia de cinco a siete motivos de anquirina, los cuales
median la interacción con los dominios RHD de las proteínas NF-κB. En general, se cree que cada una de las proteínas
ΙκB tienen preferencia por determinados dímeros, sin embargo, no existen pruebas experimentales de esto. IκBα e
ΙκBβ, parecen ser las más importantes para inhibir los complejos que contienen c-Rel y p65, teniendo IκBα mayor
afinidad por los dímeros p65-p50 que por los dímeros p65-p65 [102]. Rel B se une de forma exclusiva a p100, mientras
que Bcl-3 e ΙκBζ tienen preferencia por asociarse a homodímeros de p50 y p53[103].
1.3.2. Activación de NF-κB en la inflamación
En la respuesta inflamatoria existe una estricta coordinación en la señalización que regula la expresión de mediadores
pro- y antiinflamatorios. Actualmente, gran parte de lo que se conoce sobre señalización en inflamación se debe al
estudio de las familias de receptores de TNFα, a la superfamilia de receptores de interleuquina-1, a los TLRs y los
receptores específicos de células T y B. La señalización y activación de NF-κB a través de estos receptores se conoce
como ruta clásica o canónica de activación, pero diferentes estudios han demostrado la existencia de al menos otra ruta
de activación claramente diferenciada de la ruta clásica, a la que se conoce como la ruta alternativa o no canónica (fig.
8).
La ruta clásica de activación de NF-κB es inducida por una variedad de mediadores de la respuesta inmune innata y
adaptativa y converge en la activación de las proteínas IKK y en la degradación de IΚBα, permitiendo la liberación de
los heterodímeros p50-p65 y p50-cRel [104].
En la vía de activación clásica se produce la fosforilación de IKBα catalizada por el complejo de quinasas de IΚB
(IKKα y IKKβ) unidas a la subunidad reguladora NEMO (también conocida por IKKγ). IKKβ y NEMO son necesarias
para la fosforilación de IKKβ, mientras que IKKα parece no ser imprescindible [105]. La fosforilación de IKKα da
lugar a su poliubiquitinación y consecuente degradación por el proteosoma 26S, liberando los dímeros de NF-κB
(mayoritariamente heterodímeros p50-p65), que se translocan al núcleo donde activan la transcripción de sus genes
diana [106].
La ruta alternativa o no canónica, más recientemente descrita, depende de IKKα, pero no de IKKβ ni de NEMO [107109]. La quinasa inductora de NF-κB (NIK) fosforila la quinasa IKKα, que a su vez fosforila la proteína NF-κB2/p100
(probablemente unida a RelB) que es poliubiquitinada y, por tanto, degradada. La proteolisis de p100 genera p52,
formándose el dímero p52-RelB. La translocación nuclear de este heterodímero da lugar a la activación de una serie de
genes [110].
Entre los estímulos que pueden activar la ruta alternativa se encuentran la linfotoxina β (LTβ), el factor activador de
células B (BAFF), el receptor activador de NF-κB (RANK) y el ligando CD40 [104]. La ruta alternativa es
particularmente importante en la regulación de la organogénesis linfoide, en el desarrollo de linfocitos B y T, en la
diferenciación de células presentadoras de antígenos, cómo las células dendríticas, y en autoinmunidad [95, 107, 111].
NF-κB también puede ser activado en respuesta a estrés, por ejemplo frente al daño producido por luz ultravioleta, o
durante el estrés oxidativo. De hecho, se han encontrado elementos de unión a NF-κB en los promotores de los genes
que codifican para enzimas que participan en el control de los niveles de ROS en la célula, como la superóxido
dismutasa [113] y la catalasa [114]. Según esto, la relación entre la activación de NF-κB y la generación de enzimas
antioxidantes parece tener gran importancia en la supervivencia celular. Además, y como ya ha sido comentado con
10
anterioridad, la respuesta UPR producida por estrés de retículo, inhibe la síntesis de IκB y como consecuencia produce
la activación de NF-κB [10]
Otro área de progreso durante los últimos años ha sido el estudio de la relación entre NF-κB y el desarrollo de muchas
enfermedades. La regulación anómala de la activación de NF-κB ocurre en diferentes tipos de cáncer, enfermedades
inflamatorias y desórdenes neurodegenerativos. Sin embargo, hasta el momento se desconoce si la inhibición de NF-κB
es suficiente para tratar estas enfermedades, o si podría utilizarse cómo adyuvante terapéutico para aumentar la eficacia
de otros tratamientos.
1.4. Activación de las MAP quinasas (MAPK) en inflamación
En la respuesta inmune están implicados un gran número de tipos celulares que pueden actuar como iniciadores,
reguladores y efectores en la transducción de señales que regula la expresión génica y función inmunológica. La
cascada de señalización de las MAP quinasas es una de las vías conocidas mas antiguas y conservadas en eucariotas a
lo largo de la evolución, implicadas en numerosos procesos de la respuesta inmune y otros procesos fisiológicos tales
como proliferación, estrés celular y apoptosis [115].
Existen tres subfamilias bien definidas de MAPK: las proteínas quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK,
p44 y p42), las quinasas del extremo amino terminal de c-Jun (JNK), también conocidas como MAP quinasas activadas
por estrés (SAPK) y por último, las quinasas p38 [116]. La activación de estas proteínas se lleva a cabo mediante una
doble fosforilación en un motivo formado por tres péptidos cuya secuencia es diferente para cada grupo: ERK (ThrGlu-Tyr); JNK (Thr-Pro-Tyr); y p38 (Thr-Gly-Tyr).
El proceso de activación se lleva a cabo por una serie de fosforilaciones en cascada comenzando con la activación de
las MAP quinasas quinasas quinasas (MAPKKK). Cuando las MAPK son activadas, son capaces de fosforilar un
amplio rango de proteínas implicadas en numerosas vías de señalización intracelular (fig 9). Además, se pueden
translocar al núcleo y fosforilar proteínas que estabilizan la cromatína, o bien numerosos factores de transcripción, tales
como AP-1[116].
Las MAP quinasas desempeñan una importante función en inmunidad innata, regulando la producción de citoquinas
proinflamatorias a través de la activación de los receptores TLR [117]. En modelos de ratón, la deficiencia de proteínas
clave en la señalización a través de TLRs, como MyD88 o TRAF6, impide la activación de las MAP quinasas en
respuesta a endotoxina [118] o IL-1[119].
Además de NF-κB, otro importante factor de transcripción en la regulación de la expresión de los genes
proinflamatorios es la proteína activadora 1 (AP-1), cuya actividad es regulada por JNK, que se une al dominio de
activación amino terminal de c-Jun [120] y lo fosforila en los residuos Ser-63 y Ser-73 [121]. Cuando c-Jun es
fosforilada, se combina con la proteína c-Fos, formando el factor de transcripción.
1.5. Familia de las proteínas lipinas
Los lípidos neutros se acumulan en las células en forma de triacilglicerol (TAG), y éstos constituyen la principal
reserva energética del organismo animal. La síntesis de TAG tiene lugar en el RE, donde están localizadas la mayoría
de las enzimas de su ruta biosintética. El precursor directo de TAG, el diacilglicerol (DAG) es producido por la
11
desfosforilación del ácido fosfatídico (PA) en esta ruta biosintética. Dicha reacción es catalizada por una familia de
enzimas, las fosfatasas de PA, entre las que se encuentra la famila de las lipinas [122].
Durante las últimas décadas, el estudio de mutaciones naturales ha permitido a la comunidad científica identificar un
gran número de proteínas importantes desde un punto de vista fisiopatológico, tanto en modelos animales como en
modelos humanos. De hecho, la familia de proteínas lipinas fue identificada gracias a la aparición de una mutación
espontánea en la cepa de ratón BALB/cByJ. Estos ratones se denominaron fld porque durante la lactancia tienen el
hígado graso (fatty liver distrophy), y presentaban una gran disfunción del tejido adiposo e importantes defectos en la
homeostasis lipídica. Mediante técnicas de clonación posicional se descubrió que el fenotipo fld se debia a una
mutación en un gen, que posteriormente pasaría a ser el miembro fundador de la familia lipina, y que recibió el nombre
de Lpin1 [123]. Dos genes adicionales de mamíferos, Lpin2 y Lpin3 fueron identificados gracias a su similitud de
secuencia.
En ratones, el gen Lpin1 puede tener un procesamiento alternativo generando dos isoformas denominadas lipina-1α y
lipina-1β que poseen 891 y 924 aminoácidos de longitud respectivamente [124]. En humanos, el gen LPIN1 también da
lugar a dos isoformas lipina-1α y lipina-1β [125], y además una tercera variante recientemente identificada, lipina1γ [126] generada también por procesamiento alternativo.
Las proteínas de la familia lipina de todas las especies estudiadas comparten regiones altamente conservadas, tanto en
el extremo amino terminal, el dominio N-LIP (N-terminal lipin), como en el extremo carboxi terminal, el dominio CLIP (C-terminal-lipin) (fig. 10). En la mayoría de las especies, estas proteínas también contienen al menos una
secuencia de localización nuclear, NLS (nuclear localization signal). El dominio C-LIP presenta dos motivos
funcionales bien definidos, el motivo DIDGT y el motivo LXXIL. El motivo DIDGT esta presente en todas las
especies y constituye el sitio catalítico de la enzima para la actividad fosfatasa del PA. El motivo LXXIL, está presente
en las proteínas de mamíferos y es necesario para realizar la función de coactivador transcripcional [129].
Los tres genes de la familia lipina y las variantes del procesamiento, poseen diferentes patrones de expresión en
función del tipo de tejido, tanto en ratón como en humanos (fig. 11) [130], lo que sugiere que cada una de ellas podría
tener diferentes funciones específicas de tejido.
La primera proteína de la familia, la lipina-1 fue identificada en 2001 por clonación posicional para identificar el gen
responsable de la lipodistrofia en los ratones fld [123]. Los ratones fld deben su nombre a dos características del
fenotipo mutante; por un lado, la presencia de hígado graso durante las dos primeras semanas del período postnatal y
por otro, la existencia de neuropatía periférica caracterizada por un mal desarrollo de las vainas de mielina en las
células de Schwann [131-133]. Además, los ratones neonatos fld tienen hipertrigliceridemia, alteración del
metabolismo lipídico hepático y disminución de la actividad lipasa en el tejido adiposo. Cuando los ratones fld son
adultos, se caracterizan por tener el tejido adiposo atrofiado, tanto el blanco como el marrón y una neuropatía
progresiva [123].
Posteriormente, se identificó otra mutación independiente en otra cepa de ratones a los que se denominó ratones fld2J y
cuyo fenotipo era idéntico al de los ratones fld. Mediante análisis genéticos se comprobó que también tenían una
mutación del gen Lpin1. Mientras que los ratones fld presentan una deleción y una duplicación en el gen, los ratones
fld2J, sólo presentan una mutuación puntual, la sustitución de la glicina en posición 84 por una arginina (fig. 12). Este
aminoácido esta conservado en la secuencias de las proteínas homólogas de diversos organismos como por ejemplo en
Drosophila melanogaster, Caenorhabdiis elegans, Arabidopsis thaliana, Saccharomyces cerevisiae y Plasmodium
12
falciparum y también en humanos. Este dato sugiere que la glicina 84 es muy importante para la función fisiológica de
la lipina-1.
La falta de actividad PAP en los ratones fld, parece contribuir por diferentes mecanismos a la patología observada en
sus tejidos. Por un lado, la deficiencia en la actividad PAP puede dar lugar a la acumulación de su substrato, en este
caso el PA, que es un mediador lipídico cuyo exceso puede interferir en la correcta señalización de importantes
procesos fisiológicos [134]. Experimentos “in vitro” han mostrado que el PA reduce la mielinización y la expresión de
marcadores de diferenciación en las células de Schwann, y además, activa la ruta MEK-ERK, que parece ser
importante en el proceso de desmielinización [133].
Por otro lado, la síntesis defectuosa de TAG afecta directamente a los tejidos cuya función primordial es almacenar
lípidos, como el tejido adiposo, produciendo lipodistrofia. Los ratones fld presentan una reducción del tejido adiposo
del 80%, en comparación con los ratones wild-type, dando lugar a una reducción del 25% en su peso. Además, cuando
estos ratones son alimentados con una dieta rica en grasa no ganan peso [135]. A nivel microscópico, el tejido adiposo
de los ratones fld aparece poco diferenciado, las células tienen aspecto fibroblástico y aparecen pequeñas gotas
lipídicas (fig. 13).
La disminución en la síntesis de TAG en el tejido adiposo de los ratones fld, tiene importantes consecuencias
metabólicas a nivel sistémico. El almacenamiento de grasa juega un papel fundamental como fuente de energía en
períodos de ayuno e inanición. En condiciones normales de alimentación, los ratones utilizan la glucosa como fuente
de energía, mientras que, en situación de ayuno, utilizan en primer lugar, las reservas de glucógeno de hígado y
músculo, y posteriormente las reservas de TAG del tejido adiposo. Los ratones fld, para compensar la ausencia de
tejido adiposo en situaciones de ayuno, incrementan la síntesis de glucógeno y la síntesis hepática de ácidos grasos
para proporcionar energía a los músculos y otros determinados tejidos [136]. El incremento de la oxidación de los ac.
grasos como fuente de energía para los tejidos periféricos, podría ser la causa de la desaparición de hígado graso en los
ratones fld adultos.
Otra consecuencia de la pérdida de actividad lipina-1 en tejidos metabólicos, es una grave alteración de la homeostasis
de la glucosa. Los ratones fld realizan una mala absorción de la glucosa y presentan altos niveles plasmáticos de
insulina tras su administración, lo que indica que tienen resistencia a insulina [137]. El hígado de estos ratones
presentan una sensibilidad a insulina normal, pero la captación de glucosa en tejidos periféricos, tales como tejido
adiposo y músculo esquelético es deficiente. En este sentido, se ha observado que en adipocitos humanos existe una
fuerte correlación positiva entre los niveles de expresión de lipina-1 y el transportador de glucosa 4 (GLUT4)[138].
A pesar de que los ratones fld no poseen un perfil lipídico plasmático con riesgo aterogénico, son mas susceptibles a
padecer aterosclerosis inducida por dieta [137] y, aunque la causa es desconocida, podría deberse al estado de
resistencia a insulina y a una producción anómala de adipoquinas, siendo ambos, factores de riesgo para el desarrollo
de enfermedades cardiovasculares [139].
La lipodistrofia y la obesidad representan los extremos opuestos de un amplio espectro de alteraciones metabólicas del
tejido adiposo, que han sido atribuidas a la disfunción y desregulación de varios genes. Los ratones fld presentan
lipodistrofia, caracterizada por una grave disfunción del tejido adiposo. Al contrario, modelos de ratones transgénicos
que sobreexpresan lipina-1 en adipocitos maduros (aP2-lipina-1 Tg) o en músculo esquelético (Mck-lipina-1 Tg),
presentan obesidad, fenotipo opuesto a la lipodistrofia caracteristica de los ratones fld [140].
Con una dieta equilibrada, los ratones aP2-lipina-1 Tg tienen un peso similar a los ratones controles, mientras que los
ratones Mck-lipina-1 Tg tienen mayor peso a las 10 semanas de edad, y desarrollaron una leve obesidad a las 20
13
semanas (fig. 14A). Cuando los ratones son alimentados con una dieta rica en grasa durante 6 semanas (fig. 14B), tanto
los ratones aP2-lipina-1 Tg cómo los Mck-lipina-1 Tg ganan peso más rápidamente que los ratones controles. Los
ratones Mck-lipina-1 Tg ganan 18 g de peso, en comparación con los 9.9 g de los ratones aP2-lipina-1 Tg y los 5.3 g de
los ratones controles (fig. 14C). El gran aumento de peso de los ratones Mck-lipina-1 Tg, tanto con dieta equilibrada,
como con dieta rica en grasa, se acompaña con una reducción del 15% del gasto energético, disminución de la
temperatura corporal y de la oxidación de ac. grasos en músculo. Estos parámetros del balance energético son
curiosamente opuestos a los que presentaban los ratones fld, que muestran incremento en el gasto energético, elevada
temperatura corporal y aumento de la oxidación de ac. grasos en músculo. Asi pues, parte del fenotipo de los ratones
fld podría ser debido a la ausencia de lipina-1 en músculo.
Por otro lado, la homeostasis de la glucosa es diferente cuando la lipina-1 está sobreexpresada en el tejido adiposo o en
el músculo. A pesar de aumentar de peso, los ratones aP2-lipina-1 Tg aumentan su sensibilidad a insulina, mientras que
los ratones Mck-lipina-1 presentan resistencia a insulina en comparación con los ratones wild-type. La resistencia a
insulina en los ratones Mck-lipin-1 Tg, es probablemente un efecto secundario de la obesidad, aunque no se puede
descartar que sea debido a las alteraciones del metabolismo lipídico en músculo. Los ratones aP2-lipina-1 presentan un
incremento del 60% en el contenido de TAG en el tejido adiposo [140], y éste podría ser la causa de su sensibilidad a
insulina, debido a que una captación e incorporación más eficiente de ac. grasos en el tejido adiposo (en forma de
TAG), hace que otros tejidos metabólicamente activos cómo el músculo y el hígado queden menos expuestos a la
acción de los ac. grasos circulantes.
En el tejido adiposo humano, también existe una correlación positiva entre los niveles de expresión de lipina-1 y
sensibilidad a insulina [125, 141, 142]. Se ha visto que el tratamiento con drogas antidiabéticas incrementa la expresión
de lipina-1 [141]. Además, un estudio ha demostrado que, tras una intervención de reducción de peso, el aumento de
sensibilidad a insulina experimentado iba acompañado de un aumento en la expresión de lipina-1β en hígado y en
tejido adiposo [125]. Por otro lado, la expresión de lipina-1β en tejido adiposo está reducida en pacientes con el
síndrome de ovario poliquístico, los cuales padecen resistencia a insulina [143].
Todas las proteínas de la familia lipinas identificadas hasta el momento tienen actividad PAP dependiente de Mg2+.
Normalmente residen en el citosol y se translocan a la membrana del RE donde desfosforilan al PA (fig. 15).
Las proteínas lipinas también poseen una señal de localización nuclear, y estudios de inmunocitoquímica han
demostrado que la lipina-1 podía estar localizada tanto en el citoplasma, cómo en el núcleo celular, lo que sugiriere una
posible función nuclear [124]. En este sentido, estudios realizados en hígado de ratón han revelado que la lipina-1
también tiene una función nuclear como coactivador transcripcional, regulando la expresión de determinados genes
implicados en la oxidación de ac. grasos [129].
En mamíferos, la ruta del glicerol-fosfato es la responsable de la síntesis de TAG en la mayor parte de los tejidos,
incluyendo el tejido adiposo [145]. La síntesis de TAG desde el glicerol-3-fosfato, ocurre a través de una serie de
reacciones donde se van añadiendo grupos acilos, catalizadas por diferentes clases de enzimas (fig. 15).
Las propiedades bioquímicas de las enzimas responsables de la producción de DAG a partir de PA han sido estudiadas
durante mas de 25 años y han sido clasificadas en dos grupos, en función de sus propiedades enzimáticas y su
localización subcelular [146]. La actividad PAP (previamente conocida como PAP-1) se localiza en el citosol y se
transloca a la membrana del RE para realizar su acción enzimática. Estas enzimas requieren Mg2+ para su actividad y
son sensibles al agente bloqueante de grupos tiol N-etil maleimida (NEM). Por otro lado se encuentra la actividad LPP
14
(lipid phosphate phosphatase), anteriormente conocida como PAP-2, que es independiente de Mg2+, resistente a NEM,
localizada en la membrana plasmática y no implicada en la síntesis de TAG a través de la ruta del glicerol-fosfato.
Las proteínas responsables de la actividad PAP en mamíferos no han sido identificadas hasta muy recientemente.
Estudios realizados en Saccharomyces cerevisiae permitieron purificar e indentificar la proteína Pah1p, una
fosfohidrolasa de PA de levaduras [147]. Mediante análisis de similitud de secuencias, se descubrió que la Pah1p era
una proteína ortóloga de las lipinas humanas. La actividad PAP fue confirmada posteriormente y también se observó
que tiene específicidad para PA y no para otros substratos que pueden usar las LPPs, como el ac. lisofosfatídico, la
ceramida-1-fosfato o la esfingosina-1-fosfato [130].
La actividad enzimática de las lipinas reside en el motivo DxDxT que está presente en el dominio C-LIP de Pah1p y de
todos los miembros de la familia lipina y está conservado en todos los reinos estudiados, desde levaduras hasta
mamíferos. La presencia de este motivo DxDxT, identifica las lipinas como miembrso de la superfamilia HAD
(haloacid dehalogenase). El primer residuo de aspartato en este motivo es necesario para la actividad catalítica de la
enzima, puesto que su mutación (D712E) inhibe la actividad PAP en la lipina-1[129].
Estudios en los ratones fld, han demostrado que gran parte de la actividad PAP en determinados tejidos, como tejido
adiposo y músculo esquelético es debido a la acción de la lipina-1. Estos datos son consistentes con la ausencia de
TAG en el tejido adiposo de los ratones fld y también con la acumulación de TAG en los adipocitos de los ratones ap2lipina1 Tg que sobreexpresan lipina-1 específicamente en el tejido adiposo [140]. La actividad PAP también está muy
disminuida en el corazón, pulmón y riñón de los ratones fld [148]. Sin embargo, en el hígado de los ratones fld, la
actividad PAP es normal, sugiriendo que quizás otro miembro de la familia podía ejercer un efecto compensatorio en
este tejido. Atendiendo a esta posibilidad, se ha observado que los niveles de expresión de ARNm de la lipina-2 en el
hígado de ratones wild-type y fld son normales, pero sin embargo, los niveles de expresión de la lipina-3 en hígado de
los ratones fld aumentan de modo considerable [130].
Posteriormente, se atribuyó un papel fundamental a la lipina-2 en hígado [149], debido a estudios de silenciamiento
génico de lipina-2 realizados en hepatocitos, tanto en ratones wild-type como ratones fld, donde se observó que la
actividad PAP disminuía de modo drástico en ambos casos, fundamentalmente en los ratones fld. Aunque la expresión
de ARN mensajero de la lipina-2 en hígado de los ratones fld no cambia en relación con los ratones wild-type, estudios
realizados con [35S]-metionina [149], demuestran que la síntesis de proteína es mayor, lo que sugiere que la inducción
proteica de lipina-2 es independiente de los niveles de ARN mensajero. Sin embargo, en células HeLa, el tratamiento
con siRNA frente a lipina-2 produce un incremento de la actividad PAP, debido a una compensación mediada por la
inducción de la expresión de lipina-1 [150]. Aunque no hay razones obvias para justificar estas diferencias, parece
evidente que la actividad PAP de lipina-1 y lipina-2 es dependiente del tipo celular.
Por otro lado, la sobreexpresión de lipina-2 en hepatocitos primarios de ratón por infección con adenovirus, no
conlleva ni un aumento en la actividad PAP, ni en la síntesis de TAG. Esto podría ser debido a que la expresión basal
de lipina-2 en estas células es muy alta, y una mayor expresión no afecta a su capacidad para producir TAG.
Contrariamente, cuando las células de hígado HepG2, cuya expresión basal de lipina-2 es muy baja, sobreexpresan
lipina-2, aumentan de modo considerable su actividad PAP, pero esto tampoco afecta a sus niveles de TAG [149]. Por
tanto, una actividad PAP residual parece ser suficiente para mantener una síntesis fisiológicamente normal de TAG.
Hoy por hoy, se considera que la enzima glicerol fosfato acil transferasa (GPAT) es el paso limitante en la síntesis de
TAG [151].
El DAG que se forma gracias a la actividad PAP, además de ser substrato para la biosíntesis de TAG, también es
15
sustrato para la síntesis de fosfolípidos. Hasta el momento, se conoce poco sobre el papel fisiológico que pueden
desempeñar las lipinas en la biosíntesis de fosfolípidos en mamíferos. Sin embargo, recientemente, se ha implicado a
lipina-1 en el incremento de la síntesis de fosfolípidos que acompaña al aumento de RE que tiene lugar durante la
diferenciación de los linfocitos B [152]. Con estos estudios en mente, existe la posibilidad de que la familia de
proteínas lipinas tengan funciones adicionales en procesos donde sea necesario el aumento de síntesis de membranas.
A pesar de que todos los miembros de la familia lipina presentan actividad PAP, se ha observado que, la isoforma más
grande, la lipina-1b, tiene mayor actividad específica que la isoforma más corta, lipina-1α (tabla 1). Debido a que la
única diferencia que existe entre ambas proteínas es de sólo 33 aminoácidos, y que éstos se encuentran alejados del
motivo catalítico, la diferencia en actividad podría estar relacionada con su estructura ternaria y/o cuaternaria. Por otro
lado, la Vmax para la lipina-2 es similar a la de lipina-1α, mientras que la Vmax de la lipina-3 es algo más baja. Todas las
proteínas lipinas muestran fuerte cooperatividad positiva hacia el PA, según los valores del coeficiente de Hill.
La proteína ortóloga de la lipina en Saccharomyces pombe, conocida como Ned1p, interacciona con tres proteínas
nucleares que tienen una importante función en la formación de la envoltura y el transporte nuclear [153]. Además en
Saccharomyces cerevisiae, la actividad Pah1p regula el crecimiento de la membrana nuclear durante el ciclo celular
[154]. Las proteínas lipinas de mamíferos, también tienen una función nuclear como coactivadores transcripcionales
(fig. 16). En estudios con ratones knock-out del PPARγ coactivador-1α (PGC-1α), se descubrió que la lipina-1
requería la presencia de PGC-1α para la activación de los genes responsables de la oxidación de ac. grasos inducida
por ayuno (acil-CoA oxidasa, acil-CoA deshidrogenasa y carnitina palmitoil transferasa) [129]. Esto ocurre a través de
la unión de lipina-1 con PGC-1α y PPARα dando lugar a la formación de un complejo multiproteíco que modula la
transcripción génica. Esta interacción se realiza por medio de un motivo rico en leucinas (LxxIL) en el dominio C-LIP.
Por otro lado, la sobreexpresión de lipina-1 en hepatocitos reprime la expresión de genes implicados en lipogénesis,
como ac. graso sintasa o estearoil-CoA desaturasa [129]. Además de PPARα, la lipina-1 interacciona con HNF4α,
PPARβ, PPARγ y el receptor de glucocorticoides. Aunque lipina-1 no posee un dominio de unión a ADN,
experimentos de inmunoprecipitación de cromatina han revelado interacciones en forma de complejos con el promotor
del gen de PPARα, lo mismo que ocurre con la interacción del análogo Smp2 con los promotores que regulan la
síntesis de fosfolípidos en levaduras [154].
Los efectos descritos de lipina-1 como coactivador transcripcional sobre el metabolismo lipídico hepático están en
concordancia con el fenotipo de los ratones fld. Los ratones fld tienen hiperlipidemia [131] y los hepatocitos aislados
de ratones recién nacidos presentan una oxidación de ac. grasos disminuida [155]. Asi pues, podría ser que la
activación de lipina-1 en hígado rebajara los niveles circulantes de lípidos a través de la reducción de la secreción de
TAG, y además incrementa la β-oxidación hepática.
Con respecto a la actividad transcripcional de las proteínas lipina-2 y lipina-3, se conoce relativamente poco. Ambas
poseen el motivo LxxIL para interaccionar con receptores nucleares y estudios iniciales sugieren que lipina-3 puede
interaccionar físicamente con PPARα [129]. La lipina-2 muestra “in vitro” una actividad como coactivador
transcripcional similar a lipina-1[127], pero su actividad “in vivo” no ha sido todavía demostrada.
A pesar de no ser muy común, esta función dual de actividad enzimática y coactivador transcripcional no sólo ocurre
en las proteínas lipinas, sino que tiene lugar en otras enzimas metabólicas, como por ejemplo, la gliceraldehido-3fosfato deshidrogenasa [156] y la N-acetil-glucosamina transferasa [157].
16
1.6. Regulación de la expresión y la actividad de las proteínas lipinas
La regulación de la lipina-1 parece ser bastante compleja, ocurriendo a diferentes niveles: transcripción de ARN
mensajero, procesamiento de ARN, fosforilación y localización subcelular.
1.6.1. Regulación transcripcional
La actividad PAP ha sido objeto de estudio durante mas de 25 años. Antes de que se identificaran las proteínas lipinas,
ya se conocía que la actividad PAP en el hígado aumenta con la diabetes en condiciones de ayuno, y en respuesta a
glucocorticoides. Sin embargo, en el tejido adiposo ocurre lo contrario; la actividad PAP disminuye con el ayuno y en
diabetes, disminuyendo la síntesis de TAG y aumentando la lipolisis [158]. Así pues, parece ser que la regulación de la
actividad PAP es específica para cada tejido.
La expresión de la lipina-2 y lipina-3 no está afectadas por glucocorticoides, por lo que este estímulo sólo debe
modular los niveles de expresión de la lipina-1. El efecto de los glucocorticoides sobre la lipina-1 es favorecido por
AMP cíclico y glucagón, y es reprimido por insulina. Además, la expresión de lipina-1 es inducida en el tejido adiposo
con drogas para combatir la diabetes, como son tiazolidinedionas y harminas lo que refuerza la correlación existente
entre los niveles de lipina-1 y sensibilidad a insulina [141, 159].
Un interesante vínculo entre los niveles celulares de colesterol y la biosíntesis de TAG fue descubierto gracias a un
estudio realizado en células humanas de hepatoblastoma, donde se observó que la reducción de esteroles inducía la
expresión de la lipina-1. Esta inducción parece estar regulada por los factores de transcripción SREBP1 (sterol
regulatory response element binding protein 1) y NF-Y (nuclear factor Y) [160] (fig. 17).
Los ácidos grasos de la dieta, en particular los saturados, inducen de forma considerable la expresión de lipina-1 en
hígado, un efecto que está modulado por PPARα [161]. Este efecto podría ser considerado como una herramienta extra
que facilita al hígado incrementar la síntesis de TAG, protegiéndolo de los efectos lipotóxicos de elevadas
concentraciones de ac. grasos y acil-CoA sin esterificar.
Otros estímulos como los estrógenos, reprimen la expresión de lipina-1 en útero e hígado, sugiriendo una posible
función de lipina-1 en biología reproductiva [163]. Además, elevados niveles de estrógenos en ratones diabéticos no
obesos y con problemas de fertilidad, muestran una reducción de lipina-1 en hígado y útero, y éste estado puede ser
revertido mediante la administración de insulina [163].
La expresión de lipina-1 también es reprimida en adipocitos por la activación de los receptores TLR2 y TLR4 por
zimosán y lipopolisacárido respectivamente [164]. Estos efectos parecen ser mediados por citoquinas proinflamatorias
implicadas en obesidad y resistencia a insulina, tales como TNFα e IL-1. La expresión de lipina-1 está disminuida en
adipocitos en cultivo tras el tratamiento con TNFα y este efecto desaparece cuando se inhibe la ruta de señalización
mediada por Jak2 [165].
Se sabe que en estados de inflamación y sepsis se produce liberación de ac. grasos desde el tejido adiposo, por lo que la
represión de la lipina-1 podría contribuir a la reducción de la síntesis de TAG en estas condiciones. Además, se ha
descrito recientemente en adipocitos, que la lipina-1 puede reprimir la actividad transcripcional NFATc4 (nuclear
factor of activated T cells c4) a través de su interacción con el promotor, inhibiendo la expresión de determinados
genes cómo TNFα, resistina, FABP4 y PPARγ [166].
17
Por otro lado, debido a las funciones descritas de las proteínas lipinas, tanto en la biosíntesis de glicerolípidos, como en
la regulación de genes implicados en metabolismo lipídico y en la biogénesis de la membrana, la regulación de su
expresión parece ser un factor clave en el ensamblaje y secreción de las lipoproteínas hepáticas VLDL [167].
1.6.2. Regulación por procesamiento alternativo
Como se ha descrito anteriormente, la lipina-1 es expresada en dos isoformas generadas por procesamiento alternativo,
conocidas como lipina-1α y lipina-1β teniendo ésta última 33 aminoácidos adicionales que no están presentes en la
lipina-1α. El procesamiento parece tener una regulación específica en cada tejido. Así pues, en determinados tejidos
como, cerebro, bazo y preadipocitos predomina la isoforma lipina-1α, mientras que en hígado, corazón, riñón y
adipocitos maduros, predomina la isoforma lipina-1β [124]. Lipina-1αes la principal isoforma de lipina-1presente en
preadipocitos sin diferenciar, y con el tratamiento de diferenciación, la expresión de lipina-1β es inducida y es la
forma predominante en adipocitos maduros. Hasta el momento se sabe relativamente poco sobre la regulación del
procesamiento y su relevancia fisiológica.
1.6.3. Regulación por fosforilación
La identificación de las secuencias nucleótidicas de las lipinas ha permitido estudiar su regulación a nivel
transcripcional y post-transcripcional. Desde hace mucho tiempo se sabía que la actividad PAP era regulada por
fosforilación [168], pero sólo recientemente se han identificados múltiples residuos de fosforilación en respuesta a
insulina [148, 169] (fig. 18). Tres de los sitios de fosforilación identificados en la proteína lipina-1 (Ser106, Ser634 y
Ser720) están conservados en los tres miembros de la familia lipina y además en la proteína ortóloga en levaduras. La
Ser106, parece ser el principal sitio de fosforilación por insulina y es dependiente de la ruta mTOR, como se ha
demostrado con el uso del inhibidor rapamicina. Al contrario que la insulina, la epinefrina y el ac. oleico provocan la
desfosforilación de la lipina-1[148].
La fosforilación de la lipina-1 no parece afectar a la actividad PAP, pero sí a su localización subcelular, promoviendo
su translocación de la fracción microsomal a la fracción soluble celular. Por el contrario, cuando es desfosforilada, su
localización es fundamentalmente microsomal. Estudios en células HeLa han mostrado que, tanto la lipina-1 como la
lipina-2 son fosforiladas durante la mitosis en sitios consenso de fosforilación de quinasas dependientes de ciclinas
(Cdk1) [150] y, a diferencia de lo que ocurre con las fosforilaciones en situaciones metabólicas, la fosforilación
disminuye la actividad PAP y la desfosforilación la aumenta. La lipina-1 es desfosforilada por la fosfatasa Dullard
[170], pero su función en la regulación de la actividad PAP es aún desconocida. En levaduras, las enzimas responsables
de la fosforilación (Cdc28/Cdk1) y defosforilación (Nem1/Spo7) también han sido identificadas[154].
1.6.4. Regulación por localización subcelular
Todas las proteínas de la familia lipina poseen una o mas señales de localización nuclear (NLS). Sin embargo, estudios
en adipocitos y células hepáticas muestran que la lipina-1α está localizada fundamentalmente en el núcleo, mientras
que la lipina 1β es citoplásmica [124, 167, 171]. La deleción de la secuencia NLS impide la localización nuclear de la
lipina-1α y también su capacidad para asociarse a las membranas microsomales, pero no afecta en absoluto a su
actividad PAP. Esto indicaría que el sitio NLS también podría tener una función importante para su orientación en las
membranas. Además, estudios con la lipina-1α mutante en el sitio NLS, muestran una deficiente síntesis y secreción
de TAG en comparación con la lipina-1α wild type [167]. Estos datos reflejan la importancia de la compartimentación
de las lipinas en la regulación de su función.
18
Se han identificado diversos mecanismos moleculares que regulan la distribución subcelular de la lipina-1 (fig. 19). Así
por ejemplo, la sumoilación es un proceso clave en la localización nuclear de la lipina- 1α en células neuronales [172],
y la interacción de la lipina-1α con proteínas 14-3-3 es determinante para su localización citoplasmática en células
HEK293 y adipocitos 3T3-L1 [171]. La interacción entre la lipina-1α citoplásmica y las proteínas 14-3-3, es
promovida por la insulina, que además incrementa la fosforilación de lipina-1.
Por último, mediante estudios de co-inmunoprecipitación se ha descrito que las proteínas lipinas pueden asociarse entre
ellas formando homo- y heterodímeros estables (tetrámeros) [173]. El proceso de oligomerización es independiente de
la actividad PAP. La lipina-2 parece que tiene diferente localización subcelular que la lipina-1, apareciendo
predominantemente cerca de la envoltura nuclear [150]. Debido a que en mamíferos las lipina-2 y lipina-3 poseen una
Vmax menor que la lipina-1, la formación de heterodímeros entre lipina-1 y lipina-2, podría permitir el reclutamiento de
la lipina-1 hacia el núcleo para obtener una mayor actividad PAP en la envoltura nuclear.
1.7. Implicación de las proteínas lipinas en enfermedades humanas
Como se ha descrito anteriormente, la mutación del gen Lpin1 en ratones causa lipodistrofia y otras afecciones. Sin
embargo, las mutaciones que causan lipodistrofia en humanos, descritas hasta el momento, no corresponden al gen
LPIN1 [174, 175]. Tampoco los sujetos analizados en estos estudios presentaban características del fenotipo de los
ratones fld, como por ejemplo, hígado graso transitorio y neuropatía periférica. A pesar de esto, en determinadas
poblaciones se han identificado variaciones genéticas del gen LPIN1 asociadas con componentes del síndrome
metabólico. Existen asociaciones entre polimorfismos y haplotipos del gen LPIN1 con múltiples marcadores, como
índice de masa corporal, niveles de insulina, niveles de ac. grasos y presión sanguínea [175-178]. Además,
polimorfismos específicos del gen LPIN1 están asociados a la respuesta al tratamiento con tiazolidinedionas frente a la
diabetes tipo 2 [179].
Se han estudiado los niveles de expresión de lipina-1 en tejido adiposo en pacientes con VIH que desarrollaban
lipodistrofia y los que no. Corroborando la función que desempeña la lipina-1 en el desarrollo del tejido adiposo, los
pacientes con VIH que desarrollan lipodistrofia muestran disminución de la expresión de lipina-1 en comparación con
los pacientes sin lipodistrofia [180].
La primera mutación de LPIN1 descrita fue una mutación sin sentido, dando lugar a una proteína truncada (fig. 20).
Presentaba un patrón de herencia recesiva, afectando a tres hijos de una familia. Esta mutación causa mioglobinuria
durante la infancia [181], probablemente debido a la acumulación de lisofosfolípidos y PA en músculo. Los pacientes
afectados presentan una distribución de grasa y peso normales, sugiriendo que en el tejido adiposo puede haber algún
tipo de compensación con alguna de las otras dos proteínas, como la lipina-2 que, como se muestra en la fig. 2, también
se expresa mucho en el tejido adiposo humano [130].
La mutación en el gen LPIN2, causa una rara enfermedad recesiva conocida con el nombre de síndrome de Majeed
[182-184], que se caracteriza por osteomielitis multifocal crónica recurrente, anemia diseritropoyética e inflamación
cutánea, lo que demuestra que al menos ciertas funciones de la lipina-2 no puede ser sustituidas por ninguna de los
otros miembros de la familia. Estos síntomas pueden ser debidos a la ausencia de lipina-2 en eritrocitos y linfocitos,
donde la lipina-2 parece ser la proteína mas expresada de la familia [127]. El mecanismo por el cual la pérdida de
lipina-2 causa estos síntomas inflamatorios es desconocido. Sin embargo, se ha observado que la expresión de lipina-2
es inducida en hígado y pulmón en respuesta a estrés oxidativo, sugiriendo una posible función de esta proteína en el
control de la inflamación por estrés oxidativo [185, 186]. Varias mutaciones puntuales en la lipina-2 también han sido
19
asociadas a psoriasis, aunque las consecuencias funcionales de las sustituciones en esos aminoácidos no han sido
evaluadas [187].
Además, un amplio análisis genético en pacientes con diabetes tipo 2 ha mostrado una gran asociación entre un
polimorfismo del gen LPIN2 y el riesgo a padecer diabetes, índice de masa corporal, distribución de grasa y niveles de
glucosa e insulina [188, 189].
Hasta el momento la lipina-3 es la menos estudiada y no se conoce nada sobre su función en humanos o su posible
implicación en enfermedades humanas. En experimentos in vitro, la lipina-3 posee una actividad PAP que corresponde
al 20% de la actividad específica de la lipina-1 [130]. Su expresión es principalmente detectada en el tracto
gastrointestinal e hígado. Aunque la expresión de lipina-3 es mucho menor que la lipina-1 y lipina-2, su expresión
aumenta en el hígado de los ratones fld, y podría compensar la actividad PAP en este tejido [130].
2. OBJETIVOS
El estudio de las enzimas implicadas en la síntesis de TAG en un contexto inmunológico podría no sólo desvelar
nuevas vías de conexión entre inmunidad y sistema metabólico, sino permitir también el desarrollo de nuevas
estrategias en el control de los procesos inflamatorios y, especialmente, de aquellos que tienen lugar durante la
obesidad. Hasta el momento se desconoce el papel de las lipinas en el sistema inmunológico y más concretamente en la
inflamación desencadenada por concentraciones elevadas de ac. grasos.
Debido a la función metabólica de las lipinas y a que recientemente se ha descrito que los ac. grasos pueden modular la
respuesta inflamatoria de los macrófagos, el trabajo experimental de la presente Tesis Doctoral se centra en el estudio
de la respuesta inflamatoria inducida en macrófagos tras tratamiento con ac. grasos saturados y su posible regulación
por lipina. Este objetivo general se puede desglosar en varios objetivos más específicos:
2.1.Caracterizar la respuesta proinflamatora inducida por ac. grasos saturados tanto en macrófagos de ratón, como en
macrófagos en humanos, definiendo los receptores a través de los cuales se produce, las rutas metabólicas y la
señalización intracellular correspondientes, así como las moléculas proinflamatorias que se producen.
2.2. Determinar si las proteínas de la familia lipina modulan la respuesta inflamatoria en macrófagos tratados con ac.
grasos.
2.3. Definir los mecanismos por los cuales, la lipina regula la respuesta proinflamatoria en macrófagos. Entre otros se
estudiará la implicación del estrés de RE, la activación de NF-κB, la activación de las MAPKs y el papel de las
ceramidas.
2.4. Determinar los cambios metabólicos que tienen lugar durante la activación macrofágica cuando se reduce la
expresión de lipina.
2.5. Estudiar la localización celular de la lipina durante la activación macrofágica por ácidos grasos.
3. MATERIALES Y METODOS
4. RESULTADOS
20
5. DISCUSION
El trabajo experimental realizado en la presente tesis doctoral pone de manifiesto la relevancia de la enzima lipina-2 en
la regulación de la señalización proinflamatoria desencadenada por los ac. grasos saturados en macrófagos. Los
resultados apuntan a que la expresión de lipina-2 disminuye la indución de genes proinflamatorios como IL-6, Ccl2,
TNFα y COX-2, mientras que su eliminación exacerba la producción de estos genes. Por otra parte, la lipina-2 parece
controlar la aparición de estrés de retículo, la activación de NF-κB y la activación de AP-1 a través de JNK. De todas
ellas, sólo la activación de JNK parece tener un papel importante en la sobreexpresión de genes proinflamatorios
promovida por la falta de lipina-2 en células tratadas con ac. grasos saturados. Atendiendo a todo ello, tanto el control
de la expresión como el control de la actividad de la lipina-2 podrían ser herramientas de utilidad para combatir, al
menos parcialmente, la inflamación asociada a enfermedades metabólicas como la obesidad, la diabetes mellitus tipo 2
y la aterosclerosis.
La idea de que las enzimas con actividad PAP estén implicadas en la señalización proinflamatoria ha venido siendo
objeto de investigación durante más de una década. Existen estudios anteriores en la línea celular humana derivada de
amnios, WISH, que relacionan la actividad PAP con la activación de enzimas implicadas en la generación de lípidos
proinflamatorios, como el AA o su metabolito oxigenado la prostaglandina E2 [237]. En ellos se describe que la
actividad PAP es necesaria para la activación de la fosfolipasa A2, que libera ac. araquídónico de los fosfolípidos de
membrana, y también para la inducción génica de COX-2, una de las enzimas que metabolizan este ac. Graso a
eicosanoides. Posteriormente, esta idea ha sido también corroborada en la línea promonocítica humana U937,
utilizando LPS como estímulo [238]. Sin embargo, uno de los problemas metodológicos de estos trabajos era el uso de
inhibidores inespecíficos de la actividad PAP, como el propranolol o la bromoenol-lactona [239]. La identificación de
la secuencia génica de las lipinas en el 2006 por el grupo de Carman [147], ha permitido en el presente estudio la
utilización de siRNAs específicos para las distintas proteínas con actividad PAP, ayudándonos a definir de forma
específica el papel de la lipina-2 en un contexto inflamatorio más metabólico que el descrito en los trabajos anteriores.
El hecho de que la lipina-2 sea el gen mutado causante del síndrome de Majeed [182-184] y de algunos tipos de
psoriasis, cuyas manifestaciones clínicas los definen como enfermedades con un claro componente inflamatorio,
consolida la idea de que la lipina-2 es un importante regulador inmune. No se han publicado, hasta el momento,
estudios en humanos o roedores que exploren esta posibilidad, por lo que los resultados de la presente tesis serían los
primeros en demostrar molecularmente la implicación de la lipina-2 en inflamación. En este contexto, sería fácil
especular que los episodios de inflamación que tienen lugar en los pacientes anteriormente mencionados, podrían estar
iniciados, al menos en parte, por la activación de TLR por ac. grasos saturados provenientes de la dieta o de los propios
tejidos de los pacientes alterados metabólicamente, o bien por moléculas que contengan patrones asociados a patógenos
provenientes de infecciones. En estas condiciones la falta de lipina-2 exacerbaría el estado inflamatorio generando más
citoquinas proinflamatorias y contribuyendo al mantenimiento de la inflamación. En esta línea de pensamiento, se ha
descrito que los pacientes obesos con psoriasis son más difíciles de tratar que los pacientes no obesos, se recuperan
parcialmente cuando pierden peso, y empeoran cuando lo ganan [240, 241].
En un estudio reciente realizado en la población holandesa se ha descrito que el polimorfismo de un único nucleótido
(SPN9) en la región 3´ no codificante del gen LPIN2 está asociado de forma significtiva con el índice de masa
corporal, la distribución corporal de la grasa y la aparición de diabetes tipo 2 [188]. Puesto que SPN9 es un
polimorfismo no codificante, los autores discuten que este cambio debe alterar los niveles de expresión de LPIN2,
aumentando la obesidad y la diabetes, y lo proponen como candidato como alelo “thrifty” (económico), que en algún
momento de la evolución hubiera supuesto una ventaja metabólica para aquellos individuos que la portaran, pero en el
21
actual contexto de abundancia calórica, supone una desventaja. En espera de las consecuencias moleculares de este
polimorfismo, estos resultados están de acuerdo con los presentados en esta memoria en cuanto a que cambios en los
niveles de lipina-2 en humanos tienen una proyección real en el desarrollo de enfermedades como la diabetes de tipo 2,
que están muy influenciadas por el grado de inflamación del tejido adiposo del paciente.
5.1. La expresión de las proteínas lipinas en células del sistema inmune
En la literatura, pocos trabajos analizan la expresión o actividad de las lipinas en tejidos o células del sistema inmune.
En un reciente trabajo se ha descrito por técnicas de PCR la expresión génica de la lipina-1, -2 y -3 en tejidos linfoides
como el bazo, el timo y también en médula ósea de ratón [127]. Mientras que la lipina-1 apenas era detectada en estos
tejidos [127], todos ellos expresaban lipina-2, pero el nivel de expresión era 10 veces menor que en tejidos
metabólicamente activos como el hígado, donde alcanza los niveles más altos. La lipina-3 se expresaba en bazo y timo,
aunque sus niveles eran un 50% menor que en hígado [127]. Los autores del trabajo especulan basándose en estos
resultados que la lipina-2 es la enzima PAP más prominente en tejidos linfoides.
Los experimentos descritos en este trabajo muestran que todas las células inflamatorias analizadas, los macrófagos de
ratón RAW 264.7, los monocitos humanos y los macrófagos derivados de monocitos humanos expresan mRNA para
lipina-1α, -1β, -2 y -3. Puesto que no se han realizado experimentos de actividad, no es posible saber cómo contribuye
cada una de ellas a la actividad PAP celular total.
Una de las preguntas que surgen de estos estudios es si la expresión de cada una de estas enzimas cambia durante la
maduración de monocito a macrófago, y si ello afecta al proceso de diferenciación per se, como ocurre durante la
diferenciación adipocítica [150]. La maduración de preadipocito a adipocito supone la disminución de la expresión de
lipina-2 y la aparición secuencial de las lipinas-1α y –1β, que a su vez intervienen directamente en el proceso de
diferenciación, regulando la expresión de PPARγ, un gen esencial en este proceso [242].
5.2. Los ácidos grasos saturados incrementan la expresión de citoquínas proinflamatorias a través de TLR2/4 en
macrófagos.
En los experimentos realizados en este trabajo con células RAW 264.7 y con macrófagos humanos, se ha observado
que todos los ac. grasos saturados utilizados: ac. láurico, ac. mirístico y ac. palmítico, inducen la expresión de los
genes proinflamatorios analizados. De entre ellos se escogió el ac. palmítico como modelo de activación, debido a que
es el ac. graso saturado más abundante en plasma [199]. Otros autores utilizan una mezcla de ac. grasos saturados e
insaturados para la activación de los macrófagos [60], que a pesar de ser una forma de estimulación tal vez más
fisiológica, dificulta la interpretación de los resultados, ya que es no es posible conocer la contribución de cada ac.
graso por separado a la respuesta inflamatoria.
Una de las razones por las que se comenzó a pensar que los TLRs podían tener un papel importante en la inducción de
inflamación durante la obesidad fue debido a que los ratones deficientes de TLR4 son menos propensos a desarrollar
obesidad y resistencia a insulina por una dieta rica en grasa. Como dato adicional, estos ratones también desarrollan
menos aterosclerosis [243]. Posteriormente se demostró en células RAW 264.7 que los ac. grasos saturados inducen la
activación de factores de transcripción proinflamatorios como NF-B, a través de TLR4 [64, 244, 245]. Los resultados
de este trabajo, obtenidos en células RAW 264.7 con una reducida expresión de TLR2 y TLR4 (por silenciamiento
génico), corroboran que los efectos proinflamatorios inducidos por ac. palmítico dependen de estos receptores. Los
mismos resultados se obtuvieron utilizando macrófagos diferenciados a partir médula ósea procedentes de ratones
22
deficientes de TLR4. Esta segunda aproximación tenía dos ventajas con respecto a la primera: por un lado, las células
utilizadas no son líneas celulares, y por otro lado, se evitaban las posibles alteraciones celulares debidas a los
procedimientos de transfección.
A pesar de todas las evidencias acumuladas hasta el momento, existe hoy en dia un debate abierto en torno al
mecanismo por el cual los ac. grasos insaturados inducen inflamación. Hay autores que no están de acuerdo con lo
expuesto anteriormente y argumentan que los ac. grasos no estimulan directamente los TLRs, sino que la inducción de
genes proinflamatorios es debida a la contaminación de la albúmina que se utiliza para complejar los ac. grasos, por
LPS u otros PAMPs [246]. En nuestros estudios es fácil descartar esta posibilidad, debido a que la albúmina utilizada
es preparada en condiciones de esterilidad y filtrada previamente antes de su utilización. Por otra parte, al inicio de la
experimentación presentada se realizaron controles con células tratadas únicamente con albúmina, y en ellos se observó
que ésta no induce la expresión de genes proinflamatorios. La mejor evidencia de que la albúmina no está alterando los
resultados, fueron los experimentos de activación con ac. oleico (que también va complejado con albúmina), donde
apenas se observa inducción de genes proinflamatorios.
5.3. Papel de la lipina-2 en la expresión de genes proinflamatorios inducida por ácidos grasos saturados.
El mecanismo por el que los ac. grasos saturados activan la respuesta inflamatoria en los macrófagos no ha sido bien
definido hasta el momento, y su estudio puede contribuir a desarrollar herramientas terapéuticas para combatir
enfermedades metabólicas con un importante componente inflamatorio como son la diabetes, ateroesclerosis, etc.
¿Cuál es el papel de la lipina-2 en la inducción de inflamación por ac. grasos? Los ac. grasos no sólo activan las
células por su interacción con TLRs, sino que también pueden entrar en ellas debido a su naturaleza liposoluble o a
través de transportadores como el CD36, incrementando su concentración intracelular e incorporándose en la ruta
biosintética lipídica que culminará en un aumento de los TAG celulares y una reducción de la concentración libre
celular de ac. grasos. Ambos procesos son importantes en la indución de inflamación. Anteriormente se ha expuesto la
importancia de los TLRs en este proceso. Un defecto en la esterificación de ac. grasos (especialmente saturados) en los
TAG celulares, por ejemplo alterando la expresión o actividad de las enzimas que intervienen en la ruta de síntesis de
TAG, tambien genera señales lipotóxicas y proinflamatorias [226]. Como ejemplo alternativo al de la lipina-2, los
niveles de expresión de la acil CoA:DAG aciltransferasa (Dgat1) se han relacionado con la capacidad de los
macrófagos para producir citoquinas proinflamatorias en animales alimentados con dieta rica en grasas [247]. La
sobreexpresión de la Dgat1 específicamente en macrófagos y adipocitos, disminuye la producción de estas citoquinas
en los ratones al tiempo que aumenta la capacidad de estas células para almacenar TAG [247].
Las diferencias observadas en los efectos proinflamatorios inducidos por los ac. grasos saturados y el ac. oleico,
pueden ser debido a que el ac. oleico se incorpora con mayor facilidad que los primeros en TAG. En este sentido,
estudios realizados en fibroblastos de ratones carentes de Dgat1, donde la síntesis de TAG está muy disminuída, el ac.
oleico produce los mismos efectos lipotóxicos que el ac. Palmítico [226]. Sin embargo, en los experimentos
presentados en esta tesis, el ac. oleico apenas promueve la inducción de genes proinflamatorios en ausencia de lipina-2,
aún cuando la incorporación de ac. oleico en TAGs también está muy afectada.
Otro ejemplo claro de los efectos inflamatorios producidos por ac. grasos saturados endógenos fue descrito
recientemente en un trabajo realizado en ratones knockout de la enzima estearoil-CoA-desaturasa-1 (SCD-1 -/-) [248].
Esta enzima cataliza la conversión de ac. esteárico (18:0) y ac. Palmítico (16:0) en ac. oleico (18:1) y ac. palmitoleico
(16:1), respectivamente, convirtiendo por tanto, los ac. grasos saturados en ac. grasos monoinsaturados. Se observó que
23
los ratones SCD-1 -/- presentaban una mayor colitis inflamatoria bacteriana que los ratones control [248]. Además, la
inhibición farmacológica de la actividad enzimática de SCD1 en macrófagos procedentes de ratones alimentados con
una dieta rica en grasa, producía una mayor vulnerabilidad a la aterosclerosis [249].
En todo caso, el daño que el exceso de ac. grasos intracelulares pueda causar depende en gran parte de la activación de
los TLRs, ya que en ausencia de estos receptores la indución de genes proinflamatorios está muy disminuida, mientras
que el uso de chaperonas químicas que secuestran intracelularmente ac. grasos, sólo disminuye en un 50% la respuesta
inflamatoria, tanto en presencia, como en ausencia de lipina-2.
Dentro de la ruta de biosíntesis lipídica, las lipinas producen la desfosforilación del PA para convertirlo en DAG [130].
Ambos lípidos son importantes moléculas señalizadoras intracelulares con capacidad de regular la actividad y función
de diversas proteínas entre las que se incluyen la proteina quinasa C, los factores intercambiadores de guanina, o
proteínas “scaffold”, importantes en transducción de señal [250, 251]. Por tanto, existe la posibilidad de que los
cambios producidos en los nivels de PA/DAG durante la activación celular por ac. grasos, pudieran ser responsables, al
menos, parcialmente de la inducción génica observada en estas condiciones. Del mismo modo, alteraciones en la
expresión o actividad de la lipina-2 promovería también cambios en los niveles de PA/DAG durante la activación
celular, contribuyendo a una excesiva inducción de genes proinflamatorios. En este sentido, en el presente trabajo se ha
observado que los niveles de DAG aumentan tras el tratamiento celular con ac. palmítico y la falta de lipina-2
incrementa aún más su concentración celular.
Según todo lo expuesto, la lipina-2 podría estar involucrada en los dos procesos por los cuales los ac. grasos controlan
el estado proinflamatorio de los macrófagos; por un lado, la señalización a través de los TLR y por otro, el daño
producido por altas concentraciones de ac. grasos intracelulares. Posiblemente, ésta sea la razón por la que en ausencia
de lipina-2, las respuestas observadas, especialmente en la inducción de genes proinflamatorios, sean siempre
sinérgicas. De hecho, la ausencia de lipina-2 por sí misma no produce inflamación, todos los efectos pro o antiinflamatorios observados en ausencia o presencia de lipina-2 ocurren bajo condiciones de activación celular.
5.4. La lipina-2 modula la activación de NF-κB
La activación celular a través de TLR4 culmina en la activación de factores de transcripción implicados en la respuesta
inflamatoria, tales como NF-κB [252]. El tratamiento con ac. palmítico activa NF-κB no sólo en macrófagos [11], sino
en otros sistemas celulares como células endoteliales [218], células del músculo esquelético [253] y adipocitos [217,
254]. En macrófagos peritoneales se ha observado que esta activación está inicada por la degradación de IκBα [57].
Sin embargo, también se ha descrito en células RAW 264.7 tratadas con mezclas de ac. grasos que el silenciamiento
génico de p65 no tiene ningún efecto sobre la secreción de citoquinas proinflamatorias como TNFα [60]. Por tanto, la
implicación de NF-κB en la inducción de proteínas proinflamatorias a través de la activación de TLR4 por ac. grasos,
es un tema controvertido.
Los resultados presentados en esta memoria indican que, en las células RAW 264.7 tratadas con ac. palmítico se activa
la ruta de NF-κB, aumentando la degradación de IκBα e IκBβ, la translocación de p50 y p65, y e incrementando la
capacidad de unión a secuencias específicas de ADN de gran parte de las subunidades de NF-κB en el núcleo. Además,
la inhibición de la translocación de p50 por péptidos específicos, elimina casi completamente la inducción de todos lo
genes proinflamatorios analizados (IL-6, Ccl-2, TNF-α y COX2). Por tanto, NF-κB y más concretamente la subunidad
p50, parece jugar un papel importante en la inducción de genes proinflamatorios en este modelo. Las diferencias
24
encontradas con otros datos de la bibliografía [60], pueden deberse a la forma de estimulación, ya que en otros estudios
se utilizan mezclas de ac. grasos, que en algunos casos, pueden incluso ser saturados e insaturados, mientras que en el
presente estudio se utilizó exclusivamente ac. palmítico.
La ausencia de lipina-2 produjo un mayor aumento de la activación de NF-κB que el observado sólo con ac. palmítico,
caracterizado por un aumento de la translocación de p50 y p65 al núcleo y por un aumento de la capacidad de unión a
ADN de la mayoría de las subunidades, con excepción de RelB. Es muy llamativo que las células sin lipina-2 tengan
un incremento basal de la activación de las subnidades de NF-κB que en algunos casos, como por ejemplo p65 y RelB
es mayor que el experimentado por tratamiento con ac. palmítico. Sin embargo, esta activación basal parece ser
“infructuosa”, al menos en cuanto a la expresión de genes proinflamatorios se refiere, ya que la falta de lipina-2 no
altera los niveles basales de expresión de estos genes.
Curiosamente, la inhibición de la translocación de p50 tampoco influye en la indución génica promovida por la falta de
lipina-2. Esto puede deberse a que otra subunidad distinta de NF-κB adquiera mayor relevancia en estas condiciones,
por ejemplo p65 o cREL, o a que realmente sean otros los factores de transcripción involucrados en la inducción, como
por ejemplo AP-1.
En cuanto al mecanismo por el cual la falta de lipina-2 produce un incremento en la activación de NF-κB en células
activadas por ac. palmítico, se puede especular sobre la posibilidad de que ocurra a través de los aumentos de los
niveles celulares de DAG mostrados en estas circunstancias. El DAG estimula diferentes enzimas importantes en
transducción de señal, entre ellas la PKC. Existen numerosos trabajos que vinculan la activación de diferentes formas
de PKC con la activación de NF-κB en macrófagos [255-260]. De las PKC dependientes de calcio (clásicas), se ha
descrito que PKCα y PKCβ podrían controlar la activación de NF-κB [256, 257, 259], aunque el papel de PKCα no
está aún claro [256, 260]. De las PKCs independientes de Ca2+ (nuevas) se han descrito efectos sobre NF-κB de
PKCδ, y PKCε [258, 259], y de las PKC atípicas, PKCζ [255]. De ellas, el papel de PKCε sobre la activación de NFκB es uno de los mejor definidos, ya que estos estudios se realizaron con macrófagos procedentes de ratones carentes
de PKCε [259], evitando posibles artefactos debidos a la inespecificidad de inhibidores farmacólogicos o de
transfecciones con oligonucleótidos antisentido, herramientas que usan el resto de los estudios [255, 258]. Otra
posibilidad por la que la falta de lipina-2 podría estar activando NF-κB sería a través de posibles cambios en la
concentración de PA, que tambien puede regular enzimas relacionadas con la activación de NF-κB, como es el caso de
PKCε [261], PKCζ [262] o Raf-1[263]. En definitiva los datos obtenidos apuntan a que la lipina-2 tiene un papel
inhibidor de la ruta de activación de NF-κB por ac. grasos saturados por mecanismos moleculares que aún
desconocemos.
5.5. La lipina-2 controla el nivel de estrés de RE en macrófagos.
Se sabe que los macrófagos sometidos a tratamientos con lípidos citotóxicos pueden experimentar estrés de RE [85,
86]. In vivo, esto queda patente en modelos de aterosclerosis [93]. Sin embargo, el mecanismo por el cual ocurre es,
hasta el momento, desconocido. Se sabe también que el estrés de RE puede desencadenar una respuesta
proinflamatoria, ya que las tres rutas conocidas de respuesta durante el estrés: IRE1, ATF6 y PERK pueden promover
la activación de las vías JNK/AP1, e IKK/NF-κB [264, 265].
Los resultados presentados en esta memoria corroboran los hallazgos encontrados por otros autores en relación con la
inducción de estrés de RE por ac. palmítico [88]. La falta de lipina-2 incrementa significativamente esta inducción,
25
basándonos en la expresión de CHOP y BiP como marcadores de estrés. Atendiendo a la fosforilación del factor eIF2α,
las células sin lipina-2 presentan una notable disminución del intervalo de tiempo en el que dicha fosforilación tiene
lugar, bajando de 8 horas en las células control a 1 hora en las células sin lipina-2. Puesto que la fosforilación de eIF2α
es uno de los primeros eventos que tienen lugar tras la activación de la vía de PERK, podríamos pensar, más que en un
aumento del estrés per se, en que en ausencia de lipina-2 el estrés comience mucho antes que en las células con lipina2. Con esta premisa, el hecho de que la expresión de CHOP y BiP aparezca aumentada podría deberse a que las células
tengan más tiempo para inducir estos factores. La certeza de esta posibilidad quedaría demostrada por experimentos
donde se estudiase la aparición temporal de CHOP y BiP. En este estudio se ha utilizado 100 µM PBA, concentración a
partir de la cual la inhibición de la expresión de CHOP y BiP no aumentaba. En otros estudios los autores llegan a usar
hasta 3 mM [86], concentración que en nuestros experimentos, no mejora la capacidad de la droga para evitar el estrés
de retículo, y afecta a considerablemente la viabilidad celular. Se desconoce por el momento si la inhibición parcial del
PBA sobre la expresión de genes proinflamatorios se debe también a una inhbición parcial del estrés, a juzgar por la
inhibición que produce en la expresión de CHOP y BiP, o a que existen otros mecanismos paralelos no inhibibles por
PBA. Por otro lado, el PBA no inhibe la sobreexpresión de genes proinflamatorios inducida por la falta de lipina-2 en
células tratadas con ac. palmítico, lo que indica que existen otras vias diferentes de inducción a través de las cuales la
falta de lipina-2 actúa.
Se conoce muy poco de la relación entre estrés de RE y lípidos celulares. La mayoría de los estudios publicados sobre
la inducción de estrés de retículo lo han hecho basándose en la teoría de la UPR, donde el metabolismo proteico juega
un papel importante [66]. Sin embargo, el RE podría ser el sensor metabólico celular y responder a situaciones
metabólicas celulares comprometidas. Se conoce, por ejemplo, que el RE es muy sensible a la disponibilidad de
glucosa y a las fluctuaciones de energía celulares, y que las rutas de producción y degradación de glucosa están
transcripcionalmente reguladas durante las respuesta UPR. En cuanto a los lípidos, en tejidos relevantes
metabólicamente como el hígado, se ha visto que las tres vías mayoritarias de UPR están implicadas en la regulación
de la lipogénesis celular y en el metabolismo del colesterol mediante la activación de SREBP, una familia de factores
de transcripción que residen en el RE y se activan en respuesta a bajos niveles de colesterol [266]. También se ha
descrito que el estrés de RE juega un papel importante en la síntesis de ac. grasos a través de la activación de XBP1s en
la vía de IRE1α, que regula la transcripción de muchos genes implicados en esta ruta metabólica [267]. No obstante, no
existe mucha más información concerniente a cómo y qué lípidos pueden influir en el inicio y/o mantenimiento del
estrés de retículo. El RE es el sitio de formación de TAG [145] y posiblemente también controle el número de gotas
lipídicas producidas en las células, su composición y su tamaño [268]. Es plausible que alteraciones en la síntesis de
TAG o en las concentraciones de los intermediarios lipídicos de su síntesis, como el DAG, puedan promover una
respuesta de estrés en este orgánulo, situaciones que, según se ha descrito en este trabajo, tienen lugar en ausencia de
lipina-2. Mucha más experimentación será necesaria para esclarecer si el RE tiene sensores específicos para estas
alteraciones.
5.6. Papel de JNK en la inducción de los genes proinflamatorios por ácido palmítico en macrófagos deficientes en
lipina-2.
El mecanismo por el cual el incremento de los depósitos adiposos contribuye a la patología de enfermedades como
obesidad o diabetes mellitus tipo 2, no ha sido bien definido hasta el momento. Sin embargo, la comunidad científica
sabe que la inflamación crónica de “bajo grado” juega un papel importante en la etiología de éstas y otras
enfermedades metabólicas, debido a la activación de proteína quinasas como JNK o IKK [12, 61, 269]. Estudios
26
realizados en ratones carentes de JNK1 han mostrado que estos animales alimentados con una dieta rica en grasa no
ganan peso y presentan una disminución en la expresión de citoquinas proinflamatorias, en comparación con animales
control [76]. Posteriormente, un elegante trabajo realizado por Solinas y col. [70] utilizando ratones transplantados con
médulas óseas, determinó que la expresión de JNK en las células hematopoyéticas es la responsable de la expresión de
citoquinas proinflamatorias y de la infiltración de macrófagos en el tejido adiposo de ratones sometidos a dietas altas
en grasa, controlando por tanto la inflamación que se produce durante la obesidad y con ello la resistencia a insulina.
Por otro lado, la expresión de JNK1 en células no hematopoyéticas también influye en el control de la resistencia a
insulina, regulando la acumulación de grasa en los animales [270]. Estos estudios demuestran la importancia de JNK
en el desarrollo de inflamación por un exceso de grasa en la dieta.
Los resultados presentados en esta tesis apoyan el papel de JNK en la inducción de genes proinflamatorios por
activación con ac. palmítico y definen a esta quinasa como un elemento primordial en la sobreexpresión de estos genes
debida a la falta de lipina-2. Se desconoce por el momento el mecanismo a través del cual la lipina-2, regula la
activación/fosforilación de JNK, pero su estudio podría esclarecer nuevas vías de conexión entre inflamación y las
alteraciones metabólicas.
JNK es potente y preferentemente activada por estrés celular y por citoquinas proinflamatorias en las células [271]. De
hecho, se sabe que parte de la activación de JNK por ac. grasos se debe a estrés de retículo [10]. Sin embargo, en
nuestro modelo celular la falta de lipina-2, a pesar de producir un aumento de estrés sobre el ya generado por ac.
palmítico, no utiliza esta ruta para activar JNK e inducir una mayor expresión de genes proinflamatorios, puesto que si
esto fuera asi, la inhibición de estrés por chaperonas químicas como el PBA, reduciría tambien la expresión de estos
genes en estas condiciones. Por tanto, deben existir otras rutas diferentes de las inducidas por estrés por las cuales la
falta de lipina-2 está generando una mayor fosforilación/activación de JNK.
JNK puede también activarse por ésteres de forbol, cuyas diana más estudiadas y conocidas en la célula son las PKCs
[272, 273]. Poco se sabe del mecanismo por el cual esto ocurre, aunque podría tener lugar a través de RACK1, proteína
inicialmente identificada por unir PKC en estado de activación, y que puede también funcionar como plataformas sobre
las que distintas proteínas de las cascadas de señalización celular se unen e interaccionan, como parece ocurrir con
PKC y JNK [274]. Atendiendo a estas premisas y a los aumentos de DAG que tienen lugar en células carentes de
lipina-2, se podría hipotetizar que un aumento en la activación de PKC mediada por DAG o PA (ya que algunas PKCs
como la PKCε se activan por PA), podría estar mediando el incremento de fosforilación de JNK en estas condiciones.
La vía clásica de activación génica a través de JNK es mediante la fosforilación de c-Jun, una de las subunidades que
forman el factor de transcripción AP-1[275]. AP-1 es un factor de transcripción dimérico que está formado por
proteínas de la familia de Jun (c-Jun, JunB y JunD), Fos (c-Fos, FosB, Fra1 y Fra2), ATF (ATF2, ATF3, B-ATF…) y
Maf (c-Maf, MafB, MafA…) [276]. Las posibilidades de combinación de estas proteínas, determinan la especificidad y
afinidad del dímero y, consecuentemente el espectro de genes a regular [277]. Las proteínas Jun pueden homodimerizar
o heteromerizar, mientras que las proteínas Fos no pueden homodimerizar y, por lo general, heterodimerizan con las
proteínas Jun. Los heterodímeros Jun-Fos se unen preferentemene a una secuencia heptamérica consenso conocida
como elemento de respuesta a TPA (acetato de tetradecanoil forbol, o forbol miristato acetato, PMA) (TRE), mientras
que los dímeros Jun-ATF se unen con mayor afinidad a otra secuencia consenso conocida como elemento de respuesta
a cAMP (CRE) [278]. La fosforilación de c-Jun por JNK potencia su capacidad transcripcional, modulando su
interaccion con represores transcripcionales, y aumentando su vida media [279].
En nuestro sistema, el tratamiento celular con siRNA específico de c-Jun inhibe de forma considerable la inducción de
genes proinflamatorios por ac. palmítico, tanto en presencia como en ausencia de lipina-2. Por tanto, el mecanismo de
27
acción de JNK en este sistema debe ser mediado, en gran parte, por la activación de c-Jun/AP-1. aunque se desconoce
si c-Jun actuaría en este sistema formando homodímeros o heterodímeros con otras proteínas de AP-1. JNK también se
ha relacionado con el control postranscripcional de la expresión génica mediante la estabilización de mRNAs,
inherentemente inestables, que codifican para citoquinas y otros mediadores inflamatorios [280]. Esta posibilidad
también sería plausible en nuestro modelo, ya que JNK podría estar estabilizando mensajeros producidos por otros
factores de transcripción como NF-kB. La expresión de COX-2, uno de los genes proinflamatorios no parece estar
regulada por la activación de JNK. El promotor de COX2 es muy complejo, conteniendo múltiples sitios de regulación
para factores de transcripción como AP-1, NF-ΚB, NFAT, CREB, etc. Es posible que la sobreinducción de este gen se
esté realizando por mecanismos diferentes que la activación de JNK/AP-1. La inhibición de la subunidad p50 de NFkB tampoco parece esar implicada en estas circunstancias, pero no se puede descartar que otras subunidades de NF-kB
como p65 o cRel puedan tener su papel.
5.7. Función de la lipina-2 en el metabolismo lipídico.
En el presente estudio, tanto en las células RAW 264.7, cómo en los macrófagos humanos se observa un aumento en
los niveles de DAG tras tratamiento con ac. palmítico, pero no con ac. oleico, corroborando los resultados obtenidos en
estudios anteriores [281]. La falta de lipina-2 en células tratadas con ac. palmítico promueve un mayor aumento de la
masa total de DAG, en el caso de los macrófagos humanos, y de especies de DAG enriquecidos en ac. palmítico en el
caso de células RAW 264.7. Puesto que las lipinas catalizan la desfoforilación de PA a DAG, estos resultados resultan
difíciles de interpretar, aunque existen mecanismos de compensación entre los miembros de la familia de las lipinas
observados sobre todo en tejidos y células metabólicamente activos que podrían ayudar a explicar este fenómeno. Así
por ejemplo, en el hígado de los ratones fld, carentes de lipina-1, existe un aumento de la actividad PAP debido al
incremento en la expresión de lipina-2 [149]. Por otro lado, en células HeLa también se ha descrito que el
silenciamiento génico de lipina-2 promueve el incremento de la expresión de lipina-1 y de la actividad PAP [150]. En
nuestros experimentos de silenciamiento génico de las lipinas, realizados en las células RAW 264.7, no se observan
efectos compensatorios en la expresión génica. Con respecto a una posible compensación en la actividad PAP, no ha
sido analizado hasta el momento, aunque es de gran importancia para los próximos trabajos experimentales..
Los incrementos observados en DAG podrían ser los responsables, al menos en parte, de los aumentos de inducción de
genes proinflamatorios, como ya se ha mencionado anteriormente, a través de la activación de proteínas de
transducción de señal como PKC. No se ha estudiado en este trabajo si la sobrexpresión de lipina-2 disminuye los
niveles de DAG celulares.
Los macrófagos deficientes en lipina-2 presentan una síntesis de TAG defectuosa tras tratamiento con ac. grasos en
comparación con las células control. En células RAW264.7, la falta de lipina produce una disminución general de todas
las especies detectadas de TAG. En macrófagos humanos se produce fundamentalmente una disminución de aquellas
moléculas de TAG donde se incorporan los ac. grasos con los que se tratan las células, pero además el ac. palmítico
produce un aumento de moléculas de TAG ricas en ac. grasos saturados. Por el momento se desconoce la posible
relevancia fisiológica de estos datos, pero se podría especular sobre la posibilidad de que tanto la cantidad de TAG
como su composición en ac. grasos sea importante para mantener la homeostasis celular.
La síntesis disminuida de TAG en células carentes de lipina-2 y tratadas con ac. palmítico podría ser la causa, al
menos parcialmente, de la lipotoxicidad de este ac. graso. Sin embargo, el ac. oleico también tiene inhibida la entrada
en TAGs en estas circunstancias. Por ello, ¿cuál serí pues la diferencia entre el ac. palmítico y el ac. oléico que les
28
hacen actuar de modo tan distinto? El ac. oleico no incrementa la concentración celular de DAG, sino más bien al
contrario, la reduce, tanto en presencia como en ausencia de lipina-2. Este debe ser un factor muy importante a la hora
de desencadenar los efectos proinflamatorios observados ya que independientemente del daño que los ac. grasos no
esteríficados en TAG puedan producir, el DAG, como se ha ido comentando, podría estar activando diferentes rutas de
señalización proinflamatorias.
La lipina-2 parece ser una enzima fundamental en la síntesis de TAG celular. Los datos más ilustrativos al respecto
obtenidos en este trabajo fueron los obtenidos por análisis por citometría de flujo y de microscopía, donde la falta de
lipina-2 produce una disminución importante de la fluorescencia en estos orgánulos. Se sabe que en procesos de estrés
las células generan gotas lipídicas como mecanismo de protección [282] La falta de lipina-2 impide la generación de
estas gotas, las reduce en número y/o tamaño, o inhibe la incorporación de lídidos en ellas, reduciendo también los
posibles efectos protectores que éstas pudieran tener.
5.8. Translocación nuclear de la lipina-2 en respuesta a ácido palmítico
Debido la señal de localización nuclear que presentan todas las lipinas, estas proteínas pueden localizarse
citosólicamente, pero tambien en el núcleo de las células [123]. De hecho, la lipina-1 y la lipina-2 tienen actividad cotranscripcional, además de actividad PAP. La lipina-1 se ha identificado en el núcleo de células HEK y de adipocitos
3T3 transfectados con quimeras de GFP [124], pero nada hay descrito hasta el momento de la posible localización
nuclear de lipina-2. En este trabajo se ha observado por microcopía confocal que en células RAW 264.7 transfectadas
con la construcción lipina-2-EGFP, el ac. palmítico, pero no el ac. oleico, promueve la translocación de la lipina-2 al
núcleo celular en tan sólo una hora. Estos resultados abren nuevas posibilidades en la explicación de los posibles
mecanismos por los cuales la lipina-2 tiene efectos antiinflamatorios durante la activación por ac. grasos saturados.
En hígado, la lipina-1 es un amplificador de la expresión génica dependiente de PPARα a través de la interacción
directa con el coactivador PGC-1α[129]. Los PPAR son receptores de transcripción antiinflamatorios, especialmente
pero no exclusivamente, PPARγ [283]. Por otro lado, también se ha observado que la lipina-1 reprime la actividad
transcripcional del factor NFATc4 en adipocitos, disminuyendo la secreción de citoquinas proinflamatorias como
TNFα [166]. Este efecto está producido por interacciones proteína-proteína. Es posible, por tanto, que la lipina-2
pudiera regular en el núcleo la activación de estos u otros factores de transcripción antiinflamatorios, promoviendo la
disminución de la respuesta inflamatoria en células activadas con ac. grasos saturados.
5.9. Papel de las ceramidas en la respuesta inflamatoria inducida por ácido palmítico.
La activación de la respuesta inflamatoria por ac. grasos se puede producir a través de las ceramidas, debido a que el
ac. palmítico y el ac. esteárico son precursores de la síntesis de novo de ceramidas. El principal metabolito de las
ceramidas es la ceramida-1-fosfato (C1P), que es generado por la fosforilación de ceramidas a través de la enzima
ceramida quinasa (CerK). Durante los últimos años se ha propuesto que la C1P, es un factor clave en la respuesta
inflamatoria [284].
Debido a estos antecedentes, se analizó la expresión de los genes proinflamatorios por ac. palmítico, en presencia de un
inhibidor específico de CerK, para elucidar el papel de la C1P en nuestro modelo. Según los resultados obtenidos, la
C1P no parece desempeñar una función relevante en la respuesta inflamatoria inducida por ac. palmítico en las células
29
Raw 264.7. En este sentido, se ha observado en macrófagos derivados de médula ósea procedentes de ratones carentes
de CerK niveles significativos de C1P, lo que sugiere que podrían existir otras vías metabólicas que generasen este
lípido [285].
En astrocitos se ha observado que la adición exógena de ceramida-C2 induce la expresión de 12-lipoxigenasa, dando
lugar a la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) e inflamación [286]. Sin embargo, en nuestros
experimentos no se ha observado activación de la respuesta inflamatoria en las células RAW 264.7 con el tratamiento
de las ceramidas exógenas C2 y C8.
En cuanto al efecto de las ceramidas en la inducción proinflamatoria, hay estudios contradictorios en monocitos
humanos THP-1 [59, 212]. En los resultados presentados en esta tesis, utilizando miriocina o ISP-1, inhibidor
específico de la actividad serina palmitoil transferasa, se obtuvo que la síntesis de ceramidas no es importante para la
inducción de genes proinflamatorios por ac. palmítico en presencia o ausencia de lipina-2.
5.10. Modelo de la regulación de la respuesta inflamatoria por lipina-2 en macrófagos.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos durante este trabajo y los antecedentes bibliográficos existentes, puede
concluirse que los ac. grasos saturados, como el ac. palmítico activan la respuesta inflamatoria en macrófagos a través
de dos vías claramente diferenciadas (figura 70): por su interacción con los receptores TLR2/4 y por aumento de la
concentración intracelular de estos lípidos citotóxicos, desencadenando, en ambos casos, la inducción de genes
proinflamatorios a través de la activación de NF-κB y JNK. Es importante destacar que estas dos vías de activación
pueden converger a diferentes niveles, produciendo efectos sinérgicos en la activación de los macrófagos.
Cuando entran en la célula grandes cantidades de ac. grasos libres, su incorporación en TAG es crucial para el
mantenimiento de la homeostasis celular, ya que la acumulación intracelular de estos lípidos tiene efectos citotóxicos
que se manifiestan fundamentalmente por aumentos en el estrés de retículo. El estrés de RE contribuye en gran medida
a la respuesta inflamatoria inducida por ac. palmítico, debido a que las tres vías de inducción de la respuesta UPR
pueden activar a su vez tanto NF-κB como JNK.
En ausencia de lipina-2, los macrófagos presentan una síntesis defectuosa de TAG, siendo más vulnerables a los
efectos de los ac. grasos sin esterificar. Esta podría ser la causa de que en ausencia de lipina-2, los macrófagos
presenten mayor estrés de RE. Sin embargo, en estas condiciones, el aumento de estrés de RE no parece ser el
mecanismo por el que se produce un mayor incremento en la expresión de los genes proinflamatorios, sino la
sobreactivación de JNK. Desconocemos el mecanismo por el que esto ocurre, pero puesto que la falta de lipina-2
genera un importante incremento en la concentración de DAG, ya de por sí aumentada por tratamiento con ac.
palmítico, es posible que la acción de este lípido sobre determinadas proteínas de transducción de señal, lleve
finalmente a una sobreactivación de JNK.
La translocación de lipina-2 al núcleo en respuesta a una sobrecarga de ac. palmítico podría representar tambien un
importante punto de regulación inflamatoria, a través de la regulación de factores de transcripción cuya respuesta sea
claramente antiinflamatoria. Por el momento no hay evidencias que demuestren esta idea.
En conclusión la lipina-2 tiene efectos antiinflamatorios en macrófagos que experimentan una sobrecarga por ac.
grasos saturados. Por consiguiente, el estudio de las situaciones celulares en las que la expresión de la lipina-2 y/o su
30
actividad estén incrementadas podría ayudar a desarrollar nuevas terapias para el tratamiento de enfermedades
metabólicas que tengan un claro componente inflamatorio.
6. CONCLUSIONES
6.1. Los ac. grasos saturados inducen la expresión de genes proinflamatorios tanto en células RAW 264.7 como
macrófagos humanos.
6.2. La inducción de los genes proinflamatorios por ac. palmítico es dependiente de TLR2 y TLR4.
6.3. La inducción de los genes proinflamatorios por ac. palmítico es independiente de la síntesis de ceramidas.
6.4. La lipina-2 modula la expresión de los genes proinflamatorios inducidos por ac. palmítico, tanto en células RAW
264.7 como macrófagos humanos.
6.5. El tratamiento con ac. palmítico produce estrés de RE, activación de NF-B y activación de JNK en las células
RAW 264.7.
6.6. Las células RAW 264.7 deficientes en lipina-2, manifiestan un mayor estrés de RE y una mayor activación de NFκB y de JNK durante el tratamiento con ac. palmítico.
6.7. El exceso de respuesta proinflamatoria inducida por ac. palmítico en ausencia de lipina-2 es dependiente de la
activación de JNK, pero no de la subunidad p50 de NF-κB, ni del estrés de RE inhibible por chaperonas químicas.
6.8. La sobrexpresión de COX-2 durante el tratamiento con ac. palmítico en ausencia de lipina-2 es también
independiente de la activación de JNK.
6.9. Los macrófagos deficientes en lipina-2 presentan una síntesis dismunida de TAG y también una disminución del
número y tamaño de gotas lipídicas tras el tratamiento con ac. oleico y ac. palmítico.
6.10. Los macrófagos deficientes en lipina-2 presentan un mayor aumento en la concentración de DAG que el
generado por tratamiento con ac. palmítico.
6.11. El ac. palmítico, pero no el ac. oleico, induce la translocación de la lipina-2 del citosol al núcleo celular.
Esta tesis doctoral ha sido realizada gracias a la concesión de una beca de Formación de Personal Investigador de la Comunidad de Castilla y
León. El trabajo realizado ha dado lugar a las publicaciones científicas indicadas en las referencias 287-290.
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