Programa completo - Laboratorio de Fisicoquimica Biologica

Programa completo - Laboratorio de Fisicoquimica Biologica

Fundamentos y aplicaciones biológicas
de la espectroscopía de fluorescencia
Curso de posgrado PEDECIBA
26 de agosto al 19 de setiembre de 2008
Lab. Fisicoquímica Biológica1, Facultad de Ciencias,
Unidad Bioquímica y Proteómica Analíticas,
y Plataforma de Biología Estructural2,
Instituto Pasteur de Montevideo
Docente responsable: Dra. Ana Denicola1
Docente extranjero invitado:
Dr. Luis González-Flecha
(Facultad de Farmacia y Bioquímica,
Universidad de Buenos Aires)
Docentes colaboradores:
MSc. Horacio Botti2
MSc. Bruno Manta2
MSc. Matías Möller1
Docentes invitados:
Dra. Noel Alvarez (Fac. Medicina)
Dra. Mariela Bollati (Instituto Pasteur)
Dr. Gustavo Brum (Fac. Medicina)
MSc. Gonzalo Greif (Instituto Pasteur)
Dr. Sergio Pantano (Instituto Pasteur)
Dr. Flavio Zolessi (Fac. Ciencias)
Carga horaria: clases Teóricas, Seminarios, clases Prácticas, y Conferencias por
invitados. (62 horas totales) más evaluación final global escrita. Se evaluará la
presentación de seminarios, la participación en las actividades prácticas y el examen
final.
Cronograma general
26/08-29/08
Semana 1
16:00-17:30
17:45-19:00
25
L
---
26
M
T1
T1
27
M
T2
T3
28
J
T4
T5
29
V
S1
S2
1/09-5/09
Semana 2
16:00-17:30
17:45-19:00
1
L
T6
S3
2
M
T7
S4
3
M
Conf.1
4
J
T8
T9
5
V
S5
S6
8/09-12/09
Semana 3
9:00-13:00
8
L
G1/P1 (FC)
G2/P1 (IP)
G3/P1 (FC)
G4/P1 (IP)
9
M
G1/P4 (FC)
G2/P3 (IP)
G3/P4 (FC)
G4/P3 (IP)
10
M
G1/P3 (IP)
G2/P4 (FC)
G3/P3 (IP)
G4/P4 (FC)
11
J
G1/P2 (FC)
G2/P2 (IP)
G3/P2 (FC)
G4/P2 (IP)
12
V
Pres. Res.
Pres. Res.
Pres. Res.
Pres. Res.
L
Conf.2
Conf.3
M
Conf.4
Conf.5
M
Conf.6
Conf.7
J
Pres. Proy
Pres. Proy.
V
Pres. Proy.
Pres. Proy.
16:00-20:00
15/09-19/09
Semana 4
16:00-17:30
17:45-19:00
Semana 5
16:00
V 26/09
Examen
Teóricos
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
26/08-29/08
Introducción a la fluorescencia
Instrumentación y fluoróforos
Fluorescencia resuelta en el tiempo
Efecto del solvente
Desactivación de la fluorescencia
1/09-5/09
FRET
Anisotropía
Fluorescencia de proteínas
Fluorescencia de proteínas resuelta en el tiempo
AD
AD
MM
HB
AD
LGF
LGF
AD
MM
Prácticos
P1
Introducción a la fluorescencia: Aspectos cuali y cuantitativos de espectroscopia
de fluorescencia. Instrumentación, espectros de excitación, de emisión; curvas de
calibración IF; efecto de filtro interno; efecto del pH.
P2
Desactivación de la fluorescencia intrínseca de proteínas: Cambios
conformacionales por pH.
Quenching por ioduro de triptofano, albúmina y ovalbúmina, nativas y
desnaturalizadas.
P3
Determinación de la masa molecular de la albúmina sérica bovina por anisotropía
de fluorescencia.
Variación de la anisotropía de la albúmina dansilada en presencia de glicerol.
P4
Efecto del calcio y del pH sobre la interacción Prodan-albúmina seguidos por
FRET.
Seminarios
Artículos a presentar
Estudiantes
S1 1 Lakowicz, J.R., and Weber, G. (1973). Quenching of protein
2
S2 1
2
S3 1
2
S4 1
2
S5 1
2
S6 1
fluorescence by oxygen. Detection of structural fluctuations in
proteins on the nanosecond time scale. Biochemistry 12, 41714179.
Cardamone, M., and Puri, N.K. (1992). Spectrofluorimetric
assessment of the surface hydrophobicity of proteins. Biochem
J 282 ( Pt 2), 589-593.
Lehrer, S.S. (1971). Solute perturbation of protein
fluorescence. The quenching of the tryptophyl fluorescence of
model compounds and of lysozyme by iodide ion.
Biochemistry 10, 3254-3263.
Kosinski-Collins, M.S., Flaugh, S.L., and King, J. (2004).
Probing folding and fluorescence quenching in human
gammaD crystallin Greek key domains using triple tryptophan
mutant proteins. Protein Sci 13, 2223-2235.
Lakowicz, J.R., Gryczynski, I., Laczko, G., Wiczk, W., and
Johnson, M.L. (1994). Distribution of distances between the
tryptophan and the N-terminal residue of melittin in its
complex with calmodulin, troponin C, and phospholipids.
Protein Sci 3, 628-637.
Levi, V., and Gonzalez Flecha, F.L. (2002). Reversible fastdimerization of bovine serum albumin detected by
fluorescence resonance energy transfer. Biochim Biophys Acta
1599, 141-148.
Banik, U., Mandal, N.C., Bhattacharyya, B., and Roy, S.
(1993). A fluorescence anisotropy study of tetramer-dimer
equilibrium of lambda repressor and its implication for
function. J Biol Chem 268, 3938-3943.
Kajihara, D., Abe, R., Iijima, I., Komiyama, C., Sisido, M.,
and Hohsaka, T. (2006). FRET analysis of protein
conformational change through position-specific incorporation
of fluorescent amino acids. Nat Methods 3, 923-929.
Xu, Q.H., Wang, S., Korystov, D., Mikhailovsky, A., Bazan,
G.C., Moses, D., and Heeger, A.J. (2005). The fluorescence
resonance energy transfer (FRET) gate: a time-resolved study.
Proc Natl Acad Sci U S A 102, 530-535.
Obsilova, V., Nedbalkova, E., Silhan, J., Boura, E., Herman,
P., Vecer, J., Sulc, M., Teisinger, J., Dyda, F., and Obsil, T.
(2008). The 14-3-3 protein affects the conformation of the
regulatory domain of human tyrosine hydroxylase.
Biochemistry 47, 1768-1777.
Abbyad, P., Shi, X., Childs, W., McAnaney, T.B., Cohen,
B.E., and Boxer, S.G. (2007). Measurement of solvation
responses at multiple sites in a globular protein. J Phys Chem
B 111, 8269-8276.
Se presentarán 2 artículos por seminario. Cada artículo será presentado por 2
estudiantes.
Conferencias
Autor
Título
Conf. 1
L. González Flecha Interacciones entre lípidos y proteínas integrales de
membrana
Conf. 2
S. Pantano
Descripción in silico de sondas fluorescentes in vivo
Conf. 3
G. Brum
Estudio del Acoplamiento Excitación-Contracción en el
músculo esquelético mediante técnicas de fluorescencia
Conf. 4
G. Greif
Aplicaciones de la Fluorimetria al estudio del genoma y
la expresión génica
Conf. 5
M. Bollati
Principios y aplicaciones de la citometria de flujo
Conf. 6
N. Alvarez
Detección de oxidantes en sistemas celulares por
fluorescencia
Conf. 7
F. Zolessi
Utilización de microscopia de fluorescencia 4D para
estudiar la diferenciación in vivo de neuronas