rmn, resonancia magnética nuclear

Transcripción

Brenda Fina
RMN, RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
RMN es una espectroscopia basada en la absorción de radiación electromagnética de la región de la radiofrecuencia
(10MHz-1GHz). El fenómeno de RMN ocurre debido a las propiedades mecanocuánticas de los espines, es decir, a las
propiedades magnéticas de los núcleos atómicos, los cuales cuando se colocan en un campo magnético intenso (B0),
absorben la energía necesaria para que vayan a otro estado energético. Si se aplica energía (E) que obligue a los núcleos a
invertir el sentido de su orientación con respecto al B°, se dice que el sistema está en resonancia. Este fenómeno de
excitación de los espines nucleares se lo conoce como RMN, y la E aplicada, ∆E, corresponde a la radiación
electromagnética de la región de las radiofrecuencias.
Descripción Mecánico Cuántica
• Propiedades magnéticas del núcleo: espín nuclear
Los núcleos atómicos tienen espines que les confieren un momento magnético, es decir, núcleos magnéticamente
activos I. El espín es intrínseco del núcleo y está determinado por el número desapareado de partículas elementales
(neutrones y protones) que lo forman. El modelo atómico describe al núcleo como un cuerpo esférico con la carga nuclear
uniformemente distribuida alrededor de su superficie.
Np
Nn
Spin
Par
par
0 Inactivos
Par
Impar
1/2 3/2 Semienteros
Impar
Par
1/2 3/2
Impar
Impar
1, 2
Un núcleo sin espín, tiene un momento magnético igual a cero porque no tiene carga circulando. Estos núcleos
tienen un valor de espín igual a cero, I=0. Todos los núcleos que poseen un número másico(N) y un número de carga (Z)
12
16
par tienen un número de espín igual a cero (ej: C y O). Los núcleos que poseen un número impar de neutrones y
protones generalmente tienen un número cuántico de espín entero distinto a cero porque el número total de “nucleons”
(creo que se refiere a los neutrones y protones desapareados) desapareados es par, y cada uno contribuye en ½ al número
cuántico. También están los núcleos que tienen un número par de protones y un número impar de neutrones, o viceversa,
que poseen un número de espín no entero (tienen número fraccionados) porque poseen cantidad de “nucleons”
desapareados impares.
Dentro de este último grupo de núcleos, se encuentran núcleos con importancia biológica como
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15
19
31
H, C, N, F y P que tienen número de espín igual a ½, I=1/2. En el modelo, actúan como cuerpos
esféricos con carga uniformemente distribuida en su superficie que giran sobre un eje provocando la
circulación de la carga, y esto genera un campo magnético que da como resultado un momento
magnético nuclear. Que tenga un I=1/2 significa que cualquier carga que se aproxime al núcleo va a
experimentar el mismo campo magnético sin importar la dirección por la cual se acerca. Esto da como
resultado, un momento eléctrico cuadripolar igual a cero (igual que en los núcleos con I=0); este
parámetro describe la forma efectiva que tiene la distribución de la carga del núcleo elíptico.
1
Laboratorio de Biología Ósea y Metabolismo Mineral Facultad Cs. Médicas - UNR - Rosario – Argentina
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Brenda Fina
Sin embargo, la mayoría de los núcleos magnéticos actúan como cuerpos que
giran sobre un eje con la carga distribuida de forma no esférica, estos son núcleos con
números de espín igual 1 o igual a múltiplos enteros de ½. El modelo, los describe como
elipsoides que giran sobre su eje principal. Estos pueden tener forma de prolato o de
oblato, ambos presentan un campo magnético anisotrópico (diferentes características
según la dirección), es decir, que el trabajo electroestático al traer una carga a una dada
distancia es distinto según la dirección a la cual se aproxime. Por esta razón, tienen momentos eléctricos cuadripolares
2
14
17
33
35
distintos a cero, por convención, el prolato tiene un valor mayor a cero ( H y N) y el oblato menor a cero ( O, S y Cl).
• Número Magnético Cuántico
Una propiedad macano-cuántica del espín nuclear es que el valor promedio del vector del momento magnético
sobre una dirección dada toma valores específicos descriptos por un grupo de números cuánticos magnéticos, m=2I+1,
integrado desde +I a –I. (I= valor de spin)
1/2
El vector del momento angular del espín, I, tiene magnitud igual a [I(I+1)] ћ, y su componente en z es m. Tanto la
dirección como la magnitud del vector del momento angular de espín están cuantizados (sólo pueden tomar valores
determinados). En la ausencia de un campo magnético externo, este vector no tiene una dirección preferencial y el eje z
es arbitrario; pero cuando se aplica un campo magnético externo, la dirección de este determina el eje z. El momento
angular de un núcleo con espín ½ dentro de un campo magnético externo, tiene dos direcciones posibles, Iz=+-1/2ћ (m =
2.½+1= 2); mientras que un núcleo con espín igual a 1 tiene tres orientaciones posibles, Iz=0,+-1/2ћ (m = 2.1+1= 3).
Energía
aplicada
• Magnetización Nuclear
Un núcleo cargado que gira sobre un eje crea un campo magnético y el momento magnético (µ) resultante está
orientado sobre el eje del espín y es directamente proporcional al vector del momento angular (I).
µ=γ I
γ es la cte giromagnética. Para un dado B°, determina la diferencia de energía entre los dos estados de espín
El momento magnético de un núcleo es paralelo al momento angular de espín si la cte giromagnética es positiva, y
es antiparalelo si la cte giromagnética es negativa.
En ausencia de un campo externo B0, todas las orientaciones 2I+1 de un núcleo con espín I tienen la misma energía.
Esta situación cambia cuando se aplica un B° externo, donde la energía del momento magnético está dada por,
E= -µ . B0 (producto escalar)
Debido a que el eje z deja de ser arbitrario, y coincide con la dirección z del B°,
E=-µz B0
Por lo mencionado antes, sabemos que:
Iz=m
E=µ ћ B0
µz=Iz γ
Los núcleos con espín ½ dan lugar a dos posibles estados: m=+1/2, -1/2. La diferencia de energía entre ambos está
dada por,
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Eα= - ½ ћγB°
Eβ= +½ ћγB°
∆ E= ћγ B0
ћ = h/2π
∆ E= γ B0 h/2 π la diferencia de E es muy chica
γ = es la cte giromagnética, que es característica de c/núcleo
B0 = es el campo magnético externo
h = es la cte de Plank
Según la ley de Plank, la diferencia de E entre los dos estados es: ∆ E= hν, donde ν es la frecuencia de transición,
entonces:
↑ B0 ↑ sensibilidad
∆ E= hν = γ B0 h/2 π
ν= γ B0 /2 π [Hz]
↑ γ ↑ sensibilidad
Cada núcleo absorbe a una
dada ν
Si la cte giromagnética es positiva, el estado de menor energía es +1/2; pero si la cte es negativa este es el estado
de mayor energía.
En RMN se trabaja principalmente con núcleos que tienen I=1/2 porque, además de estar presentes en las
moléculas biológicas, son más sencillos debido a que, en presencia de un B° estos espines van a tener sólo dos
orientaciones posibles (a favor y en contra de B°) y por lo tanto dos niveles de E. La situación más favorable, el estado de
menor E (Eα), va a ser a favor del B°; mientras que la situación menos favorable, el estado de mayor E (Eβ), va a ser en
contra del B°.
• Distribución del núcleo entre los distintos estados energéticos
Cuando se aplica un B°, los núcleos tienden a alinearse con el campo adquiriendo el estado energéticamente más
favorable; esta alineación se opone a la agitación térmica de las partículas en general. El porcentaje de núcleos en cada
estado cuántico se puede calcular por la distribución de Boltzmann:
Nβ
Nα
=e
−
∆E
kT
=e
−
hν
kT
≈1
Debido a que hν <<kT a la temperatura que se realiza un experimento de RMN, hay solamente un pequeño exceso
de espines en el estado de menor energía, en otras palabras, en las condiciones de experimentación de RMN la diferencia
de energía entre los estados es muy chica, entonces el estado de mayor energía está poblado. Por esta razón, la técnica de
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RMN no es sensible comparada con otras espectroscopias (la relación señal/ruido en RMN es baja). Para solucionar este
problema se pueden usar campos magnéticos más fuertes y se pueden sumar muchos espectros (sumar scans) de manera
que las señales se van sumando mientras que el ruido aleatorio se va cancelando; además, es preferible usar núcleos con
1
ctes giromagnéticas altas y que tengan abundancia natural, ej: H.
Sustituyendo ν,
Nβ
Nα
=e
−
hγB0
2πkT
En presencia de un B0, los spines no están orientados totalmente a favor o en contra del campo, sino que están
inclinados un cierto ángulo y están precesando alrededor de la dirección del campo con una velocidad γB0=w0. si el B0 esta
en la dirección z, los spines estarán distribuidos como un abanico. Luego, existe un vector a favor del B0 que va a tener
mayor magnitud porque es mayor la población de spines Magnetización resultante.
En el equilibrio, un diagrama de energía representando la distribución de Boltzmann para 2n núcleos incluye los
momentos magnéticos individuales distribuidos en dos conos sobre el eje +z y el –z. Dependiendo del signo de la cte
giromagnética uno de los dos ejes va a estar un poco más poblado que el otro dando lugar a una magnetización neta en
esa dirección. Por ejemplo, si γ es positiva, una cantidad mayor de núcleos van a estar alineados con el campo, y la
magnetización resultante tendrá dirección +z. Si escribimos la ecuación anterior como una serie de Maclaurin sólo hasta el
segundo término, obtenemos un importante resultado: Nβ/Nα=1-γhB°/2πkT
La relación entre los núcleos en un estado y en el otro está relacionada linealmente con el campo magnético; esto
demuestra que la intensidad de la señal de RMN incrementa linealmente con la fuerza del campo magnético.
Descripción Mecánica Clásica
Si consideramos un solo espín, es necesario hacer un análisis mecánico cuántico porque los fenómenos atómicos no
se comportan bajo las leyes clásicas (no obedecen la mecánica de Newton). Sin embargo, la señal observada en un
experimento de RMN proviene de un gran conjunto de espines, entonces la señal detectada (el valor de la magnetización
en el eje x o y) sí se comporta de manera clásica. Esto es obvio si tenemos en cuenta que la muestra que utilizamos en un
experimento de RMN es un objeto clásico, entonces se espera que se comporte como tal.
Ahora consideramos una muestra compuesta por muchos núcleos idénticos con un I=1/2. Se puede representar un
1/2
momento angular con una longitud igual a [I (I+1)] ћ y su componente en z es m. El principio de incertidumbre no nos
permite especificar las componentes x e y del momento angular, sólo sabemos que está en algún lugar en el cono
alrededor del eje z. En usencia de un campo magnético B0, la muestra está compuesta por el mismo número de espines de
distinta energía con sus vectores ubicados a ángulos (Ф) al azar sobre el cono. Los ángulos (Ф) son impredecibles, y en este
paso consideramos los vectores de los espines como estacionarios. La magnetización de la muestra (M), su momento
nuclear neto, es cero. (M=0).
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• El efecto del campo estático
Dos cambios ocurren en la magnetización cuando hay un campo magnético presente:
1. Precesión Nuclear: la fuerza aplicada por el campo magnético sobre el eje de rotación causa un movimiento NO
en el plano de la fuerza, sino perpendicular a este plano. De esta forma, el eje de la partícula que está rotando se mueve
en una órbita circular, se dice que “precesa” alrededor del vector del campo magnético aplicado con una velocidad
angular igual a ω°.
ω0= γB0 [rad/s]
La velocidad angular puede ser convertida en la frecuencia de precesión, ν°
ν0= γB0 /2π [Hz] Ecuación de Larmor
Si consideramos al núcleo como un imán que gira, podemos usar la ecuación de
Larmor para explicar el fenómeno de RMN. Esta ecuación puede ser igualada a la ecuación de
la frecuencia de resonancia que se obtuvo teniendo en cuanta las propiedades mecánico
cuánticas de los núcleos. En la descripción clásica, el núcleo experimenta una resonancia con
una frecuencia de precesión (frecuencia de Larmor) que es proporcional al campo magnético
a través de su cte giromagnética. Se puede apreciar a partir de las ecuaciones hasta ahora
descriptas, que la energía del sistema NO depende del momento magnético de núcleo, sino
que sólo depende de la proyección de este vector sobre en eje del B°.
2. Magnetización nuclear todos precesan con una dirección según la distribución de Boltzman. La población de
espines en los dos estados se altera según esta distribución: aunque la diferencia de poblaciones es pequeña, hay una
magnetización (M) neta representada por un vector con dirección en el eje z y con una longitud proporcional a la
diferencia de población.
Marco Rotatorio de Coordenadas
El modelo clásico describe la resonancia nuclear en términos de la precesión del vector de magnetización
alrededor del campo magnético aplicado con una frecuencia de precesión igual a la de Larmor. Una forma de ver este
sistema, es a través de un marco rotatorio de coordenadas. En esta representación, los ejes cartesianos comunes, x, y y z,
son remplazados por los ejes, x’, y’ y z’, los cuales rotan a la frecuencia de Larmor del espín. En este sistema, el vector de
magnetización aparece estacionario. Es una forma de simplificar el análisis de los resultados cuando se trabaja con
complejas se secuencias de pulsos.
Brenda Fina
El efecto del campo de radiofrecuencia
Ahora supongamos que aplicamos un campo magnético oscilante en
el plano xy con una frecuencia igual a la frecuencia Larmor de los espines. El
núcleo va a experimentar un campo magnético estático BI porque el campo
magnético rotatorio está en fase con la precesión de los espines (B1 ┴ B0).
Bajo la influencia de este campo magnético, la magnetización comienza a
precesar alrededor de la dirección de este campo. Si aplicamos BI en un pulso
de cierta duración, la magnetización precesa al plano xy con la frecuencia de
Larmor. El movimiento de la Magnetización Rotatoria (M) induce una señal
en el detector que es amplificada y procesada.
Procesos de Relajación
Hay dos tipos de procesos de relajación en RMN
1. El primero está relacionado con el establecimiento del equilibrio térmico debido a la asociación de imanes
nucleares con diferentes energías. Suponiendo que la frecuencia de Larmor es similar para todos los núcleos, estos se
encuentran en fase y pueden intercambiar energía. El sistema vuelve a su equilibrio térmico de forma exponencial, con
una cte de tiempo denominada tiempo de relajación longitudinal, Tl . Esta cte refleja la eficiencia de acoplamiento entre un
espín nuclear y su entorno (lattice), por eso también se denomina tiempo de relajación spin-lattice. Tl es una medida de la
regeneración de la componente en Mz, la cual es función del intercambio de energía. Este proceso depende de cómo la
muestra le puede ceder energía al medio; por esto es un proceso conservativo. Este proceso de relajación es un efecto
-3
2
energético, que toma valores entre 10 a 10 s para líquidos y un rango mayor para sólidos. Un valor de Tl menor implica
un acoplamiento efectivo, y viceversa.
El T1 dará información acerca de:
Tiempo de correlación rotacional (τr)
Acoplamiento dipolar
2. El segundo proceso está relacionado con la perdida de fase de algún núcleo con respecto a todos los núcleos que
están precesando a la misma frecuencia. Si por cualquier proceso los núcleos pierden su coherencia de fase, va a haber
tantos componentes negativos como positivos en el plano xy dando como resultado un vector que se mueve hacia el eje z.
Este proceso que involucra la caída de las componentes xy de la magnetización a cero, ocurre exponencialmente con una
cte de tiempo denominada tiempo de relajación transversal, T2. Esta relajación se debe a procesos no conservativos
porque son procesos que dependen de la entropía del sistema. T2 está relacionada con el ancho de banda espectral: ∆ν1/2=
1/ πT2. Los valores típicos de T2 en RMN de protón son del orden de los segundos, que corresponde a un ancho de banda
de 0.1Hz. Hay que tener en cuenta que en la práctica el campo magnético no es homogéneo, y estás diferencia son las que
más afectan a la frecuencia de Larmor y por ende al ancho de banda.
Se puede dar por:
• Interacciones spin-spin por desfasajes en Mxy
• Imperfecciones en la homogeneidad del magneto
• No puede ser mayor que T1
Brenda Fina
T2 esta relacionado con τr:
T2 α 1/ancho de banda
T2 α 1/ τr
Ancho de banda α τr
Para MM de ↑PM, τr ↑ ↑ancho de banda
BAJA RESOLUCION
Moléculas grandes, como la proteínas, tiende a relajarse lentamente debido a la gran interacción con el medio,
dando como resultados Tl grandes. Hay que tener en cuenta que distintas regiones pueden tener distintos tiempos de
relajación, lo que indica diferencias en la movilidad de la molécula.
τr: tiempo de correlación rotacional
Según las medidas de τr se pueden dividir a las proteínas en:
-11
Rotación rápida: τc =τr=10 s
2 2
wH τr <<1
-1
T2 =k. 5 τc
-1
T2=T1
T1 =k. 5 τc
-8
Rotación lenta: τr=10 s
2 2
wH τr >>1
-1
T2 =k. 15 τc
-1
2
T2>>T1
T1 =k. 2/ wH τc
-2
wH τr=2,5 10
wH τr=250
1/π T2=∆ν ∆ν α τr
↑MM > τr >∆ν → nuevo problema
en proteínas (↑MM), mucho ∆ν.
El T1 y el T2 dependen de cada átomo, por lo que nos dan información sobre la movilidad.
Efectos del medio ambiente nuclear en RMN
La frecuencia de Larmor de un dado núcleo está fuertemente afectada por su entorno químico. Como
consecuencia, el espectro de RMN de una proteína da información que permite elucidar su estructura química. El
corrimiento en la frecuencia de absorción de un núcleo debido a su entorno químico se denomina Desplazamiento
Químico (Chemical shift). Otro efecto que tiene el entorno nuclear sobre los núcleos es el Desdoblamiento spin-spin.
Mientras que el primer efecto es dependiente de la fuerza del campo magnético, el segundo efecto no lo es.
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Parámetros en RMN:
• Desplazamiento químico
• Acoplamiento spin-spin: Escalar y Dipolar
• T1
• T2
Desplazamiento Químico
Este fenómeno ocurre porque el campo magnético, B, que experimenta el núcleo atómico difiere ligeramente del
campo magnético externo aplicado, B0. B es un poco más pequeño que B0 (B< B0) debido al apantallamiento que producen
los electrones cercanos. El campo externo induce la circulación de los electrones alrededor de las orbitas atómicas, que
4
5
genera un pequeño campo magnético B’ opuesto en dirección al B°. B’ es típicamente unas 10 -10 veces menor que B°. El
campo que siente el núcleo esta dado por,
B= B° - B’ = B° (1-σ)
Donde σ es la cte de apantallamiento, y es muy sensible al entorno químico, depende del medio.
La frecuencia de resonancia se transforma en,
ν=γ B°(1-σ)/2π la frecuencia de resonancia
de un núcleo en su átomo es
menor que la del mismo núcleo desnudo.
El desplazamiento químico no puede compararse con resultados de diferentes equipos porque depende de las
propiedades del campo magnético. Además, la cte de apantallamiento no es una medida conveniente para calcular el
corrimiento. Por estas razones, se define el desplazamiento químico en términos de la diferencia de resonancias entre el
núcleo de interés y un núcleo de referencia (ej: tetrametil silano, TMS):
δ= (νx-νref)/νo [ppm] νo es la frecuencia del campo
δ es independiente del B0
De esta forma, este parámetro es independiente del equipo que se use.
El desplazamiento químico depende de muchos factores, pero el más importante y significativo es la densidad
electrónica del entorno. Una alta densidad electrónica causa un gran efecto de apantallamiento (↑B´), lo que implica que el
campo magnético aplicado debe ser incrementado para obtener resonancia. Esto da lugar a un corrimiento de la señal a
regiones de mayor campo y menor δ.
↑ B´ se debe ↑ B0 ↓ δ
Lo contrario sucede si la densidad electrónica es baja. Por ejemplo, si un protón está unido directamente a un
átomo electronegativo como un grupo carbonilo, que tiene una densidad electrónica baja, el desplazamiento químico será
grande y tendrá valores de δ altos.
Brenda Fina
Átomos electronegativos ↓ densidad electrónica < apantallamiento ↑ δ
La intensidad de absorción es estrictamente proporcional a la concentración de núcleos que dan esa señal. Núcleos
idénticos dan la misma señal.
A
g
u
a
Arom
ati
co
Amina/da
10
7
6
Protones amídicos δ=7 y 10 ppm
HCα
5
4
3
HCβ,γ
2
1
Protones α δ= 4 y 6 ppm
0
HN backbone
En el caso de compuestos que contienen dobles o triples enlaces,
los δ no pueden explicarse solamente por los efectos locales. Pueden
ser explicados si se tienen en cuenta las propiedades magnéticas
anisotrópicas de estos enlaces.
Teoría de la corriente del anillo: Las propiedades magnéticas de
los compuestos aromáticos cambian significativamente dependiendo de
la orientación del anillo con respecto al campo magnético externo, este
efecto se denomina efecto de la corriente del anillo (ring-current effect).
Cuando el plano del anillo se encuentra perpendicular al campo
magnético externo se induce una corriente de electrones π. El campo
inducido tiene dirección opuesta al campo aplicado arriba y abajo del plano de la molécula, y la misma dirección en los
lados de la molécula. Entonces, un protón que se encuentra cerca de un anillo aromático es apantallado si está arriba o
abajo del centro del anillo plano, mientras que es desapantallado (su δ aumenta) si se encuentra por fuera del plano del
anillo. Este efecto desaparece si el anillo tiene otra orientación con respecto al campo externo. En el caso de dobles o
triples enlaces sucede lo mismo si la corriente de electrones π es perpendicular al campo externo.
Acoplamiento Espín-Espín
Hay dos tipos de acoplamientos: el acoplamiento escalar y el acoplamiento dipolar. Ambos son propiedades
espectroscópicas fundamentales en la interpretación de espectros complejos de RMN.
Acoplamiento escalar
• Se transmite a través de los enlaces
• No depende de la orientación
• Depende del ángulo diedro
Acoplamiento dipolar
• Se transmite a través de una distancia < 5Å
• Depende de la orientación
Brenda Fina
El acoplamiento escalar se representa como la influencia que ejerce un núcleo
activo en RMN sobre otro núcleo activo. Al tener dos núcleos acoplados, uno de ellos
siente a través de los enlaces químicos un incremento o decremento de campo
magnético debido al espín a favor o en contra del núcleo vecino. Este fenómeno produce señales de RMN más complejas,
por ejemplo, si un núcleo A se acopla a otro núcleo B con I=1/2, la señal de A se verá como dos señales de intensidades
1:1. La distancia entre estas dos señales se conoce como la cte de acoplamiento, J. Esta cte depende de la estructura
nuclear y NO del campo magnético externo. Otro ejemplo, si un núcleo B se acopla con dos núcleos equivalentes con I=1/2
la señal será un triplete con intensidades 1:2:1, la distancia entre las señales con intensidades 1 y 2 es la cte de
acoplamiento, y la distancia total entre las señales con intensidades 1:1 es dos veces esta cte. El acoplamiento escalar se
observa de 1 a 3 enlaces de distancia y no se manifiesta entre núcleos equivalentes. La regla general es que el número de
desdoblamientos de banda en un espectro de primer orden es igual a n + 1, donde n es el número de protones magnéticos
equivalentes. Los valores de J van de 0 a 20 Hz aprox.
Hay un orden de J:
Primer orden: interacción entre 2 núcleos unidos por un enlace. Si este enlace es C—C J↑ si paso a un enlace
doble o triple.
Segundo orden: núcleos separados entre 2 enlaces. Ej: H—C—H
Tercer orden: Acoplamiento de tres enlaces: es el acoplamiento escalar más útil para analizar estructuras
moleculares. El valor de este acoplamiento esta dado por la ecuación de Karplus:
2
J (θ) = A cos θ+ B cosθ + C
Donde θ es al ángulo diedro entre protones. Los valores de A, B y C son parámetros experimentales. Los valores
típicos son A=2Hz, B=-1Hz y C=10Hz.
Brenda Fina
Esta ecuación muestra como a partir de la constante de acoplamiento entre el NH y el Cα se puede obtener
información conformacional del backbone de la proteína a través de su ángulo diedro. Los dos mayores componentes de la
estructura secundaria de una proteína, hélices y láminas β:
α-hélice tiene un θ=120º → J< 6Hz
β-sheet tiene un θ=180º → J= 7Hz
Técnica de irradiación selectiva
1
Se utiliza para averiguar que H están acoplados con otros.
HA esta acoplado con HM y HX veo 2 dobletes, uno con JAX y el otro con
JAM.
En un experimento de irradiación selectiva:
1º se realiza un espectro de RMN 1D (normal) de protón para obtener
todas las señales y saber a que frecuencia absorben.
2º se realiza un espectro de protón, en el que además de excitar todas las
bandas, se excita selectivamente al núcleo que absorbe a 8,5 ppm. Excitando
No se tienen en cuenta porque se
continuamente a la frecuencia de absorción del núcleo x, hago que se igualen las
intercambian muy rápido con el solvente
poblaciones y como resultado la señal desaparece. Se hace que HA tenga
transiciones muy rápidas a favor y en contra del campo B0 de modo que ahora HA ve un promedio y el doblete desaparece.
El acoplamiento dipolar se presenta a través del espacio, es decir, que se requiere proximidad espacial y depende
de la orientación del campo magnético externo. Este acoplamiento se presenta como la influencia que ejerce el campo
magnético de un núcleo activo sobre otro núcleo activo cercano.
15
15
1
El B en N en la dirección del B0, puede ↑ o ↓ en relación a B0 dependiendo de la orientación del vector N— H y
1
del spin H.
B0
Solo la componente paralela al campo magnético externo lleva a la interacción. La componente z del campo dipolar
del núcleo I cambia la frecuencia de resonancia del núcleo S por una cantidad que depende en la distancia internuclear r y
en el ángulo θ.
B0
1
H
Cα
15
N
Los acoplamientos dipolares ensanchan el espectro de RMN, en estado solido son muy anchos.
En solución, este acoplamiento no se observa dado que el promedio de los diferentes acoplamientos en moléculas
que se encuentran en movimiento aleatorio con respecto a B° se promedian obteniendo un valor cero, debido a que las
moléculas se reorientan muy rápido. Entonces se ve un promedio en el tiempo, así, se resuelve mejor, pero se pierde
información si hay un poco de alineamiento Residual Dipolar Coupling (RDC). Pese a esto, este acoplamiento se
manifiesta a través del efecto nuclear Overhauser (NOE). Este efecto es un cambio de intensidad que nace de esta
interacción dipolar. La intensidad de la señal debido al NOE guarda una relación con la distancia entre los núcleos
interactuantes:
6
I (NOE) = k / (rAB)
Brenda Fina
La constante de acoplamiento dipolar es un vector:
Rjk
DD
3
= µ° γj γk h / 4π<rjk >
Los acoplamientos dan información:
Dipolar NOE y RDC
Escalar J
TÉCNICAS EXPERIMENTALES
Transformada de Fourier
Tradicionalmente, se utilizaban espectrómetros de onda continua, lo que implicaba largos experimentos y una
recopilación de datos muy lenta. Luego se utilizaron espectrómetros con muchos canales, lo que permitía la medición
simultánea de numerosos puntos; pero el instrumento tiene como límite la cantidad de canales que puede tener. No fue
hasta que se crearon los instrumentos de pulso de Fourier que se pudo utilizar la técnica de RMN de manera sensible y de
alta resolución. Como se tienen que resolver diferencias de energía muy chicas, se necesitaría mucho tiempo; para cada
valor de frecuencia hay que hacer muchos espectros se excita a TODAS las frecuencias con un pulso que dure poco
tiempo. La intensidad que corresponde a cada frecuencia se obtiene analizando cómo vuelven al equilibrio los momentos
magnéticos luego del pulso.
Bobina de
detección
En el instrumento de pulso de Fourier, los datos son recolectados en función del tiempo; pero el investigador está
interesado en la respuesta de los sistemas de espín en función de la frecuencia. Por suerte, estos dos dominios están
relacionados y se pueden convertir uno en el otro usando un procedimiento denominado Transformada de Fourier. Esta
transformación, relaciona los datos en función del tiempo f(t) con los datos en función de la frecuencia f(ν):
+∞
f (ν ) = ∫ f (t ) e iνt dt
−∞
Brenda Fina
Esta es una transformada continua porque la integración abarca desde infinito positivo a infinito negativo. En la
práctica puede acotarse sobre un rango de tiempo finito:
f (ν ) = ∑ f (t ) e iνt ∆t
La existencia de dos dominios relacionados nos permite definir las
Parejas de Fourier. Algunas de éstas son especialmente útiles en RMN. Por
ejemplo, la transformada de Fourier en función del tiempo cayendo
exponencialmente representada por una línea Lorenzana a una frecuencia
cero, es idéntica a la relación entre el FID (free induction decay) y el espectro
de RMN. Otra pareja de Fourier es la transformada de Fourier del pulso de
radiofrecuencia. Un resultado básico de la transformada de Fourier tiempo-frecuencia es que un corto pulso en el tiempo
puede ser considerado como una fuente de multifrecuencia, lo que permite la excitación simultánea de diferentes
frecuencias de resonancia en un experimento de RMN.
Para clarificar este punto, uno examina la magnetización de la muestra bajo la influencia de un campo de
radiofrecuencia estático. En el marco de referencia, la magnetización nuclear, Mj, de un núcleo con frecuencia resonante,
wi, precesa con una velocidad angular igual a w alrededor del campo efectivo:
2
2 1/2
|Beff| = (1/γ) [(νi – ν) + (γBl) ]
Bl es elegido de modo que se cumpla: γBl >>2π∆; donde ∆ (Hz) es todo el rango de desplazamiento químico de la
muestra medido con respecto a la radiofrecuencia, entonces para cualquier νi del espectro el término νi – ν puede ser
insignificante, haciendo Beff≈ Bl. Esto significa que el vector de magnetización precesa alrededor de Bl para TODOS los
núcleos con la frecuencia de Larmor en el rango ∆, es decir, se aplica un B de forma que TODOS los núcleos estén
precesando con la ν de Largor en ∆. El ancho del pulso de tiempo para cubrir este rango de frecuencia debe ser << 1/∆.
Denominamos ∆’ al rango de frecuencias a ser examinado. Debido a lo heterogéneo que es el sistema de detección,
no es la frecuencia de resonancia, νi, lo importante sino la diferencia entre esta y el campo de radiofrecuencia aplicado, νi –
ν. Si la ν del B1 es elegida dentro del rango ∆’, algunas de las diferencias van a ser positivas y otras negativas. Durante la
recolección de datos, como el detector mide en función del tiempo, no puede distinguirse entre frecuencias positivas y
negativas. Como las frecuencias negativas y positivas difieren en sus fases, se utilizan dos detectores de fase para revelar
el espectro.
El análisis de Fourier también es esencial para entender el efecto del pulso propiamente dicho. Un pulso
rectangular en el tiempo de radiación monocromática con frecuencia, ν°, puede ser descripto en función de la frecuencia
como una banda centrada en ν°. Esta frecuencia monocromática es producida por un generador de pulso y se denomina
frecuencia de espectrómetro. Siguiendo las reglas de la transformada de Fourier, si la duración del pulso disminuye, el
ancho de la banda de la frecuencia aumenta. Se asume que el largo del pulso es relativamente menor que Tl y T2 para que
no se produzca la relajación durante el tiempo que dura el pulso.
El intervalo entre pulsos se denomina T. Durante este tiempo, una señal de radiofrecuencia en función del tiempo
denominada FID (Free induction Decay) es emitida por los núcleos excitados a medida que se van relajando. FID es
detectado con un espiral recibidor (receiver coil), ubicado perpendicular al campo magnético estático.
Espectrómetro de RMN
La sensibilidad y resolución de espectrómetro dependen de la fuerza y calidad del campo magnético. El campo debe
ser altamente homogéneo y reproducible. Estas características sólo pueden ser alcanzadas con un solenoide
superconductor. Este espiral de radiofrecuencia actúa como detector y como transmisor de la frecuencia de resonancia. La
Brenda Fina
señal medida procesada en una computadora es una línea de baja frecuencia obtenida de la diferencia entre la frecuencia
transmitida y la detectada.
La muestra es ubicada en el centro del imán cilíndrico para asegurarse de que todos los núcleos magnéticos
experimenten el mismo campo. El imán superconductor opera a la temperatura del Helio líquido (4K), pero la muestra
está a temperatura ambiente.
Con el objetivo de perturbar el sistema de espín con energía del orden de las radiofrecuencias, el espectrómetro
posee sofisticados programas de pulso y unidades de transmisión
que permiten la aplicación de complejas secuencias de pulsos.
La fuente de la radiofrecuencia es un cristal oscilador
estable que funciona continuamente, y todas las frecuencias en el
espectrómetro derivan de él. La señal de onda continua
proveniente de esta fuente se controla en amplitud y fase con una
unidad de puerta.
La secuencia pulso/adquisición/retardo se repite N veces
para aumentar la relación señal/ruido.
Experimentos de Simple Pulso
Adquisición y procesamiento de datos
Después de un retardo inicial, se le aplica el pulso a la muestra con un espiral de radiofrecuencia. El detector se
enciende y, luego de un tiempo muerto corto, se mide la respuesta del sistema de espín y se almacena en la computadora.
El tiempo de adquisición de datos debe ser largo para asegurarse de que la respuesta del sistema decayó lo suficiente
hasta hacerse insignificante (un par de veces T2). Otro retardo permite que la muestra de espines vuelva completamente
al equilibrio (relajación Tl). Cuando la frecuencia del pulso, ν°, se iguala a la frecuencia de Larmor, el vector de
magnetización nuclear se inclina fuera de la dirección z. Como el pulso es sobre la dirección x’, y el ángulo de inclinación es
hacia y’. Esto puede explicar por que RMN es una técnica de resonancia. Resonancia es una condición en la cual la energía
es trasladada de tal manera que una pequeña perturbación produce un gran cambio en algunos parámetros del sistema
perturbado. RMN es una técnica de resonancia porque una pequeña perturbación periódica, Bl, produce un gran cambio
en la orientación del vector de magnetización de la muestra. El ángulo de inclinación está dado por,
α = γ B l tp
Free Induction Decay (FID) Magnetización por un pulso de 90º
En la práctica, el B0 no es completamente homogéneo, lo que causa que los grupos de núcleos en distintas partes
de la muestra experimenten diferentes B0 locales, es decir, que causa divergencias locales en la frecuencia de Larmor
haciendo que los vectores de magnetización nuclear se separen unos de otros. Esto es lo que principalmente afecta a T2,
que representa la relajación de la magnetización en el eje xy, en otras palabras, es el proceso por el cual la componente –
y’ de la magnetización se vuelve cero. Al mismo tiempo, el proceso de relajación Tl provoca que la magnetización vuelva al
equilibrio en la dirección z. Como la no homogeneidad del campo provoca que T2 sea menor a Tl, ocurre una situación
intermedia en la que la componente de la magnetización en –y’ se vuelve cero antes de que la población de espines pueda
llegar al equilibrio de Boltzmann. Después de un tiempo (después de cinco veces Tl) la magnetización alcanza el equilibrio.
A medida que la componente –y’ disminuye, el voltaje oscilante del espiral también decae y alcanza el valor cero, aun
cuando los espines no alcanzaron el equilibrio. El registro del voltaje recibido en función del tiempo se denomina FID,
Brenda Fina
porque los núcleos pueden procesar libremente en la ausencia de Bl. FID es la sumatoria de los voltajes oscilantes
individuales provenientes de los distintos núcleos de la muestra, cada uno con su frecuencia, amplitud y T2 característico.
FID es la pareja de Fourier del espectro de frecuencias de RMN.
Experimentos de Múltiples Pulsos
En un experimento de múltiples pulsos, una secuencia de pulsos de radiofrecuencia específicos es aplicada a la
muestra antes de medir FID. Estos experimentos proveen información que es imposible de obtener con los experimentos
de simple pulso. Una secuencia de pulso está definida por la amplitud y el ancho de cada pulso y el tiempo de demora
entre ellos (T). Hay una gran cantidad de experimentos de pulsos múltiples, pero todos s pueden dividir en tres grandes
grupos:
1. Grupo I: incluye secuencias de pulsos para la medición de los tiempos de relajación. Para medir el tiempo de
relajación longitudinal (Tl) se utiliza el método de inversión-recuperación (inversión-recovery) que se basa en una
secuencia simple de dos pulsos. También incluye el método de espín- eco (spin-echo) para medir el tiempo de relajación
transversal (T2), y se basa en una secuencia de pulsos distintos.
2. Grupo II: incluye técnicas de transferencia de la polarización a través del acoplamiento escalar de heteronúcleos
con el fin de aumentar la sensibilidad. Estas técnicas son importantes para la observación de núcleos raros con una cte
giromagnética baja. El truco básico implica borrar la polarización de los núcleos más sensibles (con cte giromagnéticas
altas) para poder observar la polarización de los menos sensibles. Uno de los métodos más simples es el INEPT, aumento
del núcleo insensible por transferencia de polarización. Hoy en día casi todos los experimentos de RMN heteronucleares y
multidimensionales usan el método INEPT para transferir la magnetización entre distintas especies de espín, pero la gran
desventaja de esta técnica es que su eficiencia se deteriora a medida que aumenta el tiempo de correlación rotacional
(movimiento browniano molecular). Hay otra técnica que supera esta desventaja porque en independiente del tiempo de
correlación rotacional, CRIPT, transferencia de polarización por la polarización inducida de la relajación cruzada. La
combinación de estas dos técnicas nos lleva a otra altamente eficiente para muestras en solución de moléculas de gran
tamaño, CRINEPT.
3. Grupo III: usa el efecto nuclear Overhauser (NOE) basado en la transferencia de polarización a través de
acoplamiento dipolar.
Brenda Fina
Método de inversión recuperación para medir Tl
Se eligen valores pequeños
entre 4-5 veces T1
Durante el intervalo τ, el sistema regresa al equilibrio por el proceso de relajación longitudinal. El proceso de
relajación espín-espín no está involucrado en este caso porque el vector de magnetización, M, se encuentra en el eje z. A
medida que los momentos magnéticos individuales vuelven a sus orientaciones más favorables sobre el eje +z, el vector
de magnetización neto se vuelve cada vez más corto sobre la dirección –z. Dependiendo de la duración del retardo (τ), M
pasa por cero y finalmente alcanza su magnitud original en el eje +z. Con el fin de determinar la extensión de la relajación,
M debe convertirse en una magnetización observable en el plano xy. Esto se logra aplicando un segundo pulso, pero en
este caso de 90°. Dependiendo de cuan negativa sea todavía la magnetización (todavía está en el eje –z), rotará hacia el
eje +y; pero si la relajación ya se completo cuando se aplica este pulso la señal rotará hacia el eje –y. La intensidad I del
pico que resulta de la transformada de Fourier del FID varía con τ desde un valor máximo negativo para τ=0, a un valor
máximo positivo en τ=∞.
(-τ/Tl)
I = I∞ [1-2 e
]
Si I=0 τ/T1 = ln 2
El efecto del espín-eco para medir T2
Eco de espín: es un pulso de magnetización que se deja dispersar, es reflejado, y después es detectado como otro
pulso un tiempo más tarde.
Brenda Fina
La secuencia de pulsos de esta técnica permite la medición independiente de la componente de no homogeneidad
del campo magnético externo. Se debe tener en cuenta que la magnetización en el plano xy va a ser perdido por procesos
*
que no afectan a la componente z. la cte de velocidad para esto es la reciproca de la cte de tiempo de FID, T2 .
*
T2 esta dado por:
• Heterogeneidad de B0
*
• Tiempo de relajación spin-spin T2 .
•
El pulso inicial de 90° inclina el vector de magnetización sobre el eje –y. Si los ejes estuvieran rotando exactamente
a la frecuencia de Larmor de los núcleos, el efecto de T2 es el gradual acortamiento de M en la dirección –y. Pero como B0
no es perfectamente homogéneo, algunos de los espines de la muestra precesan más rápido (1 y 2) y otros más lento (3 y
4) que el marco de coordenadas rotatorio; los más rápidos se mueven en contra de las agujas del reloj mientras que los
más lentos lo hacen en dirección de las agujas. Como resultado de esta disparidad, los vectores de los espines se dispersan
(se separan) sobre el plano xy durante τ1, después del pulso de 90°. Al final de τ1, se aplica un pulso de 180° que manda los
espines al eje +y. Los vectores dispersados todavía precesan en la misma dirección y a la misma velocidad. Durante el τ2
(misma duración que el anterior), todos los vectores se refocalizan sobre el eje +y para dar la magnetización máxima en el
plano xy (este es el eco). Si se monitorea la señal de RMN durante esta secuencia 90°- τ -180°- τ, la señal desaparece
durante el primer τ y después se recupera para dar el máximo, el eco de espín, cuando los vectores son refocalizados. La
amplitud se reduce por la relajación T2 y por los efectos residuales del sistema espín-lattice. La cte de tiempo por la
disminución de la magnitud del eco es la verdadera T2, porque los efectos de la pérdida de homogeneidad del B0 son
eliminados en el proceso de refocalización.
Nuclear Overhauser Enhancement (NOE) permite medir interacciones dipolares
El NOE se ilustra como un sistema de 2 spines I y S no equivalentes y sin acoplamiento escalar (J=0). Cuando uno es
excitado (S), el dipolo magnético perturba el estado de equilibrio del otro (interacción dipolo-dipolo), produciéndose lo
que se conoce como relajación cruzada: un spin transfiere magnetización a través del espacio al otro. Por tanto, la
intensidad de la señal del espín I cambia cuando se perturba el estado de equilibrio del espín vecino. La perturbación
puede realizarse mediante saturación o inversión con pulsos de radiofrecuencia. El cambio de intensidad que nace de
esta interacción dipolar se denomina efecto Overhauser nuclear.
Sin acoplamiento escalar el espectro de RMN consiste en un singlete en cada δ.
Luego de la saturación de S, I puede volverse:
• Mas fuerte
• Mas débil
• invertido
Brenda Fina
Sistema de spin: cuando un núcleo se excita como en RMN, la diferencia de energía entre los estados fundamental
y excitado es muy pequeña, entonces los núcleos permanecen bastante tiempo en el estado excitado y se relajan
lentamente. La forma de volver al estado fundamental es transfiriendo la energía a los núcleos vecinos. Así, cuando se
satura un spin, este va a volver al estado fundamental transfiriendo la energía a los núcleos vecinos de tal manera que se
altera la diferencia de población entre los estados fundamental y excitado de éste último y esto se manifiesta como un
cambio en la intensidad de la señal.
El cambio de intensidad del espín I está gobernado por tres probabilidades de transición: de cero, uno y doble
cuanto, denominadas W0IS, W1IS y W2IS, respectivamente. Estas describen los mecanismos de relajación cruzada en un
sistema ideal de dos espines.
No se ven porque S
esta saturado
W0 y W2 gobiernan el
regreso al equilibrio
Sin embargo, cuando el sistema vuelve al equilibrio NO hay Reglas de
selección (vuelve por donde puede).
Si W2 domina:
Vacío el excitado y lleno el fundamental ↑intensidad I (↑ señal) NOE +
Si W0 domina:
Vacío el fundamental y lleno el excitado ↓intensidad I (↓ señal) NOE -
La diferencia entre estas probabilidades (W2 - W0), se denomina constante de velocidad de relajación cruzada (σIS),
y describe la velocidad de las transiciones dipolo-dipolo que dan lugar al NOE. Por tanto, σIS es una medida de cuán rápido
crece el NOE entre los spines I y S. El otro término (ρIS), se llama constante de velocidad de relajación dipolar longitudinal
(W0 + 2W1 + W2) y define la parte del mecanismo de relajación responsable de restablecer el estado de equilibrio del spin
I. Por tanto, incorporando estas definiciones y considerando, por ejemplo, la saturación del spin S, en el estado
estacionario debe cumplirse que dIZ/dt = SZ = 0, con lo que:
NOE = (W2 - W0) / (W0 + 2W1 + W2)= σIS / ρIS
¿De que depende si la relajación es por W2 o W0?
Depende del tiempo de correlación rotacional de la proteína:
Brenda Fina
-11
-1
2
2
Moléculas pequeñas: movilidad rápida, τc ≈ 10 s; τc >>ω, ω τc <<1. Dado que:
6
W0 α 2τc /r y W2 α 12τc/r
6
W2 > W0 NOE >0
-1
2
2
Macromoléculas: movilidad lenta, τc≈ 10-8s; τc << ω, ω τc >>1. Dado que:
W2 < W0 NOE <0.
Por supuesto, en la realidad, no existen sistemas de espines ideales y la relajación dipolar entre los espines I y S no
es el único mecanismo por el que tiene lugar la relajación.
La interacción dipolar depende de:
• tiempo de correlación rotacional porque éste es capaz de modular la velocidad de relajación
1
• distancia entre los H interactuantes
3
Interacción dipolar α τc/ r
2
2
6
A su vez, el NOE α (interacción dipolar) NOE α τc / r
NOE ↓ con la distancia y mas allá de los 5 Å la interacción es muy débil y NO se ve.
Esta técnica de transferencia de la polarización se basa en aplicar selectivamente un campo de radiofrecuencia
saturante al espín con mayor cte giromagnética, S. Esto resulta en una redistribución de la población de espines de S que
provoca una magnificación de la polarización de los espines I, suponiendo que los procesos de relajación son favorables. El
campo de radiofrecuencia selectivo se aplica en la posición donde se encuentra el pico de resonancia del espín que quiero
saturar. Cuantitativamente, el NOE se expresa en términos del incremento relativo de la intensidad de la señal:
NOE= (I-I°) / I°
Donde I e I° son las intensidades con y sin la saturacion.
NOE es la consecuencia de la modulación (modulación: modificación de la frecuencia o amplitud de las ondas
eléctricas) del acoplamiento dipolo-dipolo entre dos espines a través del movimiento Browniano. La ecuación que
describe a NOE:
NOE α f(r) f (τC)
El término f(rIS) es un efecto de relajación cruzada debido a la interacción dipolo-dipolo.
3
3
6
‹1/r x 1/r › = ‹1/r ›
Esta ecuación demuestra porque NOE es aplicable a núcleos acoplados que se encuentran muy cercanos,
aproximadamente a 5Å de distancia. El máximo valor de NOE para el caso de heteronúcleos está dado por,
NOEmax = 0.5 γS/γI +1
Donde γS/γI es el radio de las cte giromagnéticas del núcleo saturado y del núcleo observado.
Una de las principales dificultades que surgen cuando uno quiere correlacionar las intensidades de NOE con las
distancias intramoleculares es la difusión de espín. Los arreglos geométricos de los protones dentro de las estructuras
espaciales de las biomoléculas permiten que la difusión de espín se dé en una variedad de rutas distintas a la relajación
cruzada directa que nos interesa analizar. Estas relajaciones cruzadas subsecuentes afectan significativamente el NOE
resultante.
El término f(τC) muestra que el fenómeno de NOE está relacionado con la relajación del espín.
Brenda Fina
NOE varía como una función del producto de la frecuencia de Larmor y el tiempo de correlación
-10
-12
8
9
rotacional (ωτC). τC es del orden de 10 -10 s para moléculas pequeñas y ω es del orden de 3.6x10 -3.6x10
rad/s. Entonces el producto ωτC es aproximadamente 0.1-0.01. Igualmente,
hay que tener en cuenta que τC aumenta con el tamaño de la molécula y la
viscosidad del solvente.
2 2
Si el producto ωτC<<0.1, el término ω τC contribuye muy poco y el
NOE está cercano a +0.5. Pero cuando el producto ωτC = 10 o más, el NOE se
acerca al límite de -1, que corresponde a la desaparición de la señal de I.
1
13
También se puede irradiar un H y observar la relajación de un heteronucleo con spin ½ ( C).
Respecto al equipo lo que se hace es realizar una serie de
1
Pico del H saturado invertido
experimentos en los cuales alternativamente se adquiere un espectro
saturado y uno sin saturar. El quipo registra el espectro del NOE
diferencial, lo cual es simplemente la resta algebraica de los 2
espectros. En el caso que I>I0 NOE >0.
1
NOE >0
Como en una proteína hay muchos H, uno tendría que irradiar a
cada uno para ver lo que le sucede al resto para solucionar este
problema se diseño RMN en 2 dimensiones.
Aproximaciones para identificar NOEs
1 1
15
13
H- H Homonuclear
N- o C- Heteronuclear
1
1
2D H↔ H
3D
1
1
1
H↔ H↔ H
1
3D
1
1
H↔ H
15
N
1
H↔ H
13
C
RMN en Dos Dimensiones
Tiempos mayores
Mayor resolución
El término RMN en una dimensión se refiere a un experimento en el cual la señal transformada se
presenta en función de de una sola frecuencia. Análogamente, en un experimento de dos dimensiones el
espectro de RMN se presenta en función de dos frecuencias.
Un típico experimento en dos
dimensiones consta de cuatro períodos
sucesivos: preparación, evolución, mezclado y
detección. El período de preparación
generalmente consiste en un tiempo de
demora durante el cual se alcanza el equilibrio
térmico, τp. Después de esta etapa, el sistema
de espines está preparado para alcanzar un
estado de no equilibrio inicial, normalmente
debido a un pulso de radiofrecuencia de 90°.
La etapa de evolución define el tiempo t1. Las
señales provenientes de los tiempos del período de evolución y del período de detección, t1 y t2, se mezclan
en el tiempo de mezclado, τm. La adquisición de datos de las señales de RMN se realiza sólo durante el
Brenda Fina
período de detección, t2. Variando el tiempo de demora t1 de forma sistemática, y manteniendo los otros
parámetros inalterados, se obtiene una matriz del tipo s(t1, t2). Haciendo una doble transformada de Fourier
obtenemos el espectro en dos dimensiones S(ω1, ω2).
Clasificación de los experimentos en dos dimensiones según Ernst:
1. COSY (correlation spectroscopy), este experimento está diseñado para correlacionar las
transiciones de espines acoplados por transferencia de magnetización transversal desde una transición a
otra en el curso de procesos de mezclado especialmente diseñados. Es un experimento en 2D a partir del
cual se obtiene información de la estructura 2ria y 3ria de una proteína teniendo en cuenta SOLO los
acoplamientos escalares spin-spin.
2. Homonuclear or Heteronuclear Two-dimensional J-resolved Spectroscopy o Spin-echo
Spectroscopy (Espectroscopia de espín eco), estos experimentos fueron diseñados para separar las
diferentes interacciones (corrimiento químico y acoplamiento espín-espín) en dimensiones ortogonales (que
forman ángulo recto) de frecuencia, con el propósito de resolver señales que se superponen en
experimentos de una dimensión. Estás técnicas requieren condiciones particulares para que la información
obtenida en el período de evolución y la obtenida en el período de detección sean distintas.
3. NOESY (Nuclear Overhauser Enhaced Spectroscopy), esta técnica se utiliza para estudiar procesos
dinámicos, como intercambio químico, relajación cruzada o el efecto de Overhauser transitorio.
Espectroscopia de Correlación (COSY)
n
La secuencia de pulso es 90°-kt1-90°-adquisición de datos, donde k=o,1,2….2 . El experimento se
repite k veces. Las señales de FID se miden y plotean como s(t1, t2), donde t1 y t2 son variables
independientes. Se aplica la transformada de Fourier a
los valores digitales de t1 y t2 para obtener el espectro
S(ω1, ω2) en frecuencia.
Consideremos dos protones, A y B, que están
acoplados escalarmente. Después del primer pulso de
90°, durante el tiempo de demora t1, cada protón
resuena a su frecuencia de Larmor, ωA y ωB; aunque en
realidad dos frecuencias están involucradas para cada
núcleo debido al acoplamiento, ωA ± ½ JAB y ωB ± ½ JAB.
Después del segundo pulso de 90°, podría parecer como
que el pulso no tiene efecto sobre los espines porque siguen precesando a las mismas frecuencias de
Larmor. Alternativamente, una porción de la magnetización asociada al espín A durante el tiempo t1 puede
ser transferida al espín B durante t2. Este resultado viene del proceso conocido como Transferencia
Coherente (Coherence Transfer). Coherencia significa que un grupo de espines parecidos tienen la misma
fase en el plano xy. En otras palabras, una porción de la magnetización que precesaba a ωB durante t1 ahora
precesa a ωA durante t2.
Brenda Fina
En el espectro que se obtiene hay picos que están sobre una diagonal, estos picos son el resultado de
la evolución de la magnetización que tiene frecuencias de transición originadas por la interacción de espines
iguales durante ambas transiciones; NO DAN INFORMACION. Los picos que están fuera de la diagonal son los
importantes porque resultan de la interacción de espines distintos que están acoplados de forma escalar. El
espectro es simétrico respecto a la diagonal. Teniendo en cuenta
que los crosspeaks que se observan corresponden a protones
separados por tres o menos enlaces en la estructura de los
aminoácidos (AA), el espectro de COSY permite identificar los
residuos de los distintos AA que componen la molécula. Hay una
zona del espectro denominada “zona
de la huella dactilar” que resulta de la
intersección del rango 7-10ppm de los
protones amídicos con el rango 46ppm de los protones alfa. En esta
zona va a haber un crosspeak por cada
AA, excepto en el caso de la prolina,
que no tiene protón alfa, y en el caso
de la glicina, que tiene dos protones
alfa. Si quiero asignar tengo que fijarme en las zonas en las
cadenas laterales del espectro, se asignan puntos en la diagonal
empezando por la parte mas resuelta. El tiempo que lleva hacer
un 2D respecto a uno normal es mucho mayor, por lo que solo
1
es ventajoso usarlo cuando tengo muchos H.
Hay veces que existe una superposición de 2 crosspeaks,
que puede deberse a:
• 2 núcleos interaccionando con un tercero
• Núcleos sin relación y los 2 crosspeaks caen
casualmente en el mismo lugar
Para poder discernir entre estas posibilidades se hace un
R-Cosy.
En estos experimentos, se irradia con secuencias de
pulso de tiempos intermedios donde interaccionan los spines:
COSY interacción escalar
Brenda Fina
NOESY interacción dipolar
En proteínas de gran tamaño, la resolución del 2D no es suficiente, entonces se realiza un 3D, que al
igual que en el 4D, se usan los trazos bidimensionales.
Otra manera de resolver los espectros es con la utilización de Heteronucleos, en los cuales se puede
ver la correlación H—N o H—C.
Relayed COSY (R-COSY): si hay dos señales que caen en la misma zona de frecuencia, esto puede
deberse a núcleos que están interaccionando con un tercero en común o simplemente son núcleos que no
tienen nada que ver. Para
diferenciar entre estos dos casos, se realiza este
experimento que produce un
espectro en el cual veo crosspeaks entre núcleos
que están interaccionando con
un tercero en común. El crosspeak no significa
que están interaccionando
entre ellos. De esta forma, si A y C están
acoplados a B de forma
independiente, voy a ver un crosspeak formado
por A y C a la altura de B. si
vuelvo a tener una superposición de picos hago un DR-COSY o un TOCSY.
Total correlation spectroscopy (TOCSY): me permite ver núcleos que están acoplados directamente y
núcleos que están acoplados a un tercero en común, es decir que es la sumatoria del COSY y R-COSY. Sirve
para caracterizar los sistemas de spin completos: hay un sistema de spin para cada AA, pudiendo
reconocerse entre que residuos están involucrados.
RMN Heteronuclear
15
13
Se marca la proteína con N o C y se estudia la interaccion H—N o H—C. Esto tiene la ventaja de
que estos núcleos, por lo general, tienen J de 1er orden, porque solo están separados por un solo enlace y la
1
interaccion es muy fuerte. Además, una proteína tiene menos cantidad de N y C que de H. Estos C y N son
más sensibles al ambiente químico, entonces tienen más rango de desplazamiento químico, por lo que las
señales están más dispersas y menos superpuestas ↑Resolución.
15
Para marcar con N: se trabaja con proteínas recombinantes, expresadas en una bacteria.
13
Para marcar con C: también se trabaja con proteínas recombinantes.
En general esto posee un problema intrínseco: los heteronucleos activos son menos abundantes en la
naturaleza y tienen ctes giromagneticas γ muy bajas, entonces son muy difíciles de observar ↓sensibilidad
Brenda Fina
1
Para resolver el problema de las ↓γ se desarrollo la Detección de Heteronucleos mediante H (HSQC).
Es un experimento de detección inversa, se detecta la señal del heteronucleo a través del protón que es más
1
sensible y más abundante, es decir, se excita al heteronucleo, le pasa la información al H y uno lo detecta.
1
15
Se aplica un pulso excitando los H, lo cual es transferido a los N; se deja relajar y se aplica otro pulso a
distintos tiempos, observando así como el N le transfiere la magnetización al H. Así se puede determinar si el
1
N esta asociado al H. Los H que están interactuando con los núcleos marcados van a tener frecuencias
distintas a la frecuencia de Larmor de los que no estén interactuando.
15
N
1
H
Espectroscopia de Magnificación del Overhauser Nuclear (NOESY)
Secuencia de pulsos que permite ver el acoplamiento dipolar. La secuencia de pulso es 90°-t1-90°-τm90°-t2-adquisición de datos. En el delay de equilibrio y el pulso inicial de 90º, se prepara al núcleo llevando el
M al plano xy. Durante t1 los núcleos son marcados por frecuencias por sus valores de desplazamiento
químico. El 2do pulso de 90º rota parte de la magnetización de nuevo al
eje z. Durante el τm la magnetización longitudinal puede relajarse, esto
produce una mezcla de magnetización entre núcleos que están
relacionados por el mecanismo de relajación dipolar. El tercer pulso es
necesario para llevar la magnetización al plano xy y poder detectar la
señal durante el período t2. Los componentes de magnetización que no intercambien con otras
componentes durante τm, mantienen sus frecuencias iguales en t1 y t2. Por esta razón, los picos
correspondientes caen sobre la diagonal en el espectro. Por otro lado, un intercambio de magnetización
entre dos componentes debido al acoplamiento dipolar durante el período de mezclado se manifiesta con el
cruce de picos (crosspeaks).
Fundamentalmente, el espectro en dos dimensiones de NOESY muestra todas las combinaciones
posibles de protones en la molécula. Un cruce de picos (crosspeaks) indica que la pareja de protones está
separada por menos de 5Å, mientras que la ausencia de pico indica una distancia mayor.
Brenda Fina
Espectroscopia de Relajación Transversal Optimizada (TROSY)
Esta técnica fue desarrollada para superar las limitaciones que presentan otras técnicas debido al
aumento de la fuerza del campo magnético externo. En experimentos heteronucleares generales, se
produce un gran aumento en el ancho de banda debido al alto grado de relajación transversal que se
produce en campos magnéticos fuertes.
En la técnica de TROSY, primero se crea la
magnetización del protón. Después, ésta es transferida al
15
núcleo N por un elemento que transfiere la polarización.
Después de la “frecuencia de marcado” de la
15
magnetización del N durante el período de evolución, t1,
1
la magnetización es transferida nuevamente a H por un
1
elemento que transfiere polarización reversa y detectada en H durante el tiempo de adquisición, t2. La
proporción de de relajación transversal nuclear aumenta con la masa molecular de la molécula.
Esta técnica utiliza el desacoplamiento de los núcleos durante los períodos de evolución y adquisición
para tener espectros más simples y mejorar la sensibilidad. No obstante, a campos magnéticos altos, la
1
15
13
anisotropía del corrimiento químico (CSA) de los núcleos de H, N y C pueden ser fuentes importantes de
relajación transversal, además de la relajación del acoplamiento dipolar que está siempre presente. TROSY
explota constructivamente la interferencia entre la relajación del acoplamiento dipolar y la relajación de la
anisotropía del corrimiento químico (CSA), y utiliza la relajación CSA a campos altos para cancelar la
relajación dipolar independiente del campo. Usando esta técnica, la estructura de multiplete se desacopla
pero sólo la línea más angosta y con la relajación más lenta de cada multiplete es retenida.
RMN Multidimensional Homo y Heteronuclear
Al igual que en RMN en dos dimensiones, los ejes en tres y cuatro dimensiones corresponden a tres y
cuatro dominios de frecuencia, respectivamente. Los períodos que constituyen las secuencias de pulsos son
básicamente las mismas, sólo que se van agregando etapas antes de la detección:
2D RMN: Pa→Ea(t1)→ Ma →Da(t2)
3D RMN: Pa→Ea(t1)→ Ma →Eb(t2) →Mb →Db(t3)
4D RMN: Pa→Ea(t1)→ Ma → Eb(t2) →Mb →Ec(t3)→ Mc →Dc(t4)
La aplicabilidad de experimento en tres dimensiones con homonúcleos está limitado a moléculas con
masas iguales o menores que 10KDa. En cambio, el experimento en tres y cuatro dimensiones con
heteronúcleos permite el estudio de moléculas con masas de 25KDa. El principal objetivo de los
1 1
experimentos de RMN heteronucleares es obtener la mayor cantidad de picos H- H NOE individuales en el
sistema estudiado.
Alineamiento Estérico Inducido
Se trata de una nueva clase de experimento basado en la anisotropía de las interacciones magnéticas
que normalmente no son observadas en espectros de RMN de alta resolución es estado líquido. Los
experimentos dan restricciones estructurales de largo alcance que están basadas en la orientación, y no en
la distancia. Dependen de la medición del acoplamiento dipolar residual, y, en algunos casos, del CSA bajo
condiciones particulares.
Brenda Fina
Acoplamiento Dipolar Residual
El acoplamiento dipolar es una interacción entre núcleos vecinos que se produce porque la corriente
magnética de uno de los núcleos afecta el campo magnético estático que está experimentando el otro
núcleo. La componente z del campo dipolar del núcleo I cambia la frecuencia de resonancia del núcleo S en
una magnitud que depende de la distancia internuclear, r, y del ángulo entre los vectores internucleares I-S y
la dirección del campo magnético externo, B°.
La interacción dipolar, DIS, está dada por,
2 3
DIS = cte (γIγShµ°/4π r IS) ‹(3cos2θ-1)/2)›
Los símbolos ‹› denotan un promedio de tiempo.
En una solución isotrópica, la interacción dipolar internuclear es cero debido al difusión Browniana
rotacional. Como consecuencia, un espectro de RMN de una solución muestra líneas de resonancia finas;
pero no tiene información rotacional valiosa. La mayoría de las biomoléculas presentan algún grado
susceptibilidad anisotrópica magnética que provoca su alineamiento en un campo magnético y lleva a un
movimiento Browniano anisotrópico (tumbar), pero este alineamiento no es muy efectivo.
Se puede conseguir un buen grado de alineamiento en un campo magnético si se utilizan agentes
orientacionales, como ser. Bicelas fosfolípidas planas, virus o fagos con forma de vara, membranas y geles
poliméricos. En el caso de las bicelas, las proteínas y péptidos se alinean por la presencia de superficies
discoidales orientadas. En una solución acuosa la proteína tumba rápidamente, pero de forma anisotrópica,
en el espacio interbicelar. En el caso de fagos, las biomoléculas parecen alinearse debido a un mecanismo
estérico y no por la unión de las macromoléculas con el fago. El alineamiento parece estar inducido por
colisiones entre la molécula asimétrica y el fago alineado magnéticamente. Con estos agentes logro una
mayor resolución el espectro de RMN.
Anisotropía del Corrimiento Químico (CSA)
Los corrimientos químicos también son interacciones de espín anisotrópicas y pueden contribuir con
información estructural. El corrimiento químico surge porque núcleos en distintos grupos funcionales
resuenan a distintas frecuencia dependiendo del apantallamiento electrónico del entorno. Los entornos
electrónicos son rara vez isotrópicos, entonces los apantallamientos son distintos según la orientación que
tengan los grupos funcionales. Por esta razón, el corrimiento químico tiene una dependencia angular que es
similar a la del acoplamiento residual.
Los resultados con macromoléculas orientadas muestran que el acoplamiento dipolar residual y CSA
no tienen más un valor de cero y pueden ser medidos. Los parámetros resultantes dan una valiosa
información estructural.
Brenda Fina
RMN DE PROTEINAS
En RMN se puede elegir lo que quiero ver, se hacen experimentos de secuencias de pulsos (al C, al N
o al H) para ver selectivamente algunas cosas. Los distintos experimentos lo que hacen es mandar al plano
xy lo que quiero ver y dejar perpendicular lo que no quiero ver.
Antes de hacer las asignaciones y ver estructuras por RMN es indispensable conocer la frecuencia de
AA de la proteína.
Como primera medida tenemos que tener en cuenta que no TODOS los núcleos están mutuamente
acoplados. Cada AA da lugar a un sub-espectro diferente (sistema de spin: NH—CH—R) que es más simple
que el espectro completo de la proteína.
Regiones del espectro corresponden a diferentes partes de los AA y la estructura terciaria incrementa
la dispersión de las resonancias, es decir, los α no van a estar todos juntos en una zona sino dispersados por
el espectro.
α
H -Hβ
Metil (Leu, Val, Ile)
HN-Hα
Interacciones del
backbone
Metil (Ala, Thr)
(Tener cuidado
con la Gly y Pro)
Aromáticos
1)
Lo primero que se debe hacer es la asignación de la secuencia, es decir, poner a cada señal
una etiqueta (decir a que residuo pertenece cada C, N o H). Para esto se debe conocer la secuencia de AA.
Estrategia básica para asignar resonancias en una proteína
I. Identificar las resonancias para cada AA sistema de spin por acoplamiento escalar.
T
G
L
S
S
R
G
Brenda Fina
II. Poner los AA en orden acoplamiento dipolar
• Asignación secuencial (R-G-S, T-L-G-S) se debe poner no solo el nombre del residuo (Cys) sino
134
también la posición en la secuencia (Cys )
1 2 3
4 5 6 7
• Asignación especifica de secuencia R -G -S - T -L -G -S
N
I. Lo que primero se hace es analizar la zona de mayor dispersión, es decir, la de los H (entre 7 y 10
N α
ppm); se mira en la zona de H -H , es decir, veo el enlace peptídico. Es la zona de mayor dispersión porque
hay pocos NH y abarcan mayores desplazamientos químicos.
COSY el acoplamiento escalar permite identificar cada sistema de spin de cada AA. (2D
HOMONUCLEAR)
α
Excepciones: la Pro no tiene NH y la Gly tiene 2 H .
α
α
Cada NH ve su propio H porque para observar el H del AA siguiente hay 4 enlaces y no se ve
α
γ
acoplamiento. El H entonces se acopla con el NH y con la cadena lateral, es decir, Hβ, H , etc esta
empaquetado en un sistema de spin NH—CH—R.
Las constantes de acoplamiento 3J están restringidas a cada AA.
Los espectros suelen ser simétricos con respecto a la diagonal. Como cada AA tiene un sistema de
spin característico, se puede ir sabiendo que AAs componen la estructura primaria de la proteína, porque se
N α
conocen los patrones de spin de cada AA. En la huella dactilar (H -H ) se cuentan los picos número de AA.
Así: COSY (1 acoplamiento) → R-COSY (2 acoplam) → DR-COSY (3 acoplam) → TOCSY (todos)
Brenda Fina
Cada NH en cada línea voy a tener el sistema de spin completo. Ventaja: no tengo que mirar la zona
de alifáticos (picos muy juntos) y no se superponen.
α
También se mira la zona de los H entre 4 y 6 ppm para ver que protones están acoplados con que
NH. Pero para poder distinguir en que posición están (por ejemplo 2 Gly) se hace el NOESY.
II. NOESY se observan los picos de los residuos i a (i+1). Se mira específicamente quien es el que
tiene al lado, acoplamiento interresiduo. Los crosspeaks son para distancias < 5Å. La intensidad de cada pico
se relaciona con la distancia internuclear. En el NOESY no hay regiones selectivas, se ven 4 cuadrantes y las
interacciones de todos con todos. Si con el COSY ya se cuales son los protones y me anoto los
desplazamientos químicos, voy al espectro de NOESY y miro esos protones y veo si están cerca (crosspeak) o
están lejos (no crosspeak), entonces, saco la DISTANCIA. Lo puedo usar cualitativamente (están cerca o lejos)
o cuantitativamente (saco distancia a través de la intensidad del pico).
Los experimentos NOESY pueden utilizarse para detectar acoplamientos dipolares de corto, medio y
largo alcance.
En general, lo que se hace es COSY-NOESY WALK
Brenda Fina
Para evitar esta tarea tan ardua, también se puede hacer un EXPERIMENTO DE DOBLE MARCA CON
HETERONUCLEOS.
2)
Asignación de cadenas laterales COSY
α
Se utiliza el COSY, pero ahora se trabaja en la zona donde interacciona el H con el resto de la cadena
lateral, por ejemplo con el Hβ; uno corrobora con la frecuencia. Existe un diagrama de conectividad para
cada AA: los patrones de acoplamiento entre los protones de un AA van a ser siempre los mismos, van a
cambiar los desplazamientos químicos debido a que el ambiente es distinto.
α
Se mira en la zona de H - Hβ .
3)
Estructura secundaria
Este es un paso intermedio entre la asignación y la estructura terciaria. Si se quiere ver estructura
secundaria, se puede estudiar solamente asignando el backbone, sin necesidad de las cadenas laterales,
porque toda la información la tengo asignando los NH y los α. En el caso que tengamos proteínas complejas
que no me interesa la estructura, pero quiero ver la interacción dinámica, no necesito asignar cadenas
laterales. Se puede obtener datos de estructura secundaria a partir de: desplazamientos químicos,
acoplamientos dipolares, acoplamientos escalares, cte de acoplamiento J y ángulos de torsión. Se puede
hacer mediante la medición de NOEs o de J-couplings.
Así para estudiar la estructura secundaria se tienen que plantear las restricciones; se puede medir:
Distancia NOESY
Desplazamiento químicos con HETERONUCLEOS
1 1
Ángulos diedros se calculan con los J 1D H- H o COSY
En cada estructura secundaria tengo geometrías que se repiten, voy a tener distancias (acop dipolar)
típicas de cada estructura secundaria y ángulos diedros (acop escalar) que se repiten en α y en β.
Se pueden usar los desplazamientos químicos, sobre todo de heteronucleos, como sensores de la
estructura secundaria. Siempre los heteronucleos son mucho más útiles porque tienen más dispersión
intrínseca que el protón.
Brenda Fina
Otra cosa que se puede utilizar son los NOEs, el acoplamiento dipolar. En el caso de la α-hélice,
después de una vuelta, voy a tener NOEs entre un residuo y el otro que esta 4 mas adelante en la secuencia.
Si hay un NOE entre una Gly de una punta con una Ala de la otra punta, quiere decir que es una α-hélice,
nunca puede ser una hoja-β. Voy a tener distancias características de las hojas-β y voy a poder diferenciar
paralelas de anti-paralelas. Ventaja: voy a poder asignar residuo por residuo en que estructura esta y no solo
hablar de porcentaje como en dicroísmo.
Distancias típicas para distinguir un α-hélice de una hoja-β: además de tener un NOE entre un residuo
y el que esta 3 o 4 posiciones mas adelante, en la α-hélice voy a tener un NOE muy intenso entre los NH de
α
residuos contiguos, mientras que en una hoja-β voy a tener un NOE muy intenso entre el H y el NH de
residuos contiguos.
El otro criterio que tengo es que las constantes de acoplamiento J las puedo correlacionar con los
ángulos diedros. Valores característicos: un α-hélice tiene una J=4hz, las hojas-β J=9-10 Hz e incluso hay
diferencia entre las que son paralelas y antiparalelas.
Brenda Fina
Para calcular las J se pueden hacer 2 experimentos:
1 1
1. Espectro común, 1D H- H, pero como se ve hay mucha superposición de los picos, por lo que se
1 1
hace un 2D H- H (COSY).
2. En un COSY con la proteína acoplada, de modo que se pueda ver bien el coplamiento:
4)
Estructura terciaria
Para determinarla se miden los NOEs entre residuos que están alejados en la secuencia, pero cercanos en el
espectro. Esto se denomina NOE de largo alcance: se ingresan los datos en una compu y se obtiene una
familia de estructuras posibles (DYANA).
La desviación media estándar (rmsd) es un parámetro que da medida de la confianza que se le puede
tener a la estructura.
Un ↑rmsd indica que hay mucha movilidad, por lo tanto, da incertidumbre. Un rmsd<1 es una buena
aproximación a la estructura.
Brenda Fina
Métodos de marcado
15
13
Para introducir N o C se utilizan, por lo general, métodos biosintéticos utilizando como organismo
15
13
huésped a E. Coli, levaduras, etc. En general, los reactivos son: NH4Cl, [ C] glucosa y D2O.
En general:
1
• H 1D: hasta 10KDa
1 15
• H- N 2D: hasta 15KDa (preferible por su bajo costo)
1 15 13
• H- N- C 3D: hasta 20KDa (más caro)
Aumenta la resolución
1 15 13 1
• H- N- C- H: hasta 20-30KDa
• TROSY: hasta ahora no hay límites
1
15
1
1
15
H- N HSQC: detecta el acoplamiento escalar de un enlace ( J). Veo una señal H- N por cada
residuo, así tengo un patrón general de toda la proteína. Sirve para distinguir plegamiento de proteínas.
Brenda Fina
1
1
Estrategia H homonuclear extendida: cuando el backbone H se superpone se utiliza la dispersión
15
15
1 1
con N Heteronuclear 3D aumenta la resolución ( N Dispersed H- H TOCSY)
1
H↔ 1H ↔15N
TOCSY
HSQC
Experimento de pares, doble marca
15
13
Se marca con N y con C. Se observan residuos consecutivos, no necesita el NOESY. Lo que se hace
es seleccionar los J de primer orden los enlaces que se quieren ver, porque los J de los distintos enlaces son
distintos.
Por ejemplo: HNCA/HN(CO)CA (3D) en este caso se ve la interacción del HN con el Cα del mismo
AA (intramolecular) o del AA contiguo (intermolecular), pasando por el C=O.
Brenda Fina
1.HNCA el HN ve el Cα de su propio AA
2.HN(CO)CA El HN ve el Cα del AA contiguo.
Brenda Fina
ESTUDIOS ESTRUCTURALES Y DINÁMICOS
Del análisis de los datos obtenidos por RMN, se obtiene aproximadamente un grupo de 50 modelos
estructurales; esto es distinto a lo que sucede con cristalografía de rayo X que genera sólo un set de
coordenadas dando lugar a una estructura. Por esta razón, los modelos obtenidos por RMN deben ser
juzgados por distintos criterios que los obtenidos por de estructuras más rígidas en cristalografía.
Indistintamente del algoritmo utilizado, cualquier estructura determinada por RMN busca un mínimo
de la función Etot, dada por,
Etot = Ecov + Evdw + ERMN
Donde: Ecov: representa la geometría covalente (enlaces, ángulos, planaridad y quiralidad).
Evdw: representa los contactos que regiones que no están enlazadas.
ERMN: representa las restricciones obtenidas por RMN.
Los dos primeros términos tienen asociada mucha incertidumbre, y la mayor determinación de
precisión reside en las restricciones de RMN.
El experimento de RMN que aporta mayor cantidad de información geométrica (o de restricciones
geométricas) es el NOE.
La exactitud de las estructuras obtenidas por RMN se ve afectada por errores en las restricciones de
las distancias interprotónicas, estos errores surgen de tres fuentes: mal asignamiento, errores en las
estimaciones de distancias y restricciones de NOE incompletas. La mejor forma de chequear cuan correctos
son estos datos es verificando que todas las distancias cortas interprotónicas (<3.5Å) estés en el espectro de
NOE. Además de las restricciones aportadas por el NOE, hay otros experimentos de RMN que aportan
información estructural de corto alcance como ser, cte de acoplamiento escalar de tres enlaces, corrimiento
13
1
químico secundario C, y corrimiento químico de H. Hay otros experimentos de RMN que aportan
restricciones que definen información estructural de largo alcance. El primer experimento se basa en la
15
dependencia de las ctes de tiempo de relajación transversal (T2) y longitudinal (Tl) de los heteronúcleos ( N
13
o C) con la difusión rotacional anisotrópica. El segundo experimento depende del acoplamiento dipolar
residual en macromoléculas orientadas. Estos dos experimentos aportan restricciones que están
relacionadas de manera geométrica a la orientación del vector de un enlace internuclear con respecto a aun
tensor externo. En el caso de T1/T2, el tensor es el tensor de difusión; y en el caso del acoplamiento dipolar
residual, el tensor puede ser el tensor de susceptibilidad magnética o el tensor de alineamiento molecular.
Ambos métodos permiten el posicionamiento relativo de elementos estructurales que no tienen una
distancia interprotónica corta.
Estructura en Tres Dimensiones de Macromoléculas Biológicas
Proteínas:
Proteínas pequeñas (6-10 KDa): en principio, la estructura de proteínas compactas y pequeñas de
100 AA o menos puede ser determinada con las restricciones de NOE. En la práctica, estas restricciones se
suplementan con restricciones basadas en acoplamiento J y en el corrimiento químico.
Proteínas medianas (20-60 KDa): se utiliza marcado con isótopos. En la técnica de doble marcado,
13
15
un tipo de AA se marca con C en la posición del carbonilo y un segundo tipo de AA se marca con N.
13
15
Fragmentos de dipéptidos en los que un C prosigue un N, se pueden identificar fácilmente vía el
1 15
desdoblamiento de los picos por el acoplamiento J en un espectro de correlación H- N. Para proteínas de
150-200 AA, el enriquecimiento completo de la proteína con isótopos y el desarrollo de RMN tridimensional
Brenda Fina
permite que el análisis estructural sea más fácil. Sin embargo, el estudio de proteínas con más de 200-300
AA todavía resulta dificultoso. Para estos casos, la sensibilidad ha mejorado gracias a la técnica de
2
deuteración (marcado con deuterio, H) al azar. El nivel de deuteración depende de la masa molecular.
Complejos moleculares grandes: las técnicas de TROSY y CRINEPT fueron desarrolladas para estos
casos y tienen muy buenos resultados.
Interacción proteína-proteína: se ha desarrollado una técnica de RMN para estudiar residuos de la
2
interfase. Ésta se basa en que la proteína target no esté marcada mientras que el ligando proteico sí ( H15
1
N), excepto por sus protones amidas. Si se aplica un campo de radiofrecuencia a los protones alifáticos ( H)
de la proteína target, sus protones aromáticos y amidas se saturan debido a la difusión de espín (este
1
fenómeno es altamente efectivo si los espines de H se encuentran cerca). La saturación puede ser
1 1
transferida desde la molécula target a la molécula marcada a través de contactos cercanos entre H- H de la
interface formada por el complejo.
Ácidos Nucléicos:
El NOE arroja restricciones insuficientes para la determinación de la estructura porque los ác
Nucléicos tienen baja densidad de protones (0.35) y no presentan un plegamiento globular. Estas
limitaciones se superaron con el desarrollo de marcado isotrópico selectivo y el alineamiento molecular en
medios ordenados. En moléculas con múltiples dominios, se puede utilizar acoplamiento dipolar para
determinar la orientación relativa de los distintos dominios. Para aplicar esta técnica es necesario saber la
estructura secundaria de los dominios. RMN permite una observación directa de los puentes hidrógeno
entre las pares de bases a través del acoplamiento escalar entre los protones aminos, el dador y el aceptor.
Carbohidratos:
Estos compuestos presentan gran movilidad, tienen dos tipos de movimientos internos: uno consiste
en un movimiento modesto en el que el ángulo diedro se mueve ±15°; y el otro es un movimiento más
pronunciado de los ángulos diedros. En este último caso, el NOE no puede asociarlo a una única
conformación y la molécula se considera como un grupo de conformeros. El avance en RMN de alta
resolución permite medir el acoplamiento dipolar en medios orientados. En algunos casos, se mide el
acoplamiento dipolar residual como la diferencia entre el acoplamiento en un medio orientado y el
acoplamiento en un medio isotrópico.
Dinámica de Macromoléculas Biológicas
Muchos experimentos de RMN permiten monitorear la dinámica de las macromoléculas en un rango
de tiempo amplio. Por ejemplo, la relajación nuclear de espín es sensible a movimientos que ocurren en
tiempos más cortos que la correlación molecular (10-20ns); el intercambio de corrimiento químico entre dos
sitios ocurre en micro o milisegundos; y los efectos de resolución espectral y el ensanchamiento de banda
ocurren en el orden de los segundos. Estas características permiten que RMN sea una técnica única para el
estudio de dinámica.
RMN permite estudiar:
Funcionalidad de una molécula
Movilidad
Contribuciones entrópicas a los fenómenos de unión
Folding – unfolding
Para los fenómenos biológicos, tenemos distintas escalas de tiempo. Dentro de los mas rápidos se
encuentran la rotación molecular o las reorientaciones de bucles.
Brenda Fina
Intercambio químico
Se encuentra dentro de los fenómenos más lentos.
Un cambio conformacional puede deberse a:
• Unión de un ligando
• Temperatura
• Solvente
Un residuo puede protonarse y desprotonarse, por lo que se esperan 2 señales: una para la forma
protonada y otra para la protonada. Sin embargo, debido a la escala de tiempo, éstas 2 señales no se
observan; se ve un promedio de las señales. Para que pueda ser visto por RMN, le velocidad de
intercambio del fenómeno tiene que ser menor que la diferencia de frecuencia de ambos.
Se observa que k depende de la temperatura ↑T → ↑intercambio. Para considerar a un proceso
rápido, la velocidad debe ser 3-4 veces mayor que ∆W, esto puede obtenerse con el δ.
1
1
Consideremos que tenemos una Y disuelta en agua, la cual tiene 4 H aromáticos con 2 tipos de H
1
equivalentes se ven 2 señales. En una proteína, obtendré 4 señales porque dejara de haber H
equivalentes; sin embargo, si ↑T, las 4 señales pasan a 2, lo que sugeriría que al ↑T la Y empieza a tener
movilidad.
Brenda Fina
1
Otra posibilidad es disolver la proteína en D2O y se observa el subespectro de H en la zona de 7-10
1
ppm a distintos tiempos. Cuando ↑T va aumentando el intercambio N- H que se vuelven N-D van
desapareciendo progresivamente crosspeaks (porque D2O no tiene señal en RMN). Luego, depende de la
exposición al solvente y la velocidad de intercambio sirva para el estudio de Folding.
Dinámica de proteínas provenientes de medidas de relajación
Asumimos que los movimientos atómicos internos de una macromolécula son independientes de su
geometría global y provienen de tumbos o de la difusión transversal. Es decir, que el tiempo de correlación
efectivo interno, τe, es mucho menor que el tiempo de correlación rotacional, τc (tiempo de correlación: es el
tiempo característico entre fluctuaciones significantes del campo magnético local que experimenta un espín
debido a la movilidad molecular). Las tres velocidades de relajación medidas por RMN, R1=1/Tl, R2=1/T2 y la
heteronuclear NOE, son sensibles a la movilidad interna en la escala de los nanosegundos.
2
En un modelo, se obtienen dos parámetros independientes: el parámetro de orden, S , que es la
medida de las restricciones espaciales del movimiento; y τe.
2
El parámetro de orden, S , mide la magnitud de la fluctuación angular del vector de un enlace químico
2
en la proteína, por lo tanto, refleja la flexibilidad de la cadena en ese sitio. S se interpreta como si estuviera
describiendo la cantidad de libertad espacial que tiene el vector µ como resultado de la movilidad interna. Si
2
el vector µ difunde en forma de cono, S decrece rápidamente a medida que el ángulo del cono θc aumenta
de 0° a 75°. Si la movilidad del vector es completamente libre, es decir que todas las orientaciones de µ son
Brenda Fina
igualmente probables, S=0; mientras que si la movilidad está completamente restringida, S=1. Esto se
15
estudia con marcado de N.
Mediante T1 y T2 puede determinarse si es la mayor movilidad la razón para los valores altos de rmsd
en una familia de estructuras.
Interacción con un ligando
Hay experimentos que determinan si una conformación es igual cuando se une un ligando. Se realiza
1
midiendo transferencia de NOE. Se hace un NOE entre 2 H cuando el ligando esta libre y dará una distancia,
si cambia la distancia cuando se une el ligando, entonces cambio la conformación.
También puede estudiarse por desplazamientos químicos.
Existe otro NOE especial NOE editado que se basa en colocar filtros que seleccionan NOEs de 2
moléculas con un patrón de marcado único.
Dinámica de Proteínas provenientes del intercambio del protón amida
El intercambio entre el protón amida en proteínas y el solvente puede ser medido de diferentes
maneras. Los intercambios lentos (de minutos a días) son determinados siguiendo la pérdida de la señal del
protón amida de una proteína disuelta en D2O, y provee información sobre la accesibilidad relativa del
solvente a los distintos compartimentos de la estructura secundaria y terciaria. Los intercambios rápidos (5500ms) pueden ser monitoreados siguiendo el intercambio de la magnetización del protón amida con los
protones del agua. A pH altos, el intercambio de protones es muy rápido, y el intercambio de la
magnetización mide directamente la velocidad límite de abertura conformacional que permite el acceso del
solvente.
Parámetros de dinámica de RMN
• Número de señales por átomo: múltiple señales para intercambios lentos entre estados
conformacionales.
• Ancho de banda: angostos para movimientos rápidos, anchos para movimientos lentos; depende
de la masa molecular y del estado conformacional.
• Intercambio de NH con solvente: tiempos lentos. Requiere eventos de unfolding locales o globales,
los NH involucrados en enlaces se intercambian muy lentamente, las regiones flexibles o de superficie tienen
un intercambio rápido.
• Mediciones de relajación: R1, R2 y NOE heteronuclear.
La calidad de las estructuras obtenidas esta dado por rmsd (la desviación media cuadrática, rmsd) es
una medida utilizada con frecuencia de las diferencias entre los valores pronosticados por un modelo o un
Brenda Fina
estimador y los valores observados de la realidad. rmsd es una buena medida de la precisión. Puedo
2
comparar los resultados de rmsd con los de S para saber si los valores altos de rmsd se deben a una alta
2
flexibilidad de la región (S bajos).
RMN en estado sólido
Obtener información de un espectro de RMN en estado sólidos es mucho más complicado que en
estado líquido. Es necesario aplicar secuencias de pulsos más complicados, usar técnicas especiales para las
muestras y aplicar energías de radiofrecuencias superiores un campo magnético externo más fuerte.
La principal diferencia entre RMN en solución y en estado sólido es la movilidad de las moléculas en la
muestra. La principal restricción para muestras en solución es que deben tener un movimiento isotrópico
mientras que para muestras sólidas mientras más rígidas mejor. Esto refleja diferencia entre RMN en estado
sólido, donde observo sistemas anisotrópicos, y RMN en solución, donde veo sistemas isotrópicos. El rango
de masa molecular que puede ser estudiado por RMN en estado sólido no tiene límites. En realidad los
espectros de muestras sólidas ofrecen más información que los otros pero esta información está escondida
debajo de picos anchos y solapados. Para eliminar esta imitación, se coloca a la muestra en un ángulo
característico (“ángulo mágico”) con respecto al campo magnético externo y de esta forma se elimina el
2
término 3cos θ-1, que está presente en el corrimiento químico y en el acoplamiento dipolar. Esto resulta en
espectros mejor resueltos con bandas más angostas.
Formación de imágenes por RMN (RMN imaging)
RMI se basa en utilizar un gradiente de campo magnético con el fin de dispersar las frecuencias de
resonancia de elementos con distintos volúmenes. En este experimento, se detecta la sensibilidad de cada
núcleo ante pequeños cambios en el campo magnético aplicado debido a los distintos microambientes.
Como estos cambios son muy pequeños es necesario aplicar un campo magnético homogéneo y fuerte a
través del volumen de la muestra. La intensidad de la señal es proporcional a la cantidad de espines por
unidad de volumen. Para obtener una imagen tridimensional, el objeto o el campo magnético deben rotarse
para producir distintas secciones en distintas direcciones, y luego el objeto es reconstruido usando
reconstrucción de imagen.
Tipos de experimentos:
Acoplamiento Escalar
Acoplamiento Dipolar
Homonuclear
COSY
TOCSY
NOESY
Heteronuclear
HSQC
TOCSY-HETERO
NOESY-HSQC
NOESY-HMQC
Calidad de la estructura obtenida por RMN depende de:
1. N° de restricciones
2. Rmsd del ensamblado estructural
3. Violación de las restricciones
4. Energía de moléculas
5. Comparación con homólogos
6. Calcular otra vez los parámetros experimentales
Brenda Fina
Aspectos prácticos
B0 homogéneo
Medio ambiente, temperatura, humedad, precisión
Concentración:
• 1D 100µM-10µM
• nD 400µM-50µM
volumen: 200-300µl
pureza >95%
15
13
sensibilidad (γ) →enriquecimiento con N y C
mantener baja la fuerza iónica
NO cristales

rmn, resonancia magnética nuclear

Transcripción

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