Escalas de tiempo en RMN

Transcripción

Metodologías para la determinación estructural
de fármacos y el estudio de fenómenos de
reconocimiento molecular
Programa de doctorado en Química Médica
Gema Domínguez Martín
USP-CEU
1
Procesos de relajación. Relajación espín-red. Relajación espínespín. Determinación de T1. Determinación de T2, secuencia
de eco de espín. Técnicas de doble resonancia.
Deacoplamiento homonuclear. Desacoplamiento heteronuclear.
Espectros editados utilizando secuencias de eco de espín:
modulación por la constante de acoplamiento (SEFT y APT).
Transferencia de polarización por irradiación selectiva (SPT).
Transferencia de polarización por inversión de población (SPI).
Experimento INEPT. Experimento DEPT.
USP-CEU
2
Procesos de relajación
• En un campo magnético estático B0, la magnetización longitudinal Mz (en el
eje z) crece progresivamente desde cero hasta un valor máximo M0. En ese
momento el sistema habrá alcanzado el equilibrio térmodinámico y la
ocupación de los niveles vendrá gobernada por la estadística de Boltzman: el
estado de espín ½ (es decir, aquel orientado como el campo B0) estará más
poblado que el estado de espín -½, por lo que aparecerá una magnetización
M0.
USP-CEU
3
• Si en esta situación aplicamos un pulso de radiofrecuencia de duración t a la
frecuencia de resonancia, la muestra se verá afectada por la acción de un
nuevo campo magnético dependiente del tiempo B1(t).
• El sistema absorbe energía provocando un aumento del número de estados
con espín -½ y una disminución del número de estados con espín ½.
Se produce una pérdida de
magnetización longitudinal
y un incremento de
magnetización transversal
USP-CEU
4
• Tras aplicar un pulso de 90º, el extremo del vector µ (vector de magnetización)
desciende hacia el plano transversal xy describiendo una espiral y los
protones adquieren la misma fase apareciendo la magnetización transversal
(Mt)
USP-CEU
5
USP-CEU
6
• Si se aplica un pulso de 180º, los protones no se detienen en el plano
transversal, continúan su movimiento en espiral volviéndose a desfasar y
aparece un componente negativo de la imantación longitudinal (-Ml).
USP-CEU
7
• Cuando finaliza el pulso de radiofrecuencia (RF) se necesita un tiempo para
que la magnetización vuelva a alcanzar el equilibrio. Debido a que en RMN la
emisión espontánea es muy poco efectiva, el retorno al equilibrio se logra a
través de los procesos de relajación .
• Procesos de relajación (PR): Diferentes tipos de transiciones sin radiación
mediante los cuales un núcleo en un estado de espín excitado vuelve al
estado inferior o fundamental.
• Los procesos de relajación se dividen en dos categorías:
- Relajación espín-red (o longitudinal), en la misma dirección que
el campo aplicado.
- Relajación espín-espín (o transversal), perpendicular a la dirección
del campo.
USP-CEU
8
• Durante la relajación, el vector µ de cada protón regresa desde el plano
transversal a su posición original recorriendo a la inversa la misma espiral
pero a una velocidad de precesión diferente en función del tipo de protón.
• En primer lugar, los espines se desfasan
mientras precesionan hasta que la
distribución es uniforme. Por consiguiente,
la magnetización transversal decrece
progresivamente hasta cero.
• En segundo lugar, la desexcitación de un
gran número de espines reestablece la
magnetización longitudinal Mz hasta su
valor en el equilibrio térmico M0.
USP-CEU
9
• Cada proceso de relajación ocurre en un periodo de tiempo determinado,
denominados tiempo de relajación longitudinal y tiempo de relajación
transversal, T1 y T2, respectivamente (o sus recíprocos, las velocidades
específicas de relajación longitudinal y transversal R1 y R2).
• Los procesos de relajación determinan la anchura de la señal. El principio de
incertidumbre de Heissenberg demuestra que la anchura natural de una
banda es inversamente proporcional al tiempo medio que el sistema
permanece en el estado excitado.
• Desde un punto de vista operativo, la velocidad de relajación determina el
tiempo que tenemos que esperar para que dos medidas consecutivas
realizadas sobre el mismo sistema sean realmente idénticas o la intensidad y
la velocidad de repetición máximas de los pulsos que no cause saturación.
USP-CEU
10
Relajación espín-red, espín-retículo o longitudinal
• La relajación espín-red es conjunto de procesos mediante los que se
recupera la magnetización longitudinal perdida tras el pulso de
radiofrecuencia y se alcanza la magnetización del equilibrio termodinámico
(M0).
• La interacción entre los espines nucleares en estado excitado y los campos
magnéticos fluctuantes generados por el entorno molecular o retículo
devuelve el espín excitado al estado fundamental desprendiendo calor.
• La constante de tiempo que regula este proceso se denomina tiempo de
relajación longitudinal T1.
• La relajación espín-red, que depende de la movilidad del retículo, es
relativamente eficiente en los líquidos (T1 del orden de 1s), pero no lo es en
los líquidos viscosos y en los sólidos cristalinos donde las movilidades son
bajas, en esos casos T1 suele ser grande (T1 del orden de 102s).
• T1 disminuye a temperaturas elevadas porque aumenta la movilidad del
sistema.
USP-CEU
11
Relajación espín-espín o transversal
• La relajación transversal es conjunto de procesos mediante los que la
magnetización transversal decae hasta prácticamente cero tras un pulso de
radiofrecuencia
• En la relajación transversal o espín-espín los espines nucleares dejan de
precesionar perdiendo la magnetización transversal (en el plano xy).
• Este desfase está producido por tres fenómenos:
La interacción dipolar entre un espín en su estado excitado y otro
espín del mismo tipo en su estado fundamental, el espín excitado
retorna al estado fundamental transfiriendo energía al otro espín que
sufre la transición al estado excitado.
Desplazamiento químico: los núcleos con diferente desplazamiento
precesan a diferentes frecuencias.
Inhomogeneidades en el campo magnético externo: núcleos bajo
diferentes valores del campo magnético externo precesan a diferentes
frecuencias.
USP-CEU
12
• La componente estática (paralela a B0) no interviene en la relajación. Varía
de un núcleo a otro bajo el efecto de los campos producidos por los otros
núcleos.
• Componente giratoria: si hay 2 núcleos vecinos de igual naturaleza,
experimentarán mutuamente la acción de estas componentes giratorias y se
pueden inducir transiciones entre las diferentes orientaciones de los espines
nucleares. Ambos núcleos podrán interactuar intercambiando energía entre
ellos. Este proceso se denomina inversión mutua de espines o flip-flop.
USP-CEU
13
• La interacción entre espines no cambia la población neta del estado excitado
porque las poblaciones N1 y N2 no se ven modificadas, pero que la duración
de vida del núcleo en el estado excitado disminuye y en consecuencia la
señal se ensancha.
• Este fenómeno, que es irreversible, se caracteriza por un tiempo de
relajación transversal T2.
• En moléculas pequeñas normalmente T2 ≈ T1 (tiempo largo de
reestablecimiento del equilibrio). En moléculas grandes T1 >>> T2.
∆ν½ = 1 / πT*2
T2 pequeño
relajación rápida
T2 grande
relajación
USP-CEUlenta
14
Relaxation Longitudinal and transverse
Magnetic
field
Ih
NET
Magnetization
Alignment…..
Random…
CLICK !
Longitudinal
T1 Relaxation
Randomization in XY plane:
Magnetization Decays
A 90º pulse flips the
z-magnetization to xy-plane
t
Transverse T2
Relaxation
USP-CEU
15
Anchura de las bandas
• Normalmente, T2 condiciona la anchura de la señal.
• Sin embargo, en ciertos casos las señales se ensanchan de forma marcada
al producirse un descenso muy acentuado de T1:
- La presencia de electrones desapareados (radicales). Los radicales
orgánicos, el oxígeno molecular (dirradical) o las sales de metales de
transición (iones paramagnéticos) producen ensanchamiento de las señales.
- La presencia de núcleos cuadrupolares (I > ½), como el 14N, puede
producir también ensanchamientos en las señales de núcleos vecinos no
cuadrupolares. Así los protones unidos a un 14N (Q = 1) o en posiciones
próximas, dan lugar a señales notablemente más anchas que el resto de los
protones de la molécula.
USP-CEU
16
Estado
físico
Relajación
espín-red
Relajación
espín-espín
Características
Líquido
Eficiente
Poco eficiente
Señales finas en el espectro.
T1↓
T2↑
Rápida restauración del
equilibrio térmico
Poco eficiente
Eficiente
Señales anchas en el espectro.
T1↑
T2↓
Muy lenta recuperación del
equilibrio térmico (saturación)
Sólido
• Una relajación espín-red eficaz es una condición necesaria para que exista
una distribución en los niveles de espín que no alcance la saturación y así
poder observar la señal de absorción de radiofrecuencia de una manera
continua.
• En la práctica esa condición no siempre se cumple y entonces la señal
disminuye con el tiempo llegando incluso a desaparecer.
USP-CEU
17
Procesos de relajación: Determinación de T1 y T2
• Los tiempos de relajación T1 y T2 nos van a proporcionar una valiosa
información sobre la muestra, debido a que están asociados a procesos
relacionados tanto con la interacción entre los espines nucleares y sus
entornos moleculares (T1) como con las interacciones entre los propios
espines nucleares (T2).
• Nos van a permitir la utilización óptima del tiempo disponible para acumular
los espectros y optimizar experimentos como el NOE o el STD que están
basados en la relajación.
• T1 se determina usando secuencias multipulso, es decir, se generan varios
pulsos de radiofrecuencias separados por intervalos de tiempo determinados.
Para T1 se utilizan dos secuencias diferentes:
• Técnica de recuperación de saturación.
• Técnica de recuperación de la inversión
• T2 se determina mediante los multipulsos de eco de espín.
USP-CEU
18
Procesos de relajación: Determinación de T1 y T2
• Un pulso de radiofrecuencias equivale a la irradiación simultánea de un
determinado rango de frecuencias y también a aplicar un campo magnético a la
muestra, dada la relación entre frecuencia y campo:
ν=
γ
2π
B0(1 - σ)
• Las secuencias de pulsos son una serie de eventos (básicamente pulsos de
radiofrecuencia separados por periodos de tiempos o delays) aplicados en el
tiempo de modo secuencial, ordenado y predefinido, que provocan una
modificación específica sobre el estado de los espines que luego se pueden
relacionar con algún parámetro molecular a partir del análisis del espectro de
RMN resultante.
Pulso de 90º iguala las poblaciones
Pulso de 180º invierte las poblaciones
USP-CEU
19
Determinación experimental de T1.
Experimento de recuperación de la inversión
• Se aplica un pulso inicial de 180º que invierte la magnetización y los niveles
poblacionales de la transición sobre la que actúa. Durante el intervalo de
tiempo τ siguiente se produce relajación longitudinal cuya magnitud depende
de la duración de dicho intervalo. Como la magnetizatión en el eje z no es
detectable, se aplica un pulso final de 90º para dirigir el vector de
magnetización hacia el plano xy y así pueda ser detectado.
τ
• Según el intervalo τ que usemos veremos señales cuya intensidad varía en
función del tiempo de relajación T1.
• Repitiendo el experimento a diferentes valores de τ puede determinarse el
valor de T1 para las distintas señales en el espectro.
USP-CEU
20
180º
τ= 0
Experimento de recuperación de la inversión
z
z
x TF
x 90º
y
τ> 0
y
z
z
x TF
x 90º
y
τ >> 0
y
z
z
x TF
x 90º
y
• Según el intervalo τ que
usemos veremos señales cuya
intensidad varía en función del
tiempo de relajación T1.
• Repitiendo el experimento a
diferentes valores de τ se
puede determinar el valor de T1
para las distintas señales en el
espectro.
y
USP-CEU
21
Procesos de relajación: Determinación de T1
Recuperación de la inversión
Secuencia: 180º - τ - 90º - Adquisición
USP-CEU
22
Procesos de relajación: Determinación de T1
Recuperación de la saturación
Secuencia: 90º - τ - 90º - Adquisición
Se usan secuencias de dos pulsos de 90º
separados por un tiempo τ determinado.
El primer pulso tumba la magnetización al
plano xy, es decir anula Mz, luego se deja
que la magnetización se recupere durante
un tiempo y finalmente se vuelve a tumbar
al plano xy para poder medirla (el
espectrómetro mide la componente x).
Variando el tiempo τ se obtienen puntos
que se ajustan a una exponencial
decreciente,
obteniendo
T1
como
parámetro del ajuste.
USP-CEU
23
Experimento de recuperación de la inversión para evaluar los tiempos de
relajación longitudinales de 13C en H2O
Espectros con τ = 1-12s y 50s. El C4 tiene una relajación
longitudinal más efectiva que los otros carbonos.
USP-CEU
24
•
Si el tiempo de espera entre pulsos (irradiación) es demasiado rápido la
magnetización no se recuperará entre una irradiación y la siguiente, la señal
se atenuará y en casos extremos puede desaparecer.
•
En una medida donde no se permite relajación total entre pulso y pulso las
señales de núcleos de mayor T1 (por ejemplo, 13C cuaternarios o carbonilos)
tendrán menor intensidad que los de menor T1 (CH y CH2).
USP-CEU
25
Eco de espines
• El campo magnético creado por el imán no es totalmente homogéneo. Las
desviaciones de la homogeneidad hacen que los núcleos "sientan" un campo
ligeramente distinto en función de su situación en el tubo de muestra. Así,
los vectores magnéticos de los núcleos individuales, que componen la
magnetización transversal del plano xy, se abrirán en abanico, disminuyendo
la intensidad de este tipo de magnetización.
• En principio la evaluación de T2 podría realizarse mediante la medición de la
anchura de las señales a altura media, pero en la práctica este parámetro
está dominado por las inhomogeneidades del campo magnético, que es de
carácter instrumental.
• El ancho de la señal se asocia entonces con el valor de T2 efectivo, T2*,
(T2* ≤ T2).
• Para evaluar al tiempo de relajación transversal T2, eliminando el efecto de
las inhomogeneidades del campo B0, se hace uso de la técnica del eco de
espines desarrollada por Hahn en 1950.
USP-CEU
26
Eco de espines
• La secuencia de pulsos del eco de espines o de Hahn se muestra en la
siguiente figura:
• Se aplica un primer pulso de 90º en x (para hacer bascular el vector de
magnetización longitudinal al plano transversal) seguido de un tiempo τ,
posteriormente se aplican conjuntos formados por pulsos de 180º en y o en x
(el pulso de 180º reenfoca los espines desfasados) seguidos de intervalos
de tiempo 2τ.
USP-CEU
27
Eco de espines
• Veamos lo que ocurre
después del pulso de 90º:
z
y
x
y
τ
≡
x
x
y
y
desfase
y
τ
x
x
180º
reenfoque
• Volvemos a las coordenadas xyz:
z
y
x
≡
AQ
y
USP-CEU
28
Eco de espines
• Si adquirimos la FID justo después del eco, la intensidad de la señal sólo
estar afectada por T2 y no por las inhomogeneidades del campo B0.
eco
evolución
Mxy(t) = Mxy(0) e-τ/T2
detección
USP-CEU
29
Eco de espines
N
N
a 90oC
Mxy(t) = Mxy(0) e-τ/T2
USP-CEU
30
Eco de espín y acoplamientos heteronucleares
• El eco de espines reenfoca la evolución del desplazamiento químico, si el pulso
inicial de 90º para un núcleo determinado está ligeramente fuera de resonancia, el
pulso de 180º lo reenfoca:
• También reenfoca los efectos del acoplamiento heteronuclear, el pulso de 180º
sólo afecta al 13C:
reenfoque del
USP-CEU
acoplamiento 31
Eco de espín y acoplamientos homonucleares
• El eco de espines no reenfoca los efectos del acoplamiento homonuclear. El
pulso de 180º no selectivo, afecta tanto a los dos núcleos involucrados en el
acoplamiento como a los espines de su pareja de acoplamiento:
evolución del
acoplamiento
• La secuencia de eco de espines se utiliza en diferentes experimentos
multipulsos y multidimensionales. La secuencia elimina la evolución de los
desplazamientos químicos y/o los acoplamientos heteronucleares.
USP-CEU
32
Técnicas de doble resonancia
• Las técnicas de doble resonancia consisten, en términos generales, en la
irradiación de la muestra con una frecuencia determinada (por ejemplo la de un
protón o la de todos los protones) y al mismo tiempo registrar el espectro de la
muestra de forma convencional, con lo que el espectro aparecerá como si dicho
protón no existiera y por tanto desaparecerán los acoplamiento con él.
• Las técnicas de doble resonancia son una herramienta importante para:
- Simplificar el espectro
- Determinar la posición relativa de los protones de una molécula
- Localizar absorciones ocultas por otras
• Desacoplamiento homonuclear: se usa fundamentalmente en 1H-RMN para
desacoplar unos protones de otros.
• Desacoplamiento heteronuclear: se utiliza fundamentalmente en 13C-RMN
donde los espectros se realizan con “desacoplamiento protónico”, lo cual
simplifica enormemente los espectros al no observarse acoplamientos 13C-1H.
USP-CEU
33
Desacoplamiento Homonuclear. Desacoplamiento espín-espín
• Se irradia a la frecuencia de un protón determinado (en el centro de la señal si se
trata de un multiplete) y se registra el espectro de protones.
• Los acoplamientos del protón irradiado con el resto de los protones de la
molécula desaparecen, el espectro se suele simplificar bastante y las
asignaciones se pueden realizar de una manera más eficaz.
• Ejemplo: desacoplamiento homonuclear en la 3-aminoacroleína
La irradiación en el centro del
doblete a 8.5 ppm (CO─H) hace
que se simplifique la señal a
5,25 ppm (que queda como un
doblete) y por tanto ésta debe
corresponder a la señal del
protón vecino al grupo aldehído,
de igual modo, la irradiación del
protón olefínico a 7,3 ppm hace
que también se simplifique la
señal a 5.25 ppm.
USP-CEU
34
Desacoplamiento Heteronuclear. Desacoplamiento de banda ancha
• El desacoplamiento de hidrógeno de banda ancha (BB decoupling) es otra
técnica de Doble Resonancia.
• Se irradia con una potencia elevada una banda de frecuencias que abarque el
intervalo completo de desplazamiento de todos los protones. Para lograrlo, se
modula la frecuencia del desacoplador mediante ruido de baja frecuencia.
• Así, los núcleos de 1H acoplados cambian de forma tan rápida la orientación de
sus espines que los 13C acoplados con ellos, sólo “ven” un valor promedio que
es nulo.
• Como resultado desaparecen los acoplamientos 13C-1H y las señales de
aparecen como singletes con una intensidad mayor.
13C
• El inconveniente es que se pierde información sobre las constantes de
acoplamiento 13C-1H.
USP-CEU
35
Ejemplo: espectro de 13C RMN desacoplado del adamantano.
Mientras que el triplete a
~ 30 ppm es fácilmente
identificable como un CH2,
en el resto de las las
señales los multipletes
están solapados.
El espectro de 13C RMN
desacoplado muestra
claramente la existencia
de tres tipos de carbonos
USP-CEU
36
Desacoplamiento Heteronuclear. Desacoplamiento off resonance
• Si se irradia en una zona muy cercana a la frecuencia de resonancia de los
protones sin coincidir exactamente con ésta, lo que se obtiene es un espectro
que denominamos de “off resonance”.
• Las señales aparecen como multipletes pero con una disminución significativa de
las JCH, no hay tanto solapamiento de señales como en el espectro acoplado.
• Ventajas: sabemos el tipo de carbono que es cada una de las señales (metilo,
metileno, metino o carbono cuaternario) dependiendo de la multiplicidad que
presenten las mismas, información que se pierde en el espectro desacoplado o
BB.
• Inconvenientes: los desdoblamientos no son siempre suficientemente claros, y si
en un intervalo estrecho de desplazamiento químico aparecen muchas señales
de carbonos se producen solapamientos que dificultan la identificación de los
multipletes.
USP-CEU
37
Ejemplo: espectro de 13C RMN off resonance del propanol.
En rojo se representan las 1J
del espectro de 13C acoplado
USP-CEU
38
Espectros editados utilizando secuencias de eco de espín: modulación
por la constante de acoplamiento (SEFT y APT).
• Existen diferentes métodos, basados en la técnica del eco de espines o en la
transferencia de polarización, que permiten editar un espectro 1D del espín
heteronuclear X (13C o 15N), y que suministran información sobre el número
de hidrógenos unidos al heteroátomo (SEFT, APT, INEPT, DEPT).
• La información no se extrae de acoplamientos residuales, sino de la
intensidad de las señales que podrán ser positivas, negativas o nulas. Este
efecto se consigue mediante experimentos modulados a través de J.
• La técnica SEFT (Spin-Echo Fourier Transform) es una de las
aproximaciones más simples para determinar el número de hidrógenos
unidos directamente a cada carbono.
USP-CEU
39
Secuencia de pulsos SEFT
τ =1/1JCH
USP-CEU
40
Técnica del Spin-Echo Fourier Transform (SEFT)
• Durante el periodo de evolución los diferentes componentes de los
multipletes de carbono precesan a sus frecuencias individuales.
• La intensidad de las señales está modulada por la evolución del
acoplamiento heteronuclear (JCH) durante el primer intervalo τ. Durante el
segundo intervalo el acoplamiento heteronuclear no evoluciona pues
estamos desacoplando a los protones. Por eso, las señales del espectro de
13C aparecen como singletes.
• El pulso de 180º reenfoca los desplazamientos químicos.
• El éxito del experimento depende de lo estrecho que sea el intervalo de
valores de 1JCH, lo que constituye una limitación importante de esta técnica.
USP-CEU
41
Secuencia SEFT
• Evolución de los vectores de magnetización del carbono bajo la influencia
del acoplamiento protón-carbono:
USP-CEU
42
Secuencia SEFT
• Espectro de 13C-RMN del alcanfor:
a) espectro convencional (no se muestra la señal del carbonilo)
b) τ = 1/J (θ = 180º)
sólo aparecen señales de C y CH2
c) τ = 1/2J (θ = 90º)
CH2
C
CH
CH3
O
3CH3, 3CH2, 1CH, 2C
USP-CEU
43
Técnica del Attached Proton Test (APT)
• La técnica APT también permite determinar el número de hidrógenos unidos
directamente a cada carbono lo que facilita la asignación de espectros de
13C RMN.
• El periodo de evolución suele ser 1/ 1JCH, de este modo las señales de los
CH y CH3 aparecen como picos positivos mientras que los CH2 y carbonos
cuaternarios son negativos.
• Secuencia APT:
USP-CEU
44
Espectro APT del acetato de colesterilo en CDCl3
USP-CEU
45
Transferencia de polarización (TP)
•
13C
y 15N: poca abundancia natural y sensibilidad reducida en RMN.
• Los núcleos poco sensibles muestran bajas intensidades de señal debido a la
escasa diferencia de ocupación de los dos estados nucleares en la inversión de
espín.
• Transferencia de polarización: transferencia del exceso de población de un
núcleo sensible (1H) a núcleos menos sensibles (13C, 15N) antes de perturbarlos.
• Se logra que las transiciones (absorciones y emisiones) del núcleo poco sensible
se intensifiquen.
USP-CEU
46
Transferencia de Polarización por irradiación Selectiva (SPT).
Caso homonuclear
• Para este diagrama usamos dos 1H que están ligeramente acoplados y
tienen una diferencia grande de δ. Se denominan I y S, con un • se indica el
el exceso de población de un estado a otro:
• Ahora irradiamos y saturamos selectivamente una sola de las transiciones
con un pulso de 90º (la 1,3 de I). Después de un tiempo, las poblaciones de
esa transición se igualan y se modifica la intensidad de las transiciones que
dependen de estas diferencias de población :
SPT
USP-CEU
47
Caso heteronuclear
• A pesar de que podemos usar las secuencias SPT y SPI para identificar
espines en regiones muy complicadas de un espectro 1H, la
TP
homonuclear no es tan útil como la TP heteronuclear.
• El efecto que tiene la saturación o inversión de una de las transiciones de un
núcleo sobre la distribución de las intensidades en la señal de otro núcleo
acoplado con aquél es mucho más significativo en el caso heteronuclear.
• En el caso de un grupo 13C-1H (cloroformo), las diferencias de población de
los niveles son más complejas que en el caso homonuclear.
• Si tenemos en cuenta los valores de razones giromagnéticas (γ1H/γ13C ≈ 4),
las diferencias de población corresponden a la relación 10:8:2:0
USP-CEU
48
Caso heteronuclear
SPT (pulso de 90º sobre la transición 1,2 de 1H)
USP-CEU
49
Transferencia de Polarización por Inversión de población (SPI).
Caso homonuclear
• Efectos más drásticos pueden obtenerse aplicando pulsos selectivos de 180º,
los que producen inversión de población entre los estados involucrados en la
transición, tal como se muestra en la figura:
SPI: (pulso de 180º
sobre transición 1,3)
USP-CEU
50
Ha
O
OEt
Ejemplo de secuencia SPI
Hb
En este caso se invierte
cada línea de los protones
olefínicos a y b. Vemos
como las intensidades de
las otras líneas varían.
b
a
USP-CEU
51
Transferencia de Polarización por Inversión de población (SPI).
Caso heteronuclear.
• En la figura se muestra el diagrama de niveles correspondientes al sistema
CH. El doblete del hidrógeno tiene líneas 4 veces más intensas que el
doblete del carbono.
USP-CEU
52
Transferencia de Polarización por Inversión de Población (SPI).
Caso heteronuclear
+2
+2
SPI (pulso de 180º
sobre la transición 1,2)
+ 10
Al manipular las poblaciones de los protones,
la señal de 13C se intensifica cuatro veces
(considerando señales positivas y negativas).
-6
+8
-8
USP-CEU
53
Experimento INEPT (Insensitive Nuclei Enhanced
by Polarization Transfer)
• La técnica INEPT (Morris, Freeman, 1979) está diseñada para transferir
polarización a través del acoplamiento 1H-13C a un enlace.
USP-CEU
54
Secuencia INEPT
Si J = 125 Hz, τ es 2 ms
De 2 a 7 se representan las magnetizaciones protónicas.
USP-CEU
En 8 la magnetización de 13C después de la transferencia de polarización.
55
Secuencia INEPT
• Tras el último pulso de 90ºy en 1H la magnetización MHCβ se encuentra invertida
con respecto a MHCα. La magnetización debida a 13C se habrá incrementado en
una proporción de -6 en sentido negativo y de 10 en sentido positivo.
MHCα
MHCβ
• El último pulso de 90ºx en 13C hace que la señal se vuelva observable al rotarla
hacia el eje y. La información obtenida es la misma que la del experimento SPI,
USP-CEU
56
pero se evita utilizar pulsos selectivos.
Experimento INEPT
Ejemplo:
USP-CEU
57
Experimento INEPT Reenfocado
• Para eliminar los acoplamientos carbono-protón en el espectro sin cancelar las
señales, es necesario añadir a la secuencia de pulsos INEPT normal dos
pulsos de 180º (para reenfocar) y dos tiempos de espera (∆ = 1/8J) en ambos
núcleos después de los dos últimos pulsos de 90º y posteriormente adquirir y
desacoplar.
• Con este experimento se obtiene una señal completamente desacoplada, en
fase y amplificada por la transferencia de polarización.
Secuencia de
pulsos INEPT
reenfocado
USP-CEU
58
Experimento INEPT Reenfocado
• Dependiendo del tipo de carbono se utilizan diferentes ∆:
CH → ∆ = 1/4J (~ 1.79 ms); CH2 → ∆ = 1/8J (~ 0.89 ms); CH3 → ∆ = 1/8J
• Se necesita una situación de compromiso, en la práctica suele usarse:
∆ = 3/8J (~ 2.68 ms)
• La limitación principal de la técnica INEPT radica en su sensibilidad al ajuste
del intervalo ∆. En sistemas con una variación apreciable de 1JCH, por ejemplo,
en presencia de carbonos con diferente hibridación, pueden presentarse
problemas con la intensidad y con el signo de las señales.
USP-CEU
59
Secuencia INEPT
USP-CEU
60
Experimento INEPT
Reenfocado
• Ejemplo:
USP-CEU
61
Experimento DEPT (Distortionless Enhancement
• El experimento DEPT (Bendall, Doddrell, Pegg 1981) es la técnica de edición
espectral actualmente más utilizada.
• También está basado en la Transferencia de Polarización.
• Presenta una menor sensibilidad a las variaciones de 1JCH que la técnica
INEPT, utiliza una secuencia de pulsos más corta y menos sensible a los
errores que se producen al introducir en el programa parámetros como la achura
de pulso o los delays (dependientes de las constantes de acoplamiento).
• Secuencia de pulsos DEPT:
USP-CEU
62
Experimento DEPT (Distortionless Enhancement
• Se pueden obtener espectros DEPT en los que solamente aparecen las señales
de CH, CH2 o CH3.
• Hay que realizar tres espectros DEPT diferentes.
• Un espectro DEPT con θ = 135º muestra a los grupos CH3 y CH como señales
positivas y a los CH2 como señales negativas.
• Cuando sea necesario diferenciar grupos CH3 de grupos CH se puede repetir el
experimento con θ = 90º que sólo muestra los grupos CH.
• El experimento con θ = 45º muestra a todos los carbonos hidrogenados como
señales positivas.
• Los carbonos cuaternarios se obtienen por diferencia del espectro normal de 13C
desacoplado.
USP-CEU
63
13C
desacoplado
pulegona
H
Me
DEPT 90 sólo CH
O
DEPT 135: CH, CH3
CH2
60
f1
150
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
USP-CEU
40
30
20
ppm
64
INEPT/DEPT
•
Para la determinación de la multiplicidad de los carbonos y para editar
espectros normalmente se utiliza el experimento DEPT (Distortionless
Enhancement by Polarisation Transfer).
– La secuencia DEPT es menos sensible que la INEPT a las variaciones
del valor de las JCH porque φ es independiente de J. En el el espectro
INEPT ocurren distorsiones cuando en la molécula hay diferentes tipos
de JCH. Por ejemplo: JCH alifática= 110-130Hz, JCH aromática= 160180Hz. La solución de compromiso JCH ~ 145 Hz presenta un error del
20%.
– La secuencia DEPT genera los multipletes en fase (adquisición sin
desacoplamiento) con un patrón regular de intensidades, mientras que
la secuencia INEPT básica genera los multipletes en antifase.
USP-CEU
65
INEPT/DEPT
•
El experimento INEPT es superior al DEPT en la transferencia de
polarización entre núcleos y se usa habitualmente como secuencia básica
en los experimentos 2D heteronucleares (HSQC).
•
La secuencia INEPT es más conveniente en experimentos a baja
temperatura o para muestras con pesos moleculares altos (T2 pequeño)
USP-CEU
66

Escalas de tiempo en RMN

Transcripción

Documentos relacionados

la relajación - Prevención del estrés en el docente