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Evaluación de características citomorfológicas y - Home E
UNIVERSIDAD ANDRES BELLO FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE TECNOLOGIA MÉDICA “Evaluación de características citomorfológicas y predicción de la evolución de frotis atípicos (ASC). Score citomorfológico” Unidad de investigación presentado en conformidad a los requisitos para obtener el Título de Tecnólogo Médico con especialidad en Morfofisiopatología y Citodiagnóstico. Autores: Jose Luis Chavarria Miranda. José Luis Riffo Carrasco. Profesor Guía: Dr. Arturo Escalona Lagos. Profesores Co Guía: Prof. Marion Ramírez G. TM. Sergio Ramos A. Año de presentación: 2010. i AGRADECIMIENTOS. "El éxito tiene a muchos que pretenden ser su padre, en cambio el fracaso es completamente huérfano." John F. Kennedy En primer lugar agradecemos al Dr. Arturo Escalona Lagos, tutor de esta unidad de investigación, por sus importantes aportes y guía durante el desarrollo de este estudio. Agradecemos al Profesor Víctor S. Carriel, por entregarnos las primeras ideas y documentos precursores del presente estudio. Sin esta casualidad, este estudio simplemente no se hubiera desarrollado. Agradecemos a nuestros Profesores estadísticos Marion Ramírez y Sergio Ramos por su gran e importante aporte a nuestra investigación. A la Escuela de Tecnología Médica por su apoyo y cooperación durante el desarrollo de la unidad de investigación y a la Universidad Andrés Bello por las competencias entregadas durante nuestros años de estudio A nuestras familias, parientes, amigos y conocidos por brindarnos palabras de ánimo en todo momento. ii RESUMEN. El ASC (Atypical Squamous Cells) es una sigla utilizada en citopatología ginecológica para referirse a aquellos frotis en los que no se sabe interpretar con exactitud la benignidad ó malignidad de las células escamosas alteradas presentes en él. Uno de los puntos más polémicos en el análisis de los ASC es la falta de criterios objetivos para su interpretación, lo que provoca una pobre reproducibilidad entre observadores debido principalmente a que las características citomorfológicas no son claras y no orientan la causa de las atipias, no dejando otra alternativa que repetir el examen. Se evaluaron 7 características citomorfológicas de células escamosas atípicas, en 229 Papanicolaou interpretados previamente como atípico entre los años 1999 y 2009, de pacientes entre los 17 y 91 años del Hospital Clínico FUSAT en Rancagua, con el objetivo de predecir su evolución utilizando el score citomorfológico propuesto por este estudio. La sensibilidad del score fue de un 75 y 68%, la especificidad de un 98 y 97%, Valor Predictivo Positivo de un 88 y 84% y un Valor Predictivo Negativo de un 98 y 93% para el observador 1 y observador 2 respectivamente. El score citomorfológico predijo la evolución de los ASC de un 93% de los PAP atípicos evaluados con una correlación del 82.2% entre ambos observadores. PALABRAS CLAVE: Papanicolaou atípico, ASC, score citomorfológico. iii ABSTRACT. The ASC (Atypical Squamous Cells) is an acronym used in gynecologic cytopathology to refer to those smears where it is not known accurately interpret the benignity or malignancy of the altered squamous cells present in it. One of the most controversial points in the analysis of the ASC is the lack of objective criteria for interpretation, causing poor reproducibility between observers mainly because the cytomorphologic features are not clear and do not guide the cause of atypical, not letting to another alternative that repeat the exam. We evaluated 7 Features cytomorphology of atypical squamous cells, in 229 previously interpreted as atypical Pap between 1999 and 2009, patients between 17 and 91 years of FUSAT Clinical Hospital in Rancagua, in order to predict its evolution using the score cytomorphological proposed by this study. The sensitivity of the score was 75 and 68%, specificity of 98 and 97%, positive predictive value of 88 and 84% and a negative predictive value of 98 and 93% for observer 1 and observer 2, respectively. The cytomorphological score predicted the development of the ASC in 93% of atypical PAP assessed with a 82.2% correlation between both observers. KEY WORDS: Atypícal Papanicolaou smear, ASC, cytomorphological score. iv ÍNDICE DE CONTENIDOS. CAPITULO I………………………………………………………………...………………1 I.1 Introducción…..……………………….............................................................................1 I.2 Marco teórico...………………………………………………..…………...….................3 I.2.1 El Cáncer Cervicouterino...……………………………………….….....……...3 I.2.2 Método de Papanicolaou..…………………………………...……......…....…..4 I.2.2.1 PAP atípicos (ASC)………….……………………......…......……….4 I.2.2.2 PAP atípicos enfocados desde el punto de vista citomorfológico………………………………..…...………..5 I.2.3 Estudios relacionados al pronóstico de la evolución de los ASCUS, a través de la evaluación de rasgos citomorfológicos………………………………………………….…..…………6 I.2.4 Antecedentes históricos e implementación del PAP en Chile…...…….............7 CAPITULO II……………………………………………………………………………….9 II.1 Hipótesis y objetivos……...……………………………………….………...…..……...9 II.1.1 Hipótesis…..………………………………………….……….….……...……9 II.1.2 Objetivo general………………………………….…………………....….…...9 II.1.3 Objetivos específicos…..……………………….…………….…….…...….....9 II.2 Metodología de la investigación………………………….………………….………...10 II.2.1 Tipo de estudio…..…………………………………….…………..……..….10 II.2.2 Lugar de realización..…………………………………..…………………....10 II.2.3 Muestra…..……………………………………………….…….….…......….10 II.2.3.1 Criterios de inclusión………..……………………...………...........10 II.2.3.2 Criterios de exclusión………..………………………...…....….….11 II.2.4 Score citomorfológico..………………………………………..…..…..….....12 II.2.4.1 Variables a evaluar…………...…………………….………...…….13 II.2.4.1.1 Características referentes a núcleo…….....………............13 II.2.4.1.2 Característica referente a disposición v celular.…………………………………………….…........22 II.2.5 Análisis estadístico……..………………………………………………..…..24 II.2.6 Materiales..…………………………………………………………..……....24 CAPITULOIII……………………………………………………………………………...25 III.1 Resultados…………………………………………………………………………….25 III.1.1 Seguimiento…………………………………………………………………25 III.1.2 Score obtenido…………………………………………………….…….…..26 III.1.3 Tabla de contingencia…………………………………………………….…27 III.1.4 Prueba de Independencia Chi cuadrado (ausencia, presencia)……………...28 III.1.5 Sensibilidad y Especificidad……………………………………………......29 III.1.5.1 Sensibilidad (S)……………………………………………..…......29 III.1.5.2 Especificidad (E)…………………………………………….……29 III.1.6 Valor Predictivo Positivo y Valor Predictivo Negativo.……………………29 III.1.6.1 Valor Predictivo Positivo (VPP)……………………….………….29 III.1.6.2 Valor Predictivo Negativo (VPN)……………………..………….29 III.1.7 Comparación y correlación del escore obtenido por ambos observadores………………………………………………………30 III.1.7.1 Comparación de Scores entre ambos observadores…………..….……….30 III.1.7.2 Correlación de scores entre ambos observadores……………………..…..30 CAPITULO IV……………………………………………………………………..32 IV.1 Discusiones…………………………………………………………………………...32 IV.1.1 Discusiones respecto a la hipótesis………………………………….……...32 IV.1.2 Discusiones respecto al Objetivo General…………………………………..32 IV.1.3 Discusiones respecto a los Objetivos Específicos………………….……….33 IV.1.4 Discusiones respecto al Score Citomorfológico y estadística........................33 IV.2 Conclusiones………………………………………………………………………….37 vi Referencias……………………………………………………........………………………38 Anexos……………………………………………………….……..……….…...................41 Anexo I: técnica de PAP utilizada en el Laboratorio de Anatomía patológica del Hospital Clínico FUSAT…………...............42 Batería de tinción………………………………………………….........43 Técnica de tinción………………………………………………………43 Resultados………………………………………………………………44 Anexo II: Autorización……………………………………………………………..45 Anexo III: Estadística……………………………...……....……………………….47 Prueba de Independencia Observador 1………………………………..48 Prueba de Independencia Observador 2………………………………..49 Sensibilidad……………………………………………………………..50 Especificidad……………………………………………………………51 Valor Predictivo Positivo (VPP)…………………………………..........51 Valor Predictivo Negativo (VPN)……………………………………...52 Anexo IV: Análisis y Modelo de Regresión Logística……………………………..54 Análisis de regresión de logística…………………………………........62 vii INDICE DE TABLAS. Tabla II.1 Número total de PAP atípicos…………...…………………………………...…12 Tabla II.2 Número total de PAP eliminados………...…………………………………..…12 Tabla III.1 Número de PAP con seguimiento negativo para una LIE y CaCu………..…...25 Tabla III.2 Número de PAP con seguimiento positivo para una LIE y CaCu………...…...25 Tabla III.3 Número de PAP por Score observador 1……..………………………..………26 Tabla III.4 Número de PAP por Score observador 2……..………………………..………26 Tabla III.5 Estadística descriptiva………………………………………………….....……26 Tabla III.6 Tabla de contingencia del observador 1…………………………..……....……27 Tabla III.7 Tabla de contingencia del observador 2………………………..………………27 Tabla III.8 Interpretación tabla contingencia……………………….……………………...27 Tabla III.9 Prueba de Independencia Chi cuadrado observador 1…………………………28 Tabla III.10 Prueba de Independencia Chi cuadrado observador 2…...….………………..28 Tabla III.11 Sensibilidad………………………………………………..….…..……..……28 Tabla III.12 Especificidad………………………………………………..………………...29 Tabla III.13 Valor Predictivo Positivo……………………………………………..………29 Tabla III.14 Valor Predictivo Negativo…………………………………..……..…..……..29 Tabla III.15 Prueba de Wilcoxon…………………………………….………...…………..30 Tabla III.16 Matriz de correlación (Spearman)……..………………………….…………..30 Tabla III.17 p-valores……………………………………………………….……………...31 Tabla III.18 Coeficiente de determinación (Spearman)……………………………………31 INDICE DE FIGURAS. Fig. II.1 Hipercromasia Nuclear score 0 y 2…………………………………..……..….....14 Fig. II.2 Hipercromasia Nuclear score 0, 1 y 2…………………………..….......................14 Fig. II.3 Cromatina Irregular score 1…………..…………………….……..…..………….16 Fig. II.4 Cromatina Irregular score 0, 1 y 2..………..………………..……..…..…………16 viii Fig. II.5 Irregularidad de la Membrana Nuclear score 0 y 2……………..………………...17 Fig. II.6 Irregularidad de la Membrana Nuclear score 0, 1 y 2……………..………..…….18 Fig. II.7 Nucléolo score 1……………...…………………………………………………...19 Fig. II.8 Anisonucleosis score 0, 1 y 2……….…..…………………………….…….…….20 Fig. II.9 Anisonucleosis score 2……………..………………………………………..........20 Fig. II.10 Aumento de la Relación Núcleo/Citoplasma score 1……..……………………..21 Fig. II.11 Agrupación celular score 0………………….…………………………………...22 Fig. II.12 Dispersión celular score 1……………………………………………………….23 Fig. III.1 Correlación entre los observadores…………………….……..……………...…..39 1 CAPITULO I. I.1 INTRODUCION. El estudio de los frotis atípicos en citopatología ginecológica (examen de Papanicolaou o PAP) ha sido y sigue siendo un tema controversial, ya que son aquellos frotis en los que no es posible interpretar con exactitud si la paciente tiene o no una lesión cervical benigna, pre-neoplásica o neoplásica. A estos frotis se les denomina ASC (Atypical Squamous Cells), anteriormente ASCUS (Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance) término introducido por The Bethesda System en 1988 y actualizado en sus versiones 1991 y 2001 (Apgar y Zoschnick, 2003; Lacruz, 2003). El ASC es una interpretación citológica que contempla anormalidades celulares que son más marcadas que las atribuibles a un proceso reactivo pero que cualitativamente o cuantitativamente no son suficientes para diagnosticarlas como lesión escamosa intraepitelial (LIE) (Kurman y Salomon, 1994). La finalidad de esta interpretación es evitar falsos negativos que puedan llevar a la muerte de la paciente, dado que entre el 10 al 20% de los casos ASC corresponden realmente a una LIE (Lacruz, 2003). Uno de los puntos más polémicos en el análisis de los ASC es la falta de criterios objetivos para su interpretación, lo que provoca una pobre reproducibilidad entre observadores (Lacruz, 2003; Fernandez y cols, 2005) debido principalmente a que las características citomorfológicas no son claras y no orientan la causa de las atipías, no dejando otra alternativa que repetir el examen (Arora y cols., 2001). Es cierto que el examen de PAP ha permitido reducir la mortalidad del cáncer cervicouterino (CaCu), pero no ha logrado disminuir el tiempo perdido para los clínicos y el tiempo de incertidumbre que debe vivir la paciente entre un PAP interpretado como Atípico de Significado Indeterminado (ASC-US) y un segundo PAP, sin embargo no acurre lo mismo cuando el PAP es informado como Atípico Sugerente de Lesión de Alto Grado (ASC-H) ya que la paciente es derivada inmediatamente a colposcopía para complementar el estudio. Es por esta razón que por conveniente que resulta la categoría “Atípico” en el 2 diagnóstico citológico, es responsabilidad del médico patólogo evitar su abuso para no pasar por alto casos que podrían ser interpretados correctamente en un primer PAP. Existen varias publicaciones referentes al valor predictivo de las características citomorfológicas en la evolución de los ASC, como por ejemplo el tamaño e hipercromasia nuclear, el contorno de la membrana nuclear y el aumento de la relación núcleo/citoplasma, sin embargo ninguno de estos estudios ha logrado establecer criterios de interpretación utilizando por ejemplo un score, que correlacione estas características con la posible evolución del frotis y permita su evaluación de manera más objetiva (Alameda y cols., 2004; Alli y Ali, 2003; Keating y Wang., 2000; Onuma y cols., 2006). Precisamente es esto lo que nos motivó a realizar este estudio, evaluar características citomorfológicas de células escamosas atípicas a través de un score, para predecir la evolución del ASC en PAP interpretados previamente como atípico entre los años 1999 y 2009, de pacientes entre los 17 y 91 años del Hospital Clínico FUSAT en Rancagua. 3 I.2 MARCO TEÓRICO. Para efecto de esta investigación, es necesario conocer el contexto general en el cual se desarrolla la problemática de la interpretación de los frotis atípicos. Es por esta razón que se incluyeron algunas definiciones y estadísticas referentes al CaCu, el PAP como herramienta de su detección precoz y el desarrollo de esta técnica en Chile. I.2.1 El Cáncer Cervicouterino. El CaCu es una neoplasia que se origina en el epitelio del cuello uterino y que se manifiesta inicialmente a través de lesiones pre-neoplasicas de lenta y progresiva evolución, las cuales si no son detectadas a tiempo, pueden convertirse eventualmente en un cáncer in-situ (CIS) y posteriormente en un cáncer invasor (CI) (Suárez, 2005). El responsable mas frecuente de estas lesiones es el Virus Papiloma Humano (VPH o HPV). Existen más de 80 tipos de los cuales 25 a 30 infectan la zona ano-genital, cabe destacar los tipos 16, 18, 31 y 45 que se asocian al 80% de los CaCu (alto riesgo) y 6, 11, 42, 43 y 44 que se asocian a condilomas acuminados y su evolución es benigna (bajo riesgo) (Atkinson, 2005). Esta patología afecta anualmente a 466.000 mujeres a nivel mundial, de los cuales 231.000 casos son letales lo que corresponde a una tasa aproximada de 9/100.000 mujeres, sobre todo en países sub-desarrollados, constituyendo un importante problema de salud pública (Donoso y cols., 2006; Suárez, 2005). En Chile el CaCu provocó la muerte de 677 mujeres en el año 2005, ocupando el quinto lugar entre las muertes por cáncer en la mujer y produciendo un importante impacto social y económico (MINSAL, 2008). Esta cifra se ha alcanzado gracias a la implementación del Programa Nacional de Pesquisa y Control del CaCu y la utilización del PAP como su principal herramienta. La tasa de mortalidad por CaCu se ha reducido de un 14,3/100.000 a un 8,2/100.000 mujeres entre los periodos 1991-2005 respectivamente y se espera reducirla a un 4,8/100.000 mujeres al término del año 2010 (Donoso y cols., 2006; MINSAL, 2008). 4 El CaCu detectado a tiempo, es curable en un 100%, por lo tanto su diagnóstico en etapas pre-invasoras (diagnóstico precoz) es la intervención sanitaria más eficiente y costoefectiva (Prieto, 2008). La sobrevida promedio a 5 años es del 91,5% de los casos de mujeres con carcinoma in-situ de cuello uterino y solo de un 12,6% de las mujeres con carcinoma invasor (Prieto, 2008; Suárez, 2005). I.2.2 Método de Papanicolaou. Desarrollado por George N. Papanicolaou, médico patólogo griego (1883-1962), consiste en el análisis y tinción de un extendido de células del cuello uterino, canal endocervical y tercio superior de la vagina, el cual tiene por finalidad evaluar indicios de una posible neoplasia u otra patología asociada, pero su principal objetivo es la detección de etapas pre-invasoras del CaCu. Este examen debe practicarse a todas las mujeres una vez que inician su actividad sexual hasta los 65 años aproximadamente (Nauth, 2004; Sirovich y cols, 2009; Takahashi, 1985). I.2.2.1 PAP atípicos (ASC). El PAP a pesar de su favorable costo-beneficio y alta especificidad (cerca del 99%), tiene una sensibilidad que no es óptima (entre un 12% y un 80%) (García y cols, 2006; Guevara-Cuéllar y cols, 2008; Nauth, 2004; O’Ryan y cols, 2008), causada por resultados falsos negativos, ya sea por una mala toma de la muestra (70% de los casos) o por errores en la interpretación del frotis (30% de los casos) (Kurman, 2002). Es por estas razones que dentro de los posibles resultados que puede arrojar un examen de PAP encontramos al atípico (ASC). En 1988 The Bethesda System (TBS) introduce el sigla ASCUS (Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance) y la define como una interpretación citológica que contempla anormalidades celulares que son más marcadas que las atribuibles a un proceso reactivo pero que cualitativamente o cuantitativamente no son suficientes para 5 diagnosticarlas como lesión escamosa intraepitelial (LIE) (Apgar y cols, 2003, Kurman y cols, 1994, Lacruz, 2003). En 1991 TBS sugiere una subcategoría de ASCUS en: ASCUS en favor de proceso reactivo y ASCUS en favor de proceso neoplásico, pero esta no fue aplicada por su escasa reproducibilidad (Apgar y cols, 2003). En 2001 TBS elimina la subcategoría introducida en 1991 y la reemplaza por Atypical Squamous Cells (ASC) que se divide en: Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance (ASC-US) (que incluye inflamación atípica, reparación atípica y sospecha de LIE de Bajo Grado: VPH y Neoplasia Intra-Epitelial I (NIE I)) y Atypical Squamous Cells cannot rule out a high grade lesion (ASC-H) (que incluye NIE II, NIE III o CIS y/o sospecha de CI) (Apgar y cols, 2003; Lacruz, 2003). La finalidad de esta interpretación es evitar falsos negativos que puedan llevar a la muerte de la paciente, dado que entre el 10 al 20% de los casos ASC corresponden realmente a una LIE (Lacruz, 2003). I.2.2.2 PAP atípicos enfocados desde el punto de vista citomorfológico. Dentro de las anormalidades celulares que podrían ser clasificadas como atípicas encontramos: Moderado o marcado agradamiento nuclear (cariomegalia) de 2 o 3 veces el tamaño del núcleo de una célula intermedia o una parabasal grande, sin hipercromasia marcada. Vacuolización citoplasmática en células escamosas intermedias sugestiva pero no diagnóstica de coilocitosis. Patrones de avanzada atrofia del cérvix y vagina particularmente en presencia de “cuerpos azules”, imitando a una célula con características neoplásicas. 6 Eventos inflamatorios, resultando en un leve agrandamiento nuclear, picnosis y leves irregularidades de la forma nuclear, como las observadas en una severa infestación por tricomonas vaginalis o infección por virus herpes. Células escamosas metaplásicas con agradamiento nuclear. Patrón anormal de queratinización de células escamosas. (Koss, 2006) I.2.3 Estudios relacionados al pronóstico de la evolución de los ASC, a través de la evaluación de rasgos citomorfológicos. Existen varias publicaciones que se han referido al valor predictivo que tienen algunos caracteres citológicos en la progresión del ASCUS (Alameda y cols., 2004; Alli y Ali, 2003; Keating y Wang, 2000; Onuma y cols., 2006), y sobre todo en el ASC-H ya que tiene más posibilidad de progresar a una LIE. Keating y Wang (2000) evaluaron la importancia de la interpretación ASCUS en mujeres premenopáusicas, perimenopáusicas y postmenopáusicas. Concluyeron que había una elevada relación ASCUS - LIE en mujeres perimenopáusicas y postmenopáusicas y que el ASCUS parece tener un bajo valor predictivo para una LIE en mujeres perimenopáusicas, sin embargo su estudio no relacionó las características citomorfológicas evaluadas con la evolución del ASCUS. En contraste, Alli y Ali (2004) evaluaron 10 características citomorfológicas y las relacionaron con la evolución del ASCUS, mostrando resultados interesantes. Su estudio reveló que 5 de las características evaluadas tenía un alto valor predictivo en los casos de ASC-H con diagnóstico final de LIE. Estas características fueron: células atípicas aisladas, alta relación núcleo citoplasma, cromatina irregular, hipercromasia nuclear e irregularidad de la membrana nuclear. Alameda y col (2004) evaluaron 5 caracteres citológicos en células escamosas inmaduras con atipías sugerentes de una LIE de alto grado, con el fin de predecir la evolución de los ASC-H. Concluyeron que ninguno de estos tenía significado pronóstico, no obstante habían características citomorfológicas que no fueron consideradas en su 7 estudio y coincidieron solo en 3 (hipercromasia nuclear, cromatina irregular y la irregularidad de la membrana nuclear) con el estudio realizado por Alli y Ali (2004). Kazuya Onuma y col (2006) investigaron sobre las implicaciones clínicas y la importancia patológica del ASC-H en mujeres embarazadas. Este estudio evaluó parámetros citológicos que Alameda y col (2004) tampoco consideraron, como el fondo del frotis, número de células atípicas, células atípicas aisladas, grupos celulares y la forma celular. Concluyeron que los parámetros citológicos evaluados tenían escaso valor predictivo en la progresión del ASC-H, ya que su frecuencia de aparición en los grupos que progresaron a un proceso benigno era la misma que los que progresaron a una LIE. De acuerdo a estos antecedentes, los resultados mostrados por estos estudios son escasamente consistentes unos con otros, además ninguno hace mención de alguna herramienta que permita predecir el valor pronóstico de las características citomorfológicas en la progresión del ASC, es por ese motivo que resulta interesante la propuesta de un score que permita aumentar la sensibilidad del examen de PAP, aportando objetividad al momento de observar los caracteres a evaluar. I.2.4 Antecedentes históricos e implementación del PAP en Chile. En 1966 el Ministerio de Salud de Chile en conjunto con la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile con el apoyo de la Organización Panamericana de la Salud (OPS) y la Organización Mundial de la Salud (OMS), desarrollaron los primeros esfuerzos para la prevención del CaCu implementando laboratorios de citología y capacitación en los 3 niveles de atención. La toma del PAP se realizaba anualmente y focalizada a las mujeres consultantes del Programa Materno-Perinatal en el nivel primario (Suárez, 2005). En 1987, gracias a los resultados de las estrategias implementadas, se decidió, tomando en cuenta recomendaciones de la OPS y la OMS, construir el Programa Nacional de Pesquisa y Control del CaCu, programa que tuvo como objetivo “Disminuir la tasa de mortalidad e incidencia por cáncer invasor a través de la detección en etapas pre-invasoras y tratamientos adecuados y oportunos” (Suárez, 2005). Dentro de las principales estrategias que conforman este programa se encuentran: 8 - La toma del PAP cada 3 años, focalizada en mujeres entre 25 y 64 años con énfasis en las mujeres mayores de 35 años, “Nunca PAP” y PAP atrasado o que corresponda repetirlo por indicación médica (Suárez, 2005). - Asegurar la oportunidad y confiabilidad del examen y del tratamiento de los casos con PAP + (PAP sugerente de Cáncer Invasor, PAP sugerente de neoplasia intraepitelial I, II, III o Cáncer In Situ, Primer PAP Atípico: sugerente de lesión de Alto Grado y PAP Atípico Glandular) (MINSAL, 2008; Suárez, 2005). - Definición de actividades en los 3 niveles de atención desde su promoción hasta tratamientos paliativos (Suárez, 2005). Entre 1988 y 1994 estas estrategias se aplicaron a modo de prueba en la Región Metropolitana para posteriormente ser aplicadas en todo el país (Suárez, 2005). En 1993 entra en funcionamiento el Laboratorio de Referencia Nacional de Citopatología, gracias a un convenio entre el Ministerio de Salud, el Instituto de Salud Pública y la Universidad de Chile. Este es el responsable de la acreditación de los 21 laboratorios del Sistema Público de Salud (Suárez, 2005). En 1997, el CaCu es definido como prioridad programática país, incorporándose el tratamiento quirúrgico al Programa de Oportunidad de Atención de FONASA y la cobertura financiera a radioterapia en el sistema público (Suárez, 2005). En 1999, se definió un protocolo para el Tratamiento del Cáncer Invasor, incorporándose la radio-quimioterapia (Suárez, 2005). La cobertura del PAP ha aumentado de un 26% a un 66% entre los años 1990 y 2008 respectivamente, esperando llegar un 80% en el 2010 (Prieto, 2008; Suárez, 2005). Desde el año 2003, la confirmación diagnóstica, tratamiento y seguimiento de los casos detectados están incluidos entre las Garantías Explícita en Salud (GES) (Prieto, 2008). 9 CAPITULO II. II.1 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS. II.1.1 Hipótesis. El score obtenido de la evaluación de las características citomorfológicas en células escamosas atípicas, predice la evolución de los ASC (ASC-US, ASC-H). II.1.2 Objetivo general. Evaluar características citomorfológicas de células escamosas atípicas en PAP interpretados como ASC entre los años 1999 y 2009, para predecir su evolución utilizando un score citomorfológico, en pacientes del Hospital Clínico Fusat en Rancagua. II.1.3 Objetivos específicos. 1. Evaluar cualitativa/cuantitativamente características citomorfológicas presentes en células escamosas atípicas en PAP interpretados como ASC. 2. Relacionar las características citomorfológicas evaluadas con procesos preneoplásicos, neoplásicos y no neoplásicos. 3. Diseñar un score citomorfológico que permita predecir el comportamiento biológico de esas alteraciones. 4. Proponer una herramienta para evaluar las características citomorfológicas y relacionarlas con la evolución del ASC. 5. Realizar estudio estadístico con los datos obtenidos. 10 II.2 METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN. II.2.1 Tipo de estudio. El estudio realizado fue longitudinal retrospectivo de tipo correlacional con enfoque cuantitativo, debido a que se evaluaron múltiples variables en PAP ya interpretados como ASC las cuales fueron correlacionadas con su evolución (diagnóstico final ya sea con un segundo PAP o biopsia) utilizando un score. II.2.2 Lugar de realización. La investigación se realizó en el Hospital Clínico Fusat de Rancagua, con muestras provenientes de Ginecología y analizadas previamente en el Laboratorio de Anatomía Patológica. II.2.3 Muestra. El número total muestras fue de 387 extendidos cervicouterinos, fijados con CitoSpray, teñidos con técnica de PAP (Anexo I) e interpretados previamente como atípico entre los años 1999 y 2009, de pacientes entre los 17 y 91 años del Hospital Clínico FUSAT en Rancagua, número correspondiente a un 0,5% del número total de PAP del periodo. Como método de selección se aplicaron los siguientes criterios de inclusión y exclusión. II.2.3.1 Criterios de inclusión. - PAP interpretado como atípico, seguimiento del caso y diagnóstico final conocido por al menos un segundo PAP o biopsia, con el fin de realizar una correlación entre este y las características citomorfológicas evaluadas en el PAP atípico. 11 - Tinción bien conservada (adecuada intensidad y contraste de la tinción en las estructuras celulares y extracelulares), ya que permite evaluar el frotis con la misma tinción con la que fue interpretado inicialmente. - Muestra satisfactoria para su interpretación. II.2.3.2 Criterios de exclusión. - PAP interpretado como atípico, sin seguimiento del caso y diagnóstico final desconocido, ya que no permite realizar una correlación entre las características citomorfológicas evaluadas en el PAP atípico y el diagnóstico final. - Tinción del frotis mal conservada (pobre o exagerada intensidad y/o contraste de la tinción en las estructuras celulares y extracelulares), ya que dificulta la evaluación de las células atípicas. No se reteñirán los frotis ya que la intensidad de la tinción variará y es probable que se desprendan células o sufran alteraciones de su morfología. - Artefactos por desecación, ya que dificulta la evaluación de las células atípicas. - Atipías en células glandulares (AGC), ya que corresponde a otro tipo celular y por lo tanto otras características citomorfológicas a evaluar. - Muestra no satisfactoria para su interpretación. 12 Clasificaron un total de 229 PAP siendo este el universo muestral a evaluar y eliminados un total de 158, detallado en las siguientes tablas: Tabla II.1 Número total de PAP atípicos Tabla II.2 Número total de PAP eliminados. Por conveniencia fue un muestreo no probabilístico ya que se evaluaron todos los PAP que cumplieron con los criterios de inclusión, a modo de privilegiar el número total de PAP a evaluar. La evaluación fue realizada por 2 observadores con el fin de comparar los datos obtenidos y estimar si la aplicación del score tiene reproducibilidad. Para efectos de esta unidad de investigación, existe una autorización del Médico Anatomopatólogo a cargo del servicio, para tener acceso a las muestras y la utilización de estas (Anexo II). II.2.4 Score citomorfológico. Un score (puntaje) es una herramienta utilizada para evaluar variables cualitativas asignándole un valor cuantitativo. 13 II.2.4.1 Variables a evaluar. Estas variables fueron seleccionadas de los estudios relacionados con la evolución del ASCUS, ya que demostraron cierto valor pronóstico para esta (Alli y Ali, 2003; Keating y Wang, 2000; Onuma y cols., 2006). II.2.4.1.1 Características referentes al núcleo. Se evaluaron 7 características citomorfológicas en células epiteliales atípicas de forma cualitativa, pero para efecto estadístico se representaron de forma cuantitativa asignándole un score a cada una de estas. 1. Hipercromasia Nuclear (H.N.): tinción perceptiblemente más oscura de los núcleos, debido a una mayor concentración de DNA (aumento de la cantidad de heterocromatina) (Nauth, 2004; Takahashi, 1985). Se evaluó la intensidad de la tinción nuclear de las células atípicas teñidas con Hematoxilina de Harris. - Hipocromático y/o normal = núcleo pálido, pobremente teñido y/o con una intensidad de tinción dentro de los parámetros normales (-), score = 0 puntos. - Hipercromasia leve = núcleo que presente una intensidad de tinción levemente aumentada (+), score = 1 punto. - Hipercromasia moderada a marcada = núcleo que presente una alta intensidad de tinción (++), score = 2 puntos. 14 Fig. II.1 Hipercromasia Nuclear score 0 y 2. La célula de la derecha presenta una H.N. de score 2 puntos y el resto de las células una tinción normal representada con un score de 0 puntos (40X). Fig. II.2 Hipercromasia Nuclear score 0, 1 y 2. Las células situadas en la zona superior derecha presentan una H.N. score 1 punto. Las células de la zona inferior derecha una H.N. score 2 puntos y las células del costado izquierdo HN en score 0 (40X). 15 2. Cromatina Irregular (C.I.): distribución granular gruesa o en grumos e irregular de la cromatina, debido a la pérdida de la relación entre la cantidad de eucromatina y heterocromatina presente en el núcleo. Las aglomeraciones granulares de cromatina se definen como cromocentros (Nauth, 2004; Takahashi, 1985). Se evaluó el núcleo de las células atípicas teñido con Hematoxilina de Harris en busca de irregularidades en la distribución de la cromatina y presencia de cromocentros, diferenciar de núcleos cariorréxicos ya que estos se encuentran fragmentados y se pueden confundir con gránulos gruesos de cromatina, para ello considerar la integridad de la membrana nuclear (excluir de la evaluación núcleos picnóticos). - Normal = cromatina de aspecto granular fino y distribución homogénea (-), score = 0 puntos. - Irregularidad leve de la cromatina = cromatina de aspecto granular grueso y distribución homogénea o levemente irregular, con o sin presencia de cromocentros (+), score = 1 punto. - Irregularidad moderada a marcada de la cromatina = cromatina de aspecto grumoso distribuida irregularmente, con o sin presencia de cromocentros (++), score = 2 puntos. 16 Fig. II.3 Cromatina Irregular score 1. Se observa cromatina de aspecto granular grueso de distribución levemente irregular y presencia de cromocentros (40X). Fig. II.4 Cromatina Irregular score 0, 1 y 2. La célula situada en la zona superior derecha presenta una cromatina de aspecto normal, score 0 puntos, las células en la zona inferior izquierda y centro superior presentan una cromatina levemente irregular, score 1 punto y la célula situada en la zona central presenta una cromatina de aspecto grumoso distribuida irregularmente, score 2 puntos (40X). 17 3. Irregularidad de la membrana nuclear (I.M.): pérdida de la forma esférica u oval de la membrana nuclear, debido a muescas, escotaduras, invaginaciones y/o estriaciones (Takahashi, 1985). Se evaluó la forma de la membrana nuclear en busca de irregularidades en su morfología, teñida con Hematoxilina de Harris y mejor definida con Pardo Bismarck. - Normal = forma nuclear esférica u oval de contorno liso (-), score = 0 puntos. - Leve irregularidad del borde nuclear = forma nuclear esférica u oval de contorno levemente alterado = (+), score = 1 punto. - Moderada a marcada irregularidad del borde nuclear = forma nuclear esférica u oval de contorno alterado y/o pérdida de la forma nuclear = (++), score = 2 puntos. Fig. II.5 Irregularidad de la Membrana Nuclear score 0 y 2. Se observa una célula atípica que posee un núcleo con una gran escotadura y estriaciones, score 2 puntos, el resto de las células presentan un núcleo redondo u oval de membrana nuclear lisa, score 0 puntos (40X). 18 Fig. II.6 Irregularidad de la Membrana Nuclear score 0, 1 y 2. En la zona centro superior izquierda se encuentra una célula de núcleo oval y membrana nuclear lisa, score 0 puntos, en la zona central se encuentran una células con leves escotaduras en su membrana nuclear, score 1 punto y al costado inferior izquierdo de esta, una célula con una gran escotadura y otras de menor tamaño, score 2 puntos (40X). 4. Nucléolo (N.): la presencia de nucléolo(s) prominente(s) se asocia con un aumento en la actividad metabólica y la síntesis proteica. El aumento del tamaño de este se debe a un bloqueo del transporte de los productos nucleolares al citoplasma y el número está dado por la cantidad de organizadores nucleolares que hay en los cromosomas (Nauth, 2004; Takahashi, 1985). Se evaluó la ausencia o presencia de nucléolo(s) en los núcleos de las células atípicas. - Ausencia de nucléolo = (-), score = 0 puntos. - Presencia de nucléolo = (+), score = 1 puntos. 19 Fig. II.7 Nucléolo score 1. Presencia de nucléolo en células atípicas (40X). 5. Anisonucleosis (A.): núcleos de diferentes tamaños como consecuencia de un aumento no coordinado del DNA (Nauth, 2004). Se evaluó la relación entre el tamaño de los núcleos de células normales escamosas intermedias ó parabasales grandes y células atípicas en busca de diferencias en el tamaño (excluyendo núcleos picnóticos) (Koss, 2006). - Ausencia de anisonucleosis = igualdad en el tamaño del núcleo entre células normales y atípicas (-), score = 0 puntos. - Presencia de anisonucleosis leve a moderada = leve a moderada diferencia en el tamaño del núcleo entre células normales y atípicas (menor a 3 veces aumentado de tamaño) (+), score = 1 punto. - Presencia de anisonucleosis marcada = marcada diferencia del tamaño del núcleo entre células normales y atípicas (igual o mayor a 3 veces aumentado de tamaño) (++), score = 2 puntos. 20 Fig. II.8 Anisonucleosis score 0, 1 y 2. Las células de la izquierda presentan un aumento en el tamaño de su núcleo, siendo la de extrema izquierda menor a 3 veces el tamaño del núcleo de una célula escamosa intermedia normal ó parabasal grande, score 1 punto y la de su derecha mayor, score 2 puntos (40X). Fig. II.9 Anisonucleosis score 2. Nótese el gran aumento del tamaño nuclear mayor a 3 veces el tamaño del núcleo de una célula escamosa intermedia normal ó parabasal grande (40X). 21 6. Aumento de la Relación Núcleo/Citoplasma (R.N-C.): la relación entre el tamaño del núcleo y el tamaño del citoplasma circundante, representa una característica de malignidad cuando se desplaza fuertemente a favor del núcleo, lo que también sucede habitualmente en procesos benignos (Nauth, 2004). Se evaluó la relación núcleo/citoplasma existente en las células atípicas comparándola con la relación núcleo/citoplasma existente en las células normales, considerando la maduración de estas (excluyendo núcleos picnóticos). - Normal = (-), score = 0 puntos. - Relación Núcleo/Citoplasma desplazada hacia el núcleo = (+), score = 1 punto. Fig. II.10 Aumento de la Relación Núcleo/Citoplasma score 1. Nótese el gran tamaño nuclear en relación al citoplasma de las células de la derecha de la figura (40X). 22 II.2.4.1.2 Característica referente a disposición celular. Se evaluaron las siguientes características en células epiteliales atípicas de forma cualitativa, pero para efecto estadístico se representaron de forma cuantitativa asignándole un puntaje (score) a cada una de estas. 7. Agrupación y Dispersión Celular (A.D.): se evaluó la disposición de las células atípicas presentes en el frotis (por campo), ya sea en grupos, láminas o dispersas individualmente, se consideró mayoría de número de campos para su evaluación. - Agrupadas = (-), score = 0 puntos. - Dispersas = (+), score = 1 punto. Fig. II.11 Agrupación celular score 0. Se observan a la derecha de la figura células atípicas agrupadas (40X). 23 Fig. II.12 Dispersión celular score 1. Se observa en el centro de la figura células atípicas aisladas (40X). 24 II.2.5 Análisis estadístico. Los datos recolectados fueron almacenados en el software XLSTAT para su posterior evaluación estadística que consistió en estadística descriptiva y la prueba de χ² (Chi-cuadrado), la cual permitió determinar la relación existente entre el score y el seguimiento de los casos. Para esto construimos tablas de contingencia y gráficos como herramientas para la presentación de los datos. II.2.6 Materiales. Los materiales utilizados para esta unidad de investigación fueron los siguientes: - Microscopio óptico (Olympus CX21). - Cámara fotográfica digital (Canon PowerShot SD990 IS). - Computador con software estadístico XLSTAT. 25 CAPITULO III. III.1 RESULTADOS. III.1.1 Seguimiento. Este fue obtenido accediendo a la base de datos de pacientes de FUSAT, ya sea por un segundo PAP o biopsia y se resumen en las siguientes tablas: Tabla III.1 Número de PAP con seguimiento negativo para LIE y CaCu. (Otros= Pólipo cervical) Tabla III.2 Número de PAP con seguimiento positivo para LIE o CaCu. 26 III.1.2 Score obtenidos. Se evaluaron 7 características citomorfológicas de forma cualitativa que fueron representadas de forma cuantitativa a través de un score en un total de 229 PAP previamente interpretados como atípicos. El número de PAP agrupados por puntaje obtenido en el score para ambos observadores se resume en las siguientes tablas: Tabla III.3 Número de PAP por score observador 1. Tabla III.4 Número de PAP por score observador 2. Se estimó la media y la desviación estándar para cada observador las cuales se muestran en la siguiente tabla: Tabla III.5 Estadística descriptiva. 27 III.1.3 Tablas de contingencia. Con los datos obtenidos se confeccionaron las siguientes tablas de contingencia: Tabla III.6 Tabla de contingencia observador 1. Tabla III.7 Tabla de contingencia observador 2. Tabla III.8 Interpretación tabla de contingencia. 28 III.1.4 Prueba de independencia Chi-cuadrado (ausencia-presencia): Se utilizó la prueba Chi-cuadrado (Anexo III) para determinar si existe independencia entre las variables de la tabla de contingencia (Tablas III.6 y III.7), arrojando los siguientes resultados: Tablas III.9 Prueba de independencia Chi-cuadrado observador 1. Tablas III.10 Prueba de independencia Chi-cuadrado observador 2. Las Hipótesis (H) fueron las siguientes: H0: las filas y las columnas de la tabla (ver Tablas III.6 y III.7) son independientes. H1: hay una dependencia entre las filas y las columnas de la tabla (ver Tabla III.6 y III.7). III.1.5 Sensibilidad y Especificidad. Se calculó la sensibilidad y especificidad del score para ambos observadores (Anexo III), arrojando los siguientes resultados: III.1.5.1 Sensibilidad (S): Los resultados se resumen en la siguiente tabla: Tabla III.11 Sensibilidad. 29 III.1.5.2 Especificidad (E): Los resultados se resumen en la siguiente tabla: Tabla III.12 Especificidad. III.1.6 Valor Predictivo Positivo y Negativo. También se calculó el valor predictivo positivo y negativo del score para ambos observadores (Anexo III): III.1.6.1 Valor Predictivo Positivo (VPP): Los resultados se resumen en la siguiente tabla: Tabla III.13 Valor Predictivo Positivo. III.1.6.2 Valor Predictivo Negativo (VPN): Los resultados se resumen en la siguiente tabla: Tabla III.14 Valor Predictivo Negativo. 30 III.1.7 Comparación y correlación del score obtenido por ambos observadores. III.1.7.1 Comparación de scores entre ambos observadores. Se aplicó la prueba de Wilcoxon de los rangos signados, entregando los siguientes resultados: Tabla III.15 Prueba de Wilcoxon. Las Hipótesis (H) fueron las siguientes: H0: la distribución de las dos muestras es la misma. H1: la distribución de ambas muestras es diferente. III.1.7.2 Correlación de scores entre ambos observadores. Se aplicó el coeficiente de correlación de Spearman, entregando los siguientes resultados: Tabla III.16 Matriz de correlación (Spearman). 31 Tabla III.17 p-valores. Tabla III.18 Coeficiente de determinación (Spearman). Gráficamente se representa de la siguiente forma: 10 9 8 Ob 1 7 6 5 4 3 2 0 2 4 6 8 Obs 2 Fig. III.1 Correlación entre los observadores 10 32 CAPITULO IV. IV.1 DISCUSIONES. IV.1.1 Discusiones respecto a la Hipótesis: De acuerdo con los resultados obtenidos, el score citomorfológico predijo la evolución de los ASC en un 94% y 92% de los PAP evaluados correspondiente al observador 1 y 2 respectivamente (promedio 93%), quedando demostrado además por sus altos porcentajes de sensibilidad, especificidad, VPN y VPP (ver Tablas III.11, III.12, III.13 y III.14). La predicción consiste en positividad o negatividad para una LIE, sin señalar específicamente el grado de la lesión. IV.1.2 Discusiones respecto al Objetivo General: Se logró evaluar todas las características citomorfológicas, sin embargo existieron otros parámetros potencialmente evaluables pero que no se incluyeron en el estudio debido a las siguientes razones: El parámetro “Hipercromasia de la Pared Nuclear”: ya que la Hipercromasia Nuclear en score 1 y sobre todo en 2, enmascaró a este patrón, haciendo en algunos PAP imposible su evaluación. El parámetro “Fondo”: ya que en todos los PAP evaluados este fue limpio ó inflamatorio y por lo tanto no tuvo ninguna relevancia en el resultado final del estudio. El parámetro “Cantidad de Células Atípicas”: debido a que resultó complejo contar células en grupos en los cuales estas se encontraron sobrepuestas y/o con limites 33 citoplasmáticos poco definidos, por lo tanto en varios PAP evaluados no fue posible determinar si correspondía a una célula bi-multinucleada ó a dos o más células. IV.1.3 Discusiones respecto a los Objetivos Específicos: Todos los objetivos específicos planteados en esta unidad de investigación se cumplieron. Con respecto al objetivo específico número uno, la evaluación cualitativa de las característica citomorfológicas interpretadas de forma cuantitativa, facilitó considerablemente la realización del score, su interpretación y permitió una comunicación más objetiva y dinámica entre los observadores. De acuerdo a lo planteado en el objetivo específico número dos, el score permitió relacionar las características citomorfológicas con la evolución del ASC, pero esta relación no fue directa entre una LIE específica y un score específico, ya que a mayor puntaje no es mayor el grado de la lesión, si no que cuando el score fue mayor o igual a 7, la LIE podía resultar tanto de bajo como de alto grado. Con respecto al objetivo específico número cuatro, propondríamos al score citomorfológico como herramienta para la predicción de la evolución de los ASC siempre y cuando esta se perfeccione, aumentando su sensibilidad y reproducibilidad, a través de futuros estudios que revaliden el presente trabajo. Con respecto al objetivo específico número cinco, la finalidad del score citomorfológico fue medida a través de estudios estadísticos como la sensibilidad, la especificidad, el valor predictivo positivo y negativo, con lo cual se determinó que el score predice la evolución de los ASC. IV.1.4 Discusiones respecto al Score Citomorfológico y Estadística. El porcentaje de PAP atípicos que finalmente resultó con un seguimiento positivo para una LIE fue de un 17.47%, el cual coincide con la literatura (Lacruz, 2003). 34 Ninguno de los PAP analizados tenía antecedentes de embarazo en el momento de la toma de muestra, por lo tanto no se hace referencia a estas pacientes en este estudio, sería importante incluirlas en futuras aplicaciones del score. De acuerdo a lo observado durante la realización del score y la evaluación de los PAP atípicos, se estableció como punto de corte un score de 7 puntos, para señalar que aquellos PAP con un score entre 1 y 6 puntos posiblemente se trate de un proceso benigno (PAP con seguimiento negativo para una LIE ó CaCu) y aquellos con un score entre 7 y 11 puntos posiblemente se trate de un proceso maligno (PAP con seguimiento positivo para una LIE ó CaCu). Una vez establecido el punto de corte, se asignó como código “0” a los casos con un seguimiento negativo de LIE y “1” a aquellos con un seguimiento positivo de LIE, para poder estimar el valor predictivo del score determinando el número de falsos positivos y negativos y verdaderos positivos y negativos (ver Tablas III.6 y III.7). Para determinar la existencia de independencia entre las variables de las tablas de contingencia se utilizó la prueba Chi-cuadrado (ver Tablas III.9 y III.10), siendo la interpretación de la prueba la siguiente: Como el Valor p computado fue menor que el nivel de significancia alfa = 0,05, se debe rechazar la hipótesis nula H0 y aceptar la hipótesis alternativa H1. El riesgo de rechazar la hipótesis nula H0 cuando es verdadera es menor que 0,01%. Por lo tanto la prueba Chi-cuadrado demuestra que existe una dependencia u asociación entre el score obtenido y la predicción de la evolución del ASC (ausencia o presencia de una LIE). Para realizar la comparación entre los score obtenidos por ambos observadores, se aplicó la prueba de Wilcoxon de los rangos signados (ver Tabla III.15), siendo la interpretación de la prueba la siguiente: Como el p-valor computado fue menor al 5% es posible concluir que existe diferencia significativa entre el score obtenido por ambos observadores. Para realizar la correlación entre los score obtenidos por ambos observadores, se aplicó el coeficiente de correlación de Spearman (ver Tabla III.16, III.17, III.18), siendo la interpretación de la prueba la siguiente: 35 Como el p-valor computado fue menor al 5%, es posible concluir que existe asociación lineal entre el score de ambos observadores, es decir, la correlación que existe es significativa, siendo esta correlación de un 82.2%. Las diferencias estadísticas encontradas al comparar los scores de ambos observadores, se debieron principalmente a que algunas características citomorfológicas analizadas (hipercromasia nuclear, irregularidad de la membrana, anisonucleosis, dispersión y agrupación) presentaron un score al que denominamos “intermedio” (ej. entre 0 y 1 ó entre 1 y 2) lo cual llevó a los observadores a definir con criterio personal que score considerar en la característica evaluada, lo que repercutió en el score total. Las diferencias entre scores de ambos observadores son relativamente altas si se comparan cada una de las características citomorfológicas por separado (ver Tabla III.15), pero si se comparan en conjunto, los scores totales son muy similares y con una correlación que es lineal (ver Tabla III.16, III.17, III.18), por lo tanto en este sentido la reproducibilidad es buena y es por esta razón que al momento de evaluar un PAP, las características analizadas deben ser consideradas en conjunto a la hora de tomar una decisión. Con respecto a la especificidad, VPP y VPN, los valores obtenidos fueron muy buenos (ver Tablas III.12, III.13, III.14) a excepción de la sensibilidad que se encontró en el límite (ver Tabla III.11), demostrando con esto que el score citomorfológico es una herramienta que cumple los objetivos para el cuales fue ideada. Las características citomorfologicas evaluadas, por separados tienen escaso valor predictivo pero en conjunto este valor aumenta considerablemente, como lo demuestra el modelo de regresión logística para cada observador (Anexo IV). Ninguno de las ASC analizados consiguió el score máximo de 11 puntos, lo cual era esperable, ya que si alguno lo hubiera alcanzado, lo más probable es que ese frotis atípico habría tenido que ser reclasificado como “positivo para células neoplásicas”, debido a que estaría cumpliendo con todos los rasgos de malignidad. Podría ocurrir que al analizar un PAP atípico, las 7 características citomorfológicas sean evaluadas con un score de 1 punto, por lo tanto un score total de 7 puntos (positivo para una LIE). Como todas las atipías son leves, lo más probable por lógica, es que este caso sea un falso positivo, por lo tanto el observador debe ser cuidadoso ya que resulta ser 36 un caso especial para el score. En este estudio ningún caso presentó esta puntuación, por lo tanto no se sabe la evolución de estos PAP atípicos. La presencia de pseudocoilocitos y bi-multinucleacion, fueron más frecuentes en PAP atípicos con una progresión negativa para LIE y lo más probable es que si se hubiera considerado estos parámetros aumentaría el score máximo, el punto de corte del score no seria 7 sino que mayor y por lo tanto hubiera generado, según la experiencia en este estudio, un mayor número de falsos negativos. Es por esta razón que no fueron considerados en el score. Para que se perfeccione el score, es importante que exista una estandarización de la técnica de tinción de PAP en todos los laboratorios de citología. 37 IV.2 CONCLUSIONES. El score citomorfológico predijo la evolución de los ASC en un 93% de los PAP atípicos evaluados con una correlación del 82% entre ambos observadores. El score citomorfológico permite una evaluación mas objetiva de los PAP atípicos. A pesar de la variabilidad en las evaluaciones de las características citomorfológicas entre ambos observadores, el score si predijo la evolución de los ASC. Esta herramienta podría reclasificar los PAP atípicos como probable lesión preneoplásica, neoplásica y no neoplásica, pero a pesar de los buenos resultados (alta sensibilidad, especificidad, VPP y VPN) a favor del objetivo del score citomorfológico, consideramos que la interpretación ASC debe seguir vigente, ya que esta herramienta necesita perfeccionarse para que pueda ser utilizada en la clínica. 38 REFERENCIAS. Alameda, F., Albert, S., Romero, E., Gimferrer, E., Soler, I., Ferrer, L., et al. (2004). ASCUS sobre células metaplásicas, significado pronostico de los cambios citológicos. Revista Española Patología, Vol. 37, nº 4: 391-394. Alli P. M. & Ali S. Z. (2003). Athypical Squamous Cells of Undetermined Significance-Rule Out High-Grade Squamous Intaepithelial Lesion: Cytopathologic Characteristic and Clinical Correlates. 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Buenos Aires (pp. 32-39, 161-163). 41 ANEXOS. 42 Anexo I: Técnica de PAP utilizada en el Laboratorio de Anatomía Patológica del Hospital Clínico FUSAT. 43 Batería de tinción. - Una cubeta de tinción con Hematoxilina de Harris, C.I.: 75290 (Merck). - Una cubeta de tinción con Orange G, C.I.: 16230 (Merck). - Una cubeta de tinción con EA50 (Eosina Y, C.I.: 45380, Verde Luz SF Amarillento, C.I.: 42095, Pardo Bismarck, C.I.: 21010) (Merck). - Una cubeta de tinción con alcohol-ácido al 1% (alcohol: Coprolan, ácido clorhídrico: Merck). - Una cubeta de tinción con solución de Bórax (tetraborato de sodio) (Riedel-Dhaën, Arquimed). - Seis cubetas de tinción con alcohol 96% (Coprolan). - Tres cubetas de tinción con alcohol 99% (Coprolan). - Seis cubetas de tinción con xilol (Reutter). Técnica de tinción. 1. Remoción de la capa de Polietilenglicol dejada por el CitoSpray con alcohol 96% por 1 min. 2. Hidratación con agua corriente. 3. Tinción nuclear con Solución de Hematoxilina de Harris por 2 min. 4. Lavado con agua corriente. 5. Diferenciación de la tinción con Hematoxilina de Harris en alcohol-acido 1% (1 a 2 seg. agitando continuamente). 6. Lavado en agua corriente. 7. Azulado con solución de Bórax a saturación por 5 seg. agitando constantemente. 8. Lavado en agua corriente. 9. Deshidratación con alcohol 96% por 30 seg. 10. Tinción citoplasmática con Solución de Orange G por 2 min. 11. Dos lavados con alcohol 96% por 5 seg. agitando constantemente. 12. Tinción con solución de EA50 por 2 min. 44 13. Lavados y deshidratación de la muestra en: dos alcoholes 96%, tres alcoholes 99% y seis xiloles, por 5 seg. en cada uno y agitando constantemente. Resultados. - Núcleos: azul-violeta. - Citoplasma células inmaduras: verde-azulado. - Citoplasma células maduras: fucsia-rosado. - Citoplasma células queratinizadas: anaranjado. 45 Anexo II: Autorización. 46 47 Anexo III: Estadística. 48 Prueba de Independencia Observador 1: Prueba chi-cuadrada: Ausencia. Presencia. Los conteos esperados se imprimen debajo de los conteos observados. Las contribuciones chi-cuadradas se imprimen debajo de los conteos esperados. Ausencia 185 160,94 3,597 Presencia 10 34,06 16,997 Total 195 2 4 28,06 20,631 30 5,94 97,483 34 Total 189 40 229 1 Chi-cuadrada = 138,709. GL = 1. Valor P = 0,000. Interpretación de la prueba: H0: La ausencia o presencia de la enfermedad es independiente del score obtenido. H1: hay una dependencia entre la ausencia o presencia de la enfermedad y el score obtenido. Dado que el valor p es menor que el nivel de significación 0,05, es posible concluir que existe dependencia entre la presencia o ausencia de la enfermedad y el score obtenido. Tabla de contingencia. Score >7 ≤7 Ausencia 185 4 presencia 10 30 49 Vista 3D de la tabla de contingencia 200 150 100 50 presencia 0 >7 ausencia ≤7 Score Prueba de Independencia Observador 2: Prueba chi-cuadrada: ausencia-presencia. Los conteos esperados se imprimen debajo de los conteos observados. Las contribuciones chi-cuadradas se imprimen debajo de los conteos esperados. ausencia 184 162,59 2,819 presencia 13 34,41 13,322 Total 197 2 5 26,41 17,357 27 5,59 82,012 32 Total 189 40 229 1 Chi-cuadrada = 115,510. GL = 1. Valor P = 0,000 Interpretación de la prueba: H0: La ausencia o presencia de la enfermedad es independiente del score obtenido. H1: hay una dependencia entre la ausencia o presencia de la enfermedad y el score obtenido. 50 Dado que el valor p es menor que el nivel de significación 0,05, es posible concluir que existe dependencia entre la presencia o ausencia de la enfermedad y el score obtenido. Tabla de contingencia. Score >7 ≤7 Ausencia 184 5 Presencia 13 27 Vista 3D de la tabla de contingencia 200 150 100 50 P resencia 0 >7 Score A usencia ≤7 Sensibilidad: Es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo enfermo, es decir, la probabilidad de que para un sujeto enfermo se obtenga en la prueba un resultado positivo. Por lo tanto es la capacidad del test para detectar la enfermedad. Corresponde a la proporción entre los verdaderos positivos y el total de positivos (verdaderos positivos + falsos negativos): 51 Donde: VP = Verdaderos Positivos. FN = Falsos Negativos. Especificidad: Es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo sano, es decir, la probabilidad de que para un sujeto sano se obtenga un resultado negativo. Por lo tanto es la capacidad del test para detectar a los pacientes sanos. Corresponde a la proporción entre los verdaderos negativos y el total de negativos (verdaderos negativos + falsos positivos): Donde: VN = Verdaderos Negativos. FP = Falsos Positivos. Valor Predictivo Positivo (VPP): Es la probabilidad de padecer la enfermedad si se obtiene un resultado positivo en el test. Corresponde a la proporción entre los verdaderos positivos y la suma entre verdaderos positivos y falsos positivos. Donde: VP = Verdaderos Positivos. FP = Falsos Positivos. 52 Valor Predictivo Negativo (VPN): Es la probabilidad de no padecer la enfermedad si se obtiene un resultado negativo en el test. Corresponde a la proporción entre los verdaderos negativos y la suma entre verdaderos negativos y falsos negativos. Donde: VN = Verdaderos Negativos. FN = Falsos Negativos. 53 Anexo IV: Análisis y Modelo de Regresión Logística. 54 Análisis de regresión de logística. El objetivo de la regresión logística es el diseño de un modelo que entregue una respuesta, que para este caso es ausencia (0) o presencia (1) de una LIE (respuesta dicotómica), ejemplificada de la siguiente forma: Código 0,1 vs. H.C.N. 0-2 / C.I. 0-2 / I.M. 0-2 / N. 0-1 /A. 0-2 /R.N-C. 0-1 /A.D. 0-1. Donde: H.N.= Hipercromasia Nuclear. C.I.= Cromatina Irregular. I.M.= Irregularidad de la Membrana Nuclear. N.= Presencia de Nucléolo. A.= Anisonucleosis. R.N-C.= Relación Núcleo/Citoplasma. A.D.= Agrupación o Dispersión celular. Siendo el modelo el siguiente: LogitP(positivo para una LIE=1)β1 β 2* H.N. β3 * C.I. β 4 * I.M. + β 5 * N. + β 6 * A. + β 7* R.N-C. + β 8* A.D. 55 En donde los valores β para ambos observadores son los siguientes: Valores β. Las Hipótesis (H) fueron las siguientes: H0: los coeficientes del modelo son nulos. H1: Los coeficientes del modelo no son nulos. Interpretación de la prueba: Para el observador 1 se observó que los p-valores asociados a los coeficientes β5, β7, β8 son superiores a 0,05. Por tanto, para un nivel de significación α = 0,05, no rechazaremos la hipótesis nula de que dichos coeficientes son nulos, lo que estaría indicando que la variable asociada al coeficiente no es relevante en el modelo, no teniendo un efecto significativo a la hora de explicar el comportamiento de la variable dependiente. Por el contrario, los p-valores asociados a los coeficientes β1, β2, β3 β4, β6 , para un nivel de significación α = 0,05, rechazaremos la hipótesis nula de que dichos coeficientes son nulos, lo que está indicando que las variables asociadas a esos coeficientes tiene un efecto significativo a la hora de explicar el comportamiento de la variable dependiente. Para el observador 2 se observó que los p-valores asociados a los coeficientes son superiores a 0,05. Por tanto, para un nivel de significación α = 0,05, no rechazaremos la hipótesis nula de que dichos coeficientes son nulos, lo que estaría indicando que la variable asociada por si sola al coeficiente no es relevante en el modelo, no teniendo un efecto significativo a la hora de explicar de manera individual el comportamiento de la variable dependiente. 56 Dada la información que se obtiene con los análisis, se realizó una propuesta para seleccionar el mejor modelo con los datos correspondientes: Propuesta para seleccionar el mejor modelo del observador 2. El mejor modelo para el criterio de selección se exhibe en rojo. Si bien existen diferencias entre estos modelos, para la realización de uno definitivo es necesario que se formulen nuevos modelos de futuras investigaciones que apliquen el score citomorfológico.
