infección por bonamia exitiosa (bonamiosis)

Transcripción

CAPÍTULO 2.2.2.
INFECCIÓN POR BONAMIA EXITIOSA
(BONAMIOSIS)
1. DEFINICIÓN DE LA ENFERMEDAD
A efectos de este capítulo, la bonamiosis (infección por Bonamia exitiosa) se considera como una
infección por Bonamia exitiosa, anteriormente denominado B. exitiosus (1, 13).
2. INFORMACIÓN PARA EL DISEÑO DE PROGRAMAS DE VIGILANCIA
a)
Factores del agente
• Agente etiológico, variedades del agente: Bonamia exitiosa; no se ha identificado ninguna
variedad.
• Supervivencia fuera del hospedador: las partículas infectivas pueden sobrevivir durante
48 horas en agua marina a 18°C (4, 6).
• Estabilidad del agente: actualmente se desconoce.
• Ciclo biológico: es posible la transmisión del parásito directamente de hospedador a
hospedador y se sospecha la transmisión por estadios de vida infectivos transportados de
forma pasiva por las corrientes que discurren entre bancos de ostras (4, 11).
b)
Factores del hospedador
• Especies de hospedadores susceptibles (hospedadores naturales): la ostra plana chilena de
Nueva Zelanda Ostrea chilensis (=Tiostrea chilensis, =T. lutaria) (7) y la ostra legamosa australiana
O. angasi (11, 15).
• Etapas susceptibles del hospedador: En el caso de O. chilensis, se sabe que son susceptibles las
ostras con un tamaño adecuado para la recolección (ostras de 58 mm. de longitud o mayores)
(7). No existen datos respecto a las otras etapas de las ostras, incluidas las huevas.
• Predilección por especies o sub-población: Ostrea chilensis y O. angasi (7, 15) de 58 mm de
longitud o mayores. En O. chilensis, las ostras hembras y las ostras agotadas se muestran con
una infección significativamente mayor que la de las ostras machos o hermafroditas (14).
• Órganos diana y tejido infectado: Bonamia exitiosa es un protozoo intrahemocítico pero
puede observarse extracelularmente (7). Este protozoo intrahemocítico se convierte
rápidamente en sistémico y puede encontrarse en diferentes órganos, especialmente en los
tejidos conectivos de las branquias y del manto (9). En Ostrea angasi, el parásito es
epiteliotrópico; aparentemente infecciones muy leves pueden causar una infiltración focal
masiva de hemocitos y focos necróticos.
• Infección persistente con portadores asintomáticos: la infección es a menudo fatal
dependiendo del hospedador y de las condiciones ambientales.
• Vectores: no son necesarios.
c)
Patrón de la enfermedad
• Mecanismos de transmisión: En O. chilensis es posible la transmisión directamente de
hospedador a hospedador. Las partículas infectivas liberadas son ingeridas por las ostras y
entran en la hemolinfa desde el intestino (9, 10). Las partículas infectivas son fagocitadas por
hemocitos agranulares, pero son capaces de resistir la lisis dentro del hemocitos (16).
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
321
Capítulo 2.2.2. — Infección por Bonamia exitiosa
• Prevalencia: variable en O. chilensis (desde 0% hasta cerca de 80%) (4). La infección con
Bonamia exitiosa muestra su mayor prevalencia de enero a abril, y el parásito es a duras
penas detectable en septiembre y octubre (9). Factores estresantes como la exposición a
temperaturas extremas (7 o 26°C) y salinidad (40%), inanición (estancia prolongada en agua de
mar filtrada), manejo (agitación vigorosa 4 veces al día), o infección grave con un apicomplejo
(12) pueden afectar la dinámica de la enfermedad de B. exitiosa en la Ostrea chilensis (14).
• Distribución geográfica: O. chilensis, en el Estrecho de Foveaux y otros lugares alrededor de
South Island, Nueva Zelanda (7, 8) y O. angasi, en Australia (Port Philip Bay, Victoria; Georges
Bay, Tasmania; y Albany, Australia Occidental) (11, 15).
• Mortalidad y morbilidad: la infección es a menudo letal. En O. chilensis, la muerte ocurre
generalmente en el mismo momento de mayor virulencia del parásito, particularmente asociado
con infecciones muy intensas por apicomplexos (12, 16).
• Repercusión de la enfermedad en la economía/producción: en O. chilensis, la mortalidad a gran
escala de la ostra nativa chilena (91% entre 1975 y 1992 en el Estrecho de Foveaux, Nueva
Zelanda [8]) se ha atribuido a este parásito. Esa industria pesquera se cerró en 1993 con una
gran repercusión económica en las comunidades locales.
d)
Control y prevención
• Vacunación: ninguna.
• Quimioterapia: ninguna.
• Inmunoestimulación: ninguna.
• Producción de resistentes: ninguna.
• Reabastecimiento con especies resistentes: ninguno.
• Agentes bloqueadores: ninguno.
• Prácticas generales de manejo: el desarrollo de dragados más ligeros y de estrategias pesqueras
menos dañinas, reduciría el riesgo de brotes de la enfermedad mediante la disminución de las
molestias (4). Evitar los factores estresantes tales como la exposición a temperaturas extremas
(7 o 26°C) y la salinidad (40%), la inanición, el manejo, o las infecciones graves por otros
parásitos, así como la disminución de la densidad, ayudarán a reducir el impacto de la
enfermedad. (4, 14).
3.
MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
a)
Métodos de diagnóstico de campo
• Signos clínicos: ostras muertas o abiertas. Estos signos clínicos no son patognomónicos para la
infección por Bonamia exitiosa.
b)
Métodos clínicos
• Lesiones macroscópicas: la mayoría de las ostras infectadas vivas parecen normales, pero
algunas veces las branquias pueden aparecer deterioradas (7).
• Bioquímica clínica: ninguna.
• Patología microscópica
• Preparaciones montadas: ninguna.
• Frotis: no existe información.
• Secciones fijadas: en O. chilensis, las lesiones ocurren en el tejido conjuntivo de las branquias
y del manto y en los senos vasculares alrededor del estómago y del intestino. La capa
subepitelial del tejido conjuntivo del manto que se infiltra mediante grupos de hemocitos
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granulares parasitados, presenta una apariencia disociada (7). En O. angasi, parece que las
infecciones leves de las branquias y de los epitelios diverticulares digestivos con tinción
débil de B. exitiosa intracelular de basófilo pálido, da como resultado hiperplasia epitelial
masiva.
• Microscopía electrónica/citopatología: no existe información.
c)
Métodos de detección e identificación del agente
• Métodos de detección directa
i) Métodos microscópicos
• Frotis de tejidos
Muestras a utilizar: huevas de ostra, ventrículo del corazón o branquias de hospedadores
adultos vivos.
Procedimiento técnico: después de secar los tejidos con papel absorbente, se preparan
varios frotis en un porta de vidrio. Se secan los portas al aire, se fijan en metanol o en
etanol absoluto y se tiñen utilizando un kit para tinción de sangre disponible en el
mercado, siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de aclararlos con agua del
grifo y secarlos, se montan los portas con un cubre-objetos utilizando la resina sintética
apropiada. Se observan primero a un aumento de × 200 y luego bajo inmersión de aceite
a × 1000. Las infecciones en O. angasi son generalmente muy suaves, incluso en el
momento de la muerte, y, por tanto, la infección puede ser muy difícil de detectar
utilizando frotis de tejido.
Controles positivos: se recomiendan y están disponibles en el laboratorio de referencia
de la OIE.
Niveles de validación:
• Especificidad y sensibilidad: la especificidad es baja, la sensibilidad es mejor que la
del análisis histológico (5). Los frotis de corazón muestran una sensibilidad del
59,3% y una especificidad del 100%, si se comparan con la aplicación combinada de
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la hibridación (ISH) in-situ.
• Método de referencia: la sensibilidad del frotis tisular es mayor que la de la histología,
que constituye el método de referencia, aunque no sea específico para una especie.
Interpretación de los resultados:
• Un resultado positivo consiste en la presencia de un organismo pequeño, de forma
esférica u ovoide de (2–5 µm de ancho), dentro de los hemocitos. Sin embargo, el
parásito también podría aparecer extracelularmente. Estos organismos muestran un
citoplasma basófilo y un núcleo eosinófilo (los colores pueden variar según el tinte
utilizado); dado que estos organismos se extienden en el porta, pueden parecer más
grandes que en el examen histológico.
Disponibilidad de las pruebas: Están disponibles en el mercado kits de tinción rápida
(v.g. Hemacolor®).
• Histopatología
Muestras a utilizar: ostras vivas o recién muertas.
Procedimiento técnico: los cortes de tejido, que incluyen las branquias, la glándula
digestiva, el manto y las gónadas, deben fijarse durante 24 horas en fijador de Davidson,
continuando con el proceso normal de parafinación de tejidos y tinción, por ejemplo
con hematoxilina y eosina. Las observaciones se realizan a aumentos crecientes de ×
1000.
Controles positivos: se recomiendan y están disponibles en el laboratorio de referencia
de la OIE.
323
• Especificidad y sensibilidad: en O.chilensis, la especificidad es baja, la sensibilidad es
buena para infecciones de intensidad entre moderada y alta, pero es baja para
infecciones de baja intensidad. Cuando se compara con la PCR y la ISH combinadas,
la histología muestra una sensibilidad del 44% (menor que la de los frotis de
corazón) y una especificidad del 100% (5).
• Método de referencia: la histolología es el método de referencia y es el método
recomendado para la vigilancia.
• Un resultado positivo de O. chilensis es la presencia de parásitos similares a células
muy pequeñas de 2–5 µm de ancho, que ocurren dentro de los hemocitos o libres en
el tejido conjuntivo o en los senos de las branquias, o del epitelio del manto o del
intestino, generalmente asociado con una infiltración de hemocito intensamente
diseminado en O. chilensis, pero con una infiltración focal de hemocitos intensa en
O. angasi. Para evitar cualquier duda, el parásito debe observarse dentro del hemocito
para un diagnóstico positivo. La técnica no es específica para una especie.
Disponibilidad de las pruebas: no existen pruebas disponibles en el mercado.
• Microscopía electrónica de transmisión
Procedimiento técnico: se describe en el capítulo I.2 del presente Manual de animales
acuáticos.
Controles positivos: no
• Especificidad y sensibilidad: mejor especificidad que con los frotis y la histología. La
microscopía electrónica de transmisión permite la diferenciación entre B. exitiosa y
otras microcélulas estrechamente relacionadas, como B. ostreae.
• Un resultado positivo consiste en la presencia de parásitos dentro de los hemocitos.
En O. chilensis, se han descrito cuatro etapas de desarrollo de parásitos en las ostras
infectadas que son: formas densas (Etapa 1), formas intermedias (Etapa 2), forma
plasmodial (Etapa 3) y forma vacuolizada (Etapa 4) (10, 13). Las estructuras
intracelulares incluyen los mitocondrios, los haplosporosomas, el aparato de Golgi y
microtúbulos intranucleares persistentes.
• A diferencia de otros haplosporidios, incluida la B. ostreae, se ha observado en
B. exitiosa una etapa que contiene una vacuola larga derivada del alargamiento de
uno o más mitocondrios (10, 13). Las formas densas de B. exitiosa son menos
densas, ligeramente más largas (3 ± 0,3 µm de diámetro medio n = 61 en
comparación con B. ostreae, con un diámetro medio de 2,4 ± 0,5 µm, n = 64), tienen
más haplosporosomas, más perfiles mitocondriales y más cuerpos lipoideos por
sección de ultraestructura, y tienen unos mitocondrios tubo-vesiculares más
pequeños que B. ostreae. Además, las formas densas, no las ligeras, de B. ostreae
carecen de Golgi unido a la membrana nuclear del apicomplejo y una fase
vacuolizada (12).
ii) Identificación y aislamiento del agente.
• Cultivo celular/medios artificiales: ninguno.
• Métodos de detección de antígeno basados en anticuerpos: actualmente no están disponibles pero
uno de los dos anticuerpos monoclonales obtenidos frente a la membrana celular de
B. ostreae reaccionó con B. exitiosa (16).
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• Técnicas moleculares: reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Procedimiento técnico: las muestras de tejido se colocan en etanol al 95% o se congelan
a –80°C hasta que se extrae el ADN. La extracción de ADN se consigue por digestión
de la proteinasa K durante toda la noche a 50°C, por extracción de fenol-cloroformo y
por precipitación de etanol (3).
Se ha demostrado que un protocolo de PCR desarrollado para la detección de Bonamia
ostreae permite la detección de B. exitiosa (2, 5, 13). El par de cebadores Bo-Boas (5’CAT-TTA-ATT-GGT-CGG-GCC-GC-3’ y 5’-GGG-GGA-TCG-AAG-ACG-ATCAG-3’, respectivamente) amplifica un producto de 304 pb de la región SSU del rADN
(3). Las mezclas PCR contienen tampón (500 mM de KCl, 100 mM de Tris/HCl
(pH 9,0 a 25°C) y 1% de Tritón® X-100), 2,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de mezcla dNTP,
1 µM de los cebadores directo e inverso, 0,02 unidades/µl de ADN polimerasa Taq, y
0,2 ng/µl del ADN molde en un volumen total de 50 µl. Se desnaturalizan las muestras
en un termociclador durante 5 minutos a 94°C antes de someterlas a 30 ciclos (94°C
durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto, 72°C durante 1 minuto), con una extensión
final de 10 minutos a 72°C.
Un segundo par de cebadores CF y CR (5’-CGG-GGG-CAT-AAT-TCA-GGA-AC-3’ y
5’-CCA-TCT-GCT-GGA-GAC-ACA-G-3’, respectivamente), también diseñados para
amplificar un producto de 760 pb a partir de la región SSU del rADN de B. ostreae
debería amplificar B. exitiosa (2).
Controles positivos/negativos: obligatorios. Los controles positivos son el ADN
genómico de hospedadores muy infectados. Los controles negativos son el ADN
genómico de hospedadores no infectados.
• Especificidad y sensibilidad: basados en la similitud de secuencias de ADN diana, el
par de cebadores Bo-Boas debe amplificar todos los haplosporidios de las
microcélulas (2). La sensibilidad del ensayo es mayor que la de los métodos
histocitológicos pero menor que la de la hibridación in-situ (5).
• Método de referencia: Si se compara con la aplicación combinada de la histología y
los frotis de corazón, y si se tiene en cuenta que estas últimas técnicas presentan un
100% de sensibilidad y de especificidad, la PCR muestra una sensibilidad del 88,2%
(inferior a la de la hibridación in situ [ISH]) y una especificidad del 36,4% (5).
• Un resultado positivo es un amplicón de tamaño apropiado, siendo negativos todos
los controles negativos y siendo positivos todos los controles positivos.
• Los ensayos de la PCR no son específicos para una especie. La secuencia del gen
SSU del rADN de Bonamia exitiosa muestra polimorfismo con el de B. ostreae y
B. roughleyi mediante análisis del polimorfismo de longitud del fragmento de
restricción (RFLP) por digestión de los productos PCR de Bo-Boas por Bgl I y Hae
II. Bonamia ostreae y B. exitiosa presentan el mismo perfil (dos productos de 115 y 189
pb) cuando se digieren con Hae II, mientras que el producto de PCR de B. roughleyi
no se digiere. El perfil de B. ostreae se compone de dos bandas de 120 y 180 pb
cuando se digiere con Bgl, I mientras que los productos PCR de B. exitiosa y
B. roughleyi no se digieren (2, 13).
• Técnicas moleculares: hibridación in-situ (ISH)
Muestras a tomar: ostras vivas o recién muertas.
Procedimiento técnico: se ha demostrado que un protocolo de ISH que se ha
desarrollado para la detección de Bonamia ostreae permite la detección de B. exitiosa (3,
5). En esta prueba se utiliza una sonda de 300 pb marcada con digoxigenina que se
orienta al gen SSU del rADN. Se colocan muestras de tejido en fijador de Davidson
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durante 24 horas y luego se envuelven en parafina. Se cortan trozos de 5 µm de espesor,
se colocan en portas recubiertos con silano y luego se cuecen toda la noche en un horno
a 60°C. Una vez desparafinados, los portas se tratan con proteinasa K (100 µg/ml) en
tampón TE (50 mM de Tris, 10 mM de EDTA [ácido etiléndiamino tetracético]) a 37°C
durante 30 minutos. Se deshidratan los portas mediante inmersión en series de etanol y
se secan al aire. Luego se cubren los portas con tampón de hibridación (4 × SSC [citrato
salino estándar; 60 mM de NaCi, 600 mM de NaCl, pH 7], formamida al 50%, 1 ×
solución de Denhardt, 250 µg/ml de tARN de levadura, sulfato de dextrano al 10%)
que contenga 20 ng de la sonda marcada con digoxigenina. Después de desnaturalizar
durante 5 minutos a 95°C, se lleva a cabo la hibridación incubando los portas en una
cámara húmeda durante toda la noche a 42°C. La sonda se produce mediante la PCR
usando el par de cebadores antes descrito Bo-Boas e incorporando la digoxigenina. La
PCR se realiza tal como se describe en la sección sobre la PCR, salvo que se añaden 25
mM de DIG dUTP a la mezcla de reacción. Los pasos de detección se ejecutan
siguiendo las instrucciones del fabricante.
Controles positivos/negativos: obligatorios. Los controles positivos son los cortes de
tejidos de hospedadores infectados. Los controles negativos son los cortes de tejidos de
hospedadores no infectados.
Niveles de validación;
• Especificidad y sensibilidad: la especificidad es mayor que la de los métodos
histocitológicos. Sin embargo, la sonda Bo-Boas también es capaz de detectar
Haplosporidium nelsoni en Crassostrea virginica, Bonamia ostreae en Ostrea edulis, pero no
es capaz de detectar Mikrocytos mackini en C. gigas (2, 3). La sensibilidad de esta
prueba es mayor que la de los métodos histocitológicos y que la de la PCR. (5).
• Prueba de referencia: Si se compara con la aplicación combinada de la histología y
los frotis de corazón, y si se tiene en cuenta que estas últimas técnicas presentan un
100% de sensibilidad y de especificidad, la ISH muestra una sensibilidad del 100%
(mayor que la de la PCR) y una especificidad del 27,3% (5).
• Un resultado positivo corresponde a parásitos oscurecidos dentro de los hemocitos,
siendo negativos todos los controles negativos, y siendo positivos todos los
controles positivos.
Disponibilidad de las pruebas: kit de detección del ácido nucleico de la DIG, Boehringer
Mannheim.
• Purificación del agente: no.
• Métodos de detección indirecta
• Métodos serológicos: ninguno es aplicable.
4. VALORACIÓN DE LAS PRUEBAS SEGÚN SU FINALIDAD
En el cuadro 1 aparecen listados los métodos disponibles en la actualidad para vigilancia, detección y
diagnóstico de Bonamia ostreae. Los símbolos utilizados en el cuadro indican: A = se trata del método
recomendado por razones de disponibilidad, utilidad, así como por la especificidad y sensibilidad del
diagnóstico; B = se trata de un método estándar con buena especificidad y sensibilidad de diagnóstico;
C = el método es aplicable en algunas situaciones, pero su aplicación se ve seriamente limitada por
razones de coste, precisión y otros factores; y D = el método no se recomienda en la actualidad ni está
disponible para ese fin. Estas denominaciones (A, B, C y D) son un tanto subjetivas, puesto que están
implicadas cuestiones de fiabilidad, sensibilidad, especificidad y utilidad.
326
Cuadro 1. Bonamia exitiosa métodos de diagnóstico, detección y vigilancia
Método
Síntomas generales
Frotis de tejidos
Histopatología
PCR
PCR-RFLP
MET
Hibridación in situ
Vigilancia
En un
Fuera de un
huésped y
huésped y
ámbito
ámbito
geográfico
geográfico
conocidos
conocidos
D
D
A
B
B
A
B
B
D
D
D
D
C
C
Presuntivo
En un
Fuera de un
huésped y
huésped y
ámbito
ámbito
geográfico
geográfico
conocidos
conocidos
D
D
A
B
B
A
B
B
D
D
D
D
D
D
Confirmativo
D
D
D
B
A
A
B
MET = microscopía electrónica de transmisión; PCR = reacción en cadena de la polimerasa,
RFLP = polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción
5. CRITERIOS DE DIAGNÓSTICO CONFIRMATIVO
a)
Definición de un caso sospechoso
En especies susceptibles conocidas dentro de una variedad geográfica conocida de B. exitiosa, se
considera un caso sospechoso de infección con B. exitiosa un resultado positivo obtenido por
uno de los siguientes métodos: histopatología, frotis de tejidos, PCR o hibridación in-situ.
En otras especies hospedadoras o fuera de la variedad conocida de B. exitiosa, se considera como
un caso sospechoso la obtención de un resultado positivo por histopatología, por frotis de tejido,
por PCR o por hibridación in situ.
b)
Definición de un caso confirmado
Un caso confirmado de B. exitiosa consiste en un resultado positivo por frotis de tejido, por
histología o por hibridación in situ combinado con un resultado por PCR-RFLP.
6. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO/DETECCIÓN PARA DECLARAR LA AUSENCIA DE INFECCIÓN
Tal y como se detallan en el Manual de animales acuáticos, los métodos prescritos de vigilancia para
declarar la ausencia de infección son: los frotis de tejido (de corazón o de branquias), la PCR o la
histología.
REFERENCIAS
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*
* *
NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE especializado en Bonamia exitiosa (véase el cuadro al
final de este Manual de animales acuáticos o consúltese la lista actualizada en la página Web de la OIE:
www.oie.int).
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infección por bonamia exitiosa (bonamiosis)

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