enfermedad del herpesvirus koi
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enfermedad del herpesvirus koi
CAPÍTULO 2.1.17 ENFERMEDAD DEL HERPESVIRUS KOI 1. DEFINICIÓN DE LA ENFERMEDAD La enfermedad del herpesvirus koi (EHVK) consiste en la infección por un herpesvirus (17) capaz de inducir una viremia grave y contagiosa en la carpa común (Cyprinus carpio) y en otras variedades como la carpa koy y la carpa fantasma (15). 2. INFORMACIÓN PARA EL DISEÑO DE PROGRAMAS DE VIGILANCIA a) Factores del agente El agente etiológico es el herpesvirus koi (KHV) de la familia Herpesviridae (17, 40) que también ha recibido las denominaciones de virus de la nefritis intersticial y virus de la necrosis de las branquias (CNGV) (19, 28). Waltzek et al. (39) aportaron pruebas que sirven para clasificar el virus como un herpesvirus, y lo denominaron herpesvirus ciprínido 3 (CyHV-3) en congruencia con la nomenclatura de otros herpesvirus ciprínidos: CyHV-1 (virus de la viruela de la carpa, papiloma de los peces) y CyHV-2 (virus de la necrosis hematopoyética del pez rojo). Las estimaciones del tamaño del genoma KHV oscilan entre 150 kpb (11) y los 277 kpb (19) hasta los 295 kpb (39). Se han identificado cuatro genes que codifican la helicasa, una proteína tríplex intercapsomérica, polimerasa ADN, y proteína principal de la cápsida, y el análisis de secuencias de esos genes ha servido para demostrar que el KHV está estrechamente relacionado con el CyHV-1 y el CyHV-2, y tiene una relación lejana con el virus del bagre de canal (Ictalurid herpesvirus 1: IcHV-1) (39). También existen diversas estimaciones del tamaño de los viriones. La medición de las nucleocápsidas de virus con marcaje negativo dan 103–112 nm de diámetro rodeado por una envoltura (17, 19, 37). Las nucleocápsidas de virus finamente seccionados tienen un diámetro de 80–110 y 110–120 nm (4, 17, 26). Se ha demostrado que el suero de carpa con anticuerpos contra el KHV produce reacción cruzada con CyHV-1, lo que constituye un indicio adicional de la estrecha relación existente entre estos virus. Se ha demostrado la reacción cruzada de anticuerpos mediante enzimoinmunoensayo y pruebas de inmunoelectrotransferencia con sueros procedente de koi infectado con CyHV-1 o KHV (1). Las comparaciones de genomas de aislados de KHV procedentes de diversas zonas geográficas mediante análisis de enzimas de restricción (9, 15) o mediante análisis de secuencias de nucleótidos (13, 20, 29) han mostrado que aquellos son prácticamente idénticos. De igual forma, los polipéptidos de aislados de KHV procedentes de diferentes zonas geográficas han resultado ser similares, aunque un aislado de Israel contenía dos polipéptidos adicionales (7, 9). El virus se inactiva por radiación UV y exposición a temperaturas superiores a los 50°C durante 1 minuto. También se inactivan con los siguientes desinfectantes: yodóforo a 200 mg/litro durante 20 minutos, cloruro de benzalconio a 60 mg/litro durante 20 minutos, alcohol etílico al 30% durante 20 minutos e hipoclorito sódico a 200 mg/litro durante 30 segundos, todos ellos a 15°C (21). b) Factores relacionados con el hospedador Se han registrado infecciones naturales por KHV sólo en la capa común (Cyprinus carpio carpio), la carpa koy y la carpa fantasma (Cyprinus carpio goi) y en híbridos de esas variedades. Parece que los peces son susceptibles al KHVD a cualquier edad (4, 29, 36), pero en condiciones experimentales, 284 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006 Capítulo 2.1.17. - Enfermedad del herpesvirus koi los peces de 2,5–6 g son más susceptibles que los de 230 g (26). Se ha demostrado una resistencia variable al KHVD entre diversos tipos de carpa común (32) y otros estudios sugieren que la resistencia depende de la edad (26). La morbilidad de las poblaciones afectadas puede ser del 100%, y la mortalidad, del 70–80% (4, 38), pero ésta puede llegar al 90 o 100% (4, 37). Las carpas se cultivan a menudo en policultivos con otras especies de peces, pero no se han observado signos de la enfermedad en esas especies durante los brotes de EHVK, en condiciones normales de policultivo. Entre las especies reacias se encuentran el pez rojo (Carassius auratus), el amur (Ctenopharyngodon idellus), la carpa plateada (Hypophthalmichthys molitrix), la tenca (Tinca tinca), el esturión (Acipenser sp.) la tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus), la perca plateada (Bidyanus bidyanus) y el bagre de canal (Ictalurus punctatus) (4, 17, 26, 35). La enfermedad depende de la temperatura, y ocurre entre los 16–25°C (6, 17, 26, 29, 36, 37). En condiciones experimentales, la enfermedad ha causado una gran mortalidad a 28°C (10) pero no a 29 o 30°C (19, 25), ni a 13°C (10). Sin embargo, se detectó AND vírico en los peces mediante PCR a 13°C, y es posible que los peces infectados que sobreviven a bajas temperaturas constituyan reservorios del virus (10). El desarrollo de la enfermedad puede ser rápido. La misma se manifestará en 3 días si añadimos peces sanos a un estanque que contiene peces infectados (38), pero lo normal es que transcurran 8–21 días hasta que la enfermedad pueda observarse en los peces que estaban sanos (4, 17). No se sabe si en condiciones normales los supervivientes de la EHVK son infectados de forma persistente por el virus, y, en caso afirmativo, durante cuánto tiempo los peces retienen el virus. Se han investigado algunos de estos aspectos con peces infectados de forma experimental, hallándose que el virus podía persistir en la carpa infectada a una temperatura soportable y después podía mantenerse a temperaturas inferiores a la soportable (33). Las variedades de carpa común (Cyprinus carpio) constituyen en la actualidad el único hospedador de la EHVK y, por tanto, se las considera como las más susceptibles a la infección por KHV. Se ha publicado que los híbridos de pez rojo y carpa común, producidos por hibridación de pez rojo macho y carpa hembra, muestran cierta susceptibilidad a la infección por KHV. Aproximadamente el 50% de estos híbridos examinados a los 25 días de administrarles una inyección intraperitoneal con una dosis alta de KHV poseían ADN genómico vírico, lo que se detectó mediante PCR (18). En contraste con los descubrimientos realizados en otros lugares, datos experimentales procedentes de Alemania sugieren que el pez rojo y el amur son susceptibles al KHV, pero es precisa una confirmación adicional de estos hallazgos (14, 18). Al realizar muestreos durante los programas de vigilancia del KHV, se debería seleccionar de forma preferente la carpa común o variedades como la carpa koi o la carpa fantasma (koi × común) y a continuación cualesquiera híbridos de carpa común presentes en el lugar, como el híbrido pez rojo × carpa común. Por lo general, se mezclan especies de ciprínidos en sistemas de policultivo y existe un gran riesgo de transmisión del virus entre las diferentes especies durante los brotes de la enfermedad. Si se confirman los hallazgos de Alemania, a efectos de vigilancia, debería considerarse a todas las especies de ciprínidos como portadoras encubiertas potenciales de KHV. Los reservorios de la EHVK son los peces con infección clínica y los portadores encubiertos de virus entre los peces cultivados, asilvestrados o silvestres. Los virus virulentos se diseminan por las heces, la orina, las branquias y el moco de la piel. Sin embargo, la branquia, el riñón y el bazo son los órganos con mayor cantidad de virus durante el curso de la infección patente. (10). La forma de transmisión del KHV es horizontal pero no se puede descartar la transmisión asociada a los huevos (normalmente llamada transmisión “vertical”). La transmisión horizontal puede ser directa (de unos peces a otros) o vectorial, siendo el agua el mayor vector abiótico. Sin embargo, los vectores animados (ej. los parásitos invertebrados y los pájaros y mamíferos piscívoros) y los fomites también pueden estar implicados en la transmisión. Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006 285 Capítulo 2.1.17. - Enfermedad del herpesvirus koi c) Patrón de la enfermedad Los patrones de la enfermedad dependen de la temperatura del agua, la virulencia del virus, la edad y estado del pez, la densidad de la población y los factores estresantes. También es un factor importante el estado inmunológico del pez, y la inmunidad inespecífica (interferón) y específica (los anticuerpos del suero, inmunidad celular) desempeñan un papel importante en las infecciones por herpesvirus. La enfermedad clínica prevalece a temperaturas superiores a los 18°C cuando la respuesta del hospedador inmune es la óptima. La carpa infectada produce anticuerpos contra el virus que se han detectado mediante pruebas ELISA con dilución alta de suero. Se han detectado anticuerpos en el suero 3 semanas después de la infección experimental y en supervivientes un año después de la infección natural (1, 28, 33). En las carpas enfermas se observan con frecuencia infecciones concurrentes secundarias por bacterias y/o parásitos que pueden incidir en la mortalidad y el despliegue de signos de la enfermedad (15). Tras las primeras descripciones de la EHVK en Israel y Alemania (4, 16, 26), se ha ampliado el ámbito geográfico de la enfermedad. Ésta se ha extendido por países de todo el mundo, debido en primer lugar a la comercialización de la carpa koy antes de que se tuviera un mayor conocimiento de la enfermedad y de los medios para detectarla. Hoy día se sabe que ocurre o se ha descubierto en peces importado por al menos 21 países. En esa cifra están incluidos los siguientes países europeos: Austria, Bélgica, Dinamarca, Francia, Italia, Luxemburgo, Holanda, Polonia, Suiza y el Reino Unido (3, 6, 15, 30). En Asia, China (Hong Kong) (15), Indonesia (34, 35), Japón (29), Malasia (15, 22, 23), Singapur (en peces importados de Malasia), Taipei China (37) y Tailandia (en peces importados a Alemania (15)). También en Sudáfrica (15) y los EE.UU. de América (11, 16, 36) se ha descrito la existencia de la EHVK. Es probable que el virus exista en muchos otros países, pero aún no se ha identificado o descrito. d) Control y prevención Los métodos de control de la EHVK consisten sobre todo en evitar la exposición al virus junto con una buena higiene y prácticas de bioseguridad. Eso es factible en pequeños criaderos cuyas aguas proceden de manantial o de pozos y que cuentan con un sistema de seguridad que impide la entrada de peces al criadero por los desagües. Entre las medidas de bioseguridad está la de asegurarse de que los peces introducidos proceden de sitios libres de la enfermedad y un sistema de cuarentena por el que los peces nuevos se mantienen junto con peces testigo a temperaturas adecuadas para la EHVK. A continuación se mantiene a los peces en cuarentena durante un período mínimo de entre 4 semanas y 2 meses antes de transferirlos al sitio principal junto con los peces no infectados. Las medidas de higiene a aplicar en el sitio son similares a las recomendadas para la viremia primaveral de la carpa (VPC), e incluyen la desinfección de los huevos mediante tratamiento con yodóforos (21), la desinfección regular de los estanques, la desinfección química del equipamiento del criadero, la manipulación cuidadosa de los peces para evitarles estrés y la eliminación de los peces enfermos en condiciones de seguridad. En las instalaciones de crianza que cuentan con un entorno controlado, la subida de la temperatura del agua por encima de los 26–28°C puede reducir la mortalidad durante los brotes de EHVK (7, 28). La disminución de la densidad de existencias y el tratamiento de las infecciones secundarias también contribuyen a atenuar la gravedad de la enfermedad (35) En la actualidad no se dispone de una vacuna segura y efectiva de fácil acceso. Sin embargo, se ha usado virus atenuado para vacunar carpas y proteger a los peces de la amenaza del virus (25, 28). La vacuna utilizada provoca la aparición de anticuerpos contra el virus, pero se desconoce la duración de la protección. Esa vacuna está autorizada en Israel y se ha utilizado de forma amplia en los criaderos del país. 3. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO Puede obtenerse el diagnóstico de EHVK para peces clínicamente infectados mediante aislamiento del virus. Sin embargo, el virus se aísla en tan sólo un pequeño número de líneas celulares, pero el manejo 286 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006 Capítulo 2.1.17. - Enfermedad del herpesvirus koi de dichas líneas puede resultar difícil. Además, el aislamiento en cultivo celular no es tan sensible como los métodos basados en la PCR, cuya utilización para detectar el ADN del KHV ha sido descrita (15). Los métodos de inmunodiagnóstico, similares a los utilizados para el diagnóstico de la viremia primaveral de la carpa (ej. las pruebas de inmunofluorescencia [IF] o las pruebas ELISA), pueden ser adecuados para la identificación y el diagnóstico rápidos de la EHVK, pero no se han descrito, comparado ni validado de forma exhaustiva. En tanto no se disponga de pruebas validadas, el diagnóstico de la EHVK no debe basarse en una sola prueba sino en una combinación de dos o tres (15). La infección por KHV produce una respuesta de anticuerpos detectable en la carpa, y se ha publicado sobre enzimoinmunoensayos que sirven para detectar de forma fiable esos anticuerpos (1, 28). Se pueden utilizar tales métodos como pruebas rápidas presuntivas durante la fase aguda de la enfermedad; sin embargo, varios parámetros, como la especificidad y sensibilidad de los anticuerpos y la preparación de la muestra, pueden influir en los resultados y, como consecuencia, se debería ponderar con cautela un resultado negativo. La detección de anticuerpos puede ser un buen método para establecer la exposición previa al KHV en peces de apariencia sana, y hasta que no se elaboren métodos basados en la PCR que sean capaces de detectar de forma fiable el virus persistente en peces expuestos, las pruebas con anticuerpos pueden constituir las únicas herramientas de vigilancia disponibles. No obstante, debido al insuficiente conocimiento que se tiene de las respuestas serológicas de los peces a las infecciones víricas, la detección de anticuerpos de los peces contra los virus no se ha aceptado hasta el momento como método rutinario de análisis para determinar el estado vírico de las poblaciones de peces. En un próximo futuro podría realizarse la validación de ciertas técnicas serológicas para algunas infecciones víricas de los peces, propiciando que el uso de la serología con peces sea ampliamente aceptado para análisis sanitarios. El material de peces adecuado para el examen virológico es: • Peces asintomáticos (peces de apariencia sana): branquia, riñón, bazo, y encéfalo (peces de cualquier tamaño). • Peces clínicamente infectados: branquia, riñón, bazo, intestino y encéfalo (peces de cualquier tamaño). a) Métodos de diagnóstico de campo Durante el brote de EHVK se producirá un notable incremento de la mortalidad en la población. Todos los grupos de edad de los peces parecen ser susceptibles a la EHVK, aunque, por lo general, los peces más jóvenes de hasta un año de edad son más susceptibles a la enfermedad clínica. Los peces se tornan letárgicos, se separan del banco, se reúnen en la entrada de agua o en las orillas del estanque y boquean en la superficie del agua. Algunos peces pueden sufrir pérdida del equilibrio y desorientación, pero también pueden mostrar signos de hiperactividad. Al examinar de cerca a los peces, los signos clínicos que se observan son decoloración, palidez o enrojecimiento de la piel, que puede adquirir un aspecto rugoso, pérdida focal o total de la epidermis, y sobre- o infraproducción de moco en la piel y las branquias. Otras lesiones macroscópicas son enoftalmía (ojos hundidos), hemorragias en la piel y en la base de las aletas y erosión de las aletas. b) Métodos clínicos No existen lesiones macroscópicas patognomónicas. El diagnóstico final se producirá tras la detección directa de ADN o antígeno vírico en tejidos o el aislamiento e identificación del virus. Sin embargo, la patología general más consistente se observa en las branquias, y ésta puede variar desde placas necróticas de color pálido hasta una decoloración amplia, necrosis grave e inflamación. Un examen adicional puede revelar erosión de las laminillas primarias, fusión de las Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006 287 Capítulo 2.1.17. - Enfermedad del herpesvirus koi laminillas secundarias e hinchazón en los extremos de las laminillas primarias y secundarias. La presencia de otras lesiones internas es variable y a menudo no se presentan en casos de mortalidad repentina. Se han descrito otras lesiones macroscópicas, como adherencias en la cavidad abdominal con o sin coloración anormal de órganos internos (más claros o más oscuros). El riñón y el hígado pueden aumentar de tamaño e incluso pueden mostrar hemorragias focales o petequiales. La presencia de lesiones macroscópicas puede complicarse por el hecho de que los peces enfermos, sobre todo la carpa común, estén infestados por ectoparásitos como Argulus sp., Chilodonella sp., Cryptobia sp., Dactylogyrus sp., Gyrodactylus sp., Ichthyobodo sp., Ichtyophthirius sp., Trichodina sp. y monogéneos de las branquias, así como numerosas especies de bacterias. La histopatología de la enfermedad puede ser inespecífica y variable, pero la inflamación y necrosis de los tejidos branquiales son una constante. Las branquias también exhiben hiperplasia e hipertrofia del epitelio branquial y pueden observarse la fusión de las laminillas secundarias y la adhesión de filamentos branquiales. Se observa una necrosis, que produce desde pequeñas zonas de células epiteliales necróticas de las laminillas secundarias hasta la pérdida total de las laminillas. Las células epiteliales y leucocitos de las branquias pueden presentar una hinchazón nuclear destacada, marginación de la cromatina en forma de “anillo de sello”, y se han observado inclusiones intranucleares eosinófilas y difusas de color pálido. Se han observado inflamación, necrosis e inclusiones nucleares (separadas o juntas) en otros órganos, sobre todo en el riñón, pero también en el bazo, páncreas, hígado, cerebro, intestinos y epitelio oral. c) Métodos de detección e identificación del agente No presentaremos métodos en detalle porque no es abundante la comparación y validación de los métodos de detección e identificación del KHV. No obstante, se ofrece una breve descripción de los métodos sobre los que se ha publicado y están disponibles. La recomendación de los métodos habrá de basarse en el ensayo y validación adicionales y en la obtención de más datos de los laboratorios que han elaborado los métodos antes de decidir si son “aptos para el fin perseguido”. • Métodos de detección directa i) Aislamiento de KHV en cultivo celular Puede aislarse el virus en un pequeño número de cultivos celulares, pero el aislamiento en cultivo celular no es tan sensible como la PCR y no se le considera fiable como método de diagnóstico de la EHVK (15). El virus se replica en células de aleta de koi (KF-1) (17), aleta de carpa (CaF-2) y células de cerebro de carpa (CCB) (24), y células de aleta de carpa común o koy (19, 26, 28). Otras líneas celulares utilizadas de forma rutinaria para el aislamiento de virus patógenos de los peces como las células EPC, FHM, BF-2, CHSE-214 y RTG-2 son refractarias al virus (4, 19, 24, 37). El virus abunda sobre todo en los tejidos de branquia, riñón y bazo durante el curso de la infección patente (10) y se recomienda tomar muestras de estos tejidos para el aislamiento del virus. La temperatura óptima de incubación para el aislamiento del virus en células KF-1 o CCB es 20°C pero puede necesitarse una incubación de 8–12 días antes de que se observe el efecto citopático (ECP) (7). ii) Identificación del virus aislado en cultivo celular Deben identificarse de forma definitiva los virus aislados en cultivo celular, ya que se han aislado diversos virus en carpas que mostraban signos clínicos semejantes a los de la EHVK (5, 15). 288 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006 Capítulo 2.1.17. - Enfermedad del herpesvirus koi Métodos de identificación presuntiva rápida Los métodos de inmunodiagnóstico, similares a los utilizados para la identificación presuntiva del SVC (ej. pruebas IF o ELISA), pueden resultar adecuados para una identificación y diagnóstico rápidos de la EHVK (27, 32). Métodos de identificación confirmativa El método más fiable para la identificación confirmativa es la PCR, o una de sus variantes, que también se ha utilizado para identificar ADN de KHV en tejidos de peces (2, 8–11, 13, 19, 20, 27, 40). Se ha informado de que una PCR basada en el gen timidina kinasa (TK) de KHV resultó ser más sensible que los métodos PCR descritos por Gilad et al. (9) y Gray et al. (11), y puede detectar 10 fg de ADN KHV (2); la PCR de Ishioka et al. (20), basada en el gen de ADN polimerasa, detectó 100 fg de ADN de KHV. El método de la amplificación isotérmica mediada por lazos (LAMP) (13) también se basó en el gen TK de KHV, y resultó tan sensible como el método de la PCR elaborado por los mismos autores, pero fue más rápido que la PCR. La PCR descrita por Gray et al. (11) fue perfeccionada por Yuasa et al. (40), y ha sido incluida en las directrices oficiales japonesas para la detección del KHV. Es de esperar que se sigan perfeccionando las pruebas PCR de diagnóstico y se sigan validando según las recomendaciones del capítulo 1.1.3 de este Manual de animales acuáticos. Los protocolos de extracción de ADN y de aplicación de la PCR que se detallan a continuación para la detección directa del KHV en tejidos de peces También son adecuados para la identificación confirmativa de sobrenadantes de cultivos celulares infectados. iii) Métodos de diagnóstico para peces con enfermedad clínica Detección directa en tejidos de peces imprints Se ha identificado el KHV en los frotis obtenidos por improntas del hígado, riñón y cerebro de peces infectados mediante IF. Se observaron niveles muy altos de inmunofluorescencia positiva en el riñón y se pudo detectar el virus en un frotis de riñón 1 día después de la infección (27, 32). También se ha detectado antígeno vírico en tejidos infectados mediante un método de tinción con inmunoperoxidasa. El antígeno vírico se detectó en el riñón antes de 2 días después de la infección, y también se observó en las branquias y el hígado (27). No obstante la detección del KHV por inmunotinción debe interpretarse con precaución, ya que la tinción positiva de las células podría ser debida a la reacción cruzada con virus serológicamente relacionados (ej. CyHV-1) o una proteína novírica (27). En varios laboratorios de todo el mundo se están elaborando métodos ELISA para la detección directa del antígeno de KHV en tejidos infectados pero aún no se ha publicado sobre ninguno. Los métodos más comúnmente utilizados para la detección directa de KHV en tejidos de peces son los ensayos PCR específicos para KHV (véase más arriba el apartado sobre identificación confirmativa). En estudios realizados en el laboratorio Cefas Weymouth, se compararon conjuntos de cebadores publicados utilizando un protocolo de PCR estándar para la detección de ADN de KHV en tejidos de carpa (K. Way, datos no publicados). El conjunto de cebadores orientados al gen TK (2) fue el más sensible con un límite de detección tres log mayor que Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006 289 Capítulo 2.1.17. - Enfermedad del herpesvirus koi los cebadores de Gilad. Los cebadores CNGV (27) y los cebadores Gray SpH modificados que se orientan a pequeñas regiones del genoma (109 pb y 151 pb, respectivamente) también se desempeñaron bien, sobre todo en tejidos descompuestos. Más tarde, el conjunto de cebadores TK se desempeñaron bien en la aplicación de un método de prueba en anillo en 21 laboratorios de 19 países de todo el mundo (K. Way, datos no publicados). En el mismo estudio realizado en Cefas y mediante el método de prueba en anillo también se compararon kits comerciales de extracción de ADN según su capacidad de proporcionar ADN de KHV con calidad suficiente para su uso en pruebas PCR. De entre los kits comerciales evaluados en Cefas, el EasyDNA (Invitrogen), el DNeasy (Qiagen) y el reactivo DNAzol (Invitrogen) sirvieron para extraer ADN de calidad adecuada. En la prueba en anillo, dieron buenos resultados el High Pure PCR template preparation kit (Roche), el QIAamp DNA blood minikit (Qiagen) y el Puregene DNA purification kit. Sin embargo, en algunos laboratorios se halló que el reactivo DNAzol no era tan fiable. En el protocolo de preparación de muestras que se detalla más adelante se utiliza el reactivo DNAzol para la extracción de ADN de KHV. Se trata de un protocolo fácil, de corta duración y relativamente barato en comparación con otros kits. A los laboratorios que no están familiarizados con la extracción mediante DNAzol puede que este método les parezca menos fiable. No obstante, existen kits de extracción de ADN en el mercado (incluidos los mencionados anteriormente) que producen ADN de gran calidad adecuado para su uso en el protocolo de la PCR detallado. A continuación se ofrecen detalles sobre dos protocolos para PCR. En el primero se utiliza el conjunto de cebadores TK elaborados por Bercovier y sus colegas en la Escuela de Medicina de la Hebrew University-Hadassah de Israel (2). El segundo fue elaborado por Yuasa y sus compañeros en el National Research Institute of Aquaculture (NRIA), Watarai, Mie, Japón (40), y es una versión perfeccionada del protocolo elaborado por Gray et al. (11). De todos los métodos PCR de una sola reacción publicados, estos protocolos son considerados actualmente como los más sensibles para la detección de ADN de KHV en muestras de tejido fresco procedentes de carpas con la enfermedad clínica. Los mismos protocolos pueden servir para la detección de niveles subclínicos del virus. Si el tejido muestra signos de descomposición, puede ser preciso el uso de conjuntos de cebadores (véase más arriba) orientados hacia las regiones cortas del genoma en vez del conjunto de cebadores TK. Notas de tipo general La PCR suele producir resultados positivos falsos y negativos falsos. De ahí que cada prueba y extracción de tejido debe incluir un control negativo para descartar la contaminación. A fin de minimizar aún más el riesgo de contaminación, deben utilizarse los extremos de la pipeta para prevenir la aparición de aerosoles en cada paso de la preparación de la reacción PCR. Preparación de muestras 290 i) Para la extracción de tejidos de órganos, debe seguirse el procedimiento descrito en el capítulo I.1 (sección B.3.2). ii) Se añaden 100 µl de homogenizado de tejidos (1/10 [p/v]) o de sobrenadante de cultivo vírico a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga 1 ml de reactivo DNAzol®. Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006 Capítulo 2.1.17. - Enfermedad del herpesvirus koi iii) Se mezcla con suavidad invirtiendo el tubo cinco veces, se mantiene a temperatura ambiente 5 minutos y luego se centrifuga a 10.000 rpm durante 10 minutos utilizando una microcentrífuga. iv) Se separa 1 ml de sobrenadante y se añade a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga 0,5 ml de etanol. v) Se mezcla con suavidad invirtiendo el tubo cinco veces y manteniéndolo a temperatura ambiente durante 5 minutos; a continuación se centrifuga a 13.000 rpm durante 30 minutos utilizando un microcentrífuga. vi) Se separa el sobrenadante y se lava el precipitado con 250 µl de etanol al 70% en agua grado biología molecular. vii) Se centrifugan las muestras durante 5 minutos a 13.000 rpm. viii) Se separa el etanol con una pipeta y se seca al aire el precipitado dejando los tubos abiertos en la mesa durante 5 minutos. ix) Se resuspende el precipitado en 50 µl de agua grado biología molecular precalentada a 60°C, y se incuba a 60°C durante 5 minutes. Las muestras pueden guardarse a –20°C hasta que se necesiten. PCR Todas las reacciones PCR deben prepararse en una zona limpia y separada de la zona en la que se realizan las amplificaciones. Con ello se minimiza el riesgo de contaminación. Protocolo 1 (con cebadores TK de Bercovier) i) Para cada muestra, se prepara una mezcla base que contenga: Para Go-Taq Polimerasa: 10 µl 5 µl 0,5 µl 0,5 µl 0,5 µl 0,25 µl 30,75 µl Tampón de reacción (×10 conc.) MgCl2 (25 mM stock) dNTPs (25 mM de mezcla) [Promega Cat.no.U1240] Cebador directo (100 pmoles/µl de stock) Cebador inverso (100 pmoles/µl de stock) Go Taq polimerasa 500 µ (5 µ/µl) [Promega Cat.no.M8305] Agua grado biología molecular Cebadores TK de Bercovier: Directo = 5’-GGG-TTA-CCT-GTA-CGA-G-3’ Inverso = 5’-CAC-CCA-GTA-GAT-TAT-GC-3’ Tamaño del producto = 409 pb Para cada muestra, se colocan 47,5 µl en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml y pared delgada y se cubre con dos gotas de aceite mineral. ii) Se añaden 2,5 µl del DNAzol® extraído del ADN. Se guarda el resto de ADN a –20ºC. iii) Se colocan los tubos en un termociclador y se realiza el programa: 1 ciclo: 5 minutos a 94ºC 40 ciclos : 1 minuto a 95ºC 1 minuto a 55ºC 1 minuto a 72ºC Un paso de extensión final de 10 minutes a 72ºC. Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006 291 Capítulo 2.1.17. - Enfermedad del herpesvirus koi iv) Se aplica electroforesis a volúmenes del producto PCR de 20 µl en gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio (al 4% cuando se separen productos de amplificación más pequeños de <300 pb) a 120 V durante 20 minutos y se observan con luz UV. Se debe incluir en el gel una escala de peso molecular adecuada para determinar el tamaño del producto. v) Mediante el análisis de secuencias, deben confirmarse productos de tamaño correcto como KHV en origen. Protocolo 2 (con cebadores Sph de Gray/modificados por Yuasa) i) Para cada muestra, se prepara una mezcla base que contenga: Para la versión TaKaRa Ex Taq™ Hot Start: 2 µl 1,6 µl 0,2 µl 0,2 µl 0,1 µl 14,9 µl Tampón Ex Taq (×10 conc.) dNTPs (2,5 mM de mezcla) Cebador directo (50 pmoles/µl de stock) Cebador inverso (50 pmoles/µl de stock) TaKaRa Ex Taq™ HS polymerasa [Takara Bio Inc. Cat.no.RR006A] Agua grado biología molecular (Nota: la concentración final de MgCl2 en la mezcla base es 2mM) Cebadores Sph de Gray: Directo = 5’-GAC-ACC-ACA-TCT-GCA-AGG-AG-3’ Inverso = 5’-GAC-ACA-TGT-TAC-AAT-GGT-CGC-3’ Tamaño del producto = 292 pb Para cada muestra, se colocan 19 µl en un tubo de microcentrífuga de 0,2 ml y de pared delgada, y se cubre con dos gotas de aceite mineral. ii) Se añade 1µl del ADN extraído iii) Se colocan los tubos en un termociclador y se lleva a cabo el programa: 1 ciclo de: 30 segundos a 94ºC 40 ciclos de: 30 segundos a 94ºC 30 segundos a 63ºC 30 segundos a 72ºC Un paso de extensión final de 7 minutos a 72ºC. iv) Se añaden 3 µl de ×6 tampón de carga a cada producto PCR y se aplica electroforesis a 7 µl en del de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio a 100 V durante 20 minutos y se observa con luz UV. Se debe incluir en el gel una escala de peso molecular adecuada para determinar el tamaño del producto. v) Mediante el análisis de secuencias, deben confirmarse productos de tamaño correcto como KHV en origen. 4. CLASIFICACIÓN DE LAS PRUEBAS SEGÚN SU FINALIDAD En el cuadro 1 aparece la lista de métodos disponibles en la actualidad para la vigilancia, detección y diagnóstico de la EHVK. Los símbolos utilizados en el cuadro indican: A = se trata del método recomendado por razones de disponibilidad y utilidad, así como por la especificidad y sensibilidad del diagnóstico; B = se trata de un método estándar con buena especificidad y sensibilidad de diagnóstico; C = el método es aplicable en algunas situaciones, pero su aplicación se ve seriamente limitada por razones de coste, precisión y otros factores; y D = el método no se recomienda en la actualidad para ese fin. Estas denominaciones (A, B, C y D) son un tanto subjetivas, puesto que están implicadas cuestiones de fiabilidad, sensibilidad, especificidad y utilidad. Aunque no todas las pruebas de las 292 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006 Capítulo 2.1.17. - Enfermedad del herpesvirus koi categorías A y B se han sometido a estandarización y validación formales (al menos las fases 1 y 2 de la figura 1 del capítulo 1.1.2), su naturaleza rutinaria y el hecho de haber sido ampliamente utilizadas sin resultados dudosos las convierte en aceptables. Cuadro 1. Métodos de vigilancia, detección y diagnóstico de la EHVK Método Vigilancia para declarar la ausencia de infección Diagnóstico presuntivo de la infección o enfermedad Diagnóstico confirmativo de la infección o enfermedad Síntomas generales D B D Histopatología de tejidos y órganos D B C Aislamiento en cultivo celular D C D Ensayos basados en anticuerpos para detectar el antígeno del KHV (IFAT, ELISA) D B C MET D B C PCR con muestras de tejidos* C A A PCR – análisis de secuencias NA C A Detección de anticuerpos de KHV en peces expuestos (ELISA)** C C D IFAT = Prueba de inmunofluorescencia indirecta; ELISA = enzimoinmunoensayo; MET = microscopía electrónica de transmisión; PCR = reacción en cadena de la polimerasa. * Los virólogos especialistas en diagnóstico deben tener en cuenta que los peces recién vacunados contra el KHV pueden dar positivo en pruebas de PCR. En la actualidad no se dispone de información que indique la existencia de diferencia alguna de secuencias genómicas entre la cepa de vacuna atenuada y el KHV en estado natural (de tipo silvestre). En tanto no se disponga de información sobre esas secuencias, los laboratorios de diagnóstico no podrán distinguir entre el tipo silvestre de KHV y la cepa vacunal, lo que puede inducir a un diagnóstico equivocado. ** Los virólogos especialistas en diagnóstico deben tener en cuenta que los peces recién vacunados contra KHV pueden dar positivo mediante ELISA. También puede darse reacción cruzada de bajo nivel con anticuerpos contra CyHV-1. NOTA: Muchos laboratorios de diagnóstico pueden tener dificultades a la hora de conseguir anticuerpos contra KHV que sean adecuados para su uso en pruebas de inmunodiagnóstico. No obstante, es posible que pronto se disponga de un número limitado de anticuerpos monoclonales y policlonales de procedencia comercial. Es muy posible que pronto se pueda contar con kits de diagnóstico de la misma procedencia. 5. CRITERIOS DE DIAGNÓSTICO CONFIRMATIVO a) Definición de caso sospechoso Un caso sospechoso de KHVD se define como la presencia de signos clínicos típicos de la enfermedad en la población de peces susceptibles, o la presencia de histopatología típica en cortes de tejidos, o el típico efecto citopático (ECP) en cultivos celulares sin identificación del agente causal o un solo resultado positivo de una de las pruebas de diagnóstico descritas con anterioridad. b) Definición de caso confirmado Un caso confirmado se define como caso sospechoso con identificación ulterior del agente causal mediante uno de los métodos serológicos o moleculares anteriormente descritos, O un segundo Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006 293 Capítulo 2.1.17. - Enfermedad del herpesvirus koi resultado positivo a partir de una prueba de diagnóstico distinta y aplicada por separado de entre las descritas anteriormente. 6. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO/DETECCIÓN PARA ESTABLECER LA AUSENCIA DE INFECCIÓN En la actualidad no existen métodos recomendados para la vigilancia de poblaciones de peces susceptibles con el fin de establecer la ausencia de infección por KHV. No obstante, muchos laboratorios están investigando el desarrollo de métodos moleculares para incrementar la sensibilidad (ej. la PCR en tiempo real y la anidada) o para la detección fiable de niveles bajos de ADN de virus persistente. Dichos métodos pueden resultar fiables para los programas de vigilancia. REFERENCIAS 1. ADKISON M.A., GILAD O. & HEDRICK R.P. (2005). An enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of antibodies to the koi herpesvirus (KHV) in the serum of koi Cyprinus carpio. Fish Pathol., 40, 53–62. 2. BERCOVIER H., FISHMAN Y., NAHARY R., SINAI S., ZLOTKIN A., EYNGOR M., GILAD O., ELDAR A. & HEDRICK R.P. (2005). Cloning of the koi herpesvirus (KHV) gene encoding thymidine kinase and its use for a highly sensitive PCR based diagnosis. BMC Microbiol., 5, 1–9. 3. BERGMANN S.M., KEMPTER J., SADOWSKI J. & FICHTNER D. (2006). First detection, confirmation and isolation of koi herpesvirus (KHV) in cultured common carp (Cyprinus carpio L.) in Poland. Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol., 26, 97–104. 4. BRETZINGER A., FISCHER-SCHERL T., OUMOUNA M., HOFFMANN R. & TRUYEN U. (1999). Mass mortalities in koi carp, Cyprinus carpio, associated with gill and skin disease. Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol., 19, 182–185. 5. CHOI D.L., SOHN S.G., BANG J.D., DO J.W. & PARK M.S. (2004). Ultrastructural identification of a herpes-like virus infection in common carp Cyprinus carpio in Korea. Dis. Aquat. Org., 61, 165–168. 6. DENHAM K. (2003). Koi herpesvirus in wild fish. Vet. Rec., 153, 507. 7. GILAD O., YUN, S. ADKISON M.A., WAY K., WILLITS N.H., BERCOVIER H. & HEDRICK R.P. (2003). Molecular comparison of isolates of an emerging fish pathogen, koi herpesvirus, and the effect of water temperature on mortality of experimentally infected koi. J. Gen. Virol., 84, 2661–2667. 8. GILAD O., YUN S., ANDREE K., ADKINSON M., ZLOTKIN, A. BERCOVIER H., ELDAR A. & HEDRICK R.P. (2001). Characteristics of the koi herpesvirus (KHV) and development of a polymerase chain reaction (PCR) assay to detect the virus in koi Cyprinus carpio koi. Fish Health Newsletter, 29, 4. 9. GILAD O., YUN S., ANDREE K.B., ADKISON M.A., ZLOTKIN A., BERCOVIER H., ELDAR A. & HEDRICK R.P. (2002). Initial characteristics of koi herpesvirus and development of a polymerase chain reaction assay to detect the virus in koi, Cyprinus carpio koi. Dis. Aquat. Org., 48, 101–108. 10. GILAD O., YUN S., ZAGMUTT-VERGARA F.J., LEUTENEGGER C.M., BERCOVIER H. & HEDRICK R.P. (2004). Concentrations of a Koi herpesvirus (KHV) in tissues of experimentally infected Cyprinus carpio koi as assessed by real-time TaqMan PCR. Dis. Aquat. Org., 60, 179–187. 11. GRAY W.L., MULLIS L., LAPATRA S.E., GROFF J.M. & GOODWIN A. (2002). Detection of koi herpesvirus DNA in tissues of infected fish. J. Fish Dis., 25, 171–178. 12. GROFF J.M., LAPATRA S.E., MUNN R.J. & ZINKL J.G. (1998). A viral epizootic in cultured populations of juvenile goldfish due to a putative herpesvirus etiology. J. Vet. Diagn. Invest., 10, 375– 378. 13. GUNIMALADEVI I., KONO T., VENUGOPAL M.N. & SAKAI M. (2004). Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification. J. Fish Dis , 27, 583– 589. 294 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006 Capítulo 2.1.17. - Enfermedad del herpesvirus koi 14. HAENEN O. & HEDRICK R.P. (2006). Koi herpesvirus workshop. Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. (Section 2: Workshops), 26 (1), 26–37. 15. HAENEN O.L.M., WAY K., BERGMANN S.M. & ARIEL E. (2004). The emergence of koi herpesvirus and its significance to European aquaculture. Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol., 24, 293–307. 16. HEDRICK R.P., GILAD O., YUN S. & SPANGENBERG J.V. (1999). An herpesvirus associated with mass mortality of juvenile and adult koi Cyprinus carpio. Fish Health News, 27, 7. 17. HEDRICK R.P., GILAD O., YUN S., SPANGENBERG J.V., MARTY G.D., NORDHAUSEN R.W., KEBUS M.J., BERCOVIER H. & ELDAR A. (2000). A herpesvirus associated with mass mortality of juvenile and adult koi, a strain of common carp. J. Aquat. Anim. Health, 12, 44–57. 18. HEDRICK R.P., WALTZEK T.B. & MCDOWELL T.S. (2006). Susceptibility of koi carp, common carp, goldfish and goldfish x common carp hybrids to cyprinid herpesvirus-2 and herpesvirus-3. J. Aquat. Anim. Health, 18, 26–34. 19. HUTORAN M., RONEN A., PERELBERG A., ILOUZE M., DISHON A., BEJERANO I., CHEN N. & KOTLER M. (2005). Description of an as yet unclassified DNA virus from diseased Cyprinus carpio species. J. Virol., 79, 1983–1991. 20. ISHIOKA T., YOSHIZUMI M., IZUMI S., SUZUKI K., SUZUKI H., KOZAWA K., ARAI M., NOBUSAWA K., MORITA Y., KATO M., HOSHINO T., IIDA T., KOSUGE K. & KIMURA H. (2005). Detection and sequence analysis of DNA polymerase and major envelope protein genes in koi herpesviruses derived from Cyprinus carpio in Gunma prefecture, Japan. Vet. Microbiol., 110, 27–33. 21. KASAI H., MUTO Y. & YOSHIMIZU M. (2005). Virucidal effects of ultraviolet, heat treatment and disinfectants against koi herpesvirus (KHV). Fish Pathol., 40, 137–138. 22 LATIFF F.A. (2004). Current status of transboundary fish diseases in Malaysia: occurrence, surveillance, research and training. In: Transboundary Fish Diseases in Southeast Asia: Occurrence, Surveillance, Research and Training, Lavilla-Pitogo C.R. & Nagasawa K., eds. SEAFDEC Aquaculture Department, Tigbauan, Iloilo, Philippines, pp. 131–157. 23. MUSA N., LEONG N.K. & SUNARTO A. (2005). Koi herpesvirus (KHV) – an emerging pathogen in koi. Colloquium on Viruses of Veterinary and Public Health Importance, Bangi, Malaysia, 146–147. 24. NEUKIRCH M. & KUNZ U. (2001). Isolation and preliminary characterization of several viruses from koi (Cyprinus carpio) suffering gill necrosis and mortality. Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol., 21, 125–135. 25. PERELBERG A., RONEN A., HUTORAN M., SMITH Y. & KOTLER M. (2005). Protection of cultured Cyprinus carpio against a lethal viral disease by an attenuated virus vaccine. Vaccine, 23, 3396–3403. 26. PERELBERG A., SMIRNOV M., HUTORAN M., DIAMANT A., BEJERANO Y. & KOTLER M. (2003). Epidemiological description of a new viral disease afflicting cultured Cyprinus carpio in Israel. Israeli J. Aquaculture, 55, 5–12. 27. PIKARSKY E., RONEN A., ABRAMOWITZ J., LEVAVI-SIVAN B., HUTORAN M., SHAPIRA Y., STEINITZ M., PERELBERG A., SOFFER D. & KOTLER M. (2004). Pathogenesis of acute viral disease induced in fish by carp interstitial nephritis and gill necrosis virus. J. Virol., 78, 9544–9551. 28. RONEN A., PERELBERG A., ABRAMOWITZ J., HUTORAN M., TINMAN S., BEJERANO I., STEINITZ M. & KOTLER M. (2003). Efficient vaccine against the virus causing a lethal disease in cultured Cyprinus carpio. Vaccine, 21, 4677–4684. 29. SANO M., ITO T., KURITA J., YANAI T., WATANABE N., MIWA S. & IIDA T. (2004A). First detection of koi herpesvirus in cultured common carp Cyprinus carpio in Japan. Fish Pathol., 39, 165–167. 30. SCHLOTFELDT H.F. (2004). Severe losses of common carp in Germany due to Koi Herpesvirus (KHV). Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol., 24, 216–217. 31. SHAPIRA, Y., BENET-PERLBERG A., ZAK T., HULATA G. & LEVAVI-SIVAN B. (2002). Differences in resistance to Koi Herpes Virus and growth rate between strains of carp (Cyprinus carpio) and their hybrids. Israeli J. Aquaculture, 54, 62–63. Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006 295 Capítulo 2.1.17. - Enfermedad del herpesvirus koi 32. SHAPIRA Y., MAGEN Y., ZAK T., KOTLER M., HULATA G. & EVAVI-SIVAN B. (2005). Differential resistance to koi herpes virus (KHV)/carp interstitial nephritis and gill necrosis virus (CNGV) among common carp (Cyprinus carpio L.) strains and crossbreds. Aquaculture, 245, 1–11. 33. ST-HILAIRE S., BEEVERS N., WAY K., LE DEUFF R.M., MARTIN P. & JOINER C. (2005). Reactivation of koi herpesvirus infections in common carp Cyprinus carpio. Dis. Aquat. Org., 67, 15–23. 34. SUNARTO A., RUKYANI A. & ITAMI T. (2005). Indonesian experience on the outbreak of koi herpesvirus in koi and carp (Cyprinus carpio). Bull. Fish. Res. Agency, Supplement No. 2: 15–21. 35. TAKASHIMA Y., WATANABE N., YANAI T. & NAKAMURA T. (2005). The status of koi herpesvirus disease outbreaks in Lake Kasumigaura and Kitaura. Bull. Fish. Res. Agency, Supplement No. 2: 65– 71. 36. TERHUNE J.S., GRIZZLE J.M., HAYDEN K. & MCCLENAHAN S.D. (2004). First report of koi herpesvirus in wild common carp in the Western Hemisphere. Fish Health Newsletter. American Fisheries Society, Fish Health Section, 32, 8–9. 37. TU C., WENG M.C., SHIAU J.R. & LIN S.Y. (2004b). Detection of koi herpesvirus in koi Cyprinus carpio in Taiwan. Fish Pathol., 39, 109–110. 38. WALSTER C. (1999). Clinical observations of severe mortalities in koi carp, Cyprinus carpio, with gill disease. Fish Vet. J., 3, 54–58. 39. WALTZEK T.B., KELLEY G.O., STONE D.M., WAY K., HANSON L., FUKUDA H., HIRONO I., AOKI T., DAVISON A.J. & HEDRICK R.P. (2005). Koi herpesvirus represents a third cyprinid herpesvirus (CyHV-3) in the family Herpesviridae. J. Gen. Virol., 86, 1659–1667. 40. YUASA K., SANO M., KURITA J., ITO T. & IIDA T. (2005). Improvement of a PCR method with the Sph 1–5 primer set for the detection of koi herpesvirus (KHV). Fish Pathol., 40, 37–39. * * * NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE especializados en la enfermedad del herpesvirus koi (véase el cuadro al final de este Manual de animales acuáticos o consúltese la lista actualizada en la página Web de la OIE : www.oie.int) 296 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006