Revista científica trimestral del Instituto de Investigaciones de

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Revista científica trimestral del Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal
ISSN (impreso): 1562-3009
ISSN (digital): 1818-1686
VOL
UMEN 16
VOLUMEN
NÚMERO 2
MA
YO-A
GOSTO 2012
-AGOSTO
MAY
COMITÉ EDITORIAL
PRESIDENTE
Dr. Luis Pérez Vicente
MIEMBROS
Dra. Elina Massó Villalón
Dra. María Elena Márquez Gutiérrez
Dra. Gloria González Arias
Dr. Emilio Fernández Gonzálvez
Dr. Luis Vázquez Moreno
Lic. Arquímedes Bécquer Portuondo
Lic. Santiago Jiménez Jiménez
M.Sc. Ricardo García Castillo
Ing. Ana Ibis Elizondo Silva
Ing. Mercedes Sáenz Díaz
EDICIÓN Y CORRECCIÓN
Lic. Fermín Romero Alfau
Lic. Gladys Armas Sánchez
IMPRESIÓN
Téc. Román Lazo Rabaza
Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal, Cuba
VOL
UMEN 16
VOLUMEN
NÚMERO 2
JUNT
A DE ARBITRAJE
JUNTA
MA
YO-A
GOSTO 2012
MAY
-AGOSTO
Árbitros externos
Dr. Armando Aguilera Castro
Dra. Lérida Almaguel Rojas
Dr. Orlando Borrás Hidalgo
Dr. Alejandro Barro Cañamaro
Dra. Ileana Fernández García
Dra. Orietta Fernández-Larrea
Dra. Hortensia Gandarilla Basterrechea
Lic. Armando García Suárez
Dra. Gilda Guerra Rivera
Dr. Carlos González Muñoz
Dr. Horacio Grillo Ravelo
Dra. Mayra Heydrich Pérez
Dra. Annia Hernández Rodríguez
Dr. Lidcay Herrera Isla
Dr. Leopoldo Hidalgo Díaz
Dr. Benedicto Martínez Coca
Dr. Jesús Mena Campos
Dr. Julio Mena Portales
Dra. Ileana Miranda Cabrera
Dr. René Novo Sordo
Dra. Nilda Pérez Consuegra
Dr. Elio del Pozo Núñez
Dr. Miguel Ramos Leal
Dr. Héctor Rodríguez Morell
Dra. Mayra Rodríguez Hernández
Centro de Investigaciones Químicas, Cuba
Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología, Cuba
Facultad de Biología, Universidad de La Habana, Cuba
Instituto de Ecología y Sistemática, Cuba
Consultora, Cuba
Laboratorio Central de Cuarentena Vegetal, Cuba
Laboratorio Central de Cuarentena Vegetal, Cuba
Universidad Agraria de La Habana, Cuba
Universidad Central Marta Abreu, Villa Clara, Cuba
Universidad Central Marta Abreu, Villa Clara, Cuba
Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria, Cuba
Centro de Ingeniería y Biotecnología La Habana, Cuba
Instituto de Ecología y Sistemática, Cuba
Árbitros internos
Dr. Luis Pérez Vicente
M.Sc. Ángela Porras González
Dra. Marusia Stefanova Nalimova
Dr. Luis Vázquez Moreno
Árbitros internacionales
Dra. Edith Estrada Venegas
Dr. Benoit Farinas
Dr. Mauricio Guzmán Quesada
Dr. Aristóteles Pires de Matos
Dr. Guillermo Mondragón Pedrero
Dr. Miguel Nájera Rincón
Dr. Renato de Oliveira Resende
Dr. Abelino Pitty Cano
Dr. Benito Reséndiz García
Dr. Dorian Rodríguez
Dr. Eduardo Salazar Solís
Dr. Alexandre Specht
Dra. Mariana M. Viscarret
Dr. Elliot Watanabe Kitajima
Dra. María de Jesús Yáñez Morales
Colegio de Posgraduados. Instituto de Fitosanidad, México
UMR AGAP CIRAD, Guadalupe
Corporación Bananera Nacional de Costa Rica
Empresa Brasileña de Investigación Agropecuaria, Brasil
Universidad Autónoma de Chapingo, México
Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas
y Pecuarias, México
Departamento de Biología Celular, Universidad de Brasilia, Brasil
Escuela Agrícola Panamericana El Zamorano, Honduras
Universidad Autónoma de Chapingo, México
Universidad Centro Occidental Lisandro Alvarado, Venezuela
Universidad Guanajuato, México
Empresa Brasileña de Pesquisa Agropecuaria (EMBRAPA), Brasil
Instituto de Microbiología y Zoología Agrícola (INTA), Argentina
Escuela Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidad de Sao
Paulo, Brasil
Colegio de Postgraduados Campus Montecillo, México
Contenido
Diagnóstico fitosanitario
Hospedantes alternativos de Phakopsora pachyrhizi en campos de soya (Glycine max) de la provincia de Ciego de
Ávila, Cuba
Yasmiany Santana Torres, Einar Martínez de la Parte, Luis Pérez Vicente, Elio Rodríguez Bustamante y Roxany
Sánchez Marín
69
Ecología
Fluctuación poblacional de Brevipalpus phoenicis (Acari: Tenuipalpidae), vector de la leprosis de los cítricos en
Tabasco, México
Prisciliano Méndez Méndez, Saúl Sánchez Soto, Jesús Romero Nápoles y Carlos Fredy Ortiz García
73
Afectaciones causadas por Colletotrichum gloeosporioides en genotipos de Dioscorea alata en el municipio de
Santo Domingo, Cuba
Yuniel Rodríguez García, Dariel Cabrera Mederos, Maryluz Folgueras Montiel y Lilián Marisol Morales Romero
79
Epidemiología
Escala logarítmica diagramática de severidad de la antracnosis (Colletotrichum gloeosporioides) en papaya
(Carica papaya)
Manuel Jesús Zavala León y Jairo Cristóbal Alejo
83
Comunicación corta
Registro de plagas de albahaca blanca (Ocimum basilicum) bajo condiciones de cultivo protegido
Blanca Bernal Areces, Rafael Deroncelé Caigñet y Tomás Díaz Pérez
87
Identificación de aislados de Bacillus spp. mediante cromatografía gaseosa de los ésteres metílicos de ácidos grasos
(FAME)
Yamilé Baró Robaina, Marcia M. Parma, Itamar Soares de Melo y Deise M. Fontana Capalbo
91
Primera detección en Cuba de Hemicriconemoides mangiferae
Hortensia Gandarilla Basterrechea y Orlando Rivas Bofill
95
Diversidad de nematodos del suelo en una selva tropical mexicana
Horacio Salomón Ballina Gómez, Esther Herrera Canto, Cindi Kantun Pat, José Tun Suárez y Esau Ruiz Sánchez
97
Reseña
RNA-seq: herramienta transcriptómica útil para el estudio de interacciones planta-patógeno
Johana Carolina Soto Sedano y Camilo Ernesto López Carrascal
101
Contents
Phytosanitary diagnosis
Alternative Hosts of Phakopsora pachyrhizi in Soybeans Fields (Glycine max) of Ciego de Ávila Province,
Cuba
Yasmiany Santana Torres, Einar Martínez de la Parte, Luis Pérez Vicente, Elio Rodríguez Bustamante and
Roxany Sánchez Marín
69
Ecology
Population Fluctuation of Brevipalpus phoenicis (Acari: Tenuipalpidae), Vector of Citrus Leprosis in Tabasco,
México
Prisciliano Méndez Méndez, Saúl Sánchez Soto, Jesús Romero Nápoles and Carlos Fredy Ortiz García
Damages Caused by Colletotrichum gloeosporioides in Genotypes of Dioscorea alata in Santo Domingo
Municipality, Cuba
Yuniel Rodríguez García, Dariel Cabrera Mederos, Maryluz Folgueras Montiel and Lilián Marisol Morales
Romero
73
79
Epidemiology
Diagrammatic Logarithmic Scale of Severity for Anthracnose (Colletotrichum gloeosporioides) in Papaya
Fruit (Carica papaya)
Manuel Jesús Zavala León and Jairo Cristóbal Alejo
83
Short communication
Pests and Diseases that Affect White Basil (Ocimum basilicum) Growing under Protected Conditions
Blanca Bernal Areces, Rafael Deroncelé Caigñet and Tomás Díaz Pérez
87
Identification of Bacillus spp. Isolates by Gas Chromatographic of Fatty Acids Methyl Esters (FAME) Analysis
Yamilé Baró Robaina, Marcia M. Parma, Itamar Soares de Melo and Deise M. Fontana Capalbo
91
First Detection of Hemicriconemoides mangiferae in Cuba
Hortensia Gandarilla Basterrechea and Orlando Rivas Bofill
95
Soil Nematodos Diversity in a Mexican Tropical Forest
Horacio Salomón Ballina Gómez, Esther Herrera Canto, Cindi Kantun Pat, José Tun Suárez and Esau Ruiz
Sánchez
97
Review
RNA-seq as a Transcriptome Useful Tool for the Studies of Plant Pathogen Interactions
Johana Carolina Soto Sedano and Camilo Ernesto López Carrascal
101
Diagnóstico fitosanitario
Fitosanidad 16(2) agosto (2012) 69-72
Hospedantes alternativos de Phakopsora pachyrhizi en campos
de soya (Glycine max) de la provincia de Ciego de Ávila, Cuba
Yasmiany Santana Torres,1 Einar Martínez de la Parte,2 Luis Pérez Vicente,3 Elio Rodríguez Bustamante1
y Roxany Sánchez Marín1
Laboratorio Provincial Sanidad Vegetal Ciego de Ávila. Carretera Central, Extremo Oeste, Ciego
de Ávila, Cuba
2
Centro Nacional de Sanidad Vegetal. Laboratorio Central de Cuarentena Vegetal. Ayuntamiento 231
e/ San Pedro y Lombillo, Plaza de la Revolución, La Habana micologí[email protected]
3
Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, La Habana,
C.P. 11600 [email protected]
1
RESUMEN
ABSTRACT
La presencia de la roya asiática de la soya causada por Phakopsora
pachyrhizi, fue informada en Cuba en 2009. Se ha encontrado posteriormente en plantaciones de soya o habichuela en municipios de las
provincias de Matanzas, Villa Clara, Cienfuegos y Ciego de Ávila.
Internacionalmente se han informado diferentes especies de leguminosas silvestres como hospederos alternativos de P. pachyrhizi, pero
en Cuba no se habían identificado hasta el presente estos hospederos silvestres del patógeno. En enero de 2011 se desarrolló un brote
de la enfermedad en el municipio de Venezuela en Ciego de Ávila, y
se encontraron síntomas de roya con uredosoros y uredosporas tipo
Malupa, cuyas características morfológicas se corresponden con las
descritas para P. pachyrhizi en Desmodium sp. (amor seco) subfamilia
Faboideae; Cassia occidentalis L. (yerba hedionda) subfamilia
Cesalpinioideae y Macroptilium lathyroides (L.) Urb. (maribú) familia
Fabaceae. Se analizaron muestras de plantas afectadas de las tres
especies con el empleo de tiras inmunocromatográficas con un anticuerpo específico contra P. pachyrhizi y se obtuvo una reacción positiva en todos los casos. Estas malezas constituyen hospederos alternativos de P. pachyrhizi en Cuba, pueden mantener la enfermedad en
los períodos intercosechas de soya en el campo y constituir las
fuentes de inóculo en ciclos sucesivos de la enfermedad. Este trabajo constituye el primer informe de la presencia en Cuba de malezas
leguminosas hospedantes alternativos de la roya asiática de la soya.
Soybean rust, caused by Phakopsora pachyrhizi was reported in Cuba
in 2009. Since then, it has been found affecting soybean fields in
municipalities of Matanzas, Villa Clara, Cienfuegos and Ciego de
Ávila provinces. Wild leguminous species have been reported
internationally as alternative hosts of this rust, but these hosts had
not been so far identified in Cuba. During a new outbreak of the
disease occurred in Venezuela municipality in Ciego de Avila in
January 2011, rust symptoms containing anamorphic sori and
uredospores (Malupa-type) with morphological characteristics
matching with those described for P. pachyrhizi, were found on
Desmodium sp. (clover) subfamily Faboideae; Cassia occidentalis L.
(coffee senna) subfamily Cesalpinioideae and Macroptilium lathyroides
(L.) Urb. (wild bushbean) family Fabaceae. Positive reactions were
obtained when samples of these three species affected plants were
analyzed with inmunocromatographic strips with a specific antibody
against P. pachyrhizi. These plants are alternative hosts of P. pachyrhizi
in Cuba and can maintain the disease under favorable conditions
between soybean cropping seasons, and could serve as potential
inoculum sources for successive diseases cycles. This is the first
report of alternative host in Cuba for Asian soybean rust.
Key words: Phakopsora pachyrhizi, alternative hosts, Glycine max
Palabras claves: Phakopsora pachyrhizi, huéspedes alternativos,
Glycine max
INTRODUCCIÓN
La roya de la soya es causada por dos especies de hongos, Phakopsora pachyrhizi Syd. & P. Syd. y P. meibomiae (Arthur) Arthur [Ono et al., 1992], conocidos
como las royas asiática y americana de la soya, respectivamente. La roya asiática se encuentra entre las diez
enfermedades de mayor riesgo para la sostenibilidad
alimentaria a nivel mundial [Pennisis, 2010], y está
considerada como la enfermedad más devastadora que
afecta a la soya [Rodríguez et al., 2009]. Ha sido asociada a importantes pérdidas de rendimiento, variables
entre el 10 y el 70 % en función de la etapa del ciclo del
cultivo en que se presenta la enfermedad, las condicio-
Recibido: 9/5/2011
Aceptado: 5/11/2011
69
Fitosanidad 16(2) agosto (2012)
Santana et al.
nes climáticas imperantes y la eficacia de las medidas
de manejo implementadas a nivel de campo [CABI,
2007]. En Asia las pérdidas informadas oscilan entre el
15 y el 70 % [CABI, 2007], en Sudáfrica entre el 31 y el
60,9 % [Jarvie, 2009] y en Brasil entre el 30 y el 75 %
[Maciel et al., 2010].
Como otras especies de royas, P. pachyrhirizi es un patógeno obligado biotrófico, y los ciclos infecciosos en
campos de soya se inician a partir del inóculo del hongo
que persiste entre cosechas en hospedantes leguminosas vivas silvestres [Gevens et al., 2008], o es transportado a grandes distancias desde focos en campos de soya
y otros hospedantes desde otras regiones [Krupa et al.,
2006].
P. pachyrhizi y P. meibomiae son capaces de infectar a
un amplio rango de especies de plantas. P. pachyrhizi
puede infectar naturalmente plantas de 31 especies de
leguminosas pertenecientes a 17 géneros [Sinclair y
Hartman, 1996; CABI, 2007], mientras que P. meibomiae
puede infectar plantas de 42 especies de leguminosas
correspondientes a 19 géneros, y además, 24 especies de
plantas en 19 géneros son hospedantes para ambos
patógenos [Frederick et al., 2002]. Los principales
hospedantes naturales de P. pachyrhizi son Glycine max
(L.) Merrill (soya), G. soja Siebold & Zucc. (soya silvestre), Pachyrhizus erosus (L.) Urban., Pueraria
montana var. lobata (Willd.) Maesen & Almeida (kudzú)
y Vigna unguiculata (L.) Walp (habichuela), mientras
que para P. meibomiae los principales hospedantes naturales son Aeschynomene americana L., Canavalia
villosa Benth., Crotalaria anagyroides Kunth, G. max, Lablab
purpureus (L.) Sweet, Phaseolus lunatus L. y P. vulgaris L.
[CABI, 2007]. La relevancia de las numerosas posibilidades de hospedantes que presentan estos patógenos
es que pueden servir como reservorio de inóculo de un
ciclo de cultivo al siguiente [Jarvie, 2009].
La presencia de P. pachyrhizi en Cuba fue informada
en 2009 [Pérez et al., 2010]. Desde entonces, y como
parte del programa de vigilancia fitosanitaria para este
patógeno, el Laboratorio Central de Cuarentena Vegetal ha confirmado su presencia en cuatro oportunidades al afectar plantaciones de soya en los municipios de
Venezuela en Ciego de Ávila, Santo Domingo en Villa
Clara, Jovellanos en Matanzas y de habichuela en
Cienfuegos; sin embargo, en Cuba todavía se desconocen las malezas que le pueden servir como hospedantes
secundarios a este patógeno. El objetivo del presente
trabajo fue la búsqueda de hospedantes naturalmente
70
infectados, entre las leguminosas silvestres presentes
como malezas en los campos de soya en la provincia de
Ciego de Ávila.
MATERIALES Y MÉTODOS
Durante un brote de P. pachyrhizi en campos de soya
de la empresa Cubasoy, ocurrido a finales de 2010, se
realizaron muestreos en el municipio de Venezuela, provincia de Ciego de Ávila, donde existían informes previos de brotes de P. pachyrhizi. Se colectaron leguminosas silvestres, presentes como malezas, con síntomas
de roya. Las especies de malezas fueron identificadas
según los criterios taxonómicos de Acuña (1974) y
Rodríguez et al. (1988), y por comparación con material de referencia presente en el Laboratorio Provincial
de Sanidad Vegetal de Ciego de Ávila.
Las muestras con síntomas de roya fueron trasladadas
al Laboratorio Central de Cuarentena Vegetal para la
determinación de la especie de roya presente. A partir
de ellas se realizaron preparaciones fijas, las cuales fueron observadas bajo el microscopio óptico (Axioskop 40,
Carl Zeiss a 40X). Los especímenes de roya presentes
en las diferentes especies de malezas se caracterizaron
morfológicamente y se identificaron de acuerdo con los
criterios de Cummings (1959) y los de Anahosur y
Waller (1978).
Producto de la similitud morfológica entre ambas especies de Phakopsora, para la confirmación de la presencia
de P. pachyrhizi se utilizaron tiras inmunocromatográficas con un anticuerpo específico contra esta especie
(QuickStix, EnviroLogix, Portland, Estados Unidos),
y se utilizó el protocolo descrito en el kit diagnóstico.
La especificidad de este kit fue previamente comprobada en los ensayos realizados para la determinación
de la presencia por primera vez para Cuba de P. pachyrhizi [Pérez et al., 2010], en los cuales las muestras fueron analizadas en paralelo con las tiras inmunocromatográficas de este kit y mediante real-time
PCR según el protocolo descrito por Frederick et al.
(2002).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se encontraron síntomas de roya en Desmodium sp.
(amor seco) familia Papilionaceae (Fig. 1); Cassia
occidentalis L. (yerba hedionda) familia Caesalpinia, y
Macroptilium lathyroides (L.) Urb. (maribú) familia
Fabaceae. Las hojas en todos los casos contenían
uredosoros tipo Malupa, anfígenos, pulverulentos, diminutos, con paráfisis clavadas 25-45 μm, engrosadas
en su ápice hasta 18 μm y uredosporas sésiles, obovoides
a elipsoidales, (25-35 x 17-22,5 μm), densamente
equinuladas, pálidas a pardo amarillentas (Figs. 2 A y
B). Estas características coinciden con las descritas para
Phakopsora sp. [Cummings, 1959; Anahosur y Waller,
1978].
Figura 1. Síntomas de P. pachyrhizi en Desmodium sp. presentes en campos de soya
de la provincia de Ciego de Ávila.
Figura 2. Paráfisis (A) y uredosporas (B) de P. pachyrhizi. Bar = 30 μm.
Las muestras de las tres especies de plantas afectadas, al ser analizadas con las tiras inmunocromatográficas del kit QuickStix, dieron reacción positiva
en todos los casos, por lo que se confirmó la presencia
en ellas de P. pachyrhizi.
Este trabajo constituye el primer informe de la presencia en Cuba de malezas leguminosas silvestres,
hospedantes alternativos de la roya asiática de la soya.
Estas leguminosas pueden mantener la enfermedad bajo
condiciones favorables, y garantizar su supervivencia
en los períodos cuando no hay soya en producción, y
constituir las fuentes de inóculo potencial en ciclos sucesivos de la enfermedad. Se requiere en el futuro continuar la identificación de nuevas especies de malezas
que sirvan de hospedantes alternativos para esta roya,
y estudiar el comportamiento estacional de estas malezas en los campos para determinar su importancia
epidemiológica como fuentes de inóculo del patógeno.
CONCLUSIONES
• Se confirmó la presencia de P. pachyrhizi en
Desmodium sp., Cassia occidentalis y Macroptilium
lathyroides, lo que constituye el primer informe de la
presencia en Cuba de malezas leguminosas silvestres
hospedantes alternativos de la roya asiática de la
soya.
• El monitoreo de la presencia de P. pachyrhizi en estas especies de malezas debe ser tenido en cuenta en
los programas de manejo de la enfermedad.
71
Santana et al.
REFERENCIAS
Acuña, J.: Plantas indeseables de los cultivos cubanos, Instituto de
Investigaciones Tropicales. Academia de Ciencias, La Habana, 1974.
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Gevens, A. J.; N. Nequi; A. Vitoreli; J. J. Marois; D. L. Wright; C. L.
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Phakopsora pachyrhizi on Erythrina herbacea (Coral Bean)», Plant
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Krupa, S.; V. Bowersox; R. Claybrooke; C. W. Barnes; L. Szabo;
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Ono, Y.; P. Buritica; J. F. Hennen: «Delimitation of Phakopsora,
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Rodríguez, F. A.; H. S. S. Duarte; G. P. Domiciano; C. A. Souza; G. H.
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cultivo de la caña de azúcar, Ed. Científico-Técnica, La Habana,
1988.
Sinclair, J. B.; G. L. Hartman (Edts.): Proceedings of the Soybean Rust
Workshop, National Soybean Research Laboratory, J. B. Sinclair&
G. L. Hartman (Edts.) Publication No. 1, EE. UU., 1996.
Ecología
Fluctuación poblacional de Brevipalpus phoenicis (Acari:
Tenuipalpidae), vector de la leprosis de los cítricos
en Tabasco, México
Prisciliano Méndez Méndez,1 Saúl Sánchez Soto,1 Jesús Romero Nápoles2 y Carlos Fredy Ortiz García1
Colegio de Postgraduados, Campus Tabasco. A.P. 24, 86500, H. Cárdenas, Tabasco, México,
[email protected]
2
Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo. Km 36.5, carretera a México-Texcoco, 56230, Montecillo,
Texcoco, México
1
RESUMEN
ABSTRACT
La leprosis de los cítricos se detectó en el estado de Tabasco, México en 2006. El objetivo de este trabajo fue determinar la fluctuación
poblacional del ácaro vector de esta enfermedad, Brevipalpus
phoenicis (Geijskes). De octubre de 2009 a septiembre de 2010 se
realizaron muestreos quincenales de hojas en una plantación de 1 ha
de naranja Valencia (Citrus sinensis L. Osbeck) en la zona citrícola
de Tabasco (17°42'00" Norte, 93°28'26" Oeste). El ácaro se presentó
durante los doce meses considerados con mayor densidad de población en octubre y noviembre de 2009 y de abril a septiembre de 2010.
La población presentó un descenso bien marcado que inició en noviembre de 2009 y finalizó en enero de 2010, el cual coincidió con la
disminución de la temperatura y un aumento de la precipitación; asimismo, presentó un incremento bien notable de febrero a abril que
concordó con el aumento de la temperatura y la escasez de lluvias.
De mayo a septiembre la fluctuación poblacional no varió notablemente, al igual que la temperatura; sin embargo, en este período la
precipitación aumentó marcadamente, cuando se presentaron los
niveles más elevados. El análisis de Pearson indicó una correlación
alta de la fluctuación poblacional con la temperatura (r = 0,7878, P = 0,0023)
y una correlación muy baja con la precipitación (r = 0,1339, P = 0,6781). Se
deduce que la fluctuación poblacional de B. phoenicis en la zona de estudio depende más de los cambios de la temperatura que de la precipitación.
Citrus leprosis was detected in the State of Tabasco, Mexico in 2006.
The aim of this study was to determine the mite population fluctuation,
vector of this disease, Brevipalpus phoenicis (Geijskes). Leaves were
sampled biweekly from October 2009 to September 2010 in a plantation
of 1 ha planted with Valencia orange (Citrus sinensis L. Osbeck) in
the citric area of Tabasco (17°42’00"North, 93°28’26" West). Mite
was present during the 12 considered months, with the highest
population density in October and November 2009, and from April to
September 2010. Population presented a well marked descent that
began in November 2009 and finalized in January 2010, which
coincided with the temperature decrease and the precipitation
increase; likewise, it presented a well marked increase from February
to April that matched the temperature increase and rainfall scarcity.
From May to September population fluctuation did not varied
considerably as same as temperature. However, in this period
precipitation increased markedly showing the highest levels. Pearson
analysis indicated a high correlation of population fluctuation with
temperature (r = 0.7878, P = 0. 0023) and a very low correlation with
rainfall (r = 0.1339, P = 0 6781). It infers that population fluctuation of
B. phoenicis in the study area depends more on temperature than
precipitation changes.
Key words: Citrus sinensis, leprosis, Brevipalpus phoenicis
Palabras claves: Citrus sinensis, leprosis, Brevipalpus phoenicis
INTRODUCCIÓN
La leprosis de los cítricos es una enfermedad viral transmitida por ácaros del género Brevipalpus, la cual afecta de forma severa hojas, ramas y frutos de naranja
[Citrus sinensis (L.) Osbeck], y reduce la producción y
el valor comercial del cultivo, con pérdidas económicas
que pueden ascender a varios millones de dólares al año
y provocar la muerte de plantas cuando no se toman
medidas de control del ácaro vector [Rodríguez, 2000;
Goes et al., 2002; Bastianel et al., 2010]. Por ejemplo,
en Brasil, principal país productor de cítricos en el
mundo, la enfermedad causa pérdidas anuales de 60
millones de dólares, y el costo de control del vector
Recibido: 6/3/2012
Aceptado: 27/7/2012
73
Méndez et al.
Brevipalpus phoenicis (Geijskes), mediante productos
acaricidas, se estima en alrededor de 75 millones de dólares al año [Rodrigues, 2000; Bastianel et al., 2006].
La leprosis de los cítricos se detectó por primera vez en
México en 2004, en ocho municipios del sur del estado
de Chiapas. En el estado de Tabasco se detectó en 2006
en algunas plantas de naranja del municipio de
Huimanguillo, donde fue erradicada oportunamente; sin
embargo, la aparición de varios brotes en 2007 en toda
la zona citrícola de este municipio condujeron a declarar a dicho estado bajo cuarentena [Robles, 2010].
Se conocen diez especies de ácaros del género Brevipalpus
Donnadieu asociadas a plantas de cítricos en el mundo, de
las cuales tres, B. californicus (Banks), B. obovatus
Donnadieu y B. phoenicis (Geijskes) se citan como vectores
de la leprosis de los cítricos, pero solamente B. phoenicis
ha probado ser un vector eficaz [Childers et al., 2001;
Mesa et al., 2009]. Esta última especie es la que transmite la leprosis de los cítricos en el estado de Tabasco
[Izquierdo et al., 2011], donde se cultivan 8172 ha de
naranja [SIAP, 2012], y donde las acciones en contra de
esta enfermedad estuvieron orientadas hacia su erradicación para evitar su propagación y proteger la superficie nacional sembrada con este frutal, que abarca alrededor de 334 000 ha [Estrada, 2010].
El control de B. phoenicis es fundamental para el manejo de la leprosis de los cítricos [Goes et al., 2002], por
lo cual es importante contar con información básica
acerca de la biología y ecología de este ácaro con el fin
de implementar medidas racionales para su control
[Oliveira, 1986; Kennedy et al., 1996; Solano et al., 2008;
Childers y Rodríguez, 2011]. Debido a que en el estado
de Tabasco la presencia de esta enfermedad es relativamente reciente y no se cuenta con información local para
su manejo, se consideró relevante determinar la fluctuación poblacional del vector B. phoenicis en el cultivo de naranja durante las diferentes épocas del año y la
relación que tiene con la temperatura y precipitación
en esta zona de México.
El trabajo se realizó en una plantación de naranja Valencia de 1 ha constituida por 238 plantas en producción con cinco años de edad, distribuidas en marco real
de 6 m x 7 m, la cual se localiza en la ranchería Tierra
Nueva 3.ª Sección del municipio de Huimanguillo,
Tabasco, dentro de las coordenadas 17°42'00" Norte y
93°28'26" Oeste, a una altura de 40 msnm. El clima en
74
esta zona es cálido húmedo con lluvias en verano; la
temperatura media anual es de 26,1 oC y la precipitación acumulada es de 2,2 mm al año [Toledo y
Etchevers, 1988]. El suelo es franco arcilloso-arenoso
en los dos primeros horizontes y arcilloso en los horizontes más profundos, con pH moderadamente ácido
[Zetina et al., 2002].
Se realizaron 27 muestreos quincenales del 13 de octubre de 2009 al 29 de septiembre de 2010. Para ello se
seleccionaron al azar 35 árboles de naranja, los cuales
se marcaron con pintura vinílica roja. De acuerdo con
la información sobre la distribución espacial de B. phoenicis en plantas de naranja Valencia [Solano et al., 2008],
la parte media de la copa de cada árbol se dividió en
cuatro cuadrantes (norte, sur, este y oeste), y se recolectaron al azar cuatro hojas por cuadrante, para un
total de 16 hojas por árbol en cada fecha de muestreo y
un total de 15 120 hojas durante los doce meses estudiados.
Las hojas se colocaron en bolsas de polietileno de 30 cm x
25 cm, y se depositaron en una hielera para su transporte al laboratorio, donde se guardaron en un refrigerador. Al siguiente día se analizaron y se contabilizaron los ácaros en estado de larva, ninfa y adulto, con
ayuda de un microscopio estereoscópico. Muestras de
ácaros se enviaron al doctor Gabriel Otero Colina, del
Programa de Entomología y Acarología del Colegio de
Postgraduados, Campus Montecillo, municipio de
Texcoco, estado de México, quien identificó a la especie
como B. phoenicis.
Los datos de temperatura y precipitación se tomaron
de la estación meteorológica del Instituto Nacional de
Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, localizada en la misma zona fisiográfica donde se ubica
dicha plantación. Para realizar el análisis de correlación de Pearson entre la fluctuación poblacional de B. phoenicis con los datos de temperatura y precipitación se
utilizó el paquete estadístico SAS (2002).
Se colectaron 4911 individuos de B. phoenicis con un
promedio de 0,33 ácaros por hoja y 5,3 ácaros por planta. Con respecto a este último dato, Czermainski et al.
(2007) registran 6,9 individuos de B. phoenicis por planta en naranja Valencia en Brasil, donde esta especie se
presenta todo el año en el cultivo, aunque su densidad
poblacional se considera normalmente baja [Anónimo,
2005].
B. phoenicis se presentó durante los doce meses en la plantación de estudio y fue más abundante en octubre y noviembre de 2009 y de abril a septiembre de 2010, meses en
los cuales el promedio de ácaros varió entre 200 y 218; la
densidad poblacional más baja se registró de diciembre a
marzo, con promedios de 92 a 154 individuos (Fig. A).
Fluctuación poblacional de B. phoenicis (A), temperatura promedio en °C (B) y precipitación acumulada en mm (C), de octubre de 2009 a septiembre de 2010 en Huimanguillo, Tabasco, México.
75
Méndez et al.
La comparación gráfica de la fluctuación poblacional
de B. phoenicis con la fluctuación de los factores
climáticos en la zona estudiada (Figs. A-C) revela una similitud entre la fluctuación poblacional del ácaro (Fig. A)
con la fluctuación de la temperatura, la cual presentó
valores promedios desde 20 hasta 30 °C (Fig. B). El
valor del coeficiente de correlación de Pearson entre la
fluctuación poblacional de B. phoenicis y la temperatura fue r = 0,7878 (P = 0,0023) y, de acuerdo con
Bisquerra (2004), indica una correlación alta. Según
Solano et al. (2008), temperaturas entre 24 y 33 °C favorecen el desarrollo poblacional de B. phoenicis, lo que
concuerda con el presente trabajo, donde la mayor densidad de población se registró a temperaturas de 26 a
30 °C; contrariamente, la menor densidad poblacional
coincidió con la temperatura más baja registrada en
enero (Figs. A, B). El descenso de la temperatura afecta la biología de B. phoenicis prolonga su ciclo de vida
y ocasiona que las hembras coloquen menor cantidad
de huevos [Anónimo, 2004]. En otras regiones citrícolas
se considera que la temperatura tiene poca influencia
sobre la población de este ácaro, y que su fluctuación
depende más de la fenología de las plantas y del tipo de
tejido disponible por épocas a lo largo del año
[Czermainski et al., 2007].
Con respecto a la precipitación, el análisis de correlación
de Person presentó un coeficiente r = 0,13397 (P = 0,6781)
que indica una correlación muy baja [Bisquerra, 2004].
Estudios al respecto en otras regiones han demostrado
que la fluctuación poblacional de B. phoenicis es
inversamente proporcional a la precipitación, ya que
este factor climático afecta el desarrollo poblacional de
la especie, la que es más abundante en el período más
seco del año [Oliveira,1986; Chiavegato y Kharfan, 1993;
Solano et al., 2008], cuando las plantas están sometidas
a períodos de estrés hídrico [Anónimo, 2005]. La comparación gráfica de la fluctuación poblacional del ácaro
con la de este factor climático (Figs. A, C) muestra que
B. phoenicis incrementó su población entre febrero y
mayo, período en el cual las precipitaciones fueron escasas; no obstante, al aumentar las lluvias a partir de
junio hasta alcanzar su máximo nivel en agosto, se observa que la población no decayó, sino que presentó un
ligero aumento en coincidencia con altas temperaturas
(Fig. B). El descenso drástico de su población solo se
registró de noviembre a enero en concordancia con el
descenso de la temperatura y con un aumento de las
precipitaciones, a pesar de que estas últimas no fueron
tan intensas como las de julio a septiembre (Figs. A, C).
76
Lo anterior sugiere que de los dos factores climáticos
considerados, la temperatura tuvo mayor influencia en
la fluctuación poblacional de B. phoenicis en la zona
estudiada, y aunque sus valores fluctuaron en un rango aproximado de 10 °C (Fig. B), demuestran que los
cambios, aunque aparentemente mínimos comparados
con los de la precipitación, influyen significativamente
en el desarrollo poblacional de la especie. De acuerdo
con Kennedy et al. (1996), el ciclo de vida completo de
B. phoenicis criado en hojas de té a 26 °C es de 41,68 ±
5,92 días, y el tiempo de generación es de 27,6 días. En
consideración a lo anterior, es probable que este ácaro
presente cerca de 13 generaciones al año en la zona
citrícola de Huimanguillo, cuya temperatura media
anual es de 26,1 °C [Toledo y Etchevers, 1988].
Los resultados de este trabajo constituyen un aspecto
básico que puede ser útil para el combate de esta plaga
en la región citrícola del estado de Tabasco, donde es
necesario realizar más estudios con el fin de establecer
un programa de su manejo integrado. El conocimiento
de la densidad poblacional de B. phoenicis es el principal indicador para la toma de decisión de medidas de
control de la leprosis de los cítricos [Czermainski et al.,
2007]. En este contexto, las recomendaciones para el
muestreo de este ácaro en plantaciones de naranja en
Brasil indican que en el período de mayor crecimiento
poblacional los muestreos deben intensificarse con una
frecuencia de siete a diez días, y en las épocas de menor
abundancia cada quince días; asimismo, cuanto antes
se determine el momento del crecimiento de la población de B. phoenicis se tendrá mayor oportunidad para
el control de la enfermedad leprosis de los cítricos [Anónimo, 2005].
CONCLUSIONES
• B. phoenicis se presentó durante los doce meses estudiados en la zona citrícola del estado de Tabasco.
• El aumento y disminución de su población estuvieron asociados notablemente con el incremento y descenso de la temperatura.
• La fluctuación poblacional de la especie presentó
correlación alta con la temperatura y correlación muy
baja con la precipitación.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos al doctor Gabriel Otero Colina por su gran
apoyo en la identificación del ácaro Brevipalpus
phoenicis.
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77
Afectaciones causadas por Colletotrichum gloeosporioides
en genotipos de Dioscorea alata en el municipio
de Santo Domingo, Cuba
Yuniel Rodríguez García,1 Dariel Cabrera Mederos,2 Maryluz Folgueras Montiel1 y Lilián Marisol Morales
Romero1
Instituto de Investigaciones en Viandas Tropicales. Apartado 6, Santo Domingo, Villa Clara, Cuba,
C.P. 53 000 [email protected]
2
Universidad Central Martha Abreu. Carretera a Camajuaní, Km 5½, Santa Clara, Villa Clara, Cuba
[email protected]
1
RESUMEN
ABSTRACT
Dioscorea alata constituye una especie de importancia económica en
muchos países del mundo y se encuentra extendida en el área del
Caribe. La antracnosis, causada por Colletotrichum gloeosporioides,
es la enfermedad foliar de mayor importancia en el género Dioscorea
y produce afectaciones severas en esta especie. Este trabajo tuvo
como objetivo evaluar seis genotipos de D. alata ante las afectaciones producidas por C. gloeosporioides en en la región central de
Cuba. Con este propósito se calculó el índice de afectación producido por este agente patógeno, hasta los doscientos cuarenta días
posteriores a la plantación (dpp). Para evaluar el índice de afectación
se empleó una escala evaluativa de 0 a 5 grados. Los primeros síntomas visibles producidos por C. gloeosporioides se observaron a los
120 dpp, en el genotipo Blanco o Pelú, con el 20 % de severidad.
Aunque todos los genotipos fueron afectados a los 240 dpp, se constató menor afectación en el genotipo INIVIT Ñ 2008, seguido por
Pacala Duclos y Belep. Los genotipos Blanco o Pelú y Ñame de Agua
alcanzaron el 100 % de severidad. Estos resultados constituyen una
valiosa herramienta para la selección de genotipos menos susceptibles a C. gloeosporioides como una alternativa de manejo de este
agente patógeno.
Dioscorea alata is a species of economic importance in many countries
worldwide and is widespread in the Caribbean area. Anthracnose
disease caused by Colletotrichum gloeosporioides is the most important
foliar disease in Dioscorea genus and produces severe damages to
this species. This study aimed to assess damages caused by C.
gloeosporioides in six genotypes of D. alata in the central Cuban
region. The damage rate caused by this pathogen was calculated 240
days after planting (dap) in order to do so. To assess the damage rate,
a 0-5 grading scale was used. The first visible symptoms caused by
C. gloeosporioides were observed on Blanco o Pelú genotype 120 dap,
with 20 % severity. Although all genotypes were affected after 240 dap,
less damage was noticed in the INIVIT Ñ 2008 genotype, followed by
Pacala Duclos and Belep. Blanco o Pelú and Ñame de Agua genotypes
reached 100 % severity. These results constitute a valuable tool to
select genotypes which are less susceptible to C. gloeosporioides, as
an alternative way for managing this pathogen agent.
Key words: Colletotrichum gloeosporioides, Dioscorea alata, genotype
Palabras claves: Colletotrichum gloeosporioides, Dioscorea alata,
genotipo
INTRODUCCIÓN
Dioscorea alata L. constituye una de las especies de
mayor importancia económica a nivel mundial, y se
comercializa por su buen rendimiento y fácil propagación mediante bulbillos [Asiedu et al., 2003]. La
antracnosis, causada por Colletotrichum gloeosporioides
Penz., es una de las enfermedades más destructivas en
esta especie [Emehute et al., 1998], y puede producir
daños que alcanzan el 90 % en genotipos susceptibles
[Winch et al., 1984; Egesi et al., 2009]. La identificación
de genotipos tolerantes a esta enfermedad constituye
una táctica de manejo que se ha desarrollado para disminuir los costos en la aplicación de agroquímicos e
incrementar los rendimientos [Onyeka et al., 2006]. En
Cuba las investigaciones relacionadas con C. gloeosporioides en genotipos de ñame han sido insuficientes,
a pesar de presentarse condiciones favorables para el
desarrollo de epífitias de este agente patógeno. Este
trabajo tuvo como objetivo evaluar las afectaciones
Recibido: 26/6/2012
Aceptado: 29/7/2012
79
Rodríguez et al.
causadas por C. gloeosporioides en genotipos de D. alata
en condiciones de campo, en el municipio de Santo Domingo, Villa Clara, Cuba.
Los experimentos fueron conducidos en áreas experimentales del Instituto de Investigaciones de Viandas
Tropicales, municipio de Santo Domingo, Cuba. Los
genotipos de D. alata evaluados fueron Pacala Duclos,
IRAT 72, Belep, Ñame de Agua, Blanco o Pelú, INIVIT
Ñ 2008. El trasplante se realizó en parcelas de 1 m x 1 m
y se evaluaron 16 montículos de cuatro plantas por cada
genotipo. Las plantas evaluadas fueron sometidas a la
infección natural por C. gloeosporioides.
Para determinar la severidad producida por C. gloeosporioides a los doscientos cuarenta días después de plantadas (ddp) se empleó la fórmula de Townsend y
Heuberger (1943). Además, se utilizó una escala
evaluativa de 0 a 5 grados, según el porcentaje de área
foliar necrosada, donde 0 = planta sana, 1 = hasta 10 %,
2 = 11-30 %, 3 = 31-50 %, 4 = 51-75 % y 5 = 76-100 %
[Nwankiti, 1984].
El análisis estadístico de los datos se realizó mediante
el paquete estadístico Statgraphics Centurión versión XV-II de 2006. La severidad final y grado de afectación de la enfermedad se analizaron mediante la prueba no paramétrica de Kruskal Wallis.
Los primeros síntomas producidos por C. gloeosporioides se identificaron a los 120 ddp, en el genotipo
Blanco o Pelú, con el 20 % de severidad. En este momento, los demás genotipos evaluados no presentaron síntomas de la infección. A los 255 ddp, aunque
todos los genotipos fueron afectados por C. gloeosporioides, se constató menor severidad en el genotipo
INIVIT Ñ 2008, con el 35 %, seguido por Pacala
Duclos, Belep e IRAT 72. Los genotipos Blanco o Pelú
y Ñame de Agua alcanzaron el 100 % de severidad
(Tabla).
Severidad de C. gloeosporioides en genotipos de D. alata
en Santo Domingo, Villa Clara, Cuba
Genotipos
Pacala Duclos
IRAT 72
Belep
Ñame de Agua
Blanco o Pelú
INIVIT Ñ 2008
Categoría
Medias
reales
(grados)
Rangos
medios
MT
S
MT
S
S
T
2,5
3,0
2,8
5,0
5,0
1,8
31,5 c
46,5 b
39,0 bc
80,5 a
80,5 a
13,0 d
Severidad
Medias
reales (%)
50,0
60,0
55,0
100,0
100,0
35,0
EE
(±)
2,58
0,00
2,24
0,00
0,00
2,24
Valoración de genotipos de ñame a la severidad de la enfermedad con una escala de 1 a 5, donde
valores < 3 expresan tolerancia y≥ 3 susceptibilidad; T= tolerante; MT: Moderadamente
tolerante; S: Susceptible. Rangos medios con letras desiguales en una columna difieren según
Kruskal Wallis a p < 0,05.
Los resultados en cuanto a la tolerancia observada en
el genotipo Belep coinciden con lo informado por Green
y Simons (1992), quienes sugieren el uso de genotipos
menos susceptibles para su extensión y cultivo en el
Caribe, e incluyen este genotipo. Resultados similares
en cuanto a la tolerancia de este genotipo fueron señalados por McDonald et al. (1998) y Ano et al. (2005).
Además, Onyeka et al. (2006) evaluaron la reacción de 50
genotipos de D. alata a la infección por C. gloeosporioides
en condiciones semicontroladas y determinaron la tolerancia del genotipo Belep a C. gloeosporioides. En con80
sideración al potencial de propagación del genotipo Belep
y su tolerancia a C. gloeosporioides, es recomendable
extender su cultivo en Cuba, unido al resto de los
genotipos tolerantes y moderadamente tolerantes.
CONCLUSIONES
• Los genotipos con menor severidad, de tolerante y
moderadamente tolerante a la infección por C. gloeosporioides, fueron INIVIT Ñ 2008, Pacala Duclos y
Belep.
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1984.
81
Epidemiología
Escala logarítmica diagramática de severidad de la antracnosis
(Colletotrichum gloeosporioides) en papaya (Carica papaya)
Manuel Jesús Zavala León1 y Jairo Cristóbal Alejo2
Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias-CIRSE, Campo Experimental
Mocochá Km 25,5, antigua carretera a Mérida-Motul, Mocochá, Yucatán, México, C.P. 97454
[email protected]
2
Instituto Tecnológico de Conkal, Km 16.3, antigua carretera a Merida-Motul, Conkal, Yuc. México,
C.P. 97345
1
RESUMEN
ABSTRACT
La antracnosis, causada por Colletotrichum gloeosporioides, representa la enfermedad fungosa que más afecta la calidad de los frutos
de papaya en poscosecha. Se desarrolló un trabajo con el objetivo de
elaborar y validar una escala logarítmica diagramática de severidad
para el patosistema papaya-antracnosis. Para ello se inocularon 130
frutos de papaya con conidios de C. gloeosporioides a una concentración 1 x 10 6 conidios/mL. Los frutos inoculados al madurar manifestaron diferentes grados de severidad, la cual se estimó con ayuda de
programas computacionales. Posteriormente se fotografió cada cara
de los frutos y algunas imágenes con diferentes grados de daño que
se proyectaron a un grupo de 18 evaluadores sin experiencia, para
que estimaran la severidad con la escala previamente elaborada.
Los datos generados por cada evaluador se sometieron a un análisis
de regresión lineal simple. Se generó una escala de seis clases, que
abarcaban frutos sin daño hasta frutos con la mayor severidad calculada. El rango de precisión fluctuó entre 0,66-0,81 y la exactitud entre
0,78-0,95; sin embargo, la precisión y exactitud mejoraron o al menos se mantuvieron durante la segunda evaluación. La escala
logarítmica generada para el patosistema papaya-antracnosis puede
emplearse como una herramienta confiable, pues es fácil de usar,
resulta aplicable a un amplio rango de condiciones y, además, proporciona resultados reproducibles, rápidos y exactos.
Anthracnose caused by Colletotrichum gloeosporioides represents the
fungal disease that affects the quality of papaya fruits in postharvest.
A study was realized with the objective of develops and validates a
logarithmic scale for severity diagrammatic papaya anthracnose
pathosystem. This was inoculated with 130 conidia papaya fruits C.
gloeosporioides at concentration of 1 x 10 6 conidia per mL. The
inoculated fruits when ripe expressed different degrees of severity,
which was estimated using computer programs. Subsequently, each
face photographed fruit and some images with different degrees of
damage were projected to a group of 18 inexperienced evaluators to
estimate the severity scale developed previously. The data generated
by each evaluator were subjected to a simple linear regression analysis.
It generated a scale consisted of six classes, covering fruit without
damage to fruits with the highest severity calculated. Precision range
varied from 0.66 to 0.81 and accuracy from 0.78 to 0.95, however,
precision and accuracy were improved or at least maintained during
the second evaluation. The logarithmic scale generated for papaya
pathosystem anthracnose, can be used as a reliable tool, it is easy to
use, is applicable to a wide range of conditions and further provides
reproducible, rapid and accurate.
Key words: anthracnose, papaya fruit, fungal diseases, postharvest
decay
Palabras claves: antracnosis, papaya, enfermedades fungosas, enfermedades poscosecha
INTRODUCCIÓN
Las pérdidas poscosecha en papaya fluctúan entre 18 y
el 30% [Flórez et al., 2009]; sin embargo, la antracnosis,
causada por Colletotrichum gloeosporioides Penz., constituye la principal enfermedad en esta etapa. El síndrome
característico de la antracnosis inicia con una emisión de
látex sobre la superficie del fruto, seguido de una aparición de lesiones de color rojizo, que conforme avanzan se
tornan circulares, acuosas y con los márgenes claros y
translúcidos. En una severidad avanzada de la enfermedad, en el centro de la lesión se producen masas de esporas de color salmón [Álvarez y Nishijima, 1987].
En la actualidad se conoce poco acerca de la relación e
intensidad de la enfermedad (severidad o incidencia) y
pérdidas en los cultivos. Una de las razones es debido a
Recibido: 18/6/2012
Aceptado: 16/7/2012
83
Zavala y Cristóbal
lo costoso que resulta su medición y también porque
los métodos de medición son arbitrarios, de manera que
la información obtenida resulta imprecisa e inexacta
para la toma de decisiones de control. Una opción son
los métodos visuales que resultan ampliamente utilizados por su simpleza y costos. De estos métodos, el uso
de escalas logarítmicas basadas en el principio de WeberFechner resultan los más adecuados, ya que permiten
la asignación de clases con base en un sistema
logarítmico; además se incluye una representación fotográfica para cada clase o categoría de la enfermedad
[Tovar et al., 2002; Sherwood et al., 1983]. En este contexto se han implementado con éxito escalas logarítmicas diagramáticas en varios patosistemas agrícolas
[Cristóbal et al., 2006; Martins et al., 2004; Spósito et
al., 2004; Tovar et al., 2002]. Por lo anterior, el objetivo
del presente trabajo consistió en elaborar y validar una
escala logarítmica diagramática de severidad para el
patosistema papaya-antracnosis (Carica papayaColletotrichum gloeosporioides).
Elaboración de la escala logarítmica diagramática
Se colectaron 130 frutos de papaya cv. Maradol en madurez fisiológica de un huerto del municipio de Tekax,
Yucatán, México. Después de un acondicionamiento bajo
condiciones de laboratorio por 24 h, se procedió a lavar
los frutos con agua potable para eliminar polvo y residuos de campo, luego se desinfestaron con alcohol y
agua estéril, y por último se dejaron secar. Posteriormente se preparó una concentración de conidios de C. gloeosporioides a 1 x 106 conidios/mL, que se asperjó sobre los
frutos con ayuda de un atomizador de plástico de 500 mL,
se esperó a que se secaran y se colocaron dentro de cajas plásticas con algodón húmedo, donde se mantuvieron bajo condiciones de laboratorio por un período de
diez días, momento en que los frutos comenzaron a
madurar, y se procedió a la estimación de la severidad
de la antracnosis. Para ello, cada cara del fruto se fotografió con una cámara digital (Olympus), luego cada
imagen se procesó con ayuda del programa Photo Magic
(versión 1.0 de Micrografx Inc.), donde se diferenció
la parte dañada con rojo y la parte sana con azul rey,
después con el programa Image Tool (versión 1.28 de
la Universidad de Texas). Cada imagen se redujo a
blanco y negro para estimar el área sana y enferma de
cada fruto. El máximo porcentaje de severidad obtenido se introdujo al programa 2 log, así como el número de clases, según el criterio de una distribución
84
normal de los porcentajes calculados y sin exceder un
número no práctico de clases, y se procedió a validar
la escala.
Validación de la escala logarítmica diagramática
Para la validación de la escala se realizaron dos evaluaciones con 18 evaluadores que emplearon la escala previamente elaborada para valorar 50 de los 130 frutos
fotografiados. Catorce días después de la primera evaluación se proyectaron nuevamente las imágenes a los
mismos evaluadores con la finalidad de evaluar la
reproducibilidad de la escala.
Análisis de los datos
La precisión y exactitud visual estimada por cada
evaluador se determinó mediante un análisis de regresión lineal simple, en el que se consideró a la severidad
real como variable independiente, y a la severidad estimada como variable dependiente. La precisión y
exactitud de cada evaluador correspondió al valor del
coeficiente de determinación (r2) y pendiente (b1), respectivamente [Tovar et al., 2002, Nutter y Schultz, 1995;
Campbell y Maden, 1990].
La escala logarítmica diagramática generada para cuantificar la severidad de la antracnosis en frutos de papaya constó de siete clases o niveles de severidad, donde
correspondió la clase 0 a frutos sin daño, y la 7 a frutos
con el máximo porcentaje de daño o severidad estimado, que fue del 60,92 % (Figura).
En la validación de la escala se formaron dos segmentos de evaluadores, uno comprendido por los evaluadores
del 1-9 y otro del 10-18. Durante la primera evaluación, el segmento de evaluadores del 1-9 obtuvo un rango de precisión (r2) de 0,66-0,81, y una exactitud (b1)
entre 0,78-0,95; sin embargo, la precisión y exactitud
mejoró o al menos se mantuvo durante la segunda evaluación (Tabla). Esta tendencia de mejora entre evaluaciones resulta común en otros patosistemas [Cristóbal et al., 2006; Villanueva et al., 2005], y se debe
principalmente al conocimiento acerca de los síntomas
de la enfermedad y al uso de la escala adquirido en la
primera evaluación [Tovar et al., 2002]. Por su parte,
en los evaluadores del segundo segmento (10-18) se observó una tendencia contraria a los evaluadores del primero, ya que inicialmente lograron una precisión entre
0,68-0,84 y una exactitud entre 0,82-0,96; sin embargo,
ambos atributos disminuyeron para la segunda eva-
luación. Al respecto, Sherwood et al. (1983) mencionaron que existen factores externos como el tamaño y
color de la lesión, la intensidad de luz, la fatiga del
evaluador al momento de la evaluación, que afectan la
precisión y exactitud de las evaluaciones visuales. Además, es importante señalar que ambos segmentos de
evaluadores mostraron una tendencia a subestimar
positivamente la severidad de la enfermedad.
Escala logarítmica diagramática para
evaluar la severidad de la antracnosis
en el patosistema Carica papayaColletotrichum gloeosporioides.
Coeficiente de determinación y pendiente de la regresión lineal
simple obtenidos entre la severidad de la antracnosis
estimada por cada evaluador, con auxilio de la escala
diagramática, y la severidad real
Evaluador
Primera evaluación
Segunda evaluación
r2
b1
R2
b1
1
0,73
0,78
0,80
0,83
2
0,70
0,86
0,82
0,90
3
0,81
0,82
0,81
0,84
4
0,75
0,90
0,79
1,00
5
0,81
0,95
0,81
0,88
6
0,76
0,80
0,76
0,80
7
0,66
0,81
0,81
0,82
8
0,75
0,79
0,87
0,80
9
0,66
0,84
0,78
0,83
10
0,76
0,82
0,67
0,71
11
0,68
0,84
0,65
0,91
12
0,82
0,82
0,78
0,85
13
0,84
0,88
0,83
0,88
14
0,78
0,83
0,70
0.80
15
0,80
0,94
0,72
0,87
16
0,80
0,92
0,74
0,90
17
0,72
0,87
0,71
0,79
18
0,82
0,96
0,79
0,96
85
Zavala y Cristóbal
Basado en estos resultados, la escala logarítmica generada para el patosistema papaya-antracnosis puede
emplearse como una herramienta confiable, ya que proporciona resultados reproducibles, rápidos y exactos
[Nutter et al., 1993].
CONCLUSIONES
• La escala diagramática propuesta para la evaluación de
la severidad de la antracnosis en papaya en poscosecha
demostró ser de fácil uso y confiable, cumple con las
condiciones de facilidad de uso y es capaz además de
proporcionar estimaciones rápidas de la enfermedad con
una buena precisión, exactitud y reproducibilidad.
• La escala se puede emplear como una guía en la toma
de decisiones en los esquemas de certificación de calidad de las empacadoras; también puede ser usado por
asesores y profesionales fitosanitarios encargados de
realizar pruebas de efectividad biológica de plaguicidas
para verificar niveles de control de la enfermedad.
AGRADECIMIENTOS
Esta publicación es producto del proyecto «Estrategias para el mejoramiento de la papaya» con número
SINASO: 159570287.
REFERENCIAS
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Villanueva, E.; M. A. Sánchez; J. Cristóbal; E. Ruiz; J. M. Tún: «Diagnóstico y alternativas de manejo del tizón foliar (Alternaria chrysanthemi
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Ramat.) Kitamura en Yucatán, México», Revista Mexicana de
Fitopatología 23 (1): 49-56, 2005.
Comunicación corta
Registro de plagas de albahaca blanca (Ocimum basilicum) bajo
condiciones de cultivo protegido
Blanca Bernal Areces, Rafael Deroncelé Caigñet y Tomás Díaz Pérez
Instituto de Investigaciones Hortícola Liliana Dimitrova. Carretera a Bejucal Km 33½, Quivicán,
Mayabeque, Cuba, [email protected]
RESUMEN
ABSTRACT
La albahaca (Ocimun bacilicum L.) pertenece a la familia de las
labiadas, hierba aromática anual nativa de la India y otras regiones
tropicales de Asia, que lleva más de cinco mil años de cultivada. Con
el objetivo de determinar las plagas y enfermedades que inciden
sobre el cultivo de la albahaca en condiciones protegidas, se
desarrolló un experimento en una plantación de albahaca blanca
variedad Genovesa en el Instituto de Investigaciones Hortícola Liliana
Dimitrova, del municipio de Quivicán, provincia de Mayabeque, de
marzo a junio de 2009. Semanalmente, a partir del trasplante, se
muestrearon raíces, hojas, tallos y flores que se revisaron mediante
observaciones al microscopio estereoscópico y microscopio óptico.
Las enfermedades observadas en la albahaca blanca, bajo condiciones protegidas, correspondieron a los patógenos fúngicos
Peronospora sp., Rhizoctonia sp. y Fusarium oxysporum Sch., y los
artrópodos plagas Pachnaeus litus Germar, Atta insularis Guer. y
Polyphagotarsonemus latus Banks. Se informa por primera vez el
picudo verde azul (Pachnaeus litus Germar) como insecto fitófago en
O. basilicum en el país.
Basil (Ocimum bacilicum L.) belongs to Labiatae family, is an annual
herb native from India and other tropical regions of Asia, with more
than 5000 years of cultivation. In order to identify the pests and
diseases that affect the basil growing in protected conditions, an
experiment was developed in white basil planting of Genovesa variety,
in the Horticultural Research Institute Liliana Dimitrova (IIHLD), in
the municipality of Quivicán, from Mayabeque province, during the
months of March to June 2009. Samples of roots, leaves, stems and
flowers were taken weekly from transplantation, and were reviewed by
observations with stereomicroscope and light microscope. Diseases
observed in white basil under protected conditions corresponded to
the fungal pathogens Peronospora sp. Rhizoctonia sp. and Fusarium
oxysporum Sch., and arthropod Pachnaeus litus Germar, Atta insularis
Guer. and Polyphagotarsonemus latus Banks. Blue green weevil
(Pachnaeus litus Germar) was reported for the first time as
phytophagous insect on O. basilicum in the country.
Key words: pests, white basil, protected crop
Palabras claves: plagas, albahaca, cultivo protegido
La albahaca pertenece a la familia de las labiadas, hierba aromática anual nativa de la India y otras regiones
tropicales de Asia, que lleva más de cinco mil años de
cultivada. En muchos países este vegetal tiene uso medicinal, culinario y religioso. Se piensa que fue una de
las primeras plantas introducidas por los colonizadores en el Nuevo Mundo. El crecimiento de las variedades de la albahaca es diferente de una a otra especie; las
hojas son opuestas de un verde lustroso, ovales u ovadas,
dentadas, de textura sedosa. Toda la planta despide
un intenso olor aromático. Existe un gran número de
cultivares de diferentes tamaños, forma, color y olor.
Se considera que hay más de ciento cincuenta especies
[Deroncelé et al., 2009]. En las condiciones de Cuba la
albahaca se desarrolla bien en suelos ferralíticos rojos
de La Habana y Matanzas. Las enfermedades foliares
y vasculares registradas en este cultivo en el país son
ocasionadas por hongos de los géneros Cercospora,
Curvularia, Alternaria y Fusarium [Marrero et al., s/a].
Con el objetivo de determinar las plagas y enfermedades que inciden sobre el cultivo de la albahaca en condiciones protegidas se desarrolló un experimento en una
plantación de albahaca blanca variedad Genovesa en el
Instituto de Investigaciones Hortícola Liliana Dimitrova, del municipio de Quivicán, provincia de
Recibido: 2/5/2012
Aceptado: 31/6/2012
87
Bernal et al.
Mayabeque, en un suelo ferralítico rojo compactado
[Hernández et al., 2000] en una instalación de cultivo
protegido Averirit (GBM-Israel), de marzo a junio de
2009. Semanalmente, a partir del trasplante, se
muestrearon raíces, hojas, tallos y flores las que posteriormente se revisaron mediante observaciones al microscopio estereoscópico y microscopio óptico, en el laboratorio de Fitopatología de IIHLD para aislar e
identificar los agentes nocivos (patógenos y artrópodos
plagas). Para la determinación de los géneros se utilizaron manuales y claves de descripciones publicadas al
respecto.
En la tabla se pueden apreciar los diferentes agentes
nocivos registrados. En las plantas con cincuenta días
de edad se visualizaron diferentes manchas foliares de
aspecto clorótico, distribuidas por el haz de las hojas;
tres días después se presentó por el envés un crecimiento polvoriento de color pardo grisáceo, el cual provocó
una abundante defoliación. Por sus características
morfológicas y patogénicas el microorganismo se identificó como Peronospora sp. de la clase Oomycetes, orden Peronosporales, de acuerdo con lo planteado por
Martínez et al., (2009) para esta patología, como una
nueva enfermedad del O. basilicum en Cuba.
Con sesenta días de establecido el cultivo se detectaron
síntomas en tallos y raíces (desde el cuello de la raíz) en
forma de manchas pardo oscuras con zona atizonada.
El agente causal de esta enfermedad fue identificado
por sus características etiológicas como el hongo
Rhizoctonia sp. [Mordue, 1974]. Durante el mismo período también se presentaron en algunas plantas clorosis
foliar, marchitamiento y muerte prematura; esta infección fue ocasionada por el hongo fitopatógeno
Fusarium oxysporum Schl. [Booth, 1977], enfermedad
señalada con anterioridad en el país [Armas et al., 2001].
Posterior a las patologías antes mencionadas, a los sesenta y cinco días también se observaron daños de hojas masticadas y plantas cortadas, cuyos insectos causantes se identificaron como picudo verde azul
(Pachnaeus litus Germar) (Coleóptero: Curculionidae)
[Blackwelder, 1947] y bibijagua (Atta insularis Guer.)
(Formicidae: Hymenóptera) [Bruner y Valdés, 1949].
La primera plaga se presentó ocasional y por primera
vez en la albahaca blanca, por lo que este resultado representa el primer registro de este organismo en Cuba;
otras infestaciones fueron el encrespamiento en las hojas y brotes deformados ocasionados, según reconocimiento visual y manuales de descripciones, por el ácaro blanco (Polyphagotarsonemus latus Banks) (Acari:
Tarsonemidae) [Krantz, 1978].
Las plagas observadas en la albahaca blanca bajo condiciones protegidas fueron tres enfermedades fúngicas y tres
artrópodos. Se informa por primera vez el picudo verde
azul como insecto fitófago en O. basilicum en el país.
Registro de las plagas en la albahaca blanca
Síntomas y daños
Agente causal
Aparición
(días)
Situación
Mildiu
Peronospora sp.
50
Hojas
Tizón
Rhizoctonia sp.
60
Cuello de la raíz y tallo
Marchitez
Fusarium oxysporum
60
Toda la planta
Brotes deformados
y encrespamiento
en las hojas
Polyphagotarsonemus
latus
65
Brotes vegetativos y
hojas
Hojas cortadas
Pachnaeus litus
65
Hojas
Planta cortada
Atta insularis
65
Planta
REFERENCIAS
Armas, Georgina de; B. Ramos; R. Ramos; Y. Hernández; J. Miguel; M. O.
López: «Primer reporte en Cuba de Fusarium oxysporum Schelecht
en albahaca verde», Fitosanidad 5 (3): 45-46, Cuba, 2001.
Blackwelder, R. E.: «Checklist of the Coleopterous Insects of México,
Central America, the West Indies and South America. Part 5,
88
Curculionidae», Bull. USA National Museum No 185: 791-921, EE. UU.,
1947.
Booth, C.: Fusarium. Laboratory Guide to the Identification of the
Major Species, CMI. Commonwealth Mycological Institute Kew,
Surrey, Inglaterra, 1977.
Bruner, S. C; F. Valdés: «Observaciones sobre la biología de la bibijagua
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técnico del cultivo de la albahaca (Ocimum basilicum L.) en Cuba»,
www.fao.org/docs/eims/upload/cuba/5178/albahaca.pdf (consultado: 24 de julio de 2009).
Martínez, E.; L. Pérez; B. Bernal; D. García: «First Report of Peronospora
sp. on Sweet Basil (Ocimum basilicum) in Cuba», New Disease
Reports 20: 18, EE. UU., 2009, http://www.ndrs.org.uk/article.php?
id=020018 (Consultado: enero de 2010).
Mordue, J. E. M.: Thanatephorus cucumeris. CMI Descriptions of
Pathogenic Fungi and Bacteria No. 406, Commonwealth Mycological
Institute, Kew, Surrey, Inglaterra, 1974.
89
Identificación de aislados de Bacillus spp. mediante cromatografía
gaseosa de los ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME)
Yamilé Baró Robaina,1 Marcia M. Parma,2 Itamar Soares de Melo2 y Deise M. Fontana Capalbo2
Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.a A y 5.a F, Playa, La Habana,
C.P. 11600, [email protected]
2
Empresa Brasileña de Investigación Agropecuaria (Embrapa). Rodovia Sp 340 Km 127,5 – Taquinho
Velho, Caixa Postal 69 13820-000, Jaguariúna SP, Brasil
1
RESUMEN
ABSTRACT
Se determinó el perfil de los ácidos grasos de seis aislados de Bacillus
spp. mediante cromatografía gaseosa. El análisis permitió identificar
dos de los aislados como B. subtilis, otro se agrupó en el género Bacillus
y los restantes aislados se agruparon dentro del grupo de B. cereus.
Aunque el análisis FAME no permitió identificar taxonómicamente
todos los aislados, sí posibilitó confirmar el espectro bacteriano.
Aun cuando el análisis FAME permite la identificación a nivel de
especie en unos casos y en otros no, la técnica es utilizada frecuentemente por diversos laboratorios en el mundo por sus potencialidades en la diferenciación bacteriana, y es muy útil como sistema de
identificación de primera línea.
Fatty acids profiles from six Bacillus spp. isolates were determined by
gas chromatographic. The fatty acids methyl esters (FAME) analysis
let identified two isolates as B. subtilis, another one was grouped in
Bacillus genus and the rest were included into B. cereus group. Although
FAME analysis did not allowed species differentiation, it facilitated
the bacterial spectrum classification of isolates. Even though the
FAME analysis allows identification at species level in some cases
and not for others, the technique is used by numerous laboratories for
routine based identifications of bacteria, because it has a potential
for species differentiation within the genus Bacillus and it is very useful
as first line identification system.
Palabras claves: Bacillus, cromatografía gaseosa, ácidos grasos,
taxonomía
Keys words: Bacillus, gas chromatographic, fatty acids, taxonomy
El género Bacillus está constituido por un grupo diverso de bacterias ampliamente distribuidas en el suelo y
en otros ecosistemas naturales. Debido a su habilidad
de formar esporas resisten un rango variable de condiciones ambientales, por lo que se adaptan fácilmente a
diversos hábitats. La identificación de las especies pertenecientes a este género se realiza comúnmente mediante pruebas bioquímicas. En algunos casos una identificación segura resulta difícil debido a que comparten
propiedades bioquímicas y morfológicas importantes
[Kwon et al., 2009]. Actualmente las técnicas de identificación empleadas con más frecuencia incluyen el
análisis de los ácidos grasos totales, la electroforesis en
geles de poliacrilamida (SDS-PAGE), los perfiles
genómicos y las técnicas de microarreglos [Parvathi et
al., 2009].
La primera evidencia de que los ácidos grasos celulares
podían utilizarse para la identificación de bacterias la
informó Abel et al. (1963), y el primer análisis del género Bacillus lo realizó Kampfer (1994), quien concluyó
que este análisis tiene potencial para la diferenciación
de especies de este género.
Slabbinck et al. (2008) plantearon que el objetivo de
una herramienta de identificación de primera línea como
el análisis FAME no es lograr una identificación exacta, sino obtener el espectro bacteriano del aislado en
cuestión.
El análisis de los perfiles de los ésteres metílicos de los
ácidos grasos totales (FAME) es una herramienta de
identificación fácil, automatizada, que se emplea
rutinariamente en la investigación microbiológica por
Recibido: 15/5/2012
Aceptado: 27/6/2012
91
Baró et al.
varios laboratorios en el mundo, la cual es cada vez
más importante en la identificación bacteriana, y es
lo suficientemente sensible y confiable para agrupar
al género Bacillus a nivel de especies [Kwon et al.,
2009].
La selección de nuevos aislados bacterianos con fines
industriales biotecnológicos, efectivos en el control de
plagas entre otras aplicaciones, es una práctica que se
realiza en numerosos laboratorios y centros de investigación. El Laboratorio de Desarrollo de Bioplaguicidas
del Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal dispone de aislados de Bacillus spp., que se han identificado y caracterizado por métodos bioquímicos y
moleculares. En este trabajo se realizó la identificación
y cuantificación del perfil de los ácidos grasos de seis
aislados de Bacillus pertenecientes a esta institución,
nombrados E4, 4, 21, LBT 87, LBT 99 y LBT 111.
La preparación y el análisis de las muestras se realizó
según el protocolo descrito en el manual del fabricante
(Sherlock Microbial Identification System version 5.5
MIDI, Inc., Newark, DE, USA).
Los aislados bacterianos se desarrollaron en medio de
cultivo caldo triptona soya a 28 ± 2 °C durante 24 h.
Transcurrido el tiempo de crecimiento se tomaron cuatro asas de crecimiento bacteriano del tercer cuadrante
de la placa de Petri y se trasvasaron a tubos de cultivo
específicos de cromatografía gaseosa. A continuación
se realizó el proceso de saponificación, para lo cual se
adicionó 1 mL de una solución de NaOH 15 % en
metanol 50 %. Seguidamente se realizó la metilación
con la adición de 2 mL de una solución de HCl 6N en
metanol 50 %, y se realizó la extracción de los ácidos
grasos formados con la adición de 1,25 mL de hexano o
metil terc-butil éter (MTBE). Finalmente se realizó el
lavado de la fase orgánica con 3 mL de una solución de
NaOH 1,2 %, y las muestras se trasvasaron para viales específicos de cromatografía gaseosa. Se utilizó un
cromatógrafo gaseoso Agilent modelo 6850 con columna Ultra 2 [25 m de longitud, ID (diámetro interno) 0,2 mm
y Film (recubrimiento interno) 0,33 μm], 5 % fenil metil
siloxano, detector FID, gas portador hidrógeno (30 mL/min),
nitrógeno (30 mL/min), volumen inyectado automáticamente 2 μL (inyector automático serie 7683), modo
de inyección split (liner 19251-60540), temperatura del
inyector 250 °C, temperatura del detector 300 °C, programa de temperatura del horno: 170 °C inicial, rampa
5 °C/min hasta 260 °C durante 18 min, rampa 40 °C
hasta 310 °C durante 1,5 min.
La biblioteca de comparación empleada fue la Sherlock
TSBA versión 6.
Para las cepas 4, E4 y 21 se obtuvo una alta proporción
de ácidos 15:0 iso y 15:0 anteiso, composición característica para la especie B. subtilis, contrariamente a lo
que ocurrió en las cepas LBT87, LBT99 y LBT111,
donde hubo una menor proporción de ácidos grasos 15:0
anteiso típico de la especie thuringiensis. En la Tabla se
pueden apreciar los índices de similitud relacionados
con cada cepa estudiada.
Índices de similitud obtenidos en el análisis FAME
Cepa
4
92
Índices de similitud
0,833 Bacillus subtilis
E4
0,490 Paenibacillus macerans (Bacillus)
0,410 Bacillus atrophaeus
21
0,488 Paenibacillus macerans (Bacillus)
0,472 Bacillus atrophaeus
0,451 Virgibacillus pantothenticus (Bacillus)
0,383 Paenibacillus larvae pulvifaciens (48 h, Bacillus)
LBT87
0,449 Bacillus cereus GC subgroup B
0,350 Bacillus cereus GC subgroup A
LBT99
LBT111
El análisis del perfil de los ácidos grasos permitió identificar con precisión los aislados E4 y 4 dentro de la
especie B. subtilis. En ambos aislados los porcentajes
de similitud estuvieron por encima de 0,6; valor a partir del cual se considera válida la identificación. Aunque el aislado 21 se agrupó dentro del género Bacillus
no se pudo determinar la especie de manera precisa.
Sosa et al. (2006) identificaron los aislamientos E4, 4 y
21 como B. subtilis mediante pruebas bioquímicas y el
minikit API 50 CHB (Biomérieux).
Los aislamientos LBT 87, 99 y 111 tuvieron índices de
similitud bajos que los ubicaron dentro del grupo de
B. cereus. Probablemente en estos aislados no se pudo
discernir la especie porque los ácidos grasos presentes
en la pared celular son muy similares, por lo que hay
que emplear otros métodos para la identificación. El
perfil FAME de B. cereus y B. thuringiensis es muy
similar, por lo que es necesario el análisis del cristal
parasporal producido solamente por B. thuringiensis
para su diferenciación. Carreras (2009) identificó estos
tres aislados como B. thuringiensis, principalmente por
la presencia del cristal parasporal.
El género Bacillus contiene dos grupos de especies muy
relacionadas: el grupo B. cereus en el cual se incluyen
las especies anthracis, cereus, mycoides, thuringiensis,
pseudomycoides y weihenstephanensis [Euzeby, 2007],
y el grupo B. subtilis, que contiene las especies
amyloliquefaciens, licheniformis, atropheus, axarquensis,
mojavensis, pumilus, sonarensis, subtilis, tequilensis,
vallismortis y velezensis. La resolución taxonómica del
FAME debe determinarse para cada taxón separadamente, ya que en algunos géneros permite la identificación a nivel de especies y en otras no. No obstante, las
diferencias en la longitud de las cadenas, posición de
los dobles enlaces y la unión de los grupos funcionales
hacen a los ácidos grasos un marcador taxonómico muy
útil [Slabbinck et al., 2008].
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93
Primera detección en Cuba de Hemicriconemoides mangiferae
Hortensia Gandarilla Basterrechea1 y Orlando Rivas Bofill2
Centro Nacional de Sanidad Vegetal. Laboratorio Central de Cuarentena Vegetal. Ayuntamiento 231
e/ San Pedro y Lombillo, Plaza de la Revolución, La Habana, [email protected]
2
Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera Central vía Holguín 371, Granma, Cuba.
1
RESUMEN
ABSTRACT
A partir del programa de recuperación de frutales en la provincia de
Granma, como parte de la protección fitosanitaria, se evaluaron los
nematodos parásitos asociados a Persea americana Mill. var. Americana en el vivero de frutales del municipio de Buey Arriba. Para el
procesamiento de las muestras del suelo adherido a las raíces se
utilizó el método de extracción decantación más tamices y embudos
Baermann. Como resultado se observó la presencia de Hemicriconemoides Chitwood & Birchfield. Los especímenes poseían una característica doble cutícula. El cuerpo de las hembras, cilíndrico,
afinado en los extremos, ligeramente arqueado, con 132-140 (133,8)
anillos cuticulares; pequeño, con una longitud entre 0,48-0,53 (0,50) mm;
estilete de 79-81 (79,9) μm con las protuberancias basales dirigidas
anteriormente, en forma de ancla; región labial aplanada anteriormente; poro excretor situado en los anillos 34-35 (34,2); vulva en los
anillos 11-12 (11,6) y ano en los anillos 7-8 (7,2) a partir del término
de la cola, con una distancia de 4-5 (4,4) anillos entre uno y otro.
Estas características coinciden con las descritas para Hemicriconemoides mangiferae Siddiqi. Es el primer registro de esta especie
en Cuba.
As part of phytosanitary protection for an improvement program of fruit
crops in Granma province, plant parasitic associated nematodes have
been evaluated on Persea americana Mill. var. Americana, from a
nursery located at Buey Arriba municipality. Nematodes of
Criconematidae family were observed in the samples received.
Specimens had a cuticular sheath which is characteristic of
Hemicriconemoides Chitwood & Birchfield genus. Female with small
cylindrical body, tapering towards ends, slightly arcuate, cuticular
annuls 132-140 (133,8); length 0,48-0,53 (0,50) mm; spear 79-81
(79,9) μm long with basal knobs anteriorly directed, anchor-like
shaped; lip region anteriorly flattened; excretory pore on annuli 34-35
(34,2); vulva on annuls 11-12 (11,6) and anus on annuls 7-8 (7,2) from
tail terminus, with 4-5 (4,4) annuls between both. These characteristics
corresponded with Hemicriconemoides mangiferae Siddiqi. This is the
first report of the species in Cuba.
Key words: Persea americana, Hemicriconemoides mangiferae, crop
fruits
Palabras claves: Persea americana, Hemicriconemoides mangiferae,
frutales
Una de las prioridades del Ministerio de la Agricultura
de Cuba es el incremento de la producción frutícola a
partir del rescate de los espacios actuales y el fomento
de nuevas áreas, lo que incluye además la incorporación
de un movimiento popular de siembra que abarque una
gama extensa de especies frutales en todo el país.
Como parte de esta actividad, en la provincia de Granma
se elaboró el programa de desarrollo de los frutales
[Minag, 2010], el cual plantea una estrategia que permita lograr la recuperación de las plantaciones afectadas y desarrollar acciones encaminadas al desarrollo
integral y diversificado de los frutales en todos los
municipios de la provincia.
Entre las amenazas para el óptimo desarrollo y rendimiento de estas plantas, fundamentalmente durante
la etapa de viveros, se encuentran los fitonematodos,
que son uno de los factores involucrados en las pérdidas económicas en las plantaciones de frutales [Castellano et al., 2004].
A partir de estas premisas, en el Laboratorio de Sanidad Vegetal de la provincia de Granma se procesaron
muestras de aguacatero (Persea americana Mill. var.
Recibido: 13/6/2012
Aceptado: 15/7/2012
95
Gandarilla y Rivas
Americana) procedentes del vivero del Poder Popular
en el municipio de Buey Arriba para determinar los
fitonematodos presentes.
El suelo adherido a las raíces se procesó mediante el
método de decantación más tamices. El procedimiento
se repitió hasta aumentar la transparencia del recobrado, que luego se depositó en embudos Baermann.
Los nematodos se colectaron en un tubo de ensayo, colocado en baño de María a 55 °C durante 3 min, y posteriormente se fijaron en una solución de formaldehído,
agua y trietanolamina (TAF) según indicaciones de
García (1979). La identificación se realizó en el Laboratorio Central de Cuarentena Vegetal (donde se conservaron los especímenes) por la morfología de 11 hembras, en base a los criterios respecto al género de Hunt
et al. (2005) y para la especie los criterios de Siddiqi
(1977), Germani y Anderson (1991), Rhaman y Ahmad
(1995), CABI (2007).
Fue distintiva la presencia de una doble cutícula semejante a la del género Hemicriconemoides Chitwood &
Birchfield. Las características principales observadas
en los especímenes fueron el cuerpo cilíndrico, afinado
en los extremos, ligeramente arqueado, de tamaño pequeño; región labial aplanada anteriormente con dos
anillos, de los cuales el anterior presentó forma angular, dirigido hacia fuera, y el otro redondeado de forma
similar a los anillos del cuerpo; las protuberancias
basales del estilete dirigidas anteriormente, en forma
de ancla; vulva en forma de hendidura transversa abierta, sin la presencia de cubierta vulvar; y cola conoide
con término redondeado y anillo terminal liso.
La longitud del cuerpo fue de 0,48-0,53 (0,50) mm; estilete 79-81 (79,9) μm; número de anillos cuticulares en el
cuerpo 132-140 (133,8); anillos del extremo anterior al
poro excretor 34-35 (34,2); anillos del término de la cola
a la vulva 11-12 (11,6); anillos del término de la cola al
ano 7-8 (7,2); anillos entre la vulva y el ano 4-5 (4,4).
Estas características coinciden con las descritas para
Hemicriconemoides mangiferae Siddiqi y es la primera
vez que se registra esta especie en Cuba.
Esta especie se considera importante en frutales tropicales y subtropicales y casi cosmopolita en las áreas
cálidas del mundo [Mac Gowan, 1984]. Otros frutales hospedantes de este nematodo son Ananas comosus, Carica papaya, Citrus spp., Cocos nucifera, Litchi
chinensis, Manguifera indica, Manilkara zapota, Musa
paradisiaca, Psidium guajava y Vitis vinifera [CABI,
2007].
96
H. mangiferae es una especie generalmente asociada con
el mango (M. indica), donde se ha demostrado su
patogenicidad; no obtante, su importancia económica
no está esclarecida [El-Borai y Duncan, 2005].
Hasta el momento los nematodos asociados al aguacatero en Cuba eran Criconemoides sp., Helicotylenchus
sp., Longidorus sp., Pratylenchus sp., Rotylenchulus sp.,
Rotylenchus sp., Tylenchorhynchus sp., Tylenchus sp.
[Fernández y Ortega, 1986] y Meloidogyne sp. [Hernández
et al., 2006].
No se observaron daños relacionados con H. mangiferae
en las plantas analizadas, por lo que esta detección constituye un aporte al conocimiento de la diversidad de
especies de fitonematodos presentes en los frutales de
Cuba, y da a conocer como nuevo hospedante el
aguacatero.
REFERENCIAS
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Diversidad de nematodos del suelo en una selva tropical mexicana
Horacio Salomón Ballina Gómez, Esther Herrera Canto, Cindi Kantun Pat, José Tun Suárez y Esau
Ruiz Sánchez
Instituto Tecnológico de Conkal, Km 16.3 Antigua carretera a Mérida-Motul, Conkal, Yucatán,
C.P. 97345, [email protected]
RESUMEN
ABSTRACT
La diversidad de nematodos del suelo ha sido escasamente estudiada en las selvas tropicales. Se realizó un estudio de la estructura
comunitaria del suelo a nivel de género en dos sitios de selva: > 50 y
< 15 años de conservación. Se determinó la densidad de plantas
(≥ 100 cm de altura), y la diversidad, dominancia y riqueza de géneros de nematodos. La densidad vegetal y la diversidad de nematodos
fueron mayores en la selva más conservada, resultado opuesto a su
dominancia. En > 50 años abundaron Helicotylenchus y Mononchus, y
en < 15 años Aphelenchus y Rhabditis. Los grupos funcionales más
abundantes fueron el cp-2 (micófagos) y cp-3 (fitoparásitos) que
difirieron por la edad de la selva. Este es un primer estudio preliminar
sobre la diversidad de nematodos del suelo en selvas tropicales de
México.
Despite importance of soil nematodes in ecosystemic process such
as organic matter decomposition and plant-parasitic interactions, the
knowledge of their biodiversity in rainforest is lack. It was explored
the community assemblage at genera level of soil nematodes of
subhumid tropical forest in two different successional age forests:
> 50 and < 15 years old. Plant density (≥ 1 height), Shannon-Wiener
diversity (H’), Simpson dominance (D) and genera community richness
(Bootstrap) were determined in each site. The most abundant genera
in > 50 years old successional age forest were Helicotylenchus and
Mononchus; while Aphelenchus and Rhabditis were in < 15 years old.
Plant density was higher in > 50 than < 15 years old. Genera community
richness was estimated in 85 %, explained mainly by the nematodes
genera found in oldest forest. Major functional groups were c-p2 and
c-p3 varying by forest age. This is a primary study about soil nematodes
diversity in a Mexican tropical forest.
Palabras claves: biodiversidad, nematodos, bosque tropical
Key words: biodiversity, nematodes, tropical forest
Los nematodos constituyen los más numerosos metazoas
del suelo y se ubican en cinco grupos funcionales: cp-1,
cp-2, cp-3, cp-4 y cp-5 [Bongers y Bongers, 1998]. Se
correlacionan con estados sucesionales de la vegetación
como respuesta a los cambios físicos y químicos del
ambiente edáfico [Hu y Cao, 2008]. Hay los de estrategias r o colonizadores, que son pequeños, numerosos,
capaces de sobrevivir bajo condiciones edáficas extremas; y los k o persistentes, de mayor tamaño, escasos,
incapaces de sobrevivir en ambientes extremos [Bongers
y Bongers, 1998]. A pesar de su alta abundancia en los
suelos de las selvas, se desconoce en gran medida su
diversidad en México.
Se analizó la diversidad de géneros de la comunidad de
nematodos en suelos de una selva alta perennifolia en
Calakmul, Campeche, México. El estudio se realizó durante marzo de 2011, en la temporada de secas en la
selva alta perennifolia de la Reserva de la Biosfera de
Calakmul (18º18’47" N y 89º51’48" O, 240 m altitud)
Campeche, México. La precipitación y la temperatura
media anual son de 1400 mm y 25 °C, respectivamente.
La riqueza de especies de plantas estimada es de 1569 a
1600 [Ballina et al., 2008].
En dos selvas con > 50 y < 15 años de conservación se
trazó un par de transectos de 20 m y se colectaron 10
muestras de suelo separadas cada 5 m. Se registró la
densidad de plantas ≥ 100 cm de altura dentro de 1 m2,
donde también se colectaron 200 g de suelo a una profundidad de 10-20 cm. Se obtuvieron cuatro submuestras homogeneizadas para asegurar la colecta de
nematodos, ya que algunas veces los espacios del suelo
de las plantas no sostienen altas densidades de ellos.
La extracción de nematodos se realizó mediante el método de extracción tamizado-centrifugado, luego se
Recibido: 13/4/2012
Aceptado: 11/6/2012
97
Ballina et al.
mataron y fijaron, y se identificaron a nivel de género
[Desgarennes et al., 2009].
Se realizaron pruebas de T para analizar la densidad de
plantas, la diversidad de Shannon-Wiener (H’) y la
dominancia entre selvas (D), todas con SPSS 20 y Species
Diversity & Richness. Se corroboró que se cumplieran
los supuestos de normalidad y homogeneidad de
varianzas. La riqueza de géneros con el procedimiento
no paramétrico Bootstrap, con EstimateS 7.5.2. Se realizó un análisis de tablas de contingencia de 5 x 2, usando los grupos funcionales como filas y las edades (selva
> 50 y < 15 años) como columnas, con SPSS 20.
La densidad de plantas fue mayor en la selva > 50 años
de conservación (media ± e.e.) 5 ± 0.8 que en la < 15
años, 2,4 ± 0,61 (gl = 18; t = 2,56; P = 0,01). Se encontraron 259 nematodos pertenecientes a siete géneros de
seis familias (Tabla). En la selva > 50 años los más abundantes fueron Helicotylenchus, Mononchus y Tylenchus.
Por su parte, en la selva <15 años fueron Aphelenchus,
Rhabditis y Helicotylenchus. En áreas cultivadas se encontró que géneros de nematodos fitoparásitos como
Aphelenchus y Mononchus son más abundantes conforme el tiempo de conservación de un área es menor, a
diferencia de Helicotylenchus y Rhabditis, encontrados
en la selva con mayor tiempo de conservación [Gallegos
et al., 2009]. Interesantemente solo Helicotylenchus (de
hábitos fitoparásitos) se ha reportado previamente para
selvas tropicales en Costa Rica, aunque no como género dominante [Powers et al., 2009].
Nematodos registrados en una selva alta perennifolia de Campeche, México
Género
Familia
Abundancia/selva (años)
> 50
< 15
Actinolaimus
Dorylaimidae
5
0
Aphelenchus
Aphelenchoididae
9
Dorylaimus
Dorylaimidae
Helicotylenchus
Grupo
alimenticio
Grupo
funcional
Depredadores**
cp-4
121
Micófagos*
cp-2
7
0
Omnivoros*
cp-4
Hoplolaimidae
53
10
Fitoparásitos*
cp-3
Mononchus
Mononchidae
21
0
Depredadores*
cp-4
Rhabditis
Rhabditidae
0
18
Bacteriófago**
cp-1
Tylenchus
Tylenchidae
16
0
Asociados a
plantas*
cp-2
111
149
Total
* : Yeates et al. (1997), ** : Azpilicueta et al. (2008).
La diversidad de géneros de nematodos fue mayor en la
selva > 50 años 1,02 ± 0,02 en comparación a la de < 15
años con 0,38 ± 0,1 (gl = 6; t = 5,96; P = 0,001). El índice
de dominancia de Simpson fue mayor en la selva > 50 años
que en la de < 15 años con 2,84 ± 0,14 y 1,38 ± 0,19, respectivamente (gl = 6; t = 6,3; P = 0,001) (Fig.), lo cual
indicó un incremento de la dominancia de géneros en la
selva < 15 años (valores cercanos a 1 indican baja diversidad y alta dominancia) [Magurran, 2009]. Los resultados
de la nematofauna por sí mismos concuerdan con registros previos de mayor diversidad en selvas más conservadas [Eisenhauer et al., 2011], y no cuando se analizan en
conjunto con la densidad de plantas. Esto llama la atención, ya que comúnmente selvas muy conservadas presentan menor densidad de árboles debido al incremento en la
dominancia vegetal, y como resultado, una disminución
en la riqueza de especies de plantas [Moreno y Halfter,
2000]; sin embargo, habría que tener en cuenta que úni98
camente se registraron las plantas > 100 cm de altura,
anulando la densidad de plantas menor a esta altura, que
generalmente se encuentran en alta proporción en selvas
con menor tiempo de conservación.
Los grupos funcionales fueron dependientes de la edad
de la selva (gl = 3, x2 = 140,9; P < 0,0001), y fueron los
más abundantes el cp-2 de los micófagos con el 50 % y
el cp-3 de los fitoparásitos con el 24 % de la abundancia total en ambos sitios de selva (Tabla). La riqueza
específica estimada fue de 8,27, lo que indica un adecuado esfuerzo de muestreo del 85 % [Moreno y Halfter,
2000]. No obstante, son necesarios más muestreos y
abarcar otros posibles hábitats como la hojarasca y el
sotobosque; asimismo, considerar la temporada de lluvias por la importancia que podría implicar. Este trabajo presenta un primer estudio sobre la diversidad de
nematodos del suelo en selvas tropicales de México.
Diversidad de Shannon-Wiener (H’) (A) y dominancia de Simpson (D) (B) para los géneros de
presentes en dos sitios de selva de diferente edad en una selva alta perennifolia, Campeche,
México. (**: Indican diferencias significativas a p = 0,001).
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99
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Reseña
RNA-seq: herramienta transcriptómica útil para el estudio
de interacciones planta-patógeno
Johana Carolina Soto Sedano1 y Camilo Ernesto López Carrascal2
Universidad de Nacional de Colombia, sede Bogotá, Carrera 45 No. 26-85, Facultad de AgronomíaGrupo de Investigación en Fitopatología Molecular, Facultad de Ciencias, [email protected]
2
Universidad de Nacional de Colombia, sede Bogotá, Carrera 45 No 26-85 - Edificio Uriel Gutiérrez.
Grupo de investigación en Fitopatología Molecular. Facultad de Ciencias, departamento de Biología
[email protected]
1
RESUMEN
ABSTRACT
El conocimiento del transcriptoma y su regulación es fundamental
para la interpretación articulada de los diversos constituyentes
moleculares que integran la red de respuesta génica ante un determinado evento inductor, como los que se presentan en interacciones
planta-patógeno. La actual tecnología de secuenciación ha llevado al
desarrollo del RNA-seq como herramienta transcriptómica que permite el secuenciamiento masivo de ADNc o ARN, y hace posible
obtener perfiles de expresión génica de las respuestas de defensa,
lo cual ofrece grandes posibilidades para profundizar en el entendimiento de los mecanismos que se activan durante las respuestas
inmunes en plantas. El RNA-seq ha cambiado la manera de cómo se
estudian los transcriptomas, y ha permitido identificar y cuantificar
nuevos y conocidos transcriptos relacionados con defensa vegetal.
Aquí se presenta el principio, aplicaciones y ventajas del RNA-seq;
además se discuten trabajos recientes que revelan la importancia y
utilidad de esta herramienta en estudios de interacciones planta patógeno.
The knowledge gained from transcriptome and its regulation is
essential to articulate the constituents that make up the molecular
network of response gene induction for a certain event, such as those
occurring in plant pathogen interactions. The current sequencing
technology has led to the development of RNA-seq as a tool that
enables mass sequencing of cDNA or RNA, making possible to obtain
gene expression profiles for defense responses, which offers great
potential to deepen the understanding of mechanisms that are activated
during immune responses in plants. RNA-seq is changing the way of
how we used to study the transcriptome and has helped identify and
quantify new and known plant defense related transcripts. Here, it has
present the basis, applications and advantages of RNA-seq, also are
discussed recent studies that have revealed the importance and
usefulness of this tool for studies of plant pathogen interactions.
Key words: cDNA, sequencing, phytopathology
Palabras claves: secuenciación, ADNc, fitopatología
INTRODUCCIÓN
Celularmente la información genética cifrada en el ADN
y contenida en los genes se expresa a través de los mecanismos de transcripción y traducción, a partir del
cual se producen moléculas de ARNm y proteínas, respectivamente. Eventos celulares tales como la replicación, la diferenciación y la división celular y otros caracteres macroscópicos tales como rasgos fenotípicos,
morfológicos, funcionales y de respuesta ante estímulos son producto de la expresión diferencial de genes.
En plantas, el control de la respuesta frente a estados
de estrés biótico y abiótico está dado por la actividad
transcripcional de activación o represión de genes
[Proudfoot et al., 2002]. La transcripción es un proceso
nuclear cuya activación depende de estímulos intra o
extracelulares que activan cascadas de señalización para
determinar cuáles genes deben expresarse o reprimirse
de acuerdo con el tipo de estímulo inicial.
La regulación de la transcripción depende de la unión
de activadores o represores en los elementos del promotor ubicados en la región 5’ de la secuencia
codificante. Los activadores o represores dictaminan
la tasa de síntesis de ARNm que debe producir la ma-
Recibido: 6/3/2012
Aceptado: 31/7/2012
101
Soto y López
quinaria basal de transcripción, la cual está constituida por los factores de transcripción generales (GTFII)
y la ARN polimerasa II [Proudfoot et al., 2002].
La cantidad de moléculas producidas de determinado
ARNm depende de la función que este tenga en un proceso celular específico. Así, cuando se requiera dar respuesta a una condición determinada en la cual un gen
tiene una participación importante, más moléculas de
este transcrito se producirán. De manera similar, bajo
ciertas circunstancias particulares hay genes que permanecen apagados, pero un estímulo hace que se expresen y se inicia entonces la transcripción. De esta
manera la determinación de dónde, cómo y cuándo es
generado un transcripto, bajo una condición dada, es
fundamental para el entendimiento de la actividad biológica de un gen. Más aún los niveles de ARNm pueden
dar no solo una visión clara de patrones de expresión,
sino también cuantificaciones altamente correlacionadas
entre cambios en la abundancia de ARNm con cambios
en la abundancia de proteínas [Lockhart y Winzeler,
2000]. En conjunto, todos los transcriptos derivados
de genes que se producen en una célula en un momento
y bajo una condición fisiológica determinada se denomina transcriptoma.
El estudio y análisis del transcriptoma es esencial para
el entendimiento de la función de genes. De manera general se puede establecer que si un gen se expresa en
una condición o célula determinada es porque cumple
allí una función. El estudio global del transcriptoma
permite también establecer patrones de regulación
génica coordinada, lo que contribuye no solo a dilucidar la función y agrupamiento de varios genes bajo un
estímulo o condición específica, sino también a identificar elementos promotores comunes a varios genes. En
la década de los noventa, los northern blots, los microarreglos de ADNc (ADN complementario obtenido
por transcriptasa inversa a partir de ARNm), los cDNAAFLP y el análisis serial de expresión de genes SAGE
(del inglés serial analysis of gene expression), entre otras
técnicas, permitieron el desarrollo y generación de conocimiento en transcriptómica, al estudiar la expresión
de genes relacionados con respuestas a estímulos o a
condiciones particulares, así como para determinar cambios en los patrones de expresión génica en tratamientos y cinéticas de expresión [Shalon et al., 1996; Schena
et al., 1998; Meyers et al., 2004; Marguerat y Bahler,
2010]; sin embargo, estas estrategias resultan limitantes
al estar basadas en hibridación, tener baja cobertura,
y en algunos casos necesitar algún conocimiento previo
102
de la secuencia del genoma para su implementación
[Ward et al., 2012].
Actualmente, y gracias a los avances en las técnicas de
secuenciación del ADN, a través de tecnologías de nueva generación, NGS (del inglés Next Generation
Sequencing), se han revolucionado campos como los de
la genómica y la transcriptómica. Estas tecnologías han
permitido no solo generar información con altos rendimientos y a bajo costo, sino también abrir nuevos horizontes para el entendimiento detallado y global de
procesos de expresión génica [Mochida y Shinozaki,
2011; Schneeberger y Weigel, 2011; Ward et al., 2012].
La caracterización completa y el análisis global de la
expresión génica en una célula o tejido, aun sin ninguna información genómica previa, es ahora posible a través de la implementación de la secuenciación de ADNc,
o más recientemente de la secuenciación directa de
ARN, tecnología conocida como RNA-seq [Wang et al.,
2009; Garber et al., 2011; Egan et al., 2012; Ward et al.,
2012]. Esta herramienta transcriptómica cambia la
manera de cómo se analizan y comprenden los
transcriptomas [Wang et al., 2009]. Además, el RNAseq da una cobertura completa de transcriptos, genera
información no solo de la secuencia, sino también de la
estructura de exones y posibles eventos de splicing alternativo [Lister et al., 2009; Gulledge et al., 2012]. La
información de esta manera puede ser integrada e interpretada, y se constituye de gran utilidad para vislumbrar procesos biológicos y mecanismos de coexpresión.
En el poco tiempo que esta tecnología se encuentra disponible se han desarrollado un grupo relativamente
amplio de investigaciones dirigidas a caracterizar y a
cuantificar transcriptomas, así como a comprender los
mecanismos de la variación de la expresión génica. Las
aplicaciones de RNA-seq se han llevado a cabo en especies eucariotas tales como Saccharomyces cerevisiae,
Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster, el
ratón y el humano [Nagalakshmi et al., 2008; Mortazavi
et al., 2008; Maher et al., 2009; Pickrell et al., 2010;
Gan et al., 2010; Daines et al., 2011; Peng et al., 2012],
lo que ha demostrado la alta aplicabilidad que el RNAseq ha tenido en estudios de especies modelo.
Recientemente la tecnología de RNA-seq también se
ha implementado para estudios de transcriptomas vegetales. Los estudios de RNA-seq en plantas ha permitido, por ejemplo, la identificación de genes expresados
frente a tratamientos de vernalización y respuesta a
giberelinas en remolacha azucarera [Mutasa-Gottgens
et al., 2012] y en respuesta a estrés hídrico y calor
[Gulledge et al., 2012]. La información generada por
RNA-seq también se ha explotado para la identificación de SNP (del inglés single nucleotide polimorphism)
en uva y arroz [Zenoni et al., 2010; Lu et al., 2010] y
para la detección de variantes de splicing alternativo
durante el desarrollo del fruto de uva y en Arabidopsis
[Zenoni et al., 2010; Gulledge et al., 2012]. También se
ha constituido en una herramienta fundamental para
ayudar en la anotación de genes [Lu et al., 2010]. Lo
anterior muestra la utilidad y posibilidades que esta
herramienta transcriptómica tiene y su aplicación bajo
diferentes enfoques investigativos.
Tecnología RNA-seq
El RNA-seq es una herramienta transcriptómica actual que está fundamentada en la secuenciación de
ADNc basada en los desarrollos NGS. En esta tecnología se captura el ARN total o ARNm, el cual se fragmenta y convierte en una librería de ADNc. Uno de los
pasos fundamentales es la obtención de un ARN de
buena calidad que represente todos los transcritos que
se producen en la condición y tejido de estudio. Para el
aislamiento del ARN con frecuencia se emplean kits de
extracción de ARNm, que aplican la captura a partir
de la cola poly(A) [Ward et al., 2012]. La fragmentación del ARN o del cDNA se realiza o bien por
nebulización, por digestión con enzimas de restricción
o a través del uso de cationes divalentes bajo condiciones de presiones elevadas [Wang et al., 2009]. Generalmente el fraccionamiento se realiza posteriormente a la
síntesis de ADNc. Esta síntesis se realiza con procedimientos estándares bien establecidos para la mayoría
de organismos que hacen uso de la enzima transcriptasa
reversa.
Una vez obtenido el ADNc se ligan adaptadores de tal
forma que cada fragmento generado contendrá un adaptador ligado en sus extremos 3´y 5´. Las secuencias de
estos adaptadores se conocen y serán necesarias para
que cada fragmento pueda ser secuenciado, y en algunos casos pueden emplearse para diferenciar otros grupos de fragmentos obtenidos a partir de muestras de
ADNc diferentes; sin embargo, no en todos los casos se
requiere la ligación de adaptadores, lo cual dependerá
de la plataforma de secuenciación a emplear. Los
adaptadores se pueden ligar directamente a la muestra
de ARN, previa síntesis de ADNc [Core et al., 2008;
Marguerat y Bahler, 2010], o alternativamente se pue-
den adicionar directamente a la cadena sencilla de ADNc
[Maher et al., 2009; Marguerat y Bahler, 2010].
En cuanto a la cantidad y concentración del ARNm
que se requiere para la tecnología RNA-seq, el rango
está actualmente entre 5 y 10 μg, con una concentración alrededor de 500 ng/μl [Ryan Kim, UC Davis
Genome Center; Nong Chen, Business Development
Director, BGI Americas, comunicación personal].
Por otro lado, dentro de las aplicaciones y ventajas que
tiene la tecnología RNA-seq está que da una cobertura
completa de transcriptos, genera información tanto de
la secuencia como de la estructura de exones y sitos de
splicing alternativo [Lister et al., 2009; Gulledge et al.,
2012]. Asimismo, los datos arrojados por RNA-seq tienen una alta precisión con respecto a los niveles de expresión génica que se obtienen a través de PCR (del
inglés polimerase chain reaction) cuantitativa (qPCR)
[Nagalakshmi et al., 2008; Wang et al., 2009; Ward et
al., 2012]. Además, también se ha mostrado que los
resultados son altamente reproducibles [Wang et al.,
2009].
Plataformas y estrategias de secuenciación
para RNA-seq
La tecnología RNA-seq actualmente está disponible
comercialmente en las compañías Roche/454, Solexa/
Illumina, SOLiD/Life Technologies y Helicos/
BioSciences; sin embargo, de las tecnologías de NGS
disponibles las más aplicadas son Roche/454 y Solexa/
Illumina [Strickler et al., 2012]. No obstante, estas compañías y otras no cesan en la búsqueda de mayores rendimientos de secuenciación, obtención de lecturas más
largas que se lleven a cabo en tiempo real y cada vez a
costos más bajos [Metzker, 2010; Mardis, 2011].
Roche/454
Roche/454 es una tecnología que emplea el secuenciador
454-Genome-Sequencer FLX, desarrollado en 2005.
Este fue el primer sistema comercial de NGS. Su principio se basa en la piro-secuenciación o detección de
pirofosfato descrita en la década de los ochenta [Nyrén
y Lundin, 1985]. En esta tecnología se incorporan
adaptadores a los extremos de los fragmentos de cadena simple de ADN o ADNc, los cuales serán adheridos
a microperlas que contienen en la superficie oligonucleótidos complementarios a las secuencias de los
adaptadores. Posteriormente se lleva a cabo una PCR
en emulsión para la amplificación de los fragmentos.
El objetivo de esta amplificación es la obtención de un
103
Soto y López
gran número de moléculas idénticas que producirán altas intensidades de señal en cada lectura (Fig.) [Ansorge,
2009; Mardis, 2011; Egan et al., 2012].
Al finalizar la amplificación se lleva a cabo una
denaturación, y las microperlas son transferidas a pozos en un chip de fibra óptica, en donde se incuban con
las enzimas ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa
y apirasa, así como con los sustratos luciferina y
adenosin-5-fosfosulfato (APS). Posteriormente sobre el
chip se adiciona un deoxinucleótido particular (dNTP);
así cuando la ADN polimerasa incorpore el dNTP a la
cadena naciente se liberará pirofosfato. Este pirofosfato
proviene de la formación del enlace fosfodiéster y es convertido a adenosin trifosfato (ATP), en presencia de la
APS. El ATP así producido reaccionará con la enzima
luciferasa en presencia de luciferina para generar
oxiluciferina y producirse luz en proporciones equivalentes a las cantidades de ATP producidas. La emisión
de luz será detectada por una cámara CCD (dispositivo
de carga acoplada, del inglés charge coupled device). Finalmente, la apirasa removerá el ATP y dNTPs no incorporados. Una vez realizado esto, se repite el ciclo con
un nuevo dNTP [Nyrén y Clifton 2007; Ansorge, 2009;
Egan et al., 2012].
Actualmente Roche/454 ofrece el servicio de secuenciación
para RNA-seq con su más reciente secuenciador, el sistema SG FLX+. Con esta tecnología es posible obtener
lecturas de hasta 1000 nucleótidos; sin embargo, la cobertura es baja, alrededor de 2,5 millones de lecturas o
reads por corrida (454/Roche sequencing contact, comunicación personal).
Illumina
Por su parte, Solexa/Illumina se basa en el principio
de amplificación en puente y el uso de marcaje por
fluorescencia de nucleótidos modificados como
terminadores reversibles (Fig.) [Metzker, 2010]. En
esta tecnología, uno de los adaptadores de los extremos
de los fragmentos de ADN o ADNc se liga complementariamente a oligonucleótidos adheridos a una
superficie sólida o flow cell. Estos oligonucleótidos
harán las veces de primers o cebadores sentido o
antisentido, y crean puentes que favorecen la amplificación. Los amplicones permanecerán adheridos y luego de una denaturación formarán otro puente para permitir la amplificación. Estos pasos se repiten hasta
generar millones de grupos o clusters de un fragmento
determinado. Una vez formados estos grupos se desnaturalizarán nuevamente para iniciar la polimerización o
104
síntesis de cada fragmento, y se introduce esta vez en
la mezcla de síntesis cuatro nucleótidos marcados 32 O –azidometil o terminadores reversibles [Ju et al., 2006;
Guo et al., 2008; Metzker, 2010].
Los terminadores reversibles (dideoxinucleótidos) detendrán la síntesis de ADN una vez la ADN polimerasa
integre a la cadena naciente el nucleótido correspondiente. Seguido de la síntesis, los fluoróforos de los
terminadores reversibles integrados a la cadena naciente
son activados por un láser. La emisión de luz será diferencial de acuerdo con el nucleótido incorporado. La
información será registrada y almacenada. Una vez
hecha la detección, un lavado retira los dideoxinucleótidos no integrados y enzimáticamente es cortado el terminador para que así un nuevo ciclo permita la
incorporación del siguiente nucleótido [Metzker, 2010;
Egan et al., 2012].
Cada flow cell de Illumina contiene ocho carriles o
lanes. Cada uno de ellos en la actualidad tiene un
rendimiento de 150 millones de lecturas o reads. La
longitud de las lecturas generadas es pequeña, del
rango de 50-100 nucleótidos, las cuales pueden ser
lecturas sencillas desde un solo extremo, SE (del inglés single end sequencing reads) o bien lecturas desde ambos extremos PE (del inglés pair end sequencing
reads) [Wang et al., 2009; Garber et al., 2011]. Aunque las longitudes sean cortas, el alto número de lecturas generadas incrementarán la cobertura y permitirá extender la secuencia hasta poder, en algunos
casos, obtener la secuencia de todo el transcripto.
Además, cada lane tiene una capacidad para 24 muestras o librerías de ADNc; sin embargo, entre mayor
es el número de muestras que se ubiquen en cada
lane de Illumina, los millones de lecturas por muestra disminuirán. En el caso en el que se desee potencializar la técnica a través de la obtención de un mayor
número de lecturas por muestra, el uso de réplicas
biológicas es adecuado [Ryan Kim, UC Davis Genome
Center y Veridiana Cano, Illumina, comunicación
personal].
El número de millones de lecturas deseables dependerá de varios factores. Uno de ellos es la disponibilidad de un genoma de referencia que facilitará el
ensamblaje de las lecturas. Otro factor importante
es la información sobre el número de genes de la especie, pues lo que se busca es tener representado en
miles de lecturas cerca de la totalidad de genes expresados.
Secuenciación directa de ARN-Tecnología Helicos
Helicos/BioScience fue el primer sistema comercial
en disponer de una tecnología de secuenciamiento por
síntesis capaz de secuenciar una molécula sencilla
[Harris et al., 2008; Thompson y Milos, 2011]. Más
aún, esta compañía ha desarrollado un método de
secuenciación directo de ARN o DRS (del inglés direct
RNA sequencing), sin necesidad de la previa conversión de ARN a ADNc, método que fue reportado por
primera vez en transcriptos de Saccharomyces
cerevisiae y que aún está en perfeccionamiento
[Ozsolak et al., 2009; Lipson et al., 2009; Levin, et al.,
2010; Ozsolak y Milos, 2011]. La secuenciación directa de ARN podría disminuir alguno de los inconvenientes que se pueden presentar durante la conversión de ARN a ADNc. Uno de los problemas más
frecuentes es la obtención de ADNc quimérico, en
donde la cadena naciente se puede disociar del molde
ARN y posteriormente realinear a una cadena diferente de ARN con una secuencia similar, e iniciar la
síntesis de nuevo [Mardis, 2011; Ozsolak y Milos,
2011]; sin embargo, hasta que la tecnología DRS no
se establezca ampliamente, la obtención de librerías
ADNc para RNA-seq seguirá de líder.
Secuenciamiento masivo de ADNc, RNA-seq, por las tecnologías NGS Illumina y 454. a: Tecnología de secuenciación 454, basada
en el principio de PCR en emulsión y piro-secuenciación; b: Tecnología de secuenciación Illumina basado en el principio de
amplificación en puente y uso de marcaje por fluorescencia de terminadores reversibles.
105
Soto y López
Estrategias y consideraciones para experimentos
RNA-seq
Independiente de la plataforma de secuenciación a usar,
es recomendable que cada muestra o librería contenga
patrones de reconocimiento llamados códigos de barra o
barcodes, lo que permitirá maximizar el número de muestras a ubicar en un solo lane. Esta estrategia es conocida como barcoding o multiplex. Cada barcode es una secuencia corta, alrededor de cinco o seis nucleótidos, que
caracteriza cada muestra o librería de ADNc. Esta secuencia generalmente está ubicada contigua a la secuencia del adaptador en el fragmento de ADNc [Strickler
et al., 2012]. Los barcodes son muy útiles, ya que permiten no solo diferenciar las muestras, sino también que
hacen más eficiente el uso de cada lane.
Los barcodes deben diseñarse uno por cada muestra o
librería de ADNc. Aunque las compañías de secuenciación ofrecen secuencias prediseñadas y probadas, el
diseño debe ser cuidadoso. Algunas de las recomendaciones es que los dos primeros nucleótidos no pueden
ser iguales de un barcode a otro; además, un barcode no
puede ser la secuencia reversa complementaria del otro,
ni tampoco pueden ser secuencias palíndromas. Al hacer uso del barcoding se debe tener en cuenta que el tamaño de cada lectura de los transcriptos se reducirá en
aproximadamente 18 nucleótidos, pues en el ensamblaje de estas se eliminarán tanto las secuencias de los
adaptadores como las de los barcodes [Strickler et al.,
2012].
Una vez revisadas de manera general las tecnologías de
secuenciación para RNA-seq, surge la pregunta de cómo
escoger la plataforma de secuenciación apropiada para
un proyecto RNA-seq. A partir de la premisa de similitud en cuanto a rendimiento, precisión y capacidad de
las lecturas desde ambos extremos del ADNc (3´y 5´), y
que actualmente las tecnologías con mayor demanda son
Roche/454 y Solexa/Illumina, el punto crítico para la
respuesta dependerá de cuál es la longitud de las lecturas que se desea obtener, así como si se cuenta o no con
un genoma referencia e indudablemente del presupuesto con el que se disponga, pues en términos generales, el
costo por base es menor con la tecnología Illumina. Un
lane de Solexa/Illumina para RNA-seq en la actualidad
tiene un costo cercano a los 3000 dólares.
Como se mencionó anteriormente, Roche/454 produce
lecturas más largas con respecto a Solexa/Illumina; sin
embargo, cuando el propósito es realizar ensamblaje de
Novo, es decir, sin genoma de referencia, lo más reco106
mendable es obtener lecturas más largas con el fin de
facilitar el ensamblaje. En este caso Roche/454 sería de
gran utilidad; no obstante, es necesario considerar que
el número de lecturas obtenidas no será muy alto. Si se
dispone de un presupuesto cuantioso se puede realizar
un elevado número de lecturas, lo que facilitará el ensamblaje. Alternativamente, si se cuenta con un genoma
referencia, las lecturas cortas obtenidas con Illumina
pueden ser la mejor opción, ya que no es necesario ensamblar el transcriptoma completo y el alto número de
lecturas que se generan darán mayor confiabilidad a
los datos para la cuantificación de la expresión y para
otros fines como la detección de polimorfismos [Ozsolak
y Milos, 2011].
Para el ensamblaje de las lecturas existe una amplia
diversidad de programas bioinformáticos disponibles.
Hay programas especializados en la eliminación de
barcodes, eliminación de ruido, etc. Si se trata de un
ensamblaje de Novo, las lecturas serán ensambladas a
partir de contigs, es decir, en secuencias sobrelapadas,
de allí la importancia de tener secuencias más largas.
Algo importante de este tipo de ensamblaje es que es
posible encontrar transcriptos que pueden no estar representados en el genoma, como por ejemplo eventos
de splicing alternativo o genes que no se expresan bajo
la condición de estudio [Strickler et al., 2012].
Dentro de los programas bioinformáticos aplicados al
ensamblaje y análisis de RNA-seq se encuentra por
ejemplo Scriptuture, desarrollado en el Massachusetts
Institute of Technology. Este se ha empleado para el
estudio del transcriptoma de ratones [Guttman et al.,
2010]. Trinity es otro programa ampliamente usado, el
cual fue desarrollado por Broad Institute y la Hebrew
University of Jerusalem, que permite la reconstrucción de transcriptos, reconoce eventos de splicing alternativo y es especializado en análisis de muestras que
no tienen genoma de referencia [Grabherr et al., 2011].
El programa R ya ha diseñado un paquete estadístico,
denominado DEGseq, dirigido al análisis de la expresión diferencial entre muestras y tratamientos [Wang
et al., 2010]. Además de estos, actualmente existen
muchos otros programas útiles, probados y de acceso
gratuito [Ward et al., 2012].
Uno de los objetivos al emplear la tecnología de RNAseq no es solo identificar la presencia de transcriptos,
sino la de cuantificar el nivel de expresión de cada uno.
En este sentido aquellas lecturas que se encuentren en
alta proporción representarán niveles altos de expre-
sión de determinado gen y aquellos transcriptos ausentes, o con un bajo número de lecturas, serán aquellos que o no se expresan o lo hacen a niveles muy bajos
[Schenk et al., 2012]. En algunos casos se realizan
normalizaciones químicas en las librerías ADNc con el
fin de igualar su abundancia. De esta manera aquellos
transcriptos altamente expresados no serán los únicos
para los que se obtengan lecturas en la secuenciación
[Ward et al., 2012]. Para este fin existen comercialmente diferentes kits, y por lo general están asociados con
cada plataforma de secuenciación. En otras situaciones lo que se desea es comparar el perfil de expresión
génica entre diferentes muestras que pueden corresponder a tratamientos, tejidos o condiciones.
Para los análisis de las lecturas generadas por RNAseq es muy frecuente el uso de varios parámetros estadísticos. Uno de ellos es el RPKM (del inglés reads per
kilobase of exon per million mapped reads). Con este
parámetro es posible cuantificar niveles de transcriptos,
y facilita la comparación entre muestras [Mortazavi et
al., 2008]. Otro parámetro útil y muy usado es el fold
change de las lecturas que corresponde a la división del
número de lecturas generadas para un gen particular
en una muestra vs. el de la otra. Al estimar este
parámetro es posible correlacionar la expresión de un
gen en dos condiciones distintas, así como establecer
radios de expresión génica diferencial entre tratamientos [Auer y Doerge, 2010].
RNA-seq y sus aplicaciones enfocadas al estudio
de interacciones planta-patógeno
Dentro de los retos de la fitopatología están el detallar
cómo los patógenos son reconocidos por sus hospederos y cómo se establecen interacciones de resistencia y
susceptibilidad. En este sentido la biología molecular y
la bioinformática, así como el estudio de la expresión
génica en eventos de patogenicidad han contribuido de
manera importante [Verhage et al., 2010; Lodha y
Basak, 2012; Schenk et al., 2012].
Actualmente el entendimiento molecular que se tiene
de las interacciones planta-patógeno ha permitido desarrollar un modelo de la función y evolución de la inmunidad vegetal [Jones y Dangl, 2006]. Según este
modelo denominado zigzag, el primer evento o fase de
la respuesta de resistencia consiste en la capacidad de
reconocimiento de moléculas conservadas en los
microorganismos conocidas como PAMP (del inglés
pathogen associated molecular patterns) o MAMP (del
inglés microbe-associated molecular patterns). Dentro de
las moléculas reconocidas de este tipo, las más estudiadas son la flagelina (flg22) [Felix et al., 1999; Chinchilla
et al., 2006], el factor de elongación Tu (EF-Tu) [Zipfel
et al., 2006], los lipopolisacáridos (LPS) y la quitina
[Kaku et al., 2006]. El reconocimiento de PAMP depende de proteínas denominadas PRR (del inglés
pathogen recognition receptors), las cuales son proteínas
de reconocimiento ubicadas generalmente en la membrana plasmática de la célula vegetal [Gómez-Gómez y
Boller, 2000; He et al., 2007; Boller y Yang He, 2009;
Zipfel, 2009; Thomma et al., 2011].
El primer PRR identificado y más estudiado es el receptor de flg22, denominado FLS2, el cual es una proteína transmembranal con un dominio extracelular rico
en repeticiones de leucinas (LRR, leucine rich repeats)
y un dominio serina/treonina kinasa intracelular, posiblemente encargado de la comunicación de la señal. La
proteína FLS2 es clasificada como un receptor con actividad kinasa (RLK, Receptor-Like Kinase) [GómezGómez y Boller, 2000; Asai et al., 2002]. No fue hasta el
2006 cuando se hizo posible la clonación del receptor
EFR que reconoce al PAMP EF-Tu, el cual también es
de tipo RLK [Zipfel et al., 2006]. Esta primera respuesta basada en la interacción entre PAMP-PRR es
denominada como inmunidad mediada por PAMP o PTI
(PAMP triggered immunity). Este tipo de inmunidad
generalmente detiene la infección antes de que el microorganismo comience su multiplicación y es suficientemente efectiva contra patógenos potenciales no adaptados [Chisholm et al., 2006].
Una vez que se da la percepción del ligando por parte de
los PRR se desencadena una cascada de señalización
mediada principalmente por MAP Kinasas (del inglés
mitogen associated protein kinase) [Gohre y Robatzek,
2008; Colcombet y Hirt, 2008; Beckers et al., 2009], que
finaliza con la activación de factores de transcripción, lo
que conlleva a una reprogramación en la expresión génica.
Por ejemplo, en Arabidopsis se ha establecido que la inducción de la expresión de los genes FRK, At2g17740 y
WRKY22/29 es un criterio diagnóstico de la activación
de la PTI [Asai et al., 2002; Shan et al., 2008]. Adicionalmente estas respuestas están asociadas con eventos de apertura de canales iónicos en la membrana
plasmática, producción de especies reactivas de oxígeno
y fortificación de paredes celulares a través de la deposición de callosa [Buchanan et al., 2000; Zipfel, 2008; 2009].
Durante la evolución, un grupo particular de patógenos
desarrolló un tipo especial de proteínas denominadas
107
Soto y López
efectoras, que al ser inyectadas al interior de las células
de las plantas hospederas bloquean la PTI y logran una
colonización exitosa [Jones y Dangl, 2006]. Este tipo de
interacciones se denominan compatibles, y el resultado
para la planta es el desarrollo de la enfermedad. Según
el modelo zigzag propuesto, este tipo de interacciones
cae bajo el concepto de ETS (del inglés effector triggered
susceptibility); sin embargo, las plantas frente a esta
situación desarrollaron una segunda rama de la inmunidad basada en el reconocimiento de proteínas efectoras
del patógeno, tercera fase del modelo zigzag. Esta inmunidad es denominada como ETI (del inglés effector
triggered immunity). La ETI depende de la presencia de
proteínas de resistencia que pueden reconocer, de manera directa o indirecta, efectores. Este reconocimiento
desencadena una reacción de incompatibilidad o resistencia [Chisholm et al., 2006; Jones y Dangl, 2006; Dodds
y Rathjen, 2010]. De manera similar a la PTI, parte de
las respuestas desencadenadas durante la ETI incluyen
la reprogramación de la expresión génica. El estudio de
esta reprogramación permite conocer los mecanismos
moleculares de respuesta, y es susceptible de ser estudiada mediante la técnica RNA-seq.
La inducción de varios genes importantes para la defensa vegetal se ha identificado durante las respuestas
ETI. Producto de la expresión de estos genes se encuentran las proteínas PR (del inglés pathogenesis-related
proteins) [Loon y Strien, 1999]. Algunas proteínas codificadas por estos genes PR tienen actividad quitinasa
y glucanasa. En la cascada de señalización que lleva a la
transcripción de estos genes, el ácido salicílico SA (del
inglés salycilic acid) y el etileno desempeñan una función reguladora y sinérgica. Asimismo, se ha encontrado que la activación de grupos de genes PR puede ser
mediada por patógenos a través de un mecanismo llamado resistencia sistémica adquirida o SAR (del inglés
systemic acquired resistance). Para que este mecanismo
ocurra, la infección inicial debe resultar en una lesión
necrótica, como parte de una respuesta hipersensible o
HR (del inglés hypersensitive response). La activación
de SAR produce una reducción de los síntomas de la
enfermedad ante un siguiente ataque del patógeno e
incluso algunos otros tipos de patógenos no relacionados con el de la primera infección [Durrant y Dong,
2004].
Las proteínas PR son una gran familia, y aunque muchas de ellas fueron inicialmente encontradas en tabaco
y en Arabidopsis, su inducción por patógenos se ha reportado en diversas especies vegetales [Loon y Strien,
108
1999]. Más aún, su reconocida actividad de defensa ante
eventos de patogénesis ha convertido a estos genes PR
en genes marcadores de defensa, y ha hecho que la medición de los niveles de su expresión sea ampliamente
utilizada en estudios de interacciones planta-patógeno
[Slaughter et al., 2012; Zhang et al., 2012].
La reprogramación de la expresión génica durante las
reacciones de PTI, ETS y ETI ha sido bastante estudiada en diferentes patosistemas a través de la aplicación de microarreglos o cDNA-AFLP (del inglés
amplified fragment length polymorphism). En el modelo
Arabidopsis, a través del estudio de perfiles de expresión de ARNm con microarreglos y frente a interacciones con P. syringae, fue demostrado que las respuestas
entre interacciones compatibles (bacteria virulenta), incompatibles (bacteria avilurenta) y no hospedero (P. syringae pv. phaseolicola), son similares, y que las diferencias en expresión encontradas son cuantitativas en
cuanto a la intensidad y en la rapidez con la que se
producen; sin embargo, la respuesta vegetal en la
interacción incompatible es robusta en términos de altos niveles de expresión de los genes de resistencia RPS2
y RPM1, los cuales activan la respuesta mediada por
los genes avr avrRpt2 y avrB, avrRpm1 de P. syringae
[Tao et al., 2003]. Asimismo, el empleo de microarreglos
contribuyó a la identificación del receptor EFR que
reconoce el PAMP Ef-Tu [Zipfel et al., 2006]. También
recientemente esta técnica permitió profundizar en el
entendimiento de la actividad de las citoquininas en la
inmunidad vegetal, y puso en evidencia que este
fitorregulador regula positivamente el incremento de
las respuestas de defensa mediada por ácido salicílico y
más aún, que este último tiene una retroalimentación
negativa al inhibir la señalización de citoquininas
[Argueso et al., 2012].
De manera más general los microarreglos han permitido el estudio de la reprogramación génica en Arabidopsis
en respuesta a virus [Whitham et al., 2003], a hongos
[Ramonell et al., 2002] e incluso a nematodos [Puthoff
et al., 2003]. También se han empleado microarreglos
de papa para el estudio de las interacciones incompatibles con Phythophtora [Avrova et al., 1999], pero también durante la interacción compatible [Restrepo et al.,
2005]. En arroz los perfiles de expresión por microarreglos se han estudiado frente a infección por patógenos
como Xanthomonas oryzae pv. oryzae y Magnaporthe
oryzae [Li et al., 2006].
En cuanto al uso de cDNA-AFLP para análisis de
transcriptomas vegetales en patosistemas, esta ha sido
aplicada fundamentalmente para la búsqueda de perfiles polimórficos, relacionados con la expresión de genes
frente al ataque por patógenos [Birch y Kamoun, 2000;
Durrant et al., 2000]. También a través de cDNA-AFLP
se han estudiado perfiles de expresión relacionados con
respuesta hipersensible en tabaco y tomate [Vandenabeele et al., 2003; Gabriëls et al., 2006], así como en
resistencia sistémica adquirida en Arabidopsis [Maleck
et al., 2000]; sin embargo, como se mencionó antes, estas técnicas o bien requieren de pasos de hibridación
como los microarreglos, o poseen una baja cobertura
de transcriptos. Esto hace que la alternativa del uso de
RNA-seq sea llamativa y muy prometedora.
Antecedentes del uso de RNA-seq en interacciones
planta-patógeno
Los primeros trabajos de secuenciación de ADNc en
plantas se llevaron a cabo en Medicago truncatula,
Arabidopsis thaliana y Zea mays con la tecnología 454.
En estos reportes se identificaron más de 17 000 genes
de Arabidopsis, 25 000 secuencias genómicas en maíz
que no estaban anotadas ni tenían similitud alguna con
otras especies, y 400 SSR (del inglés simple sequence
repeats) en M. truncatula [Cheung et al., 2006; Emrich
et al., 2007; Weber et al., 2007]. Desde entonces el RNAseq mostró ser altamente sensible y prometedor para
el análisis profundo de transcriptomas en plantas. Dado
lo novedoso de la técnica, los estudios en interacciones
planta-patógeno, en donde se hace uso de RNA-seq,
son escasos. A la fecha se han reportado estudios en
Arabidopsis thaliana, algodón y soya, pero en otras especies como yuca y maíz las investigaciones están en
desarrollo.
Uno de los trabajos más recientes enfocado al análisis
de múltiples genomas y transcriptomas en Arabidopsis
con el uso de RNA-seq reveló que la variación en los
niveles de expresión génica es mucho mayor en genes
que están involucrados en respuestas a estrés biótico.
Asimismo, que los genes de resistencia de las subfamilias
NB-LRR (del inglés nucleotide binding leucine rich
repeat), coiled-coil, receptores Toll interleuquina-1 y
genes relacionados con defensa codifican para proteínas más variables que aquellas codificadas por genes
del metabolismo basal [Xiangchao et al., 2011].
En el patosistema algodón-Verticillium dahliae se reportó inicialmente, mediante microarreglos, cambios
transcriptómicos en las respuestas de defensa de 211
genes, así como la activación de la respuesta de defensa
basal correspondiente a la PTI y a la rápida produc-
ción de fitoalexinas, terpenoides y felipropanoides [Cui
et al., 2000]. No obstante este conocimiento, el entendimiento de las respuestas de defensa del algodón ante
V. dahliae era limitado. Recientemente, a través de la
aplicación de RNA-seq y la plataforma Illumina, se logró obtener el primer análisis global del transcriptoma
de defensa en algodón. En este estudio se pudo
monitorear los perfiles de expresión en raíces a las 4,
12, 24 y 48 h posinoculación (hpi), se detectó expresión
diferencial en más de 3000 genes, lo que permitió enriquecer el entendimiento de cómo los genes involucrados
en actividad enzimática, especialmente en la ruta
metabólica fenilpropanoide, están involucrados en eventos de respuesta [Xu et al., 2011]. También se reportaron niveles de lignificación y actividad enzimática
contrastante, así como expresión génica diferencial en
plantas resistentes y susceptibles al hongo.
En soya, con RNA-seq, fueron mapeados más de 43 000
genes con el genoma referencia de esta especie, y se estudiaron expresiones diferenciales de más de 1000 genes en
líneas casi isogénicas a las 0, 6 y 12 hpi con Xanthomonas
axonopodis pv. glycines (Xag), agente causal de la BPL
(del inglés bacterial leaf pustule) de la soya. Asimismo,
bajo este enfoque, se detectó la sobrexpresión de PRR y
genes que son inducidos por estos en líneas resistentes a
Xag [Kim et al., 2011]. En esta investigación se unieron
tres réplicas biológicas de cada tiempo 0, 6 y 12 hpi, se
corrió un lane de Illumina para cada uno de ellos y se
obtuvo más de 125 millones de reads. También en soya y
con la tecnología Illumina, pero en un estudio de la roya,
otra de las enfermedades más limitantes de este cultivo,
recientemente se analizaron patrones de expresión de
genes con el objetivo de dilucidar los eventos moleculares
que ocurren tras la infección por parte del hongo
Phakopsora pachyrhizi [Tremblay et al., 2011]. En plantas susceptibles y en etapas avanzadas de infección, un
alto porcentaje de genes involucrados en el metabolismo
de síntesis de aminoácidos, carbohidratos y lípidos fueron detectados con regulación negativa. Por el contrario, muchos otros genes relacionados con rutas metabólicas implicadas en defensa se sobrexpresaron en etapas
iniciales de la infección. De acuerdo con los autores,
muchos de los genes encontrados en este trabajo han
dado luces para el desarrollo de un programa de mejoramiento genético enfocado a lograr resistencia amplia contra la roya de la soya a través de sobrexpresión o silenciamiento génico [Tremblay et al., 2011].
El RNA-seq también ha sido aplicado para análisis de
perfiles transcriptómicos en fitopatógenos. Es el caso
109
Soto y López
de Phytophthora phaseoli, agente causal del mildeo velloso en lima bean, Phaseolus lunatus. Poco se conoce de
la base molecular de la interacción de este oomycete con
su hospedero. En esta investigación con la tecnología
Illumina para RNA-seq se compararon los transcriptomas de tres tratamientos: el primero P. phaseoli creciendo bajo condiciones de cultivo, el segundo P. phaseoli
infectando a P. lunatus tres días posinoculación (dpi), y
el tercero a los seis dpi. Se trabajaron dos réplicas biológicas por tratamiento y un total de 150 millones de
reads fueron obtenidos. Los resultados mostraron similitud en 10 427 genes de P. phaseoli con el genoma de
P. infestans, de los cuales 318 son genes putativos de
virulencia, y que mostraron ser sobrexpresados en los
transcriptomas del patógeno en interacción con la planta
[Kunjeti et al., 2011]. Este reporte muestra que esta
herramienta también tiene un gran potencial en investigaciones direccionadas hacia el estudio de transcriptomas en fitopatógenos.
Sin duda la implementación de RNA-seq está dentro de
las actuales y futuras proyecciones de investigación en
diversos patosistemas. A modo de ejemplos está el maíz
(Zea mays-Aspergillus flavus) y la yuca (Manihot esculentaXanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam)). En maíz
se planea encontrar genes expresados diferencialmente
entre líneas susceptibles y resistentes, así como integrar esta información del transcriptoma con la presencia de QTL (del inglés quantitative trait loci), ya reportados de resistencia a la acumulación de aflatoxinas
producidas por el patógeno [Kelley et al., 2010].
En yuca actualmente se desarrolla una estrategia en
donde se combinará la información arrojada por RNAseq de líneas resistentes y susceptibles a Xam y el
genoma referencia, con el fin de asignar funciones putativas a muchos de los 35 000 genes de la yuca. Asimismo se busca identificar los genes que se inducen o reprimen frente al ataque de la bacteria, y finalmente realizar
identificación de SNP con el fin de establecer relaciones
entre estos marcadores y QTL para resistencia [López
y Bernal, 2012]. Este enfoque contribuirá de manera
determinante no solo en el mejor entendimiento de la
interacción molecular de este patosistema, sino también aportará información para incrementar el número
de marcadores presentes en el mapa genético de yuca,
lo que facilitará la clonación de genes R contra la
bacteriosis vascular de yuca.
De igual forma, hoy por hoy es factible la posibilidad
de profundizar en preguntas como ¿cuáles son aquellos
110
genes que son expresados en el hospedero ante el ataque de un fitopatógeno?, incluso, ¿cuáles son aquellos
genes que son expresados en una planta dentro de un
sistema heterólogo no hospedero?, ¿cuáles son aquellos
genes que se expresan en el patógeno frente a la
interacción con su hospedero?, ¿cuál es el nivel de esta
expresión?, ¿en qué momento después de iniciada la
interacción ocurre?, ¿de manera temprana o tardía?,
¿cuáles son esos nuevos transcriptos que no pudieron
ser identificados con previas técnicas para análisis de
transcriptoma?, ¿cómo en determinado patosistema la
estructura génica en cuanto a exones y sitios de splicing
alternativo están relacionados con activaciones de respuestas de defensa? Las respuestas a estos y otros
cuestionamientos pueden encontrarse bajo el enfoque
de RAN-seq.
Conclusiones, retos y perspectivas futuras
• El secuenciamiento masivo de ADNc permite ampliar los rangos de detección de transcriptos que se
lograron en su momento bajo la herramienta de
microarreglos. Es evidente el gran potencial que tiene el RNA-seq en cuanto a reconocimiento de genes
relacionados con defensa, factores de transcripción
involucrados en activaciones de respuesta génica y
determinación de expresión diferencial, incluso cuando el conocimiento del genoma es escaso o incluso
nulo.
• Asimismo, el conocimiento generado por el RNA-seq
contribuirá de manera importante dentro de programas de fitomejoramiento. Con la información generada será posible la identificación de nuevos genes
blancos para su uso en transformación genética, en
búsqueda de expresión génica que se traduzca en el
desarrollo de plantas resistentes a patógenos. Con
seguridad, en el futuro cercano la literatura enfocada a interacciones planta-patógeno contendrá un sinnúmero de reportes alrededor de esta herramienta
transcriptómica. Más aún, las tecnologías de NGS
avanzarán, y en esa medida la herramienta se volverá cada vez más poderosa, mejorarán sus rendimientos, se podrán obtener lecturas más largas en un
menor tiempo, y por supuesto a menores costos.
• El secuenciamiento directo de ARN es uno de los
mayores retos que presenta la técnica; sin embargo,
las investigaciones, desarrollos y comprobaciones al
respecto están en marcha, y pronto la alta oferta de
esta tecnología será una realidad [Ozsolak et al., 2009;
Ozsolak y Milos, 2011]. Asimismo, el reto computacional es grande, el análisis de millones de lecturas
que generan archivos de tamaños enormes requiere
del desarrollo de herramientas bioinformáticas cada
vez con mayor capacidad de análisis, rendimientos
más altos, procesos de ensamblaje más sencillos, así
como con capacidad de caracterización precisa de estructura y dinámica de transcriptoma. Estos son
otros de los retos que tiene esta poderosa herramienta
transcriptómica para los próximos años.
• El reto para la fitopatología es explotar la utilidad
de esta herramienta transcriptómica y a través de
ella profundizar en el entendimiento de las complejas interacciones planta-patógeno, así como revelar
eslabones moleculares involucrados que hasta hoy no
habían podido ser revelados.
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113
Normas editoriales
Objetivos y alcance
Fitosanidad se dedica a la publicación de artículos originales básicos y aplicados, comunicaciones cortas y revisiones, investigaciones biológicas
y tecnológicas relacionadas con la sanidad vegetal en las especialidades de entomología,
micología, virología, bacteriología, fitopatología,
malezas, taxonomía, biología de plagas, métodos de diagnóstico, nuevos reportes de plagas,
protección de cultivos; control químico y biológico, tecnologías de reproducción de especies benéficas, antagonistas y metabolitos con actividad
biológica; en los campos de cuarentena vegetal;
interacción patógeno-hospedante y resistencia
genética; prácticas culturales; eficacia química,
impacto ambiental y residuos de plaguicidas,
ecología, epidemiología y pronóstico de plagas,
medios y métodos de aplicación de plaguicidas,
manejo de plagas y biología molecular.
Tipos de contribuciones
1. Artículos originales de investigación (artículos
científicos). Deben informar los resultados
de investigaciones originales. Los materiales no deben haber sido publicados previamente excepto en forma preliminar. Los
trabajos tendrán la estructura siguiente: título, autor(es), afiliación de los autores, resumen y palabras claves (abstract y key words),
introducción, materiales y métodos, resultados
y discusión, conclusiones, agradecimientos (excepcionalmente si los hubiera) y referencias.
2. Comunicaciones cortas. Son notas de investigación cortas que tienen uno o dos resultados
de interés y novedad particular, pero no todo
el cuerpo de trabajo esperado de un artículo
completo. Deben ser temas de interés inmediato por su novedad o porque su impacto
tiene importancia en relación con el tiempo,
y serán publicados en un tiempo tan corto
como sea posible. Se espera que los autores
mantengan las Notas de investigación muy
concisas con título, autor(es), afiliación de los
autores, con un Resumen e Introducción muy
concisos, Métodos referenciados siempre que
esto sea posible, Resultados y Discusión combinados y un mínimo de referencias. La longitud no debe ser mayor de cuatro páginas
impresas en total, y debe adherirse a los
estándares científicos de la revista.
3. Artículos de revisión. Su contenido debe estar
dentro del ámbito del alcance de la revista y
cubrir temas con un interés actual. Pueden
someterse a consideración para su publicación
por los autores o por invitación mediante consulta con uno de los editores de la revista.
4. Notas al editor. Son bienvenidos comentarios o críticas útiles de materiales publicados
que se espera permitan un intercambio de
puntos de vista que sean beneficiosos para la
revista o los lectores. La decisión de la publicación de las cartas sometidas descansa puramente en la decisión del editor principal.
Envío de artículos en línea
o por correo electrónico
El envío de un artículo implica que el trabajo
descrito no ha sido publicado (excepto en la
forma de un resumen como parte de una tesis
académica o memoria de evento), que no ha
sido sometido a consideración para publicación en otro lugar y que su publicación esté
aprobada por todos los autores, y tácitamente por las autoridades responsables donde el
trabajo se desarrolló, y que después de publicado, no lo será con el mismo formato en
otro lugar, en inglés o en otro idioma sin el
consentimiento de Fitosanidad.
El envío de los artículos será totalmente por vía
electrónica, usando la guía presente para preparar el artículo. Le será enviada una carta al autor a cargo de la correspondencia, confirmando
su recepción. Una vez aceptado, a los autores se
les solicitará una transferencia de los derechos
de autor antes de pasar a arbitraje.
Requerimiento de formato electrónico
El formato electrónico es Word en cualquiera
de las variantes de Windows, en letra Arial,
con 11 de puntaje. Se debe mantener siempre una copia de resguardo del fichero electrónico para referencia y seguridad, y salvar el
fichero con la extensión.doc.
Documentos de W
or
d
Wor
ord
Los textos deben estar en formato de una sola
columna y mantener ese formato del texto lo
más sencillo posible. Pueden utilizarse cursivas,
negritas, subscritos, exponentes, etc. No incluir
o adjuntar ecuaciones o tablas diseñadas gráficamente, y prepararlas utilizando las utilidades
del procesador Word o del Excel. De usar divisiones al preparar tablas, debe usarse una sola rejilla para cada tabla individual, y no una para
cada línea o columna. Si no se usa rejilla, usar el
tabulador y no espacios para alinear las columnas. No importar las figuras dentro del fichero
de texto; en cambio, indicar la posición aproximada de la figura en el texto electrónico.
Preparación de manuscritos
1. Se aceptarán manuscritos en español o inglés.
2. Los artículos deben prepararse en papel tamaño carta 28 x 21,5 con márgenes de 2,5 cm
completamente, a 1,5 espacios (incluyendo
resumen, notas al pie y referencias). Cada
línea del texto debe estar numerada (utilizar
el formato de página del Word la opción de
numerado de líneas con reinicio en cada página). Con las opciones de formato de páginas descritas anteriormente, cada página incluye 25 líneas. Deben numerarse las páginas
del manuscrito, incluida la del título, referencias y las tablas; sin embargo, en el texto no
deben realizarse referencias al número de la
página, si fuese necesario referirse a secciones
del texto. No subrayar palabras. Evitar el uso
de excesivo de cursivas (itálicas) para enfatizar partes del texto.
3. El estilo de escritura debe ser totalmente
impersonal (tercera persona), con criterio
de exactitud, brevedad y párrafos cortos.
Debe utilizarse el sistema métrico decimal.
Los nombres científicos se escribirán completos, incluso el del autor, en su primera mención (ejemplo: Leucoptera coffeella Guerin
Meneville). Si es necesario utilizarlos en va-
rias partes del texto, entonces se escribirán
completos la primera vez que aparezcan y
luego se abreviarán (ejemplo: L. coffeella). Se
escribirán en cursiva o se subrayan.
4. Los manuscritos deberán en general organizarse en el siguiente orden:
• Título (debe ser claro, descriptivo y no
muy largo).
• Nombre(s) y dos apellidos de autor(es).
• Dirección postal completa o afiliaciones.
• Dirección electrónica del autor correspondiente.
• Resúmenes en español e inglés.
• Palabras claves (términos de indexación),
normalmente de tres a seis siguiendo el
tesauro de la FAO.
• Introducción. Debe definir claramente el
problema por el que se hizo el trabajo
investigativo, y tener una breve referencia actualizada de los antecedentes específicos del trabajo que se relacionan con
el tema que se presenta y cómo se ha
abordado por otros investigadores. Debe
redactarse en pasado. También se incluirá el alcance y el objetivo del trabajo.
• Materiales y métodos(material estudiado, descripción de métodos, técnicas). Deben ser claros y concretos, expresar la cantidad y calidad de los materiales usados y describir en
detalle los métodos y condiciones experimentales. Se redactarán según un orden
lógico. De igual forma, se escribirán claramente los procedimientos analíticos y estadísticos utilizados. Se pueden citar los métodos y procedimientos siempre que se hayan
publicado en revistas científicas de amplia
circulación. No incluir marca comercial alguna de equipos o agroquímicos. En este
caso se utilizará el del ingrediente activo.
• Resultados. Se pueden expresar apoyados en tablas y figuras o gráficos, con
una discusión a partir de referencias actualizadas, de manera lógica, interpretando las conclusiones. Las figuras se
deben elaborar solamente en Word, Excel
u otro programa compatible, nunca como
imágenes ni en colores.
• Discusión. Los resultados deben discutirse en relación con su impacto, novedad e
implicaciones de tipo científico-técnico,
y en apoyo o contraposición al conocimiento previo existente.
• Conclusiones. Deben ser breves y concretas y
estar en relación con la hipótesis experimental y los principales objetivos descritos.
• Reconocimiento o cualquier información
adicional concerniente a financiamiento
de la investigación, etc.
• Tablas.
• Pies de grabado de las figuras.
5. Al escribir el manuscrito, los títulos y subtítulos se harán en líneas independientes en
minúsculas.
Resúmenes y abstracts
Deben ser claros, descriptivos y con no más
de 300 palabras. Contendrán los aspectos
fundamentales y relevantes del contenido del
tema, materiales y métodos y los resultados,
con énfasis en la novedad y el impacto teórico-práctico de las conclusiones.
Fórmulas
1. Los subíndices y los exponentes deben ser
claros y no muy pequeños.
2. Brindar el significado de cada símbolo inmediatamente después de la ecuación en
que se utilicen.
3. Los niveles de significación estadística que
pueden mencionarse sin posterior explicación
son: *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001.
4. En las fórmulas químicas las valencias de
los iones deben ser dados como Ca2+ y no
como Ca++.
5. Los números de isótopos deben preceder el
símbolo: Ej.: 18O.
Nomenclatura
1. Los autores y editores están obligados a seguir los códigos internacionales que gobiernan la nomenclatura biológica (International Code of Botanical Nomenclature,
International Code of Nomenclature of
Bacteria, International Code of Zoological
Nomenclatura, Index Fungorum, etc.).
2. Todos los grupos bióticos (cultivos, plantas,
insectos, pájaros, mamíferos, etc.) deben
identificarse por sus nombres científicos.
3. Todos los biocidas y otros compuestos orgánicos deben identificarse por su nombre
de Ginebra cuando se nombran por primera vez en el texto. Los ingredientes activos
de todas las formulaciones incluidas en los
reportes deben igualmente identificarse.
4. Para la nomenclatura química se deben seguir
las convenciones de la Unión Internacional de
Química Pura y Aplicada, y las recomendaciones de la Comisión Combinada IUPAC_IUB
sobre nomenclatura bioquímica.
para los mejores estándares, con seguridad de
la claridad, precisión y alto nivel de detalles.
Puntos generales
1. Siempre suministrar ediciones de alta calidad de los dibujos.
2. Comprobar que se emplean letras y tamaños
uniformes en todas las ilustraciones originales.
3. Salvar el texto dentro de las ilustraciones
como gráfico o adjuntar el tipo de letra.
4. Evitar gráficas tridimensionales siempre que
la estructura de los datos así lo permita.
5. Numerar las ilustraciones de acuerdo con
su secuencia en el texto.
6. Usar una convención lógica para los ficheros de figuras y suministrar una lista separada de los ficheros y el programa utilizado.
7. Suministrar las ilustraciones como ficheros separados y una impresión en hojas separadas.
8. Hacer una lista separada de los pies de figura.
9. Producir las imágenes con el tamaño
aproximado de la versión impresa.
10. Las imágenes fotográficas al microscopio
deben venir acompañadas de una barra
escala (en la imagen, no debajo de ella), y
brindar en la leyenda el factor de aumento de la imagen.
Formato de las imágenes
Salvar los formatos de sus ilustraciones con
uno de los siguientes formatos y resoluciones:
TIFF: fotografías en gris (tonos medios). Usar
siempre un mínimo de 300 dpi.
TIFF: dibujos con líneas mapa de bits. Usar
un mínimo de 1000 dpi.
JPG: fotografías en gris (tonos medios). Utilizar siempre un mínimo de 500 dpi.
DOC, XLS, o PPT. Si se han creado las ilustraciones con una de las aplicaciones de
Microsoft Office, suministrarlas tal como son.
Tablas o cuadr
os
cuadros
Por favor NO
NO:
1. Las tablas o cuadros deben elaborarse de
acuerdo con las limitaciones de tamaño y
diseño de la revista. Siempre que sea posible se evitarán grandes tablas. Las columnas y líneas reversas frecuentemente reducirán las dimensiones de la tabla.
2. Si deben presentarse muchos datos, se recomienda dividirlos en varias tablas.
3. Deben numerarse de acuerdo con su secuencia en el texto. El texto debe contener
referencias a todas las tablas.
4. Cada tabla o cuadro del manuscrito debe
presentarse en una página independiente.
5. Cada una debe tener un título breve y explicativo por sí mismo.
6. Los encabezamientos de las columnas deben ser breves, pero suficientemente explicativos. Se añadirán entre paréntesis las abreviaturas estándares de las unidades de medida.
7. No colocar líneas verticales para separar
las columnas. Dejar un espacio entre ellas.
8. Las explicaciones esenciales para entender
el contenido de las tablas se deben colocar
como una nota al pie al final de ella.
• Suministrar los gráficos dentro de su
procesador de texto.
• Suministrar ficheros que se hayan optimizado para utilizarlos en pantalla (GIF,
BMP, PIC, WPG) debido a que su resolución es muy baja.
• Suministrar gráficos que sean desproporcionadamente grandes para el contenido.
Posición en el texto
Preparación de ilustraciones electrónicas
El envío de los dibujos y esquemas en un formato electrónico ayuda a producir el artículo
Marcar en el texto la posición aproximada de
la figura en el artículo.
Referencias
1. Se tratará que el número de referencias se
mantenga en el mínimo indispensable para
el soporte de las informaciones (ser más selectivo que inclusivo). Todas las referencias en el
texto serán presentadas en una lista de referencias en orden alfabético de los autores al
final del manuscrito. A cada cita en el texto le
corresponderá una referencia en la lista.
2. Las referencias solo serán de publicaciones
adecuadas al tema, todas necesarias, y al
menos el 60 % de los últimos cinco años y
listadas correctamente.
3. En el texto las referencias de publicaciones
hasta de dos autores se realizarán con los
apellidos y el año de la cita entre paréntesis
(ej.: Stover (1970); Stover y Mulder
(1978)). Las citas de artículos donde hay
más de dos autores, se citará el primero y
añadirá et al. (ej.: Stover et al. (1996)).
4. Las referencias citadas conjuntas en el texto deben escribirse en orden cronológico.
Las publicaciones de un mismo autor estarán en orden cronológico, y de haber
coautores por orden alfabético del segundo
autor. Las publicaciones de los mismos autores en un mismo año deben listarse con el
año y letras (ej.: 1974 a, 1974 b, etc.).
5. En el listado de referencias, evitar las comunicaciones personales y las inéditas, así
como el abuso de autocitas. Se colocará el
primer apellido del autor principal y luego
las iniciales de los nombres. para el resto de
los autores, primero la inicial y luego el primer apellido, en todos los casos separados
por punto y coma. Cuando una obra tenga
más de tres autores, se pondrá el apellido y
nombre de todos, a continuación el título
del artículo, el nombre de la revista en cursiva, así como volumen, número, páginas,
país de la publicación y año.
6. En el caso de los libros y folletos, después
del título escribir número de la edición, lugar de la publicación (ciudad o país), casa
editorial y páginas.
7. Los títulos de los artículos y ponencias se
pondrán entre comillas, mientras que los
referidos a libros y publicaciones periódicas, en cursiva o subrayados.
8. Las referencias de internet deben estar bien
escritas para poder acceder a ellas, y poner la
fecha de actualización del sitio y de consulta.
9. Para citar reuniones, simposios, congresos, etc.
se escribirá el nombre del evento (número, días,
mes, lugar donde se realizó y año de realización). Año de la publicación. Título. Mención
del editor (es). Ciudad y país de publicación.
Casa editorial. Páginas o volúmenes.
Envío de manuscritos
Los manuscritos se enviarán a: Instituto de
Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110
no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, La Habana, Cuba.
También pueden enviarse por correo electrónico a Revista Fitosanidad: [email protected]
No se aceptan manuscritos que no estén
acompañados de la Declaración de Originalidad y del Formato de Cesión de Derechos
Patrimoniales de Autor.
Arbitraje
Los trabajos enviados al Comité Editorial serán sometidos al proceso de dictaminación
por pares académicos, con la participación de
evaluadores externos, utilizando el sistema de
doble ciego. Los árbitros evaluarán las contribuciones de acuerdo con el formato de dictamen utilizado por la revista. Los resultados
del proceso serán enviados a los autores, quienes dispondrán de no más de 15 días para
enviar la versión corregida. El Comité Editorial se reserva el derecho de aprobar o rechazar los trabajos propuestos, lo cual será notificado oportunamente a los interesados.
Editorial standards
Objectives and scope
Fitosanidad journal is dedicated to the
publication of basic and applied original
articles, short communications and reviews,
of biological and technological researches
related to plant health, in the specialties of
entomology, mycology, virology, bacteriology,
phytopathology, weeds, taxonomy, pests
biology, diagnosis methods, new pests reports,
crops protection, chemical and biological control, reproduction technologies of benefic
species, antagonist species and metabolites
with biological activity, in the fields of plant
quarantine, pathogenic-host interaction and
genetic resistance, cultural practices, chemical
efficacy, environmental impact and pesticide
residues, ecology, epidemiology and pests
prognosis, means and methods of pesticides
application, pests management and molecular
biology.
Types of contributions.
1. Original investigation articles (scientific
articles): they must inform the results of
primary investigations. These materials
should not have been published previously,
except in preliminary form. The works will
have the following structure: title, author(s),
affiliation of the authors, abstract and key
words, introduction, materials and methods,
results and discussion, conclusions, acknowledgements (exceptionally if any), references.
2. Short communications: they are short
investigation notes that have one or two
results of interest and particular novelty,
but not the whole body of work expected
from a finished article. They must be
subjects of immediate interest because to
their novelty or because their impact in
relation to the time and they will be
published in at the earliest time. It is
expected that the authors should keep the
Investigation Notes very concise, with title,
author(s), affiliation of the authors, with
very concise abstract and introduction,
referenced methods whenever possible,
combined results and discussion, and a
minimum of references. The length should
not be greater than four pages printed on
the whole and must adhere to the scientific
standards of the magazine.
3. Review articles: their content should be inside
the scope environment of the magazine and
cover subjects with a present-day interest.
They can be subject to consideration for
their publication by the authors or by
invitation through consultation with one of
the editors of the magazine.
4. Notes to the editor: comments or useful critics
of published materials are welcome, which
are expected to allow an exchange of view
points that may be beneficial for the magazine or the readers. The decision of
publishing the submitted letters lies purely
on the Main Editor’s choice.
Sending of articles online or by e-mail
The mailing of an article implies that the
described work has not been published (except
in the form of an abstract as part of an
academic thesis or event memory), not
submitted to consideration for publication in
any other place and that its publication is
approved by all the authors and tacitly by
the responsible authorities where the work was
developed, and that after having been
published, it will not be published with the
same format in another place, in English or
in another language without the plant health
department consent.
Sending of the articles will be completely by
electronic way, using the present guide for
preparing the article. A letter will be sent to
the author in charge of the mail, confirming
its reception. Once accepted, transference of
the copyright will be requested from the
authors, before going on to arbitration.
Electronic format requirement
The electronic format is Word in any of the
variants of Windows, in Arial font type with a
size of 11. It is always necessary to keep a safety
copy of the electronic file for reference and safety,
and save the file with the extension .doc.
Wor
d documents
ord
The texts should have one column format.
Keep the text format as simple as possible.
Italics, bolds, subscripts, superscripts, etc. can
be used. Do not include or attach equations
or tables designed graphically; prepare them
using the tools of Word or Excel processor. If
you use divisions when preparing tables, a single cell for each individual table must be used,
and not one for each raw or column. If cells
are not used, then use the tabulator and spaces
not to align the columns. Do not import figures inside the text file; instead indicate the
approximated position of them in the
electronic text.
Preparation of manuscripts
1. Manuscripts in English or Spanish will be
accepted
2. The articles should be prepared with a page
size letter 28 x 21.5 with margins of 2.5 cm,
with a line and paragraph spacing of 1.5
(including abstract, footnotes and references). Each line of the text should be
numbered (use in the page layout of Word
the line numbers option of restart each
page). With the page layout options
described previously, each page includes 25
lines. The pages of the manuscript should
be numbered, including the title page,
references and tables. Nevertheless,
references to the page number should not
be made in the text, if making reference to
sections of the text is required. Do not
underline words in the text. Avoid the
excessive use of italics to emphasize parts
of the text.
3. The document should be completely impersonal (3rd person), with accuracy
criterion, conciseness and short paragraphs.
The metric system should be used.
Scientific names will be written completely,
even the one of the author, in his first
mention (e.g: Leucoptera coffeella Guerin
Meneville). If it is necessary to use them in
several parts of the text, then they will be
written completely the first time that they
appear and afterwards they will be
abbreviated (e.g: L. coffeella), they will be
written in italics or underlined.
4. The manuscripts should generally be
organized in the following order:
• Title (must be clear, descriptive and not
very long.
• Name(s) and two surnames of author(s)
• Complete mailing address or affiliations
• E-mail address of the corresponding
author.
• Abstracts in Spanish and English.
• Key words (indexing terms), normally
from three to six following the Multilingual Thesaurus of the FAO. Agrovec..
FAO. Rome. 2000. Available in: http://
aims.fao.org/es/pages/472/sub
• Introduction: it should clearly define the
problem originating the research work,
and having a brief up-to-date reference
of the specific antecedents related to the
subject shown and how it has been
approached by other investigators. It
should be drafted in past tense. The
objective and scope of the work will also
be included.
• Materials and methods: (studied material, description of methods, techniques):
they should be clear and exact, expressing
the amount and quality of the used
materials and describing in detail the
experimental methods and conditions;
they will be written according to a logical
order. Likewise, the used analytical and
statistical procedures will be written
clearly. The methods and procedures can
be mentioned provided that they have
been published in scientific magazines
of broad-coverage. Do not include
trademarks of equipment or agrochemical, in this case the name of the
active ingredient will be used.
• Results: They can be shown aided by
tables and diagrams or graphs, with a
discussion from up-to-date references, in
a logical way, interpreting the conclusions.
The figures should only be drawn up in
Word, Excel or any other compatible
program, never as images, or with colors.
• Discussion: Results should be discussed in
relation to their impact, novelty and
implications of scientific-technical type, and
in support of or against the prior knowledge.
• Conclusions: They should be brief and
exact, and be in relation with the experimental hypothesis and the main objectives
described.
• Acknowledgments or any additional
piece of information concerning financing of the investigation, etc.
• Tables
• Engraving feet of figures
5. When writing the manuscript, the titles
and subtitles are written in independent
lines, in small letters.
Abstracts
Preparation of electronic illustrations
They must be clear, descriptive and not greater
than 300 words. They must contain the fundamental and outstanding aspects of subject,
materials and methods and results content,
with emphasis in the novelty and the
theoretical-practical impact of the conclusions.
Sending drawings and diagrams in an
electronic format helps to produce the article
for the best standards, assuring the clearness,
precision and high level of details.
Formulas
1. Subscripts and exponents should be clear
and not too small.
2. Provide the meaning of each symbol after
the equation in which they are used.
3. The statistical significance levels that can
be mentioned without later explanation are:
*p<0.05, **p< 0.01 and *** p<0.001
4. In the chemical formulas, the valence of
ions must be given as Ca2+ and not as Ca++.
5. The numbers of isotopes must precede the
symbol e.g.: 18O.
Nomenclature
1. The authors and publishers are obliged to
follow the international codes that rule the
biological nomenclature (International
Code of Botanical Nomenclature, International Code of Nomenclature of Bacteria;
International Code of Zoological Nomenclature; Index Fungorum, etc.).
2. All the biotic groups (crops, plants, insects,
birds, mammals, etc.), must be identified
by their scientific names.
3. All the organic biocides and other compounds must be identified by their Geneva’s
name when they are named for the first
time in the text. The active ingredients of
all the formulations including in the reports,
must also be identified.
4. For the chemical nomenclature the
conventions of the International Union of
Pure and Applied Chemistry must be
followed and the recommendations of the
IUPAC-UB Combined Commission on
Biochemical Nomenclature.
Tables or Charts.
1. The tables or charts should be drawn
according to the size and design limitations
of the magazine. Whenever possible, great
tables will be avoided. The reverse columns
and lines will frequently reduce the
dimensions of the table.
2. If plenty of data should be shown, it is
recommended to split them in several tables.
3. The tables must be numbered according to
their sequence in the text. The text should
contain references to all the tables.
4. Each table or chart of the manuscript must
appear in an independent page.
5. Each one should have a brief and selfexplanatory title.
6. The headings of the columns should be
brief, but sufficiently explanatory. The standard abbreviations of the units of measurement should be added between parentheses.
7. Do not place vertical lines to separate the
columns. Leave a space between the
columns.
8. The essential explanations to understand
the content of the tables should be placed
as a footnote at the end of the table.
General points
1. Always provide high-quality editions of the
drawings.
2. Verify that uniform fonts and sizes are used
in all the original illustrations.
3. Save the text inside the illustrations as a
graph or enclose the font type.
4. Avoid three-dimensional graphs whenever
the structure of the data allows it.
5. Number the illustrations according to their
sequence in the text.
6. Use a logical convention for the files of
figures and provide a separated list of the
used files and programs.
7. Provide the illustrations as separate files
and a print in separate sheets of paper.
8. Make a separate list of the figures feet.
9. Produce images with a size similar to the
printed version.
10.Thephotographicimagesunderthe microscope
should be accompanied by a scale-bar (in
the image, not underneath it) and offer in
the legend the image magnification factor.
Format of the images
Save the formats of its illustrations with one
of the following formats and resolutions:
TIFF: gray photographs (middle tones) always
use a minimum of 300 dpi.
TIFF: drawings with bitmapped lines: use a
minimum of 1000 dpi.
JPG: gray photographs (middle tones) always
use a minimum of 500 dpi.
DOC, XLS, or PPT. If the illustrations have
been created with one of the Microsoft Office
applications provide them as they are.
Please DO NOT
NOT:
- provide the graphs inside thetext processor.
- provide files that have been optimized to
use them in screen (GIF, BMP, PIC, WPG)
because their resolution is very low.
- provide graphs that are disproportionately
big for the content.
Position in the text.
Mark in the text the approximated position
of figures in the article.
References
1. The amount of references most be the
minimum essential for the support of the
investigations (be rather selective than inclusive). All the references in the text will
be presented in a list of references in
alphabetical order of authors at the end of
manuscript. Each author cited in the text
may have a reference in the list.
2. References will only be of publications in
agreement with the subject, all of them
necessary, at least the 60% from the last
five years, and correctly listed by.
3. In the text, the references of publications
of up to two authors will be made using the
last names and the year of the citation
between parentheses e.g.: Stover (1970);
Stover y Mulder (1978); the article citation
where there are more than two authors,
the first author will be mentioned and add
et al. E.g: Stover et al. (1996).
4. The joint references cited in the text should
be written in chronological order. The
publications of a same author should have
a chronological sequence and if they have
coauthors should appear by alphabetical
order of the second author. The publications
of the same authors in a same year should
be listed with the year and letters, e.g: 1974
a, 1974 b, etc.
5. In the listing of references, avoid the personal communications and the unpublished
ones, and avoid the misuse of self-citations.
The last name of the main author will be
placed first then the initials of the names;
for the other authors, it should be first the
initial of the names and then the last name;
all the cases will be separated by semicolon.
When a work has more than three authors,
it will be written the last name and names
of all of them, then the title of the article,
the name of the magazine in italics, as well
as volume, number, pages, country of
publication and year.
6. In the case of books and leaflets, after the
title should be written the edition number,
place of the publication (city or country),
publishing house and pages.
7. The titles of articles and communications
will be placed in quotation marks, whereas
those referring to books and periodic
publications will be written in italics, or
underlined.
8. The Internet site references should be well
written in order to access to them, and place the site maintenance and consultation
date.
9. For citations of meetings, symposiums,
congresses, etc., write the name of the event
(number, year in which it took place,
location where it was carried out). Year of
publication. Title. Mention of the publisher
(s). City of the publication and country,
publishing house. Pages or volumes.
Sending of manuscripts
The manuscripts will be sent by mail to Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal.
Calle 110 no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, La
Habana. Cuba. CP 11600.
They can also be sent by e-mail to Fitosanidad
magazine: [email protected]
Manuscripts that are not accompanied with
the Declaration of Originality shall not be
accepted.
Arbitration
The works sent to the Publishing Committee
will be subject to a review in academic pairs,
with the participation of external evaluators,
using the double-blind system. Arbiters will
assess the contributions according to the
judgment format used by the magazine.
Results of the process will send back to the
authors who will have not more than 15 days
to send the correct version. The Publishing
Committee reserves the right to approve or
reject the proposed works, which will be
notified opportunely to the interested parts.
(Incluye costo de envío)
Suscripción anual y envío al exterior:
América: $45.00 Europa: $50.00
Resto del Mundo: $55.00
Envío de ejemplar suelto al exterior:
América: $ 15.00 Europa: $ 20.00
Resto del Mundo: $25.00
Distribución nacional:
Ejemplar MN: $10.00 – USD: $10.00
Anual
MN: $40.00 – USD: $40.00
Nota: Envíe por correo postal / Cada suscripción tendrá un acuse de recibo
Nombre y Apellidos/Name and Surname......................................................................................................................................................
Institución/Institution ....................................................................................................................................................................................
Profesión/Profession ......................................................................................................................................................................................
Dirección/Address ..........................................................................................................................................................................................
Código Postal/Zip Code ..................................................................... Ciudad/City ....................................................................................
País/Country ..................................................................... Telef./Telephone ………………………………. Telefax ………………………
Email ………………………………………………………….
Número de Cuenta y Agencia Bancaria ................................................................................
Se aceptan cheques en cualquier moneda libremente convertible,
excepto contra agencias bancarias comprometidas con el sistema
norteamericano de pagos.
¾ Cheque en MLC: Empresa CATEC, cuenta BICSA No. 32101146000
¾ Cheque en MN: Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal.
Calle 110 no. 514 e/ 5a. B y 5a. F, Playa, Ciudad de La Habana,
CP. 11600.
Cuenta No. 822
¾ Pago en la institución directamente o por intermediario
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