ηi(s) = I0 El efecto NOE I

EFECTO NOE
(Nuclear Overhauser Effect)
RMN
H1
H3
4
H4
H2
3
2
H2
1
H1
H3
NOESY
H4
H2
H1
H4
H3
El efecto NOE
NOE (Nuclear Overhauser Effect) Cambio de intensidad de una señal correspondiente
a un espín i cuando se perturba la señal de un espín s.
ηi(s) =
I-I0
I0
x 100 (%)
El cambio de intensidad puede ser positivo o negativo
La perturbación utilizada es la aplicación de una radiofrecuencia adicional y
selectiva sobre el espín i provocando su “saturación”
¿Por qué se produce?
El NOE es la consecuencia de la respuesta del sistema a la perturbación (intentos de
recuperar la situación de equilibrio)
El spin I y el S deben tener un mecanismo de relajación común (acoplamiento
dipolar)
Qué factores influyen en el NOE ? Distancia de los spins ( < 5 Å)
Movilidad de la molécula y/o grupos que la constituyen
Procesos de relajación que puedan competir con el que origina el NOE
FUNDAMENTOS RMN
m = -1/2
Núcleo de hidrógeno
Número cuántico espín nuclear I= 1/2
m= -I…+I
m = +1/2
-1/2
∆E = h υ
υ = Β0γ/2π
m = 1/2
Condiciones de equilibrio estado de
menor energía ligeramente más poblado
EL EFECTO NOE
Si consideramos un sistema de dos espines I1 e I2 podemos emplear el diagrama de energía:
N-δ
δ
N
I2
H
H
I1
N
N+δ
δ
poblaciones en el estado de equilibrio
Existen tres tipos de transiciones:
W1 cambio de estado de un único espín por relajación longitudinal (T1)
W0 cambio simultáneo del estado β
α para un espín y del estado α
β para el otro.
W2 cambio simultáneo de los dos espines en la misma dirección β
α
W0 y W2 requieren interacción dipolar entre los núcleos
EL EFECTO NOE
H
El NOE es la consecuencia de la respuesta del sistema a una perturbación
H
I2
(intentos de recuperar la situación de equilibrio)
I1
Invertimos las transiciones de I1
N-1/2δ
δ
W1
no
afecta
I2
N+1/2δ
δ
N-1/2δ
δ
relajación longitudinal
N+1/2δ
δ
(T1 espín-red)
poblaciones I1 saturado
Transiciones W1 originan señales en el espectro
W0 y W2 requieren interacción dipolar
entre los núcleos
Transiciones W0 y W2 no producen señales en el
espectro pero afectan a las poblaciones y dan lugar a NOE
Procesos de relajación cruzada
N-1/2δ
H
I2
N-1/2δ+∆
H
I1
N+1/2δ−∆
la transición W0 disminuye la diferencia de
población entre los niveles α y β de I2 y
después de un pulso 90 esto resultará en una
disminución de la señal I2 NOE negativo
N+1/2δ
N-1/2δ-∆
N-1/2δ
N+1/2δ
N+1/2δ+∆
la transición W2 aumenta la diferencia de
población entre los niveles α y β de I2 y
después de un pulso 90 esto resultará en
aumento de la señal I2 NOE positivo
El signo e intensidad del NOE depende del balance entre las velocidades de
cada una de estas rutas
Ejemplo: Sistema de 2 núcleos I, S de espín I =1/2 en la misma molécula
La población de cada nivel depende de su energía
de acuerdo con distribución de Boltzmann.
Si γS distinto de γI NOE heteronuclear
η Intensidad del NOE observado
σ = W2-W0 constante de velocidad de relajación cruzada
ρ = 2W
2 1+W2+ W0 velocidad de relajación dipolar longitudinal
Determina el signo y la magnitud del
NOE observado
Depende de los movimientos
moleculares
EFECTO NOE Y MOVIMIENTOS MOLECULARES
Las transiciones W0 y W2 requieren campos magnéticos con la frecuencia adecuada.
W0 diferencia de frecuencias de los núcleos ωI1-ω
ωI2 unas pocas ppms (100-1000 Hz)
W2 suma de las frecuencia de los dos espínes ωI1+ ωI2 (1000 MHz)
Estos campos magnéticos pueden ser generados por el movimiento de los espines. Por
tanto existe relación entre los proceso de relajación de las magnetizaciones de RMN y los
movimientos moleculares porque entre ambos procesos puede tener lugar intercambio de
energía.
B0
olo
di p
lu
sf
dip
o lo
s
nte
a
u
ct
dipolos fluctuantes
sf
lu c
tu a
nte
s
En solucion, (τc, tiempo de correlación ) significa rotación de la molecula (tiempo que
tarda en girar un radian). Los espines quedan alineados con el campo Bo
externo mientras la molecula rota, y esto genera campos magnéticos (dipolos
fluctuantes) a la frecuencia de la rotacion que permiten que el sistema libere o
intercambie energía magnética.
Si los movimientos moleculares son muy rápidos (moléculas pequeñas)
tendrán preferencia las transiciones de tipo W2 (frecuencias del orden de la suma de las
frecuencia de los dos espínes ωI1+ ωI2 (?1000 MHz).
Si los movimientos moleculares son lentos (macromoléculas) tendrán
preferencia las transiciones de tipo W0 (frecuencias del orden de la diferencia de las
frecuencia de los dos espínes ωI1- ωI2 (?1000 Hz).
FUNCIÓN DE CORRELACIÓN
1
volteo rápido
FT (transformada de Fourier)
volteo lento
C(t)
0
FUNCIÓN DE DENSIDAD ESPECTRAL J(ω
ω)
tiempo
C(t)= e –t/τ
c
τc tiempo de correlación
τc ps moléculas pequeñas
τc ns moléculas grandes
frecuencia
τc
J(ω)=
1+ω
ω2 τc2
• Como la probablilidad de que una transicion ocurra depende de las distintas frecuencias que el
sistema tenga (o densidad espectral), los terminos W son proporcionales a J(ω).
• Igualmente, como se necesitan una interacción dipolar entre los espines, el NOE es proporcional a
rIS-3(distancia entre los espines) ya que la intensidads de la interacción entre dipolos depende del
inverso del cubo de la distancia entre estos.
Por tanto las probabilidades de transición W van a depender de rIS-6 :
El NOE va a decaer muy rápido a medida que los espines se separen.
Para protones el NOE solo será observable cuando estén a distacias inferiores a 5-6 Angstroms)
J (0)
J(2w)
volteo rápido
J(ω)=
J(ω
ω)
τo
volteo lento
1+ω
ω2 τo2
frecuencia
NOEs positivos
Se requieren valores altos de la
función de densidad espectral a la
frecuencia ω = 2 ω0 se dan para τ0
cortos moléculas pequeñas
<
NOEs negativos
Cuando
Los efectos de las mecanismos W0 y W2 se
cancelan y no se observa efecto NOE
NOE max
Para τ0 largos domina el mecanismo W 0 y
tendremos NOEs negativos moléculas
grandes
6
0.5
4
2
0.0
0
-2
-4
-6
-8
-1.0
- 10
- 12
0
5
10
ωτc
ωτ
15
OBSERVACION EXPERIMENTAL DEL NOE
NOE estacionario
NOE transitorio
Experimentos
monodimensionales
bidimensionales
saturación
EXPERIMENTOS
NOE estacionario
1H
1D
90°
∆
τm
2D NOESY
τm
1D NOESY
Selective
90° or 270°
NOE transitorio
Selective
180°
τm
1D transient NOE
inversión
1H
Selective
180°
τm
1D DPFGSE NOE
PFG
1H
90°
*
∆
Selective
90° or 270°
τm
SL
τm
SL
*
2D ROESY
1D ROESY
2D
LAS DISTANCIAS INTERPROTÓNICAS
¿Pueden deducirse cuantitativamente?
¿Cómo se deducen?
HAY MUCHOS PROBLEMAS: flexibilidad
escala de tiempos de movimientos locales
Steady-state NOE
• In small, rigid molecules the following relationships are valid:
(ω
ωωI --ωωS))**ττc<<
1
(ω
I
S
c<< 1
ωωS **ττc<<
<<11
S
c
ωωS **ττc <<
1
S
c << 1
(ω
ωωI ++ωωS))**ττc<<
(ω
<<11
I
S
c
•They move really fast. There is a simplification of the probability equations, and
we end with a simple dependency for the NOE enhancement: ηI = 0.5.
•We had the rIS-6 dependency there and now it’s gone. The problem is that we
have only two spins, and this basically means no ‘geometry’. This is normally the
case for 1H-13C.
• Fortunately, when we look at the proton enhancements in a molecule, we are
always looking at more than one proton. This means that if we irradiate a proton, it
will be dipolarly coupled to several protons at the same time.
b
c
a
rba
rac
Steady-state NOE (continued)
• What happens is that we have competing relaxation mechanisms for the proton
we are saturating (two or more protons in the surroundings). Now the rates of the
relaxation with the different protons becomes important (the respective Ws).
• The equations get really complicated, but if we are still in the extreme narrowing
limit, we can simplify things quite a bit. In the end, we can establish a ‘simple’
relationship between the NOE enhancement and the internuclear distances:
fIf{S}
{S}==ηηmax **
I
max
rrIS-6-6--ΣΣX fXf {S}
* rIX-6-6
IS
X X{S} * rIX
rrIS-6-6++ΣΣX rrIX-6-6
IS
X IX
• In order to estimate distances between protons in a molecule we can saturate one
nuclei and analyze the relative enhancements of other protons. This is know as
steady-state NOE.
• We take two spectra. The first spectrum is taken without any irradiation, and the
second with. The two are subtracted, and the difference gives us the enhancement
from which we can estimate distances...
NOE difference spectroscopy
• If our molecule has three protons, two of them at a fixed distance (a CH2), we
have:
Hb
C
Ha
Hb
Hc
Ha
Hc
_
ηηab ∝∝rrab-6-6
ab
ab
=
ηab
ηac
rrac ==rrab **((ηηab / /ηηac ))-1/6
-1/6
ac
ab
ab
ac
ηηac ∝∝rrac-6-6
ac
ac
• Since we have a reference pair of protons (Ha and Hb) for which we know the
distance, we can establish a reference NOE effect for it, and then calculate the
distance between the other protons (Ha and Hc in this example):
• The sizes of the peaks are measured by integration. Since the effect is not
symmetric, we usually do the I
S and then the S
I enhancement and take an
average value.
Transient NOE
• One of the problems of steady-state NOE is that we are continuously giving
power to the system (saturation). This works well for small molecules, because W2
processes (double-quantum) are dominant and we have few protons.
• However, as the size and τc increase, other processes are more important
(normal single-quantum spin-spin relaxation and zero-quantum transitions).
• Additionally, there are more protons in the surroundings of a larger molecule, and
we have to start considering a process called spin diffusion:
I
S
• Basically, the energy transferred from I to S then diffuses to other nuclei in the
molecule. We can see an enhancement of a certain proton even if it is really far
away from the center we are irradiating, which would give us ambiguous results.
• Therefore, we need to control the amount of time we saturate the system. The
longer we irradiate, the more spin diffusion…
Transient NOE (continued)
• There are also some technical difficulties if we try to do this by selective saturation.
Since what we need is to see how a system returns to equilibrium through crossrelaxation, we can selectively invert one transition and then see how the NOE grows
with time:
(∗∗∗∗) αβ
ββ (∗∗)
W1I
W2IS
W0IS
W1S
βα ()
W1I
αα (∗∗)
W1S
• A pulse sequence to do this could be the following:
90
180s
tm
selective inversion
• The last π / 2 pulse is usually called a read pulse, and its only job is to convert
whatever magnetization is in <z> after tm into <xy> magnetization (detectable). All
the equations are the same, but the NOE will also depend on the mixing time, tm.
Transient NOE (…)
ηmax
• If we do it for different tm values, we
get NOE build-up curves, which in the
case of two isolated protons and ideal
conditions are exponentials that grow
until they reach ηmax.
tm
• If we also take into account the T1/T2
ηmax
relaxation, the NOE grows and then
falls to zero (all the magnetization
returns to the <z> axis…):
tm
Transient NOE and NOESY
• If we had more spins and spin diffusion, the curve (for three spins, I, S, and X)
would look like this:
ηmax
Diffusion to X
tm
• If we want to measure distances more or less accurately, we have to find a
compromise between the mixing time tm that we use and the spin-diffusion we may
have.
• Doing one proton at a time takes forever, so we obviously use a 2D experiment in
which we study all protons at the same time. The sequence is called NOESY (NOE
SpectroscopY), and it’s shown below:
90
90
t1
“inversion”
90
tm
1H
90°
∆
2D NOESY
τm
∆
90
90
etiquetado de
frecuencias
τ
inversión
90
m
evolución efecto NOE
PARÁMETROS EXPERIMENTALES
-Calibración del pulso de 90º
-Elección del tiempo de mezcla adecuado:
macromoléculas τm < 200 ms
moléculas pequeñas τm 600 , 700 ms hasta 1s
relajación
cruzada
NOESY (continued)
• The first two pulses (with the t1 variable time) are basically an inversion for all
protons, in which we label everything with chemical shifts and couplings (no refocusing).
• What ends up in the <-z> axis evolves during the tm mixing time, and dipolarly
coupled spins will suffer NOE cross-relaxation according to all the equations we’ve
seen.
• The 2D spectrum after 2D FT has chemical shifts in both f1 and f2 (t2 has all the
chemical shifts also) and cross-peaks for systems that are dipolarly coupled:
δ (f1)
Hc
Hb
Ha
C
Ha
Hc
Hb
δ (f2)
• The size of the cross-peak will depend on the internuclear distances. These are
measured relative to a cross-peak for which we know a distance, using the crosspeak volumes.
Efecto NOE : determinación de distancias experimentales
Aproximación de 2 espines en el límite de tiempos de mezcla cortos: La
velocidad inicial sólo depende de la relajación cruzada del par de espines. Si no
hay variación en el tiempo de correlación la velocidad inicial sólo depende de la
distancia internuclear.
A = exp [-R τm]
R=
ρi
σij σik ...
σji
ρj
aij = -σij τm ∝
1/ rij6
σij
2 espines
σjk ...
Tiempo de mezcla
σki σkj
ρk ...
...
... ...
...
aij = -σij τm +
Σσ
ik
σkj τm2 + ....
Las distancias:
Aproximación de spines aislados
Isolated spin pair aproximation (ISPA)
HO
OH
HO
HO
HO
OH
O
OH
H
O
H
H
r H1’-H4
=
1,5
1,0
0,0
NOE H1’-H4
0
250 500 750 1000 1250 1500
Tiempo de mezcla (ms)
σ H1’-H4
σ H1’-H3’
2,0
0,5
OH
NOE H1’-H3’
2,5
NOE(%)
O
=
r-6 H1’-H4
r-6 H1’-H3’
r H1’-H3’ σ H1’-H3’
σ H1’-H4
distancia conocida
2 espines
1/6
σij
M (0)= P0*P1
Tiempo de mezcla
Tratamiento de la Matriz de Relajación
R=
ρ1
σ12 σ13 ...
σ21
ρ2
σ23 ...
σ31 σ32
ρ3 ...
...
... ...
...
Ecuación de Solomon
d
η=- R. η
dt
NOEs directos
e indirectos
H
Σσ
ik
σkj τm2 + ....
H
Matriz A de Intensidades NOE
A = exp [-R τm]
En general se debe considerar toda la red de espines
aij = -σij τm +
H
j
i
k
Efecto NOE : Determinación de distancias experimentales
NOE ∝ r -6
Difusión de spín:
Efectos a 3 ó más espines pueden causar errores importantes en la distancia
NOESY problemas identificación : moléculas grandes picos indirectos igual signo picos directos
moléculas pequeñas distinto signo
2 espines
3 espines
Efectos a 3 espines pueden distinguirse por la pendiente de la curva de crecimiento de NOE.
Pendiente positiva a Tm cortos. Empleo de experimentos ROESY
OH
HO
HO
O
D
OH
O
HO
O
H
OH
H
C
H
H
B
OH
A
rAB=rAC
NOEAB>NOEAC
OH
HO
HO
O
OH
O
HO
O
H3
OH
H2
H1
HB
OH
NOESY
ROESY
Cuando
Los efectos de las mecanismos W0 y W2 se
cancelan y no se observa efecto NOE
NOE max
6
0.5
4
2
0.0
0
-2
-4
-6
-8
-1.0
- 10
- 12
0
5
10
15
ωτc
ωτ
σΝΟΕ = C . <r -3>2 . [ 6 J(2ω) - J (0) ]
σROE = C . <r -3>2. [ 2 J(0) + 3 J (ω) ]
ROESY:
Siempre +
ROE(τc)
0.5
0.0
NOEmax
ROEmax
-0.5
Magnetización confinada en el plano xy
mediante la aplicación de un pulso largo de
potencia intermedia.
Relajación dipolar conduce al efecto Overhauser
en el sistema rotatorio.
NOE(τc)
-1.0
1x10-11
1x10-10
1x10-9
1x10-8
τc [s]
Picos ROESY distinto signo que picos diagonales
Artefactos TOCSY del mismo signo que la
diagonal
σΝΟΕ = C . <r -3>2 . [ 6 J(2ω) - J (0) ]
σROE = C . <r -3>2. [ 2 J(0) + 3 J (ω) ]
Flexibilidad
A
rAB
A
B
NOE AB = f (r-6 AB )
B
A
NOE AB = f ( <r-6 AB> )
B
“virtual” Conformación de alta energía
Intercambio
‘virtual’
H
H2N
2.7-3.0 A
RO
OH
O
O
φ/ψ 0/−
0/−60
OH
H
NH2
H
OH
O
2.5 A
R
E (kcal/mol)
180
350
4
120
300
5
60
250
-150
-100
d15=2.5A
83%
g)
0
5
ψ( d
e
-50
-60
0
Φ( d
eg 50
)
-120
100
150
-180
d14=2.3A
17%
4
Conformación y flexibilidad
Ψ
NOEs exclusivos
NOE H1´-H4
‘syn’ 90-95%
AMBER mapa de energía
Ψ
‘anti’ 5-10%
NOE H1´-H3
<r-6> = χa <r-6 A> + χb <r-6 B>
<r’-6> = χa <r’-6 A> + χb <r’-6 B>
NOE ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL
Búsqueda conformacional
Estructuras generadas
Simulación de NOE: programa NOEPROM
Características:
•
•
•
•
NOE estacionario, 2D NOESY y 2D ROESY
Equilibrio conformacional
Simulación simultánea de toda la red de protones
Flexibilidad: modelos dinámicos
Distancias
modelo/s
Matriz de
relajación
Intensidades
NOE
Cálculos de NOE con matriz de relajación completa
El NOE teórico puede calcularse a partir de la/s conformación/ones
A = exp [-Rteór. τm]
NOEPROM:
R = -ln[Ateór. ] / τm
Tratamiento de múltiples conformaciones: Mapas de Energía, MD, SA,
-180-120 -60 0
180
120
120
60
y
60
% NOEteór.
60 120 180
180
0
0
-60
-60
-120
-120
-180
-180-120-60 0
f
-180
60 120 180
El problema inverso: DEDUCCIÓN DE LA ESTRUCTURA A PARTIR DE LOS NOE
Problemas con NOE
Ambigüedades en la asignación: quiralidad, pro-quiralidad,
solapamiento de señales → Considerar un conjunto de posibles
asignaciones del NOE.
Falta de asignación, asignación incorrecta, ruido, equilibrio
conformacional, solapamiento en pico diagonal
Distancias imprecisas → Introducir un cierto margen de error en la
distancia permitida produce imprecisión en la estructura. Su efecto
no es demasiado crítico si se tiene un número suficiente de
restricciones en esa zona de la molécula.
Matriz de distancias incompleta
Matriz R incompleta
Introducción de restricciones NOE en cálculos moleculares MM
Metodo I
Restricciones de distancia fijas previamente deducidas a partir de la
intensidad del NOE se introducen en el cálculo de la energía
Intensidad
NOE
restricción
distancia
A
Optimizar
geometría
B
dA-B < dmax
La optimización de la geometría se realiza mediante MM incluyendo un
término de pseudo-energía basado en las distancias NOE calculadas
E = EMM + Edist. + ...
Edist. = Σ f (rij-rij0)
funcion biharmónica
f (rij-rij0) =
Otras posibilidades de f : funcion cuadrada, cuadrada suavizada ó simétrica
0
(r - r0)n
Si r ≤ r0
Si r > r0
r0 valor deseado de distancia
Cálculo de estructuras
1028 NOES
234 intrarresiduo
405 corto alcance
101 medio alcance
288 largo alcance
1185 NOES
249 intrarresiduo
434 corto alcance
133 medio alcance
369 largo alcance
20 estructuras
RMSD 2,22 Å
20 estructuras
RMSD 1,66 Å
1407 NOES
261 intrarresido
472 corto alcance
185 medio alcance
489 largo alcance
20 estructuras
RMSD 1,03 Å
Introducción de restricciones NOE en cálculos moleculares MM
Metodo II
Se simula el propio efecto NOE con matriz R durante el refinamiento
Intensidad
NOEteórica/exp.
restricción
distancia
Optimizar
geometría
E = EMM + ENOE + ...
Esquema de algoritmos iterativos:
Estructura de partida
Espectros NOESY a varios τm
Matriz A teórica
Matriz A experimental
Matriz A mezclada
Matriz R
A = exp [-R τm]
Restricciones de distancia
Estructuras refinadas
Programas: IRMA, MARDIGRAS, CANDID, DINOSAUR, HADDOCK ...
Güntert et al., J. Mol. Biol., 2002, 319, 209-227
Dominguez, C. et al. J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 1731 - 1737
NOESY discodermolida
TR-NOESY disodermolida/tubulina
Conformación enlazada