Matrices libres de ácidos nucleicos: regeneración de

Matrices libres de ácidos nucleicos: regeneración de

Laboratorio clínico y biotecnológico
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Matrices libres de ácidos nucleicos:
regeneración de columnas de
extracción de ADN
El coste de la purificación de ácidos nucleicos ha sufrido un incremento en el
curso de los últimos años. Durante más de dos décadas se han ido desarrollando
sistemas de purificación de ADN y ARN más eficientes y focalizados a aplicaciones concretas [1,2]. El polvo de cristal (“glass milk”, “batch procedure” [3]), o
columnas de silica, permite protocolos rápidos y eficientes. Este logro técnico se
correlaciona con un incremento de costes en los procedimientos de purificación
puesto que las columnas de silica utilizadas hoy en día son de alta tecnología.
El hecho de que no todos los ácidos nucleicos son eliminados de la matriz de
silica después de su primer uso, hace que las columnas no se puedan reciclar.
Normalmente, entre el 5-10% de los ácidos nucleicos purificados queda atrapado en la matriz de silica. Este ADN residual contiene tanto moléculas libres
como moléculas complejas con partículas proteicas o fragmentos bacterianos
(Figura 1). Por tanto, incluso reutilizando las columnas para la preparación del
mismo plásmido, la capacidad de retención de ADN se reduce. Además, las
columnas que se han utilizado con moléculas de ADN recombinante deben ser
autoclavadas antes de desecharse par evitar peligros ecológicos. Como resultado, los laboratorios que utilizan este tipo de columnas para la purificación de
ácidos nucleicos no tan sólo están utilizando productos de alto coste, sino que,
además, se tienen que hacer cargo de los costes del manejo de residuos potencialmente peligrosos. Aquí presentamos el novedoso sistema de regeneración de
columnas para el uso de purificación de ADN MAXXBOND. Tanto la electroforesis con geles de agarosa [2] como el análisis con PCR [4] demuestran que las
columnas regeneradas están libres de ácidos nucleicos al 100%. Palabras clave:
columnas de retención de ADN, regeneración, potencial de ahorro, MAXXBOND.
Pronosticamos que el uso de columnas regeneradas puede llevar a la reducción del coste del aislamiento y purificación de ácidos nucleicos en más
del 70%. Para que un producto de regeneración
sea efectivo, debe cumplir algunos requisitos:
• debe ser rápido y sencillo
• debe eliminar completamente todos los ácidos
nucleicos (tanto los libres como los atrapados)
• no debe dañar la matriz de sílice
• debe regenerar por completo la capacidad de
unión de la columna
• debe ser asequible
Estos requisitos son cumplidos por los dos componentes del sistema MAXXBOND, que son el buffer de regeneración 1 (RG1) y el buffer de regeneración 2 (RG2). El proceso de regeneración es
análogo al usado en el aislamiento de ADN mediante columna, y permite una regeneración eficiente de las columnas en aprox. 30 minutos (ver
figura 2). En primer lugar, RG1 se pipetea en el interior de la columna y se incuba durante 30 minutos. Durante este paso, todas las moléculas residuales de ADN (tanto las libres como las atrapadas en partículas) son degradadas y liberadas de
la columna. Tests de incubaciones durante 24 horas demuestran que la columna y la matriz de sílice no son dañadas por RG1. RG1 se elimina mediante una centrifugación de 1 minuto.
Después, se aplica RG2 en la columna para eliminar e inactivar cualquier resto de RG1 y regenerar la capacidad original de unión de la columna.
Existe también la posibilidad de reunir un número mayor de columnas usadas y regenerarlas después al mismo tiempo.
Sistema de
regeneración de
columnas
de extracción de ADN
MAXXBOND Kit de reciclaje
en cuestión de aprox. 30 minutos
absolutamente exento de ADN
● inagresivo para el material de la columna
● biodegradable y no tóxico
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El nuevo procedimiento de regeneración MAXXBOND ha sido probado en varios laboratorios de
referencia durante varios meses y no se ha detectado ningún artefacto contaminante. Para verificar
que las columnas regeneradas mediante MAXXBOND no contienen trazas de ADN procedentes
de las muestras anteriores, dichas columnas fueron tratadas con 50 µl del tampón de elución adecuado y las muestras eluidas fueron analizadas. Se
utilizaron análisis en geles de agarosa y análisis de
PCR para verificar que en las muestras eluidas no
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clonificaciones, secuenciaciones y PCR.
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fragmentos
bacterianos
Figura 1: Principio y problemas asociados con la
purificación de ADN plasmídico utilizando
columnas. Después de que las moléculas de
ADN se atrapen en la matriz de silica, el ADN es
purificado con lavados y eluido. Dicha elución se
lleva sólo el 90-95% de las moléculas de ADN de
la matriz de silica. El ADN residual permanece
atrapado en la matriz en forma de moléculas
libres, inclusiones en partículas proteicas y/o
fragmentos bacterianos. Las moléculas de ADN
residual contaminan la columna y reducen la
capacidad de retención de ADN.
Biochemica Chemica Synthesis Service
Darmstadt tiene otra casa de primera:
AppliChem GmbH, Ottoweg 4, 64291 Darmstadt
Teléfono: 06151/9357-0, Fax: 06151/9357-11,
[email protected], www.applichem.com
Laboratorio clínico y biotecnológico
Regeneración de las columnas ADN en aprox. 30 minutos
1er paso:
eliminación de los
5-10% de ADN
residuales
2° paso:
Eliminación de los resíduos de
RG1 y regeneración de la capacidad
original de retención de la columna
20
Columna:
Plásmido:
Uso:
Incubación
por 30 min.
Centrifugación
Plásmido X
Centrifugación
directa
Figura 2: Esquema del procedimiento de regeneración de columnas de extracción de ADN mediante
el nuevo MAXXBOND. Se aplican a la columna sucesivamente 750 µl de las soluciones de regeneración
RG1 y RG2. El proceso completo de regeneración
se realiza en tan aprox. 30 minutos.
Producto PCR
Oligonocleótidos
era posible detectar moléculas de ADN residual
procedentes del primer aislamiento (ver figura
4A). Una misma columna de extracción puede ser
reutilizada hasta 20 veces para el aislamiento de
nuevas muestras de ADN.
El aislamiento de ADN plasmídico mediante columnas regeneradas con MAXXBOND cumple todos
los estándares de calidad para Biología Molecular y
resulta idéntico al aislamiento de ADN plasmídico
mediante columnas nuevas. El ADN obtenido con
las columnas regeneradas con MAXXBOND fue
probado con éxito en varias aplicaciones de Biología Molecular como screening de ADN plasmídico,
clonaje, digestiones de restricción, aislamiento de
fragmentos de ADN, ligamientos, transformaciones, etc. Como consideraciones adicionales al desarrollo y éxito del nuevo sistema de regeneración
MAXXBOND, destacan las características innovadoras de las soluciones que propone:
• Todos los componentes de MAXXBOND son
biodegradables, inofensivos o no tóxicos para
los seres humanos
Columna:
Plásmido:
Uso:
Figura 3: Demostración de la capacidad de
retención regenerada después de 20 ciclos de
uso. Las columnas A o B se usaron y regeneraron
durante 20 ciclos de purificación de ADN plasmídico originado a partir de cultivos celulares de E.
Coli. Las muestras de ADN eluidas se linearizaron mediante restricción enzimática y analizadas
en gel de agarosa. El gel fue fotografiado tras su
correspondiente tinción con Bromuro de Etidio.
Figura 4 A
Figura 4 B
Figura 4 A y B: Demostración de que las columnas regeneradas con MAXXBOND no contienen moléculas de ADN residuales de purificaciones previas. Se utilizaron las columnas C y D para la purificación del plásmido X. Después de la regeneración de las columnas se purifica un segundo plásmido Y
con las mismas columnas. Separación electroforética en gel analítico de agarosa (4A) de las alícuotas
equivalentes a las purificaciones de ADN. La gran diferencia entre los pesos moleculares de X y Y permiten la rápida identificación de cualquier tipo de contaminación. La segunda purificación de la muestra Y no contiene ninguna traza de la primera muestra X. El ADN plasmídico fue linearizado mediante restricción enzimática antes de la electroforesis. El análisis por PCR (4B) no identificó ninguna molécula de ADN en la primera purificación. Previamente a la purificación de la muestra Y, las columunas
C y D fueron tratadas con RG1 durante 24 horas y 5 minutos respectivamente. Entonces, se dispensaron 750 µl de RG2 en cada columna. Finalmente, se centrifugaron con 50 µl de buffer de elución
(10 mM Tris, pH 8.0). De estos 50 µl eluidos, alícuotas de 2 µl se añadieron a 50 µl de mezcla de
reacción PCR junto con los oligonucleótidos apropiados para el inserto X. (C1: Control con plásmido ADN X (1ng); 0: sin muestra; C2: Control con plásmido ADN X (1ng) y 2 µl de cada eluido posterior a la regeneración de la columna C y D; C: 2 µl de eluído de la columna C posterior a la purificación del plásmido X y regeneración (24h); D: 2 µl de eluido de la columna D posterior a la purificación del plásmido X y regeneración (5 min.).
• No utiliza ni ácidos ni bases agresivas. No se detectan daños ni en el material ni el equipo, incluso durante incubaciones prolongadas
• Las propiedades catalíticas y cooperativas de los
componentes de la solución causan una rápida
y eficiente eliminación o degradación de moléculas biológicas, como fragmentos de membrana, proteínas y ácidos nucleicos
• Las soluciones permanecen activas incluso en
rangos de pH de 6 a 8
El nuevo sistema de regeneración MAXXBOND
puede ser aplicado a todas las columnas que contengan matriz de sílice disponibles en el mercado.
Datos preliminares indican que otros materiales
de unión como polvo de vidrio o partículas minerales pueden también ser regenerados mediante
MAXXBOND.
El nuevo producto MAXXBOND está ahora disponible para científicos tanto del campo académico
como del industrial que intentan conseguir optimizar sus protocolos de aislamiento de ADN y reducir una parte sustancial de los costes. El sistema de
regeneración MAXXBOND y las soluciones están
pendientes de patente.
Bibliografia:
[1] Birnboim, H.C. & Doly, J. (1979) A rapid alkaline lysis procedure for screening recombinant
plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7, 1513-1522.
[2] Sambrook, J. et al., eds (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
[3] Vogelstein, B. & Gillespie, D. (1979) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 76, 615-619.
[4] Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J. & White, T.J. (eds) (1990) PCR Protocols – A guide
to methods and applications. Academic Press, Inc.,
San Diego, California
Anote el
Dr. Karl-Heinz Esser, Prof. Dr. Thomas Lisowsky
multiBIND biotec GmbH, Otto-Hahn-Str. 15,
D-44227, Dortmund, Alemania
Dr. Wolfram H. Marx
AppliChem GmbH, Ottoweg 4, D-64291 Darmstadt, Alemania