antigenos empleados en las pruebas inmunodiagnosticas para

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antigenos empleados en las pruebas inmunodiagnosticas para
BlOMEDlCA
Vol. 1, No. 4
- 1981
REVISIONES
ANTIGENOS EMPLEADOS EN LAS PRUEBAS
INMUNODIAGNOSTICAS PARA DETECTAR
ANTICUERPOS DE MALARIA
La serología en malaria se emplea de
rutina para: 1) evaluar las áreas maláricas
en estudios epidemiológicos: 2) confirmar
por laboratorio los casos sospechosos en los
cuales no se ha podido definir un diagnóstico
por el estudio de la gota gruesa y extendidos
de sangre periférica, y 3) el control de
potenciales donantes de sangre. Históricamente, en cada una de estas variables. las
pruebas se han aplicado para detectar o
estimar los anticuerpos maláricos que,
cuando están presentes, se encuentran con
frecuencia en relativos bajos nive1es;por lo
tanto, en el desarrollo de pruebas serológicas
para malaria se ha hecho énfasis en el
hallazgo de técnicas de alta sensibilidad,
minimizando la atención puesta a la especificidad de las reacciones antígenoanticuerpo.
La siguiente revisión no incluye la
evaluación de prueba alguna y se restringe a
considerar las preparaciones antigénicas
J e f e , M a l a r i a Vacccne P r o g r a n .
M a r v l a n d 2 0 8 1 3 U: S . A .
empleadas como reactivos en la defección de
anticuerpos antimaláricos. La especificidad
alcanzada en cualquiera de las pruebas es
función principal de los antígenos seleccionados y por ello. la discusión se centra en la
factibilidad y aplicabilidad de las preparaciones antigénicas utilizadas en cada una de
ellas. Las pruebas en sí mismas han sido
discutidas recientemente por Voller y Houba
(1)y descritas detalladamente en el memorando de WHO, "Serological Testing in
Malaria" (2). No se incluyen discusiones
sobre nuevas estrategias serológicas para
detectar parásitos, antígenos circulantes ni
complejos inmunes en la sangre.
1.
Técnicas de Anticuerpos por
Fluorescencia Indirecta [IFAJ:
Debido a que esta prueba emplea como
antígeno el parásito intracelular, es actualmente la más especie-específica dentro de
las que seleccionan como antígeno al pará-
Inimiii,oparasifolopy H r n r i c h . N a v a l M e d i c a l R e \ e a r c h I i i , t i t u t r .
I<efhr\da.
M i c r o b i i > I o e s , M a l a r i a V a c c i l i r P r o g r a m . [ r n r n u n o p a r a r i t o l ~ ~ tyl r a n r l i . N a v a l M e d i c t i l K r , r a r c h I i i ~ r i t i i l c .
t l r t l i r s d a . M a r y l ñ n d 2 0 8 1 4 U . S. A .
+ e s
B i ó l o g a , M a l a r i a V a c c i n e P r o g r a m . I r n r n u i i o p a r a a i t o l o g y Br;,iicli. N a v a l M r d i i a l K e \ i ~ r c l il i ~ r t i t u t r .
t l c l h e r d a . M a r y l a i i d 2 0 8 14 U . S . h .
""
l e f e d e la U n i d a d d c I n i i i u n o l o g í a d e h l a l a i i a . i ; i i i p o d e M i c r o h i o l o g i a . I i i i f i t i i i o N;ictondl d e S u l i i i l .
Boeoti. Colonihin.
N O T A : Este trabajo fue auspiciado por el "Naval Medical Research and Development Cornmand, Work
Unit No. M F 58.524.009.0095". Las aseveraciones y opiniones aquí expresadas son privativas de los
autores y no deben considerarse como oficiales o reflejo de los puntos de vista del "U. S. Navy
Department" o del Servicio Naval en general.
ANTIGENOS EMPLEADOS E N L A S PRUEBAS INMUNODIAGNOSTICAS PARA DETECTAR
sito homólogo. La técnica de IFA es considerada por lo general como el patrón de
comparación cuando se valoran otras
pruebas (3). El antígeno es colocado en
forma de extendido o gota gruesa de sangre
perasitada rica en esquizontes. el cual es el
estadío más reactivo del paresito. La sangre
infectada obtenida de un paciente con
Plasrnodium falciparum requiere de un
periódo corto de incubación a partir de la
sangría para alcanzar la maduración, por
cuanto en la sangre periférica sólo circulan
trofozoitos jóvenes (anillos).
Una de las fuentes obvias de paresitos
para la preparación del antígeno es entonces
un individuo infectado con las formas sanguíneas circulantes de una especia apropiada de Plasmodium. No obstante, esta fuente
representa un serio problema para los
laboratorios localizados en áreas de baja
endemicidad por cuanto requiere del acceso
a pacientes clínicamente enfermos. Como
fuente sustitutiva pueden emplearse primates del género Aotus trivirgotus infectados
con una cepa adaptada de cada una de las
especies del parásito; sin embargo. los Aotus
son demasiado costosos y difíciles de conseguir. Por otra parte, los cultivos in vitro de
estadíos eritrocíticos del parásito, constituyen una atractiva fuente alterna para los
laboratorios que no tienen acceso a infecciones activas (4). Desafortunadamente. el
desarrollo de este sistema está restringido
en el presente al P. falciparum, aun cuando
existe un informe preliminar sobre el cultivo
de P. vivax (5).
En ausencia de una fuente conveniente de
parásitos humanos. estos se han sustituído
con algún éxito por parásitos de simios
estrechamente relacionados. Como ejemplos
de este tipo de sustitución estan P. fieldi o P.
cynomolgi bastianelli. para P. falciparum (7,
8): P. brasilianum o P. fieldi, para P.
malariae (7) y P. cynomolgi para P. vivox (9).
Recientemente se ha sugerido (10) la sustitución de P. falciparum por P. berghei
parásito del ratón, pera esta elección puede
ser cuestionable en razón de las considerables diferencias que pueden presentarse en
los antígenos de estas dos diferentes
especies. No obstante como se ha demostrado
en pacientes con múltiples infecciones
previas (7). por los datos de tasas de
transmisión en malaria (11)y por estudios de
evaluación de la sensibilidad de la prueba
IFA (12). la sustitución del antígeno homólogo
por un heterólogo provee una información
valedera auncuando existe una disminución
de la especificidad de especie y de la
sensibilidad de la prueba. Además, el
empleo de antígenos heterólogos en estudios
seroepidemiológicos puede causar dificultades en la interpretación, cuando en un brea
malarica esta presente más de una especie
del parásito.
Con la prueba IFA pueden ocurrir reacciones cruzadas, necesitándose múltiples
evaluaciones con preparaciones de cada
especie del parásito para definir la especificidad de la reacción. Para reducir estas
pruebas múltiples se ha empleado la preparación de un antígeno único. producto de
una mezcla de células infectadas con
El mantenimiento del cultivo in vitro del P. especies diferentes del parásito (13).
falciparum y la producción continua de
formas maduras del parásito es un procediEn resumen. la principal ventaja de la
miento sencillo pero laborioso y en ocasiones prueba IFA radica en la especificidad de
costoso, limitando su utilización a laborato- especie y sensibilidad, ya que se emplea
rios
especializados
de
investigación. como antígeno al parásito intraeritrocítico
Además. no pueden ignorarse las posibilida- intacto. Este tipo de antígeno proporciona
des de cambios antigénicos en los parásitos los puntos de enlace naturales para inducir
mantenidos en cultivos por largos periódos los anticuerpos, lo cual lo hace superior a los
de tiempo. Langreth y sus colaboradores ( 6 ) antígenos preparados con extractos solubles
demostraron como algunas cepas manteni- crudos.
das en cultivo por tiempo prolongado perdían
Desde el punto de vista técnico. la
gradualmente el antígeno "knob", presente
en las membranas de los glóbulos rojos principal dificultad de la prueba reside en la
infectados con trofozoitos maduros o seg- obtención de una fuente adecuada de antígeno. Tal dificultad puede obviarse, en el
mentos de Plasmodium falciparum.
R. L. BEAUOOIN. J. M. RAMSEY. N. D. PACHECO.
caso de P. falciporum, estableciendo una
unidad central que produzca el antígeno a
partir del cultivo in vitro. para distribuirlo a
los laboratorios que no cuenten con un
sistema apropiado.
Las láminas portaobjeto con las preparaciones de sangre parasitada, puedensecarse
al aire y almacenarse durante varias semanas a temperatura ambiente con un desecante, facilitando así su transporte (2).
También pueden congelarse y mantenerse
almacenados hasta por 12 meses a -70°C
(121.
Para otras especies diferentes al P.
falciparum es imperioso contar con una
unidad que tenga acceso a los Aotus, para
producir antígeno con destino a los laboratorios dedicados al trabajo de serología en
malaria. La centralización de la producción
de estas especies es una medida importante
para la conservación de los primates,
mientras se desarrollan los métodos de
cultivo adecuados.
C. A. ESPINA1
dad o la especificidad de la prueba. lo que a
su vez puede influir en su reproductibilidad.
Por esta razón se deben preparar grandes
lotes de antígeno que se almacenan liofilizados (191. Debido a que se requieren muy
pocas cantidades de antígeno cuando la
prueba se lleva a cabo en placas de
microaglutinación, un lote de eritrocitos
sensibilizados es suficiente, por lo general.
para cubrir incluso amplios estudios seroepidemiológicos (20). Sin embargo, en algunos estudios longitudinales de larga duración, como el llevado a cabo durante diez
años por Armstrong en Etiopia (211, se han
encontrado fallas en la reproducibilidad.
debidas a las diferencias de reactividad
entre las distintas preparaciones antigénicas. No obstante. hay que resaltar que la
relativa poca cantidad de material que se
requiere por prueba y la posibilidad de
preparar y almacenar grandes lotes.
reducen la necesidad de contar con un
acceso regular a sangres infectadas para
preparar el antígeno, como es el caso de la
prueba IFA.
uso de cultivos eritrocíticos del P.
falciparum y los métodos más eficientes de
separación y aislamiento de parásitos (22.
En esta prueba la preparación antigénica 231, podrán incrementar la uniformidad
consiste en eritrocitos adsorbidos con ex- antigenica con el consecuente aumento en la
tractos solubles, crudos, de malaria.
sensibilidad y especificidad de la prueba. No
ha sido investigado convenientemente el
La prueba es relativamente sencilla de impacto que produzca sobre la especificidad
aplicar aún en condiciones de campo. pero de especie el empleo de antígenos heterólolos procedimientos para preparar elantígeno gos para la prueba IHA. En los estudios seroy para adsorber los eritrocitos portadores epidemiológicos la prueba IHA produce con
son complicados y solo pueden ser realizados frecuencia resultados falsos negativos en
por laboratorios experimentados. Los deta- población infantil y en niños menores infeclles para estos procedimientos han sido tados, incluso cuando sus sueros reaccionan
descritos amplia y adecuadamente (14. 15, a altos títulos con la prueba IFA (26). En un
r e
.o,
LO, 1 1 , LO,.
esfuerzo para aclarar las razones de tal
discrepancia. Bidwell y sus colaboradores
Debe anotarse, sin embargo, que la fuente (291, empleando el sistema Plosrnodium
de los eritrocitos portadores [cordero u folciparum-Aotus, demostraron que el antíhombre "O"), la manera como ellos son geno soluble en la prueba IHA falló en la
tratados (temperatura y tiempo de almace- detección de los anticuerpos inducidos
namiento, tamizado y método de fijación], las h r a n t e la parasitemia. Si estos anticuerpos
especies de Plasmodium [P. knowlesi, P. desarrollados durante la fase inicial de la
vivax o P. folciporuml, la fuente de las infección fuepon ciertamente detectados por
células infectadas (mono u hombre), asi la prueba IFA, es probable que los antígenos
como el método de extracción del antígeno empleados en las dos pruebas reaccionen
soluble, pueden afectar. todos. la sensibili- con diferentes anticuerpos.
2.
Técnica de Hemaglutinación Indirecta
VHAJ
.
ANTIGENOS EMPLEADOS EN LAS PRUEBAS lNMUNOOlAGNOSTlCAS PARA DETECTAR
El empleo de antígenos homólogos, su paración de antígenos específicos de meropurificación y la estandarización de los zoitos requiere excesivas manipulaciones de
reactivos deben elevar, en forma ponderable, los cultivos, lo cual puede complicar consila calidad de la prueba IHA y la interpreta- derablemente esta tarea. Aún más, es
posible que este sistema, por su misma
ción de los datos obtenidos en ella.
naturaleza, reduzca la sensibilidad de la
Tecnicos Inmunoenzimóticos: ELISA
técnica por que restringe el antígeno reactivo
Fnzyme-linked immunosorbent Assay)
solo a aquellos exo-antígenos liberados por
un solo estadío del parásito, en una infección
Auncuando la mayoría de los reactivos sincrónica.
basicos que se requieren para la prueba se
consiguen en el comercio, el antígeno debe Técnicas de Difusión en Gel (GDT)
ser preparado localmente. Brevemente, éste
se obtiene preparando un extracto soluble
Los antígenos empleados en las pruebas
de una sangre altamente infectada. Se de precipitinas para la serología en malaria.
sonica la sangre infectada y luego de centri- son de origen humano y consisten en dos
fugarla se retira el sobrenadante, rico en tipos principales: 1) antígenos placentarios.
antígeno, para con él cubrir los tubos de también utilizados en la IFA, obtenidos por
polipropileno o las placas de microtitulación lo general en el momento del parto a partir
(30, 31). La fuente de células parasitadas de placentas altamente parasitadas, (34).
puede ser un animal infectado (Aotus para 2) antígenos solubles, que circulan libreP. falciporum y Rhesus para P. knowlesi) o mente en la sangre de personas altamente
cultivos in vitro para P. folciporum (32). No infectadas (35).
se ha estudiado adecuadamente la especificidad de especie que tiene la prueba ELISA
El antígeno placentario, rico en parásitos
pero es de esperar que las preparaciones del maduros, se prepara como un filtrado del
antígeno soluble crudo no tengan mayor extracto acuoso, crudo. de placentas maceespecificidad que la encontrada en la radas. Por otra parte. el gran número de
prueba IHA. Por otra parte. los procedimien- antígenos solubles que se encuentran libres
tos para la preparación del antígeno y para en el plasma se pueden catalogar claramenel cubrimiento de los tubos o las microplacas te en 3 grupos principales: Los antígenos
son menos complicados que los de la prueba "L", que son termolábiles, destruyendose a
IHA y por lo tanto están sujetos a menos 56°C; los antígenos "R", que son termoresisvariaciones. Los lotes del antígeno para tentes, resisten temperaturas de 56°C pero
ELISA pueden prepararse y almacenarse en se destruyen a 100°C y los antígenos "S".
alícuotas a -70°C. para su posterior empleo que son completamente termoestables, no
en el tamizado de los tubos o las placas. siendo destruidos a 100°C.Cada uno de estos
Tanto el ELISA como la técnica IHA requie- grupos puede a su vez subdividirse; han sido
ren míniyas cantidades de antígeno, espe- identificados cuando menos 20 antígenos
cialmente- cuando se emplean las micro- "S" serológicamente diferentes (35).
placas.
Como los antígenos requeridos para la
Ambroise Thomas y sus colaboradores aplicación de la prueba de difusión en gel se
(33), demostraron que los exo-antígenos obtienen de individuos altamente infectados.
solubles presentes en el sobrenadante de en el momento actual su uso está restringido
cultivos de seis horas de merozoitos de a los laboratorios que tienen acceso a
P. folciporum, pueden ser empleados para población con infecciones clínicas. Aún más,
preparar las placas para la prueba de estos antígenos sólo son empleados para
ELISA e incluso, que se puede aumentar la detectar infecciones por P. falciporum.
especificidad cuando se emplean para
Cuando se emplean antígenos solubles
detectar las infecciones por esta especie; sin
embargo, no se ha determinado la posibilidad plasmáticos, se agrava el problema de un
de emplear estos exo-antígenos en estudios posible exceso de especificidad en la reacepidemiológicos. Debe anotarse que la pre- ción. No todos los antíaenos se encuentran a
R. L. BEAUOOIN.
J. M. RAMSEY. N. D. PACHECO. C.
un mismo tiempo y al parecer pueden presentarse seriadamente según el periódo de
la infección. con inducción de anticuerpos de
poca afinidad. Por lo tanto, en la actualidad
parece improbable el que se puedan vencer
todas las dificultades en la estandarización
para establecer el empleo de la prueba en
forma general y rutinaria. No obstante, los
antígenos "S" podrían usarse para serotipificar las infecciones Dor P. folci~arumen
diferentes localidadesA
(36). La
comunicación de que pueden obtenerse
antigenos solubles de P. falciporum, en
Aotus infectados (37), hace preveer que se
tenga una fuente alterna más conveniente.
Sin embargo. esta alternativa de emplear los
Aotus para la obtención de antígenos continuará siendo un problema por largo tiempo,
dado su costo y dificultad de consecución,
como fue enfáticamente discutido el tratar la
prueba IFA. El aislamiento de exo-antígenos
solubles, detectables por la prueba de ELISA
y producidos por cultivo de parásitos (33),
sugiere que puede ser viable la producción
in vitro de los antígenos empleados en las
pruebas de precipitación, como la GDT y por
lo tanto merecen un estudio más amplio.
A. ESPINA1
genos se preparan como extracto soluble de
sangre parasitada y están sujetos a las
mismas ventajas y desventajas discutidas
para la prueba de ELISA. Como es de
esperar, la sensibilidad es alta, pero su
especificidad, que depende de la pureza del
antígeno, no es mayor que la obtenida con
ELISA.
Otros Pruebas
Han sido descritas otras pruebas para
detectar anticuerpos contra los parásitos de
la malaria; por ejemplo, la aglutinación de
células infectadas por esquizontes, asi como
una variedad de pruebas de crecimiento in
vitro e inhibición de la reinvasión. Estas
fueron desarrolladas para satisfacer requisitos experimentales específicos y no han
sido adaptados aún para llenar las necesidades comunes en aplicaciones seroepidemiológicas o sero-diagnósticas. En su
estado actual no son aplicables o son
impracticables para un trabajo serológico de
rutina.
DISCUSIONES Y CONCLUSIONES
Técnicos de Radioinmunoensoyo (RIA)
Los antígenos empleados en las pruebas
serológicas para detectar los anticuerpos
inducidos por los parásitos de la malaria, se
agrupan en dos amplias categorías: 1)
parásitos intactos y 2) extractos solubles
preparados, bien de homogeneizados de
parásitos o bien de productos (exoantígenos), liberados por el parásito. en el
curso de una infección o cultivo. Las
mayores fuentes para la preparación de
estos antígenos están en los humanos o en los
primates no humanos infectados con las
apropiadas especies humanas del parásito.
La factibilidad de los cultivos de P. falciparum y más recientemente de P. vivax están
reduciendo considerablemente la dependencia de las infecciones activas en mamíferos,
con el fin de proveer los antígenos necesarios para las pruebas serológicas.
Las pruebas RIA no han sido empleadas
hasta ahora para fines sero-epidemiológicos
o sero-diagnósticos, sin embargo, se han
comunicado resultados sobre los métodos
indirectos, empleando antígenos de malaria
adsorbidos en eritrocitos de cordero (391, o
en placas de microtitulación (40). Los antí-
Es incuestionable que el primer requisito
que debe cumplir una prueba serológica
para detectar los anticuerpos en un individuo
infectado por parásitos de la malaria es su
sensibilidad. porque estos anticuerpos se
presentan a menudo en relativos bajos
niveles. dentro de la población de individuos
Los antígenos placentarios empleados en
la prueba GDT pueden prepararse en
relativos grandes lotes y son fácilmente
almacenables en estado de liofilización (3,
4). También los antígenos solubles "S" son
muy estables (38) y fácilmente se congelan y
almacenan indefinidamente a -70°C.
Las pruebas de precipitación, son considerablemente menos sensibles que las otras
pruebas tratadas. La GDT requiere. por otra
parte. soluciones de reactivos más concentrados para obtener el punto final de
reacción. Esta prueba es prácticamente
descartable por la limitación en los recursos
de antígeno y antisueros.
ANTIGENOS EMPLUOOS EN LAS PRUEBAS INMUNOOIAGNOSTICAS PARA DETECTAR....
sometidos a estudio. Por otra parte, la
especificidad reviste considerable importancia, ya que es ampliamente reconocido que los parásitos de la malaria comparten antígenos con otros agentes infecciosos
(V.g. espiroquetas) y. más importante aún
entre ellos mismos. Hay cuatro especies
diferentes del parásto responsables de la
enfermedad clínica en el hombre que requieren de una identificación específica. Como la
especificidad de cualquier prueba serológica
para detectar anticuerpos no puede ser
mayor que la del antígeno usado. se hace
imperativo extremar los cuidados para su
selección, procesamiento y estandarización.
Dentro de las preparaciones antigénicas de
uso más corriente. están los eritrocitos
intactos parasitados, empleados para la
prueba de fluorescencia indirecta, los que
pueden dar un alto grado de especificidad de
especie con los parásitos humanos homólogos. De igual manera, la identificación de
especies por cualquiera de los métodos
serológicos no puede hacerse si se e m ~ l e a n
antígenos beterólogos derivados de un par&sito de simio. Por otra parte. podría emplearse una prueba con reactivos como los de los
antígenos "S", que poseen una alta especificidad en su reactividad. pero cuya aplicación
generalizada tiene severas limitaciones.
Es indudable que la clave para incrementar la sensibilidad y la especificidad en las
pruebas serológicas para detectar anticuerpos de la malaria, depende de la selección de
antígenos mejor definidos. más altamente
purificados y mejor estandarizados.
AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan su agradecimiento a
la señorita Betty Leckey por su asesoría
editorial en la preparación del trabajo.
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La factibilidad de un sistema para producir P. folciparum en cultivos de eritrocitos,
provee una fuente de antígenos específicos
para esta especie, al igual que la reciente
comunicación preliminar sobre el éxito en el
cultivo de P. vivax 151.
. .. Darece brindar una
adecuada fuente de suministro de este
parásito para las pruebas serológicas en el
futuro. Deben favorecerse los intentos de
cultivar P. maloriae y P. ovale. Una vez
identificada una adecuada fuente de par$&tos
in vitro,
aúnla incognita
de su purificación. En un amplio sentido. la
purificación incluye el aislamiento del parásito, libre de antígenos extraños v- s e ~ a r a d o
por estedíos de evolución (22).
A
La purificación química de los antígenos
específicos. incluida la identificación de los
puntos de enlace con sus anticuerpos.
parece ser
más
los
sistemas disponibles. como el uso de 10s
anticuerpos monoclonales (41).
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