guidelines for the collection, preparation and analysis of organic

Transcripción

CEP Technical Report: 56
2009
GUIDELINES FOR THE COLLECTION, PREPARATION
AND ANALYSIS OF ORGANIC CONTAMINANTS IN
ENVIRONMENTAL SAMPLES
“Colombia, Costa Rica, and Nicaragua – Reducing Pesticides
Runoff to the Caribbean Sea” GEF-REPCar
Coastal Monitoring Programme
Guidelines for the collection, preparation and analysis
of organic contaminants in environmental samples
(water, soil/sediments, and biota)
August 2009
Note:
This document was prepared by Dr. José Sericano, of the Universidad Texas A&M in the
United States of America, in his capacity as consultant to UNEP for the GEF-REPCar Project
being financed by the Global Environment Facility (GEF).
The designations employed and the presentation of the materials in this document do not
imply the expression of any opinion whatsoever on the part of UNEP concerning the legal
status of any State, Territory, city or area, or its authorities, or concerning the delimitation of
their frontiers or boundaries. The document contains the views expressed by the authors
acting in their individual capacity and may not necessarily reflect the views of UNEP.
©2008 UNEP
Caribbean Environment Programme
14-20 Port Royal Street
Kingston, Jamaica
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nonprofit purposes without special from the copyright holder, provided acknowledgement of
the source is made. UNEP would appreciate receiving a copy of any publication that uses this
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No use of this publication may be made for resale or for any other commercial purposes
whatsoever without prior permission in writing of UNEP.
For bibliographic purposes the printed version of this document may be cited as:
UNEP: Guidelines for the collection, preparation and analysis of organic contaminants in
environmental samples (water, soil/sediments, and biota). Coastal Monitoring Manual for the
GEF-REPCar Project. UNEP-Caribbean Environment Programme, Kingston 2008.
Table of Contents
Page
1.
2.
3.
4.
5.
INTRODUCTION ....................................................................................................................
OBJETIVE OF THE PROJECT ...............................................................................................
SAMPLING DESIGN ..............................................................................................................
STUDY AREAS .......................................................................................................................
4.1. Colombia.........................................................................................................................
4.2. Costa Rica .......................................................................................................................
4.3. Nicaragua ........................................................................................................................
SAMPLING ..............................................................................................................................
5.1. General considerations ....................................................................................................
5.1.1. Personnel safety ...............................................................................................
5.1.2. Record keeping.................................................................................................
5.1.3. Sample integrity ...............................................................................................
5.1.4. Sample representativeness................................................................................
5.1.5. Containers ........................................................................................................
5.1.6. Preservatives ....................................................................................................
5.1.7. Transport and holding time ..............................................................................
5.1.8. Quality control in the field ...............................................................................
5.2. Preparation procedures prior to sampling .......................................................................
5.2.1. Logistic considerations.....................................................................................
5.2.1.1. Site access ........................................................................................
5.2.1.2. Field equipment ...............................................................................
5.2.1.3. Boat(s)..............................................................................................
5.3. Field collection criteria ...................................................................................................
5.3.1. Definition of station and site ............................................................................
5.4. Surface water samples ....................................................................................................
5.4.1. Site documentation ...........................................................................................
5.4.2. Sample collection .............................................................................................
5.4.2.1. Shallow sites (coastal marine areas or rivers/creeks) .....................
5.4.2.2. Deep sites (marine areas or large river) .........................................
5.4.3. Initial handling andl treatment of samples in the field .....................................
5.4.4. Pesticide samples .............................................................................................
5.4.5. Ancillary parameters ........................................................................................
5.4.6. Sample labeling ................................................................................................
5.4.7. Sample storage .................................................................................................
5.4.8. Chain of custody ..............................................................................................
5.5. Surface sediment samples ...............................................................................................
5.5.3. Initial handling and treatment of samples in the field ......................................
5.5.5. Ancillary parameters ........................................................................................
5.5.5.1. Grain size determination..................................................................
5.5.5.2. Total organic carbon and dry weight determination .......................
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Table of Contents (cont.)
Page
6.
ii
5.5.6. Sample labeling ................................................................................................
5.5.7. Storage .............................................................................................................
5.5.8. Chain of custody ..............................................................................................
5.6. Biota sample: Bivalves ...................................................................................................
5.6.3. Initial handling and treatment of samples in the field ......................................
5.6.5. Sample labeling ................................................................................................
5.6.6. Storage .............................................................................................................
5.6.7. Chain of custody ..............................................................................................
ANALITICAL PROCEDURES ...............................................................................................
6.1. Interference .....................................................................................................................
6.2. Quality control requirements ..........................................................................................
6.3. Extraction and purification of water samples .................................................................
6.3.1. Introduction ......................................................................................................
6.3.2. Application .......................................................................................................
6.3.3. Sample collection, preservation and storage ....................................................
6.3.4. Equipment and supplies ...................................................................................
6.3.4.1. Glassware and hardware .................................................................
6.3.4.2. Reagents ...........................................................................................
6.3.4.3. Analytical Standards ........................................................................
6.3.5. Procedure..........................................................................................................
6.3.5.1. Sample preparation..........................................................................
6.3.5.2. Sample extraction ............................................................................
6.3.5.3. Purification of the extract by column chromatography ...................
6.3.5.4. Silica gel/alumina column chromatography cleanup ......................
6.3.5.5. Florisil column chromatography cleanup .......................................
6.4. Extraction and purification of soil/sediment and biota samples .....................................
6.4.1. Introduction ......................................................................................................
6.4.2. Application .......................................................................................................
6.4.3. Sample collection, preservation and storage ....................................................
6.4.4. Equipment and supplies ...................................................................................
6.4.4.1. Glassware and hardware .................................................................
6.4.4.2. Reagents ...........................................................................................
6.4.4.3. Analytical Standards ........................................................................
6.4.5. Procedure..........................................................................................................
6.4.5.1. Dry weight determination ................................................................
6.4.5.2. Sample extraction ............................................................................
6.4.5.3. Purification of the extract by column chromatography ...................
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6.5. Quantitative determination of pesticides by gas chromatography/
electron capture detector .................................................................................................
6.5.1. Introduction ......................................................................................................
6.5.2. Detection limits ................................................................................................
6.5.3. Analytical quality control .................................................................................
6.5.3.1. Qualitative identification of target analytes ....................................
6.5.3.2. Calibration of the gas chromatograph ............................................
6.5.3.3. Solvent blank ....................................................................................
6.5.3.4. Degradation check solution .............................................................
6.5.4. Criteria for QC samples in an analytical batch.................................................
6.5.4.1. Laboratory blank .............................................................................
6.5.4.2. Laboratory blank spike and laboratory blank spike duplicate ........
6.5.4.3. Standard reference material ............................................................
6.5.4.4. Matrix spike and matrix spike duplicate ..........................................
6.5.4.5. Sample duplicate ..............................................................................
6.5.4.6. Surrogate standard recovery ...........................................................
6.5.5. Apparatus and materials ...................................................................................
6.5.5.1. Gas chromatograph/Electron capture detector ...............................
6.5.5.2. Analytical standards ........................................................................
6.5.5.3. Surrogate and internal standard spiking solutions ..........................
6.5.5.4. Target analyte spike solution ...........................................................
6.5.5.5. Degradation check solution .............................................................
6.5.6. Calibration of the gas chromatograph ..............................................................
6.5.7. Sample analysis ................................................................................................
6.5.8. Qualitative identification of target analytes .....................................................
6.5.9. Quantitative determination of target analytes ..................................................
6.5.9.1. Calibration and quantitative determination using a quadratic
equation ...........................................................................................
6.5.9.2. Calibration and quantitative determination using an exponential
equation ...........................................................................................
6.5.9.3. Dilution of sample extracts ..............................................................
6.5.9.4. Manual calculation check ................................................................
6.5.10. Sample analysis - QA/QC Parameters .............................................................
6.5.10.1. Surrogate standard recovery ...........................................................
6.5.10.2. Relative percent difference ..............................................................
6.5.10.3. Recovery of target compounds in spiked samples and standard
reference materials ..........................................................................
6.5.11. Gas chromatograph maintenance .....................................................................
6.5.12. Documentation .................................................................................................
6.5.13. Reporting ..........................................................................................................
iii
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Page
6.6. Quantitative determination of carbamate insecticides by
high performance liquid chromatography .......................................................................
6.6.1. Introduction ......................................................................................................
6.6.5.1. High performance liquid chromatograph/
fluorescence detector .......................................................................
6.6.5.3. Target analyte spike solution ...........................................................
6.6.6. Calibration of the high performance liquid chromatograph .............................
6.6.7. Sample analysis ................................................................................................
6.6.9.2. Manual Calculation Check ..............................................................
6.6.10. Sample analysis - QA/QC Parameters .............................................................
6.6.10.1. Relative percent difference ..............................................................
6.6.10.2. Recovery of target compounds in spiked samples and
standard reference materials ...........................................................
6.6.11. High performance liquid chromatograph maintenance ....................................
6.6.12. Documentation .................................................................................................
6.6.13. Reporting ..........................................................................................................
6.7. Determination of triazine herbicides by gas chromatography/mass spectrometry .........
6.7.1. Introduction ......................................................................................................
6.7.5.1. Gas chromatograph/Mass spectrometer ..........................................
6.7.6. Calibration of the gas chromatograph ..............................................................
6.7.7. Sample analysis ................................................................................................
6.7.9.2. Manual Calculation Check ..............................................................
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Page
7.
6.7.10. Sample analysis - QA/QC Parameters ............................................................. 77
6.7.10.1. Surrogate Recovery.......................................................................... 77
6.7.10.2. Relative percent difference .............................................................. 77
6.7.10.3. Recovery of target compounds in spiked samples and
standard reference materials ........................................................... 77
6.7.11. Gas chromatograph and mass spectrometer maintenance ................................ 77
6.7.12. Documentation ................................................................................................. 77
6.7.13. Reporting .......................................................................................................... 78
6.8. Calibration, data analysis and calculations ..................................................................... 78
6.8.1. Preparation of spiking solutions (surrogate and internal standards and target
analytes) ........................................................................................................... 78
6.8.1.1. Surrogate standards ......................................................................... 78
6.8.1.2. Internal standard ............................................................................. 79
6.8.1.3. Target analyte spike solutions ......................................................... 79
6.8.1.4. Organochlorine insecticide spike solution....................................... 80
6.8.1.5. Modern insecticide, fungicide, and herbicide spike solution ........... 80
6.8.1.6. Triazine herbicide spike solution ..................................................... 81
6.8.1.7. Carbamate insecticide spike solution .............................................. 82
6.8.2. Calibration Solutions ........................................................................................ 82
6.8.2.1. Organochlorine insecticides ............................................................ 82
6.8.2.2. Modern insecticides/fungicides/herbicides ...................................... 83
6.8.2.3. Triazine herbicides .......................................................................... 84
6.8.2.4. Carbamate insecticides .................................................................... 84
6.8.3. Analytical Sequence ......................................................................................... 85
6.8.4. Calibration and quantitative determination ...................................................... 86
6.8.4.1. Calibration curve using the surrogate standard .............................. 88
6.8.4.2. Calibration curve without using the surrogate standard ................. 89
6.8.5. Calculation example ......................................................................................... 91
6.8.5.1. Surrogate Recovery.......................................................................... 92
6.8.5.2. Quantitative determination of analyte “X” concentration
using the surrogate standard ........................................................... 92
6.8.5.3. Quantitative determination of analyte “X” concentration without
surrogate standard ........................................................................... 94
6.9. Reporting ........................................................................................................................ 95
REFERENCIAS ....................................................................................................................... 100
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List of Figures
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Figure
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Station Network to evaluate pesticides runoff from agricultural lands
to the Colombian Caribbean Sea ..............................................................................................
Distribution of pineapple and banana plantations along the Costa Rican
Caribbean coast. Arrows indicate the proposed sampling areas ...............................................
Sampling sites in Costa Rica ....................................................................................................
Selected basins to evaluate pesticides runoff from agricultural lands
to coastal areas of Nicaragua ....................................................................................................
Water sampling flowchart.........................................................................................................
Collection of water sample at shallow locations ......................................................................
A simple sampler design to collect water samples at a predetermined
water depth ...............................................................................................................................
Criteria for collection of sediment samples flowchart ..............................................................
Sediment sampling flowchart ...................................................................................................
Bivalve sampling flowchart ......................................................................................................
Flowchart illustrating the procedure described for the analysis of different
pesticides in water samples .......................................................................................................
Flowchart illustrating the procedure described for the analysis of different
pesticides in soil/sediment and biota samples...........................................................................
Organochlorine insecticides by GC/ECD .................................................................................
Modern insecticides by GC/ECD. ............................................................................................
GC/MS chromatogram of triazine herbicides ...........................................................................
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Modern and legacy pesticides(*) identified as target analytes for this project...........................
Sampling areas in selected watersheds and coastal areas of the Costa Rican
Caribbean Sea. ..........................................................................................................................
List of minimum sampling gear ................................................................................................
Recommended pretreatment of water sample containers .........................................................
Preservation and maximum holding time for water samples ....................................................
Bottom sediment grab samplers................................................................................................
Recommended pretreatment of soil/sediment sample containers .............................................
Preservation and maximum holding time for soil/sediment samples .......................................
Identification of target bivalve species .....................................................................................
Recommended pretreatment of biota sample containers ..........................................................
Preservation and maximum holding time for biota samples.....................................................
Relevant methods of the United States Environmental Protection Agency
(U.S.EPA) .................................................................................................................................
Summary of QC requirements for quantitative analysis ...........................................................
Quantitation and confirmation ions for the analysis of triazine herbicides by GC/MS ............
Common qualifiers to characterize the data .............................................................................
Analytical quality control requirements of accuracy and precision..........................................
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List of “Step by step guides"
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Water sample extraction ..........................................................................................................
Silica gel/alumina column chromatography cleanup ................................................................
Florisil column chromatography cleanup .................................................................................
Determination of percent dry weight in solid samples .............................................................
Soil/sediment or biota sample extraction ..................................................................................
Definition and procedure for the determination of the method detection limits .......................
Degradation Check ...................................................................................................................
Dilution of a sample extract......................................................................................................
Example of manual calculation check ......................................................................................
Quantitative determination using the surrogate standard .........................................................
Quantitative determination without the surrogate standard ......................................................
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FOREWORD
The intensive use of pesticides in agriculture in American countries entails a growing risk regarding
their runoff into the Caribbean Sea. If tropical climate is favorable for the production of a wide
variety of crops such as banana, coffee, rice, coco, oil palm and pineapple, among others; it is also
propitious for the establishment of pests, which has resulted in the increased usage of insecticides,
fungicides and herbicides. Once they enter the marine environment, these pesticides become a serious
threat to the coral reefs and marine grasslands, placing at risk favorable environments for the
reproduction of fish as well as the important tourist activity in the region and overall health of the
population.
Colombia, Costa Rica and Nicaragua started the challenge of reducing pesticide runoff from
agricultural lands into the Caribbean Sea and improving the quality of coastal and marine waters
trough a monitoring programme in their coastal zones. This project focuses on the study and
occurrence of current-use pesticides in fresh and marine water, soil/sediments and biota samples, and
includes some of the most persistent pesticides (i.e., legacy pesticides) as indicators of the reach of a
potential runoff.
Measurement of target pollutants for the "Colombia, Costa Rica and Nicaragua - Reducing Pesticides
Runoff to the Caribbean Sea" project should be of the highest quality to assist decision makers with
the protection of the Caribbean Sea and the sustainable use of its resources. This guide describes in
detail the sampling design, including the preparation of the sampling material and the type of sample
to collect for the analysis of different pesticides as well as the analytical procedures and calculations
for the final report. In each step, the analyst is guided to achieve the precise and accurate results
required for this programme.
ix
Guidelines for the collection, preparation and analysis of organic contaminants…
1.
INTRODUCTION
Different scientific studies have reported that coral reefs and marine pastures in the Caribbean Sea
could be seriously threatened by pesticides, placing at risk the important tourist activity in the region,
the health of the population and endangering favorable environments for the reproduction of fish. A
report by the World Research Institute indicates that nearly two-thirds of the region’s reefs are
directly threatened by human activities, and estimates future economic losses from diminished coral
reef fisheries, dive tourism and shoreline protection services at between US$350 – US$870 million
per year (Burke & Maidens, 2004). The report concludes that the process can be reversed with the
commitment and action from governments and private sectors across the Caribbean region.
Appropriate decisions for the protection and the sustainable use of the resources in the Caribbean Sea
require reliable, high quality information on the status and trends of environmental conditions. In
response to this need for information on the effects of human activities on environmental quality and
the need to develop management strategies to deal with these conditions, Colombia, Costa Rica and
Nicaragua took on the challenge of reducing pesticide runoff into the Caribbean Sea and improving
the quality of coastal and marine waters through a monitoring programme jointly funded by the
Global Environment Facility (GEF) and participating countries.
This initiative has the participation of national, regional and local stakeholders such as farmers,
agrochemical distributors, health, agricultural and environmental ministries and agencies,
environmental non-governmental organizations (NGOs) and other community-based organizations,
relevant international organizations, and academic institutions. The Project Steering Committee
(PSC) is the regional primary decision making body, guiding the overall implementation of the
project. The National Coordinating Committees (NCC) are represented in the PSC by the National
Coordinator (representing the Ministry of Environment) and a delegate from the Ministry of
Agriculture. Both ensure a proper liaison between the PSC and the National Committees. Besides
UNEP, two International Organizations are members of the PSC: the Inter-American Institute for
Cooperation on Agriculture (IICA) and the Food and Agriculture Organization of the United Nations
(FAO). The pesticides industry is represented in the PSC by CropLife Latin America (CropLife LA),
a non-profit organization that associates companies dedicated to the development of products and
technological solutions for agriculture. NGOs represent the civil society, specifically the interest of
farmers and of environmentalists. E.A.R.T.H. University (Escuela de Agricultura de la Region
Tropical Húmeda), Costa Rica, as a regional educational institution in the agricultural sciences and
natural resources, enriches the PSC with the viewpoints of the academic sector. This ambitious
project is part of the protocol on land-based sources of contaminants of the Convention of Cartagena
(UNEP, 1983) and has also been ratified by the Governments of Panama and Trinidad and Tobago.
The "Colombia, Costa Rica, and Nicaragua - Reducing Pesticide Runoff to the Caribbean Sea"
project contains a significant number of activities. The GEF’s project contains six main topics that
will be implemented by three components and several subcomponents. The six topics are: 1)
monitoring and evaluation of pesticide runoff impact; 2) transfer of technology and alternative
management resources; 3) education and capacitation; 4) development of incentives; 5) institutional
strengthening and training; and 6) management and information dissemination by conducting
demonstration activities of clean farming which will allow validating new pesticide management
technologies and monitoring its effects. The three components of the project are:
• Component 1:
coordination of the project
• Component 2:
demonstrative projects
• Component 3:
institutionalization of the improved management of pesticides and capacity
building to reduce chemical runoff
1
Introduction
This third component of the project anticipates improving processes to reduce pesticide runoff
towards the Caribbean Sea, identified during the development of component 2, and implementing a
pesticides monitoring programme in the coastal area of Colombia, Costa Rica and Nicaragua,
including the certification of or increment in the number of parameters already validated or accredited
in three laboratories (one in each participating country), as a model for the region. This activity will
provide the basis for a long-term monitoring action by the academic and oceanographic institutions in
the region. The analytical capabilities of local laboratories will be improved with the acquisition of
equipment or training activities as part of the regional monitoring component.
During March 27-28, 2008 took place the Second Planning Workshop for the ”Colombia, Costa Rica,
and Nicaragua - Reducing Pesticide Runoff to the Caribbean Sea" project with the attendance of
representatives of research institutions in the participating countries and four external experts. The
objective of the meeting was to update the progress made in the design of the coastal pesticide
monitoring programme, review the capabilities of participating institutions and define the most
appropriate sampling techniques, samples to collect, compounds to investigate, analytical methods to
use, and quality control to observe as well as to look for alternatives monitoring activities and
complete the general framework for this programme.
Contaminant measurements made for the GEF’s "Colombia, Costa Rica, and Nicaragua - Reducing
Pesticide Runoff to the Caribbean Sea" project must be of the highest quality to enable the realization
of mathematical models, holistic assessment, prediction of trends and management under different
situations. To achieve these goals, protocols of quality control have been incorporated into this
manual to provide the professionals of participating countries with the necessary information on
sampling logistics and subsequent analyses, including its quality assurance, to ensure procedures
according to the project’s objectives.
2
Guidelines for the collection, preparation and analysis of organic contaminants…
2.
OBJETIVE OF THE PROJECT
The objectives of the coastal monitoring project are to observe and evaluate pesticides runoff from
agricultural lands to the Caribbean Sea. While this project focuses on the study of current-use
pesticide, the study also includes the determination of more persistent (legacy) pesticides, most of
them actually banned or severely restricted, as indicators to gauge the extension of a potential runoff.
This project seeks to establish information to serve as a baseline to evaluate future pesticide levels in
coastal and marine areas. Whenever possible, the project wants to supplement this baseline
information with the monitoring of pesticides runoff from watersheds as guidance to end users to
promote a better use of pesticides. The information generated will serve as a baseline as well as, in
the long term, an indicator of the environmental benefit from the project.
3
Sampling Design
3.
SAMPLING DESIGN
Fulfilling the project objectives of observing and assessing pesticides runoff from agricultural lands to
the Caribbean Sea requires specific goals such as setting baseline values in coastal zones and in
specific areas (i.e., watersheds). This baseline information will be useful to evaluate future changes in
levels of contamination in the region resulting in response to a change in pest management. Note that,
although this project focuses on the study of current-use pesticides in the region, it also includes the
determination of legacy pesticides as a mean to evaluate the impact and extension of a potential
runoff. The specific goals are:
•
Obtain water, sediment and biota (bivalves) samples for the analysis of target modern-use
and legacy pesticides (Table 1) and determine their concentrations.
•
Determine the current status and the geographical distribution of pollution in the area of
study.
•
Determine and compare the impact of target modern-use and legacy pesticides runoff in
the area of study.
•
Set baseline values that can be used as reference information to evaluate future changes
in environmental levels in the region as a result of modifications in current intensities and
practices of pesticide application.
While water generally represents an entry point of pollutants into the marine environment, with a
subsequent transfer to sediment and biota, and that most toxicological studies are related to aquatic
levels, it is known that the concentrations in this environmental compartment are highly variable due
to sporadic processes such as local discharges and atmospheric conditions (e.g., rain, wind). These
processes are particularly important in coastal areas where a water sample generally represents an
instant reading (snap picture) rather than a true representation of the place. More open water shows a
greater homogenization which translate into a lower temporal variability. For this reason, together
with the fact that concentrations in water are generally low, the measurement of organic pollutants in
water is not commonly included in most monitoring programmes. In spite of this, the project includes
the analysis of water samples because many current-use pesticides, considered relevant to this study,
are mostly soluble in the aqueous medium and, compared with chlorinated insecticides, show
negligible possibilities of accumulation in sediment and biota. The analysis of the three compartments
(i.e., water, sediment and biota) will allow for a more thorough evaluation of the impact and
extension of a potential runoff of target analytes (Table 1) into the Caribbean Sea.
Table 1.
Modern and legacy pesticides(*) identified as target analytes for this project
Aromatic fungicides
Chlorothalonil
Triazine herbicides
Ametryn
Atraton
Atrazine
Prometon
Prometryn
Propazine
Secbumeton
Simetryn
4
Carbamate insecticides
Carbaryl
Carbofuran
Oxamyl
Pyrethroid insecticides
Permethrin
Uracil herbicides
Bromacil
Urea herbicides
Diuron
Organophosphorus insecticides
Organochlorine insecticides
Aldrin
alpha-chlordane
Dieldrin
4,4'-DDD
4,4'-DDE
4,4'-DDT
Endosulfan I
Endosulfan II
Endosulfan sulfate
Endrin
Simazine
Terbuthylazine
Terbutryn
(*)
Chlorpyrifos
Diazinon
Fenamiphos
Parathion-methyl
Endrin aldehyde
Endrin ketone
alpha-HCH
beta-HCH
delta-HCH
gamma-HCH (Lindane)
Heptachlor
Heptachlor epoxide
Methoxychlor
Pesticides that are no longer used but that persist in the environment.
5
Study Areas
4.
STUDY AREAS
4.1. Colombia
An initial sampling in the Colombian Caribbean Sea will include 17 coastal stations selected among
those that are more likely to receive inputs of pesticides due to their proximity to areas of crops and
plantations that use agrochemicals. In fact, chlorinated insecticides were detected at these locations
through the Marine Environmental Quality Monitoring Network in Colombia (REDCAM, Figure 1).
In addition, a cruise on board of the Research Vessel B/I Ancón will include 14 stations located
between 1 to 5 miles from the Colombian coast. These sampling efforts are intended to establish the
baseline information of pesticides to coastal and marine runoff of the Colombian Caribbean Sea.
Figure 1.
Station Network to evaluate pesticides runoff from
agricultural lands to the Colombian Caribbean Sea
For two years, the project will collect water samples during the dry and rainy seasons along the coasts
of Colombia. The oceanic stations will only be sampled in the first year during the rainy season.
Surface sediment samples will be collected during the rainy season of the first and last year in the
proposed areas. Both, the first coastal sampling activities and the oceanographic cruise will be carried
out during the second half of 2008 to sample at the beginning of the dry season. Collection of
bivalves is anticipated along the coastal areas.
6
4.2. Costa Rica
Costa Rica will monitor stations located in selected watersheds and along coastal zones of the Costa
Rican Caribbean Sea (Table 2 and Figure 2). Sampling efforts are planned with a biannually
frequency (dry and rainy seasons).
Table 2.
#
1
2
3
3
4
5
6
7
Sampling areas in selected watersheds and coastal areas of the Costa Rican
Caribbean Sea
Sampling Site
La Jalava
Puerto Vargas
La Estrella river
La Estrella river
Moín river
Matina river
San Carlos river
Sarapiquí river
Description
Latitude/
Longitude
Tortuguero
channels (outlet to
open ocean)
Between the beach
and the coral reef.
10°21’08.9” N
83°23’27.8” W
Under the bridge
(road to Cahuita)
River mouth
09°47’13.3” N
82°54’54.6” W
09°47’48.0” N
82°53’48.0” W
09°44’10.8” N
82°48’39.2” W
Under the bridge
(near the school)
09°59’54” N
83°04’49.5” W
100 m to the river
mouth (south side)
10°06’48.4” N
83°11’30.6” W
River mouth into
the San Juan river
River mouth into
the San Juan river
Matrix
(number of
samples)
Water (3)
Sediments (3)
Biota (3)
Water (3)
Sediments (3)
Biota (3)
Sediments (3)
Sampling
frequency
Twice
(dry and rainy seasons)
Twice
Twice
Water (3)
Sediments (3)
Biota (3)
Water (3)
Sediments (3)
Biota (3)
Water (3)
Sediments (3)
Biota (3)
Water (3)
Sediments (3)
Biota (3)
Water (3)
Sediments (3)
Biota (3)
Twice
Twice
Twice
Twice
Twice
During the first sampling activity, marine sediments will be collected from open ocean stations facing
the mouths of rivers Parismina, Matina, La Estrella, Moín and Limoncito (Figure 3). Sites to sample
during the second sampling event will depend on the results obtained from the first effort. Collection
of bivalves will be attempted at these locations.
7
Study Areas
Figure 2.
Distribution of pineapple and banana plantations along
the Costa Rican Caribbean coast. Arrows indicate the
proposed sampling areas
Figure 3. Sampling sites in Costa Rica
8
4.3. Nicaragua
Monitoring in Nicaragua will be focused on coastal lagoons, river’s mouths and their basins. The
National Coordinating Committee proposed by the Centro para la Investigación en Recursos
Acuáticos at Universidad Autónoma de Nicaragua (CIRA/UNAN), selected the following basins
taking into account the crops present in the area (Figure 4):
Figure 4.
Selected basins to evaluate pesticides runoff from
agricultural lands to coastal areas of Nicaragua
•
Basin 45:
Coco River along the border with Honduras; it drains to the Northwest corner
of Nicaragua (North Atlantic autonomous region).
•
Basin 61:
Escondido River; it drains into Bluefields bay (South Atlantic autonomous
region).
•
Basin 63:
Between Escondido and Punta Gorda rivers; both drain into Bluefields bay
(South Atlantic autonomous region).
9
Sampling
5.
SAMPLING
This document provides detailed logistic and field sampling procedures in use for this project.
However, actual field collections are dependent upon a number of non-controllable natural and/or
logistic factors that may require modifications of the procedures described here. Such factors include,
but are not limited to, weather, site accessibility, bivalve abundance, unfavorable coastal surf
conditions and extreme tidal ranges and diurnal cycles.
5.1. General considerations
The objective of a field quality control programme is to control sampling errors to acceptable levels.
Since the quality of the data generated by a laboratory are largely dependent on the integrity of the
sample analyzed, different procedures are designed to prevent, detect, and correct problems in the
sampling process and to statistically characterize errors through quality control samples. Most of the
errors in environmental analysis result from an incorrect sampling practice. The five factors
controlling sampling, taken directly from Smith (1997), are:
•
Ensuring the safety of the person(s) performing the sampling,
•
Obtaining a representative sample according to the analysis to be performed,
•
Preventing contamination of the sample,
•
Providing legal documentation of the sampling effort, and
•
Protecting the sample from chemical, physical or biological change before analysis.
A brief description of these five factors is presented in the following paragraphs; however, for a more
detailed discussion, the reader is referred to the Handbook of Environmental Analysis (Smith, 1997).
5.1.1. Personnel safety
For safety, a minimum of two persons are routinely necessary for sample collection. Sampling
personnel must avoid collecting samples under unsafe situations. Unfavorable coastal surf conditions
and day light access are major safety considerations. Occasionally, major storm systems and local
weather conditions might result in the rescheduling of sampling operations or completely halt all
activities. Finally, all sampling personnel must be properly equipped not only for self protection but
also to minimize the potential of sample contamination.
5.1.2. Record keeping
Keeping an adequate documentation and detailed record before, during, and after a sampling
operation is important to help elucidate any problem or question, arising at a later date, regarding the
collection or integrity of a sample. A field log book, bound preferably with waterproof resin-coated
pages, must contain a complete record of all activity carried on at the sampling location. This
information includes, at a minimum, time and date of sampling collection, name(s) of the person(s)
performing the sampling, proper identification of the sample containers, list of samples collected,
preservatives used, quality control samples obtained, weather conditions and site description. All
entries are made in waterproof ink and any correction to a record is made by a line striking through
the faulty notation and adding the correct information, the date the correction is made together with
the initials of the person responsible . A complete description of the sampling location is improved
with maps and field photographs.
10
The most important document in a sampling operation is the chain of custody. This form is a
complete description of the sample history from collection to analysis and specifies details of the
sample as well as any ancillary information that might be useful to the analyst. The form must have
room for recording the time and date the sample is transferred from the field team to the reception
department and to the laboratory. A similar form is maintained in the laboratory to document the
work done on the sample from its arrival at the laboratory to the final report.
All documentation related to the sampling operation and subsequent analysis is important and is kept
in a secured area even after the study is finalized.
5.1.3. Sample integrity
All samples must be clearly identified. The samples containers must be correctly labelled at the time
of collection. Whenever possible, the markup will be performed directly on the sample container or
on a sticker. The sticky label must be water resistant and should clearly display, in indelible ink, the
name of the person who collected the sample, the date, time and exact location where the sample was
collected, details of any added preservatives, type of analysis intended and the unique identification
code of the sample.
To ensure the integrity of the samples, it may be necessary to have a storage area with limited or
controlled access and record the name of any person who handles them.
5.1.4. Sample representativeness
There is not a single sample that reliably represents a system under study and, because of limitations
of the laboratories, it is only possible to analyze a small portion of the system and extrapolate the
result. For this reason, different sampling designs have been developed in an attempt to collect the
most representative samples. Several environmental contaminants (e.g., hydrocarbons, pesticides) can
only be analyzed in individual samples; therefore, a system is studied with a repetitive sampling over
a period of time and averaging the results.
The concept of multiple sampling to obtain comprehensive information of study area can be
formalized into a series of variables. These variables may be, for example, time, where samples are
taken at the same place at regular intervals of time or space, where samples are taken at regular
distances, either vertically or horizontally. These samples can be collected in the same conditions,
stored and analyzed individually to characterize an area or can be combined into one to form a
composite sample from where a sub-sample is analyzed.
5.1.5. Containers
Containers to hold samples should be adequate, perfectly clean, dry, and free of contaminants that
may interfere with the analysis. The selection of the wrong material, where the sample is in contact
with potentially reactive, adsorbent or contaminating surfaces, is one of the most common causes of
systematic errors. The type of container to choose, usually made of borosilicate glass or high-density
polythene (HDPE), depends on the type of sample and analysis to perform. These containers, which
should be cleaned in the lab previously to the sampling or acquired as certified to be free of
pollutants, must be of an appropriate size to contain sufficient sample for the analysis to be
performed, including associated quality control samples such as duplicates and spike samples. Once
cleaned, these containers must be kept in a protected place so their integrity is not compromised.
Biota and soil/sediment samples for pesticide analysis are usually held in glass containers with lids
internally protected with a Teflon liner. Dark-colou red bottles (amber glass), which have not been
11
Sampling
recycled in the lab (e.g., to contain wastes, to prepare or contain dissolutions, etc.), can be used to
storage water samples if kept with their original caps and in a place protected from potential pollution
sources.
5.1.6. Preservatives
Preservatives are used to maintain the integrity of the samples and must not interfere with the planned
analysis. Most solid samples (e.g., soil/sediment and biota) require a temperature below the freezing
point to preserve them while liquid samples (e.g., water) may require cooling and different types of
additives, such as acids or bases added to control the pH, depending on the type of analysis.
Generally, water samples to study the environmental fate of semivolatile organic pollutants are held
in dark bottles, kept at a low temperature (~4°C) with or without the addition of preservatives, until
their analysis. The preservation of samples for the analysis of organic pollutants is mostly related to
the storage time.
5.1.7. Transport and holding time
The time elapsed between the collection of the sample and its analysis is critical as, regardless of the
conservation method used, there is a possibility of degradation of the target compounds over time. It
is recommended that samples are sent to the laboratory within 24 hours of collection to be properly
stored according to the type of sample and analysis.
The maximum time to store samples for the analysis of organic and inorganic compounds has been a
cause of concern for many years. A variety of tables and graphs exist in the literature that suggests
maximum storage times for different samples and types of analysis. Relevant portions of that
information are summarized in the sections corresponding to the different sample types. The storage
times given in the literature and in official methods are variable and often conflicting; however, they
provide guidance to perform the analysis in a timeframe that does not compromise the integrity of the
sample.
5.1.8. Quality control in the field
When low concentrations of organic pollutants are expected, it is particularly important to process
different samples to help to assess the quality of the sampling procedures. For example:
12
•
Blank samples: consists of water free of organic contaminants placed in a container
similar to the one used for the sample, including the preservative used, carried to the field
–not exposed- and returned to the laboratory to be analyzed with regular samples. This
blank sample serves to assess the quality of containers, purity of the preservative and the
potential for contamination in situ and during transport.
•
Equipment blanks: consists in collecting the rinses of the equipment used in the field,
done immediately before the sampling operation with an organic solvent, and sending the
rinsate to the laboratory for analysis. In this way, it is possible to control if the sampling
equipment is properly decontaminated between sample collections.
•
Field blanks: it is of particular importance in the study of volatile compounds. One of
the recipients similar to the ones used to hold the samples is transported to the field,
exposed (i.e., opened, to conditions existing during sample collection and sent back to the
laboratory for analysis as a regular sample. The field blank serves to assess the potential
of contamination in situ and during transport.
•
Field duplicates: consists in a regular sample divided into two or more containers for
analysis as regular samples to control the consistency of sample collection, transfer and
subsequent analytical technique. These samples should not be confused with duplicate
samples which are samples collected in two different sampling events at the same site and
serve to evaluate, through the analysis in the laboratory, the variation of natural
concentrations of contaminants present in the area of study.
5.2. Preparation procedures prior to sampling
5.2.1. Logistic considerations
Two or three people (for safety) are recommended and generally required to collect water,
soil/sediment, and biota samples. In shallow marine areas, it is possible to reach the sampling site by
walking to the area behind the waves’ breakdown to avoid the contamination from resuspended
sediments. Similarly, in shallow rivers and small creeks, it is possible to walk to the middle of the
stream. Sites located in slightly deeper coastal marine areas or larger rivers must be accessed using a
small boat with oars or an outboard motor. The access to sites located in significantly deeper areas
requires a larger vessel to collect the sample as well as more specialized equipment. During sampling
activities, it is important to record, at a minimum, a complete description of the site, including access
information, geographical position (latitude-longitude), day, date and time of sampling, type of
sample collected, type of container type that holds the sample, sampling method used, responsible
person, and, for sediments, any other information considered relevant (e.g., odor, color, texture,
presence of organisms, shells, pieces of plants, pebbles, etc.).
There are several factors to consider when planning the sampling schedule for the project and the
logistics to succeed:
•
Sampling should progress concurrently among the participating countries: Colombia,
Costa Rica y Nicaragua.
•
Each site has an optimum collection time window to be maintained in successive visits to
the site with the purpose of minimizing temporal variability (e.g., changes in the general
direction of winds, water circulation, seasonal rain regime, etc.). For example, an
acceptable one-week window on either side of the preselected sampling date for a given
location should be maintained throughout the programme.
•
A low tidal period (usually minus) is necessary for bivalve collections at most coastal
sites. The Field Manager considers extremes in tidal ranges when scheduling the field
collections and is responsible to obtain the necessary tidal information for the field
team(s).
•
Coastal surf conditions and day light access are major safety considerations, and site
access should be planned accordingly. The field team chief, in consultation with the Field
Manager, determines the best time to safely collect samples at each site.
•
Major storm systems and severe local weather conditions calls for a complete suspension
of sampling operations. The possibility of collecting at other scheduled sites, until
conditions at the original site improve, is given priority and decided by the field staff in
consultation with the Field Manager.
•
The location and accessibility of boat launch facilities is considered by the field teams
during boat operations.
13
Sampling
•
Field consumables, such as ice and ice chests, are not always readily available ate every
location. Field team members are responsible for ensuring that they have sufficient field
supplies.
Responsibilities
•
The Field Manager, in collaboration with the field team(s), is responsible for carrying out
the sample collections in a safe, cost-effective and timely manner.
•
The Field Manager is responsible for the correct localization of the sampling site.
•
The Field Manager is responsible for all equipment, personnel, and for successfully
achieving all the sampling objectives. However, each field team member is also
responsible for the equipment and activities assigned to him/her.
5.2.1.1.
Site access
Some collection sites might involve crossing private or government properties, restricted areas or
national parks and require prior permission to gain access or to collect samples.
•
Initial permission to access private property and/or government property is obtained by
the Field Manager. However, each field team is responsible for confirmation of
accessibility while in the field.
•
If access is denied to the field team, the Field Manager should be immediately contacted
and the matter discussed. The field team should avoid confrontation and do their best to
represent his/her institution in a positive and professional manner.
•
The Field Manager shall obtain the sampling permits for all the sites scheduled for
collection. The field teams are responsible for adhering to all permitting instructions and
regulation, including checking in with local authorities before collection. Furthermore, it
is the responsibility of each field collector to be aware of the forbidden use of certain
types of collection implements, such as dredges, in or near coral reefs.
5.2.1.2.
Field equipment
A complete list of all the sampling equipment (supplies and spares) to be carried by each field team
ensures that they are properly and thoroughly equipped to handle the sampling efficiently. A list of
minimum sampling gear is provided in Table 3.
14
Table 3 List of minimum sampling gear
Bristle brush
Chipping hammers
Clipboard w/field sampling forms
Combusted aluminum foil(1)
Digital camera
Gloves (work, Kevlar & neoprene)
Hand held conductivity meter or similar
Handheld GPS unit w/manual
Nautical charts
Office supplies (pens, markers, tape, etc.)
Organic solvents (methylene chloride, methanol)
Oyster knives
Paper towels
Past site logs and photographs (if available)
Precleaned glass bottles/jars(1) w/Teflon lined
caps/lids for water and sediment/biota
(1)
VHF radio w/antenna
Refractometer
Regular or artificial ice
Salinity bottles
Sample coolers (large and small)
Sampling manual
Scientific collecting permits
Site sample preprinted labels
Spare 20 & 10-liter buckets
Squeeze bottles for organic solvents
Stainless steel sediment grab
Teflon coated sediment scoops
Thermometer
Reclosable bags (8, 4, 1 & 0.5 liter)
Combusted at 440oC for 4 hours
All sampling instrument/equipment should be decontaminated prior to sample collection. Spoons,
shovels, etc. to be used to transfer the sample from the sampling device to the container should be
keep clean, washed with solvents and wrapped in aluminum foil until their use and should be
decontaminated between samples.
Responsibilities
•
It is the responsibility of the Field Manager, in collaboration with designated personnel,
to ensure that all sampling equipment is serviced and field ready.
•
The Sample Control Group is responsible for preparations in conjunction with field
operations, including purchasing of all consumables such as reclosable bags, aluminum
foil (and its combustion), and collection jars. The Field Manager provides the Sample
Control Group with the above information for purchasing (e.g., supply amounts).
•
Each field team members is responsible for ensuring that all preparations for field
operations are complete before entering the field.
•
The Field Manager is responsible for implementing training programmes when needed.
Some background marine and general safety knowledge is expected of all field teams.
However, when necessary, field teams are trained to handle the contingencies of adverse
weather and mechanical breakdowns, and be well versed in dealing with expected and
unexpected sampling activities.
5.2.1.3.
Boat(s)
Boats may be required for sampling coastal sites. The Field Manager selects a field crewmember to
be jointly responsible for ensuring that the boat(s) and trailer(s) used in the field are properly
maintained and mechanically fit prior to their use. A designated field crewmember is also responsible
for testing for proper functioning of boating equipment (including GPS systems, VHF marine radios,
15
Sampling
mobile phones, bivalve and sediment collection gear, and backups). The boats are “checked-out” on
open water before their use on field operations. Up-to-date and accurate boating charts and notes of
safe harbors at collection sites and in the general travelling area are carried in the boat on all sampling
excursions for safety. It is the responsibility of field crewmembers involved with boating operations
to assess weather conditions in respect to the site(s) location(s) and make a decision as to whether or
not boat activities can be safely attempted. Boating personnel are required to be familiar with general
first aid techniques and cardio-pulmonary resuscitation (CPR). All boating personnel should be able
to independently and safely operate the boat and associated safety, emergency, and navigation
equipment. All incidents, accidents, and recommendations involving field safety issues should be
immediately communicated to the Field Manager.
In the case of sites located in deeper waters or farther away from the coast or the place where a boat
ramp is located, a larger vessel with professional staff in charge (e.g., fishing, oceanographic or naval
vessel) might be necessary.
5.3. Field collection criteria
5.3.1. Definition of station and site
•
A site is the geographic unit sampled and is selected to be representative of a target area,
general location, or bay system.
•
Within each site, three independent stations are sampled for the purposes of spatially
characterizing the site.
•
The latitude and longitude corresponding to each site are measured at an equidistant
distance from both extremes or the center of the sampling circle as the case may be:
Shoreline, inter-tidal or subtidal sites are defined as linear areas of approximately
50-m along the tidal horizon to either side of the equidistant point.
For areas located at a mouth of a river, samples from three stations should be
collected with one station located in front and center of the river and one station
located to each side of the river’s mouth.
Stations in offshore sites are typically located inside approximately a 400 meter
radius circle.
•
Each sampling site should be clearly designated by using a pre-determined code referring
to its location.
5.4. Surface water samples
Sampling sites can be located in coastal areas or in deeper waters, farther away from coastline. In
general, samples collected near the coast detect rapid changes, in a scale of hours or days, mostly
associated with on land processes while samples collected from more remote and deeper locations
represent the situation on a much broader time scale (weeks or months). Because of this, it is
important that the preselected sampling positions are maintained unchanged except when conditions
for are not favorable for the sampling team.
16
5.4.1. Site documentation
To ensure that samples collected in subsequent years originate from the same locations -or as
reference for future studies- the collection site locations are accurately determined using a
combination of GPS coordinates and documented notes. Therefore, it is required to write and have
archived accurate site documentation. Previous years notes should be maintained for this purpose
even after the finalization of this project.
A Field Sampling Log Sheet is completed each time a site is visited for sampling. On the Field
Sampling Log Sheet, the following minimum information regarding the site is recorded:
•
Date and time of collection
•
Site name and unique identification code
•
GPS coordinates (latitude, longitude; e.g., 12°28'58.9” N, 79°48'22.9” W) of the site and
boat launch facilities or point of access (where applicable). When necessary,
supplemental GPS coordinates for landmark references are recorded.
•
Water temperature, obtained using a handheld thermometer.
•
Salinity (seawater), obtained using a handheld conductivity meter. If a duplicate sample
to control the calibration of the handheld conductivity meter against a salinometer in the
laboratory is collected, this is noted.
•
Description of the site and number and identification of photographs taken at the site (if
any). If a coastal location, indicate access to the site (e.g., boat launch facilities). If a river
location, indicate route of access to the site.
•
Description of the sample (water = odor, cloudiness, foam, presence of oil, etc.; sediment
= odor, color, texture, debris, presence of oil, etc.; biota = quantity, approximate size,
etc.), including type of container and identification code.
•
Physical conditions at the station. This includes weather conditions, such as the degree of
cloud cover, wind speed, wind direction, and water depth. If at sea, include information
regarding sea conditions; if in a river, estimate flow.
•
Any relevant information regarding the sampling site/stations or any incident in the field
that might compromise the integrity of the samples.
•
Collector's name and signature
If a Field Sampling Log Sheet is physically lost or damaged and the information is not longer legible,
the field person(s) involved in the sampling must notify the Sample Custodian and Field Manager. An
attempt to re-record the data/information should be made immediately after such an event occurs.
It is important to maintain the predetermined positions of sampling locations except if conditions
present in location at the time of sampling (e.g., atmospheric, circulation, flow) represent a potential
risk to the sampling team. In this case, the site can be relocated to an alternative place after
documenting the decision.
5.4.2. Sample collection
The following procedures are followed to obtain subsuperficial water samples. Figure 5 outlines the
procedures to collect water samples for chlorinated and organophosphorus insecticides and triazine
herbicides and carbamate insecticides, respectively, and the initial treatment of samples in the field.
17
Sampling
It is recommended to collect the water samples directly in the containers in which they will be
transferred to and stored in the laboratory until their extraction and analysis. It is important that the
containers come already clean from the laboratory. Note that these containers should not be rinsed
with water from location as this could leave a pollutant film in the interior of the container. The
containers must be identified with site sampling information, name of the operator, date, time and
analysis to perform. If possible, it is best to use preprinted labels with most of this information. The
following procedures are followed to obtain water samples from:
5.4.2.1.
18
Shallow sites (coastal marine areas or rivers/creeks)
•
Locate the selected site using a Global Positioning System (GPS) and the available
latitude and longitude information. In a river/creek, it is preferably to collect the sample
at a midpoint where the current is fastest; avoid very shallow areas with stagnant water or
very little movement.
•
Get a 4 L amber bottle, pretreated to be free of organic contaminants and a Teflon lined
lid, and walk to the sampling station. The station should be located at a depth where
resuspended sediments do not contaminate the sample.
•
Once on location, the operator should frontally position him/herself toward open sea, and
behind the waves’ breakdown area, or against the flow in rivers and creeks.
•
Take the bottle from near its neck and submerge it, passing through the water-air
interface (surface film) closed, to an intermediate depth between surface and bottom (A
in Figure 6). Once in position, remove the cap with the free hand reaching to it from the
back of the bottle to avoid contamination and position the bottle’s mouth towards the
current (B). Hold your free hand away from the flow.
Figure 5. Water sampling flowchart
•
Once the bottle is full, immediately replace the cap from behind and without moving the
bottle from its sampling position (C) and recover it by bringing it up against the current
(D). Be sure that the cap is firmly in place, place the bottle in a plastic bag to retain the
water in the case of rupture or an accidental spill and carefully accommodate the bottle in
a cooler.
•
Be sure to record, on the bottle label, all required information (see 5.4.6.).
•
In general, there is no mention in the literature regarding the need of preservatives to be a
critical issue to ensure quality and representativeness of samples when they come from
natural water bodies or streams. However, it is important to fix the pH according to the
type of analysis to be performed (see Figure 5) and to keep them refrigerated (~4°C) until
their treatment in the laboratory, which should take place within the required holding
times.
•
Proceed to the next station and repeat the sampling procedures until you have been
worked all stations within the site, after which move to the next location.
19
Sampling
Figure 6. Collection of water sample at shallow locations
At deeper places, where a boat is required for sample collection, the vessel must be anchored and wait
for its positioning with the flow. If it is not possible to anchor, the boat should remain in position
against the tide or flow through actions of the engine or oars. In both cases, the operator will be
located in the bow of the vessel, slightly tilted forward, and will proceed to collect the sample at
about 50 cm below surface following the directions above. In any case, avoid collecting the sample
directly in the area of turbulence generated by the boat’s movement as it can stir bottom sediments.
5.4.2.2.
•
Deep sites (marine areas or large river)
Locate the selected site using a Global Positioning System (GPS) and the available
latitude and longitude information.
Use a 4 L amber bottle as indicated before and using a simple sampler, similar to that
shown on Figure 7, which can be easily made and operated from the vessel. An empty
solvent bottle, attached to a weight (see details in Figure 7), is gently covered with a
Teflon plug and thrown from the boat tied to a buoy to collect water sample at one meter
of depth, passing through the surface film with the bottle’s stopper in place. Once in the
water, the bottle quickly reaches 1 meter depth extending the rope between buoy and
stopper and unplugging the bottle to collect the sample. The operator should avoid
possible contamination from the boat or vessel. For this current reason the sampler is
thrown from the bow of a slow moving boat or vessel to a distance that allows the
complete filling of the bottle before the boat or vessel reaches the position of the sampler.
Remember that the bottles used in the sample come pre-cleaned from the laboratory and
they should not be rinsed with water from location as this could leave a pollutant film in
the interior of the container.
•
20
Once on board, plug immediately the bottle with the sample and replace it with a new
bottle. It is recommended to store the sample in the same bottle used to collect the sample
as transferring from one to another might contaminate the sample in addition to the need
of repeated solvent rinses between samplings to remove any contaminating film left
inside the container.
Figure 7.
A simple sampler design to collect water samples
at a predetermined water depth
•
Firmly cap the bottle, place it in a plastic bag to retain the water in the case of rupture or
an accidental spill and carefully accommodate the bottle in a cooler.
•
Be sure to record, on the bottle label, all required information (see 5.4.6.)
•
As indicated previously, there is no mention in the literature regarding the need of
preservatives to be a critical issue to ensure quality and representativeness of samples
when they come from natural water bodies or streams. However, it is important to fix the
pH according to the type of analysis to be performed (see Figure 5) and to keep them
refrigerated (~4°C) until their treatment in the laboratory, which should take place within
the required holding times.
•
Proceed to the next station and repeat the sampling procedures until you have been
worked all stations within the site, after which move to the next location.
5.4.3. Initial handling and treatment of samples in the field
21
Sampling
Water samples are initially processed in situ by adding base or acid to fix the pH, either aboard a
vessel or on land, immediately after collection. While processing of samples, avoid smoking or
working in areas where the samples may be contaminated by emissions of combustion engines (e.g.,
cars, outboard motors).
5.4.4. Pesticide samples
Water samples for the analysis of pesticides are collected and stored in 4 L glass amber bottles
previously treated to eliminate all organic pollutants. The containers can be bought certified to be free
of organic pollutants or cleaned in the laboratory. Glass bottles are washed with water and a
laboratory quality detergent/soap free of phosphates, sequentially rinsed with small volumes of
different solvents and air dried before they are protected with Teflon lined caps (Table 4). Empty
solvent amber bottles can be used to store water samples only if they have not been reused in the
laboratory (e.g., to contain waste, to prepare or contain dissolutions, etc.), saved with its original lid
and kept in a place protected from possible contaminating sources. It is recommended that containers
intended to hold samples come pre-labeled with type of analysis and site and station information from
the laboratory (see 5.4.6).
Table 4
Recommended pretreatment of water sample containers
Parameter
Organochlorine,
organophosphorus, and
carbamate insecticides
and triazine, uracil and
urea herbicides.
Matrix
Water
Recommended
container
Cleanup procedure
4 L amber glass bottle
with a Teflon lined cap
Rinse the bottle three times with
water and a detergent/soap free of
phosphates, followed with three
rinses with organic free water, one
rinse with low grade acetone (to
remove water), one rinse with
pesticide grade acetone, two rinses
with pesticide grade hexane and two
rinses with pesticide grade methylene
chloride. Air-dry the bottles and
firmly cover the with the original
Teflon lined caps.
5.4.5. Ancillary parameters
Measurements of ancillary parameters in water (pH, temperature, and salinity) are performed in situ
on samples taken for that purpose and never on samples reserved for the analysis of pesticides.
Salinity samples are collected at a depth of, at least, 50 cm to minimize variations due to, for
example, recent rains or excessive surface evaporation. Salinity can be measured in situ, using a
handheld refractometer, or in the laboratory. In the first case, it is always advisable to retain the
samples for a laboratory confirmation of some of the field readings using a calibrated salinometer.
22
5.4.6. Sample labeling
All sample containers should be labeled with the site identification code, station number, type of
analysis to be performed, added preservatives, if any, and date, time and initials of the person who
collected the sample using indelible ink.
5.4.7. Sample storage
After fixing the pH, the water samples for the analysis of pesticides are preserved in an ice cooler,
with enough ice, and transported to the laboratory at the end of the day where they are refrigerated
and stored at ~4°C until extraction and analysis (Table 5).
Table 5.
Preservation and maximum holding time for water samples
Parameter
Organochlorine and
organophosphorus
insecticides
Triazine herbicides
Uracil & Urea
herbicides
Preservation
Maximum holding time
Refrigerated at ~4°C, kept in the
dark, and pH fixed between 6
and 8
Extraction within 7 days
Analysis of sample extract within 40 days after
extraction
Refrigerated at ~4°C, kept in the
dark, and pH <4 with H2SO4 or
HCl
extraction
Note: Diazinon, an organophosphorus insecticide, is unstable in water; therefore, if diazinon is a target analyte,
the sample should be processed immediately after collection.
5.4.8. Chain of custody
At the end of the day, the sampling team shall review the activities completed during the day and
indicating any comments they deem pertinent. The samples and all relevant forms are then transferred
to the person responsible for their custody and further distribution to different analytical groups.
5.5. Surface sediment samples
The criteria for collection of sediment samples are illustrated in Figure 8 and are summarized below:
•
The selected site should integrate contaminants from multiple sources in the surrounding
area rather than reflect inputs from individual point sources of contamination. Without a
detailed study, the selection of a suitable site depends mainly on the assessment of
pollution sources into the area, general water circulation and depth in the area as well as
the experience of the sampling team. In general, sediments that are located directly under
a source pipe, in a shallow pool comprised mostly of effluents, or in close proximity to
man-made substrates (e.g., pilings) should be avoided as these samples might not be
representative of an area. In an area of good circulation it would be enough to collect
samples from areas located 300-500 meters away from known sources.
•
Only sites that have at least 20% fine sediment (silt and clay) are sampled.
23
Sampling
•
Field personnel are responsible for deciding if a sediment sample is suitable for
collection.
•
The site should be a sub-tidal (never exposed at lowest tides) low energy depositional
area as evidenced by deposition fine sediment.
•
Sediment is never collected from under artificial structures (e.g., docks) or underneath (or
moving) large rocks.
•
If acceptable sediments cannot be located within the established site, the sampling team
must contact the project leader for a possible relocation of the site.
•
If you are collecting water or biota samples beside sediments all samples should be
exposed to the same body of water.
Figure 8. Criteria for collection of sediment samples flowchart
24
A Field Sampling Log Sheet is completed with accurate and comprehensive site information each
time a site is visited for sampling (see 5.4.1.).
The project aims to study the current runoff of modern and legacy pesticides; therefore, an unaltered
surface sediment sample is carefully collected at each of the three stations in each site. To choose the
sediment sample, keep in mind that organic contaminant concentrations are generally greater in
sediment with higher percentages of fine materials (e.g., silt and clay).
It is important to consider the characteristics of the sediment to be collected, such as texture,
consolidation and organic matter content, to decide the equipment to use in the collection of the
samples (Table 6). It is also important to know the limitations of each sampler type to collect different
sediments as some equipment could disturb the superficial layer of fine sediments. Likewise,
consolidated sediments require the use a sampler with a greater penetration potential.
•
Where water depth permits (i.e., creeks and small rivers), sediments are collected by hand
using either a small Teflon-coated, or stainless steel, scoop. The sampling place is
approached slowly and against the flow to avoid that resuspended sediments contaminate
the sampling area. Prior to each use, the scoop is washed with a detergent/soap free of
phosphates and water, cleaned and triple rinsed with methanol followed by a triple rinse
with methylene chloride, both pesticide grade solvents, to remove any organic
contaminant. The solvent rinse is collected in a waste container and returned to the
laboratory for proper disposal. The upper 1-cm layer of sediment is removed using the
cleaned scoop and placed in pre-cleaned 500 mL glass containers for organic analysis and
reclosable bags for grain size analysis. When sampling very fine sediments, the scoop
must be retrieved slowly to minimize sample wash-out.
•
In shallow waters (rivers and coastal marine areas) sediment samples are collected by
hand using a small box-corer sampler operated from a small boat and a stainless steel
spatula or spoon. As discussed before, the place is approached against the flow to avoid
contaminating the area with sediments resuspended by the boat outboard motor or oars.
Before sampling, dredger and spatula are washed as indicated above. Used solvents
should be collected and returned to the laboratory for its final disposal. Once it has
decided, by visual observation, that the sediments have not been altered, the first
centimeter is collected with the stainless steel spatula and placed in a clean 500 mL glass
container.
•
In deep waters (open sea), where manual sampling is not possible, a bigger box-corer
operated from a larger ship is needed. Alternatively, and depending on the compactness
of the bottom sediment, samples can be collected using a Van Veen Grab. In any case, a
slow retrieving is necessary to allow for a complete closure of the spade or the jaws,
respectively. Once on board, only the top centimeter of sediment is kept. The same
requirements and precautions discussed in the previous paragraph should be noted here.
25
Sampling
Table 6. Bottom sediment grab samplers
These samplers are designed to collect a representative sample of the sediment bottom. The portion of the
sampler should be deep enough so, if applicable, all depths are sampled equally. The closing mechanism is
required to completely close and hold the sample as well as prevent wash-out during retrieval. In most samplers,
hinged upper lids swing open to let water pass, as it is lowered to the bottom, that are not only designed to
minimize disturbance of the topmost sediment by the pressure wave but also to provide direct access to the
sample once on board.
The Box Corer is one of the simplest and most commonly used
sediment corers. The stainless steel sampling box can contain a surface
sediment block as large as 50cm x 50cm x 75cm with negligible
disturbance. Once the sediment is recovered onboard, the sediment box
can be detached from the frame and taken to a laboratory for processing
(subsampling).
The sample size is controlled by the speed at which the corer is lowered
into the ocean bottom. A firmer bottom requires a higher speed to obtain
a complete sample. Once the core box is filled with sediment, the
sample is secured by a moving, sharp cutting edge spade into the
sediment until the bottom of the sediment box is completely covered.
The Van Veen Grab is a lightweight sampler designed to take large
samples in soft bottoms. Its long lever arms and the sharp cutting edges
on the bottom of the scoops, enable it to cut deeply into the softer
bottoms. The relatively large surface area and the strong closing
mechanism allow the jaws to excavate relatively undisturbed sediments.
During retrieval, the chains attached at the top of the release exert great
tension on the long arms extending beyond the jaws, causing them to
lift, dip deeper into the sediment, and trap material as they tightly close.
26
Table 6. Bottom sediment grab samplers (cont.)
The Ekman Bottom Grab sampler is designed for sampling in soft
sediments in shallow areas. As the sampler is lowered to the bottom,
two hinged upper lids swing open to let water pass through and close
upon retrieval preventing sample washout. When the sampler reaches
the bottom, a messenger is sent down the line tripping the overlapping
spring-loaded scoops. In shallow waters, the sampler can be operated
from a boat with 1.5 and 3.0 meter handles instead of a cable and
messenger.
The Gravity Corer must be operated from a relatively large boat with a
winch powerful enough to lower and raise the corer, which can be very
heavy with hundreds to thousands of pounds of lead weights attached.
The sampler is deployed vertically and consists of a steel tube in which
is inserted a plastic liner to retain the sample. The penetrating end of the
tube is fitted with a cutter and a concave spring-steel core-catcher to
retain the sample when the corer is retracted from the bottom and
recovered to the ship. A Gravity corer is simple, robust, and relatively
reliable; the major disadvantage is its weight.
The Gravity Corer is helpful to collect sediments deposited over a long
period of time that can span for several hundreds years.
The following procedures are followed to obtain surface sediment samples (Figure 9).
•
Find the preselected site using coordinates information from a Global Positioning System
(GPS). In general, soft, fine sediments are easily collected.
•
Use a positioning technique and the most appropriate, according to the depth of the site,
sampler type to collect the samples. Transfer enough sediment (~ 200 g) from the surface
layer (~ 1 cm) with a small stainless steel spatula or spoon into a contaminant free 500
mL glass container. Avoid collecting sediments that are close to or in contact with the
sides of the dredge or sampler to reduce the chance of contamination. Similarly, do not
touch the sides of the dredge or sampler with the stainless steel spatula or spoon used to
collect the sediment sample.
•
If it is necessary to combine multiple sediment samples from one station to collect
enough sample volume, this is done by combining, into a clean glass container, similar
amounts of sediment from each casting.
•
Do not fill the container to more than 2/3 of its capacity to allow expansion of the content
during freezing.
27
Sampling
Figure 9. Sediment sampling flowchart
28
•
Once the sample has been collected place the container, properly identified and inside a
plastic bag to prevent contamination of other samples if the jar breaks or in case of an
accidental spill, in a cooler with ice for transportation to the laboratory. Freeze the sample
as soon as possible.
•
Collect ~100 grams of sediments as before and place the sample in a reclosable bag
(Ziplock or similar) for the determination of grain size. Keep the sample in a cooler, with
little or no ice, to protect it from environmental conditions. This sample should not be
frozen.
•
Proceed to the following station and repeat the sampling procedures (Figure 9) until all
stations within the site have been worked, after which the sampling team moves to the
following site (Figure 8).
•
Be sure to recondition the sampling gear between stations as previously indicated,
regardless if the new station corresponds to the same site or not.
Immediately after collection, all samples are visually inspected to ensure that the sediments have been
taken to the desired depth. It is important to note if the sampler has completely closed after a
perpendicular penetration into the sediment or if it has been inclined during retrieval resulting in the
loss of sample or disturbance of top sediment layer (see illustrations in Table 6). If the sample
presents any of these problems, it is rejected and another sample is collected for that station. The
position of the new sample shall be next to the location of the original sample. The rejected sample is
discarded in a manner that it does not contaminate the new sample or any other stations in the site
where samples are to be collected. This disposal is preferentially done after all sampling activities in
the site have been completed.
Sediment samples are processed immediately in situ after collection, either on board of the vessel or
on land if the access to the site is near. While processing the samples (Figure 9) avoid smoking or
working in areas where the samples can be contaminated with the emissions of combustion engines
(e.g., car, outboard motor).
Sediment samples for the analysis of pesticides are placed and stored in 500 mL glass containers
(jars) previously treated to eliminate all organic contaminants. These glass containers can be bought
certified to be free of organic contaminants or cleaned in the laboratory. Glass containers are washed
with water and a laboratory quality detergent/soap free of phosphates, sequentially rinsed with small
volumes of different solvents and air dried before covering them with Teflon lined lids (Table 7).
Alternatively, containers can be covered with aluminum foil, after being cleaned as before and
combusted for 4 hours at 440°C. It is recommended that these containers come pre-labeled from the
laboratory indicating type of analysis and site and station information (see 5.6.6.).
5.5.5. Ancillary parameters
In sediments, organic contaminants are usually associated with fine materials and adsorbed organic
matter; therefore, the determination of the grain size, organic carbon and moisture content is
important to standardize the results.
5.5.5.1.
Grain size determination
Sediment samples intended for the determination of grain size are collected in reclosable plastic bags
(Ziplock or similar) and held at room temperature and protected from environmental conditions inside
of a cooler with little or no ice (never frozen). As with the containers for pesticides, it is
recommended that these bags come pre-labeled from the lab with unique identification codes and
related information (see 5.5.6.).
5.5.5.2.
Total organic carbon and dry weight determination
Measurements of total organic carbon and moisture content or dry weight are carried out in aliquots
taken from the samples during the analysis of pesticides; therefore, it is not necessary to collect or
process extra material in the field.
29
Sampling
Table 7
Recommended pretreatment of soil/sediment sample containers
Parameter
Organochlorine,
urea herbicides.
Matrix
Soil
Sediments
Recommended
container
Cleanup procedure
500 mL glass
containers (jars) with a
Teflon lined lid
Rinse the jars three times with water
and a detergent/soap free of
chloride. Air-dry the jars and firmly
cover with Teflon lined lids.
Alternatively, rinse the jars with
rinses with organic free water. Airdry the containers, cover with
aluminum foil and combust at 440°C
for 4 hours. Let them cool down and
cover with Teflon lined lids,
removing the aluminum foil just
before collecting the sample
All sample containers (glass jars and plastic bags) are labeled on the outside indicating the site/station
unique identification code, date and time, type of analysis to perform and initials of the person who
collects the sample.
5.5.7. Storage
Sediment samples for the analysis of pesticides are frozen immediately after collection, if possible, or
kept in a cooler with ice until transported to the laboratory at the end the day and stored frozen (Table
8). In this last case, it is important that the sample containers are kept on ice but separated from it
with newspaper or similar to minimize the possibility of contamination if the containers become in
contact with water. For the same reason, it should be avoided that water from melting ice accumulates
in the cooler. In general, it is not recommended or necessary the use of chemicals to preserve the
integrity of analytes in sediment samples.
Grain size samples are maintained and transported to the laboratory at room temperature, or slightly
refrigerated, inside of a cooler or similar for their protection.
30
Table 8.
Preservation and maximum holding time for soil/sediment samples
Parameter
Organochlorine and
organophosphorus
insecticides
Triazine herbicides
Uracil & Urea
herbicides
Preservation
Kept in the dark and
frozen at -20°C
extraction.
5.6. Biota sample: Bivalves
The bivalve term includes clams, mussels and oysters. Table 9 describes and gives information on
habitat, size and general characteristics of species of interest for this project as a guide to aid with
their identification. The most common species in the area of study are:
•
Crassostrea rhizophorae
•
Isognomon alatus
These species of bivalve are widely distributed in the Caribbean Sea; therefore, they can provide a
good coverage of the region. In those stations where more both species cohabit, they are collected and
kept as separate samples to evaluate potential differences in the accumulation of pollutants when
exposed to the same environmental levels. This information will facilitate the integration of the area
when -and if- different species are sampled. If the presence of any other species of bivalve is
observed, it should also be collected for potential analysis.
An appropriate site for bivalve sampling has the following characteristics:
•
As previously discussed for sediment samples, an appropriate site for bivalve collection
should integrate contaminants from multiple sources in the surrounding area rather than
reflect inputs from individual point sources of contamination. The selection of a suitable
site depends mainly on the assessment of pollution sources into the area, water circulation
and depth in the area as well as the experience of the sampling team. In general, bivalves
that are directly exposed to a source (e.g., attached to an outflow pipe), in a shallow pool
comprised mostly of effluents, or in close proximity to man-made substrates (e.g.,
pilings, buoys) should be avoided as these samples might not be representative of an area.
In an area of good circulation it would be enough to collect samples from areas 300-500
meters away from known sources.
•
The selected site must have native bivalves of suitable size and abundance to allow for
biannual sampling during the two years of the project without compromising the area
resources.
•
The selected site must be accessible during the duration of the project (e.g., no physical
disruption, such as dredging or constructions, of the place is expected)
•
Bivalves included in the sample are limited to natural substrates (e.g., rocks, mangroves).
31
Sampling
Table 9 Identification of target bivalve species
Parameter
Common name
Isognomon alatus
(Guilding, 1828)
(Gmelin, 1791)
Mangrove cupped oyster (En.)
Ostión de mangle (Sp.)
Flat Tree Oyster (En.)
Ostión plano (Sp.)
Up to 150 mm in length
Shell is rough with ridges or bumps. Shell
lightweight, deep-cupped, inequivalve,
left valve (attached) larger than right.
Shell shape and outline variable. Inner
margin smooth.
Pale white to dirty light grey
Up to 80 mm in length
Shell is fan-shaped appearing extremely
compressed and thin-walled
Picture
Size
Shell
Exterior
Interior
Habitat
Distribution
Comments
Whitish or light grey splotched with
bluish purple
Typically found fixed to the roots of
mangrove, rocks and other hard substrates
in intertidal or shallow area. Populations
can be affected by over exploitation
Caribbean to Brasil
Can be erroneously identified as
Crassostrea virginica (Gmelin, 1791)
Usually drab greenish white to purpleblack
Yellowish with a purple-brown stain and
darker borders
Typically found in groups fixed to the
roots of mangrove, rocks and other hard
substrates in intertidal or shallow area.
Caribbean to Brasil
A Field Sampling Log Sheet is completed with accurate and comprehensive site information each
time a site is visited for sampling (see 5.4.1.).
The target sizes for bivalves are 100 to 150 mm and 60 to 80 mm for Crassostrea rhizophorae and
Isognomon alatus, respectively.
Bivalves can be collected by hand, with tongs or dredge. Collection by hand is the preferred method
and it should be used in all sites located in intertidal or shallow areas. Many bivalves, such as oysters,
can be simply removed or separated from their substrate with an oyster knife or a small chipping
hammer. In the case of bivalves adhering to their natural substrate by byssus threads (e.g., mussels),
they must be removed using a pair of scissors or knife to avoid damaging the bivalve. In slightly
deeper places, bivalves are collected using tongs designed for this purpose. At deeper sub-tidal sites,
32
bivalves are collected using a stainless steel dredge. The clumps of bivalves and shell are then
separated into individuals using an oyster knife oysters or small chipping hammer.
The specific procedures for bivalve sampling are summarized below and displayed, as a flowchart, in
Figure 10.
•
The geographical position of the site and the method used to collect the samples must be
properly documented. Bivalves are collected in between tides from the intertidal areas or
at low tide by hand or, depending on the depth, using tongs or dredge. A minimum of 30
bivalves, or the number of necessary to collect 200 g of wet tissue, are collected for the
analysis of pesticides. Bivalves are double wrapped in aluminum foil free of organic
contaminants and placed in double plastic bags with the identification label outside the
first bag.
Figure 10. Bivalve sampling flowchart
•
The three samples (i.e., three stations) corresponding to any given site are placed in
containers (coolers) with ice. Samples should be place on top of the ice (isolated with
33
Sampling
newspaper to prevent their opening) and properly separated and labeled according to
station and site to ensure that the samples are not exchanged by accident.
•
Make sure that no water from melting ice accumulates inside the container by keeping the
drain open or that bivalves are not in contact with this water to avoid their opening and
possible contamination or death.
Bivalves are not opened or processed in the field other than separated and freed from attached debris.
As the samples are collected, bivalves are separated, washed with local water and identified according
to their station and site. An effort is made to collect organisms in the same size range; thus, those
organisms pooled for analysis are of similar age and/or maturity. This also applies to duplicate
samples.
The bivalves are scrubbed free of mud and debris at the collection site. Only pure bristle brushes and
seawater from the collection site are used for cleaning purposes. The bivalves are sorted and counted
to ensure that an adequate number of suitable specimens (~30 specimens per station or more,
depending on the sample size, to collect ~200 g of wet tissue) are collected for the analytical
determinations. If the bivalves are extremely small, a greater number must be collected to ensure an
adequate sample size to complete all chemical analyses with replication if needed. These bivalves are
double wrapped in combusted aluminum foil and then double bagged in labeled reclosable plastic
bags. Each separate sample from each of the three stations per site receives its own labeled sample
bag, ensuring that there is no mixing of samples. While processing the samples (Figure 10) avoid
smoking or working in areas where the samples may be contaminated with the emissions of
combustion engines (e.g., car, outboard motor).
Once in the laboratory, the bivalves are rinsed again with clean water, keeping them always in
movement to avoid opening, and dried on paper towels. The bivalves, corresponding to each of the
three stations within a site, are opened with the help of an oyster knife and the tissues carefully
separated from the shells and placed in a pre-cleaned 500 mL glass container (Table 10), properly
labeled with the corresponding information and covered with a Teflon lined lid, and kept frozen at 20°C until analysis. Do not fill the container to more than 2/3 of its capacity to allow for expansion of
the content during freezing.
All sample containers (glass jars and plastic bags) are labeled on the outside indicating the site/station
unique identification code, date and time, type of analysis to perform and initials of the person who
collects the sample.
5.6.6. Storage
On board, and immediately after cleaning and sorting, samples are placed in coolers until the end of
the day when samples are transferred to the laboratory for storage (Table 11). It is important that
during the storage in the field and transportation to the laboratory, bags of bivalves are not in contact
with the water from melting ice to avoid their opening and possible contamination or death. Drain the
excess water out of cooler by leaving the cooler drain open.
34
Table 10
Recommended pretreatment of biota sample containers
Parameter
Organochlorine,
urea herbicides.
Matrix
Biota
Recommended
container
Cleanup procedure
500 mL glass
containers (jars) with a
Teflon lined lid
Rinse the jars three times with water
and a detergent/soap free of
chloride. Air-dry the jars and firmly
cover with Teflon lined lids.
Alternatively, rinse the jars with
rinses with organic free water. Airdry the containers, cover with
aluminum foil and combust at 440°C
for 4 hours. Let them cool down and
cover with Teflon lined lids,
removing the aluminum foil just
before collecting the sample
Table 11. Preservation and maximum holding time for biota samples
Parameter
Organochlorine and
organophosphorus
insecticides
Triazine herbicides
Uracil & Urea
herbicides
Preservation
Kept in the dark and
frozen at -20°C
extraction.
35
Analytical Procedures
6.
ANALITICAL PROCEDURES
The analytical methods discussed below are a compilation of techniques used by laboratories of the
National Oceanic and Atmospheric Administration (NOAA) for the National Status and Trends
Program (NOAA, 1998) and by the Pesticide Analytical Laboratory (LAPA, from its initials in
Spanish) in the Environmental Pollution Research Center (CICA, from its initials in Spanish) at the
University of Costa Rica (UCR). In this section, the methods are presented as brief discussions and as
step by step guides, in the grayed boxes, for those analysts who need the extra details. Many of these
techniques are adaptations of methods of the United States Environmental Protection Agency (U.S.
EPA); therefore, it is advisable to consult those methods and their latest versions for more
information (Table 12).
Table 12.
Relevant methods of the United States Environmental Protection Agency (U.S.
EPA)
Method Number
Title
507
Determination of nitrogen and phosphorous-containing pesticides in water by gas
chromatography with a nitrogen-phosphorus detector
Determination of chlorinated pesticides in water by gas chromatography with an
electron capture detector
Determination of organic compounds in drinking water by liquid-solid extraction
and capillary column gas chromatography/mass spectrometry
Organochlorine pesticides and PCBs
Determination of organophosphorus pesticides in municipal and industrial
wastewater
Determination of organohalide pesticides and PCBs in municipal and industrial
wastewater
Determination of triazine pesticides in municipal and industrial wastewater
Determination of carbamate and urea pesticides in municipal and industrial
wastewater
The determination of organo-halide pesticides in municipal and industrial
wastewater
Determination of pyrethrins and pyrethroids in municipal and industrial
wastewater
Organic extraction and sample preparation
Separatory funnel liquid-liquid extraction
Soxhlet extraction
Ultrasonic extraction
Cleanup
Alumina cleanup
Florisil cleanup
Silica gel cleanup
Sulfur cleanup
Determinative chromatographic separations
Organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls by gas chromatography
Organochlorine pesticides by gas chromatography
Organophosphorus pesticides
Organophosphorus compounds by gas chromatography: Capillary column
technique
Semivolatile organic compounds by gas chromatography/mass spectrometry
(GC/MS)
N-methylcarbamates by high performance liquid chromatography (HPLC)
508
525.2
608
614
617
619
632
1656
1660
3500B
3510C
3540C
3550B
3600C
3610B
3620B
3630C
3660B
8000B
8080A
8081A
8140
8141A
8270C
8318
36
6.1. Interference
Interferences in the determination of organic pollutants at trace levels can be caused by contaminants
in solvents, reagents, glassware or other utensils used during sampling and subsequent sample
treatment. These interferences can produce false positives during instrumental analysis. All glassware
and solvents used in these methods must be verified to be free from interfering compounds; for this
reason, quality control samples such as blank and spike blank samples are processed with each
analytical batch.
Interferences from the matrix result from the co-extraction of compounds together with the analytes
of interest. In general, natural water samples present fewer interference problems and purification of
the sample extract by column chromatography is only used when colored extract suggests the
possibility of interferences. In contrast, elemental sulphur and lipids, naturally present in soils and
sediments, can cause interferences in the analysis of these samples extracts. Removal of sulphur and
lipids is possible by activated copper and silica gel:alumina column chromatography, respectively.
The effectiveness of these steps is evaluated by the extraction and subsequent analyses of quality
control samples intended for this purpose such as duplicate and spiked samples and, if available,
reference materials.
6.2. Quality control requirements
Common to all the analytical methods discussed in the following sections are the samples to control
the quality of the data. The analysis of target analytes (Table 1) includes, at a minimum with each
analytical batch, the following: a method blank (or blank), a duplicate sample, a matrix spike, a
matrix spike duplicate, and, if available for the same sample matrix and target analytes, a certified
reference material.
Method blank. The method blank is used to determine if samples are contaminated during the
extraction procedure. A method blank is prepared, following all laboratory steps of extraction and
purification without the sample matrix, with every 20 samples or with every sample set, whichever is
more frequent. The method blank is spiked with the appropriate amounts of surrogate standards
before the extraction and internal standards before its instrumental analysis. If the concentration for
any target component in the method blank is above the QC acceptance criteria or if an interference is
present which affect the analysis or quantification of target compounds, samples included in that
sample set should be re-extracted and reanalyzed.
Blank spike and blank spike duplicate. The recoveries of target analytes added to the blank spike are
used to estimate analytical accuracy of the analytical method without the matrix. A blank spike is
prepared, following all laboratory steps of extraction and purification, with every 20 samples or with
every sample set, whichever is more frequent, with the addition of appropriate amounts of surrogate
standards and known amounts of target analytes before the extraction and internal standards before its
instrumental analysis. A comparison of the recoveries in the blank spike and blank spike duplicate, if
available, is used to estimate the analytical precision of the method.
Matrix spike and matrix spike duplicate. The recoveries of target analytes added to the matrix spike
and matrix spike duplicate are used to estimate analytical accuracy and precision of the analytical
method in the presence of the matrix. Matrix spike and matrix spike duplicate samples are routinely
prepared with every 20 samples or with every sample set, whichever is more frequent. The matrix
spike and matrix spike duplicate samples are spiked with known amount of target compounds and
processed together with regular samples.
Duplicate sample. The duplicate sample is a replicate sample that is used to evaluate analytical
precision and sample homogeneity. This sample, chosen at random from the group of samples to
37
analyze, is prepared, following all laboratory steps of extraction and purification, with every 20
samples or with every sample set, whichever is more frequent, with the addition of appropriate
amounts of surrogate standards before the extraction and internal standards before its instrumental
analysis.
Certified reference material. A certified reference material, of the same or comparable sample matrix,
may be used with an extraction batch to monitor the accuracy of the analytical procedure by
comparing the obtained data with certified concentrations reported by experienced laboratories using
different and independent analytical determinations.
Analytical check sample (ACS). The analytical check sample (ACS) is prepared with every sample set
using the surrogate and internal standard and spike solutions used during sample preparation activities
and brought to volume with the appropriate analytical solvent. There is no extraction or any other
preparation activities performed upon the ACS. The ACS is used internally to evaluate the quality of
the standards used (e.g., check for solvent losses, evaporation or degradation in the standard and spike
solutions) and to control the volumes spiked into de the samples. At the instrument level, the ACS
allows for an evaluation of the analytical precision.
6.3. Extraction and purification of water samples
6.3.1. Introduction
The precise and accurate determination of organic contaminants, such as pesticides, in water samples
requires the extraction and purification of these compounds before their instrumental analysis. The
water samples are collected in precleaned amber bottles and, when required, preserved by adding
enough acid to reduce the pH to < 4. Alternatively, samples may be preserved by adding methylene
chloride at a volume ratio of approximately 1 part of methylene chloride to 40 parts of water sample.
The samples are then stored in the dark at 4°C±2°C until extraction. After the addition of the proper
amounts of surrogate standards, the water samples are extracted with methylene chloride and the
extracts are dried with anhydrous sodium sulfate (Na2SO4). The extracts are concentrated and the
solvent exchanged into hexane if required. Depending on the pesticides to be determined, optional
extract purification steps, using column chromatography for the removal of matrix interferences, may
be necessary. Quality control samples are processed following all laboratory steps of extraction and
purification with each analytical batch.
The determination of pesticide concentrations in water samples require their measurement a trace
levels (i.e., ng L-1 or pg L-1); therefore, a 4-liter sample, at a minimum, need to be extracted. Water
samples of other sizes may be collected and extracted by appropriately adjusting the volume of
methylene chloride used for the extraction, the amounts of surrogate and internal standards and the
final volume of the extract (see 6.8.5.). The samples extracts are stored in the dark at 4°C±2°C.
6.3.2. Application
The extraction and purification methods for water samples described in the next sections apply to the
following analytes:
38
Aromatic fungicides
Triazine herbicides
Organophosphorus
insecticides
Uracil herbicides
Urea herbicides
Chlorothalonil
Ametryn
Atraton
Atrazine
Prometon
Carbaryl
Chlorpyrifos
Diazinon
Permethrin
Bromacil
Diuron
Aldrin
alpha-chlordane
Dieldrin
4,4'-DDD
4,4'-DDE
4,4'-DDT
Endrin
Prometryn
Propazine
Secbumeton
Simetryn
Carbofuran
Fenamiphos
Parathion-methyl
Endosulfan I
Endosulfan II
Endosulfan sulfate
Endrin aldehyde
Endrin ketone
Simazine
Terbuthylazine
Terbutryn
Oxamyl
alpha-HCH
beta-HCH
delta-HCH
gamma-HCH (Lindane)
Heptachlor
Heptachlor epoxide
Methoxychlor
6.3.3. Sample collection, preservation and storage
Water samples must be collected and stored in precleaned amber bottles (see Table 4). Once
collected, the water samples must be kept in the dark, on ice, and transported to the laboratory where
are kept in the dark at 4°C ± 2°C until analysis (see Table 5). When required, acid or methylene
chloride can be added to preserve the samples.
6.3.4. Equipment and supplies
6.3.4.1.
Glassware and hardware
All laboratory glassware is pre-cleaned according to the laboratory Standard Operation Procedures.
Typically, glassware is cleaned with water and laboratory detergent, excess water removed with low
grade acetone and sequentially rinsed with pesticide grade acetone, hexane and methylene chloride.
Alternatively, non volumetric glassware can be air dried, covered with aluminum foil, combusted at
440°C for 4 h and kept in a protected area, without removing the aluminum foil.
The following laboratory glassware and hardware are needed for this method:
-
Separatory Funnel: 2 or 3-L Pyrex with Teflon stopcock
Analytical Balance: with an accuracy of 0.0001 mg
Balance: top loading with an accuracy of 0.1 g
Flat Bottom Flask: 250 and 500 mL, combusted at 440°C for 4 hours
Water Bath: heated to 60-70ºC
Graduated Cylinders: 250 and 1000 or 2000 mL capacity
Chromatographic Columns: 30 cm x 13 mm (i.d.) with 250 mL reservoir and Teflon stopcock
Snyder Columns: 3-ball column
Desiccators
Funnels: borosilicate glass, assorted sizes
Spatula: stainless steel with a scoop at one end
39
-
Nitrogen gas evaporation unit
Pyrex Glass Wool: combusted at 440°C for 4 hours or previously extracted with solvents
Micro pipettes: 100 µL
Teflon Boiling Chips: solvent rinsed.
pH Paper
Pasteur pipettes: 1 mL, disposable, combusted at 440°C for 4 hours
Scissors
Concentrator Tubes: Kuderna-Danish, 25 mL graduated, with ground glass stoppers
Glass rod: 50 cm x 0.7 cm
Beakers: 50, 250 and 500 mL capacity, borosilicate glass
Vials: 1 mL to 7 mL glass vials with Teflon-lined caps.
Glass Wool: combusted at 440°C for four hours in a covered beaker.
Note: Volumetric glassware for sample measurement or introduction of internal standards must be
calibrated prior to use.
6.3.4.2.
Reagents
- Hydrochloric acid: reagent grade; 12 N and 6 N (prepared as a 1:1 (v/v) mixture of
concentrated HCl with reagent water prior to use).
- Purified water: HPLC grade or equivalent
- Alumina Oxide (alumina): basic Brockmann I; chromatographic grade, ~150 mesh or
equivalent; combusted at 440°C for 4 hours and stored at 120°C
- Sand: White quartz, -50 to 70 mesh; combusted at 440°C for 4 hours
- Copper: 20-30 mesh; granular
- Florisil
- Chromatographic Silica gel: grade 923, 100-200 mesh; activated at 170°C for at least 24
hours and stored at 170°C
- Analyte spike solution
- Internal standard Solution
- Recovery standard solution
- Sodium sulfate (Na2SO4): granular; anhydrous; combusted at 440°C for 4 hours and stored at
120°C.
- Solvents:
Acetone: pesticide grade or equivalent
Hexane: GC/GC-MS grade or equivalent
Methanol: pesticide grade or equivalent
Methylene chloride: pesticide grade or equivalent
Pentane: pesticide grade or equivalent
6.3.4.3.
Analytical Standards
Analytical Standards are purchased as solutions with certification of their purity, concentration and
authenticity. Standards are stored in the dark at approximately -4°C ± 2°C in amber glass screwcapped vials with Teflon-lined caps.
6.3.5. Procedure
Figure 11 shows a flow chart illustrating the procedure for the analysis of different pesticides in water
samples.
40
Figure 11. Flowchart illustrating the procedure described for the analysis of different
pesticides in water samples
41
6.3.5.1.
Sample preparation
As indicated above, the determination of pesticide concentrations in water samples require the
extraction of at least a 4-liter sample but other sample sizes may be collected and extracted by
appropriately adjusting the volume of methylene chloride used for the extraction, the amounts of
surrogate and internal standards and the final volume of the extract. In general, water sample extracts
are adequately clean to be analyzed by gas chromatography without additional clean up. In most
cases, water sample extracts that are colored, have strong odor or present an oily appearance need
further clean up. Different cleanup options, depending on the target analytes, are discussed in the
following sections.
6.3.5.2.
Sample extraction
After the pH adjustment, if needed, and the addition of the appropriate surrogate standards, a known
volume of water sample is extracted 3 times with fresh portions of methylene chloride (80-100 mL
per liter) in a separatory funnel. The separatory funnel is manually shaken for 3 minutes each time
allowing time for the solvent to decant between extractions. The portions of solvent are dried with
anhydrous Na2SO4 as they are collected, as one fraction, in a 500 mL flask. Once the extraction is
completed, 3-5 boiling chips are added to the flask and a three ball Snyder column is attached to the
flask and the solvent is evaporated to 10-15 mL on a water bath at 40-45°C. This volume is then
transferred to a 25 mL concentrator tube together with 2 or 3 methylene chloride rinses of the flask.
After the addition of a boiling chip, the extract is concentrated in hexane on a water bath at 40-45°C
under a gentle nitrogen flow. The final volume is ~2 mL if the extract is colored, have strong odor or
present an oily appearance that requires clean up. Most interfering substances can be removed by
silica gel:alumina or Florisil column chromatography as discussed below. If the final extract is clean,
it is taken to a ~1.0 mL final volume, spiked with the internal standard and analyzed.
Water sample extraction – A step by step guide
•
Mark the water meniscus in the sample container. Measure and record the pH of the sample. Transfer the
sample to the separatory funnel.
o
•
The pH of the sample needs to be adjusted before extraction. With the exception of samples intended for
the analysis of carbamate insecticides, the pH should be adjusted to 7±1 with NaOH or H2SO4. Samples
reserved for the analysis of carbamate insecticides should be adjusted to ~3 with H2SO4 or HCl. Check
final pH with a pHmeter.
•
Based upon the information received, add the appropriate amount of surrogate standards to all samples,
including those intended for quality control (e.g., blank and spikes). Add the matrix spike solution to the
matrix spike/matrix spike duplicate or laboratory blank spike/laboratory blank spike duplicate samples.
Seal the separatory funnel and shake it to thoroughly mix the sample.
•
Pour 80-100 mL of methylene chloride into a graduated cylinder per liter of sample. If the whole sample
volume is used, rinse the sample bottle with this methylene chloride, and then add the rinse to the
separatory funnel.
o
42
If the total volume of the sample is not going to be extracted measure exactly the volume to extract
using a 1000 mL graduated cylinder and transfer to the separatory funnel.
If only a portion of the sample volume is extracted, add the methylene chloride directly into the
separatory funnel.
•
Initial venting should be done after the funnel has been sealed and shaken once since methylene chloride
creates excessive vapor pressure rapidly.
•
Seal and shake the separatory funnel vigorously for 3 minutes, with periodic venting into the hood to
release excess pressure.
•
After extracting for 3 minutes, allow the organic layer to separate from the water phase for about 10-15
minutes. Collect the solvent extract layer by draining the solvent through a funnel packed with
anhydrous sodium sulfate into a 500 mL flat bottom flask.
•
If an emulsion interface forms that is more than 1/3 the size of the solvent layer, refer to EPA Method
3510 for possible mechanical techniques to break the emulsion. The emulsion can be broken with the
addition of a few grams of NaCl, agitation with a glass rod or filtration through combusted glass wool.
•
Repeat the extraction two more times using fresh portions of solvent (80-100 mL for each 1 L sample
volume). Rinse the sodium sulfate funnel several times with 5-10 mL of methylene chloride. Collect the
rinses into the 500 mL flat bottom flask with the sample extract.
•
If further pH adjustment and extraction is required, adjust the pH of the aqueous phase in the separatory
funnel and extract three more times with methylene chloride with 60 mL per 1 L sample). Collect and
combine these three extracts into a second 500 mL flat bottom flask, dry with sodium sulfate if needed,
and label appropriately.
•
If the whole sample volume was extracted, refill the sample bottle with tap water to the mark previously
done. Measure the amount of sample with a 1- or 2-L graduated cylinder (± 5 mL) as appropriate.
Record the volume.
•
Add clean boiling chips and a three ball Snyder column to the 500 mL flat bottom flask. Place the
apparatus in a water bath heated to approximately 40-45°C. The methylene chloride extract is
concentrated to a volume of about 10-15 mL. At the proper rate of distillation the balls will actively
chatter but the chambers will not flood.
•
Remove the Snyder Column and rinse its lower joint. Transfer the content of the flask into a 25 mL
Kuderna-Danish concentrator tube. Add clean boiling chips and place the concentrator tube in a hot
water bath (40-45°C). The extract volume is subsequently concentrated to about 2 mL in methylene
chloride.
•
Inspect extracts at about a 2 mL volume. If particulate is present, if colored, or if oil is suspected (either
by odor, visual appearance, or by documentation), the extract should be processed through a cleanup
procedure before instrumental analysis.
6.3.5.3.
Purification of the extract by column chromatography
In general, water sample extracts are adequately clean to be analyzed without the need of clean up. If
needed, the water sample extracts can be cleaned using one the following procedures depending on
the target analyte.
6.3.5.4.
Silica gel/alumina column chromatography cleanup
This cleaning procedure applies to the pesticides listed in the application of the method with the
exception of carbamate and organophosphorus insecticides and triazine herbicides (see Florisil
cleanup below). Briefly, the chromatographic column is filled with methylene chloride followed by a
plug of combusted glass wool, placed at the bottom of the column through the solvent to retain the
adsorbent material. This glass wool plug is then covered with 1 cm of anhydrous sodium sulfate or
washed and combusted sand to achieve uniform surface. Ten grams of dry alumina (activated at
43
400°C and partially deactivated with 1 % w/w with organic free water) is added to the column.
Twenty grams of silica gel (activated at 170°C and partially deactivated with 5 % w/w with organic
free water) is suspended in methylene chloride before it is added to the column. Once the reaction
between the silica gel and the methylene chloride is finished (the mix stops bubbling), the silica gel
slurry is added to the column on top of the alumina. Approximately 2 cm of anhydrous sodium sulfate
or washed and combusted sand and 1-2 cm of activated copper are added to the top column (see Silica
gel/alumina cleanup below). At this point, the column contains, in methylene chloride and from the
bottom upwards, a glass wool plug, 1 cm of anhydrous sodium sulfate or washed and combusted
sand, 10 grams of partially deactivated alumina, 20 grams of partially deactivated silica gel, 2 cm of
anhydrous sodium sulfate or washed and combusted sand and 1-2 cm of activated copper. The
methylene chloride is eluted to reach the activated copper and 50 mL of pentane are added and to
completely replace the methylene chloride. The column is now ready to receive the concentrated
sample extract.
The sample extract, concentrated to ~2 mL in hexane as explained earlier, is transferred into the
column using a disposable Pasteur pipette and eluted until it reaches the surface of the activated
copper. The eluted solvent is collected in a 250 mL flat bottom flask placed directly under the
column. The tube containing the sample is rinsing 2-3 times with small volumes (~1 mL) of a
methylene chloride:pentane (1:1) mixture and added to the column, allowing the solvent to elute into
the copper before a new addition. Two hundred mL of methylene chloride:pentane (1:1) mixture are
added to the column and eluted into the 250 mL flat bottom flask at a speed of approximately 1 ml
per minute (drop by drop). In addition to the compounds of interest to this study (chlorinated
insecticides), this fraction also contains other chlorinated contaminants (e.g., polychlorinated
biphenyls, polybrominated diphenyl ethers, and aromatic hydrocarbons.
Silica gel/alumina column chromatography cleanup – A step by step guide
Preparation for column setup
•
Remove the sodium sulfate, alumina, and silica gel from the oven storage and place them in
desiccators to cool to room temperature.
•
Remove combusted sand from the 130°C oven and let it sit on the bench to cool to room
temperature.
Note: When taking out materials from the oven, wear heat protective gloves or use large forceps
capable of handling heavy objects. The beakers containing sand, silica gel, alumina, and sodium
sulfate are heavy (up to 1000 grams), and are hot. Make sure all the beakers are properly covered
with aluminum foil.
Preparation of partially deactivated silica gel and alumina
44
•
Clean and calibrate the balance prior to use according to the instructions in the balance calibration
logbook. Be sure to indicate calibration date, weight used and operator’s initials.
•
Place an empty flask and funnel on the balance and tare the weight until the balance reading is
“0.000 g”
•
Weigh the alumina into the flask. The total amount of alumina weighed should be 10 g times the
number of samples. Generally, extra alumina is weighed (at least 10 g) in case additional adsorbent
is needed when building columns. Record this weight.
•
Place the flask and alumina on the balance and tare the weight until the balance reading is “0.000 g”.
Deactivate the alumina by adding 1% (w/w) of HPLC water, or similar organic free water, to the
alumina flask while the flask is still sitting on the balance.
Note: The amount of water added is calculated by multiplying the total weight of alumina x 0.01.
For example, if 171.2 g of alumina (for 16 columns plus extra ~10g) is in the flask, 1.7 g of water
(171.2 x 0.01 ≈ 1.7) is added to the flask. Tare the weight of the alumina, then add the calculated
amount of water into the flask.
•
Place a second empty flask and funnel on the balance and tare the weight until the balance reading is
“0.000 g”
•
Weigh the appropriate amount of silica gel into the flask. The total amount of silica gel should be 20
g times the number of samples. Extra silica gel (at least 20-25 g) is usually weighed out in case
additional silica gel is needed when building columns. Record this weight.
•
Place the flask and silica gel on the balance and tare the weight until the balance reading is “0.000
g”. Deactivate the silica gel by adding 5% (w/w) of HPLC water, or similar organic free water, to
the silica gel flask.
Note: The amount of water added is calculated by multiplying the total weight of silica gel x
0.05. For example, if 340 g of silica gel (for 16 columns plus extra ~20g) is weighed, the amount of
water added to the silica gel is 17 g (340 x 0.05 = 17). Tare the weight, then add the calculated
amount of water into the flask.
•
Seal and shake the flasks every 5-10 minutes for 1 to 2 hour to equilibrate. Be sure to shake it
briskly to break any lumps formed during water addition.
Preparation of activated copper
Note that activated copper is used to remove elemental sulfur that might interfere with the analysis
of target analytes by gas chromatography associated with an electron capture detector. If the sample
does not present the characteristic rotten-egg smell of sulphydric acid, it might not be necessary to
add activated copper on top of the column; although, to be on the safe side, addition of copper is
recommended. Do not add activated copper to the portion of the extract intended for
organophosphorus insecticides as copper may degrade some of these compounds. Used an
alternative way to remove sulfur if needed (use of tetrabutylammonium sulfide; EPA Method
3660B).
•
Place approximately 50 g (for 16 samples) of granular copper into a 250 mL beaker.
•
Under a fume hood, carefully pour an appropriate amount of concentrated 12 N hydrochloric acid
into the beaker. The copper should be submerged in the acid.
•
Stir the copper with a glass stirring bar gently for a few seconds and let the copper stand in the acid
for 5 minutes.
•
Under a fume hood, place a funnel plugged with glass wool on top of another 250 mL beaker and
carefully pour the copper/acid mixture into the funnel.
•
Rinse the copper with HPLC water, or similar organic free water, until the rinsing water is neutral.
To check that the acid was removed, place the funnel on another clean 250 mL beaker and rinse the
copper again. Test the rinse water with a small amount of baking soda. If rinse reacts with the
baking soda then additional rinsing with water is needed. If it does not react, place the funnel
containing the copper on a clean beaker. The collected rinsing water is neutralized with baking soda
and discarded according to the laboratory procedures.
•
Rinse the copper in the funnel three to four times of approximately 20 mL of methanol followed
with three to four times of approximately 20 mL of methylene chloride and three to four times of
approximately 20 mL of hexane. Discard the solvents as waste following the laboratory procedures.
•
Store the copper covered with hexane in a properly labeled beaker and cover with aluminum foil,
noting date and identity of hexane as the solvent. It is better to activate the copper just before using
it as it gets deactivated with time.
45
Preparation of pentane/methylene chloride (1:1) solvent mixture
•
The pentane/methylene chloride (1:1) solution is prepared by mixing 2 L of pentane with 2 L of
methylene chloride. Use a 4 L labeled mixing bottle and a 2 L graduated cylinder to measure the
solvents.
•
Measure 2 L of pentane in the graduated cylinder and pour the solvent into the mixing bottle.
•
Using the graduated cylinder, measure 2 L of methylene chloride and add it to the mixing bottle.
Seal the mixing bottle and mix the solvents by shaking the bottle. Shake again immediately prior to
use.
Column setup
46
•
Clamp the glass chromatography columns (30 cm x 13 mm with a Teflon stopcock and a 250 mL
reservoir) onto the column rack located in the hood. The number of columns should be the same as
the number of sample extracts.
•
Place a 250 mL waste jar under each column to collect waste solvent.
•
Open the stopcock. Using labeled squeeze bottles, rinse the columns three times with approximately
10 mL of methanol each time followed by three 10 mL of rinses with methylene chloride. Make
sure that the rinsing solvents completely coat and rinse the inside of the column.
•
Close the stopcock and fill the column with approximately 30 mL of methylene chloride.
•
Rinse the tips of a pair of forceps and scissors with methylene chloride. Cut a plug of glass wool
with the scissors. Place the glass wool into the column using the forceps. Rinse a glass rod with
methylene chloride and pack the glass wool into the bottom of the column with the glass rod. Note
that the glass wool plug is inserted through the solvent so no air is trapped in the plug.
•
Place a funnel on top of the column and add 1 cm of combusted sand into each column through the
funnel using a stainless steel scoop pre-rinsed with methylene chloride.
•
Place a 50 mL beaker on a clean calibrated balance. Tare the weight.
•
Weigh approximately 10 g (±0.1 g) of deactivated alumina per column.
•
Pour the alumina into the column through the funnel. Rinse the funnel and column reservoir with
methylene chloride, making sure all of the alumina transfers into the column. Settle the alumina by
opening the stopcock to drain part of the solvent and tapping, very gently, the column while
draining the solvent to the surface of the alumina. Add more solvent if necessary.
•
After adding the alumina into every column, place a 50 mL beaker on a clean calibrated balance.
Tare its weight and weigh approximately 20 g (±0.2 g) of deactivated silica gel for each column.
•
Add methylene chloride to the silica gel in the weighing beaker. Mix well with a glass rod to make
slurry, making sure no visible air bubbles are present once the reaction between solvent and silica
gel stops.
•
Pour the silica gel/methylene chloride slurry into the column through the funnel. Rinse the beaker
with methylene chloride and pour it into the column. Rinse the funnel and the column reservoir with
methylene chloride, making sure all the silica gel settles into the bottom of the column. Open the
stopcock and drain the solvent to a few centimeters above the silica gel surface.
•
Add approximately 2 cm of sodium sulfate anhydrous or combusted sand into the column using a
stainless steel scoop. If necessary, rinse the column reservoir with methylene chloride to make sure
all the sodium sulfate (or combusted sand) settles onto the column.
•
If required (i.e., if sulfur is suspected), slowly add approximately 1 cm of activated granular copper
evenly over the sodium sulfate, using a stainless steel scoop.
•
Open the stopcock and drain the solvent to the top surface of the column (sodium sulfate or copper).
Discard solvent waste into appropriate waste container.
•
Add 50 mL of pentane and drain the pentane to the surface of sodium sulfate or copper.
•
Close the stopcock. The column is ready to receive the sample extract.
Purification of the sample extract using the silica gel/alumina column
•
Rinse the outside of the column tip (below the stopcock) into the waste jar using methylene
chloride.
•
Replace the waste collecting jar with a 250 mL flat bottom flask. Discard solvent waste into
appropriate waste container. Each flask should be appropriately labeled with extraction batch
number, fraction type (if more than one), and extract ID number. This flask is used to collect the
desired extract fraction.
•
Transfer the extracts from the concentrating tubes to the column using disposable pipettes. The
samples should already be concentrated and solvent exchanged into about 2 mL of hexane.
•
Open the stopcock and let the extract drain to the top surface of the column. Close the stopcock.
•
Rinse the extract concentrating tube using with 1 mL of pentane/methylene chloride (1:1) solution
and add the rinsing solution into the column with the same disposable pipettes.
•
Open the stopcock. Let the extract rinse drain to the surface of the column. Close the stopcock.
•
Repeat the two previous steps with two additional pentane/methylene chloride rinses of the
concentrating tube. Allow for each portion to drain to the top of the column before a new addition.
•
After transferring the extract and rinses to the top of the column, add carefully, to avoid disturbing
the top of the column and resuspending the sample, 200 mL of pentane/methylene chloride (1:1)
solution using a graduated cylinder.
•
Open the stopcock and elute the sample in the flat bottom flask at a flow rate of about 1 mL per
minute (drop by drop). The flow rate is controlled by adjusting the stopcock.
•
After the 200 mL of pentane/methylene chloride solution have passed through the column and are
collected in the 250 mL flat bottom flask, close the stopcock of the column. Remove the collecting
flask and cap it with a glass stopper. Dismantle the column by pouring out the alumina and silica gel
from the column into a specified chemical waste container.
•
The collected sample extracts are then transferred to the laboratory area where the concentration
step can be performed.
6.3.5.5.
Florisil column chromatography cleanup
This method describes procedures for Florisil cleanup of solvent extracts of environmental samples
containing the carbamate insecticides, triazine herbicides and organophosphorus insecticides listed in
Table 1. Briefly, the chromatographic column is filled with hexane and a small amount of glass wool
is packed into the bottom of the column, to keep the column material, followed by just enough
combusted sand or sodium sulfate anhydrous for an even surface. An adequate amount of calibrated
Florisil (usually 20 g) is added, dry, into the column and allowed to settle. Approximately 1 cm of
combusted sand or sodium sulfate anhydrous is added to the top of the column. At this point, the
column contains, in hexane and from the bottom upwards, a glass wool plug, 1 cm of combusted sand
or anhydrous sodium sulfate, approximately 20 g of calibrated Florisil and 1 cm of combusted sand or
anhydrous sodium sulfate. The hexane is eluted to the surface of the combusted sand or anhydrous
sodium sulfate and extra 30 mL of hexane are added to rinse the column. After the elution of this
solvent, the column is ready to receive the sample extract.
47
The sample extract, adjusted to ~2 mL in hexane, is transferred to the column using a disposable
Pasteur pipette. The extract is drained to the top of the column and the eluted solvent is collected in a
500 mL flat bottom flask. The tube is rinsed 2-3 times with small volumes (~1-2 mL) of an
acetone/hexane (1:1) mix and the rinses added to the column allowing the solvent to elute to the top
of the column before each new addition. Two hundred and fifty (250) mL of the acetone/hexane
eluting solvent mix is added to the column and the solvent eluted at a flow rate of 3-5 mL min-1. The
clean extract is concentrated in acetonitrile before instrumental analysis.
Florisil column chromatography cleanup – A step by step guide
Preparation of acetone/hexane (1:1) solvent mixture
•
The acetone/hexane (1:1) solution is prepared by mixing 2 L of acetone with 2 L of hexane. Use a 4
L labeled mixing bottle and a 2 L graduated cylinder to measure the solvents.
•
Measure 2 L of acetone in the graduated cylinder and pour the solvent into the mixing bottle.
•
Using the graduated cylinder, measure 2 L of hexane and add it to the mixing bottle. Seal the mixing
bottle and mix the solvents by shaking the bottle. Shake again immediately prior to use.
Column setup
•
Clamp the glass chromatography columns (30 cm x 13 mm with a Teflon stopcock and a 250 mL
reservoir) onto the column rack located in the hood. The number of columns should be the same as
the number of sample extracts.
•
Place a 250 mL waste jar under each column to collect waste solvent.
•
Open the stopcock. Using labeled squeeze bottles, rinse the columns three times with approximately
10 mL of methanol each time followed by three 10 mL of rinses with methylene chloride. Make
sure that the rinsing solvents completely coat and rinse the inside of the column.
•
Close the stopcock and fill the column with hexane.
•
Rinse the tips of a pair of forceps and scissors with methylene chloride. Cut a plug of glass wool
with the scissors. Place the glass wool into the column using the forceps. Rinse a glass rod with
methylene chloride and pack the glass wool into the bottom of the column with the glass rod. Note
that the glass wool plug is inserted through the solvent so no air is trapped in the plug.
•
Place a funnel on top of the column and add 1 cm of combusted sand or sodium sulfate anhydrous
into each column through the funnel using a stainless steel scoop pre-rinsed with methylene
chloride.
•
Place a 50 mL beaker on a clean calibrated balance. Tare the weight.
•
Weigh approximately 20 g (±0.1 g) of calibrated Florisil per column.
o
48
Different lots of Florisil may vary in adsorptive capacity. To standardize the amount of Florisil
to utilize in the columns, use the lauric acid value. This procedure determines de adsorption of
lauric acid as mL g-1 of Florisil (ASTM, 1980).
•
Pour the Florisil into the column through the funnel. Rinse the funnel and column reservoir with
small volumes of hexane, making sure all of the Florisil transfers into the column. Settle the Florisil
by opening the stopcock to drain the solvent and tapping, very gently, the column while draining the
solvent to the surface of the Florisil.
•
Add approximately 2 cm of sodium sulfate anhydrous or combusted sand into the column using a
stainless steel scoop. If necessary, rinse the column reservoir with small volumes of hexane to make
sure all the sodium sulfate (or combusted sand) settles in the column
•
Open the stopcock and drain the solvent to the surface of column. Discard solvent waste into
appropriate waste container.
•
Add 30 mL of hexane and drain the solvent to the surface of the column.
•
Close the stopcock. The column is ready to receive the sample extract.
Purification of the sample extract using the Florisil column
•
Rinse the outside of the column tip (below the stopcock) into the waste jar using hexane.
•
Replace the waste collecting jar with a 500 mL flat bottom flask. Discard solvent waste into
appropriate waste container. Each flask should be appropriately labeled with extraction batch
number and extract ID number.
•
Transfer the extracts from concentrating tubes to the column using disposable pipettes. The samples
should already be concentrated and solvent exchanged into about 2 mL of hexane.
•
Open the stopcock and let the extract drain to the top surface of the column. Close the stopcock.
•
Rinse the extract concentrating tube using with ~1-2 mL of acetone/hexane (1:1) solution and add
the rinsing solution into the column with the same disposable pipette.
•
Open the stopcock. Let the extract rinse drain to the surface of the column. Close the stopcock.
•
Repeat the two previous steps with two additional acetone/hexane rinses of the concentrating tube.
Allow for each portion to drain to the top of the column before a new addition.
•
After transferring the extract and rinses to the top of the column, add carefully, to avoid disturbing
the top of the column and resuspendind the sample, 250 mL of acetone/hexane (1:1) solution using a
graduated cylinder.
•
Open the stopcock and elute the sample in the flat bottom flask at a flow rate of about 3-5 mL min-1.
The flow rate is controlled by adjusting the stopcock.
•
After the 250 mL of acetone/hexane solution have passed through the column and are collected in
the 500 mL flat bottom flask, close the stopcock of the column. Remove the collecting flask and cap
it with a glass stopper. Dismantle the column by pouring out the Florisil from the column into a
specified chemical waste container.
•
The collected clean samples are then transferred to the laboratory area where the extracts are
concentrated, in acetonitrile, before the instrumental analisis.
6.4. Extraction and purification of soil/sediment and biota samples
6.4.1. Introduction
The evaluation of organic contaminants, such as pesticides, in environmental samples at trace levels
(ng g-1 or pg g-1) requires the extraction and isolation of these contaminants from the matrix. A portion
of homogenized soil/sediment or tissue sample, respectively, is chemically dried and extracted using a
Soxhlet extractor after the addition of the proper amounts of surrogate standards. The extract is then
concentrated and purified by column chromatography before instrumental analysis. Quality control
samples are processed in each analytical batch with regular samples following the same laboratory
procedures.
6.4.2. Application
The extraction and purification methods for soil/sediment and biota samples described in the next
sections apply to the following analytes:
49
Aromatic fungicides
Triazine herbicides
Organophosphorus
insecticides
Uracil herbicides
Urea herbicides
Orgaochlorine insecticides
Chlorothalonil
Ametryn
Atraton
Atrazine
Prometon
Carbaryl
Chlorpyrifos
Diazinon
Permethrin
Bromacil
Diuron
Aldrin
alpha-chlordane
Dieldrin
4,4'-DDD
4,4'-DDE
4,4'-DDT
Endrin
Prometryn
Propazine
Secbumeton
Simetryn
Carbofuran
Fenamiphos
Parathion-methyl
Simazine
Terbuthylazine
Terbutryn
Oxamyl
Endosulfan I
Endosulfan II
Endosulfan sulfate
Endrin aldehyde
Endrin ketone
alpha-HCH
beta-HCH
delta-HCH
gamma-HCH (Lindane)
Heptachlor
Heptachlor epoxide
Methoxychlor
6.4.3. Sample collection, preservation and storage
The soil/sediment or biota sample must be collected and placed in glass containers free of organic
contaminants (see Table 7), transported on ice to the laboratory and stored at -20°C in its original
container until analysis (see Table 8). In preparation for their analyses, the samples are left to thaw in
a refrigerator and homogenized as appropriate. Soil/sediment samples are homogenized with a spatula
previously washed with laboratory detergent/soap and water and sequentially rinsed with pesticides
quality acetone, hexane and methylene chloride. Tissue (biota) samples are homogenized using a
tissue homogenizer (Tissumizer or similar). After withdrawing the necessary amount of sample for
analysis and dry weight determination the remaining is stored in the dark at -20°C. Sample extracts
are maintained at or below 4°C until instrumental analysis, after which they are also stored in the dark
at -20°C.
6.4.4. Equipment and supplies
6.4.4.1.
Glassware and hardware
All laboratory glassware is pre-cleaned according to the laboratory Standard Operation Preocedures.
Typically, glassware is cleaned with water and laboratory detergent, excess water removed with low
grade acetone and sequentially rinsed with pesticide grade acetone, hexane and methylene chloride.
Alternatively, non volumetric glassware can be air dried, covered with aluminum foil, combusted at
440°C for 4 h and kept in a protected area without removing the aluminum foil, until needed.
The following laboratory glassware and hardware are needed for this method:
-
50
Analytical Balance: with an accuracy of 0.0001 mg
Balance: top loading with an accuracy of 0.1 g
Flat Bottom Flask: 250 and 500 mL, combusted at 440°C for 4 hours
Water Bath: heated to 60-70
Cellulose or ceramic thimbles
Graduated Cylinders: 250 and 1000 or 2000 mL capacity
-
Chromatographic Columns: 30 cm x 13 mm (i.d.) with 250 mL reservoir and Teflon stopcock
Snyder Columns: 3-ball column
Desiccators
Funnels: borosilicate glass, assorted sizes
Spatula: stainless steel with a scoop at one end
Convection oven set to 63-65°C
Soxhlets
Nitrogen gas evaporation unit
Glass Wool: combusted at 440°C for four hours in a covered beaker.
Micro pipettes: 100 µL
Teflon Boiling Chips: solvent rinsed.
Aluminum paper: combusted at 440°C for four hours
Forceps: stainless steel, assorted sizes
Pasteur pipettes: 1 mL, disposable, combusted at 440°C for 4 hours
Scissors
Concentrator Tubes: Kuderna-Danish, 25 mL graduated, with ground glass stoppers
Glass rod: 50 cm x 0.7 cm
Beakers: 10 (for dry weight determination), 50, 250 and 500 mL capacity, borosilicate glass
Vials: 1 mL to 7 mL glass vials with Teflon-lined caps.
Note: Volumetric glassware for sample measurement or introduction of internal standards must be
calibrated prior to use.
6.4.4.2.
Reagents
- Hydrochloric acid: reagent grade; 12 N.
- Purified water: HPLC grade or equivalent
- Alumina Oxide (alumina): basic Brockmann I; chromatographic grade, ~150 mesh or
equivalent; combusted at 440°C for 4 hours and stored at 120°C
- Sand: White quartz, -50 to 70 mesh; combusted at 440°C for 4 hours
- Copper: 20-30 mesh; granular
- Florisil
- Chromatographic Silica gel: grade 923, 100-200 mesh; activated at 170°C for at least 24
hours and stored at 170°C
- Analyte spike solution
- Internal standard Solution
- Recovery standard solution
- Sodium sulfate (Na2SO4): granular; anhydrous; combusted at 440°C for 4 hours and stored at
120°C.
- Solvents:
Acetone: pesticide grade or equivalent
Hexane: GC/GC-MS grade or equivalent
Methylene chloride: pesticide grade or equivalent
Pentane: pesticide grade or equivalent
6.4.4.3.
Analytical Standards
Analytical Standards are purchased as solutions with certification of their purity, concentration and
authenticity. Standards are stored in the dark at approximately -4°C ± 2°C in amber glass screwcapped vials with teflon-lined caps.
51
Figure 12. Flowchart illustrating the procedure described for the analysis of different
pesticides in soil/sediment and biota samples
52
6.4.5. Procedure
Figure 12 (above) shows a flow chart illustrating the procedure for the analysis of different pesticides
in solid samples (soil/sediment or biota).
6.4.5.1.
Dry weight determination
An aliquot of approximately 1 g of homogenized soil/sediment or tissue sample is weighed in a tared
small beaker (10 mL) and dried in stove, with air circulation, at 63-65°C. After 24 hours the aliquot is
weighed and returned to the stove for 2 more hours before repeating the weighing. If the difference
between the two weights is less than 0.02 g, the second reading is used to calculate the dry weight
percent of the sample. If the difference is greater than 0.02 g, the sample is returned to the stove for 2
extra hours until the difference between two consecutive weights is equal to or less than 0.02 g.
Determination of percent dry weight in solid samples– A step by step guide
•
Calibrate the toploading balance according to the manufacturer's instructions and indications on the
calibration lab notebook. Register the date of calibration, used weighs and initials of the operator.
•
Tare the balance until the weight indicator reads "0.000 g".
•
Place a vial or 10 mL beaker and register the weight ("Vial weight") in the dry weight lab notebook.
•
Stir carefully, with a stainless steel spatula previously cleaned with solvents, the homogenized wet
soil/sediment or tissue sample and weight approximately 1-2 g of sample in the vial ("Vial+Wet
sample") in the dry weight lab notebook.
•
Prepare a method blank with every analytical batch by using an empty vial. The values for "Vial
weight" and "Vial + Wet sample" will be the same.
•
Process the quality control samples (blank, duplicate, matrix spike samples and certified reference
material) in of the same way as the regular samples.
•
Record any unusual characteristics (i.e., odor, oily appearance, pieces of vegetation, shells) in the
comment section of the in the dry weight lab notebook.
•
Once all the samples have been processed, place all % dry weight samples in a laboratory tray, cover
loosely with aluminum foil and place in a 63-65°C convection oven for 24 hour.
•
After 24 hours, carefully remove the tray from the oven and place the samples in a desiccator. Allow
the vials to cool to room temperature in the desiccator for at least 30 minutes.
•
•
•
Place the vial with the dry sample on the balance and register the weight ("Vial weight+ Dry sample
#1") in the dry weight lab notebook.
•
Return the samples to the 63-65°C convection oven for at least 2 hour.
•
After 2 hours, carefully remove the tray from the oven and place the samples in a desiccator. Allow the
vials to cool to room temperature in the desiccator for at least 30 minutes.
•
53
•
•
Place the vial with the dry sample on the balance and register the weight ("Vial weight+ Dry sample
#2") in the dry weight lab notebook.
•
If the difference is greater than 0.02 g, continue the heating, cooling and weighing process until the
difference in the last two weights is less than 0.02 g.
•
If the difference between the first and second weights -or the last two readings- of the vial with the
dried sample is less than or equal to 0.02 g, calculate the % dry weight using the second weight
•
Determine the relative percent difference (RPD) for the calculated % dry weight values for the original
and duplicate samples. The RPD should be within the range specified by the laboratory as acceptable,
usually ± 25%. If not, reweigh the samples. If the RPDs still are not within specifications, the % Dry
Weights may need to be redetermined. Notify the supervisor before proceeding.
•
For the blank, the absolute difference between the vial weight before and after drying should be less
than 0.02 g
Calculations
⎛ (Vial + Dry sample) - (Vial weight) ⎞
⎟⎟ * 100
% Dry Weight = ⎜⎜
⎝ (Vial + Wet sample) - (Vial weight) ⎠
⎡
⎤
⎢ % Dry weight original sample - % Dry weight duplicate sample ⎥
⎥ *100
Relative Percent Difference (RPD) = ⎢
⎢ ⎛ % Dry weight original sample + % Dry weight duplicate sample ⎞ ⎥
⎟⎥
⎢⎜
2
⎠⎦
⎣⎝
6.4.5.2.
Sample extraction
Approximately 10 to 30 g of soil/sediment or 10 to 15 g of tissue samples are chemically dried with
anhydrous sodium sulfate. The mixtures of anhydrous sodium sulfate/sample, in a ratio of 3-5 to 1,
must be constantly stirred with a stainless steel spatula until the samples are dry to avoid
consolidation. The dry samples are then transferred to cellulose or ceramic cartridges and placed in
Soxhlet extractors. Three hundred mL of methylene chloride:acetone (1:1) and 3-5 Teflon boiling
chips are added to 500 mL flasks. The extractors are attached to the flasks and the samples moistened
with approximately 50 mL of methylene chloride. Surrogate standards are added to all samples and
spiking standards to the appropriate samples. The Soxhlet apparatus are attached to Soxhlet
condensers and the samples are extracted for 8 hours on a heated bath adjusting the temperature to
achieve an extraction cycle every 5-6 minutes (10-12 cycles per hour).
After extraction, the flasks are removed from the Soxhlet apparatus and attached to three ball Snyder
columns and the extracts are concentrated to 10-15 mL on a water bath at 60-65°C or with a rotovap
on a water bath at or below 35°C. If any of the extracts contain sample material or particles, it must
be filtered before its concentration. The concentrated extracts are transferred to 25 mL concentrator
tubes together with 2-3 rinses of the 500 mL flasks. A boiling chip is added to each concentrator tube,
the extracts concentrated on a water bath at 60-65°C and the solvent exchanged into hexane under a
gentle nitrogen flow. The final extract volume, before column chromatography, is approximately 2 ml
in hexane.
54
Soil/sediment or biota sample extraction – A step by step guide
•
Add 300 mL of methylene chloride:acetone (1:1) to an appropriately labeled 500 mL flat bottom flask.
Add 5-6 Teflon boiling chips to the flask. Place a Soxhlet extractor on top of the flask.
o
Preparation of methylene chloride/acetone (1:1) solvent mixture
The methylene chloride/acetone (1:1) solution is prepared by mixing 2 L of methylene
chloride wth 2 L of acetone. Use a 4 L labeled mixing bottle and a 2 L graduated cylinder to
measure the solvents.
Measure 2 L of methylene chloride in the graduated cylinder and pour the solvent into the
mixing bottle.
Using the graduated cylinder, measure 2 L of acetone and add it to the mixing bottle. Seal the
mixing bottle and mix the solvents by shaking the bottle. Shake again immediately prior to
use.
•
A subsample (approximately 10 to 30 g of soil/sediment or 10-15 g of tissue) is weighed into a clean
glass jar after thoroughly homogenizing the sample by stirring and mixing. This aliquot of the sample
will be used for extraction. The remainder of the original sample is stored frozen at -20°C.
•
Dry the aliquoted sample by mixing with approximately 3-5 parts of anhydrous sodium sulfate. Stir the
sample/sodium sulfate mixture with a clean spatula until the mixture flows free (the sample is then
dry).
•
Add the dried sample to a Soxhlet extraction thimble previously extracted with methylene chloride for
8 hours at 10-12 cycles per hour. Using methylene chloride rinsed forceps, place the thimble with
sample into the Soxhlet extractor. Carefully add 50 mL of methylene chloride/acetone (1:1) into the
Soxhlet extractor to wet the sample.
•
Add surrogate standards to all samples and the spiking standards to the appropriate samples
•
Attach the Soxhlet apparatus to Soxhlet condensers and extract the samples for 8 hours on a heated
bath. Adjust the temperature to achieve an extraction cycle every 5-6 minutes (10-12 cycles per hour).
Be especially careful to check that a cycling occurs every time the solvent level reaches the siphon
instead of overflowing drop by drop.
•
Ιn general, it is expected to achieve a total of 50-60 cycles. If cycles are longer, extraction can be
maintained for longer time. In this case, be careful to ensure that enough volume of methylene
chlroide:acetone (1:1) is in the flask to avoid loses by overheating or drying. Add solvent to the flask
as necessary.
•
After extraction, cool the apparatus until solvent cycling stops and remove the Soxhlet apparatus from
condensers.
•
Add a few boiling chips to the sample extract and attach a three ball Snyder column to the flask. Place
the flasks on a water bath (60-65°C) to concentrate the sample extract to a 10-15 milliliters.
Alternatively, the sample can be concentrated using a rotovapor on a water bath at or below 35°C.
•
After concentrating on the water bath to 10-15 mL, transfer the extract to a 25 mL concentrator tube
and add one or two clean boiling chips to the tube. Rinse the flask three times with small amounts of
methylene chloride and add the rinses to the extract. Concentrate the sample extract to about 1 mL on
a water bath at 60-65°C.
•
Without removing the concentrator tube from the water bath, add 10 mL of hexane and concentrate the
extract again to 1 mL under a gently nitrogen flow. Repeat this step as many times as necessary to
replace all the methylene chloride:acetone (1:1) mix with hexane.
55
6.4.5.3.
Purification of the extract by column chromatography
Soil/sediment and biota sample extracts generally require clean up before their instrumental analysis.
Soil/sediments and biota sample extracts are purified following one the procedures discussed for
water samples (see 6.3.5.3.).
6.5. Quantitative determination of pesticides by gas chromatography/electron capture
detector
6.5.1. Introduction
A wide variety of pesticides are routinely determined by gas chromatography associated to an
electron capture detector (ECD), a very sensitive technique able to determine these compounds at
trace levels (e.g., ng g-1 o pg g-1). These compounds can be determined after applying specific
extraction and purification procedures with appropriate surrogates and/or internal standards,
specialized calibration standards, and particular chromatographic method programmes. The
instrumental procedures described in this document are applicable to the quantitative analysis of the
following target analytes in extracts obtained from water, soil/sediment, and tissue samples:
Aromatic fungicides
Organophosphorus
insecticides
Uracil herbicides
Urea herbicides
Chlorothalonil
Chlorpyrifos
Diazinon
Permethrin
Bromacil
Diuron
Aldrin
alpha-chlordane
Dieldrin
4,4'-DDD
4,4'-DDE
4,4'-DDT
Endrin
Fenamiphos
Parathion-methyl
Endosulfan I
Endosulfan II
Endosulfan sulfate
Endrin aldehyde
Endrin ketone
alpha-HCH
beta-HCH
delta-HCH
gamma-HCH (Lindane)
Heptachlor
Heptachlor epoxide
Methoxychlor
6.5.2. Detection limits
The analytical method detection limit (MDL) for target analytes can be determined following the
procedures outlined in 40CFR, Part 136; Appendix B; 198-199, (1984) and described below.
Alternatively, the lowest calibration level (LCL) may be used after adjusting the concentration of this
standard by the sample weight or volume extracted.
56
Definition and procedure for the determination of the method detection limits (1
A step by step guide
Definition
The method detection limit (MDL) is defined as the minimum concentration of a substance that can be
measured and reported with 99 % confidence that the analyte concentration is grater than zero. The MDL is
determined from analysis of a sample in a given matrix containing the analyte.
Application
This procedure is designed for applicability to a wide variety of samples ranging from a reagent blank to a
more complex matrix. The MDL for an analytical method may vary as a function of the sample type;
therefore, it is essential that all analytical steps of the method used are included to determine the MDL.
Procedure
1. Estimate the method detection limit using one of the following:
the concentration value that corresponds to an instrument signal/noise in the range of 3 to 5.
the concentration equivalent to the value that corresponds to three times the standard diversion
of replicated analyses of the analyte in water.
2. If the MDL is to be determined in an aqueous media, get water free of the analyte under study and
proceed with the study as shown below.
3. If the MDL is to be determined in any solid matrix (soil/sediment, biota) analyze the sample to
determine the native concentration of the analyte under study.
If the concentration of the analyte is in recommended range of 2 to 5 times the estimated
detection limit, proceed with the study as indicated below.
If the concentration of the analyte is greater than the recommended range of 2 to 5 times the
estimated detection limit, try obtaining another sample of the same or similar matrix with a
lower level.
If the presence of the analyte not is detected, proceed with the study as indicated below.
4. Once determined the analyte native concentration, analyze a minimum of seven aliquots (spike the
analyte into the sample if it was not detected or analyze as it is if the analyte concentration was
within the recommended range) according to the analytical method. Include a method blank with the
analytical batch.
If the analysis confirms that the concentration of the analyte is within the recommended range,
continue with the calculations
If the analysis indicates that the concentration of the analyte is outside the recommended range,
get a new sample and repeat steps 2-4
5. Calculate the variance (S) and standard deviation (s) of the replicate measurements as follows:
57
⎡ n
⎛
1 ⎢
S =
X i2 − ⎜
⎜
(n - 1) ⎢ i =1
⎝
⎣
∑
2
n
∑
i =1
2
⎤
⎞
⎟
X i / n⎥
⎟
⎥
⎠
⎦
s = S2
where:
Xi, i = 1 to n are the analytical results
Σ is the sum of X values from i = 1 to n
6. Calculate the MDL as follows:
MDL = t (n -1, 1-α = 0.99) (s)
where:
MDL = method detection limit
t(n-1, 1-α=0.99) = the student’s t value appropriate for a 99 % confidence level test and a standard
deviation estimate with n-1 degrees of freedom
s = standard deviation of the replicate analyses
7. The 95 % confidence interval for the MDL, calculated in point 6, is estimated according to the
following equations derived from the Chi-square distribution for the degrees of freedom
Lower Confidence Limit (LCL) = 0.64 MDL
Upper Confidence Limit (UCL) = 2.20 MDL
(1)
Federal Register (1984)
6.5.3. Analytical quality control
The analytical quality control requirements for quantitative analysis are summarized in Table 13 with
details provided in the following sections. These criteria can be adjusted as needed by the laboratory
management.
6.5.3.1.
Qualitative identification of target analytes
Qualitative identification of target compounds is based on a comparison of the retention times of the
target compounds contained in the calibration standards with the target compound found in the
sample extract. The retention time of the peak should be within ± 4 seconds of the average retention
time for the authentic compound found in the calibration standards. The experienced analyst may use
manual peak selection and baseline correction when appropriate. In addition, the experienced analyst
may adjust the size of the retention time windows to ensure that all target compounds are properly
identified. Minimum intensity of selected peaks should be at three times the noise level.
58
Table 13. Summary of QC requirements for quantitative analysis
Element
-
Instrument Calibration
(method A)
Instrument Calibration
(method B)
-
Instrumental Blank
-
Degradation Check Solution
-
Surrogate Recovery
-
Method Blank
-
Duplicate
-
Laboratory Blank Spike
-
Laboratory Blank Spike
Duplicate (if applicable)
Standard Reference Material
(SRM)
-
-
Matrix Spike
-
Matrix Spike Duplicate (if
applicable)
6.5.3.2.
Control Limit Criteria
Frequency
Minimum of 4 standards.
Correlation coefficient of ≥0.990
Minimum of 4 standards.
Correlation coefficient of
≥0.990.
Calibration checks, within ±15%
nominal concentrations.
Instrument free of interfering
contamination or perform
necessary maintenance
Degradation of labile chlorinated
compounds less than 15%.
Recovery of 40 to 120% for all
surrogates.
No more than two analytes
>3 x MDLs.
Average RPD ≤30% for all
analytes >10 x MDLs
Recovery within 40 to 120% for
80% of target analytes.
RPD for the spike recoveries
should be ≤30% for all analytes.
Recovery within the certified
range for 80% of target analytes
having concentrations that are
>10 x MDLs.
Recovery within 40 to 120% for
80% of target analytes.
RPD for the spike recoveries
should be ≤30% for all analytes
With every analytical batch
interspersed with actual samples.
Prior to the analysis of an analytical
batch.
Every 12 hours or less.
batch.
batch
All samples
One per QC batch
One per QC batch
One per QC batch. May replace
SRM if not available; may replace
MS/MSD if difficult matrix or
inadequate sample is available.
One per QC batch if available. May
be replaced using LBS/LBSD
One per QC batch. May be replaced
by LBS/LBSD if difficult matrix or
inadequate sample is available
Calibration of the gas chromatograph
The calibration of the gas chromatograph for the analysis of target analytes can be performed by one
of the following mehtods:
•
Calibration of the instrument for the analysis of chlorinated hydrocarbons can be done as
part of the analytical run. The four calibration standard mixtures are interspersed with
actual samples during the chromatographic analyses. The calibration curve is then based,
at a minimm, on four standards. If the calibration curve has an r of 0.9950 or higher (i.e.,
R2 of 0.9900 or higher) for all analytes present in the samples, the calibration curve is
accepted. If this criterion is not met for a target analyte, then the calibration standards as
well as all the samples must be reanalyzed for that analyte.
•
Calibration of the instrument for the analysis of chlorinated hydrocarbons can be done
before the analytical run and must satisfy the criterion discussed above (i.e., R2 of 0.9900
or higher). In this case, calibration checks have to be run periodically (i.e., every 12 hours
or less) to verify that the initial calibration is still valid. This calibration can be
59
maintained for several days or weeks but must be verified before a new analytical batch
is analyzed and every 12 hours during the run.
The recommended standard concentrations for most analytes are approximately 5.0, 20.0, 80.0, and
200.0 ng/mL; however, concentrations in the calibration solutions depend on the response of a
particular analyte and the responsivenessof the instrument. Concentration levels can be adjusted as
needed.
6.5.3.3.
Solvent blank
A solvent blank (instrument blank) is injected and analyzed prior to an analytical run to verify
instrument operation and absence of contamination. Analysis is not initiated unless the solvent blank
shows no contamination. Corrective action can include repeated solvent blank flushes, cleaning the
injection port, breaking off part of the column, or replacing the column.
6.5.3.4.
Degradation check solution
Prior to initiate an analytical run, a solution containing selected chlorinated hydrocarbons (e.g., DDT
and aldrin) that are known to degrade in the injection port under certain conditions is used to verify
the “inertness” of the instrument. Degradation of these compounds in the injection port should be no
higher than 15% in order to continue with the analytical run. If degradation is higher than 15%, the
analytical run is stopped and the problem is corrected before proceeding (e.g., replacement of the
syringe, injection port liner, injection port base plate, or septum or removal of one or two loops of the
analytical column).
6.5.4. Criteria for QC samples in an analytical batch
The acceptance criteria for QC samples are evaluated within an analytical group (QC batch or
extraction batch). Therefore, failure of one QC sample type does not necessarily cause the entire QC
batch to fail.
6.5.4.1.
Laboratory blank
A laboratory blank (e.g., blank or method blank) is used to demonstrate freedom from contamination
in the analytical procedure and is required for each QC batch of 20 or fewer samples.
60
•
An acceptable method blank contains no more than two target compounds at
concentrations greater than three times the corresponding method detection limits (>3 x
MDLs). If more than two of the target compounds are found in the blank at
concentrations greater than three times the corresponding MDLs, re-extraction of the
entire QC batch may be required.
•
If any of the target compounds is found in the blank at greater than three times the MDL,
but are not detected in the analytical samples above the MDL, the reported analytical data
for the blank must be flagged as “>3 x MDL”, but no further action is required.
•
When target compounds are present in the method blank at concentrations above three
times the MDL and the concentration in the sample(s) is ten times that found in the blank,
the blank is flagged as “>3 x MDL”, but sample data can be reported and are not flagged.
•
6.5.4.2.
When target compounds are present in the method blank concentrations above three times
the MDL and the concentration in the samples is less than ten times the level found in the
blank, the QC batch should be re-extracted and re-analyzed. If no sample remains for reextraction, the analytical data for those target compounds in the blank is flagged as “>3 x
MDL” and samples may be reported but must be flagged using a “B”.
Laboratory blank spike and laboratory blank spike duplicate
A laboratory blank spike (LBS) is used to estimate analytical accuracy of the method if no more
sample is available, or if there is no SRM available. A laboratory blank spike is used to demonstrate
that the analytical system is in control. It may be required one LBS with each QC batch of 20 or fewer
samples. A laboratory blank spike duplicate (LBSD) is used to estimate both analytical accuracy and
precision and may be required for each QC batch of 20 or fewer samples.
•
QC acceptance criterion for the LBS or LBSD target compound recoveries is that 80% of
the target compounds should have recoveries between acceptable limits (e.g., 40 and
120% of the spike amount).
•
If 20% or more target compounds are outside this criterion, corrective action may include
recalculation and/or reanalysis of the LBS, re-extraction of the sample group, instrument
maintenance or re-calibration.
•
If the LBSD has been included, the recoveries determined from the LBS and LBSD
should agree within an absolute Relative Percent Difference (RPD) of ≤30%.
6.5.4.3.
Standard reference material
The analysis of a standard reference material (SRM) is used to estimate analytical accuracy of the
method. If an SRM is not available, a laboratory blank spike may be used to demonstrate that the
analytical system is in control. The SRM is required with each QC batch of 20 or fewer samples.
•
QC acceptance criterion for the SRM target compound recoveries is that 80% of the
target compounds should have recoveries within the certified range for target compounds
that are, at least, ten times the MDL (≥10 x MDLs).
•
If the above QC acceptance criterion for the SRM is not met, the data are recalculated or
the extract is re-injected. If the criterion is still not met, the analysis is halted until the
project manager reviews the data and decides on further corrective action which may
include instrument maintenance or re-extraction of the entire QC sample batch.
6.5.4.4.
Matrix spike and matrix spike duplicate
The matrix spike (MS) and matrix spike duplicate (MSD) samples are used to estimate analytical
accuracy in the presence of a representative matrix and are normally required for each QC batch of 20
or fewer samples. Together, the MS and MSD are used to estimate analytical precision in the
presence of a representative matrix. If inadequate sample is available or if the sample matrix is
difficult to extract/analyze, an LBS/LBSD may be used to replace the MS/MSD. Failure of the
MS/MSD alone does not require re-extraction of the entire QC sample batch, since one of the
purposes of the QC pair is to establish matrix effects on target analytes.
•
The QC acceptance criterion requires that 80% of the target compound recoveries in the
MS and the MSD be between 40 and 120% of the spiked amount. It might be possible
61
that the recovery of one or several analytes be invalidated by the high concentrations
already present in the sample (native concentrations). In computing the recovery, only
valid spikes will be used. In a valid spike, the amount of target compound added is at
least as much as was originally present in the sample, or the spike amount is responsible
for at least a 50% increase in the instrument response for an analyte.
•
If native concentrations are not a problem and 20% or more of the target compounds are
outside the QC acceptance criterion, corrective actions are indicated. Corrective action
may include recalculation and/or reanalysis of the MS and MSD; re-extraction of the
sample/MS/MSD group; or instrument maintenance and/or re-calibration followed by
reanalysis.
•
If the above criterion is not met, it might be necessary to review integration and identity
of the peaks in the chromatogram, review calculations or reanalysis of the sample extract.
If the criterion is still not met, re-extraction of the sample group is required.
•
If a Matrix Spike Duplicate (MSD) has been included with the analytical batch, the
recoveries determined from the MS and MSD samples should agree within an absolute
Relative Percent Difference (RPD) of ≤30%. Corrective actions include recalculation
and/or reanalysis of the MS and MSD; re-extraction of the sample/MS/MSD group; or
instrument maintenance and/or re-calibration followed by reanalysis.
6.5.4.5.
Sample duplicate
A duplicate sample (DUP) is used to demonstrate sample homogeneity and analytical precision in the
presence of a representative matrix and is required with each QC batch of 20 or fewer samples. QC
acceptance criterion requires that analyte concentrations greater than ten times the MDL have an
average Relative Percent Difference (RPD) of ≤25%. If the RPD is outside the QC acceptance
criteria, a corrective action is indicated. Corrective actions include recalculation or reanalysis of the
duplicate sample and the original sample, instrument maintenance, re-calibration, or re-extraction of
the analytical QC batch.
6.5.4.6.
Surrogate standard recovery
All samples, including those intended for quality control, are spiked with the appropriate surrogate
spiking solution to both determine the concentration of target compounds and to monitor method
performance. One or more internal standards might be used as a reference for this purpose. Different
analyses may use different surrogates and QC recovery criterion based upon method development.
•
QC acceptance criterion for all surrogate compounds used during routine GC-ECD
analyses requires a recovery between 40 to 120% in each sample analyzed.
•
If surrogate recovery fails the QC acceptance criterion, the following corrective actions
are taken:
The calculations are checked to ensure that there are no errors.
The internal standard and surrogate solutions are checked for degradation,
concentration, contamination, etc., and the instrument performance is checked.
If the recovery of the surrogate standard used in the calculation of the concentrations
of target analytes is outside the upper control limit, but the instrument calibration and
other surrogate standard concentrations are in control, it is concluded that an
interference specific to that surrogate was present that resulted in a higher recovery.
62
A second surrogate standard may be used in the calculation of analyte concentrations.
The presence of this type of interference is confirmed by evaluation of
chromatographic peak shapes and patterns.
The extract is reanalyzed if the steps above fail to reveal a problem. If reanalysis of
the extract yields surrogate recoveries within the stated limits, then the reanalysis
data is reported. If reanalysis does not yield acceptable recoveries, the sample is reextracted and re-analyzed. If reanalysis does not improve surrogate recovery, the data
can be reported and is properly qualified.
6.5.5. Apparatus and materials
6.5.5.1.
Gas chromatograph/Electron capture detector
The analytical system includes a temperature programmable gas chromatograph with an electron
capture detector or micro electron capture detector (ECD or µECD). The injection port is designed for
split or splitless injection and analyses are conducted in the splitless mode. A 30-m long x 0.25-mm
I.D. fused silica capillary column with a 0.25 µm DB-5 bonded phase, or equivalent, is generally
used. The autosampler is capable of making 1 to 4 µL injections.
A second column of different polarity (e.g., DB-17ht column or equivalent) may be used for
confirmation of target compounds. A typical instrument method programmes routinely used for the
GC-ECD analyses is the following:
Injector temperature ............................................ 275°C
Detector temperature ........................................... 325°C
Oven temperatura programme:
Initial temperatura .................................. 100°C, held for 1 min.
1st ramp rate ............................................ 5.0°C min-1
1st ramp final temperature....................... 140oC, held for 1 min.
2nd ramp rate ........................................... 1.5°C min-1
2nd ramp final temperature ...................... 250°C, held for 1 min.
3rd ramp rate............................................ 10°C min-1
3rd ramp final temperature ...................... 300°C, held for 5 min.
Carrier gas ........................................................... Helium at ~1.5 mL min-1
Make-up gas ........................................................ Argon/Methane (95:5) at ~40 mL min-1
Total run time ...................................................... 94.3 min.
The GC oven temperature programme as well as flow of carrier gas may be modified to improve
resolution.
6.5.5.2.
Analytical standards
The procedures used for the preparation of the different standards needed for pesticide analyses are
summarized below and discussed with greater details in section 6.8 (Calibration, Data analysis and
calculations). Note that, whenever possible, it is convenient to purchase pesticide solutions as a
certified mix to diluted, if necessary, prior to use.
63
6.5.5.3.
Surrogate and internal standard spiking solutions
Surrogate and internal standard spiking solutions are made by weighing appropriate amounts of pure
compounds into a volumetric flask and diluting to volume with hexane or an equivalent nonchlorinated solvent. Note that surrogate and internal standard spiking solutions are used at different
moments in the laboratory; therefore, they must be prepared and stored as individual solutions.
Surrogate and internal standards are added to the samples prior to extraction and before GC analysis,
respectively, and are prepared to yield concentrations, in the final sample extract volume (i.e., ~1
mL), within the calibration range. All sample target compound concentrations are quantified based on
the recovery of the specified analytical surrogate standard. The recovery of the surrogate standard is
calculated based on the recovery of the specified analytical internal standard. If higher concentrations
of the target analytes are anticipated, the surrogate and internal standard concentrations and the final
volume of the sample extract can be appropriately adjusted (see 6.8.5.).
6.5.5.4.
Target analyte spike solution
A solution containing all or selected target analytes is used to spike the blank spike and matrix spike
samples. A spike solution is made by weighing the appropriate amounts of pure compounds into a
volumetric flask and diluting them with hexane or an equivalent non-chlorinated solvent to a working
concentration. A spiking solution is added to the blank spike and matrix spike samples prior to
extraction and is prepared to yield concentrations, in the final sample extract volume (i.e., ~1 mL),
within the calibration range. The amount of spike can be adjusted as needed to meet the requirements
of the sample being prepared for analysis. The spike solution does not contain surrogate or internal
standards.
6.5.5.5.
Degradation check solution
As mentioned earlier, a solution containing selected chlorinated hydrocarbons (e.g., DDT and aldrin)
that are known to degrade in the injection port under certain conditions is used to verify the
“inertness” of the instrument. This solution may be purchased as a certified mixed standard requiring
dilution prior to use or it can be made by weighing the appropriate amounts of pure compounds into a
volumetric flask and diluting them with hexane or an equivalent non-chlorinated solvent to a working
concentration. The working solution yields, in the final sample extract volume (i.e., ~1 mL), analyte
concentrations within the calibration range. The degradation check solution must contain surrogate
and internal standards.
Degradation Check – A step by step guide
64
•
A solution containing selected chlorinated hydrocarbons (e.g., DDT and aldrin) that are known to
degrade in the injection port under certain conditions is used to verify the “inertness” of the instrument.
•
Prepare a solution of 4,4’-DDT and endrin by weighing the appropriate amounts of pure compounds
into a volumetric flask and diluting them with hexane or an equivalent non-chlorinated solvent to a
working concentration, generally in the central portion of the calibration range.
•
Inject 2 µL of this solution and process employing the same method used to analyze the regular sample
extracts.
•
Look for the presence of degradation products of 4,4’-DDT (i.e., 4,4’-DDE and 4,4’-DDD) and endrin
(i.e., endrin ketone and endrin aldehyde).
•
Calculate the degradation percentage of each analyte using the following formulas:
⎛
⎞
(4,4'-DDE Area + 4,4'-DDD Area)
⎟⎟ * 100
% Degradation of 4,4'-DDT = ⎜⎜
(4,4'-DDT
Area
+
4,4'-DDE
Area
+
4,4'-DDD
Area)
⎝
⎠
⎛
⎞
(endrin ketone Area + endrin aldehyde Area)
⎟⎟ *100
% Degradation of endrin = ⎜⎜
⎝ (endrin Area + endrin ketone Area + endrin aldehyde Area) ⎠
•
If the degradation of any of these analytes is larger than 15%, it is necessary to correct the problema
before continuing with the calibration of the gas chromatograph and analysis of the sample extracts.
6.5.6. Calibration of the gas chromatograph
Calibration of the GC/ECD for the analysis of pesticides is done following one of the two procedures
indicated above (see 6.5.3.2.).
6.5.7. Sample analysis
As discussed, actual samples and QA samples (e.g., blanks, spike samples, and SRM) are analyzed as
one analytical sequence together with the calibration mixtures under the conditions described before
(see 6.5.3.2.). Before an analytical sequence is initiated, 1 or 2 µL of hexane (see 6.5.3.3.) followed
by 1 or 2 µL of the Degradation Check Solution (see 6.5.3.4.) are injected into the GC/ECD. Analysis
of these solutions demonstrate and document that the analytical system is free from interfering
contamination and that labile target compounds are not being degraded in the system. Sample extract
injections of 1 to 4 µL are then made with an autosampling device.
6.5.8. Qualitative identification of target analytes
A gas chromatographic peak must meet the criterion specified before (see 6.5.3.1.) to be identified as
a target compound. Elution order and relative responses of target analytes and surrogate and internal
standards are shown in Figures 13 and 14. Concentration of each analyte is 100 ng mL-1.
6.5.9. Quantitative determination of target analytes
As described in the following sections, the concentration of target analytes is determined based upon
the response factor of each analyte in the calibration standards. In general, the instrument software
generates and prints out calibration data for each instrument; however, it is important to understand
these procedures to manually verify some of the data generated by the software as an additional
quality control check of the final results.
65
Figure 13. Organochlorine insecticides by GC/ECD
Figure 14. Modern insecticides by GC/ECD
66
6.5.9.1.
Calibration and quantitative determination using a quadratic equation
A four-point calibration curve is used to establish the response of the detector. The calibration curve
is prepared using a non-linear calibration equation of the form:
Y = b 0 + b1 x + b 2 x 2
(1)
where:
x
b0, b1, y b2
=
=
Y
=
amount of the target compound (µg) in the calibration standards
coefficients of the quadratic equation. If the quadratic fit is forced through
zero, b0 is defined as zero
modified area ratio (described in equation 2) representing the ratio of the
area of the analyte (Aa) to the area of the surrogate standard (Asu) times the
amount (µg) of the surrogate standard (Csu):
⎛A
Y = ⎜⎜ a
⎝ A su
⎞
⎟⎟ * C su
⎠
(2)
where:
Aa
Asu
Csu
=
=
=
area of the analyte
area of the surrogate standard
amount (µg) of the surrogate standard
For the gas chromatographic peaks that have met the qualitative identification criterion discussed
earlier (see 6.5.3.1.), a solution to this quadratic equation, to produce the amount of each target
analyte in µg µL-1 in the extract, is:
x=
− b1 + b12 − 4 b2 (b0 − Y )
2 b2
(3)
To determine the analyte concentration in the sample, multiply the analyte extract concentration by
106, and then divide by the extracted sample mass or volume. This factor, 106, is used to adjust the
result for the extract volume (usually 1000 µL) and to convert micrograms to nanograms, yielding a
concentration result expressed in ng g-1 or ng L-1, respectively.
6.5.9.2.
Calibration and quantitative determination using an exponential equation
As an alternative to the quadratic equation, the following exponential equation can be used:
Y = A XB
(4)
where:
Y
X
A
B
=
=
=
=
concentration ratio between Ca and Csu (see equation 5)
area ration between Aa and Asu (see equation 5)
slope of the regression equation
polynomial coefficient for the line fit
This equation can then be expressed as:
67
⎛ A
Ca
= A ⎜⎜ a
C su
⎝ Asu
⎞
⎟⎟
⎠
B
(5)
where:
Ca
Csu
=
=
Aa
Asu
=
=
concentration of the analyte to be measured (ng mL-1)
the concentration of the surrogate standard used in the calculation of the
concentration of target analytes (ng mL-1)
area for the analyte to be measured
area for the surrogate standard used in the calculation of the concentration
of target analytes
Since Ca and Csu refer to the concentration of the analyte and surrogate standard in the same extract
volume, they can be substituted for their amounts. Re-arranging the equation and dividing both terms
by the sample mass, it is possible to determine the analyte concentration in the sample as ng g-1 or
ng L-1:
[Analyte](ng g-1 ) or (ng L-1 )
⎛ A
= A ⎜⎜ a
⎝ Asu
B
⎞
Amount su
⎟⎟ *
Sz
⎠
(6)
where:
6.5.9.3.
A
B
Aa
Asu
=
=
=
=
Amountsu
Sz
=
=
slope of the regression equation
polynomial coefficient for the line fit
area for the analyte to be measured
area for the surrogate standard used in the calculation of the concentration
of target analytes
amount of surrogate (ng) added to the sample before extraction
sample size in grams or liters
Dilution of sample extracts
If the concentration in the final extract of any of the target compounds exceeds the concentration in
the highest calibration solution, the sample extract must be diluted and reanalyzed after a new
addition of surrogate standards. The analyte concentration in the diluted extract is recalculated using
the new surrogate amount, multiplied by the appropriate dilution factor and adjusted by the surrogate
recovery of the original sample.
Dilution of a sample extract – A step by step guide
68
•
Before diluting a sample extract be sure that its original volumen, disregarding the volumen injected
into the gas chromatograph (i.e., 1 ó 2 µL), is exactly 1.0 mL.
•
Depending on the requiered dilution, transfer an exact volumen of the original sample extract into a
new vial. For example, if the sample needs to be diluted 10 times, take exactly 0.100 mL which will
be diluted to approximately 1.0 mL (see table below).
•
Add 0.100 mL of the surrogate standard spike solution.
•
Bring the volume to aproximately 1 mL with hexane or similar and return to the instrumental
laboratory for reinjection and analysis.
•
The diluted extract should be analyzed to determine only the concentrations of those target analytes
that showed concentrations outside the calibration range of the instrument.
Required
dilution
Volume of the
original extract
Surrogate standard
spike solution
Solvent(2)
Final
volumen(2)
5x
0.200 mL
0.100 mL
~ 0.70 mL
~ 1 mL
10x
0.100 mL
0.100 mL
~ 0.80 mL
~ 1 mL
20x
0.050 mL(1)
0.100 mL
~ 0.85 mL
~ 1 mL
50x
0.020 mL(1)
0.100 mL
~ 0.90 mL
~ 1 mL
100x
0.010 mL(1)
0.100 mL
~ 0.90 mL
~ 1 mL
500x
0.002 mL(1)
0.100 mL
~ 0.90 mL
~ 1 mL
(1)
It is advisably to produce an intermediate dilution.
(2)
Since surrogate standard are used to determine the concentrations of target analytes, it is not
necesary to bring the final volume to exactly 1.0 mL (see 6.5.9)
6.5.9.4.
Manual calculation check
The concentrations of selected analytes, determined by one of the two methods given in the preceding
sections, are routinely confirmed by independent manual calculations. Randomly selected sample
analyte concentrations are confirmed using either Eq. 3 or Eq. 6 on a spreadsheet template (Excel or
similar) and compared to the reported value. Both concentrations should agree well except for
rounding errors. An example of the manual calculation is shown below.
Example of manual calculation check – A step by step guide
The following is information from the laboratory logbook and the computer printout of the gas chromatograph.
The calculations include generic names for the target analyte and surrogate and internal standards.
Sample ID: .................................................................................F99999
Sample weight: ...........................................................................5.211 g
Amount of surrogate added: .......................................................90.8 ng
Final volume: .............................................................................1.0 mL
Concentration of the surrogate standard:....................................0.0000908 mg mL-1
Calibration Coefficients:
b0 = 0.0
b1 = 0.4814
b2 = -205.9
Area of surrogate standard: ........................................................228.95
Area of analyte “A” ....................................................................24.211
Reported value: ..........................................................................3.863 ng g-1
Using equation (3) above:
x=
− b1 + b12 − 4 b 2 (b 0 − Y)
2 b2
(3)
Where:
⎛A
Y = ⎜⎜ a
⎝ Asu
⎞
⎟ * Csu
⎟
⎠
(2)
Calculation of analyte “A”
69
⎛ 24.211 ⎞
-1
-1
Y =⎜
⎟ * 0.0000908 µg µL = 0.000009602 µg µL
⎝ 228.95 ⎠
[Analyte " A" ] =
− 0.4814 + 0.4814 2 − 4 * (−205.9) * (0 − 0.000009602)
2 * (−205.9)
[Analyte " A" ] =
= 0.000020119 µg µL−1
0.000020119 µg µL−1 *1000 ng µg −1 *1000 µL mL−1
= 3.861 ng g −1
5.211 g
The relative percent difference (RPD) between the result given by the instrument software and the concentration
calculated manually should be negligible. This indicates that both concentrations are the same except for
rounding errors.
⎡
⎤
⎢
⎥
⎢ (3.863 ng g -1 − 3.861 ng g -1 ) ⎥
* 100 = 0.05%
Relative percent difference (RPR) = ⎢
-1
-1 ⎥
⎢ ⎛⎜ 3.863 ng g + 3.861 ng g ⎞⎟ ⎥
⎢⎜
⎟⎥
2
⎠⎦
⎣⎝
6.5.10. Sample analysis - QA/QC Parameters
6.5.10.1. Surrogate standard recovery
The recoveries of the surrogate standards in the sample extracts are calculated comparing the relative
response of the surrogate standard to the internal standard in each sample to the average of those
observed in the calibration solutions. The laboratory will take appropriate corrective action whenever
the recovery of any surrogates is less than 40% or greater than 120%, as described in Table 13
(Surrogate Recovery).
6.5.10.2. Relative percent difference
The analyte concentrations measured in the original and duplicate samples must be comparable to
certify sample homogeneity and precision of the analysis (see 6.5.4.5.). If the RPD is outside the QC
acceptance criteria, corrective actions are necessary.
⎤
⎡
⎥
⎢
(C
C
)
−
md ⎥
Relative percent difference (RPD) = ⎢ mo
*100
⎢ ⎛ C mo + C md ⎞ ⎥
⎟⎥
⎢⎜
2
⎠⎦
⎣⎝
where:
Cmo
Cmd
70
=
=
concentration measured in the original sample
concentration measured in the duplicate sample
(7)
6.5.10.3. Recovery of target compounds in spiked samples and standard reference materials
Acceptable recoveries of spiked or certified target analytes are an indication of a good laboratory
practice. Calculate and report the percent recovery of target compounds in the matrix spike (MS) and
matrix spike duplicate (MSD), and, if analyzed, in the laboratory blank spike/laboratory blank spike
duplicate (LBS/ LBSD) samples using the following equation:
⎡ (C * S − C os * S o ) ⎤
Percent recovery = ⎢ ss s
⎥ * 100
A sa
⎣
⎦
(8)
where:
Css
Cos
Ss
So
Asa
=
=
=
=
=
measured concentration of analyte in the spiked sample
measured concentration of analyte in the original sample
spike sample size in grams or liters
original sample size in grams or liters
amount of spiked analyte
Note that Cos for a LBS/LBSD is zero by definition. The laboratory takes appropriate corrective
action whenever the recovery of any target analyte is less than 40% or greater than 120%, as
described in Table 13 for blanks and matrix spikes.
If a standard reference material is analyzed with the samples, calculate and report the concentrations
of target analytes and verify that recoveries are within the certified range for 80% of target analytes
having concentrations that are, at least, 10 x MDL (see Table 13).
6.5.11. Gas chromatograph maintenance
These are a few simple steps that help to keep the gas chromatograph and the electron capture
detector in good working conditions:
•
The syringe is cleaned by rinsing with appropriate solvent after each injection. This can
be done manually or, if available, mechanically by a programmeable autosampler.
•
The injection of sample extracts with significan amounts of chlorinated solvents (e.g.,
methylene chloride) o sulfur (e.g., extracts of anoxic soils/sediments or rotten eggs) is
avoided.
•
A new septum is installed as needed after a number of injections, depending on the
condition and quality of the siringe, to avoid fluctuations on the retention times.
•
A new injection port liner is installed as needed after a number of injections or as soon as
degradation of the more labile analytes is noted. It is recommended that a new port liner
is installed, even before reaching the action level of 15% degradation, if conditions
deteriorate rapidly.
•
A new injection port base plate is installed as needed. This is generally done together
with a replacement of the port liner to minimize degradation of target analytes or tailing
of the peaks.
•
If after replacing the port liner and port base plate, there is still significant tailing of the
peaks; one to two feet of the analytical column (injector end) are removed.
71
•
The tanks of carrier (He) and make-up (Argon/Methane) gases are replaced when the
pressure falls below 500 psi to avoid contaminating the gas chromatograph (column and
detector).
•
All instrument maintenance, including changes of gas tanks, is recorded in the
maintenance log for the specific instrument.
6.5.12. Documentation
When sample extracts are transferred to the instrumental laboratory for analysis, the analyst receives a
folder with complete information from the wet laboratory, including a copy of the pages of the
logbook documenting the extraction process, problems, comments, and, if any, accidents that might
compromise the analysis. All documentation related to the analitical request and name of the
responsible person for the project (e.g., Principal Investigator) is included in this folder.
All injections and the original analytical run sequences are recorded on a computer printout kept on
file at the instrument. Any modification of the run sequence is maintained in the analytical folder with
the original sequence and the final analysis files. All information on the instrument calibration is
included in the analytical folder. For all analytical and laboratory Quality Control samples, the
analytical documentation is printed and included in the analytical folder. The compiled data report
includes Relative Percent Difference (RPD) between duplicate analyses or MS/MSD recoveries, and
percent recovery of analytes in MS/MSD and/or LBS/LBSD QC samples
6.5.13. Reporting
Data are routinely reported to three places after the decimal point as ng g-1 dry weight (e.g.,
soil/sediment, biota) or as ng L-1 (e.g., water).
6.6. Quantitative determination of carbamate insecticides by high performance liquid
chromatography
6.6.1. Introduction
Carbamate insecticides are quantitatively determined by high performance liquid chormatography
(HPLC) associated to a fluorescence detector. This is a very sensitive technique able to determine
these compounds at trace levels in water, soil/sediment and biota sample extracts after the appropriate
extraction and purification procedures. Analytical efforts relevant to this study include the
determination of the following target carbamate insecticides:
Carbaryl
Carbofuran
Oxamyl
The analytical method detection limit can be determined following the procedures outlined in 40CFR,
Part 136; Appendix B; 198-199, (1984) as described in section 6.5 (Detection limits). As mentioned,
the lower calibration level, adjusted by the sample weight or volume extracted may be used instead.
72
The analytical quality control requirements for quantitative analysis are discussed in section 6.5
(Analytical quality control).
The acceptance criteria for QC samples are evaluated within an analytical group (QC batch or
extraction batch) are discussed in section 6.5 (Criteria for QC samples in an analytical batch).
6.6.5.1.
High performance liquid chormatograph/fluorescence detector
The high performance liquid chromatograph (HPLC) must be a robust, high performance system able
to generate accurate, precise, and reproducible data with the sensitivity and resolution appropriate for
the analysis of carbamate insecticides. It is important to use a column of dimensions and packing
material adequate for the analysis (e.g., dimethyloctadecyl/silica, 150 mm length x 3.9 mm of internal
diameter or similar). It is advantageous to have an autsampler attached to the HPLC to attain
maximum analytical flexibility. The chromatographic conditions for the analysis of carbamate
insecticides are as follows:
Column: ................................................ 3,9 x 150 mm
Packing: ................................................ dimethyloctadecyl/silica
Movil phase flow: ................................. 1.5 mL min-1
Column temperature: ............................ 25°C
Injection volume: .................................. 300 µL
Oven temperature: ................................ 80°C
He flow: ................................................ 30 mL min-1
Mobile phase: ....................................... HPLC water/methanol/acetonitrile (gradient)
Phase A:................................... HPLC water
Phase B: ................................... metanol
Phase C: ................................... acetonitrile
Run time: .............................................. 30 min
Fluorescence detector:
Emission: ....................................... 445 nm
Excitation: ...................................... 339 nm
73
Gradient:
Flow
Phase A
Phase B
Phase C
mL min-1
%
%
%
0
1.5
88
12
0
4.0
1.5
88
12
0
4.1
1.5
68
16
16
16.1
1.5
30
35
35
35
1.5
88
12
0
60
1.5
88
12
0
75
1.0
0
100
0
96
1.0
0
100
0
130
0
0
100
0
Time
These conditions can be modified as needed by the analyst to improve the chromatographic profile.
6.6.5.2.
The criteria for the preparation of standards are summarized in section 6.5 (Apparatus and materials,
Analytical standards) and with greater details in section 6.8 (Calibration, data analysis and
calculations). Note that, whenever possible, it is convenient to purchase certified solutions to diluted,
if necessary, prior to use.
6.6.5.3.
Target analyte spike solution
As discussed earlier (see 6.5.5.4.) a target analyte spike solution solution, made by weighing the
appropriate amounts of pure compounds of all or selected target analytes, is used to spike the blank
spike and matrix spike samples. The amount of spike can be adjusted as needed to meet the
requirements of the sample being prepared for analysis. The spike solution does not contain surrogate
or internal standards.
6.6.6. Calibration of the high performance liquid chromatograph
The calibration of the high performande liquid chromatograph associated to a florescence detector for
the analysis of carbamate insecticides is done following one of the two procedures indicated in
section 6.5 (see 6.5.3.2.).
Actual samples and QA samples (e.g., blanks, matrix spikes, SRM) are analyzed as one analytical
sequence together with the calibration mixtures under the conditions discussed in section 6.5
(Analytical quality control, Calibration of the gas chromatograph). Before an analytical sequence is
74
initiated, a solvent blank is injected into the analytical system to confirm that it is free of interfering
contaminants. Sample extract injections of ~300 µL are then made with an autosampling device.
For a chromatographic peak to be identified as a target compound, it must meet the criterion specified
in section 6.5 (Analytical quality control, Qualitative identification of target analytes).
The concentration of target analytes is determined based upon the response factor of the analyte in the
calibration standards. In general, the instrument software generates and prints out calibration data for
each instrument; however, it is important to understand these procedures to manually verify some of
the data generated by the software as an additional quality control of the final results (see 6.5.9.).
6.6.9.1.
the highest calibration solution, the sample extract must be diluted by an appropriate dilution factor
and reanalyzed.
6.6.9.2.
Manual Calculation Check
The concentrations of selected analytes, determined by the software of the instrument are routinely
confirmed by independent manual calculations. Randomly selected sample analyte concentrations are
confirmed using a spreadsheet template (Excel or similar) and compared to the reported value. Except
for rounding errors, the concentrations must agree well.
certify sample homogeneity and precision of the analysis (see 6.5.4.5. and 6.5.10.2.).
practice (see 6.5.10.3.).
6.6.11. High performance liquid chromatograph maintenance
All maintenance performed on the high performance liquid chromatograph or its detector, including
solvent changes, is recorded in a dedicated logbook.
75
folder with complete information from the wet laboratory as discussed in section 6.5 (Documentation)
6.6.13. Reporting
6.7. Determination of triazine herbicides by gas chromatography/mass spectrometry
6.7.1. Introduction
Triazine herbicides can be determined, at trace concentrations (e.g., ng g-1), by gas chromatography
associated with a mass spectrometer detector (GC/MS) after appropriate extraction and cleanup
procedures. The method described in the following sections is applicable to the quantitative analysis
of the following target analytes in extracts obtained from water, soil/sediment, and tissue samples:
Triazine herbicides
Ametryn
Atraton
Atrazine
Prometon
Prometryn
Propazine
Secbumeton
Simetryn
Simazine
Terbuthylazine
Terbutryn
The analytical method detection limit (MDL) for target analytes can be determined following the
procedures outlined in 40CFR, Part 136; Appendix B; 198-199, (1984) as described in section 6.5
(Detection limits). As mentioned, the lower calibration level, adjusted by the sample weight or
volume extracted may be used as MDL.
The analytical quality control requirements for quantitative analysis are summarized in section 6.5
(Analytical quality control). For the qualitative identification of an analyte it is important to note that,
in addition to the requirement for the retention time of the peak to be within ± 4 seconds of the
average retention time for the authentic compound found in the calibration standards, the retention
times of the analyte and corresponding ions their must be within ±2 second window.
The acceptance criteria for QC samples within an analytical group (QC batch or extraction batch) are
discussed in section 6.5 (Criteria for QC samples in an analytical batch).
76
6.7.5.1.
Gas chromatograph/Mass spectrometer
The gas chromatograph must possess a "split/splitless" injector and the ability to use a capillary
column, in an oven with programmable temperature, associated with a mass spectrometer. The most
commonly used capillary column for the analysis of organic pollutants is a 30 m length x 0.25 mm
internal diameter and 0.25 µm DB-5 film. It is advisable to have an automatic injector capable of
making 1 to 4 µL injections. The programme used for the analysis of herbicides triazinas by gas
chromatography associated with a mass spectrometry is as follows:
Injector temperature: ........................................... 300°C
Oven temperatura programme:
Initial temperature: ................................. 120°C held for 0 min
1st ramp rate ............................................ 5°C min-1
1st ramp final temperature....................... 140oC held for 0 min
2nd ramp rate ........................................... 1.5°C min-1
2nd ramp final temperature ...................... 200°C held for 0 min
3rd ramp rate............................................ 25°C min-1
3rd ramp final temperature ...................... 300°C held for 2 min
Carrier gas ........................................................... Helium at ~1.0 mL min-1
Total run time ...................................................... 50 min
The GC oven temperature programme as well as flow of carrier gas may be modified to
improve resolution.
6.7.5.2.
The criteria for the preparation of standards are summarized in section 6.5 (Apparatus and materials,
Analytical standards) and with greater details in section 6.8 (Calibration, data analysis and
calculations).
6.7.6. Calibration of the gas chromatograph
The calibration of the gas chromatograph associated to a mass spectrometer detector for the analysis
of triazine herbicides is done following one of the two procedures indicated earlier (see 6.5.3.2.).
Actual samples and QA samples (e.g., blanks, matrix spikes, SRM) are analyzed as one analytical
sequence together with the calibration mixtures under the conditions discussed in section 6.5
(Analytical quality control, Calibration of the gas chromatograph). Before an analytical sequence is
initiated, 1 or 2 µL of hexane is injected into the analytical system to confirm that it is free of
interfering contaminants. Sample extract injections of 1 to 4 µL are then made with an autosampling
device.
77
For a chromatographic peak to be identified as a target compound, it must meet the criteria specified
in section 6.5 (Analytical quality control, Qualitative identification of target analytes)
In addition, the determination of multiple individual ions (e.g., primary ion and 1 or 2 confirmation
ions), presenting an appropriate response with negligible interference, must comply with the
following quality criteria:
•
The characteristic masses of each target compound must maximize in the same scan or
within one scan of each other.
•
The relative peak heights (intensities) of the primary ion compared to the confirmation
(or secondary) ion mass for a target compound should fall within ±20 percent of the
relative intensities of these masses in a mass spectrum obtained from a reference
standard of that target compound with the same GC/MS.
Figure 14 shows the order elución and relative responses of triazine herbicides as well as recovery
and internal standards; the concentration of each analyte is 100 ng mL-1. The quantification and
confirmation ions monitored for each analyte are indicated in Table 15.
Figure 15. GC/MS chromatogram of triazine herbicides
78
The concentration of target analytes is determined based upon the response factor of the analyte in the
calibration standards. In general, the instrument software generates and prints out calibration data for
each instrument; however, it is important to understand these procedures to manually verify some of
the data generated by the software as an additional quality control of the final results (see 6.5.9.).
Table 14. Quantitation and confirmation ions for the analysis of triazine herbicides by GC/MS
Analyte
Quantitation ion
Confirmation ion
TCMX (Internal standard)
209
244
Atraton
196
211
Simazine
201
186
Prometon
210
225
Atrazine
200
215
Propazine
214
229
Terbuthylazine
214
229
Secbumeton
196
225
Simetryn
213
170
Ametryn
227
170
Prometryn
241
226
Terbutryn
226
241
PCB 103 (Surrogate standard)
324
326
6.7.9.1.
the highest calibration solution, the sample extract must be diluted and reanalyzed after a new
addition of surrogate standards (see 6.5.9.3.).
6.7.9.2.
Manual Calculation Check
The concentrations of selected analytes, determined by the software of the instrument are routinely
confirmed by independent manual calculations. Randomly selected sample analyte concentrations are
confirmed using a spreadsheet template (Excel or similar) and compared to the reported value. Except
for rounding errors, the concentrations must agree well.
79
6.7.10.1. Surrogate Recovery
The percent recovery of the surrogate standards in the sample extract are calculated using the ratio of
the response (area) of the internal standard added to the final extract just prior to instrumental
analyses to the response (area) for the surrogate. The laboratory will take appropriate corrective
action whenever the recovery of any surrogates is outside expected range. (see 6.5.10.1.).
certify sample homogeneity and precision of the analysis (see 6.5.4.5. and 6.5.10.2.).
practice (see 6.5.10.3.).
6.7.11. Gas chromatograph and mass spectrometer maintenace
There are a few simple steps that help to keep the gas chromatograph and the mass spectrometer
detector in good working conditions: See section 6.5.11. for helpful suggestions to keep the gas
chromatograph in good working conditions:
•
Keep a clean syringe
•
Maintain the septum in good conditions
•
Insert a new injection port liner as needed
•
Replace the injection port base plate as needed
•
Remove one to two feet of the analytical column if needed
•
Replace gas tanks once the pressure falls below 500 psi
Mass spectrometer maintenance:
•
The source assembly is cleaned and replaced as necessary
•
The emission filament is replaced as necessary
•
The rotary pump oil is changed yearly or more frequently if indicated.
•
The transfer line/re-entrant assembly is disassembled, cleaned or repaired and
reassembled as necessary.
•
All instrument maintenance, including changes of gas tanks, is recorded in the
maintenance log for the specific instrument.
folder with complete information from the wet laboratory as discussed in section 6.5
(Documentation).
80
6.7.13. Reporting
6.8. Calibration, data analysis and calculations
6.8.1. Preparation of spiking solutions (surrogate and internal standards and target analytes)
During the training course held in Costa Rica, the participants were given ampoules of target analytes
and internal and surrogate standards to prepare calibration solutions. Note that these ampoules
generally contain an amount of liquid slightly larger than the volume indicated; therefore, the analyst
should always measure the volume needed. For convenience, the same surrogate and internal
standards are used in the analysis of all target analytes by gas chromatography associated to either an
electron
capture
detector
(chlorinated
insecticides
and
a
mix
of
modern
insecticides/fungicides/herbicides) or mass spectrometer (triazine herbicides). The spiking solutions
of target analytes are mixed and prepared according to their analysis.
Note that the solutions prepared in the following sections are used to prepare the calibration solutions
discussed in section 6.8.2. The concentrations of surrogate and internal standards in the final sample
extract volumes are the same as those in levels 1-5 of the calibration solutions. Similarly, the
concentrations of target analytes in the final spike sample extracts are the same as those in levels 3 of
the calibration solutions.
6.8.1.1.
Surrogate standards
4,4' dibromooctafluorbiphenyl (DBOFB)
2,2’,4,5’,6-pentachlorobiphenyl (PCB 103)
(Individual ampoules; concentration of each analyte is 100 µg mL-1)
Surrogate standards are added to all regular and quality control (e.g., blank, spike blank, duplicate,
matrix spike, matrix spike duplicate, and certified reference material) samples before they are
processed in the laboratory. The use of surrogate standards in the calculation of analyte
concentrations allows compensation for losses occurred in the laboratory. Calculations are
independent of the final sample extract volume or the volume of extract injected into the gas
chromatograph.
•
Preparation
One hundred (100) mL of the surrogate standard mix solution are prepared by 1:100 dilutions of
the stock solutions provided. A pre-rinsed 100 mL class A volumetric flask should be filled with
about 50 mL of hexane prior to adding the individual compound solutions. Exactly 1.000 mL of
each stock solution is added to the volumetric flask and the final volume is brought up to 100 mL
with hexane. The final concentration of each surrogate standard is 1,000 ng mL-1.
[Surrogate standard] (ng mL
-1
•
) = 100 µg
⎛ 1,000 ng mL-1 ⎞ ⎛ 1.000 mL ⎞
⎟*
mL-1 * ⎜
= 1,000 ng mL-1
⎜ 1 µg mL-1 ⎟ ⎜⎝ 100 mL ⎟⎠
⎝
⎠
Use
One hundred microliters (100µL or 0.100mL) of the spike surrogate standard solution are added
to all samples in the analytical batch before extraction. After all laboratory procedures (e.g.,
extraction, purification, concentration) and before the instrumental analysis, the sample extract
81
volume is adjusted to approximately 1 mL; thus, the final concentration of each surrogate
standard is 100 ng mL-1.
[Surrogate standard] (ng mL
-1
6.8.1.2.
) = 1,000 ng
⎛ 0.100 mL ⎞
-1
mL-1 * ⎜
⎟ = 100 ng mL
⎝ 1 mL ⎠
Internal standard
2,4,5,6-tetrachloro-meta-xylene (TCMX)
(Individual ampoule; concentration is 2,000 µg mL-1)
The internal standard is added to all regular and quality control (e.g., blank, spike blank, duplicate,
matrix spike, matrix spike duplicate, and certified reference material) sample extracts before the
instrumental analysis. The use of an internal standard provides information reagarding the magnitude
of the losses occurred in the laboratory independently of the final sample extract volume or the
volume of it injected into the gas chromatograph.
•
Preparation
One hundred (100) mL of the internal standard solution are prepared by 1:2,000 dilution of the
stock solution provided. A pre-rinsed 100 mL class A volumetric flask should be filled with about
50 mL of hexane prior to adding the individual compound solution. Exactly 0.050 mL of the
stock solution are added to the volumetric flask and the final volume is brought up to 100 mL
with hexane. The final concentration of the internal standard is 1,000 ng mL-1.
[Internal standard] (ng mL
-1
•
) = 2,000 µg
⎛ 1,000 ng mL-1 ⎞ ⎛ 0.050 mL ⎞
⎟*
mL-1 * ⎜
= 1,000 ng mL-1
⎜ 1 µg mL-1 ⎟ ⎜⎝ 100 mL ⎟⎠
⎝
⎠
Use
One hundred microliters (100µL or 0.100mL) of the spike internal standard solution are added to
all samples in the analytical batch after all laboratory procedures (e.g., extraction, purification,
concentration). Before the instrumental analysis the sample extract volume is adjusted to
approximately 1 mL; thus, the final concentration of the internal standard is 100 ng mL-1.
[Internal standard] (ng mL ) = 1,000 ng mL-1 * ⎛⎜ 0.100 mL ⎞⎟ = 100 ng mL-1
-1
⎝
6.8.1.3.
1 mL
⎠
Target analyte spike solutions
These solutions are used to spike those samples intended to estimate accuracy of the analytical
method without (blank spike) and with (matrix spike) the presence of the matrix. Comparisons of the
recoveries in the blank spike/blank spike duplicate and matrix spike/matrix spike duplicate are used to
estimate the analytical precision of the method.
82
6.8.1.4.
Organochlorine insecticide spike solution
Aldrin
alpha-HCH
beta-HCH
delta-HCH
gamma-HCH
4,4'-DDD
4,4'-DDE
4,4'-DDT
Dieldrin
Endosulfan I
Endosulfan II
Endosulfan Sulfate
Endrin
Endrin Aldehyde
Endrin ketone
Heptachlor
Heptachlor epoxide
Methoxychlor
alpha-Chlordane
gamma-Chlordane
(A mix solution of target analytes; individual concentration is 1000 µg mL-1)
•
Preparation
Two hundred and fifty (250) mL of the organochlorine insecticide spike solution are prepared by
1:2,500 dilution of the stock solution provided (i.e., mix of organochlorine insecticides @ 1,000
µg mL-1 each compound). A pre-rinsed 250 mL class A volumetric flask should be filled with
about 150 mL of hexane prior to adding the organochlorine insecticide stock solution. Exactly
0.100 mL of the stock solution is added to the volumetric flask and the final volume is brought up
to 250 mL with hexane. The final concentration of each surrogate standard is 400 ng mL-1.
[Analyte] (ng mL
-1
•
) = 1,000 µg
⎛ 1,000 ng mL-1 ⎞ ⎛ 0.100 mL ⎞
⎟*
mL-1 * ⎜
= 400 ng mL-1
⎜ 1 µg mL-1 ⎟ ⎜⎝ 250 mL ⎟⎠
⎝
⎠
Use
One hundred microliters (100µL or 0.100mL) of the organochlorine insecticide spike solution are
added to all spike samples (e.g., blank spike, blank spike duplicate, matrix spike, and matrix spike
duplicate) in the analytical batch before extraction. After all laboratory procedures (e.g.,
volume is adjusted to approximately 1 mL; thus, the final concentration of each organochlorine
insecticide is 40 ng mL-1.
[Analyte] (ng mL ) = 400 ng mL-1 * ⎛⎜ 0.100 mL ⎞⎟ = 40 ng mL-1
-1
⎝
6.8.1.5.
1 mL
⎠
Modern insecticide, fungicide, and herbicide spike solution
Chlorothalonil
Diuron
Permethrin
Chlorpyrifos
Fenamiphos
Bromacil
Diazinon
Parathion-methyl
(Individual ampoules; concentration of each analyte is 100 µg mL-1, except for Diuron @ 1000 µg
mL-1)
•
Preparation
Two hundred and fifty (250) mL of the modern insecticide, fungicide, and herbicide spike
solution are prepared by 1:250 (1:2,500 for Diuron) dilutions of the stock solutions provided. A
pre-rinsed 250 mL class A volumetric flask should be filled with about 150 mL of hexane prior to
adding the modern insecticide, fungicide, and herbicide stock solutions. Exactly 1.000 mL (0.100
mL for Diuron) of each stock solution is added to the volumetric flask and the final volume is
brought up to 250 mL with hexane. The final concentration of each modern insecticide, fungicide,
and herbicide is 400 ng mL-1.
83
[Analyte] (ng mL
-1
⎛ 1,000 ng mL-1 ⎞ ⎛ 1.000 mL ⎞
⎟*
mL-1 * ⎜
= 400 ng mL-1
⎜ 1 µg mL-1 ⎟ ⎜⎝ 250 mL ⎟⎠
⎠
⎝
) = 100 µg
or:
[Diuron ] (ng mL
-1
•
) = 1,000 µg
⎛ 1,000 ng mL-1 ⎞ ⎛ 0.100 mL ⎞
⎟*
mL-1 * ⎜
= 400 ng mL-1
⎜ 1 µg mL-1 ⎟ ⎜⎝ 250 mL ⎟⎠
⎝
⎠
Use
One hundred microliters (100µL or 0.100mL) of the modern insecticide, fungicide, and herbicide spike
solution are added to all spike samples (e.g., blank spike, blank spike duplicate, matrix spike, and matrix
spike duplicate) in the analytical batch before extraction. After all laboratory procedures (e.g., extraction,
purification, concentration) and before the instrumental analysis, the sample extract volume is adjusted to
approximately 1 mL; thus, the final concentration of each organochlorine insecticide is 40 ng mL-1.
[Analyte] (ng mL
-1
6.8.1.6.
) = 400 ng
⎛ 0.100 mL ⎞
-1
mL-1 * ⎜
⎟ = 40 ng mL
⎝ 1 mL ⎠
Triazine herbicide spike solution
Ametryn
Prometon
Secbumeton
Terbuthylazine
Atraton
Prometryn
Simetryn
Terbutryn
Atrazine
Propazine
Simazine
(A mix solution of target analytes; concentration of each analyte is 100 µg mL-1)
•
Preparation
Two hundred and fifty (250) mL of the triazine herbicide spike solution are prepared by 1:250
dilution of the stock solution provided. A pre-rinsed 250 mL class A volumetric flask should be
filled with about 150 mL of hexane prior to adding the triazine herbicide stock solutions. Exactly
1.000 mL of the stock solution is added to the volumetric flask and the final volume is brought up
to 250 mL with hexane. The final concentration of each triazine herbicide is 400 ng mL-1.
[Analyte] (ng mL
-1
•
) = 100 µg
⎛ 1,000 ng mL-1 ⎞ ⎛ 1.000 mL ⎞
⎟*
mL-1 * ⎜
= 400 ng mL-1
⎜ 1 µg mL-1 ⎟ ⎜⎝ 250 mL ⎟⎠
⎝
⎠
Use
Two hundred microliters (200µL or 0.200mL) of the triazine herbicide spike solution are added to
all spike samples (e.g., blank spike, blank spike duplicate, matrix spike, and matrix spike
volume is adjusted to approximately 1 mL; thus, the final concentration of each triazine herbicide
is 80 ng mL-1.
[Analyte] (ng mL ) = 400 ng mL-1 * ⎛⎜ 0.200 mL ⎞⎟ = 80 ng mL-1
-1
⎝
84
1 mL
⎠
6.8.1.7.
Carbamate insecticide spike solution
Carbaryl
Carbofuran
Oxamyl
-1
(Individual ampoules; concentration of each analyte is 100 µg mL )
•
Preparation
Twenty five (25) mL of the carbamate insecticide spike solution are prepared by 1:25 dilutions of
the stock solutions provided (individual compound solutions @ 100 µg mL-1 each). A pre-rinsed
25 mL class A volumetric flask should be filled with about 10 mL of hexane prior to adding the
carbamate insecticide stock solutions. Exactly 1.000 mL of each stock solution is added to the
volumetric flask and the final volume is brought up to 25 mL with hexane. The final
concentration of each carbamate insecticide is 4,000 ng mL-1.
[Analyte] (ng mL
-1
•
)
⎛ 1,000 ng mL-1 ⎞ ⎛ 1.000 mL ⎞
⎟*
= 4,000 ng mL-1
= 100 µg mL-1 * ⎜
⎜ 1 µg mL-1 ⎟ ⎜⎝ 25 mL ⎟⎠
⎝
⎠
Use
Two hundred microliters (200µL or 0.200mL) of the carbamate insecticide spike solution are
added to all spike samples (e.g., blank spike, blank spike duplicate, matrix spike, and matrix spike
volume is adjusted to approximately 1 mL; thus, the final concentration of each triazine herbicide
is 800 ng mL-1.
[Analyte] (ng mL ) = 4,000 ng mL-1 * ⎛⎜ 0.200 mL ⎞⎟ = 800 ng mL-1
-1
⎝
1 mL
⎠
6.8.2. Calibration Solutions
It is important that an experimented analyst be responsible for the preparation of these solutions, with
the corresponding internal and surrogate standards, for the analysis of target analytes (Table 1) by gas
chromatography associated to different detectors or high performance liquid chromatography
(HPLC).
Note that, in all cases, calibration solution, level 3, is prepared in a larger volume as this solution is
used to control the calibration of the instrument as needed.
6.8.2.1.
The volumes of the relevant solutions prepared above (i.e., organochlorine insecticide spike solution,
surrogate and internal standard solutions) and a non-chlorinated solvent (e.g., hexane) to prepare
calibration solutions at five different concentration levels are suggested in the following table.
85
Volume of surrogate
Volume of internal
Volume of
standard solution (b)
standard solution (c)
target analyte
solution (a)
(@ 1.000 ng mL-1)
(@ 1.000 ng mL-1)
(@ 400 ng mL-1)
Level 1
0.125
1.000
1.000
Level 2
0.500
1.000
1.000
Level 3
5.000
5.000
5.000
Level 4
2.000
1.000
1.000
Level 5
5.000
1.000
1.000
(a) Use the solution prepared in seccion 6.8.1 (see Organochlorine insecticide spike solution)
(b) Use the solution prepared in seccion 6.8.1 (see Surrogate standards)
(c) Use the solution prepared in seccion 6.8.1 (see Internal standard)
Calibration
Solution
Volume of
solvent
Final volume
(mL)
7.880
7.500
35.000
6.000
3.000
(mL)
10.000
10.000
50.000
10.000
10.000
Final concentrations of target analytes, surrogate and intenal standards in each calibration solution are
as follow:
Calibration
Solution
Level 1
Level 2
Level 3
Level 4
Level 5
6.8.2.2.
Concentration of each target
analyte
(ng mL-1)
5
20
40
80
200
Concentration of each surrogate
standard
(ng mL-1)
100
100
100
100
100
Concentration of the internal
standard
(ng mL-1)
100
100
100
100
100
Modern insecticides/fungicides/herbicides
The volumes of each of the relevant solutions prepared above (i.e., modern insecticide, fungicide, and
herbicide spike solution, surrogate and internal standard solutions) and a non-chlorinated solvent
(e.g., hexane) to prepare calibration solutions at five different concentration levels are suggested in
the following table.
Volume of surrogate
Volume of internal
Volume of
Volume of
solvent
target analyte
solution (a)
(@ 1.000 ng mL-1)
(@ 1.000 ng mL-1)
(mL)
(@ 400 ng mL-1)
Level 1
0.125
1.000
1.000
7.880
Level 2
0.500
1.000
1.000
7.500
Level 3
5.000
5.000
5.000
35.000
Level 4
2.000
1.000
1.000
6.000
Level 5
5.000
1.000
1.000
3.000
(a) Use the solution prepared in seccion 6.8.1 (see Modern insecticide, fungicide, and herbicide spike solution)
(b) Use the solution prepared in seccion 6.8.1 (see Surrogate Standards)
(c) Use the solution prepared in seccion 6.8.1 (see Internal Standard)
Calibration
Solution
Final volume
(mL)
10.000
10.000
50.000
10.000
10.000
as follow:
86
Calibration
Solution
Level 1
Level 2
Level 3
Level 4
Level 5
6.8.2.3.
analyte
(ng mL-1)
5
20
40
80
200
standard
(ng mL-1)
100
100
100
100
100
standard
(ng mL-1)
100
100
100
100
100
Triazine herbicides
The volumes of each of the relevant solutions prepared above (i.e., triazine herbicide spike solution,
surrogate and internal standard solutions) and a non-chlorinated solvent (e.g., hexane) to prepare
calibration solutions at five different concentration levels are suggested in the following table. Note
that simazine and atrazine have a low solubility in hexane; therefore, if a more concentrated solution
is desired, the solvent to use is acetone.
Volume of surrogate
Volume of internal
Volume of
target analyte
solution (a)
(@ 1.000 ng mL-1)
(@ 1.000 ng mL-1)
(@ 400 ng mL-1)
Level 1
0.250
1.000
1.000
Level 2
1.000
1.000
1.000
Level 3
10.000
5.000
5.000
Level 4
4.000
1.000
1.000
Level 5
8.000
1.000
1.000
(a) Use the solution prepared in seccion 6.8.1 (see Triazine herbicide spike solution)
(b) Use the solution prepared in seccion 6.8.1 (see Surrogate standards)
(c) Use the solution prepared in seccion 6.8.1 (see Internal standard)
Calibration
Solution
Volume of
solvent
Final volume
(mL)
7.750
7.000
30.000
4.000
0.000
(mL)
10.000
10.000
50.000
10.000
10.000
as follow:
Calibration
Solution
Level 1
Level 2
Level 3
Level 4
Level 5
6.8.2.4.
analyte
(ng mL-1)
10
40
80
160
320
standard
(ng mL-1)
100
100
100
100
100
standard
(ng mL-1)
100
100
100
100
100
The volumes of the carbamate insecticide spike solution and solvent to prepare calibration solutions
at five different concentration levels are suggested in the following table.
87
Calibration
Solution
Analytes (a)
Volume of solvent
(mL)
Final volume
@ 4,000 ng mL-1
(mL)
Level 1
0.125
4.875
5.000
Level 2
0.500
4.500
5.000
Level 3
5.000
20.000
25.000
Level 4
2.000
3.000
5.000
Level 5
5.000
0.000
5.000
(a) Use the solution prepared in seccion 6.8.1 (see Carbamate insecticide spike solution)
Final concentrations of target analytes in each calibration solution are as follow:
Calibration Solution
Level 1
Level 2
Level 3
Level 4
Level 5
Concentration of each
target analyte
(ng mL-1)
100
400
800
1.600
4.000
6.8.3. Analytical Sequence
The analytical sequence is designed to ensure that the instrument is in calibration before the analysis
of the sample extracts and that the calibration is maintained throughout the analytical run. A typical
analytical sequence includes:
•
Calibration solutions and, if needed (see below) a mid-level calibration standard to
control that the instrumental maintains its calibration throughout the analytical run.
•
Sample extracts
The calibration of the instrument can be performed by one of the following methods:
•
Method A: The calibration is performed as part of the analytical run by interspersing the
calibration standards with actual samples. Routinely 8 or 9 samples are analyzed between
the interspersed calibration solutions. The calibration curve is then based on these four
standards. If the calibration curve has a correlation coeficient of 0.9950 or higher (i.e., R2
of 0.9900 or higher) for all analytes present in the standards it is accepted. If these QC
acceptance criteria are not met, the calibration standards as well as all the samples must
be reanalyzed.
•
Method B: The calibration, based on four standards, is performed before the analytical
run and the samples are not analyzed until the calibration is acceptable. An acceptable
calibration curve has a correlation coeficient of 0.9950 or higher (i.e., R2 of 0.9900 or
higher) for all analytes present in the standards. With this method, the calibration is
controlled every 12 hours, or less, by injecting a mid-level calibration solution
(“ConCal”, continuing calibration). This calibration can last for several days, even weeks,
but must be controlled before a new analytical batch is run and every 12 hours or less
during the run.
A typical analytical batch includes 16 samples in addition to the QA/QC samples (e.g., blank,
duplícate, blank spike, matrix spike, matrix spike in duplícate, and, if available, a certified reference
88
material). According to the calibration method selected, the instrumental analytical sequence can have
one of the following arrangements:
Method A
Orden
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
I.D.
W1000
W1001
Q3645
Q3646
Q3647
Q3648
Q3649
Q3650
K1518
W1002
K1519
K1522
K1523
K1525
K1526
K1527
K1540
K1541
W1003
K1542
K1543
K1544
K1545
K1546
K1547
K1548
W1004
Method B
Sample
Solvent
Calibration solution, Level 1
Blank
Spike blank
Duplicate sample
Matrix spike
Matrix spike duplicate
Certified reference material
Sample 1
Sample 2
Sample 3
Sample 4
Muestra 5
Muestra 6
Muestra 7
Sample 8
Sample 9
Sample 10
Sample 11
Sample 12
Sample 13
Sample 14
Sample 15
Sample 16
Orden
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
I.D.
W1000
W1001
W1002
W1003
W1004
W1005
Q3645
Q3646
Q3647
Q3648
Q3649
Q3650
K1518
W1006
K1519
K1522
K1523
K1525
K1526
K1527
K1540
K1541
W1007
K1542
K1543
K1544
K1545
K1546
K1547
K1548
W1008
Sample
Solvent
Calibr. Sol., Level 3 (control)
Blank
Spike blank
Duplicate sample
Matrix spike
Matrix spike duplicate
Certified reference material
Sample 1
Sample 2
Sample 3
Sample 4
Sample 5
Sample 6
Sample 7
Sample 8
Sample 9
Sample 10
Sample 11
Sample 12
Sample 13
Sample 14
Sample 15
Sample 16
6.8.4. Calibration and quantitative determination
This section discusses the calibration of the gas chromatograph and the quantitative determination of
the concentration of an analyte X, as a generic example, using calibration curves with and without the
use of a surrogate standard.
Independently of the method used to calibrate the gas chromatograph a minimum of four-point
calibration curve is used to establish the response of the detector (see 6.8.3). The information
obtained has the form:
89
Analyte X
Calibration solution – Level 1
I.S.
S.S.
Conc =
Area =
100
2500
100
1800
200 ng mL-1
5200
100
2933
100
2049
80 ng mL-1
2392
100
2104
100
1469
20 ng mL-1
442
100
2304
100
1625
5 ng mL-1
124
Conc =
Area =
Conc =
Area =
Conc =
Area =
90
6.8.4.1.
Calibration curve using the surrogate standard
⎛ Analyte X Area ⎞
Relative Area = ⎜
⎟
⎝ Surr. Std. Area ⎠
(5200/1800) = 2.8889
(2392/2049) = 1.1674
(442/1469) = 0.3009
(124/1625) = 0.0763
⎛ Analyte X Conc. ⎞
Relative Conc. = ⎜
⎟
⎝ Surr. Std. Conc. ⎠
(200 ng mL-1/100 ng mL-1) = 2.000
(80 ng mL-1/100 ng mL-1) = 0.800
(20 ng mL-1/100 ng mL-1) = 0.200
(5 ng mL-1/100 ng mL-1) = 0.050
The calibration curve is prepared using an equation of, for example, the form:
Y = A XB
Where:
Y = Relative concentration
X = Relative area
A = slope of the regression equation
B = polynomial coefficient for the line fit
In the example above, A and B are equal to 0.6811 and 1.016, respectively, with an R2 equal to
1.0000.
91
Quantitative determination using the surrogate standard - Equations
Y = A XB
(1)
Relative Conc. = A * (Relative Area )B
(2)
[Analyte] (ng mL ) = A * ⎛⎜ Analyte Area ⎞⎟ B
⎜ Surrogate Std. Area ⎟
[Surrogate Std.] (ng mL )
⎝
⎠
(3)
⎛ Analyte Mass (ng) ⎞
⎜
⎟
B
⎝ Extract Volume (mL) ⎠ = A * ⎛⎜ Analyte Area ⎞⎟
⎜ Surrogate Std. Area ⎟
⎛ Surrogate Std. Mass (ng) ⎞
⎠
⎝
⎜
⎟
⎝ Extract Volume (mL) ⎠
(4)
-1
-1
B
⎛ Analyte Area ⎞ ⎛ Surrogate Std. Mass (ng) ⎞
AnalyteMass (ng)
⎟⎟ * ⎜
= A * ⎜⎜
⎟
Extract Volume (mL)
⎝ Surrogate Std. Area ⎠ ⎝ Extract Volume (mL) ⎠
⎜
⎟
⎜⎜
⎟⎟
⎛ Sample Weight (g) ⎞
⎜
⎟
-1
[Analyte] (ng g
-1
)
(6)
⎛ Analyte Area ⎞ ⎛ Surrogate Std. Mass (ng) ⎞
⎟⎟
⎟⎟ * ⎜⎜
= A * ⎜⎜
⎝ Surrogate Std. Area ⎠ ⎝ Sample Weight (g) ⎠
(7)
B
dry weight)
⎞
⎛ Analyte Area ⎞ ⎛ Surrogate Std. Mass (ng) ⎞ ⎛
100
⎟⎟ (8)
⎟⎟ * ⎜⎜
⎟⎟ * ⎜⎜
= A * ⎜⎜
⎝ Surrogate Std. Area ⎠ ⎝ Sample Weight (g) ⎠ ⎝ Dry Weight Percent ⎠
Calibration curve without using the surrogate standard
92
⎛ Surrogate Std. Mass (ng) ⎞
⎜
⎟
Extract Volume (mL) ⎠
*⎝
⎜
⎟
B
[Analyte] (ng g
6.8.4.2.
⎛ Analyte Area ⎞
⎟⎟
= A * ⎜⎜
⎝ Surrogate Std. Area ⎠
B
(5)
Analyte X Area
Analyte X Concentration
5200
2392
442
124
200 ng mL-1
80 ng mL-1
20 ng mL-1
5 ng mL-1
Using the same equation as in the previous example:
Y = A XB
Where:
Y = Concentration
X = Area
A = slope of the regression equation
B = polynomial coefficient for the line fit
In this example, A and B are equal to 0.0517 and 0.9591, respectively, with an R2 equal to 0.9958.
Quantitative determination without the surrogate standard - Equations
Y = A XB
(1)
[Analyte] (ng mL ) = ⎛⎜
-1
Analyte Mass (ng) ⎞
B
⎟ = A * (Analyte Area )
(9)
⎡
⎤
⎜
⎟
⎢
⎥
1
⎝ Extract Volume (mL) ⎠ = A * (Analyte Area )B * ⎢
⎥
⎢ ⎛ Sample Weight ⎞ ⎥
⎜
⎟
⎢ ⎜ Extract Volume ⎟ ⎥
⎠⎦
⎣⎝
(10)
⎛ Extract Volume ⎞
⎟⎟
⎟⎟ = A * (Analyte Area )B * ⎜⎜
⎜⎜
(g)
Sample
Weight
⎠
⎝ Sample Weight ⎠
⎝
(11)
[Analyte] (ng g
-1
[Analyte] (ng g
-1
)
⎛ Extract Volume ⎞
⎟⎟
= A * (Analyte Area )B * ⎜⎜
⎝ Sample Weight ⎠
sample weight) = A *
⎞
100
⎟⎟
Sample
Weight
Dry
Weight
Percent
⎠
⎠ ⎝
⎝
(AnalyteArea )B * ⎛⎜⎜ Extract Volume ⎞⎟⎟ * ⎛⎜⎜
(12)
(13)
93
6.8.5. Calculation example
Consider the following data:
Example A:
Sample Matrix
Sample Weight
Sample Weight Percent
Volume of Surrogate Std. added
[Surrogate Std.]
Final Extract Volume
Volume of Internal Std. added
[Internal Std.]
=
=
=
=
=
=
=
=
sediment
10.82 grams wet weight
12.9%
0.100 mL
1000 ng mL-1
~ 1 mL
0.100 mL
1000 ng mL-1
Alternatively, the final volume of the sample extract can be concentrated to a smaller volume (e.g.,
approximately 0.5 mL) to increase the instrumental response of the target analytes. In this case, the
amounts of surrogate and internal standards added to the sample extract are adjusted accordingly to
produce responses similar to those observed in the chromatograms of the calibration solutions for a
direct visual comparison:
Example B:
Sample Matrix
Sample Weight
[Surrogate Std.]
[Internal Std.]
=
=
=
=
=
=
=
=
sediment
12.9%
0.050 mL
1000 ng mL-1
~ 0.5 mL
0.050 mL
1000 ng mL-1
=
=
=
=
=
=
=
=
sediment
12.9%
0.025 mL
1000 ng mL-1
~0.25 mL
0.025 mL
1000 ng mL-1
or
Example C:
Sample Matrix
Sample Weight
[Surrogate Std.]
[Internal Std.]
A similar approach can be followed if high concentrations are suspected:
Example D:
Sample Matrix
Sample Weight
[Surrogate Std.]
[Internal Std.]
94
=
=
=
=
=
=
=
=
sediment
12.9%
0.500 mL
1000 ng mL-1
~ 5 mL
0.500 mL
1000 ng mL-1
Note that in these examples, the final concentrations of target analytes in the sample are increased
(example B and C) or decreased (example D) while the levels of surrogate and internal standards do
not change. As mentioned before, the goal is to maintain the standards instrumental responses in the
sample extracts similar to those observed in the chromatograms of the calibration solutions for a
direct visual comparison.
6.8.5.1.
Surrogate Recovery
The percent recovery of the surrogate standard in the sample extract is calculated using the ratio of
the responses of the surrogate and internal standards. The average ratio in the calibration solutions
represents a percent recovery equal to 100%. If the additions of the surrogate and internal standards
are done as indicated (see 6.8.2), the concentrations in the final sample extracts are similar to those in
the calibration solutions (i.e., 100 ng mL-1 each). These ratios, independently of the final sample
extract volumes, are compared as shown:
Calibration Solution - Level 1
Average
Example A (vol. = ~1 mL)
Example B (vol. = ~0,5 mL)
Int. Standard
Area
(I.S.)
Surr. Standard
Area
(S.S.)
Ratio
(Area S.S./Area
I.S.)
2500
2933
2104
2304
3200
3260
1800
2049
1469
1625
2285
2340
0.7200
0.6986
0.6981
0.7053
0.7055
0.7141
0.7178
Surrogate Recovery (%) =
0.7141
*100 = 101.21%
0.7055
(Example A)
Surrogate Recovery (%) =
0.7178
*100 = 101.74%
0.7055
(Example B)
or
6.8.5.2.
Quantitative determination of analyte “X” concentration using the surrogate standard
With the information obtained above for the calibration curve using the surrogate standard and the
situation given in example A, consider the following chromatogram:
95
Analyte X
I.S.
S.S.
Area =
3200
2285
4046
As shown above, the equation for the calculation of analyte X using the surrgate standard is:
[Analyte] (ng g
B
-1
⎛ Analyte Area ⎞ ⎛ Surrogate Std. Mass (ng) ⎞ ⎛
⎞
100
dry weight) = A * ⎜
⎜ Surrogate Std. Area ⎟⎟ * ⎜⎜ Sample Weight (g) ⎟⎟ * ⎜⎜ Dry Weight Percent ⎟⎟ (8)
⎝
⎠ ⎝
⎠ ⎝
⎠
Replacing the terms in the equation (8):
[Analyte] (ng g
1.016
-1
dry weight)
⎛ 4046 ⎞
= 0.6811 * ⎜
⎟
⎝ 2285 ⎠
⎛ 100 (ng) ⎞ ⎛ 100 ⎞
* ⎜⎜
⎟⎟ * ⎜
⎟ = 87.20 ng/g dry weight
⎝ 10.82 (g) ⎠ ⎝ 12.9 ⎠
If the sample extract is spiked with half the amount of surrogate standard and the final volumen
concentrated to ~ 0.5 mL (example B), the chromatogram results as follows:
Analyte X
I.S.
S.S
Area =
3260
2340
8012
Replacing the terms in equation (8):
[Analyte] (ng g
1.016
-1
dry weight)
⎛ 8012 ⎞
= 0.6811 * ⎜
⎟
⎝ 2340 ⎠
⎛ 50 (ng) ⎞ ⎛ 100 ⎞
-1
*⎜
⎟*⎜
⎟ = 85.20 ng g dry weight
10.82
12.9
(g)
⎝
⎠
⎝
⎠
Calculation, following the information given in examples C and D, proceeds in similar manner:
96
6.8.5.3.
1.016
[Analyte] (ng g
-1
[Analyte] (ng g
-1
dry weight)
⎛ 15743 ⎞
= 0.6811 * ⎜
⎟
⎝ 2255 ⎠
dry weight)
⎛ 836 ⎞
= 0.6811 * ⎜
⎟
⎝ 2303 ⎠
1.016
⎛ 25 (ng) ⎞ ⎛ 100 ⎞
-1
* ⎜⎜
⎟⎟ * ⎜ 12.9 ⎟ = 87.86 ng g dry weight
10.82
(g)
⎠
⎝
⎠ ⎝
⎛ 500 (ng) ⎞ ⎛ 100 ⎞
-1
* ⎜⎜
⎟⎟ * ⎜
10.82
12.9
(g)
⎠
⎝
⎠ ⎝
Quantitative determination of analyte “X” concentration without surrogate standard
Without surrogate standard, there is no internal compensation of losses incurred in the laboratory
during sample processing or difference in the final extract volume; therefore, it is important that the
final sample extract volume be exactly known (i.e., 1.000 mL). Given the analyte X responses
presented above for the four calibration levels and some of the information in example A, consider
the following chromatogram:
Analyte X
Area =
I.S.
S.S.
0
0
4046
As discussed above, the equation for the calculation of analyte X without the surrgate standard is:
[Analyte] (ng g
-1
dry weight) = A *
⎞
100
⎟⎟ (13)
⎝ Sample Weight ⎠ ⎝ Dry Weight Percent ⎠
(Analyte Area )B * ⎛⎜⎜ Extract Volume ⎞⎟⎟ * ⎛⎜⎜
Replacing the terms in the equation:
[Analyte] (ng g
-1
dry weight)
⎛ 1.000 ⎞ ⎛ 100 ⎞
-1
= 0.0517 * (4046)0.9591 * ⎜
⎟*⎜
⎝ 10.82 ⎠ ⎝ 12.9 ⎠
If the sample extract is concentrated to a smaller volume, as in example B, with the difference that the
final volume (i.e., 0.500 mL) must be known exactly, the chromatogram results as follows:
97
Analyte X
I.S.
S.S
0
0
Area =
8012
Replacing the terms in equation (13):
[Analyte] (ng g
-1
dry weight)
⎛ 0.500 ⎞ ⎛ 100 ⎞
-1
= 0.0517 * (8012 )0.9591 * ⎜
⎟*⎜
⎝ 10.82 ⎠ ⎝ 12.9 ⎠
Calculation, following the information given in examples C and D, proceeds in the same way:
[Analyte] (ng g
-1
[Analyte] (ng g
dry weight) = 0.0517 *
-1
dry weight)
(15743)0.9591 * ⎛⎜ 0.250 ⎞⎟ * ⎛⎜ 100 ⎞⎟ = 98.18 ng g -1 dry weight
⎝ 10.82 ⎠ ⎝ 12.9 ⎠
⎛ 5.000 ⎞ ⎛ 100 ⎞
-1
= 0.0517 * (836 )0.9591 * ⎜
⎟*⎜
10.82
12.9
⎝
⎠ ⎝
⎠
6.9. Reporting
Data are routinely reported to three places after the decimal point as ng g-1 dry weight
(soils/sediments and biota) or as ng L-1 (water) results. Table 15 shows common qualifiers to
characterize the data.
The laboratory must have in place a set of corrective actions if the analytical quality control
requirements for quantitative analysis of accuracy and precision (Table 16) are not met.
98
Table 15.
Common qualifiers to characterize the data
Qualifier
Description
ND
=
Not detected
J
=
Below the Method Detection Limit
NA
=
Not applicable
Q
=
Data out of control
I
=
Interference
B
=
Blank contamination
d
=
Dilution
EC
=
Exceede calibration range
Table 16.
Analytical quality control requirements of accuracy and precision
Analytical quality control
requirements
Surrogate standards
Accuracy
Blank Spike
Matrix Spike
Precision
Duplicate Sample
Blank Spike Duplicate
Matrix Spike Duplicate
Frequency
Objetives(a)
Every sample
Recoveries between 40-120% of added
amount
5 % of the samples in
the analytical batch
(1:20) (a, b)
Recoveries between 40-120% of added
amount
5 % of the samples in
the analytical batch
(1:20) (a, b)
Relative Percent Difference
< 25% for each detected analyte
(a) at a minimum one per analytical batch
(b) Duplicate sample or Matrix Spike Duplicate can be omitted if no enough material is available
The following pages are an example of a data report. Note that the information provided in these
pages is given with the sole purpose to illustrate the proposed report format. The first page shows the
concentrations in four samples and their associated qualifiers. The second page shows the
concentrations measured in the blank sample and compares the original and duplicate samples,
including information on the relative percent difference for each detected analyte above the MDL.
Those analytes that show a relative percent difference larger than 25%, for example 4,4’-DDE, are
qualified with a “Q” as they are outside contol limits (Tables 15 and 16). The third page shows the
concentrations detected in the original sample and in the matrix spike and matrix spike duplicate,
including the recoveries of spiked analytes in these last two samples and the relative percent
difference between recoveries.
99
100
101
102
7.
REFERENCES
ASTM Annual Book of Standards, Part 31, D3086, Appendix X3, Standardization of Florisil column
by weight adjustment based on adsorption of lauric acid, American Society for Testing and
Materials, Philadelphia, PA, 765 p.
Burke, L. & Maidens, J. (1984). Reefs at Risk in the Caribbean, World Resources Institute,
Washington D.C., 80 p.
Federal Register (1984). Definition and procedures for the determination of the Method Detection
Limits, 40 CFR (Code of Federal Regulations), Part 136, Appendix B rev. 1.11.
International Mussel Watch Project Secretariat (1995), International Mussel Watch Project, Initial
Implementation Phase – Final Report, Farrington, J.W. & Tripp, B.W. Eds., NOAA Technical
Memorandum NOS ORCA 95, 63 p.
National Oceanic and Atmospheric Administration (1998). Sampling and Analytical Methods of the
National Status and Trends Program Mussel Watch Project; 1993-1996 Update, Lauenstein,
G.G. & Cantillo, A.Y. Eds., NOAA Technical Memorandum NOS ORCA 130, 233 p.
Smith, R.-K. (1997). Handbook of Environmental Analysis, 3rd. Ed., Genium Publishing Corporation,
New York, NY, 462 p.
UNEP (1983). Convenio para la Protección y el Desarrollo del Medio Marino en la Región del Gran
Caribe. UNEP Regional Seas Conventions and Protocols, 225 p.
103
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cul
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“Colombia, Costa Rica y Nicaragua – Proyecto Reduciendo el
Escurrimiento de Plaguicidas al Mar Caribe” (Proyecto GEF-REPCar)
Programa de Monitoreo Costero
Guía para el muestreo, preparación y análisis de
contaminantes orgánicos en muestras ambientales
(agua, suelos/sedimentos y biota)
Agosto 2008
Introducción
Nota:
Este documente fue preparado por el Dr. José Sericano de la Universidad Texas A&M en los
Estados Unidos de América en calidad de consultor del PNUMA para el Proyecto GEFREPCar financiado por Fondo para el Medio Ambiente Mundial (GEF).
Las denominaciones empleadas en este documento y la forma en que aparecen presentados
los datos que contiene, no implican, de parte del PNUMA juicio alguno sobre la condición
jurídica de Estados, Territorios, ciudades o regiones, ni de sus autoridades, ni respecto de la
delimitación de sus fronteras o límites territoriales. Este documento contiene las
observaciones expresadas por los autores en su capacidad propia y no necesariamente refleja
las observaciones del PNUMA.
©2008 PNUMA
Programa Ambiental del Caribe
Kingston, Jamaica
Está publicación puede ser reproducida en su totalidad o en parte y en cualquier forma para
propósitos educacionales y no lucrativos sin permiso del autor, una vez que la fuente sea
mencionada. El PNUMA agradecería una copia de cualquiera publicación que use este
material como una fuente.
No debe usar esta publicación para la venta o para cualquier otro propósito comercial sin
contactar primero el PNUMA por escrito.
Para efectos bibliográficos este documento debe ser citado como:
PNUMA: Guia para el muestreo, preparación y análisis de contaminantes organicos en
muestras ambientales (agua, suelos/sedimentos y biota). Manual del Programa del
Monitorieo Costero del Proyecto GEF-REPCar. PNUMA Programa Ambiental del Caribe,
Kingston 2008.
Programa Ambiental del Caribe
Kingston, Jamaica
2
Índice de contenido
Pág.
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
INTRODUCCION ........................................................................................................ 1
OBJETIVO DEL PROGRAMA DE MONITOREO COSTERO ................................ 3
DISEÑO DEL MUESTREO ........................................................................................ 3
AREAS DE ESTUDIO................................................................................................. 5
4.1 Colombia .......................................................................................................... 5
4.2 Costa Rica ......................................................................................................... 7
4.3 Nicaragua .......................................................................................................... 9
TOMA DE MUESTRAS .............................................................................................. 10
5.1 Consideraciones generales................................................................................ 10
5.2 Preparación previa al muestreo ........................................................................ 16
5.3 Criterios para la toma de muestra ..................................................................... 21
5.4 Muestras de agua superficial ............................................................................ 21
5.5 Muestras de sedimentos superficiales .............................................................. 31
5.6 Muestras de biota: Bivalvos ............................................................................. 41
PROCESAMIENTO ANALITICO DE LAS MUESTRAS......................................... 48
6.1 Interferencias .................................................................................................... 48
6.2 Requerimientos de control de calidad .............................................................. 50
6.3 Extracción y limpieza de muestras de agua ...................................................... 51
6.4 Extracción y limpieza de muestras de suelos/sedimentos y biota .................... 65
6.5 Determinación cuantitativa de plaguicidas por cromatografía de gases con
detector de captura electrónica ......................................................................... 73
6.6 Determinación cuantitativa de insecticidas carbamatos por cromatografía
líquida de alta resolución .................................................................................. 97
6.7 Determinacion de herbicidas triazinas por cromatografía de gases con
detector de espectrometría de masas ................................................................ 102
6.8 Calibración y cálculos ...................................................................................... 110
6.8.1 Preparación de las disoluciones de siembra (estándares de
recuperación, internos y enriquecimiento) ........................................... 110
6.8.2 Preparación de las disoluciones de calibración .................................... 117
6.8.3 Secuencia analítica ............................................................................... 122
6.8.4 Curvas de calibración ........................................................................... 124
6.8.5 Ejemplos de cálculos ............................................................................ 129
6.9 Reporte final de concentraciones...................................................................... 135
REFERENCIAS ........................................................................................................... 140
i
Introducción
Índice de figuras
Figura
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Pág.
Red de estaciones para establecer la línea base del escurrimiento de plaguicidas
en la zona costera y marina del Caribe colombiano ..................................................... 6
Distribución de los cultivos de piña y banano en el Litoral Caribe de Costa Rica,
las flechas indican las cuencas dónde se muestrearán los puntos ................................ 8
Sitios de monitoreo marino-costero en Costa Rica ...................................................... 8
Cuencas seleccionadas para establecer la línea base del escurrimiento de plaguicidas
en la zona costera de Nicaragua ................................................................................... 9
Diagrama de flujo del tratamiento de muestras de agua en el campo .......................... 24
Toma de muestras de aguas en lugares pocos profundos ............................................. 25
Dispositivo simple para la toma de muestras de agua a un metro de profundidad ...... 27
Diagrama de flujo para la toma de muestras de sedimentos ........................................ 32
Diagrama de flujo del tratamiento de muestras de sedimentos en el campo ................ 37
Diagrama de flujo del tratamiento de muestras de bivalvos en el campo .................... 44
Diagrama de flujo del análisis de plaguicidas en muestras líquidas ............................ 56
Diagrama de flujo del análisis de plaguicidas en muestras sólidas .............................. 69
Insecticidas clorados por cromatografía de gases y detector de captura electrónica.... 88
Insecticidas contemporaneos por cromatografía de gases y detector de captura
electrónica. ................................................................................................................... 89
Herbicidas triazinas por cromatografía de masas ......................................................... 106
Índice de tablas
Tabla
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
ii
Pág.
Plaguicidas de aplicación actual y de uso en el pasado que han sido identificados
de interés para este proyecto ........................................................................................
Puntos de muestreo en las cuencas hidrográficas seleccionadas en Costa Rica...........
Equipamiento mínimo de muestreo ..............................................................................
Recipiente recomendado para muestras de agua y su procedimiento de limpieza .......
Métodos de preservación y tiempos máximos de almacenamiento recomendados
para muestras de agua...................................................................................................
Muestreadores de sedimentos de fondo ........................................................................
Recipiente recomendado para muestras de suelos/sedimentos y su procedimiento
de limpieza ...................................................................................................................
para muestras de suelos y sedimentos ..........................................................................
Identificación de bivalvos.............................................................................................
Recipiente recomendado para muestras de biota y su procedimiento de limpieza ......
5
7
19
29
30
34
39
41
42
46
11
12
para muestras de biota .................................................................................................. 47
Métodos de la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (U.S. EPA)
relevantes a este proyecto ............................................................................................. 49
Índice de tablas (cont.)
Tabla
13
14
15
16
Pág.
Requerimientos de control de calidad para el análisis cuantitativo de plaguicidas ...... 77
Iones de cuantificación y confirmación seleccionados para la determinación de
herbicidas triazinas y estándares correspondientes por espectrometría de masas ........ 107
Calificadores de uso común para caracterizar los datos ............................................... 135
Objetivos de precisión y exactitud de los análisis ........................................................ 136
iii
PRESENTACION
El uso intensivo de plaguicidas en la agricultura de países caribeños conlleva una creciente
preocupación relacionada al escurrimiento de éstos hacia aguas del Mar Caribe. Si bien el
clima tropical de la zona es favorable para la producción de una gran variedad de cultivos
como lo son entre otros banano, café, arroz, cacao, palma africana y piña, principales cultivos
de la región, también lo es para el establecimiento de plagas, lo que ha resultado en el uso de
insecticidas, fungicidas y herbicidas. Al ingresar al medio acuático marino, estos plaguicidas
pueden amenazar seriamente a los arrecifes coralinos y pastos marinos, comprometiendo
ambientes propicios para la reproducción de peces, y colocando en riesgo la importante
actividad turística de la región y la salud de la población.
Colombia, Costa Rica y Nicaragua inician el reto de disminuir el escurrimiento de
plaguicidas agrícolas al Mar Caribe, y así mejorar la calidad de aguas costeras y marinas, a
través de un programa de capacitación en Buenas Prácticas agrícolas y de monitoreo de
residuos de plaguicidas en la zona costera de los tres países. El proyecto se enfoca en el
estudio de plaguicidas de uso actual. El programa de monitoreo se concentra en muestras de
aguas territoriales y marino costeras, suelos/sedimentos y biota, e incluye plaguicidas más
persistentes como indicadores del alcance de un potencial escurrimiento.
La medición de contaminantes de interés para el proyecto GEF “Colombia, Costa Rica y
Nicaragua – Reduciendo el Escurrimiento de Plaguicidas al Mar Caribe - REPCar” debe
ser de una calidad tal que permitan la toma de decisiones adecuadas para la protección y el
uso sostenible de recursos del Mar Caribe. Esta guía describe, en forma detallada, desde el
diseño del muestreo, donde se incluye el tipo de matriz a tomar para buscar determinados
plaguicidas y la preparación del material para la toma de las muestras, hasta los cálculos
analíticos para la entrega del resultado al final de los análisis. En cada paso se orienta al
analista para lograr el objetivo principal de obtener resultados precisos y exactos.
v
Guía para el muestreo, preparación y análisis de contaminantes orgánicos en muestras ambientales …
1.
INTRODUCCION
Estudios científicos han comprobado que los arrecifes coralinos y los pastizales marinos del
Mar Caribe podrían estar seriamente amenazados por plaguicidas, colocando en riesgo la
importante actividad turística de la región, la salud de la población y comprometiendo
ambientes propicios para la reproducción de peces. Según indicadores económicos del World
Research Institute (Burke & Maidens, 2004), el valor de la degradación en curso de los
arrecifes coralinos será entre 350 y 870 millones de dólares al año si no se toman las medidas
necesarias. La toma de decisiones adecuadas para la protección y el uso sostenible de
recursos del Mar Caribe requiere de información confiable y de alta calidad que reflejen el
estado y tendencia de la salud del ecosistema. En respuesta a la necesidad de conocer los
efectos de las actividades antropogénicas sobre las condiciones ambientales, y la exigencia
de desarrollar estrategias administrativas para afrontar esas condiciones, Colombia, Costa
Rica y Nicaragua inician el reto de disminuir el escurrimiento de plaguicidas agrícolas al Mar
Caribe y así mejorar la calidad de aguas costeras y marinas con importantes aportes por parte
del Fondo para el Medio Ambiente Mundial (FMAM, mas conocido como GEF por su siglas
en Inglés) y otro tanto de los países participantes.
Esta iniciativa cuenta con amplia participación de productores agrícolas, gremios, diferentes
sectores de la sociedad civil y con la vinculación de Croplife América Latina, como
representante de la industria proveedora de insumos agrícolas, con sus aportes técnicos y
financieros. El proyecto inició sus actividades a principios de 2007 y tiene una duración
prevista de 4 años. El objeto de este ambicioso proyecto forma parte del protocolo sobre
fuentes terrestres de contaminación marina del Convenio de Cartagena (UNEP, 1983),
protocolo que aún no ha entrado en vigor por falta de numero de países ratificantes, ya que a
la fecha ha sido ratificado por los gobiernos de Panamá, Trinidad y Tobago, Francia, Saint
Lucia y Belice.
El proyecto “Colombia, Costa Rica y Nicaragua – Reduciendo el Escurrimiento de
Plaguicidas al Mar Caribe” contiene un número significativo de actividades. El proyecto,
que cuenta con el apoyo dl Fondo para el Medio Ambiente Mundial (GEF, por sus siglas en
inglés), contiene seis elementos mayores que son implementados por tres componentes y
varios subcomponentes. Los seis elementos son: 1) Monitoreo y Evaluación del Impacto; 2)
Transferencia de Tecnología y de Alternativas de Manejo; 3) Educación y Capacitación; 4)
Desarrollo de Incentivos; 5) Fortalecimiento Institucional; y 6) Manejo y Difusión de la
Información. Varios de estos elementos se combinan en el desarrollo de proyectos
demostrativos de producción limpia en fincas agrícolas, los cuales permitirán validar nuevas
tecnologías de manejo de plaguicidas y monitorear sus efectos. Los tres componentes del
proyecto son:
•
Componente 1: Coordinación del proyecto
•
Componente 2: Proyectos demostrativos
•
Componente 3: Institucionalización del mejoramiento del manejo de plaguicidas
y fortalecimiento de la capacidad para reducir el escurrimiento de
estos químicos.
1
Introducción
Este tercer componente del proyecto contempla, como subcomponente, mantener los
procesos de mejoramiento, identificados durante el desarrollo del componente 2, para la
reducción del escurrimiento de plaguicidas hacia el Mar Caribe y un programa de monitoreo
de plaguicidas en la zona costera establecido en los tres países, incluyendo la certificación, o
ampliación del número de parámetros ya validados o acreditados, en los tres laboratorios,
uno en cada país participante. Esta actividad suministrará la base del monitoreo a largo plazo
para las instituciones académicas y oceanográficas en la región. La capacidad de los
laboratorios locales de análisis serán mejorados con la adquisición de equipos y
capacitaciones, como parte del apoyo en el componente de monitoreo regional de zonas
costeras.
Para asesorar el programa de monitoreo costero y con el fin de guiarlo en la toma de
decisiones, se ha establecido un comité asesor. Este comité asesor está conformado por las
instituciones particpantes y cuatro unos expertos externos. Este comité asesor se reunió el
27-28 de marzo de 2008, como parte del Segundo Taller de Planificación del Programa de
Monitoreo Costero del proyecto GEF - REPCar. El objetivo de la reunión fue actualizar los
avances en el diseño del Programa de Monitoreo Costero de Plaguicidas, revisar las
capacidades de las instituciones participantes, definir las técnicas más convenientes para el
muestreo, seleccionar las matrices, compuestos y métodos de análisis a utilizar, control de
calidad a desarrollar, alternativas para el monitoreo en zona marina y completar el marco
general para este programa.
La medición de contaminantes de interés para el proyecto GEF REPCardebe ser de una
calidad tal, que los resultados puedan ser utilizados para la validación modelos de
simulación , la predicción de tendencias y el manejo de las situaciones que se presenten. Para
lograr estos objetivos, protocolos de control de calidad han sido integrados en este manual
para proporcionar a los profesionales de los países participantes la información necesaria
sobre la logística de toma de muestra y posterior análisis de éstas, incluyendo su control de
calidad, para asegurar procedimientos que cumplan con los objetivos del proyecto.
2
2.
OBJETIVO DEL PROGRAMA DE MONITOREO COSTERO
El objetivo del programa de monitoreo costero es monitorear y evaluar el escurrimiento de
plaguicidas al Mar Caribe. Si bien este programa se enfoca en el estudio de plaguicidas de
uso actual en la zona de estudio, se ha incorporado la determinación de plaguicidas más
persistentes, prohibidos o severamente restringidos en la actualidad, como indicadores del
alcance de un potencial escurrimiento. A través de este programa se busca establecer
información que sirva de línea de base a la contaminación por plaguicidas en zonas marinas y
costeras. En la medida de lo posible, se desea complementar esta línea de base con el
monitoreo del escurrimiento de plaguicidas en zonas específicas (cuencas hidrográficas), con
el fin de retroalimentar a los usuarios del sistema agrícola con esta información y así
promover un mejor uso de plaguicidas. La información generada por este programa servirá
como línea de base y, a largo plazo, como indicador del beneficio ambiental.
3
Diseño del Muestreo
3.
DISEÑO DEL MUESTREO
Para cumplir con los objetivos del proyecto de realizar una evaluación y alcance del
escurrimiento de plaguicidas hacia el Mar Caribe se requiere de metas específicas tales como
establecer valores de base en las zonas marino-costeras y en áreas específicas, como cuencas
hidrográficas, contra los cuales puedan medirse futuros cambios en los niveles de
contaminación en respuesta a un cambio en el manejo de plagas. Se destaca que, si bien este
proyecto se enfoca en el estudio de plaguicidas de uso actual en la zona de estudio, se ha
incorporado la determinación de plaguicidas más persistentes, prohibidos o severamente
restringidos en la actualidad, como indicadores del alcance de un potencial escurrimiento.
Las metas que se persiguen son:
•
Obtener muestras de agua, sedimentos marinos y biota (bivalvos) que permitan el
análisis de plaguicidas modernos y tradicionales (Tabla 1) y determinar sus
concentraciones.
•
Determinar el estado actual y la distribución geográfica de la contaminación en el
área de estudio.
•
Determinar y comparar el alcance del escurrimiento de plaguicidas modernos y
tradicionales en el área de estudio.
•
Establecer valores de línea de base que puedan ser utilizados como referentes a
cambios futuros en los niveles ambientales en respuesta a un cambio en las
prácticas de aplicación de plaguicidas.
Si bien el agua representa el medio de transporte principal y el punto de entrada de
contaminantes al medio marino para una posterior transferencia a sedimentos y biota, y que
la mayoría de los estudios toxicológicos en este medio se relacionan con los niveles
acuáticos, es sabido que las concentraciones en este medio son altamente variable debido a
procesos esporádicos, atmosféricos (e.g., lluvias, vientos), vertidos, etc. Estos fenómenos son
particularmente importantes en zonas costeras, donde una muestra de agua representaría una
lectura instantánea (muestra puntual) más que una representación del lugar, en contraste con
la situación en aguas más abiertas donde existe una mayor homogenización del medio. Por
este motivo, sumado a que las concentraciones en agua son generalmente bajas, la medición
de contaminantes orgánicos en agua no es comúnmente incluida en la mayoría de programas
de monitoreos. Sin embargo, y a pesar de lo expresado, en este proyecto se decidió la
inclusión del análisis de muestras de agua porque muchos de los analitos de uso actual y
reciente, y considerados de interés para este estudio, son prinicipalmente solubles en el
medio acuoso con posibilidades menores de acumulación en sedimentos y biota comparados
con los insecticidas clorados. Se considera que el análisis de las tres matrices (agua,
sedimentos, y biota) posibilitará una evaluación más completa del escurrimiento de los
analitos indicados en la Tabla 1 hacia aguas del Mar Caribe.
4
Tabla 1. Plaguicidas de aplicación actual y de uso en el pasado que
han sido identificados de interés para este proyecto
Fungicidas aromáticos
Clorotalonil
Herbicidas triazinas
Ametrina
Atraton
Atrazina
Prometon
Prometrina
Propazina
Secbumeton
Simetrina
Simazina
Terbutilazina
Terbutrina
Insecticidas carbamatos
Carbaril
Carbofurán
Oxamil
Insecticidas organofosforados
Clorpirifos
Diazinon
Fenamifos
Metil paratión
Insecticidas piretroides
Permetrina
Uracil herbicidas
Bromacil
Urea herbicidas
Diuron
Insecticidas organoclorados
Aldrin
alpha-clordano
Dieldrin
4,4'-DDD
4,4'-DDE
4,4'-DDT
Endosulfan I
Endosulfan II
Endosulfan sulfato
Endrin
Endrin aldehido
Endrin cetona
alpha-HCH
beta-HCH
delta-HCH
gamma-HCH (Lindano)
Heptacloro
Heptacloro epóxido
Metoxicloro
La lista de plaguicidas a monitorear fue establecida considerando las plaguicidas
comúnmente en uso en zonas costeras de Colombia, Costa Rica y Nicaragua. En función de
los resultados obtenidos en una primera evaluación se procederá a actualizar esta lista.
5
Areas de Estudio
4.
AREAS DE ESTUDIO
4.1. Colombia
En el Caribe colombiano, se realizará un primer muestreo en la zona costera, en 17
estaciones, seleccionadas por ser las que tienen mayor probabilidad de recibir descargas de
plaguicidas, según su cercanía a áreas de cultivos y plantaciones que usan agroquímicos; y
por ser en las que se han encontrado residuos de insecticidas clorados, de acuerdo a los
resultados obtenidos en el monitoreo de la Red de Vigilancia de la Calidad Ambiental Marina
en Colombia (REDCAM, Figura 1). Adicionalmente, se hará un crucero con el buque de
investigaciones B/I Ancón, en 14 estaciones ubicadas a 1 y 5 millas de la costa colombiana.
Estos muestreos se harán para establecer la línea base de escurrimiento de plaguicidas a la
zona costera y marina del Caribe colombiano.
Figura 1. Red de estaciones para establecer la línea base
del escurrimiento de plaguicidas en la zona
costera y marina del Caribe colombiano.
En las estaciones costeras se monitoreará la matriz agua dos veces al año por dos años, uno
en época seca y otro en época lluviosa. Sólo se tiene contemplado un crucero en las
estaciones oceánicas durante el primer año en la época lluviosa. La matriz de sedimento
superficial se tomará en las diferentes zonas durante la época lluviosa del primer y último
año. Tanto el primer muestreo costero como en el crucero, se llevarán a cabo durante el
6
segundo semestre del 2008, tratando de muestrear al inicio de la época seca. En las
estaciones costeras, se intentará la colecta de bivalvos.
4.2. Costa Rica
Costa Rica monitoreará estaciones en cuencas hidrográficas y en la zona marino costera
sobre el Caribe costarricense. En la Tabla 2 se describen los puntos de muestreo a monitorear
en las cuencas hidrográficas con una frecuencia mínima de muestreo en dos épocas
climáticas: lluvias y seca. En la Figura 2 se representa gráficamente la ubicación geográfica
de cada punto de muestreo.
Tabla 2. Puntos de muestreo en las cuencas hidrográficas seleccionadas en Costa Rica.
#
Sitios de
muestreo
1
La Jalava
2
Puerto Vargas
3
Río La Estrella a la
altura del puente
3
Barra del Río La
Estrella
4
Río Moín a la
altura del puente
5
Barra del Río
Matina
6
Río San Carlos
7
Río Sarapiquí
Descripción
del sitio
Latitud/
Longitud
Salida a mar
abierto de los
Canales de
Tortuguero
Entre la playa y
la cresta interna
de las olas que
sobrepasan el
arrecife coralino
Debajo del
puente carretera
a Cahuita
En la
desembocadura
10°21’08.9” N
83°23’27.8” W
Agua (3)
Sedimentos (3)
Organismos (3)
Dos (época de lluvias
y época seca)
09°44’10.8” N
82°48’39.2” W
Agua (3)
Sedimentos (3)
Organismos (3)
y época seca)
09°47’13.3” N
82°54’54.6” W
Sedimentos (3)
y época seca)
09°47’48.0” N
82°53’48.0” W
y época seca)
Debajo del
puente, por la
escuela
100 m antes de la
desembocadura,
borde sur
09°59’54” N
83°04’49.5” W
Agua (3)
Sedimentos (3)
Organismos (3)
Agua (3)
Sedimentos (3)
Organismos (3)
Agua (3)
Sedimentos (3)
Organismos (3)
Agua (3)
Sedimentos (3)
Organismos (3)
Agua (3)
Sedimentos (3)
Organismos (3)
y época seca)
En
desembocadura
al Río San Juan
En
desembocadura
al Río San Juan
10°06’48.4” N
83°11’30.6” W
Matriz
(cantidad de
muestras)
Frecuencia
mínima de
muestreo
y época seca)
y época seca)
y época seca)
7
Areas de Estudio
Figura 2. Distribución de los cultivos de piña y banano en el
Litoral Caribe de Costa Rica, las flechas indican las
cuencas dónde se muestrearán los puntos.
Los puntos en los cuales se tomarán sedimentos marinos superficiales en el primer muestreo
son: en el mar frente a las desembocaduras de los ríos Parismina, Matina, La Estrella y frente
al Muelle de Moín y a Limoncito (Figura 3). Los sitios a muestrear en el segundo muestreo
dependerán de los resultados obtenidos en el primero. En estos sitios se intentará la colecta
de bivalvos.
8
Figura 3.
Sitios de monitoreo marino-costero en Costa Rica
4.3. Nicaragua
El monitoreo estará enfocado en lagunas costeras, desembocaduras de los ríos y cuencas
hidrográficas. El Comité de Coordinación Nacional, propuesto por el Centro para la
Investigación en Recursos Acuáticos de la Universidad Autónoma de Nicaragua
(CIRA/UNAN), ha seleccionado las siguientes cuencas tomando en cuenta los cultivos
presentes en ellas (Figura 4):
•
Cuenca 61: Río Escondido que drena a la Bahía de Bluefields (Región
Autónoma Atlántico Sur).
•
Cuenca 63: Entre río Escondido y río Punta Gorda, que también drena a la Bahía
de Bluefields (Región Autónoma Atlántico Sur).
•
Cuenca 45: Río Coco que fronteriza con Honduras y drena a la esquina noroeste
de Nicaragua (Región Autónoma Atlántico Norte).
9
Areas de Estudio
Figura 4. Cuencas seleccionadas para establecer la línea base
del escurrimiento de plaguicidas en la zona costera
de Nicaragua.
Se realizarán mínimo dos mustreos anuales, uno en época seca y otro en época de lluvia. Los
sitios de monitoreo pueden ser ajstados en función de los resultados obtenidos en el primer
muestreo.
10
5.
TOMA DE MUESTRAS
Este manual proporciona una detallada descripción de la logística y procedimientos de
muestreo en el campo; sin embargo, la toma actual de muestras depende de un número
imprevisible de factores naturales y de la logística que pueden requerir la modificación de los
procedimientos descritos aquí, tales como factores relacionados, por ejemplo, con las
condiciones atmosféricas, acceso a la estación de muestreo, variaciones extremas de marea y
ciclos diurnos.
5.1. Consideraciones generales
El programa de control de calidad en el campo es un proceso sistemático el cual,
conjuntamente con el programa dedicado a este fin en el laboratorio y posterior reporte,
asegura un grado específico de confianza en los resultados generados durante un estudio
ambiental.
La calidad de los datos generados en el laboratorio depende en gran medida de la integridad
de las muestras que arriban al laboratorio. De esta manera, la mayor fuente de errores en el
análisis de muestras ambientales reside en una mala práctica en la toma de muestra. Los
factores a considerar durante este procedimiento son:
•
•
•
•
•
La seguridad personal de quienes toman las muestras
La obtención de una muestra representativa según su análisis
La prevención de la contaminación de la muestra
El mantenimiento de documentación legal
La protección de la muestra de cambios químicos, físicos y biológicos antes de su
análisis
Seguridad personal
Se deben evitar toda situación donde se ponga en peligro la seguridad personal. Por
seguridad, la operación de toma de muestra debe hacerse, como mínimo, en pareja y
utilizando el vestuario adecuado. Condiciones de mareas extremas y falta de luz para
continuar con las tareas de muestreo son, por ejemplo, situaciones de preocupación en cuanto
a la integridad de las personas. En ocasiones, tormentas severas y condiciones
meteorológicas locales pueden ser motivo de la suspensión de las operaciones de muestreo.
Finalmente, el personal encargado de la toma de muestra debe utilizar el equipo adecuado no
sólo para protegerse durante la práctica del muestreo sino también para evitar contaminar la
muestra que se está recogiendo.
Registros de actividades
El mantenimiento de una documentación (e.g., notas de campo) adecuada antes, durante y
después de la toma de muestra es siempre aconsejable ya que, en ocasiones, un registro
exacto de las actividades realizadas puede ayudar a resolver cualquier duda que exista con
respecto a la muestra. Un libro debidamente encuadernado y, preferentemente, con páginas
protegidas contra la acción del agua debe documentar, en detalle, toda actividad realizada en
11
Toma de Muestras
el lugar relacionada con la toma de muestra. Información que debe registrarse incluye, como
mínimo, hora y fecha de la recolección de la muestra, nombres de las personas que realizan la
actividad, adecuada identificación de los recipientes, lista de muestras obtenidas,
preservantes utilizados, muestras relacionadas con el control de calidad de la actividad,
estado del tiempo y condiciones del lugar. Todo registro debe hacerse con tinta indeleble y
las correcciones necesarias se deben hacer trazando una línea sobre la anotación incorrecta,
agregando las iniciales de la persona y la fecha en que se hace la corrección. La descripción
completa del lugar de muestreo puede ser complementada con fotos tomadas in situ. Una
buena documentación fotográfica es la mejor manera de asegurar que cada sitio de muestreo
es identificado correctamente.
Uno de los documentos más importantes a mantener es la cadena de custodia. Esta forma
documenta la historia de la muestra desde su toma hasta su ingreso al laboratorio. La cadena
de custodia describe la muestra, quien fue la persona que realizó la toma y el tipo de
recipiente utilizado, incluyendo dónde y cúando la muestra fue tomada. La hoja de registro
tiene, además, lugares para registrar la firma, fecha y hora cuando la muestra pasa de mano
en mano hasta su llegada al laboratorio. De manera similar, y como continuación de la
documentación de campo, se debe contar con otro registro donde conste el recorrido de la
muestra desde su ingreso al laboratorio hasto el reporte de resultados.
Toda documentación relacionada con la operación de muestreo y el posterior análisis de las
muestras es importante y debe archivarse apropiadamente aún hasta después de finalizado el
estudio.
Integridad
Todas las muestras deberán estar identificadas de forma inequívoca. Los recipientes donde se
colocan las muestras deben ser marcados correctamente al momento de tomar las mismas.
Siempre que sea posible, el marcado se realizará directamente sobre el recipiente de la
muestra o mediante el uso de una etiqueta engomada. La etiqueta debe ser resistente al agua
y debe mostrar, en tinta indeleble, el nombre de la persona que realizó la toma de muestra,
fecha, hora y lugar exacto en donde la muestra fue recogida, preservantes agregados, tipo de
análisis a realizar y código identificatorio único de la muestra.
Para asegurar la integridad de las muestras, puede ser necesario contar con un lugar de
almacenamiento de acceso limitado o controlado. La cadena de custodia es el documento
principal relacionado con la integridad de la muestra y registra cada persona que tiene
contacto con la misma y el tiempo por el cual es responsable de ella.
Representatividad
En principio, no existe una muestra única que represente fehacientemente al sistema que se
estudia y, por limitaciones propias del laboratorio, sólo es posible analizar una pequeña
porción del mismo y extrapolar el resultado. Por este motivo, se han desarrollado diferentes
diseños de muestreos en un intento de lograr muestras lo más representativas posible. Varios
12
contaminantes ambientales (e.g., hidrocarburos, plaguicidas) pueden solamente ser
analizados en muestras individuales y la representación del sistema se logra con la toma
repetitiva de muestras sobre un período de tiempo y promediando o analizando los
resultados.
El concepto de muestreo múltiple con el objeto de obtener una información integral de la
zona de estudio se puede formalizar dentro de una serie de variables. Estas variables puede
ser, por ejemplo, el tiempo, donde las muestras son tomadas en el mismo lugar en intervalos
regulares de tiempo, o el espacio, donde las muestras son tomadas a distancias regulares ya
sea en forma vertical u horizontal. Estas muestras pueden ser recogidas en las mismas
condiciones, almacenadas y analizadas individualmente para caracterizar un área o pueden
ser combinadas en una sola para formar una muestra representativa de donde se analiza una
submuestra.
Recipientes
Los recipientes donde vayan a contenerse las muestras deberán estar perfectamente limpios,
secos, adecuados y libres de contaminantes que puedan interferir con los análisis. La
selección del material equivocado, donde la muestra se pone en contacto con superficies
potencialmente reactivas, adsorbentes o contaminantes es una de las causas de error
sistemático más común.
El tipo de recipiente a elegir, generalmente de vidrio borosilicato o de polietileno de alta
densidad (HDPE, por sus siglas en inglés), depende del tipo de muestra y de análisis que se
vaya a realizar. Estos recipientes, que deben limpiarse en el laboratorio previamente a la
toma de muestra o adquirirse certificados libres de contaminantes, deben ser de un tamaño
apropiado para contener una cantidad suficiente de muestra para realizar los análisis
planeados, incluyendo las muestras de control de calidad asociadas tales como duplicados y
muestras enriquecidas. Una vez tratados, los recipientes destinados a contener muestras
ambientales para el análisis de contaminantes orgánicos deben mantenerse en un lugar
protegido que no comprometa su integridad. Las muestras para plaguicidas son normalmente
mantenidas en recipientes de vidrio con tapas protegidas internamente con una lámina de
teflón.
Para el almacenamiento de las muestras de aguas pueden utilizarse botellas oscuras (color
ámbar) de disolventes, las que no deberían haber sido re-utilizadas en el laboratorio (e.g.,
para contener desechos, preparar o contener disoluciones, etc.), mantenidas cerradas con sus
tapas originales y acumuladas en un lugar protegido de posibles fuentes contaminantes.
Preservantes
Los preservantes son utilizados para mantener la integridad química de las muestras y deben
ser de una calidad que no interfiera con los análisis planeados. La mayoría de las muestras
sólidas (e.g., suelos, sedimentos y biota) requieren solamente de una temperatura por debajo
del punto de congelamiento para conservarlas mientras que muestras líquidas (e.g., aguas)
pueden necesitar distintos tipos de aditivos, tales como ácidos o bases, agregados para
13
Toma de Muestras
controlar el pH dependiendo del tipo de análisis, y refrigeración. Generalmente, las muestras
de aguas destinadas al estudio de contaminantes orgánicos semivolátiles son mantenidas,
preferentemente en botellas oscuras, a una temperatura baja (4oC), con o sin el agregado de
preservantes, hasta su análisis en el laboratorio. La preservación de muestras destinadas al
análisis de contaminantes orgánicos está relacionada con el tiempo de almacenamiento.
Transporte y tiempo de almacenamiento
El tiempo transcurrido entre la toma de muestra hasta su análisis en el laboratorio es de una
importancia crítica ya que, independientemente del tipo de conservación utilizada, existe la
posibilidad de una degradación de los compuestos de interés con el tiempo. Es recomendable
que las muestras se envíen al laboratorio dentro de las 24 horas de tomadas donde deberán
ser almacenadas adecuadamente y de acuerdo al tipo de muestra y análisis.
El tiempo máximo de almacenamiento de muestras destinadas al análisis de compuestos tanto
orgánicos como inorgánicos ha sido motivo de preocupación y existen en la literatura una
variedad de tablas y gráficas que sugieren los tiempos de almacenamiento máximos para
distintas muestras y tipos de análisis; parte de esa información es resumida en las secciones
correspondientes a los tipos de muestras. El tiempo de almacenamiento indicado en la
literatura y en métodos oficiales es variable y, con frecuencia, conflictivo aunque sirven de
guía para realizar los análisis dentro de un lapso de tiempo que no comprometa la integridad
de la muestra.
Control de calidad en el campo
Cuando se esperan concentraciones bajas de contaminantes orgánicos, es particularmente
importante analizar distintas muestras que ayuden a evaluar la calidad de los procedimientos
de muestreo. Por ejemplo:
14
•
Blancos: Consiste en colocar agua libre de contaminantes orgánicos en un
recipiente, similar al destinado a contener la muestra, con el agregado de los
preservantes que se van a utilizar, llevada al campo y regresada al laboratorio para
ser analizada con las muestras regulares. Esta muestra en blanco sirve para
evaluar la calidad de los recipientes, pureza de los preservantes y el potencial de
contaminación in situ.
•
Blancos de equipos de muestreo: Consiste en recoger el lavado de los equipos
en el campo con un disolvente orgánico inmediatamente antes de la toma de
muestra y el envío de este líquido al laboratorio para su análisis. Se controla, de
esta manera, si el equipo de muestreo está adecuadamente descontaminado entre
toma de muestras.
•
Blancos de transporte: Este tipo de blanco es de particular importancia en el
estudio de compuestos volátiles. Uno de los recipientes destinados para contener
las muestras es transportado al campo, expuesto a las condiciones existentes
durante la toma de muestra y enviado de regreso al laboratorio para ser analizado
como una muestra normal. Sirve para evaluar el potencial de contaminación in
situ y durante el transporte.
•
Duplicados de campo: Consiste en la toma de una muestra regular dividida en
dos o más recipientes para su análisis como muestras regulares. Se controla de
esta manera la consistencia de la técnica de muestreo y posterior análisis. Este
tipo de muestras no debe confundirse con muestras duplicadas, las cuales son
muestras recogidas mediante dos eventos de muestreo distintos en el mismo sitio
y sirven para evaluar, mediante el análisis en el laboratorio, la variación natural en
la concentración de contaminantes presente en el área de estudio.
5.2. Preparación previa al muestreo
Consideraciones logísticas
Se recomienda un equipo de dos o tres personas como mínimo, por seguridad, para realizar la
toma de muestras (agua, sedimentos y biota). En áreas marinas poco profundas, es posible
alcanzar el sitio de muestreo caminando hasta pasar la zona de rompimiento de olas, para
evitar la contaminación por sedimentos en suspensión, o llegar a la parte media de ríos y
arroyos, si la profundidad lo permite. En áreas marino costeras de profundidad media se
deberá acceder al sitio utilizando una pequeña lancha a motor o remo. En áreas más
profundas, se necesitará una embarcación de mayor porte para acceder al lugar de toma de
muestra y equipos especializados. Durante el ejercicio de toma de muestra, se deberá incluir,
como mínimo, una descripción completa del sitio, incluyendo manera de acceso, posición
geográfica (latitud-longitud), día, fecha y hora del muestreo, tipo de muestra, información
sobre el tipo de recipiente que la contiene, método de muestreo utilizado, quién realizó la
toma de muestra y, para sedimentos, cualquier otra información que se considere pertinente
(e.g., olor, color, textura, presencia de organismos, plantas, piedras, etc.).
Son varios los factores a considerar al planear el cronograma de toma de muestras para el
proyecto y la logística para llevarlo a cabo:
•
La toma de muestras debe realizarse en forma sincronizada entre los países
participantes: Colombia, Costa Rica y Nicaragua.
•
De ser posible, la fecha de toma de muestra en cada sitio debe ser mantenida en
muestreos sucesivos (±1 semana) con el propósito de minimizar variables
temporales (e.g., cambio de dirección de los vientos, cambios de circulación del
agua, épocas más o menos lluviosas, etc.).
•
De existir una amplitud de mareas importante, la recolección de bivalvos en la
mayoría de los sitios costeros deberán accederse durante un periodo de marea
baja. El responsable del equipo de muestreo deberá obtener esta información.
•
El acceso a ciertos lugares que típicamente presentan un mar de mucha energía o
que requieren luz diurna para trabajar, deberán planearse cuidadosamente para
evitar accidentes. El responsable del equipo de muestreo deberá determinar el
mejor momento para tomar la muestra sin riesgos para su gente.
15
Toma de Muestras
•
En presencia de una tormenta o condiciones de tiempo severas, las operaciones de
muestreo deberán suspenderse completamente. El responsable del equipo de
muestreo, en consulta con el encargado del proyecto, puede dar prioridad a la
toma de muestras en otros sitios hasta que las condiciones en el sitio original
mejoren.
•
El encargado del equipo de muestreo deberá recopilar la información relacionada
al acceso a marinas o facilidades que permitan colocar el bote en el agua.
•
Artículos como el hielo y los contendores no siempre son fáciles de obtener en el
campo. El encargado del equipo de muestreo será responsable de asegurar que el
grupo tenga suficiente disponibilidad de ambos.
Responsabilidades
•
El encargado del equipo de muestreo, en colaboración con su gente, será
responsable de llevar a cabo la toma de muestras de manera segura y eficiente.
•
El encargado del equipo de muestreo será responsable de la localización
apropiada del sitio de muestreo.
•
El encargado del equipo de muestreo será responsable de su gente, de los
elementos de muestreo y la recolección de muestras acorde con los objetivos del
proyecto. Cada miembro del equipo, sin embargo, será responsable de las
actividades y equipamiento que le son asignados.
Accesos y permisos
Es posible que para acceder a algunos sitios de toma de muestra (e.g., propiedades privadas,
gubernamentales, zonas protegidas o parques nacionales) o para tomar la muestra se necesite
un permiso.
16
•
El permiso inicial para acceder a sitios restringidos será responsabilidad de la
dirección del proyecto; sin embargo, cada miembro del equipo será responsable
de confirmar la accesibilidad antes de ingresar.
•
Si el acceso a una propiedad privada fuese negado o revocado, el encargado del
equipo de muestreo deberá contactar inmediatamente al encargado del proyecto.
Todos los miembros del equipo de muestreo deberán evitar toda confrontación y
hacer todo lo posible para representar a su institución de una manera positiva y
profesional.
•
El responsable del proyecto deberá obtener, si es necesario, el permiso
correspondiente para la toma de muestra en áreas protegidas. Será responsabilidad
de todo el equipo de muestreo cumplir con las instrucciones y regulaciones del
permiso, incluyendo consultar con autoridades locales antes de realizar las
operaciones de muestreo, y de conocer las prohibiciones sobre el uso de ciertos
equipos de muestreos, tales como dragas, en arrecifes coralinos o en sus
proximidades.
Equipamiento de campo
La elaboración de una lista control de todo el equipamiento de campo necesario para el
muestreo asegurará que cada grupo cuente con los materiales mínimos necesarios para
realizar la toma de muestra de manera precisa y eficiente (Tabla 3).
Todo instrumento de muestreo deberá ser descontaminado previo a la toma de muestra como
espátulas, palitas, cucharas, etc., las cuales se utilizarán para la transferencia de muestra del
muestreador al recipiente, y deberán mantenerse limpias, lavadas con disolventes y envueltas
en papel de aluminio hasta su uso y deberán descontaminarse entre tomas de muestras.
Tabla 3
Equipamiento mínimo de muestreo
Cepillo de fibra natural
Pico pequeño o martillo de geólogo
Procedimientos operativos de toma de muestras
Recipientes libres de contaminantes orgánicos(1) y
tapa con interior de teflón para sedimentos, agua y
biota
Papel de aluminio libre de
contaminantes orgánicos(2)
Cámara digital
Planillas/registro de muestreo incluyendo un
listado de muestras necesarias
Equipo de primeros auxilios
Medidor manual de conductividad
Posicionador Global Satelital(GPS, por sus siglas
en inglés) portable con su manual
Disolventes orgánicos
(diclorometano, metanol)
Cartas náuticas
Material de oficina (lápices, marcadores
indelebles, cinta engomada, etc.)
Cuchillo para bivalvos
Toallas de papel
Fotografías e información del sitio
(si existiesen de muestreos previos)
Equipo de seguridad (cuerdas, chalecos
salvavidas, botas, etc.)
(1)
(2)
Refractómetro
Hielo regular o artificial
Botellas de salinidad
Hieleras (grandes y pequeñas)
Manual del muestreo
Permisos de muestreo
Guante de hilos metálicos para bivalvos
Etiquetas preimpresas con información
completa
Baldes de metal
(10 y 20 litros)
Botellas de teflón o plástico de alta
densidad para disolventes orgánicos
Muestreador de sedimentos
Palita metálica o de teflón para sedimentos
Termómetro
Radio VHF con su antena o equipo de
comunicación
Bolsas plásticas tipo “Ziplock”
(0,5, 1, 4 y 8 litros)
Etiquetas impresas
Si el recipiente es de vidrio puede ser calcinado a 440oC por 4 horas; si el recipiente es de
plástico debe ser lavado con agua/detergente libre de fosfatos y enjuagado con disolventes.
Calcinado a 440°C por 4 horas
17
Toma de Muestras
Responsabilidades
•
Es responsabilidad de todo el equipo de campo asegurar que el instrumental de
muestreo esté en excelente condiciones de trabajo y listo para ser utilizado.
•
El grupo encargado de la recepción de las muestras será responsable de la
preparación de todo el material necesario para la preservación de las muestras
(e.g., papel de aluminio y recipientes libres de contaminantes orgánicos,
disolventes, etc.) a pedido del encargado del muestreo.
•
Cada miembro del equipo de muestreo será responsable de asegurar que todos los
preparativos para las operaciones de campo estén finalizados antes de llegar a la
estación.
•
La dirección del proyecto será responsable de implementar los cursos de
entrenamiento dónde y cuándo sean necesarios. Por ejemplo, se espera que el
personal de muestreo esté familiarizado con las actividades de navegación
básicas, preparado para afrontar condiciones atmosféricas adversas o fallas
mecánicas, y capacitado para solucionar imprevistos en las actividades de
muestreo.
Lanchas y embarcaciones
Para estaciones costeras, se recomienda que el encargado del muestreo seleccione a un
miembro de su equipo para compartir la responsabilidad de asegurar el mantenimiento y el
buen funcionamiento de las lanchas y embarcaciones antes de su uso en el campo, si éstas no
tienen un personal asignado. Un segundo integrante deberá estar encargado de controlar, o
verificar con la persona responsable, el funcionamiento apropiado del equipamiento de a
bordo (e.g., Posicionador Global Satelital, radios, teléfonos, guinches o plumas para dragas,
etc.). La lancha o embarcación deberá ser probada en el agua antes de salir hacia la zona de
muestreo. Es responsabilidad del encargado del grupo de muestreo conseguir cartas náuticas
actualizadas de la zona de trabajo e información referente al pronóstico del tiempo para
decidir si la operación de muestreo puede realizarse o no. Es aconsejable que todos los
miembros del equipo estén familiarizados con técnicas de primeros auxilios y reanimación
cardiopulmonar (CPR, por sus siglas en inglés) y capacitados para operar la embarcación en
caso de emergencia. Todo incidente, accidente y/o recomendaciones relacionadas con la
seguridad en el campo deberá inmediatamente comunicarse al encargado del proyecto.
En el caso de estaciones localizadas en aguas más profundas o alejadas de la costa o lugar
donde se encuentra la rampa de acceso, será necesario utilizar una embarcación mayor con
personal profesional a cargo (e.g., buque oceanográfico, pesquero, naval).
18
5.3. Criterios para la toma de muestra
Definición de Sitio y Estación
•
El sitio se define como la unidad geográfica muestreada y se selecciona de
manera tal que sea representativo del área de estudio.
•
Dentro de cada sitio, se deberán recoger muestras de tres estaciones
independientes con el propósito de caracterizar espacialmente al sitio.
•
La latitud y longitud correspondientes al sitio se medirán a un punto equidistante
a ambos extremos o en el centro del círculo de muestreo según sea el caso:
•
9
Las estaciones extremas, localizadas a lo largo de la costa, deberán estar
comprendidas en una distancia no mayor de 50 metros lineales del punto
equidistante.
9
Para estaciones localizadas frente a la boca de un rio, éstas deberán estar
ubicadas inmediatamente hacia la izquierda, al centro y hacia la derecha de
la desembocadura.
9
Las estaciones en mar abierto deberán estar comprendidas dentro de un
círculo de 400 metros de radio.
Cada sitio deberá ser identificado con un código predeterminado que identifique
su posición.
5.4. Muestras de agua superficial
Los sitios de muestreos pueden estar localizados en zonas cercanas a la costa o en aguas más
profundas. En general, las muestras tomadas en cercanía de la costa detectan cambios
rápidos, en una escala de horas o días, y mayormente asociados a procesos en tierra mientras
que muestras tomadas en sitios más alejados y profundos, representan una situación
resultante de una escala de tiempo mucho más amplia (semanas o meses). Debido a esto, es
importante que la posición predeterminada de los sitios de muestreos sean mantenidos sin
cambios excepto que existan condiciones que representen un peligro para el personal
encargado de tomar la muestra.
1
Documentación del lugar
Para asegurar que las muestras en los dos años de duración del proyecto sean recolectadas en
el mismo sitio, o como referencia para otros proyectos, el lugar en donde se realiza la toma
de muestras debe ser debidamente documentado utilizando una combinación de Posicionador
Global Satelital (GPS, por sus siglas en inglés) y notas, y archivados con ese propósito. La
toma de muestras en cada una de las tres estaciones de un sitio predeterminado deberá ser
documentada in situ y debe contener, como mínimo, la siguiente información:
•
Fecha y hora de la toma de cada muestra
•
Nombre del sitio y código de la estación
19
Toma de Muestras
•
Coordenadas del Posicionador Global Satelital (latitud, longitud) correspondientes
al sitio expresadas como: 12°28'58.9” N, 79°48'22.9” W
•
Temperatura y salinidad del agua de mar
•
Descripción del sitio y, si es costero, del lugar de acceso al mismo (e.g., rampa de
lanchas). Indicar si se toman fotografías
•
Técnica de muestreo utilizada y tipo de muestras tomadas
•
Descripción de la muestra (agua = olor, turbiedad, presencia de espuma, etc.;
sedimento = olor, color, textura, etc.; biota = cantidad, tamaño aproximados, etc.),
incluyendo recipiente utilizado y código único de la muestra
•
Datos hidrográficos y meteorológicos (dirección y velocidad de marea, estado del
mar, profundidad, porcentaje de nubes, velocidad y dirección del viento).
•
Incluya cualquier otra información que considere relevante, ya sea referente al
sitio/estaciones de muestreo o a un evento ocurrido a bordo que pudiera haber
comprometido la muestra
•
Nombre y firma de la persona que tomó la muestra
Si la forma donde se registra la información es extraviada o resulta dañada (e.g., anotaciones
ilegibles), las personas que realizaron la toma de muestra deberán hacer un intento de recrear
la información perdida y notificar inmediatamente al responsable del grupo.
Es importante que la posición predeterminada de los sitios de muestreos sea mantenida sin
cambios excepto que las condiciones presentes en el mismo al momento del muestreo (e.g.,
atmosféricas, circulación) representen un peligro para el personal encargado de tomar la
muestra. En este caso, se procederá a localizar un sitio alternativo y a documentar la
información correspondiente.
Recolección de la muestra
Los siguientes procedimientos deberán ser seguidos para obtener las muestras de agua
subsuperficiales. La Figura 5 esquematiza los detalles de la toma de muestras, para
insecticidas clorados, fosforados y triazinas e insecticidas carbamatos, respectivamente.
Es preferible recoger la muestra directamente en el recipiente en el cual se almacenará y
trasladará al laboratorio. Es importante que el recipiente ya venga limpio del laboratorio y no
se enjuague con el agua del lugar ya que esto podría dejar una película contaminante en el
interior del recipiente. El recipiente debe ser identificado con información del sitio de
muestreo, nombre del operador, fecha, hora y análisis a realizar. De ser posible, es preferible
disponer de etiquetas preimpresas con parte de esta información (e.g., sitio de muestreo y
análisis a realizar). Los siguientes procedimientos deberán ser seguidos para obtener las
muestras de agua según sea el caso:
20
Figura 5. Diagrama de flujo del tratamiento de muestras de
agua en el campo
Sitios poco profundos (costero marinos o ríos/arroyos)
•
Localice el sitio predeterminado utilizando la información de coordenadas del
Posicionador Global Satelital. De preferencia, tome la muestra en un punto medio
de la corriente principal y donde la corriente es rápida; evite zonas pocos
profundas, con agua estancada o de muy poca circulación.
•
Obtenga una botella de 1 litro de capacidad previamente lavada y libre de
contaminantes orgánicos y con tapa recubierta interiormente con una lámina de
teflón y camine hacia la estación de muestreo. La misma deberá estar localizada a
una profundidad donde la resuspensión de sedimentos de fondo no contamine la
muestra.
•
Una vez alcanzada la estación, el operador se deberá posicionar frontalmente
hacia mar abierto, y detrás del área de rompimiento de olas, o en contra de la
corriente, en ríos y arroyos.
21
Toma de Muestras
•
Tome la botella por debajo de su cuello, sumérjala cerrada a través de la interfase
agua-aire (película superficial) hasta una profundidad intermedia entre superficie
y fondo (A en Figura 6). Una vez en posición, retire, con la mano libre, el tapón
desde atrás de la botella para evitar contaminación y oriente bien la boca hacia la
corriente (B). Mantenga su mano alejada del flujo.
•
Figura 6. Toma de muestras de aguas en lugares pocos
profundos
•
Una vez que la botella está llena, tápela inmediatamente desde atrás y sin quitar la
botella de su posición de muestreo (C) y retírela llevándola hacia arriba contra la
corriente (D). Asegúrese de cerrar bien la botella, coloque el envase en una bolsa
plástica para retener el líquido en caso de rotura o derrame accidental y acomode
en una hielera evitando que las botellas se toquen entre sí.
•
Asegúrese de registrar toda la información requerida en la etiqueta de la botella
(ver Etiquetado de las muestras).
•
En general, la literatura no menciona el uso de preservantes como un punto crítico
para asegurar la calidad y representatividad de la muestras de agua cuando
provienen de causes naturales. Es importante fijar el pH de acuerdo al tipo de
análisis a realizar (ver Figura 5) y mantenerlas en frío hasta su tratamiento en el
laboratorio, el cual debe realizarse dentro de los tiempos requeridos.
En lugares algo más profundos, donde se requiere una lancha para la toma de muestra, la
embarcación debe anclarse y esperar a que se posicione con la corriente. Si no es posible
anclar, la misma deberá mantenerse en posición contra corriente mediante el accionar del
22
motor o remos. En ambos casos, el operador de la toma de muestra se ubicará en la proa de la
embarcación, ligeramente inclinado hacia delante, y procederá a realizar el muestreo a unos
50 cm de profundidad siguiendo las indicaciones anteriores. Si se está muestreando desde
una embarcación evite hacerlo directamente en la zona de turbulencia generada por el
movimiento de la misma ya que puede remover sedimentos del fondo.
Sitios profundos
•
Posicionador Global Satelital.
Recoja agua a un metro de profundidad, cuidando de que la botella pase la
película superficial en posición cerrada. Utilice una botella de 1 litro como se
indicó anteriormente y utilizando un dispositivo simple, similar al que se muestra
en Figura 7, el que puede ser fabricado y arrojado desde la embarcación para este
propósito. Una botella de disolvente vacía y lastrada (ver detalle incluido) es
tapada suavemente, con tapón de teflón, y lanzada atada a una boya por medio de
Figura 7. Dispositivo simple para la toma de muestras
de agua a un metro de profundidad.
23
Toma de Muestras
una cuerda o soga de manera tal que, una vez en el agua, la boca de la botella
quede a una profundidad de 1 metro. Al extenderse la cuerda o soga, la botella se
abrirá para permitir la toma de muestra. La muestra deberá ser recogida de manera
tal que se evite la posible contaminación de la lancha o embarcación. Para esto se
deberá lanzar el muestreador corriente arriba y a una distancia que permita su
llenado antes de que llegue a la altura de la lancha o embarcación.
•
Tape inmediatamente y reemplace la botella del muestreador. Es conveniente que
en el muestreador se utilice la misma botella donde se almacenará la muestra ya
que el transvase de una a otra botella conlleva el peligro de contaminación
además de tener que lavar cuidadosamente con disolventes la botella del
muestreador entre muestras.
•
Asegúrese de cerrar bien la botella, coloque el envase en una bolsa plástica para
retener el líquido en caso de rotura o derrame accidental y acomode en una hielera
evitando que las botellas se toquen entre sí.
•
Asegúrese de registrar toda la información requerida en la etiqueta de la botella
(ver Etiquetado de las muestras).
•
Como se indicó anteriormente, la literatura no menciona el uso de preservantes
como un punto crítico para asegurar la calidad y representatividad de las muestras
de agua cuando provienen de causes naturales. Es importante fijar el pH de
acuerdo al tipo de análisis a realizar (ver Figura 5) y mantenerlas en frío hasta su
tratamiento en el laboratorio, el cual debe realizarse dentro de los tiempos
requeridos.
•
Proceda a la siguiente estación y repita los procedimientos de muestreo hasta que
se hayan trabajado todas las estaciones dentro del sitio, luego de lo cual se
procede al siguiente.
Manejo y tratamiento inicial de las muestras en el campo
Las muestras de agua serán procesadas in situ (fijación del pH), ya sea a bordo de la
embarcación o en tierra en el caso de que el acceso al sitio sea por este medio,
inmediatamente después de ser tomadas. Durante el procesamiento de las muestras evite
fumar o trabajar en áreas donde las muestras puedan contaminarse con las emisiones de
motores de combustión (e.g., automóviles).
Muestras de plaguicidas
Las muestras para el análisis de plaguicidas deberán ser colocadas y almacenadas en botellas
de vidrio de 1 L previamente tratadas para eliminar todo contaminante orgánico. Los
recipientes de vidrio pueden comprarse certificados libres de contaminantes orgánicos o
pueden tratarse en el laboratorio. Las botellas de vidrio pueden ser lavadas con agua y
detergente/jabón de laboratorio libre de fosfatos, enjuagadas secuencialmente con porciones
de distintos disolventes y puestas a secar antes de cubrir con su tapa protegida con película de
teflón en su interior (Tabla 4). Si se van a utilizar botellas color ámbar de disolventes para el
24
almacenamiento de las muestras de aguas es imprescindible que las mismas no hayan sido reutilizadas en el laboratorio (e.g., contener desechos, preparar o contener disoluciones, etc.),
mantenidas cerradas con su tapa original y acumuladas en un lugar protegido de posible
fuentes contaminantes. Es recomendable que estos recipientes ya vengan con la etiqueta y
código identificatorio de tipo de análisis, sitio y estación del laboratorio.
Tabla 4
Recipiente recomendado para muestras de agua y su procedimiento de
limpieza
Parámetro
Insecticidas clorados y
fosforados
Uracil & Urea
herbicidas
Matriz
Aguas
Recipiente
Recomendado
Procedimiento de limpieza
Botella de vidrio oscuro
de 1 L con tapa
protegida con lámina
interior de teflón
Lave tres veces con agua y
detergente libre de fosfatos, seguido
de tres enjuagues con agua libre de
compuestos orgánicos, una con
acetona de baja calidad, una con
acetona, dos con hexano, y dos con
diclorometano. Estos últimos
enjuagues con disolventes calidad
plaguicidas. Dejar secar destapado y
una vez seco, tapar con tapa con
interior protegido con película de
teflón.
Parámetros auxiliares
Las mediciones de parámetros auxiliares en agua (pH, temperatura y salinidad) serán
realizadas in situ en muestras tomadas para tal fin y nunca en la muestra reservada para los
análisis de plaguicidas. La muestra de salinidad deberá recolectarse a no menos de 50 cm de
la superficie para evitar determinaciones de salinidad que estén afectadas, por ejemplo, por
lluvias recientes o excesiva evaporación superficial. La salinidad puede ser medida in situ
utilizando un lector de conductividad manual o en el laboratorio. En el primer caso, siempre
es recomendable retener las muestras para que algunas sean controladas en el laboratorio
utilizando un salinómetro y asegurar de esta manera la calibración del instrumental manual.
Etiquetado de las muestras
Todos los envases de muestras deberán llevar etiquetas que indiquen el código de
identificación del sitio, número de estación, fecha y hora, tipo de análisis a realizar,
preservantes agregados e iniciales de la persona que tomó la muestra.
25
Toma de Muestras
Almacenamiento
Las muestras de agua para el análisis de plaguicidas deberán fijarse el pH y mantenerse
refrigeradas, no congeladas, a 4oC o conservadas en una hielera con suficiente hielo hasta su
regreso al laboratorio al final del día donde se almacenarán refrigeradas hasta su extracción y
análisis (Tabla 5).
Tabla 5. Métodos de preservación y tiempos máximos de almacenamiento
recomendados para muestras de agua
Parámetro
Insecticidas
clorados y
fosforados
Herbicidas
triazinas
Uracil & Urea
herbicidas
Insecticidas
carbamatos
Preservación
Tiempos máximos de almacenamiento
Enfriamiento a 4°C; pH = 6-8
Extracción en 7 días; análisis 40 días después de la
extracción.
Enfriamiento a 4°C; pH <4 con
H2SO4 o HCl
extracción.
Nota: Diazinon presenta inestabilidad en el medio acuoso por lo que si este compuesto es de interés, la muestra
debe ser extraída inmediatamente después de tomada.
Cadena de custodia
Al final del día, el equipo de muestreo deberá revisar las actividades realizadas durante la
jornada, marcando los sitios trabajados e indicando toda observación en las planillas que
consideren pertinente. Las muestras y todas las planillas, en este punto, serán transferidas a la
persona responsable de su custodia quien se encargará de su posterior distribución a los
diferentes grupos analíticos.
5.5. Muestras de sedimentos superficiales
El criterio para la toma de muestras de sedimentos se ilustra en la Figura 8 y se resume a
continuación:
•
26
El sitio deberá seleccionarse en un área que integre la contaminación de múltiples
fuentes en lugar de reflejar el aporte de un punto en particular. Sin necesidad de
realizar un estudio detallado, la selección adecuada de un sitio depende
principalmente de la evaluación previa de las fuentes de contaminación en el área,
circulación y profundidad en la zona y la experiencia del equipo de muestreo. En
general, sedimentos que están localizados a la salida de un efluente o en lagunas
pocos profundas, compuestas principalmente de efluentes, deberán evitarse ya que
no son sitios verdaderamente representativos del área y no obedecen al objetivo
del programa de monitoreo. En un área de buena circulación será suficiente
recolectar muestras en sitios alejados unos 300-500 metros de las fuentes de
contaminación conocidas.
•
Sólo sedimentos que tienen como mínimo un 20% de materiales finos (i.e., limos
y arcillas) deberán conservarse como muestras.
•
El personal de campo será responsable de decidir si el sedimento del sitio es
adecuado para su toma o si se deberá buscar un sitio diferente.
•
La toma de sedimentos deberá realizarse en áreas que nunca han sido expuestas al
aire durante períodos de marea baja y de baja energía que permita la deposición
de sedimentos finos.
•
Las muestras de sedimentos nunca deberán ser recogidas debajo de estructuras
artificiales (e.g., muelles) o de grandes rocas ni moviendo las mismas.
•
Si no se pueden localizar sedimentos que se consideren adecuados para su
recolección dentro del sitio preseleccionado, el encargado del equipo de muestreo
deberá comunicarse con la dirección del proyecto para una posible relocalización
del sitio.
•
Si se recogen muestras de agua o biota en el área, la muestra de sedimento deberá
estar expuesta a la misma masa de agua.
27
Toma de Muestras
Sitio de Muestreo
(3 estaciones por sitio)
Estación 1 - 3
¿Se observa
la presencia de >20%
de sedimentos
finos?
Si
No
Obtenga la
muestra de
sedimento
Seleccione una estación
alternativa dentro de un
radio de 400 metros
Proceda a
la siguiente
estación o sitio
No
¿Se observa
la presencia de >20%
de sedimentos
finos?
Si
No
Seleccione un sitio alternativo
dentro de un radio de 2 Km.
del sitio original
Figura 8.
Diagrama de flujo para la toma de muestras de
sedimentos
Ver sección 5.4 (Muestras de agua superficial, Documentación del lugar)
El objetivo del proyecto es estudiar el escurrimiento reciente de plaguicidas modernos, por lo
que la capa superficial de sedimentos no alterados deberá ser recolectada con cuidado en
cada una de las tres estaciones de cada sitio. Al elegir el sedimento a muestrear se deberá
tener presente que las concentraciones de contaminantes orgánicos son generalmente
mayores en sedimentos con altos porcentajes de materiales finos (e.g., alto contenido de
limos y arcillas).
28
En la colecta de muestras de sedimentos es importante considerar las características del
mismo, tales como su textura, consolidación y contenido de materia orgánica, para decidir el
equipo a utilizar (Tabla 6). Conocer las limitaciones de cada muestreador ante distintos tipos
de sedimentos es importante ya que algunos podrían disturbar más que otros una capa de
sedimentos muy finos. Similarmente, sedimentos consolidados requerirán la utilización de un
muestreador que posibilite una mayor penetración.
•
En aguas muy poco profundas (arroyos y ríos pequeños) los sedimentos serán
recolectados a mano utilizando una palita pequeña o cuchara de acero inoxidable
o teflón. El acercamiento al lugar debe realizarse en contra de la corriente para
evitar que el área se contamine con sedimentos resuspendidos en una zona distinta
de la que se quiere muestrear. Antes de cada uso, el utensilio deberá ser lavado
con detergente/jabón de laboratorio, libre de fosfatos, y agua, secado y enjuagado
tres veces con metanol seguido de diclorometano para remover cualquier residuo
orgánico. Los disolventes que se utilicen para estos enjuagues deben ser
recolectados en una botella y regresados al laboratorio para ser desechados acorde
a su política de tratamiento de desechos. En la toma de sedimentos muy finos, el
utensilio debe subirse lentamente tratando de evitar corrientes rápidas para evitar
la pérdida selectiva de estos materiales finos.
29
Toma de Muestras
Tabla 6. Muestreadores de sedimentos de fondo
Estos muestreadores están designados para recoger una muestra representativa de sedimentos de fondo. La
porción de sedimento que se recoge debe ser lo suficientemente profunda para evitar el mezclado de la capa
superficial. El mecanismo de cerrado es necesario para mantener el sedimento y evitar el lavado del mismo
durante la subida. La abertura en la parte superior de estos equipos no sólo permite el flujo de agua para lograr
así un acercamiento al fondo sin que se afecte por una onda de presión sino que también es el acceso directo a la
capa de sedimento superficial una vez a bordo.
El “Box-corer” o muestreador de caja es uno de los instrumentos
muestreadores de sedimentos más simples y comúnmente usados. En su
versión más grande, la caja de acero inoxidable del muestreador puede
contener un volumen de sedimento de 50cm x 50cm x 75cm
prácticamente sin disturbarlos. Una vez a bordo, la caja puede ser
retirada de la estructura y llevada al laboratorio para procesar (toma de
submuestras).
El tamaño de muestra es controlado por la velocidad en que el
muestreador es bajado hacia el fondo marino. Un fondo más firme
requiere de una velocidad mayor para obtener una muestra completa.
Una vez que el muestreador de caja ha tomado la muestra, la misma es
asegurada por el desplazamiento de dos compuertas que cubren
completamente el fondo de la caja.
La draga tipo van Veen es un muestreador relativamente liviano el
cual, posado suavemente sobre la superficie sedimentaria, está
designado a la toma de sedimentos suavemente compactados. Su
construcción de brazos largos, amplia superficie y bordes de penetración
afilados permiten la toma de grandes cantidades de sedimentos blandos
con mínima alteración de su superficie. Al retirarse, el cable de
recuperación actúa sobre los largos brazos del muestreador los que
penetran profundamente en el sedimento por debajo del mismo cerrando
su fondo y permitiendo la recuperación de la muestra.
30
Tabla 6. Muestreadores de sedimentos de fondo (cont.)
La draga Ekman está designada para la colecta de sedimentos suaves
en cuerpos de agua pocos profundos. A medida que la caja es bajada
hacia los sedimentos, dos puertas de metal en la porción superior se
abren para dejar pasar el agua; mismas que se cierran durante la
recuperación para evitar el lavado del sedimento. Una vez en el fondo,
un mensajero es lanzado por la línea y libera las dos cuchillas inferiores.
El muestreador puede también utilizarse con extensiones metálicas de
1,5 y 3,0 metros para su operación desde un bote en aguas someras.
El nucleador por gravedad (“Gravity Corer”) se opera desde una
embarcación relativamente mayor con un guinche adecuado para bajar y
subir el muestreador el cual puede ser bastante pesado. El muestreador
es lanzado verticalmente y las muestras son recogidas dentro de una
camisa plástica interior bajo la fuerza gravitacional que producen las
pesas del equipo. Este muestreador es simple, robusto y relativamente
confiable. La mayor desventaja es su peso.
•
En aguas poco profundas (ríos y zonas marino-costeras) los sedimentos deberán
recolectarse a mano utilizando una draga pequeña tipo “box-corer” o muestreador
de caja, operado desde una lancha, y una espátula o palita de acero inoxidable. Al
igual que en el caso anterior, el acercamiento al lugar debe realizarse en contra de
la corriente para evitar contaminar el área con sedimentos resuspendidos.
Similarmente, antes de cada uso, la draga y la espátula deberán ser lavadas como
se indicó anteriormente. Los disolventes utilizados deberán ser recolectados y
regresados al laboratorio para su disposición final. Con la espátula de acero
inoxidable se tomará el primer centímetro del sedimento, luego de observar que el
sedimento no haya sido agitado durante la operación, y se colocará en un
recipiente de vidrio de 500 mL previamente tratado y libre de contaminantes.
•
En aguas profundas (mar abierto) donde la toma de muestra en forma manual no
es posible, se deberá utilizar una draga tipo “box-corer” de mayor tamaño
operadas desde una embarcación de mayor envergadura. Alternativamente, se
podrán utilizar equipos nucleadores o muestreadores tipo draga “van Veen”.
Siempre se debe tener la precaución de retirar lentamente el “box-corer” o draga
“van Veen” del fondo para permitir el cerrado de las láminas inferiores. Una vez
31
Toma de Muestras
recogido el sedimento, sólo se debe retener el centímetro superior del sedimento.
Los mismos requerimientos y precauciones discutidos en el punto anterior deben
observarse aquí.
Los siguientes procedimientos deberán ser seguidos para obtener las muestras de sedimentos
superficiales (Figura 9).
32
•
Posicionador Global Satelital. En general, los sedimentos blandos, compuestos
mayormente de materiales finos, son fácilmente recolectados.
•
Utilice el tipo de muestreador y medio de acercamiento más apropiado de acuerdo
a la profundidad del sitio y con una palita pequeña o cuchara de acero inoxidable
o teflón, previamente lavadas y recoja suficiente sedimento (~200 g) de la capa
superficial (~1 cm) en un recipiente de vidrio de 500 mL previamente tratado y
libre de contaminantes para el análisis de plaguicidas. Evite colectar el sedimento
en contacto con los lados de la draga o muestreador, o a menos de un centímetro
de distancia, para reducir la posibilidad de contaminación. De igual manera se
deberá evitar tocar los laterales del muestreador con la cuchara o espátula que se
utilice para recoger la muestra de sedimento superficial.
•
Si es necesario combinar sedimentos de múltiples tomas dentro de la misma
estación para completar la cantidad necesaria, porciones iguales de cada toma
deberán ser depositados en el recipiente correspondiente al sitio.
•
No llene el recipiente más de 2/3 de su capacidad para permitir la expansión sin
rotura durante su congelamiento.
sedimentos en el campo
•
Una vez completada la recolección de muestra, coloque el recipiente,
debidamente identificado y dentro de una bolsa plástica para contener la muestra
y evitar la contaminación de las restantes en caso de rotura o derrame accidental,
en una hielera con hielo para su transporte al laboratorio. Congele la muestra tan
pronto como pueda.
•
De la misma manera colecte ~100 gramos y colóquelos en una bolsa tipo
“Ziplock” para la determinación de granulometría y conserve la muestra en una
hielera sin o con poco hielo para protegerla de las condiciones ambientales. Esta
muestra no debe ser congelada.
33
Toma de Muestras
•
Proceda a la siguiente estación y repita los procedimientos de muestreo (Figura 9)
hasta que todas las estaciones dentro del sitio se hayan trabajado, luego de lo cual
se procede al siguiente sitio (Figura 8).
•
Asegúrese que el equipo es acondicionado como se indicó anteriormente entre
estaciones, independientemente si las mismas corresponden al mismo sitio o no.
Criterio de aceptabilidad de la muestra de sedimento
Todas las muestras deberán ser visualmente inspeccionadas para asegurar que el sedimento
ha sido tomado hasta la profundidad deseada y que no hay evidencia de un cierre incompleto
de la draga o que la draga no penetró el sedimento en un ángulo no deseado o se inclinó
durante su izado resultando en pérdida o perturbación del sedimento (ver ilustración en
Tabla 6).
Si la muestra recogida presenta alguno de los problemas mencionados, la misma deberá ser
rechazada y colectarse otra muestra en esa estación. La posición de la nueva muestra deberá
ser próxima a la ubicación de la muestra original. La muestra rechazada deberá ser
descartada de manera que no afecte la nueva muestra u otras posiciones donde se colectarán
muestras.
Las muestras de sedimentos serán procesadas in situ, ya sea a bordo de la embarcación o en
tierra en el caso de que el acceso al sitio sea por este medio, inmediatamente después de ser
tomadas. Durante el procesamiento de las muestras (Figura 9) evite fumar o trabajar en áreas
donde las muestras puedan contaminarse con las emisiones de motores de combustión (e.g.,
automóviles).
Las muestras para el análisis de plaguicidas deberán ser colocadas y almacenadas en
recipientes de vidrio de 500 mL previamente tratados para eliminar todo contaminante
orgánico. Los recipientes de vidrio pueden comprarse certificados libres de contaminantes
orgánicos o pueden tratarse en el laboratorio. Los recipientes de vidrio pueden ser lavados
con agua y detergente/jabón de laboratorio libre de fosfatos, enjuagados secuencialmente con
porciones de distintos disolventes y puestos a secar antes de cubrirse con su tapa protegida
con película de teflón. Alternativamente, los recipientes pueden ser tapados con papel de
aluminio después de ser lavados con agua y jabón/ detergente libre de fosfatos y puestos a
quemar a 440oC por 4 horas (Tabla 7). Es recomendable que estos recipientes ya vengan, del
laboratorio, con la etiqueta y código de identidad de tipo de análisis y el sitio y la estación de
muestreo.
34
Tabla 7
Recipiente recomendado para muestras de suelos/sedimentos y su
procedimiento de limpieza
Parámetro
fosforados
Uracil & Urea
herbicidas
Matriz
Suelos
Sedimentos
Recipiente
Recomendado
Frasco de 500 mL con
tapa protegida con
lámina interior de teflón
acetona de baja calidad, una con
acetona y dos con hexano, ambos
disolventes calidad plaguicidas.
Dejar secar destapado y una vez
seco, tapar con papel de aluminio y
calcinar en mufla a 440°C por 4
horas. Dejar enfriar y tapar con tapa
con interior protegido con película de
teflón sin remover el papel de
aluminio hasta el momento del
muestreo.
Parámetros auxiliares
Los contaminantes orgánicos en sedimentos están generalmente asociados con los materiales
finos, y la materia orgánica adsorbida sobre estos, por lo que la determinación del tamaño de
grano y el contenido de carbón orgánico y la humedad es importante para explicar valores
aparentemente atípicos por normalización de los resultados.
Granulometría
Las muestras de sedimentos destinadas a la determinación de tamaño de grano deberán ser
recogidas en bolsas plásticas tipo “Ziplock” y mantenidas a temperatura ambiente y
protegidas del calor (e.g., no dejadas al sol) dentro de una hielera sin hielo. Es recomendable
que estas bolsas vengan previamente etiquetadas del laboratorio con el código que identifica
el tipo de análisis y el sitio y la estación de muestreo.
Carbón orgánico total y humedad
Las mediciones de otros parámetros auxiliares en sedimentos (carbón orgánico total y
humedad) serán realizadas en alícuotas tomadas de las muestras destinadas al análisis de
plaguicidas por lo que no es necesario recoger o procesar material extra.
35
Toma de Muestras
Todos lo contenedores de muestras (recipientes de vidrio y bolsas plásticas) deberán llevar
etiquetas en su exterior que indiquen el código del sitio, número de estación, fecha y hora,
tipo de análisis a realizar e iniciales de la persona que toma la muestra.
Almacenamiento
Las muestras de sedimentos para el análisis de plaguicidas deberán congelarse, si es posible,
inmediatamente después de tomadas o conservarse en una hielera con hielo hasta su regreso
al laboratorio al final del día donde se congelarán (Tabla 8). En este último caso, es
importante que los recipientes se mantengan sobre el hielo y aislados del mismo con papel
periódico, o similar, para evitar la posibilidad de contaminación al ponerse los recipientes en
contacto con el agua. Por el mismo motivo, se deberá evitar que se junte agua dentro de la
hielera. En general, no se aconseja el uso de productos químicos para preservar la integridad
de analitos en muestras de sedimentos.
Las muestras destinadas al análisis de tamaño de grano deberán ser mantenidas y
transportadas al laboratorio a temperatura ambiente, dentro de una hielera o similar para su
protección.
recomendados para muestras de suelos y sedimentos
Parámetro
Insecticidas
clorados y
fosforados
Herbicidas
triazinas
Uracil & Urea
herbicidas
Insecticidas
carbamatos
Preservación
Congelamiento a -20°C
extracción.
Cadena de custodia
Ver sección 5.4 (Muestras de agua superficial, Cadena de custodia)
5.6. Muestras de biota: Bivalvos
El término bivalvos se refiere a almejas, mejillones y ostras. En la Tabla 9 se describe y se
presenta información sobre hábitat, tamaño y características como una guía simple para la
identificación de especies de interés para este proyecto. Las especies más comunes en el área
de estudio son:
36
•
•
Isognomon alatus
Estas especies de bivalvos se encuentran ampliamente distribuidas en el Mar Caribe por lo
que pueden proporcionar una buena cobertura de la región. En aquellas estaciones donde
habitan más de una especie, se deberá tomar una muestra de cada una, mantenidas separadas,
para comparar la acumulación de contaminantes por las mismas al estar expuestas a los
mismos niveles ambientales. Esta información facilitará la integración del área cuando
distintas especies son muestreadas. Si se observan otras especies de bivalvos, éstas también
deberán ser recolectadas para su potencial análisis.
Tabla 9
Parámetro
Sinónimos
menores
Nombre común
Imagen
Tamaño
Concha
Exterior
Interior y línea
paleal
Hábitats
Distribución
geográfica
Comentarios
Identificación de bivalvos
(Guilding, 1828)
Isognomon alatus
(Gmelin, 1791)
Ostrea arborea, O. parahibensis, O.
parasitica, O. praia, O. rhizophorae
Ostión de mangle
Isognomon alata, Ostrea alatus, Pedalion
alatus, Perna alatus, P. oblicua
Ostión plano
Hasta 150 mm de largo
Valva izquierda de copa profunda y
mayor tamaño que la derecha plana.
Bordes irregulares y de forma variable,
Margen interno suave.
Grisáceo, gris claro a gris manchado
Hasta 80 mm de largo
Valvas ovales, en forma de abanicos
aplanados, muy comprimidas, valva
derecha es plana, y la izquierda
moderadamente obesa
Gris manchado a gris púrpura, café o
negro
El interior es aperlado, pero esta textura
no se extiende hasta los márgenes. La
línea paleal es discontinua. Abertura bisal
en el margen anterior cerca de la parte
dorsal
Viven adheridas a raíces de mangles y
rocas mediante el biso y formando
agrupaciones. Se encuentra en zonas
intermareal o poco profunda.
El interior es blancuzco a gris claro con la
impresión muscular púrpura, cerca del
margen dorsal; los márgenes internos
rectos y lisos; el de la valva izquierda con
manchones azul púrpura
Viven adherida a raíces de manglares,
rocas u otros substratos duros. Es una
especie que habita en zona intermareal o
poco profunda. La población puede ser
fácilmente afectada por sobre explotación
Golfo de México, Caribe, Las Antillas,
Brasil y Uruguay
Puede confundirse con Crassostrea
virginica (Gmelin, 1791)
Golfo de México, Las Antillas, Centro
América, Brasil, Bermudas
37
Toma de Muestras
El sitio adecuado para la toma de muestras de bivalvos deberán tener las siguientes
características:
•
El sitio deberá seleccionarse en un área que integre la contaminación de múltiples
fuentes en lugar de reflejar el aporte de un punto en particular. La selección
adecuada de un sitio depende principalmente de la evaluación previa de las
fuentes de contaminación en el área, circulación y profundidad en la zona y la
experiencia del equipo de muestreo. En general, bivalvos que están directamente
expuestos a la salida de un efluente, en lagunas poco profundas, compuestas
principalmente de efluentes, o pegados a estructuras realizadas por el hombre
(muelles, pilares, etc.) deberán evitarse para no obtener un valor no representativo
del área. En un área de buena circulación será suficiente recolectar muestras en
sitios alejados unos 300-500 metros de las fuentes de contaminación conocidas.
•
El sitio deberá tener bivalvos nativos, de tamaño y abundancia adecuados, que
permitan un muestreo bianual durante los dos años del proyecto sin peligros de
agotar los recursos de la zona.
•
El sitio seleccionado deberá estar accesible durante los dos años del proyecto; es
decir que no se espera ninguna disrupción física del lugar (construcciones,
dragado)
•
La toma de muestra deberá estar limitada a sustratos naturales (rocas, manglares)
y se deberán evitar todos aquellos que no lo son (muelles, pilares, boyas).
Ver sección 5.4 (Muestras de agua superficial, Documentación del lugar)
El tamaño preferible para la recolección de bivalvos es de 100 a 150 mm y de 60 a 80 mm
para Crassostrea rhizophorae e Isognomon alatus, respectivamente.
Los bivalvos pueden ser recolectados a mano, con pinzas o dragas. La recolección a mano es
el método preferido y deberá ser utilizado en todos los sitios localizados en zonas entre
mareas o en áreas poco profundas. Muchos bivalvos, como las ostras, pueden ser
simplemente despegados y separados de los materiales adheridos utilizando un cuchillo de
ostras o un pico pequeño (martillo de geólogo). En el caso de bivalvos que se adhieren a su
substrato natural por medio del biso se deberá utilizar un par de tijeras o un cuchillo para
evitar dañar el animal al retirarlo del lugar. En lugares ligeramente más profundos, los
bivalvos deberán ser recolectados utilizando pinzas diseñadas para este propósito mientras
que a profundidades mayores se deberá utilizar una draga. Los bivalvos y conchas que se
presentan aglomerados deben ser separados utilizando un cuchillo de ostras o pico pequeño.
Los procedimientos específicos para la toma de muestras de bivalvos son resumidos a
continuación y mostrados, como un diagrama de flujo, en Figura 10.
38
bivalvos en el campo
•
La posición geográfica del sitio y el método utilizado deberán ser debidamente
documentados. Las muestras de bivalvos serán recolectados de zonas de entre
mareas o bajo la línea de marea baja a mano o utilizando pinza o draga según sea
la profundidad del sitio. Un mínimo de 30 bivalvos, o el número de individuos
necesarios para juntar 200 g de tejido húmedo, deberán ser recogidos para el
análisis de plaguicidas. Los bivalvos deberán ser envueltos en doble hoja de papel
de aluminio libre de contaminantes orgánicos y puestos en doble bolsa plástica
tipo “Ziplock” con su etiqueta identificatoria entre ellas.
•
Las tres muestras correspondientes a un sitio deberán ser colocadas en
contenedores (hieleras) separados e identificados de otros sitios para asegurar que
las muestras no son intercambiadas por accidente.
•
Procure que no se junte agua de deshielo dentro de los contenedores o que los
bivalvos no entren en contacto con el agua para evitar su apertura y
contaminación o muerte.
39
Toma de Muestras
Los bivalvos no deberán ser abiertos o procesados en el campo. A medida que las muestras
son recogidas, serán separadas e identificadas de acuerdo a sus estaciones y sitios. Se deberá
hacer el esfuerzo de recoger bivalvos de tamaño similar y dentro del rango preestablecido
para que los organismos que se combinan en una muestra representen una edad o grado de
madurez similar. Esto también aplica a las muestras duplicadas.
Limpieza y clasificación
Los bivalvos deberán ser liberados del sedimento e incrustaciones al momento de tomar la
muestra. Para eso se deberá utilizar un cepillo de fibra natural y agua del lugar. Los bivalvos
serán separados y contados para asegurar que un número adecuado de organismos (30+
organismos por estación, dependiendo del tamaño) han sido juntados para el trabajo analítico.
Si los bivalvos son extremadamente pequeños, un mayor número de bivalvos deberán ser
juntados para asegurar un tamaño de muestra ideal (~200 g de tejido húmedo) para completar
todos los análisis químicos incluyendo replicados. Las muestras de bivalvos deberán ser
envueltos en doble papel de aluminio libre de contaminantes orgánicos y luego colocado en
doble bolsa plástica tipo “Ziplock”. Las muestras correspondientes a cada estación dentro de
un sitio deberán poseer su propio número identificatorio. Durante el procesamiento de las
muestras (Figura 10) evite fumar o trabajar en áreas donde las muestras puedan contaminarse
con las emisiones de motores de combustión (e.g., automóviles).
Una vez en el laboratorio, los bivalvos cerrados deberán lavarse nuevamente con agua
limpia, siempre en movimiento para evitar que se abran, y secarse con papel toalla. Los
bivalvos, correspondiente a cada una de las tres estaciones dentro de un sitio, son abiertos
con la ayuda de un cuchillo para ostras y el tejido es separado de las conchas y colocados en
un frasco de 500 mL libre de contaminantes orgánicos (Tabla 10), etiquetado con la
información correspondiente, cubiertos con una tapa con película de teflón en su interior y
congelados a -20ºC hasta su análisis. No llene el envase más de 2/3 de su capacidad para
permitir la expansión del contenido durante su congelamiento sin rotura del recipiente.
40
Tabla 10 Recipiente recomendado para muestras de biota y su procedimiento de
limpieza
Parámetro
fosforados
Uracil & Urea
herbicidas
Matriz
Biota
Recipiente
Recomendado
Frasco de 500 mL con
tapa protegida con
lámina interior de teflón
acetona de menor calidad, una con
acetona y dos con hexano, ambos
disolventes calidad plaguicida. Dejar
secar destapado y una vez seco, tapar
con papel de aluminio y calcinar en
mufla a 440°C por 4 horas. Dejar
enfriar y tapar con tapa con interior
protegido con película de teflón sin
remover el papel de aluminio hasta el
momento del muestreo.
Todos los recipientes de vidrio deberán llevar etiquetas en su exterior que indiquen el código
que identifique el sitio, número de estación, fecha y hora, tipo de análisis a realizar e iniciales
de la persona que tomó la muestra.
Almacenamiento
Todas las muestras deberán ser colocadas con hielo en hieleras a bordo de la lancha o
embarcación hasta el final del día. Al finalizar la jornada, las muestras serán transferidas al
laboratorio donde se comenzarán a procesar para su almacenamiento (Tabla 11). Es
importante que durante el almacenamiento en el campo y el transporte hacia el laboratorio,
las bolsas de bivalvos se mantengan sobre el hielo y aislados del mismo con papel periódico,
o similar, para evitar la posibilidad de contaminación al ponerse los organismos en contacto
con el agua con posibilidad de que se abran. Por el mismo motivo, se deberá evitar que se
junte agua dentro de la hielera dejando abierta la llave de drenaje.
Cadena de custodia
Ver sección 5.4 (Muestras de agua superficial, Cadena de custodia)
41
Toma de Muestras
recomendados para muestras de biota.
Parámetro
Insecticidas
clorados y
fosforados
Herbicidas
triazinas
Uracil & Urea
herbicidas
Insecticidas
carbamatos
42
Preservación
Congelamiento a -20°C
extracción.
6.
PROCESAMIENTO ANALITICO DE LAS MUESTRAS
Los métodos analíticos que se discuten a continuación son una recopilación de las técnicas
utilizadas por laboratorios de la Administración Nacional de Océanos y Atmósfera (NOAA,
por sus siglas en inglés) de los Estados Unidos de América, para su programa de monitoreo
“National Status and Trends Program” que se viene desarrollando desde 1986 (NOAA, 1998)
y por el Laboratorio de Análisis de Plaguicidas (LAPA) perteneciente al Centro de
Investigación en Contaminación Ambiental (CICA) de la Universidad de Costa Rica (UCR).
En esta sección, los métodos son presentados en forma breve y, en cuadros grisados, se
presentan las distintas secciones descritas paso a paso para aquellos analistas que lo
necesiten. Muchas de estas técnicas son adaptaciones de métodos de la Agencia de
Proteccion Ambiental de los Estados Unidos de America (U.S. EPA, por sus siglas en
inglés); para mayor información, es aconsejable consultar esos métodos en sus revisiones
más recientes (Tabla 12).
6.1. Interferencias
Interferencias en los métodos dedicados al análisis de contaminantes orgánicos a niveles
trazas pueden deberse a contaminantes presentes en disolventes, reactivos, cristalería u otros
instrumentos utilizados en las tomas de muestras y su posterior tratamiento. Estas
interferencias pueden causar falsos positivos durante el análisis instrumental. Todos los
materiales utilizados en estos métodos deben ser controlados de estar libres de interferencias
al procesar, con cada batería analítica, muestras destinadas al control de calidad en el
laboratorio, tales como blancos y blancos enriquecidos.
Interferencias provenientes de la matriz resultan de la co-extracción de compuestos distintos
a los analitos de interés. En general, las muestras de aguas naturales presentan pocos
problemas de interferencias por lo que la limpieza mediante cromatografía en columna sólo
deberá utilizarse cuando se observa color en el extracto que pudiese sugerir la posibilidad de
interferencias. En contraste, azufre elemental y materiales lipídicos, naturalmente presentes
en suelos y sedimentos, pueden causar interferencias en el análisis de los extractos de estas
muestras. La limpieza de estos extractos para remover azufre y lípidos es posible mediante el
uso de cobre activado y columna de cromatografía conteniendo sílica gel y alúmina,
respectivamente. La eficacia de estos pasos es controlado por el tratamiento y posterior
análisis de muestras de control de calidad destinadas a este propósito como muestras
duplicadas, muestras enriquecidas y, si están disponible, materiales de referencia.
43
Procesamiento Analitico de las Muestras
Tabla 12.
Métodos de la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos
(U.S. EPA) relevantes a este proyecto
EPA – Método Nro.
Título
507
Determination of nitrogen and phosphorous-containing pesticides in water by gas
chromatography with a nitrogen-phosphorus detector
Determination of chlorinated pesticides in water by gas chromatography eiyh an
electron capture detector
Determination of organic compounds in drinking water by liquid-solid extraction
and capillary column gas chromatography/mass spectrometry
Organochlorine pesticides and PCBs
Determination of organophosphorus pesticides in municipal and industrial
wastewater
Determination of organohalide pesticides and PCBs in municipal and industrial
wastewater
Determination of triazine pesticides in municipal and industrial wastewater
Determination of carbamate and urea pesticides in municipal and industrial
wastewater
The determination of organo-halide pesticides in municipal and industrial
wastewater
Determination of pyrethrins and pyrethroids in municipal and industrial
wastewater
Organic extraction and sample preparation
Separatory funnel liquid-liquid extraction
Soxhlet extraction
Ultrasonic extraction
Cleanup
Alumina cleanup
Florisil cleanup
Silica gel cleanup
Sulfur cleanup
Determinative chromatographic separations
Organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls by gas chromatography
Organochlorine pesticides by gas chromatography
Organophosphorus pesticides
Organophosphorus compounds by gas chromatography: Capillary column
technique
Semivolatile organic compounds by gas chromatography/mass spectrometry
(GC/MS)
N-methylcarbamates by high performance liquid chromatography (HPLC)
508
525.2
608
614
617
619
632
1656
1660
3500B
3510C
3540C
3550B
3600C
3610B
3620B
3630C
3660B
8000B
8080A
8081A
8140
8141A
8270C
8318
6.2. Requerimientos de control de calidad
Común a todos los métodos que se presentan es el control de calidad de los resultados. El
análisis de plaguicidas debe incluir, como mínimo y con cada lote analítico, un blanco de
laboratorio (o del método), una muestra analizada en duplicado, una muestra enriquecida y su
duplicado. De estar disponible para el tipo de muestra y analitos de interés, es conveniente
agregar un material de referencia con valores certificados.
Blanco de laboratorio. El blanco de laboratorio se utiliza para demostrar que el método
analítico no presenta problemas de contaminación. La muestra blanco se prepara mediante la
ejecución de todos los pasos necesarios para la extracción y purificación del extracto sin
44
presencia de muestra. El blanco de laboratorio debe ser sembrado con los volúmenes
apropiados de estándar de recuperación, antes de comenzar la extracción, y de estándar
interno antes de su análisis instrumental.
Blanco enriquecido y blanco enriquecido en duplicado. El blanco enriquecido de laboratorio
se utiliza para demostrar la exactitud del método y se prepara mediante la ejecución de todos
los pasos necesarios para la extracción y purificación del extracto sin presencia de muestra.
El blanco enriquecido de laboratorio debe ser sembrado con los volúmenes apropiados de
estándares de recuperación y disolución de analitos de interés, antes de comenzar la
extracción, y de estándar interno antes de su análisis instrumental. De existir un blanco
enriquecido de laboratorio en duplicado, el estudio de los resultados de ambas muestras
permiten evaluar la precisión de los análisis.
Muestra enriquecida y muestra enriquecida en duplicado. Este duplicado es utilizado para
demostrar la exactitud y precisión de los análisis. La muestra enriquecida y muestra
enriquecida en duplicado son tratadas como las demás muestras de la batería analítica con la
diferencia que, antes de su extracción y demás procedimientos de laboratorio, son
enriquecidas con una cantidad conocida de los analitos en estudio. La muestra enriquecida y
su duplicado deben ser sembrados con los volúmenes apropiados de estándares de
recuperación y disolución de analitos de interés, antes de comenzar la extracción, y de
estándar interno antes de su análisis instrumental.
Muestra en duplicado. La muestra duplicada es utilizada para demostrar no sólo la precisión
analítica sino también el grado de homogenización de las muestras. Esta muestra, tomada al
azar del grupo que compone la batería analítica, es tratada como las demás muestras. La
muestra en duplicado debe ser sembrada con los volúmenes apropiados de estándar de
recuperación, antes de comenzar la extracción, y de estándar interno antes de su análisis
instrumental.
Material de referencia certificado. El análisis de un material de referencia, para aquellas
matrices que éstos existan, permite evaluar la exactitud del laboratorio al analizar una
muestra auténtica y comparar los resultados obtenidos con aquellos reportados y certificados
por laboratorios de calidad y experiencia reconocida. Usualmente, estos materiales son
certificados por medio de métodos de análisis variados e independientes.
Control del método analítico (CoMA). Una disolución para el Control del Método Analítico
(CoMA) es preparada a partir de las disoluciones de estándares de recuperación, e internos y
la mezcla de analitos de interés agregados a un volumen de disolvente igual al volumen final
de los extractos de las muestras. El CoMA es similar a un blanco fortificado de laboratorio
pero sin ser sometido a ningún proceso de extracción y purificación. EL CoMA es utilizado
internamente por el laboratorio para evaluar la calidad de los estándares utilizados y las
cantidades sembradas. A nivel de los instrumentos, el CoMA sirve para controlar que la
predicción de los análisis es correcta.
45
6.3. Extracción y limpieza de muestras de agua
Introducción
La determinación precisa y cuantitativa de contaminantes orgánicos, tales como plaguicidas,
en muestras de agua requiere de la extracción de estos compuestos antes de su análisis
instrumental. Las muestras de agua son recogidas y almacenadas en botellas oscuras (color
ámbar), con o sin el agregado de preservantes, y almacenadas en la oscuridad a 4°C ± 2°C.
Las muestras de agua, adicionadas de los estándares de recuperación apropiados, son
extraídas con diclorometano y el extracto secado con Na2SO4 anhidro. Si es necesario, y
dependiendo de los analitos que se buscan cuantificar, el extracto puede ser purificado
utilizando cromatografía en columna. Muestras de control de calidad son procesadas, con
cada lote de muestras, de manera idéntica a éstas.
La evaluación de contaminantes orgánicos en muestras acuosas requiere su medición a
niveles trazas (ng L-1 o pg L-1). Un litro de muestra necesita ser extraído con diclorometano
utilizando un embudo de separación (ampolla de decantación) y concentrado para su análisis
instrumental.
Aplicación
Este método de extracción y limpieza de muestras de aguas es aplicable a los siguientes
analitos:
Uracil herbicidas
Urea herbicidas
Clorotalonil
Ametrina
Atraton
Atrazina
Prometon
Carbaril
Clorpirifos
Diazinon
Permetrina
Bromacil
Diuron
Aldrin
alpha-clordano
Dieldrin
4,4'-DDD
4,4'-DDE
4,4'-DDT
Endrin
Prometrina
Propazina
Secbumeton
Simetrina
Carbofurán
Fenamifos
Metil paratión
Endosulfan I
Endosulfan II
Endosulfan sulfato
Endrin aldehido
Endrin cetona
Simazina
Terbutilazina
Terbutrina
Oxamil
alpha-HCH
beta-HCH
delta-HCH
gamma-HCH (Lindano)
Heptacloro
Heptacloro epóxido
Metoxicloro
Recolección de la muestra, preservación y almacenamiento
La muestra de agua debe ser recolectada y almacenada en botellas de vidrio oscuro
previamente tratada para estar libres de contaminantes orgánicos (ver Tabla 4). Una vez
46
tomada, la muestra debe ser mantenida en la oscuridad y en hielo hasta su arribo al
laboratorio donde se almacenará a 4°C ± 2°C.
Equipos y materiales
Materiales de laboratorio
Todo material de vidrio de laboratorio debe ser lavado con agua y jabón/detergente de
laboratorio, secado con acetona y secuencialmente enjuagado una vez con acetona, dos con
hexano, y dos con diclorometano. Estos últimos enjuagues con disolventes calidad
plaguicidas. Alternativamente, el material no volumétrico se puede dejar secar destapado y
una vez seco, se procede a tapar con papel de aluminio y quemar en mufla a 440°C por 4
horas. Dejar enfriar y guardar en un lugar protegido, sin remover el papel de aluminio hasta
el momento de su utilización.
Los siguientes materiales de laboratorio son necesarios para este método:
- Embudo de separación de 2 L, Pyrex con llave de teflón
- Balanza analítica con capacidad de pesar 0,0001 mg
- Balanza analítica con capacidad de pesar 0,1 g
- Balones de fondo plano (o redondo) de 250 y 500 mL
- Baño de agua con calentamiento regulado a 60-70°C
- Probetas graduadas, 250 y 1000 ó 2000 mL de capacidad
- Columnas cromatográficas de 300 mm de longitud x 13 mm de diámetro interno con
reservorio superior de 250 mL y llave de teflón.
- Columnas de concentración tipo Snyder de tres bolas
- Desecador
- Embudos, diferentes tamaños de vidrio borosilicato
- Espátulas de acero inoxidable
- Gas nitrógeno para evaporación
- Lana de vidrio calcinada a 440°C por 4 horas o previamente extraída con disolventes
- Micro pipeta de 100 µL
- Núcleos de ebullición, de vidrio o teflón, previamente lavados con disolventes
- Papel indicador de pH o pHmetro
- Pipetas Pasteur descartables de 1 mL y bulbos de goma
- Tijeras
- Tubos concentradores tipo Kuderna-Danish de 25 mL, graduados y con tapones de
vidrio esmerilados
- Varilla de vidrio de 50 cm
- Vasos de precipitados de 50, 250 y 500 mL
- Viales de vidrio oscuro de 1 y 7 mL con tapa protegida con película de teflón
Todo material volumétrico para medidas de la muestra o agregado de estándares y
disoluciones de enriquecimiento debe ser previamente calibrado.
47
Reactivos
- Acetona, calidad plaguicidas o equivalente
- Acido clorhídrico, grado reactivo 6 N, preparado como una dilución 1:1 con agua
libre de contaminantes orgánicos
- Acido clorhídrico, grado reactivo 12 N
- Agua libre de contaminantes orgánicos
- Alúmina, Básica Brockmann I, grado cromatográfico, ~150 mesh o equivalente,
activada a 440°C por 4 horas y mantenida en estufa a 120°C. Para utilizar, se deja
enfriar a temperatura ambiente en desecador
- Arena lavada y calcinada a 440°C por 4 horas
- Cobre metálico, grado analítico, 20-30 mesh
- Diclorometano, calidad plaguicidas o equivalente
- Florisil calibrado
- Hexano, calidad plaguicidas o equivalente
- Pentano, calidad plaguicidas o equivalente
- Sílica, Grado 923, 100-200 mesh o equivalente, activada en estufa a 170°C por 24
horas antes de utilizar; dejar enfriar a temperatura ambiente al usar
- Disolución de enriquecimiento
- Disolución de estándares internos
- Disolución de estándares de recuperación
- Sulfato de sodio (Na2SO4), granular anhidro, calcinado a 440°C por 4 horas y
mantenido en estufa a 120°C. Para utilizar, se deja enfriar a temperatura ambiente en
desecador
Estándares analíticos
Todos los estándares utilizados en el método pueden ser adquiridos en disolución con
certificación de su pureza, concentración y autenticidad. Cuando no están en uso, las
disoluciones deberán ser mantenidas a -4°C ± 2°C en viales de vidrio oscuro con tapa
protegida en su interior con película de teflón.
Procedimiento
La Figura 11 ilustra la marcha analítica a seguir para la determinación de distintos
plaguicidas en muestras líquidas.
Preparación de la muestra
Dependiendo de la disponibilidad de muestra, tanto el volumen de agua a ser extraída como
el volumen del extracto final puede ser modificado. Es posible que el extracto de la muestra
sólo necesite limpieza si existiese una coloración, olor o presencia de material oleoso que
48
pudiese interferir con los análisis. Distintas opciones para la limpieza de la muestra, esto
dependiendo de los analitos a analizar, son presentadas en las secciones siguientes.
Extracción de la muestra
Un volumen conocido de agua es extraído tres veces con 80-100 mL de diclorometano por
litro de muestra en ampolla de decantación luego del ajuste de pH y agregado de los
estándares de recuperación. El embudo de separación es agitado manualmente por tres
minutos cada vez dejando decantar el disolvente al finalizar. Los disolventes de las
extracciones son secados con Na2SO4 a medida que son recolectados como un solo extracto
en un balón de 500 mL. Terminada la extracción, se agregan 3-5 núcleos de ebullición al
balón y se adosa una columna tipo Snyder de tres bolas al mismo para concentrar el extracto
a 10-15 mL sobre baño de agua a 40-45°C. El extracto concentrado a 10-15 mL es
transferido a un tubo de concentración de 25 mL. El balón de 500 mL es enjuagado 2 ó 3
veces con diclorometano y los enjuagues transferidos al tubo de concentración. Se agrega un
núcleo de ebullición, el extracto es concentrado y el disolvente cambiado en hexano sobre
baño de agua a 40-45°C bajo una suave corriente de nitrógeno. Volumen final del extracto
debe ser de aproximadamente 2 ml en el disolvente adecuado si se observa color, olor o
materiales oleosos en el extracto que ameriten su remoción. De necesitarse una limpieza del
extracto, esta puede realizarse mediante una cromatografía en columna adecuada (sílica gel:
alúmina o florisil). Si el extracto se observa limpio, se concentra a un volumen final de 1 mL,
se agrega el estándar interno y se procede con el análisis instrumental.
49
Figura 11. Diagrama de flujo del análisis de plaguicidas en muestras líquidas
50
Extracción de la muestra – Paso a paso
•
Marque el menisco de la muestra de agua en la botella que la contiene. Mida y registre el pH de la
muestra. Transfiera la muestra al embudo de separación.
o
Si la muestra no va a ser extraída en su totalidad, mida exactamente el volumen de agua a extraer en
una probeta graduada de 1.000 mL, ajuste el pH y transfiera la muestra al embudo de separación.
•
Si no se ha hecho en el campo, se deberá ajustar el pH de la muestra antes de la extracción. Para los
analitos indicados en la aplicación del método, con la excepción de insecticidas carbamatos, ajuste el pH
a 7±1 con NaOH ó H2SO4 mientras se monitorea con un phmetro. Para la extracción de insecticidas
carbamatos, ajuste el pH a ~3 con H2SO4 o HCl mientras se monitorea con un phmetro.
•
Basado en la información recibida en el laboratorio, agregue la cantidad apropiada de estándares de
recuperación a todas las muestras, incluyendo aquellas destinadas al control de calidad del método, y de
disolución de enriquecimiento a las muestras que corresponda. Tape el embudo de separación y agite
ligeramente para mezclar su contenido.
•
Mida 80-100 mL de diclorometano por litro de muestra en una probeta graduada y enjuague con este
volumen el recipiente que contenía la muestra. Agregue este disolvente a la ampolla de decantación.
o
Si el total de la muestra de agua no fue utilizado, agregue el disolvente directamente a la ampolla de
decantación.
•
Una vez tapada la ampolla de decantación para iniciar la extracción, el primer venteo de vapores debe
hacerse inmediatamente después de la primera agitación ya que el diclorometano produce una presión
importante rápidamente.
•
Vuelva a tapar y agite vigorosamente la ampolla de decantación por 3 minutos con venteos periódicos
bajo campana para liberar el exceso de presión.
•
Pasados los 3 minutos, permita que la capa orgánica se separe de la fase acuosa por 10-15 minutos.
Recoja el disolvente en un balón de 500 mL luego de pasar por un embudo con Na2SO4 anhidro para
secar.
•
Si se forma una emulsión importante (más de un tercio del volumen del disolvente) entre las capas es
necesario romperla antes de proseguir. Esto se puede lograr con el agregado de unos gramos de NaCl,
agitación mecánica con una varilla de vidrio o filtración a través de lana de vidrio.
•
Repita la extracción dos veces más utilizando porciones frescas de disolvente (80-100 mL por L de
muestra). Enjuague el Na2SO4, después de pasar la tercera extracción, varias veces con porciones de 510 mL de diclorometano colectando todos los volúmenes en el mismo balón.
•
De necesitarse un nuevo ajuste de pH y extracción, el procedimiento es realizado como se indicó
anteriormente. Las instrucciones recibidas por el laboratorio deberán indicar, en este caso, si ambas
extracciones deberán ser combinadas y concentradas o mantenidas como extractos independientes.
•
Si la muestra fue utilizada en su totalidad, llene el recipiente que la contenía con agua hasta llegar a la
marca hecha antes de retirar la misma. Transfiera este volumen a una probeta graduada y mida con
precisión de ± 5 mL. Registre el volumen en el cuaderno de laboratorio.
•
Agregue núcleos de ebullición y adose una columna tipo Snyder al balón de 500 mL. Coloque el balón
sobre un baño de agua a 40-45°C y concentre el extracto a 10-15 mL.
•
Retire la columna de evaporación y transfiera el contenido del balón a un tubo concentrador de 25 mL.
Agregue un nuevo núcleo de ebullición, coloque el tubo sobre el baño de agua (40-45°C) y concentre a 2
mL en diclorometano.
•
Inspeccione cuidadosamente el extracto. Si existiese material particulado, se observa color o se sospecha
la presencia de hidrocarburos (ya sea por olor de la muestra, observación visual, o documentación al
momento de la toma), el extracto deberá ser purificado antes de su análisis.
51
Limpieza del extracto con cromatografía en columna
La mayoría de los extractos de muestras de aguas se presentarán lo suficientemente limpios
para necesitar un tratamiento de limpieza. De ser necesario se puede utilizar uno de los dos
métodos siguientes, según sea el análisis a realizar.
Limpieza con sílica gel/alúmina en columna de cromatografía
Este procedimiento de limpieza es utilizado con los plaguicidas indicados en la aplicación del
método, con la excepción de insecticidas carbamatos, herbicidas triazinas y organofosforados
(ver limpieza con florisil más abajo). La columna de cromatografía se llena con
diclorometano, se coloca un tapón de lana de vidrio calcinada en el fondo de la columna para
retener el material adsorbente y sobre ella 1 cm de sulfato de sodio anhidro o de arena lavada
y calcinada para lograr una superficie uniforme. Diez gramos de alúmina (desactivada con
1% de agua, peso en peso) es agregada en seco sobre el diclorometano y dejada decantar
dentro de la columna. Veinte gramos de sílica gel (desactivada con 5% de agua, peso en
peso) es suspendida en diclorometano antes de su agregado a la columna. Una vez que la
reacción de la sílica gel con el diclorometano ha terminado (no se observa la formación de
burbujas de gas) se agrega la sílica gel sobre la alúmina y se deja decantar.
Aproximadamente 2 cm de sulfato de sodio anhidro o de arena lavada y calcinada es
agregada al tope de la columna y, sobre ella, 1-2 cm de cobre activado (ver Limpieza con
sílica gel/alúmina en columna de cromatografía – Paso a paso). En este punto, la columna
contiene, en diclorometano y de abajo hacia arriba, 1 tapón de lana de vidrio, 1 cm de arena
lavada, 10 gramos de alúmina parcialmente desactivada, 20 gramos de sílica parcialmente
desactivada, 2 cm de sulfato de sodio anhidro o de arena lavada y 1-2 cm de cobre activado
(sólo si se percibe olor a ácido sulfídrico). Se eluye el diclorometano de la columna hasta
alcanzar la superficie superior del cobre activado y se agregan 50 mL de pentano. Se permite
que el pentano eluya de la columna y reemplace el diclorometano hasta que alcance el cobre
activado. La columna está lista para recibir el extracto concentrado de la muestra.
El extracto de la muestra concentrado a 2 ml en hexano es transferido a la columna mediante
el uso de una pipeta Pasteur descartable. El agregado es eluído hasta alcanzar la superficie
del cobre activado, y el disolvente es recogido en un balón de 250 mL colocado debajo de la
columna. El tubo concentrador que contenía la muestra es enjuagado 2-3 veces con pequeñas
porciones (~1 mL) de una mezcla de diclorometano:pentano (1:1) y los enjuagues agregados
a la columna siguiendo el procedimiento anterior entre agregados. Doscientos mL de la
mezcla de diclorometano:pentano se agregan a la columna y son recogidos en el balón de 250
mL a una velocidad de aproximadamente 1 ml por minuto (gota a gota). En adición a los
compuestos de interés para este estudio (insecticidas clorados), esta fracción contiene otros
contaminantes clorados (e.g., bifenilos policlorados y éteres de bifenilos polibrominados) e
hidrocarburos aromáticos.
52
Limpieza con sílica gel/alúmina en columna de cromatografía – Paso a paso
Preparación de la columna
•
Retire el sulfato de sodio, alúmina y sílica gel de la estufa y colóquelos en un desecador para enfriar
a temperatura ambiente.
•
Retire la arena lavada y calcinada de la estufa y coloque sobre la mesa para enfriar a temperatura
ambiente
Nota: al retirar materiales de la estufa use siempre guantes de protección o pinzas largas adecuadas
para manejar objetos pesados. Los recipientes de arena, sílica y alúmina pueden pesar hasta 1 Kg. y
están calientes. Asegúrese de que todos los recipientes están cubiertos con papel aluminio.
Preparación de la sílica y alúmina desactivadas
•
Calibre la balanza antes de su uso de acuerdo a las instrucciones del fabricante e indicaciones del
cuaderno de calibración del laboratorio. Registre la fecha de calibración, pesa utilizada e iniciales
del operador.
•
Coloque un balón de 1000 mL con boca esmerilada y embudo sobre la balanza y tare el peso hasta
que el mismo lea “0,000 g”
•
Agregue alúmina dentro del balón y pese. El peso total de la alúmina debería ser igual a 10 g x n
muestras. Generalmente se pesa una cantidad extra (i.e., 10-15 g) en caso de accidentes o de
necesitar más al construir las columnas.
•
Registre este peso
•
Vuelva a tarar el balón con la alúmina hasta que el mismo lea“0,000 g” y desactive parcialmente el
adsorbente con el agregado de 1% (peso en peso) de agua libre de contaminantes orgánicos al balón.
Nota: la cantidad de agua es calculada al multiplicar el peso total de alúmina en el balón x 0,01. Por
ejemplo, si el peso total de alúmina en el balón es de 171,2 g, se debe agregar 171,2 g x 0,01 =
1,712 ≈ 1,7 g de agua. Es conveniente no agregar toda el agua en el mismo lugar para evitar la
formación de grumos.
•
Coloque otro balón de 1000 mL con boca esmerilada y embudo sobre la balanza y tare el peso hasta
que el mismo lea “0,000 g”
•
Agregue sílica dentro del balón y pese. El peso total de la sílica debería ser igual a 20 g x n
muestras. Generalmente se pesa una cantidad extra (i.e., 20-25 g) en caso de accidentes o de
necesitar más al construir las columnas. Registre este peso
•
Vuelva a tarar el balón con la sílica gel hasta que el mismo lea “0,000 g” y desactive parcialmente el
adsorbente con el agregado de 5% (peso en peso) de agua libre de contaminantes orgánicos al balón.
Nota: la cantidad de agua es calculada al multiplicar el peso total de alúmina en el balón x 0,05. Por
ejemplo, si el peso total de alúmina en el balón es de 363,1 g, se debe agregar 363,1 g x 0,05 =
18,15 ≈ 18,2 g de agua. Es conveniente no agregar toda el agua en el mismo lugar para evitar la
formación de grumos.
•
Tape los dos balones y agite bruscamente al inicio, para romper grupos que se pudieran haber
formados, y más suavemente cada 5-10 minutos por una hora para equilibrar.
Preparación del cobre activado
Nota: el cobre activado sirve para remover el azufre que pueda interferir durante el análisis de los
extractos por cromatografía de gases y detector de captura electrónica. Si la muestra no presenta el
olor a huevo en putrefacción, característico del ácido sulfídrico, no es necesario agregar el cobre
activado a la columna. Si la remoción de azufre es necesaria no utilize cobre en la porción de
extracto destinada a la determinación de insecticidas organofosforados ya que estos pueden ser
degradados en presencia de cobre.
53
•
Coloque aproximadamente 50 g (para 24 muestras) de cobre metálico en un vaso de precipitados de
250 mL
•
Agregue, bajo campana y con mucho cuidado una cantidad de ácido clorhídrico necesaria para
cubrir el cobre.
•
Agite el cobre con una varilla de vidrio durante unos segundos y deje reposar por 5 minutos
•
Coloque un embudo de vidrio con el vástago tapado con lana de vidrio sobre otro vaso de
precipitados de 500 mL y transfiera, cuidadosamente y bajo campana, el ácido con el cobre.
•
Lave el cobre activado con abundante agua libre de contaminantes orgánicos hasta remover todo el
ácido. La mezcla de ácido y agua de lavado es neutralizada con bicarbonato de sodio y desechada de
acuerdo a las normas del laboratorio.
•
Enjuague el cobre lavado con porciones 3 ó 4 porciones de 20 mililitros de metanol seguido de 3 ó 4
porciones de 20 mL de diclorometano, desechando los disolventes de acuerdo a las normas del
laboratorio.
•
Almacene el cobre activado bajo hexano en un vaso de precipitados cubierto y debidamente
identificado. Es conveniente activar el cobre al momento de utilizar ya que con el tiempo pierde
afectividad o se desactiva totalmente.
Preparación de la mezcla de diclorometano:pentano (1:1)
•
La mezcla de diclorometano:pentano (1:1) es preparada al mezclar 2 litros de pentano con 2 litros de
diclorometano.
•
Mida 2 litros de pentano utilizando un cilindro graduado y vierta en una botella de 4 litros.
•
Utilizando el mismo cilindro graduado, mida 2 litros de diclorometano y agréguelos a la botella de 4
litros. Tape la botella y agite vigorosamente para lograr un mezclado completo. Agite nuevamente
antes de cada uso.
54
•
Asegure las columnas cromatográficas (30 cm x 13 mm con llave de teflón y reservorio de 250 mL)
a sus soportes dentro de la campana. El total de columnas debe ser el mismo que el número de
extractos.
•
Coloque un recipiente de 250 mL bajo la columna para recoger los disolventes de desecho.
•
Abra la llave y, utilizando una botella de lavado, enjuague las columnas 3 veces con
aproximadamente 10 mL de metanol cada vez seguido de 3 enjuagues con aproximadamente 10 mL
de diclorometano cada vez.
•
Enjuague los extremos de una pinza y de una tijera con diclorometano y corte una porción de lana
de vidrio calcinada suficiente para cubrir el fondo de la columna. Con una varilla de vidrio,
enjuagada con diclorometano, empuje la lana de vidrio hacia el fondo de la columna.
•
Cierre la llave y llene la porción de la columna cromatográficas con diclorometano.
•
Coloque un embudo sobre la columna y agregue un 1 cm de arena lavada dentro de cada columna
utilizando una espátula de acero inoxidable enjuagada con diclorometano.
•
Coloque un vaso de precipitados de 50 mL sobre una balanza calibrada y tare su peso.
•
Pese aproximadamente 10 g (±0,1 g) de alúmina parcialmente desactivada por columna.
•
Vierta la alúmina en la columna utilizando un embudo. Enjuague el embudo y el interior del
reservorio de la columna con pequeñas porciones de diclorometano para asegurarse que toda la
alúmina es transferida hacia la columna. Abra brevemente la llave de la columna para facilitar el
decantado de la alúmina.
•
Luego del agregado de la alúmina, coloque un vaso de precipitados de 50 mL sobre la balanza
calibrada y tare su peso. Pese aproximadamente 20 g (±0,2 g) de sílica parcialmente desactivada por
columna.
•
Agregue diclorometano a cada vaso de precipitados y mezcle bien con una varilla de vidrio hasta no
observar burbujas de gas.
•
Vierta la mezcla de sílica gel/diclorometano dentro de la columna utilizando un embudo. Enjuague
el vaso de precipitados, el embudo y el interior del reservorio de la columna con pequeñas porciones
de diclorometano para asegurarse que toda la sílica es transferida hacia la columna. Abra
brevemente la llave de la columna para facilitar el decantado de la sílica.
•
Agregue 2 cm de sulfato de sodio anhidro o arena lavada y combustionada sobre la sílica. Si es
necesario enjuague el reservorio con pequeñas porciones de diclorometano para asegurar la
transferencia completa de sulfato de sodio anhidro o arena a la columna.
•
Agregue, con cuidado para evitar alterar la superficie de la columna, 1-2 cm de cobre activado (sólo
si se sospecha la presencia de azufre).
•
Abra la llave de la columna para que eluya el diclorometano hasta alcanzar la superficie de cobre
activado, recogiendo los desechos en recipientes adecuados.
•
Agregue 50 mL de pentano y eluya hasta alcanzar la superficie de cobre activado.
•
Cierre la llave y la columna esta lista para recibir el extracto de la muestra.
Purificación del extracto
•
Enjuague la punta inferior de la columna de cromatografía (por debajo de la llave) con
diclorometano
•
Reemplace el recipiente de desechos con un balón de 250 mL. Cada balón deberá estar debidamente
identificado con el código de la muestra y batería de análisis.
•
Transfiera los extractos de los tubos de concentración a las columnas utilizando pipetas Pasteur
descartables. Los extractos de las muestras están, a este punto, concentrados en aproximadamente 2
mL en hexano.
•
Abra la llave de la columna y permita que el extracto se introduzca dentro de la columna. Cierre la
llave.
•
Enjuague el tubo de concentración con 1 ml del disolvente de elución (1:1 diclorometano:pentano) y
agregue el lavado a la columna utilizando la misma pipeta Pasteur por muestra.
•
Abra la llave de la columna y permita que el primer lavado se introduzca dentro de la columna.
Cierre la llave.
•
Repita los dos pasos anteriores con dos enjuagues adicionales del tubo de concentración usando la
mezcla de elución y permitiendo que el lavado se introduzca completamente dentro de la columna
antes del agregado siguiente.
•
Luego de la transferencia completa de los extractos a las columnas y de sus respectivos enjuagues,
agregue, con cuidado para no disturbar la superficie de la columna y evitar así la resuspensión de la
muestra, 200 mL de la mezcla diclorometano:pentano utilizando un cilindro graduado.
•
Abra la llave y eluya la muestra a una velocidad de unos 2 mL por minuto, ajustando la llave como
sea necesario
•
Una vez que ha eluído el volumen total de la mezcla de diclorometano:pentano, cierre la llave.
Retire y cubra el balón. Retire las columnas de cromatografía y deseche apropiadamente la sílica y
alúmina utilizadas.
•
Los extractos limpios de las muestras están listos para ser concentrados para su análisis
instrumental.
55
Limpieza con florisil en columna de cromatografía
Este procedimiento de limpieza es aplicable a los insecticidas carbamatos, herbicidas
triazinas y organofosforados indicados en la aplicación del método. La columna de
cromatografía se llena con hexano, se coloca un tapón de lana de vidrio calcinada en el fondo
de la columna para retener el material adsorbente y sobre ella 1 cm de sulfato de sodio
anhidro o de arena lavada y calcinada para lograr una superficie uniforme. Una cantidad
adecuada de florisil previamente calibrado (usualmente 20 g, ver descripción paso a paso a
continuación) es agregado en seco sobre el hexano y dejado decantar dentro de la columna.
Aproximadamente 1 cm de sulfato de sodio anhidro o de arena lavada y calcinada es
agregada al tope de la columna. En este punto, la columna contiene, en hexano y de abajo
hacia arriba, 1 tapón de lana de vidrio, 1 cm de sulfato de sodio anhidro o de arena lavada,
aproximadamente 20 gramos de florisil calibrado y 1 cm de sulfato de sodio anhidro o de
arena lavada. Se eluye el hexano de la columna hasta alcanzar la superficie superior del
sulfato de sodio anhidro o de arena lavada y se agregan 30 mL de hexano para lavar la
columna. Se permite que el hexano eluya de la columna hasta alcanzar nuevamente la
superficie superior del relleno y la columna está lista para recibir el extracto concentrado de
la muestra. El extracto de la muestra, ajustado a ~2 mL en hexano es transferido a la columna
mediante el uso de una pipeta Pasteur descartable. El agregado es eluído hasta alcanzar la
superficie superior de la columna y el disolvente es recogido en un balón de 500 mL
colocado debajo de la misma. El tubo concentrador que contenía la muestra es enjuagado 2-3
veces con pequeñas porciones (~1-2 mL) de una mezcla de acetona:hexano (1:1) y los
enjuagues agregados a la columna siguiendo el procedimiento anterior entre agregados.
Doscientos cincuenta mL de la mezcla de acetona:hexano se agregan a la columna y son
recogidos en el balón de 500 mL a una velocidad de aproximadamente 3-5 mL por minuto.
Finalmente, el extracto limpio se concentra a un volumen final en acetonitrilo para su análisis
instrumental.
Limpieza con florisil en columna de cromatografía – Paso a paso
Preparación de la mezcla de acetona:hexano (1:1)
•
La mezcla de acetona:hexano (1:1) es preparada al mezclar 2 litros de acetona con 2 litros de
hexano.
•
Mida 2 litros de acetona utilizando un cilindro graduado y vierta en una botella de 4 litros.
•
Utilizando el mismo cilindro graduado, mida 2 litros de hexano y agréguelos a la botella de 4 litros.
Tape la botella y agite vigorosamente para lograr un mezclado completo. Agite nuevamente antes de
cada uso.
56
•
Asegure las columnas cromatográficas (30 cm x 13 mm con llave de teflón y reservorio de 250 mL)
a sus soportes dentro de la campana. El total de columnas debe ser el mismo que el número de
extractos.
•
Coloque un recipiente de 250 mL bajo la columna para recoger los disolventes de desecho.
•
Abra la llave y, utilizando una botella de lavado, enjuague las columnas 3 veces con
aproximadamente 5 mL de metanol cada vez seguido de 3 enjuagues con aproximadamente 5 mL de
diclorometano cada vez.
•
Enjuague los extremos de una pinza y de una tijera con diclorometano y corte una porción de lana
de vidrio calcinada suficiente para cubrir el fondo de la columna. Con una varilla de vidrio,
enjuagada con diclorometano, empuje la lana de vidrio hacia el fondo de la columna.
•
Cierre la llave y llene la porción de la columna cromatográficas con hexano.
•
Coloque un embudo sobre la columna y agregue 1 cm de sulfato de sodio anhidro o de arena lavada
dentro de cada columna utilizando una espátula de acero inoxidable enjuagada con diclorometano.
•
Coloque un vaso de precipitados de 50 mL sobre una balanza calibrada y tare su peso.
•
Pese aproximadamente 20 g de florisil previamente calibrado por columna.
o
Diferentes lotes de florisil pueden variar sus capacidades adsorbentes. Para estandarizar la
cantidad de florisil a utilizar en la columna se sugiere el uso del ácido láurico. Este
procedimiento determina la adsorción de acido láurico, presente en una disolución hexánica, en
miligramos por gramos de florisil (ASTM, 1980).
•
Vierta el florisil en la columna utilizando un embudo. Enjuague el embudo y el interior del
reservorio de la columna con pequeñas porciones de hexano para asegurarse que todo el florisil es
transferido hacia la columna. Abra brevemente la llave de la columna para facilitar el decantado del
florisil.
•
Agregue 2 cm de sulfato de sodio anhidro o de arena lavada y combustionada sobre el florisil. Si es
necesario enjuague el reservorio con pequeñas porciones de hexano para asegurar la transferencia
completa de sulfato de sodio anhidro a la columna.
•
Abra la llave de la columna para que eluya el hexano hasta alcanzar la superficie de la columna,
recogiendo los desechos en un recipiente adecuado.
•
Agregue 30 mL de hexano y eluya hasta alcanzar la superficie del relleno de la columna.
•
Cierre la llave y la columna está lista para recibir el extracto de la muestra.
Purificación del extracto
•
Enjuague la punta inferior de la columna de cromatografía (por debajo de la llave) con hexano.
•
Reemplace el recipiente de desechos con un balón de 500 mL. Cada balón deberá estar debidamente
identificado con el código de la muestra y batería de análisis.
•
Transfiera los extractos de los tubos de concentración a las columnas utilizando pipetas Pasteur
descartables. Los extractos de las muestras están, a este punto, concentrados en aproximadamente 2
mL en hexano.
•
Abra la llave de la columna y permita que el extracto se introduzca dentro de la columna. Cierre la
llave.
•
Enjuague el tubo de concentración con ~1-2 ml del disolvente de elución (1:1 acetona:hexano) y
agregue el lavado a la columna utilizando la misma pipeta Pasteur por muestra.
•
Abra la llave de la columna y permita que el primer lavado se introduzca dentro de la columna.
Cierre la llave.
•
Repita los dos pasos anteriores con dos enjuagues adicionales del tubo de concentración usando la
mezcla de elución y permitiendo que el lavado se introduzca completamente dentro de la columna
antes del agregado siguiente.
•
Luego de la transferencia completa de los extractos a las columnas y de sus respectivos enjuagues,
agregue, con cuidado para no disturbar la superficie de la columna y evitar así la resuspensión de la
muestra, 250 mL de la mezcla acetona:hexano utilizando un cilindro graduado.
•
Abra la llave y eluya la muestra a una velocidad de unos 3-5 mL por minuto, ajustando la llave
57
como sea necesario
•
Una vez que ha eluído el volumen total de la mezcla de acetona:hexano, cierre la llave. Retire y
cubra el balón. Retire las columnas de cromatografía y deseche apropiadamente el florisil utilizado.
•
Los extractos limpios de las muestras, concentrados a un volumen final en acetonitrilo, están listos
para ser concentrados para su análisis instrumental.
6.4. Extracción y limpieza de muestras de suelos/sedimentos y biota
Introducción
La determinación de contaminantes orgánicos, tales como plaguicidas, en suelos, sedimentos
y biota requiere la extracción y aislamiento de estos contaminantes de la matriz. Una porción
de la muestra de suelo/sedimento o tejido homogenizado es secada químicamente con sulfato
de sodio anhidro y extraído con diclorometano:acetona (1:1) utilizando un aparato Soxhlet.
El extracto es concentrado y purificado utilizando una columna de cromatografía con sílica
gel y alúmina o florisil, según corresponda, antes del análisis instrumental. Muestras de
control de calidad son procesadas, con cada lote de muestras, de manera idéntica a éstas.
La evaluación de contaminantes orgánicos en muestras ambientales requiere su medición a
niveles trazas (ng g-1 o pg g-1). Diez a 30 g de suelos o sedimentos y 10 a 15 g de tejido
secados químicamente necesitan ser extraídos con disolventes utilizando un aparato Soxhlet.
Seguidamente, el extracto es concentrado y purificado utilizando cromatografía en columna
con sílica gel y alúmina o florisil para remover posibles materiales interferentes.
Aplicación
Este método de extracción y limpieza de muestras de suelos, sedimentos y biota es aplicable
a los siguientes analitos:
Uracil herbicidas
Urea herbicidas
58
Clorotalonil
Ametrina
Atraton
Atrazina
Prometon
Carbaril
Clorpirifos
Diazinon
Permetrina
Bromacil
Diuron
Aldrin
alpha-clordano
Dieldrin
4,4'-DDD
4,4'-DDE
4,4'-DDT
Endrin
Prometrina
Propazina
Secbumeton
Simetrina
Carbofurán
Fenamifos
Metil paratión
Endosulfan I
Endosulfan II
Endosulfan sulfato
Endrin aldehido
Endrin cetona
Simazina
Terbutilazina
Terbutrina
Oxamil
alpha-HCH
beta-HCH
delta-HCH
gamma-HCH (Lindano)
Heptacloro
Heptacloro epóxido
Metoxicloro
Recolección de la muestra, preservación y almacenamiento
La muestra de suelo/sedimento o biota debe ser colectada y colocada en recipientes de vidrio
previamente tratados para estar libres de contaminantes orgánicos. De no ser posible su
congelamiento inmediato, la muestra debe ser mantenida en hielo hasta su arribo al
laboratorio donde debe ser almacenada a -20°C en su recipiente original hasta su análisis. Al
preparar la muestra para su análisis, la misma debe dejarse descongelar en un refrigerador.
Una vez descongelada, la muestra se homogeniza según corresponda. Las muestras de
sedimentos pueden homogenizarse con una espátula previamente lavada con agua y
jabón/detergente de laboratorio, secada con acetona de baja calidad y secuencialmente
enjuagada una vez con acetona, dos con hexano, y dos con diclorometano; estos últimos
enjuagues con disolventes calidad plaguicidas. Las muestras de tejido (biota) deben
homogenizarse utilizando un moledor de tejidos. Luego de retirar la porción necesaria para
su análisis, 10 a 30 g para suelos/sedimentos y 10 a 15 g para biota, el sobrante es
almacenado en oscuridad a -20°C. Los extractos de las muestras son mantenidos a 4°C, o
menos, hasta su análisis instrumental; luego de lo cual deben ser también almacenados en
oscuridad a -20°C.
Equipos y materiales
Materiales de laboratorio
Todo material de vidrio de laboratorio debe ser lavado con agua y jabón/detergente de
laboratorio, secado con acetona y secuencialmente enjuagado una vez con acetona, dos con
hexano, y dos con diclorometano; estos últimos enjuagues con disolventes calidad
plaguicidas. Alternativamente, el material no volumétrico, se puede dejar secar destapado y
una vez seco, tapar con papel de aluminio y quemar en mufla a 440°C por 4 horas. Dejar
enfriar y guardar en un lugar protegido, sin remover el papel de aluminio hasta el momento
de su utilización.
Los siguientes materiales de laboratorio son necesarios para este método:
- Balanza analítica con capacidad de pesar 0,0001 mg
- Balanza analítica con capacidad de pesar 0,1 g
- Balones de fondo plano (o redondo) de 250 y 500 mL
- Baño de agua con calentamiento regulado a 60-70°C
- Cartuchos de celulosa o cerámicos previamente extraídos en aparato Soxhlet
- Cilindros graduados, 250 y 1000 mL de capacidad
- Columnas cromatográficas de 300 mm de longitud x 13 mm de diámetro interno con
reservorio superior de 250 mL y llave de teflón.
- Columnas de concentración tipo Snyder de tres bolas
- Desecador
- Embudos, diferentes tamaños de vidrio borosilicato
59
- Espátulas de acero inoxidable
- Estufa con circulación de aire regulado a 63-65°C
- Extractores Soxhlet
- Gas nitrógeno para evaporación
- Lana de vidrio calcinada a 440°C por 4 horas o previamente extraída con disolventes
- Micro pipeta de 100 µL
- Núcleos de ebullición, de vidrio o teflón, previamente lavados con disolventes
- Papel de aluminio calcinado
- Pinzas
- Pipetas Pasteur descartables de 1 mL y bulbos de goma
- Tijeras
- Tubos concentradores tipo Kuderna-Danish de 25 mL, graduados y con tapones
esmerilados de vidrio
- Varilla de vidrio de 50 cm
- Vasos de precipitados de 10 mL para la determinación de peso seco
- Vasos de precipitados de 50, 250 y 500 mL
- Viales de vidrio oscuro de 1 y 7 mL con tapa protegida con película de teflón
Todo material volumétrico para medidas de la muestra o agregado de estándares y
disoluciones de enriquecimiento debe ser previamente calibrado.
Reactivos
- Acetona, calidad plaguicidas o equivalente
- Acido clorhídrico, grado reactivo 12 N
- Agua libre de contaminantes orgánicos
- Alúmina, Básica Brockmann I, grado cromatográfico, ~150 mesh o equivalente,
activada a 440°C por 4 horas y mantenida en estufa a 120°C. Para utilizar, se deja
enfriar a temperatura ambiente en desecador
- Arena lavada y calcinada a 440°C por 4 horas
- Cobre metálico, grado analítico, 20-30 mesh
- Diclorometano, calidad plaguicidas o equivalente
- Hexano, calidad plaguicidas o equivalente
- Florisil calibrado
- Pentano, calidad plaguicidas o equivalente
- Sílica, Grado 923, 100-200 mesh o equivalente, activada en estufa a 170°C por 24
horas antes de utilizar; dejar enfriar a temperatura ambiente al usar
- Disolución de enriquecimiento
- Disolución de estándares internos
- Disolución de estándares de recuperación
60
- Sulfato de sodio (Na2SO4), granular anhidro, calcinado a 440°C por 4 horas y
mantenido en estufa a 120°C. Para utilizar, se deja enfriar a temperatura ambiente en
desecador
Procedimiento
La Figura 12 ilustra la marcha analítica a seguir para la determinación de distintos
plaguicidas en muestras sólidas (suelos/sedimentos o biota).
Determinación de peso seco (porcentaje de humedad)
Una alícuota de aproximadamente 1 g de muestra de suelos, sedimentos o tejido
perfectamente homogenizada es pesada en un vaso de precipitados, previamente tarado, de
10 mL. Después de secada en estufa con circulación de aire a 63-65°C por 24 horas, la
alícuota es pesada y regresada a la estufa por 2 horas antes de una segunda pesada. Si la
diferencia entre las dos pesadas es menor a 0,02 g, la segunda lectura es utilizada para
calcular el porcentaje de peso seco de la muestra. Si la diferencia es mayor a 0,02 g, se
regresa la muestra a la estufa y se vuelve a pesar después de 2 horas y así sucesivamente
hasta obtener una diferencia de peso igual o menor a 0,02 g.
61
Figura 12. Diagrama de flujo del análisis de plaguicidas en muestras sólidas
62
Determinación de peso seco (porcentaje de humedad) - Paso a paso
•
cuaderno de calibración del laboratorio. Registre la fecha de calibración, pesa utilizada e iniciales del
operador.
•
Tare la balanza vacía hasta que el indicador de peso lea “0,000 g”.
•
Coloque un vial o vaso de precipitados de 10 mL y registre el peso del mismo (“Peso del Vial”).
•
Revuelva cuidadosamente, con una espátula de acero inoxidable previamente lavada con disolventes,
la muestra ya homogenizada de suelo/sedimento o tejido y pese, sin volver a tarar la balanza,
aproximadamente 1-2 g de muestra dentro del vial (“Vial+Muestra húmeda”)
•
Prepare las muestras destinadas al control de calidad (blanco, muestra duplicada, muestra enriquecida
y material de referencia) de la misma manera que las demás muestras. En el caso del blanco, el “Peso
del Vial” y “Vial+Muestra húmeda” serán iguales.
•
Registre cualquier característica de las muestras que le llame la atención mientras trabaja (olor, color,
trozos de vegetación en suelos/sedimentos, etc.)
•
Una vez finalizadas todas las muestras, coloque los viales con las muestras húmedas dentro de una
bandeja de laboratorio y coloque en estufa con circulación de aire a 63-65°C por 24 horas.
•
Pasadas las 24 horas, retire con cuidado y protección adecuada, la bandeja de la estufa y coloque en
desecador. Permita que los viales se equilibren con la temperatura del laboratorio por 30 minutos.
•
operador.
•
•
Coloque uno de los viales y registre el peso del mismo (“Vial+Muestra seca #1”).
•
Finalizados todos los viales, regrese la bandeja a la estufa a 63-65°C por 2 horas.
•
Después de las 2 horas, retire la bandeja de la estufa con cuidado y protección adecuada la bandeja de
la estufa y coloque en desecador. Permita que los viales se equilibren con la temperatura del
laboratorio por 30 minutos.
•
operador.
•
•
Coloque uno de los viales y registre el peso del mismo (“Vial+Muestra seca #2”).
•
Si la diferencia entre las dos últimas lecturas es menor o igual a 0,02 g, calcule el porcentaje de peso
seco utilizando la segunda lectura.
•
Si la diferencia es mayor a 0,02 g regrese la muestra a la estufa por 2 horas y repita el pesado como se
indicó.
•
Determine la Diferencia Porcentual Relativa (DPR) entre los pesos secos calculados para la muestra
original y muestra duplicada. La DPR debería estar entre los rangos especificados por el laboratorio
como aceptables, generalmente ±25%. Si la DPR es mayor a ±25% vuelva a pesar ambas muestras
para corroborar los pesos y/o revise los cálculos. Si después de recalcular los pesos secos, la DPR
continua siendo mayor a ±25%., notifique a su supervisor antes de proseguir.
63
•
Para el blanco, la diferencia absoluta de los pesos del vial antes y después del secado debería ser igual
o menor a 0,02 g.
Cálculos
⎛ (Vial + Muestra Seca) - (Peso del Vial) ⎞
⎟⎟ *100
% Peso Seco = ⎜⎜
⎝ (Vial + Muestra húmeda) - (Peso del Vial) ⎠
⎤
⎡
⎢ % Peso Seco Muestra Original - % Peso Seco Muestra Duplicada ⎥
⎥ * 100
Diferencia Porcentual Relativa = ⎢
⎢ ⎛ % Peso Seco Muestra Original + % Peso Seco Muestra Duplicada ⎞ ⎥
⎟⎥
⎢⎜
2
⎠⎦
⎣⎝
Extracción de la muestra
Una cantidad pesada de muestra, 10 a 30 g para sedimentos y 10- 15 g para tejidos, es secada
químicamente con sulfato de sodio anhidro. La mezcla sulfato de sodio anhidro:muestra
(proporción de 3-5 partes de sulfato de sodio anhidro por 1 parte de muestra) debe ser
constantemente revuelta con una espátula de acero inoxidable hasta que la muestra esté seca
para evitar que se consolide. La muestra seca es transferida a un cartucho de celulosa o
cerámico y éste es colocado en el extractor Soxhlet. Trecientos mL de diclorometano:acetona
(1:1) y 3-5 núcleos de ebullición son agregados a un balón de 500 mL. El extractor es unido
al balón y el cartucho, con muestra en su interior, es humedecido con unos 50 mL de
diclorometano.
Una vez armado el extractor Soxhlet, cada muestra y muestras correspondientes al control de
calidad son sembradas con los estándares de recuperación correspondientes y, aquellas
seleccionadas a ser enriquecidas, con la disolución conocida de analitos. El extractor Soxhlet
es colocado sobre una fuente de calentamiento por un mínimo de 8 horas con un ciclo de
extracción cada 5-6 minutos (e.g. 10-12 ciclos por hora).
Terminada la extracción, se adosa una columna tipo Snyder de tres bolas al balón de 500 mL
y el extracto es concentrado a 10-15 mL sobre baño de agua a 60-65°C. La concentracióm
del extracto puede realizarse en rotoevaporador cuidando de que la temperatura del baño de
agua no sobrepase los 35°C. Si el extracto contiene algo de la muestra qua ha pasado o
material particulado, éste debe ser filtrado antes de su concentración utilizando un embudo de
vidrio que contenga sulfato de sodio sobre un tapón de lana de vidrio calcinada. El extracto
concentrado a 10-15 mL es transferido a un tubo de concentración de 25 mL. El balón de 500
mL es enjuagado 2 ó 3 veces con diclorometano:acetona (1:1) y los enjuagues transferidos al
tubo de concentración. Se agrega un núcleo de ebullición, el extracto es concentrado y el
disolvente cambiado en hexano sobre baño de agua a 60-65°C bajo una suave corriente de
nitrógeno. Volumen final del extracto antes de la limpieza en columna de cromatografía debe
ser de aproximadamente 2 ml en hexano.
64
Extracción de la muestra – Paso a paso
•
Agregue 300 mL de diclorometano:acetona (1:1) a un balón identificado claramente con el código
identificatorio de la muestra y batería analítica, agregue 5-6 núcleos de ebullición y conecte el
extractor Soxhlet al balón.
o
Preparación de la mezcla de diclorometano:acetona (1:1)
9
La mezcla de diclorometano:acetona (1:1) es preparada al mezclar 2 litros de diclorometano
con 2 litros de acetona.
9
Mida 2 litros de diclorometano utilizando un cilindro graduado y vierta en una botella de 4
litros.
9
Utilizando el mismo cilindro graduado, mida 2 litros de acetona y agréguelos a la botella de 4
litros. Tape la botella y agite vigorosamente para lograr un mezclado completo. Agite
nuevamente antes de cada uso.
•
Utilizando una espátula de acero inoxidable previamente enjuagada con diclorometano, transfiera la
cantidad deseada de muestra homogenizada, 10 a 30 g de suelo/sedimentos o 10-15 g de tejido, a un
vaso de preciptados de 250 mL.
•
Mezcle la muestra con sulfato de sodio anhidro, en proporción de 3-5 partes de sulfato de sodio
anhidro por 1 parte de muestra, para secarla cuidando de revolver continuamente para evitar que la
mezcla se consolide.
•
Con una espátula, previamente lavada, transfiera la muestra seca a un cartucho de extracción, de
celulosa o cerámico, previamente extraído con diclorometano por 8 horas a 10-12 ciclos por hora. Con
una pinza enjuagada con diclorometano acomode el cartucho dentro del extractor Soxhlet y agregue 50
mL de diclorometano:acetona (1:1) para humedecer la muestra con cuidado de no empujarla fuera del
cartucho.
•
Adicione los estándares de recuperación a todas las muestras, incluyendo las muestras destinadas al
control de calidad, y adicione las disoluciones de analitos de interés a las muestras a ser enriquecidas.
•
Conecte un condensador al Soxhlet, coloque sobre la fuente de calentamiento y extraiga, como
mínimo, durante 8 horas bajo campana. Ajuste la temperatura hasta lograr un ciclo de extracción cada
5-6 minutos ó 10-12 ciclos por hora. Tenga especial cuidado en controlar periódicamente que se
produzca el ciclo cuando el disolvente en el extractor Soxhlet está a nivel del sifón y que no esté
simplemente rebalsando gota a gota.
•
En general, se espera tener un total de 50-60 ciclos. Si los ciclos son más largos se puede mantener la
extracción por más horas. En esta situación, se debe tener cuidado de tener suficiente volumen de
diclorometano:acetona (1:1) en el balón para realizar el ciclo y una reserva para evitar perdidas por
recalentamiento o secado. Agregar disolvente al balón si es necesario.
•
Una vez finalizada la extracción, deje enfriar el extractor Soxhlet hasta que paren los ciclos y retire el
condensador.
•
Agregue unos 4-5 núcleos de ebullición frescos al balón, conecte una columna de destilación tipo
Snyder de tres bolas y coloque el balón en un baño de agua a 60-65°C para concentrar el volumen a
10-15 mL. Alternativamente, el extracto puede ser concentrado en un rotoevaporador cuidando que la
temperatura del baño de agua no sobrepase los 35°C.
•
Transfiera el volumen a un tubo de concentración de 25 mL y enjuague el balón con pequeñas
porciones de diclorometano:acetona (1:1). Colecte los líquidos de lavado en el mismo tubo de
concentración. Agregue un núcleo de ebullición al tubo de concentración y coloque sobre baño de agua
a 60-65°C hasta concentrar el extracto a aproximadamente 1 mL en diclorometano:acetona (1:1).
•
Sin retirar del baño, agregue al tubo de concentración 10 mL de hexano y lleve nuevamente a 1 mL
bajo corriente suave de nitrógeno. Repita este paso tantas veces como sea necesario hasta reemplazar
65
todo el diclorometano:acetona (1:1) por hexano, lo cual se evidencia por la ausencia de ebullición en el
extracto.
Limpieza con sílica gel/alúmina en columna de cromatografía
La limpieza de los extractos de muestras de suelos, sedimentos y biota se puede realizar
como se indica para las muestras de agua (ver Extracción y limpieza de muestras de agua
para el análisis de plaguicidas).
6.5. Determinación cuantitativa de plaguicidas por cromatografía de gases con
detector de captura electrónica
Introducción
Los insecticidas clorados son rutinaria y cuantitativamente determinados mediante la técnica
de cromatografía de gases asociada a un detector de captura electrónica (GC/ECD, por sus
siglas en inglés). Esta técnica es muy sensible y capaz de determinar estos compuestos
contaminantes a niveles trazas (e.g., ng g-1 o pg g-1). El método que se describe es aplicable a
extractos de agua, suelos/sedimentos y biota luego de la limpieza apropiada.
Una gran variedad de compuestos clorados pueden ser determinados por cromatografía de
gases asociada a un detector de captura electrónica al utilizar técnicas de extracción y
limpieza, disoluciones de calibración y métodos de cromatografía adecuados. Si bien con este
método se pueden determinar, de manera rutinaria, la concentración de muchos compuestos,
los analitos de interés para este estudio se limitan a:
Uracil herbicidas
Urea herbicidas
66
Clorotalonil
Clorpirifos
Diazinon
Permetrina
Bromacil
Diuron
Aldrin
alpha-clordano
Dieldrin
4,4'-DDD
4,4'-DDE
4,4'-DDT
Endrin
Fenamifos
Metil paratión
Endosulfan I
Endosulfan II
Endosulfan sulfato
Endrin aldehido
Endrin cetona
alpha-HCH
beta-HCH
delta-HCH
gamma-HCH (Lindano)
Heptacloro
Heptacloro epóxido
Metoxicloro
Límites de detección
Los límites de detección del método para los análisis rutinarios deben ser determinados
siguiendo las indicaciones proporcionadas en el Federal Register (1984) y resumidas en el
cuadro siguiente. En su defecto se pueden utilizar las concentraciones de la disolución de
calibración más baja usada en los análisis, ajustada por el peso o volumen de muestra
extraída.
Definición y procedimientos para la determinación de los límites de detección del método
Definición
El límite de detección del método (LDM) se define como la concentración mínima de una substancia que
puede ser medida y reportada con una certeza del 99% de que la concentración determinada es distinta de
cero. El LDM debe ser determinado a partir del análisis de una matriz específica que contiene el analito.
Aplicación
Este método esta designado para ser aplicado a una variedad de muestras que van desde el blanco del método
a distintas matrices. El LDM para un método analítico bien definido puede variar de acuerdo al tipo de
muestra y es esencial que todos los pasos analíticos detallados en el método analítico sean incluidos al
determinar el LDM.
Procedimiento
1.
Estime el limite de detección del método como:
9
El valor de la concentración que corresponde a una relación señal:ruido del instrumento de 3 a 5
9
La concentración equivalente al valor que corresponde a tres veces el desvío estándar de
análisis replicados del analito en agua
2.
Si el MDL va a ser determinado en agua, consiga un agua libre del analito bajo estudio y proceda
con el estudio como se indica más abajo.
3.
Si el MDL va a ser determinado en cualquier otro tipo de matriz (suelos, sedimentos, biota), analice
la muestra para determinar la concentración del analito bajo estudio.
4.
9
Si la concentración determinada está comprendida entre dos a cinco veces el límite de detección
estimado, proceda con el estudio como se indica a continuación.
9
Si la concertación determinada es mayor al rango recomendado, trate de conseguir una muestra
de la misma matriz proveniente de un área no contaminada.
9
Si la presencia del analito no es detectada, proceda con el estudio como se indica a
continuación.
Una vez determinada la concentración nativa del analito, analice un mínimo de siete alícuotas
(enriquezca, si en la muestra no se detectó el analito bajo estudio, o analice sin agregados, si la
concentración del analito resulto dentro de los límites recomendados) y procese de acuerdo al
método analítico. Incluya un blanco de método en la batería analítica.
9
Si esta determinación confirma que la concentración del analito está dentro del rango
recomendado, prosiga con los cálculos
9
Si esta determinación indica que la concentración del analito está por fuera del rango
recomendado, obtenga una nueva muestra y repita los pasos 2-4.
67
5.
Calcule la varianza (S) y desvíación estándar (s) de las medidas replicadas:
⎡ n
⎛
1 ⎢
S =
X i2 − ⎜
⎜
(n - 1) ⎢ i =1
⎝
⎣
∑
2
n
∑
i =1
2
⎤
⎞
⎟
X i / n⎥
⎟
⎥
⎠
⎦
s = S2
donde:
Xi, i=1 a n son los resultados analíticos finales obtenidos de las alícuotas analizadas
Σ es la suma de los valores X de i=1 a n
6.
Calcule el LDM de la siguiente manera:
LDM = t (n-1, 1-α =0.99) (s)
donde:
LDM = límite de detección del método
t(n-1, 1-α=0.99) = valor “t” del test de Student apropiado para un nivel de confianza de 99% y un
desvío estándar con n-1 grados de libertad
s = desvío estándar de los análisis replicados
7.
El intervalo de confianza del 95% para el LDM calculado en el punto 6 se calcula de acuerdo a las
siguientes ecuaciones derivadas de la distribución Chi-cuadrado para los grados de libertad.
Límite de confianza inferior (LCI) = 0,64 LDM
Límite de confianza superior (LCS) = 2,20 LDM
Control de calidad de los análisis
Los controles de calidad requeridos para el análisis cuantitativo de los compuestos de interés
están resumidos en Tabla 13 y discutidos en detalle a continuación. Estos criterios pueden ser
modificados por el encargado del laboratorio según lo considere necesario.
Identificación cualitativa de compuestos de interés
La identificación cualitativa de un analito en el extracto de muestra se basa en la
comparación del tiempo de retención del mismo con el tiempo promedio observado para ese
compuesto en las disoluciones de calibración. La diferencia no debe ser mayor a ±4
segundos. El analista experimentado debe utilizar la selección manual de picos y corrección
de la línea de base cuando sea apropiado y ajustar el tamaño de la ventana de tiempo de
retención para asegurar que todos los compuestos sean identificados correctamente. La
intensidad del pico elegido no debe ser menor a tres veces el ruido de base.
68
Calibración del instrumental
La calibración del instrumento para el análisis de plaguicidas puede hacerse siguiendo uno de
los siguientes métodos:
Tabla 13. Requerimientos de control de calidad para el análisis cuantitativo de
plaguicidas
Parámetro
Criterio de Control de
Calidad
Frecuencia
-
(método A)
Disperso entre las muestras de cada
batería analítica
-
(método B)
-
Blanco de instrumento
Mínimo de 4 disoluciones de
calibración con un coeficiente de
correlación >0,990
Mínimo de 4 disoluciones de
calibración con un coeficiente de
correlación >0,990
Control de calibración (ConCal);
no mayor a ±15% de las
concentraciones nominales
Instrumental libre de
contaminación
-
Control de degradación en el
sistema
-
Recuperación de estándares de
recuperación
-
Blanco de laboratorio
-
Duplicado
-
enriquecido
enriquecido en duplicado (si
existe)
-
-
Material de referencia
certificado
-
Muestra enriquecida
Muestra enriquecida en
duplicado (si existe)
La degradación de compuestos
más lábiles no debe ser mayor al
15%
Recuperación entre 40 a 120%
de todos los estándares de
recuperación
No más de dos analitos
detectados en concentraciones
>3 veces el límite de detección
del método
Diferencia porcentual relativa
<30% para todos los analitos de
interés que resulten >10 veces el
límite de detección del método
para el 80% de los analitos de
interés
interés
Recuperación del 80% de los
analitos de interés, presentes en
concentraciones >10 veces el
límite de detección del método,
dentro del rango certificado
para el 80% de los analitos de
interés
interés
Al comienzo de un período y control
cada 12 horas como mínimo
Antes de realizar la calibración (o
control de calibración) y de
comenzar el análisis de las muestras
Antes de realizar la calibración (o
control de calibración) y de
comenzar el análisis de las muestras
Todas las muestras, incluyendo
muestras destinadas al control de
calidad de los análisis
Uno por batería analítica
Uno por batería analítica
Uno por batería analítica. Pueden
reemplazar la muestra enriquecida y
muestra enriquecida en duplicado si
no se dispone de suficiente material
Uno por batería analítica si está
disponible. Puede ser reemplazado
por una muestra enriquecida
Uno por batería analítica. Pueden
ser reemplazados por el blanco
enriquecido y blanco enriquecido en
duplicado si no se dispone de
suficiente material
69
•
La calibración puede realizarse como parte de la corrida analítica en donde las
cuatro disoluciones de calibración se colocan dispersos entre las muestras de la
batería analítica. La curva de calibración es construida con estos cuatro niveles y
es considerada como aceptable si presenta un coeficiente de correlación lineal (r)
≥ 0,9950 (i.e., R2 ≥0,9900) para todos los analitos presentes en las disoluciones.
Si este criterio no se satisface para un analito en particular y el mismo se
encuentra presente en las muestras, la calibración debe realizarse nuevamente
seguida del análisis de las muestras.
•
La calibración puede realizarse antes de correr las muestras y debe satisfacer los
requerimientos mencionados en el primer método. En este caso, la calibración
debe controlarse durante una corrida mediante la inyección de disoluciones para
controlar la calibración (“ConCal”) con períodos no mayores a 12 horas entre uno
y otro. Esta calibración puede durar días o semanas pero debe controlarse al
comenzar una batería analítica y cada 12 horas, como máximo, durante la misma.
Los niveles de concentración dependen del tipo de plaguicida y sensibilidad del equipo por lo
que pueden ser ajustados según sea necesario.
Blanco del instrumento
El blanco de instrumento (o blanco de disolvente) es inyectado y analizado antes de cada
secuencia analítica para verificar la operación del cromatógrafo y la ausencia de
contaminación. Los análisis no deben ser iniciados hasta que el blanco del instrumento esté
completamente libre de compuestos contaminantes. En caso de problemas con el blanco del
instrumento, se deben tomar acciones correctivas como, por ejemplo, inyecciones repetidas
de disolvente, limpieza del puerto de inyección, cambio del inserto de vidrio, retiro de una
porción de la columna de cromatografía o reemplazo total de la columna.
Control de la degradación en el puerto de inyección
Después de comprobar que el instrumental se encuentra libre de contaminantes, se debe
controlar que el sistema no presenta sitios activos que puedan degradar a los compuestos más
lábiles. Una disolución de compuestos seleccionados (e.g., DDT y Aldrin que son conocidos
por su degradación en el puerto de inyección bajo ciertas condiciones) es utilizada para
verificar si el sistema es inerte. La degradación de estos compuestos en la puerta de inyección
no debe ser mayor a un 15% de la cantidad inyectada para considerar que el sistema está listo
para iniciar una corrida analítica. Si la degradación de cualquiera de estos compuestos es
mayor al 15% se debe corregir el problema antes de comenzar con los análisis. Esto puede
representar el cambio del inserto de vidrio y del sello inferior del inyector o retiro de una
porción de la columna.
70
Criterio para el control de calidad de las muestras
Las muestras dedicadas al control de calidad dentro de un lote analítico deben ser evaluadas
en conjunto ya que el incumplimiento de los criterios preestablecidos en una de esas muestras
no significa necesariamente el rechazo de todas las muestras en esa extracción.
El blanco de laboratorio (o blanco de método) es utilizado para demostrar que no existieron
problemas de contaminación en el laboratorio durante el procesamiento de la batería
analítica. Se requiere un blanco del método para cada grupo de muestras que son procesadas
al mismo tiempo.
•
Un blanco es aceptable cuando no contiene más de dos analitos de interés en
concentraciones mayores a 3 veces los límites de detección establecidos. Si
existieran más de dos analitos de interés en el blanco en concentraciones mayores
a 3 veces los límites de detección del método (LDM), puede necesitarse la reextracción de todas las muestras.
•
Si cualquiera de los analitos de interés detectados en el blanco de laboratorio
presenta una concentración mayor a 3 veces el límite de detección, pero no es
detectado en las muestras en concentraciones mayores al límite de detección, el
resultado de ese analito en el blanco debe ser identificado como “3>LDM” y se
continúa con el análisis.
•
Cuando un analito de interés se detecta en el blanco de laboratorio en una
concentración mayor a 3 veces el límite de detección y la concentración del
mismo compuesto en las muestras es 10 veces mayor que la concentración
encontrada en el blanco, el valor en el blanco es identificado como “3>LDM” y
las muestras se reportan como tal.
•
Cuando un analito de interés se detecta en el blanco de laboratorio en una
concentración mayor a 3 veces el límite de detección y la concentración del
mismo compuesto en las muestras es menor a 10 veces la concentración
encontrada en el blanco, las muestras de esa batería analítica deberán ser reextraídas y re-analizadas. Si no se dispone de suficiente muestra para hacerlo, las
concentraciones encontradas se pueden reportar pero el analito en el blanco debe
ser identificado con el calificador “3>LDM” y en las muestras con el calificador
“B.”
Blanco de laboratorio enriquecido y blanco de laboratorio enriquecido en duplicado
El blanco de laboratorio enriquecido es utilizado para estimar la precisión analítica del
método. Puede reemplazar a la muestra enriquecida cuando no se dispone de suficiente
material para producirla. El blanco de laboratorio enriquecido en duplicado es utilizado para
estimar la precisión analítica y, conjuntamente con el blanco de laboratorio enriquecido, la
exactitud de los análisis. Se requiere un blanco de laboratorio enriquecido en cada batería
analítica.
71
•
El análisis de un blanco de laboratorio enriquecido es aceptable cuando el 80% de
los analitos de interés presentan una recuperación entre 40 y 120% de la cantidad
sembrada.
•
Si el criterio anterior no se cumple, se impone una acción correctiva la cual puede
incluir la revisión de los cálculos y/o re-análisis, re-extracción del grupo de
muestras y re-calibración o mantenimiento del equipo
•
Si la batería analítica incluye un blanco de laboratorio enriquecido en duplicado,
las recuperaciones de analitos sembrados en este y en el blanco de laboratorio
enriquecido no deben presentar una Diferencia Porcentual Relativa mayor al 30%.
Material de referencia certificado
El análisis de un material de referencia certificado es utilizado para estimar la precisión
analítica del método. Si no se dispone de un material de referencia certificado el blanco de
laboratorio enriquecido puede utilizarse con este propósito. Se requiere el análisis de un
material de referencia certificado en cada batería analítica.
•
El análisis de un material de referencia certificado es aceptable cuando el 80% de
los analitos de interés, presentes en el material en concentraciones mayores a 10
veces el LDM, se encuentran dentro de los rangos de concentraciones certificadas
•
Si el criterio anterior no se cumple, es necesario revisar las integraciones e
identidad de los picos del cromatograma, repasar los cálculos o re-inyectar el
extracto. Si aún no se cumple con el criterio de control de calidad, se deberá
decidir la re-extracción de las muestras.
Muestra enriquecida y muestra enriquecida en duplicado
El análisis de la muestra enriquecida es utilizado para estimar la exactitud de los análisis en
presencia de la matriz. La muestra enriquecida en duplicado es utilizada para estimar la
precisión analítica y, conjuntamente con la muestra enriquecida, la exactitud de los análisis.
Se requiere una muestra enriquecida en cada batería analítica. Cuando no se dispone de
material suficiente para producir una muestra enriquecida, la misma puede ser sustituida por
el blanco de laboratorio enriquecido.
72
•
El análisis de la muestra enriquecida es aceptable cuando la recuperación del 80%
de los analitos de interés se encuentran entre 40 y 120% de la cantidad sembrada.
Es posible que la recuperación de uno o varios analitos se vea invalidada por las
altas concentraciones presentes naturalmente en la muestra. En este caso, sólo se
consideran, para el cómputo, las recuperaciones de los analitos que no presentan
este problema. Si la mayoría de o todos los analitos presentan este problema, se
dice que la muestra seleccionada para su enriquecimiento no es válida.
•
Si las concentraciones nativas en la muestra no son un problema y más del 20%
de los analitos de interés presentan recuperaciones por fuera de los límites
establecidos, se debe considerar revisar las integraciones e identidades de los
picos del cromatograma, repasar los cálculos, re-analizar el extracto o, incluso, la
re-extracción de las muestras.
•
Si el criterio anterior no se cumple, es necesario revisar las integraciones e
identidad de los picos del cromatograma, repasar los cálculos o re-inyectar el
extracto. Si aún no se cumple con el criterio de control de calidad, se deberá
decidir la re-extracción de las muestras.
•
Si la batería analítica incluye una muestra enriquecida en duplicado, las
recuperaciones de analitos sembrados en esta y en la muestra enriquecida no
deben presentar una diferencia porcentual relativa mayor al 30%.
Muestra duplicada
El análisis de la muestra duplicada es utilizado para estimar el grado de homogeneidad de las
muestras y, en conjunto con la muestra original, la precisión de los análisis. Se requiere una
muestra enriquecida en cada batería analítica. Se espera que las diferencias porcentuales
relativas entre las concentraciones encontradas en la muestra original y muestra duplicada
sean menores al 25%. Si estas diferencias son mayores en más de un 20% de los analitos
detectados en concentraciones mayores a 10 veces el límite de detección se requiere una
acción correctiva. Esto puede incluir, revisión de las integraciones e identidades de los picos
del cromatograma y cálculos, re-inyección y re-análisis de ambas muestras, mantenimiento
y/o nueva calibración del equipo o re-extracción de la batería analítica.
Estándares de recuperación e internos
Todas las muestras, incluyendo aquellas introducidas por el laboratorio y destinadas al
control de calidad, son sembradas con las cantidades adecuadas de los estándares de
recuperación apropiados para el análisis de plaguicidas. Estos estándares son utilizados para
determinar la concentración de los analitos de interés y para evaluar el comportamiento del
método. Esto se hace utilizando como referencia a uno o más estándares internos. Distintos
análisis pueden requerir diferentes estándares de recuperación e internos y los límites de
recuperación aceptables para estándares de recuperación son definidos durante el desarrollo
del método.
•
En general, el análisis rutinario de plaguicidas requiere que la recuperación de los
estándares agregados esté comprendida entre el 40 al 120% de la cantidad
sembrada. Si esto no se logra, se deben revisar los cálculos, posibles interferencia
con cualquiera de los dos tipos de estándares (de recuperación e internos), errores
de siembra, etc. En el caso de recuperaciones constantemente por encima de
120%, se debe sospechar una posible concentración de la disolución que lo(s)
contiene(n).
•
Si la recuperación del estándar utilizado para determinar las concentraciones de
los analitos de interés en una muestra presenta una recuperación por encima del
120% se debe sospechar la existencia de interferencias si el mismo estándar en las
disoluciones de calibración y demás muestras de la batería analítica está en
73
control. De ser posible, es conveniente tener más de un estándar de recuperación
para evitar este problema.
•
Si la causa de una recuperación fuera de límites no es identificada, el extracto
debe ser re-analizado. Si el re-análisis rinde una recuperación dentro de los límites
establecidos, la muestra puede ser reportada, caso contrario debe re-extraerse. Si
aún persiste el problema, la muestra se reporta con los calificadores
correspondientes.
Equipamiento y materiales
Cromatógrafo de gases asociado a un detector de captura electrónica
El cromatógrafo de gases debe poseer un inyector tipo “split/splitless” y tener la capacidad de
utilizar una columna capilar en horno de temperatura programable asociada a un detector de
captura electrónica normal o micro detector. La columna comúnmente utilizada para el
análisis de plaguicidas tiene las siguientes características: columna capilar de 30 m de
longitud x 0,25 mm de diámetro interno y una fase liquida DB-5 de 0,25 µm de espesor.
Otras columnas similares características pueden utilizarse. Es conveniente contar con un
inyector automático con capacidad de realizar inyecciones de 1 a 4 µL. Una segunda
columna de diferente polaridad, tipo DB-17ht o equivalente, puede ser utilizada para la
confirmación de los compuestos de interés. El programa utilizado para el análisis de
plaguicidas por cromatografía de gases y captura electrónica es el siguiente:
Temperatura del inyector: ..............................275°C
Temperatura del detector: ..............................325°C
Programa de temperatura del horno:
Temperatura inicial: ...........................100°C mantenida por 1 minuto
1ra rampa de calentamiento ................5,0°C min-1
Temperatura final 1ra rampa ..............140oC mantenida por 1 minuto
2da rampa de calentamiento ................1,5°C min-1
Temperatura final 2da rampa ..............250°C mantenida por 1 minuto
3ra rampa de calentamiento ................10°C min-1
Temperatura final 3ra rampa ...............300°C mantenida por 5 minuto
Gas transportador ...........................................Helio a 1,5 mL min-1
Gas secundario (“make-up”) ..........................Argón/Metano (95:5) a 40 mL min-1
Tiempo total de corrida ..................................94.3 minutos
Estas condiciones pueden ser modificadas para mejorar el perfil cromatográfico si se desea.
74
Estándares
A continuación se resumen, en forma breve, el procedimiento para preparar los distintos
estándares necesarios para el análisis de plaguicidas, teniendo en cuenta que, siempre que sea
posible, es conveniente comprar los estándares de plaguicidas como mezclas certificadas ya
preparadas las cuales pueden ser mezcladas y diluidas antes de su uso.
Disolución de estándares de recuperación e internos
Las disoluciones de estándares de recuperación e internos se preparan pesando las cantidades
apropiadas de los compuestos puros, transferidos cuantitativamente a un matraz volumétrico,
y diluyendo con hexano o disolvente similar no clorado. Las disoluciones de estándares de
recuperación e internos son de uso individual y deben prepararse y almacenarse como tal.
Las disoluciones de estándares de recuperación e internos deben ser preparadas de manera tal
que la adición de 0,100 mL a la muestra, antes de su extracción y antes de su análisis
instrumental, respectivamente, resulte en concentraciones finales de estándares de
recuperación e internos que, en el volumen final del extracto de 1 mL, resulten intermedias
entre el nivel más bajo y el más alto de la curva de calibración. Todos los analitos de interés
presentes en la muestra son cuantificados en base a un estándar de recuperación y la
recuperación de este en base a un estándar interno. Por este motivo, si se esperan
concentraciones muy altas o muy bajas de los compuestos de interés en las muestras, las
cantidades agregadas de estándares de recuperación, internos y los volúmenes finales de los
extractos deben ser ajustados convenientemente.
Disolución de enriquecimiento
La disolución de enriquecimiento (o de siembra) contiene todos o una buena selección de los
analitos de interés que van a ser utilizados para fortalecer un blanco o muestra enriquecidos.
Esta disolución se prepara pesando las cantidades apropiadas de los compuestos puros,
transferidos cuantitativamente a un matraz volumétrico, y diluyendo con hexano o disolvente
similar no clorado. La disolución de enriquecimiento debe ser preparada de manera tal que la
adición de 0,100 mL al blanco o a la muestra, antes de su extracción, resulte en
concentraciones finales de analitos que, en el volumen final del extracto de 1 mL, resulten
intermedias entre el nivel más bajo y el más alto de la curva de calibración. Si se esperan
concentraciones muy altas o muy bajas de los compuestos de interés en la muestra
seleccionada para enriquecer y el volumen final del extracto va a ser ajustado (ver Disolución
de estándares de recuperación e internos), la cantidad de disolución de enriquecimiento a
sembrar debe ajustarse convenientemente.
Disolución de control de degradación
La disolución utilizada para comprobar que el sistema no presenta sitios activos que puedan
degradar a los analitos más lábiles contiene compuestos como el DDT y Aldrin, conocidos
por su fácil degradación en el puerto de inyección bajo ciertas condiciones. Esta disolución
se prepara pesando las cantidades apropiadas de los compuestos puros, transferidos
75
cuantitativamente a un matraz volumétrico, y diluyendo con hexano o disolvente similar no
clorado para lograr concentraciones similares a las intermedias de la curva de calibración.
Esta disolución debe contener, en su forma final y lista para utilizar, las cantidades adecuadas
de estándares de recuperación e internos.
Control de degradación – Paso a paso
•
El DDT y endrin pueden ser fácilmente degradado en el puerto de inyección del cromatógrafo si el
mismo, o el principio de la columna, están sucios. Esta suciedad resulta de la acumulación de residuos
de alto punto de ebullición de muestras analizadas previamente.
•
Prepare una disolución de concentración conocida, y correspondiente a la región central de la curva de
calibración, de 4,4’-DDT y endrin.
•
Inyecte 2 µL de esta disolución y analice utilizando el método que va a utilizar para el análisis de los
extractos de las muestras.
•
Registre la presencia y cantidades de los productos de degradación del 4,4’-DDT (4,4’-DDE y 4,4’DDD) y endrin (endrin cetona y endrin aldehido).
•
Calcule el porcentage de degradación utilizando las siguiente fórmulas:
⎛
⎞
(Área de 4,4'-DDE + Área de 4,4'-DDD)
⎟ * 100
% Degradación de 4,4'-DDT = ⎜⎜
⎟
⎝ (Área de 4,4'-DDT + Área de 4,4'-DDE + Área de 4,4'-DDD) ⎠
⎛
⎞
(Área de endrin cetona + Área de endrin aldehido)
⎟ * 100
% Degradación de endrin = ⎜⎜
⎟
⎝ (Área de endrin + Área de endrin cetona + Área de endrin aldehido) ⎠
•
Si la degradación de cualquiera de los dos analitos es superior al 20% se necesita
corregir el problema antes de proceder con la calibración y análisis de los extractos de
las muestras.
Calibración del Cromatógrafo
La calibración del cromatógrafo de gases para el análisis de plaguicidas puede realizarse
utilizando uno de los dos métodos que se indican más arriba (ver: Control de calidad de los
análisis, Calibración del instrumental).
Análisis cromatográfico de las muestras
Como se ha mencionado, las muestras dedicadas al control de calidad (e.g., blanco, muestra
en duplicado, muestra enriquecida, y material de referencia) y muestras que componen el lote
analítico son analizadas como una sola secuencia analítica con las disoluciones de calibración
o de control de la calibración, según sea el método escogido (ver Control de calidad de los
análisis, Calibración del instrumental). Antes de comenzar la secuencia analítica, se debe
inyectar 1 ó 2 µL de hexano (ver: Control de calidad de los análisis, Blanco del instrumento)
seguido de similar volumen de la disolución de control de la degradación (ver: Control de
calidad de los análisis, Control de la degradación en el puerto de inyección) para comprobar
que el sistema está libre de contaminantes y no se observa degradación de los compuestos
76
más lábiles en el puerto de inyección. El análisis de las muestras se hace inyectando de 1 a 4
µL de los extractos.
Identificación cualitativa de los analitos de interés
Para identificar un pico como correspondiente a un analito de interés se deben seguir el
criterio discutido más arriba (ver: Control de calidad de los análisis, Identificación cualitativa
de compuestos de interés). Las Figuras 13 y 14 muestra el órden de elución y respuestas
relativas de los insecticidas clorados y contemporaneos de interés y estándares de
recuperación e interno; la concentración de cada analito es 100 ng/mL.
Figura 13. Insecticidas clorados por cromatografía de gases y detector de captura
electrónica.
Determinación cuantitativa de los analitos de interés
Como se describe en las secciones siguientes, las concentraciones de los analitos de interés se
basan en los factores de respuestas de esos compuestos en las disoluciones de calibración. En
general, los sistemas cromatográficos modernos poseen programas de computadoras que
permiten realizar estos cálculos de manera casi automática. No obstante es importante
77
entender los conceptos que se utilizan para poder comprobar, en forma manual y como un
control de calidad adicional, algunos de los resultados producidos por el software.
Figura 14. Insecticidas contemporaneos por cromatografía de gases y detector de
captura electrónica.
Calibración y determinación cuantitativa utilizando una ecuación cuadrática
La curva de calibración se establece a partir de la información adquirida de la inyección de
los cuatro niveles de calibración. El ajuste de curva puede realizarse utilizando una ecuación
de la forma:
Y = b 0 + b1 x + b 2 x 2
(1)
donde:
x
= cantidad del analito de interés en ng
b0, b1, y b2 = coeficientes de la ecuación cuadrática. Si la ecuación es forzada por
cero, entonces b0 = 0
Y
= área modificada del analito de interés definido como:
⎛A ⎞
Y = ⎜⎜ a ⎟⎟ * Csu
⎝ A su ⎠
78
(2)
donde:
Aa
Asu
Csu
= área del compuesto
= área del estándar de recuperación
= cantidad de estándar de recuperación en ng
Para aquellos picos cromatográficos que satisfacen el criterio de identificación cualitativa
(ver: Control de calidad de los análisis, Identificación cualitativa de compuestos de interés),
la solución de esta ecuación cuadrática:
x=
− b1 + b12 − 4 b2 (b0 − Y )
2 b2
(3)
producirá la cantidad de cada analito de interés en el extracto analizado. Para determinar la
concentración del compuesto en la muestra, se deberá dividir el valor encontrado por el peso
o volumen de muestra extraído para expresar la concentración como ng g-1 o ng L-1.
Calibración y determinación cuantitativa utilizando una ecuación exponencial
Como una alternativa a la ecuación cuadrática, se puede utilizar una ecuación exponencial de
la forma:
Y = A XB
(4)
donde:
Y
X
A
B
=
=
=
=
concentración relativa (razón de concentraciones entre Ca y Csu)
área relativa (razón de áreas entre Aa y Asu)
pendiente de la ecuación
coeficiente exponencial
Esta ecuación se puede expresar como:
⎛ A ⎞
Ca
= A ⎜⎜ a ⎟⎟
Csu
⎝ Asu ⎠
B
(5)
donde:
Ca
Csu
Aa
Asu
=
=
=
=
concentración del analito (ng mL-1)
concentración del estándar de recuperación utilizado (ng mL-1)
área del analito que se mide
área del estándar de recuperación utilizado
Como Ca y Csu se refieren a las concentraciones del analito y estándar de recuperación en el
mismo volumen de extracto, ambos pueden ser substituidos por sus cantidades. Reacomodando los términos de la ecuación y dividiendo ambos lados de la misma por la
79
cantidad de muestra extraída, es posible expresar la concentración del analito de interés como
ng g-1 o ng L-1:
B
[Analito](ng g-1 ) or (ng L-1 )
⎛ A ⎞ Cantidad su
= A ⎜⎜ a ⎟⎟ *
Mt
⎝ Asu ⎠
(6)
donde:
A
B
Aa
Asu
Cantidadsu
Mt
=
=
=
=
=
pendiente de la ecuación
coeficiente exponencial
área del analito que se mide
área del estándar de recuperación utilizado
cantidad de estándar de recuperación, en ng, agregado a la muestra
antes de la extracción
= tamaño de muestra, en g o L
Dilución de un extracto
Si la respuesta instrumental de un analito excede la respuesta observada para el mismo
compuesto en la disolución de calibración más concentrada, el extracto requiere una dilución
apropiada. Para obtener una respuesta dentro de rango de concentraciones utilizadas para
calibrar el cromatógrafo se procede a un nuevo agregado de estándares de recuperación antes
de re-analizar la muestra.
Dilución de un extracto – Paso a paso
•
Antes de hacer la dilución, asegúrese que el volumen del extracto original es exactamente 1 mL,
ignorando la cantidad inyectada en el cromatógrafo (i.e., 1 ó 2 µL).
•
Dependiendo de la dilución requerida, tome el volumen adecuado y exacto del extracto original y
colóquelo en un nuevo vial. Por ejemplo, si la muestra necesita ser diluida 10 veces, tome
exactamente 0,100 mL los que se diluirán a aproximadamente 1 mL (ver Tabla a continuación).
•
•
Siembre con 0,100 mL de la disolución de standards de recuperación.
Lleve a aproximadamente 1 mL con hexano o disolvente similar no clorado y regrese al
cromatógrafo para su re-inyección y análisis.
•
El extracto diluido debe ser analizado para determinar solamente la concentración de aquellos
analitos que exhibieron una concentración superior al nivel más alto de calibración.
Dilución
Requerida
Volumen de
extracto original
Volumen de disolución
de estándares de
recuperación
Volumen de
disolvente(2)
5 veces
0,200 mL
0,100 mL
~ 0,700 mL
10 veces
0,100 mL
0,100 mL
~ 0,800 mL
20 veces
0,050 mL(1)
0,100 mL
~ 0,850 mL
50 veces
0,020 mL(1)
0,100 mL
~ 0,880 mL
100 veces
0,010 mL(1)
0,100 mL
~ 0,890 mL
500 veces
0,002 mL(1)
0,100 mL
~ 0,898 mL
(1)
es aconsejable realizar una dilución intermedia.
(2)
al utilizar los estándares de recuperación para determinar la concentración de los
80
Volumen
final(2)
~ 1 mL
~ 1 mL
~ 1 mL
~ 1 mL
~ 1 mL
~ 1 mL
analitos de
interés se produce una compensación interna y no es necesario llevar a volumen exacto.
Control de calidad de los cálculos
Las concentraciones calculadas utilizando cualquiera de los dos métodos anteriores deben ser
confirmadas con cálculos independientes. Varias concentraciones seleccionadas al azar deben
ser confirmadas utilizando ecuación 3 ó 6, según sea la calibración, en una hoja de cálculo
comercial (Excel o similar), utilizando la misma ecuación de calibración y comparadas con
los valores reportados. Ambas concentraciones deben coincidir exactamente excepto por
errores de redondeo.
Ejemplo de cálculos de concentraciones
La siguiente información es recopilada del libro del laboratorio y del impreso del análisis utilizando el software
del cromatógrafo de gases. Para generalizar el ejemplo, se omiten los nombres del analito, estándar de
recuperación y estándar interno.
Código de la muestra:.................................................................F99999
Peso de la muestra: .....................................................................5.211 g
Cantidad de estándar de recuperación adicionado:.....................90.8 ng
Volumen final: ...........................................................................1.0 mL
concentración de estándar de recuperación ................................0,0000908 mg mL-1
Coeficientes de la curva de calibración:
b0 = 0.0
b1 = 0.4814
b2 = -205.9
Área del estándar De recuperación:............................................228.95
Área del analito “A” ...................................................................24.211
Valor reportado ..........................................................................3.863 ng g-1
Utilizando la ecuación:
x=
− b1 + b12 − 4 b 2 (b 0 − Y)
(3)
2 b2
donde:
⎛A
Y = ⎜⎜ a
⎝ A su
⎞
⎟⎟ * C su
⎠
(2)
Cálculo manual de la concentración del analito “A”
⎛ 24.211 ⎞
-1
-1
Y =⎜
⎟ * 0,0000908 µg µL = 0,000009602 µg µL
228.95
⎝
⎠
[Analito A] =
− 0,4814 + 0,4814 2 − 4 * (−205,9) * (0 − 0,000009602)
[Analito A] =
2 * (−205,9)
= 0,000020119 µg µL−1
0,000020119 µg µL−1 *1000 ng µg −1 *1000 µL mL−1
= 3,861 ng g −1
5,211 g
La diferencia porcentual relativa entre la concentración obtenida mediante el uso del software del cromatógrafo
de gas y el calor obtenido manualmente deben coincidir exactamente excepto por errores de redondeo.
81
⎡
⎤
⎢
⎥
-1
-1
⎢ (3,863 ng g − 3,861 ng g ) ⎥
Diferencia Porcentual Relativa = ⎢
* 100 = 0,05%
-1
-1 ⎥
⎢ ⎛⎜ 3,863 ng g + 3,861 ng g ⎞⎟ ⎥
⎟⎥
⎢ ⎜⎝
2
⎠⎦
⎣
Evaluación de los parámetros de control de calidad
Recuperación de estándares de recuperación
Los porcentajes de recobro de los estándares de recuperación en los extractos de muestras
son estimados comparando la respuesta relativa del estándar de recuperación en la muestra
con la obtenida de las disoluciones de calibración. El laboratorio deberá tomar las acciones
correctivas apropiadas cada vez que la recuperación de los estándares de recuperación estén
fuera del rango buscado (ver: Control de calidad de los análisis, Estándares de recuperación
e internos).
Las concentraciones encontradas en la muestra original y su muestra duplicada deben ser
comparables para certificar la homogeneidad de las muestras y la precisión de los análisis
(ver: Control de calidad de los análisis, Muestra duplicada). De no cumplirse con los
requerimientos de control de calidad, el laboratorio deberá implementar las acciones
correctivas necesarias.
⎡
⎤
⎢ (C − C ) ⎥
md
⎥ * 100
Diferencia Porcentual Relativa = ⎢ mo
+
C
C
⎛
⎢ mo
md ⎞ ⎥
⎟⎥
⎢⎣ ⎜⎝
2
⎠⎦
donde:
Cmo
Cmd
82
= concentración encontrada en la muestra original
= concentración encontrada en la muestra duplicada
(7)
Recuperación de analitos de interés en muestras enriquecidas y materiales de referencia
certificados
Una buena recuperación de los analitos agregados a las muestras enriquecidas o duplicación
de concentraciones certificadas en materiales de referencia son indicativos de una buena
técnica de laboratorio. El porcentaje de recuperación de los distintos analitos sembrados en
muestras enriquecidas es calculada utilizando la ecuación:
⎡ (C * M me − C mo * M mo ) ⎤
Porcentaje de recuperación = ⎢ me
⎥ * 100
A ad
⎣
⎦
(8)
donde:
Cme
Cmo
Mme
Mmo
Aad
=
=
=
=
=
concentración encontrada en la muestra enriquecida
concentración encontrada en la muestra original
tamaño de muestra enriquecida
tamaño de muestra original
concentración de analito adicionado
Calcule y reporte el porcentaje de recuperación de todos los analitos de interés adicionados a
las muestras enriquecidas y todos los compuestos con concentración certificada en los
materiales de referencia. Note que, por definición, Cmo en el blanco de laboratorio
enriquecido y su duplicado es igual a cero. El laboratorio deberá implementar las acciones
correctivas necesarias si los requerimientos de control de calidad no se cumplen (ver: Control
de calidad de los análisis, Muestra enriquecida y muestra enriquecida en duplicado y
Material de referencia certificado).
Mantenimiento del cromatógrafo de gas y detector de captura electrónica
Existen varios pasos simples que pueden ayudar a mantener el buen funcionamiento del
cromatógrafo de gas y su detector de captura electrónica. A saber:
•
La jeringa debe ser enjuagada con el disolvente apropiado después de cada
inyección. Esto puede hacerse manualmente o mediante el uso del inyector
automático.
•
Evite la inyección de extractos que contengan restos importantes de disolventes
clorados (e.g., diclorometano) o altos contenidos de azufre (e.g., muestras de
suelos y/o sedimentos anóxicos, huevos de aves, etc.)
•
El septum de inyección deberá cambiarse luego de unas cuantas inyecciones,
dependiendo del estado de la jeringa, para evitar variaciones en los tiempos de
retención.
•
Un inserto de vidrio nuevo deberá instalarse apenas se presenten signos de
degradación de los compuestos más lábiles. Incluso, si se observa un incremento
importante en el porcentaje de degradación de analitos en la disolución de control
83
de la degradación, es conveniente reemplazar el inserto antes de llegar al nivel de
acción del 15%.
•
En ocasiones es necesario reemplazar, junto con el inserto de vidrio, el sello
inferior del inyector para evitar degradación o arrastre de los picos.
•
Si luego de reemplazar el inserto y sello aún se observa degradación, arrastre o
disminución en la respuesta de los analitos de interés, será necesario remover las
primeras dos vueltas de la columna capilar del extremo del inyector.
•
Los tanques de gases de arrastre (helio) y auxiliares (mezcla de argón:metano o
nitrógeno) deben cambiarse mucho antes de que estén vacíos para evitar suciedad
que pueda incrementar el ruido de base o contaminar columna y/o detector. En
general, es preferible cambiar el tanque cuando la presión en el mismo cae por
debajo de las 500 psi.
•
Todo mantenimiento que se realice al cromatógrafo de gas o detector de captura
electrónica, incluyendo cambios de tanques de gases, debe ser registrado en un
cuaderno o libro destinado para este fin y dedicado exclusivamente a un solo
equipo.
Documentación
Al momento de recibir las muestras para su análisis instrumental, el analista debe también
recibir, en un folder debidamente identificado, copias de las hojas del laboratorio que
corresponda al lote analítico y en donde se documenta el proceso de las muestras incluyendo
los problemas encontrados, accidentes ocurridos y/o comentarios relevantes. De existir,
también se debe incluir en el folder la documentación de iniciación o pedido de análisis
donde se identifica la persona responsable del proyecto que pueda responder ante cualquier
duda (e.g., tipo de análisis a realizar, cantidad de muestra a extraer, volumen de estándares de
recuperación e internos a sembrar y reporte final de las concentraciones).
Al realizar el análisis instrumental, el analista debe agregar a este folder copia de la secuencia
analítica, información sobre el blanco del instrumento, disolución de control de la
degradación, calibración del instrumento, impresos de los cromatogramas y sus análisis y
copia del reporte finalizado. Este reporte final deberá incluir, además de los resultados de las
muestras analizadas, información sobre las muestras de control de calidad (blanco de
laboratorio, muestra duplicada, muestra enriquecida y material de referencia) y sus
parámetros (recuperación de estándares de recuperación, diferencia porcentual relativa entre
originales y duplicados, recuperación de analitos de interés en blancos y muestras
fortificadas, duplicación de resultados certificados para el material de referencia).
Reporte de concentraciones
Las concentraciones son generalmente reportadas, con tres decimales, como ng g-1 peso seco
o húmedo (suelos/sedimentos/biota) o como ng L-1 (aguas) (ver sección 6.8).
84
6.6. Determinación cuantitativa de insecticidas carbamatos por cromatografía liquida
de alta resolución
Introducción
Los insecticidas carbamatos son cuantitativamente determinados mediante la técnica de
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés) asociada a un
detector de fluorescencia. Esta técnica capaz de determinar estos compuestos contaminantes
a niveles trazas (e.g., ng g-1). El método que se describe es aplicable a extractos de agua,
suelos/sedimentos y biota luego de la limpieza apropiada. Los compuestos carbámicos de
interés para este estudio se limitan a:
Carbaril
Carbofurán
Oxamil
siguiendo las indicaciones proporcionadas en el Federal Register (1984) y resumidas en
sección 6.5 (Límite de detección). Como se mencionó, alternativamente se pueden utilizar las
concentraciones de la solución de calibración más baja usada en los análisis, ajustada por el
peso o volumen de muestra extraída.
están resumidos en sección 6.5 (Control de calidad de los análisis).
Los criterios para el control de calidad de las muestras están resumidos en sección 6.5
(Criterio para el control de calidad de las muestras).
Cromatógrafo líquido de alta resolución asociado a un detector de fluorescencia
El cromatógrafo líquido de alta resolución debe ser un sistema robusto, de alto rendimiento y
que genere datos reproducibles, exactos y precisos con la sensibilidad y resolución adecuada
para el análisis de insecticidas carbámicos. Es importante utilizar una columna de
dimensiones y relleno adecuados al análisis. Para la determinación de insecticidas
carbámicos por cromatografía líquida de alta resolución asociada a un detector de
85
fluorescencia se recomienda una columna para carbamatos de dimetiloctadecil/silica de 150
mm de largo por 3,9 de diámetro interno o similar. Es conveniente, además, contar con un
auto-muestreador que permita la inyección automática de los extractos. Las condiciones
cromatográficas del análisis de carbamatos son las siguientes:
Columna: ..........................................3,9 x 150 mm para carbamatos
Relleno: ............................................dimetiloctadecil/silica
Flujo de la fase móvil:......................1,5 mL min-1
Temperatura de la columna:.............25°C
Volumen de inyección: ....................300 µL
Temperatura del horno reactor: ........80°C
Flujo de He:......................................30 mL min-1
Fase móvil: .......................................Agua Milli-Q/metanol/acetonitrilo (gradiente)
Composición de fase móvil:
Fase A: .................................agua milli-Q
Fase B: .................................metanol
Fase C: .................................acetonitrilo
Tiempo de corrida: ...........................30 min
Detector de Fluorescencia:
Emisión: .....................................445 nm
Excitación: .................................339 nm
Gradiente:
Tiempo
Flujo
Fase A
Fase B
Fase C
mL min
%
%
%
0
1,5
88
12
0
4,0
1,5
88
12
0
4,1
1,5
68
16
16
16,1
1,5
30
35
35
35
1,5
88
12
0
60
1,5
88
12
0
75
1,0
0
100
0
96
1,0
0
100
0
130
0
0
100
0
Estas condiciones pueden ser modificadas para adaptarlas al equipamiento propio de cada
laboratorio o para mejorar el perfil cromatográfico si es necesario.
86
Estándares
Los criterios para la preparación de estándares están resumidos en sección 6.5 (Equipamiento
y materiales, Estándares). Como ya se indicó, es conveniente comprar los estándares de estos
insecticidas como mezclas certificadas ya preparadas las cuales pueden ser mezcladas y
diluídas antes de su uso.
La calibración del cromatógrafo líquido de alta resolución asociado a un detector de
fluorescencia para el análisis de insecticidas carbámicos puede realizarse utilizando uno de
los dos métodos que se indicaron anteriormente (ver sección 6.5; Control de calidad de los
análisis, Calibración del instrumental).
o de control de la calibración según sea el método escogido (ver sección 6.5; Control de
calidad de los análisis, Calibración del instrumental). Antes de comenzar la secuencia
analítica, se debe correr un blanco del instrumento para comprobar que el sistema está libre
de contaminantes. El análisis de las muestras se hace inyectando de 300 µL de los extractos.
criterio discutido anteriormente (ver sección 6.5; Control de calidad de los análisis,
Identificación cualitativa de compuestos de interés).
Las concentraciones de los analitos de interés se basan en los factores de respuestas de esos
compuestos en las disoluciones de calibración. En general, los sistemas cromatográficos
modernos poseen programas de computadoras que permiten realizar estos cálculos de manera
casi automática. No obstante es importante entender los conceptos que se utilizan para poder
comprobar, en forma manual y como un control de calidad adicional, algunos de los
resultados producidos por el software (ver sección 6.5; Determinación cuantitativa de los
analitos de interés).
87
apropiada para obtener una respuesta dentro de rango de concentraciones utilizadas para
calibrar el cromatógrafo, nuevo agregado de estándares de recuperación y re-análisis.
Las concentraciones calculadas utilizando el programa del cromatógrafo deben ser
ser confirmadas utilizando en una hoja de cálculo comercial (Excel o similar), utilizando la
misma ecuación de calibración, y comparadas con los valores reportados. Ambas
concentraciones deben coincidir exactamente excepto por errores de redondeo.
fuera del rango buscado (ver seccion 6.5; Control de calidad de los análisis, Estándares de
recuperación e internos).
(ver sección 6.5; Control de calidad de los análisis, Diferencia porcentual relativa).
certificados
técnica de laboratorio (ver sección 6.5; Control de calidad de los análisis, Recuperación de
analitos de interés en muestras enriquecidas y materiales de referencia certificados).
88
Mantenimiento del cromatógrafo líquido de alta resolución asociado y detector de
fluorescencia
Todo mantenimiento que se realice al cromatógrafo líquido de alta resolución asociado o el
detector de fluorescencia, incluyendo cambios de solventes, debe ser registrado en un
cuaderno o libro destinado para este fin y dedicado exclusivamente a un solo equipo.
Documentación
La documentación que debe recibir el laboratorio junto a los extractos de las muestras a
analizar, así como la documentación que el analista debe agregar a la carpeta correspondiente
se discute en la seccion 6.5 (Documentación).
o húmedo (suelos/sedimentos/biota) o como ng L-1 (aguas) (ver sección 6.8)
6.7. Determinación de herbicidas triazinas por cromatografía de gases con detector de
espectrometría de masas
Introducción
Los herbicidas triazinas pueden ser determinados por cromatografía de gases asociada a
espectrometría de masas (GC/MS, por sus siglas en inglés) al utilizar técnicas de extracción y
limpieza, soluciones de calibración y métodos de cromatografía adecuados. Esta técnica es
capaz de determinar estos compuestos contaminantes a niveles trazas (e.g., ng g-1). El método
que se describe es aplicable a extractos de agua, suelos/sedimentos y biota luego de la
limpieza apropiada. Las herbicidas triazinas de interés para este estudio se limitan a:
Ametrina
Atraton
Atrazina
Prometon
Prometrina
Propazina
Secbumeton
Simetrina
Simazina
Terbutilazina
Terbutrina
siguiendo las indicaciones proporcionadas en el Federal Register (1984) y resumidas en
sección 6.5 (Límite de detección). Como se mencionó, alternativamente se pueden utilizar las
concentraciones de la solución de calibración más baja usada en los análisis, ajustada por el
peso o volumen de muestra extraída.
89
están resumidos en sección 6.5 (Control de calidad de los análisis). Es importante destacar
que para la identificación cualitativa de un analito es necesario, además del requerimiento
mencionado de una diferencia menor de ± 4 segundos en los tiempos de retención del analito
y su estándar, tener una diferencia menor a ±2 segundos entre los tiempos de retención
correspondientes a los iones seleccionados como de cuantificación y confirmación.
Los criterios para el control de calidad de las muestras están resumidos en sección 6.5
(Criterio para el control de calidad de las muestras).
Cromatógrafo de gases asociado a un detector de espectrometría de masas
El cromatógrafo de gases debe poseer un inyector tipo “split/splitless” y tener la capacidad de
utilizar una columna capilar en horno de temperatura programable asociada a un
espectrómetro de masas. La columna capilar más utilizada para el análisis de contaminantes
orgánicos posee una longitud de 30 m x 0,25 mm de diámetro interno y una fase liquida DB5 de 0,25 µm de espesor o similar. Es conveniente contar con un inyector automático con
capacidad de realizar inyecciones de 1 a 4 µL. El programa utilizado para el análisis de
herbicidas triazinas por cromatografía de gases asociado a un detector de espectrometría de
masas es el siguiente:
Temperatura del inyector: ..............................300°C
Programa de temperatura del horno:
Temperatura inicial: ...........................120°C mantenida por 0 minuto
Temperatura final 1ra rampa ...............140oC mantenida por 0 minuto
2da rampa de calentamiento ................1,5°C min-1
Temperatura final 2da rampa ..............200°C mantenida por 0 minuto
Temperatura final 3ra rampa ...............300°C mantenida por 2 minuto
Gas transportador ...........................................Helio a 1,0 mL min-1
Tiempo total de corrida ..................................50 minutos
Estas condiciones pueden ser modificadas para adaptarlas al equipamiento propio de cada
laboratorio o para mejorar el perfil cromatográfico si es necesario.
90
Estándares
Los criterios para la preparación de estándares están resumidos en sección 6.5 (Equipamiento
y materiales, Estándares). Como se ya se indicó, es conveniente comprar los estándares de de
estos insecticidas como mezclas certificadas ya preparadas las cuales pueden ser mezcladas y
diluídas antes de su uso.
La calibración del cromatógrafo de gases asociado a espectrometría de masas para el análisis
de herbicidas triazinas puede realizarse utilizando uno de los dos métodos descritos en
sección 6.5 (Control de calidad de los análisis, Calibración del instrumental).
o de control de la calibración según sea el método escogido (ver sección 6.5; Control de
calidad de los análisis, Calibración del instrumental). Antes de comenzar la secuencia
analítica, se debe correr un blanco del instrumento para comprobar que el sistema está libre
de contaminantes. El análisis de las muestras se hace inyectando de 1 a 4 µL de los extractos.
criterio discutido anteriormente (ver sección 6.5; Control de calidad de los análisis,
Identificación cualitativa de compuestos de interés).
Además, la determinación de multiples iones individuales (e.g., ion primario y 1 ó 2 de
confirmación) que presentan una respuesta adecuada y pocas posibilidades de interferencias
se deben ajustar a los siguientes criterios de calidad:
•
Las masas caracteristicas de cada analito deben mostrar su máxima intensidad en
al mismo ciclo de lectura (barrido de espectro) o separados por un ciclo como
máximo.
•
Las intensidades relativas de los iones seleccionados para el analito de interés
deben corresponder a los valores obtenidos en el mismo GC/MS con una
tolerancia máxima de ±20%.
La Figura 15 muestra el orden de elución y respuesta relativa de triazinas y estándares de
recuperación e interno; la concentración de cada analito es 100 ng/mL. Los iones de
cuantificación y confirmación monitoreados para cada analito son los indicados en Tabla 15.
91
Figura 15. Herbicidas triazinas por cromatografía de masas.
Las concentraciones de los analitos de interés se basan en los factores de respuestas de esos
compuestos en las disoluciones de calibración. En general, los sistemas cromatográficos
modernos poseen programas de computadoras que permiten realizar estos cálculos de manera
casi automática. No obstante es importante entender los conceptos que se utilizan para poder
comprobar, en forma manual y como un control de calidad adicional, algunos de los
resultados producidos por el software (ver sección 6.5; Determinación cuantitativa de los
analitos de interés)
92
Tabla 14. Iones de cuantificación y confirmación seleccionados para la determinación
de herbicidas triazinas y estándares correspondientes por espectrometría de
masas
Analito
Ion de Cuantificación
Ion de Confirmación
Tetracloro-meta-xileno
209
244
Atraton
196
211
Simazina
201
186
Prometon
210
225
Atrazina
200
215
Propazina
214
229
Terbutilazina
214
229
Secbumeton
196
225
Simetrina
213
170
Ametrina
227
170
Prometrina
241
226
Terbutrina
226
241
PCB 103
324
326
apropiada (ver seccion 6.5; Determinación cuantitativa de los analitos de interés, Dilución de
un extracto).
Las concentraciones calculadas utilizando el programa del cromatógrafo deben ser
ser confirmadas utilizando en una hoja de cálculo comercial (Excel o similar), utilizando la
misma ecuación de calibración, y comparadas con los valores reportados. Ambas
concentraciones deben coincidir exactamente excepto por errores de redondeo.
93
fuera del rango buscado (ver seccion 6.5; Control de calidad de los análisis, Estándares de
recuperación e internos).
(ver sección 6.5; Control de calidad de los análisis, Diferencia porcentual relativa).
certificados
técnica de laboratorio (ver sección 6.5; Control de calidad de los análisis, Recuperación de
analitos de interés en muestras enriquecidas y materiales de referencia certificados).
Mantenimiento del cromatógrafo de gases y detector de espectrometría de masas
Existen varios pasos simples que pueden ayudar a mantener el buen funcionamiento del
cromatógrafo de gas y su espectrómetro de masas.
Para el buen mantenimiento del cromatógrafo de gases se debe:
94
•
La jeringa debe ser enjuagada con el disolvente apropiado después de cada
inyección. Esto puede hacerse manualmente o mediante el uso del inyector
automático.
•
El septum de inyección deberá cambiarse luego de unas cuantas inyecciones,
dependiendo del estado de la jeringa, para evitar variaciones en los tiempos de
retención.
•
Un inserto de vidrio nuevo deberá instalarse apenas se presenten signos de
degradación de los compuestos más lábiles. Incluso, si se observa un incremento
importante en el porcentaje de degradación de analitos en la disolución de control
de la degradación, es conveniente reemplazar el inserto antes de llegar al nivel de
acción del 15%.
•
En ocasiones es necesario reemplazar, junto con el inserto de vidrio, el sello
inferior del inyector para evitar degradación o arrastre de los picos.
•
Si luego de reemplazar el inserto y sello aún se observa degradación, arrastre o
disminución en la respuesta de los analitos de interés, será necesario remover las
primeras dos vueltas de la columna capilar del extremo del inyector.
•
Los tanques del gas de arrastre (helio) debe cambiarse mucho antes de que esté
vacío para evitar suciedad que pueda incrementar el ruido de base o contaminar
columna y/o detector. En general, es preferible cambiar el tanque cuando la
presión en el mismo cae por debajo de las 500 psi.
Para el buen mantenimiento del espectrómetro de masas se debe:
•
La fuente debe ser limpiada, incluyendo el reemplazo del filamento de emisión,
cada vez que sea necesario.
•
El aceite de las bombas de vacio debe ser renovado anualmente o más
frecuentemente si es necesario.
•
Se debe controlar que no existan pérdidas de vacio cada vez que se abra el
espectrómetro de masas.
En general, todo mantenimiento que se realice al cromatógrafo de gas o espectrómetro de
masas, incluyendo cambios de tanques de gases, debe ser registrado en un cuaderno o libro
destinado para este fin y dedicado exclusivamente a un solo equipo.
Documentación
La documentación que debe recibir el laboratorio junto a los extractos de las muestras a
analizar, así como la documentación que el analista debe agregar a la carpeta correspondiente
se discute en la seccion 6.5 (Documentación).
o húmedo (suelos/sedimentos/biota) o como ng L-1 (aguas) (ver sección 6.8).
6.8. Calibración y cálculos
6.8.1. Preparación de las disoluciones de siembra (estándares de recuperación,
internos y enriquecimiento)
Por conveniencia, los mismos estándares de recuperación e internos serán utilizados con
todos los analitos que se determinen por cromatografía de gases asociada a un detector de
captura electrónica (insecticidas clorados y mezcla de insecticidas/fungicidas/herbicidas de
uso reciente) o de masas (herbicidas triazinas). Las disoluciones de enriquecimiento serán
independientes para cada grupo de analitos.
95
Estándares de Recuperación
4,4' Dibromooctafluorbifenilo (DBOFB)
2,2’,4,5’,6-pentaclorobifenilo (PCB 103)
Los estándares de recuperación se agregan a todas las muestras a analizar y de control de
calidad (e.g., blanco, muestra duplicada, blanco enriquecido, muestra enriquecida, muestra
enriquecida en duplicado, material de referencia) antes de su procesamiento por el
laboratorio. El uso de estándares de recuperación en los cálculos permite compensar por
pérdidas sufridas durante el procesamiento de la batería de muestras por el laboratorio y es
independiente del volumen final del extracto o volumen del mismo inyectado en el
cromatógrafo.
•
Preparación
Cien mL de esta mezcla de siembra de estándares de recuperación se preparan por
dilución 1:100 de las disoluciones provistas (4,4' dibromooctafluorbifenilo y 2,2’,4,5’,6pentaclorobifenilo @ 100 µg mL-1 cada compuesto). Para ello se toman 1,000 mL de
cada disolución y se lleva a 100 mL, en un mismo matraz, con hexano. La concentración
final de cada estándar de recuperación es de 1.000 ng mL-1.
[Estándar subrogado] (ng mL ) = 100 µg mL-1 * ⎛⎜⎜ 1.000 ng mL
-1
-1
-1
⎝ 1 µg mL
•
⎞ ⎛ 1,000 mL ⎞
-1
⎟⎟ * ⎜
⎟ = 1.000 ng mL
⎠ ⎝ 100 mL ⎠
Uso
Cien µL (0,100mL) de esta disolución de siembra de estándares de recuperación se
agregan a todas las muestras de una batería analítica antes de la extracción. Luego de los
procedimientos de laboratorio (extracción, limpieza, concentración) y antes del análisis
por cromatografía, el extracto se lleva a un volumen de 1 mL. Bajo estas condiciones, la
concentración final del estándar de recuperación es de 100 ng mL-1.
[Estándar subrogado] (ng mL ) = 1.000 ng mL-1 * ⎛⎜ 0,100 mL ⎞⎟ = 100 ng mL-1
-1
⎝
1 mL
⎠
Esta disolución de estándares de recuperación será utilizada para la preparación de las
disoluciones de calibración correspondientes como se indica en la sección siguiente.
Note que esta concentración de estándar de recuperación es igual a la presente en los niveles
1-5 de las disoluciones de calibración (ver sección 6.8.2).
Estándares Internos
2,4,5,6-tetracloro-meta-xileno (TCMX)
Los estándares internos se agregan a todos los extractos a analizar y de control de calidad
(e.g., blanco, muestra duplicada, blanco enriquecido, muestra enriquecida, muestra
enriquecida en duplicado, material de referencia) antes de su análisis por cromatografía. El
uso de estándares interno permite conocer la magnitud de las pérdidas sufridas durante el
96
procesamiento de la batería de muestras en el laboratorio y es independiente del volumen
final del extracto y volumen del mismo inyectado en el cromatógrafo.
•
Preparación
Cien mL de esta mezcla de siembra de estándar interno se preparan por dilución 1:2000
de la disolución provista (2,4,5,6-tetracloro-meta-xileno @ 2.000 µg mL-1). Para ello se
toman 0,050 mL de disolución y se llevan a 100 mL con hexano. La concentración final
del estándar interno es de 1.000 ng mL-1.
[Estándar interno] (ng mL ) = 2.000 µg mL-1 * ⎛⎜⎜ 1.000 ng mL
-1
-1
-1
⎝
•
1 µg mL
⎞ ⎛ 0,050 mL ⎞
-1
⎟⎟ * ⎜
⎟ = 1.000 ng mL
100
mL
⎠
⎠ ⎝
Uso
Cien µL (0,100mL) de esta disolución de siembra de estándar interno se agregan a todas
las muestras de una batería analítica después que el extracto se lleva a un volumen de 1
mL y antes del análisis por cromatografía. La concentración final del estándar interno es
de 100 ng mL-1.
[Estándar interno] (ng mL ) = 1.000 ng mL-1 * ⎛⎜ 0,100 mL ⎞⎟ = 100 ng mL-1
-1
⎝
1 mL
⎠
Esta disolución de estándar interno será utilizada para la preparación de las disoluciones de
calibración correspondientes como se indica en la sección siguiente.
Note que esta concentración de estándar interno es igual a la presente en los niveles 1-5 de
las disoluciones de calibración (ver sección 6.8.2).
Disoluciones de Enriquecimientos de Analitos
Estas disoluciones se usarán para enriquecer aquellas muestras destinadas a evaluar la
recuperación de los compuestos de interés por el método utilizado sin (e.g., blanco
enriquecido) y con (e.g., muestra enriquecida, muestra enriquecida en duplicado) el efecto
del medio. La comparación de muestra enriquecida con su duplicado permite no sólo evaluar
la capacidad del laboratorio para recuperar y determinar concentraciones en presencia de la
matriz estudiada sino también la habilidad del mismo para reproducir resultados.
Disolución de Enriquecimiento de Insecticidas Clorados
Aldrin
alpha-HCH
beta-HCH
delta-HCH
gamma-HCH
4,4'-DDD
4,4'-DDE
4,4'-DDT
Dieldrin
Endosulfán I
Endosulfán II
Endosulfán Sulfato
Endrin
Endrin Aldehido
Endrin Cetona
Heptacloro
Heptacloro Epoxido
Metoxicloro
alpha-Clordano
gamma-Clordano
97
•
Preparación
Doscientos cincuenta mL de esta mezcla de fortificación se preparan por dilución 1:2500
de la disolución provista (mezcla de componentes @ 1000 µg mL-1 cada uno). Para ello
se toman 0,100 mL de esta disolución y se llevan a 250 mL con hexano. La concentración
final de cada analito es de 400 ng mL-1.
[Analito] (ng mL ) = 1.000 µg mL-1 * ⎛⎜⎜ 1.000 ng mL
-1
-1
-1
⎝
•
1 µg mL
⎞ ⎛ 0,100 mL ⎞
-1
⎟⎟ * ⎜
⎟ = 400 ng mL
⎠ ⎝ 250 mL ⎠
Uso
Cien µL (0,100 mL) de esta disolución de fortificación se agregan a la muestra a analizar
antes de la extracción. Luego de los procedimientos de laboratorio (extracción, limpieza,
concentración) y antes del análisis por cromatografía, el extracto se lleva a un volumen
de 1 mL. Bajo estas condiciones, la concentración final de cada analito es de 40 ng mL-1.
[Analito] (ng mL ) = 400 ng mL-1 * ⎛⎜ 0,100 mL ⎞⎟ = 40 ng mL-1
-1
⎝
1 mL
⎠
Esta disolución de enriquecimiento de insecticidas clorados será utilizada para la preparación
de la disolución de calibración correspondiente como se indica en la sección siguiente.
Note que esta concentración igual a la concentración de cada analito presente en el nivel 3 de
la disolución de calibración. Una recuperación del 100% de los analitos sembrados en
cualquiera de las muestras enriquecidas dará una respuesta de detector similar al nivel 3 de
calibración (ver sección 6.8.2).
Disolución de Enriquecimiento de Insecticidas/Fungicidas/Herbicidas de Uso Reciente
Clorotalonil
Diuron
Permetrina
•
Clorpirifos
Fenamifos
Bromacil
Diazinon
Metil paratión
Preparación
Doscientos cincuenta mL de esta mezcla de fortificación se preparan por dilución 1:250,
en un mismo matraz, de las disoluciones provistas (concentración de componentes @ 100
µg mL-1 cada uno con la excepción de Diuron a @ 1000 µg mL-1). Para ello se toman
1,000 mL de cada disolución (0,100 mL de la disolución de Diuron) y se llevan a 250 mL
con hexano. La concentración final de cada analito es de 400 ng mL-1.
[Analito] (ng mL ) = 100 µg mL-1 * ⎛⎜⎜ 1.000 ng mL
-1
-1
-1
⎝ 1 µg mL
98
⎞ ⎛ 1,000 mL ⎞
-1
⎟⎟ * ⎜
⎟ = 400 ng mL
⎠ ⎝ 250 mL ⎠
o para Diuron:
[Analito] (ng mL ) = 1.000 µg mL-1 * ⎛⎜⎜ 1.000 ng mL
-1
-1
-1
⎝
•
1 µg mL
⎞ ⎛ 0,100 mL ⎞
-1
⎟⎟ * ⎜
⎟ = 400 ng mL
⎠ ⎝ 250 mL ⎠
Uso
Cien µL (0,100mL) de esta disolución de fortificación se agregan a la muestra a analizar
antes de la extracción. Luego de los procedimientos de laboratorio (extracción, limpieza,
concentración) y antes del análisis por cromatografía, el extracto se lleva a un volumen
de 1 mL. Bajo estas condiciones, la concentración final de cada analito es de 40 ng mL-1.
[Analito] (ng mL ) = 400 ng mL-1 * ⎛⎜ 0,100 mL ⎞⎟ = 40 ng mL-1
-1
⎝
1 mL
⎠
Esta disolución de enriquecimiento de insecticidas/fungicidas/herbicidas de uso reciente será
utilizada para la preparación de la disolución de calibración correspondiente como se indica
en la sección siguiente.
Disolución de Enriquecimiento de Herbicidas Triazinas
Ametrina
Prometon
Secbumeton
Terbutilazina
•
Atratón
Prometrina
Simetrina
Terbutrina
Atrazina
Propazina
Simazina
Preparación
Doscientos cincuenta mL de esta mezcla de fortificación se preparan por dilución 1:250,
en un mismo matraz, de las disoluciones provistas (concentración de componentes @ 100
µg mL-1 cada uno). Para ello se toman 1,000 mL de cada disolución y se llevan a 250 mL
con hexano. La concentración final de cada analito es de 400 ng mL-1.
[Analito] (ng mL ) = 100 µg mL-1 * ⎛⎜⎜ 1.000 ng mL
-1
-1
-1
⎝ 1 µg mL
⎞ ⎛ 1,000 mL ⎞
-1
⎟⎟ * ⎜
⎟ = 400 ng mL
⎠ ⎝ 250 mL ⎠
99
•
Uso
Doscientos µL (0,200 mL) de esta disolución de fortificación se agregan a la muestra a
analizar antes de la extracción. Luego de los procedimientos de laboratorio (extracción,
limpieza, concentración) y antes del análisis por cromatografía, el extracto se lleva a un
volumen de 1 mL. Bajo estas condiciones, la concentración final de cada analito es de 80
ng mL-1.
[Analito] (ng mL
-1
)
⎛ 0,200 mL ⎞
-1
= 400 ng mL-1 * ⎜
⎟ = 80 ng mL
⎝ 1 mL ⎠
Esta disolución de enriquecimiento de herbicidas triazinas será utilizada para la preparación
de la disolución de calibración correspondiente como se indica en la sección siguiente.
Disolución de Enriquecimiento de Insecticidas Carbamatos
Carbaril
•
Carbofuran
Oxamil
Preparación
Veinticinco mL de esta mezcla de fortificación se preparan por dilución 1:25, en un
mismo matraz, de las disoluciones provistas (concentración de componentes @ 100 µg
mL-1 cada uno). Para ello se toman 1,000 mL de cada disolución y se llevan a 25 mL con
hexano. La concentración final de cada analito es de 4.000 ng mL-1.
[Analito] (ng mL
-1
•
⎛ 1.000 ng mL-1 ⎞ ⎛ 1,000 mL ⎞
-1
) = 100 µg mL * ⎜
⎜ 1 µg mL-1 ⎟⎟ * ⎜ 25 mL ⎟ = 4.000 ng mL
⎠
⎝
⎠ ⎝
-1
Uso
Doscientos µL (0,200 mL) de esta disolución de fortificación se agregan a la muestra a
analizar antes de la extracción. Luego de los procedimientos de laboratorio (extracción,
limpieza, concentración) y antes del análisis por cromatografía, el extracto se lleva a un
volumen de 1 mL. Bajo estas condiciones, la concentración final de cada analito es de
800 ng mL-1
[Analito] (ng mL ) = 4.000 ng mL-1 * ⎛⎜ 0,200 mL ⎞⎟ = 800 ng mL-1
-1
⎝
1 mL
⎠
Esta disolución de enriquecimiento de insecticidas carbamatos será utilizada para la
preparación de la disolución de calibración correspondiente como se indica en la sección
siguiente.
100
6.8.2. Preparación de las disoluciones de calibración
Como parte del curso de actualización realizado en CICA se entregaron disoluciones
patrones de insecticidas y estándares de recuperación e internos para la preparación de
disoluciones de calibración. Es importante que la preparación de disoluciones de calibración,
con el agregado de estándares de recuperación e interno, para el análisis de los compuestos
de interés para este proyecto (Tabla 1) por cromatografía de gas asociada a distintos
detectores o cromatografía líquida de alta presión (HPLC, por sus siglas en inglés) sea por
parte de un analista experimentado. Corresponde mencionar que las ampollas usualmente
contienen un volumen un poco mayor que el indicado, por lo que siempre se deberá medir lo
que se necesita y no usar el contenido total de las ampollas asumiendo el volumen indicado
como real.
Insecticidas clorados
•
Patrón de calibración/enriquecimiento
Disolución mezcla de analitos, concentración de cada componente es 1000 µg
mL-1:
Aldrin
alpha-HCH
beta-HCH
delta-HCH
gamma-HCH
4,4'-DDD
4,4'-DDE
•
4,4'-DDT
Dieldrin
Endosulfán I
Endosulfán II
Endosulfán Sulfato
Endrin
Endrin Aldehido
Endrin Cetona
Heptacloro
Heptacloro Epoxido
Metoxicloro
alpha-Clordano
gamma-Clordano
Estándares de recuperación
Disoluciones individuales, concentración de cada componente es 100 µg mL-1:
•
Estándar Interno
Concentración del componente es 2000 µg mL-1:
Los volúmenes (en mL) a utilizar de las disoluciones recibidas mencionadas más arriba (i.e.,
analitos, estándares de recuperación y estándar interno) y de un disolvente a elección no
101
clorado, por ejemplo hexano, en la preparación de cada disolución de calibración son
sugeridos en el siguiente cuadro:
Volumen de la disolución
Volumen de la
Volumen de
Volumen de la
de estándares de
disolución de estándar
disolvente
disolución de
recuperación I + II (b)
interno (c)
analitos (a)
-1
-1
-1
(@ 1.000 ng mL )
(@ 2.000 ng mL )
(mL)
(@ 400 ng mL )
Nivel 1
0,125
1,000
0,500
8,375
Nivel 2
0,500
1,000
0,500
8,000
Nivel 3
5,000
5,000
2,500
37,500
Nivel 4
2,000
1,000
0,500
7,500
Nivel 5
5,000
1,000
0,500
3,500
(a) Utilice la disolución preparada en sección 6.8.1 (ver Disolución de Enriquecimiento de Insecticidas Clorados).
(b) Utilice la disolución preparada en sección 6.8.1 (ver Estándares de Recuperación).
(c) Utilice la disolución preparada en sección 6.8.1 (ver Estándares Internos).
Disoluciones de
calibración
Volumen final
(mL)
10,000
10,000
50,000
10,000
10,000
Note que la disolución de calibración a nivel 3 se prepara en mayor volumen para ser
utilizada cada vez que se requiera controlar la calibración del cromatógrafo. Las
concentraciones resultantes para los analitos, estándares de recuperación y estándar interno
en cada disolución de calibración son las que se indican en el siguiente cuadro:
Disoluciones de
calibración
Nivel 1
Nivel 2
Nivel 3
Nivel 4
Nivel 5
Concentración de
cada analito
(ng mL-1)
5
20
40
80
200
Concentración de
cada estándar de recuperación
(ng mL-1)
100
100
100
100
100
Concentración de
cada estándar interno
(ng mL-1)
100
100
100
100
100
Insecticidas/fungicidas/herbicidas de uso reciente
•
Disoluciones individuales, concentración de cada componente es 100 µg mL-1,
excepto por Diuron (1000 µg mL-1):
Clorotalonil
Diuron
Permetrina
•
Clorpirifos
Fenamifos
Bromacil
Diazinon
Metil paratión
•
Estándar Interno
102
Los volúmenes (en mL) a utilizar de las disoluciones recibidas mencionados más arriba (i.e.,
analitos, estándar de recuperación y estándar interno) y de un disolvente a elección no
clorado, por ejemplo hexano, en la preparación de cada disolución de calibración son
sugeridos en el siguiente cuadro:
Volumen de la
Volumen de
Volumen final
Volumen de la
de estándares de
disolvente
disolución de
interno (c)
analitos (a)
(@ 1.000 ng mL-1)
(@ 2.000 ng mL-1)
(mL)
(mL)
(@ 400 ng mL-1)
Nivel 1
0,125
1,000
0,500
8,375
10,000
Nivel 2
0,500
1,000
0,500
8,000
10,000
Nivel 3
5,000
5,000
2,500
37,500
50,000
Nivel 4
2,000
1,000
0,500
6,500
10,000
Nivel 5
5,000
1,000
0,500
3,500
10,000
(a) Utilice disolución preparada en sección 6.8.1 (ver Disolución de Enriquecimiento de Insecticidas/fungicidas/herbicidas de uso
reciente).
(b) Utilice disolución preparada en sección 6.8.1 (ver Estándares de Recuperación).
(c) Utilice disolución preparada en sección 6.8.1 (ver Estándares Internos).
Disoluciones de
calibración
Como en el caso de insecticidas clorados, note que la disolución de calibración a nivel 3 se
prepara en mayor volumen para ser utilizada cada vez que se requiera controlar la calibración
del instrumental utilizado. Las concentraciones resultantes serán:
Disoluciones de
calibración
Concentración de
cada analito
(ng mL-1)
5
20
40
80
200
Nivel 1
Nivel 2
Nivel 3
Nivel 4
Nivel 5
Concentración de
(ng mL-1)
100
100
100
100
100
Concentración de
(ng mL-1)
100
100
100
100
100
•
Disolución mezcla de analitos; la concentración de cada componente es 100 µg
mL-1:
Ametrina
Prometon
Secbumeton
Terbutilazina
•
Atratón
Prometrina
Simetrina
Terbutrina
Atrazina
Propazina
Simazina
Concentración de cada componente es 100 µg mL-1:
•
Estándar Interno
103
analitos, estándares de recuperación y estándar interno) y de un disolvente a elección en la
preparación de cada disolución de calibración son sugeridos en el siguiente cuadro. Note que
simazina y atrazina son poco solubles en hexano por lo que si se desea preparar soluciones
más concentradas el disolvente a utilizar debería ser acetona.
Volumen de la
Volumen de
Volumen de la
de estándares de
disolvente
disolución de
interno (c)
analitos (a)
-1
-1
-1
(@ 1.000 ng mL )
(@ 2.000 ng mL )
(mL)
(@ 400 ng mL )
Nivel 1
0,250
1,000
0,500
8,250
Nivel 2
1,000
1,000
0,500
7,500
Nivel 3
10,000
5,000
2,500
32,500
Nivel 4
4,000
1,000
0,500
4,500
Nivel 5
8,000
1,000
0,500
0,500
(a) Utilice disolución preparada en sección 6.8.1 (ver Disolución de Enriquecimiento de Herbicidas Triazinas).
(b) Utilice disolución preparada en sección 6.8.1 (ver Estándares de recuperación).
(c) Utilice disolución preparada en sección 6.8.1 (ver Estándares Internos).
Disoluciones de
calibración
Volumen final
(mL)
10,000
10,000
50,000
10,000
10,000
Como en los casos anteriores, note que la disolución de calibración a nivel 3 se prepara en
mayor volumen para ser utilizada cada vez que se requiera controlar la calibración del
instrumental utilizado. Las concentraciones resultantes serán:
Disoluciones de
calibración
Nivel 1
Nivel 2
Nivel 3
Nivel 4
Nivel 5
Concentración de
cada analito
(ng mL-1)
10
40
80
160
320
Concentración de
(ng mL-1)
100
100
100
100
100
Concentración de
(ng mL-1)
100
100
100
100
100
•
Carbaril
Carbofuran
Oxamil
analitos, estándares de recuperación y estándar interno) y de un disolvente a elección en la
preparación de cada disolución de calibración son sugeridos en el siguiente cuadro:
Disoluciones de
Analitos (a)
Disolvente
Volumen Final
4 µg mL-1
(mL)
(mL)
Calibración
Nivel 1
0,125
4,875
5,000
Nivel 2
0,500
4,500
5,000
Nivel 3
5,000
20,000
25,000
Nivel 4
2,000
3,000
5,000
Nivel 5
5,000
0,000
5,000
(a) Utilice disolución preparada en sección 6.8.1 (ver Disolución de
Enriquecimiento de Insecticidas Carbamatos).
104
Como en los casos anteriores, note que la disolución de calibración a nivel 3 se prepara en
mayor volumen para ser utilizada cada vez que se requiera controlar la calibración del
instrumental utilizado. Las concentraciones resultantes serán:
Disoluciones de
Calibración
Nivel 1
Nivel 2
Nivel 3
Nivel 4
Nivel 5
Cada Analito
(ng mL-1)
100
400
800
1.600
4.000
6.8.3. Secuencia analítica
En ésta y en las secciones siguientes se considera el análisis de insecticidas clorados como
ejemplo para la obtención de una curva de calibración y cálculos posteriores de
concentración. En estos procedimientos analíticos guías se utilizan las disoluciones
introducidas en las secciones precedentes y son aplicables a todos los análisis de compuestos
orgánicos por métodos similares.
La secuencia analítica para el análisis de compuestos orgánicos por cromatografía de gases
debe incluir:
•
Disoluciones de calibración y disoluciones para controlar la calibración del
cromatógrafo
•
Extractos de las muestras a analizar
La calibración del instrumento para el análisis de plaguicidas puede hacerse siguiendo uno de
los siguientes métodos:
•
Método A: La calibración puede realizarse como parte de la corrida analítica en
donde las cuatro disoluciones de calibración se colocan dispersos entre las
muestras de la batería analítica. La curva de calibración es construida con estos
cuatro niveles y es considerada como aceptable si presenta un coeficiente de
correlación = 0,9950 (i.e., R2 >= 0,9900) para todos los analitos presentes en las
disoluciones.
•
Método B: La calibración puede realizarse antes de correr las muestras y es
considerada como aceptable si presenta coeficiente de correlación = 0,9950 (i.e.,
R2 >= 0,9900) para todos los analitos presentes en las disoluciones. En este caso,
la calibración debe controlarse durante una corrida mediante la inyección de
disoluciones para controlar la calibración (“ConCal”) con períodos no mayores a
12 horas entre uno y otro. Esta calibración puede durar días o semanas pero debe
controlarse al comenzar una batería analítica y cada 12 horas, como máximo,
durante la misma.
105
Si la batería de muestras extraídas por el laboratorio incluye 16 muestras originales además
de las muestras destinadas al control de la calidad (blanco, muestra duplicada, blanco
enriquecido, muestra enriquecida, muestra enriquecida en duplicado, material de referencia),
la secuencia analítica del instrumento puede tomar una de las dos formas siguientes:
Método A
Orden
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
I.D.
W1000
W1001
Q3645
Q3646
Q3647
Q3648
Q3649
Q3650
K1518
W1002
K1519
K1522
K1523
K1525
K1526
K1527
K1540
K1541
W1003
K1542
K1543
K1544
K1545
K1546
K1547
K1548
W1004
Método B
Clase
Disolvente
Sol Cal 1
Blanco
Blanco enriquecido
Muestra duplicada
Muestra enriquecida
Muestra enriquecida en duplicado
Muestra 1
Sol Cal 2
Muestra 2
Muestra 3
Muestra 4
Muestra 5
Muestra 6
Muestra 7
Muestra 8
Muestra 9
Sol Cal 4
Muestra 10
Muestra 11
Muestra 12
Muestra 13
Muestra 14
Muestra 15
Muestra 16
Sol Cal 5
Orden
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
I.D.
W1000
W1001
W1002
W1003
W1004
W1005
Q3645
Q3646
Q3647
Q3648
Q3649
Q3650
K1518
W1006
K1519
K1522
K1523
K1525
K1526
K1527
K1540
K1541
W1007
K1542
K1543
K1544
K1545
K1546
K1547
K1548
W1008
Clase
Disolvente
Sol Cal 1
Sol Cal 2
Sol Cal 4
Sol Cal 5
Cal 3 (control)
Blanco
Blanco enriquecido
Muestra duplicada
Muestra enriquecida
Muestra 1
Cal 3 (control)
Muestra 2
Muestra 3
Muestra 4
Muestra 5
Muestra 6
Muestra 7
Muestra 8
Muestra 9
Cal 3 (control)
Muestra 10
Muestra 11
Muestra 12
Muestra 13
Muestra 14
Muestra 15
Muestra 16
Cal 3 (control)
6.8.4. Curvas de calibración
Esta sección ejemplifica la obtención de las curvas de calibración y uso de las ecuaciones de
cálculos. A modo de ejemplo comparativo se muestran los procedimientos a seguir con y sin
el agregado de estándares de recuperación. Independientemente del método utilizado para
realizar la calibración del cromatógrafo de gases, la información resultará de la forma:
106
Analito X
Disolución de Calibración Nivel 1
E.I.
E.S
Conc =
Área =
100
2500
100
1800
200 ng mL-1
5200
100
2933
100
2049
80 ng mL-1
2392
100
2104
100
1469
20 ng mL-1
442
100
2304
100
1625
5 ng mL-1
124
Conc =
Área =
Conc =
Área =
Conc =
Área =
107
Curva de Calibración Utilizando el Estándar de Recuperación
Disolución de Calibración-Nivel 1
⎛ Área Analito X ⎞
⎟⎟
Área Relativa = ⎜⎜
⎝ Área E.S. ⎠
(5200/1800) = 2,8889
(2392/2049) = 1,1674
(442/1469) = 0,3009
(124/1625) = 0,0763
⎛ Conc. Analito X ⎞
Conc. Relativa = ⎜
⎟
⎝ Conc. E.S. ⎠
(200 ng mL-1/100 ng mL-1) = 2,000
(80 ng mL-1/100 ng mL-1) = 0,800
(20 ng mL-1/100 ng mL-1) = 0,200
(5 ng mL-1/100 ng mL-1) = 0,050
Curva de Calibración
Concentraciones Relativas
2.500
2.000
1.500
1.000
0.500
2
R = 1.0000
0.000
0.000
0.500
1.000
1.500
2.000
2.500
3.000
Areas Relativas
La curva de calibración puede corresponder a ecuaciones de distintas formas. Por ejemplo:
Y = A XB
donde:
Y = Concentración Relativa
X = Área Relativa
A & B = pendiente y coeficiente de la ecuación, respectivamente
En este ejemplo, los valores de ajuste de curva A y B son 0,6811 y 1,016, respectivamente,
con un R2 de 1,0000.
108
Ecuaciones de Cálculo Utilizando el Estándar de Recuperación
Y = A XB
(1)
(
Conc. Relativa = A * Área Relativa
)B
(2)
[Analito] (ng mL ) = A * ⎛⎜ Área Analito ⎞⎟
⎜ Área Est. Subrogado ⎟
[Est. Subrogado] (ng mL )
⎠
⎝
-1
B
(3)
-1
⎛ Masa Analito (ng) ⎞
⎜
⎟
B
⎛
⎞
Área Analito
⎝ Volumen (mL) ⎠
⎟⎟
= A * ⎜⎜
⎛ Masa Est. Subrogado (ng) ⎞
⎝ Área Est. Subrogado ⎠
⎜
⎟
Volumen (mL)
⎝
⎠
(4)
B
⎛
⎞ ⎛ Masa Est. Subrogado (ng) ⎞
Masa Analito (ng)
Área Analito
⎟⎟ * ⎜⎜
= A * ⎜⎜
⎟⎟
Volumen (mL)
Volumen (mL)
⎠
⎝ Área Est. Subrogado ⎠ ⎝
⎟
⎜
⎜⎜ Volumen (mL) ⎟⎟
⎠
⎝
⎛
⎞
Área Analito
⎟
= A * ⎜⎜
Área Est. Subrogado ⎟⎠
⎛ Peso Muestra (g) ⎞
⎝
⎜
⎟
B
⎛ Masa Est. Subrogado (ng) ⎞
⎜
⎟
Volumen (mL)
⎝
⎠
*
⎜
⎟
(5)
(6)
B
[Analito] (ng g
-1
[Analito] (ng g
-1
)
⎛
⎞ ⎛ Masa Est. Subrogado (ng) ⎞
Área Analito
⎟⎟ * ⎜
= A * ⎜⎜
⎟
Peso Muestra (g)
⎠
⎝ Área Est. Subrogado ⎠ ⎝
(7)
B
peso seco)
⎛
⎞ ⎛ Masa Est. Subrogado (ng) ⎞ ⎛
Área Analito
100
⎞
⎟⎟ * ⎜
= A * ⎜⎜
⎟*⎜
⎟
Área
Est.
Subrogado
Peso
Muestra
(g)
Peso
Seco
(%)
⎠ ⎝
⎠
⎝
⎠ ⎝
(8)
Curva de Calibración sin Utilizar el Estándar de Recuperación
Área del Analito X
5200
2392
442
124
Concentración del Analito X
200 ng mL-1
80 ng mL-1
20 ng mL-1
5 ng mL-1
109
Curva de Calibración
Concentraciones (ng/mL)
250
200
150
100
50
2
R = 0.9958
0
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Areas
Utilizando la misma ecuación del ejemplo anterior:
Y = A XB
donde:
Y = Concentración Relativa
X = Área Relativa
A & B = pendiente y coeficiente de la ecuación, respectivamente
En este ejemplo, los valores de ajuste de curva A y B son 0,0517 y 0,9591, respectivamente,
con un R2 de 0,9958.
Ecuaciones de Cálculo sin Utilizar el Estándar de Recuperación
Y = A XB
(1)
[Analito] (ng mL ) = ⎛⎜ Masa Analito (ng) ⎞⎟ = A * (Área Analito)B
(9)
⎡
⎤
⎜
⎟
⎢
⎥
1
⎝ Volumen (mL) ⎠ = A * Área Analito B * ⎢
⎥
⎢ ⎛ Peso Muestra ⎞ ⎥
⎜
⎟
⎢ ⎜ Volumen ⎟ ⎥
⎠⎦
⎣⎝
-1
(
)
(10)
(
)
(11)
Volumen ⎞
B ⎛
⎜
⎟ = A * Área Analito * ⎜
⎟
⎝ Peso Muestra ⎠
⎝ Peso Muestra (g) ⎠
110
[Analito] (ng g
-1
[Analito] (ng g
-1
) =A*
Volumen ⎞
(Área Analito)B * ⎛⎜ Peso
⎟
Muestra
peso seco) = A *
⎝
(12)
⎠
Volumen ⎞ ⎛ 100 ⎞
⎟*⎜
⎟
Muestra
Peso Seco
⎝
⎠ ⎝
⎠
(13)
6.8.5. Ejemplos de cálculos
Considere los siguientes datos de laboratorio
Ejemplo A:
Muestra de
Peso de muestra
Porcentaje de peso seco
Estándar de recuperación agregado
[estándar de recuperación]
Volumen final del extracto
Estándar interno agregado
[estándar interno]
=
=
=
=
=
=
=
=
sedimento
10,82 gramos de peso húmedo
12,9%
0,100 mL
1000 ng mL-1
~ 1 mL
0,100 mL
1000 ng mL-1
Alternativamente, se puede concentrar el volumen final del extracto anterior a un volumen
menor (e.g., aproximadamente 0,5 mL) para aumentar la señal del cromatógrafo de los
analitos de interés. En este caso se debe ajustar adecuadamente el agregado de estándares de
recuperación e internos para obtener una respuesta similar a la observada para estos
estándares en los cromatogramas de calibración y facilitar así una rápida comparación visual
de la recuperación, calidad de la inyección, etc.:
Ejemplo B:
Muestra de
Peso de muestra
[estándar interno]
=
=
=
=
=
=
=
=
sedimento
12,9%
0,050 mL
1000 ng mL-1
~0,500 mL
0,050 mL
1000 ng mL-1
=
=
=
=
=
=
sedimento
12,9%
0,025 mL
1000 ng mL-1
~0,250 mL
o
Ejemplo C:
Muestra de
Peso de muestra
111
[estándar interno]
=
=
0,025 mL
1000 ng mL-1
Similar procedimiento se puede seguir si se sospecha de una muestra de concentraciones
altas:
Ejemplo D:
Muestra de
Peso de muestra
[estándar interno]
=
=
=
=
=
=
=
=
sedimento
12,9%
0,500 mL
1000 ng mL-1
~ 5 mL
0,500 mL
1000 ng mL-1
Note que en estos ejemplos la concentración final de los estándares de recuperación e
internos no varía ya que la extrapolación a un volumen de aproximadamente 1 mL da como
resultado un agregado equivalente a 0,100 mL de una disolución de 1000 ng mL-1. Como se
destaca anteriormente, la reducción del volumen final de los extractos apunta a la obtención
de una respuesta similar a la observada para estos estándares en los cromatogramas de
calibración lo que facilita la evaluación visual de la corrida cromatográfica.
Cálculo de la concentración del analito “X” utilizando estándar de recuperación
Tomando la información de la Curva de Calibración Utilizando el Estándar de Recuperación
y la situación del ejemplo A considere el siguiente cromatograma:
Analito X
E.I.
E.S.
Área =
112
3200
2285
4046
La ecuación final para el cálculo de concentraciones utilizando el estándar de recuperación,
discutida más arriba (ecuación 8), es:
[Analito] (ng g
B
-1
⎛
⎞ ⎛ Masa Est. Subrogado (ng) ⎞ ⎛
Área Analito
100
⎞
peso seco) = A * ⎜
⎟*⎜
⎟
⎜ Área Est. Subrogado ⎟⎟ * ⎜
Peso Muestra (g)
⎠ ⎝ Peso Seco (%) ⎠
⎝
⎠ ⎝
Reemplazando en la ecuación:
[Analito] (ng g
1,016
-1
peso seco)
⎛ 4046 ⎞
= 0,6811 * ⎜
⎟
⎝ 2285 ⎠
⎛ 100 (ng) ⎞ ⎛ 100 ⎞
* ⎜⎜
⎟⎟ * ⎜⎜
⎟⎟ = 87,20 ng/g peso seco
⎝ 10,82 (g) ⎠ ⎝ 12,9 ⎠
Si el mismo extracto es tratado como se indica en el ejemplo B, se obtendrá el siguiente
cromatograma:
Analito X
E.I.
E.S
Área =
3260
2340
8012
Reemplazando en ecuación (8):
[Analito] (ng g
1,016
-1
peso seco)
⎛ 8012 ⎞
= 0,6811 * ⎜
⎟
⎝ 2340 ⎠
⎛ 50 (ng) ⎞ ⎛ 100 ⎞
* ⎜⎜
⎟⎟ * ⎜⎜
⎟⎟ = 85,20 ng g -1 peso seco
12,9
10,82
(g)
⎠
⎝
⎠ ⎝
Los cálculos utilizando la información dada en los ejemplos C y D se realizan de manera
similar siempre teniendo en cuenta la cantidad de estándar de recuperación agregado al
extracto o a la muestra antes de la purificación o extracción y purificación, respectivamente:
1,016
[Analito] (ng g
-1
[Analito] (ng g
-1
peso seco)
⎛ 15743 ⎞
= 0,6811 * ⎜
⎟
⎝ 2255 ⎠
peso seco)
⎛ 836 ⎞
= 0,6811 * ⎜
⎟
⎝ 2303 ⎠
1,016
⎛ 25 (ng) ⎞ ⎛ 100 ⎞
* ⎜⎜
⎟⎟ * ⎜⎜
⎟⎟ = 87,86 ng g -1 peso seco
10,82
12,9
(g)
⎝
⎠ ⎝
⎠
⎛ 500 (ng) ⎞ ⎛ 100 ⎞
* ⎜⎜
⎟⎟ = 87,14 ng g -1 peso seco
⎟⎟ * ⎜⎜
10,82
12,9
(g)
⎝
⎠ ⎝
⎠
113
Cálculo de la concentración del analito “X” sin utilizar estándar de recuperación
Tomando la información de la curva de calibración sin utilizar el estándar de recuperación y
la situación del ejemplo A, con la excepción que, al trabajar sin la compensación interna del
estándar de recuperación, el volumen final del extracto debe ser exactamente 1 mL, considere
el siguiente cromatograma:
Analito X
E.I.
E.S
0
0
Área =
4046
La ecuación final para el cálculo de concentraciones sin utilizar el estándar de recuperación,
discutida más arriba (ecuación 13), es:
[Analito] (ng g
-1
peso seco) = A *
Volumen ⎞ ⎛ 100 ⎞
⎟
⎟*⎜
Muestra
Peso Seco
⎠ ⎝
⎝
⎠
Reemplazando en ecuación:
[Analito] (ng g
-1
peso seco) = 0,0517 *
(4046)0,9591 * ⎛⎜⎜ 1,000 ⎞⎟⎟ * ⎛⎜⎜ 100 ⎞⎟⎟ = 106,70 ng g -1 peso seco
⎝ 10,82 ⎠ ⎝ 12,9 ⎠
Si el mismo extracto es tratado como se indica en el ejemplo B, con la excepción de que el
volumen debe ser exactamente de 0,500 mL se obtendrá el siguiente cromatograma:
Analito X
Área =
114
E.I.
E.S
0
0
8012
Reemplazando en ecuación 13:
[Analito] (ng g
-1
peso seco) = 0,0517 *
(8012)0,9591 * ⎛⎜⎜ 0,500 ⎞⎟⎟ * ⎛⎜⎜ 100 ⎞⎟⎟ = 102,74 ng g -1 peso seco
⎝ 10,82 ⎠ ⎝ 12,9 ⎠
Los cálculos utilizando la información dada en los ejemplos C y D se realizan de manera
similar siempre teniendo en cuenta la cantidad de estándar de recuperación agregado al
extracto o a la muestra antes de la purificación o extracción y purificación, respectivamente:
[Analito] (ng g
-1
[Analito] (ng g
-1
peso seco) = 0,0517 *
(15743)0,9591 * ⎛⎜⎜ 0,250 ⎞⎟⎟ * ⎛⎜⎜ 100 ⎞⎟⎟ = 98,18 ng g -1 peso seco
peso seco) = 0,0517 *
(836)0,9591 * ⎛⎜⎜ 5,000 ⎞⎟⎟ * ⎛⎜⎜ 100 ⎞⎟⎟ = 117,58 ng g -1 peso seco
⎝ 10,82 ⎠ ⎝ 12,9 ⎠
⎝ 10,82 ⎠ ⎝ 12,9 ⎠
Calculo de recuperación del estándar de recuperación usando el estándar interno
La utilización de estándares internos permite calcular la recuperación de los estándares de
recuperación y poder evaluar la efectividad del método de laboratorio. Si el agregado de
estándares de recuperación e internos se hace correctamente, las concentraciones de éstos en
el extracto final y en las disoluciones de calibración serán iguales (i.e., 100 ng mL-1 cada
uno) y esta relación se mantendrá independientemente del volumen final del extracto. La
razón entre el estándar de recuperación y el estándar interno en las disoluciones de
calibración representa una recuperación ideal del 100%. Un cálculo simple utilizando como
referencia cualquiera de esas disoluciones de calibración, o mejor aún, utilizando el promedio
de todas las disoluciones de calibración nos permite calcular la recuperación del estándar de
recuperación en la muestra como se ilustra a continuación:
Promedio
Ejemplo A (vol. = 1,0 mL)
Ejemplo B (vol. = 0,5 mL)
Área
Estándar Interno
(E.I.)
2500
2933
2104
2304
3200
3260
Área
Estándar de
Recuperación (E.R.)
1800
2049
1469
1625
2285
2340
Razón
(Área E.R./Área E.I)
0,7200
0,6986
0,6981
0,7053
0,7055
0,7141
0,7178
115
Recuperación de Estándar Subrogado (%) =
0,7141
*100 = 101.21%
0,7055
(Ejemplo A)
Recuperación de Estándar Subrogado (%) =
0,7178
*100 = 101,74%
0,7055
(Ejemplo B)
o
6.9. Reporte final de concentraciones
En general, el reporte final debe expresar estas concentraciones, con tres decimales después
de la coma, en ng g-1 peso seco, para suelo/sedimentos y biota, y en ng L-1, para agua. Los
calificadores que comúnmente se utilizan para caracterizar los datos son:
Tabla 15.
Calificadores de uso común para caracterizar los datos
Calificador
Significado
ND
=
No detectado
J
=
Por debajo del límite de detección del método
NA
=
No aplicable
Q
=
Resultado fuera de control
I
=
Interferencia
B
=
Contaminación presente en el blanco
d
=
Dilución
EC
=
Excede el punto máximo de la calibración
El laboratorio debe poseer un sistema de acciones correctivas que se active ante toda
situación que afecta la calidad de los datos y no se cumplan los objetivos de precisión y
exactitud detallados en Tabla 16.
Las planillas siguientes son ejemplos de reporte. Note que la información que se presenta en
estas planillas (e.g., encabezado y concentraciones que se mencionan) es totalmente ficticia y
sólo sirve a los propósitos de ilustrar el reporte que se propone. La primera página muestra
las concentraciones de los analitos de estudio para cuatro muestras y sus calificadores
correspondientes. La segunda página muestra las concentraciones detectadas en el blanco de
laboratorio y compara la muestra original con su duplicado, incluyendo información sobre la
desviación porcentual relativa entre las concentraciones de ambas. Aquellos analitos que
presentan una diferencia mayor al 25%, por ejemplo el 4,4’-DDE, son calificados con una
116
“Q” por encontrarse fuera de los límites deseados. La tercera página, da información sobre
las concentraciones encontradas en la muestra original y las recuperaciones de los analitos
adicionados a la muestra enriquecida y su duplicado asi como el desvío porcentual relativo
entre las recuperaciones de ambas muestras enriquecidas.
Tabla 16.
Objetivos de precisión y exactitud de los análisis
Parámetros de calidad
de los datos
Exactitud
Blanco enriquecido
Muestra enriquecida
Precisión
Muestras Duplicadas
Blanco enriquecido en duplicado
Frecuencia
Objetivos a cumplir (a)
En cada muestra
Recuperación entre el 40-120% de la
cantidad agregada
5 % de las muestras en
la batería analítica
(1:20) (a, b)
Recuperación entre el 40-120% de la
cantidad agregada
5 % de las muestras en
la batería analítica
(1:20) (a, b)
Diferencia porcentual relativa entre
concentraciones de un mismo analito menor
al 25%
(a) por lo menos uno por batería analítica
(b) puede ser obviado si no se tiene suficiente muestra
117
118
119
120
7. REFERENCIAS
ASTM Annual Book of Standards, Part 31, D3086, Appendix X3, Standardization of florisil
column by weight adjustment based on adsorption of lauric acid, American Society for
Testing and Materials, Philadelphia, PA, 765 p.
Burke, L. & Maidens, J. (1984). Reefs at Risk in the Caribbean, World Resources Institute,
Washington D.C., 80 p.
Federal Register (1984). Definition and procedures for the determination of the Method
Detection Limits, 40 CFR (Code of Federal Regulations), Part 136, Appendix B rev.
1.11.
International Mussel Watch Project Secretariat (1995), International Mussel Watch Project,
Initial Implementation Phase – Final Report, Farrington, J.W. & Tripp, B.W. Eds.,
NOAA Technical Memorandum NOS ORCA 95, 63 p.
National Oceanic and Atmospheric Administration (1998). Sampling and Analytical Methods
of the National Status and Trends Program Mussel Watch Project; 1993-1996 Update,
Lauenstein, G.G. & Cantillo, A.Y. Eds., NOAA Technical Memorandum NOS ORCA
130, 233 p.
UNEP (1983). Convenio para la Protección y el Desarrollo del Medio Marino en la Región
del Gran Caribe. UNEP Regional Seas Conventions and Protocols, 225 p.
121
GE
FReduc
i
ngPesc
i
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UNE
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guidelines for the collection, preparation and analysis of organic

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