la inmunización con adn: ¿una nueva generación de vacunas?
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la inmunización con adn: ¿una nueva generación de vacunas?
LA INMUNIZACIÓN CON ADN: ¿UNA NUEVA GENERACIÓN DE VACUNAS? Orlando L Pardo División Vacunas, CIGB, Apdo. 6162, c.P. 10600, Ciudad de la Habana, Cuba. ABSTRACT ' In the last five years, it has been foun~ !hat ~irect nucleic acid transfer into living organisms is a feasible ap- . proach to obtain expression levels that although a-re still farfrom being of emy therapeutic value, are indeed enough to elicit in the host a significative immune response against the protein codified by the nucleic acid .as', . such. This methodology of immunization has many advantages over more conventional ones, namely: t.q!3.., :' need of purifying proteins is obviated, as the expression occurs in the host cells the appropriate protein p~oc}~ ", essing and conformation are guaranteed, and most pros of live (e.g. elicitation of an efficient cellula,rp~~, . sponse) and subunit vaccines (e.g. high safety) are combined while most cons of both are avoided (e.g, eJ¡~i.-, tation of an immune response against the proteins of the specific live vector used). Therefore, although mony questions on the topic still remain unanswered, the possibility of nucleic acid vaccines becoming a new ge~eration of human vaccines belongs now to the near future. .." ;:~.. Key words: DNA immunization, DNA vaccines, gene-transfer, plasmid D~A. ':;:. Blotecnologla Aplicada J996; 13:8 J-88 (); .'1 ;. ~ i." y ~. ;:RESUMEN En los últimos cinco años se ha logrado demostrar que la transferencia directa de ácidos nucleic::o~:a'org'anismos vivos genera niveles de expresión que si bien son aún de escaso valor terapéutico,' son sufldehtespara despertar en el hospedero una respuesta inmune significativa contra la proteína codificada poi el'a'Cido nucleico en cuestión. Esta metodología de inmI;Jnización posee múltiples ventajas sobre las ya convencionales: se obvia la necesidad de purificar proteínas, la expresión en las propias células.del hospedero garantiza una maduración y conformación adecuadas para la proteína de interés, y se combinan muchos aspectos 'positivos de las vacunas vivas (p.e. obtención de respuesta celular eficiente) con los de las vacunas de subunidades (p.e. alta seguridad), evitándose además muchos de los aspectos negativos de ambas (p.e. desencadenamiento de respuesta contra los antígenos propios del vector vivo empleado). Por consiguiente, y aunque'aún existen muchas interrogantes abiertas al respecto, la posibilidad de que las vacunas de ácidos nucleicos se conviertan en una nueva generación de vacunas humanas pertenece ahora a un futuro no muy lejano. Palabras claves: ADN plasmídico, transferencia Introducción En enero de 1989, un grupo de científicos de la Universidad de Wisconsin (EE.UU.) dirigido por Jon WolfT,trabajaba en la verificación de una hipótesis elaborada pocos meses antes por el grupo de Philip Felgner en la compañía biotecnológica Vical Inc., de San Diego, Califomia. La idea. en resumen, consistía en emplear los complejos eIectrostáticos que surgen entre el ADN y determinados lípidos catiónicos, como vehículo para lograr una transfección in vivo eficiente, que rindiera niveles de expresión de cierto valor terapéutico. Para sorpresa de todos, en los animales usados' como controles negativos (en los que sólo se administró ADN plasmídico en solución acuosa) los niveles de expresión del transgén en el músculo munno eran significativos también. Una vez comprobada la reproducibilidad de semejante hallazgo, la llamada tecnología de "transferencia directa de ADN desnudo" recién había nacido, lo cual despertó gran interés en toda la comunidad científica intemacional. 87 Si bien era la primera vez que se demostraba expresión in vivo mediante la administración directa de ADN "desnudo", existían varios precedentes de "transferencia genética directa" desde los años ochenta, cuando la inyección inlraperitoneal de ADN plasmídico coprecipitado con fosfato cálcico generó expresión delectable en varios órganos murinos (1). Poco antes, un intent.o similar había sugerido que sólo las moléculas replicativas serían capaces de persislir suficiente tiempo en el organismo en cuestión (2), y de hecho, era conocido que la inyección del ADN genómico de ciertos virus sí rendía tral1sfecciones exitosas in vivo. Asimismo, no sólo los complejos ADN lípidos, sino también los de ADN proteínas (entre otros sistemas más o menos sofisticados), se venían estudiando intensamente durante esos años con el objetivo común de desarrollar mi vehículo efectivo para la transfección del ADN i1/ vivo. Pero es sólo después.del inusitado descubrimiento dc los grupos de WolIT y Fclgner (3), que se presta suficiclIl<: genética, vacunas de ADN o Pardo Inmunización atención a la posibilidad de lograr dicho objelivo sin necesidad de apelar a fonnulaciones especiales. La presente revisión se concentra básicamente en los estudios desencadenados a raíz del mencionado descubrimiento, y está enfocada, como lo indica su título, hacia el campo de las vacunas, pero también se abordan otras aplicaciones no menos importantes que van siendo ensayadas con esta novel tecnología de "transferencia directa de ADN desnudo". Estudios iniciales Varios estudios fueron iniciados a partir de 1990 para dilucidar los aspectos básicos de la "transferencia di-' recta de ADN desnudo", así como para establecer las condiciones óptimas en las que ésta se verificaba (322, revisado en 23). Los resultados más relevantes de estos primeros estudios pueden resumirse de If siguiente manera: l. Mediante la inyección directa de ADN plasmídico puro en animales se obtiene expresión importante en el tejido muscular estriado (esquelético y cardiaco), pero apenas en otros órganos como son el cerebro, pulmón, estómago, bazo, útero y ru1ón (5). Esporádicamente se ha reportado expresión también en el higado (24) y la gláJldula tiroides (25). 2. La solución a ulyectar requiere por lo general de cierta fuerza iónica (16), por ejemplo: NaCI 0,9 %p:v, prefiriéndose un pH cercano a la neulrnlidad, si bien la implantación quirúrgica de precipit.1dosetanólicos del plásmido puro también resulta efectiva (4). 3. El n!imero de fibras transfectadas, salvo en casos particulares, resulta inferior al I % del total que compone al músculo en cuestión, pero la expresión es detectable durante más de un w10(15), especialmente cuando se emplean promotores virales "promiscuos" como el inmediato-temprano del citomegalovirus humano. 4. La presencia física del plásmido en el tejido muscular, al igual que su expresión, es detectable durwlte varios meses (15), a pesar de que la mayor parte tiende a ser degradado rápidamente, y de que no hay evidencias de su integración ni de su replicación en el wnbiente [posmitótico) de las libras musculares (15). La fonna superenrollada del plásmido resulta 20-100 veces más eficiente que la lineal (15), lo cual pudiera estar relacionado con una mayor resistencia a la degradación o con e] mecanismo, aÚndesconocido, de entrada a la célula. 5. En muy pocos casos la inyección del plásmido provoca infiltración de células mononucIeares a] tej ido muscular (17), Ytambién es limitado el número de fibras dañadas por esta técnica. 6. En el modelo murino, se considera que la dosis "saturwJte" de plásmido es inferior aSO Jlg (16), Y si bien es recomendable inyectar durante las seo' manas de rápido crecimiento (12), se ha verificado expresión en casi todas las edades del animal. Entre las especies donde inicialmente también se de- 82 con ADN mostró expresión mediante la inyección de ADN plasmídico se incluyen carpas, pollos, perros, gatos, puercos, hwnsters y conejos. 7. Por último, las moléculas de ARN traJ1SCril3S y procesadas apropiadamente in vilro también generan expresión' detectable por esta técnica, pero mucho más transiente que la generada por el ADN plasmídico (3). De todas las generalizaciones aportadas por los estudios iniciales referidos arriba (3-23), quedaba cIaro que la tecnología de "transferencia directa de ADN desnudo" era una realidad que podría revolucionar los protocolos convencionales de terapia génica, especialmente los diseñados para combatir miopatías primarias como la distrofia muscular de Duchelllle, entre olJ'as, y en este sentido se comenzó a investigar (8). I.a inmunización con ADN Al margen de las posibles aplicaciones terapéuticas de la "transferencia directa de ADN desnudo", quedaba otro campo aún sin explorar: ¿sería posible generar una respuesta inmune en el hospedero al transferirle genes heterólogos? ¿Cuán efectiva resultaría dicha respuesta para protegerlo contra un patógeno específico? En 1992, De-chu Tang y colaboradores en la Universidad de Texas (EE.UU.), responden afirmativamente la primera de las interrogantes anteriores al detectar anticuerpo s en ratones inoculados con los genes de la honnona del crecimiento y/o la antitripsina-al humanas, si bien la técnica empleada en este caso no fue la inyección intramuscular, sino la proyección intradérmica de micra partículas de oro recubiertas superficialmente con los plásmidos en cuestión (26). Esta variante de administración ill vivo del ADN plasmídico será abordada con algún detalle más adelante. En el mismo reporte (26), se notó una evidente respuesta secundaria al inmunizar más de una vez los animales, pudiéndose detectar los wlticuerpos durante al menos cinco meses. A partir de entonces, numerosos grupos científicos interesados en generar inmunidad protectora contra determinados patógenos (especialmente intracelulares), decidieron ensayar la inmunización con ADN para detenninar si las respuestas inmunes obtenidas mediante esta técnica tenían algún significado biológico (revisado en 27-32). De ser así, podrían compararse los resultados de esta incipiente tecnología con los alcanzados mediante las ya convencionales (inmunización con proteínas puras, microorganismos inactivados o atenuados, etc.). Un patógeno en el que se comenzó a trabajar con gran intensidad fue el virus de la influenza humana (33-43, revisado en 44) empleando como modelos animales ratones, pollos, y más recientemente, hurones. Biolecnología Aplicada 1996; Vol. 13, No. 2 Inmunización o Pardo Los resultados positivos obtenidos han superado con toda s~guridad cualquier vaticinio preliminar. En el mode1o-.murino,en varios casos se generaron títulos discretos de anticuerpos.contra la hemaglutinina (HA) y la nucleocápsida (NP), los que resultarOn capaces de inhibir la hemaglutinación viral e incluso neutralizar el virus in vitro. Se generó, además, respuesta citotóxica de amplio espectro contra NP, la cual fue detectable aún al año de la inmunización (38, 42). Pero lo que resulta más importante: en dependencia de la dosis de ADN y la vía de inmunización empleada, hasta un 95 % de los ratones inmunizado s quedaron protegidos contra UIJ reto letal del virus de la influenza (33-35, 40). Los estudios realizados con este ortomixovirus no sólo demuestran que las vacwlas de ADN resultan de hecho efectivas, sino que han modificado en gran medida los conocimientos iniciales ya mencionados sobre "la transferencia directa de ADN desnudo". Por ejemplo, además de la vía intramuscular de inmunización, la intravenosa (35) y la intradérmica (35,42) también generan respuestas inmunes importantes. Asimismo, en ratones la dosis de ADN plasmídico puede ser tan poca como I J.1g(40), Ysi se emplea la variante de los microproyectiles in- . tradénnicos, mucho menor aún (35). Otro importante patógeno abordado por la imnunización con ADN es el virus de la imnunodeficiencia humana (VIIi-I) (45-53). En este caso, se han obtenido anticuerpos contra epítopes relevantes de las glicoproteínas gp 120 Y gp4 I en ratones y primates no humanos. Estos anticuerpos neutralizan ill vitro al virus, inhiben la fonnación de sincisio por el mismo, e interfieren parcialmente la unión de gpl20 con su receptor celular (45, 46). Además, también se genera respuesta citotóxica contra las proteínas gpl60 y gpl20 de este retrovirus, la cual tiende a anteceder la aparición de los anticuerpo s (47), Y resulta suficiente para proteger a más del 90 % de los ratones imnwlizados de un reto letal con células tumorales transfectadas con la gpl60 del propio VIH-I (48). Un resumen de los principales patógenos donde se ha aplicado (con mayor o menor éxito) la inmunización con ADN, aparece en la Tabla 1; también se han iniciado estudios con los genes de las proteínas gB de citomegalovirus, porinas de Salmonella typhi, y varios antígenos Oavivirales, entre otros. Vías Alternativas con ADN no lo emplean "desnudo" exactamente, sino conjugado a otras moléculas. Estas estrategias persiguen, en última instancia, lograr una transfección más eficiente in vivo, o dirigir específicamente la expresión a determinado tejido de interés que no sea el muscular estriado. Cañón de micropartículas En la sección anterior se mencionó el empleo de los microproyectiles intradénnicos, primero como reporte original de la obtención de anticuerpo s al inmunizar éon ADN (26), Yya luego aplicado al caso específico del virus de la influen~a humana' (35). Esta variante de administración hace uso de un "cm1ón" capaz de propulsar las micropartículas recubiertas con el ADN en cuestión a través de varias capas celulares del tejido a transfectnr, bien sea este un órgano quirúrgicamente expuesto, o simplemente la piel (54-56). La expresión de los genes transferidos mediante esta técnica, al igual que con la inyección directa, se ha demostrado en múltiples especies de animales (ratón, rata, hámster, conejo y mono rhesus), pero distintivamente, la misma no se limita sólo al músculo estriado, sino que es detectabl.etambién en epidemlis, dennis, hígado, rú1ón,páncrens y, algo menos, en corazón, bazo y músculos abdominales (22). Con dosis tan bajas como 15 ng de ADN ya es posible obtener una respuesta biológica eficiente (57), lo que es atribuible no sólo a la alta efectividad en la entrega intracelular del ADN, sino también a la posibilidad de transfectar tejidos más inmuno-competentes que el músculo (58). Propulsor de fluidos El principio de funcionamiento es la proyección con alta presión de la solución donde se haBa disuelto el ADN. Este procedimiento ha sido empleado con anterioridad para la vacunación convencional en humanos. .. Al parecer no resulta tan eficaz cpmo el "cw1ón" de micropartículas, pero el mero hecho de no introducir tales partículas metálicas en el orgmlismo, lo hace muy atractivo para WIapresunta inmunización con ADN en seres humwlOs. Además, esta técnica mWItienela ventaja de pennitir expresión no sólo en el músculo estriado, sino taJnbiénen picI, tejido adiposo y glándulas mamarias (59, 60), lo cual genera respuestas humorales y ccIularcs signilicalivas (61). Complejos ADN lípidos (3D, 62) Si bien la inyección intramuscular directa de complejos ADN lípidos no rinde ventajas significativas sobre el ADN "desnudo", por vía intravenosa sí se obtiene con ellos una expresión importante en músculo, así como en muchos otros tejidos y órganos: pulmón, riñón, hígado, bazo, timo, médula ósea, endotclio vascular, útero, páncreas e intestino. Sin embargo, la expresión en estos tejidos resulta, por Además de la inyección intramuscular en solución salina fisiológica, se han desarrollado varias vías altemativas de inmunización, algunas de las cuales ya han demostrado ser superiores a la primera. A continuación se describen brevemente estas vías altemativas. También aparecen relacionadas, en aras de brindar un cuadro más completo, algunas estrategias "directas" de inmunización con ADN que 83 Biolecnología Aplícacla 1996: Vol.13,No. 2 o Parda Inmunización lo general, menos duradera que en el músculo, aunque en ratones tamhién se ha rcportado la transferencia ~.e\plesiÚn de dichos wmplcJos en los fetos y progenie neouala de hemhras inmunizadas (63). ( '(I/UI''''}''.\' ..11 J.\'/>rcJleiI1OS (6-1-66) Se han empleado mÚltiples variantes de complejos ¡\:)N proteínas. La dección de la proteína (transfenina. insulina, asialoglico-prolcínas. etc.) se basa en la presencia de los rcceptores celulares cspecífil'I1Sen d lcjido a transfeclar U,Ú).¡\demás, también se han desanollado complejos más sofisticados que Incluven particulas adenovirales no replicativas, con d ohjclivo de favorecer el escape cndosomal una vez endocitado el complejo (65); Otras Aplicaciones Las aplicaciones de la "transferencia directa de genes" no se reducen a generar inmunidad contra agentes infecciosos, sino que, mediante la transferencia de los gcnes codificantes para las proteínas del sistema principal de histocompatibilidad (67-72), mÚltiples linfoquinas (73-76), regiones variables de inmunoglobulinas (77), el receptor de las células T (7R) así como las moléculas de diferenciación CD4 y CD8 (79), ya se ha comenzado a manipular i" vivo' d sistema inmune de una fonna mucho más práctica que las disponibles por las metodologías convencionales. Los resultados obtenidos en este campo son también muy alentadores, como lo indican los ejemplos citados a continuación: l. En r~tones, la transferencia intramuscular de los genes de IL2, IL4 Y GM-CSF adyuva la respuesta humoral que estos animales desarrollan contra un antígeno determinado, mientras que la transferencia de los genes de TGF-j31 y IFN-y la suprimen (73, 76). Asimismo, la administración intravenosa de los genes del propio TGF-j31 y de PDGF B, provoca marcados efectos biológicos en el tejido endotelial transfectado (75, 80). 2. Se han iniciado estudios con los genes codilicantes para la cadena de receptores de células T "patogénicos" (provenientes de tejidos sino viales de pacientes con artritis reumatoide), y es posible generar respuesta humoral contra esa proteína en ratones (78), lo cual pudiera tener importancia terapéutica de verificarse en humanos. 3. Varios esquemas de inmunización con ADN plasmídico se han realizado en animales para gene., rar una respuesta inmune protectora antitumoral. Los transgenes por excelencia han resultado ser las moléculas del sistema principal de histocompatibilidad tipo 1 (67, 68, 71, 72) (con el propósito de provocar un rechazo hacia las células tumorales transfectadas), si bien otros candidatos (como los antígenos T del virus SV40 y el antígeno carcinoembrionario) también han sido empleados (81 ). 84 can ADN Por lo general, en estos estudios el ADJ-..se ha evaluado acomplejado con lípidos catiónicos, buscando amplificar los efectos biológicos de la terapia (respuesta cito tóxica antitumoral, regresión o progresión retardada del tumor, etc.), pero en solución salina fisiológica también se desata una respuesta ilUnune en el animal vacunado (69, 70), Es precisamente en pato.logías incurables por la medicina actual, donde la "transferencia directa de ADN" ha sido aplicada en seres humanos por primera vez. Varios estudios clínícos de fase 1 y 11, que involucran en total a decenas de pacientes de cáncer, han sido realizados o están en desarroIlo en EE.UU. (82). En estos estudios, los panímetros seguidos más rigurosamente han sido la toxicidad de la formulación, la aparición de síntomas de autoinmunidad y por supuesto, la cuantificación y localización tanto de la pro.teína for-ánea como dcI plásmido que la codifica. Aún es muy temprano para emitir veredicto alguno sobre los efectos biológicos de la terapia, si se toma en cuenta que las vías de inoculación, fonnulaciones y dosis aún están siendo optimizadas. Por último, no debe omitirse aquí la mención de dos aplicaciones muy recientes de la inmunización con ADN, y que resultan no menos espectaculares: l. El empleo de detenninadas bacterias transformadas con el plásmido de interés como vehículo vivo para su entrega a nivel de las mucosas (83). 2. La inmunización directa con bibliotecas genómicas de detenninados patógeno s, como metodología de identificación .de los antígenos protectores contra eIlos (84). 8ioseguridad y Regulaciones Tres consecuencias negativas que en principio podrian derivarse de la ilUnwlización con ADN son: l. La aparición de anticuerpo s contra el ADN inyectado pudiera generar estados autoininunes reminiscentes de los que se presentan, por ejemplo, en ellupus eritematoso sistémico. 2. La integración genómica al azar del ADN inyectado pudiera activar un oncogén, inactivar genes supresores de oncogenes, etc. 3. La expresión continua de "bajos" niveles del antígeno, y su presentación al sistema ilUnune por largos periodos, pudiera generar estados de tolerancia, hiperilUnunidad, etc. El primero de estos puntos es tal vez el menos preocupante de los tres, ya que durante años se conoce la escasa imnunogenicidad de la confonnad{)n B (más usual) del ADN, especialmente libre en solución. La obtención de anticuerpos contra el ADN B se logr.a mediante su conjugación a proteínas inmunogénicas. Además, de los anticuerpo s contra el ADN doblecatenario, solamente aqueIlos de alta afinidad que posea.n aminoácidos básicos en sus paratopos resultan realmente patogénicos, al de- Biofecno/og(a Aplicada 1996; Vol. 13, No. 2 o Pardo Inmunizacióh Tabla 1. Principales patógenos contra los que se ha aplicado la inmunización con ADN. COMENTARIOS PÁ TÓGENO Herpesvirus bovino 1 con ADN REFERENCIAS Anticuerpos murinos contra gl, glll, Y glV, estol últimos neutrali%antes. la inmunización con ..1 g..n d.. glV confi..r.. prot..cción Virus de las hepatitis ByC Anticuerpos Virus de la coriomeningitis linfocltica Escasos onticu..rpos Virus de la rabia Obt..nción d.. anticu..rpos prot..ctora, d..t..ctándos.. murinos contra prot..lnas en ratas y conejos 'o han generado en raton..s contra la NP d..1 VHC. quiméricas anticuerpo. NP (del VHC) y pr..S2-S o S (d..1 VHB). Tambión contra S, y s. ha d.tectado murinos conlro lo NP o GP, pero sensibilización in vivo y 50 % d.. prot..cción d. terneros (92) parcial. (..n ocosion..s (103-105) d.. linfocitos citotóxicos inmunoamplificación). murinos n..utralizant..s adyuvación (93-101,102) respuCtsta cito'óxico o supr..sión y r..spu..sta m..diante citotóxica contra gG, asi como inmunidad la coinoculación d.. plásmidos (106,107,76) codificant... para GM-CSF o IFN-1. r...p..ctivam..nte. Micobacterias La inmunización d.. raton... con ..1 g..n d.. HSP65 d.. M. leprae rind.. m..nor... tras un r..to con M. tuberculosis. d.. M. tuberculosis. Leishmania majar La inmunización Plasmodium yoelii Obt..nción d.. ratones de anticuerpo. parcialmento Tambión s.. ..studian bact..r..mia. h..pática. (108) los g..n..s d.. HSP65, 85A, 85B Y 85C con el g..n de gp63 de L. maior confi..re prot..cción murinos contra ..1 antlg..no (109,110) parcial. CSP d.. P. yoelii (lo. qu.. in vitro inhib..n la invasión microbiana a h.patocitos), as( como respuesta Virus herpes simplex Anticu..rpos murino. anticu..rpo. n..utralizont... Schistosoma japonicum Anticuerpo. murino. contra Sj97, no a.i contra Sj26. Mycoplasma pulmonis Anticuerpos murinos y respuesta Cryptosporidi um parvum La inmunización d. ovoias con 01 g8n de CP15/60 Papilomavirus La inmunización con el gen de L¡ en con..jos g..n..ró anticu..rpos contra gB de HSV.¡ poco n..utralizant..s, - (111 114) cito'óxico y protección parcial. pero 80 % d.. prot..cción. Tambión (115,116,117) contra gD de HSV.2. citotóxica positarse fundamentalmente .en la membrana basal de los glomérulos (85). Por último, en todos los esquemas de inmunizació\1 con ADN donde sc han buscado anticuerpos a.nti-ADN, éstos nunca se han d,etectado (14). Los otros dos aspectos son de mayor significación, ya su vez, mucho mós difíciles de monitorcar ;n vivo. Los plásmidos que se emplean para la inmunización no poseen regiones reportadas como orígcncs dc replicación en células eucarióticas, ni tampoco sccuencias homólogas promotoras dc evcntos recomhinativos-integrativos (exceptuando los casos donde el gen a transferir es homólogo). Adcmás, nunca se ha logrado detectar esos eventos expcrimentalmente (15), si bien es imposihle aún excluir su oculTcnciaal azar con muy baja frecucncia. Tampoco se han dctect;:¡dosíntomas de tolenUlciao hiperinmunidad en los animales inmunizados con ADN, ni ningún tipo de trdstomo autoilUnunedegenerativo. Pero, obviamente, muchos experimentos controlados han de ser diseiiados aim antes de que la Última palabro sobre tan delicado aspccto sea dicha. contra (118) determinados (119,84) antígenos. genera anticuorpo, en ,uoro y calostro. n..utralizant... y prot..ctor.... Tal v~ Wlaaltemativa que aún no haya sido apreciada a cabalidad sea el empleo del ARN en lugar del ADN. De hecho, ya se han comenzado a desarrollar sistcmas replicativos de ARN capaces de rcndir expresiones suficientemente estables como para gencrar respuestas i1Ul1unessignificativas (86, 87). C'onclusiones ¿Cuánto habrá qué esperar para la aplicación en seres humanos de una vacuna de ADN? La rcspuesta dcpelide de los conocimientos quc sumi-nistren los estudios mencionados arriba. También dcpcnde dcl patógeno específico contra el quc se prctcnda proteger. Por ejemplo, en el caso del HIV-l (incurable por la ciencia actual) algunas compmiías norteamericmlas ya han obtenido la autorización olicial para realizar cxpcrimentos de inmunización con ADN en seres humanos. Los controles que habrán de realizarse preliminarmente, así como las regulaciones que rcgirán la presunta aplicación en humanos de la primera vacuna de ADN, recién comienzan a ser discutidos (88, 85 Biolecno/ogla -- .. Aplicado 1996; Vol. 13, No. 2 (120) (121 ) o Pardo Inmunización 89,90,91), y ya se han celebrado varios eventos internacionales de gran prestigio para abordar el tema de las vacW1asde ADN, como los sostenidos en Ginebra (Suiza) en mayo '94, en Arlington (EE.UU.) en abril '95, y en Bethesda (EE.UU.) en febrero '95 Y '96. Son muchos los argumentos emitidos por la comunidad científica internacional fuera y dentro de estos eventos, tanto a favor como en contra de una posible vacunación con ADN en seres humanos. Muchas son las interrogantes que se han 1. Benv.ni'ly N ond R..h.1 L. Direct inlrodUdion 01 ganes ¡nto rats and eXpr8s.$ion 01 Ih. gen... PNAS USA 1986;83:9551-9555. 2. Dub.n.ky TW. CompbeU 8A ond ViUor. real lP. Direct .rond.dion o, viral ond plo.mid DNA inlo Ih. liver or .pl..n 01 mic.. PNAS USA 1984;81 :7529-7533. 3. WolII JA, Molon. RW. Williom. p. Chong W. Acsadi G, Jani A, el 01. Direct gene tronsl.r ¡nto mouse muscl. In vivo. Science 1990;247: 1465-1468. 4. 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Por hoy, nos basta con saber que la iJUnunización con ácidos nucleicos "desnudos" es ya una altemativa real que va abriéndose camino paulatinamente como fonna práctica de manipulación del sistema iJUnune.Para maJlana nos queda la graJl incertidumbre de si esta técnica llegará a convertirse o no en una nueva generación de vaCWlashwnaJlas. is superior to virol vedors 'or dir.d g.n. tronder into adult mous. sk.letal muscle. Hum Gen. Th.r 1993;4:733-740. 18. Dovi. HL. Whol.n RG ond D.m.n.ix BA. Dired oene tron,'er into ,keletal mu,ele In vltro: 'octon in'luencing efficiency of trons'er and stobility o, expression. Hum G.n. Ther 1993;4:151-159. . 19. Dovi. HL ond Jo.min 8J. Dir.ct g.n. Ironder inlo mouo. diophrogm. FEBSL." 1993;333: 146-150. 20. WolII JA, Dowty ME. Jioo S. R.pe"o G, Berg RK, Ludlke JJ. o, a'. Expr...ion 01 no. k.d ploomido by eullured myolube. ond .n. Iry 01 plo.mido inlo T lubule. ond eoveolo. 01 mommolion .k.l.lol mu.d.. J C.U Sei 1992;103: 1.249-1259. 21, N.ck... LM. 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