FREE PSA EIA - Diagnóstica Internacional

FREE PSA EIA - Diagnóstica Internacional

FREE PSA EIA
Inmunoensayo Enzimático para la Determinación Cuantitativa de
Antígeno Específico Prostático Libre (f-PSA) en Suero Humano
USO RECOMENDADO
Este equipo de prueba es recomendado para la determinación cuantitativa de f-PSA en suero humano mediante inmunoensayo enzimático.
INTRODUCCIÓN
El Antígeno Prostático Humano (PSA) es una proteinaza sérica de
33 kD, la cuál en suero humano, esta generalmente unida a una α-1antiquimiotripsina (PSA-ACT) y a una α-2-macroglobulina (PSA-AMG).
Cantidades traza de α-1-antitripsina y del inhibidor Inter-α-tripsina unidos
a PSA también pueden ser determinadas. Ningún remanente de PSA esta
en la forma libre (f-PSA).1-3 Los métodos actuales de rastreo en hombres
para cáncer prostático utilizan la detección de la mayor cantidad de la
forma PSA-ACT. Niveles de 4.0 ng/ml o mayores son fuertes indicadores
de la posibilidad de cáncer prostático. 4 Sin embargo, niveles elevados en
suero de PSA también pueden ser atribuidos al comienzo de una hiperplasia prostática y prostatitis, lo que puede ocasionar un alto porcentaje
de falsos positivos en los resultados de rastreo. 5 Una solución potencial
a este problema requiere que se determinen las concentraciones de PSA
libre1-3. Estudios preeliminares han sugerido que el porcentaje de PSA
libre es más bajo en pacientes con cáncer prostático que en aquellos
que están iniciando una hiperplasia prostática.2 Así que, la cuantificación
de PSA libre en suero en conjunto con la PSA total, puede mejorar la
especificidad del rastreo de cáncer prostático en los hombres seleccionados con niveles altos de PSA en suero, lo cual subsecuentemente podría
reducir biopsias prostáticas innecesarias con efectos mínimos en los porcentajes de detección de cáncer. 6
PRINCIPIO DE LA PRUEBA
La prueba EIA para f-PSA es un inmunoensayo de dos sitios en fase sólida. Un anticuerpo monoclonal anti-f-PSA esta unido sobre la superficie
de pozos de microplaca y otro anticuerpo monoclonal anti-PSA marcado
con peroxidasa de rábano es usado como trazador. Las moléculas de
f-PSA presentes en la solución estándar o suero están “en medio” de los
dos anticuerpos. Siguiendo la formación del antígeno-anticuerpo cubierto
y el complejo antígeno-enzima, los trazadores no unidos al anticuerpoenzima son retirados con los lavados. La actividad de la peroxidasa de
rábano unida en los pozos es entonces revelada mediante una reacción
colorimétrica. La intensidad del color formado esta en proporción a la
concentración de f-PSA presente en la muestra.
MATERIALES Y REACTIVOS
Materiales proporcionados con el equipo de prueba:
1. Microplaca de 96 pozos con el anticuerpo unido.
2. Diluente de la muestra, 12 ml.
3. Estandares de referencia con 0, 0.1, 0.5, 2.0, 5.0, y 10.0 ng/ml fPSA, líquido, listo para su uso. 1 equipo.
4. Conjugado enzimático, 22 ml.
5. Sustrato TMB (un solo paso), 12ml
6. Solución de paro (2N HCl), 12 ml.
7. Buffer de lavado concentrado (50X), 15 ml.
Cat. IIDE-2082
VER.1
Materiales necesarios pero no provistos:
1. Pipetas de precisión de: 0.10, 0.20, and 1.0 ml.
2. Puntas de micropipeta deshechables.
3. Agua destilada.
4. Mezclador Vortex o su equivalente
5. Papel absorbente o toallas de papel
6. Papel para gráficas
7. Un lector de placas con un ancho de banda de 10 nm o menos y con
un rango de densidad óptica de 0-2 o mayor a 450 nm.
PREPARACIÓN Y TOMA DE LA MUESTRA
1. La sangre deberá ser obtenida usando las técnicas comunes de
punción venosa y el suero deberá ser separado de las células rojas
de la sangre tan pronto como sea posible. Evitar hemólisis severa,
lipemia o la turbidez de las muestras.
2. Las muestras de plasma tomadas en tubos con EDTA, heparina, u
oxalato pueden causar interferencia con los procedimientos de la
prueba y deberán de evitarse.
3. Las muestras deben de taparse y guardarse hasta por 48 h a 2-8°C,
antes de realizar la prueba. Las muestras que se requieran mantener por tiempos más largos pueden congelarse a –20°C. Las
muestras congeladas deben de derretirse y mezclarse antes de iniciar la prueba.
ALMACENAMIENTO DEL EQUIPO DE PRUEBA E INSTRUMENTACIÓN
1. Los equipos de prueba que no se han abierto deben de almacenarse
2-8oC, la placa de microtitulación debe mantenerse dentro de la
bolsa sellada con los desecantes para evitar su exposición a la humedad del aire. El equipo de prueba puede usarse hasta la fecha
de caducidad (un año de la fecha de fabricación). Revisar la etiqueta
del paquete para verificar la fecha de caducidad.
2. Los equipos de prueba abiertos permanecerán estables hasta la fecha de caducidad mostrada, este es almacenado como se describió
anteriormente.
3. Un lector de microplacas con un ancho de banda 10nm o menos y
un rango de densidad óptica de 0-2 o más, a una longitud de onda
de 450 nm es recomendable para medir la absorbancia.
PREPARACIÓN DE REACTIVOS
1. Todos los reactivos deben de conservarse a temperatura ambiente
(18-25oC ) y mezclarse suavemente por inversión previamente antes de sus uso.
2. Diluir 1 volumen de buffer de lavado (50 X) con 49 volumenes de
agua destilada. Por ejemplo diluir 15 ml de buffer de lavado (50 X)
con 750 ml de agua destilada para preparar 750 ml de solución de
lavado (1X). Mezclar bien antes de su uso.
PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA
1. Asegurarse que estén en el contenedor el número de pozos recubiertos necesarios para el estudio.
2. Dispensar 100µl de los estándares, muestras y controles dentro de
los pozos adecuados.
Distribuido por:
DIAGNÓSTICA INTERNACIONAL S.A. de C.V.
Rudyard Kipling 4886 Col. Jardines de la Patria
CP 45110 Zapopan, Jalisco, México
Lada sin costo: 01 800 440 0404 c/ 10 líneas
Tel: 01 (33) 3770 1940 c/ 10 líneas
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3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
Dispensar 100µl del diluente de la muestra dentro de cada pozo.
Mezclar vigorosamente por 10 segundos. Es muy importante realizar un mezclado completo en este paso.
Incubar a 37°C por 60 minutos.
Retirar la mezcla de incubación vaciando el contenido de la placa
dentro de un contenedor adecuado.
Enjuagar y secar los pozos de microtitulación 5 veces con solución
de lavado (1X).
Retirar el exceso y gotas de agua residual utilizando un papel absorbente o toallas de papel.
Dispensar 200µl del reactivo de conjugado enzimático dentro de
cada pozo. Mezclar suavemente por 5 segundos.
Incubar a 37oC por 60 minutos.
Retirar la mezcla de incubación vaciando el contenido de la placa
dentro de un contenedor adecuado.
Enjuagar y secar los pozos de microtitulación 5 veces con agua de
la llave o agua destilada..
Retirar el exceso y gotas de agua residual utilizando un papel absorbente o toallas de papel.
Dispensar 100µl de solución TMB dentro de cada pozo. Mezclar
suavemente por 5 segundos.
Incubar a temperatura ambiente por 20 minutes en la obscuridad.
Parar la reacción adicionando 100µl de 2N HCl a cada pozo.
Mezclar suavemente por 30 segundos hasta que el color azul cambie
completamente a amarillo.
Usar un lector de microplacas, leer a una densidad óptica de a
450nm dentro de 20 minutos.
Notas importantes:
1. El procedimiento de lavado es crítico. Un lavado insuficiente resultara en una precisión pobre y lecturas de absorbancia falsamente
elevadas.
2. Se recomienda que si el pipeteo es manual, no deben de usarse
más de 32 pozos por cada corrida de prueba, desde que el pipeteo
de todos los estándares, muestras y controles debe de terminarse
en 3 minutos. Una placa completa de 96 pozos puede usarse si se
dispone de un pipeteo automático.
3. El uso de duplicados para todos los estándar y muestras, aunque no
es requerido, si es recomendable.
CALCULO DE RESULTADOS
Calcular el promedio del valor de la absorbancia (A450) para cada corrida
estándares de referencia, controles y muestras de pacientes. Elaborar
una curva estándar interpolando el promedio de la absorbancia obtenida
de cada estándar de referencia contra su concentración en ng/ml en un
papel milimétrico. Los valores de la absorbancia son colocados en la vertical, o eje “Y”, y la concentración en la horizontal o eje de las “X”. Usar
los valores promedio de absorbancia obtenidos en cada muestra para
determinar la concentración correspondiente de f-PSA en ng/ml a partir
de la curva estándar.
Ejemplo de curva estándar
Los resultados de una corrida típica con estándares leídos a una densidad óptica de 450nm, se muestran en el eje de las “Y” contra la concentración de f-PSA en el eje de las “X”.
Esta curva estándar es con el único propósito de ilustrar, y no debe de
usarse para calcular muestras desconocidas. Cada usuario tiene que obtener su propia curva estándar y sus datos.
PSA libre (ng/ml)
Absorbancia (450nm)
00.006
0.10.032
0.50.155
2.00.597
5.01.302
10.02.361
SENSIBILIDAD
La concentración mínima detectable de PSA libre para esta prueba se
estima que es de 0.05 ng/ml.
REACTIVIDAD CRUZADA
Antígenos
Concentración % Reacción cruzada
PSA-ACT500 ng/ml0.2
AFP10,000 ng/mL0
CEA5,000 ng/mL0
CA 1251,000 U/mL0
CA 15-31,000 U/mL0
CA 19-91,000 U/mL0
α-HCG
1,000 ng/ml
0
ß-HCG1,000 ng/mL0
HCG50,000 mIU/ml0
PRECISIÓN
Pruebas internas
Replicas
Nivel I
20
Nivel II
20
Nivel III
20
S.D.
0.005
0.011
0.128
% CV
13.1
4.4
3.2
LINEARIDAD
Se realizaron diluciones seriadas de dos sueros de pacientes con un estándar de 0 ng/ml. El promedio de recuperación fue de 108.7%.
Muestra A
Dilucion
Esperado
Observado
Sin diluir
8.691
8.691
2X
4.346
4.455
4X
2.173
2.290
8X
1.086
1.258
16X
0.543
0.617
32X
0.272
0.294
64X
0.136
0.147
Recuperación promedio: 107.6%
% Recov.
100
102.5
105.4
115.8
113.6
108.1
108.1
2
Muestra B
Dilucion
Esperado
Observado
undiluted
7.015
7.015
2X
3.508
3.516
4X
1.754
1.834
8X
0.877
0.970
16X
0.438
0.509
32X
0.219
0.249
64X
0.110
0.136
Recuperación promedio: 109.8%
% Recov.
100
100.2
104.6
110.6
116.2
113.7
123.6
NOTA . Esta traducción ha sido realizada lo mas apegada posible
al inserto original. sin embargo puede presentar modificaciones
importantes en su contenido de acuerdo al estilo y forma de traducción. por lo que recomendamos manejar el procedimiento de la
prueba a partir del inserto original.
REFERENCIAS
1.
Christensson A, Bjork T, Nilsson O, et al. Serum Prostate Specific Antigen
Complexed to 1-Antichymotrypsin As An Indicator of Prostate Cancer. J. of
Urol. 150:100-105; 1993.
2.
RECUPERACIÓN
Partes iguales de suero diluido de paciente se examinaron para probar
la interferencia de materias desconocidos, tales como drogas u hormonas, durante el desarrollo de la prueba. Concentraciones de PSA libre
se determinaron antes (original y adicionada) y después (observada). El
promedio de recuperación fue de 99.2%.
Lilja H, Christensson A, Dahlen U, et al. Prostate-specific antigen in serum
occurs predominantly in complex with -1-antichymotrypsin. Clin Chem.
1991;37:1618-1625.
3.
Stenman U-H, Leinonen J, Alfthan H, Rannikko S, Tuhkanen K, Alfthan O.
A complex between prostate-specific antigen and -1-antichymotrypsin is
the major form of prostate-specific antigen in serum of patients with prostate
cancer:assay of the complex improves clinical sensitivity for cancer. Cancer
Res. 1991;51:222-226.
Muestra 1
4.
Muestra Orig.Conc Adicionada Esperada Observada %Recov
A
9.802
0.141
4.972
4.540
91.3
B
9.802
0.281
5.042
4.638
92.0
C
4.699
2.168
3.434
3.342
97.3
D
2.168
1.170
1.669
1.661
99.5
E
0.563
0.281
0.422
0.423
100.2
F
4.699
1.125
2.912
2.727
93.6
G
0.563
0.141
0.352
0.399
113.4
Catalona WJ, Smith DS, Ratliff TL, Basler JW. Detection of organ-confined
prostate cancer is increased through prostate-specific antigen-based screening. JAMA. 1993;270:948-954.
5.
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J Med. 1987;317-:909-916.
6.
Catalona et al. Percentage of Free Serum PSA and Prostate Cancer Detection.
JAMA. 1995;274, No. 15: 1214-1220.
7.
Recuperación promedio: 98.2%
Catalona WJ, Smith DS, Ratliff TL, et al. Measurement of prostate-specific antigen in serum as a screening test for prostate cancer. N Engl J Med.
1991;324:1156-1161. Erratum: N Engl J Med. 1991;325:1324.
Muestra 2
8.
Muestra Orig.Conc Adicionada Esperada Observada %Recov
A
6.825
0.098
3.462
3.301
95.3
B
6.825
0.195
3.510
3.156
89.9
C
3.342
1.563
2.453
2.503
102.0
D
1.706
0.781
1.244
1.205
96.9
E
0.391
0.195
0.293
0.327
111.6
F
3.342
0.781
2.062
1.964
95.2
G
0.391
0.098
0.245
0.271
110.6
Recuperación promedio: 100.2%
Carter HB, Pearson JD, Metter J, et al. Longitudinal evaluation of prostatespecific antigen levels in men with and without prostate disease. JAMA.
1992;267:2215-2220.
9.
Smith DS, Catalona WJ. Rate of change in serum prostate-specific antigen
levels as a method for prostate cancer detection. J Urol. 1994;152:1163-1167.
10. Benson MC, Whang IS, Pantuck A, et al. Prostate specific antigen density: a
means of distinguishing benign prostatic hypertrophy and prostate cancer. J
Urol. 1992; 147:815-816.
11. Catalona WJ, Hudson MA, Scardino PT, et al. Selection of optimal prostate
specific antigen cut-offs for early detection of prostate cancer: receiver operating characteristic curves. J Urol. 1994;152:2037-2042.
LIMITACIONES DEL PROCEMIENTO
1. Se obtendrán resultados fiables y reproducibles cuando el procedimiento de la prueba se realice con el completo entendimiento de
las instrucciones y apegándose totalmente a las buenas practicas
de laboratorio.
2. El procedimiento de lavado es crítico. Un lavado insuficiente resultara en una precisión pobre y que las lecturas de absorbancia se
encuentren elevadas
3. Anticuerpos heterofilicos tales como anticuerpos anti-ratón (HAMA)
se encuentran frecuentemente en el suero de sujetos humanos. Estos anticuerpos pueden causar una interferencia severa en muchos
de los procedimientos de inmuno-diagnostico. Esta prueba se ha
diseñado para disminuir estos tipos de interferencia. Sin embargo, la
eliminación completa de esta interferencia de todas las muestras de
pacientes no puede garantizarse. Un resultado inconsistente de esta
prueba con la descripción clínica y la historia del paciente debe de
interpretarse con cuidado.
12. Smith DS, Catalona WJ. The nature of prostate cancer detected through prostate specific antigen based screening. J Urol. 1994;152:1732-1736.
3