RAT LIVER, KIDNEY, STOMACH IFA KIT/SLIDES

Transcripción

CONTENTS
RAT LIVER, KIDNEY, STOMACH IFA
KIT/SLIDES
Page No
1
Intended use
2
Summary and explanation
3
Principle
4
Reagents
5
Caution
6
Storage and stability
For in-vitro diagnostic use
Product code:
Product manufactured by:
The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K.
www.bindingsite.co.uk
Telephone: +44 (0)121 436 1000
Fax: +44 (0)121 430 7061
e-mail: [email protected]
7
Specimen collection
8
Methodology
9
Results
10
Limitations of procedure
11
Expected values and specific performance
characteristics
12
References
13
Summary of procedure
FDA (USA) Information:
Analyte name: Rat liver, kidney, stomach IFA kit
Complexity Category: High
2
Siehe Seite
Français
Español
Cf. page
Página
Italiano
1
INTENDED USE
This product is intended for use in the screening and titration of circulating
autoantibodies in human serum as an aid in the diagnosis and treatment of various
autoimmune diseases. The four major autoantibodies detected are antinuclear
antibodies (ANA), antimitochondrial antibodies (AMA), antismooth muscle antibodies
(ASMA) and antigastric parietal cell antibodies (AGPCA).
Deutsch
Português
FK013.1
FK013.2
FS013._
Veja páginas
Pagine
SUMMARY AND EXPLANATION
Indirect immunofluorescence is the reference method for screening and titration of
circulating autoantibodies in human serum. Animal tissue sections, e.g. from rat, are
generally preferred over other commonly-used substrates including human tissue
sections and cell preparations; this is primarily due to the lack of interference from HLA
and/or other blood group antibodies. Using three different tissues (liver, kidney and
stomach) enables autoantibodies to be more easily identified by comparing the results
obtained with each tissue.
Particular autoantibodies are associated with a number of different diseases. ANA
almost always occur with systemic lupus erythematosus (SLE) but are also commonly
found in patients with connective tissue and rheumatoid diseases. AMA are frequently
present in primary biliary cirrhosis but may also be detected in patients with other liver
diseases. ASMA are frequently associated with chronic active hepatitis and primary
biliary cirrhosis, but are also detectable in low concentrations in various other
conditions. AGPCA occur in the serum of most patients with pernicious anaemia. A
more detailed description of which autoantibodies are associated with which disease is
given in section 9 (refs.1-9).
3
PRINCIPLE
An indirect immunofluorescence technique is utilised where patient samples and
appropriate controls are incubated with the substrate slides (ref.10). The unreacted
antibodies are washed off and an appropriate fluorescein labelled conjugate is applied.
Unbound conjugate is washed off, and slides are viewed with a fluorescence
microscope. Positive samples produce apple-green fluorescence which corresponds to
areas of the section where autoantibody has bound.
4
4.1
REAGENTS
Rat liver, kidney, stomach sections on 5- or 10-well slides.
Kits only:
4.2
ANA homogeneous positive control serum containing 0.099% sodium
azide. Prediluted, ready for use.
4.3
Negative control serum containing 0.099% sodium azide.
ready for use.
4.4
Affinity purified sheep anti-human IgG (H+L) fluorescein isothiocyanate
(FITC) conjugate containing 0.099% sodium azide. Prediluted, ready for
use.
4.5
Mitochondrial positive control serum, containing 0.099% sodium azide.
Prediluted, ready for use.
4.6
Smooth muscle positive control serum, containing 0.099% sodium azide.
Prediluted, ready for use.
4.7
1% Evans Blue Optional counterstain.
4.8
Phosphate buffered saline (PBS), a 20-fold concentrate in liquid form.
4.9
Blotters, to blot the slides after washing.
Insert code: CIN006, Version: 1 October 2006, Page 1 of 18
Prediluted,
4.10
Mounting medium, containing an anti-fading agent (DABCO) 1, 4 diazabicyclo
[2.2.2] octane.
8.3.1
Mounting medium. Remove the mounting medium from the fridge to allow
it to reach room temperature (18-28ºC) before it is needed.
4.11
Coverslips (22 x 70mm).
8.3.2
Dilute PBS concentrate. Dilute PBS concentrate with distilled water (1
part PBS concentrate + 19 parts distilled water) and mix. The PBS is
used for diluting patient samples and as a wash buffer.
8.3.3
Dilute patient samples.
Screening: Dilute patient samples 1/20 by adding 50μL of serum to
950μL of PBS buffer.
Titration: Make serial dilutions of positive samples with PBS buffer. (e.g.
1/20, 1/40, 1/80, 1/160 and 1/320, etc).
For example: Take 100μL of the 1/20 dilution, mix with 100μL PBS to give
a 1/40 dilution. Repeat for further dilutions.
The Evans Blue and the kit controls contain 0.099% sodium azide as a preservative and must
be handled with caution – do not ingest or allow contact with the skin or mucous membranes.
If contact does occur wash with a large volume of water and seek medical advice. Explosive
metal azides may be formed with lead and copper plumbing; on disposal of reagent, flush with
a large volume of water to prevent azide build up.
8.3.4
Substrate slides. Allow substrate slide(s) to reach room temperature (1828°C) prior to removal from pouch(es). Label slides appropriately, place
in the humid chamber and add one drop of each positive and negative
control to appropriate wells. Add 50μL of diluted patient samples to the
remaining wells.
This product should only be used by suitably trained persons for the purposes stated.
Adherence to the given procedure is recommended
8.3.5
Slide incubation. Incubate slides for 20 minutes in a humid chamber at
room temperature (18-28°C).
8.3.6
PBS Wash. Remove slides from humid chamber and rinse briefly with
PBS squeeze bottle. Do not squirt directly on to the wells. Place slides in
a rack and immerse in PBS and agitate or stir for 5-10 minutes.
8.3.7
Addition of fluorescent conjugate. Shake off excess PBS and blot around
wells using blotters provided. Return slides to humid chamber and
immediately cover each well with a drop of fluorescent conjugate. DO
NOT LEAVE WELLS UNCOVERED FOR LONGER THAN 15 SECONDS.
Drying out of the substrate seriously affects the results.
8.3.8
Slide Incubation. Incubate slides for 20 minutes in humid chamber at
room temperature (18-28°C) in the dark.
8.3.9
PBS Wash.
Wash again as described in step 8.3.6.
Optional
counterstain. Add 2-3 drops of 1% Evans Blue per 100mL of PBS prior to
slide immersion.
8.3.10
Mounting with coverslip. Remove one slide at a time from PBS wash.
Quickly dry around the wells and add a drop of mounting medium to each
well. Carefully lower slide onto the coverslip, avoiding air bubbles, but if
present do not attempt to remove. Wipe excess medium from around
edge of coverslip.
8.3.11
View slides under fluorescence microscope. Slides may be stored for up
to 3 days at 2-8°C, in the dark, without significant loss of fluorescence.
5
CAUTION
All donors of human serum supplied (kits only) have been tested and found to be negative for
Hepatitis B surface antigen and antibodies to Hepatitis C virus and Human Immunodeficiency
Virus (HIV 1 & 2).
However, these tests cannot guarantee the absence of infective agents. Proper handling and
disposal methods should be established as for all potentially infective material and only
personnel adequately trained in such methods should be permitted to perform the procedures.
6
STORAGE AND STABILITY
Unopened kits/slides should be stored at 2-8°C and can be used until the given expiry date.
DO NOT FREEZE. Once slides are removed from their foil bag, they should be used
immediately. Diluted PBS buffer can be stored for up to one month at 2-8°C. All reagents
should be stored at 2-8°C.
7
SPECIMEN COLLECTION
Blood samples should be collected by venepuncture, allowed to clot naturally and the serum
separated as soon as possible to prevent haemolysis. The serum may be stored at 2-8°C for
up to 7 days prior to assay (ref. 11) or for prolonged storage, aliquoted and stored at -20°C or
below. DO NOT freeze and thaw sera more than once. Avoid using lipaemic, haemolysed or
microbially contaminated sera as decreased titres or unclear staining patterns may occur.
8
METHODOLOGY
8.1
Materials provided
8.1.1
50T Kit FK013.1
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
10 x Rat liver, kidney, stomach slide (5-well).
1 x 1mL ANA Positive Control (prediluted).
1 x 1mL Negative Control (prediluted).
1 x 1mL Mitochondrial Positive Control (prediluted).
1 x 1mL Smooth Muscle Positive Control (prediluted).
1 x 6.2mL Anti-human IgG (H+L) AFF FITC (conjugate).
1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain.
2 x 60mL PBS Buffer (x20 conc).
1 x 3mL Mounting Medium.
20 x Blotters.
10 x Coverslips (22 x 70mm).
1 x instruction leaflet.
8.1.2
250T Kit FK013.2
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
25 x Rat liver, kidney, stomach slide (10-well).
1 x 1mL ANA Positive Control (prediluted).
1 x 1mL Negative Control (prediluted).
1 x 1mL Mitochondrial Positive Control (prediluted).
1 x 1mL Smooth Muscle Positive Control (prediluted).
1 x 15.5mL Anti-human IgG (H+L) AFF FITC (conjugate).
1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain.
2 x 60mL PBS Buffer (x20 conc).
1 x 10mL Mounting Medium.
50 x Blotters.
25 x Coverslips (22 x 70mm).
8.1.3
FS013.1, FS013.2
1.
FS013.1 - 10 x Rat liver, kidney, stomach slide (5-well),
FS013.2 - 25 x Rat liver, kidney, stomach slide (10-well)
2.
8.2
Additional materials required.
8.2.1
Distilled water to dilute PBS concentrate.
9
RESULTS
9.1
Quality control
The ANA positive control should give a bright apple-green homogeneous pattern in cell
nuclei. The mitochondrial positive control should give bright apple-green staining of
renal tubules and gastric parietal cells. The smooth muscle positive control should give
bright apple-green staining of the muscularis layer of the stomach.
The negative control should show dull green staining in all tissues, with no discernible
fluorescence. If the controls do not appear as described, the test is invalid and should
be repeated.
9.2
Interpretation of results
9.2.1
Negative result
These are seen as dull green staining in all sections, with no discernible fluorescence.
Weak reactions should be repeated but at a higher dilution (e.g. 1/40). If the repeated
result appears the same as the original, the test is regarded as negative.
9.2.2
Positive result
These are seen as significant fluorescence in specific tissue areas giving one or more
of the following patterns:
Antinuclear antibodies (ANA)
ANA stain the nuclei of the following: liver cells, distal and proximal kidney tubules,
gastric parietal and chief cells. Almost all SLE patients have ANA in the serum, but
ANA can also be found in various connective tissue diseases including rheumatoid
arthritis. ANA can also occur with chronic active hepatitis and primary biliary cirrhosis
and in response to certain drug treatments.
Additional information can be gained by interpreting the ANA nuclear patterns obtained
(see below). It is recommended that all positive ANA samples are titred to endpoint to
ensure that possible mixed reactions are detected that may otherwise have been
missed. Further analysis of such samples for autoantibodies to double stranded DNA
and extractable nuclear antigens (ENA) is also advised.
8.2.2
Container for PBS buffer.
8.2.3
Micropipettes and disposable tips to apply patient samples.
8.2.4
Humid chamber for incubation steps (e.g. Magnetic Staining Chamber, BD010).
8.2.5
Fluorescence microscope with 495nm exciter filter and 515nm barrier filter.
8.2.6
Plastic squeeze bottle for initial wash in PBS.
8.2.7
If slides only are being used, additional components may be obtained from The
Binding Site: PBS (CON 3.3), negative control (CON 92) ANA homogeneous
control (FA105), mitochondrial positive control (FA128), smooth muscle positive
control (FA134), anti-Human IgG (H+L) FITC conjugate (FA003), mounting
medium (CON 195) and 1% Evans Blue (CON 93).
8.3
Test procedure
Pattern
Homogeneous
Common antigens involved
ds DNA, histones
Peripheral
(Rim)
Speckled
Native/ds DNA
Nucleolar
4-6S sRNA
Quality control. Positive and negative controls should be used every time a
batch of samples is tested.
Extractable nuclear antigens,
Ribonucleoprotein,
Scl-70,
SSB
Disease association
SLE
Rheumatoid arthritis (RA)
Mixed
connective
tissue
disease
Drug induced lupus
SLE
Scleroderma
Sjögren’s syndrome
Mixed
connective
tissue
disease
SLE
Scleroderma
Sjögren’s syndrome
SLE, RA and progressive
systemic sclerosis
Tissue specific autoantibody staining patterns include:
Antibody
Tissue associated
Antimitochondrial
antibodies (AMA)
Antismooth muscle
antibodies (ASMA)
Antigastric parietal cell
antibodies (AGPCA)
Antireticulin antibodies
(ARA)
2.
Doniach, D, et al. (1986). Tissue antibodies in primary biliary cirrhosis,
active chronic (lupoid) hepatitis, cryptogenic cirrhosis and other liver
diseases and their clinical implications. Clin. Exp. Imm 1: 237-262.
3.
Wallington, T B & Gooi H C (1990). Clinical Immunology. A practical
approach. Ed. Gooi, H C & Chapel, H. Publ. IRL Press, Oxford UK. 195220.
4.
Cavallaro, J J, et al (1976). Immunofluorescent detection of autoimmune
diseases, Immunology Series No. 7. CDC, Atlanta, GA.
Chronic active
hepatitis
5.
Seah, P P et al (1971). Antireticulin antibody: Tissue autoantibodies in
dermatitis herpetiformis and adult coeliac disease. Lancet 1, 834-836.
Pernicious anaemia
6.
Seah, P P et al (1973). Antireticulin antibody: Incidence and diagnostic
significance. Gut 14, 311-315.
7.
Goudie, R B et al (1966). Serological and histological diagnosis of
primary biliary cirrhosis. J. Clin. Path, 19, 527-538.
8.
Rizzeto, M & Doniach, D (1973). Types of reticulin antibodies detected in
human sera by immunofluorescence. J. Clin. Path. 26, 841-851.
9.
Bird, A G (1990). Clinical Immunology. A practical approach. Ed. Gooi,
H C & Chapel, H. Publ. IRL Press, Oxford, UK. Pg.175-194.
10.
Weller, TH, Coons, AH (1954). Fluorescent antibody studies with agents
of
Varicella
and
Herpes
zoster
propagated
in
vitro.
Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 86, 789 – 794.
Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004. Ed. A
Milford Ward, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14.
Main disease
association
Kidney distal tubule cytoplasm
and the proximal tubules (to a
lesser extent).
Hepatic cell cytoplasm (liver)
and gastric parietal cell
cytoplasm (stomach)
Muscularis layers (stomach)
Arteriole muscle layers (other
tissues)
Parietal cells (stomach)
Primary biliary
cirrhosis
& other liver disease
Peritubular fibres & Bowman’s
capsules (kidney)
Hepatic cell membranes,
sinusoidal walls (liver)
Crohn’s disease
Coeliac disease
Dermatitis
herpetiformis
NB: Each laboratory should establish at which point a positive result is considered clinically
significant.
10
LIMITATIONS OF PROCEDURE
10.1
This test alone should not be considered diagnostic. All other factors including
the clinical history of the patients and other serological or biopsy results must
also be taken into account.
10.2
Staining patterns often change as a sample is titred out to end point. This is
usually due to the presence of more than one autoantibody, especially for ANAs.
11.
10.3
A negative result with this kit can be due to disease remission or to the presence
of autoantibodies not detectable by this technique.
13
10.4
The light source, filters and optics of different makes of fluorescence
microscopes will influence the sensitivity of the assay. The performance of the
microscope is significantly influenced by correct maintenance especially centring
of the mercury vapour lamp and changing of the lamp after the recommended
period of time.
13.1
13.2
13.3
13.4
13.5
10.5
Autoantibodies can be activated or induced by a wide range of drugs including
oral contraceptives and antibiotics.
13.6
13.7
13.8
10.6
Due to the short distance between wells on the 10 well slides, it is possible for
cross contamination of samples and controls to occur. Care must be taken,
especially at the washing stages, to ensure that this does not happen.
10.7
Suitability for use with other manufacturers' IFA reagents has not been assessed
but use with such reagents should not necessarily be excluded.
13.9
13.10
13.11
13.12
SUMMARY OF PROCEDURE
Equilibrate mounting medium to room temperature.
Dilute PBS with distilled water.
Dilute patient sera 1/20 with PBS.
Equilibrate substrate slides to room temperature (18-28°C).
Apply 50μL positive and negative controls and diluted patient sera to
appropriate wells.
Incubate in a humid chamber for 20 minutes.
Wash for 5-10 minutes in PBS.
Blot around each well and immediately cover each well with a drop of
conjugate.
Incubate as in step 13.6.
Wash as step 13.7.
Mount.
View slide under fluorescence microscope.
FDA information – see page 1. Slides sold separately are classified as Analyte Specific
Reagents. Except as a component of the kit, analytical and performance characteristics are
not established.
11
EXPECTED VALUES AND SPECIFIC PERFORMANCE
CHARACTERISTICS
11.1
Expected results
Normals
Antibody
ANA
AMA
ASMA
ARA
AGPCA
Occurrence percentage
0-2
0-8
3
5
10-15 (in elderly)
Reference
2
7
2
8
9
Abnormals
Clinical diagnosis
ANA
AMA
ASMA
ARA
AGPCA
11.2
SLE
Mixed connective tissue
disease
Other autoimmune disease
(RA, scleroderma,
Sjögren’s syndrome,
dermatomyositis)
Primary biliary cirrhosis
Chronic hepatitis
Primary biliary cirrhosis
Crohn’s disease
Coeliac disease
Dermatitis herpetiformis
Pernicious anaemia
Occurrence
percentage
99
90
Reference
15-50
3, 5
>95
70
50
24
38-50
22
90
3
3
3
6
3, 6
6
9
4
3
Comparison study
A comparison study was performed on 96 clinical samples using this kit and a commerciallyavailable reference method. 93 out of the 96 samples tested gave identical results by the two
methods. For the patterns described in section 9.2, the relative sensitivity ranged from 89100%, the relative specificity was 100% in every case and the relative agreement ranged from
93-100%. For the samples that differed, weak ANA or SMA positive staining was obtained in
each case by the reference method only, suggesting that these samples were borderline for
the particular pattern, and/or there are slight differences in sensitivity between the two
methods.
12
1.
REFERENCES
Tan E M (1989). Antinuclear Antibodies: Diagnostic markers for autoimmune
diseases and probes for cell biology. Adv. Immunol. 44, 93-151.
INHALT
RATTEN-LEBER-NIERE-MAGEN
IMMUNOFLUORESZENZ KITS UND
OBJEKTTRÄGER
Seite
1
Verwendungszweck
2
Einführung
3
Prinzip
4
Reagenzien
5
Warnungen und Vorsichtmaßnahmen
6
Lagerung und Stabilität
7
Probensammlung und –vorbereitung
8
Testdurchführung
9
Ergebnisse
10
Grenzen des Tests
11
Erwartete Ergebnisse und spezifische Leistungsdaten
12
Referenzen
13
Kurzarbeitsanleitung
Zur in vitro Diagnostik
Bestell-Nr.: FK013.1,
FK013.2,
FS013._
Hergestellt von:
The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, UK.
www.bindingsite.co .uk
Vertrieb in Deutschland und Österreich durch:
The Binding Site GmbH, Robert-Bosch-Straße 2A
D-68723 Schwetzingen, Deutschland
Telefon: +49 (0) 6202 92 62 0
Fax: +49 (0) 6202 92 62 222
1
VERWENDUNGSZWECK
Diese Kits bzw. Objektträger dienen zum Nachweis und zur Titration von zirkulierenden
Autoantikörpern im Humanserum. Diese Autoantikörper sind wichtige Marker bei der
Diagnose und Therapie von verschiedenen Autoimmun-Erkrankungen. In Kombination
mit den entsprechenden Positiv-Kontrollen können mit diesen Kits unter anderem
Antikörper gegen glatte Muskulatur (ASMA / GMA) oder Magenparietalzellen (AGPCA)
sowie antimitochondriale Antikörper (AMA) und antinukleäre Antikörper (ANA)
nachgewiesen werden.
2
EINFUHRUNG
Die indirekte Immunfluoreszenz ist die Referenzmethode für den Nachweis und die
Titration
von
zirkulierenden
Autoantikörpern
im
Humanserum.
Tierische
Gewebeschnitte, wie z. B. von der Ratte, werden allgemein gegenüber anderen
Gewebeschnitten, einschließlich menschlichem Gewebe oder Zellkulturen, bevorzugt,
da bei ihnen keine Störungen durch HLA und/oder anderen Blutgruppen-Antikörpern
auftreten. Die gleichzeitige Verwendung von drei unterschiedlichen Geweben (Leber,
Niere und Magen) erleichtert die Interpretation der Ergebnisse.
Einzelne Autoantikörper sind mit einer Anzahl von verschiedenen Erkrankungen
assoziiert. ANAs werden in der Regel bei systemischem Lupus erythematodes (SLE),
aber auch bei Patienten mit Bindegewebs- und rheumatischen Erkrankungen gefunden.
AMAs werden häufig bei Patienten mit primärer biliärer Zirrhose gefunden, sie können
aber auch bei anderen Lebererkrankungen auftreten. ASMA ist mit der chronischen
aktiven Hepatitis und der primären biliären Zirrhose assoziiert, ist aber auch in niedrigen
Konzentrationen bei anderen Erkankungen nachweisbar. AGPCA werden bei Patienten
mit perniziöser Anämie gefunden. Eine detaillierte Auflistung, welche Autoantikörper mit
welcher Krankheit assoziiert werden, ist in Abschnitt 9 aufgeführt (Ref.1-9).
3
PRINZIP
Der Test beruht auf der indirekten Immunfluoreszenz-Technik (ref. 10). Die
Patientenseren und entsprechenden Kontrollen werden auf den Gefrierschnitten
inkubiert. In einem Waschschritt werden die nicht reagierenden Antikörper entfernt und
dann das Fluoreszein-Konjugat zugegeben. Überschüssiges Konjugat wird durch
Waschen entfernt. Die Untersuchung der Objektträger erfolgt unter dem
Fluoreszenzmikroskop. Positive Proben zeigen in den Bereichen der Gefrierschnitte, in
denen die Autoantikörper an entsprechende Strukturen gebunden haben, eine
apfelgrüne Fluoreszenz.
4
4.1
REAGENZIEN
Objektträger mit Ratten-Leber-Niere-Magen-Dreifachschnitt mit 5 oder 10
Auftragsstellen.
Gilt nur für Kits:
4.2
Die Homogene ANA-Positivkontrolle liegt gebrauchsfertig
Enthaltene Konservierungsmittel: 0,099% Natriumazid.
4.3
Die Negativkontrolle: liegt gebrauchsfertig vor. Enthaltene Konservierungsmittel: 0,099% Natriumazid.
4.4
Das affinitätsgereinigte anti-human-IgG-(H+L)-FITC-Konjugat ist optimal
mit Fluoresceinisothiocyanat markiert und liegt gebrauchsfertig vor.
4.5
Die anti-mitochondriale Positivkontrolle liegt gebrauchsfertig
4.6
Die Positivkontrolle gegen glatte Muskulatur liegt gebrauchsfertig vor.
vor.
vor.
4.7
Die
1%ige
Evans-Blue-Lösung
gebrauchsfertig.
zur
optionalen
Gegenfärbung
ist
4.8
Der PBS-Puffer: liegt als 20-fach Konzentrat vor und muss vor Gebrauch
entsprechend verdünnt werden.
4.9
Saugfähige Papierblotter um nach dem Waschschritt die Objektträger optimal zu
trocknen.
4.10
Das Eindeckmedium ist speziell für die Immunfluoreszenz und enthält einen
Ausbleich-Schutzfaktor (DABCO) 1, 4 diazabicyclo [2.2.2] octan.
4.11
Die Deckgläschen (22 x 70mm) zum Abdecken der Objektträger.
5
WARNUNGEN UND VORSICHTSMAßNAHMEN
Das Ausgangsmaterial zur Erstellung der Kontrollen stammt aus menschlichem Blut. Jede
Einzelspende wurde mit Tests bezüglich Antikörpern gegen Human-Immunschwäche-Virus
(HIV1&2), Hepatitis-C-Virus und Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAG) untersucht und als
negativ befunden. Es gibt aber zur Zeit keine absolut sicheren Testmethoden zum Ausschluss
von HIV, Hepatitis B-Virus, Hepatitis-C-Virus und anderen Infektionsträgern.
Deshalb sollten die Reagenzien als potentiell infektiös behandelt werden. Umgangs- und
Entsorgungsmethoden sollten denen für potentiell infektiösem Material entsprechen und der
Test nur entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden.
Die Evans-Blue-Lösung und die Kit-Kontrollen enthalten 0,099% Natriumazid als
Konservierungsmittel. Deshalb sollten die entsprechenden Vorsichtsmaβ-nahmen beachtet
werden. Verschlucken, sowie Kontakt mit der Haut oder Schleimhäuten vermeiden. Nach
Kontakt Hautstelle mit viel Wasser abspülen und ärztlichen Rat einholen. Natriumazid kann
mit Blei- oder Kupferrohren explosive Metallazide bilden. Nach der Entsorgung mit
ausreichender Menge Wasser nachspülen um Azidablagerungen zu vermeiden. Dieses
Produkt sollte nur von entsprechend geschultem Laborpersonal für den angegebenen
Verwendungszweck verwendet werden. Die Einhaltung der Arbeitsvorschrift wird empfohlen.
Reagenzien unterschiedlicher Chargen dürfen nicht untereinander gemischt oder gemeinsam
verwendet werden. Bei groβem Testdurchsatz muss darauf geachtet werden, dass alle
Reagenzien der gleichen Charge entstammen.
6
LAGERUNG UND STABILITÄT
8.2
Benötigte, nicht im Kit enhaltene Materialen
8.2.1
Destilliertes Wasser zum Verdünnen des PBS-Pufferkonzentrats.
8.2.2
Behälter für den PBS-Puffer.
8.2.3
Mikropipetten und Einmal-Spitzen zum Pipettieren der Patientenseren.
8.2.4
Feuchte Kammer für die Inkubation (z.B. Magnetische Färbekammer,
BD010).
8.2.5
Fluoreszenzmikroskop mit einem 495nm Anregungsfilter und 515nm
Barrierefilter.
8.2.6
Spritzflasche für den PBS-Waschpuffer.
8.2.7
Bei Verwendung von Einzelobjektträgern können die zusätzlich benötigten
Komponenten bei The Binding Site bestellt werden: PBS (CON 3.3),
Negativ-Kontrollserum (CON 92) ANA–homogen Positiv-Kontrollserum
(FA105), Anti-Mitochondrial Positiv-Kontrollserum (FA128), Glatte
Muskulatur Positiv-Kontrollserum (FA134), anti-Human-IgG-(H+L)-FITCKonjugat (FA003), Eindeckmedium (CON 195) und 1%ige Evans-BlueLösung (CON 93).
8.3
Testdurchführung
Qualitätskontrolle
Die Negativ- und Positivkontrollen sollten bei jedem Testansatz mitgeführt
werden.
8.3.1
Eindeckmedium. Das Eindeckmedium aus dem Kühlschrank nehmen und
vor Gebrauch auf Raumtemperatur (18-28°C) erwärmen lassen.
8.3.2
PBS-Konzentrat verdünnen. PBS-Konzentrat mit destilliertem Wasser im
Verhältnis 1/20 (1 Teil PBS Konzentrat + 19 Teile destilliertes Wasser)
verdünnen und gut mischen. Der gebrauchsfertige PBS-Puffer wird zum
Verdünnen der Patientenseren und als Waschpuffer verwendet.
8.3.3
Patientenseren verdünnen.
Screening: Patientenseren im Verhältnis 1/20 verdünnen (z.B. 50μL
Serum + 950μL PBS-Puffer).
Titration: Von im Screening positiven Proben eine serielle
Verdünnungsreihe erstellen (z.B. 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320, 1/640
usw.).
z.B. 100μL eines 1/20 verdünnten Patientenserums mit 100μL PBS-Puffer
versetzen – ergibt eine 1/40 Verdünnung usw.
8.3.4
Objektträger vorbereiten. Die Objektträger auf Raumtemperatur (18-28°C)
erwärmen lassen. Folienbeutel erst direkt vor dem Gebrauch öffnen! Die
Objektträger aus dem Folienbeutel nehmen, entsprechend beschriften
und in eine feuchte Kammer geben. Je einen Tropfen der Positiv- und
Negativkontrollen und je 50μL der verdünnten Patientenseren auf die
jeweiligen Auftragstellen geben.
8.3.5
Inkubation der Objektträger. Die Objektträger 20 min bei Raumtemperatur
(18-28°C) in der feuchten Kammer inkubieren.
8.3.6
Waschen mit PBS-Puffer. Die Objektträger aus der feuchten Kammer
nehmen und rasch mit PBS-Puffer (Spritzflasche) waschen, dabei nicht
direkt in die Auftragsstellen spritzen. Die Objektträger in eine Halterung
geben und in ein PBS-Pufferbad eintauchen. Die Objektträger 5-10 min.
im PBS-Puffer belassen, dabei rühren oder leicht schütteln.
8.3.7
Zugabe von Fluoreszenz-Konjugat. Überschüssigen PBS-Puffer
abschütteln und die Objektträger um die Auftragsstellen herum
abtrockenen. Die Objektträger wieder in die feuchte Kammer legen und
sofort, d.h. innerhalb von 15 sec., auf jede Auftragsstelle einen Tropfen
Fluoreszenz-Konjugat geben. Das Austrocknen des Substrats kann das
Ergebnis beträchtlich beeinträchtigen.
8.3.8
Inkubation der Objektträger. Die Objektträger 20 min. bei Raumtemperatur
(18-28°C) in der feuchten Kammer im Dunkeln inkubieren.
8.3.9
Waschen mit PBS-Puffer. Erneut waschen wie unter Punkt 8.3.6
beschrieben. Wenn eine Gegenfärbung gewünscht wird können bei
diesem Waschschritt 2-3 Tropfen einer 1%igen Evans-Blue-Lösung pro
100mL PBS-Puffer zugegeben werden.
8.3.10
Deckgläschen aufsetzen. Jeweils nur einen Objektträger aus dem PBSPufferbad nehmen. Um die Auftragsstellen herum rasch abtrocknen und
jeweils 1 Tropfen Eindeckmedium auf die Auftragsstellen geben. Das
Deckgläschen sorgfältig auf den Objektträger legen, wobei Luftbläschen
zu vermeiden sind. Eventuell vorhandene Luftblasen nicht versuchen zu
entfernen. Überschüssiges Eindeckmedium mit Filterpapier entfernen.
8.3.11
Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop auswerten. Sie können im
Dunkeln bei 2-8°C bis zu drei Tage ohne signifikanten Fluorenzverlust
aufbewahrt werden.
Ungeöffnete Kits bei 2-8°C lagern, sie sind so bis zum angegebenen Verfallsdatum
verwendbar. Nicht einfrieren! Ist der Folienbeutel eines Objektträgers einmal geöffnet, muss er
sofort verwendet werden. Der verdünnte PBS-Puffer ist bis zu einem Monat bei 2-8°C haltbar.
Alle Reagenzien bei 2-8°C aufbewahren.
7
PROBENSAMMLUNG UND -VORBEREITUNG
Das Serum steril durch Venenpunktur entnehmen und bei Raumtemperatur gerinnen lassen.
Das Serum so schnell wie möglich abtrennen um eine Hämolyse zu vermeiden. Das Serum
kann bei 2-8°C bis zu 7 Tage vor dem Test gelagert werden (Ref. 11). Für eine längere
Lagerung sollten die Patientenseren aliqotiert und bei mindestens -20°C eingefroren werden.
Mehrfaches Einfrieren und Auftauen der Seren vermeiden. Keine stark lipämischen,
hämolytischen oder mikrobiell verunreinigte Seren verwenden, da dadurch ein erniedrigter
Titer oder ein unspezifisches Muster auftreten kann.
8
TESTDURCHFÜHRUNG
8.1
Gelieferte Materialien (Kits)
8.1.1
50T Kit FK013.1
1.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
10 x Rat liver, kidney, stomach slide (5-well) (10 x 5-Felder Ratten-Leber-NiereMagen Objektträger).
1 x 1mL ANA Positive Control (Positiv-Kontrollserum, ANA homogen).
1 x 1mL Negative Control (Negativ-Kontrollserum).
1 x 1mL Mitochondrial Positive Control (Positiv-Kontrollserum mitochondrial).
1 x 1mL Smooth Muscle Positive Control (Positiv-Kontrollserum glatte
Muskulatur).
1 x 6,2mL Anti-human IgG (H+L) AFF FITC (anti-human IgG-(H+L)-FITCKonjugat).
1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain (1%ige Evans-Blue-Lösung).
2 x 60mL PBS Buffer (x20 conc) (PBS-Konzentrat - 20-fach).
1 x 3mL Mounting Medium (Eindeckmedium).
20 x Blotters (Papier-Blotter).
10 x Coverslips (Deckgläschen - 22 x 70mm).
1 x Arbeitsanleitung.
8.1.2
250T Kit FK013.2
1.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
25 x Rat liver, kidney, stomach slide (10-well) (25 x 10-Felder Ratten-LeberNiere-Magen Objektträger).
1 x 1mL ANA Positive Control (Positiv-Kontrollserum, ANA homogen).
1 x 1mL Negative Control (Negativ-Kontrollserum).
1 x 1mL Mitochondrial Positive Control (Positiv-Kontrollserum mitochondrial).
1 x 1mL Smooth Muscle Positive Control (Positiv-Kontrollserum, glatte
Muskulatur).
1 x 15,5mL Anti-human IgG (H+L) AFF FITC (anti-human IgG-(H+L)-FITCKonjugat).
1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain (1%ige Evans-Blue-Lösung).
2 x 60 mL PBS Buffer (x20 conc) (PBS-Konzentrat – 20-fach).
1 x 10mL Mounting Medium (Eindeckmedium).
50 x Blotters (Papier-Blotter).
25 x Coverslips (Deckgläschen - 22 x 70mm).
8.1.3
FS013.1, FS013.2
1.
FS013.1 - 10 x Rat liver, kidney, stomach slide (5-well) (10 x 5 Felder).
FS013.2 - 25 x Rat liver, kidney, stomach slide (10-well) (25 x 10 Felder).
2.
3.
4.
5.
6.
2.
3.
4.
5.
6.
2.
9
9.1
ERGEBNISSE
Qualitätskontrolle
Die
ANA-Positivkontrolle
sollte
eine
leuchtend-apfelgrüne
homogene
Fluoreszenzfärbung der Zellkerne zeigen. Die anti-mitochondriale Positivkontrolle sollte
eine apfelgrüne Anfärbung der Nieren-Tubuli und der Parietalzellen im Magen zeigen.
Bei der Positivkontrolle gegen die glatte Muskulatur wird die Muskelschicht des Magens
apfelgrün angefärbt.
Die Negativkontrolle zeigt eine matt-grüne Anfärbung des Gewebes ohne erkennbare
Fluoreszenz. Erscheint eine der Kontrollen nicht wie beschrieben, sollte der Testansatz
verworfen werden und ein neuer Ansatz gemacht werden.
9.2
Interpretation der Ergebnisse
9.2.1
Negative Ergebnisse
11
ERWARTETE ERGEBNISSE UND SPEZIFISCHE LEISTUNGSDATEN
11.1
Bei einem negativen Ergebnis zeigen alle Teile des Gewebes eine matt-grüne Färbung ohne
erkennbare Fluoreszenz. Proben, die lediglich eine sehr schwache Fluoreszenz zeigen,
sollten erneut mit einer Verdünnung von 1/ 40 getestet werden. Ist das Ergebnis wie zuvor, so
wird die Probe als negativ angesehen.
NORMALE
Autoantikörper
ANA
AMA
ASMA
ARA
AGPCA
9.2.2
Positive Ergebnisse
Bei einer positiven Probe wird eine signifikante Fluoreszenz in den spezifischen
Geweberegionen gefunden. Folgende Fluoreszenz-Muster können auftreten:
Antinukleäre Antikörper (ANA)
ANA färben die Zellkerne der Leberzellen, der distalen und proximalen Nierentubuli, MagenParietalzellen und Hauptzellen an. ANAs werden im Serum von fast allen SLE-Patienten,
aber auch bei Patienten mit Bindegewebs-Erkrankungen, inkl. Rheumatischer Arthritis,
gefunden. Sie können aber auch bei aktiver chronischer Hepatitis, primärer biliärer Zirrhose
und als Reaktion auf Medikamente auftreten.
Erwartete Ergebnisse
Beteiligte Antigene
dsDNA,
Histone
Peripher
Gesprenkelt
Native/dsDNA
Extrahierbare, nukleoläre Antigene
Ribonukleoproteine,
Scl-70
SSB
Autoantikörper
ANA
Nukleolär
4-6S RNA
Assoziierte Erkrankungen
SLE,
Rheumatische Arthritis (RA)
Mischkollagenosen
Medikamenten-induzierter
Lupus
SLE
Sklerodermie
Sjögren’s Syndrom
Mischkollagenosen
SLE
Sklerodermie
Sjögren’s Syndrom
SLE, RA und progressive
systemische Sklerodermie
Fluoreszenzmuster von gewebespezifischen Autoantikörpern:
Autoantikörper
Gewebe
Assoziierte
Erkrankungen
Antimitochondriale
Antikörper (AMA)
Antikörper gegen
Muskulatur (ASMA)
glatte
Antikörper
gegen
Magenparietalzellen (PCA)
Anti-Retikulin
Antikörper
(ARA)
Niere: distales, tubuläres
Zytoplasma und proximale
Tubuli (seltener)
Leber: Zytoplasma der
Hepatozyten
Magen: Zytoplasma der
Parietalzellen
Magen: Muskelschicht
Andere Gewebe: arterielle
Muskelschicht
Magen: Parietalzellen
Primäre biliäre
Zirrhose und
andere Lebererkrankungen
10
10.1
GRENZEN DES TESTS
Dieser Test allein ist nicht als diagnostischer Beweis ausreichend. Alle
Ergebnisse sollten immer nur im Zusammenhang mit anderen Laborbefunden
(Serologie, Biopsie) und dem klinischen Bild des Patienten betrachtet werden.
Bei der Titration einer Probe bis zum Endpunkt kann sich das
Fluoreszenzmuster ändern. Diese Änderung wird durch das Vorkommen von
mehreren Autoantikörpern (speziell bei ANAs) verursacht.
10.3
Ein negatives Ergebnis kann auch auf eine Remission der Krankheit
zurückgeführt werden, oder die Autoantikörper sind mit dieser Methode nicht
nachweisbar.
10.4
Die im Fluoreszenzmikroskop verwendete Lichtquelle, Filter und Optik
beeinflussen die Sensitivität des Tests. Die Qualität des Mikroskops wird
maβgeblich durch die korrekte Wartung, speziell durch Zentrieren der
Quecksilberlampe und deren Austausch nach der empfohlenen Brenndauer,
beeinflusst.
10.5
Es ist zu beachten, dass Autoantikörper durch verschiedene Medikamente,
einschließlich Antibiotika und Orale Kontrazeptiva, aktiviert oder induziert
werden können.
10.6
Aufgrund der nur kleinen Abstände zwischen den Auftragstellen bei den
Objektträgern mit 10 Auftragstellen besteht eine gewisse Verschleppungsgefahr.
Deshalb muss besonders sorgfältig gearbeitet werden (speziell beim Waschen)
um eine Verschleppung zu vermeiden.
Die Verwendung dieser Produkte mit IFT-Reagenzien anderer Hersteller wurde
nicht überprüft, ist aber nicht zwangsläufig ausgeschlossen.
FDA (USA) Informationen: siehe englische Packungsbeilage.
ARA
AGPCA
11.2
Diagnose
SLE
Kombinierte
Bindegewebserkrankungen
Andere Autoimmunerkrankungen
(z.B. RA, Sklerodermie,
Sjögren’s Syndrom,
Dermatomyositis)
Primäre biliäre Zirrhose
Chronische Hepatitis
Primäre biliäre Zirrhose
Morbus Crohn
Zöliakie
Dermatitis herpetiformis
Pernizöse Anämie
Häufigkeit in %
99
90
Referenz
4
3
15-50
3, 5
>95
70
50
24
38-50
22
90
3
3
3
6
3, 6
6
9
Vergleichsstudie
In einer Vergleichsstudie wurde dieser Kit mit einer kommerziell erhältlichen
Referenzmethode verglichen. Es wurden 96 Patientenseren getestet und folgende
Ergebnisse erhalten: 93 der 96 getesteten Proben ergaben mit beiden Methoden ein
identisches Ergebnis. Es wurde für die in Abschnitt 9.2 beschriebenen Muster eine
relative Sensitivität von 89-100%, eine relative Spezifität von 100% und eine relative
Übereinstimmung von 93-100% gefunden. Die Proben mit abweichendem Ergebnis
wurden mit der Referenzmethode als schwach ANA-positiv befunden. Dies bedeutet,
daß die Proben grenzwertig sind und/oder die zwei Methoden kleine Unterschiede in
der Sensitivität aufweisen.
12
REFERENZEN
1.
2.
Doniach, D, et al. (1986). Tissue antibodies in primary biliary cirrhosis, active
chronic (lupoid) hepatitis, cryptogenic cirrhosis and other liver diseases and their
clinical implications. Clin. Exp. Imm 1: 237-262.
3.
Wallington, T B & Gooi H C (1990). Clinical Immunology. A practical approach.
Ed. Gooi, H C & Chapel, H. Publ. IRL Press, Oxford UK. 195-220.
4.
5.
Seah, P P et al (1971). Antireticulin antibody: Tissue autoantibodies in dermatitis
herpetiformis and adult coeliac disease. Lancet 1, 834-836.
6.
7.
Goudie, R B et al (1966). Serological and histological diagnosis of primary biliary
cirrhosis. J. Clin. Path, 19, 527-538.
8.
Rizzeto, M & Doniach, D (1973). Types of reticulin antibodies detected in human
sera by immunofluorescence. J. Clin. Path. 26, 841-851.
9.
Bird, A G (1990). Clinical Immunology. A practical approach. Ed. Gooi, H C &
Chapel, H. Publ. IRL Press, Oxford, UK. Pg.175-194.
10.
Weller, TH, Coons, AH (1954). Fluorescent antibody studies with agents of
Varicella and Herpes zoster propagated in vitro. Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 86, 789
– 794.
11.
Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004. Ed. A Milford
Ward, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14.
Perniziöse Anämie
10.2
10.7
AMA
ASMA
Chronisch aktive
Hepatitis
Peritubuläre Fibern und
Morbus Crohn
Bowman’sche Kapsel
Zöliakie
(Niere)
Dermatitis
herpetiformis
Zellmembrane und
sinusoidale Wände (Leber)
Hinweis: Jedes Labor sollte eigene Richtlinien erstellen und festlegen wann ein positives
Ergebnis klinisch relevant ist.
Referenz
2
7
2
8
9
PATHOLOGISCHE
Das gefundene ANA-Fluoreszenz-Muster kann zusätzliche Informationen liefern. Es wird
allgemein empfohlen, dass alle ANA-positiven Seren austitriert werden um sicher zu gehen,
dass keine anderen Autoantikörper übersehen werden. Weiterhin sollten ANA-postive Seren
auf Antikörper gegen doppelsträngige DNA (dsDNA) und extrahierbare nukleäre Antikörper
getestet werden.
Muster
Homogen
Häufigkeit in %
0-2
0-8
3
5
10-15 (Ältere)
13
13.1
13.2
13.3
13.4
13.5
13.6
13.7
13.8
13.9
13.10
13.11
13.12
KURZARBEITSANLEITUNG
Eindeckmedium auf Raumtemperatur erwärmen lassen.
PBS-Pufferkonzentrat mit destilliertem Wasser verdünnen.
Patientenseren 1/20 mit PBS-Puffer verdünnen.
Objektträger auf Raumtemperatur (18-28°C) erwärmen lassen.
Objektträger aus dem Folienbeutel nehmen und in eine feuchte Kammer
legen. Je 50µL der Positiv- und Negativkontrollen und der verdünnten
Patientenseren auftragen.
20 Minuten bei Raumtemperatur (18-28°C) inkubieren.
Objektträger mit PBS-Puffer waschen: Erst mit der Spritzflasche kurz
spülen, dann 10 min. in einem PBS-Bad eintauchen.
Objektträger aus dem PBS-Bad nehmen, um die Auftragsstellen herum
gut abtrocknen, wieder in die feuchte Kammer legen und sofort einen
Tropfen FITC-Konjugat auf jede Auftragselle auftropfen.
20 Minuten bei Raumtemperatur (abdunkeln) inkubieren.
Wie unter Punkt 13.7 beschrieben waschen.
Objektträger aus dem PBS-Bad nehmen, um die Auftragsstellen herum
gut abtrocknen, auf jede Auftragsstelle Eindeckmedium auftropfen und ein
Deckgläschen aufsetzen.
Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop auswerten.
CONTENU
COFFRET D’IMMUNOFLUORESCENCE
COUPES DE FOIE, REIN, ESTOMAC DE
RAT
Page No
1
Indications
2
Présentation générale
3
Principe
4
Réactifs
5
Précautions
6
Stockage et stabilité
7
Echantillons
8
Méthodologie
9
Résultats
10
Limites de la procédure
11
Valeurs attendues et performances
12
Bibliographie
13
Résumé
Pour un usage en diagnostic in vitro
Référence : FK013.1, FK013.2,
FS013._
Produits fabriqués en Angleterre par la société :
The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, UK.
Distribués en France par la société :
The Binding Site, 14 rue des Glairaux, BP226, 38522 Saint-Egrève Cedex.
Téléphone : 04.38.02.19.19
Fax : 04.38.02.19.20
e-mail : [email protected]
1
INDICATIONS
Ces coffrets sont destinés au dépistage et au titrage des autoanticorps circulants dans
le sérum humain. Ils apportent une aide au diagnostic et au traitement de plusieurs
maladies autoimmunes. Les quatre principaux autoanticorps détectés sont les antinucléaires (ANA), les anti-mitochondries (AMA), les anti-muscle lisse (ASMA) et les
anti- cellules pariétales gastriques (AGPCA).
2
PRESENTATION GENERALE
L’immunofluorescence indirecte est la méthode de choix pour le dépistage et le titrage
des autoanticorps circulants dans le sérum humain. Les coupes de tissus d’origine
animale, comme le rat, sont généralement préférées aux autres substrats
habituellement utilisés comme les tissus humains et les préparations de cellules; ceci
est dû à l’absence d’interférence avec le système HLA et/ou les autres anticorps dirigés
contre les groupes sanguins. L’utilisation des trois tissus différents (foie, rein et
estomac) permet d’identifier plus facilement les autoanticorps en comparant les
résultats obtenus avec chaque tissu.
Des autoanticorps particuliers sont associés à différentes maladies. Les ANA sont
presque toujours présents dans le lupus érythémateux disséminé (LED) mais sont aussi
communément trouvés chez des patients atteints de maladies rhumatoïdes et de
connectivites. Les AMA sont fréquemment retrouvés dans les cirrhoses biliaires
primitives mais peuvent aussi être détectés chez des patients atteints d’autres maladies
du foie. Les ASMA sont fréquemment associés aux hépatites chroniques en phase
active et aux cirrhoses biliaires primitives mais ils sont également présents en faibles
concentrations dans d’autres conditions. Les AGPCA sont présents dans le sérum de la
plupart des patients atteints d’anémie pernicieuse. Une description plus détaillée de
l’association des autoanticorps avec certaines maladies est donnée dans la section 9
(réfs1-9).
3
PRINCIPE
Ce coffret fait appel à une technique d’immunofluorescence indirecte (réf. 10). Les
sérums de patients et les contrôles appropriés sont incubés sur les coupes de tissus.
Les anticorps non spécifiques sont éliminés par lavage. Un conjugué approprié marqué
à la fluorescéine est appliqué. Le conjugué non lié est éliminé par lavage et la lecture
des lames s’effectue à l’aide d’un microscope à fluorescence. La positivité des
échantillons se traduit par un marquage fluorescent de certaines régions de la coupe de
tissus sur lesquelles sont accrochés les autoanticorps.
4
4.1
REACTIFS
Lames de 5 ou 10 puits recouverts de coupes de foie, rein et estomac de
rat.
Les coffrets contiennent:
4.2
Un sérum de contrôle positif donnant un aspect homogène ANA. Il est
fourni prédilué et contient de l’azide de sodium à 0,099%.
4.3
Un sérum de contrôle négatif, universellement négatif pour tous les
autoanticorps. Il est fourni prédilué et contient de l’azide de sodium à
0,099%.
4.4
Un antisérum de mouton anti IgG humaines, purifié par affinité et couplé à
l’isothiocyanate de fluorescéine. Il est fourni prédilué et contient de
l’azide de sodium à 0,099%.
4.5
Un sérum de contrôle positif anti mitochondrie. Il est fourni prédilué et
contient de l’azide de sodium à 0,099%.
4.6
Un sérum de contrôle positif anti muscle lisse. Il est fourni prédilué et
contient de l’azide de sodium à 0,099%.
4.7
Bleu d’Evans à 0,1%. Contre coloration optionnelle.
8.2.5
Microscope à fluorescence avec un filtre d’excitation à 495nm et un filtre
d’émission à 515nm.
Buvards pour sécher les lames.
8.2.6
Pissette pour les lavages au PBS.
4.10
Milieu de montage, contenant un agent « anti-fading » (DABCO, 1, 4
diazabicyclo (2.2.2) octane).
8.2.7
4.11
Lamelles (22 x 70mm).
Si seules les lames sont utilisées, les réactifs complémentaires peuvent
être obtenus auprès de la société The Binding Site : PBS (CON 3.3),
contrôle négatif (CON 92), contrôle ANA homogène (FA105), contrôle
positif mitochondrie (FA128), contrôle positif muscle lisse (FA134),
conjugué anti-IgG (H+L) humaines FITC (FA003), milieu de montage
(CON 195) et bleu d’Evans 1% (CON 93).
Tous les sérums des donneurs humains ont été soumis aux tests des hépatites B et C, de
l’HIV1 et HIV2 et se sont avérés négatifs. Toutefois ces tests ne peuvent garantir l’absence
totale d’agents infectieux. Tous les échantillons doivent donc être considérés comme
potentiellement infectieux et manipulés par un personnel averti.
8.3
Procédure
Le bleu d’Evans et les contrôles du coffret contiennent 0,099% d’azide de sodium comme
conservateur. Il est donc nécessaire de les manipuler avec précaution. Ne pas ingérer ou
mettre en contact avec la peau ou les muqueuses. En cas de contact, laver à grande eau et
consulter un médecin. Des azides de métaux explosifs peuvent se former avec le cuivre et le
plomb. Laver à grande eau les récipients ayant contenu ces réactifs afin d’empécher la
formation des azides de métaux.
8.3.1
Milieu de montage. Sortir le milieu de montage du réfrigérateur pour qu’il
atteigne la température ambiante (18-28ºC) avant d’être utilisé.
8.3.2
Diluer le PBS concentré. Diluer le PBS dans de l’eau distillée (1 volume
de PBS pour 19 volumes d’eau) et mélanger. Une fois bouché, il peut être
conservé un mois à 2-8°C. Le PBS est utilisé pour diluer les échantillons
et comme tampon de lavage.
8.3.3
Dilution des échantillons.
Pour le dépistage : diluer les échantillons au 1/20 (mettre 50μL de sérum
dans 950μl de PBS dilué).
Pour la titration : faire une gamme de dilution du sérum en PBS (1/40,
1/80, 1/160, 1/320,...). Ex : Prendre 100µL de la dilution au 1/20 et ajouter
100µL de PBS pour obtenir une dilution au 1/40. Continuer les dilutions en
cascade pour obtenir les dilutions suivantes.
8.3.4
Lames. Les ramener à température ambiante (18-28°C) avant de les sortir
de leur emballage. Les marquer puis les déposer dans la chambre humide
avant le dépôt des contrôles positifs et négatifs (1 goutte) dans les puits 1
et 2. Déposer 50μL d’échantillons dilués dans les autres puits.
8.3.5
Incubation des lames. Incuber les lames pendant 20 minutes en chambre
humide à température ambiante (18-28°C). (Des feuilles d’essuie-tout
imbibées d’eau maintiendront le degré d’humidité nécessaire.)
8.3.6
Lavage en PBS Sortir les lames de la chambre humide et les rincer
rapidement à l’aide d’une pissette contenant le tampon PBS. Ne pas
diriger le jet directement sur les puits. Mettre les lames sur un portoir et
les immerger en PBS sous agitation lente pendant 5 à 10 minutes.
8.3.7
Conjugué fluorescent. Eliminer l’excès de PBS et sécher le pourtour des
puits à l’aide des buvards fournis ou de papier absorbant. Remettre les
lames en chambre humide et couvrir immédiatement chaque puits avec
une goutte de conjugué fluorescent approprié. NE PAS LAISSER LES
PUITS A L’AIR PLUS DE 15 SECONDES. Le dessèchement des puits
affecte le résultat.
8.3.8
Incubation des lames. Incuber les lames pendant 20 minutes en chambre
humide à température ambiante (18-28°C). Recouvrir la chambre humide
de papier pour éviter l’exposition à la lumière.
8.3.9
Lavage en PBS. Procéder comme à la section 8.3.6. Il est possible
d’ajouter 2 à 3 gouttes de bleu d’Evans à 1% pour 100mL de PBS avant
l’immersion des lames. Ceci permettra une contre coloration.
8.3.10
Montage des lames. Sortir les lames une à une du PBS. Sécher
rapidement le pourtour des puits puis déposer une goutte de milieu de
montage dans chaque puits. Déposer la lamelle en évitant la formation de
bulles d’air. Ne pas essayer d’éliminer les bulles d’air éventuellement
apparues. Essuyer l’excès de milieu de montage.
8.3.11
Lecture des lames. La lecture se fait à l’aide d’un microscope à
fluorescence le plus rapidement possible.
4.8
Tampon PBS. Solution liquide concentrée 20 fois.
4.9
5
PRECAUTIONS
Il est recommandé de suivre scrupuleusement la procédure.
6
STOCKAGE ET STABILITE
Les coffrets non ouverts doivent être stockés à 2-8°C et peuvent être utilisés jusqu’à la date
de péremption. Ne pas congeler. Lorsque les lames sont sorties de leur étui, les utiliser
immédiatement. Le tampon PBS dilué peut être stocké plus d’un mois à 2-8°C. Le conjugué
FITC doit être conservé à l’obscurité et à 2-8°C. Tous les autres réactifs peuvent être stockés
à 2-8°C.
7
ECHANTILLONS
Prélever de façon stérile et par ponction veineuse de sang. Laisser le sang coaguler à
température ambiante, puis séparer le sérum du caillot dès que possible pour éviter
l’hémolyse. Les sérums peuvent être conservés à 2-8°C pendant 7 jours avant les tests (réf.
11) ou aliquotés et congelés à -20°C minimum pour une conservation plus longue. Les
congélations et décongélations successives peuvent donner des résultats faussement positifs
ou faussement négatifs. Ramener le sérum à température ambiante avant les tests. Il est
recommandé d’utiliser des sérums non lipidiques, non hémolysés et non contaminés par des
bactéries car les titres peuvent être moins élevés ou les aspects peuvent être difficilement
identifiables.
8
Contrôle de qualité
Les contrôles positifs et négatifs doivent être testés lors de chaque série.
METHODOLOGIE
8.1
Matériel fourni
8.1.1
Coffret pour 50 tests (réf. : FK013.1)
1.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
10 x Rat liver, kidney, stomach slide (5-well) (5-puits recouverts de foie, rein et
esomac de rat).
1 x 1mL ANA Positive Control (contrôle positif ANA prêt à l’emploi).
1 x 1mL Negative Control (contrôle négatif prêt à l’emploi).
1 x 1mL Mitochondrial Positive Control (contrôle positif anti mitochondrie prêt à
l’emploi).
1 x 1mL Smooth Muscle Positive Control (contrôle positif anti muscle lisse prêt à
l’emploi).
1 x 6,2mL Anti-human IgG (H+L) AFF FITC (conjugué FITC anti-IgG (H+L)
humaines).
1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain (solution de Bleu d’Evans à 1%).
2 x 60mL PBS Buffer (solution de PBS concentrée 20 fois).
1 x 3mL Mounting Medium (milieu de montage).
20 x Blotters (buvards).
10 x Coverslips (lamelles) (22 x 70mm).
1 x fiche technique.
8.1.2
Coffret pour 250 tests (réf.: FK013.2)
1.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
25 x Rat liver, kidney, stomach slide (10-well) (10-puits recouverts de foie, rein et
estomac de rat).
1 x 1mL ANA Positive Control (contrôle positif ANA prêt à l’emploi).
1 x 1mL Negative Control (contrôle négatif prêt à l’emploi).
1 x 1mL Mitochondrial Positive Control (contrôle positif anti mitochondrie prêt à
l’emploi).
1 x 1mL Smooth Muscle Positive Control (contrôle positif anti muscle lisse prêt à
l’emploi).
1 x 15,5mL Anti-human IgG (H+L) AFF FITC (conjugué FITC anti-IgG (H+L)
humaines).
1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain (solution de Bleu d’Evans à 1%).
2 x 60mL PBS Buffer (solution de PBS concentrée 20 fois).
1 x 10mL Mounting Medium (milieu de montage).
50 x Blotters (buvards).
25 x Coverslips (lamelles) (22 x 70mm).
8.1.3
FS013.1, FS013.2
1.
FS013.1 - 10 x Rat liver, kidney, stomach slide (5-well) (10 x 5puits),
FS013.2 - 25 x Rat liver, kidney, stomach slide (10-well) (25 x 10 puits)
Le contrôle négatif peut présenter un très léger bruit de fond vert pâle sur toutes les
coupes de tissu, mais en aucun cas une fluorescence franche. Les réactions faibles
doivent être répétées mais à une concentration plus élevée (ex : 1/40). Si le nouveau
test paraît identique au précédent, il est considéré comme négatif.
2.
9.2.2
8.2
Matériel nécessaire et non fourni
Un échantillon est considéré positif lorsqu’une fluorescence significative apparaît dans
les organelles des tissus spécifiques donnant un des aspects suivants :
2.
3.
4.
5.
6.
2.
3.
4.
5.
6.
9
8.2.1
Eau distillée pour diluer le PBS concentré.
8.2.2
Un flacon pour contenir le PBS dilué.
8.2.3
Micropipettes pour le dépôt des échantillons.
8.2.4
Chambre humide pour les étapes d’incubation (ex : chambre humide The
Binding Site : réf. BD010).
9.1
RESULTATS
Contrôle de qualité
Le contrôle ANA homogène doit présenter une fluorescence verte dans les noyaux des
cellules. Le contrôle positif anti-mitochondrie doit présenter une fluorescence verte des
tubules rénaux et des cellules pariétales gastriques. Le contrôle positif muscle lisse doit
présenter une fluorescence verte dans la couche musculaire de l’estomac.
Le contrôle négatif peut présenter un très léger bruit de fond vert pâle sur toutes les
coupes de tissu, mais en aucun cas une fluorescence franche. Si les puits de contrôle
ne correspondent pas à la description ci-dessus, le test doit être considéré comme
invalide et il est conseillé de le répéter.
9.2
Interprétation des résultats
9.2.1
Résultats négatifs
Résultats positifs
Anticorps anti-nucléaires (ANA)
Les ANA reconnaissent les noyaux des cellules du foie, les tubules distaux et
proximaux du rein et les cellules gastriques pariétales et cellules principales. Presque
tous les patients atteints de LED ont des ANA dans leur sérum mais les ANA peuvent
aussi être trouvés dans différentes connectivites comprenant l’arthrite rhumatoïde. Les
ANA peuvent être détectés également chez des patients atteints d’hépatite chronique
en phase active et de cirrhose biliaire primitive ou en réponse à certains médicaments.
Des informations supplémentaires peuvent être obtenues par l’interprétation des aspects
nucléaires des ANA (voir au-dessous). Il est recommandé de titrer tous les échantillons
positifs. Il est également conseillé de rechercher les autoanticorps contre l’ADN double brin et
les antigènes nucléaires solubles.
Aspect
Antigène impliqué
Maladie associée
Homogène
DNA double brin, histones
LED
arthrite rhumatoïde (AR)
Connectivites mixtes
Lupus médicalement induit
LED
Périphérique
(Rim)
Moucheté
DNA natif, double brin
11.2
12
ENA
Ribonucléoproteine,
Scl-70,
SSB
sRNA 4-6S
Nucléolaire
Sclérodermie
Syndrome de Sjögren
LED
Sclérodermie
Syndrome de Sjögren
LED,
AR
et
Sclérose
systémique progressive
Autoanticorps anti
mitochondries (AMA)
Autoanticorps anti
muscle lisse (ASMA)
Autoanticorps anti
cellules gastriques
pariétales (AGPCA)
Autoanticorps anti
réticuline
(ARA)
Tissus associés
Tubules distaux des reins et
tubules proximaux (moins)
Cytoplasme des hépatocytes
(foie) et cytoplasme des cellules
pariétales (estomac)
Couche musculaire (estomac)
Couche musculaire des
artérioles (autres tissus)
Cellules pariétales (estomac)
Fibres péritubulaires
Capsules de Bowman (rein)
Membranes des cellules
hépatiques,
parois sinusoidales (foie)
2.
Doniach, D, et al. (1986). Tissue antibodies in primary biliary cirrhosis, active
chronic (lupoid) hepatitis, cryptogenic cirrhosis and other liver diseases and their
clinical implications. Clin. Exp. Imm 1: 237-262.
3.
Wallington, T B & Gooi H C (1990). Clinical Immunology. A practical approach.
Ed. Gooi, H C & Chapel, H. Publ. IRL Press, Oxford UK. 195-220.
Principales maladies
associées
4.
Cirrhoses biliaires
primitive et autres
pathologies du foie
5.
Seah, P P et al (1971). Antireticulin antibody: Tissue autoantibodies in dermatitis
herpetiformis and adult coeliac disease. Lancet 1, 834-836.
6.
7.
Goudie, R B et al (1966). Serological and histological diagnosis of primary biliary
cirrhosis. J. Clin. Path, 19, 527-538.
8.
Rizzeto, M & Doniach, D (1973). Types of reticulin antibodies detected in human
sera by immunofluorescence. J. Clin. Path. 26, 841-851.
9.
Bird, A G (1990). Clinical Immunology. A practical approach. Ed. Gooi, H C &
Chapel, H. Publ. IRL Press, Oxford, UK. Pg.175-194.
10.
Weller, TH, Coons, AH (1954). Fluorescent antibody studies with agents of
Varicella and Herpes zoster propagated in vitro. Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 86, 789
– 794.
11.
Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004. Ed. A Milford
Ward, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14.
Hépatites chroniques
actives
Anémie pernicieuse
Maladie de Crohn
Maladie coeliaque
Dermatoses
herpétiques
Note : Chaque laboratoire doit établir son seuil de positivité clinique.
10
BIBLIOGRAPHIE
1.
Aspect du marquage pour les autoanticorps spécifiques des tissus:
Autoanticorps
Etude comparative
Une étude comparative a été faite sur 96 échantillons cliniques en utilisant ce coffret et
une méthode de référence commercialement disponible. 93 échantillons sur 96 ont
donné des résultats identiques par les deux méthodes. Pour les aspects décrits dans le
paragraphe 9.2, la sensibilité relative était de 89-100%, la spécificité relative était de
100% dans chaque cas et les valeurs acceptables étaient de 93-100%. Pour les 3 cas
qui différent, un marquage ANA positif faible a été obtenu uniquement avec la méthode
de référence, suggérant que ces échantillons sont limites pour cet aspect particulier
et/ou qu’il y a de petites différences de sensibilité entre les deux méthodes.
LIMITES DE LA PROCEDURE
10.1
Les aspects positifs des autoanticorps n’apportent qu’une aide au diagnostic et
ne constituent pas un diagnostic en soit. Les résultats du test doivent tenir
compte des autres résultats du laboratoire et de l’histoire clinique du patient.
10.2
Les aspects du marquage changent souvent lorsqu’un échantillon est titré jusqu’
à son point final. Ceci est dû à la présence de plusieurs autoanticorps,
spécialement pour les ANA.
10.3
Un résultat négatif avec ce coffret peut être dû à une rémission ou à la présence
d’autoanticorps non détectables avec cette technique.
10.4
La qualité des filtres, des optiques et de la source lumineuse peut influencer la
sensibilité du test.
10.5
Les autoanticorps peuvent être activés ou induits par un grand nombre de
médicaments tels que les contraceptifs oraux ou les antibiotiques.
10.6
Compte tenu du faible espacement entre les puits sur les lames de 10 puits, il
est possible qu’il y ait des contaminations. La plus grande attention est
recommandée lors des étapes de lavage.
10.7
Aucun test n’a été fait avec les réactifs provenant d’autres fournisseurs, mais
leur utilisation n’est pas exclue.
13
13.1
13.2
13.3
13.4
13.5
13.6
13.7
13.8
13.9
13.10
13.11
13.12
RESUME
Placer le milieu de montage à température ambiante.
Diluer le PBS en eau distillée.
Diluer le sérum des patients au 1/20 en PBS.
Ramener les lames à température ambiante (18-28°C).
Déposer 50µL des contrôles positifs et négatifs et des sérums de patients
correctement dilués dans les puits appropriés.
Incuber dans une chambre humide pendant 20 minutes.
Laver pendant 5 à 10 minutes en PBS.
Sécher le pourtour des puits et recouvrir immédiatement chaque puits
d’une goutte de conjugué.
Incuber comme en 13.6.
Laver comme en 13.7.
Monter les lames.
Observation sous microscope à fluorescence.
FDA informations – Voir première page de la version anglaise.
11
11.1
VALEURS ATTENDUES ET PERFORMANCES
Valeurs attendues
Valeurs normales
Autoanticorps
ANA
AMA
ASMA
ARA
AGPCA
Pourcentage d’apparition
0-2
0-8
3
5
10-15 (chez les personnes
âgées)
Références
2
7
2
8
9
Valeurs anormales
Diagnostic clinique
ANA
AMA
ASMA
ARA
AGPCA
LED
Autre maladies auto
immunes (AR,
sclérodermie, sydrome
de Sjögren,
dermatomyosite)
Cirrhose biliaire
primitive
Hépatite chronique
Cirrhose biliaire
primitive
Maladie de Crohn
Maladie coeliaque
Dermatose herpétique
Anémie pernicieuse
Pourcentage
d’apparition
99
90
15-50
Références
4
3
3, 5
>95
3
70
50
3
3
24
38-50
22
90
6
3, 6
6
9
INDICE
KIT/PORTAS IFA – SECCIONES DE
HIGADO, RIÑÓN, ESTÓMAGO DE RATA
Pagina
Spanish
1
Aplicación
2
Resumen y explicación
3
Principio
4
Reactivos
5
Precauciones
6
Almacenamiento y estabilidad
Para uso diagnóstico in-vitro
Código producto: FK013.1
FK013.2
FS013._
Fabricado por:
The Binding Site Ltd., P.O. Box 11712, Birmingham B14 4ZB, UK.
Teléfono: +44 (0)121 436 1000
Fax: +44 (0)121 430 7061
7
Preparación de las muestras
8
Metodología
9
Resultados
10
Limitaciones del procedimiento
11
Valores previstos y características de rendimiento
1
El presente producto se utiliza para el screening y la titulación de los autoanticuerpos
circulantes en el suero humano como auxiliar en el diagnóstico de las diferentes
enfermedades autoinmunes. Los cuatro autoanticuerpos principales detectados son:
anticuerpos antinucleares (ANA), anticuerpos antimitocondriales (AMA), anticuerpos
anti-musculatura lisa (ASMA) y anticuerpos anti-células parietales gástricas (AGPCA).
2
12
Bibliografía
13
Resumen del procedimiento
APLICACIÓN
RESUMEN Y EXPLICACIÓN
La inmunofluorescencia indirecta es el método de referencia para el screening y la
titulación de los autoanticuerpos circulantes en el suero. En general se prefieren las
secciones de tejido animal, por ejemplo de ratón, a otros substratos utilizados
habitualmente, tal como los preparados de células y las secciones de tejido humano;
esto se debe principalmente a la ausencia de interferencias de HLA y/u otros
anticuerpos dirigidos contra los grupos sanguíneos. La utilización de los tres tejidos
diferentes (hígado, riñón y estómago) permite identificar los autoanticuerpos más
fácilmente comparando los resultados obtenidos con cada tejido.
Algunos autoanticuerpos se asocian con un número diferente de enfermedades. Los
ANA generalmente se encuentran en sueros de pacientes con lupus eritematoso
sistémico (SLE) pero también en sueros de pacientes con enfermedades del tejido
conjuntivo y reumáticas. Los AMA se localizan generalmente en pacientes con cirrosis
biliar primaria, pero también pueden encontrarse en pacientes con otras enfermedades
hepáticas. Frecuentemente, los ASMA se asocian a hepatitis crónica activa y a cirrosis
biliar primaria, siendo también detectados en concentraciones bajas con otras
enfermedades. Los AGPCA aparecen en el suero de pacientes con anemia perniciosa.
En el punto 9 se describe más detalladamente qué autoanticuerpos se asocian con qué
enfermedad (ref.1-9).
3
PRINCIPIO
El test se basa en la inmunofluorescencia indirecta. Tanto las muestras como los
controles correspondientes se incuban en los portaobjetos con substrato. Mediante
lavado se eliminan los anticuerpos que no han reaccionado y después se aplica el
conjugado de fluorescencia apropiado (ref. 10). El conjugado no ligado se elimina
mediante lavado. Los portas se examinan en un microscopio de fluorescencia. Las
muestras positivas producen una fluorescencia de color verde que corresponde a las
áreas de la sección en las que se ha unido el autoanticuerpo.
4
4.1
REACTIVOS
Portas con secciones de hígado, riñón, estómago de rata de 5 ó 10
pocillos.
Los kits contienen:
4.2
Suero de control positivo ANA homogéneo conteniendo el 0,099% de
azida sódica. Prediluido y listo para el empleo.
4.3
Suero de control negativo conteniendo el 0,099% de azida sódica.
Prediluido y listo para el empleo.
4.4
Antisuero de oveja anti-IgG humanas purificado por afinidad (H+L)
conjugado con FITC (isotiocianato de fluoresceína) conteniendo el
0,099% de azida sódica. Prediluido y listo para el empleo.
4.5
Suero de control positivo anti-mitocondrial, conteniendo el 0,099% de
4.6
Suero de control positivo anti-musculatura lisa, conteniendo el 0,099% de
4.7
Azul de Evans al 1% coloración de contraste opcional.
4.8
Tampón (PBS), en forma liquida concentrado 20 veces.
4.9
Secantes, para secar los portas después del lavado.
4.10
Solución de montaje, conteniendo un agente anti-fading (DABCO) 1, 4
diazabicyclo [2.2.2] octano.
4.11
Cubreobjetos (22 x 70mm).
5
PRECAUCIONES
8.2.7
En caso de utilizar solo portas con substrato, pueden adquirirse de The
Binding Site los siguientes componentes adicionales: PBS (CON 3.3)
control negativo (CON 92) control ANA homogéneo (FA105), control
positivo anti-mitocondrial (FA128), control positivo anti-musculatura lisa
(FA134), conjugado anti-IgG (H+L) humanas FITC (FA003), solución de
montaje (CON 195), Azul de Evans al 1% (CON 93).
8.3
Procedimiento del test
Todos los sueros humanos suministrados en el kit han sido sometidos a screening para
donantes, resultando negativos a la presencia del antígeno de superficie de la hepatitis B y a
la presencia de los anticuerpos ante los virus HIV1, HIV2 y HCV.
Sin embargo los sobredichos ensayos no garantizan la ausencia de agentes infecciosos.
Deben establecerse métodos de manipulación y eliminación adecuados para todos los
materiales potencialmente infecciosos y los procedimientos deben permitirse sólo a personal
experto y autorizado.
El Azul de Evans y los controles del kit contienen el 0,099% de azida sódica como
conservante y deben manipularse con precaución – no trague ni permita el contacto con la
piel o las mucosas. En caso de contacto, lave con abundante agua y consulte a un médico.
Con el plomo y el cobre pueden formarse azidas metálicas explosivas. Cuando se elimine el
reactivo, lave con mucha agua los recipientes para evitar la acumulación de azida.
El presente producto debe ser utilizado por personal especializado. Se recomienda observar
estrictamente el procedimiento indicado.
6
Control de calidad. Deben utilizarse controles positivos y negativos cada
vez que se ensayen las muestras.
8.3.1
Solución de montaje. Antes de su empleo, sacar la solución de montaje
del refrigerador y dejar que llegue a temperatura ambiente (18-28ºC).
8.3.2
PBS concentrado. Diluir el PBS concentrado con agua destilada (1 parte
PBS + 19 partes de agua destilada) y mezclar. El PBS se emplea para la
dilución de las muestras de los pacientes y como tampón de lavado.
8.3.3
Dilución de muestras de los pacientes.
Screening: Diluir las muestras de los pacientes 1:20 (añadiendo 50μL de
suero a 950μL de tampón PBS).
Titulación: Realizar diluciones en serie de las muestras positivas con
PBS (p.ej. 1/20 1/40, 1/80, 1/160 y 1/320 etc.).
Ejemplo: Mezclar 100μL de la dilución 1:20 con 100μL de PBS para
obtener una dilución de 1/40. Repetir el procedimiento para otras
diluciones.
8.3.4
Portas con substrato. Dejar que los portaobjetos alcancen la temperatura
ambiente (18-28°C) antes de sacarlos de la bolsa. Etiquete los
portaobjetos correctamente, colóquelos en la cámara húmeda y añada el
control positivo y negativo en los respectivos pocillos. Añada 50µL de las
muestras diluidas en los pocillos restantes.
8.3.5
Incubación de los portas. Incubar los portas durante 20 minutos en una
cámara húmeda a temperatura ambiente (18-28ºC).
8.3.6
Lavado con PBS. Saque los portaobjetos de la cámara húmeda y
aclárelos brevemente con el PBS en una botella comprimible de plástico.
No diriga directamente el chorro a los pocillos. Coloque los portaobjetos
en un rack, sumérjales en el PBS, después agite durante 5-10 minutos.
8.3.7
Adición de conjugado de fluorescencia. Eliminar el exceso de PBS y
secar alrededor de los pocillos. Colocar los portas de nuevo en la cámara
húmeda e inmediatamente aplicar en cada pocillo una gota de
conjugado fluorescente. NO DEJAR LOS POCILLOS DESTAPADOS
MÁS DE 15 SEGUNDOS. El secado del substrato afecta negativamente
los resultados.
8.3.8
Incubación de los portas. Incubar los portas durante 20 minutos en la
cámara húmeda a temperatura ambiente (18-28ºC) y a oscuras.
8.3.9
Lavado con PBS. Lavar otra vez tal y como se describe en el paso 8.3.6.
Contra-coloración opcional: añadir 2-3 gotas de Azul de Evans al 1% por
100mL de PBS antes de proceder a la inmersión de los portas.
8.3.10
Montaje del cubreobjetos. Sacar uno por uno los portas del PBS. Secar
rápidamente alrededor de los pocillos y añadir una gota de solución de
montaje a cada pocillo. Cubrir con cuidado el porta con el cubreobjetos
evitando la formación de burbujas. ¡En caso de formarse burbujas, no
intente quitarlas!
8.3.11
Examen de los portas con el microscopio de fluorescencia. Los
portaobjetos pueden conservarse a 2-8ºC a oscuras durante un máximo
de 3 días, sin una significativa pérdida de fluorescencia.
ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
Los kits y los portaobjetos no abiertos deben conservarse a 2-8°C y se pueden usar hasta la
fecha de caducidad indicada. ¡NO CONGELAR! Tras la extracción de los portas de su bolsa
deberán utilizarse inmediatamente. El tampón PBS diluido puede conservarse durante un mes
a 2-8°C. El conjugado FITC debe conservarse, en la medida de lo posible, al resguardo de la
luz solar, fluorescente o ultraviolada. Todos los reactivos deben conservarse a 2-8°C.
7
PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
Las muestras de suero deben proceder de extracciones venosas y dejarse coagular de forma
natural. Separar rápidamente el suero con el fin de evitar hemólisis. El suero puede
conservarse a 2-8°C durante un máximo de 7 días antes del ensayo (ref. 11), o para periodos
más largos, distribuir el suero en alícuotas y conservarlo a -20°C, o temperatura inferior. Evitar
repetidas congelaciones y descongelaciones. No utilizar muestras de suero contaminado
microbiológicamente o con partículas, ni tampoco sueros hemolíticos o lipémicos ya que puede
darse un título inferior o patrones de fluorescencia poco claros.
8
METODOLOGÍA
8.1
Materiales suministrados
8.1.1
Kit FK013.1 para 50 Tests
1.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
10 x Rat liver, kidney, stomach slide (5-well) (10 portas con secciones de
hígado, riñón y estómago de rata, 5 pocillos)
1 x 1mL ANA Positive Control (Control positivo ANA, prediluido. Listo para usar)
1 x 1mL Negative Control (Control negativo, prediluido. Listo para usar)
1 x 1mL Mitochondrial Positive Control (Control positivo anti-mitocondrial,
prediluido. Listo para usar)
1 x 1mL Smooth Muscle Positive Control (Control positivo anti-musculatura lisa,
1 x 6,2mL Anti-human IgG (H+L) AFF FITC (Conjugado anti-IgG (H+L) humanas
FITC purificado por afinidad)
1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain (Azul de Evans al 1%)
2 x 60mL PBS Buffer (PBS concentrado 20 veces)
1 x 3mL Mounting Medium (Solución de montaje)
20 x Blotters (Secantes)
10 x Coverslips (22 x 70mm) (Cubreobjetos)
1 instrucciones de empleo.
8.1.2
Kit FK013.2 para 250 Tests
1.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
25 x Rat liver, kidney, stomach slide (10-well) (25 portas con secciones de
hígado, riñón y estómago de rata, 10 pocillos)
1 x 1mL ANA Positive Control (Control positivo ANA, prediluido. Listo para usar)
1 x 1mL Negative Control (Control negativo, prediluido. Listo para usar)
1 x 1mL Mitochondrial Positive Control (Control positivo anti-mitocondrial,
1 x 1mL Smooth Muscle Positive Control (Control positivo anti-musculatura lisa,
1 x 15,5mL Anti-human IgG (H+L) AFF FITC (Conjugado anti-IgG (H+L)
humanas FITC purificado por afinidad)
1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain (Azul de Evans al 1%)
2 x 60mL PBS Buffer (PBS concentrado 20 veces)
1 x 10mL Mounting Medium (Solución de montaje)
50 x Blotters (Secantes)
25 x Coverslips (22 x 70mm) (Cubreobjetos)
1 x instrucciones de empleo
8.1.3
FS013.1, FS013.2
1.
FS013.1 - 10 x Rat liver, kidney, stomach slide (5-well) (10 portas con secciones
de hígado, riñón y estómago de rata, 5 pocillos)
FS013.2 - 25 x Rat liver, kidney, stomach slide (10-well) (25 portas con
secciones de hígado, riñón y estómago de rata, 10 pocillos)
2.
3.
4.
5.
6.
2.
3.
4.
5.
6.
2.
1 instrucciones de empleo.
8.2
Materiales necesarios y no suministrados
9
9.1
RESULTADOS
Control de calidad
El control de ANA positivo debe dar una fluorescencia verde brillante con patrones
homogéneos en los núcleos celulares. El control positivo mitocondrial debe dar un color
verde brillante en los túbulos renales y en las células parietales gástricas. El control
positivo de musculatura lisa debe dar una fluorescencia verde brillante en la capa
muscular del estómago.
El control negativo debe dar una coloración débil en todos los tejidos sin apreciarse una
fluorescencia. En caso de que los controles no concuerden con lo antes descrito, el test
no es válido y deberá repetirse.
9.2
Interpretación de los resultados
9.2.1
Resultado negativo
Se observa una coloración verde oscura en todas las secciones, sin fluorescencia
visible. Reacciones débiles sospechas deben repetirse pero aumentando el factor de
dilución (por ejemplo 1/40). Si, tras la repetición del ensayo, el resultado es igual al
inicial, el ensayo se considera negativo.
9.2.2
Resultado positivo
8.2.1
Agua destilada para diluir el PBS concentrado.
Se observa una fluorescencia significativa en las áreas tisutales específicas que
presentan uno o más de los siguientes patrones:
8.2.2
Recipientes para el PBS.
Anticuerpos antinucleares (ANA)
8.2.3
Micropipetas y puntas desechables para dispensar las muestras de los
pacientes.
8.2.4
Cámara húmeda para los pasos de incubación (p.ej. cámara de tinción
magnética; Código BD010).
Los ANA coloran los núcleos de las siguientes células: células hepáticas, túbulos
renales distales y proximales, células principales y parietales gástricas. Casi todos los
pacientes con SLE presentan ANA en el suero, pero los ANA pueden también estar
presentes en varias enfermedades del tejido conjuntivo, incluyendo la artritis
reumatoide. Además los ANA se pueden observar en la hepatitis crónica activa, cirrosis
biliar primitiva, así como en respuesta a determinados tratamientos farmacológicos.
8.2.5
Microscopio de fluorescencia con un filtro a 495nm (exciter) y un filtro a 515nm
(barrier).
8.2.6
Botella comprimible de plástico para el lavado inicial con PBS.
Pueden obtenerse informaciones adicionales mediante la interpretación de los patrones
nucleares de los ANA observados en los ensayos (véase a continuación). Se
recomienda titular todas las muestras ANA positivas hasta el punto final para garantizar
la detección de eventuales reacciones mixtas que de lo contrario podrían no revelarse.
También se recomienda efectuar otro análisis de dichas muestras para determinar los
autoanticuerpos ante el DNA bicatenario y los antígenos nucleares extraíbles (ENA).
Patrón
Homogéneo
Antígeno implicado
ds DNA, histonas
Periférico
(Borde)
Granular
Nativo/ds DNA
Antígeno nucleolares
extraibles
Ribonucleoproteinas
Scl-70
SSB
4-6S sRNA
Nucleolar
Enfermedad asociada
SLE
Artritis reumatoide (RA)
Enfermedad del tejido conjuntivo
mixto
Lupus inducido por fármacos
SLE
ANA
Esclerodermia
Síndrome de Sjögren
Enfermedad del tejido conjuntivo
mixto
SLE
Esclerodermia
Síndrome de Sjögren
SLE, RA y esclerosis sistémica
progresiva
AMA
ASMA
Patrones de fluorescencia de autoanticuerpos específicos del tejido:
Anticuerpo
Tejido asociado
Patologías asociadas
Anticuerpos
antimitocondriales
(AMA)
Anticuerpos antimúsculo liso (ASMA)
Anticuerpos anticélulas gástricas
parietales (AGPCA)
Anticuerpos
antireticulina (ARA)
Citoplasma de los túbulos
renales distales y túbulos
proximales (en medida
menor)
Citoplasma de las células
hepáticas (hígado) y
citoplasma de las células
parietales gástricas
(estómago)
Capas musculares
(estómago)
Capas musculares arteriolas
(otros tejidos)
Células parietales (estómago)
Fibras peritubulares y
cápsulas de Bowman (riñón)
Membranas celulares
hepáticas, paredes
sinusoidales (hígado)
Cirrosis biliar primaria y otras
enfermedades hepáticas
ARA
AGPCA
11.2
Frecuencia en %
99
90
Referencia
4
3
15-50
3, 5
>95
70
50
24
38-50
22
90
3
3
3
6
3, 6
6
9
Estudio comparativo
BIBLIOGRAFÍA
1.
Tan E M (1989).
Antinuclear Antibodies: Diagnostic markers for
autoimmune diseases and probes for cell biology. Adv. Immunol. 44, 93151.
2.
3.
4.
Hepatitis crónica activa
Anemia perniciosa
Enfermedad de Crohn
Enfermedad celíaca
Dermatitis herpetiforme
Diagnóstico
SLE
Enfermedad del tejido
conjuntivo mixto.
Otras enfermedades
autoinmunes (RA,
esclerodermia, síndrome
de Sjögren,
dermatomiositis)
Cirrosis biliar primaria
Hepatitis crónica
Cirrosis biliar primaria
Enfermedad de Crohn
Enfermedad celíaca
Dermatitis herpetiforme
Anemia perniciosa
Se realizó un estudio comparativo con 96 muestras clínicas utilizando este kit y con un
método de referencia comercialmente disponible. 93 de las 96 muestras analizadas
dieron resultados idénticos con ambos métodos. Para los patrones descritos en el
punto 9.2, la sensibilidad osciló entre 89 y 100%, la especificidad relativa fue del 100%
en cada caso y la concordancia relativa osciló entre 93 y 100%. Para las muestras que
difirieron, se obtuvo una coloración positiva débil ANA o SMA sólo con el método de
referencia, lo que sugiere que estas muestras estuvieron en el límite en el patrón
específico y/o que existen ligeras diferencias de sensibilidad entre los dos métodos.
12
NOTA: Cada laboratorio deberá establecer el punto en el que se considera que un resultado
positivo es clínicamente significativo.
10
Valores anormales
5.
6.
7.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
10.1
Este ensayo por sí solo no es válido para el diagnóstico. También deben tenerse
en cuenta los demás factores, incluidos la historia clínica de los pacientes y
otros resultados serológicos o biópsicos.
8.
10.2
Los patrones de fluorescencia a menudo cambian cuando la muestra es titulada
hasta punto final. Este cambio generalmente es debido a la presencia de más
de un autoanticuerpo, especialmente para los ANA.
9.
H C & Chapel, H. Publ. IRL Press, Oxford, UK. Pp175-194.
10.3
Un resultado negativo puede indicar la remisión de la enfermedad o la presencia
de autoanticuerpos no detectables con esta técnica.
10.
10.4
La fuente de luz, los filtros y la óptica de los microscopios de fluorescencia de
diferentes marcas influirá en la sensibilidad del kit. El funcionamiento del
microscopio depende en gran medida de un correcto mantenimiento,
especialmente del enfoque y reemplazo de la lámpara de vapor de mercurio
después del período de tiempo recomendado.
of
Varicella
and
Herpes
zoster
propagated
in
vitro.
11.
13
10.5
Los autoanticuerpos pueden ser activados o inducidos por determinados
fármacos como los antibióticos o los anticonceptivos orales.
10.6
Debido a la reducida distancia entre pocillos de los portaobjetos de 10 pocillos,
puede que se produzca contaminación cruzada de muestras y controles. Se
recomienda por lo tanto, una manipulación cuidadosa, especialmente en los
pasos de lavado.
10.7
No se ha evaluado la idoneidad del uso con reactivos IFA de otros fabricantes,
sin embargo, no debe excluirse su empleo.
FDA (USA) Advertencia: ver la primera página del folleto de instrucciones en ingles.
11
11.1
13.1
13.2
13.3
13.4
13.5
13.6
13.7
13.8
13.9
13.10
13.11
13.12
VALORES PREVISTOS Y CARACTERÍSTICAS DE
RENDIMIENTO
RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO
Dejar que la solución de montaje alcance la temperatura ambiente.
Diluir el tampón PBS con agua destilada.
Diluir los sueros de los pacientes 1/20 con PBS.
Dejar que los portas alcancen la temperatura ambiente (18-28°C).
Dispense 50µL de los controles positivos y negativos y sueros de
pacientes diluidos en los respectivos pocillos.
Incubar en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 20
minutos.
Lave durante 5-10 minutos en PBS.
Seque el contorno de cada pocillo y cubra inmediatamente cada pocillo
con una gota de conjugado.
Incube como en la fase 13.6 en lugar oscuro.
Lave como en la fase 13.7.
Monte.
Examine el portaobjetos con el microscopio de fluorescencia.
Resultados esperados
Valores normales
Anticuerpo
ANA
AMA
ASMA
ARA
AGPCA
Frecuencia en %
0-2
0-8
3
5
10-15 (en ancianos)
Referencia
2
7
2
8
9
ÍNDICE
Página
1
Utilização
KIT/LÂMINAS PARA IFA COM FÍGADO, RIM
E ESTÔMAGO DE RATAZANA
Portuguese
2
Resumo e explicação
Para diagnóstico in-vitro
3
Princípio da técnica
4
Reagentes
5
Precauções
6
Armazenamento e estabilidade
7
Colheita das amostras
8
Metodologia
9
Resultados
10
Limitações da técnica
11
Valores de referência
12
Referências
13
Resumo da técnica
Código do produto: FK013.1
FK013.2
FS013._
Produto fabricado por:
Telefone: +44 (0)121 436 1000
Fax: +44 (0)121 430 7061
1
UTILIZAÇÃO
Este produto destina-se à pesquisa e quantificação de autoanticorpos existentes no
soro humano, como complemento ao diagnóstico e tratamento de várias doenças
autoimunes. Os quatro principais grupos de autoanticorpos detectados são: anticorpos
anti-nucleares (ANA), anticorpos anti-mitocondriais (AMA), anticorpos anti-músculo liso
(ASMA) e anticorpos anti-células gátricas parietais (AGPCA).
2
RESUMO E EXPLICAÇÃO
A imunofluorescência indirecta é o método de referência para o despiste e
quantificação de autoanticorpos no soro. As secções de tecido animal, e.g. de
ratazana, são geralmente preferidos em relação aos substratos usuais incluindo
secções de tecido humano e preparações celulares devido à falta de interferência entre
HLA e/ou outros anticorpos do sangue. A utilização de três tecidos diferentes (fígado,
rim e estômago) torna mais fácil a identificação dos autoanticorpos comparando os
resultados obtidos em cada tecido.
Os autoanticorpos estão associados a um grande número de doenças. Os ANA
encontram-se presentes no soro de doentes com Lúpus eritimatoso sistémico (SLE)
mas são também comuns nos casos de doenças reumatóide e do tecido conjuntivo. Os
AMA estão frequentemente relacionados a casos de cirroses biliares primárias e outras
doenças hepáticas. Os ASMA estão associados a hepatites crónicas e cirroses biliares
primárias, no entanto encontramo-los em baixas concentrações noutras situações. Os
AGPCA aparecem maioritariamente em doentes com anemia perniciosa. Na secção 9
será dada uma descrição mais detalhada de quais os autoanticorpos associados a
cada doença (ref.1-9).
3
PRINCÍPIO DA TÉCNICA
A imunofluorescência indirecta é utilizada quando as amostras dos doentes e os
controlos apropriados são incubados com o substrato das lâminas. Os anticorpos que
não reagem são eliminados por lavagem e é aplicado um conjugado marcado com
fluoresceína. O conjugado que não se liga ao substrato é também eliminado por
lavagem, e procede-se à visualização da lâmina num microscópio de fluorescência. As
amostras positivas apresentarão uma fluorescência “verde-maçã” que corresponde a
áreas da secção congelada onde o anticorpo se ligou.
4
REAGENTES
4.1
Secções de fígado, rim e estômago de ratazana em lâminas de 5 ou 10
poços
4.2
Soro controlo positivo homogéneo para ANA contendo 0,099% de azida
de sódio. Prédiluido, pronto a usar.
4.3
Soro controlo negativo contendo 0,099% de azida de sódio. Prédiluido,
pronto a usar.
4.4
IgG (H+L) de cabra anti-humana, purificada e conjugada com isocianato
de fluoresceína (FITC) contendo 0,099% de azida de sódio. Prédiluido,
pronto a usar.
4.5
Soro controlo positivo mitocondrial, contendo 0,099% de azida de sódio.
Prédiluido, pronto a usar.
4.6
Soro controlo positivo músculo liso contendo 0,099% de azida de sódio.
Prédiluido, pronto a usar.
4.7
1% de Evans Blue contrastante opcional.
4.8
Tampão fosfato (PBS), concentrado 20x na forma líquida.
4.9
Papel absorvente “Blotters”, para absorver o excesso da lâmina após a
lavagem.
4.10
Meio de montagem, com agente que evita a perda de fluorescência
(DABCO) 1,4 octanato dazabiciclo [2.2.2].
Apenas em kits:
4.11
Lamelas (22 x 70mm).
8.2.7
Se estão a utilizar apenas as lâminas pode obter os componentes
adicionais na The Binding Site: PBS (CON 3.3), controlo negativo (CON
92), controlo homogéneo de ANA (FA105), controlo positivo mitocondrial
(FA128), controlo positivo músculo liso (FA134), IgG (H+L) anti-humana
conjugada com FITC (FA003), meio de montagem (CON 195), 1% Evans
Blue (CON 93).
No entanto estes testes não garantem a ausência de agentes infecciosos. Deverão ser
tomadas medidas adequadas quando se procede ao manuseamento e eliminação de todo o
material potencialmente infectado; os métodos deverão ser executados por pessoal
especializado e treinado.
8.3
Procedimento
O Azul de Evans e os controlos contêm 0,099% de azida de sódio como conservante e
devem ser manuseados com cuidado – não ingerir nem permitir o contacto com a pele ou
membranas mucosas. No caso de contacto lavar abundantemente com água e procurar um
médico. Podem formar-se azidas metálicas explosivas nas canalizações de cobre e aluminio,
quando eliminar o reagente lavar abundantemente com água de modo a impedir a formação
das azidas.
8.3.1
Meio de montagem. Retirar o meio de montagem do frigorífico de forma a
que este fique à temperatura ambiente (18-28ºC) antes de ser utilizado.
8.3.2
Diluir o PBS concentrado. Diluir o PBS concentrado com água destilada
(1 parte de PBS concentrado + 19 partes de água destilada) e misturar
bem. O PBS irá servir para diluir as amostras dos pacientes e como
tampão de lavagem.
8.3.3
Diluir as amostras do paciente.
Despiste: Diluir as amostras do paciente 1/20 adicionando 50μL do soro
a 950μL de PBS.
Quantificação: Efectuar diluições sucessivas das amostras positivas com
tampão PBS (eg. 1/20 1/40, 1/80, 1/160 and 1/320 etc). Por exemplo:
Retirar 100μL da diluição 1/20, misturar com 100μL de PBS para dar uma
diluição de 1/40. Repetir para outras diluições.
8.3.4
Lâminas substrato. Deixar as lâminas atingirem a temperatura ambiente
(18-28ºC) antes de retirá-las dos invólucros. Rotular as lâminas
adequadamente, colocá-las na câmara húmida e adicionar uma gota de
cada um dos controlos positivo e negativo nos poços adequados.
Adicionar 50μL das amostras diluídas nos restantes poços.
8.3.5
Incubação das lâminas. Incubar as lâminas durante 20 minutos na
câmara húmida à temperatura ambiente (18-28ºC) e no escuro.
8.3.6
Lavagem com PBS. Retirar as lâminas da câmara húmida e lavar
ligeiramente com o esguicho de PBS. Não deitar o tampão directamente
nos poços. Colocar as lâmina num suporte, e emergi-las em PBS, agitar
durante 5-10 minutos.
8.3.7
Adição do conjugado fluorescente. Sacudir o excesso de PBS e em volta
dos poços absorver com os discos fornecidos. Colocar as lâminas
novamente na câmara húmida e cobrir imediatamente cada poço com
uma gota de conjugado fluorescente. NÃO DEIXAR OS POÇOS
DESCOBERTOS DURANTE MAIS DE 15 SEGUNDOS. Se o substrato
secar os resultados serão seriamente afectados.
8.3.8
Incubação da lâmina. Incubar as lâminas durante 20 minutos na câmara
húmida à temperatura ambiente (18-28ºC) no escuro.
8.3.9
Lavagem com PBS. Lavar novamente as lâminas como descrito no passo
8.3.6. Contraste opcional. Adicionar até 2-3 gotas de 1% de Azul de
Evans por 100mL de PBS antes de emergir as lâminas.
8.3.10
Montagem das lâminas. Remover uma lâmina de cada vez do PBS. Secar
rapidamente os poços e adicionar a cada um uma gota do meio de
montagem. Cuidadosamente colocar a lamela, evitando a formação de
bolhas de ar, mas se existirem não tente removê-las. Limpar o excesso
de meio de montagem em volta da lamela.
8.3.11
Visualização das lâminas no microscópio de fluorescência. As lâminas
podem ser armazenadas até 3 dias a 2-8ºC, na escuridão, sem perder
significativamente a fluorescência.
5
PRECAUÇÕES
Todos os dadores de soro fornecido nos kits foram analisados e considerados negativos para
o antigénio da Hepatite B, anticorpos contra o vírus da Hepatite C e para o Vírus de
Imunodeficiência Humano (HIV 1 & 2).
Este produto deve ser utilizado por pessoal treinado e deve ser utilizado apenas para os fins a
que se propõe. Recomenda-se seja seguido o procedimento descrito.
6
ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE
Os kits e as lâminas fechados devem ser armazenados a 2-8ºC e podem ser utilizados até à
data de validade inscrita na embalagem. NÃO CONGELAR. Desde que as lâminas sejam
retiradas do invólucro de alumínio em que se encontram, devem ser utilizadas imediatamente.
O PBS diluído pode ser armazenado durante um mês a 2-8ºC. Todos os reagentes devem ser
armazenados a 2-8ºC.
7
COLHEITA DAS AMOSTRAS
As amostras de sangue devem ser colhidas por venepunctura, deixar coagular naturalmente e
separar o soro o mais rapidamente possível para evitar a hemólise. O soro pode ser
conservado de 2-8°C até 7 dias antes do teste (ref. 11), ou em aliquotas a -20°C ou menos,
para períodos mais prolongados. NÃO congelar e descongelar o soro mais do que uma vez.
Evitar a utilização de soro contaminado com lípidos, hemolisados ou micróbios dado que pode
ocorrer uma coloração fraca e diminuição dos títulos.
8
Controlo de qualidade. Os controlos positivos e negativos deverão ser
utilizados sempre que é testado um lote de amostras.
METODOLOGIA
8.1
Material fornecido
8.1.1
Kit para 50 testes FK013.1
1.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
10 x Rat liver, kidney, stomach slide (5-well) (Lâminas com fígado, rim e
estômago de ratazana, 5-poços)
1 x 1mL ANA Positive Control (Controlo positivo de ANA, prédiluído)
1 x 1mL Negative Control (Controlo negativo, prédiluído)
1 x 1mL Mitochondrial Positive Control (Controlo positivo mitocondrial,
prediluído)
1 x 1mL Smooth Muscle Positive Control (Controlo positivo para músculo liso,
prédiluído)
1 x 6,2mL Anti-human IgG (H+L) AFF FITC (IgG (H+L) anti-humana de afinidade
purificada conjugada com FITC)
1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain (1% Contrastante Evans Blue)
2 x 60mL PBS Buffer (Tampão PBS, x20 conc)
1 x 3mL Mounting Medium (Meio de montagem)
20 x Blotters (Discos absorventes)
10 x Coverslips (22 x 70mm) (Lamelas, 22 x 70mm)
1 x folheto de instruções
8.1.2
Kit para 250 testes FK013.2
1.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
25 x Rat liver, kidney, stomach slide (10-well) (Lâminas com fígado, rim e
estômago de ratazana, 10-poços)
1 x 1mL ANA Positive Control (Controlo positivo de ANA, prédiluído)
1 x 1mL Negative Control (Controlo negativo, prediluído)
1 x 1mL Mitochondrial Positive Control (Controlo positivo mitocondrial, prédiluído
1 x 1mL Smooth Muscle Positive Control (Controlo positivo para músculo liso,
prédiluído)
1 x 15,5mL Anti-human IgG (H+L) AFF FITC (IgG (H+L) anti-humana de
afinidade purificada conjugada com FITC)
1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain (1% Contrastante Evans Blue)
2 x 60mL PBS Buffer (Tampão PBS, x20 conc)
1 x 10mL Mounting Medium (Meio de montagem)
50 x Blotters (Discos absorventes)
25 x Coverslips (22 x 70mm) (Lamelas, 22 x 70mm)
1 x Folheto de instruções
9.2
Interpretação dos resultados
8.1.3
FS013.1, FS013.2
9.2.1
Resultados negativos
1.
FS013.1 – 10 x Rat liver, kidney, stomach slide (5-well) (Lâminas com fígado,
rim e estômago de ratazana com 5 poços)
FS013.2 – 25 x Rat liver, kidney, stomach slide (10-well) (Lâminas com figado,
rim e estômago de ratazana com 10 poços)
São visualizados com coloração verde baço em todas secções, sem fluorescência. As
reacções que se serem fracas devem ser repetidas com uma diluição mais elevada (ex.
1/40). Se os resultados repetidos forem iguais aos originais, o teste é dado como
negativo.
2.
1 x Folheto de instruções
9.2.2
8.2
Material adicional necessário
Estes são vistos com fluorescência bem marcada em áreas específicas do tecido
dando um ou mais dos seguintes padrões:
8.2.1
Água destilada para diluir o PBS concentrado.
8.2.2
Recipiente para o tampão PBS.
8.2.3
Micropipetas e pontas descartáveis para aplicar as amostras dos doentes.
8.2.4
Câmara húmida para os passos de incubação (eg. Câmara de Coloração
Magnética, BD010).
8.2.5
Microscópio de fluorescência com filtro excitador de 495nm e filtro de barreira de
515nm.
8.2.6
Esguicho de plastico para as lavagens iniciais com o PBS.
2.
3.
4.
5.
6.
2.
3.
4.
5.
6.
9
9.1
RESULTADOS
Controlo de qualidade
O controlo positivo para ANA deverá apresentar um padrão homogéneo verde
brilhante nos núcleos das células. O controlo positivo mitocondrial deverá apresentar
uma coloração verde-maçã brilhante nos tubulos renais e células gástricas parietais. O
controlo positivo músculo liso deverá paresentar coloração verde brilhante na camada
muscular do estômago.
O controlo negativo deverá presentar uma coloração verde baço em todos os tecidos,
sem fluorescência. Se os controlos não se apresentarem como descrito, o teste está
inválido e deverá ser repetido.
Resultados positivos
Anticorpos antinucleares (ANA)
Os ANA marcam os núcleos das estruturas seguintes: células hepáticas, túbulos renais
distais e proximais, células gástricas parietais e principais. Quase todos os doentes
com SLE possuem ANA no seu soro, mas estes podem também ser encontrados em
várias doenças do tecido conjuntivo incluindo artrite reumatoide. Os ANA podem
também ser encontrados nos casos de hepatite crónica activa e cirrose biliar primária e
em resposta a tratamentos com determinadas drogas.
Pode obter-se informação adicional interpretando os padrões nucleares obtidos para os
ANA (ver abaixo). É recomendável que todas as amostras positivas para ANA sejam
tituladas até ao fim para assegurar que possiveis reacções misturadas sejam
detectadas, dado que de outra forma podiam ser perdidas. É aconselhável efectuar outros
testes a estas amostras para os autoanticorpos anti-dsDNA e antigénios nucleares extraíveis
(ENA).
Padrão
Homogéneo
Periferial (Rim)
Mosqueado
Nucleolar
Antigénios comuns
involvidos
ds DNA, histonas
Primitivo/ds DNA
Antigénios nucleares extraíveis
Ribonucleoproteinas,
Scl-70,
SSB
4-6S sRNA
ANA
SLE
Artrite Reumatoide (AR)
Doença do tecido conjuntivo
Drogas indutoras de lupus
SLE
Escleroderma
Sindroma de Sjögren
Doença do tecido conjuntivo
SLE
Escleroderma
Sindroma de Sjögren
SLE, AR e esclerose
sistémica progressiva
Tecido associado
Anticorpos
anti-mitocondrias
(AMA)
Anticorpos anti- músculo
liso (ASMA)
Anticorpos anti-células
gástricas parietais
(AGPCA)
Anticorpos anti-reticulina
(ARA)
Citoplasma do túbulos distal e
proximal (numa extensão
inferior) Citoplasma de células
hepáticas (fígado) e
citoplasma de células
gástricas parietais (estômago)
Camadas musculares
(estômago). Camada
muscular das arteriolas
(outros tecidos)
Células parietais (estômago)
Fibras peritubulares e
cápsulas de Bowman (rim).
Membranas de
célulashepáticas e paredes
sinusoidais (fígado)
Principais doenças
Cirrose biliar primária
e outras doenças do
fígado
Hepatite crónica activa
10.1
Doença de Crohn
Doença celiaca
Dermatite hepetiforme
LIMITAÇÕES DA TÉCNICA
Este teste só por si não pode ser considerado diagnóstico. Todos os outros
factores incluindo história clinica dos doentes e outros resultados serológicos ou
biópsias também devem ser considerados.
Os padrões mundam frequentemente à medida que a amostra é quantificada
até ao fim. Este fenómeno deve-se à presença de mais do que um anticorpo,
especialmente para os ANA.
10.3
Um resultado negativo com este kit pode dever-se à ausência de doença ou à
presença de autoanticorpos não detectados por esta técnica.
10.4
A sensibilidade da técnica pode ser influênciada pela fonte de luz, filtros e
ópticas de microscópios de fluorescência diferentes. A qualidade do microscópio
é significativamente influênciada pela correcta manutenção, especialmente
centrando a lâmpada de mercúrio a vapor e mudando-a no período
recomendado.
10.5
Os autoanticorpos podem ser activados ou induzidos por várias drogas incluíndo
contraceptivos orais e antibióticos.
10.6
Dada a curta distância entre os poços nas lâminas com 10 poços, é possível
contaminação cruzada de amostras e controlos. Deve ser tomado especial
cuidado nomeadamente nos passos de lavagem, para assegurar que tal não
aconteça.
10.7
Não foi testado a utilização de reagentes de IFA comercializados por outras
casas pelo que não se sabe se são adequados, no entanto a sua utilização não
deverá ser necessariamente excluída.
Informação da FDA (EUA) - ver folha de rosto do Folheto de Instruções em Inglês.
11.1
11.2
Percentagem de
ocorrência
99
90
Referência
4
3
15-50
3, 5
>95
70
50
24
38-50
22
90
3
3
3
6
3, 6
6
9
Estudo comparativo
Foi feito um estudo comparativo em 96 amostras clínicas utilizando este kit um método
de referência comercial. 93 amostras das 96 testadas obtiveram resultados identicos
pelos dois métodos. Para os padrões descritos na secção 9.2, a sensibilidade realtiva
variou entre os 89-100%, a especificidade relativa foi de 100% em todos os casos e a
concordância relativa variou dos 93-100%. Para as amostras que diferiam, obteve-se
uma marcação fracamente positiva para os ANA ou SMA em cada caso, com apenas o
método de referência, sugerindo que estas amostras estavam na zona limite para
aquele padrão e/ou que existe ligeiras diferenças na sensibilidade dos dois métodos.
REFERÊNCIAS
1.
Tan E M (1989).
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
of
Varicella
and
Herpes
zoster
propagated
in
vitro.
11.
13
13.1
13.2
13.3
13.4
13.6
13.7
13.8
Valores de referência
Normais
Percentagem de ocurrência
0-2
0-8
3
5
10-15 (idosos)
AGPCA
13.5
VALORES DE REFERÊNCIA
Anticorpo
ANA
AMA
ASMA
ARA
AGPCA
ARA
12
10.2
11
AMA
ASMA
SLE
Doença do tecido
conjuntivo
Outras doenças
autoimunes (AR,
escleroderme, sindroma
de Sjögren,
dermatomiosite)
Hepatite crónica
Doença de Crohn
Doença celiaca
Dermatite herpetiforme
Anemia perniciosa
Anemia perniciosa
Nota: Cada laboratório deve estabelecer qual o ponto para o qual um resultado positivo é
considerado clinicamente significante.
10
Diagnóstico clínico
Associação a doenças
Padrões de marcação de autoanticorpos especificos do tecido incluem:
Anticorpo
Anormais
Referência
2
7
2
8
9
13.9
13.10
13.11
13.12
RESUMO DA TÉCNICA
Equilibrar o meio de montagem para a temperatura ambiente.
Diluir o tampão PBS em água destilada.
Diluir o soro do doente 1/20 em PBS.
Equilibrar as lâminas com substrato para a temperatura ambiente (1828ºC).
Aplicar 50μL dos controlos positivo e negativo e do soro diluido nos poços
apropriados.
Incubar na câmara húmida durante 20 minutos.
Lavar durante 5-10 minutos em PBS.
Absorver o excesso em volta de cada poço e cobrir imediatamente com
uma gota de conjugado.
Incubar como no passo 13.6.
Lavar como no passo 13.7.
Montar.
Visualizar as lâminas no microscópio de fluorescência.
CONTENUTO
Pagine
1
Indicazioni
2
Riassunto e descrizione
KIT/VETRINI PER IMMUNOFLUORESCENZA
- SEZIONI DI FEGATO, RENE, STOMACO DI
RATTO
Italian
3
Principio
4
Reagenti
5
Precauzioni
6
Conservazione e stabilita’
7
Prelievo campioni
8
Metodologia
Per uso diagnostico in vitro
9
Risultati
10
Limiti della procedura
11
Valori attesi e prestazioni
12
Bibliografia
13
Sintesi della procedura
Codice Prodotto: FK013.1
FK013.2
FS013.1
FS013.2
Prodotto da:
Telefono: +44 (0)121 436 1000
Fax: +44 (0)121 430 7061
1
INDICAZIONI
Questo prodotto è utilizzato per lo screening e la titolazione degli autoanticorpi circolanti
nel siero umano come supporto nella diagnosi e nel trattamento di varie malattie
autoimmuni. I quattro autoanticorpi principali individuati sono gli antinucleo (ANA), gli
antimitocondrio (AMA), gli anti-muscolatura liscia (ASMA) e gli anti-cellule parietali
gastriche (AGPCA).
2
RIASSUNTO E DESCRIZIONE
L’immunofluorescenza indiretta è il metodo di riferimento per lo screening e la
titolazione degli autoanticorpi circolanti nel siero. Le sezioni di tessuto di origine
animale, come il ratto, generalmente sono preferibili ad altri substrati comunemente
usati come le sezioni di tessuto umano e i preparati cellulari; ciò è dovuto
principalmente all’assenza d’interferenza con il sistema HLA e/o con gli altri anticopri
diretti contro i gruppi sanguigni. L’utilizzo dei tre diversi tessuti (fegato, rene e stomaco)
permette d’identificare più facilmente gli autoanticorpi confrontando i risultati ottenuti
con ogni tessuto.
Determinati autoanticorpi sono associati a diverse patologie. Gli ANA sono quasi
sempre presenti nel lupus erimatoso sistemico (LES), ma si osservano anche
comunemente nei pazienti affetti da malattie reumatoidi e del tessuto connettivo. Gli
AMA si osservano con frequenza nelle cirrosi biliari primitive ma si possono anche
individuare nei pazienti con altre malattie epatiche. Gli ASMA sono frequentemente
associati all’epatite cronica attiva e alla cirrosi biliare primitiva, ma sono anche
identificabili a basse concentrazioni in diverse altre condizioni. Gli AGPCA sono
presenti nel siero della maggior parte dei pazienti affetti da anemia perniciosa. Una
descrizione più particolareggiata dell’associazione degli autoanticorpi con certe
patologie è riportata al punto 9 (rif.1-9).
3
PRINCIPIO
Il kit usa una tecnica di immunofluorescenza indiretta in cui i campioni dei pazienti e i
relativi controlli sono incubati sui vetrini con substrato (rif. 10). Gli anticorpi non specifici
sono eliminati con il lavaggio, quindi viene applicato un coniugato fluorescente
specifico. Il coniugato non legato viene eliminato con il lavaggio. Per la lettura dei vetrini
si usa un microscopio a fluorescenza. I campioni positivi presentano una fluorescenza
di colore verde che corrisponde alle aree della sezione dove l’autoanticorpo si è legato.
4
4.1
REAGENTI
Sezioni di fegato, rene, stomaco di ratto su vetrini da 5 o 10 pozzetti.
I kit contengono:
4.2
Siero di controllo positivo ANA omogeneo contenente lo 0,099% di sodio
azide. Prediluito, pronto all’uso.
4.3
Siero di controllo negativo contenente lo 0,099% di sodio azide.
Prediluito, pronto all’uso.
4.4
Antisiero di pecora anti-IgG umane (H+L) purificato per affinità coniugato
con FITC (isotiocianato di fluoresceina) contenente lo 0,099% di sodio
4.5
Siero di controllo positivo anti mitocondrio contenente lo 0,099% di sodio
4.6
Siero di controllo positivo anti muscolatura liscia contenente lo 0,099% di
sodio azide. Prediluito, pronto all’uso.
4.7
Blu di Evans all’1% colorazione di contrasto opzionale.
4.8
Tampone PBS soluzione liquida concentrata (x20).
4.9
Carte assorbenti per asciugare il vetrino dopo il lavaggio.
4.10
Soluzione di montaggio contenente un agente ‘anti-affievolimento’ (DABCO) 1, 4
diazodiciclo [2.2.2] ottano.
4.11
Vetrini coprioggetti (22 x 70mm).
5
8.2.5
Microscopio a fluorescenza con filtro a 495nm (exciter) e filtro a 515nm
(barrier).
8.2.6
Bottiglia di plastica a pressione per lavaggio iniziale in PBS.
8.2.7
Se si usano solo i vetrini, è possibile ottenere da The Binding Site alcuni
componenti aggiuntivi: il PBS (CON 3.3), il controllo negativo (CON 92), il
controllo positivo omogeneo ANA (FA105), il controllo positivo antimitocondrio (FA128), il controllo positivo anti-muscolatura liscia (FA134), il
coniugato FITC (FA003), la soluzione di montaggio (CON 195) e la
soluzione Blu di Evans all’1% (CON 93).
8.3
Procedura
PRECAUZIONI
Tutti i sieri umani forniti nel kit sono stati sottoposti a screening per donatori, risultando
negativi per l’antigene di superficie dell’epatite B e per gli anticorpi verso i virus HIV1, HIV2 e
HCV. Ciò nonostante, questi test non possono garantire l’assenza di agenti infettivi. Devono
essere stabiliti metodi di trattamento e di eliminazione adeguati come per tutti i materiali
potenzialmente infettivi e le procedure devono essere eseguite soltanto da personale esperto
ed autorizzato.
Controllo qualità
I controlli negativi e positivi devono essere usati ogni volta che sono
dosati i campioni.
8.3.1
Soluzione di montaggio. Togliere la soluzione di montaggio dal frigorifero
per portarla a temperatura ambiente (18-28ºC) prima dell’uso.
8.3.2
Diluire il PBS concentrato. Diluire il PBS con acqua distillata (1 parte di
PBS + 19 parti di acqua distillata) e miscelare. Il PBS viene usato per
diluire i campioni dei pazienti e come tampone di lavaggio.
8.3.3
Diluire i campioni dei pazienti.
Screening: Diluire i campioni 1/20 aggiungendo 50μL di siero in 950μL di
PBS.
Titolazione: Effettuare diluizioni seriali dei campioni positivi con PBS (p.e.
1/20, 1/40, 1/80, 1/160 e 1/320 ecc.)
Per esempio: Prendere 100μL della diluizione 1/20 e diluire con 100μL di
PBS per ottenere una diluizione 1/40. Ripetere questa procedura per
ulteriori diluizioni.
8.3.4
Vetrini con substrato. I vetrini devono raggiungere la temperatura
ambiente (18-28°C) prima di essere tolti dalla confezione. Etichettare
correttamente i vetrini, metterli nella camera umida e aggiungere una
goccia di ciascun controllo positivo e negativo nei rispettivi pozzetti.
Aggiungere 50μL dei campioni diluiti nei pozzetti rimanenti.
8.3.5
Incubazione vetrini. Incubare i vetrini per 20 minuti in una camera umida
a temperatura ambiente (18-28°C).
8.3.6
Lavaggio PBS. Togliere i vetrini dalla camera umida e risciacquarli
brevemente con il PBS in una bottiglia di plastica a pressione. Non
spruzzare direttamente nei pozzetti. Posizionare i vetrini in un rack e
immergerli nel PBS, poi agitare per 5-10 minuti.
8.3.7
Aggiunta del coniugato fluorescente. Eliminare l’eccesso di PBS e
asciugare intorno ai pozzetti con le carte assorbenti fornite. Riportare i
vetrini nella camera umida e coprire immediatamente ogni pozzetto con
una goccia di coniugato fluorescente. NON LASCIARE I POZZETTI
SCOPERTI PER OLTRE 15 SECONDI. L’essicatura del substrato
compromette seriamente i risultati.
8.3.8
Incubazione dei vetrini. Incubare i vetrini per 20 minuti in una camera
umida a temperatura ambiente (18-28°C) al buio.
8.3.9
Lavaggio con PBS. Lavare nuovamente come descritto nella fase 8.3.6.
Colorazione di contrasto opzionale. Aggiungere fino a 2-3 gocce di Blu di
Evans all’ 1% per 100mL di PBS prima di immergere i vetrini.
8.3.10
Montaggio con il vetrino coprioggetti. Rimuovere un vetrino alla volta dal
lavaggio PBS. Asciugare rapidamente intorno ai pozzetti e aggiungere
una goccia della soluzione di montaggio in ciascun pozzetto. Mettere con
cura il vetrino sul vetrino coprioggetti, evitando le bolle d’aria, ma se ci
sono non tentare di rimuoverle. Rimuovere la soluzione di montaggio in
eccesso intorno al bordo del vetrino coprioggetti.
8.3.11
Lettura dei vetrini con il microscopio a fluorescenza. I vetrini possono
essere conservati a 2-8°C al buio fino a 3 giorni, senza una significativa
perdita di fluorescenza.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Kit per 250 test FK013.2
25 x Rat liver, kidney, stomach slide (10-well) (Vetrini da 10 pozzetti con fegato,
rene, stomaco di ratto)
1 x 1mL ANA Positive Control (Controllo positivo ANA omogeneo. Prediluto,
pronto all’uso)
1 x 1mL Negative Control (Controllo negativo. Prediluito, pronto all’uso)
1 x 1mL Mitochondrial Positive Control (Controllo positivo anti-mitocondrio,
Prediluito, pronto all’uso)
1 x 1mL Smooth Muscle Positive Control (Controllo positivo anti-muscolatura
liscia. Prediluito, pronto all’uso)
1 x 15,5mL Anti-human IgG (H+L) AFF FITC (Coniugato anti-IgG (H+L) umane
FITC purificato per affinità)
1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain (Blu di Evans all’1%)
2 x 60mL PBS Buffer (PBS concentrato, x20)
1 x 10mL Mounting Medium (Soluzione di montaggio)
50 x Blotters (Carte assorbenti)
25 x Coverslips (Vetrini coprioggetti, 22 x 70mm)
1 scheda tecnica
8.1.3
FS013.1, FS013.2
9.2
Interpretazione dei risultati
1.
FS013.1 - 10 x Rat liver, kidney, stomach slide (5-well) (Vetrini da 5 pozzetti con
fegato, rene, stomaco di ratto)
FS013.2 - 25 x Rat liver, kidney, stomach slide (10-well) (Vetrini da 10 pozzetti
con fegato, rene, stomaco di ratto)
9.2.1
Risultato negativo
Il Blu di Evans e i controlli del kit contengono lo 0,099% di sodio azide come conservante e
devono essere trattati con cautela – non ingerire né permettere il contatto con la pelle o le
mucose. In caso di contatto, lavare con molta acqua e rivolgersi al medico. Azotidrati metallici
esplosivi si possono formare con il rame e il piombo. Quando si procede all’eliminazione del
reagente, lavare con molta acqua i recipienti allo scopo di evitare l’accumulo di azide.
Il prodotto deve essere utilizzato esclusivamente da personale adeguatamente formato. Si
raccomanda di attenersi rigorosamente alla procedura indicata.
6
CONSERVAZIONE E STABILITA’
I kit o i vetrini non aperti devono essere conservati a 2-8°C e possono essere usati fino alla
data di scadenza indicata. NON CONGELARE. Una volta estratti dal loro involucro, i vetrini
devono essere usati immediatamente. Il tampone PBS diluito può essere conservato fino ad
un mese a 2-8°C. Tutti i reagenti devono essere conservati a 2-8°C.
7
PRELIEVO CAMPIONI
I prelievi di sangue devono essere effettuati per via venosa. Lasciare che il sangue si coaguli in
modo naturale. Separare il siero il più rapidamente possibile onde evitare l’emolisi. Il siero può
essere conservato a 2-8°C per un massimo di 7 giorni prima del dosaggio (ref. 11), oppure per
periodi più lunghi, aliquotare e conservare a -20°C o temperature inferiori. NON congelare e
scongelare più di una volta. Evitare l’uso di sieri lipemici, emolizzati o contaminati da batteri in
quanto si potrebbero avere titoli più bassi o pattern di colorazione non chiari.
8
METODOLOGIA
8.1
Materiali forniti
8.1.1
Kit per 50 test FK013.1
1.
10 x Rat liver, kidney, stomach slide (5-well) (Vetrini da 5 pozzetti con fegato,
rene, stomaco di ratto)
1 x 1mL ANA Positive Control (Controllo positivo ANA omogeneo. Prediluito,
pronto all’uso)
1 x 1mL Negative Control (Controllo negativo. Prediluito, pronto all’uso)
1 x 1mL Mitochondrial Positive Control (Controllo positivo anti-mitocondrio.
Prediluito, pronto all’uso)
1 x 1mL Smooth Muscle Positive Control (Controllo positivo anti-muscolatura
liscia. Prediluito, pronto all’uso)
1 x 6,2mL Anti-human IgG (H+L) AFF FITC (Coniugato anti-IgG (H+L) umane
FITC purificato per affinità)
1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain (Blu di Evans all’1%)
2 x 60mL PBS Buffer (PBS concentrato, x20)
1 x 3mL Mounting Medium (Soluzione di montaggio)
20 x Blotters (Carte assorbenti)
10 x Coverslips (Vetrini coprioggetti, 22 x 70mm)
1 scheda tecnica
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
8.1.2
1.
2.
3.
4.
5.
6.
9
9.1
RISULTATI
Controllo qualità
Il controllo positivo ANA omogeneo deve presentare una fluorescenza color verde
brillante nei nuclei delle cellule. Il controllo positivo anti mitocondrio deve presentare
una fluorescenza verde brillante dei tubuli renali e delle cellule parietali gastriche. Il
controllo positivo anti muscolatura liscia deve presentare una fluorescenza verde
brillante nello strato muscolare dello stomaco.
Il controllo negativo deve presentare una colorazione verde scura in tutti i tessuti, senza
fluorescenza visibile. Se i controlli non risultano come sopra descritto, il test non è
valido e deve essere ripetuto.
2.
1 scheda tecnica
Si osserva una colorazione verde scuro in tutte le sezioni, senza fluorescenza visibile.
Reazioni deboli sospette devono essere ripetute ma aumentando il fattore di diluizione
(p.e. 1/40). Se dopo avere ripetuto il test, il risultato sembra uguale a quello iniziale, il
test viene considerato negativo.
8.2
Materiale necessario ma non fornito
9.2.2
8.2.1
Acqua distillata per diluire il PBS.
Si osserva una fluorescenza significativa nelle zone tissutali specifiche che presentano
uno o più dei seguenti pattern:
8.2.2
Recipiente per contenere il PBS.
8.2.3
Micropipette e puntali monouso per dispensare i campioni dei pazienti.
8.2.4
Camera umida per le fasi d’incubazione (p.e. Camera di Colorazione Magnetica,
Codice BD010).
Risultato positivo
Anticorpi antinucleo (ANA)
Gli ANA colorano i nuclei delle cellule epatiche, dei tubuli renali distali e prossimali,
delle cellule principali e parietali gastriche. Quasi tutti i pazienti affetti da LES hanno
degli ANA nel loro siero, ma gli ANA possono anche essere presenti in varie patologie
del tessuto connettivo compresa l’artrite reumatoide. Inoltre gli ANA si possono
osservare nei casi di epatite cronica attiva, di cirrosi biliare primitiva e in risposta a
determinate terapie farmacologiche.
Valori anormali
E’ possibile ottenere ulteriori informazioni interpretando i pattern nucleari degli ANA osservati
nei test (vedere qui di seguito). Si raccomanda di titolare tutti i campioni ANA positivi fino
all’end-point per garantire l’individuazione di eventuali reazioni miste che altrimenti potrebbero
andare perse. Si consiglia inoltre un’analisi supplementare di questi campioni per ricercare gli
autoanticorpi diretti contro il DNA a doppio filamento e gli antigenti nucleari estraibili (ENA).
Pattern
Omogeneo
Antigeni comuni coinvolti
DNA a doppio filamento,
istoni
Periferico
(Bordo)
Granulare
DNA a doppio
filamento/Nativo
Antigeni nucleari estraibili
Ribonucleoproteina,
Scl-70,
SSB
4-6S sRNA
Nucleolare
Patologia associata
LES
Artrite reumatoide (AR)
Connettiviti miste
Lupus farmaco-indotto
LES
Sclerodermia
Sindrome di Sjögren
Connettiviti miste
LES
Sclerodermia, Sindrome di
Sjögren
LES, AR e sclerosi sistemica
progressiva
I pattern di colorazione degli autoanticorpi specifici dei tessuti comprendono:
Anticorpo
Tessuto associato
Anticorpi
antimicondrio (AMA)
Citoplasma dei tubuli distali
renali e dei tubuli prossimali
(in minor misura)
Citoplasma delle cellule
epatiche (fegato) e
citplasma delle cellule
parietali gastriche
(stomaco)
Strati muscolari (stomaco)
Strati muscolari arteriole
(altri tessuti)
Cellule parietali (stomaco)
Anticorpi
antimuscolatura liscia
(ASMA)
Anticorpi anti cellule
parietali gastriche
(AGPCA)
Anticorpi antireticolina
(ARA)
Fibre peritubulari e capsule
di Bowman (rene)
Membrane cellulari
epatiche, pareti sinusoidali
(fegato)
Principali
patologie
associate
Cirrosi biliare primitiva
e altre patologie epatiche
10.1
AMA
ASMA
ARA
AGPCA
11.2
Questo test da solo non permette la formulazione di una diagnosi. E’ necessario
prendere in considerazione tutti gli altri fattori compresa l’anamnesi clinica dei
pazienti e altri risultati sierologici o derivanti da biopsie.
10.2
I pattern di colorazione spesso variano quando un campione è titolato fino al suo
end-point. Ciò è dovuto di solito alla presenza di più di un autoanticorpo,
soprattutto per gli ANA.
10.3
Un risultato negativo con questo kit può essere dovuto ad una remissione della
patologia o alla presenza di autoanticorpi non identificabili con questa tecnica.
10.4
La fonte luminosa, i filtri e l’ottica dei microscopi a fluorescenza di diverse
marche influiranno sulla sensibilità del test. La performance del microscopio è
influenzata notevolmente da una corretta manutenzione, e in particolare dalla
centratura e dalla sostituzione della lampada a vapori di mercurio dopo il periodo
di tempo consigliato.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
of
Varicella
and
Herpes
zoster
propagated
in
vitro.
11.
Poiché sui vetrini con 10 pozzetti, questi ultimi sono a breve distanza l’uno
dall’altro, è possibile una contaminazione incrociata dei campioni e dei controlli.
Bisogna fare attenzione affinché ciò non si verifichi soprattutto nelle fasi di
lavaggio.
13.1
13.2
13.3
13.4
13.5
10.7
L’idoneità all’uso del kit con reagenti IFA di altri fabbricanti non è stata valutata
ma l’uso con tali reagenti non deve essere necessariamente escluso.
13.6
13.7
13.8
13.9
13.10
13.11
13.12
Risultati attesi
BIBLIOGRAFIA
10.6
11.1
Studio comparativo
3.
13
VALORI ATTESI E PRESTAZIONI
SINTESI DELLA PROCEDURA
Portare il mezzo di montaggio a temperatura ambiente.
Diluire il PBS con acqua distillata.
Diluire i sieri dei pazienti 1/20 con PBS.
Portare i vetrini a temperatura ambiente (18-28°C).
Applicare 50μL dei controlli positivi e negativi e dei sieri dei pazienti diluiti
nei rispettivi pozzetti.
Incubare in una camera umida per 20 minuti.
Lavare per 5-10 minuti in PBS.
Asciugare bene intorno ad ogni pozzetto e coprire immediatamente ogni
pozzetto con una goccia di coniugato.
Incubare come nella fase 13.6 al buio.
Lavare come nella fase 13.7.
Montare.
Leggere il vetrino con il microscopio a fluorescenza.
Valori normali
Anticorpo
ANA
AMA
ASMA
ARA
AGPCA
Percentuale di insorgenza
0-2
0-8
3
5
10-15 (in pazienti anziani)
3
3
3
6
3, 6
6
9
Gli autoanticorpi possono essere attivati o indotti da un’ampia varietà di farmaci
compresi i contraccettivi orali e gli antibiotici.
11
4
3
3,5
2.
10.5
FDA (USA) Avvertenze: vedere la pagina iniziale delle instruzioni per l’uso in Inglese.
>95
70
50
24
38-50
22
90
Riferimento
Tan E M (1989).
Anemia perniciosa
LIMITI DELLA PROCEDURA
Percentuale
d’insorgenza
99
90
15-50
1.
Epatite cronica attiva
Morbo di Crohn
Morbo celiaco
Dermatite erpetiforme
LES
Connettiviti miste
Altre malattie
autoimmuni (AR,
sclerodermia, Sindrome
di Sjögren,
dermatomiosite)
Epatite cronica
Morbo di Crohn
Morbo celiaco
Dermatite erpetiforme
Anemia perniciosa
E’ stato eseguito uno studio comparativo su 96 campioni clinici utilizzando questo kit e
un metodo di riferimento disponibile sul mercato. 93 su 96 campioni dosati hanno
fornito risultati identici con i due metodi. Per i pattern descritti al punto 9.2, la sensibilità
relativa variava dall’ 89 al 100%, la specificità relativa era del 100% in ogni caso e la
concordanza relativa variava dal 93 al 100%. Per i campioni che hanno dato risultati
diversi, è stata ottenuta una debole colorazione ANA o SMA positiva in ciascun caso
soltanto con il metodo di riferimento, suggerendo così che tali campioni erano
borderline quel particulare pattern e/o che esistevano delle leggere differenze di
sensibilità tra i due metodi.
12
NB: Ogni laboratorio deve stabilire a che punto un risultato positivo è considerato clinicamente
significativo.
10
Diagnosi clinica
ANA
Riferimento
2
7
2
8
9

RAT LIVER, KIDNEY, STOMACH IFA KIT/SLIDES

Transcripción

Documentos relacionados

panel de piedra - stone panel exclusive

CHIUSURA ESTIVA SUMMER CLOSING NOTICE

istruzioni instructions instructions de montage Bedienungsanleitung

sfogliatrici