Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos Rápidos para el
control Microbiológico de
Alimentos
Vigo, 8 de septiembre del 2011
1
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Necesidades en el análisis de alimentos
• Contaminación
microbiana:
principales
problemas
asociados al consumo
• Las toxiinfecciones alimentarias conllevan un elevado
impacto económico (patógenos)
• Las alteraciones de alimentos también preocupan a las
industrias alimentaria (indicadores
(
de calidad))
• Sistemas APPCC es la herramienta de seguridad
alimentaria más reconocida
• Requiere de un gran número de análisis y obtención
rápida
p
de resultados
2
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Necesidades en el análisis de alimentos
•
•
•
•
•
•
•
3
Métodos
Mé
d cada
d vez más
á rápidos
á id (industrias,
(i d
i
l b
laboratorios)
i )
Métodos sencillos
Métodos fiables
Métodos reconocidos
Métodos trazables
Métodos sensibles
Métodos económicos
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos tradicionales/oficiales:
• Largos
Surgen los métodos
alternativos
(rápidos y/o
• Elevada
manipulación
automatizados)
• Tediosos
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos:
y
uno o varios días frente a los
• Disminuyen
protocolos tradicionales
Métodos automatizados:
• Utilización de un equipo que realiza una o varias
tareas que habitualmente realiza un técnico
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos Rápidos: Consideraciones generales
CARACTERISTICAS DE UN MÉTODO RÁPIDO/AUTOMATIZADO
IDEAL
¾Preciso
¾Rápido
p
yp
productivo
¾Económico
¾Aceptable
¾Realización simple
¾Entrenamiento
¾Reactivos comunes
¾R
¾Reputación
t ió d
de lla compañía
ñí
¾Buen servicio técnico
¾Requerimientos de espacio y utilidad óptimos
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos Rápidos
Clasificación en áreas de acuerdo a lo que se busca:
¾Sistemas para facilitar la toma de muestras
¾Métodos para ayudar al procesamiento de las muestras
¾Sistemas de cuantificación microbiológica
¾Métodos para identificación y cuantificación de microorganismos
¾Sistemas especiales para análisis de muestras de aguas, ambientales y
superficies
¾Sistemas de identificación mediante métodos moleculares
¾Métodos inmunológicos para detección y/o cuantificación de microorganismos
¾Otros métodos misceláneos
7
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
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Métodos rápidos para ayudar a la toma de
muestras
t
MUESTREADORES, APLICADORES
Muestreo dinámico
Estandarización
Concepto de trazabilidad
8
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
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Métodos rápidos para ayudar al procesamiento
de la muestra
DILUIDORES
Estandarización
Aumentan productividad
Trazabilidad
PREPARADORES y DISPENSADORES DE MEDIOS DE CULTIVO
9
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Indicadores de calidad
Recuentos
10
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a Indicadores
microbiológicos
FILM HIDRATABLE: PETRIFILM: 3M
¾Optimizan el espacio de incubación
¾Manual
¾Algunos protocolos Express
Láminas
deshidratadas que
se rehidratan al
inocular la muestra
¾Posibilidad de lector automático
¾Validaciones internacionales
Recuento total
Enterobacterias
E.coli/Coliformes
Mohos y levaduras
Staph. Aureus
Listeria ambiental
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a Indicadores
microbiológicos
g
SISTEMA TEMPO: bioMerieux
•Fácil preparación de muestra
Trazabilidad
•Trazabilidad
•Mismo protocolo para diferentes parámetros
•Validaciones internacionales
•Recuento Total
•Enterobacterias
E t
b t i
Sistema totalmente
automatizado
NMP miniaturizado
i i t i d
Lectura por
fluorescencia
•Coliformes
E.coli
•E.coli
•S. Aureus
•Mohos y levaduras
•Bacterias Lácticas
12
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Protocolo de trabajo
dilu
ent
X g (or ml)
9X ml
10-1 suspension
Sample
p preparation
p p
Inoculation
Reading & interpretation
13
Métodos rápidos para el control
microbiológico de alimentos
Incubation
Protocolo de trabajo
+
=
dilu
ent
X g (or ml)
9X ml
10-1 suspension
Sample
p preparation
p p
WIFI
Reading & interpretation
14
Inoculation
Métodos rápidos para el control
microbiológico de alimentos
Incubation
Protocolo de trabajo
+
=
dilu
ent
X g (or ml)
9X ml
10-1 suspension
Sample
p preparation
p p
WIFI
Reading & interpretation
15
Inoculation
Métodos rápidos para el control
microbiológico de alimentos
Incubation
Protocolo de trabajo
+
=
dilu
ent
X g (or ml)
9X ml
10-1 suspension
Sample
p p
preparation
p
WIFI
Inoculation
RESULTS
READING
REPORT
Reading & interpretation
16
Métodos rápidos para el control
microbiológico de alimentos
Incubation
Métodos rápidos aplicados a Indicadores
microbiológicos
g
SISTEMAS BASADOS EN IMPEDANCIA: BACTRAC
•Fácil
Fá il preparación
ió de
d muestra
t
•Lectura automática
Más sencillo cuando es “mono-producto”
mono producto
•Más
•Necesaria calibración para recuento
•Esterilidad comercial (pasa/no pasa)
Recuento total
E t
Enterobacterias
b t i
E.coli/Coliformes
Hongos y levaduras
Staph. Aureus
Ácido Lácticas
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Mide los cambios que producen
los microorganismos de un
cultivo que alteran las
substratos cambiando su
conductividad eléctrica y esto
varía la impedancia
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a Indicadores
microbiológicos
g
SISTEMAS BASADOS EN CITOMETRIA DE FLUJO
AES: Bactiflow
•Fácil preparación de muestra
•Lectura automática
•Rápido
•Utilidad:
Utilid d yogures, champús,
h
ú cremas,
refrescos, zumos de frutas
Marcaje de las células,
detección una una y contaje
R
Recuento
t ttotal
t l
Enterobacterias
Hongos y levaduras
Salmonella
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Métodos rápidos aplicados a Indicadores
microbiológicos
Sembradores en espiral y lectores automáticos de colonias
Deposición
p
automática de la
muestra líquida en la superficie
de un placa rotatoria de agar
•Estandarización
•Eliminación de diluciones
•Lectura automática
Ahorro de tiempo
•Ahorro
•Trazabilidad
Lectores
automáticos de
colonias
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a Indicadores
microbiológicos
SISTEMA SimPlate: Biocontrol
. Fácil de leer
· Consistente y reproducible
· Rápido
· Fácil
Fá il de
d preparar
· Menos interferencia
· Amplio rango de conteo
· Tecnología
g innovadora
Placa de p
plástico circular de 84 pocillos
p
Lectura por fluorescencia
Recuento total
El número de positivos se convierten en
valores
l
NMP
Coliformes/E.coli
Mohos y levaduras
Campylobacter
20
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a Indicadores
microbiológicos
g
SISTEMAS BASADOS EN ATP
•Económico
•Rápido
Utilización en el entorno lácteo: esterilidad comercial
•Utilización
•Más utilizado en control de limpieza y desinfección
Mide niveles de ATP
Lo relaciona con niveles de
contaminación
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Patógenos
Ausencia/presencia
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g
PROTOCOLOS CORTOS
Salmonella:
•Pre-enriquecimiento y placa
•SESAME (BIOSER)
•Manuales
•IBISA ((AES))
•Medios cromogénicos o semisólidos
•Validaciones internacionales
•Económicos
E
ó i
•SMS (AES)
•SALMONELLA PRECIS (OXOID)
•RAPID SALMONELLA (BIORAD)
Listeria Monocytogenes:
•Salmonella
•Listeria spp
•Listeria monocytogenes
•ALOA ONE DAY (AES)
•LISTERIA PRECIS (OXOID)
•RAPID LMONO (BIORAD)
•COMPASS LISTERIA (BIORAD)
•CHROMOID LMONO (BIOMEREIUX)
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
25
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
26
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g
SISTEMAS BASADOS EN PRUEBAS ELISA:
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g
SISTEMAS BASADOS EN PRUEBAS ELISA
Si
Sistema
VIDAS (bi
(bioMerieux)
M i
)
•Salmonella
•Listeria
Li t i spp/Listeria
/Li t i
monocytogenes
•Equipo automatizado
•Campylobacter
py
spp
pp
•Tecnología ELFA
(elisa+fluorescecia) e
inmunoconcentración
•E.coli O157:H7
•Resultados en 16-24 horas
•Toxina Staph aureus
•Validaciones internacionales
•Lectura automática, no calibración,
no interpretación
•Procesado de muestras: 12-30
simultáneamente cada 45 minutos
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g
29
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g
SISTEMAS BASADOS EN ELISA
Sistema TECRA (Biotrace)
Salmonella
Listeria spp
Campylobacter spp
•Manual
•Desarrollo
Desarrollo de color
•Resultados : 1-2 días
-
+
•Validaciones internacionales
•Posibilidad de realizarlo
automáticamente con el UNIQUE
PLUS
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g
SISTEMAS BASADOS EN ELISA
Sistema TRANSIA
(Biocontrol)
Salmonella
Listeria Monocytogenes
Listeria spp
•Automático
•Manejo de elevados volúmenes
•Procesado de muestras: 93
muestras simultáneamente
•Resultados rápidos: 1-2 días
•Validaciones internacionales
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g
SISTEMAS BASADOS EN ELISA
L
Lateral
l fl
flow
Rapid test (Oxoid)
VIP (BioControl)
RayAl (Rayal Ltd)
REVEAL (Neogen)
Rapidcheck (Bioser)
•Manual
•La
L muestra
t difunde
dif d por
capilaridad hacia la zona de Ac
•Lectura habitual p
por una línea
de color
•Validaciones internacionales
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g
SISTEMAS BASADOS EN PCR
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g
34
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g
SISTEMAS BASADOS EN Real Time PCR (BAX System: Oxoid)
•Procotolos diferentes según
matriz
•Validaciones internacionales
Salmonella spp
Listeria spp
Listeria Monocytogenes
•Resultados
R
lt d en 24-33
24 33 h
horas
•Sonda Sybr Green
Campylobacter
E.coli O157:H7
Enterobacter sakazakii
Mohos y levaduras
S.aureus
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g
SISTEMAS BASADOS EN REAL TIME PCR (Applied Biosystem):
•2 tipos de kits: Taqman y Microseq
•Validaciones internacionales
Salmonella spp
•Resultados en 20-28 horas
Salmonella entérica
Listeria spp
Listeria Monocytogenes
E.coli O157:H7
Campylobacter jejuni
•Cronobacter sakazakii
•E. coli O157:H7
•Listeria monocytogenes
•Pseudomonas aeruginosa
•Staphylococcus aureus
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g
SISTEMAS BASADOS EN PCR (Adia food: AES)
Salmonella spp
•Termociclador: Stratagen
Listeria spp
•Resultados en 19-21 horas
Listeria Monocytogenes
E.coli O157:H7
E coli O157:H7 y Salmonella
E.
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g
SISTEMAS BASADOS EN REAL TIME PCR (iQ-CHECK: Biorad)
•Sondas: Molecular Beacons
Varios termocicladores:iCycler iQ, chrom 4,
•Varios
iQ 5 y miniOpticon.
•En algunos software de interpretación de
resultados
lt d
•Validación 16140
Salmonella spp
y g
Listeria Monocytogenes
Listeria spp
Campylobacter
E.coli 0157:H7
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g
SISTEMAS BASADOS EN REAL TIME PCR (Assurance GDS:
Biocontrol)
•Salmonella
•Listeria spp
•Listeria monocytogenes
•E.coli O157:h7
•Shiga
Shiga Toxin
To in
•Combina concentración de muestra
y detección
d t
ió de
d DNA
•Termociclador:Assurance GDS
Rotor-Gene™.
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g
SISTEMAS DE DETECCIÓN CON FAGOS
Salmonella
E.coli 0157:H7
+
•Detección rápida y
automática de patógenos
mediante FAGOS ligada
g
a
fluorescencia.
Salmonella
+
42
•Detección
D t
ió rápida
á id y
manual de patógenos
mediante FAGOS (lateral
flo )
flow)
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Food & envt.
225 ml of BPW +
supplement (green)
41.5 +/- 1 °C
18-24 h
Heat & Go 5 min*
min
*Except for poultry & egg products
VIDAS UP Salmonella
48 min
43
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Identificación
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
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Métodos rápidos aplicados a la identificación de
microorganismos
g
IDENTIFICACIÓN CON SISTEMAS MINIATURIZADOS
•Manual
•Miniaturización de pruebas bioquímicas
•Diferentes formatos: galerías, tubos de plástico,
•API: bioMerieux
•BBL
BBL Enterotube: BD
•BBL Crystal: BD
•RapID™
RapID System: REMEL
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a la identificación de
microorganismos
g
SISTEMAS AUTOMÁTICOS DE IDENTIFICACIÓN
Fenotípica:
VITEK: bioMerieux
•BIOLOG: AES
•PHOENIX: BD
•Resultados a partir de 4 horas
•Combinan reacciones enzimáticas y
bioquímicas
Genotípica:
•MICROSEQ:
C OS Q ABI
46
•Secuenciación del
ARN 16 S
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a la identificación de
microorganismos
CLASIFICACIÓN FILOGENÉTICA
Family
VITEK, API, BIOLOG, PHOENIX
Genus
Species
Subspecies Strain
DNA sequencing
MicroSeq
16S rDNA sequencing
ARDRA
Riboprinter
Riboprinting
tRNA PCR
tRNA-PCR
ITS-PCR
BioRad
PFGE, LFRFA, RLFP
Multilocus Isozyme
Whole cell protein profiling
ABI
AFLP
RAPD APPCR
Diversilab
G
Genetic
ti Differences:
Diff
Technique Discrimination:
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rep-PCR
M
More
F
Fewer
Low
High
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Métodos rápidos aplicados a la identificación de
microorganismos
•Genera huellas genéticas únicas y reproducibles para cada
una de las muestras
•13 muestras en 4 horas
1. Extracción de ADN: Extracción de ADN a partir de cultivos aislados.
2. Amplificación mediante rep-PCR: Amplificación de muestras con la técnica rep-PCR y los
correspondientes kits de identificación genética DiversiLab (DiversiLab DNA Fingerprinting kits).
3. Detección: Separación de fragmentos mediante electroforesis de microfluidos en chip (DNA
LabChip Kits).
4. Análisis de datos: Análisis de los datos en tiempo real, con informes a los que se puede
acceder a través de un sitio web individual y seguro.
48
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a la
identificación de microorganismos
ESPECTROMETRÍA DE MASAS
•
Técnica analítica para determinar la composición elemental de
una muestra
•
El principio de MS consiste en la ionización de compuestos
químicos p
q
para g
generar moléculas cargadas
g
y medir su relación
masa/carga (m/r)
•
MALDI-TOF
MALDI
TOF (Matrix
(M t i Assisted
A i t d Laser
L
Desorption
D
ti / Ionisation
I i ti Time of Flight), es un tipo de espectrometría de masas que
permite el screening de proteínas directamente a partir de
bacterias intactas
Ionization
Mass
Ion
InletDetector
Analyzer
System
System
Sample
Under Vacuum
49
Data
Analysis
S
System
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
• Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time
Of Flight.
Flight MALDI is the Ionization System-TOF is
the Mass Analyzer system.
1
2
3
1
Una muestra en una solución matriz absorbe energía de un haz láser. El resultados
es una ionización de la muestra.
2
Todos los iones son acelerados a la misma energía cinética, entran en el tubo y
son separados de acuerdo con su masa
3
Detección al final del tubo
50
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a la
identificación de microorganismos
ESPECTROMETRÍA DE MASAS
3775
3
<<C:\Dokumente und Einstellungen\m.erhard\Eigene Dateien\AnagnosTec-dc\Zwischenablage\Dokument Banner.txt>> Spec [BP = 3
5000
7000
10939
11000
11572
11
1906
10226
1
10347
9000
10
0608
9330
10
0
3000
9994
7980
20
8450
8
30
7863
40
6837
7092
7367
7
50
5931
5015
60
3581
% Intensity
70
9654
80
8744
8074
90
9453
1648.1
7075
100
13000
Mass (m/z)
51
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a la
identificación de microorganismos
ESPECTROMETRÍA DE MASAS
Fungi, yeast and mycobacteria:
On-target extraction
addition of
1.0 µL matrix solution
di t
direct
solvent evaporation
at room temperature
Target slide
No selección previa de la colonia
Identificación en solo 2
minutos
automated
MS analysis
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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos rápidos aplicados a la
identificación de microorganismos
•VITEK MS RUO:
bioMerieux
•Maldi Biotyper: Bruker
Pow e r
53
Ionis ing
V a cuum
N eg ative
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
MUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIÓN
Ana María Fuertes Barrio
[email protected]
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