Guia Transcripcion

Transcripci
ón
Transcripción
Prof. Iván Rebolledo
Introducción
Transcripción procariótica
El flujo de información genética
sigue el siguiente camino :
El ARNm sintetizado a partir del
ADN es de corta vida (unos 2
minutos). Ellos son cadenas largas,
con varios codones de iniciación
(AUG);
por
tanto,
pueden
sintetizar varias proteínas al
mismo tiempo, es decir, son
policistrónicos
(poli:
muchos,
cistron: unidad de transcripción).
replicación
DNA
transcripción
RNA
traducción
Prot
Los ARN existentes en eucariontes
son :
ARNm : ARN mensajero
ARNt : ARN transferencia
ARNr : ARN ribosómico
ARNhn : ARN heterogéneo nuclear
(precursor del ARNm)
ARNsn : ARN nuclear pequeño
ARNsc : ARN citosólico pequeño
(caso del PRS)
En procariontes sólo existen los
tres primeros.
La transcripción del ADN en ARN
es mediada por acción de las
enzimas ARN polimerasas, que en
procariontes es una sola y en
eucariontes son tres.
En procariontes, los 3 tipos de
ARN (ARNm, ARNt y ARNr) son
sintetizados por la misma ARN
polimerasa. Para ello, utiliza una
cadena de ADN, es decir, es una
transcripción asimétrica. La
ARN polimerasa es una enzima
compleja
y
de
grandes
dimensiones, formada por 5
cadenas polipeptídicas (2 α, 2 β y el
factor sigma σ).
Pueden distinguirse 3 etapas en la
transcripción: iniciación, alargamiento y terminación. En la
iniciación, la ARN polimerasa,
mediante el factor sigma, reconoce
un sitio inicial en la cadena del
ADN llamado promotor, el cual es
rico en A y T (TATAATG o
variaciones de éste, por esto se le
llama caja TATA). Es probable que
esta región sea favorable para una
separación local de las cadenas del
ADN, para que así la ARN
polimerasa pueda tener acceso a
103
Transcripción
las bases de una de las cadenas del
ADN, la que tiene la información
para producir determinado ARN.
ADN
Durante el alargamiento, la ARN
polimerasa copia de una manera
exacta la secuencia del ADN,
avanzando rápidamente por la
cadena
(30
nucleótidos
por
segundo). Sólo se transcribe una
cadena del ADN, siguiendo la
dirección 5’ a 3’, igual a la
replicación del ADN.
Recordemos que se está formando
una cadena de ARN a partir del
ADN, por tanto, la complementación de las bases debe seguir la
regla de A→U. Por ejemplo: si las
bases del ADN son
G−A−T−A−C−A
las de ARN serán
C−U−A−U−G−U.
La terminación se produce
cuando la ARN polimerasa llega a
producir una secuencia rica en
residuos U consecutivos en la ARN
(4 a 8 U). Un factor de
terminación, llamado factor rho ρ,
es una proteína con actividad
ATPásica,
que
produce
la
liberación de las moléculas de ARN
completas.
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Transcripción eucariótica
Aunque el proceso es similar al de
procariontes, se presentan dos
diferencias
muy
claras.
En
procariontes actúa una sola
molécula de ARN polimerasa
mientras que en eucariontes
intervienen varias (ver cuadro
abajo) y luego, el sitio promotor es
reconocido en eucariontes por una
variedad de proteínas.
Tipos de ARN
ARN polime
ARNm
II
ARNt
III
ARNr (5.8 S, 18 S y 28 S)
ARNr (5 S)
ARNsn, ARNsc
I
III
II y III
Cada
unidad
de
las
ARN
polimerasas mencionadas están
conformadas por 8 a 14 cadenas
polipeptídicas. Además, las 2
subunidades más grandes de las 3
ARN polimerasas son similares a
las subunidades β de la ARN
polimerasa de procarionte. Por
último, 5 subunidades son comunes
en las tres ARN polimerasas. Se
muestra, en la página siguiente,
una figura de una ARN polimerasa
eucariótica para considerar su
complejidad.
Transcripción
ADN
ARN mensajero
La
ARN
polimerasa
II
es
responsable de la síntesis del
ARNm. Esta ARN polimerasa II
requiere
de
unas
proteínas
llamadas factores de transcripción
para iniciar el proceso. Estos
factores mostrados en la figura
como TBP, B, F, E y H van
asociándose secuencialmente sobre
la polimerasa para que al final esté
activada para producir el ARNm. A
diferencia de los procariontes, este
ARNm no puede ser utilizado
inmediatamente por los ribosomas,
es producido como un pre−ARNm
dentro del núcleo.
Los productos iniciales de la
transcripción de un ARNm son
modificados
antes
de
ser
exportados desde el núcleo hacia el
citosol.
El
proceso
incluye
modificación de ambos extremos de
la molécula (extremo 5’ y 3’) y la
remoción de los intrones.
En cuanto se sintetiza la molécula
del pre-ARNm, se le añade al
extremo 5’ una molécula llamada
casquete de metil-guanosina
(llamada 5’ cap). La utilidad de
este 5’ cap es triple: (a) alinear el
ARNm sobre el ribosoma durante
la traducción en el citosol; (b)
evitar que el extremo 5’ del ARNm
sea digerido por nucleasas; y (c)
ayudar a transportar el ARNm
hacia fuera del núcleo.
Muchos
genes
eucarióticos
contienen segmentos de secuencias
codificantes
llamados
exones
alternados
con
secuencias
no−codificantes llamados intrones
Tanto los intrones como los exones
son transcriptos al pre−ARNm. Los
intrones son luego removidos por
cortes para formar el ARNm
maduro que saldrá al citosol.
El extremo 3’ está definido por un
corte de la molécula de pre−ARNm
y la adición de una cola poli-A,
llamado también poliadenilación.
La señal para ubicar esta cola es la
presencia de una secuencia de 6
nucleótidos A−A−U−A−A−A. Esta
señal sirve también para que un
complejo
de
proteínas
(endonucleasas) corte la molécula
de pre−ARNm y una polimerasa
poli−A añada unos 200 nucléotidos
de A. Esta cola permite estabilidad
en la molécula de ARNm a la vez
que ayuda con la traducción.
105
Transcripción
Transcripción
5’ cap
3’ poliadenilación
Eliminación intrones
La poliadenilación juega un rol
importante en embriología, donde
la longitud de la cola poli−A
controla la traducción del ARNm.
Muchos ARNm almacenados en los
ovocitos no fecundados son no
traducibles debido a una corta cola
de poli−A (20 nucleótidos). La
fecundación estimula el alargamiento de la cola poli−A de los
ARNm almacenados, los cuales
inician la traducción y síntesis de
proteínas necesarias para el
desarrollo temprano del embrión.
Análisis
bioquímicos
han
demostrado que los cortes y
eliminación de los intrones son
producidos por grandes moléculas
llamados espliceosomas compuestos de proteínas y ARN. El
componente ARN está integrado
por 5 tipos de ARNsn llamados U1,
U2, U4, U5 y U6. El número de
nucleótidos es variable, rangean de
50 a 200. Ellos se unen con 6 a 10
proteínas para formar pequeñas
partículas de ribonucleoproteínas
(RNPsn).
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El primer paso en este proceso es
el reconocimiento que la RNPsnU1 hace de las secuencias GU del
pre-ARNm. Luego se añade la
RNP-U2 a secuencias con A Ahora
se añade el complejo U4/U6 y
finalmente lo hace el U5 el cual
corta los extremos del intron.
Interesante mencionar aquí que los
mismos intrones son capaces en
algunos casos de cortarse a sí
mismos,
sin
necesidad
de
proteínas, lo que da la alternativa
que estos sectores de ARN pueden
actuar como ribosimas (enzima
constituída
por
ARN).
En
conclusión, parece ser que las
proteínas del espliceosoma tienen
la función de reconocer los sitios de
corte y los ARNsn realizan la
función catalítica.
Transcripción
ARN transferencia
Los ARN de transferencia (ARNt)
son sintetizados por acción de la
ARN polimerasa III, la cual
produce un pre—ARNt. El primer
paso en el proceso de maduración
es el corte en ambos extremos de la
molécula: en el extremo 5’ actúa la
ribosima llamada RNasa P y en el
extremo
3’
una
proteína
convencional (ver Figura hoja 5).
En el extremo 3’ se añaden los
nucleótidos C—C—A, es en esta
secuencia donde se añaden los
aminoácidos que posteriormente
serán utilizados en la síntesis de
proteínas. Los aminoácidos serán
añadidos por acción de la enzima
aminoacil—ARNt sintetasa.
Otra modificación en la molécula
del ARNt es la alteración de bases
específicas en posiciones precisas.
Finalmente, ocurre un plegamiento
de la molécula originando asas,
entre las cuales la más importante
es el asa anticodon, que tendrá las
bases
complementarias
(anticodon) con las bases del
ARNm (codon).
Cortes
Adición CCA
Modificación bases
107
Transcripción
ARN ribosómico
Los ARNr se encuentran en el
interior de las dos subunidades de
los ribosomas, junto un número
característico de proteínas para
cada subunidad.
Recordemos
que
la
ARN
polimerasa I es la encargada de
sintetizar la mayoría de los ARNr
La enzima produce una molécula
de 45 S la cual es procesada para
producir las tres de 28 S, 5,8 S y
y18 S.
promotor
transcripción
Nota: la letra S que acompaña a las
subunidades y a las moléculas de ARNr
corresponde
al
coeficiente
de
sedimentación (unidad Svedberg). Cuanto
mayor el número, mayor velocidad
durante la centrifugación y mayor el
tamaño de la molécula.
procesamiento
En humano, la subunidad grande
contiene 3 ARNr (28 S, 5,8 S y 5 S)
y ∼45 proteínas. La subunidad
pequeña contiene el ARNr 18 S
junto con ∼30 proteínas.
Del
esquema
mostrado,
la
subunidad pequeña contendrá el
ARNr 18 S al cual se añaden unas
30 proteínas y la subunidad grande
incluirá los ARNr 28 S, 5,8 S y el 5
S que proviene del nucleoplasma
más unas 40 proteínas.
Tres de los ARNr mencionados
derivan de un pre—ARNr : 28 S,
18 S y 5,8 S. Este pre—ARNr se
organiza dentro del nucléolo; en
tanto que el ARNr de 5 S deriva
directamente desde el núcleoplasma éste se incorpora dentro del
nucléolo
para
organizar
la
subunidad grande del ribosoma.
Los nucléolos se han asociado a la
actividad de síntesis de proteína
celular.
Células con nucléolos
muy pequeños
o
ausentes
exhiben poca síntesis proteica; en
cambio,
células con nucléolos
grandes manifiestan una activa
síntesis proteica (células acinares
pancreáticas, neuronas, etc.)
108
Transcripción
Durante la mitosis los nucléolos se
dispersan
y
vuelven
a
reconstituirse en la telofase, en
regiones específicas
de los
cromosomas;
la llamada constricción secundaria que son los
organizadores
nucleolares, es
decir, una gran porción de ADN
que contiene los genes para los
ARNr (18 S, 5.8 S y 28 S).
A ME se pueden distinguir 2 zonas
en el nucléolo: una zona fibrilar
central y una granular periférica.
Mediante
técnicas
autorradiográficas usando uridiria-H3 se ha
comprobado la siguiente relación:
Nota: los dibujos de abajo se refieren a la
estructura
de
los
ribosomas
en
procariontes y eucariontes
Procarionte (70 S)
30 S
50 S
16 S
21 prot.
23 S
5 S
34 prot.
ADN nucleolar⎯→ región fibrilar
↓
citoplasma ←⎯ región granular
La región fibrilar contiene los
genes de ARNr que se desenrollan
del cromosoma y penetran al
nucléolo junto con las moléculas de
ARN recién sintetizadas. En este
lugar actúa la ARN polimerasa I
transcribiendo el ADN en pre—
ARNr. La región granular contiene
precursores de las subunidades en
distintos estados de procesamiento.
Una vez que
las subunidades
están maduras son liberadas del
nucléolo
y
salen
hacia
el
citoplasma por los complejos de
poros nucleares.
Eucarionte (80 S)
18 S
30 prot.
40 S
28 S
5.8 S
5 S
40 prot.
60 S
109
Transcripción
Notas
110