UN MEDIO PARA LA PRODUCCION MASIVA DE Hirsutella

UN MEDIO PARA LA PRODUCCION MASIVA DE Hirsutella

CitriFrut 30(1) ene-jun:19-22. 2013
ISSN: 1607-5072
Artículo Científico
UN MEDIO PARA LA PRODUCCION MASIVA DE Hirsutella thompsonii var. thompsonii,
BIORREGULADOR DE ACAROS FITOFAGOS*
Reinaldo Israel Cabrera-Cabrera y Jesús Ferrer-González
Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical. Ave. 7ma. No. 3005 entre 30 y 32, Miramar, Playa. La Habana. Cuba.
E-mail: [email protected]
Resumen
La producción a gran escala de muchos hongos patógenos de ácaros e insectos, aún requiere de la búsqueda de nuevos medios de cultivo que resulten económicos y eficientes. No obstante los avances en la obtención de medios de cultivo para la producción masiva del hongo Hirsutella thompsonii var. thompsonii, todavía
se necesita disponer de nuevas fuentes de nutrientes que resulten apropiadas para cada tecnología, estén disponibles y sean eficientes y poco costosas. Se
ensayaron cinco concentraciones de soya (4; 6; 8; 10 y 12% p/v) más azúcar de caña turbinada al 3% y se evaluó el crecimiento del hongo en cada una de ellas
más un testigo. Luego de 72 horas de fermentación en zaranda de producción continua a 180 r.p.m. y una temperatura de 27±1°C, se comprobó que todas las
concentraciones dieron resultados superiores al testigo, con diferencias significativas y que el mayor peso seco de micelio (1,93 g/100 mL de medio), se logró
cuando su utilizó la soya y el azúcar al 12 y 3% p/v respectivamente.
Palabras clave: Glycine max, medio líquido, biorregulador, Hirsutella thompsonii var. thompsonii.
A medium for the massive production of Hirsutella thompsonii var. thompsonii, bioregulator of phytophague mites
Abstract
For the large-scale production of many fungi pathogen of mites and insects, it is still required the search of new culture media of low cost and with characteristics
appropiated to the reproduction technology to employ. Nevertheless the advances in the obtention of culture media for the massive production of the fungus
Hirsutella thompsonii var. thompsonii, it is yet necessary to dispose of new nutrient sources not only efficient but also available and cheap. Five soybean concentrations (4; 6; 8; 10 y 12% w/v) were assayed plus turbinated cane sugar at 3% and fungus growth was evaluated in each one plus a control, after 72 hours of
fermentation in continuous production shaker at 180 r.p.m. and a temperature of 27±1°C. It was verified that all the concentrations gave results greater than the
control, with significant differences and that the greatest mycelium dry weight (1,93 g/100 mL of medium), was obtained when soybean and sugar cane were
used at 12 and 3% w/v respectively.
Key words: Glycine max, liquid medium, bioregulator, Hirsutella thompsonii var. thompsonii
INTRODUCCIÓN
La producción masiva del hongo Hirsutella thompsonii Fisher,
considerado como un importante biorregulador de muchos
ácaros fitófagos (Hall et al., 1980, Mc Coy 1981, Sosa Gómez
y Nasca, 1983, Cabrera, 1985, Cabrera et al., 2007 y 2008), ha
estado limitada por la poca existencia de fuentes de nutrientes
eficientes, de alta disponibilidad y poco costosas, lo que despertó el interés hacia la búsqueda de medios de cultivo para su
reproducción a gran escala (Mc Coy et al. 1972; 1975 y 1978;
Van Winkelhoff y Mc Coy, 1984).
En 1988 Latgé et al., señalaron que este Deuteromyceto parecía comercialmente viable si su producción masiva y la formulación fuesen altamente mejoradas. En tal sentido Rosa et al.
(1994 y 1995), ensayaron el crecimiento micelial y la conidiación de H. thompsonii e Hirsutella nodulosa Petch en medios
líquidos y cultivo mixto. Años más tarde Cabrera et al. (2006),
propusieron un medio simplificado a base de soya más azúcar
turbinada de caña para la producción de H. nodulosa en fase
líquida y demostraron la eficiencia de tales fuentes de nutrientes, en el desarrollo de esta especie de Hirsutella.
La utilización del mosto de cerveza de primera extracción como
una nueva fuente natural de nitrógeno, en combinación con el
azúcar turbinada de caña como fuente de carbono, permitió
también la obtención de un medio simplificado y eficaz para
la producción del hongo Pochonia chlamydosporia var. chlamydosporia (Goddard) Zare & Gams en fase líquida (Cabrera
et al., 2011).
Tomando en consideración que Hirsutella thompsonii var.
thompsonii Samson, Mc Coy y O’Donnel, al igual que H. thompsonii, son actualmente los biorreguladores más importantes de
muchos ácaros reponsables de grandes pérdidas económicas,
particularmente de la mayoría de los eriófidos que constituyen
plagas agrícolas de gran interés y de otros que siendo solo fitófagos, se comportan también como sus hospedantes naturales
(Hall et al., 1980; Peng et al., 2002; Rosas y Sampedro, 2006,
* Recibido: 19 de diciembre de 2012. Aceptado: 8 de febrero de 2013
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R.I. Cabrera y J. Ferrer: UN MEDIO PARA LA PRODUCCION MASIVA DE H. thompsonii var. thompsonii
Cabrera et al., 2007, 2008 y 2009), se hace necesario continuar
la búsqueda de nuevas alternativas para la multiplicación eficiente de este biorregulador.
Por lo antes expuesto, el objetivo del presente trabajo fue el
obtener un medio de cultivo poco costoso y eficaz para la producción masiva de H. thompsonii var. thompsonii en fase líquida
o como la primera parte del cultivo mixto, lo que contribuirá
a la obtención de un bioacaricida a base de este hongo, para
su utilización en los programas de control biológico y manejo
integrado de plagas.
MATERIALES Y METODOS
Para la preparación del medio se pesaron en balanza analítica 20, 30, 40, 50 y 60 g de soya en grano (Glycine max (Lin.)
Merr. y se depositaron por separado en erlenmeyers de 1 L
de capacidad con 400 mL de agua destilada cada uno. Estos
se taparon con tapones de algodón y se colocaron en autoclave a 121 °C durante 35 minutos. Una vez a temperatura
ambiente (entre 25 y 29 °C), el contenido de cada erlenmeyer
se maceró en una licuadora por espacio de 20 segundos y se
filtró por un paño de lienzo, presionado manualmente, para
la extracción de la parte líquida. Seguidamente se adicionó
a cada uno de ellos azúcar turbinada de caña al 3 % p/v, se
filtraron al vacío por papel Whatman No.1 y se enrasaron con
agua destilada a 500 mL, para que la soya quedara en una
proporción del 4, 6, 8, 10 y 12% p/v respectivamente. Lotes
de tres erlenmeyers de 300 mL, con 100 mL de medio cada
uno, sirvieron como réplicas del experimento, con tres repeticiones. En todos los casos el medio fue esterilizado como en
el caso anterior. El pH inicial fluctuó entre 5,9 y 6,8.
Se trabajó con una cepa de H. thompsonii var. thompsonii aislada a partir del ácaro del cocotero Aceria guerreronis Keifer y
reactivada sobre el mismo eriófido para su utilización. El hongo
se desarrolló durante 10 días en cuñas inclinadas de medio H
(medio de Mc Coy et al., 1972 modificado por Cabrera, 1980),
contenidas en cuatro tubos de ensayo, previamente inoculadas
con 0.2 mL de una suspensión conidial de 108 c/mL.
de agitación en zaranda y bajo las mismas condiciones antes
señaladas, se extrajeron los micelios de cada recipiente por filtración al vacío con papel de filtro como en el caso anterior y
se colocaron en estufa a 60 °C durante 24 horas, para la posterior determinación en balanza analítica de la biomasa micelial
(peso seco) producida en cada caso.
Para el análisis estadístico de la variable peso seco del micelio,
a todos los datos se les comprobó la normalidad mediante la
prueba Kolmogorov-Smirnhov y la homogeneidad de varianza según el test de Bartlett. Se utilizó un diseño de bloques
al azar y se realizó un ANOVA de clasificación simple, previa
transformación de los resultados en arcos √X y las medias se
compararon entre sí por el Test de Rangos Múltiples de Duncan (Duncan, 1980) con un nivel de significación de p= 0,05. Se
empleó el paquete de programas TONISTAT (Sigarroa, 1987).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se obtuvo un medio de cultivo eficiente y con buenas características para la producción masiva de H. thompsonii var. thompsonii en fase líquida. En este estudio no se logró la presencia de
la conidiación en este hongo, pero sí una abundante biomasa
formada por los micelios y conidióforos típicos de esta variedad de Hirsutella.
Para la variable peso seco de micelio producido por este acaropatógeno, se presentaron diferencias significativas para
p<0,05 entre el testigo y todas las concentraciones de soya
más el azúcar turbinada de caña al 3% p/v que se ensayaron.
Igualmente se presentaron diferencias significativas al mismo
nivel, entre las dos concentraciones más bajas de soya y entre
estas y sus dos más altas, las que sin diferir entre si, mostraron
los mejores resultados en la producción de micelio, difiriendo
a su vez del testigo con el valor más bajo (Figura 1).
Transcurrido este tiempo, se recuperaron los conidios de estos tubos por dilución en tres mL de agua destilada estéril y
se transfirieron a dos erlenmeyers de 300 mL con 100 mL de
medio (glucosa 4 % más extracto de levadura 0, 86 % p/v) los
que, como inóculo, fueron agitados durante cuatro días en una
zaranda de producción continua a 180 r.p.m. y a una temperatura de 27± 1 °C.
Estandarizado el micelio que creció en los dos erlenmeyers
(1,5 g de micelio húmedo/100 mL de medio), este sirvió para
inocular al 4 % p/v los 18 erlenmeyers que se utilizaron para
el montaje del diseño experimental, con las diferentes concentraciones de soya y el medio testigo como el que se utilizó para
la producción del inóculo. Todo el trabajo se realizó en mesa
de flujo laminar y con pipeta automática. Luego de 72 horas
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Fig. 1. Comparación del peso seco de la biomasa de H. thompsonii var. thompsonii en diferentes concentraciones de soya más azúcar turbinada al 3 %. (Letras
iguales no difieren para p<0,05)
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La dinámica de desarrollo de este hongo en las diferentes combinaciones de soya fue muy rápida, en lo que respecta a la producción de biomasa micelial (peso seco), la que alcanzó hasta un
promedio de 1,93 g por cada 100 mL de medio a los tres días de
fermentación a 180 r.p.m. y a una temperatura de 27 ± 1 °C.
El procedimiento que se utilizó para la extracción de los nutrientes a partir de la soya, fue muy similar al que desarrollaron
Cabrera et al. (2006), cuando propusieron un medio líquido
a base de esta fuente de nutriente, más azúcar turbinada de
caña, para la producción del hongo acaropatógeno Hirsutella
nodulosa Petch. En este caso se logró obtener igualmente, un
medio similar para la reproducción masiva de esta variedad de
H. thompsonii, así como disponer de un medio simplificado, eficiente y económico para su multiplicación a gran escala, tanto
en fase líquida como en la primera fase del cultivo mixto.
La selección de un medio de cultivo a partir de sustancias naturales no solo dependerá de su aporte nutricional, ya sea como
fuente portadora de carbono, nitrógeno, etc. sino, además, de
las características del medio tales como su viscosidad, turbidez y pH entre otras (Cabrera, 2001). Estos aspectos también
pudieron haber influido favorablemente en el rendimiento micelial de H. thompsonii var. thompsonii, cuando se reprodujo en
este medio líquido.
La ausencia de conidios no se relaciona con el medio de cultivo
que se utilizó, sino a que esta cepa, como ocurre normalmente
con la mayoría de las cepas de Hirsutella y sus variedades, no
presenta conidiogénesis en medio líquido o cultivo sumergido
(Cabrera, 2001).
Las diferencias significativas entre las menores y mayores
concentraciones de soya y el haber logrado en estas últimas la
mejor producción de micelio, reafirma la importancia del nitrógeno en el desarrollo micelial de H. thompsonii y sus variedades, tal y como lo señalaran Mc Coy et al. (1978) y Cabrera
(2001). La posibilidad de sustituir la glucosa y el extracto de
levadura, reactivos altamente costosos, por fuentes de nitrógeno y carbono a partir de la soya y el azúcar turbinada de caña
respectivamente, facilitará la producción masiva de este acaropatógeno en un nuevo medio menos costoso y más eficiente.
Este medio reduce, además, de cuatro a tres días su tiempo de
fermentación en fase líquida.
El logro de resultados superiores a los de Cabrera et al. (2006),
cuando alcanzaron hasta 1,14 g (peso seco de micelio) por
cada 100 mL de un medio similar y utilizando una cepa de H.
nodulosa, evidencia cuánto se puede hacer en la búsqueda de
nuevas fuentes de nutrientes, con una mayor velocidad de desarrollo y una menor fase de adaptación al inicio de la fermentación.
Si bien la soya al 12 % p/v, fue la que proporcionó el mayor
crecimiento micelial de este hongo (1,93 g promedio seco
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peso/100 mL de medio) este no difirió significativamente de
los valores alcanzados con la soya al 8 y al 10 % p/v; lo que permite recomendar la producción de H. thompsonii var. thompsonii en un medio que contenga entre 80 y 100 g de soya por litro
de agua, más 30 g de azúcar turbinada de caña.
CONCLUSIONES
La utilización de soya entre el 8 y el 10 % más azúcar turbinada
de caña al 3 % p/v, constituye un medio de cultivo eficiente
y económico para la producción masiva de H. thompsonii var.
thompsonii en fase líquida.
El hongo produce en las diferentes concentraciones de soya
más el azúcar, una abundante masa micelial con sus conidióforos típicos, pero sin la formación de conidios.
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