Diagnóstico microbiológico de la tos ferina

Diagnóstico microbiológico de la tos ferina

Diagnóstico microbiológico de la tos ferina
Rafael Borrás Salvador, Profesor de Microbiología, Jefe de Sección del Servicio de
Microbiología, Hospital Clínico Universitario, Facultad de Medicina, Valencia
La tos ferina es una enfermedad infecciosa de las vías respiratorias, altamente
contagiosa, común en la infancia y prevenible mediante
vacunación, que en la fase de estado se caracteriza por unos
típicos “accesos de tos violenta, espasmódica, con sensación
de asfixia, que termina con un sonido estridente durante la
inspiración”.
Históricamente, de Bauillou, en 1589, describió la tos
quintosa (Tussis quintin), uno de los síntomas de la tos ferina;
Sydenham, en 1679, y Willis en 1682, describieron la
enfermedad (Pertussis); Bordet y Gengou, en 1907, aislaron la
Prof. Rafael Borrás
bacteria productora de la enfermedad a la que denominaron Bacillus pertussis;
Madsen, en 1923, llevó a cabo la introducción de la vacuna; y en 1952, Moreno López
creó el género Bordetella para incluir en él a Haemophilus pertussis, una especie del
género Haemophilus que no requería derivados de la sangre para su crecimiento, el
actual Bordetella pertussis, el agente causal de la tos ferina, la especie tipo del género
Bordetella.
Las especies del género Bordetella se caracterizan por ser cocobacilos
gramnegativos de 0,3 a 0,5 x 1 a 2 µm, no A. A. R.; comúnmente inmóviles, no
capsulados (salvo B. pertussis) y no esporulados; catalasa positivos y comúnmente
oxidasa positivos. Son exigentes nutricionalmente, pero su exigencia nutricional no es
debida al requerimiento de derivados de la sangre, como sucede con Haemophilus
spp., sino a la necesidad de agregar a los medios sólidos de productos detoxicantes
del agar como sangre, almidón o carbón. Los medios más adecuados para su
aislamiento y mantenimiento en cultivo son los Bordet-Gengou y el de Regan-Lowe a
pH 6,8 - 7,2; en los que a 37 ºC, tardan en crecer entre 7-12 días. En el último de ellos,
las colonias son lisa (S), grisáceas, como gotas de mercurio, de 1 a 3 mm de diámetro.
Hasta 1984 en
el género Bordetella se incluían solo tres especies que eran
reconocidas como patógenos humanos, B. pertussis, y Bordetella parapertussis y
Bordetella bronchiseptica, causantes de la tos ferina y de síndromes pertusoides,
respectivamente.
El singular genio infeccioso de B. pertussis está determinado por su material
genético que condiciona: i) la expresión de adhesinas proteicas como, la pertactina y
la hemaglutinina filamentosa que le permiten fijarse a glucoproteínas sulfatadas de la
membrana citoplasmática de las células ciliadas de la mucosa respiratoria y a
receptores CR3 de los macrófagos. Proteínas
parapertussis y B. bronchiseptica; ii) de
semejantes se han descrito en B.
los lipopolisacáridos LPS A y LPS X
(antígenos O) que pueden activar el sistema del complemento por la vía alterna y
estimular la liberación de citosinas; iii) la síntesis de exotoxinas como, la toxina
pertussis, la toxina adenil ciclasa/hemolisina, la toxina dermonecrótica, y la citotoxina
traqueal.
Después de 1984, se han descrito nuevas especies, unas propias del hombre y
otras de origen animal y ambiental, productoras de infecciones en el hombre tanto
respiratorias como extrarrespiratorias (tabla 1), cuya diferenciación con las especies
clásicas se puede realizar atendiendo a sus características fenotípicas (tabla 2)
Tabla 1. Especies del género Bordetella e infecciones que producen en el hombre
Especie
Año de
descripción
1907
Reservorio
Hombre
Tos ferina
B. bronchiseptica
1912
Animal
Síndrome pertusoide, infección respiratoria
B. parapertussis
1938
Hombre
Síndrome pertusoide
B. hinzii
1995*
Animal
Infección respiratoria, bacteriemia,
B. pertussis
Tipo de Infección
colangitis
B. holmesii
1995
Hombre
Síndrome pertusoide, bacteriemia,
endocarditis
B. trematum
1996
Hombre
B. petrii
2001
Ambiental
Infección de heridas
Infección respiratoria, mastoiditis,
osteomielitis
B. ansorpii
2005
Humano
Infección de heridas
B. avium
2008*
Animal
Infección respiratoria
*Año de su descripción como patógeno humanos
Tabla 2. Diferenciación fenotípica de las especies del género Bordetella
Resultado / Especie
Característica
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Crecimiento en agar sangre
-
+
+
+
+
+
+
+
+
Crecimiento en agar de
-
+
±
+
+
+
+
+
+
Oxidasa
+
+
-
+
-
-
+
-
+
Nitratasa
-
+
-
-
-
±
-
-
-
Ureasa
-
+
+
±
-
-
-
-
-
Movilidad
-
+
-
+
-
+
-
+
+
MacConkey
1: B. pertussis; 2: B. bronchiseptica; 3: B. parapertussis; 4: B. hinzii; 5: B.
holmesii; 6: B. trematum; 7: B. petrii; 8: B. ansorpii; 9: B. avium. (Ko. et al. J
Clin Microbiol. 2005; 43: 2516–2519).
Desde el punto de vista clínico-biológico la tos ferina tiene cuatro periodos o fases
evolutivas en las que los parámetros: la carga bacteriana en las secreciones
respiratorias, y presencia de anticuerpos séricos no son constantes. De modo, que el
adecuado conocimiento del estadio evolutivo de la enfermedad en el que se halla el
paciente y su relación con la probable carga bacteriana o el título de anticuerpos
existentes en las secreciones respiratorias o en la sangre del mismo, respectivamente,
son de capital importancia para la adecuada orientación del diagnóstico microbiológico
de la tos ferina (tabla 3).
Tabla 3.
Periodos evolutivos de la tos ferina y su relación con la presencia de
bacterias en las secreciones respiratorias y de anticuerpos séricos
Periodo evolutivo
Duración
Carga bacteriana
Anticuerpos
Incubación
Fase prodrómica
Fase de estado
Fase de convalecencia
7 a 10 días
2
semanas
3+
2 a 4 semanas
2+ / -
4 semanas
-
- /1+
3+
3+
En la evolución del diagnóstico microbiológico de la tos ferina, desde la descripción
del agente etiológico hasta nuestros días, atendiendo a las herramientas diagnósticas
utilizadas podemos considerar la existencia de tres periodos:
i)
Periodo 1907-1959, que se inicia con la descripción del agente causal de la
tos ferina, B. pertussis (Bordet & Gengou, 1907), y del medio de cultivo
utilizado durante décadas para su cultivo, el medio de Bordet-Gengou. En
1912, Ferry, describió el aislamiento de B. bronchiseptica, y Eldering y
Kendrick, en 1938, describieron B. parapertussis. Además, durante este
periodo,
se
demostró
la
ineficacia
diagnóstica
de
los
exámenes
microscópicos de las secreciones respiratorias tras tinción por el método de
Gram;
ii)
Periodo 1961-1990, que se inicia con la utilización de anticuerpos
policlonales marcados con fluoresceína para el diagnóstico mediante
inmunofluorescencia directa (Whitaker et al., 1960). En 1977, Regan y Lowe
describen un medio de cultivo más sensible que el medio de Bordet-Gengou,
que entre otros componentes lleva incorporado carbón, el medio de Regan y
Lowe. Boreland et al. (1988), aplican anticuerpos monoclonales anti-B.
pertussis para el diagnóstico de la tosferina mediante electrosineresis. En
1990, Glare et al. aplican por primera vez los métodos moleculares para el
diagnóstico microbiológicos de esta enfermedad;
iii)
Periodo 1991-noviembre 2014, en PubMed existen 471 artículos sobre
Bordetella y PCR, 409 de ellos sobre PCR y B. pertussis y 118 PCR en
tiempo real. Se han probado diferentes dianas (región 522 pb gen cyaA,
operón PT, IS418, IS1001, IS1002, etc) y las más utilizadas han sido las
IS418 e IS1001 consideradas específicas de B. pertussis y B. parapertussis,
respectivamente. Por otro lado, se han descrito nuevas especies (tabla 1),
pero se ha podido comprobar que algunas de ellas pueden ser portadoras de
dianas propias de B. pertussis y B. parapertussis. Asi, Loeffelholz et al.
(2000) encontraron
que B. holmesii podía ser detectado mediante PCR
IS418 de B. pertussis; Donato et al. (2005) encontraron que B. hinzii es
portador del gen cyaA codificante de la toxina adenilato ciclasa-hemolisina, y
Tizolova et al. (2005) demostraron que B. bronchiseptica puede llevar las
secuencias de inserción IS418 e IS1001 consideradas específicas de B.
pertussis y B. parapertussis, respectivamente.
Por todo lo expuesto, cabe pensar que el diagnóstico microbiológico adecuado se
debe iniciar en la consulta, cuando el médico realiza la historia clínica y determina el
periodo evolutivo en el que se halla el paciente; las muestras que debe remitir y las
pruebas que debe solicitar al Servicio de Microbiología de su Hospital (figura 1).
El diagnóstico de la tos ferina se puede realizar por procedimientos directos e
indirectos. No obstante, el diagnóstico indirecto, basado en la detección de
anticuerpos, es un procedimiento poco sensible comparado con los métodos de
diagnóstico directo existentes actualmente. Para aumentar la sensibilidad de los
procedimientos serológicos, se han desarrollado técnicas para la detección de
anticuerpos frente pertactina, hemaglutinina filamentosa y toxina pertussis; los
anticuerpos frente a toxina pertussis son específicos para B. pertussis, pero los
anticuerpos frente a los otros antígenos pueden aparecer en infecciones por B.
parapertussis y B. bronchiseptica.
Para el diagnóstico directo contamos con diferentes herramientas, siendo los
métodos moleculares, como la PCR, los procedimientos diagnósticos más sensibles.
Tanto es así, que en la mayoría de los laboratorios han sustituido tanto la detección de
B. pertussis mediante inmunofluorescencia directa, como su aislamiento en cultivo, por
técnicas de PCR. Pero una buena praxis microbiológica aconseja la utilización de
ambos procedimientos: la detección de B. pertussis mediante PCR y su aislamiento en
cultivo.
Para tal fin, es necesario obtener la muestra adecuada que depende de la edad del
paciente y de su capacidad de expectoración. En el caso de los niños pequeños, la
muestra más adecuada es el aspirado nasofaríngeo, y en los niños con capacidad de
expectorar y en los adultos el esputo. Dado que B. pertussis es una bacteria muy
sensible a la desecación, las muestras deben ser transportadas rápidamente al
laboratorio y si no fuese posible deben ser conservadas en un medio de transporte
adecuado (medio de transporte de Regan y Lowe).
Respecto al aislamiento en cultivo el medio más utilizado actualmente es el medio de
Regan y Lowe, y la identificación de los aislados se puede realizar atendiendo a las
características morfológicas macro y microscópicas de las colonias, y a las
propiedades fenotípicas de los aislados (tabla 2)
Experiencia, en el Hospital Clínico Universitario de Valencia
En nuestra experiencia, en el Hospital Clínico Universitario de Valencia (HCUV), en
el periodo 2011-2012 se estudiaron 121 enfermos, 116 (95,9%) niños y 5 (4,1%)
adultos, diagnosticados de tos ferina/tos pertusoide, 86 casos (71,1%); bronquiolitis,
29 casos (23,9%); infección respiratoria aguda, 3 (2,5%), y neumonía, 3 (2,5%). El
diagnóstico se estableció mediante PCR hibridación reversa IS481 e IS1001
(GenoQuick® Bordetella, HainLifescience) y cultivo en medio de Regan y Lowe (BD
Diagnostic).
La PCR hibridación resultó positiva en 42 casos (34,7%), y todos ellos hibridaron con
la secuencia de inserción IS481 específica de B. pertussis. Veintisiete de los cultivos
(27/121; 22,3%) fueron positivos para B. pertussis; siendo buena (kappa = 0,662) la
concordancia entre ambos procedimientos.
La combinación de los resultados obtenidos con ambos procedimientos (tabla 4),
demuestra que en el periodo 2011-2012 se diagnosticaron 43 casos (35,5%); siendo
más común entre los adultos (60%) que la población infantil (34,5%), ratio 1:0,6 (p
Fisher=0,186). El 77,5% (31/40) de los casos infantiles se produjeron en lactantes de
≤4 meses (p<0,05).
La infección fue más común en los casos con sospecha de tos
ferina / tos pertusoide (32 / 86; 37,2%), que en los pacientes con otros diagnósticos
(11 / 35; 31,4%)
Tabla 4. Resultados obtenidos en el HCUV en el periodo 2011-2012
Resultados: PCR / Cultivo
Grupo etario
Pacientes
Cultivos
PCR
+/+
+/-
-/+
Total
Población
121 (100)
27 (23,3)
42 (34,7)
26 (21,5)
16 (13,2)
1 (0,8)
43 (35,5)
5 (4,1)
2 (40)
3 (60)
2 (40)
1 (20)
0
3 (60,0)
Niños
116 (95,9)
25 (21,5)
39 (33,6)
24 (20,7)
15 (12,9)
1 (0,8)
40 (34,5)
• ≤4 meses
89 (76,7)
23 (25,8)
30 (33,7)
22 (24,7)
8 (9,0)
1 (1,1)
31 (34,8)
• 5-12 meses
16 (13,8)
2 (12,5)
2 (12,5)
2 (12,5)
0
0
2 (12,5)
• 1-4 años
3 (2,6)
0
2 (66,7)
0
2 (66,7)
0
2 (66,7)
• 5-14 años
8 (6,9)
0
5 (62,5)
0
5 (62,5)
0
5 (62,5)
Adultos
(): resultado expresado en tanto por ciento
El análisis estadístico demostró que la PCR es una herramienta diagnóstica más
eficaz que el aislamiento en cultivo para el diagnóstico de la tos ferina.
Bibliografía
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