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Raíces transformadas
Algunos metabolitos secundarios sintetizados en raíces
Metabolito
Género vegetal
Aplicación
Atropina
Hyoscyamus
Anticolinérgico
Berberina
Hydratis
canadensis
Antihemorrágico
uterino
Esteres
bornilo
de Valeriana
Sedante
Ginsenósidos Panax ginseng
Tónico,
estimulante
Rotenona
Derris elliptica
Insecticida
Vincristina,
vinblastina
Catharantus
roseus
Antileucémico
Quinina,
quinidina
Cinchona
Antimalárico,
antirreumático
Reserpina
Rauwolfia
Antihipertensivo
Metabolitos acumulados en cultivos de raíces NO transformadas
El estudio de la bioquímica y la química
de las raíces ha estado siempre
acotado debido a las dificultades
técnicas derivadas de los hábitos
subterráneos de este órgano.
La posibilidad de contar con un sistema
de cultivo "in-vitro" se a tornado en una
herramienta sumamente útil a los fines
de investigación.
Agrobacterium rhizogenes …….
Bacteria del suelo gram negativa
causa la enfermedad de las raíces en cabellera
Agrobacterium tumefaciens
La infección de muchas especies in-vitro con el
microorganismo patógeno Agrobacterium
rhizogenes permite obtener clones de raíces
estables y en condiciones axénicas
Mayoritariamente, los clones preservan la
capacidad biosintética de las raíces de las
plantas que les dieron origen
Las raíces neoplásicas producidas por A.
rhizogenes se caracterizan por :
su alto índice de crecimiento
y su estabilidad genética
Estos cultivos producen niveles de
metabolitos secundarios comparables a las
plantas intactas
Otra aplicación de los cultivos de raíces transformadas es
la producción de proteínas bioactivas
Ej: exoenzimas: peroxidasas en Brassica napus
quitinasas de acción antifúngica
glucanasas proteínas activantes de
ribosomas (RIPs)
También
es
posible
almacenamiento
acumular
proteínas
de
Ej: sporamina en batata que también ha
demostrado jugar algún rol en procesos de
defensa.
Además los cultivos de raíces transformadas constituyen
ideales para realizar estudios metabólicos y regulatorios.
modelos
Por ejemplo con estos sistemas se ha demostrado que las raíces
pueden expresar capacidad fotosintética, llegando en algunos casos a
desarrollarse en ausencia de fuentes hidrocarbonadas, en total
fotoautotrofía.
Ya que la asimilación de carbono esta estrechamente afectada por la
producción de metabolitos secundarios estos sistemas son aptos para
analizar interacciones entre metabolismo primario y secundario.
Biología de la interación
Agrobacterium-planta
El único ejemplo conocido de
transferencia natural de ADN
inter-reino
•Can survive independent of plant host in the soil.
•Infects plants through breaks or wounds.
•Common disease of herbaceous plants, dicots.
The genus Agrobacterium has a wide host
range:
n
Agrobacterium can transfer T-DNA to a broad group of plants
n
Individual Agrobacterium strains have a limited host range
n
The molecular basis for the strain-specific host range is
unknown
n
Many but not all the monocot plants can be transformed
n
Under lab conditions, T-DNA can be transferred to yeast,
other fungi, and even animal and human cells
Steps of Agrobacterium-plant cell
interaction
n
n
n
n
n
n
Cell-cell recognition
Signal transduction and transcriptional
activation of vir genes
Plasmidic DNA metabolism
Intercellular transport
Nuclear import
T-DNA integration
T-DNA
n
n
T-DNA carries genes involved in the synthesis of
plant growth hormones (auxin: auxin synthesis;
cyt: cytokinin synthesis) and the production of
low molecular weight amino acid and sugar
phosphate derivatives called opines (ocs:
octopine; mas: mannopine; and ags: agropine).
Agrobacteria are usually classified based on the
type of opines specified by the bacterial T-DNA.
El T-ADN es el sector del plásmido que se transfiere a las células huésped
Esta flanqueado por las secuencias bordes de aproximadamente 25 pb
esenciales para la transferencia
En el T-ADN existen dos regiones, la derecha (TR) y la izquierda (TL)
Ambas codifican para funciones rizogénicas una vez integradas a la célula
huésped
La región TR especifica la síntesis de agropinas y auxinas
Región TL porta cuatro loci que contienen los genes rol (A,B,C y D)
implicados en el desarrollo morfológico de las raíces mediante la
sensibilización de las células al efecto auxínico
El gen rol D induce la formación de tejido de callos mientras que los
genes rol A, B y C regulan el tamaño, grado de ramificación, alteraciones
de tropismo y demás características de las raíces en cabellera
Opinas
Auxinas
Genes Rol A, B, C y D
TL
TR
Región Vir
catabolismo de opinas
Origen de Replicación
Los genes codificados en el TT-DNA presentan secuencias
regulatorias eucarióticas que permiten su expresión en las
plantas infectadas
En la región Ti hay también genes vir cuya transcripción
induce la síntesis de compuestos fenólicos como los que
liberan las plantas mecánicamente injuriadas como las
acetosiringonas..
acetosiringonas
En ausencia de TRTR-DNA los genes del TLTL-DNA dirigen la
diferenciación hacia raíces en cabellera si hay suministro
de auxinas exógenas.
Agrobacterium-host cell recognition
is a two-step process
1.Loosely bound step: acetylated
polysaccharides are synthesized.
2.Strong binding step: bound
bacteria synthesize cellulose
filaments to stabilize the initial
binding, resulting in a tight
association between
Agrobacterium and the host cell.
Plant Receptors are involved in initial binding
n
n
n
Plant vitronectin-like protein
(PVN, 55kDa) was found on the
surface of plant cell. This
protein is probably involved in
initial bacteria/plant cell binding.
PVN is only immunologically
related to animal vitronectin.
Animal vitronectin is an
important component of the
extracellular matrix and is also
an receptor for several bacterial
strains.
Plant signals
n
n
Wounded plants secrete sap with acidic pH (5.0 to 5.8) and a high
content of various phenolic compounds (lignin, flavonoid precursors)
serving as chemical attractants to agrobacteria and stimulants for vir
gene expression
Among these phenolic compounds, acetosyringone (AS) is the most
COCH
effective.
3
H3CO
OCH3
OH
n
n
The plant phenolic compounds stimulate the autophosphorylation of
a transmembrane receptor kinase VirA at its His-474
It in turn transfers its phosphate group to the Asp-52 of the
cytoplasmic VirG protein
3
n
VirG then binds to the vir box
enhancer elements in the
promoters of the virA, virB,
virC, virD, virE and virG
operons, upregulating
transcription.
Plant signals
n
n
Sugars like glucose and galactose also stimulate vir gene expression
when AS is limited or absent
Low opine levels further enhance vir gene expression in the
presence of AS
Structure of the T-DNA
n
n
Although right border
and left border are
required to delimit the
transferred segments,
the T-DNA content
itself has no effect on
the efficiency of
transfer.
Therefore, researchers
replace most of the TDNA with DNA of
interest, making
Agrobacterium a vector
for genetic
transformation of
plants.
Production of T-strand
n
n
n
Every induced Agrobacterium
cell produces one T-strand.
VirD1 and VirD2 are involved
in the initial T-strand
processing, acting as site-and
strand-specific
endonucleases.
After cleavage, VirD2
covalently attaches to the 5’
end of the T-strand
Formation of the T-complex
n
?
n
n
n
n
The T-complex is composed of
at least three components:
one T-strand DNA molecule,
one VirD2 protein,
and around 600 VirE2 proteins
Whether VirE2 associates with
T-strand before or after the
intercellular transport is not
clear.
Formation of the T-complex
n
?
Judging from the size of
the mature T-complex
(13nm in diameter) and
the inner dimension of Tpilus (10nm width), the Tstrand is probably
associated with VirE2 after
intercellular transport.
Plant Nuclear Import
n
n
Because the large size of Tcomplex (50,000 kD, ~13nm in
diameter), the nuclear import
of T-complex requires active
nuclear import.
The T-complex nuclear import
is presumably mediated by the
T-complex proteins, VirD2 and
VirE2. Both of them have
nuclear-localizing activities.
Nuclear Import
n
n
n
VirD2 is imported into the cell
nucleus by a mechanism
conserved between animal, yeast
and plant cells (bipartite
consensus motif).
VirE2 has a plant-specific nuclear
localization mechanism. It does
not localize to the nucleus of yeast
or animal cells.
In host plant cells VirD2 likely
cooperate with cellular factors to
mediate T-complex nuclear import
and integration into the host
genome.
T-DNA integration is not highly
sequence-specific
n
n
There are no obvious site preference for
integration throughout the genome.
About 40% of the integrations are in
genes and more of them are in introns.
Rutas bioosintéticas de fitorreguladores vegetales en el género Agrobacterium
serie octopina
Derivan de Arg
serie nopalina
serie manopinas
Derivan de Glu
serie agropinas
Opinas sintetizadas por plantas infectadas con Agrobacterium rhizogenes
Rol de las opinas
Las opinas son utilizadas como fuente de C y N por el
Agrobacterium pero no por la planta
su síntesis determina una desviación energética del
vegetal en provecho de la bacteria
En muchos casos las opinas son el metabolito más
importante de las células afectadas, constituyendo hasta
un 7 % del peso seco total
En un proceso de infección normal las opinas son
secretadas al suelo y son catabolizadas por los
Agrobacterium de vida libre
Establecimiento de cultivos de raíces transformadas
•Se deben preparar suspensiones de A. rhizogenes de 48 h. de edad cultivado
entre 25-26°C, puesto que a temperaturas mayores de 28°C pueden provocar la
“cura” de la bacteria de su plásmido.
•Acondicionar los explantos a infectar que pueden ser órganos de plantas
silvestres o preferentemente plántulas estériles.
•Provocar cortes con una jeringa hipodérmica conteniendo la suspensión de A.
rhizogenes sobre la superficie de los explantos y cultivar.
•A los 7-14 días, cuando las raíces emergentes tengan de 5-10 mm de longitud,
seccionarlas, separarlas del explanto y colocarlas en medio de cultivo apropiado
(B5, LS o MS de media fuerza (La mitad de la concentración salina) con 30g/l de
sacarosa y 0.5 mg/ml de sulfato de ampicilina).
•Subcultivar cada dos semanas en el mismo medio utilizando inóculos de 3 a 4
cm de longitud con ramificaciones laterales.
•Luego de 8 subcultivos suprimir el agregado de antibiótico al medio.
The growth medium has a significant effect
on hairy root induction.
•High salt media such as LS or MS favors
hairy root formation in some plants but not
in others.
•Low salt media such as B5 favor excessive
bacterial multiplication in the medium and
therefore the explant needs to be
transferred several times to fresh antibiotic
containing medium before incubation.
The bacterial concentration
•Suboptimal concentrations may
result in lower availability of bacteria
for transforming the plant cells
•High concentrations may decrease it
by competitive inhibition
Hairy roots induced from the leaf explants on
growth regulator-free Murashige and Skoog
medium (MS) 20 days after infection by
Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 (scale bar
1.5 cm)
Detection of agropine(A) and mannopine (M) and neutral sugars
(NS) by paper electrophoresis in extract of two hairy root cultures.
Lane 1 agropine and mannopine standards
Lanes 2 and 3 hairy root cultures
Lane 4 non-transformed control roots of sterile plants
,
PCR analysis of hairy roots
PCR was performed with primers for the rooting locus genes rolC
(lanes 1–5) and rolB (lanes 6–11).
Lanes 1–4 and lanes 6–9 fragments from hairy roots
Lanes 5 and 10 fragments from control roots
Lane 11 control without template DNA
Lane 12 marker (1 kb DNA ladder)
These results indicated that the rolB and rolC genes from the Ri plasmid of A.
rhizogenes ATCC15834 were integrated into the genome of P. phaseoloides
hairy roots.
A Sterile hairy roots of Pueraria phaseoloides cultured
on solid, growth regulator-free MS medium for 18 days
(scale bar 2.5 cm).
B Sterile hairy roots in liquid MS medium, cultured for
10 days (scale bar 2.2 cm)
Hairy roots are fast growing and plagiotropic
•They require no external supply of growth hormones
•The plagiotropic characteristic is advantageous as it
increases the aeration in liquid mediumand roots grown
in air have an elevated accumulation of biomass.
Una vez establecidos los cultivos de raíces transformadas se
pueden desarrollar a partir de pequeños inóculos y obtener
buenos índices de crecimiento.
El principal problema
es el cambio de escala a niveles
industriales ya que la agitación mecánica causa injurias que
conducen a la formación de callos.
En los medios líquidos se forman esferas
de raíces con las raicillas jóvenes en
crecimiento sobre la periferia y un corazón
de tejido viejo en el interior
La restricción nutricional que soporta esta parte interna, principalmente en
lo referido al oxígeno da origen a un “bolsillo” de tejido senescente
Debido a las ramificaciones las raíces forman una matriz que ofrece
resistencia al flujo, siendo el principal problema nuevamente el suministro
de oxígeno.
Producción de metabolitos en cultivos de raíces TRANSFORMADAS
Las principales ventajas de utilizar cultivos de raíces transformadas, en
cabellera o hairy roots para producir metabolitos secundarios en lugar
de cultivos dediferenciados son:
•Con estos sistemas no son necesarios medios suplementados con
fitorreguladores para desarrollar biomasa
•Las raíces transformadas crecen rápidamente, son robustas y
vigorosas
•Sintetizan metabolitos secundarios característicos de las raíces de las
plantas de las cuales provienen
•La síntesis de estos metabolitos se realiza a niveles reproducibles
puesto que, a diferencia de los cultivos de células indiferenciadas, son
genéticamente estables por períodos prolongados de cultivo
•El cultivo masivo de raíces transformadas es sencillo y tiene
potencialidad para desarrollarse en biorreactores, ampliando la
posibilidad de aplicación industrial de estos procedimientos