Comparación del efecto de la administración oral de dos probióticos

Comparación del efecto de la administración oral de dos probióticos

Rev. Ibero-Latinoam. Parasitol. (2010); 69 (1): 60-65
Artículo de Original
Comparación del efecto de la administración
oral de dos probióticos en ratones infestados
con Trichinella spiralis
RANDAZZO V.1, COSTAMAGNA S. R.1
1
Cátedra de Parasitología Clínica, Universidad Nacional del Sur, San Juan 670, 8000 Bahía Blanca, Provincia de
Buenos Aires, Argentina.
ABSTRACT
COMPARISON OF THE EFFECT OF ORAL ADMINISTRATION OF TWO PROBIOTICS ON
TRICHINELLA SPIRALIS INFECTED MICE
The aim of the present work was at determine whether the oral administration of Lactobacillus casei
and Kefir of milk exerts adverse effects on Trichinella spiralis-infected mice. Fifteen BALB/c mice were
divided into three even groups: Control Group “C”, L. casei Treated Group “T1” and of Kefir Treated
Group” “T2”. During seven days before T. spiralis larvae infection, Group “C” was fed with a regular diet,
Group “T1” was fed on a daily basis with a regular diet plus a 5 ml of suspension L. casei and Group “T2”
was fed on a daily basis with a regular diet plus a 5 ml of suspension Kefir. On the eighth day, all Groups
were orally inoculated with infecting T. spiralis larvae. Five days after infection, mice were sacrificed in
order to determine the number of parasites in the intestinal lumen and in the intestinal mucosa. The average
number of recovered adult T. spiralis parasites from the intestinal content was 160,4 in Group “C”, 189
in Group “T1” and 191,4 in Group “T2”, respectively. Significant differences for p < 0.05 were observed
between the three groups analyzed. The average number of recovered females in Group “C” was 95,6 while
in Group “T1” it was 12 and in Group “T2” it was 8,8. Highly significant differences for p < 0.01 were
observed. Results indicate that the oral administration of L. casei and Kefir to mice produces adverse effects
on the penetration of the parasite into the intestinal mucosa, both being equally effective.
Key words: Probiotics, Trichinellosis, Lactobacillus casei, Kefir of milk.
RESUMEN
Una alternativa para la prevención de la trichinellosis es el uso de probióticos. Nuestro objetivo fue
comparar la eficacia protectiva de 2 probióticos frente a la invasión de la mucosa intestinal por Trichinella
spiralis. Se compararon: Lactobacillus casei cepa ATCC 469 y leche fermentada obtenida por actividad de
Recibido: 12 de Diciembre de 2009. Aceptado: 15 de Abril de 2010.
Correspondencia: Viviana Randazzo
E-mail: [email protected]
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EFECTO DE DOS PROBIÓTICOS CONTRA TRICHINELLA SPIRALIS
los gránulos de kéfir. Quince ratones BALB/c se distribuyeron homogéneamente en tres grupos: Control
(C), Tratados con L. casei (T1) y Tratados con kéfir de leche (T2). Siete días previos a la infestación con
larvas de T. spiralis el grupo C fue alimentado con 5 ml de solución fisiológica como placebo, T1 con 5 ml
de suspensión en solución fisiológica de L. casei y T2 con 5 ml de suspensión de kéfir. Al octavo día todos
fueron inoculados oralmente con 800 larvas infestantes de T. spiralis. A los cinco días post-infestación,
los animales se sacrificaron humanitariamente para determinar la carga parasitaria en la luz intestinal y en
mucosa. Los parásitos de la luz intestinal fueron obtenidos por lavado del intestino con formol 5%, y los de
mucosa intestinal, recuperados por digestión enzimática. Se efectuó recuento de parásitos presentes en cada
lugar. Se aplicó ANOVA simple y se compararon las medias de a pares con Diferencia Mínima Significativa
(DMS). El promedio de parásitos obtenidos en contenido intestinal en C fue de 160,4, en T1 de 189 y en
T2 de 191,4, presentándose diferencias significativas para p < 0,05 entre T1 - T2 y C. En la mucosa, el
promedio de parásitos hallados en C fue de 95,6, en T1 de 12 y en T2 de 8,8, presentándose diferencias
altamente significativas entre C y T1 - T2 (p < 0,01), no hallándose diferencias significativas entre ambos
tratamientos (T1 frente a T2). Los resultados demuestran que ambos probióticos, administrados oralmente,
producen un efecto antagónico sobre la penetración del parásito en la mucosa intestinal del hospedador,
siendo ambos igualmente efectivos.
Palabras clave: Probióticos, Trichinellosis, Lactobacillus casei, Kéfir de leche.
INTRODUCCIÓN
La trichinellosis es una zoonosis parasitaria
producida por el nemato Trichinella spiralis. La
provincia de Buenos Aires, y especialmente la
región de Bahía Blanca, son las principales áreas
endémicas de esta enfermedad en Argentina (Bolpe
et al., 1998, Giménez et al., 1998, Costamagna et al.,
2002,). El hombre adquiere la parasitosis al consumir
carne de cerdo o subproductos cárnicos crudos o
inadecuadamente cocidos que contengan larvas
viables de T. spiralis. Las larvas son liberadas en el
intestino gracias a la acción de los jugos digestivos.
Alrededor de 30 horas después de la ingesta, se
desarrollan los adultos: machos y hembras. Luego
de la cópula, los machos son expulsados en la luz
del intestino, mientras que las hembras grávidas
se introducen en la mucosa intestinal liberando
las larvas recién nacidas que alcanzan el torrente
circulatorio, para posteriormente invadir las fibras
musculares esqueléticas.
La ausencia de un tratamiento totalmente
efectivo contra el parásito, alienta la búsqueda de
alternativas para el control de la parasitosis. El uso
de inmunomoduladores (Bautista et al., 1992, Shu
et al., 2001) que incrementan la respuesta inmune
no específica, es una de ellas. Los microorganismos
probióticos son utilizados en la producción de
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productos lácteos fermentados y diversos estudios
los señalan como responsables de acciones
beneficiosas para el organismo humano. Se les
adjudica un rol importante en la prevención de
enfermedades infecciosas de origen gastrointestinal
tanto bacterianas como virales (Spanhaak et al.,
1998, Shu et al., 2001, Teitelbaum y Walker
2002), así como su participación en mecanismos
inmunomoduladores, incrementando la inmunidad
innata, estimulando la actividad de las células
Natural Killer, activando la producción de
citoquinas, desencadenando efectos antitumorales e
induciendo la apoptosis celular (Berezi et al., 2000,
Elenkov et al., 2000, ESPHHAN 2005). Tanto L.
casei como Kéfir de leche son microorganismos
probióticos usados en la producción de productos
lácteos fermentados (Spanhaak et al., 1998, Garrote
et al., 2001, Perdigon et al., 2001). Poco se conoce
de la acción de estos microorganismos frente a
enfermedades parasitarias con puerta de entrada
gastrointestinal.
Estudios previos demostraron que L. casei ejerce
un efecto antagónico en el ingreso a la mucosa
intestinal de las hembras grávidas de T. spiralis
(Manson et al., 1979, Randazzo y Costamagna
2005). En este contexto nuestro objetivo fue
evaluar el efecto de los probióticos L. casei y Kéfir
de leche, en la infestación por T. spiralis en ratones
y comparar la eficacia protectiva de ambos.
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V. RANDAZZO y S. R. COSTAMAGNA
MATERIAL Y MÉTODO
Las experiencias fueron realizadas sobre 15
ratones BALB/c, controlados sanitariamente, obtenidos del Bioterio del Departamento de Biología,
Bioquímica y Farmacia de la Universidad Nacional
del Sur.
La cepa de T. spiralis que se utilizó fue tipificada
por PCR en el Centro Internacional de Referencia,
en Roma (Italia), por el Dr. Edoardo Pozzio.
Los probióticos utilizados fueron el L. casei,
cepa ATCC 469, mantenida en caldo Ellefer y
leche fermentada obtenida por la actividad de
los gránulos de Kéfir. La concentración de las
suspensiones utilizadas para el L. casei fue de 1,9 x
109 ufc/ml de L. casei viables.
Los quince ratones fueron distribuidos al azar
en tres grupos de cinco ratones cada uno: Grupo C
o Grupo Control, Grupo T1 o Grupo Tratado con
L. casei y Grupo T2 o Grupo Tratado con Kéfir de
leche. Al alimento del grupo C se le adicionó 5 ml.
de solución fisiológica estéril a modo de placebo,
durante los siete días previos a la infestación con
larvas de T. spiralis. Al grupo T1 se lo alimentó
diariamente, con 5 ml de suspensión en solución
fisiológica de L. casei 1,9 x 109 ufc/ml, adicionado
a su alimento normal, durante siete días previos a
los desafíos con larvas infestantes de T. spiralis.
El Grupo T2 se alimentó diariamente con 5 ml de
suspensión de leche fermentada obtenida por la
actividad de los gránulos de Kéfir, agregada a su
alimento normal.
Al octavo día todos los grupos (C, T1 y T2)
fueron inoculados vía oral con 800 larvas de T.
spiralis obtenidas por el método de digestión
enzimática artificial (Montali et al., 1997). A
los cinco días post-infestación, los animales se
sacrificaron para determinar la carga de parásitos
adultos presentes en el intestino (machos y hembras
y en la mucosa intestinal (hembras). Los parásitos
intestinales se obtuvieron por lavado del contenido
intestinal con solución fisiológica formolada al
5%, mientras que las hembras de la mucosa, por
digestión enzimática artificial (Bautista et al.,
1995). Se efectuó la cuantificación de machos y
hembras hallados en cada material.
Para estimar la Efectividad Potencial (EP) de
la infestación experimental con T. spiralis, en cada
uno de los grupos, se procedió a contar diariamente
desde la inoculación, las larvas eliminadas por
62
materia fecal, durante los cinco días previos al
sacrificio de los animales.
El EP (%) se calculó como:
EP (%) = (LI-LE) x 100/ LI donde LI = larvas
inoculadas
LE = larvas
eliminadas
Análisis estadístico: Se aplicó ANOVA simple
a cada variable. Luego se compararon las medias
de a pares con Diferencia Mínima Significativa
(DMS) p < 0,05. El Diseño fue completamente
aleatorizado con 5 réplicas por tratamiento.
RESULTADOS
a) Análisis del contenido intestinal: Al realizarse la cuantificación de parásitos hallados, en el
contenido intestinal, luego del lavado con solución
formolada, el número promedio de parásitos adultos de T. spiralis recuperados en el grupo Control C
fue de 160,4.
En el lavado intestinal del grupo de ratones
T1 (Tratados con L. casei), el número promedio
de parásitos adultos recuperados fue de 189. El
número promedio de parásitos hallados en T2
(Tratados con Kéfir) fue de 191,4.
Ambos tratamientos tuvieron medias mayores
que el control (ES = 9,0).
En la Figura 1 se observa el número de parásitos
adultos recuperados en el contenido intestinal en
cada uno de los grupos.
b) Análisis de la digestión de mucosa intestinal:
El número promedio de hembras recuperadas en el
Figura 1. Comparación de Parásitos adultos de
Trichinella spiralis recuperados por lavado de contenido
intestinal 5 días después de la infestación en cada uno de
los grupos.
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EFECTO DE DOS PROBIÓTICOS CONTRA TRICHINELLA SPIRALIS
producto de la digestión enzimática artificial de la
mucosa, en el grupo Control fue de 95,6.
El número promedio de hembras recuperadas
en el grupo T1 (Tratados con L. casei) fue de 12.
El número promedio de hembras halladas en T2
(Tratados con kéfir) fue de 8,8.
Los resultados obtenidos mostraron diferencias
altamente significativas (p << 0,01) entre los
tratamientos C y T1 y T2.
Al comparar los tratamientos con DMS
ambos tratamientos resultaron efectivos respecto
del control (ES = 3,6). En la Figura 2 se observa
el número de hembras recuperadas en mucosa
intestinal en cada uno de los grupos.
c) Porcentaje de penetración: Se definió
porcentaje de penetración como la relación
porcentual entre los parásitos recuperados en
mucosa intestinal respecto del total de parásitos
contabilizados tanto en mucosa como en contenido
intestinal para cada uno de los grupos.
La expresión matemática fue la siguiente:
% = 100 x Pm/ Pm + Pci
Siendo Pm: Parásitos totales recuperados en mucosa intestinal
Pci: Parásitos totales recuperados en contenido intestinal.
El porcentaje de penetración para el grupo C
fue de 37,44%, para T1 de 5,73% y para T2 de
4,40%.
Los resultados obtenidos indicaron diferencias
altamente significativas (p << 0,01) entre el grupo
C y los grupos T1 y T2.
Ambos tratamientos tuvieron menor porcentaje
de penetración respecto del Control (ES = 1,4). Los
resultados se muestran en la Figura 3.
c) Efectividad potencial de la infestación: La
Efectividad potencial fue calculada como:
EP (%) = (LI-LE) x 100/ LI
Donde: LI = 800 y LE = 358, 589, 637
respectivamente.
En la Tabla 1 se muestran los porcentajes de la
Efectividad Potencial de la infestación experimental, hallados con un inóculo de 800 larvas para cada
uno de los grupos. Se puede advertir claramente
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Figura 2. Comparación de parásitos adultos (hembras)
de Trichinella spiralis recuperados en mucosa intestinal,
5 días después de la infestación en cada uno de los grupos.
Figura 3. Porcentaje de penetración de parásitos adultos
de Trichinella spiralis recuperados en contenido y
mucosa intestinal 5 días después de la infestación en cada
uno de los grupos. El Gráfico muestra las diferencias
entre el Grupo C (Control) y los Grupos T1 (Tratado con
L. casei ) y T2 (Tratado con Kéfir).
Tabla 1. Porcentajes de Efectividad Potencial en
infestación experimental con un inóculo de 800 larvas
de Trichinella spiralis, para cada uno de los grupos.
Grupo C (Control) y los Grupos T1 (Tratado con L.
casei) y T2 (Tratado con Kéfir)
Grupo
LE
LI-LE
EP(%)
C
T1
T2
358
589
637
442
211
163
55,2
26,3
20,4
que en la Efectividad potencial de la infestación se
reduce significativamente en los grupos tratados T1
y T2 con respecto al grupo Control C.
Los resultados obtenidos indican que tanto L.
casei viable como la leche fermentada con gránulos
de Kéfir administrado vía oral en ratones durante
siete días previos a la infestación con T. spiralis
promueven una respuesta protectora significativa
(p < 0,01) contra el establecimiento de dicha parasitosis. Los resultados muestran que el porcentaje de
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V. RANDAZZO y S. R. COSTAMAGNA
hembras que penetraron en mucosa intestinal se redujo considerablemente al realizarse el tratamiento
previo con ambos probióticos. Esto indica que el
ciclo evolutivo de T. spiralis se puede obstaculizar
mediante la administración cíclica y continua de L.
casei y Kéfir minimizando la invasión de larvas
al hospedador, resultando ambos probióticos igualmente efectivos.
DISCUSIÓN
Teitelbaum y Walter (2002), definieron a los
probióticos como aquellos productos que contienen
microorganismos viables definidos, en cantidad suficiente para alterar la microflora (por implantación
o colonización) en el intestino ejerciendo efectos
beneficiosos en el hospedador.
Las bacterias más comunes relacionadas
con la actividad probiótica son: Lactobacillus
acidophilus, L. casei, L. reuteri, L. plantarum,
L. casei GG; Bifidobacterium brevis, B. longum,
B. infantis, B. animalis; Streptococcus salivaris
subespecie thermophilus, y algunas variedades
de levaduras como Saccharomyces boulardii. El
Kéfir de leche, proviene de la región del Cáucaso,
y es uno de los productos lácteos acidificados más
antiguos. Para su producción se utiliza el grano
de kéfir que consta de proteínas, polisacáridos y
una mezcla de levaduras y bacterias formadoras
de aromas y ácido láctico. Las bacterias que lo
componen son Lactobacillus brevis, L. kéfir, L. case
y L. paracasei. Las levaduras son Saccharomyces
cerevisiae, S. unisporus y Candida kéfir.
La diferente capacidad de las bacterias ácido
lácticas se manifiesta en su contribución al aporte
vitamínico de la leche fermentada produciendo
un incremento de niacina, tiamina, B6 y ácido
fólico (Spanhaak et al., 1998, Teitelbaum y
Walter 2002). Los mecanismos de acción
implicados incluyen inducción a pH inferior a 4,
inhibición del crecimiento de bacterias patógenas,
producción de ácido láctico, disminución de la
permeabilidad intestinal, aumento en la actividad
de la lactasa, efecto competitivo en otras bacterias
patógenas ocupando sus lugares de nidación (Shu
et al., 2001), incremento en la producción de
los linfocitos T helper (Spanhaak et al., 1998),
y aumento de la inmunoglobulina A secretora
(Perdigon et al., 2001). L. casei, como probiótico,
64
induce mecanismos de acción que influyen y
modulan las respuestas inmunitarias, en parte
mediadas por el tejido linfoide asociado al intestino
(“gut associated lymphoid tissue” [GALT]),
promueve protección inmunitaria mediante la
producción de interferón gama (IFN) e interferón
alfa, y un estímulo de las células T helper (Th) 1,
productoras de citocinas, activación de macrófagos
y procesamiento acelerado de antígenos (Elenkov
et al., 2000, Garrote et al., 2002).
La evidencia del aumento de la resistencia a los
agentes antihelmínticos, y el empeoramiento de las
condiciones socio-económicas crea la necesidad
de buscar nuevas alternativas para la prevención
y el control de las enfermedades parasitarias y en
especial en nuestra región de la trichinellosis.
Nuestros resultados indican que tanto L. casei
como el Kéfir de leche administrados oralmente
ejercen un efecto antagónico sobre la penetración de
parásitos adultos en la mucosa intestinal, suscitando
una respuesta protectora altamente significativa
contra el establecimiento de T. spiralis. El efecto
inmunoprotector se logra con una alimentación
cíclica, prolongada y cercana al momento de la
infestación (Randazzo y Costamagna 2005).
La trichinellosis es una zoonosis parasitaria
que se transmite a través de los alimentos Es un
serio problema para la salud pública como causa
de morbi-mortalidad, en especial en nuestra región, considerada como área endémica (Bolpe y
Caminoa 1998, Costamagna et al., 2002). La falta
de un diagnóstico certero en los alimentos destinados al consumo humano es la causa principal de
esta zoonosis, por lo que es fundamental el conocimiento y la educación como medida primordial
para la prevención. El uso de probióticos juega un
rol importante en la prevención y el tratamiento de
infecciones gastrointestinales de origen bacteriano
y viral (Teitelbaum y Walker 2002), pero poco se
conoce de su acción sobre las enfermedades parasitarias. Los resultados obtenidos indican que tanto
L. casei viable como el kéfir administrados vía oral
en ratones durante siete días previos a la infestación
con T. spiralis promueven una respuesta protectora
significativa (p < 0,01) contra su establecimiento.
Se demostró además que en el contenido intestinal
hubo un aumento significativo de parásitos adultos
eliminados posteriormente por materia fecal, reduciéndose significativamente el porcentaje de hembras que penetraron en mucosa intestinal al reali-
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zarse el tratamiento previo con los probióticos. El
porcentaje de penetrabilidad fue significativamente
menor en los dos grupos tratados con probióticos
con respecto al control. Nuestros resultados demuestran que el ciclo evolutivo de T. spiralis se
puede obstaculizar mediante la administración cíclica y continua de ambos probióticos, ya que reducen la entrada de hembras a la mucosa intestinal
minimizándose la diseminación de las larvas al
torrente circulatorio del hospedador y la posterior
invasión de las fibras musculares.
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