Tesis Irene_28_05_15_Ultima_versión
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PROGRAMA DE DESARROLLO DE LAS CIENCIAS BÁSICAS (PEDECIBA) TESIS DE MAESTRIA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS ORIENTACIÓN: GENÉTICA TÍTULO: Análisis de secuencias del cromosoma X de CHOK1 a partir de la microdisección y secuenciación de Xq Autor: Lic. Irene María da Cruz Guerisoli Orientador: Dr. José Sotelo-Silveira Co-orientador: Dra María Vittoria Di Tomaso Co-orientador: Dr. Gustavo Folle Tribunal: Dra. Cora Chalar Dra. Adriana Mimbacas Dr. Juan Martín Marqués Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (I.I.B.C.E) Facultad de Ciencias – Universidad de la República MONTEVIDEO – URUGUA 1 INDICE AGRADECIMIENTOS .............................................................................. 4 RESUMEN............................................................................................... 5 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................ 7 1.1 La línea celular CHO........................................................................... 7 1.2 El subclon CHOK1 ............................................................................. 7 1.3 El genoma de hámster Chino y CHOK1 ............................................... 9 1.4 El cromosoma X de hámster Chino y CHOK1 .................................... 12 1.5 El brazo largo del cromosoma X de CHOK1....................................... 20 1.6 Problema de investigación ............................................................... 21 2- HIPÓTESIS ...................................................................................... 21 2.1 Objetivo General ................................................................................... 22 2.2 Objetivos Específicos ........................................................................... 22 3. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................... 23 3.1 Aislamiento de Xq CHOK1 ................................................................ 23 3.2 Generación de sonda Xq y FISH en metafases de CHOK1 .................. 25 3.3 Estimación del tamaño del cromosoma X de CHOK1 ......................... 28 3.4 Secuenciación del amplificado de Xq de CHOK1 ............................... 28 3.5 Control de calidad de la biblioteca de lecturas Xq CHOK1.................. 29 3.6 Importación de las lecturas en CLC Genomic Workbench .................. 29 3.7 30 Información de las referencias genómicas de CHOK1 y hámster Chino 3.8 Alineamiento de la biblioteca de Xq al genoma de hámster Chino ...... 32 3.9 Identificación de las secuencias del genoma de CHOK1 que corresponden al cromosoma X ................................................................... 32 3.9.1 Identificación de scaffolds y contigs de CHOK1 homólogos al cromosoma X de hámster Chino ................................................................. 33 3.9.2 Identificación de scaffolds y contigs de Xq de CHOK1 CriGri v1.0 ...... 34 3.10 Localización de marcadores cromosómicos del cromosoma X de hámster Chino en elconjunto de scaffold y contigs para el X de CHOK1. ...... 35 3.11 Identificación de las secuencias de Xq homólogas al cromosoma 5 y 6 de hámster Chino ....................................................................................... 37 3.12 Identificación de Repetidos .............................................................. 37 3.13 Análisis de Rna-seq y descripción de los genes anotados en los scaffolds y contigs del cromosoma X de CHOK1. ........................................ 38 4. RESULTADOS ................................................................................... 40 4.1 Aislamiento, amplificación y especificad de Xq CHOK1 ..................... 40 2 4.2 Secuenciación de Xq de CHOK1, control de la calidad y especificidad de la biblioteca. .......................................................................................... 41 4.3 X hámster Chino vs Xq CHOK1: Control de la especificidad de la biblioteca de Xq ......................................................................................... 45 4.4 Identificación de las secuencias del genoma de CHOK1 que corresponden al cromosoma X ................................................................... 48 4.5 Análisis global de secuencias repetidas en la colección de “scaffolds y contigs” del X de CHOK1 ............................................................................ 58 4.6 Contenido de secuencias génicas en la colección de secuencias del cromosoma X de CHOK1 ............................................................................ 63 5. DISCUSIÓN ................................................................................... 69 5.1 Aislamiento y amplificación del brazo largo Xq de CHOK1. ................ 69 5.2 Obtención de la biblioteca de lecturas de Xq CHOK1 ......................... 70 5.3 Las secuencias de Xq se alinearon, en su mayoría, al cromosoma X de hámster Chino............................................................................................ 71 5.4 Identificación de scaffolds y contigs correspondientes a los brazos largos y cortos del cromosoma X de CHOK1. .............................................. 74 5.5. Diferencias en la composición de ADN repetido entre los brazos Xp y Xq de CHOK1 ............................................................................................. 76 5.6 Identificación de genes en el cromosoma X de CHOK1: análisis de expresión génica ........................................................................................ 77 6. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS .................................................. 79 7. REFERENCIAS .................................................................................. 81 ANEXO I ............................................................................................... 86 3 AGRADECIMIENTOS Gracias a mi orientador Dr. José Sotelo-Silveira por su dedicación, motivación, criterio y por su confianza en mí depositada en el transcurso de la elaboración de la tesis Gracias a mis co-orientadores la Dra. María Vittoria Di Tomaso y el Dr. Gustavo Folle, por la orientación, apoyo entusiasmo y aliento en el proceso de formación. Gracias al tribunal integrado por la Dra. Adriana Mimbacas, Dra. Cora Chalar y Dr. Juan Martín Marqués por el interés mostrado en mi trabajo y por las sugerencias recibidas en mi labor científica. Gracias a mis compañeros del Departamento de Genómica, Vale, Joaca, Andrés Di, Guille, Facu, Andrés I, por el apoyo, las discusiones, el aliento y buena disposición de siempre a colaborar Gracias a los Jefes y a mis compañeros del DPAN, por abrirme las puertas para aprender en las tareas del laboratorio. Gracias a mis compañeros del Departamento de Genética por la colaboración en el proceso de la elaboración de este trabajo Gracias a mis compañeras de la Asociación Española por brindarme apoyo, y contención. Gracias por la comprensión, paciencia y el ánimo recibidos de mi familia, a mi novio y a mis amigos que de alguna manera me brindaron su apoyo incondicional durante esta etapa tan importante para mi vida. Gracias a todos… 4 RESUMEN La línea celular proveniente de ovario de hámster Chino (CHO), es una de las más empleadas en investigación biológica, biomédica y en la producción de proteínas recombinantes con fines terapéuticos. En nuestro laboratorio se determinó que la organización de la cromatina en el único cromosoma X submetacéntrico de CHOK1 presenta características inusuales. El brazo largo Xq presenta en casi su totalidad un patrón de cromatina heterocromático (banda C positivo) lo cual indicaría que este brazo presenta un alto orden de empaquetamiento, alta cantidad de secuencias repetidas en tándem, replicación tardía, poca presencia de genes y baja actividad transcripcional, en contraste con el brazo corto Xp eucromático. El objetivo de esta tesis fue estudiar la composición molecular del cromosoma X de CHOK1 a nivel de su secuencia. Para lograrlo, se combinaron tres aproximaciones de tecnología de avanzada. Primero, se aisló el brazo largo Xq de CHOK1 mediante microdisección LASER UV. Segundo, se amplificaron las pequeñas cantidades de ADN obtenidas mediante procedimientos de alta sensibilidad. Luego el ADN amplificado fue secuenciado por secuenciación masiva. Para estudiar las secuencias obtenidas, se emplearon estrategias bioinformáticas que combinaron análisis comparativos, en base a los genomas de CHOK1 y el X de hámster Chino recientemente publicados. Estos análisis permitieron identificar 1187 scaffolds/contigs que corresponderían al cromosoma X de CHOK1, totalizando 110 MB, que reflejan el 77% del largo estimado para este cromosoma. Adicionalmente, se logró discriminar que 61 scaffolds y contigs corresponderían al brazo Xp, 137, al brazo Xq, presentando homología con el X de hámster Chino y 989, a Xq, no siendo homologos al X de hámster Chino. Este último conjunto presenta un 67,3% de secuencias similares al cromosoma 5 y 6 de hámster Chino. Dichas secuencias se localizarían en el tercio distal de Xq de CHOK1, por debajo de la constricción secundaria. La composición global de ADN repetido de X y Xq no aparenta ser diferente al cromosoma paterno. Sin embargo, en la porción distal a la 5 constricción secundaria de Xq predominan secuencias de ADN satélite y un menor porcentaje de secuencias SINEs con respecto al brazo Xp. Estimamos que la densidad génica en el brazo largo Xq es menor que en el brazo corto Xp. Se identificaron por primera vez genes en Xp y Xq de CHOK1, un bajo número de genes en el extremo distal del brazo largo que presentaría una escasa actividad transcripcional. En suma, se pudo demostrar que la secuenciación de segunda generación de cromosomas microdisecados es factible y puede ser realizada a partir de algunas pocas moléculas de ADN. Al combinar nuestros datos con marcadores previos, se logró mejorar el conocimiento de la estructura del cromosoma X, generando una valiosa información para la construcción de un futuro mapa de este cromosoma, tanto para la línea CHOK1 como para el hámster Chino. Nos planteamos a futuro realizar una secuenciación a mayor profundidad (>30x), empleando una biblioteca con un largo de inserto mayor a la biblioteca estándar paired-end. Esto tendría como ventaja la posibilidad de mejorar el ensamblado de las secuencias de Xq, permitiendo integrar esta información con las secuencias detectadas para Xq de CHOK1. 6 7. REFERENCIAS Albert’s B, Johnson A, Lewis J, et al. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. New York: Garland Science; 2002. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21054/ Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman, DJ. 1990 Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410. Arrighi FE, Hsu TC, Pathak S, Sawada H. 1971. The sex chromosome of the Chinese hamster:constitutive heterochromatin deficient in repetitive DNA sequence. Cytogenet.Cell Genet. 13, pp.268-274. Bahr SM, Borgschulte T, Kayser K, Lin N. 2009. Using microarray technology to select housekeeping genes in Chinese hamster ovary cells. 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