Identificación de Hongos Micorrízicos

Identificación y propagación de hongos micorrízicos
arbusculares en Valle de Bravo, Edo. de Méx.
RESUMEN
En los ecosistemas actuales las plantas han evolucionado junto con los hongos
micorrízicos arbusculares (HMA) durante millones de años. La micorriza
arbuscular es una simbiosis mutualista en la cual las plantas proporcionan
hidratos de carbono a los hongos y estos a su vez los nutrientes minerales
disponibles para la planta como el fosforo y el nitrógeno. En México la diversidad
de HMA ha sido poco estudiada, la mayoría son inventarios de riqueza de especies
en ecosistemas o agroecosistemas. El objetivo de este trabajo fue aislar,
identificar y propagar los hongos micorrízicos arbusculares presentes en la
rizósfera de diferentes plantas en el rancho Valle la Paz, ubicado en el Municipio
de Valle de Bravo. Los géneros que predominan son Scutellospora, Acaulospora,
Gigaspora y Entrophospora.
INTRODUCCIÓN
Los ecosistemas terrestres dependen, en
buena medida de la actividad microbiana del
suelo. Los microorganismos benéficos
intervienen en diversas funciones benéficas
para las plantas con las que se asocian.
Alrededor del 80% de las plantas terrestres
conocidas forman la simbiosis micorrízica
arbuscular (Dickson, 2004). El vocablo
micorriza que significa literalmente “raíz
fungosa”, describe la relación simbiótica con
los sistemas radiculares (Bucher, 2006). Los
hongos endomicorrízicos o arbusculares
penetran, sin matar, a las células de la raíz
estableciendo una membrana para el
intercambio de nutrientes.
Los HMA detentan un gran potencial como
bioprotectores y biofertilizantes (Deepika et
al, 2008). Existen numerosos reportes en
donde se mencionan los beneficios que esta
simbiosis aporta a la planta hospedera, dentro
de los cuales destacan:
a) El HMA tiene prolongaciones conocidas
como hifas que penetran al interior de las
raíces del huésped. Lo anterior conforma una
interface entre el suelo y la planta que
favorece la absorción de nutrientes desde la
solución del suelo, hasta el interior de las
raíces (Sekhara et al, 2007; Toljander et al,
2007; Toussaint et al, 2007; Jurkiewics et al,
2010). El HMA absorbe P, N, K, Zn, Cu, S, Fe,
Mg, Ca y Mn para cederlos posteriormente a
la raíz de la planta hospedera (Sundar et al,
2009).
b) Los hongos micorrízicos incrementan el
área de contacto de la raíz con el suelo,
asegurando la continuidad entre la superficie
OBJETIVO
absorbente radicular y la solución del suelo.
De esta manera se optimiza la interacción del
suelo con las raíces (Jurkiewics et al, 2009;
Sundar et al, 2009).
c) Ante un escenario de estrés hídrico, la
micorriza es capaz de tomar los líquidos aún
bajo este estado de carencia, en contraste con
la incapacidad que se manifestaría por la
planta sin esta simbiosis. Es así que la
simbiosis micorrízica tiene el potencial para
disminuir los efectos nocivos de la sequía y la
salinidad (Giri et al, 2005; Giri et al, 2007)
d) Cuando la planta sufre una lesión en los
foliolos dejando comprometido el sistema
fotosintético y por tanto los fotosintatos, las
vesículas cumplen una función de almacén
cubriendo la carencia de sustancias nutritivas
(Jurkiewics et al, 2010; Deepika et al, 2008).
e) La colonización de hongos micorrízicos
induce un cambio en el microambiente de las
raíces, de tal forma que se modifica el nicho
ecológico de los patógenos que pueden atacar
a la planta hospedera. Además, la
colonización favorece la lignificación de las
raíces incrementando su resistencia, así como
la activación de mecanismos de defensa del
huésped (Pozo y Azcón, 2008).
f) Se reporta la tolerancia a contaminantes a
través
de
la
simbiosis
micorrízica,
disminuyendo la captación de metaloides y la
translocación de los mismos al huésped
(Kapoor et al, 2007).
g) Existen diversos reportes que mencionan
un efecto positivo en el incremento de
metabolitos secundarios en las plantas.
Mismo que representa un alto potencial para
la implementación de esta simbiosis en la
producción de plantas medicinales (Kapoor et
al, 2007; Guerra, 2008).
Identificar, evaluar y propagar hongos
micorrizízicos arbusculares a partir de la
recolección suelo rizosférico de las plantas
medicinales en Valle la Paz, Estado de
México, con miras a implementar un
desarrollo biotecnológico que impacte
significativamente en la calidad y producción
de las plantas medicinales.
METODOLOGIA
Identificación taxonómica
Se tomaron 21 muestras de suelo de las
distintas parcelas productivas, que consistió
en la recolección de 200g de suelo próximo a
las raíces de la planta con una profundidad de
20cm.
Se pesan 100 g de suelo y se agregan a 1 litro
de agua; se mezcla hasta formar una
suspensión y se hace pasar por los tamices de
acuerdo con el método de tamizado húmedo
y decantación (Gerdemann y Nicolson, 1963).
Posteriormente, las esporas se lavaron con
abundante agua para evitar su plasmólisis
(ruptura). La suspensión obtenida se colocó
en una caja de Petri manteniéndose húmeda
para impedir su desecación y mejorar la
observación microscópica.
La identificación de los distintos géneros se
basó en la caracterización morfológica de las
esporas, considerando que algunas de estas
estructuras que son determinantes en su
clasificación. Para dicho fin se realizó el
siguiente
procedimiento
descrito
por
González-Chávez en 1993. Las esporas del
suelo sin aparente daño mecánico, fueron
examinadas al microscopio y mediante agujas
de disección fueron aisladas y seleccionadas
por tamaño, ornamentación, hifa sustentora y
contenido
citoplasmático.
Una
vez
clasificadas las esporas, se fijaron en
preparaciones permanentes. Se colocaron de
20 a 25 esporas intactas en un portaobjetos y
se montan con polivinil-alcohol-ácido láctico
(PVLG).
Una vez terminadas las preparaciones fueron
observadas al microscopio de campo claro,
para realizar mediciones de las esporas. Para
corroborar los hallazgos taxonómicos, se
empleó el método de reacciones químicas de
la pared celular de las esporas, a través del
reactivo de Melzer`s. Finalmente, la
identificación se basó en las claves de
Schenck y Pérez (1990), así como en los
especímenes incluidos en la página web del
INVAM (2008). A partir de las preparaciones,
se tomaron fotografías en campo claro o
Nomarski con el microscopio óptico
(Olympus, Modelo BX5) para observar las
estructuras.
Evaluación
del
porcentaje
colonización de raíces.
de
Dentro de las 21 muestras de suelo que se
realizaron en Valle la Paz, se recolectaron
raíces secundarias a fin de determinar el
porcentaje de colonización. Este es un
indicador del grado de virulencia de las
esporas nativas, así como su afinidad con las
plantas medicinales.
Las raíces son procesadas conforme a la
técnica de Phillips y Hayman, (1970)
mediante el clareo con KOH al 10 %,
acidificación con HCl al 10% y tinción de
raíces con una solución colorante de Azul de
tripano al 0.05 %. Posteriormente eliminar el
colorante y dejar las raíces en una solución de
lactoglicerol. Una vez teñidas, se procederá a
cortar las raíces en segmentos y se montarán
en laminillas utilizando lactoglicerol como
liquido de montaje Se observarán las raíces al
microscopio óptico a 40X de aumento y se
registrará por separado la frecuencia
de las estructuras fúngicas micorrízicas en las
células corticales (arbúsculos, vesículas o
hifas) y segmentos de raíces no colonizadas.
Considerando que solo el 80% de las plantas
forma simbiosis con los HMA, es muy
importante determinar cuál de las plantas
medicinales en Valle la Paz, establece esta
relación simbiótica con el hongo. Es entonces
que el porcentaje de colonización ayuda a
determinar las plantas que son susceptibles
de ser estudiadas bajo la influencia de los
HMA.
Propagación
Una vez identificadas las especies, se
estableció un sistema de propagación a través
del método estandarizado con plantas
trampa.
Las muestras de suelo rizosférico se utilizan
para establecer cultivos trampa con el fin de
propagar los HMA. Los cultivos trampa
utilizando Zea Maiz como hospedante, se
realizaron al colocar una capa de
aproximadamente 150 g del suelo rizosférico
sobre arena estéril contenida en macetas con
capacidad de 1 kg. Esta capa se cubrió con
arena estéril y posteriormente, se procedió a
la siembra de semillas de maíz. Las macetas
fueron irrigadas cada 15 días con 150 mL de
lixiviados. La propagación de los HMA se
realizó durante tres meses, en condiciones de
invernadero cuya temperatura promedio
mínima y máxima fue de 16 y 32 ° C,
respectivamente.
Transcurridos los tres meses se retiró el maíz
de las macetas, colectando raíces secundarias
y una muestra del sustrato a fin de
determinar la esporulación y el porcentaje de
colonización en las raíces.
Una vez extraído el maíz, se procedió a la
siembra de trébol en las macetas,
considerando que esta especie, tiene una
germinación acelerada y que cubre una gran
superficie del subsuelo con raíces tiernas.
DISCUSIÓN
Con los últimos estudios se están develando
patrones de interacción complejos entre las
comunidades de HMA y de plantas, por lo que
es necesario realizar más muestreos en zonas
estratégicas y desarrollar metodologías más
sensibles para la detección de todas las
especies de HMA. Se ha observado que los
patrones poblacionales y la diversidad de los
HMA son fuertemente afectados por varios
factores como: las propiedades del suelo, las
condiciones ambientales, la planta hospedera
y las prácticas agrícolas, en el caso de los
cultivos (Lugo y Cabello, 2002). Aun cuando
la diversidad de los HMA tiene un papel
importante, la abundancia de cada especie
que conforma a un consorcio puede ser
determinante
en
la
promoción
del
crecimiento vegetal (Lovelock et al. 2003).
Sin embargo, no se descarta la posibilidad de
que las especies identificadas de HMA en los
consorcios puedan estar subestimadas debido
a la dificultad de caracterizar aquellas
especies de HMA no esporulantes (Douds &
Millner 1999).
CONCLUSIONES
Se identificaron cuatro grupos taxonómicos
de
hongos
micorrízicos
arbusculares
obtenidos de la rizósfera de plantas
(Scutellospora, Acaulospora, Gigaspora y
Entrophospora).
Este trabajo resalta la necesidad de estudiar la
diversidad autóctona de HMA para usarlos
como inoculantes en la producción comercial
de plantas.
Las esporas muestreadas en suelo presentan
altos índices de latencia, así como baja
viabilidad y parasitismo que dificultan su
propagación.
En las plantas muestreadas en las parcelas de
Valle la Paz, se observa una simbiosis mayor
al 60%.
RESULTADOS
Ide ntificación m orf ológ ica de es p oras nativas p re se nte s e n la p arce la
A5
Escudo
Escudo
Hifa
a
b
Hifa
Hifa
c
d
Pared de la espora
Escudo
e
Fi gur a I: a) Espora de Scutellospora cerradensis, b) Amplificación del escudo de germinación; c ) Espora
de Scutellospora sp; d) Amplificación de la hifa y de la pared de la espora; e) Espora rota de Scutellospora
sp; f) Ampliación del escudo de germinación
Ide ntificación m orf ológ ica de e sp oras nativ as p re se nte s en la Mil pa
a
d
g
b
c
e
f
h
i
Fi gu ra II : a) Acaulospora laevis (objetivo10x); b) Acaulospora laevis (objetivo 40x); c) Scutellospora sp (objetivo 10x); d)
Scutellospora pellucida (objetivo10x); e) Scutellospora pellucida (objetivo 40x); f) Gigaspora sp (objetivo 10x); g)
Entrophospora infrecuens (objetivo 10x); h) Entrophospora infrecuens (objetivo 40x); i) Acaulospora sp (objetivo 10x).
Ide ntificación m orf ológ ica de es p oras nativas p re se nte s e n la m ilp a
(rizós fe ra de frijol )
a
b
c
d
e
f
Fi gu ra I II : a) Scutellospora sp (objetivo 20x); b) Scutellospora aff. calospora (objetivo 10x);
c)
Entrophospora infrecuens (objetivo 10x); d) Entrophospora infrecuens (objetivo 40x); e) Scutellospora sp
(objetivo 10x); f) Scutellospora sp (objetivo 40x).
Ide ntificación m orf ológ ica de es p oras nativas p re se nte s e n la tabl a J4
a
b
c
d
Fi gu ra IV: a) Acaulospora sp (PVLG); b) Acaulospora sp (PVLG+MELZER); c) Acaulospora sp (PVLG); d)
Acaulospora sp (PVLG+MELZER)
Ide ntificación m orf ológ ica de es p oras nativas p re se nte s e n la tabl a J4
a
b
c
Fi gu ra V: a) Acaulospora sp (PVLG); b) Acaulospora sp (PVLG+MELZER); c) Acaulospora sp (PVLG); d)
Acaulospora sp (PVLG+MELZER).
Ide ntificación m orf ológ ica de es p oras nativas p re se nte s e n la tabl a J4
a
b
c
d
Fi gu ra VI: a) Scutellospora aff. cerradensis Acaulospora sp (PVLG); b) Acaulospora sp (PVLG +
MELZER); c) Gigaspora sp (10X); d) Gigaspora sp
Ide ntificación m orf ológ ica de es p oras nativas pr es en tes e n l a tabla J 4
a
b
Fi gu ra VII : a) Gigaspora sp (10X); b) Gigaspora sp (40X)
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