Clonagem molecular - Biologia Molecular e Genética

Clonagem molecular
Tópicos
Significado e objectivos da clonagem molecular
Etapas da clonagem molecular
Sistemas de clonagem em E. coli de fragmentos de diferentes dimensões
Sistemas de clonagem em E. coli de produção de DNA de cadeia simples
Preparação de bibliotecas genómicas
Preparação de bibliotecas de cDNA
Desenvolvimento da clonagem molecular
An Introduction to Genetic Engineering
Definição de clonagem molecular
A clonagem molecular é o processo de construção de moléculas
de DNA recombinante e da sua propagação em hospedeiros
apropriados que possibilitam a selecção do DNA recombinante.
Esta tecnologia permite estudar os genes e os seus produtos, obter
organismos transgénicos e realizar terapia génica.
Expressões utilizadas com o mesmo significado:
clonagem molecular
engenharia genética
manipulação génica
clonagem génica
tecnologia do DNA recombinante
modificação genética
nova genética
Representação esquemática da clonagem molecular
Genetics a molecular approach
Objectivos gerais da clonagem molecular (1)
Recombinant DNA. Principles and Methodologies
Objectivos gerais da clonagem molecular (2)
A clonagem molecular permite isolar e amplificar uma sequência particular de DNA a partir
de uma mistura complexa de fragmentos, porque se formam moléculas de DNA recombinante
independentes que replicam numerosas vezes no hospedeiro.
Papel dos ácidos nucleicos na clonagem molecular
Os ácidos nucleicos são as moléculas centrais da clonagem
molecular:
• O DNA é utilizado como vector de clonagem ou como inserto
• O cDNA, obtido a partir de mRNA, é utilizado como inserto
• DNA e RNA obtidos por clonagem molecular são utilizados como
sondas de hibridação na identificação, quantificação e caracterização
de outros ácidos nucleicos
Principais etapas da clonagem molecular (1)
Construção de DNA recombinante
Transformação
Principais etapas da clonagem molecular (2)
Amplificação
Isolamento de clones de DNA recombinante
Especificação das etapas da clonagem molecular
Preparação do DNA vector
Preparação do DNA dador
Ligação de DNA vector e DNA dador
Selecção do sistema vector/hospedeiro
Introdução de DNA recombinante no hospedeiro
Selecção de clones recombinantes
Identificação de clones recombinantes
Preparação de DNA vector e DNA dador
Preparação de DNA vector
Digestão com enzima(s) de restrição de tipo II
Métodos de produção de fragmentos de DNA dador
Digestão com enzimas de restrição de tipo II
Digestão parcial com DNase I
Quebra mecânica controlada
Síntese enzimática (cDNA, PCR)
Síntese química de oligodesoxirribonucleótidos
Métodos de modificação das extremidades do DNA
Preenchimento parcial de extremidades 3’ recuadas
Preenchimento total de extremidades 3’ recuadas
Remoção de extremidades 3’ projectadas
Adição de linkers
Adição de adaptadores
Adição de caudas de homopolímeros
Desfosforilação
Nomenclatura das enzimas de restrição
Nomenclatura das enzimas:
As enzimas são denominadas por
abreviaturas das estirpes bacterianas a
partir das quais foram isoladas.
A
primeira
letra
maiúscula
corresponde à inicial do nome genérico
e as duas letras minúsculas às inicias
do restritivo específico. A numeração
romana indica a ordem cronológica de
isolamento da enzima na estirpe
produtora.
Exemplo: AluI foi a primeira enzima
de restrição a ser isolada de
Arthrobacter luteus.
As sequências de reconhecimento
são escritas de 5’ → 3’ (pode estar
representada apenas uma das
cadeias) e os locais de clivagem são
indicados por setas.
R. J. Roberts, 1988, Nucl. Acids Res. 16(suppl):271.
Digestão enzimática
As enzimas de restrição catalisam a hidrólise das ligações fosfodiéster do DNA,
originando extremidades 5’P e 3’OH (excepto NciI que origina extremidades 3’P e
5’OH).
A ligação que é clivada está representada a rosa.
Especificidades das enzimas de restrição de tipo II
Tipos de extremidades:
BamHI, EcoRI e XhoI clivam a 5’
do eixo de simetria, originando
extremidades
coesivas,
5’P
projectadas.
HaeIII cliva segundo o eixo de
simetria, originando extremidades
cegas (sem projecções).
HhaI cliva a 3’ do eixo de
simetria, originando extremidades
coesivas, 3’OH projectadas.
As sequências de reconhecimento são, em geral, constituídas por quatro a seis pares de nucleótidos, e
palindrómicas, isto é, quando lidas na mesma orientação em ambas as cadeias, 5’→3’ ou 3’→5’, são
idênticas. A clivagem ocorre dentro da sequência de reconhecimento ou num local próximo.
As setas indicam os locais de corte e os símbolos a verde assinalam o eixo de simetria.
EcoRI e metilase EcoRI
As bactérias que produzem endonucleases de restrição também contêm as enzimas de modificação
correspondentes que metilam bases no local de reconhecimento das endonucleases. A metilase EcoRI
(M.EcoRI) catalisa a adição de um grupo metilo a duas adeninas da sequência reconhecida por EcoRI.
A sequência metilada não é clivada por EcoRI, assegurando que o DNA da célula que produz esta
enzima de restrição não é destruído.
Isosquisómeros
Reconhecem a mesma sequência e clivam nos mesmos locais
AccIII
T↓CCGGA
AGGCC↑T
e
BspE1 T↓CCGGA
AGGCC↑T
Estas enzimas geram extremidades compatíveis com XmaI C↓CCGGG
GGGCC↑C
Reconhecem a mesma sequência e clivam em locais diferentes
Acc65I G↓GTACC
CCATG↑G
e
KpnI
GGTAC↓C
C↑CATGG
XmaI C↓CCGGG
GGGCC↑C
e
SmaI
CCC↓GGG
GGG↑CCC
Reconhecem a mesma sequência e têm sensibilidades diferentes à metilação
DpnII e MboI ↓GATC
CTAG↑
Sau3A1
↓GATC
CTAG↑
DpnI
e
↓Gm6ATC
CTAm6G↑
↓Gm6ATC
CTAm6G↑
Isosquisómeros são enzimas que reconhecem a mesma sequência de nucleótidos.
Métodos de modificação das extremidades do DNA (1)
1. Preenchimento parcial de extremidades 3’ recuadas
dATP
5’_________
OH 3’ dGTP
3’_________TCGA p 5’ →
Hind III
Klenow
5’ _________ AG
OH 3’
3’ _________ TCGA p 5’
dCTP
5’_________
OH 3’ dTTP
3’_________GATC p 5’ →
XbaI
Klenow
5’ _________ CT OH 3’
3’ _________ GATC p 5’
A extremidade Hind III modificada é compatível com a extremidade XbaI modificada
Métodos de modificação das extremidades do DNA (2)
2. Preenchimento total de extremidades 3’ recuadas
dATP
5’_________G
OH 3’ dTTP
5’ _________ GAATT OH3’
3’ _________ CTTAA p 5’
3’_________CTTAA p 5’ →
Klenow
dATP
dCTP
dGTP
5’_________A
OH 3’ dTTP
5’ _________ AAGCT OH 3’
3’ _________ TTCGA p 5’
3’_________TTCGA p 5’ →
Klenow
As extremidades coesivas são convertidas em extremidades cegas
Métodos de modificação das extremidades do DNA (3)
3. Remoção de extremidades 3’ projectadas
As enzimas utilizadas são:
• Polimerase de DNA do fago T4
• Polimerase Klenow
• Nuclease S1
• Nuclease mung bean
As extremidades coesivas são convertidas em extremidades cegas
4. Adição de linkers
↓
AatII GGACGTCC
CCTGCAGG
↑
Linker fosforilado
5’-d (pGGACGTCC) -3’
Linker não fosforilado 5’-d (GGACGTCC) -3’
As extremidades cegas são convertidas em extremidades coesivas
Métodos de modificação das extremidades do DNA (4)
5. Adição de adaptadores
- Adaptador com extremidades coesivas:
XmnI
5’ .......AATTCGAACCCCTTCG...................3’
3’ .....................GCTTGGGGAAGCCTAG.......5’
EcoRI
BamHI
Uma extremidade coesiva é convertida numa extremidade coesiva diferente
- Adaptador com uma extremidade cega:
XmnI
5’ .......AATTCGAACCCCTTCG.......3’
3’ .....................GCTTGGGGAAGCp..........5’
EcoRI
Uma extremidade coesiva é convertida em extremidade cega ou vice-versa
6. Adição de caudas de homopolímeros
As extremidades cegas são convertidas em extremidades coesivas pela
transferase terminal
Métodos de modificação das extremidades do DNA (5)
7. Desfosforilação
Remoção dos grupos 5’P das extremidades do DNA pela
fosfatase alcalina para impedir a recircularização do vector
(aumenta a eficiência de clonagem) ou a ligação intermolecular do
DNA dador, em particular, a ligação de fragmentos de DNA de
regiões genómicas diferentes.
Ligação de DNA vector e DNA dador
Construção de DNA recombinante
Estratégias de ligação de DNA vector e DNA dador
Clonagem não dirigida (DNA vector EcoRI + DNA dador EcoRI)
Clonagem dirigida (DNA vector EcoRI/PstI + DNA dador EcoRI/PstI)
Construção de novos locais de clivagem
Construção de DNA recombinante
A ligase de DNA é a enzima
que liga extremidades 3’
OH e 5’ P adjacentes,
produzindo uma molécula
de DNA recombinante.
Ligação intermolecular do DNA dador e intramolecular do DNA
vector
A
tendência
para
a
circularização de moléculas
individuais é mais acentuada
quando a concentração de
DNA
é
baixa
e
as
possibilidades de colisão
entre diferentes moléculas
com extremidades coesivas
complementares é reduzida.
Selecção do sistema vector/hospedeiro
Vectores procarióticos de clonagem em E. coli
Características dos vectores de clonagem
Tipos de vectores e suas aplicações
Plasmídios
Vectores derivados do fago lambda
Cosmídios
Vectores derivados do fago M13
Fagemídios
Cromossomas artificiais derivados do fago P1 (PACs)
Cromossomas artificiais bacterianos (BACs)
Vectores shuttle
Estirpes de E. coli
Características dos vectores de clonagem
Os vectores de clonagem são moléculas de DNA que permitem
a propagação do inserto no hospedeiro.
Características fundamentais
- São moléculas de DNA de cadeia dupla
- Têm capacidade de replicação autónoma no hospedeiro
- Possuem locais de restrição únicos para clonagem
- Possuem pelo menos uma marca genética de selecção
Características adicionais vantajosas
- Baixa massa molecular
- Mais do que um sistema de selecção
Polylinker ou MCS
Este polylinker inclui uma cópia
dos locais de reconhecimento,
indicados por chavetas, de cada
uma das 10 enzimas de restrição
assinaladas. Está representada
apenas uma cadeia.
Os polylinkers são sintetizados
quimicamente e inseridos nos
vectores de clonagem.
Em condições de reacção
apropriadas, a inserção de um
único fragmento de restrição é
maximizada.
Na clonagem de fragmentos
EcoRI num vector clivado com
EcoRI, são reconstituídos dois
locais
EcoRI
no
DNA
recombinante.
MCS (multiple cloning site) – local múltiplo de clonagem
Vector plasmídico pUC19
A origem de replicação (ori) deriva do plasmídio semelhante a ColE1, pMB1. A porção do gene
lacZ incluída no vector codifica o fragmento amino-terminal da β-galactosidase. O MCS está
inserido de modo a preservar a grelha de leitura e a sua correcta expressão.
Clonagem de DNA num vector plasmídico (1)
Clonagem de DNA num vector plasmídico (2)
Os clones recombinantes são colónias bacterianas.
Ciclo de vida do fago λ
Mapa simplificado do genoma do fago λ
O genoma do fago λ tem cerca de 50 kb. Na extremidade esquerda estão localizados os genes que
codificam as proteínas da cabeça e cauda; os genes que codificam proteínas envolvidas no ciclo lítico
mapeiam na extremidade direita. A região central do genoma pode ser removida ou substituída por
DNA exógeno sem afectar a capacidade de replicação do fago, permitindo a inserção de DNA
exógeno até ≈25 kb.
Encapsidação in vivo de DNA do fago λ
Durante o estádio tardio da infecção fágica formam-se longas
moléculas de DNA, denominadas concâtemeros; estas moléculas
multiméricas consistem de cópias do genoma do fago λ ligadas
pelas extremidades e separadas por locais cos (vermelho).
Figure 7-11. © 2000 by W. H. Freeman and Company.
Encapsidação in vitro de DNA de λ recombinante
Sistema baseado em extractos celulares de duas estirpes de E. coli lisogénicas de fagos λ mutantes.
Proteína E – proteína principal da cápside
Proteína D – proteína secundária da cápside
38-53 kb
Sistema baseado numa única estirpe, E. coli C λ cI857 cos2 Sam7, lisogénica do fago λ mutante
cos2 (deleção de 22 pb de cosN que impede a formação de placas fágicas de DNA endógeno).
Vector λ de inserção
Clonagem de DNA num vector λ de substituição
As enzimas Sau3A e BamHI
geram extremidades coesivas
compatíveis.
Os fagos recombinantes
infectam E. coli, originando
em meio sólido placas fágicas
(clones recombinantes).
Figure 7-12. © 2000 by W. H. Freeman and Company
Cosmídio
O cosmídio é um plasmídio que contém um local cos.
MboI e BamHI geram extremidades coesivas compatíveis
A clonagem em cosmídios conjuga a elevada eficiência de infecção associada à clonagem no fago λ
com a facilidade de manipulação de DNA plasmídico, dado que o DNA recombinante replica
como um plasmídio.
Clonagem de DNA num cosmídio
Da infecção de E. coli com
os viriões recombinantes
resultariam quatro tipos
diferentes de colónias,
embora esteja representada
apenas uma.
Figure 7-16. © 2000 by W. H. Freeman and Company
Características do fago M13
- M13 é um fago filamentoso
- Tem um genoma circular de DNA de cadeia simples (cadeia +) de 6,4 kb
- Infecta E. coli F’
- O ciclo de vida permite a sua utilização como vector de clonagem
- As partículas virais são libertadas no meio de cultura sem lise de E. coli (≈ 200
partículas/célula/geração)
- Forma placas fágicas análogas às do fago λ
- 90% do genoma codifica proteínas indispensáveis à realização do ciclo de vida
Características dos vectores M13 (série mp)
- É utilizada a forma replicativa (RF) do DNA vector
- O DNA recombinante é introduzido por transformação em células de E. coli F’
- Existem dois tipos de vector com o polylinker nas duas orientações
- Adjacente ao polylinker está clonada a região 5’ do operão lac
- A selecção de recombinantes é baseada na α-complementação
- O DNA recombinante de cadeia simples é extraído das partículas fágicas e
utilizado como molde para sequenciação, na obtenção de sondas de hibridação
e em mutagénese sítio-dirigida
- A capacidade de clonagem oscila entre 300-400 nucleótidos (sequências
clonadas maiores do que 1000 nucleótidos são instáveis, originando deleções
durante a propagação dos fagos)
Clonagem de DNA num vector M13
Transformação
RF – Forma replicativa, de cadeia dupla
Clonagem de DNA num fagemídio
O fagemídio é um vector híbrido que
possui uma origem de replicação
plasmídica e uma origem de
replicação fágica (M13, f1).
Capacidade de clonagem dos vectores de E. coli
Tipo de vector
DNA clonado (kb)
Plasmídio
Fago λ
Cosmídio
PAC (cromossoma artificial derivado do fago P1)
BAC (cromossoma artificial bacteriano)
10
25
45
100
300
Vector shuttle
Genótipos de estirpes de E. coli
All genes in the bacterium are presumed to be in the wild-type state, except for those
listed, which are mutant alleles carried by that bacterium. Genes listed on the F’
episome, however, represent wild-type alleles unless specified otherwise. Strains are λunless specified otherwise.
BL21(DE3) F-, ompT, hsdSB, (rB-, mB-), dcm, gal, λ(DE3)
BL21(DE3)pLysS F-, ompT, hsdSB, (rB-, mB-), dcm, gal, λ(DE3), pLysS (Cmr)
DH5α φ8OdlacZ∆M15, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdRl7 (rK-, mK+), supE44, relA1,
deoR, ∆(lacZYA-argF)U169
Significado das marcas genéticas de estirpes de E. coli (1)
Symbol
Description
Effect
dam
Adenine methylase mutation
Blocks methylation of adenine residues in the
sequence 5’…GmATC…3’.
dcm
Cytosine methylase mutation
Blocks methylation of cytosine in the sequence
5’…CmCAGG...3’or 5’...CmCTGG...3’.
endA1
Endonuclease mutation
Improves quality of plasmid DNA isolations.
hsdR (rK- , mK+)
Restriction minus, modification positive
Allows cloning without cleavage of transformed
DNA by endogenous restriction endonucleases.
DNA prepared from this strain can be used to
transform rK+ E. coli strains.
hsdS20 (rB-, mB-) Restriction minus, modification minus
lacIq
Allows cloning without cleavage of transformed
DNA by endogenous restriction endonucleases.
DNA prepared from this strain is unmethylated by
the hsdS2O melhylases.
Overproduction of the lac repressor protein Leads to high levels of the lac repressor protein,
inhibiting transcription from the lac promoter.
Significado das marcas genéticas de estirpes de E. coli (2)
Symbol
Description
Effect
lon
Deletion of lon protease
Reduces proteolysis of expressed fusion proteins.
mcrA
Mutation in restriction system
Blocks restriction of DNA methylated at the sequence
5’..GmCGC.,3’.
mcrB
Mutation in restriction system
Blocks restriction of DNA methylated at the sequence
5’..AGm CT. .3’.
ompT
Mutation of protease VII,
an outer membrane protein
Reduces proteolysis of expressed fusion protein.
P2
P2 bacteriophage lysogen present in host
λ phages containing the red and gam genes of λ are
growth inhibited by P2 lysogens .
recA1, recAl3
Mutation in recombination
Prevents recombination of introduced DNA with host
DNA, ensuring stability of inserts. Inserts are more
stable in recAl than recAl3 hosts.
Características do hospedeiro do fago M13
GENOMA: ∆(lac-proAB)[F’ traD36, proAB, lacIqlacZ∆M15]
∆ (lac-proAB)
Deleção cromossómica de um segmento de DNA que inclui o operão lac e os
genes vizinhos que codificam enzimas envolvidas na biossíntese da prolina.
proAB
Genes proAB existentes no epissoma F’, podendo complementar a auxotrofia para
a prolina do hospedeiro ∆(lac-proAB). A manutenção de F’ no hospedeiro tem
que ser garantida isolando a estirpe em MM/Glu.
lacZ∆M15
Deleção parcial no gene lacZ, correspondente aos aa 11-41 da β-galactosidase.
Permite a α-complementação.
traD36
Mutaçäo no factor de transferência que evita a transferência do epissoma F’ (por
conjugacäo).
Métodos de introdução de DNA no hospedeiro (1)
Transformação bacteriana
Transfecção
Electroporação
Microinjecção
Bombardeamento com microprojécteis
Infecção viral
Métodos de introdução de DNA no hospedeiro (2)
Métodos de selecção de clones recombinantes (1)
Selecção indirecta
Inactivação de genes de resistência a antibióticos
Selecção directa
Gene lacZ
Selecção pela cor - α-complementação
Fenótipo Spi-
Métodos de selecção de clones recombinantes (2)
A inserção de DNA em pBR322 é detectada por inactivação de um gene de resistência a um
antibiótico (tetR), indicada pelo fenótipo sensível TetS. Em pUC18 ocorre inactivação da βgalactosidase (lacZ’), resultando na incapacidade de converter o substrato artificial X-Gal num
corante azul.
Métodos de identificação de clones recombinantes
Análise do padrão de restrição
Sequenciação de DNA
Hibridação de ácidos nucleicos
Complementação génica de estirpes mutantes
PCR
Análise de produtos génicos (reconhecimento imunológico)
Identificação do clone recombinante relevante
Análise do padrão de restrição
Identificação de clones com fragmentos de DNA inseridos em orientações opostas.
Identificação de clones recombinantes por hibridação de colónias
Identificação de clones recombinantes por hibridação de placas fágicas
Hibridação Southern
Construção de sondas degeneradas
Uma curta sequência de aminoácidos da proteína relevante é utilizada para construir um conjunto de
sondas oligonucleotídicas que servem para identificar o gene que codifica a proteína. Uma das sondas
do conjunto de sondas degeneradas terá um emparelhamento perfeito com o gene.
Figure 12-11. From H. Lodish, D. Baltimore, A. Berk, S. L. Zipursky, P. Matsudaira, and J. Darnell, Molecular Cell Biology, 3d ed. Copyright ©
1995 by Scientific American Books, Inc..
Triagem de bibliotecas YAC por PCR
Identificação de clones recombinantes com anticorpos
Figure 12-12. Recombinant DNA, 2d ed. Copyright © 1992
Estratégias de clonagem
Bibliotecas genómicas
Chromosome walking
Bibliotecas de cDNA
Preparação de uma biblioteca de DNA genómico
A digestão enzimática parcial do DNA dador origina fragmentos sobreponíveis, isto é,
com sequências de DNA comuns.
Chromosome walking (1)
Esta técnica é utilizada para isolar fragmentos de DNA sobreponíveis partindo de um
fragmento de DNA previamente clonado que mapeia próximo do gene de interesse
(representado a vermelho), permitindo identificar o clone que contém o gene.
Figure 12-15. From J. D. Watson et al., 1992, Recombinant DNA, 2d ed., W. H. Freeman and Company, p. 128.
Chromosome walking (2)
Neste exemplo, os fragmentos de DNA cromossómico estão clonados no fago λ.
O clone inicial da biblioteca genómica, representado a verde, é utilizado como sonda na triagem de
sequências sobreponíveis presentes noutros clones da biblioteca.
O walk é conduzido em ambas as direcções, dado que em geral não se sabe a que distância o gene de
interesse está do clone inicial, ou se está para a esquerda ou para a direita. Para simplificar está
representado um walk unidireccional.
Os clones isolados no walk são utilizados como sondas em hibridações Southern com DNA genómico
de mutantes. Esta análise permite detectar deleções cromossómicas e rearranjos no DNA, mas
normalmente não detecta mutações pontuais, a não ser que alterem as sequências reconhecidas pelas
enzimas de restrição utilizadas na análise. Deste modo, o clone de DNA contendo a região
correspondente ao gene de interesse é identificado.
Normalmente, um walk envolve mais do que as três etapas representadas na figura. Nalguns casos,
parte do gene pretendido pode já estar clonado, sendo o walking de DNA necessário para isolar o gene
completo.
Iniciar walks em paralelo a partir de vários clones diferentes (estes walks serão eventualmente ligados),
acelera o processo de isolamento de clones sobreponíveis em longas extensões contíguas de DNA.
Isolamento de mRNA (1)
Isolamento de mRNA (2)
A cromatografia de afinidade em coluna oligo-dT é utilizada no isolamento de mRNA
eucariótico.
O RNA citoplásmico é constituído fundamentalmente por RNAs ribossómicos (rRNAs) e RNAs de
transferência (tRNAs). Os RNAs mensageiros (mRNAs), são muito menos abundantes, mas têm
caudas poli-A que hibridam com oligo-dTs covalentemente ligados à matriz da coluna.
Após hibridação, os rRNAs e tRNAs são removidos da coluna por lavagem, sendo os mRNAs
depois eluídos com um tampão de baixa concentração salina.
A preparação de mRNA purificado resultante contém muitas moléculas de mRNA diferentes que
codificam diferentes proteínas.
Preparação de cDNA (1)
Para se obter uma representação mais normal das
sequências, em vez do primer oligo(dT), são
utilizadas misturas de primers oligonucleotídicos
aleatórios.
Preparação de cDNA (2)
Preparação de uma biblioteca de cDNA num vector λ (1)
Preparação de uma biblioteca de cDNA num vector λ (2)
Uma mistura de mRNAs é utilizada para produzir cDNAs correspondentes a todos os mRNAs
celulares (etapas 1 a 3).
Os cDNAs de cadeia simples (verde claro) são depois convertidos em cDNAs de cadeia dupla,
que são tratados com metilase EcoRI para impedir posterior digestão com EcoRI (etapas 4 a 6).
Os cDNAs de cadeia dupla previamente protegidos são ligados a linkers EcoRI de cadeia dupla
sintéticos, em ambas as extremidades, e depois clivados com a enzima de restrição
correspondente, produzindo cDNAs com extremidades coesivas (letras vermelhas).
Os cDNAs com extremidades coesivas são inseridos em vectores λ de clonagem, e os viriões
recombinantes resultantes são utilizados para infectar E. coli que é depois plaqueada em meio
sólido nutritivo (etapas 7 a 9).
Obtenção de clones genómicos e de cDNA por PCR e RT-PCR (1)
Obtenção de clones genómicos e de cDNA por PCR e RT-PCR (2)
(A) Os clones genómicos podem ser obtidos por PCR a partir de DNA cromossómico extraído
das células. São adicionados primers que ladeiam a região de DNA que se pretende clonar, sendo
amplificado apenas o DNA entre os primers (incluindo os primers). Esta técnica permite obter
selectivamente uma curta extensão de DNA cromossómico.
(B) Os clones de cDNA podem ser obtidos por RT-PCR a partir de mRNA extraído das células, e
purificado por cromatografia de afinidade em coluna oligo-dT. O primeiro primer (oligo-dT) é
depois adicionado à população de mRNAs, sendo utilizada a transcritase reversa para produzir a
cadeia de cDNA complementar.
Após adição do segundo primer, a molécula de DNA de cadeia simples é amplificada através de
muitos ciclos de PCR, originando cDNA de cadeia dupla.
Em ambos os tipos de clonagem, a sequência de nucleótidos de pelo menos parte da região
que se pretende clonar deve ser previamente conhecida.
Diferenças entre clones de DNA genómico e clones de cDNA (1)