PAPEL CRUCIAL DE RECEPTORES CANNABINOIDES CB2 EN LA

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PAPEL CRUCIAL DE RECEPTORES CANNABINOIDES CB2 EN LA REGULACIÓN DE RESPUESTAS INMUNES CENTRALES DURANTE EL DOLOR NEUROPÁTICO REVISIÓN MCCR Desde que se descubrió en la modernidad el uso médico de los cannabinoides, el uso de estos para
tratamientos ha aumentado.
En este estudio se examinó el dolor neuropático, ya que es una lesión en el nervio muy difícil de
tratar, inclusive con analgésicos potentes. Sin embargo, sabiendo el poder del CBD, aquí hemos
utilizado diferentes tipos de ratones modificados genéticamente para aclarar el papel que tienen los
receptores CB2 en la regulación de las respuestas inmunes centrales que conducen al dolor
neuropático. Durante los estudios, los ratones CB2 y los ratones tipo salvaje, fueron expuestos a la
lesión del nervio ciático, ambos desarrollaron una hiperalgesia y alodinia similar. Lo curioso es que
los ratones CB2 desarrollaron un reflejo de dolor colateral, asociado a un aumento de la microglia y
la expresión astrocítica en el cuerno espinal contralateral.
Las mejoradas manifestaciones de dolor neuropático se replicaron en ratones de tipo salvaje, con
células de la medula ósea de ratones CB2, demostrando así que la implicación de los receptores CB2
se expresa en células hematopoyéticas en el desarrollo del dolor neuropático en la medula espinal.
Estos resultados demuestras el papel clave que tiene el receptor CB2 en la modulación de la
activación de la glía en respuesta a la lesión del nervio, llegando a la conclusión de los agonistas
cannabinoides CB2 podrían representar un nuevo grupo de agentes farmacológicos para el
tratamiento del dolor neuropático.
RESUMEN ABSTRACTO El dolor neuropático es una manifestación clínica de la lesión del nervio difícil de tratar incluso con
compuestos analgésicos potentes. Aquí, hemos utilizado diferentes líneas de ratones modificados
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Este documento es solo para fines educativos y uso no comercial. Más información en
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genéticamente para aclarar el papel desempeñado por los receptores cannabinoides CB2 en la
regulación de las respuestas inmunes centrales que conducen al desarrollo del dolor neuropático.
Los ratones CB2 y los compañeros de camada de tipo salvaje fueron expuestos a la lesión del nervio
ciático, y ambos genotipos desarrollaron una hiperalgesia y alodinia similar en la pata ipsilateral. Lo
más sorprendente es que los ratones CB2 también desarrollaron un reflejo de dolor contralateral,
asociado a un aumento de la microglia y la expresión astrocítica en el cuerno espinal contralateral.
De acuerdo a esto, la hiperalgesia, alodinia, y microglial y la activación astrocítica inducida por la
lesión del nervio ciático se atenuaron en los receptores de ratones transgénicos sobre expresando
CB2. Estos resultados demuestran el papel del receptor CB2 cannabinoide, crucial en la modulación
de la activación de la glía en respuesta a la lesión del nervio. Las mejoradas manifestaciones de
dolor neuropático se replicaron en ratones de tipo salvaje irradiadas reconstituidos con células de la
médula ósea de los ratones CB2, demostrando de este modo la implicación de los receptores CB2 se
expresan en células hematopoyéticas en el desarrollo del dolor neuropático en la médula espinal.
INTRODUCCIÓN El interés en el uso médico de los cannabinoides ligados ha aumentado considerablemente en los
últimos años. Dos receptores de cannabinoides, CB1 y CB2, se han estudiado ampliamente para
aclarar su participación en varias situaciones fisiopatológicas en la que los cannabinoides ligados
podrían ser agentes terapéuticos potenciales, incluyendo el tratamiento del dolor. En efecto, los
derivados del cannabis se han utilizado durante siglos como compuestos analgésico, y agonistas de
cannabinoides se han reportado para ser eficaz en varios modelos animales de dolor agudo y
crónico (Pertwee, 2001). Sin embargo, los efectos psicoactivos de estos agonistas podrían
representar una seria limitación para su uso clínico. Los receptores CB1, ubicados principalmente en
el sistema nervioso central (Tsou et al., 1998)
Curiosamente, la activación de los receptores CB1 expresados en los nociceptores periféricos, pero
no en el SNC atenúa el dolor neuropático en roedores (agar-Wal et al., 2007). La identificación de los
receptores CB2 en las células gliales (Zhangetal., 2003;. Beltramoetal, 2006) ha abierto nuevas
aproximaciones terapéuticas para estos receptores ligados. CB2 ha sido también propuesto para
estar presentes en las neuronas (Van Sickle et al, 2005.).
En la médula espinal, la expresión del receptor CB2 se indujo durante el dolor neuropático
producido por lesión del nervio periférico en paralelo con la expresión simultánea de microglia
activada (Zhang et al., 2003). La microglia parece estar implicado en el desarrollo del dolor
neuropático a través de la liberación de varias citocinas, que son conocidos para producir
sensibilización de las neuronas en la espina dorsal (De Leoand Yezierski, 2001;. Clarketal, 2007). Los
CB2 agonistas inducen efectos analgésicos en modelos de dolor neuropático (Ibrahimetal., 2003).
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MATERIALES Y MÉTODOS ANIMALES EN CONDICIONES EXPERIMENTALES. Los animales fueron alojados en grupos de tres a cinco y tuvieron acceso a agua y a los
alimentos. Las condiciones de vivienda se mantuvieron a 21° C y una humedad relativa del 55 al 10%
en un ciclo de luz / oscuridad controlado (luz encendida 08 a.m.-8:00 PM). Se llevaron a cabo todos
los procedimientos y la cría de animales de experimentación de acuerdo con las normas éticas
estándar (Comunidad Europea orientaciones sobre el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio
86/609/CEE) y aprobado por el comité de ética local (Ético de Animales Experimentales Comité ‘ Instituto Municipal de Asistencia Sanitaria / Universidad Pompeu Fabra, Bezirksregierung Ko ¨
ln). Todos los experimentos se realizaron bajo condiciones ciegas. Con ratones de 3 meses de edad
y un peso de 23-29 g, fueron utilizados.
CONSTRUCTOS DE PLÁSMIDO Y GENERACIÓN DE RATONES TRANSGÉNICOS QUE SOBRE EXPRESAN CB2 La lectura abierta de los receptores CB2 murinos se aislaron mediante la amplificación de PCR de
ARNm del cerebro de los ratones, usando cebadores que crean un sitio de enzima de restricción
XhoI adyacente a la translación inicial y final de los sitios. El vector de expresión MoPrP.Xho (Watkins
et al., 2003) se utilizó para la producción de ratones transgénicos. Este vector contiene el promotor
murino de PrP, exón 1, intrón 1, el exón 2, y 3 secuencias no trasladadas. El receptor CB2 ORF se
clonó en el exón 2 de MoPrP.Xho (Watkins et al., 2003). El transgén de PrP-CB2 se escindió del vector
de plásmido con la endonucleasa de restricción NotI que conduce a fragmentos de ADN de 12
kb. Fundadores transgénicos se cruzaron con los ratones CD-1 durante siete generaciones. La
presencia del transgen fue determinada por PCR usando cebadores específicos de nuevo exón 2 de
la PrP (5-CCAGC-CTCCACCACCATGTGGC) y del receptor CB2 (5-AGCCACCGTTG-GAGCCGTTG).
ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DEL ARNM DE CB2 POR PCR EN TIEMPO REAL. Los ratones fueron asesinados por dislocación cervical. Secciones del cerebro y cervical y torácica de
la médula espinal se retiraron rápidamente, se colocaron en un lugar fresco/congelado y
almacenado inmediatamente a -80 ° C hasta su uso. Las secciones del cerebro se redujeron a 500
um en diferentes niveles que contienen las regiones de interés: tálamo y materia gris periacueductal
(PAG). Estas secciones se obtuvieron de acuerdo con Paxinos y Franklin (2001), montadas en
portaobjetos, y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. Secciones fueron disecadas siguiendo el
método descrito por Palkovits (1983). Después de la digestión con DNasa, se realizó la transcripción
inversa siguiendo las instrucciones del fabricante de Epicentro Technologies Corporation. PCR
cuantitativa se realizó en tres repeticiones utilizando un Rotorgene 3000 Tiempo real termociclador
(Corbett Research) y SYBR Green (Invitrogen) como un ADN específico fluorescente de doble cadena
(Gutiérrez-Ada’netal., 2004). Los cebadores para la cuantificación transgénica fueron los mismos
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como se describieron anteriormente. Los cebadores para la cuantificación de la expresión de CB2
endógena fueron 5′-TCTGGAAAGCC-CACCGGCATGTAG y 5′-CAAGGCACAGCATGGAACAGAAGG. El
método comparativo CT se utiliza para la cuantificación de los niveles de expresión (Gutiérrez-Ada’n
et al., 2004). Un ADNc de GADPH se utilizó como control de la formalización para asegurar los
niveles de GADPH constantes en todas las muestras independiente-mente de las condiciones
experimentales.
GENERACIÓN DE LA MÉDULA ÓSEA DE RATONES QUIMÉRICOS. Las células de médula ósea (BM) se cosecharon por lavado de tibias y fémures de 6 – a 8-semanas
de edad CB2 + / + o CB2-/ – ratones donantes masculinos con PBS. Los animales recibieron por vía
intraperitoneal 150 mg / kg de amoxicilina y 15 mg / kg clavulánico en un volumen de 0,1 ml/10 g
durante 10 d a partir del día de la transferencia. Después de 8 semanas de injerto, la eficiencia de la
reconstitución se evaluó mediante análisis de citometría de flujo de linfocitos de sangre periférica
(PBL). A todos los ratones se les extrajo sangre de la vena de la cola y los PBL se analizaron
mediante citometría de flujo (FACS Canto de flujo de Cy-Tometer; BD Biosciences; software de
análisis de FlowJo; árbol estrella) con anticuerpos monoclonales contra CD45.1 y CD45.2 (BD
Biosciences) para determinar el grado de quimerismo. Sólo los ratones BM-quiméricos que
mostraron> 93% de eficiencia de la reconstitución con células de donante fueron elegidos para los
experimentos. CB2 + / + ratones reconstituidos con CB2 + / + BM se denominan como quimera-WT,
y CB2 + / + y a los animales reconstruidos con CB2-/ – BM se conocen como quimera-CB2.
PREPARACIÓN DE LA MICROGLIA. Los cerebros y las médulas espinales fueron retirados de los ratones perfundidos, y una sola célula
de suspensiones fue generado y filtrada a través de un filtro de células de 100 um. Gradientes de
Percoll de 30/37/70% se llevaron a cabo para el fraccionamiento de las células a 1000 x g durante 30
min, y las células mononucleares de cerebro se recogieron de la interfaz.
EXPERIMENTOS CONDUCTUALES. Los estímulos mecánicos (modelo de estimulación von Frey) se utilizaron como medidas del
resultado de dolor neuropático. En la prueba plantar, la pata media con latencias de abstinencia
para las patas traseras laterales y contralaterales se determinaron a partir de la media de tres
ensayos separados, tomada en intervalos de 5 min para prevenir la sensibilización Térmica y
alteraciones del comportamiento usando un aparato disponible comercialmente (Ugo Basile
Biológica Aparato de Investigación) (Har-greavesetal., 1988).
En una primera secuencia experimental, CB2-/ – fueron utilizados (16 machos más 16 hembras) y
CB2 + / + (16 machos más 15 hembras). En el segundo estudio, se utilizaron ratones transgénicos
que sobre expresan los receptores CB2 (12 machos más 12 hembras) y CB2 + / + (12 hombres,
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además de 12 hembras). Por último, CB2-/ – fueron evaluados (10 machos), CB2 + / + (10 machos),
quimera-CB2 (12 machos), y la quimera-WT (10 hembras) ratones. Los ratones se habituaron
primero durante 1 hora para cada prueba experimental diferente una vez al día durante 4
d. Después del periodo de habituación, se establecieron las respuestas de línea de base durante 2
días consecutivos para cada paradigma en la siguiente secuencia: modelo de von Frey, prueba
plantar (30 minutos más tarde), y las pruebas en frío (15 minutos más tarde). Todas las pruebas de
comportamiento se realizaron en el mismo grupo de animales. Un día después de las mediciones
iniciales de la lesión del nervio ciático fue inducida. La ligadura parcial del nervio ciático a nivel de la
mitad del muslo justo próximo a la trifurcación se formó con una ligadura del muslo utilizando un
hilo de seda 9-0 para inducir el dolor neuropático, como se ha descrito previamente (Malmberg y
Basbaum, 1998). Los ratones CB2 -/- y CB2 +/+ se ensayaron en cada paradigma en los días 3, 6, 8,
10, y 15 después de la intervención quirúrgica utilizando la misma secuencia que para las
respuestas de línea de base. Los datos se compararon cada día experimental utilizando un ANOVA
de dos vías (cirugía y el genotipo como entre-grupo de factores) seguido por ANOVA de una vía
correspondiente cuando sea apropiado.
INMUNOHISTOQUÍMICA Al final del experimento de comportamiento, de tres a cinco ratones por grupo fueron
profundamente anestesiados con ketamina / xilazina (50/10 mg / kg) y después intracardialmente
perfusos con fosfato heparinizada-phatebuffer (PB), seguido de 4% de paraformaldehído lumbar. La
región de la médula espinal se ha retirado, se fijaron posteriormente en paraformaldehído a lo 4%
durante 2 h, y crio preservados en solución de sacarosa al 15% a 4 º C. Se seleccionó la sección de L2
a L6-S1 de la médula espinal y luego embebido en OCT, seleccionado en 25 um secciones sobre
acryostat, y montado seis secciones por ratones y dos ratones por diapositiva en diapositivas
heladas recubiertas.
Los portaobjetos se incubaron en anticuerpos policlonales Iba1 (1:200; Wako Chemicals) para la
tinción de la microglia o anticuerpo policlonal GFAP (1:1000; Dako) para la tinción de astrocitos a 4 °
C durante la noche. Los ensayos inmunohistoquímicos fueron seguidos por incubación en el
anticuerpo de conejo anti-CY3 secundario (1:500; Jackson Immunoresearch) para Iba1 o GFAP
durante 1 h a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con PB 0,1 M, los portaobjetos se
montaron con Mowiol.
TINCIÓN CB2. Las médulas espinales se eliminaron y se congelaron en hielo seco y sin perfusión anterior. Ellos se
seccionaron en un criostato a 20 um de espesor y se montaron en portaobjetos de vidrio. Los
tejidos se fijaron durante 30 min en formaldehído al 4% disuelto en PBS 0,1 M, pH 7,3. A
continuación, los portaobjetos se incubaron durante 15 min en 0,3% de H2O2, durante 60 min en
0,5% Triton X-100 y durante 2 h en 3% de BSA. Los portaobjetos se lavaron en PBS por lo menos dos
veces durante 5 min entre cada fase de incubación. Las secciones se marcaron a 4 º C durante 20 h
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utilizando un anticuerpo policlonal de conejo CB2 primario (1:1000; Abcam), para la tinción de la
microglia con Iba1 anticuerpo primario policlonal (1:200; Wako Chemicals), para la tinción con
anticuerpo policlonal de astrocitos GFAP primaria anticuerpos (1:1000; Dako), y para la tinción de las
neuronas con fluoresceína conjugada Neu-N (1:500; Millipore Bioscience Investigación Reactivos)
anticuerpo primario.
La doble tinción para los receptores CB2 y para la microglia o astrocitos utilizando un anticuerpo
secundario de la misma anfitrión fue formado por utilizando el método de To’th y Mezey
(2007). Brevemente, después de que los receptores CB2, el proceso fue seguido mediante el uso de
un sistema de amplificación de señal de tiramida. Los portaobjetos se incubaron durante 30 min en
estreptavidina-HRP (1:200) dissolvedin TNB (Tris 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, reactivo de bloqueo
0,5%). Las secciones se lavaron tres veces durante 5 min y se incubaron en fluoróforo de tiramida
(1:100 en reactivo de amplificación) por 6-9min. Los portaobjetos se lavaron en PBS (tres veces
durante 5 min), y se fijaron de nuevo durante 15 minutos en 4% de paraformaldehído. Después de
lavar en PBS (3 veces en 10min), el ensayo fue seguido por la cocción de los portaobjetos en el
horno de microondas en 10 mM en citrato, pH 6, durante 5 min, después del enfriamiento (6090min), que se lavaron de nuevo. A continuación, los portaobjetos se incubaron en 0,5% de Triton X100 y en PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino y 10% de suero de cabra durante 60
min. Las secciones se marcaron a 4 º C durante 20 h utilizando policlonal de conejo anti-GFAP
anticuerpo primario (1:1000; Dako) o de conejo policlonal Iba1 anticuerpo primario (1:200; Wako
Chemicals). El ensayo fue seguido por una incubación en conjugado con Cy3 de burro anti-conejo
(1:250; Jackson Immunoresearch) anticuerpo secundario. Los ensayos fueron seguidos por
incubación con burro conjugado con FITC anti-conejo (1:250; Jackson Immunoresearch) anti-cuerpo
secundario para la microglia o astrocitos para a temperatura ambiente durante 2 h. Las secciones se
lavaron en agua y se montaron en Vectashield medio de montaje (VectorLaboratories, H-1200).
RESULTADOS LAS MANIFESTACIONES DE DOLOR NEUROPÁTICO SE HAN MEJORADO EN LOS CB2-‐/ – RATONES La hiperalgesia a un estímulo nocivo térmico (ensayo plantar), y la alodinia al frío (prueba de fríoplaca) y los estímulos mecánicos (modelo de estimulación de von Frey) se utilizaron primero como
medidas de resultado del comportamiento del dolor neuropático. Respuestas basales de ratones
CB2-/ – y CB2 + / + fueron similares en los tres modelos nociceptivos, y el simulacro de operación no
produjo ninguna modificación de estos umbrales nociceptivos en ambos genotipos. La lesión del
nervio ciático mejoró de manera similar a la hiperalgesia térmica y alodinia inducida mecánica y
térmica en la pata ipsilateral en ambos CB2-/ – CB2+ / +. Lo más sorprendente, sin embargo, el
mismo grado de hiperalgesia térmica y alodinia mecánica también desarrollado en la pata
contralateral de los ratones CB2-/ – , revelando una imagen de espejo del dolor. Esta imagen de
espejo no se observó en CB2 + / +. Un resultado similar se obtuvo en ambos sexos de CB2-/ – y CB2
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+ / + en las tres medidas de comportamiento nociceptivo. (Ibrahim et al, 2006) De acuerdo con los
informes anteriores, se observó una tendencia a mejorar la respuesta nociceptiva basada en la
prueba plantar en CB2-/ -, aunque un efecto significativo (p <0,05) sólo se reveló en el análisis de
datos desde ambos géneros juntos.
LAS CÉLULAS MICROGLIALES SE INVOLUCRAN EN LAS MEJORADAS MANIFESTACIONES DE DOLOR NEUROPÁTICO EN CB2-‐/ – RATONES Hemos evaluado respuestas gliales en el asta dorsal de la médula espinal lumbar después de la
lesión del nervio ciático o simulacro de operación en CB2-/ – y CB2 + / + para determinar su posible
participación en el aumento de la sensibilidad al dolor neuropático de los animales CB2-/ -. La lesión
del nervio ciático induce una potenciación similar de células micro gliales totales en el cuerno dorsal
y ventral ipsilateral de la médula espinal en CB2-/ – y CB2+ / +. Curiosamente, se observó una
reacción microglial similar en los cuernos ipsilateral y contralateral en CB2-/ -, pero no en CB2 + /
+. Del mismo modo, CB2-/ una activación de micro gliales en los cuernos ipsilaterales se observaron
y CB2 + / +, y una estimulación en los cuernos contralaterales sólo en CB2 + / +. De acuerdo con
estos hallazgos, un aumento significativo de la tinción para Iba1, un marcador específico de células
micro gliales, se observó en el lado ipsilateral después de la lesión del nervio en CB2 + / + y en el
lado ipsilateral y contralateral en CB2-/-.
Este aumento se debió a un aumento en el número de células de la microglia, que muestran
cambios morfológicos específicos. Por lo tanto, no se observaron descansos típicos con un cuerpo
de células pequeñas y ramificaciones delgadas y grandes en ratones con operación
simulada. Después de la lesión del nervio, estos microglia descansando estaban presentes sólo en el
lado contralateral de CB2 + / +. En contraste, el lado ipsilateral de CB2 + / + y tanto el lado ipsilateral
y contralateral de CB2-/ – ratones contenía microglia con un fenotipo activado. Estas células tienen
cuerpos celulares más grandes, así como ramificaciones más gruesas y más cortas. El mismo
resultado también se encontró en las respuestas astrocíticas, con una activación similar en los
cuernos ipsilaterales en CB2-/ – y CB2 + / + ratones, y una reacción selectiva en los cuernos
contralateral sólo en CB2-/ -. Por lo tanto, notablemente, el perfil de activación de las células gliales
igualó exactamente el patrón de hipersensibilidad nociceptivo. Debido a la activación glial y
respuestas funcionales son inhibidas por la estimulación del receptor CB2 (Ehrhart et al, 2005;
Romero-Sandoval y Eisenach, 2007), estos resultados sugieren que la supresión de los receptores
CB2 tuvieron un efecto de desinhibición en la respuesta glial después de lesión del nervio ciático, lo
que conduce a la respuesta al dolor exacerbado en estos animales, que se revelaron sobre todo en
el lado contralateral.
EL DOLOR NEUROPÁTICO ES ATENUADO EN RATONES TRANSGÉNICOS QUE SOBRE EXPRESAN LOS RECEPTORES DE CANNABINOIDES CB2 2015
Estos ratones transgénicos se generaron mediante el uso de un promotor de PrP murina que se
expresa específicamente en las neuronas y células gliales. Se obtuvieron cinco líneas transgénicas
diferentes. Tres líneas transgénicas fueron seleccionados por la evaluación de los receptores CB2
transgénicos en diferentes regiones del cerebro. Una de estas líneas con alta expresión del receptor
CB2 transgénico en la médula espinal fue seleccionado para los presentes experimentos.
La diferente expresión observada en la médula espinal, tálamo y la materia gris periacueductal era
atribuible al promotor PrP murino utilizado en la construcción del transgen. Para los tipos de células
que expresan receptores CB2, se realizó un análisis de inmunofluorescencia de secciones de la
médula espinal de ratones transgénicos que sobre expresan los receptores CB2. Se encontró que
los receptores CB2 localizados con el marcador de microglia Iba1 y con el marcador neuronal Neu-N,
pero no con el marcador GFAP de astrocitos.
De acuerdo con el experimento anterior, las respuestas iniciales de ratones transgénicos que sobre
expresan los receptores CB2 y CB2 + / + fueron similares en los tres modelos nociceptivos y los del
simulacro de operación no produjeron ninguna modificación en los umbrales nociceptivos. La
hiperalgesia térmica y mecánica inducida por la lesión del nervio ciático en la pata ipsilateral en CB2
+ / + fueron fuertemente atenuadas en los ratones transgénicos que sobre expresan los receptores
CB2.
El nervio ciático lesionado robustamente mejoró la respuesta de la microglia en el cuerno ipsilateral
de los CB2 + / +, indicados por un aumento significativo de la tinción de Iba1.
La tinción Iba1 mejorada fue atributada de un mayor número de microglias, con un fenotipo
activado. Esta respuesta fue significativamente atenuada en ratones transgénicos que
sobreexpresan los receptores CB2. La tinción microglial no se modificó significativamente en el
cuerno contralateral en estos grupos de ratones. La tinción de astrocíticos también fue
significativamente mayor en el cuerno ipsilateral de la médula espinal en CB2 + / +, pero no en
animales transgénicos más de los receptores expressingCB2 ni en el lado contralateral en cualquier
grupo experimental.
LESIÓN DEL NERVIO CIÁTICO EN CB2 + / + CB2-‐/ – DE LA MÉDULA ÓSEA DE RATONES QUIMÉRICOS PRODUCE EL DESARROLLO SIMILAR DE DOLOR NEUROPÁTICO COMO EN LOS RATONES CB2-‐/ -‐ Finalmente hemos evaluado in vivo la participación del sistema inmune en las respuestas
observadas en los ratones CB2-/ -.
Las células BM de los ratones CB2-/ – donantes que expresan los antígenos de superficie CD45.2
fueron inyectados por vía intravenosa en los receptores congénicos irradiados letalmente con
CD45.1. Después de 8 semanas de injerto, la reconstitución eficaz del receptor de los ratones
quiméricos se verificó por análisis de linfocitos de sangre periférica.
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La lesión del nervio ciático en ratones BM-quimérico produjo una alodinia mecánica similar y la
hiperalgesia térmica en la pata ipsilateral como se observó en CB2 + / + y CB2-/ – los animales.
La activación de las células microgliales inducidas por la lesión del nervio ciático se evaluó mediante
el uso de inmunofluorescencia de Iba1. Una mejora similar se observó en el cuerno ipsilateral y
contralateral de la médula espinal en ratones quiméricos.
DISCUSIÓN Los presentes resultados revelan un papel crucial de los receptores de cannabinoides CB2 en el
control del desarrollo del dolor neuropático a través de un mecanismo inmunológico ligado a la
activación glial. La hiperalgesia y alodinia inducida por la lesión del nervio ciático se mejoraron en
los ratones CB2 – / -. Estas manifestaciones conductuales de dolor neuropático se ajustaban a los
cambios inducidos en la microglia y la activación de astrocitos. Se observó una manifestación
reducida de dolor neuropático después de la lesión del nervio en ratones transgénicos que
sobreexpresan receptores CB2 bajo el control de un promotor de PrP en el cerebro y la médula
espinal.
La expresión de los receptores CB2 transgénicos fueron encontradas en las células microgliales y las
neuronas, pero ausente en los astrocitos, de acuerdo con la literatura (Van Sickle et al, 2005;..
Romero-Sandoval et al, 2008). La disminución de la hiperalgesia, alodinia, y la activación glial espinal
en estos ratones transgénicos podrían estar relacionados con la fuerte sobreexpresión de los
receptores CB2 en el nivel de la médula espinal. Sin embargo, estos ratones también mostraron un
aumento de la expresión de los receptores CB2 en estructuras supra espinales implicadas en la
transmisión del dolor, tales como el tálamo y la materia gris periacueductal, que también podría
participar en las manifestaciones disminución de dolor neuropático. El fenotipo opuesto revelado en
los ratones transgénicos que sobreexpresan los receptores CB2 y CB2 – / – subraya la relevancia de
estos receptores en la mediación de las manifestaciones de dolor neuropático.
Estas respuestas iniciales similares se obtuvieron en las diferentes líneas de ratones modificados
genéticamente que carecen o que sobreexpresan los receptores CB2, lo que indica la ausencia de
cambios nociceptivas en condiciones fisiológicas en estos animales. Estos resultados sugieren que la
activación de los receptores CB2 podrían atenuar las manifestaciones de dolor neuropático en dosis
más bajas que las requeridas para inducir antinocicepción.
Las manifestaciones alteradas de dolor neuropático observados en los ratones CB2-/- y los ratones
transgénicos que sobreexpresan receptores CB2 sugieren que los endocannabinoides juegan un
papel importante en el control del dolor en estas condiciones patológicas. En apoyo de esta
hipótesis, una mejora en los niveles de los dos principales endocannabinoides, anandamida y 2araquidonoil-glicerol, se reveló después de la lesión del nervio ciático en la médula espinal y varias
áreas del cerebro implicadas en el dolor, tales como la materia gris periacueductal y la médula
rostral ventral (Petrosino et al., 2007).
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Los niveles de endocannabinoides también se han mejorado después de la lesión del nervio ciático
en la raíz dorsal (Mitrirattanakul et al., 2006) y la sección del nervio ciático próxima a la lesión
(Agarwal et al., 2007). Estos aumentos de los niveles de endocannabinoides están probablemente
relacionados con una mayor biosíntesis o un catabolismo disminuido y el transporte, porque los
endocannabinoides se producen en la demanda de almacenamiento sin ninguna sustancia (Di
Marzo, 1998). Por lo tanto, los endocannabinoides podrían producir una activación tónica de los
receptores CB2 después de la lesión del nervio ciático que limitarían la progresión y las
manifestaciones de dolor neuropático. De acuerdo a esto, la hiperalgesia mecánica y térmica
producida después de la lesión del nervio ciático se atenúa por la administración del Naraquidonoil-serotonina, un inhibidor de la hidrolasa de amida del ácido graso, la enzima
responsable de la degradación de la anandamida, que apoyan aún más el papel de los
endocannabinoides en el control del dolor neuropático.
En la médula espinal, la expresión del receptor CB2 se asocia con la aparición de las células
microgliales activadas después de dolor crónico producido por lesión del nervio periférico. Su
activación se requiere para la inducción y el desarrollo de estados de dolor crónico.
La activación de la microglia está involucrada en el desarrollo del dolor neuropático a través de la
liberación de varias citosinas que se sabe que producen sensibilización neuronal en la médula
espinal (DeLeo y Yezierski, 2001; Clark et al, 2007) e iniciar el proceso de neuroinflamatoria que lleva
al desarrollo de dolor neuropático (Watkins et al., 2001). Los moduladores químicos que activan las
células microgliales están bajo el control de los mediadores inmunes, así como neuromoduladores
liberados por las neuronas cercanas, tales como las prostaglandinas (Tanga et al., 2006). IFN-_
(interferón-_) es otro mediador implicado en la activación de la microglia que puede inducir una
regulación positiva de la expresión de ARNm de CB2 (Carlisle et al., 2002). El proceso de
neuroinflamación completa que conduce a la progresión del dolor neuropático requiere la
coactivación de ambos microglia y astrocitos (Colburn Et al., 1999).
Curiosamente, la estimulación del receptor CB2 se ha informado para atenuar la activación
microglial.
Los receptores de CB2 se encuentran en las células microgliales que jugarían un papel crucial en la
limitación de la difusión de este proceso neuroinflamatorio. Por lo tanto, la actividad de los
receptores CB2 en células microgliales reduciría su activación durante el desarrollo del dolor
neuropático.
Una alteración de la respuesta inmune central después de la lesión del nervio podría ser
responsable de las mejoradas manifestaciones del dolor neuropático en los ratones CB2-/-. Esta
hipótesis se demostró mediante la replicación de las manifestaciones conductuales e histológicas
mejoradas del dolor neuropático observadas en los ratones CB2 -/- en los ratones
CB2+/+ irradiados trasplantados con células de médula ósea de CB2-/-. Estos ratones CB2- /- BM
quiméricos mostraron mejoradas manifestaciones de dolor neuropático según lo revelado por la
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alodinia, hiperalgesia, y los astrocitos y la activación de las células microgliales en el lado
contralateral de la médula espinal después de la lesión del nervio ciático. Mediante la generación de
ratones con médula ósea quiméricas, se presentan pruebas de que los monocitos recién
contratados procedentes de la médula ósea de ratones CB2-deficientes participan en la
reconstitución de la médula espinal después de microglia lesiones nerviosas periféricas.
Recientemente, se ha demostrado que las células derivadas de médula ósea que son reclutados a la
médula espinal están implicadas en el desarrollo del dolor neuropático. En particular, la expresión
de CCR2 en cualquiera de microglia residentes o los macrófagos derivados de médula ósea puede
ser suficiente para el desarrollo de alodinia mecánica en un modelo de dolor neuropático
murino. Después de la lesión del nervio, gradientes formados por quimio quinas ligadas a 2 (CCL2) y
CCL3 orquestan el reclutamiento y la activación de la microglia residente y derivados de los
monocitos a través de señalización a través de sus respectivos receptores CCR2, CCR1, CCR5. La
actividad del receptor de cannabinoides CB2 puede influir críticamente en la inducción de la
expresión de CCR2 por los monocitos y por lo tanto inhibir su quimio taxis (Steffens et al.,
2005). Por lo tanto, nuestros hallazgos demuestran un papel crucial de la respuesta inmune
mediada por la microglia en el desarrollo de una mayor sensibilidad al dolor neuropático en los
animales CB2-/-.
Los ratones modificados genéticamente, ya sea mediante el aumento o la eliminación de genes
específicos pueden estar limitados por el hecho de que este cambio genético puede estar afectando
no sólo el gen, pero también otros componentes biológicos, tal vez participando en los efectos
evaluados en estos modelos genéticos. Nuestros resultados revelan un papel crucial de los
receptores CB2 en la modulación de la respuesta inmune del sistema nervioso durante el dolor
neuropático. En contraste, la disrupción genética de los receptores CB1 no tuvieron consecuencias
importantes en el desarrollo del dolor neuropático (Castan ~ e ‘et al., 2006) a pesar de la alta
expresión de estos receptores en el SNC (Tsou et al., 1998). Solamente los receptores CB1
expresados en los nociceptores periféricos, pero no en el SNC parecen estar implicadas en las
manifestaciones de dolor neuropático (Agarwal et al., 2007). La participación selectiva de los
receptores CB2 y la baja expresión en las neuronas (Van Sickle et al., 2005) enfatizan aún más la
relevancia de estos receptores en los mecanismos adaptativos centrales que conducen al dolor
neuropático. Por lo tanto, los agonistas cannabinoides CB2 podrían representar un nuevo grupo de
agentes farmacológicos para el tratamiento del dolor neuropático ya que carece de efectos
secundarios psicoactivos.
INFORMACIÓN MCCRID: ARKMCCR-00131
PUBMED ID: 19005077
PMCID: PMC3844839
Nombre Original: Crucial Role of CB2 Cannabinoid Receptor in the Regulation of Central Immune
Responses during Neuropathic Pain
2015

PAPEL CRUCIAL DE RECEPTORES CANNABINOIDES CB2 EN LA

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