87 El número de bacterias de un cultivo PDF

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87 El número de bacterias de un cultivo PDF
EL NÚMERO DE BACTERIAS
RECUENTO EN PLACA
El recuento en placa es uno de los métodos más utilizados para determinar cuál es el número de
microorganismos viables en un medio líquido.
Cuando la concentración es baja se procede a filtrar la muestra a través de una membrana que
será pasada al medio de cultivo, en una placa de Petri. Los microorganismos retenidos en la
membrana se desarrollarán formando colonias, permitiendo su cuantificación.
Cuando la concentración es alta, se procede a la preparación de diluciones seriadas en una
secuencia de 1:10, alcanzándose diluciones de 10 -7 o mayores. Pequeñas alícuotas de esas
diluciones son sembradas en medio nutritivo en placa, donde las bacterias se desarrollan formando
colonias.
En las placas donde la concentración de la alícuota sembrada es muy alta, las bacterias formarán
un césped, pero si la concentración es muy baja, el número de colonias podrá ser muy bajo. Entre
los dos extremos, alguna de las placas contendrá un número de colonias entre 20 y 300,
permitiendo la cuantificación.
Como esta técnica demanda mucho material, consideramos que una simplificación como la de
Wymer puede ser muy útil en un laboratorio de enseñanza.
BIBLIOGRAFíA
MALAJOVICH M.A. Atividades práticas – Trabalhar em segurança. Guia n0 67, www.bteduc.bio.br
VERMELHO A.B. et al. Práticas de Microbiologia. Rio de Janeiro, Guanabara-Koogan, 2006
WYMER P. Practical Microbiology and Biotechnology for Schools. London, McDonald & Co., 1987.
ACTIVIDAD PRÁCTICA
OBJETIVO
Determinar el número de microorganismos de un cultivo bacteriano.
MATERIALES
Cultivo de Escherichia coli preparado el día anterior y diluido a 10-4 un rato antes de la clase, 1
placa de Petri con medio nutritivo, 5 tubos de ensayo con 4,5 ml de solución salina estéril, 1 pipeta
de 1 ml, 1 pipeta Pasteur, recipiente de descarte con desinfectante, cinta adhesiva, marcador,
estufa a 37ºC.
Antes de comenzar, verificar la ausencia de agua de condensación en la placa de Petri. En caso
contrario ver la Guía Nº 81: El secado de las placas de Petri.
Guía 87
María Antonia Malajovich / Guías de actividades
Biotecnología: enseñanza y divulgación
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EL NÚMERO DE BACTERIAS / RECUENTO EN PLACA
PROCEDIMIENTO
Seguir las normas de trabajo standard (ver Guía Nº 67). Todo el
procedimiento debe realizarse en condiciones asépticas.
A.
Preparación de una serie de diluciones
Transferir 0,5 ml de una suspensión bacteriana de un tubo al siguiente, iniciando el
procedimiento a partir del tubo que contiene la suspensión bacteriana de concentración 10-4.
Un esquema general de los pasos a seguir se encuentra representado en la Figura 1. Entre una
dilución y otra, mezclar bien el contenido de los tubos, mezclando por rotación.
Figura 1. Preparación de la serie de diluciones.
Serie de diluciones
0,5 mL
0,5 mL
0,5 mL
0,5 mL
0,5 mL
A
B
C
D
E
F
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
10-9
Concentraciones
B.
ROTULACIÓN DE LA PLACA
Dividir la placa en 6 sectores, como se representa
en el esquema siguiente.
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EL NÚMERO DE BACTERIAS / RECUENTO EN PLACA
C. SEMBRADO
1. Tomar con la pipeta Pasteur una pequeña cantidad de líquido del tubo F, de concentración 10 -9
(dilución 109).
2. Abrir la placa de Petri y dejar caer una gota en el sector rotulado -9.
3. Cerrar la placa y colocar el exceso de líquido en el tubo F.
4. Repetir los pasos anteriores con los tubos E, D, C, B y A.
5. Descartar la pipeta en el recipiente con desinfectante.
6. Cerrar la placa e incubar a temperatura adecuada durante 24-48 hs.
RESULTADOS
Observar la placa y buscar un sector donde puedan diferenciarse entre 10 y 20 colonias.
1. Calcular cuántas veces el cultivo A fue diluido en esa gota.
2. En base al números de colonias y a la dilución correspondiente, calcular la concentración de
microorganismos en el tubo A.
Pista: se estima que en una pipeta calibrada, 1 ml de líquido contiene 20 gotas.
3. La dilución del cultivo original fue realizada con una única pipeta, partiendo del tubo más
concentrado en sentido al tubo menos concentrado. Al sembrar invertimos ese sentido. ¿Cuáles
son los errores introducidos con estos procedimientos?
NUESTRO COMENTARIO
Las actividades prácticas de titulación demandan una cantidad grande de material, lo que muchas
veces resulta inviable en un laboratorio de enseñanza. Este protocolo, tomado del libro de Wymer,
“Practical Microbiology and Biotechnology for Schools”, resulta muy interesante porque permite
introducir el procedimiento de un modo bastante simple. De todos modos exige de cierta
experiencia previa y bastante habilidad manual.
Los resultados pueden observarse en la Figura1.
¿CÓMO ARMAR UN PROYECTO?
La técnica puede ser aplicada para determinar la concentración de microorganismos en agua o a lo
largo de una fermentación, siempre y cuando se utilicen los medios de cultivo correspondientes.
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EL NÚMERO DE BACTERIAS / RECUENTO EN PLACA
Figura 1: Titulación de un cultivo de Escherichia coli.
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