Libro - Università di Bologna
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XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES 12-15 de Julio de 2006 Lugo - Santiago de Compostela (ESPAÑA) COMITÉ ORGANIZADOR Presidentes Prof. Pablo Díez Baños (Fe.Me.S.P.Rum) Prof. José Luís Benedito Castellote (A.V.E.B.U) Vicepresidentes Dr. Lorenzo Monserrat Bermejo. Centro de Investigaciones Agrarias de Mabegondo (España) Prof. Luciano Sánchez García. Univ. Santiago de Compostela (España) Secretaria Científica Prof. María Patrocinio Morrondo Pelayo. Univ. Santiago de Compostela. Tesorero Prof. Joaquín Hernández Bermúdez. Univ. Santiago de Compostela. Vocales Prof. Cristina Castillo Rodríguez. Prof. Pedro García Herradón. Prof. María Marta López Alonso. Prof. Ceferino López Sandez. Prof. Rosario Panadero Fontán. Prof. Adolfo Paz Silva. Prof. Rita Sánchez-Andrade Fernández. COMITÉ CIENTÍFICO Prof. Paulino García Partida. Prof. Bogo Fatur (Eslovenia). Prof. Felipe Prieto Montaña. Prof. Cándido Gutiérrez Panizo. Prof. Arcangelo Gentile (Italia). Prof. Pablo Díez Baños. Prof. Mª Patrocinio Morrondo Pelayo. Prof. José Luís Benedito Castellote. Dr. Lorenzo Monserrat Bermejo. Prof. Luciano Sánchez García. Prof. Pedro García Herradón. Prof. Gonzalo Fernández Rodríguez. Dr. Hossein Hamali (Irán). Profa. Marta López Alonso. Profa. Cristina Castillo Rodríguez. Prof. José Fernández Revuelta EDICIÓN A CARGO DE: PABLO DÍEZ BAÑOS JOSÉ LUIS BENEDITO CASTELLOTE MARÍA PATROCINIO MORRONDO PELAYO JOAQUÍN HERNÁNDEZ BERMÚDEZ CEFERINO MANUEL LÓPEZ SÁNDEZ XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES ACTO INAUGURAL DEL 14 Congreso Internacional de la Federación Mediterránea de Sanidad y Producción de Rumiantes. (FeMeSPRum) Excmo. Sr. Vicerrector de la Comunidad Universitaria y Compromiso Social, como representante de Excmo y Sr. Rector da Universidade de Santiago de Compostela D. Jose Manuel Mayán Santos. Excelentisimo Sr. Conselleiro do Medio Rural (Xunta de Galicia) D. Alfredo Suárez Canal. Ilma Sra. representante de la Consellería de Educación e Ordenación Universitaria. Profesora Mª del Mar Yllera Fernandez Ilmo Sr. Presidente del Consello Galego de Colegios Veterinarios de Galicia. D. Filemón Rodríguez Rodriguez Ilmo Sr. Presidente de la FEMESPRUM Prof. Antonio Pugliese (Univarsidad de Mesina, Italia). Ilmo. Sr. Prof. Paulino García Partida. Miembro fundador y Honorífico de la FeMeSPRum. Dignísimas autoridades, señoras y señores congresistas y acompañantes. Es para mí un honor, al tiempo que un placer, darles la bienvenida, en nombre del Comité Organizador, al 14 Congreso de la Federación Mediterránea de Sanidad y Producción de Rumiantes, cuyo acto inaugural celebramos en este salón noble del Colegio- Pazo de Fonseca, sede central de la Universidad de Santiago de Compostela. Mis primeras palabras han de ser de agradecimiento. A nuestra Universidad, en la persona del representante, del Magnífico y Excelentísimo Sr. Rector. Agradecimiento también a todas las autoridades y personas que representan Instituciones públicas y oficiales, por acompañarnos en esta ocasión, y por su patrocinio personal y material, tan necesario para poder realizar este evento. Nuestro reconocimiento a todos ustedes, congresistas, por su presencia y por sus importantes contribuciones científicas, y cómo no, también mi particular reconocimiento a los miembros de los Comités Organizador y Comité Científico, así como a la Junta directiva de la Federación Mediterránea de Sanidad y Producción de Rumiantes. Todos han aportado su inestimable ayuda, en la medida de sus posibilidades, e incluso, a veces, sobrepasándolas con creces. No debo olvidar a las diferentes entidades y firmas privadas, que han sido entusiastas patrocinadores materiales y colaboradores de nuestro Congreso. Después de 18 años de la constitución de la FeMeSPRum, que nació en el seno de la Asociación Mundial de Buiatría, las esperanzas e ilusiones de sus fundadores, (entre los que no olvidamos al prof. Gentile, desgraciadamente ausente y a nuestro conferenciante de hoy, prof. García Partida), se han ido cumpliendo a lo largo de los sucesivos congresos internacionales, celebrados en distintas ciudades y países del entorno del mediterráneo. Desde el ya lejano año de 1991, en Alghero (Cerdeña), hasta el último celebrado en Bari, pasando por Salamanca, Téramo, Murcia, Bolonia, Lubliana, Sentarem, Giardini (Sicilia), León, Túnez, Olvia (Cerdeña) y Estambul, XI XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES ¿Por qué un congreso dedicado a los rumiantes, propio de países del área de influencia mediterránea? En primer lugar, las condiciones geográficas y climáticas, las propias culturas y tradiciones ganaderas, son muy diferentes respecto de países y zonas situadas más al norte de Europa. De ahí, que muchos temas de los que se vienen ocupando los congresos de nuestra Federación (FeMeSPRum) dentro de la medicina, sanidad, producción, etc, de los rumiantes, tengan sus peculiaridades. En este sentido, hay dos hechos que actualmente cobran mucho interés. Por una parte, la última ampliación de la UE (hasta los 25 países actuales) con todo lo que ello implica sobre la producción, comercialización, control de distintas enfermedades, etc, pues de todos es bien sabido que los agentes causales de enfermedades no entienden de fronteras. Además, la aparición de enfermedades nuevas, exóticas y las emergentes. Todo ello obliga a la profesión veterinaria a estar muy atenta a los avances científicos que se produzcan, y a adquirir una preparación que le permita responder ante estos nuevos desafíos y saber actuar con las pautas correctas ante estas situaciones. La Federación Mediterránea de Sanidad y Producción de Rumiantes, es una asociación joven, que gracias al entusiasmo de sus fundadores, unido a la ilusión de los sucesores en su dirección, ha venido cumpliendo sus objetivos a lo largo de los sucesivos años, de manera particular a través de las reuniones internacionales, cuyas aportaciones científicas han supuesto un considerable impulso a la medicina, sanidad y producción de los rumiantes en las diversas zonas de la cuenca mediterránea. Entre los temas tratados habitualmente en los congresos de la Federación, se incluyen aspectos relativos a problemas clínico-médicos, infecciosos y parasitarios, así como los de nutrición, selección y mejora de razas y producción de carne y leche principalmente, sin excluir otros sobre la valoración de la calidad sanitaria, y calidad alimenticia de los diversos productos derivados. Todo ello centrado esencialmente en explotaciones de grandes y pequeños rumiantes. Entre los objetivos científicos se cuenta también el estudio de las razas autóctonas de rumiantes en diferentes zonas de la cuenca mediterránea, que tienen sus peculiaridades de manejo y explotación y que, sobre todo, destacan por la alta calidad de sus productos, que son muy apreciados por los consumidores. Hoy hay un interés añadido por los rumiantes no domésticos (los silvestres), que aparte de su importancia como especies de caza, están muy implicadas en la conservación del medio natural. Curiosamente, algunas de estas especies son indicadoras de lo que podríamos llamar “sanidad o calidad ambiental” y su conservación o introducción en determinadas zonas, está adquiriendo un creciente interés. En el mes de septiembre de 2005, en la preciosa y acogedora ciudad italiana de Bari, aceptamos el encargo de la organización de esta 14ª edición del FeMeSPRum. Hoy estamos en su comienzo, pero antes los organizadores, hemos tenido que salvar obstáculos y dedicar horas de intenso trabajo. Todos estos esfuerzos los daremos por bien empleados si, como esperamos, todo se desarrolla con normalidad y sobre todo, si contamos con el apoyo y la participación activa de todos los asistentes. Contamos con la inestimable ayuda de ponentes, muy cualificados en sus respectivas especialidades, pero es con vuestra presencia y participación activa como se conseguirá el nivel científico que todos deseamos. XII XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES La discusión sobre los temas presentados y las conclusiones a las que se llegue, serán una ayuda inestimable para abordar soluciones a muchos problemas sanitarios y productivos de los rumiantes en las respectivas áreas de influencia de los países del Mediterráneo. Hemos de estacar la participación de personas con nivel científico reconocido, que mediante conferencias plenarias, ponencias en mesas redondas, o en forma de comunicaciones orales o de póster, darán justa medida del contenido a este Congreso, y cuyos trabajos pretenden contribuir a mejorar el bienestar de nuestras sociedades. Por supuesto, no buscamos entrar en competencia con congresos habidos anteriormente. Estamos seguros de que cada uno ha destacado especialmente en algún aspecto. Nosotros sólo deseamos que, una vez más, esta ocasión sea un motivo y un foro de encuentro, que propicie el intercambio fructífero de conocimientos y que, al mismo tiempo, sea un pretexto para crear nuevos vínculos de amistad entre los socios de los distintos países. Así pues, tenemos una amplia tarea para estos próximos días, que indudablemente tiene mucho interés para todos nosotros, por lo que supone de intercambio y contraste de conocimientos. En definitiva, nuestro objetivo no es otro que el Congreso responda a criterios del mayor nivel científico en los temas a tratar, y que sus conclusiones contribuyan a proponer las mejores soluciones a los distintos problemas que se plantean en los rumiantes de las zonas de especial influencia mediterránea. Estamos convencidos de que el resultado de las aportaciones científicas será muy positivo para todos nosotros, pero también lo será para los colegas que trabajan en las instituciones y en calidad de veterinarios clínicos, sin olvidar el interés que han de representar estos trabajos para nuestros estudiantes. Espero que disculpen las posibles deficiencias que hayamos tenido, pero quiero que sepan también que estamos a su disposición en el Comité Organizador, para intentar solucionar las dificultades que puedan surgir en estos próximos días. Lo que sí es seguro es que también dispondrán de tiempo para acercarse a conocer las gentes, y disfrutar de la historia, los monumentos (que son muchos) y la gastronomía (que es extensa e intensa), por lo menos de las dos ciudades (Santiago de Compostela y Lugo), y seguramente también de otros lugares de Galicia, que ofrecen numerosos atractivos. Lo que les deseo a todos es que después del Congreso recuerden, con sumo agrado, su estancia en estas tierras de Galicia, que desde siempre han sido y muy acogedoras, y hospitalarias con sus visitantes. Bienvenidos a todos y que entre todos realicemos un excelente trabajo. Santiago de Compostela, 12 de julio de 2006 Pablo Díez Baños José Luis Benedito Castellote Presidentes del Comité Organizador del XIV Congreso Internacional de la Federación Mediterránea de Sanidad y Producción de Rumiantes XIII XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES ÍNDICE CONFERENCIAS / CONFERENCES FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES: VEINTE AÑOS DE BUIATRÍA García Partida, P. (Con la colaboración de Ruiz Abad, L.)....................................................1 APLICACIONES PRÁCTICAS DE LA BIOTECNOLOGÍA DEL ADN EN LOS PROGRAMAS DE MEJORA GENÉTICA DE LOS RUMIANTES. López Viana, J........................................................................................................................5 DISEASES RELATED TO COPPER, MOLYBDENUM AND SULPHUR INTERACTIONS IN RUMINANTS. Gooneratne, R. .......................................................................................................................8 MECANISMOS DEL ESTRÉS EN EL TORO DE LIDIA. Illera, J.C.; Silván, G.; Gil-Cabrera, F.; Illera, M.J. .............................................................15 PARANFISTOMOSIS BOVINA: ENFERMEDAD EMERGENTE EN EL ÁREA MEDITERRÁNEA. Paz Silva, A..........................................................................................................................19 MESA REDONDA / ROUND TABLE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES EN EL MEDITERRÁNEO AGGIORNAMENTI SULLA TOXOPLASMOSI E NEOSPOROSI DEI RUMINANTI DEL BACINO DEL MEDITERRANEO. TOXOPLASMOSIS AND NEOSPORORIS UPDATES IN RUMINANTS OF THE MEDITERRANEAN BASIN. Scala, A. ...............................................................................................................................24 VACUNAS Y VACUNACIÓN EN LOS PEQUEÑOS RUMIANTES. Martín Gómez, S. .................................................................................................................33 EVOLUCIÓN Y SITUACIÓN ACTUAL DE LA ENCEFALOPATÍA ESPONGIFORME BOVINA (EEB). Fernández Rodríguez, G.......................................................................................................45 XV XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES MESA REDONDA / ROUND TABLE PROBLEMÁTICA DE LAS RAZAS AUTÓCTONAS DE RUMIANTES EN EL ÁREA MEDITERRÁNEA CALIDAD DE LA CARNE DE LAS RAZAS AUTÓCTONAS. Sánchez García, L. ...............................................................................................................55 POSIBILIDADES Y FUTURO DE LAS RAZAS AUTÓCTONAS DE PRODUCCIÓN CÁRNICA. Monserrat Bermejo, L. .........................................................................................................66 CRECIMIENTO Y CALIDAD DE LA CARNE DE TERNEROS DE RAZA MINHOTA. Araújo, J.P............................................................................................................................70 MESA REDONDA / ROUND TABLE PROBLEMAS SANITARIOS Y DE MANEJO EN RRUMIANTES SILVESTRES DEL ÁREA MEDITERRÁNEA INFECCIÓN POR PESTIVIRUS EN EL REBECO (Rupicapra pyrenaica) EN EL PIRINEO CATALÁN. Lavín, S.; Marco, I. ..............................................................................................................79 RILIEVI CLINICI, LEGISLATIVI, GESTIONALI, DI BENESSERE E PROTEZIONE DEL MUFLONE IN SARDEGNA. Cubeddu, G. .........................................................................................................................88 ANÁLISIS DEL ESTADO PARASITARIO DE RUMIANTES SILVESTRES EN EL NORTE DE CASTILLA Y LEÓN. Díez-Baños, N. .....................................................................................................................95 COMUNICACIONES CIENTÍFICAS/SCIENTIFIC COMMUNICATIONS VALOR NUTRITIVO DE LA CARNE DE LOS TERNEROS DE RAZA RUBIA GALLEGA: EFECTO DEL AMAMANTAMIENTO Y ÉPOCA DE PARTO. NUTRITIVE VALUE OF RUBIA GALLEGA VEAL: EFFECT OF MATERNAL SUCKLING AND THE CALVING SEASON. Bispo, E.; Franco, D.; Amor, V.; Monserrat, L.; Moreno, T..............................................103 XVI XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES EFECTO DEL PESO DE SACRIFICIO Y EL TIPO DE ENSILADO EN LA CALIDAD DE LA CANAL, LA CARNE Y LA GRASA. I. TERNEROS. EFFECT OF SLAUGHTERED WEIGHT AND SILAGE TYPE ON CARCASS, MEAT AND FAT QUALITY. I. YOUNG BULLS. Zea, J., Díaz, Mª D.; Carballo, J. A. ...................................................................................109 EFECTO DEL PESO DE SACRIFICIO Y EL TIPO DE ENSILADO EN LA CALIDAD DE LA CANAL, LA CARNE Y LA GRASA. II. TERNERAS. EFFECT OF SLAUGHTERED WEIGHT AND SILAGE TYPE ON CARCASS, MEAT AND FAT QUALITY. II. HEIFFERS. Zea, J.; Díaz, Mª D.; Carballo, J. A. ..................................................................................119 LA PONTREMOLESE: UNA RAZZA BOVINA AUTOCTONA IN VIA DI ESTINZIONE. PONTREMOLESE: AN ITALIAN BOVINE BREED IN ENDANGERED STATUS Goracci, J.; Giuliotti, L.; Benvenuti, N.; Verità, P.; Facdouelle, I. ....................................128 PRODUZIONE E QUALITA’ DEL LATTE DI CAPRE MALTESI ALLEVATE IN SICILIA. MILK YIELD AND QUALITY IN MALTESE GOATS REARED IN SICILY. Zumbo, A.; Di Rosa, A.R.; Finocchiaro, R. .......................................................................136 EFFETTO DELLA STAGIONE DI PARTO SULLE CARATTERISTICHE QUANTIQUALITATIVE DEL LATTE DI CAPRE “ DERIVATE DI SIRIA”. EFFECT OF THE “SASON OF KIDDING”ON THE QUANTITATIVE AND QUALITATIVE CHARACTERISTICS OF THE MILK OF “DERIVATA DI SIRIA”GOATS. Zumbo, A.; Di Rosa, A.R.; Amato, C.; Maresca, L. ..........................................................141 CORTISOL LEVELS AS INDICATOR OF STRESS IN DOMESTIC GOATS UNDER DIFFERENT HOUSING SYSTEMS. Fazio, E.; Medica, P.; Cavaleri, S.; Cravana, C.; Ferlazzo, A............................................147 INFECTION VALUTAZIONE DELL’APPARATO LACRIMALE IN PECORE CON INFEZIONE DA Brucella spp. EVALUATION OF THE LACRIMAL SYSTEM IN SHEEP WITH Brucella spp. Gruppillo, A.; Galia, S.; Bosco, V.R.F.; Parisi, F.; Mazzullo, G.; Pugliese, A. .................151 ANALISI CHIMICA DELL’UMORE ACQUEO NELLA SPECIE OVINA: VALUTAZIONE COMPARATIVA CON CAMPIONI POSITIVI PER Brucella spp. (REAL TIME PCR). ANALYSIS OF AQUEOUS HUMOR IN THE SHEEP: COMPARATIVE EVALUATION WITH SAMPLES POSITIVE TO Brucella spp. (REAL-TIME PCR). Di Pietro, S.; Bosco, V.R.F.; Gruppillo, A.; Galia, S.; Venza, I.; Pugliese ,A. ..................156 XVII XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Brucella spp. (REAL-TIME PCR) IN LACRIME, UMORE ACQUEO E VITREO DI PECORE INFETTE. Brucella spp. (REAL-TIME PCR) INTO TEARS, AQUEOUS AND VITREOUS OF INFECTED SHEEP. Di Pietro, S.; Galbo, A.; Bonanno, G.; De Domenico, A.; Reale, S.; Giudice, E...............163 L’ESAME ANATOMO-PATOLOGICO AL MACELLO PER UNA MIGLIORE CONOSCENZA E VALUTAZIONE DELLE RETROVIROSI OVINE IN TOSCANA. THE ANATOMO-PATHOLOGICAL DIAGNOSIS IN SLAUGHTERHOUSE TO BEST KNOWLEDGE AND EVALUATION OF OVI-CAPRINE PATHOLOGY BY RETROVIRIDAE IN TUSCANY. Bio, C.; Gregori, M.; Taccini, E.; Braca, G........................................................................167 DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI LISOZIMA IN LATTE OVINO NORMALE E MASTITICO. EVALUATION OF LYSOZYME TITRATION IN NORMAL AND MASTITIC OVINE MILK. Fratini, F.; Ebani, V.V.; Ampola, M.; Innocenti, E.; Forzale, F.; Periccioli, M.; Cerri, D.; Andreani, E. .......................................................................................................................171 INTERACCIÓN ENTRE LAS INFECCIONES POR BVDV Y BoHV-1 EN ESTABLOS LECHEROS DE ITALIA. INTERACTION BETWEEN BVDV AND BoHV-1 INFECTION IN DAIRY HERDS IN ITALY. Cuteri, V.; Cittadini, F.; Romero Tejeda, A.; Preziuso, S.; Marenzoni, M.L.; Attili, A.R.; Passamonti, F.; Giorgi, G.; Valente, C. ..............................................................................180 AGENTES INVOLUCRADOS EN LOS ABORTOS DE BÚFALOS (Bubalus bubalis) PROVENIENTES DE LA REGIÓN CENTRAL DE ITALIA. SELECTED AGENTS INVOLVED IN BUFFALO (Bubalus bubalis) ABORTION IN CENTRAL ITALY. Cuteri, V.; Attili, A.R.; Cittadini, F.; Preziuso, S.; Romero Tejeda, A.; Marenzoni, M.L.; Valente, C...........................................................................................................................187 NIVELES DE CADMIO EN HÍGADO, RIÑÓN Y MÚSCULO EN GANADO OVINO PROCEDENTE DE LEON (N.O. ESPAÑA). CADMIUM LEVELS IN LIVER, KIDNEY AND MEAT IN SHEEP FROM LEON (N.W. SPAIN). Sierra Carro, J.A.; López Alonso, M.; García-Partida, P.; Escudero Población, A.; Benedito, J.L.......................................................................................................................................194 MANEJO FARMACOLÓGICO DE LA GOTERA ESOFÁGICA OVINA. FARMACOLOGICAL CLOSURE OF THE ESOPHAGEAL GROOVE IN SHEEP. González Montaña, J.R.; López Méndez, S.; Alonso Díez, A.J.; Rejas López, J.; Álvarez Nistal, R.; Prieto Montaña, F..............................................................................................201 XVIII XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES CIRCULATING TOTAL AND FREE IODOTHYRONINES LEVELS OF SHEEP (Ovis aries): DIFFERENTIATED EFFECTS OF RESTRAINT AND SHEARING AND PREVIOUS EXPOSURE TO SHEARING. Medica, P.; Fazio, E.; Cravana, C.; Aronica, V.; Ferlazzo, A............................................206 DISMIELOGENESI SPINALE DEL BOVINO (SDM). SU DI UN CASO IN UN VITELLO DI RAZZA BRUNA. BOVINE SPINAL DYSMYELINATION (SDM). A CASE IN AN ITALIAN BROWN CALF. Testoni, S.; Gentile, A........................................................................................................210 IMPIEGO DELLA TERMOGRAFIA AD INFRAROSSO QUALE MEZZO PER LA DETERMINAZIONE DELLO STATO DI SALUTE E BENESSERE DEI RUMINANTI: RISULTATI PRELIMINARI. USE OF INFRARED THERMOGRAPHY FOR EVALUATING HEALTH AND WELFARE STATUS IN RUMINANTS: PRELIMINARY RESULTS. Morgante, M.; Gianesella, M.; Cannizzo, C.; D’alterio, G.; Stelletta, C............................215 OSSERVAZIONI LEGISLATIVE E MEDICO LEGALI SUI DANNI CAGIONATI DAI RUMINANTI SELVATICI (Cervus elaphus ) IN SARDEGNA. Cubeddu, G.M.; Pinna Parpaglia, M.L.; Cocco, R. ............................................................221 THE CLINICAL EFFICIENCY OF MINERASOL ON CATTLES, WHICH IS A NEW TRACE ELEMENT COMBINATION. Erman Or; M.; Kayar, A.; Gönül, R.; Dokuzeylül, B.; Rıza Kiziler, A.; Parkan, Ç.; Morkoç, T.; Barutçu, B.....................................................................................................................226 PRIMI RISULTATI DI UN INDAGINE SULLA FREQUENZA DEGLI APLOTIPI ALFA GLOBINICI IN RAZZE ISOLANE ITALIANE. ALPHA GLOBIN HAPLOTYPE SCREENING IN ITALIAN ISLANDER SHEEP BREEDS: PRELIMINARY RESULTS. Alloggio, I.; Bramante, G.; Pieragostini, E. .......................................................................233 RELAZIONI TRA POLIMORFISMI GENETICI LATTOPROTEICI E LA QUALITA’ CHIMICO-FISICA E NUTRIZIONALE DEL LATTE OVINO. RELATIONS BETWEEN MILK GENETIC POLYMORPHISMS AND THE CHEMICALPHYSICAL AND NUTRITIONAL QUALITY OF SHEEP MILK. Martini, M.; Salari, F.; Scolozzi, C.; Cecchi, F.; Ceriotti, G.; Caroli, A. ...........................238 RELAZIONI TRA IL POLIMORFISMO GENETICO DELL αs1-CASEINA E LA QUALITA’ CHIMICO-FISICA E NUTRIZIONALE DEL LATTE DI CAPRA. RELATIONS BETWEEN THE GENETIC POLYMORPHISM OF αs1-CASEIN AND THE CHEMICAL-PHYSICAL AND NUTRITIONAL QUALITY OF GOAT MILK Martini, M.; Salari, F.; Scolozzi, C.; Chiatti, F.; Chessa, S.; Caroli, A..............................244 XIX XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES GENOTIPADO DEL SCRAPIE OVINO: ADAPTACIÓN DEL MÉTODO DE ANÁLISIS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE NUEVAS VARIANTES ALÉLICAS. SHEEP GENOTYPED FOR SCRAPIE: ADJUSTMENT OF THE ANALYSIS METHOD FOR THE IDENTIFICATION OF NEW ALLELIC VARIANTS. Portela, C.; Bouzada, J.A.; Prado, C.; Areán, H.; Fernández, M.; López, M.; Fernández, A.; Viana, J.L. ..........................................................................................................................250 CONTROL GENEALÓGICO EN LAS ESPECIES OVINA Y CAPRINA MEDIANTE ANÁLISIS DE MARCADORES MICROSATÉLITE DE ADN. SHEEP AND GOATS GENEALOGICAL CONTROL USING THE ANALYSIS OF DNA MICROSATELLITE MARKERS. Bouzada, J.A.; Portela, C.; Prado, C.; Areán, H.; Fernández, M.; Fernández, A.; Viana, J.L. ............................................................................................................................................256 RÉPONSE SUPEROVULATOIRE ET RÉCUPERATION D'EMBRYONS DE CHÈVRES DONEUSES DE RACE BOER DANS LES PROCÉDURES DE TRANSFERT D'EMBRYONS. SUPEROVULATION RESPONSE AND EMBRYO RECOVERY OF DONOR DOES BOER RACE IN EMBRYOTRANSFER PROCEDURES. Grizelj, J.; Vince, S.; Tomaskovic, A.; Baril, G.; Makek, Z.; Getz, I.; Djuricic, D.; Prvanovic, N.; Samardzija, M. ...........................................................................................264 FUNCIÓN DE LAS GLICOPROTEÍNAS ASOCIADAS A LA GESTACIÓN (PAGs) Y PROGESTERONA EN DIAGNÓSTICO PRECOZ DE LA GESTACIÓN Y MORTALIDAD EMBRIONARIA PRECOZ EN VACAS. ROLE OF PREGNANCY ASSOCIATED GLYCOPROTEINS (PAG) AND PROGESTERONE IN EARLY PREGNANCY DIAGNOSIS AND EARLY EMBRIONIC MORTALITY IN COWS. Prvanovic, N.; Beckers, J.F.; Sulon, J.; Tomaskovic, A.; Cergolj, M.; Dobranic, T.; Grizelj, J.; Samardzija, M.; Kocila, P..............................................................................................267 EFFETTO DEL MOMENTO DEL PARTO SULLA RIPRESA DELL’ATTIVITÀ RIPRODUTTIVA IN PECORE DI RAZZA SARDA. EFFECT OF THE LAMBING DATE ON THE RESUMPTION OF REPRODUCTIVE ACTIVITY IN SARDA EWE. Carcangiu, V.; Vacca, G.M.; Mura, M.C.; Marchi, B.; Falchi, L.; Bini P.P. .....................272 ATTIVITÀ RIPRODUTTIVA E LEPTINA IN AGNELLE DI RAZZA SARDA. LEPTIN AND REPRODUCTIVE ACTIVITY IN SARDA EWE LAMBS. Carcangiu, V.; Vacca, G.M.; Parmeggiani, A.; Mura, M.C.; Fiori, M.; Pazzola, M.; Bini, P.P. .....................................................................................................................................278 ATTIVITÀ RIPRODUTTIVA NELLA CAPRA DI RAZZA SARDA ED ESPRESSIONE GENICA DEL RECETTORE DELLA MELATONINA. XX XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES REPRODUCTIVE ACTIVITY IN SARDA GOAT AND GENIC EXPRESSION OF MELATONIN RECEPTOR. Mura, M.C.; Carcangiu, V.; Luridiana, S.; Vacca, G.M.; Atzeni, M.; Falchi, L.; Bini, P.P. ............................................................................................................................................284 VALUTAZIONE IGIENICO-SANITARIA E CARATTERIZZAZIONE MICROBIOLOGICA DELLA CACIOTTA CAPRINA A LATTE CRUDO DELL’ISOLA DI CAPRAIA. HYGIENICAL EVALUATION AND MICROBIOLOGICAL CHARACTERIZATION OF THE GOAT CACIOTTA BY RAW MILK OF THE CAPRAIA ISLAND. Cerri, D.; Innocenti, E.; Fratini, F.; Ebani, V.V.; Ampola, M.; Zucconi, C.; Andreani, E. ............................................................................................................................................289 OBTENCIÓN DE PROTEÍNAS MORFOGENÉTICAS OSEAS PARCIALMENTE PURIFICADAS A PARTIR DE HUESO BOVINO. EXTRACTION OF PARTIALLY PURIFIED BONE MORPHOGENETIC PROTEINS FROM BOVINE BONE. Bustamante Cano, J.J.; Rivera Posada, J.; Fernández Revuelta, J.; Alonso Alonso, P.; Alonso Diez, A.J..; González Montaña, J.R.......................................................................299 EFFECT OF THE REPEATED DOSES OF PROSTAGLANDINS ON THE UTERINE DISCHARGES IN THE COWS WITH RETAINED FETAL MEMBRANES. Hamali, H. ..........................................................................................................................306 VALUTAZIONE ECOGRAFICA DEL CAPEZZOLO MEDIANTE IMMERSIONE IN ACQUA NELLA BOVINA IN LATTAZIONE ED ASCIUTTA. EVALUATION OF TEAT BY WATER-FILLED CUP ULTRASONOGRAPHY IN LACTATING AND DRIED COWS. De Domenico, A.; Parisi, F.; La Spisa, M.; Pugliese, M.; Niutta, P.P.; De Majo, M.........309 ENDOPARASSITI IN UN ALLEVAMENTO DI PECORA ZERASCA, UNA RAZZA AUTOCTONA ITALIANA. ENDOPARASITES IN A FLOCK OF ZERASCA, AN ITALIAN AUTOCHTONOUS BREED OF SHEEP. Perrucci, S.; Bianchi, C.; Benvenuti, N.; Goracci, J.; Fichi, G.; Giuliotti, L......................318 XXI XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES POSTERS DE SANIDAD / HEALTH POSTERS TREMATODOSIS PARASITARIAS EN BOVINOS SACRIFICADOS EN EL NOROESTE DE ESPAÑA. PARASITIC TREMATODOSIS IN SLAUGHTERED CATTLE FROM NW SPAIN. Arias, M., Lomba, C., Painceira, A., Vázquez, L., Cienfuegos, S., Dacal, V., Pedreira, J., Sánchez-Andrade, R., Morrondo, M.P., Paz-Silva, A........................................................325 NUEVOS RETOS EN LA VETERINARIA DE LA GANADERÍA ECOLÓGICA EN GALICIA. NEW CHALLENGES OF VETERINARY IN GALICIAN ORGANIC FARMING. Blanco Penedo, I.; López Alonso, M.; Miranda, M.; García Vaquero, M.; Gutierrez,B.; Velasco, J.; Hernández, J.; Castillo, C.; Benedito, J.L. ......................................................333 HUESO BOVINO COMO FUENTE DE MATRIZ ÓSEA DESMINERALIZADA. Bustamante Cano, J.J.; Rivera Posada, J.; Cano Quintero, W.; Robles Robles, R.; González Montaña, J.R.; Prieto Montaña, F. .....................................................................................341 LA DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS DE DVB EN TANQUE DE LECHE COMO HERRAMIENTA PARA LA DETECCIÓN DE EXPLOTACIONES CON ANIMALES PERSISTENTEMENTE INFECTADOS. BVDV BULK MILK ANTIBODY TESTING: AN ASSISTANCE FOR THE DETECTION OF FARMS WITH PERSISTENTLY INFECTED ANIMALS. Carnero, I.; Eiras, C.; Arnaiz, I. .........................................................................................345 LAS OVEJAS NO SON UN RESERVORIO ZOONÓTICO IMPORTANTE PARA GIARDIA. ADULT SHEEP MAY NOT BE AN IMPORTANT ZOONOTIC RESERVOIR FOR GIARDIA. Castro-Hermida, J.A.; Almeida, A.; González-Warleta, M.; Correia Da Costa, J.M.; Mezo, M. .......................................................................................................................................349 EVALUATION OF BOBEL-24 FOR TREATMENT OF EXPERIMENTAL CRYPTOSPORIDIOSIS. Castro-Hermida, J.A.; García-Presedo, I. González-Warleta, M.; Mezo, M. ; Fenoy, S.; Rueda, C.; Del Águila, C....................................................................................................355 INDUCCIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE INTERFERON GAMMA (IFN-γ) EN CULTIVOS DE LINFOCITOS DE BOVINOS CON HIPODERMOSIS. MODULATORY EFFECT OF THE HIPODERMIN A ON THE SECRETION OF GAMMA INTERFERON (IFN-γ) IN CULTURES OF LYMPHOCITES FROM CATTLE WITH HIPODERMOSIS. Dacal, V.; Panadero, R.; López, C.; Vázquez, L.; Díaz, P.; Pedreira, J.; Morrondo P.; DíezBaños, P. ............................................................................................................................362 XXII XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES INFLUENCIA DEL CONTROL ANTIPARASITARIO SOBRE NEMATODOS GASTROINTESTINALES EN GRANJAS DE VACAS RUBIA GALLEGA. INFLUENCE OF ANTHELMINTIC CONTROL PRACTICES ON GASTROINTESTINAL NEMATODES IN RUBIA GALLEGA FARMS. Díaz, P.; Pedreira, J.; Sánchez-Andrade, R.; Paz, A.; López, C.; Díez-Baños, P.; Morrondo, P. ........................................................................................................................................370 INFLUENCIA DEL MANEJO SOBRE LA INFECCIÓN POR COCCIDIOS EN VACAS DE RAZA AUTÓCTONA RUBIA GALLEGA. INFLUENCE OF MANAGEMENT ON COCCIDIA INFECTIONS IN AUTOCHTHONOUS RUBIA GALLEGA CATTLE. Díaz, P.; Pedreira, J.; Sánchez-Andrade, R.; Paz, A.; Suárez, J.L.; Díez-Baños, P.; Morrondo, P. ......................................................................................................................375 ESTUDIO PARASITOLÓGICO DEL GANADO OVINO EN LA PROVINCIA DE LEÓN (ESPAÑA) MEDIANTE ANÁLISIS COPROLÓGICO. PARASITIC STUDY OF SHEEP EN THE PROVINCE OF LEON (SPAIN) BY COPROLOGICAL ANALYSIS. Díez-Baños, N.; Martínez Delgado, A.; Hidalgo-Argüello, M.R.......................................380 INFLUENCIA DE LA LOCALIZACIÓN GEOGRÁFICA SOBRE LOS NIVELES DE CADMIO EN GANADO OVINO EN LEÓN (N.O. ESPAÑA). INFLUENCE OF THE GEOGRAPHIC LOCATION ON CADMIUM LEVELS IN SHEEP IN LEON (N.W. SPAIN). López Alonso, M.; Sierra Carro, J.A.; Escudero Población, A.; Benedito, J.L.; Prieto Montaña, F. ........................................................................................................................384 ANÁLISIS DE LA DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA DEL RIESGO DE EEB EN GALICIA (ESPAÑA). ANALYSIS OF THE GEOGRAPHICAL DISTRIBUTION OF THE BSE RISK ON GALICIA (SPAIN). Allepuz, A.; López, A.; Forte, A.; Fernández, G.; Casal, J. ...............................................390 CLASIFICACIÓN DE ZONAS DE GALICIA SEGÚN CARACTERIZACIÓN DEL RIESGO DE TUBERCULOSIS BOVINA. CLASSIFICATION OF ZONES OF GALICIA (NORTH- WETS OF SPAIN) DEPENDING ON THE RISK OF BOVINE TUBERCULOSIS. Fernández, G.; Diéguez, F.J. ..............................................................................................393 ANÁLISIS DE RIESGO DE LENGUA AZUL EN GALICIA. BLUE TONGUE RISK ANALYSIS IN THE GALCIA REGION OF SPAIN. Fernández, G.; Diéguez, F.J. ..............................................................................................397 XXIII XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES VALIDACIÓN DEL ELISAi PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS FRENTE A INFECCIONES DE Brucella abortus EN GANADO VACUNO. Francia, C.; Fernández, D.; Fernández, G. .........................................................................401 EL GANADO VACUNO COMO INDICADOR DE LA DEPOSICIÓN ATMOSFÉRICA DE MERCURIO EN GALICIA (NO ESPAÑA). CATTLE LIKE INDICATOR OF ATMOSPHERIC MERCURY DEPOSITION IN GALICIA (NW SPAIN). García Vaquero, M.; Benedito, J.L.; Blanco, I.; Miranda, M.; Gutierrez, B.; Hernández, J.; Castillo, C.; López-Alonso, M. ..........................................................................................405 SUL COSIDDETTO “VITELLO PANCIONE”. THE SO CALLED “PAUNCH CALF”. Gentile, A.; Militerno, G.; Sconza, S.; Testoni, S. .............................................................410 CALIDAD SANITARIA DE LA LECHE CAPRINA DE RAZAS EUROPEAS EXPLOTADAS EN EL BAJÍO MEXICANO. SOMATIC CELL COUNT OF GOAT MILK PRODUCED BY EUROPEAN RACES EXPLOITED IN THE MEXICAN BAJIO. Fernández Pérez, M.; Castillo Juárez, H. Fernández Perrino, F.J.; Saltijeral Oaxaca, J.A.; González Montaña, J.R. .....................................................................................................413 INFLUENCIA DE LA RAZA SOBRE LA DISTRIBUCIÓN ORGÁNICA DE COBRE EN TERNEROS DE CEBO SUPLEMENTADOS CON COBRE. INFLUENCE OF BREED ON ORGANIC COPPER ACCUMULATION IN FEEDLOT CATTLE RECEIVING COPPER SUPPLEMENTATION. Gutierrez, B.; López-Alonso, M.; Miranda, M.; Blanco, I.; Hernández, J.; Castillo, C.; Velasco, J.; García Vaquero, M.; Benedito, J.L. ................................................................418 EFECTOS DE LA SUPLEMENTACIÓN CON MONENSINA O Saccaromyces cerevisiae SOBRE PARAMETROS PRODUCTIVOS E HIDROELECTROLITICOS EN TERNEROS EN FASE DE CRECIMIENTO. EFFECTS OF MONENSIN AND Saccaromyces cerevisiae SUPPLEMENTATION ON PRODUCTIVE AND HYDROELECTROLYTIC BALANCE IN GROWING FEEDLOT STEERS. Hernández, J.; Castillo, C.; Vázquez, P.; Pereira, V.; Vecillas, R.; López Alonso, M.; Benedito, J.L. .....................................................................................................................423 CAMBIOS EN LOS VALORES SANGUÍNEOS DE L-LACTATO Y EN EL RENDIMIENTO PRODUCTIVO ASOCIADOS AL PROCESAMIENTO DEL GRANO EN TERNEROS DE CEBO. CHANGES IN BLOOD L-LACTATE AND GROWTH PERFORMANCE ASSOCIATED TO GRAIN PROCESSING IN FEEDLOT STEERS. Castillo, C.; Hernández, J.; Vázquez, P.; Pereira, V.; López Alonso, M.; Gómez, J.J.; Benedito, J.L. .....................................................................................................................428 XXIV XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES OBTENCIÓN DE ANTÍGENOS PARASITARIOS ÚTILES PARA EL DIAGNÓSTICO DE TREMATODOSIS BOVINAS MEDIANTE ELECTROELUCIÓN. GETTING PARASITIC ANTIGENS FOR THE DIAGNOSIS OF BOVINE TREMATODOSIS BY ELECTROELUTION. Francisco, I.; Lomba, C., Pardo, M.; Pedreira, J.; Suárez, J.L.; Sánchez-Andrade, R.; Díaz, P.; Arias, M., Paz-Silva, A.; Morrondo, M.P.; Díez-Baños, P. ..........................................433 IDENTIFICACIÓN DE CÉLULAS LEUCOCITARIAS EN MUESTRAS DE BOVINO FIJADAS EN ETANOL. CELL IDENTIFICATION IN ETHANOL-FIXED BOVINE SAMPLES. LEUCOCYTE López, C.; Panadero, R.; Dacal, V.; Vázquez, L.; Díaz, P.; Pedreira, J.; Morrondo, P.; Díez, P. ........................................................................................................................................438 DATOS PRELIMINARES SOBRE LA PARASITOFAUNA DEL CIERVO (Cervus elaphus) DE LA RESERVA REGIONAL DE CAZA DE RIAÑO (NE DE LEÓN, ESPAÑA). Martínez-Delgado, A.; Diez-Baños, N.; Hidalgo-Argüello, M.R. .....................................443 ESTUDIO DE LA PROTECCIÓN CON EL ANTÍGENO Fh15 MÁS INMUNOMODULADORES EN OVINOS INFECTADOS EXPERIMENTALMENTE CON Fasciola hepatica. ASSESSMENT OF STUDY WITH Fh15 ANTIGEN AND IMMUNOMODULATORS IN SHEEP EXPERIMENTALLY INFECTED WITH Fasciola hepatica. Morrondo, P.; Arias, M.S.; Pedreira, J.; Dacal, V.; Vázquez, L.; López, C.; Díez-Baños, P.; Martínez, A.R.....................................................................................................................450 PRODUCCIÓN DE INTERLEUQUINA 10 EN GANADO VACUNO INFESTADO EXPERIMENTALMENTE POR Hypoderma lineatum. PRODUCTION OF INTERLEUKIN 10 IN CATTLE EXPERIMENTALLY INFESTED BY Hypoderma lineatum. Panadero, R.; Cienfuegos, S.; Dacal, V.; Vázquez, L.; Pedreira, J.; Díaz, P.; López, C.; Díez-Baños, P.....................................................................................................................456 ESTADO ACTUAL DE LAS MIASIS QUE AFECTAN A LOS RUMIANTES DOMÉSTICOS EN LA PENÍNSULA IBÉRICA. CURRENT STATUS OF MYIASIS AFFECTING DOMESTIC RUMINANTS IN THE IBERIAN PENINSULA. Panadero, R.; Sánchez-Andrade, R.; Morrondo, P.; López, C.; Paz, A. Suarez, J.L.; DíezBaños, P. ............................................................................................................................461 XXV XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES APLICACIÓN CONJUNTA DE PRUEBAS DE DETECCIÓN DE RESISTENCIA ANTIHELMÍNTICA in vivo E in vitro A BENCIMIDAZOLES Y LACTONAS MACROCÍCLICAS EN TRICOSTRONGÍLIDOS OVINOS. Pedreira, J.; Díaz, P.; Suárez, J.L.; Arias, M.; Lomba, C.; Painceira, A.; Sánchez-Andrade, R.; Paz-Silva, A.; Morrondo, M.P.; Díez-Baños, P............................................................467 ESTRATEGIA RECOMENDADA PARA EL DIAGNÓSTICO Y CONTROL DE LA NEOSPOROSIS BOVINA EN LAS ADSG DE GALICIA. RECOMMENDED STRATEGY FOR THE DIAGNOSIS AND CONTROL OF THE BOVINE NEOSPOSOSIS IN THE ADSG OF GALICIA. Pedreira, J.; Díaz, P.; Suárez, J.L.; Arias, M.; Lomba, C.; Painceira, A.; Sánchez-Andrade, R.; Paz-Silva, A.; Díez-Baños, P.; Morrondo, M.P............................................................471 INFLUENCIA DE LA SUPLEMENTACIÓN CON MALATO EN DIETAS RICAS EN GRANO Y CON ALTOS NIVELES DE FIBRA BRUTA SOBRE EL EQUILIBRIO HIDROELECTROLÍTICO EN TERNEROS DE CEBO EN FASE DE CRECIMIENTO. INFLUENCE OF MALATE SUPPLEMENTATION ON HYDROELECTROLYTIC BALANCE IN GROWING FEEDLOT STEERS FED A HIGH-GRAIN, HIGH-FIBRE DIET. Pereira, V.; Castillo, C.; Hernández, J.; Vázquez, P.; López-Alonso, M.; Gómez, J.J.; Benedito, J.L. .....................................................................................................................474 DIFERENCIAS ENTRE LA SUPLEMENTACIÓN CON MONENSINA Y MALATO EN DIETAS RICAS EN GRANO Y CON ALTOS NIVELES DE PROTEÍNA BRUTA SOBRE EL EQUILIBRIO HIDROELECTROLÍTICO EN TERNEROS DE CEBO EN FASE DE CRECIMIENTO. DIFFERENCES BETWEEN MONENSIN AND MALATE SUPPLEMENTATION ON HYDROELECTROLYTIC BALANCE IN GROWING FEEDLOT STEERS FED A HIGHGRAIN, HIGH-PROTEIN DIET. Pereira, V.; Castillo, C.; Hernández, J.; Vázquez, P.; López-Alonso, M.; Vecillas, R.; Benedito, J.L. .....................................................................................................................482 CONSIDERAZIONI CLINICHE SULLA DIARREA VIRALE DEI BOVINI (BVD). Fiore, F., Cubeddu, G.M.; Lai, M.G.; Coda, S.; Pintori, G. ...............................................491 EFICACIA DE IVERMECTINA FRENTE A Oestrus ovis EN OVEJAS MEDIANTE ELISA-INDIRECTO. EFFICACY OF IVERMECTIN AGAINST Oestrus ovis IN SHEEP BY ELISA. Ramírez, M.; Suárez, J.L.; García-Alba, C.; Díaz, P.; Scala, A.; Arias, M.; Morrondo, M.P.; Díez-Baños, P.; Paz-Silva, A.; Sánchez-Andrade, R..........................................................496 XXVI XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES CHORIOPTIC MANGE IN DAIRY CATTLE: AN EPIDEMIOLOGICAL INVESTIGATION IN SARDINIA (ITALY). LA ROGNA CHORIOPTICA DELLA BOVINA DA LATTE: INDAGINE EPIDEMIOLOGICA IN SARDEGNA (ITALY). Scala, A.; Bonfanti, M. ; Leotta, G.; Rondoni Angioni, G.; Marongiu, M.; Nieddu, M.S.; Mocci, G.............................................................................................................................500 VACCINAZIONE CONTRO LA CENUROSI NEGLI OVINI – PROVE DI CAMPO. PRELIMINARY DATA ON FIELD TRIAL VACCINATION AGAINST COENUROSIS IN SHEEP. Varcasia, A.; Sanna Coccone, G.N.; Cocco, A.; Basciu, M.; Tosciri, G.; Fiori, I.; Pipia, A.P.; Lightowlers, M.W.; Garippa, G.; Scala, A................................................................507 SEROPREVALENCIA DE DICROCELIOSIS EN BOVINOS DE RAZA RUBIA GALLEGA.. Suárez, J.L.; Arias, M.; Díaz, P.; Lomba, C.; Painceira, A.; Pedreira, J.; Sánchez-Andrade, R.; Morrondo, M.P.; Díez-Baños, P.; Paz-Silva, A............................................................512 BIOLOGICAL AND NUTRITIONAL STRATEGIES FOR THE CONTROL OF TRINCHOSTRONGYLE INFECTIONS IN GRAZING GOATS. Gómez-Rincón, C.; Valderrábano, J.; Uriarte, J.................................................................516 PREVALENCIA DE LA FASCIOLOSIS OVINA Y ESTUDIOS DE RESISTENCIAS A FASCIOLICIDAS EN LA PROVINCIA DE LEÓN. PREVALENCE OF SHEEP FASCIOLOSIS AND ANTHELMINTIC RESISTANCE STUDY IN LEON PROVINCE. Vara-Del Río, M.P.; Martínez-Valladares, M.; Martínez-Delgado, A.; Rojo-Vázquez, F.A. ............................................................................................................................................523 FACTORES QUE INFLUYEN EN EL DESARROLLO DE LAS LARVAS DE Hypoderma lineatum DURANTE SU PERMANENCIA EN EL ESÓFAGO DE BOVINOS EN GALICIA. FACTORS INFLUENCING THE DEVELOPMENT OF Hypoderma lineatum LARVAE DURING THEIR PERMANENCE IN THE OESOPHAGUS OF GALICIAN CATTLE. Vázquez, L.; Panadero, R.; López, C., Dacal, V; Díaz, P.; Pedreira, J.; Morrondo, P.; DíezBaños, P. ............................................................................................................................530 EXTRACTOS VEGETALES COMO ALTERNATIVA AL USO DE MONENSINA EN LA NUTRICIÓN DE TERNEROS DE CEBO: EXTRACTOS VEGETALES. VEGETABLE EXTRACTS AS MONENSIN ALTERNATIVE IN FEEDLOT CATTLE NUTRITION: VEGETABLE EXTRACTS Vázquez, P.; Pereira, V.; Castillo, C.; Hernández, J.; López Alonso, M.; Benedito, J.L. ..537 XXVII XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES FOLLICLE NUMBER AFFECTS IN VITRO DEVELOPMENTAL COMPETENCE OF SHEEP OOCYTES. Mossa F., Berlinguer F., Succu S., Madeddu M., Bebbere D., Leoni Gg., Naitana S. ......545 ETIOLOGÍA Y SENSIBILIDAD ANTIBIOTICA DE LA MAMITIS DE VERANO EN EL OCCIDENTE DE ASTURIAS. AETIOLOGY AND ANTIBIOTIC SENSITIVITY OF SUMMER MASTITIS IN WEST ASTURIAS. Suárez De La Fuente, J.; García Paloma, J. A.; Suárez Sánchez, F, Lombardía Alvarez, V.; Martinez Lopez, M. A.; Nieto Pardal, F. .............................................................................550 XXVIII XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES POSTERS DE PRODUCCIÓN / PRODUCTION POSTERS INDAGINE SUL BENESSERE DEGLI OVINI DA LATTE IN PUGLIA: PRIMI RISULTATI OTTENUTI ATTRAVERSO L’UTILIZZO DI DIFFERENTI INDICATORI FUNZIONALI. SURVEY INTO THE WELFARE OF DAIRY-SHEEP IN APULIA: PRELIMINARY RESULTS FROM DIFFERENT FUNCTIONAL INDICATORS. Rubino, G.; Alloggio, I.; Bramante, G.; Petazzi, F. ...........................................................555 INFLUENCIA DEL COLESTEROL EN EL DESARROLLO DE LOS EMBRIONES BOVINOS CULTIVADOS in vitro. Barrio, M.; Becerra, J.J.; Peña, A.I.; Quintela, L.A.; Deiros, J.; Rey, C.; Ruibal, S.Y.; Herradón, P.G. ...................................................................................................................560 EFECTO DEL MOMENTO DE LA INCORPORACIÓN DE LA GLUCOSA AL MEDIO DE CULTIVO SOBRE EL DESARROLLO DE LOS EMBRIONES BOVINOS CULTIVADOS in vitro. Barrio, M.; Peña, A.I.; Quintela, L.A.; Becerra, J.J.; Deiros, J.; Rey, C.; Ruibal, S.Y.; Herradón, P.G. ...................................................................................................................566 INFLUENZA DI FATTORI CLIMATICI SULLE PRODUZIONI E SUI PARAMETRI EMATOCHIMICI NELLA PECORA DI RAZZA SARDA. INFLUENCE OF CLIMATIC FACTORS ON PRODUCTION AND HEMATOCHEMICAL PARAMETERS IN SARDA BREED SHEEP. Bini, P.P.; Sanna, M.; Lunesu, R.; Sanna, G.A.; Sanna, E.; Vacca, G..M.; Carcangiu, V. ............................................................................................................................................574 MANAGEMENT SYSTEMS AND MEAT QUALITY CHARACTERISTICS OF THE MAREMMANA CATTLE BREED IN TUSCANY. Bonanzinga, M.; Bozzi, R.; Giorgetti, A.; Sbarra, F.; Filippini, F. ....................................583 EVOLUCIÓN DE LA ENCEFALOPATÍA ESPONGIFORME BOVINA EN LA PROVINCIA DE LUGO (2000-2005). EVOLUTION OF BSE IN LUGO PROVINCE (2000-2005). Cantalapiedra, J.; Molinero J.; Darriba C.; Balado J.; Ocampo A.; Toubes J. ...................591 EFFETTO DELLA RESTRIZIONE IDRICA SULLE PRESTAZIONI PRODUTTIVE E SU ALCUNI PARAMETRI EMATICI IN PECORE COMISANE ALLEVATE INTENSIVAMENTE. EFFECT OF WATER RESTRICTION ON PRODUCTIVE PERFORMANCES AND SOME HAEMATIC PARAMETERS IN COMISANA SHEEP REARED UNDER INTENSIVE CONDITIONS. Casamassima, D.; Pizzo, R.; Palazzo, M.; Quaranta, A.; D’alessandro, A.G.; Martemucci, G....................................................................................................................596 XXIX XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES EFECTO DE LA ÉPOCA DE NACIMIENTO EN EL CRECIMIENTO DE TERNEROS RUBIA GALLEGA X NELORE CRIADOS EN BRASIL. EFFECT OF BIRTH DATE ON GROWTH OF RUBIA GALLEGA X NELORE CALVES IN BRAZIL. Iglesias, A.; Ferreiro, J.M.; Cantalapiedra, J.; Ramella, J. L.; Sánchez, L. ........................608 APLICACIÓN DEL MUESTREO DE GIBBS EN LA ESTIMACIÓN DE COMPONENTES DE VARIANZA Y PARÁMETROS GENÉTICOS PARA RASGOS DE CRECIMIENTO EN LA RAZA RUBIA GALLEGA. IMPLEMENTATION OF THE GIBBS SAMPLING FOR VARIANCE COMPONENTS AND GENETIC PARAMETER ESTIMATION ON GROWTH TRAITS FOR RUBIA GALLEGA CATTLE. Gandoy, J.; Sánchez, L.; Iglesias, A...................................................................................612 CALIDAD DE LA CARNE DE AÑOJO Y DE TERNERA DE RAZA TUDANCA ACOGIBLE A LA I.G.P. “CARNE DE CANTABRIA”. Martínez Penagos, A.; Sanchez, L.; Monserrat, L.; Calderon, L.; Cimadevilla, C.; Humada, M.J.; San Miguel, B.; Fernández Celis, E. .........................................................................616 CALIDAD NUTRICIONAL DEL LOMO DE LOS TERNEROS FINALIZADOS EN PASTOREO Y CEBADERO. NUTRITIVE QUALITY OF LOIN FROM CALVES FINISHED ON PATURE AND FINISHED ON CONCENTRATE. Bispo, E.; Monserrat, L.; Franco, D.; Pérez, N.; Moreno, T. .............................................623 EFFETTO DELLO STATO DI GESTAZIONE SULL’ANDAMENTO DI PARAMETRI EMATOCHIMICI NELLA PECORA DA LATTE. PREGNANCY STATUS EFFECT ON BLOOD PARAMETERS TREND IN DAIRY SHEEP. Morgante, M.; Vazzana, I.; Gianesella, M.; Ferrantelli, V.; Cannizzo, C.; Stelletta, C. ...631 THE QUALITY OF OVINE OOCYTES IS RELATED TO THE KINETIC OF MATURATION. Berlinguer, F.; Succu, S.; Mossa, F.; Madeddu, M.; Bebbere, D.; Satta, V.; Leoni, G.G.; Naitana, S. ..........................................................................................................................640 EVOLUZIONE DELLA FRAZIONE CASEINICA DEL LATTE BUFALINO CONGELATO. THE EVOLUTION OF CASEIN FRACTION IN FROZEN BUFFALO MILK. Alviti, G.; Loizzo, P.; Trani, A.; Pieragostini, E. ...............................................................645 XXX XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES APLICACIÓN DE UN IMPLANTE AURICULAR DE PROGESTERONA PARA EL TRATAMIENTO DEL SÍNDROME DE REPETICIÓN DE CELOS EN LA VACA. USE OF EAR PROGESTERONE IMPLANTS FOR TREATING REPEAT BREEDING SYNDROME IN COWS. Díaz, C.; Quintela, L.A.; Becerra, J.J.; Peña, A.I.; Rey, C., Barrio, M.; Ruibal, S.; Herradón, P.G. ....................................................................................................................................649 EVALUACIÓN DEL POSTPARTO EN LA RAZA RUBIA GALLEGA. Rey C.; Quintela L.A.; Peña A.I.; Becerra J.J.; Deiros J.; Barrio M.; Herradón P.G.........653 QUALIFICAZIONE DELL’AGNELLO ZERASCO: 1. PERFORMANCE IN VITA E QUALITÀ DELLA CARCASSA. QUALIFICATION OF ZERASCO LAMBS: 1. LIVE PERFORMANCE AND CARCASS QUALITY. Russo, C.; Preziuso, G.; D’agata, M.; Verità, P. ................................................................659 QUALIFICAZIONE DELL’AGNELLO ZERASCO: 2. QUALITÀ DELLA CARNE. QUALIFICATION OF ZERASCO LAMBS: 2. MEAT QUALITY. D’Agata, M.; Russo, C.; Serra, A.; Mele, M.; Preziuso, G.;Verità, P. ...............................663 CARATTERISTICHE MORFOMETRICHE DEL GLOBULO DI GRASSO DEL LATTE OVINO (nota I): INFLUENZA DEL TIPO GENETICO E DELLA FASE DI LATTAZIONE. INFLUENCE OF GENETIC TYPE AND PHASE OF LACTATION. MORPHOMETRIC CHARACTESISTICS OF SHEEP MILK FAT GLOBULES (part I): Martini, M.; Salari, F.; Scolozzi, C.; Bianchi, L.; Pauselli, M.; Rossetti, E.; Verita, P......667 CARATTERISTICHE MORFOMETRICHE DEL GLOBULO DI GRASSO DEL LATTE OVINO (nota II): RELAZIONI CON I PARAMETRI QUANTI-QUALITATIVI DELLA PRODUZIONE. MORPHOMETRIC CHARACTESISTICS OF SHEEP’S MILK FAT GLOBULES (part II): RELATIONSHIP WITH SOME QUANTITATIVE AND QUALITATIVE PARAMETERS OF MILK PRODUCTION. Martini, M.; Salari, F.; Scolozzi, C.; Bianchi, L.; Pauselli, M.; Rossetti, E.; Verita, P......672 COMPOSIZIONE CHIMICA DEL TESSUTO MUSCOLARE DEL CAPRETTO SARDO DA LATTE CHEMICAL COMPOSITION OF SARDINIAN SUKLING KID MUSCLE. Vacca G.M.; Dettori M.L.; Daga C.; Carcangiu V.; Pazzola M.; Tilloca G. .....................678 XXXI XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES IL BENESSERE ANIMALE NELL’ALLEVAMENTO INTENSIVO DEL BOVINO DA CARNE: CORRELAZIONE TRA SPAZIO LIBERO DISPONIBILE E PARAMETRI PRODUTTIVI. ANIMAL WELFARE IN INTENSIVE BEEF-CALF FARMING: THE RELATIONSHIP BETWEEN UNOBSTRUCTED SPACE-ALLOWANCE AND PRODUCTION PARAMETERS. Pazzola, M.; Vacca, G.M.; Carcangiu, V.; Pintore, M.D.; Ouled Ahmed Ben Ali, H.; Bini, P.P. .....................................................................................................................................685 XXXII XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES: VEINTE AÑOS DE BUIATRÍA GARCÍA PARTIDA, P. Con la colaboración del Dr. LUIS RUIZ ABAD Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid. 28080 Madrid (España). La creación de una federación transnacional cual es la de nuestra cuenca del Mediterráneo, conllevo la necesidad de la misma, expuesta en foros internacionales por los diversos especialistas que al acudir a los mismos, nos planteamos la necesidad de desarrollar una organización que pudiera no solo agrupar a científicos de países de un mismo área geográfica, sino que sirviera para solucionar problemas inherentes a estos países. FEMESPRUM se origina en los Congresos mundiales de la Asociación Mundial de Buiatria, creada esta Asociación por Rossemberg en Hannover, nos incorporamos a este movimiento buiatras del mundo entero, si bien y desde su génesis pudimos evidenciar que los problemas presentados por los países de la Europa verde no siempre iban a coincidir con los nuestros, de ahí que iniciáramos contactos y reuniones de los delegados de nuestra área para tratar de influir en los comités y seminarios de los periódicos congresos, estos hechos se evidenciaron ya con rigor en el Congreso de Tel-Avit, cuyo presidente el Profesor MAYER, hizo explicita referencia a la necesidad de que la Buiatria Mundial se ocupara no solo de las enfermedades de los bovinos sino de llos problemas del resto de los rumiantes, dado que en el Mediterraneo no es posible diferenciar su común problemática. Es en Durban donde va a crearse el clima adecuado para que nuestras propuestas vayan tomando sentido, ya que es aquí donde se elige Presidente de la A.M. de Buiatria al Profesor ESPINASS de Francia, continuando de vocal por nuestro área el Prf. MAYER,de Israel en este Congreso España obtuvo el mandato para la organización del Mundial de Buiatria, a celebrar en Palma de Mallorca, aceptando las condiciones que nuestra aún inexistente Federación propuso a la Asamblea General, • • • • • El titulo del Congreso seria Mundial de Buiatría (hasta Dublín se nomino de “Enfermedades de los Bovinos” Desde este Congreso se aceptaría por el Comité organizador Comunicaciones científicas del resto de los rumiantes Hasta un 20 % de los trabajos presentados podrían versar sobre Producción de rumiantes El Congreso de Palma de Mallorca debería de configurar en el Mismo al máximo de científicos de los países del Mediterráneo En DUBLIN y de acuerdo con la dirección de la Mundial de Buiatria programamos una Reunión de los asistentes de nuestro área, demandando de los mismos su integración en los trabajos del Congreso de Palma de Mallorca, y estableciendo las bases para crear si así se estimara en su momento una Federación de países del Mediterráneo en este próximo evento científico. El Congreso de Palma de Mallorca (POR PRIMERA VEZ mundial de Buiatria, XV Congreso) se anuncia en su documentación la convocatoria de una asamblea de los países 1 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES del Mediterráneo con el fin de plasmar la creación de nuestra Federación, esta nace bajo los auspicios de la Mundial de Buiatria, ya que fue presidida por el Presidente de la Mundial de Buiatria Prf. ESPINAS, actuando como secretario de la misma el de la propia Mundial Pr. Mateus STOBER. El Comité científico de este Congreso aporto una considerable contribución económica para el posterior desarrollo de esta iniciativa, se constituyo un comité de notables entre los que se encontraban ESPINASSE por Francia J. GENTILE por Italia que presidirá este comité, JAZBEZ por la antigua Yugoslavia, VAZ PORTUGAL, por Portugal MAYER por Israel, GARCIA PARTIDA por España, actuando como secretario el Prf TRENTI de Italia. La Asociación Italiana de Buiatria fue encargada del desarrollo y tramitación de la nueva Federación, para lo cual no solo aporto su apoyo logístico imprescindible sino que desembolso una importante cifra económica. Giusepe GENTILE, a la sazón Presidente de la Facultad de Medicina Veterinaria de Bolonia, organizo meses antes , dentro de los actos de celebración del noveno centenario de la Universidad de Bolonia una “Conferencia Internacional” sobre “Sanidad y producción bovina en el área del Mediterráneo”, ala cual acude el Presidente de la Mundial de Buiatria, Prf. Espinasse.y los miembros de su directiva, E. Mayer y Dirksen, así como representantes de F.A.O., O.M.S., O.I.E., y representantes de diversos servicios de países mediterráneos como Malta Egipto, España, Sudan, Etiopía, Grecia, Chipre, y los miembros del Comité constituido en Palma de Mallorca. Un año después, 12-14 de mayo de 1989, y bajo los auspicios de la Sociedad Italiana de Buiatria, en su XXI congreso, se reunió este comité en Gardone Rivera, aprobándose tras su discusión los estatutos elaborados por Trenti y Soldati , tomando desde este momento carta de naturaleza la FEDERACIÓN MEDITERRANEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES. La cronología de estos eventos científicos hasta el que hoy iniciamos en la Universidad de Santiago de Compostela es la Siguiente: ALGHERO 1991 SALAMANCA 1992 TERAMO 1993 MURCIA 1996 BOLONIA 1997 POSTONIA 1998 SANTAREM 1999 SICILIA 2000 LEON 2001 OLBIA (Sassari) 2002 TUNEZ 2003 ESTAMBUL 2004 BARI 2005 SANTIAGO / LUGO 2006 Nuestros estatutos disponen que los Congresos serán organizados anualmente por una Universidad, y no por un país concreto, contando en todo momento con la aportación de su Asociación nacional de Buiatria. 2 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Las aportaciones científicas tendrán que ser publicadas “in extenso” en los seis mese posteriores a la celebración del congreso respectivo., se admitirán para su publicación en el idioma del autor o autores, si bien deberá de aportar un resumen en Español, Francés o Italiano. Debemos hacer referencia al tiempo transcurrido entre Teramo y Murcia, recordando que en ese tiempo se celebro el Congreso Mundial de Buiatria, en Bolonia, siendo Gentile y Trenti sus organizadores, por lo cual este Congreso tuvo una parte satélite dedicado específicamente a nuestra Federación. La Universidad de Salamanca, fue la organizadora de la FERIA UNIVERSAL GANADERA, dentro de la celebración del quinto centenario de la llegada de Colon a América, se organizo un Congreso que fue presidido por Gentile y García Partida al haber sido invitada la “Latino Americana de Buiatria” se incorporo a la organización su entonces presidente el Dr. Ugarte, a la sazón vicepresidente de la Mundial de Buiatria. Quiero especialmente destacar que la REAL ACADEMIA DE CIENCIAS VETERINARIAS, celebro una sesión solemne en el paraninfo de la Universidad salmantina para recibir como miembro de la misma al uruguayo Raúl Casas Olascoaga, quien presidirá años más tarde el Congreso Mundial de Buiatria en Montevideo, el acto fue presidido por el Prf. Illera actuando como padrino del recipendiario el Prf. García Partida. Hemos de destacar que el celebrado en Postonia, en la recién creada Republica de Eslovenia, tuvo una singular trascendencia , ya que fue el primer evento internacional que organizo este joven país, el entonces Presidente de la Asociación Mundial de Veterinaria el griego Apostolos Rantsios ,desarrollo la conferencia inaugural disertando sobre “Algunas observaciones sobre la profesión veterinaria contemporánea” Es en Postonia donde se celebra el X Congreso, por lo cual el Comité organizador hizo entrega de placas acreditativas a los miembros de honor de esta Federación El X Congreso se celebro en Túnez, como satélite del XXVII Congreso mundial de Veterinaria. Los estatutos indican claramente que los congresos no serán adjudicados a países concretos, sino a universidades de esos países, si bien en este caso el comité directivo propuso esta variación a la asamblea, dado que por primera vez el FEMESPRUM celebraría en la costa africana del Mediterráneo su congreso. Al Presidente Gentile, le sucede el binomio Prieto Gutierrez Panizo, quienes y tras la oportuna votación entregan en León al Profesor Pugliese la Presidencia, siendo reelegido este por un segundo mandato cuatrianual en Estambul. La aportación científica ha sido de 1194 artículos, y 114 ponencias. Distribuidos en la siguiente forma, tomando a Alghero como valor base 100, la evolución se ve reflejada en la siguiente gráfica. La presentación de artículos referentes a Patología representa el 68,5 %, frente al 31,5 % aportaciones vinculadas con la Producción animal. El siguiente gráfico nos muestra el % de las diferentes especies, siendo los bovinos claro esta la que nos muestra una mayor presencia, si bien al integrar a los pequeños rumiantes ovejas y cabras observamos como alcanzan un numero similar de aportaciones que la de los bovinos.es indudable que esto en parte se ha debido al efecto compensador de la P.A.C., ya que el censo de estas especies se ha elevado notablemente gracias a la politica de subvenciones de la U.E., si bien por el contrario en algúnos países la implantación de cuotas lacteas ha venido a debilitar la presencia de explotaciones bovinas. 3 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Nos hacemos eco de que los búfalos alcanzan un 4,1 % de nuestros contenidos, así como hemos visto que las aportaciones sobre los “camélidos son testimoniales. No así lo concerniente a rumiantes salvajes, su evolución e importancia insto a que en la Asamblea de Bari, se determinara la conveniencia de que este Congreso de Santiago tuviera como tema principal el de RUMIANTES SALVAJES. EL FEMESPRUM lo constituyen 21 países con derecho a ser miembros natos, incluyendo los no ribereños como Rumania Portugal y Siria. Mantenemos relación con los sigioentes organismos y entidades: OMS, FAO, UNESCO. Oficina Internacional de Epizootias, Consejo de Europa, Unión Europea, Asociación Mundial de Veterinaria, Asociación Mundial de Buiatria, Sociedades nacionales de Buiatria de la cuenca Mediterranea. Asociación Latinoamericana de Buiatria, Asociación Centroeuropea de Buiatria. Excelentísimo Sr. Presidente de FEMESPRUM, Profesore PUGLIESE (mio caro amichi Antonio, esta es la síntesis los primeros veinte años de vida de nuestra Federación, si en Slovenia alcanzamos la pubertad creo sinceramente que en Santiago y Lugo llegamos a nuestra mayoría de edad, Rector Magnifico de esta Universidad de Santiago, os confieso que cuando se me encargo esta ponencia inagural, y pese a mi larga trayectoria Universitaria me sobrevino el lógico nerviosismo de ocupar este histórico estrado de Fonseca, pero a la vez me senti reconfortado al pensar que como unico representante de aquel comité de siete miembros nuestra labor conjunta se iba a ver recompensada por estos tan gratos y emotivos momentos, por todo ello y en recuerdo de los Profesores ESPINASSE, GENTILE, MAYER y VAZ PORTUGAL, demando de vuestra autoridad permiso para rendirlos nuestro comun homenaje postumo guardando un minuto de silencio Para finalizar deseo como único de los siete integrantes del comité constitutivo hacer alguna reflexión para el futuro. Como habéis podido comprobar era una necesidad diferenciarnos de los países con un elevado índice publio métrico, y ocuparnos de los pequeños rumiante y otras especies, así como incorporar la producción animal, no obstante considero necesario que la programación venidera se haga eco de la necesidad de que Femesprum se abra a otros países ribereños, es la forma más convincente de favorecer el desarrollo buiatrico en estos países, facilitar intercambios culturales y promover desde las propias Universidades con Facultades de Veterinaria el estudio de los rumiantes, como principal elemento transformador en alimentos , carne leche, mantequilla, cueros lana, el escaso manto vegetal de nuestro campo, estableciendo a la vez un magnifico elemento conservador de nuestro entorno natural, ya que son estos rumiantes ribereños, principalmente los pequeños rumiantes y rumiantes salvajes, los que van ha tener un efecto corrector en el consumo de subproductos y facilitaran la eliminación de restos vegetales, secos, tan peligrosos en el estiaje. GRACIAS POR SU ATENCIÓN, HE DICHO 4 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES APLICACIONES PRÁCTICAS DE LA BIOTECNOLOGÍA DEL ADN EN LOS PROGRAMAS DE MEJORA GENÉTICA DE LOS RUMIANTES. LÓPEZ VIANA, J. Jefe de área de Producción e Innovación Tecnológica. Xenética Fontao, S.A. El gran desarrollo alcanzado por la Genética Molecular en las últimas décadas ha generado numerosas aplicaciones en el campo de la Veterinaria. Los llamados "Proyecto genoma" de las diferentes especies animales, son proyectos de investigación cuyo propósito es conocer la secuencia de todo el ADN de la especie en cuestión. A diferencia de lo que ha ocurrido en genética vegetal y en genética humana, en sanidad y producción animal la inversión dedicada al desarrollo genómico ha sido mucho más reducida, sin embargo, las iniciativas llevadas a cabo para secuenciar el genoma humano han servido de catalizador para cambiar en los últimos 10 años el interés de los grupos de genética animal en la genómica, ésta es una subdisciplina de la genética que tiene por objetivo la caracterización molecular de los genomas completos. Xenética Fontao, S.A. es una empresa especializada en la mejora genética, que se encarga de la gestión del Centro de Selección y Reproducción Animal de Galicia. En el año 1999 creó el Laboratorio de Genética Molecular, como una nueva unidad para la prestación de servicios mediante el empleo de la biotecnología del ADN en los campos de la Sanidad y la Producción Agropecuaria. Esta unidad en el año 2001 quedó registrada como miembro institucional de la I.S.A.G. (International Society for Animal Genetics) con el código laboratorial E/X. La ISAG es el organismo encargado a nivel internacional para coordinar a los distintos laboratorios y estandarizar protocolos, nomenclaturas y selección de paneles de marcadores moleculares, que permitan que los resultados obtenidos por los distintos investigadores sean objetivos y comparables. Esta Sociedad apoya de forma eficiente el intercambio de trabajos de investigación, resultados y sus aplicaciones, mediante la organización de conferencias, workshops, organizando test de comparación, publicación de la revista Animal Genetics (diario oficial de la ISAG), y otras numerosas actividades. Varios hechos ocurridos en las últimas décadas se pueden considerar como los responsables del gran desarrollo actual de la genómica. En base a su aparición desde el punto de vista cronológico cabría destacar los siguientes: el descubrimiento de las endonucleasas o enzimas de restricción, el desarrollo de los métodos de secuenciación automática y los descubrimientos de la reacción en cadena de la polimerasa o PCR (Polymerase Chain Reaction) y los marcadores genéticos moleculares. Con la aparición de las técnicas modernas de la biología molecular, surgieron diversos métodos de detección de polimorfismo genético directamente a nivel del DNA. Los marcadores moleculares son fragmentos de ADN que sirven de referencia para seguir la transmisión genética de una generación a otra. En un sentido restringido, un marcador genético es una entidad genética que manifiesta polimorfismo y se hereda de forma mendeliana. El interés por detectar la variación molecular para diversas aplicaciones prácticas ha conducido a un enorme incremento en el tipo y número de marcadores disponibles para análisis genético. Existen numerosas aplicaciones resultantes del estudio de los diferentes marcadores genéticos moleculares en los programas de mejora genética animal, por su utilidad práctica se podrían destacar las siguientes: 5 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES - Identificación genética: desde un estado muy temprano del desarrollo los individuos poseen un genoma estable, este hecho permite hablar de lo que frecuentemente se ha denominado la “huella genética” que, como la huella dactilar de un individuo, es única y fácilmente evidenciable mediante técnicas moleculares, y permite la identificación del individuo en todo momento y circunstancia. Los marcadores genéticos que se analizan hoy en día para la realización de este tipo de pruebas, son los microsatélites o STRs (Short Tandem Repeats). Estos marcadores son particularmente apropiados para este tipo de pruebas por sus propiedades: son muy abundantes y están dispersos en todo el genoma, su modelo de herencia es mendeliano en codominancia, son altamente polimórficos o con elevado número de alelos y su análisis es de gran reproducibilidad experimental, con fácil identificación mediante PCR, y muy apropiados para analizar mediante reacciones múltiplex en los nuevos analizadores genéticos automáticos. - La comparación del perfil genético obtenido del análisis de los microsatélites entre individuos, proporciona numerosas aplicaciones prácticas, como son los análisis de filiación, que permiten garantizar la fiabilidad y credibilidad de los libros genealógicos en las distintas razas animales. Se trata de una prueba genética que se utiliza para comprobar el pedigrí de un individuo. Confirmar la ascendencia de un animal garantiza el valor genético del mismo, y por tanto su valor económico. La aplicación rutinaria de estos análisis en el control de la reproducción, por inseminación artificial y/o transferencia de embriones, permite evitar errores en ambos procesos y fraudes en el origen de semen o embriones; y esto es importante debido al coste de los procesos involucrados, especialmente el del material genético. - El perfil genético que se obtiene al analizar diferentes muestras de un mismo individuo, se puede aplicar al control de la trazabilidad o rastreabilidad de los productos. Así, por ejemplo, en el caso de la industria de la carne o productos cárnicos, la utilización de los marcadores de ADN permite asegurar una trazabilidad del 100%. La molécula de ADN, además, tiene la ventaja de que es bastante estable a diferentes tratamientos (calor, salado, ahumado, etc.), posibilitando así su estudio en cualquier punto de la cadena de producción. - Diagnóstico de enfermedades genéticas: procesos provocados por alteraciones en los genes, y que pueden ser a nivel de un gen, varios genes (poligenes) o incluso cromosomas (trisomías, monosomías, etc.). La alteración genética puede producir por sí misma directamente la enfermedad, o bien, determinar la resistencia o susceptibilidad a padecerla (como ocurre por ejemplo en el Scrapie o Encefalopatía Espongiforme Transmisible ovina). El interés del diagnóstico de las enfermedades genéticas se centra en la detección de los animales portadores de estas anomalías hereditarias, sobre todo si se trata de animales empleados como reproductores en los programas de mejora genética (productores de semen para inseminación artificial, embriones para transferencia embrionaria u ovocitos para fecundación in vitro), por la gran propagación que provocan de los mismos en la población, ya que existen determinados sementales de los se comercializan cientos de miles de dosis seminales. - Diagnóstico de anomalías genéticas: todas las células diploides de un individuo presentan la misma dotación cromosómica, sin embargo, ocasionalmente se puede producir un cambio cromosómico después de la formación del zigoto, provocando que determinadas secciones de tejidos contengan células con diferentes constituciones cromosómicas. Estos individuos se conocen como mosaicos o quimeras. El síndrome Freemartin en bovino constituye el 6 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES ejemplo clásico de esta anomalía sexual en Medicina Veterinaria, y provoca infertilidad en hembras nacidas gemelas de macho. El Freemartinismo no se puede prevenir, pero se puede diagnosticar de forma precoz en el momento del nacimiento empleando la técnica de PCR. - Identificación de variantes genéticas relacionadas con caracteres productivos o morfológicos: como por ejemplo en las proteínas lácteas, donde numerosas investigaciones realizadas a lo largo de los últimos treinta años, han demostrado que algunas de sus variantes genéticas tienen efectos importantes sobre la composición de la leche, y sobre las propiedades tecnológicas y el rendimiento para la fabricación quesera. Otras veces, estas mutaciones originan cambios morfológicos, como ocurre en la raza vacuna Holstein, en la que existen dos subpoblaciones en base a las variaciones en los genes responsables de la coloración de la capa. - Otras aplicaciones: existen otras muchas aplicaciones resultantes del estudio de los marcadores genéticos moleculares, como son: la Identificación Racial, útil para evitar actividades fraudulentas en la comercialización de ciertos productos nobles de determinadas razas, empleando productos provenientes de animales de menor valor comercial; la Identificación de Especies, de gran aplicación para evitar la sustitución parcial o total con materias primas de menor calidad en productos elaborados, que no presentan características físicas reconocibles; los estudios de Variabilidad Genética de las poblaciones, cuya información puede ser empleada para conocer los límites existentes para la selección y la mejora genética y, por lo tanto, para el control de las actuaciones en las diferentes razas animales, y por último, la Selección Asistida por Marcadores, principal línea de investigación actual de la genómica y que cada vez con más fuerza se está incorporando en los programas de mejora genética, ya que contribuye a conseguir mayores ganancias genéticas por unidad de tiempo, al ser posible la selección de los individuos sin necesidad de su información fenotípica. 7 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES DISEASES RELATED TO COPPER, MOLYBDENUM AND SULPHUR INTERACTIONS IN RUMINANTS S.R. GOONERATNE Cell Biology Group, Agriculture & Life Sciences Division Lincoln University, Canterbury, New Zealand KEY WORDS Copper, molybdenum, sulphur, mineral interactions, polioencephalomalacia ABSTRACT Copper (Cu), molybdenum (Mo) and sulphur (S) are essential minerals for the functioning of many biological processes in animals and humans and their interactions are widely recognised as being important especially in ruminant nutrition. A small change in Mo or S at concentrations encountered naturally in feed or herbage is capable of producing major changes in absorption, distribution, or excretion of Cu, resulting in clinical syndromes of either Cu deficiency or Cu toxicity in ruminants. Cattle given high S and low Cu in the feed tend to have low blood thiamine (B1) concentration and succumb to polioencephalomalacia (PEM). INTRODUCTION The importance of Cu, Mo, and S for proper functioning of many biological systems is well documented (Underwood, 1977). Copper deficiency and Cu toxicity of grazing animals occur in many parts of the world. The development of these two syndromes depends not only on total Cu concentrations in the diet but also on other factors which influence the absorption and availability of Cu. Of these, the concentrations of Mo and S in the diet are most important. In addition, excess dietary iron (Fe) and zinc intakes can also independently affect Cu absorption. Copper, Mo and S content of pasture and forage varies with the species of plant, soil conditions and fertilizer used. The Cu content of ruminant diets usually vary between 4 and 10 mg kg -1 dry matter (DM), Mo within the range of 0.1 to 5 mg kg -1 DM, and the total inorganic and amino acid S content between 1 and 3 g kg -1 DM. Ruminants are most susceptible to Cu deficiency and toxicity. A small change in herbage Mo or S at concentrations encountered naturally in feedstuffs is capable of producing a major change in absorption, distribution, or excretion of Cu in ruminants, resulting in clinical syndromes of Cu deficiency, Cu toxicity or other associated syndromes such as PEM. Copper toxicity is common in sheep, apparently because of their inability to excrete excess Cu from the body (Gooneratne et al. 1985a). The pathogenesis of Cu toxicity in sheep has been reviewed (Howell and Gooneratne, 1987). Although common in sheep, Cu toxicity is rare in cattle. Cu deficiency is an important problem in both species although cattle are more susceptible to Cu deficiency than sheep. Field studies have shown that cattle fed high S and low Cu show low blood B1 levels and succumb to PEM. The emphasis in this paper is on Cu, Mo, S and B1 interactions and the associated disease syndromes that occur due to imbalances of these, namely, Cu deficiency, Cu toxicity and PEM. 8 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES COPPER DEFICIENCY The first reports of naturally occurring problems in ruminants related to a lack of Cu that responded to Cu therapy was “Salt-sick” of cattle in Florida (Neal et al, 1931) and “Lecksucht” of sheep and cattle in Netherlands (Sjollema, 1933). Subsequently, an ataxic disease of lambs due to Cu deficiency of ewes during pregnancy in Western Australia was reported (Bennetts & Chapman, 1937). In most cases of Cu deficiencies in ruminants, a range of clinical symptoms including scouring, growth depression, emaciation, anaemia, achromotrichia, and excessive craving for salt have been reported (Underwood, 1977). Genetic variation in Cu metabolism is seen in both sheep and cattle. Scottish Blackface sheep are more prone to Cu deficiency (Wiener, 1987) because they absorb less Cu from the intestines. Certain breeds of cattle like the Simmental are also sensitive to Cu deficiency since they excrete more Cu in bile and urine (Gooneratne et al. 1994). The biochemical basis for the clinical manifestations of Cu deficiency has been unravelled. “Enzootic ataxia” in newborn and “swayback” in lambs occur due to a loss of cytochrome oxidase enzyme activity, bone fragility and cardiovascular disorders due to a deficiency of lysyl oxidase and therefore a lack of elastin - collagen cross linkages, anaemia due to a derangement in mobilization and transport of Fe as a consequence of low ferroxidase activity of the ceruloplasmin enzyme, coat colour changes in cattle and sheep and a loss of crimp (“steely wool”) in sheep due to a lack of disulphide linkages in keratin, low immuno-competence due to low superoxide dismutase enzyme activity, swelling of joints, increased brittleness of bones, and loss of compact bone from the shaft of long bones due to a deficiency of the enzyme lysyl oxidase, an important Cu-containing enzyme involved in cross-linking of connective tissue, and loss of hair colour due to a deficiency of tyrosinase enzyme. COPPER TOXICITY In many parts of the world, Cu toxicity is generally a rare occurrence now in grazing animals. When it occurs, chronic Cu toxicity is usually seen only in small ruminants, especially in sheep. However, cattle grazing areas rich in soil Cu, Cu accumulation can still pose problems (Alonso, 2002). Among sheep, some breeds such as Texel are more prone to Cu toxicity (Wiener, 1987). Sheep develop Cu poisoning on diets containing amounts of Cu well tolerated by cattle. This is because in contrast to cattle, sheep have an inherent inability to excrete excess Cu via bile (Gooneratne and Christensen, 1984). Diets containing 15 mg kg -1 are dangerous especially if the Mo content is below 0.1 mg kg -1. The clinical phase of Cu toxicity in sheep is characterised by the haemolytic crisis. At this time, there is massive liver necrosis, the animal becomes dull and lethargic, pass soft faeces, lose appetite, and the mucous membranes become jaundiced. It is now believed that the massive liver damage and haemolysis are due to a sudden release of massive amounts of Cu, Cu metallothionein, and acidic enzymes from the large lysosomes that rupture just prior to haemolysis. Haemolysis and hypercupraemia overload the kidney tubular cells with haemoglobin, Cu, and Fe and these lead to severe necrosis of renal tubules (Howell and Gooneratne, 1987). 9 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES EFFECT OF Mo AND / OR S ON Cu METABOLISM The principal site of the interaction between Cu, Mo, and S in ruminants is in the alimentary tract. Sulphur compounds exacerbate molybdenosis and also appear to have an independent, negative effect on Cu absorption. Suttle and Peter (1985) observed a negative correlation between rumen sulphide and plasma Cu concentrations. There is also evidence that S and Fe also have independent effects on liver Cu in calves, since removal of supplemental S does not reduce the severity of Fe-induced Cu deficiency (Humphries et al. 1983). Excess Mo can independently cause Mo toxicity in addition to Cu deficiency, especially in cattle. A Cu:Mo ratio of 5:1 or less in forage is reported to cause molybdenosis. The typical symptoms are severe scouring, and achromotrichia, and infertility. Excess Mo inhibits two enzymes, sulphite oxidase and sulphide oxidase in the gut and liver. This affects conversion of S2- to SO4 in the enterocytes. Excess S2- is now thought to be responsible for the scouring. In addition, Mo forms a complex with S to form thiomolybdates (TM). Dick et al (1975) and Suttle (1975) proposed that TM form spontaneously in the rumen. These workers suggested that TM would react with Cu in the rumen to form an insoluble Cu-TM complex and that most of this is not absorbed but eventually excreted in the faeces. The role of rumen TM in the induction of Cu deficiency has since been confirmed by many researchers and it has now been conclusively shown that TM when administered intravenously (iv) over a prolonged period induces a full range of clinical signs (Gooneratne et al. 1981a; 1981b) which are similar to those observed when excess dietary Mo and S are given to sheep (Bremner and Young, 1978). It is established that tri (TM3) and tetrathiomolybdates (TM4) are primarily responsible for the inhibitory effects on Cu absorption from the gut. In ruminants, a relatively high dietary content of Mo ultimately decreases liver Cu and provokes clinical signs of Cu deficiency. But frequently an increase in plasma Cu levels is also observed. However, most of this Cu is not released into the supernatant on precipitation of plasma proteins with 5% trichloroacetic acid (TCA). Bremner (1976) has shown that the appearance of this TCA insoluble component was contingent upon a simultaneous high intake of both Mo and S and did not appear if the intake of either was low. Thus, it is not surprising that TM given either iv (Gooneratne et al. 1981b) or duodenally (Mason et al. 1980) produce a marked and an immediate increase in plasma Cu most of which is TCA insoluble. It has been suggested that the presence of TCA insoluble Cu in plasma reflects transformation of Cu to a more tightly bound (and thus metabolically unavailable) form although in reality the significance of this fraction is still not clear. Thiomolybdate compounds are absorbed from the rumen to bind reversibly to Cu in albumin (Mason et al. 1982). The end result is a delay in transfer of Cu to extravascular space and tissues including the liver. Thiomolybdates inhibit a wide range of Cu enzymes in-vitro. The diamine oxidase activity of Cp is inhibited by all forms of TM in vitro, particularly by TM4 (Kelleher and Mason, 1979). When sheep are fed low to moderate Cu levels and given high dietary Mo and S (Allen and Gawthorne, 1986), or TM4 iv (Gooneratne et al. 1981a), a rapid decline in the hepatic Cu reserves occurs. Based on these findings Gooneratne et al (1981a) first suggested that iv administration of TM4 might be of value in the control of Cu intoxication in sheep. In contrast, if the sheep are maintained on a basal diet high in Cu and subjected to the same high Mo and S exposure or TM4 (Gooneratne et al. 1981a), the Cu and Mo concentrations 10 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES in the liver increase markedly. In spite of this, the activities of SOD and cytochrome oxidase in the liver are markedly reduced suggesting that much of the increased liver Cu is not available for the normal liver metabolism (Allen and Gawthorne, 1986). Kidney Cu accumulation occurs in sheep given either excess dietary Mo and S supplements (Marcilese et al. 1969), or TM4 iv (Gooneratne et al. 1989a). The rate and degree of Cu accumulation in the kidneys of sheep given TM appears to depend on several factors: a) Cu intake, b) liver Cu concentration, and c) dosage of TM. The highest Cu (and also Mo) concentration was found in the kidneys of sheep which received high oral Cu intakes and TM4 iv (Gooneratne et al. 1981a; 1981b). Albumin may be one route whereby Cu and TM are transferred to the kidney to accumulate therein, because degradation of modified albumin molecules is slower. Changes in long bones of cattle and sheep fed excess Mo and S have been reported (Underwood, 1977). Skeletal abnormalities can be induced in rats given TM4 at Mo levels of 6 to 20 mg Kg-1 DM in the diet (Mills et al. 1976). Abnormalities have been reported in femur, tibia, fibula and cranium with changes in long bone growth being most severe. Sheep given high doses of TM iv developed severe diarrhoea (Gooneratne et al 1981a), an indication of molybdenosis. Rats given TM4 for two weeks showed an increase in mitochondrial abnormalities in the mucosal cells of the duodenum and jejunum, and apoptosis and necrosis of the caecal and colonic mucosa (Fell et al. 1979). The cytochrome oxidase activity of the intestinal epithelial cells was reduced indicating local interference in the availability of Cu to these cells. Since S2- may be generated from TM, it is possible that this S2- may have inhibited cytochrome oxidase directly. Although bile is regarded as the major pathway of Cu excretion in all species, there are only few reports on long term monitoring of Cu secretion via this route in ruminants (Symonds, 1982; Gooneratne et al. 1994). We have shown that iv TM lowers liver Cu levels in sheep and increases excretion via faeces and urine (Gooneratne et al 1981a). But Cu excreted in faeces may have originated from bile, endogenous secretion of saliva, gastric and intestinal juices, or exogenous secretion of unabsorbed dietary Cu. Gooneratne and Christensen (1984) and Gooneratne et al (1985) were the first to report that iv administration of TM4 to sheep causes a dramatic increase in biliary Cu (and Mo) secretion. A subsequent study carried out using radiolabel led 67Cu and 99Mo labelled TM4 (Gooneratne et al. 1989a; 1989b) showed that the increase in biliary Cu excretion originates mostly from the liver, but a small proportion is probably transferred directly from plasma as a plasma Cu-TM complex from the hepatic artery into the bile ductules in the vicinity of the portal triad as suggested by Kressner et al (1984). The similar times of peak biliary Cu excretion patterns when either 67Cu or 99Mo labelled TM4 is injected in sheep and the synchrony with which both 67Cu and 99Mo are secreted into bile suggest similar pathways (transbiliary, transhepatocellular and hepatolysosomal) of bile Cu excretion in either situation (Gooneratne et al 1989a; 1989b). But during removal of Cu from long-term storage compartment the transhepatocellular pathway appeared absent, while transbiliary and hepatolysosomal pathways were still operative (Gooneratne et al. 1989b). Tetrathiomolybdate predominantly enhances removal of Cu from the short-term liver Cu storage compartment, but effects on the long-term storage compartments, albeit lower, are still of significance. Based on these observations, the relative importance of the different biliary Cu excretory pathways which become functional during long and short term liver Cu 11 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES depletion have been predicted (Gooneratne et al. 1989b). Sephadex G-75 gel filtration studies have shown that the increased biliary Cu (and Mo) following TM4 administration is mostly bound to a macromolecular form, and hence is not available to the animal (Gooneratne et al. 1989e). Similar increases in biliary Cu associated with high dietary Mo and S intakes by bovine have also been reported (Gooneratne et al. 1994). This study also reported on genetic differences in biliary Cu excretion in cattle. Biliary Cu excretion in the Simmental breed appears to be at least two-fold higher than in the Angus breed. This is probably one of the reasons why Cu deficiency is observed more frequently in this breed. TM4 administration increases faecal Cu (free of bile Cu) excretion indicating that this is derived from either saliva or endogenous gastro- intestinal secretions (Gooneratne et al. 1989a; 1989b). Increased urinary Cu excretion has been reported in sheep fed dietary supplements of Mo and S (Marcilese et al. 1970). We have observed similar increases in urinary Cu in sheep (Gooneratne et al. 1985) and cattle (Gooneratne et al. 1994) given TM4. EFFECT OF COPPER AND SULPHUR IN POLIOENCEPHALOMALACIA Polioencephalomalacia is an acute disturbance in glucose metabolism in ruminants characterized clinically by blindness, depression, and incoordination. It is often encountered in cattle after concentrate feeding. It can be caused by simple B1 deficiency, but in most instances by thiaminase-produced analogues that can block pyruvate oxidation (Loew and Dunlop, 1972). Sulphur is essential for ruminal microbial synthesis because it contributes to microbial S- containing amino acids. Sulphur deficiency is not common in ruminants but can occur when fed protein deficient diets. Critical S concentration is about 1g kg -1 DM. Addition of sulphate to the diet is also capable of inducing a B1 deficiency in steers (Goetsch and Owens, 1986). Feedlot cattle fed S dioxide-treated high moisture barley develop PEM. High S in the diet and/or water can induce a low ruminal pH. This can acidshock the ruminal bacteria to release bacterial cell surface bound thiaminase enzyme. Our field studies have shown that cattle fed high S and low Cu show low blood B1 and succumb to PEM (Gooneratne et al. 1989d). Animals that develop PEM in S toxicity, if not acutely ill can recover and increase their blood B1 on Cu supplementation alone without B1 administration. Thus it appears that the mechanism underlying S-induced PEM involve a three-way interaction between Cu, S and B1. When sheep with a lower B1 status are fed excess dietary S, neurophysiologic abnormalities such as decreased conductivity and / or excitability of nerve fibres along the auditory pathways [as measured by brain-stem auditory evoke response (BAER) technique] can occur (Olkowski et al. 1989a). BAER recordings correlate with the histopathological lesions in the brain stem of sheep. Sheep that develop PEM on high-S diets also have a compromised immune function independent of Srelated Cu deficiency (Olkowski et al. 1989b). If Cu is low in a high S diet, then less Cu is available for formation of Cu-S complexes such as CuS and TM, and hence more free S is available to lower rumen pH and favour release of thiaminase I enzyme. But if the diet is high in both Cu and S, it appears then that excess Cu probably chelates S and increases its excretion in bile and urine. In such instance, occurrence of PEM is less likely. 12 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES REFERENCES: Allen, J.D. and Gawthorne, J.M. 1986. Involvement of organic molybdenum compounds in the interaction between copper, molybdenum, and sulphur. J. Inorg. Biochem. 27: 95-112. Alonso, M.L., Benedito, J.L., Miranda, M., Castillo, C., Hernandez, J., Shore, R.F. 2002. Interactions between toxic and essential trace metals in cattle from a region with low levels of pollution. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 42:165-72. Bennetts, H.W. and Chapman, F.E. 1937. Copper deficiency in sheep in Australia. Aust. Vet. J. 13: 138 - 149. Bremner, I. 1976. The effect of dietary molybdenum and sulphate on plasma copper distribution in sheep. Proc. Nutr. Soc. 35: 21A Bremner, I. and Young, B.W. 1978. 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Profiles of 67 Cu in blood, bile, urine and faeces from 67Cu primed lambs: Effect of 99Mo-labelled tetrathiomolybdate on the metabolism of 67Cu after long-term storage. Br. J. Nutr. 61: 373385. Gooneratne, S.R., Laarveld, B. and Christensen, D.A. 1989c. Effect of 67Cu and 99Mo labelled tetrathiomolybdate on the distribution of 67Cu, Cu and copper 99Mo in bile fractions in sheep. J. Inorg. Biochem. 35: 233-246. 13 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Gooneratne, S.R., Olkowski, A.O. Klemmer, R.G., Kessler, G.A. and Christensen, D.A. 1989d. High sulfur related thiamine deficiency in cattle: A field study. Can. Vet. J. 30: 139-146. Gooneratne, S.R., Symonds, H.W., Bailey, J.V. and Christensen, D.A. 1994. Effects of dietary copper, molybdenum and sulfur on biliary copper and zinc excretion in Simmental and Angus cattle. Can. J. Anim. Sci. 14 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES MECANISMOS DEL ESTRÉS EN EL TORO DE LIDIA. ILLERA, J.C.; SILVÁN, G.; GIL-CABRERA, F.; ILLERA, M.J. Dpto. Fisiología Animal. Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid. 28040 Madrid. Una amplia gama de experiencias, distintas entre sí, provocan síntomas externos comunes. “La expresión de las emociones en el hombre y los animales” (Darwin). Fisiología del Estrés El Dr. Hans Selye sentó las bases para el conocimiento y estudio posterior de los cambios funcionales orgánicos de nuestro organismo que ocurren durante un estado de estrés que experimente una persona (figura 1). Los sistemas orgánicos iniciales y principales que se activan como respuesta al estrés son, a saber: (1) el sistema nervioso y (2) el sistema endocrino. Ambos sistemas se conocen como el sistema neuro-endocrino. Otros sistemas orgánicos se involucran y son eventualmente afectados durante las etapas del estrés, tal como el sistema inmunológico, el sistema cardiovascular, el sistema gastrointestinal (digestivo), entre otros. A continuación una descripción funcional de los sistemas orgánicos que juegan un papel importante durante la respuesta física del cuerpo al confrontarse con el estrés: El Sistema Nervioso El sistema nervioso del organismo humano se encuentra constituido por el sistema nervioso central (SNC) y el sistema nervioso periférico (SNP). El sistema nervioso central (SNC) lo compone el encéfalo y la médula espinal y se encuentra protegido por el cráneo y la columna vértebras, respectivamente. El encéfalo consta de una estructura importante localizada en la región del diencéfalo, (base del cerebro) conocida como el hipotálamo. Esta estructura posee un centro que controla las emociones y ciertos impulsos básicos, a saber: el apetito, la sed, el sueño, la temperatura y el metabolismo. En los inicios del estrés, el hipotálamo estimula a la pituitaria (hipófisis) para que secrete diversas hormonas, incluyendo la hormona adrenocorticotrofa (ACTH). La ACTH se transporta mediante la circulación y estimula a la corteza suprarrenal (localizada sobre el riñón) para que libere cortisol. Inicialmente esta hormona aumenta la capacidad del ser humano para afrontar efectivamente el estrés debido a que promueve la producción de glucosa (para la generación de energía) y produce efectos antinflamatorios. Sin embargo, eventualmente el cortisol provoca el degradamiento de proteínas y la disminución de las reacciones inmunitarias, lo cual resultaría en una mayor propensión para la adquisición de enfermedades (etapa final del estrés). La médula espinal es aquella parte del SNC que se extiende a lo largo del agujero vertebral de la columna espinal hasta la altura de la primera vértebra lumbar. Esta conectada con el cerebro y el encéfalo. Se compone de materia gris (neuronas) y materia blanca. El líquido encefaloraquídeo fluye entre el encéfalo y la médula. Su función básica consiste en transportar información a través de los nervios que salen y entran al encéfalo. El sistema nervioso periférico (SNP) esta compuesto del sistema nervioso somático y el sistema nervioso autonómico (SNA) o vegetativo. Este último se ramifica en dos secciones, a saber: el sistema nervioso simpático y el sistema nervioso parasimpático. 15 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES El sistema nervioso somático lleva información sensorial al SNC, y transmite las órdenes motoras de éste hacia los órganos de los sentidos y músculos involuntarios. Regular los intercambios con el ambiente externo. Por otro lado, el sistema nervioso autónomo regula el equilibrio interno del cuerpo, manteniendo los valores fisiológicos dentro de lo normal (homeostasia). Este sistema posee dos grandes ramas, la simpática y parasimpática. El sistema nervioso simpático prepara al cuerpo para la acción. Durante la etapa de alerta del estrés, el sistema simpático se encarga de activar el organismo, vía el aumento de la frecuencia respiratoria, la presión arterial, la frecuencia y volumen de las contracciones cardíacas (las palpitaciones del corazón) la manufacturación de glucosa (azúcar) en el hígado, la circulación en los músculos (lo cual agiliza el sistema esqueleto-muscular), la liberación de epinefrina (adrenalina) de la médula renal, dilatación de las pupilas, la disminución de la circulación en los órganos abdominales (estómago, intestinos), riñones y piel y la reducción de la actividad digestiva. La actividad constante del sistema simpático puede ser detrimental para los órganos del cuerpo, donde el resultado final sería un estado de sobrecarga evidente en la fase de agotamiento que describe Selye. Por el contrario, el sistema nervioso parasimpático controla la recuperación, relajación y asimilación. El Sistema Endocrino Este es un sistema del cuerpo compuesto de órganos internos (glándulas endocrinas) que secretan hormonas. Las hormonas son mensajeros (mediadores) químicos liberados dentro de la sangre con el fin de ser transportados hacia células particulares (células meta) sobre las cuales regulará su función metabólica. El sistema endocrino interacciona con el sistema nervioso para coordinar e integrar la actividad de las células corporales. A lo largo del transcurso de las fases del estrés, las glándulas y hormonas que participan con mayor intensidad son la glándula pituitaria (hipófisis), la glándula suprarrenal y la glándula tiroide. La hipófisis se encuentra conectada estructural y funcionalmente con el hipotálamo. Posee dos (2) principales lóbulos, los cuales son, el lóbulo anterior (adenohipófisis) y el lóbulo posterior (neurohipófisis). La adenohipófisis ha sido tradicionalmente conocida como la "glándula endocrina maestra" debido a sus numerosos productos hormonales, muchos de los cuales regulan la actividad de otras glándulas endocrinas. Agentes estresores estimulan a la adenohipófisis para que secrete cantidades aumentadas de ACTH. La producción de la hormona ACTH es consecuencia directa de un factor hormonal liberado do por el hipotálamo como respuesta al estresor. La ACTH actúa sobre la corteza suprarrenal para estimular la producción de cortisol. El cortisol es el principal regulador de las respuestas adaptativas al estrés. La neurohipófisis se localiza en la prolongación del hipotálamo y tiene una relación directa con éste. Está formada por fibras nerviosas, células gliales y una red capilar. Las neurosecreciones emitidas por el hipotálamo pasan por el sistema portahipofisario a la neurohipófisis, donde son almacenadas en las protuberancias de las fibras nerviosas y luego liberadas en los capilares, que las distribuyen en la circulación general. La neurohipófisis segrega dos hormonas: la occitocina y la vasopresina u hormona antidiurética. 16 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES La glándula suprarrenal son órganos pares, con formas de pirámide, ubicadas sobre la porción superior de cada riñón. Estas glándulas se componen estructural y funcionalmente de dos (2) glándulas endocrinas, a saber: la corteza suprarrenal y la médula suprarrenal. La corteza adrenal produce una serie de hormonas que en colectividad se conocen como glucocorticoides. La hormona destacada durante el estrés que pertenece al grupo de los glucocorticoides es el cortisol. Los glucocorticoides tienen acción sobre el metabolismo de la glucosa y son anti-inflamatorios. En un estrés prolongado, los glucocorticoides pueden inducir a hiperglucemia (altos niveles de azúcar en la sangre) puesto que mantendrían una producción constante de glucosa . La médula adrenal secreta dos poderosas hormonas produce la médula adrenal, a saber: epinefrina (o adrenalina) y la norepinefrina (o noradrenalina). La epinefrina prolonga las respuestas que producen el sistema simpático. La glándula tiroide juega una función importante durante el estrés de origen psicosocial o físico estimula a la producción de tiroxina de la glándula tiroidea. Esta hormona aumenta la tasa metabólica de los tejidos del cuerpo. Tales cambios afectan el humor, la energía, la irritabilidad nerviosa y el nivel de alerta mental. El flujo sanguíneo aumenta marcadamente, lo que ocasiona un aumento en la presión sanguínea. El Síndrome de Adaptación General (SAG) Como fue previamente señalado al principio de este capítulo, el Dr. Hans Selye descubrió que los ratones sometidos bajo un estrés crónico (constante) manifestaban un conjunto de signos y síntomas particulares. A esto él le llamó el Síndrome de Adaptación General (figura 3) y, basado en las respuestas fisiológicas de estos animales, lo dividió en tres fases muy particulares, conocidas como: alarma (o pelear e huir), resistencia (adaptación) y desgaste (o fatiga, deterioro). El síndrome de adaptación general representa un conjunto de respuestas fisiológicas y psicológicas generales (no específicas) ante las demandas de un estrés (positivo o negativo). Existen diferentes estímulos estresantes que quedan recogidos en el siguiente esquema (esquema 1) Es una tríada de procesos de adaptación sucesivos como respuesta a los estímulos continuos (a largo plazo o crónico) del estrés. Cuando hablamos de síndrome, no referimos a variedad o grupo de signos y síntomas concurrentes de carácter físicos, mentales y de comportamiento indicativo de una enfermedad. La adaptación representa el síndrome de cambios hace posible que el cuerpo se adapte para poder afrontar con efectividad el estrés. La funciones orgánicas del cuerpo humano se modifican automáticamente, de manera que puedan ajustarse a los estresores constantes que lo perturban en su medio ambiente sicosocial y físico. Finalmente, el componente general es hace referencia a los estresantes generales que inducen a un estado de estrés. El síndrome es producido únicamente por distintos agentes estresores que inducen efectos generales (no específicos) a niveles de gran magnitud en organismo. 17 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES La Fase de Alarma (Reacción de lucha o Fuga) Es la respuesta fisiológica aguda inicial del organismo ante una amenaza. El cuerpo reacciona al estresor y causa que el hipotálamo produzca un mediador bioquímico, el cual a su vez provoca que la hipófisis secreta ACTH hacia la sangre. Esta hormona estimula a la glándula adrenal a que libere epinefrina y otros corticoides. Como consecuencia, se atrofia el timo (glándula constituyente del sistema glandular endocrino ubicada detrás de la porción superior del esternón o hueso del pecho) y los ganglios linfáticos. La actividad del sistema nervioso simpático aumenta. Esta etapa se caracteriza por una baja resistencia ante los agentes productores de tensión. La Fase de Resistencia (Adaptación) El organismo trata de adaptarse al estrés continuo que lo afecta. Esta es una etapa de reparación como resultado del deterioro ocurrido en la primera etapa. Esta etapa se caracteriza por manifestaciones clínicas (físicas) y mentales. La Fase de Fatiga o Desgaste (Deterioro) Ante la incapacidad de afrontar la tensión (estresor) por más tiempo, ocurre un desbalance homeostático (equilibrio interno) y fisiológico en el cuerpo, el organismo colapsa y cede ante la enfermedad. Como resultado del estrés continuo, durante esta etapa pueden surgir una variedad de enfermedades psicosomáticas, tales como hipertensión, ataque al corazón, derrame cerebral, úlceras, trastornos gastrointestinales (e.g., colitis y otras), asma, cáncer, migraña, alteraciones dermatológicas, entre otras condiciones. 18 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES PARANFISTOMOSIS BOVINA: ENFERMEDAD EMERGENTE EN EL ÁREA MEDITERRÁNEA. PAZ SILVA, A. Departamento de Patología Animal, Facultad de Veterinaria de Lugo. Universidad de Santiago de Compostela (España) Definición e importancia La organización mundial de la salud (OMS) define enfermedades emergentes como aquellas “nuevas enfermedades producidas por agentes no identificados anteriormente, causantes de problemas de salud pública”. En este caso nueva no quiere decir desconocida hasta la fecha, sino que en los últimos años se ha mejorado el conocimiento de su extensión y gravedad. Una definición más precisa podría ser la de “enfermedad de etiología infecciosa, por lo general epizoótica, con carácter epidémico, e incidencia mayor en los últimos 20 años, que afecta a diversas poblaciones de riesgo”. La paramfistomosis es una trematodosis causada por parásitos de la familia Paramphistomidae, que se caracterizan morfológicamente por la presencia de una ventosa ventral o acetábulo en el extremo posterior, y su forma cónica. Tienen un ciclo biológico similar a Fasciola hepatica, y de hecho comparten el hospedador intermediario, principalmente caracoles del género Lymnaea y también coinciden en que el diagnóstico que se hace de forma rutinaria consiste en la demostración de huevos en las heces de los bóvidos infectados, empleando la técnica coprológica de sedimentación. A veces es un poco difícil diferenciar los huevos de estos dos trematodos, lo que ha llevado a su diagnóstico incorrecto. Los paranfistomos afectan con mayor frecuencia a rumiantes jóvenes (terneros, cabritillos y corderos), son causantes de alteraciones digestivas y hemáticas que a veces pueden llegar a provocar la muerte de los animales. Existe evidencia de que estas alteraciones se deben principalmente a los trematodos juveniles, mientras que se discute la patogenicidad de las formas adultas. Atendiendo a la definición de la OMS, se trata de una enfermedad emergente puesto que se ha incrementado el conocimiento de su extensión: en los últimos años se ha diagnosticado en diferentes países europeos como Italia, Francia o España, y americanos como México o Argentina, donde además se ha comprobado que la prevalencia de paranfistomosis ha aumentado en los últimos años, obteniéndose porcentajes que oscilan entre el 11% y el 40%. Es necesario destacar que en Francia, durante el periodo 1990-1999, la prevalencia de paranfistomosis pasó del 5’2% al 44’7%, en tanto que la de fasciolosis no experimentó variaciones. La importancia de esta trematodosis queda reflejada por las cuantiosas pérdidas económicas que se producen en industrias de lana, carne y leche. En algunos estudios se ha postulado que una de las causas responsables del incremento de vacas con paranfistomosis es la administración de tratamientos fasciolicidas eficaces, mientras que no está muy extendida la utilización de productos de acción paranfistomicida. 19 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Epidemiología y distribución Se han descrito varias especies de trematodos Paramphistomidae, entre los que destacan los géneros Paramphistomum (P. cervi, P. ichikawi, o P. microbothrium), Cotylophoron, Gigantocotyle y Calicophoron. La especie más habitual en Europa es Calicophoron daubneyi, que en España se ha descrito en el noroeste (Díaz et al., 2006). La presencia de estos parásitos está asociada a ambientes húmedos, con abundante vegetación, temperaturas moderadas, que constituyen el hábitat idóneo para el hospedador intermediario. Como tal pueden actuar caracoles de los géneros Bulinus, Glyptanisus, Indoplanorbis, Planorbis y Lymnaea, siendo estos últimos los más frecuentes en Europa y América. La supervivencia de estos moluscos se ve favorecida en zonas con escasa pendiente, que favorecen el encharcamiento de los terrenos. En general, el riesgo de infección a lo largo del año está directamente relacionado con las precipitaciones. En Europa predomina el clima atlántico, en el que las precipitaciones más abundantes se registran en septiembre-noviembre. En España se ha comprobado que los valores máximos de prevalencia en ganado vacuno se obtenían en el mes de septiembre (Fig. 1), en tanto que en Francia fue entre enero y diciembre. Por el contrario, las cifras máximas de eliminación se obtuvieron en junio y septiembre, respectivamente. % 100 Epg 30 Prevalencia 90 Epg 25 80 70 20 60 50 15 40 10 30 20 5 10 0 0 E F M A My J Jl Ag S O N D mes Fig. 1.- Prevalencia y cifras de eliminación de huevos de C. daubneyi en ganado vacuno del NO de España. Es posible encontrar caracoles infectados por miracidios de Fasciola hepatica y de Calicophoron daubneyi. En algunos estudios se ha demostrado que los miracidios de 20 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Calicophoron favorecen el desarrollo de los de Fasciola, lo que constituye un ejemplo del fenómeno clásico de facilitación. También se ha comprobado que cuando las metacercarias (fases infectivas de estos trematodos) abandonan las limneas, las de Fasciola lo hacen agregadas, que favorece el mantenimiento de la humedad. Como ya se ha citado enteriormente, los bóvidos se infectan mediante la ingestión de metacercarias emitidas por los caracoles, que se desenquistan en el intestino; los paranfistomos juveniles migran a través de la mucosa intestinal hasta alcanzar el rumen, retículo e incluso abomaso, donde se transforman en parásitos adultos. En el ganado vacuno pueden coexistir las dos especies de trematodos, las fasciolas en el hígado y los paranfistomos adultos en el retículo y rumen. No está clara la influencia de la edad en el grado de parasitación de los animales, pero se ha comprobado que la prevalencia es significativamente superior en los vacunos de menos de 8 años. No se ha establecido relación entre la raza de los animales y la disponibilidad para desarrollar la paranfistomosis. Ciclo intraorgánico e inmunidad Cuando los paranfistomos juveniles se encuentran en el intestino e inician la migración hasta su localización definitiva, la presencia de espículas en su tegumento provoca la aparición de pequeñas hemorragias responsables del descenso de los valores de los parámetros de las series roja (eritrocitos, hematocrito) y blanca (leucocitos, linfocitos). Al mismo tiempo se produce la liberación de productos de excreción/secreción con actividad antigénica, que estimulan en el sistema inmunitario del ganado vacuno la producción de anticuerpos. Se ha demostrado que la infección por trematodos Paramphistomidae induce la aparición de un grado de inmunidad casi completo frente a sucesivas reinfecciones; también se ha comprobado que estas reinfecciones no se acompañan por un incremento en los valores de anticuerpos, como sucede en el caso de fasciolosis. Tratamiento y control Según la Oficina Internacional de Epizootologías (OIE), en la prevención y control de las enfermedades emergentes ha de basarse en dos aspectos: detección precoz y reacción rápida (tratamiento) ante la enfermedad. El diagnóstico rutinario de paranfistomosis se realiza mediante el análisis de muestras fecales con la técnica de sedimentación, lo que supone algunos inconvenientes. En primer lugar, la aparición de huevos del trematodo en las heces implica que los parásitos han alcanzado el estado adulto (8-12 semanas post-infección), y la mayoría de las alteraciones (a nivel intestinal) ya se han producido. En segundo lugar, como ya se apuntaba con anterioridad la morfología de los huevos de paranfistómidos es similar a la de los de Fasciola hepatica, salvo en la coloración, más amarillenta y oscura en estos últimos por la presencia de pigmentos biliares. En nuestra opinión esto ha contribuido a que la paranfistomosis no se haya diagnosticado en todos los casos en que se haya producido, dando lugar a falsos negativos. Además, con ello también se ha sobrevalorado la presencia de fasciolosis, lo que se ha traducido en un incremento en la utilización de fasciolicidas, y el riesgo consiguiente de aparición de resistencias. En algunas encuestas epidemiológicas se 21 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES ha demostrado que el porcentaje de vacas con paranfistomos que eliminan huevos a través de las heces es del 45%. Con objeto de solucionar este problema del diagnóstico de paranfistomosis se ha aplicado la técnica inmunoenzimática ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), que permite la detección precoz de anticuerpos específicos frente a antígenos de Calicophoron, especialmente de excreción/secreción. El principal inconveniente de esta técnica radica en la existencia de un cierto grado de imunidad cruzada con antígenos de F. hepatica, que dificulta la interpretación de los resultados. Sin embargo, y a diferencia de ésta, los valores de anticuerpos (IgG) alcanzan valores elevados sólo cuando existe una infección activa. Si se considera que entre las causas de la emergencia de la paranfistomosis en ganado vacuno del área mediterránea se encuentra el diagnóstico erróneo y tardío que se consigue Fig. 2.- Dinámica de IgG frente a antígeno de excreción/secreción de C. daubneyi en ganado vacuno tratado con Nilzan Plus®. 0,8 Grupo infectado no tratado Grupo infectado tratado Grupo no infectado 0,6 Tratamiento 0,4 0,2 0,0 -4 0 1 5 6 12 16 21 24 spt con la sedimentación, la utilización del inmunoensayo sería una gran ayuda para mejorar las posibilidades de detección de estas trematodosis. Incrementando la fiabilidad del 22 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES diagnóstico también se conseguiría reducir los tratamientos que se están aplicando frente a F. hepatica, lo que a su vez disminuiría la posibilidad de aparición de cepas resistentes. El control de la paranfistomosis bovina ha de basarse en la actuación sobre el hospedador intermediario y su hábitat, y sobre el hospedador definitivo. Las medidas orientadas a entorpecer la supervivencia de los caracoles implican todas aquellas operaciones para reducir la presencia de agua en exceso en los prados (= drenado), o la aplicación de productos de acción molusquicida como la cianamida cálcica, aunque su elevado coste y los problemas ecológicos que se derivan desaconsejan esta última opción. El tratamiento eficaz frente a los paranfistomos en el ganado vacuno exige su diagnóstico preciso y precoz. Existen muy pocos productos eficaces frente a los trematodos Paramphistomidae. Hace algunos años se postuló el empleo de antihelmínticos como el nitroxynil, pero hoy en día el fármaco de elección es la oxyclozanida, que presenta una excelente actividad sobre estos parásitos. Este principio activo se comercializa en un preparado junto con levamisol, bajo el nombre de Nilzan Plus®, por la firma ScheringPlough™. Mediante ELISA se ha demostrado que los valores de IgG disminuyen después del tratamiento eficaz con oxyclozanida, de modo que esta técnica inmunoenzimática también se podría emplear para valorar la eficacia de los tratamientos frente a los paranfistomos (Fig. 2). BIBLIOGRAFÍA Abrous M, Rondelaud D, Dreyfuss G, Cabaret J. (1999). Infection of Lymnaea truncatula and Lymnaea glabra by Fasciola hepatica and Paramphistomum daubneyi in farms of central France. Veterinary Research, 30: 113-118. Augot D, Abrous M, Rondelaud D, Dreyfuss G. (1996). Paramphistomum daubneyi and Fasciola hepatica: The redial burden and cercarial shedding in Lymnaea truncatula subjected to successive unimiracidial cross-exposures. Parasitology Research, 82: 623-627. Díaz P, Lomba C, Pedreira J, Arias M, Sánchez-Andrade R, Suárez JL, Díez-Baños P, Morrondo P, Paz-Silva A. (2006). Analysis of the IgG antibody response against Paramphistomidae trematoda in naturally infected cattle. Application to serological surveys. Veterinary Parasitology, 140: 281-288. Mage C, Bourgne H, Toullieu JM, Rondelaud D, Dreyfuss G. (2002). Fasciola hepatica and Paramphistomum daubneyi: changes in prevalences of natural infections in cattle and in Lymnaea truncatula from central France over the past 12 years. Veterinary Research 33: 439-447. Morrondo P, Sánchez-Andrade R., Díez-Baños P, Pérez L, López C. (1994). Dynamics of Fasciola hepatica egg elimination and Lymnaea truncatula populations in cattle farms in Galicia (North-West Spain). Research and Reviews in Parasitology. 54: 47-50. Rangel-Ruíz LJ, Alborés-Brahms ST, Gamboa-Aguilar J. (2003). Seasonal trends of Paramphistomum cervi in Tabasco, Mexico. Veterinary Parasitology, 116: 217-222. Silvestre A., Sauve C., Cabaret J. (2000). Caprine Paramphistomum daubneyi (Trematoda) infection in Europe. Veterinary Record, 146: 674-675. 23 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES AGGIORNAMENTI SULLA TOXOPLASMOSI E NEOSPOROSI DEI RUMINANTI DEL BACINO DEL MEDITERRANEO. SCALA, A. Dipartimento di Biologia Animale, Sezione di Parassitologia e Malattie Parassitarie, Università degli Studi di Sassari, Via Vienna 2 – 07100 Sassari, Tel. 39079229465, Fax 39079229464. La Toxoplasmosi da Toxoplasma gondii e Neosporosi da Neospora caninum sono due “recenti” parassitosi causate da protozoi Apicomplexa abbastanza simili, tanto che sino al 1984, anno in cui N. caninum è stato identificato da Bjerka et al. (1984) come un protozoo distinto da T. gondii, il cui ciclo biologico peraltro è stato delineato con l’identificazione del suo ospite definitivo, il gatto, solo a metà degli anni ’60. Questi due protozoi, oltre ad essere accumunati da una spiccata rassomiglianza morfologica, possiedono anche un ciclo biologico abbastanza sovrapponibile, caratterizzato da tre stadi infettivi: tachizoiti, cisti tissutali e oocisti. I primi due si riscontrano in posizione intracellulare, soprattutto a livello del SNC e, per T. gondii, anche a livello muscolare dei numerosi ospiti intermedi, che comprendono anche la maggior parte dei ruminati oltre che a numerose altre specie animali. Le oocisti, anche in questo caso straordinariamente simili sotto l’aspetto morfometrico, si formano a seguito di fasi schizogoniche e gametogoniche che avvengono nell’intestino tenue degli ospiti definitivi, quali il gatto e i felidi selvatici per T. condii, e il cane per N. caninum, come recentemente provato da McAllister et al. nel 1998. La Toxoplasmosi è considerata una delle più gravi e diffuse zoonosi a livello mondiale, così come nei paesi del bacino del Mediterraneo. In particolare per l’uomo una fonte importante di contagio risultano le cisti tissutali contenute nelle carni di animali da reddito. Queste si possono sviluppare negli ospiti intermedi già 6-7 gg dopo l’assunzione per via orale di oocisti o altre cisti tissutali e persistere anche per tutta la vita dell’ospite stesso. Nel gatto, ospite definitivo della parassitosi e quindi possibile veicolo dell’infezione anche ai ruminanti, il periodo di prepatenza che precede l'eliminazione delle oocisti varia a seconda della forma parassitaria ingerita: in seguito all'ingestione di cisti tissutali quasi il 100% dei gatti eliminerà oocisti entro 3-10 giorni; se l'infezione ha luogo per ingestione di oocisti o tachizoiti, soltanto il 15-20% dei felini eliminerà oocisti dopo 19-48 giorni. Il ruolo del gatto nella trasmissione dell’infezione nell’uomo viene talvolta messo in discussione: Luft e Remington (1988) hanno ad esempio dimostrato che il possesso di gatti non costituisce un fattore di rischio neanche per i soggetti immunodepressi. L'importanza epidemiologica delle oocisti non va tuttavia sottovalutata, in quanto studi condotti da Munday (1972), Omata et al. (1990) e Wallace (1969), hanno rilevato come l'infezione risulti praticamente assente, sia nella popolazione umana che animale di piccole isole e atolli che non siano mai stati abitati da gatti. E’ quindi evidente, soprattutto per i ruminanti in quanto erbivori, il ruolo di questi felini attraverso l’eliminazione delle oocisti che possono inquinare pascoli, insilati e granaglie, possa risultare determinante per l’acquisizione dell’infezione, che si manifesta con la comparsa a “fine” ciclo delle cisti tissutali o terminali. La distribuzione e il numero di queste cisti che si sviluppano nell’ospite intermedio variano da specie a specie: il riscontro è più frequente in suini, caprini e ovini, meno negli equini e, infine, estremamente raro in manzi e bufali sebbene la sieroprevalenza può essere 24 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES estremamente elevata. Questi dati epidemiologici, insieme ai risultati di una recente indagine di Cook et al. (2000) che mette in evidenza il trend negativo del consumo di carni bovine in Europa a favore di quelle suine e ovine, evidenziano la scarsa rilevanza del ruolo epidemiologico dei bovini nella toxoplasmosi umana. Tuttavia la diffusione dell’infezione nei bovini allevati nei paesi del bacino mediterraneo rilevata attraverso indagini soprattutto sierologiche si evince dall’esame della tabella n°1. Egitto Francia “ “ Grecia Israele Periodo campionamento < 1990 < 1997 2004 2004-2005 < 1995 1985-90 N° campioni esaminati 17 642 1961 93 8700 372 Italia 1999-2002 7194 Nazione “ 2006 1963 Prevalenza (%) 29 92 48,6 65,6 23 25 28,4(IgG) 9(IgM) 49,1 “ 1999-2005 29886 “ Marocco Rep. Ceca Serbia Spagna “ “ “ 2006 2005 1982-89 2002-03 < 1991 1992-93 < 1996 < 1996 1043 261 886 511 550 541 2306 2306 19,2(IgG) 5,4(IgM) 51,3 27,6 55 84,5 35 12 35 34 “ 2004 173 (feti) 23,1 Turchia “ 1990-92 1997 259 531 22 40 Metodica Bibliografia IHAT IFAT MAT DAT ELISA IFAT El Ridi et al., 1990 Cabannes et al., 1997 Aubert et al., 2006 Aubert et al., 2006 Stefanakis et al., 1995 Shkap et al., 1992 IFA Masala et al., 2003 varie metodiche Villari et al., 2006 IFA Masala et al., 2006 ELISA ELISA SFDT MAT IFAT MAT MAT IFAT varie metodiche ELISA SFDT Natale et al., 2006 Sawadogo et al., 2005 Hejlicek et al.,1994 Klun et al., 2006 Moreno et al., 1991 Mainar et al., 1996 Marca et al., 1996 Marca et al., 1996 Pereira-Bueno et al., 2004 Oz et al., 1995 Altintas et al., 1997 Tuttavia nonostante il reperimento di queste sieropositività nel bovino, la ricerca degli elementi parassitari di T. gondii in campioni di muscolo diaframmatico e cardiaco, spesso conduce a dei risultati negativi; d’altro canto rari risultano essere anche i casi clinici di toxoplasmosi in questa specie animale, compresi gli aborti (Boch e Supperer, 1980). Tutto questo, insieme a studi sperimentali di riproduzione dell’infezione nel bovino (Rimmel e Breuning, 1967, citati da Boch e Supperer, 1980), portano ad affermare addirittura che la carne cruda di bovino e/o di vitello, nonché il fegato, non rappresenterebbero una fonte di infezione nell’uomo (Janitschke et al., 1967, citato da Boch e Supperer, 1980). In relazione a quanto sopra affermato verranno quindi riportati i dati sulla diffusione della toxoplasmosi soprattutto nei piccoli ruminanti, in cui la parassitosi assume un interesse zootecnico sanitario più rilevante. La maggior parte dei dati disponibili sulla diffusione di T. gondii negli ovini riguardano, tra i paesi del bacino del mediterraneo, l’Egitto (29%) (El Ridi et al., 1990), la Francia (dal 22 al 92%) (Cabannes et al., 1997; Aubert et al., 2006), la Grecia (23%) (Stefanakis et al., 1995), Israele (25%) (Shkap et al., 1992), il Marocco (27,6%) (Sawadogo et al., 2005), Repubblica Ceca (55%) (Hejlicek et al.,1994), Serbia 25 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES (84,5%) (Klun et al., 2006), Spagna (dal 12 al 35%) (Mainar et al., 1996; Moreno et al., 1991; Marca et al., 1996; Pereira-Bueno et al., 2004), Turchia (dal 22 al 40%) (Oz et al., 1995; Altintas et al., 1997) e l’Italia (dal 5,4 al 51,3%) (Masala et al., 2003; Masala et al., 2006; Natale et al., 2006); Villari et al., 2006). E’ evidente come la toxoplasmosi risulti ampiamente diffusa nelle nazioni sopramenzionate, anche se appare difficile interpretare i dati a disposizione, in quanto viene spesso meno la standardizzazione delle procedure diagnostiche impiegate per indagini attuate su categorie di animali e metodiche differenti. In particolare recentissime indagini sieroepidemiologiche svolte in Sardegna sulla toxoplasmosi ovina in 22 allevamenti hanno evidenziato anticorpi nei confronti del protozoo nel 51,3% degli ovini monitorati; nei vari allevamenti le siropositività variavano dal 18,4% al 97,9% (Natale et al., 2006). Tra gli ovini allevati in modo intensivo è stata osservata una prevalenza statisticamente superiore (94%) rispetto a quelli allevati allo stato brado e semi-brado (44,2%), a testimoniare il fatto che evidentemente il gatto inquina in modo nettamente superiore con le proprie feci contenenti le oocisti di T. gondii gli alimenti destinati alle pecore allevate intensivamente, quali insilati e granaglie. Per ciò che concerneva invece i tassi di sieroprevalenza stratificati per fasce d’età, si è potuto notare come questi tendevano ad aumentare con l’età; facevano tuttavia eccezione gli agnelli di età inferiore ad un mese, in cui probabilmente si riscontrano ancora gli anticorpi colostrali (Natale et al., 2006) (tabella n°2). La ricerca del protozoo nei tessuti ovini non risulta sicuramente un compito semplice, in quanto la densità delle cisti terminali risulta estremamente limitata. Anche l’eventuale riscontro istologico talvolta pone dei problemi interpretativi in quanto si pone l’esigenza di una diagnosi differenziale con le cisti di sarcosporidi, peraltro nettamente più diffuse rispetto a quelle di T. gondii. Questa scarsa densità delle cisti terminali pone inoltre dei problemi anche per ciò che concerne l’utilizzo di metodiche molto sensibili quali ad esempio la PCR. Infatti, sempre ricerche in tal senso, condotte su ovini adulti della Sardegna regolarmente macellati, in cui i tassi di sieroprevalenza normalmente risultano in media oltre il 50%, il DNA di T. gondii è stato evidenziato tra i 323 di quelli esaminati di miocardio, diaframma, esofago, lingua, massetere, fegato e milza, esclusivamente in 2 campioni di miocardio (0,6%) (Natale et al., 2006), nonostante il protozoo nell’isola risulti l’agente abortigeno più importante in questa specie animale (Tola et al., 2002). In ogni caso, il ruolo effettivo dell’ovino nella possibile trasmissione dell’infezione all’uomo, secondo un’ampia indagine epidemiologica volta da Cook et al. (2000) condotta con lo scopo di individuare le principali fonti di rischio cui sono esposte le donne in Europa, ha messo in luce che, anche in virtù dei cambiamenti nelle abitudini alimentari, tra le principali fonti di infezione va considerato il consumo di carni di agnello poco cotte. 26 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Tabella n°2 Età N° soggetti testati N° capi positivi Prevalenza (%) Odds Ratio < 1 mese 59 32 54,2% 1,00 < 1 anno 64 15 23,4% 0,26 1 anno 139 59 42% 0,62 2 anni 208 91 43,8% 0,66 3 anni 186 109 58,6% 1,19 4 anni 155 82 52,9% 0,95 5 anni 67 33 49,3% 0,82 > 5 anni 163 112 68,7% 1,85 Se per la toxoplasmosi tra i ruminanti il ruolo più importante era svolto dagli ovini e dai caprini, per ciò che concerne invece la Neosporosi è sicuramente il bovino che subisce le conseguenze negative più rilevanti, in quanto riconosciuta come la causa più frequente di aborto in tutto il mondo. Nei bovini la trasmissione di N. caninum può avvenire per via orale attraverso l'ingestione di oocisti sporulate o di tachizoiti contenuti nelle lochiazioni degli animali che hanno abortito a causa dell’infezione (trasmissione orizzontale) o più facilmente per via transplacentare (trasmissione verticale) (Dubey, 1999). Nel cane invece può verificarsi, oltre che con le modalità sopra riferite, anche attraverso l'ingestione di cisti terminali contenute nei tessuti infetti di vari animali colpiti (McAllister et al., 1998). Nel bovino N. caninum è in grado di determinare un'insufficienza riproduttiva con ripercussioni sul prodotto del concepimento, potendo provocare riassorbimento e mummificazione fetale, aborti sporadici, endemici o epidemici, nonché natimortalità o nascita di soggetti clinicamente normali ma infetti cronicamente, mentre nel cane sono descritte soprattutto forme congenite nei cuccioli che presentano una sintomatologia di tipo neuro-muscolare (Dubey et al., 2003). L'infezione sembrerebbe ormai aver raggiunto una diffusione cosmopolita e rendersi responsabile di aborti in alte percentuali (Anderson et al., 1991; Anderson et al., 1995). Inoltre sembrerebbe ormai assodato come la presenza del protozoo in un determinato allevamento possa causare delle ripercussioni negative anche sulla produzione di latte (Thurmond and Hietala, 1997). Attualmente su questa infezione si stanno acquisendo velocemente numerosi dati grazie agli studi condotti tramite la biologia molecolare (PCR) e soprattutto anche alla disponibiltà in commercio di kits diagnostici in grado di rilevare anticorpi per N. caninum che non crossreagiscono con T. gondii e Sarcocystis spp. e che garantiscono una buona affidabilità (Dubey, 1998; Bjorkman et al., 1999; Dubey, 1999). La prevalenza degli anticorpi di N. caninum nella popolazione bovina europea è estremamente varia, anche se i dati disponibili in letteratura al momento sono alquanto 27 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES limitati. Vengono riportate delle sieroprevalenze nelle popolazioni bovine della Francia del 5,6% (Ould-Amrouche et al., 1999) e della Repubblica Ceca del 3,9% (Vàclavek et al., 2003). Esistono inoltre delle situazioni come quella della Spagna (35,4% degli animali monitorati con circa il 60% delle aziende positive) (Lopez-Gatius et al., 2004; QuintanillaGozalo et al., 1999; Mainar-Jaime et al., 1999) e del Portogallo (28% che sale a 46% se si restringe il campione ai soli allevamenti con problemi di ondate abortigene) (Canada et al., 2004), in cui la prevalenza è tale da giustificare la sistematica ricerca di N. caninum in casi di aborto; ve ne sono quindi delle altre, quali quella relativa alla Turchia, in cui non si è riscontrata alcuna positività nei soggetti autoctoni. Motivo di preoccupazione è la dinamicità epidemiologica dimostrata dal fatto che, sempre in Turchia, campionature effettuate su discendenti di soggetti importati hanno individuato prevalenze dell’8,2% (odds ratio 20,3) (Akca et al., 2005). In Italia la presenza di N. caninum è stata più volte rilevata in feti abortiti e le indagini sierologiche indicano un’ampia diffusione sul territorio nel bovino (Magnino et al., 1998; Otranto et al., 2003). In particolare in Sardegna, indagini condotte tramite IFAT hanno rilevato tassi di prevalenza del 64% nei bovini da latte monitorati (Masala et al. 2000), mentre le aziende positive sono risultate il 55%, tramite l’analisi del latte di massa con un test iscom ELISA (Varcasia et al. 2006). Le esperienze condotte anche in Italia, soprattutto riguardo gli elevati valori di sieroprevalenza riscontrati in aziende in cui non si registrano problemi di fertilità, pongono nuovi interrogativi sugli eventi che potrebbero scatenare la patogenicità di N. caninum che determinerebbe l'aborto probabilmente solo in concomitanza di particolari situazioni stressanti. Fattori di rischio importanti infatti per l’insorgenza e persistenza dell’infezione, oltre che la presenza di più cani (eliminatori di oocisti) e pollame (disseminatori di oocisti?) in azienda, viene ipotizzata anche l’azione immunosopressiva esercitata dalle micotossine eventualmente presenti negli insilati, che determinerebbe una rottura delle cisti del protozoo con la riacutizzazione della malattia (Wouda et al., 1999; Wouda et al., 2000. Tuttavia le esperienze condotte in Sardegna a riguardo, confermano l’importanza della trasmissione transplacentare dell'infezione, in quanto nelle feci dei cani presenti nelle aziende monitorate, non si sono mai riscontrate oocisti del protozoo nelle loro feci e anche i soggetti sieropositivi sono risultati in numero estremamente limitato. Tutto questo in analogia con quanto rilevato anche in Germania in cui le analisi coprologiche condotte su 8438 cani hanno consentito il riscontro di oocisti morfologicamente simili a quelle di N. caninum esclusivamente nell’1,7% dei campioni esaminati (Barutzki et al., 2003). E’ evidente quindi che eventuali sforzi "scientifici" nel ricercare una soluzione profilattico/terapeutica al problema dovrebbero essere indirizzati soprattutto verso il bovino, anche perché gli eventuali protocolli terapeutici proposti non sempre risultano attuabili per via degli elevati costi relativi all’attuazione e ai residui dei farmaci nel latte. Recentemente, tuttavia, il riscontro di DNA di N. caninum nel colostro di vacche sieropositive pone nuovi interrogativi e ha portato ad ipotizzare anche una possibile trasmissione orizzontale dell’infezione tramite questa via (Moskwa et al., in press). E’ evidente quindi che queste parassitosi nei paesi del bacino del mediterraneo, seppure non ancora indagate capillarmente e con metodiche standardizzate, sembrerebbero costituire un importante problema zootecnico e, per quanto riguarda la toxoplasmosi, anche socialesanitario di non scarsa rilevanza, e che in quanto tali, necessitano di una particolare 28 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES attenzione non solo da parte degli addetti al settore, ma sicuramente anche di un adeguato piano integrato di profilassi. Ringraziamenti: Si ringrazia per la collaborazione la Dott.ssa Porqueddu Monica. BIBLIOGRAFIA Altintas K, Gungor C, Zeybek H, Yarali C (1997). Sabin-Feldman testi ile Ankara yoresi koyunlarinda Toxoplasma gondii prevalansinin saptanmasi. Turk Parazitol Derg, 21: 63-65. Akca A, Gokce H.I., Guy C.S, McGarry J.W. and Williams D.J.L.(2005). 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CEVA SALUD ANIMAL INTRODUCCIÓN La Inmunología Veterinaria es una de las herramientas que cada vez tiene más importancia en el quehacer del Veterinario puesto que “más vale prevenir que curar” ascendiendo la medicina preventiva a los primeros lugares en la producción animal. Es una ciencia abierta y compleja que ha avanzado considerablemente en los últimos años. Ya no sólo es la ciencia que se encarga de estudiar básicamente la "producción de anticuerpos (Ac), sueros y vacunas " sino que ya va formando parte de la vida cotidiana en muchas facetas, así se habla no solo de inmunoprofilaxis, sino de inmunoterapia, inmunodiagnostico, inmunofarmacología, inmunonutrición, inmunomodulación, etc, siendo estas herramientas básicas en un futuro más o menos próximo. La Inmunología, a través del sistema inmune, interrelaciona numerosos órganos de los seres vivos, de modo que se implica en la regulación de numerosas funciones fisiológicas del organismo que debemos conocer para entender mejor su importancia en el animal. Por ejemplo: cuando un animal se pone en contacto con un agente infeccioso, se activa el sistema inmune y todo el organismo se adapta para el mejor control del mismo: fiebre -el aumento de temperatura dispara la alarma que pone en marcha ciertos mecanismos de destrucción de agentes patógenos, incrementándose la multiplicación de las células de defensa–; decaimiento del animal -el animal restringe sus movimientos para no gastar energía puesto que toda ella se pone a disposición del sistema inmune- pérdida del apetito –la digestión es una de las funciones del organismo que más energía gasta-, etc. Es decir, los síntomas que el veterinario ve en el campo (fiebre, decaimiento y anorexia) son resultados de la acción del sistema inmune frente al patógeno más que de la acción del patógeno en sí. Incluso influye en los parámetros productivos de las especies de abasto ya que la activación del sistema inmune (como respuesta, en ocasiones, a una agresión) produce una serie de sustancias -citoquinas- que pueden influir muy negativamente en el crecimiento de los animales (p.ej: inhiben las hormonas del crecimiento, provocan situaciones de hipoglucemia, etc). ¿Has llegado a pensar que él feto es un cuerpo extraño y que el parto puede ser un rechazo controlado por el sistema inmune? La Inmunología es una ciencia con ciertas peculiaridades para cada especie animal que el Veterinario especialista, en nuestro caso en los pequeños rumiantes, debe conocer para comprender su funcionamiento y establecer los aspectos más prácticos de esta ciencia en condiciones de campo: -la VACUNA como herramienta y -la VACUNACIÓN como acto clínico de prevención y control de patologías. Los aspectos más destacados de estos dos conceptos -VACUNA y VACUNACIÓN- serán expuestos en mi presentación atendiendo a diversos puntos de vista: Investigación (Tesis Doctoral en inmunoprofilaxis), Clínica (veterinario clínico de Coopetaritiva ganadera), Técnica (responsable técnico de Ceva Salud Animal para los productos de pequeños rumiantes) y Comercial (Jefe de Ventas de Ceva Salud Animal, Laboratorio multinacional). 33 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES 1.- VACUNAS “En el manejo de los medicamentos, el conocimiento y la aplicación de buenas prácticas son imprescindibles para la obtención de los mejores resultados” 1.1.- ¿Qué es una vacuna? Es un producto biológico, compuesto liquido que contiene una solución o suspensión de agentes infecciosos (completos o no) o de toxinas –en cualquier caso antígenos específicostratados para que pierdan su capacidad patógena (muerte o inactivación) a los que se le añade un adyuvante que potenciará la respuesta inmune. El conjunto –antígeno (Ag)/adyuvante- permitirá estimular específicamente el sistema inmunitario del animal vacunado con el fin de instaurar una protección inmunológica (inmunidad humoral y/o celular) frente a patógeno/s incluido/s en la vacuna durante un plazo más o menos largo. 1.2.- Antígenos y adyuvantes Uno de los puntos clave para entender el funcionamiento de la diferentes vacunas es precisamente tener claro su composición antigénica y el adyuvante que incorporan. 1.2.1.- Atendiendo al antígeno las vacunas las podemos clasificar en: ANACULTIVO- Cualquier cultivo de un agente infeccioso cuya capacidad patógena ha sido eliminada bien por métodos físicos (calor) o químicos (formol). Sólo se refiere exclusivamente al cultivo del microorganismo, no indica nada respecto a la capacidad antigénica que conserve ni a los factores de virulencia que elimina. VACUNA MUERTA- Es un anacultivo, pero que necesariamente mantiene su capacidad inmunógena y por tanto contiene los antígenos frente a los que pretendemos vacunar. Toda vacuna muerta, partirá de un anacultivo, pero no todo anacultivo podrá ser una vacuna. BACTERINA- Vacuna muerta completa de naturaleza bacteriana. TOXOIDE ó ANATOXINA- Es la toxina inactivada a la que se le ha hecho perder su capacidad tóxica. VACUNA VIVA- Contiene los microorganismos metabólica y antigénicamente completos. VACUNA VIVA ATENUADA/INACTIVADA - (la mayoría víricas son atenuadas). La vacuna viva atenuada es una vacuna viva cuya virulencia ha sido disminuida por medios naturales: pases sucesivos por animales de experimentación, por hospedador no natural, por cultivos celulares sucesivos, por cultivo en medios limitantes (donde es restringido algún factor de crecimiento o nutriente) o por cepas manipuladas genéticamente para incapacitarlas en la expresión de uno o varios genes que se relacionan con la virulencia. La inactivación suele ser un proceso en el que se incapacita al microorganismo para la reproducción. Es lo mismo que el efecto bacteriostático de los antibióticos (impide la replicación). 1.2.2.-Atendiendo a los adyuvantes: Con la vacunación se pretende simular una infección natural a la que el organismo responde con la activación del sistema inmune. En la infección natural el animal recibe un contacto normalmente “constante” con el agente agresor (antígeno). Los adyuvantes permiten presentar al sistema inmune los antígenos incorporados en las vacunas de forma continuada en el tiempo simulando lo que ocurre en la naturaleza. 34 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Los adyuvantes de por sí ya son una sustancia extraña para el organismo por lo que su presencia ya activa al sistema inmune: se incrementa la producción de interleuquinas lo que incrementa la multiplicación de células defensivas, etc. Adyuvante de referencia: El hidróxido de aluminio: muestra un excelente compromiso «reacción local/eficacia». Actúa por depósito en el punto de inoculación por lo que puede generar focos de inflamación. Muy eficaces cuando se requiere la activación de la respuesta humoral con generación de elevadas cantidades de anticuerpos. P. Ej.: frente a toxinas. Actualmente, el desarrollo de nuevos adyuvantes es uno de los campos en los que más se está avanzando a nivel de investigación, ya que tan importante es contar con el antígeno adecuado en la vacuna como con el adyuvante que optimice la presentación del antígeno al sistema inmune permitiendo su mejor respuesta. Ejemplos de adyuvantes en los que se está investigando son: saponinas, ISCOM, interleuquinas, inmunoestimulates como el levamisol, melatonina, etc. 1.3.- Importancia de los estudios epidemiológicos en el diseño de los productos vacunales Uno de los aspectos clave en el diseño de vacunas frente a una determinada enfermedad deben ser los estudios epidemiológicos que indiquen qué agentes patógenos o qué especies dentro de un mismo género o qué toxinotipos dentro de una misma especie están presentes en el mapa microbiológico de la zona en la que se pretende usar la vacuna posteriormente. En este sentido la Epidemiología Veterinaria no está, a mi juicio si lo comparamos con la Medicina Humana, teniendo un papel relevante por lo que en un futuro sería de desear que tanto Laboratorios productores de vacunas como Instituciones Científicas Veterinarias apoyaran este tipo de estudios de gran utilidad para el control de las enfermedades. 1.4.- Conservación-embalaje de las vacunas Si bien es claro la importancia tanto del antígeno como el adyuvante en la composición vacunal, no es de menor importancia el embalaje a realizar para asegurar su correcto transporte y manteniento de la cadena de frío. Los últimos avances en este tipo de embalaje aparecidos en el mercado español de vacunas para pequeños rumiantes hace referencia a: -Caja de cartón aluminio: permite la mejor transmisión del frío desde la nevera a la vacuna. -Efecto tampón térmico del disolvente sobre el liofilizado. Fuera de lo que pueden ser aspectos de marketing, lo importante es intentar asegurar el manteniendo de la temperatura de conservación constante (normalmente el fabricante indica entre 2-8ºC). Así por ejemplo, en vacunas que se componen de un liofilizado a reconstituir en un diluyente, este puede utilizarse como tampón térmico siempre y cuando esté en contacto con el liofilizado. Además, se evitan espacios muertos en la caja que también es importante desde un punto de vista práctico en el almacenaje en frío de las vacunas. 1.5.- Seguridad-confianza en los productos biológicos El Veterinario, el productor y el consumidor –que somos todos- exigimos unos productos medicamentos para la mejora de la producción animal con la garantía de seguridad absoluta. Por supuesto que esta solo se conseguirá en el caso de haber respetado las condiciones de utilización marcadas. 35 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES De ahí, que cada vez más la Agencia Española del Medicamento (Ministerio de Sanidad y Consumo) esté muy focalizada en el cumplimiento de la FARMOCOVIGILANCIA VETERINARIA: De acuerdo con el RD 109/1995 de medicamentos veterinarios y con la directiva 2001/82/CE modificada por la Directiva 2004/28/CE por la que se establece un código comunitario sobre medicamentos veterinarios, cualquier sospecha de reacción adversa grave o inesperada o de reacción adversa en el ser humano debe ser inmediatamente notificada al laboratorio titular del medicamento o a la Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios. Existe para ello un formulario de Notificación de supuestas reacciones adversas que debe rellenarse con el máximo de información posible sobre el caso. Dicho formulario puedes encontrarlo en: www.agemed.es/index.htm La investigación en el establecimiento de protocolos de seguridad previos a la comercialización/utilización de las vacunas es esencial para este tipo de productos medicamentosos. Varios grupos de Investigadores realizan su labor en este sentido. Sin embargo, más estudios son necesarios (y de forma continuada) y por tanto la colaboración entre los Laboratorios productores y los centros de investigación, parece día tras día ser más importante. 2.- VACUNACIÓN 2.1.- ¿Qué es la vacunación? La vacunación es una herramienta de prevención que permite al sistema inmune del animal vacunado desarrollar una respuesta específica frente a una posible agresión. En la mayoría de las ocasiones se alcanzar una protección inmunológica adecuada reduciendo la posibilidad de contraer la infección. Ha demostrado ser el método más eficaz y económico para controlar determinadas enfermedades de carácter infeccioso. Podemos decir que la vacunación es un “método indirecto de actuación sobre el animal”, si lo comparamos con la administración de un antibiótico, un antiparasitario u otro tipo de medicamentos (vitaminas, etc), puesto que su éxito depende en gran medida de la condición del sistema inmune del animal vacunado y de diversas circunstancias que le rodean. Más indirecto todavía es la utilización de la “vacunación calostral” (inmunoprofilaxis lactogénica), de gran importancia en los rumiantes en general –ver apartados 2.3.- y 2.3.4.-- ya que su eficacia dependerá, además de la vacunación de la madre y de la situación de su sistema inmune, de las condiciones de la administración del calostro a los neonatos. A pesar de que la acción de vacunar sea individual, de manera zootécnica en el ganado ovino y caprino, se considera el lote o incluso el rebaño como unidad de trabajo. La variabilidad individual existente en cuanto a la respuesta a la vacunación puede hacer que en condiciones ideales sea muy difícil conseguir un 100% de la protección inmunitaria deseada. Desde un punto de vista más práctico tampoco debemos olvidar que la vacunación debe ser una herramienta cuyo fin es mejorar la salud del rebaño para evitar pérdidas económicas y por tanto mejorar la rentabilidad de las explotaciones. Diversos factores debidos tanto a los animales, como al producto vacunal, como al material utilizado en la vacunación, pueden variar la eficacia de la vacunación o el grado de protección inmunológica adquirida tras la misma. 36 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES 2.2.- Condiciones ideales para realizar una correcta vacunación 2.2.1.- De los animales: cuidados antes, durante y después de la vacunación Es esencial solo vacunar animales en buen estado general (sólo los ANIMALES SANOS tienen capacidad para responder ante las vacunas): alimentación equilibrada, desparasitados (los parásitos consumen mucha energía necesaria para que el sistema inmune reaccione de forma adecuada a la vacunación y condicionan y desvían la respuesta inmune a Th2), sin fiebre (una temperatura corporal por encima de lo normal puede indicar que el animal está respondiendo a otra infección por lo que su sistema inmune desviará la atención de la vacunación; por otro lado, este aumento de la temperatura puede eliminar las bacterias incluidas en las vacunas vivas), buena condición corporal, no sometidos a condiciones de estrés (produce inmunodepresión). Identificar los animales vacunados y hacer un seguimiento del estado general (no olvidar que el estrés producido por la vacunación puede favorecer la aparición de infecciones latentes en el rebaño) así como del punto de inoculación. Seleccionar el sitio correcto para la inoculación: por vía intramuscular son adecuados los músculos del cuello y para la utilización de la vía subcutáneas la piel del cuello y la axila. La zona corporal seleccionada debe estar limpia. Durante la vacunación es importante que el animal este suficientemente quieto y tranquilo, ello evitará accidentes y disminuirá el estrés que conlleva esta manipulación. Evitar realizar la vacunación en días húmedos y en los que se ha sacado el abono puesto que se aumenta la posibilidad de contaminación del punto de inoculación. De forma particular, tener en cuenta la sensibilidad a veces exacerbada de las cabras a cualquier acto médico. 2.2.2.- De la vacuna y los protocolos de vacunación Determinar la vacuna (por composición) y el programa vacunal más adecuados atendiendo a los antecedentes patológicos de la explotación y de otras ubicadas en la misma área, al sistema productivo y reproductivo seguido (a la carta en cada explotación en dependencia de sus necesidades intentando no sobrecargarlos). Hay que tener en cuenta que la vacunación no es un tratamiento aislado sino que requiere de una doble dosificación (en la mayoría de los casos en primovacunaciones –ver apartado 2.3.-) y de dosis de recuerdo cada cierto periodo, y en preparto si queremos realizar una vacunación calostral (ver apartado 2.4.-). Respetar la cadena de frío sin olvidar que las vacunas vivas solo se conservan unas pocas horas una vez abiertas. En el momento inicial de su manipulación cerciórese del aspecto homogéneo del frasco. Una vez vacunados todos los animales propuestos descarte los sobrantes vacunales. Antes de su uso leer detenidamente el prospecto prestando especial atención a la fecha de caducidad de la vacuna, la dosis adecuada siguiendo la vía de inoculación descrita y los intervalos entre vacunaciones 2.2.3.- Del instrumental necesario El material reservado para la inoculación (jeringuillas, pistola vacunadora o vacunador y agujas) debe estar estéril y mejor ser de un solo uso. En el momento de la inoculación colocaremos todo el material necesario en un lugar limpio, cómodo para el manipulador y seguro para evitar accidentes. La utilización de guantes de látex de un solo uso permitirá una manipulación higiénica. Si es necesario la recomposición de la vacuna utilice el material anexo. 37 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Las agujas a utilizar deben ser adecuadas al tipo de animal a vacunar: como norma general para animales adultos es suficiente con agujas de un calibre entre 16 y 18 y con una longitud de 12 a 25 mm para inoculaciones subcutáneas y de 25 a 40 mm para las inoculaciones intramusculares. Idealmente utilizar agujas nuevas para cada animal o como mínimo cambiarlas cada 10 animales. Cuando se esté cargando la jeringuilla expulsar el aire fuera de la jeringuilla para depositar la dosis correcta. 2.3.- Respuesta vacunal Como se ha desarrollado previamente, estrictamente el cometido de una vacunación es la estimulación del sistema inmune del animal vacunado (respuesta vacunal) para que proporcione un umbral de defensa humoral y/o celular por encima del considerado básico que permita resolver una futura posible infección. Si el tipo de vacunación realizada responde a Th-2 (mayoritariamente humoral), una de las medidas más objetivas para medir la eficacia de la primovacunación es analizar la seroconversión producida en un número representativo de animales vacunados entre los 15 días y 3 meses posteriores a la vacunación. Sin embargo, en animales que han podido tener contacto con el agente patógeno la seroconversión sólo es válida si se ha utilizado vacunas marcadas. Primovacunación: Entendemos por primovacunación el primer contacto del animal con una vacuna determinada independientemente de la edad en la que se practique la citada vacunación. Este hecho es importante puesto que para conseguir una correcta primovacunación con la mayoría de las vacunas –a excepción de las vivas-, es necesario que el animal reciba dos contactos con el antígeno lo que se denomina “efecto booster”: Tras la segunda inoculación, el batallón de linfocitos B de memoria específicamente generados en el primer contacto con el antígeno, se movilizan rápidamente y producen una mayor cantidad de anticuerpos específicos. De aquí la importancia de una segunda inoculación en la primavacunación para conseguir una respuesta vacunal más eficaz. Además, la aparición de las IgG es mucho más rápida, acortando el periodo de latencia. Clásicamente se establece un periodo de 3 a 6 semanas entre las dos inoculaciones. Si la primovacunación se realiza sobre animales neonatos, debemos recordar que su sistema inmuniatario NO es totalmente maduro aunque puede responder pocos días después del nacimiento. La reacción será más lenta y menos eficaz que el de un animal adulto. Además, tenemos que tener en cuenta las posibles interferencias con los anticuerpos calostrales. Revacunación: La respuesta generada en la primovacunación no es de por vida ya que la población de células B de memoria desaparece y por lo tanto la capacidad de luchar eficientemente contra el Ag disminuye con el tiempo. La inoculación de recuerdo a intervalos regulares (normalmente bianual) permite mantener la respuesta inmunitaria a largo plazo. En estas inoculaciones de recuerdo, la movilización de los linfocitos B sensibilizados previamente, así como la generación de más linfocitos de memoria, es más eficiente, por lo que la producción de anticuerpos (fundamentalmente IgG como ya se ha explicado) es mayor y más rápida obteniéndose así una respuesta inmunitaria más especializada para ese tipo de antígeno concreto. Muy importante: la revacunación cada 6 meses es esencial en vacunaciones en las que se desencadena fundamentalmente la vía humoral (Th- 2: genera poca memoria) (p. Ej.: 38 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES vacunación frente a las enterotoxemias; durante 6 meses aproximadamente tras la vacunación hay liberación constante de antígeno y por tanto estimulación constante de linfocitos B con la consecuente producción de Ac. Pasado este tiempo, y dado que en este tipo de respuesta no se genera una gran memoria, no hay estimulación y por tanto no hay producción de Ac y los animales quedan desprotegidos. 2.3.1.- Interpretación/medición de resultados La cantidad de un anticuerpo específico frente a un agente patógeno que tiene el suero sanguíneo (o calostral) de un animal se mide mediante lo que se denomina “título sérico de anticuerpos”. P.ej.: en una muestra de sangre que recibimos del Laboratorio nos dicen que el título frente a una determinada enfermedad es 1/128 ¿qué significa? Que el suero sigue teniendo anticuerpos específicos después de ser diluido 128 veces. Cuanto más alto es el denominador mas diluida está la muestra y por tanto indica una mayor concentración de anticuerpos en el suero. Este título puntual no proporciona demasiada información ya que puede estar condicionado por numerosos factores: contacto puntual con el antígeno, etc. Una mayor información nos la da su evolución: seroconversión y cinética de anticuerpos. La cinética de anticuerpos en la sangre nos describe la cantidad (título) y duración de los anticuerpos circulantes en el tiempo. Por debajo del umbral de protección, el animal no tiene defensas para asegurar una respuesta eficaz frente a una hipotética agresión del agente patógeno. Seroconversión: un animal antes de haber tenido contacto con un agente patógeno o ser vacunado no presenta anticuerpos específicos en su sangre, es seronegativo. Después del contacto con el antígeno (infeccioso o vacunal) se produce la seroconversión al poder detectarse títulos positivos de anticuerpos específicos en su sangre (ya es seropositivo). Esta conversión puede usarse a nivel diagnóstico teniendo en cuenta que las muestras se deben tomar de forma pareada con un intervalo mínimo de 15 días. La seroconversión en cuanto a la vacunación mide la capacidad antigénica de la vacuna. El mero hecho de hacer un perfil sérico proteico o determinar la cinética de anticuerpos específicos para una determinada enfermedad NO va a dar la información completa sobre el estado inmunológico del animal en general o frente a esa determinada enfermedad ya que por un lado sólo estamos valorando la respuesta humoral y además sólo la sistémica sin tener en cuenta la que se produce a nivel local. ¿Cómo puedo medir la capacidad inmunológica del rebaño? Resulta difícil ya que como hemos visto debemos de tener en cuenta la inmunidad celular y la humoral, y que además en ambas, parte de la respuesta se genera a nivel local y otra parte a nivel sistémico. Hoy por hoy los análisis rutinarios que se realizan suelen ser de muestras sanguíneas (por tanto sólo reflejan la inmunidad sistémica) y para medir únicamente anticuerpos (por lo que no se valora la inmunidad celular). Teniendo en cuenta estas premisas, realizar el perfil proteico del suero observando el % o concentración de inmunoglobulinas de un número más o menos representativo de animales puede indicarme el estado inmunitario del rebaño 39 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES 2.3.2.- Fallo en la respuesta vacunal Según lo citado en el apartado 2.3.-, el fallo en la respuesta vacunal será la no consecución de la protección inmunológica deseada, es decir una disminución de la eficacia de la vacunación que no ha conseguido la respuesta suficiente en un notable número de animales vacunados. ¿En qué porcentaje este fallo es debido a la propia vacuna –fallo vacunal-? Es difícil de valorar puesto que son muchos los factores que intervienen. Cuando se presentan los fallos en la respuesta vacunal y antes de achacar el problema a la vacuna en cuestión, es importante descartar otros factores relacionados con los animales y con el material utilizado para la vacunación que pueden también influir. Además, debemos de descartar otras situaciones a menudo frecuentes: -A veces lo que realmente ha habido es un mal diagnóstico y no se ha vacunado frente al agente que hay que combatir. -En otros casos lo ocurrido es la mala elección de la vacuna por no tener entre sus objetivos el agente patógeno (o su toxina) en cuestión. -No son fallos vacunales intentar obtener una respuesta terapéutica en vez de profiláctica. Reacciones generales tales como fiebre, decaimiento, anorexia, infartación de los ganglios proximales al sitio de inoculación (indica la mayor división y proliferación de células inmunes), pueden ser reacciones observadas tras la vacunación sin que puedan considerarse reacciones adversa. Sin embargo, si tras una determinada vacuna se presentan tales síntomas, estas deben describirse en el prospecto del producto vacunal. El buen conocimiento del producto vacunal (muy importante seguir correctamente las indicaciones del prospecto) así como de su manipulación y utilización son armas imprescindibles para evitar la aparición de fallos en la respuesta vacunal y/o reacciones adversas. 2.4.- El calostro: inmunoprofilaxis lactogénica. Gran importancia para los pequeños rumiantes neonatos. Capítulo aparte merece el calostro y su importancia en los pequeños rumiantes neonatos. El calostro es la primera secreción láctea " primera leche" de las hembras mamíferas después del parto. Contiene un nivel alto de varios nutrientes fundamentales para la salud y viabilidad de la cría. Entre ellos destaca las inmunoglobulinas presentes de forma muy concentrada en el calostro (ver apartado 2.3.1.). Este hecho es fundamental en el ganado ovino y caprino debido al tipo de placenta sindesmocorial que poseen. A diferencia de la especie humana la placenta de lo pequeños rumiantes se compone de numerosas capas que separan la sangre materna y fetal. Por ello, el paso de anticuerpos de un compartimento al otro es imposible durante la gestación y los corderos y cabritos nacen sin anticuerpos en su sangre procedentes de su madre. Así, la correcta ingestión de calostro materno provee a estos neonatos de la primera fuente natural, específica y eficiente de protección inmunológica frente a una variedad de microorganismos patógenos presentes en el medio. Por tanto, una de las estrategias más importantes para mantener con vida y con buena salud tanto a los corderos es asegurarse que reciban la cantidad y calidad de calostro adecuada durante las primeras dos o tres horas de vida. El fenómeno de la trasferencia de las inmunoglobulinas (Ig) desde la luz intestinal hasta la sangre del recién nacido tiene un tiempo limitado, comenzando su regresión progresiva a las 40 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES 12 horas de vida y finalizando aproximadamente a las 24 horas. Estos periodos varían para las diferentes Ig, siendo inferior para las Ig más pesadas (IgM: pentámero). También varían a la baja si el animal está estresado (p.ej.: frío, hacinamiento, etc) 2.4.1.- La composición inmunológica del calostro Inmunoglobulinas (fundamentalmente IgG, IgM e IgA) que serán absorbidas por los entericitos únicamente durante las 24 primeras horas de vida. A partir de ahí las inmunoglobulinas (sobretodo IgA) presentes en la leche producirán una inmunidad local. Un calostro de alta calidad debe contener >50 mg de inmunoglobulinas/ml. Este dato es importante para determinar la valía de sustitos de calostros (ojo!!!! suplementos comerciales) Leucocitos que participan en la inmunidad celular del cordero neonato: solo pueden absorberse los leucocitos de la madre biológica del cordero, lo que explica que los calostros de otras hembras o de otras especies sean menos eficaces. Los leucocitos maternos del calostro que no sean absorbidos por el neonato ejercen un efecto protector a nivel local intestinal. Citoquinas e interferón: que como hemos descrito desempeñan funciones de regulación del sistema inmune y otras funciones fisiológicas Conforme avanza la lactación el calostro se convierte en leche evidenciándose cambios en su composición inmunológica. El hecho de que la mayoría de la IgG e IgM del calostro provenga del suero sanguíneo nos permite saber cual será la cantidad de estas Ig en el calostro (y por tanto saber la capacidad inmunológica humoral de este calostro) fácilmente sólo mediante la determinación de la concentración de Ig en una muestra de sangre tomada en un momento próximo al parto. 2.4.2.- Condiciones idóneas de ingestión de calostro por los pequeños rumiantes neonatos TODOS LOS CORDEROS RECIÉN NACIDOS NECESITAN CALOSTRO Como norma en los pequeños rumiantes debemos administrar la cantidad de calostro equivalente al 10% del peso vivo durante las 12-24 primeras horas de vida (p. Ej: un cordero de 4,5 kg debe recibir 450 gr de calostro en ese periodo, recibiendo la mitad entre las 4 a 8 horas después del nacimiento). Se debería permitir que los corderos mamen de sus madres lo antes posible. En muchas ocasiones se debe ayudar al recién nacido: AHIJAMIENTO, esta práctica es más eficiente que el posterior suministro de calostro por biberón. Las tomas debe ser entre 60 a 120 gramos a intervalos de 3 a 4 horas. Es importante retirar el calostro rápidamente de la ubre de la madre después del parto (mediante lactación u ordeño), ya que después del parto no se forman más proteínas calostrales y comienzan procesos de reabsorción y degradación de las mismas así como de otros componentes del calostro, se considera que un calostro retenido en la ubre conserva una buena calidad sólo durante 2-4 horas. Es crítico el que los corderos y cabritos reciban el calostro durante las primeras 24 horas de vida para asegurar la correcta absorción de anticuerpos. El tamaño de los poros intestinales existentes entre los enterocitos de los recién nacidos (permeabilidad intestinal) solo es lo suficientemente grande para el paso de las inmunoglobulinas durante las primeras 24 horas de vida. A diferencia de otras especies animales en los rumiantes se absorben todos los tipo de inmunoglobulinas presentes en el calostro 41 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES 2.4.3.- Indicadores de la calidad inmunológica del calostro y de una buena transferencia de anticuerpos calostrales al neonato: En condiciones de campo se suele utilizar un densitómetro (calostrómetro): nos indica la densidad del calostro. Ésta está directamente relacionada con la concentración de proteínas presentes en el mismo lo que nos da una ligera idea de la cantidad de inmunoglobulinas que contiene el calostro. Sin embargo, para tener una mayor certeza es conveniente realizar un perfil proteico sobre una muestra de calostro: específicamente nos indicará el contenido en Inmunoglobulinas. Durante la etapa de transferencia de anticuerpos calostrales, parte de ellos se elimina simultáneamente por la orina del neonato (se produce una inmunoglobulinuria= proteinuria). Por ello, la utilización de una tira reactiva para la detección de proteínas en orina nos indicará de forma indirecta la transmisión de anticuerpos calostrales. La proteinuria solo se produce mientras dura la transmisión de anticuerpos calostrales. 2.4.4.- Vacunación de las madres en preparto La vacunación de las madres antes del parto permite enriquecer inmunológicamente el calostro: es el principio de la “vacunación calostral”. Además, los títulos de anticuerpos específicos en leche son muy superiores y aunque no serán absorbidos vía intestinal, proporcionarán al cordero inmunidad local. En caso de primovacunación y para asegurar un enriquecimiento máximo del calostro, es necesario separar la inoculación del parto al menos de 2 a 6 como máximo, obteniéndose los mejores resultados cuando la inoculación se realiza a las 3 semanas preparto En las ovejas no vacunadas en preparto la caída de los títulos de anticuerpos en leche y calostro es más pronunciada que en las ovejas vacunadas en el preparto (inoculación entre 3-6 semanas previas al parto). La vacunación en preparto de las madres es fundamental para proteger al neonato contra las enfermedades de los 2-3 primeros meses de vida. Posteriormente, la eficacia de la vacunación calostral dependerá de la cantidad y calidad del calostro administrado, permitiendo a los neonatos retrasar la susceptibilidad a las infecciones hasta por lo menos las 6-8 semanas de vida. Si se produce un buen suministro y aprovechamiento del calostro, el suero de los recién nacidos de madres vacunadas en preparto presenta títulos más elevados de anticuerpos específicos y durante más tiempo manteniendo un nivel de defensa inmunológica superior al umbral. En neonatos de madres no vacunadas la zona de indefensión inmunológica (zona en la que el nivel de anticuerpos en suero está por debajo del umbral de protección) es mayor que en neonatos amamantados por madres vacunadas. !La vacunación de las hembras en el preparto contra enfermedades tales como la enterotoxemia es de vital importancia para los neonatos, ya que de esta forma el calostro contendrá los anticuerpos capaces de combatir estas enfermedades! 3.-MIS ANIMALES ESTÁN VACUNADOS, PERO ¿ESTÁN PROTEGIDOS? La vacunación es un acto seguro aunque conlleva ciertos riesgos que deben ser siempre valorados y tenidos en cuenta tanto por el Veterinario como por el propietario de los animales. 42 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Manejo la explotación Situación epidemiológica de la zona Condiciones inmunológicas de los animales Programa sanitario Agentes patógenos: presión de infección Programa Vacunal Respuesta vacunal A lo largo de todo este texto ha quedado refrendado la importancia de diversos parámetros en la respuesta vacunal, no solo en cuanto a la vacuna, al animal y al acto de la vacunación, sino también como se muestra en el gráfico anterior la interrelación entre el programa vacunal dentro del programa sanitario integral de la explotación, las condiciones inmunológicas del rebaño dentro del manejo general de la explotación y todo en una situación sanitaria influida por el entorno. De aquí que siempre tenemos que tener muy en cuenta que la vacunación como herramienta preventiva para el control de patologías debe de realizarse en unas condiciones óptimas y para ello siempre debe venir asociada a la profilaxis zootécnica, es decir, asociada a todos aquellos aspectos que mejoren las condiciones de producción de los animales. PROFILAXIS ZOOTÉCNICA objetivos disminuir las circunstancias inmunosupresoras “control de estresores” aumentar las circunstancias inmunoestimuladoras Para ello debemos vigilar: Nutrición Ventilación Temperatura Densidad Transporte Parasitación Presión de infección Bienestar animal es sinónimo de calidad inmunológica 43 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES BIBLIOGRAFÍA Manteca, Ch., Zorrilla, I., De Mora, F., Fariñas, F., Martín, S. Y Suárez, S. (2004) Guía CEVAC de inmunología en ganado ovino. Primera parte. Edición: ICE SALUD. ISBN: 84-609-2457-2. Manteca, Ch., Zorrilla, I., De Mora, F., Fariñas, F., Martín, S. Y Suárez, S. (2004) Guía CEVAC de inmunología en ganado ovino. Segunda parte. Edición: ICE SALUD. ISBN 84-609-6268-7. 44 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES EVOLUCIÓN Y SITUACIÓN ACTUAL DE LA ENCEFALOPATÍA ESPONGIFORME BOVINA (EEB) GONZALO FERNÁNDEZ Dpto. Patología Animal. Facultad Veterinaria de Lugo. Universidad de Santiago de Compostela. Corresponding author. Tel +34 982285900; fax: +34 982252195. E-mail address: [email protected] (G. Fernández). Dado las características específicas de la Encefalopatía espongiforme bovina (EEB) para llevar a cabo un análisis sobre esta enfermedad es necesario tener en cuenta una serie de consideraciones. Es un proceso que se caracteriza por su largo período de incubación (media de 5-7 años), por producirse la infección principalmente en el primer año de vida de los animales y por ser transmitida mediante alimentos contaminados. Por lo tanto, la situación actual de la enfermedad no sólo va a ser reflejo de los condicionantes que se producen en la actualidad, sino principalmente, de los que tuvieron lugar en el pasado. En la actualidad, tras un máximo en los años previos, se ha observado una disminución de casos en todos los países de la Unión Europea (UE), tanto en el Reino Unido (RU), donde la enfermedad ha presentado su mayor expresión, como en el resto de los estados (figura 1). Este hecho está llevando a una situación de reflexión sobre el futuro de los programas de vigilancia y control de la enfermedad que se están llevando a cabo en todos los países europeos. Para realizar este ejercicio reflexivo es imprescindible analizar tanto la evolución de la enfermedad como la eficacia de las medidas establecidas en los últimos años. 400 350 300 Francia España Italia Portugal 250 200 150 100 50 0 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 Figura 1. Evolución de casos de EEB en estados europeos según año de nacimiento 45 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Para realizar una valoración de la situación actual analizaremos los animales detectados durante el año 2004 teniendo en cuenta su año de nacimiento (figura 2). 1000 65,5% 900 800 3,5% 700 600 30,6% 500 400 300 200 100 Nº 0 -1990 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 Figura 2. Año de nacimiento de los animales confirmados con EEB en la UE menos el RU en el año 2004 Animales nacidos antes de 1994 A pesar de que son animales ya nacidos hace más de 10 años todavía representan un porcentaje importante de los casos que se presentan en la actualidad (hasta un 30%). Este período se caracterizó por la existencia de un gran número de casos de BSE en el RU. En está época se van estableciendo medidas para evitar la exportación de la enfermedad desde el RU que no fueron totalmente completadas hasta años después. Aparecen por primera vez casos de la enfermedad en varios países europeos (figura 3). 46 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Liechtenstein Irlanda Suiza España Dinamarca Alemania Holanda Bélgica Luxemburgo Francia Portugal 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 Figura 3. Año de declaración del primer caso nativo de EEB en países de la UE-UK Las medidas para evitar la diseminación de la enfermedad por medio de la alimentación animal no son todavía establecidas de forma que una vez introducida en un país la enfermedad pudo transmitirse a otros animales de la cabaña mediante piensos contaminados. Animales nacidos entre 1994 y 1998 Son los animales que representan todavía un mayor porcentaje de los casos que se presentan en la actualidad (hasta el 65%). Las medidas para evitar la exportación de la enfermedad desde el RU se van haciendo más efectivas a lo largo de este período (figura 4). 47 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES 80 70 60 Embargo animal RU 50 Embargo Portugal Identificación RU 40 Identificación UE Embargo subpr RU 30 Doc. Normalizado ANIMO 20 10 0 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 Figura 4. Año de implementación de medidas para evitar la diseminación entre países Se establecen los primeros programas de vigilancia y control en diversos países de la UE y las primeras bases comunes de epidemiovigilancia a nivel europeo. Aparecen casos por primera vez en Holanda, Bélgica, Luxemburgo y Liechtenstein. En este período todavía existen claras deficiencias en las medidas para disminuir su disminación mediante la alimentación animal. Así, aunque se prohíbe la alimentación de rumiantes con subproductos de mamíferos en el año 1994 en toda la UE, esta medida no se considera totalmente efectiva en algunos estados miembros hasta años posteriores. Hasta el final de este período no se fijan claramente los métodos de tratamiento de los subproductos que inactivan el agente causal y que tardarán también un tiempo en ser aplicados de forma efectiva. También no se aplica de forma general, salvo en países como el RU y posteriormente en Francia, Irlanda y Portugal, la eliminación de los materiales específicos de riesgo de la cadena de alimentación animal. Este período se caracteriza también por la posibilidad de contaminaciones cruzadas en la fabricación, distribución y dispensación con piensos con destino a animales no rumiantes. Así, se han descrito en diversos países diferencias de presentación de la enfermedad en distintas zonas dependiendo, por ejemplo, de la carga ganadera de porcino (figura 5). 48 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES A.Allepuz, J.Casal, A.Alba, A.Picado G.Fernández, 2004 1994-1998 Figura 5. Comparación del censo de porcino en Galicia con las zonas con mayor número de casos de EEB de los esperados en los animales nacidos en el período 1994-1998 Animales nacidos entre 1998-2000 Estos animales representan en la actualidad un número menos importante de casos (hasta el 3,5%). Esta época se caracteriza por la efectividad de las medidas para evitar la exportación de la enfermedad y un mucho menor número de casos en el RU. Aparecen los primeros casos de BSE en España, Dinamarca y Alemania. 80 70 60 50 Piensos rumiantes Cont. Cruzada 40 Tratamiento MER 30 20 10 0 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 49 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Figura 6. Año de implementación de medidas para evitar la contaminación de piensos en relación a la EEB También las medidas para evitar la diseminación de la enfermedad por medio de la alimentación animal se desarrollan más eficazmente (figura 6), lo que se ha reflejado en diversos estudios realizados en los que se ha observado una variación en el patrón de presentación de los casos de EEB (figura 7) y en una disminución en los animales confirmados con la enfermedad nacidos desde el inicio de este período (figura 8) 1998-2000 p h s . 8 9 9 1 y l u J r e t f A 4 9 . 7 7 5 1 . 8 4 8. 1 . 62 05 11 -4. 8 9 .6 70 71 8 . 0 3 2 1 . 2 5 1 5 . 5 2 5 8 . 0 3 2 Allepuz A., Lopez A., Forte A., Fernández G., Casal J 2006 Figura 7. Distribución geográfica de los casos de EEB de los animales nacidos durante el período 1998-2004 en Galicia. 50 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES 160 140 120 100 80 60 40 20 0 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 Figura 8. Animales declarados con EEB en España según su año de nacimiento. A pesar de ello sigue siendo posible la contaminación cruzada de piensos con los de otras especies y no es efectiva hasta el final del período la eliminación de los materiales específicos de riesgo en la alimentación animal. Esto hace que a pesar de las medidas establecidas todavía exista un número de casos no desdeñable de animales nacidos en este período. Animales nacidos a partir del enero de 2001 Dada la mayor eficacia de las medidas ya tomadas y las establecidas a final del año 2000 (para evitar contaminaciones cruzadas y eliminación efectiva de materiales específicos de riesgo) son muy pocos los casos presentados en la UE de animales nacidos en este período. En la figura 8 se pueden observar la disminución de animales nacidos desde el año 1997 Sin embargo, como efecto de la situación de los años anteriores y al largo período de incubación de la enfermedad, se producen la mayor presentación de animales detectados con la enfermedad en la UE distintos al RU (figura 9). 51 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES 1200 1000 800 600 400 200 0 -1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 Figura 9: Nº de casos de EEB en la UE menos el RU según año de presentación Por efecto de la situación anterior y, en algunos casos, la mejora de los programas de vigilancia se presentan por primera vez animales con BSE en muchos países europeos como Grecia, Italia, República Checa, República Eslovaca, Austria, Eslovenia, Finlandia y Polonia. También este período se caracteriza por la presentación de los primeros bovinos detectados en países no europeos como Japón, Israel, Canadá o Estados Unidos y la aparición de un caso de EEB en un caprino en Francia. A pesar del bajo número de casos de animales nacidos en esta época y el bajo riesgo que representan para la salud pública, éstos tienen una gran significación dado el alto nivel de implantación de las medidas de control. Este mismo hecho se está observando en el RU con casos nacidos a partir de la prohibición efectiva. La existencia de estos animales con BSE ha llevado a cuestionar diferentes aspectos de la enfermedad, como por ejemplo su origen primario, la posibilidad de existencia de casos esporádicos, el papel de la transmisión vertical o la eficacia total de las medidas establecidas hasta una fecha dada. Aún es pronto para obtener conclusiones y debe seguir observándose y analizando la presentación de estos casos y su evolución en el tiempo. También es necesario la vigilancia y el seguimiento de casos de EEB en pequeños rumiantes. 52 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES CONCLUSIONES La experiencia adquirida nos permite valorar la eficacia de las medidas tomadas hasta el momento y la influencia que tuvieron tanto en la prevalencia de la enfermedad como en la distribución de ésta según las características de los territorios. La implantación de sistemas de identificación y trazabilidad del ganado, el replanteamiento de la policía sanitaria en relación a la alimentación animal y los subproductos de origen animal, entre otros aspectos, que aunque han sido establecidos en base a la aparición de esta enfermedad se mantendrán en el tiempo ya que son básicos para la sanidad animal y la salud pública. Sin embargo, la realidad epidemiológica de la enfermedad y la situación en cada estado debe estudiarse y tenerse en cuenta a la hora de el mantenimiento de algunas medidas más específicas. La posibilidad de categorizar los estados según el riesgo, el desarrollo de nuevas técnicas para la detección en piensos y materias primas de proteínas de origen animal, o para tipificar cepas de encefalopatías espongiformes bovinas o para detectar animales infectados “in vivo” y la evolución de la enfermedad, pueden permitir el establecimiento de medidas adecuadas al riesgo en relación a los materiales específicos de riesgo, el tratamiento de subproductos o los sistemas de vigilancia y medidas de erradicación. En definitiva adecuar la estrategia a la nueva situación, de forma que asegurando la salud pública permita desarrollar las actuaciones de una forma y con un coste proporcionado al riesgo. BIBLIOGRAFÍA: 1-Abrial D., Calavas D., Jarrige N., Ducrot C. 2005. Spatial heterogeneity of the risk of BSE in France following the ban of meta and bone meal in cattle feed. Prev. Vet. Med., 67, 69-82. 2-Allepuz A., Fernández G., Alba A., Casal J. 2005. Etude de la distribution spatiale des cas d´encéphalopathie spongiforme bovine (ESB) en Galice (2000-2004). Epidémiol. Et santé anim. 47, 141-150 3-Allepuz A., López A., Forte A, Fernández G., Casal, J. 2006. Análisis of the geographical distribution of the BSE risck on Galicia (Spain). 14 Congreso Internacional de la Federación Mediterránea de Sanidad y Producción de Rumiantes. Lugo-Santiago de Compostela, Spain. 3- Baron T., Calavas D. 2005. L´encéphalopathie spongiforme bovine. Pathologie Biologie 53, 229-236. 4-Comisión Europea. 2005. “Hoja de ruta” para las EET. Bruselas. COM (2005) 322 final. 5-Comisión Europea. 2005. Report on the monitoring and testing of ruminants for the presence of Transmissible spongiform encephalopathy (TSE) in the EU in 2004. Luxemburgo. 6-Cuenot M., Didier C., Abrial D., Gasqui P., Cazeau G., Ducrot C. 2003. Temportal and spatial patterns of the clinical surveillance of BSE in France, analysed from January 1991 to May 2002, trough a vigilance index. Vet. Res., 34, 261-272. 7-Defra. 2005. Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE). http://www.defra.gov.uk/animalh/bse/index.html. 8-Heim D., Mumford E. 2005. The future of BSE from the global perspective. Meat Science 70, 555-562. 53 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES 9-Hoinville J.J. Declene in the incidence of BSE in cattle born after the introduction of the feed ban. 1994. Vet. Rec., 134, 274-275. 10-Stevenson M.A., Morris R.S., Lawson A.B., Wilesmith J.W., Ryan J.B.M., Jackson R. 2005. Area-level risks for BSE in British cattle before and after July 1988 meat and bone meal feed ban. Prev. Vet. Med., 69, 129-144. 54 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES CALIDAD DE LA CARNE DE LAS RAZAS AUTÓCTONAS SÁNCHEZ, L. Dpto. Anatomía y Producción Animal. Facultad de Veterinaria. 27002 LUGO Teléf. +34-982-252231 Ext. 22400. Fax 982-252195. E-mail [email protected] I.- Situación actual del mercado En el mercado actual de la carne bovina existen tendencias en las preferencias del consumo que pueden ser interesantes para elaborar las estrategias del comercio a medio plazo. Nos referimos a aspectos tan importantes como la calidad, la seguridad y la salud de los consumidores. Nuestros ciudadanos tienen unas legítimas elevadas expectativas en relación con la seguridad y la calidad de sus alimentos. Los modernos sistemas de producción y las actuales estructuras de comercio permiten que haya una transparencia total, no sólo en cuestiones relacionadas con la salud de los animales y la seguridad de los alimentos, sino también por lo que se refiere a unas normas de producción que respeten el medio ambiente y el bienestar de los animales. Para cumplir estas expectativas y tener en cuenta el progreso técnico de los últimos años, la UE ha llevado a cabo una profunda revisión de su legislación en el ámbito de la seguridad alimentaria. Actualmente, este proceso de reforma ha finalizado casi totalmente. La nueva legislación alimentaria de la UE insiste mucho en los procesos de control a lo largo de toda la cadena alimenticia, desde la granja hasta la mesa. La legislación alimentaria general apoya una buena circulación de la información y una gestión de la calidad. Esta filosofía refleja las exigencias de los consumidores y explota las oportunidades que ofrece el progreso técnico. Es evidente que con controles únicamente sobre el producto final no se podría proporcionar el mismo nivel de seguridad, calidad y transparencia al consumidor. Conviene recordar que la reordenación de la política de producciones de la U.E. y los últimos acontecimientos ocurridos en relación con la seguridad alimentaria, han hecho reaccionar a productores y consumidores, reivindicando unas orientaciones más positivas y acomodadas a las situaciones del mercado. Esta circunstancia ha motivado que los sólidos cimientos que representan la ganadería tradicional vuelvan a tener actualidad, representando por si mismas la salubridad de los alimentos producidos en esos tres signos que el consumidor valora: sano, bueno y natural. Como soluciones inmediatas, las autoridades comunitarias han reconducido los apoyos y estrategias, fomentando la diversificación de las producciones para conseguir un mayor equilibrio en el mercado entre la oferta y la demanda, pero más específicamente de los productos que presentan determinadas características con connotaciones de calidad y garantía de origen geográfico; la mayor parte de ellos proceden incluso de zonas poco favorecidas y más periféricas, con lo que su promoción y mayor valor económico podría asegurar una mejora de la renta de los ganaderos y el asentamiento en las poblaciones rurales. Con esta filosofía se ha emitido el Reglamento (CE) Nº 510/2006 sobre la protección de las indicaciones geográficas y de las denominaciones de origen de los productos agrícolas y alimenticios. Paralelamente se está observando que los consumidores tienden a otorgar mayor importancia a la calidad que a la cantidad, polarizando su demanda en productos de un origen determinado. Estamos en un momento en el que, junto a la mayor atención que se le 55 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES presta a las características perceptibles con los sentidos, se han puesto de manifiesto las preocupaciones por la salud, por el medio ambiente, por la región productora y por las cuestiones éticas incluso, como el bienestar de los animales. Se quiere la calidad completa, tanto técnico-económica, como organoléptica, sanitaria, dietética, nutritiva, culinaria o gustativa. Se desea, en definitiva, la calidad total, influenciada por características y éstas por atributos que vienen a representar indicadores de esa calidad. La más idónea combinación de estos indicadores, según la actitud de los consumidores, nos va a proporcionar la mejor aceptabilidad de la carne(Sánchez, 1997). Como consecuencia de los diferentes sistemas de producción y de las razas utilizadas para desarrollarlos, el mercado de la carne presenta una gran heterogeneidad en cuanto a los caracteres cuantitativos y cualitativos que definen los diferentes tipos de canales comercializadas. Esta gran variabilidad, lejos de constituir un inconveniente para la comercialización, representa de alguna manera, una cierta ventaja, por cuanto permite ofrecer al mercado carnes marcadamente diferentes, que pueden satisfacer las más encontradas diferencias de la demanda. Sin embargo, cada día se pone más de manifiesto que esa oferta diversificada de la carne debe de estar garantizada al comprador por unas cualidades y características específicas, que en definitiva se van a relacionar con la categorización y calidad del producto. Esta calidad va a depender directamente del tipo genético y de las prácticas de explotación, en la proporción aproximada del 30 y 70%, respectivamente. La raza es responsable de variaciones importantes en dos caracteres de la canal que condicionan su calidad: la conformación y composición en carne, hueso y grasa, según el gusto del consumidor. En un sistema determinado de producción, donde se presentan en armonía los caracteres enumerados, éstos van a significar los criterios básicos que prevalecen en todos los sistemas de valoración implicados en el comercio de la carne. El sistema de producción, entendido como el conjunto de técnicas o peculiaridades concernientes al manejo, alimentación, selección y reproducción que se realizan en el ganado en función de la ecología y de los condicionamientos socio-económicos de una determinada área geográfica, conlleva y determina sobre las canales dos características cuantitativas de gran importancia económica: el peso de la canal y su edad cronológica, de las que van a depender factores tan determinantes de la calidad como es la terneza. El sistema de alimentación y manejo, lactación y suplementación natural, proporciona a su vez algunos de los más importantes parámetros que influyen en la calidad de la carne, como son el olor, aroma y sabor. En las razas autóctonas de ganado (Sánchez, 1998), la producción especializada de carne, viene a representar el principal aval de calidad, al poseer unas características diferentes y diferenciadas de otras razas (composición de los tejidos, tamaño de la fibra muscular, etc.), a las que se unen todas aquellas que se producen como consecuencia de un manejo y alimentación tradicional (color del músculo, jugosidad, terneza y composición de la grasa intramuscular). Estos aspectos se han hecho valer por los ganaderos de las diferentes razas y se han acogido al régimen de Denominaciones de Origen y Denominaciones Genéricas y Específicas con el fin de hacer posible la diferenciación de las carnes que por sus características raciales y de producción presentan una elevada calidad comercial. 56 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Con los actuales planteamientos de mercado, hay que aceptar como muy válida la vieja definición de calidad de la carne: Poder de atracción sobre el consumidor y capacidad para satisfacer a éste cuando se convierte en consumidor. En la confluencia de estos dos factores está la clave del éxito. Conocer el grado de preferencias del consumidor significa la primera garantía que asegura de alguna manera la mejor oportunidad de venta de la carne, sobre todo si ha existido o completado una o varias fases de promoción del producto. La Comisión Europea ha difundido unos estudios sobre el impacto de las campañas promocionales de la carne de vacuno entre la población europea y los resultados son altamente clarificadores. En los quince países miembros de la U.E., cinco de cada diez europeos han oido hablar de los productos con Denominaciones de Origen, cuatro de diez los han comprado alguna vez y uno de cada diez los compra habitualmente. La encuesta indica que más de la mitad de los europeos están dispuestos a pagar un poco más por estos productos. El grado de conocimiento en España es mayor. El 88,7% de los encuestados valoran estas campañas bien o muy bien y le resultan agradables de oir o ver (73,1%), las entiende bien (89,8%) y le resultan informativas (80,6%). La mayoría compra carne de vacuno, con una frecuencia de 7 o menos días (64,3%), generalmente en la carnicería (70%) y en menor medida en supermercados o autoservicios (25,4%). El tiempo medio que pasa entre que se compra la carne y se consume en el hogar es de dos tres días para un 45,8% y de un día para un 40,3%. Casi dos tercios de las personas que en alguna ocasión realizan la compra de productos de alimentación opina que es imprescindible que la carne tenga un certificado de calidad (63,1%) y un 32,2% cree que es bueno pero no imprescindible. Sin embargo, el consumidor se fija habitualmente en determinadas características o particularidades, principalmente el color, textura y cantidad de grasa, y en función de ellas realiza la elección, si tiene la confianza necesaria en el producto o en el punto de compra. Según la encuesta a la que nos estamos refiriendo, el color (77,5%), el corte de la carne (51,1%) y le que no tenga grasa (45,1%), son los aspectos en los cuales se fija más la gente a la hora de comprar carne de vacuno. El precio del kilo (34,6%), el tamaño del corte (32,6%), la certificación de calidad (28,7%) y su lugar de procedencia (28,1%) son otros aspectos a destacar. Por lo que se refiere a la comparación de diferentes carnes, para la mayoría de la población (68,7%) la carne de pollo es la más barata, si bien el 34% considera que la carne de vacuno es la más sana. La carne de pollo es la más digestiva para un 51,9% de la población, mientras que el 19,6% opina que es la carne de vacuno. Esta última es la preferida por el 37,2 de las personas siendo el pollo la preferida para el 19,3% y el cordero para el 20,1%. La carne más consumida para la población es carne de vacuno con un 40,3% mientras que el pollo lo es para el 29,2% . 57 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES A modo de resumen, y según los resultados de esta encuesta, se puede decir que los consumidores valoran muy positivamente las carnes procedentes de las razas autóctonas, con marca de calidad y que su atracción la polariza en el color, textura y contenido en grasa, II. Características de calidad de la carne de las razas autóctonas Las canales que proporcionan las razas autóctonas son de bovino joven y en su mayor porcentaje están incluidas en la clasificación U de conformación, y 2-3 de estado de engrasamiento, mejorando esta valoración con la edad, ya que las canales se hacen más largas, espesas, profundas y compactas. La misma tendencia se observa en el color del músculo, sobre todo en el grado de saturación del color, que se va haciendo más rojo a medida que el animal se hace mayor. En cuanto al color de la carne, se puede apreciar que los animales sacrificados a los diez meses presentan un color claro (L = 41,08 en los machos y L= 38,48 en las hembras) con un índice de rojo medio (a*= 9,70 en los machos y a*= 12,05 en las hembras), y por lo tanto rosada, y con un elevado índice de amarillo (b*= 9,17 en los machos y b*=10,38 en las hembras). La mayor luminosidad, tono y porcentaje de pigmentos hemínicos conducen a que en los terneros de cría semiextensiva exista una mayor estabilidad del color. El efecto del sistema de producción, época de nacimiento y año no parecen influir en la jugosidad y terneza de la carne, si bien las mejores características de la terneza se presentaron en las terneras de diez meses de edad, con un valor de fuerza de corte de 46,94 N/cm2. El color de la carne es el criterio principal con el que los consumidores evalúan la calidad de la carne y su aceptabilidad, incluso puede llegar instintivamente, a relacionarlo con la terneza, grado de frescura y hasta con su sabor, aroma y jugosidad. De las características organolépticas de la carne, quizás sea el color junto a la terneza, las que más influyen como elementos o criterios para su elección por parte del consumidor. Desafortunadamente, aunque el color rojo vivo de la carne es atractivo psicologicamente y, por lo tanto influye, de una manera importante en la formación del precio de la canal, no tiene por que ser el mejor indicador de la terneza, frescura u otras propiedades como el flavor o la jugosidad. Decimos desafortunadamente, porque en España se produce un tipo de carnes con menos intensidad de color, pero con unos buenos componentes de calidad. Las preferencias de color por parte del consumidor varían entre países e incluso dentro del mismo país según el hábito de consumo, nivel cultural, perjuicios adquiridos, etc.. El consumidor español ha considerado durante mucho tiempo como favorable el color blanco de la carne, ya que el mismo lo asocia a una edad joven del animal y con ello a una carne de mayor terneza. Frente a este comportamiento, en los países europeos de nuestro entorno se consume carne de color rojo o rojo vivo, procedente de animales de más edad y con otros sistemas de acabado. En la actualidad, y con la introducción de un sentido más personal en los hábitos de consumo, el propio consumidor ha manifestado un nuevo comportamiento que incluye la valoración de todos los elementos de calidad de la carne. Con ello ha descubierto que las carnes rosadas tienen tanto sabor y aroma como las carnes oscuras, pero con la ventaja de que son más tiernas y con más atractivos culinarios. 58 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Estos supuestos en el comportamiento de los consumidores han sido ratificados en España por encuesta profesionalizada (Sánchez, 1994). Por regla general, los sistemas de clasificación conceden una mejor puntuación a los colores claros, por el rechazo del consumidor a las carnes de colores oscuros, que lo asocia con carnes de animales viejos o alterados. Por estas inclinaciones del consumidor, aún llenas de subjetivismo, había que considerar el color de la carne como criterio de clasificación, aunque con sentido opcional, tal como lo contempla la normativa de la Unión Europea. Además es una característica tridimensional, como la de todos los objetos que consta de un atributo de calidad y dos atributos cromáticos (tono y saturación). El color es una característica subjetiva, que depende de fenómenos puramente cerebrales consecuencia de la excitación de ciertos centros del cortex por influjos nerviosos procedentes de células fotosensibles de la retina. El color de un objeto dependerá pues de la fracción de luz reflejada por él en cada longitud de onda de la distribución espectral de la luz. En consecuencia, sus atributos son la claridad, tono, saturación y cromaticidad. La claridad es el atributo que hace corresponder a cada color una equivalencia con una escala de grises o bien la intensidad del color o cantidad de luz reflejada. Para nuestro caso, se corresponde con el estado físico de la carne, especialmente de su superficie, ligada al pH y otros factores postmortem que determinan el grado de hidratación y estado de las proteínas musculares (Sañudo, 1990). La intensidad del color aumenta con el contenido en mioglobina y depende de la microestructura del músculo, que está a su vez influenciado por el pH: la intensidad del color aumentará con el pH, dándonos carnes oscuras a partir de 6. La tonalidad variará en función del estado de oxigenación u oxidación de la mioglobina: la mioglobina reducida no oxigenada es rojo púrpura, la mioglobina reducida oxigenada es rojo vivo, mioglobina oxidada es rojo oscuro y entraña una reacción de rechazo por el consumidor. Debido a la preferencia por el color rojo brillante de la oximioglobina, la mayor parte de la carne fresca se envasa con envolturas permeables al oxígeno (embarquetados), para su venta en las grandes superficies. Por el contrario si la carne se envasa al vacío, el oxígeno no tiene acceso a la carne y la actividad residual de los enzimas citocromo reducen la pequeña cantidad de metamioglobina que pueda formarse en estas circunstancias y la convierten en mioglobina de color rojo púrpura. Después se pueden dejar reoxigenar para la venta quitándole la película, con lo cual se recupera el color rojo brillante de la oximioglobina. Este proceder podría servir de base para el envasado centralizado de carne con IGP o DE para su exportación, reservándose los embarquetados para las ventas en supermercados e hipermercados. La terneza mide la facilidad con que una carne puede ser masticada. Después del color, esta cualidad es considerada como la más primordial por la mayor parte de los consumidores, de manera que si la carne no es tierna se rechaza sistemáticamente aún cuando sea jugosa y con buen sabor. La terneza varía con la cantidad y calidad del tejido conjuntivo y con el grado de alteración de las proteínas estructurales en el curso de la maduración. El tejido conjuntivo contiene esencialmente dos proteínas fibrilares, el colágeno y la elastina. El colágeno es el principal responsable de la “terneza de base” de la carne, que después va a estar afectada por la maduración, habiendo una relación estrecha entre la terneza y el contenido en colágeno, que, por cierto, varía mucho de un músculo a otro. Sin 59 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES embargo, la cantidad de colágeno no es suficiente para explicar las variaciones de la terneza, porque la dureza del músculo aumenta con la edad sin variación importante del contenido total (Kopp, 1971). De otra parte, las características cualitativas del colágeno juegan también un papel importante, fundamentalmente en el número y naturaleza de los enlaces intermoleculares. Las diferencias raciales son importantes para la terneza (May et al., 1975), habiéndose observado que aumenta con el desarrollo muscular y disminuye en función del contenido de colágeno (Boccard et al., 1980). La jugosidad de la carne comprende dos acontecimientos simultáneos. El primero consiste en la liberación del agua al comienzo de la masticación; el segundo es más prolongado y resulta de la estimulación de la salivación por los lípidos. La jugosidad como cualidad organoléptica depende entonces del poder de retención de agua, de la cantidad y, puede ser, que de la naturaleza de los lípidos de la carne. Las diferencias de jugosidad entre músculos de un mismo animal están todavía muy mal explicadas. Se puede pensar que los factores que influencian el poder de retención de agua afectan igualmente a la jugosidad. Sin embargo, el pH que es uno de los principales determinantes del poder de retención de agua, tiene poca influencia sobre esta cualidad organoléptica (Dransfield, 1981). Pürchas y Davies (1974) discutieron la relación de la grasa intramuscular, sobre la base de sus propias observaciones y muchos otros autores, y concluyen que existe una pobre relación entre la tasa de este componente y la jugosidad en los bovinos. Lo que sí parece estar más claro es que igual que el flavor , la jugosidad aumenta con el metabolismo oxidativo (Valin et al., 1982). El flavor de la carne está determinado por la composición química y los ingredientes aportados a esta última por la cocción. Los músculos presentan grandes diferencias de flavor. Por ejemplo, los músculos diafragma o recto abdominal están considerados de tener un flavor mucho más desarrollado que el psoas. El tipo metabólico parece ser un factor muy importante (Valin et al., 1982) y más concretamente la grasa intramuscular y sobre todo la fracción fosfolipídica (Mottram y Edwards, 1983), cuya tasa crece con la intensidad del flavor aumenta con la actividad de este metabolismo. Los perfiles de ácidos grasos obtenidos en la raza Rubia Gallega nos indican una buena palatabilidad de la carne debido al nivel oleico. También son favorables los niveles de ácidos grasos saturados, sobre todo el palmítico, teniendo en cuenta la influencia que ejercen sobre los niveles de colesterol. Lo mismo ocurre con los niveles de araquidónico, cuya importancia radica en el hecho de ser precursor de una gran variedad de eicosanoides, que gobiernan la función inmune y otros factores como la presión sanguínea y la contracción de ciertos músculos lisos. En cuanto a la proporción insaturados/saturados representa un índice parámetrico positivo para la raza, ya que los ácidos grasos más importantes por su cantidad e influencia en la jugosidad, como son el oleico (con valores entre el 31,50 en machos de diez meses y 34,08 en hembras de siete meses) y palmítico (cuyos niveles oscilan entre el 22,98 en hembras de siete meses y el 24,75 en hembras de diez meses) tienden a permanecer estables. Los niveles de los ácidos eicosapentaenoico y 60 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES docosapentaenoico, resultan muy interesantes por sus efectos beneficiosos en la protección contra enfermedades cardiovasuclares. En este sentido, deberíamos considerar valor nutritivo y dietético que tiene la carne. Las motivaciones de los humanos sobre las preferencias alimenticias no siempre coinciden plenamente con las leyes de la alimentación, ya que se rigen fundamentalmente por las necesidades fisiológicas, en especial el hambre, por el placer sensorial (gusto, olfato), placer psicológico (promoción, distinción social), calidad de vida y precios (economía de tiempo y esfuerzo en la preparación culinaria familiar) y por el temor a las enfermedades (cardiovasculares, hipertensión, obesidad, aterosclerosis, etc.) que viene a representar la característica de mayor valor en la calidad dietética. Cada vez es mayor la atención que se presta a la ingesta de grasa, especialmente de origen animal, sobre las enfermedades cardiovasculares y la relación de estas enfermedades con los niveles de colesterol en la sangre. Actualmente se cree que los ácidos grasos saturados, principalmente el palmítico, pero no el esteárico, al parecer debido a su rápida conversión en oleico son los responsables en los sujetos susceptibles, de la elevación del nivel de colesterol de baja densidad (LDL) que se consideran negativas con respecto al nivel de colesterol y a la aparición de enfermedades cardiovasculares. Los ácidos grasos insaturados parecen tener un efecto opuesto, disminuyendo el nivel de colesterol y de LDL. Los ácidos grasos poliinsaturados, de los cuales el linoleico es el más importante desde el punto de vista cualitativo, parecen reducir al mismo tiempo la concentración de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) que se consideran beneficiosas en relación a la aparición de problemas cardiovasculares. El ácido oleico, monoinsaturado, reduce el nivel de LDL y no el de HDL, por lo que se considera más beneficioso. Ello explica la bondad atribuida al aceite de oliva frente a otros aceites con contenido de ácido oleico inferior, como el de soja, el de girasol normal y el de maíz. En todo caso, parece que la proporción LDL/HDL, que es más importante que la cantidad de HDL, se ve reducida por los ácidos grasos poliinsaturados, por lo que pueden considerarse beneficiosos desde este punto de vista. Algunos ácidos grasos presentes en el pescado, especialmente pescado azul, como el eicosapentaoico y el docosahexanoico, tienen propiedades antiagregantes de las plaquetas, por lo que se consideran beneficiosos en la protección contra las enfermedades cardiovasculares. El ácido linolínico (18:33) es un precursor metabólico y se encuentra en algunos aceites vegetales. A partir de estos conceptos pueden comprenderse los esfuerzos que se están realizando para conocer la composición de la grasa de la carne en sus diferentes orígenes con el objeto de mejorar la calidad dietética. Quizá haya llegado el momento en el que el consumidor conozca, en cada carne de calidad, su perfil de ácidos grasos como indicador más de esa calidad. Las nuevas tendencias en los hábitos de consumo, a las que hemos hecho mención, nos muestran un cambio importante en el tipo de animales y razas utilizadas para la producción actual de carne bovina con una clara orientación hacia canales magras, con lo que el producto consumido es muy diferente del que hace solamente 10 ó 15 años encontrábamos en el mercado. Las diferencias conciernen, en particular, al componente lipídico en el que se 61 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES aprecia no sólo una disminución del contenido total de los lípidos (y del colesterol, por supuesto) sino también un cambio sorprendente en la composición de los ácidos grasos. Resulta profundamente modificada la relación existente entre las clases de ácidos grasos , con un aumento significativo del componente poliinsaturado y, en particular del ácido linoleico. Este panorama, sin lugar a dudas positivo desde el punto de vista nutricional, puede evidenciarse en algunas carnes en España como la Ternera Gallega, cuyos porcentajes de ácidos grasos indican que la mayor proporción es de oleico (41,35), siguiendo en cantidades porcentuales importantes el palmítico (24,18), esteárico (17,28) y linoleico (4,35), El incremento de la concentración de oleato influencia la palatabilidad y percepción de la carne, de manera que, a medida que aumenta el porcentaje, se mejora la puntuación en los paneles de cata. Las buenas proporciones de oleico en la carne de Ternera Gallega puede ser una de las razones de su aceptación en el mercado por parte del consumidor, ya que esta cantidad no debe de tomarse en términos absolutos sino en relación proporcional con los contenidos de mirístico (2,59) y palmítico (24,18). De otra parte, también hay que recordar que la proporción de jugos en el longissimus dorsi está correlacionada negativamente con los contenidos de mirístico y palmítico y positivamente con la relación de ácidos grasos insaturados/saturados, con lo que la jugosidad de la Ternera Gallega (12,5) podría ser una de las consecuencias de la composición de la grasa intramuscular y uno de los factores de influencia en la percepción positiva del consumidor. De ahí, su importancia en utilizar estos atributos como indicadores de calidad debidamente combinados con otros de tipo sensorial, higiénico o los que se encuentran dentro del plan dietético que ya hemos comentado, incluyendo, por supuesto, los de carácter positivo que influyen favorablemente en la salud y en el mejor desarrollo del cuerpo humano. Precisamente estos últimos conceptos, los que descubren la bondad de la carne, son los que el consumidor conoce poco, nada o de forma muy general por que van a representar, posiblemente, nuevos indicadores de la calidad de la carne que deben transmitirse adecuadamente. Los consumidores tienen que saber que con la disminución en el consumo de carne (tendencia que actualmente se detecta) puede provocar en su cuerpo un estrés oxidante. El estrés oxidante, agudo o crónico, influye de manera esencial en numerosos procesos patógenos. Las investigaciones sobre la compleja correlación existente entre la nutrición individual y el entorno de las que nos habla Kuklinski (1997), llegan a la conclusión de que, en los seres humanos, en los países de industrialización avanzada, con áreas tecnológicamente densas, está aumentando el riesgo de estrés oxidante. Los recortes en la dieta pueden deteriorar el equilibrio Redox en vivo, por aporte insuficiente de oligoelementos, selenio y zinc. El aumento de colesterol, que depende de la edad, refleja una reacción de adaptación contra el estrés oxidante y el colesterol protege las dobles capas fosfolipídicas contra los daños que causa la oxidación. La disminución drástica del consumo de carne es un camino equivocado, dado que el estrés oxidante secundario, por inducción, revela propiedades aterogenéticas e inmunosupresoras. Se ha constatado un efecto protector del colesterol contra el estrés oxidante, al igual que una correlación inversa, existente entre la 62 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES concentración de colesterol de membrana y el grado peroxidación de los lípidos en los seres humanos. El consumo de carne, al que nos estamos refiriendo, tiene también una relación importante con el nivel de hierro, que el consumidor no se ha parado a pensar o no conoce. Un nivel de hierro no adecuado, como el que se mide con la ferritina plasmática, que refleja las reservas existentes en el hígado, es un problema generalizado en las mujeres jóvenes y en los niños. En el estudio más reciente de la UE, un niño de cada ocho, con edad comprendida entre el año y medio y los dos años y medio, presentaba niveles de hemoglobina en la sangre inferiores a 11,0 g/dl, el nivel de anemia, según la definición de la OMS. Un niño de cada cinco tiene un bajo nivel de hierro (ferritina plasmática < 10 ug/l). Unas escasas ingestas de hierro protoheme, la forma de hierro que se encuentra en la carne, se conectaron cos estas anomalías del nivel de hierro. Una reciente investigación que se efectuó en Irlanda demostró un elevado predominio del bajo nivel de hierro en las adolescentes y, una vez más, se indicó una significativa conexión existente entre la ingesta de hierro procedente de la carne (hierro protoheme) y el bajo nivel de hierro. Dado que el bajo nivel de hierro, al principio del embarazo, repercute seriamente en el peso del recién nacido, ello representa un problema para la salud pública. Un nivel de hierro igualmente bajo en los niños aumenta significativamente el riesgo de una escasa capacidad cognoscitiva y de aprendizaje. Y ésta es, asimismo, otra cuestión que hay que analizar, como nos dice Gibrey (1997)y, porque el consumidor se muestra muy sensible a todos los aspectos relacionados con la salud, desde la gestación y durante lactancia hasta la senectud. A causa del requerimiento proteico durante el embarazo, generalmente, todos están de acuerdo sobre el hecho de que el RDA de proteínas debería contener, como mínimo, el 5065 por ciento de carne. Las proteínas de la carne presentan una mejor biodisponibilidad y compatibilidad. La carne es la mejor fuente de aminoácidos esenciales y de varias vitaminas y minerales. Entre éstos se encuentran el hierro, el zinc, el cobre, el selenio y las vitaminas hidrosolubles. Al revés de la creencia más generalizada, los requerimientos de nutrientes, de costumbre, no se duplican durante la gestación. Solamente el requerimiento de hierro, ácido fólico y vitamina D aumenta en un 100% respecto a los niveles normales. Otros nutrientes, como el calcio, la tiamina y la vitamina B6 aumentan en un 33-50 por ciento. Las proteínas, el zinc y la riboflavina aumentan en un 20-25% aproximadamente, mientras que la energía, el selenio, el magnesio, el yodo, la vitamina PP y las vitaminas A, B12 y C aumentan en un 18 por ciento o menos. Afortunadamente, todos estos nutrientes se dan en cantidades abundantes y están biodisponibles en la carne, por ello, se aconseja la ingesta de cantidades suplementarias de estos alimentos, durante la gestación y durante los primeros seis meses de la lactancia. Asimismo, la carne, como fuente de proteínas de primera calidad, va a influir favorablemente en el crecimiento de los niños, el desarrollo de los jóvenes y en la mejor alimentación de los ancianos. El papel de la carne en el crecimiento del niño está relacionado con el incorrecto aporte calórico y/o proteínico. La deficiencia en la estatura, concomitantemente con la malnutrición calórico-proteica se caracteriza, a nivel hormonal, por las elevadas cifras de hormona del crecimiento (GH), tanto basales como de estímulo específico. Sin embargo, las somatomedinas (IGF) resultan muy bajas. Ello permite sacar la conclusión de que la malnutrición puede ser considerada como una forma de insensibilidad a la GH, o bien, una 63 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES respuesta de adaptación del organismo que desvía la acción de la GH del crecimiento a la supervivencia, aprovechando su capacidad lipolítica y anti-insulina. Dichas variaciones se ven corroboradas por las modificaciones de los niveles plasmáticos de las proteínas aglutinantes de las somatomedinas (BP o hinding proteins), que contribuyen a realizar esa acción de “desvío” de las funciones de la IGF (Quaas, 1997). Para los jóvenes, un aporte suficiente y equilibrado de carne es fundamental para un correcto desarrollo del cuerpo, aspecto éste que deberá cuidarse mucho más en la tercera edad, ya que los ancianos, por lo general, poseen un recambio de proteínas más bajo que el de los jóvenes adultos y necesitan una ingesta más elevada de proteínas para conservar el balance de nitrógeno. Por lo tanto, podemos sacar la conclusión de que la carne y los productos cárnicos son una fuente rica en micronutrientes (biodisponibles), que se insertan adecuadamente en una dieta equilibrada y sana, y que este concepto puede servir como indicador de calidad más para transmitir al consumidor. Todos los indicadores de calidad de la carne que hemos descrito o comentado, están siendo estudiados en las razas, lo que permitirá utilizarlos adecuadamente para mejorar la confianza del consumidor. Explotación extensiva de las razas autóctonas, complementando su cebo con alimentos de suministro propio y comercialización de productos tradicionales de calidad, serán las claves para el futuro. BIBLIOGRAFÍA Boccard, R.; C. Valin & B. Bonaiti (1980). Effect of genotype on pigment, lipid and collagen content of the longissimus dorsi muscle in young bulls. 26e Congrés Europ. Chercheurs Viande, Colorado Springs, 1: 271-274. Brea, M.T. 1993. Efecto del pastoreo rotacional y continuo en un sistema de producción con vacas de carne y su posible influencia en las características de la pradera. Tesis Doctoral. Univ. de Santiago de Compostela. Calvo, C. 2001. Estudio del crecimiento y de las características de la canal y de la carne del ternero Rubio Gallego acogible a las primas de la PAC en rebaños de vacas nodrizas. Tesis Doctoral. Fac. Veterinaria. Lugo. Dransfield, E. (1981). Eating quality of dark-cutting beef. Curr. Top. Vet. Med. Anim. Sci., 10: 37-57. Gibrey, M.J. (1997). Relación existente entre el consumo de carne y el nivel de hierro. Ist European Beef Congress. Venecia (Italia). Kopp, J. (1971). Evolution qualitative du collagène musculaire de bovin en fonction de l’âge des animaux. Consequences sur la tendreté de la viande. Bull. Techn. C.R.Z.V. Theix, 5: 47-54. Kuklinski, B. (1997). Estrés oxidante provocado por la disminución de la carne en la alimentación. Ist European Beef Congress. Venecia (Italia). May, M.L.; M.E. Dikeman & R.R. Schalles (1975). Histology of exotic cross bovine muscles. J. Anim. Sci., 41: 298 (Abstract). Monserrat, L & Sánchez, L. 2000. Sistemas de producción de carne en pastoreo con Rubia Gallega. Bovis, 92: 23-34. 64 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Monserrat, L. 1990. Sistemas de producción de carne con vacas madres en Galicia. Mundo Ganadero, 4: 35-43. Mottram, D. S. & R.A. Edwards (1983). The role of triglicerides and phospholipids in the aroma of cooked beef. 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E-mail: [email protected] ABSTRACT Because of its adaptation to environmental conditions, common location in less-favoured areas and highlands where another more profitable agrarian speculation is not competitive, the frequent necessity of the farmer presence to its managing and the necessity of growing high biologic value food, local meat breeds are a very important resource for the country development in less-favoured areas, so their possibilities are attached to: I) The acknowledgment of their utility in mountain areas to fix population, to protect the environment and to improve the landscape and biodiversity. II) The production of singular food with very good quality, traded as IGP (Geographic Protected Indication) or DOP (Protected Origin Denomination) directly to consumers in fresh or as laboured products. I) Utility of local breeds in highlands and less-favoured areas: Beef production farms imply: - Fixation of a minimum of agrarian active population due to the farmer presence, this helps to avoid the appearance of mountain deserted areas that is one of the biggest problems. In this way we should consider that the farmer steady is going to depend on the economic viability of the exploitation on its own or together other recurs to cover the whole family needs and the existence of infrastructure, media devices, services, etc. by the settlement. - The observance, in a sensible and uncostly way, of the Good Agrarian Manners for the environment, biodiversity and landscape preservation are kept in the regulations (CE) 1257/99 and developed in RD 3482/2000 and RD 4/2001, that also makes a good example of this sort of actions for the non European Mediterranean countries and where it is considered: - To limit soil erosion.- To keep or increase soil organic matter.- To keep soil structure and permanent pasture surface.- To preserve a minimum entertainment level: minimum stocking rate, landscape preservation and avoiding the undesirable vegetation invasion. This steps are implicit in meat production systems on pasture because they don’t consider lands tillage, animals distribute defections and it is interesting to use grassland in a right way by means of a stocking rate that ensures a maximum use without over pasturing. II) Production of singular food with a very good quality. Local breeds produce meat that is different due to the breed and the geographical location where they are adapted and have proper conditions to be candidates for DOP, IGP or Ecologic Agriculture, these breeds are sensibly exploited on pasture which satisfied all those consumers who prefer to buy meat of animals that have enjoyed animal welfare with open rearing respecting the environment. Inside this atmosphere there are new possibilities 66 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES to improve beef trade, bearing in mind tourists that look for the countryside and free range food consumption in situ or to take home. To make local breeds play an important roll in highlands add to the highest economic viability it is important to think about a group of critical points related to the management, to the product quality and to the improvement of its added value. These critical points will be enumerated without being very strict and knowing that there are several examples developed in different Mediterranean areas. Critical points in extensive management related to economic viability and its relation with the environment: - Stocking rate, grassing method and grassing pressure suitable to highest utilization avoiding grass damage and over pasturing. - Adaptation of forage production cycle and the herd nutritive necessities through: calving or lambing grouping, annual variation in the stocking rate and forage preservation, variation dam fat reserves and supplementation with concentrate. - Food in scarcity periods like winter and summer. - Providing shelters during pasturing periods and improving relations between farmer and animals thinking of animal welfare and farmer security. - Protection of isolated trees and singular specimens, and mainly avoid any damage in forest areas. Product quality and added value improvement: - Enhancement of the traditional type: improving, through food and management, its sensorial and nutritive value, mainly its content in ω3, CLA and PUFA/SFA, ω6/ω3 rates. - Improving the marketing of less appreciated meat pieces: standing out their nutritive quality and their functional amino acids content like taurine and carnitine and proposing new easy cooking recipes. - Trying to diversify the offer, adding different types to the traditional through slaughter age, carcass fat score, sort of food the animal had during its life, etc. - Improving direct selling of groups of different pieces of aged meat, studying the best combination of pieces, the type of packaging that improves its presence and shelf life, etc. All packages should have as much information as it is possible about its characteristics, cooking attitude and quality. - Encouraging the marketing of prepared and precooked products. INTRODUCCIÓN Las razas autóctonas de producción de carne por su adaptación a las condiciones del medio, su ubicación normal en zonas desfavorecidas y de montaña donde no es competitiva una especulación agraria más rentable, la necesidad frecuente de la presencia del ganadero para su manejo y la producción de un alimento de alto valor biológico, constituye un recurso de máxima importancia en el desarrollo rural en zonas desfavorecidas, estando en consecuencia sus posibilidades ligadas a: I) El reconocimiento explicito de su utilidad en zonas desfavorecidas y de montaña para la fijación de población, la gestión del medio ambiente y el enriquecimiento del paisaje y la biodiversidad. y 67 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES II) La producción de alimentos diferenciados de buena calidad comercializados como IGP o DOP para vender, con preferencia, directamente al consumidor, añadiéndole el máximo valor mediante la transformación o elaboración del producto I) Utilidad de las razas autóctonas en las zonas desfavorecidas y de montaña Las explotaciones de producción de carne suponen: - La fijación de un mínimo de población activa agraria debido a la presencia del ganadero, por lo que contribuye a evitar la desertización de las comarcas de montaña, que es uno de sus problemas más importante. En este sentido hay que considerar que la permanencia del ganadero va a depender de que la explotación tenga una rentabilidad adecuada para las necesidades familiares, por si sola o como parte importante en un conjunto de diversos recursos, y que exista una dotación suficiente en el entorno, de servicios, infraestructura, comunicación, etc. - El cumplimiento en una forma racional y económica de las normas de Buenas Practicas Agrarias para la conservación del medio ambiente, la biodiversidad y el paisaje dispuestas en el Reglamento (CE) 1257/99 y desarrollados en el RD 3482/2000 y RD 4/2001, que constituye también, un ejemplo valido de este tipo de acciones para los países mediterráneos no europeos, y en las que se considera: -Limitar la erosión. -Mantener o restablecer la tasa de materia orgánica del suelo. -Mantener la estructura del suelo y la superficie de praderas permanentes -Preservar un nivel mínimo de entretenimiento considerando: carga mínima de ganado, conservación de elementos paisajísticos y evitando la invasión de vegetación indeseable. Medidas implícitas en los sistemas de producción racional de carne en pastoreo, ya que no contempla el laboreo de la tierra, los animales distribuyen sus deyecciones, e interesa mantener las praderas con una utilización adecuada mediante una carga ganadera que asegure el máximo aprovechamiento sin sobre pastoreo. II) Producción de un alimento de buena calidad. Las razas autóctona produce una carne singularizada por la raza y el medio geográfico al que están adaptadas, que cumple las condiciones adecuada para aspirar a Denominación de origen protegido (DOP), Indicación Geográfica protegida (IGP) o Agricultura Ecológica y, explotada racionalmente en pastoreo colmar la sensibilidad de los cada vez mas numerosos consumidores de adquirir carne de animales que han disfrutado de bienestar animal y han sido criados en respeto a la conservación del medio ambiente. Dentro de este panorama se abren posibilidades de mejorar la comercialización teniendo en cuenta el turismo que busca el campo y el consumo de alimentos naturales in situ o para llevar a su casa. Para que las razas autóctonas jueguen el papel importante que deben tener en las zonas de montaña junto con una rentabilidad lo más alta posible, conviene tener en cuenta una serie de puntos críticos y actuaciones convenientes en relación al manejo, la calidad del producto y el incremento de su valor añadido, que vamos a enumerar sin pretender ser exhaustivos, e indicando de antemano que existen bastantes ejemplos desarrollados total o parcialmente en distintas comarcas de la cuenca mediterránea. 68 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Puntos críticos en el manejo en relación a la rentabilidad y la relación con el medio ambiente: - Carga ganadera, método y presión de pastoreo adecuados al máximo aprovechamiento de la hierba, evitando deterioro de la vegetación y el sobre pastoreo. - Adaptación del ciclo de recursos forrajeros y el de necesidades del rebaño mediante: Agrupación partos, Variación de la carga en pastoreo y conservación forrajes, Movilización reservas corporales de la madre y Suplementación. - Alimentación en épocas de escasez, invierno y/o verano. - Previsión de refugios en pastoreo y mejora relación hombre- animal pensando en el bienestar animal y la seguridad personal. - Relación del animal con superficie arbolada, protección absoluta árboles aislados y ejemplares excepcionales y en general prevención daños significativos en cualquier tipo de superficie arbolada. Calidad del producto y mejora del valor añadido: - Potenciar el tipo tradicional: resaltando y/o mejorando mediante la alimentación y el manejo, sus cualidades sensoriales y nutricionales con espacial interés en contenido ω3, CLAs, e índices PUFA/SFA, ω6/ω3. - Potenciar piezas poco apreciadas: resaltando sus calidades nutricionales y/o contenido en aminoácidos funciónales tipo taurina y carnitina y, rescatando o proponiendo nuevas formas culinarias de fácil ejecución y buenas forma de preparar - Diversificar la oferta produciendo más tipo que el tradicional, bien diferenciados, por edad, nivel engrasamiento, tipo de alimentación, etc. - Fomentar y/o potenciar la venta directa en lotes envasados de carne madurada, estudiando la mejor combinación de trozos de piezas, el tipo de envasado que mejore su presentación y vida útil, etc. y contenga el máximo de información posible sobre sus características, aptitud culinaria y calidad. - Fomentar y/o potenciar la venta de producto semielaborados o elaborados. 69 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES CRECIMIENTO Y CALIDAD DE LA CARNE DE TERNEROS DE RAZA MINHOTA ARAÚJO, JOSÉ PEDRO. Escola Superior Agrária de Ponte Lima – Instituto Politécnico de Viana do castelo 4990-706 Ponte de Lima, Portugal [email protected] La raza bovina Minhota es una raza autóctona localizada en el Norte de Portugal, que ha empezado su programa de mejora genética en el año 1997. Esta raza presenta como principal aptitud la producción de carne. En el presente trabajo se ha efectuado el estudio del crecimiento y de las características físico y químicas de la carne de terneros de raza Minhota. Entre el nacimiento y los 11 meses de edad el mejor ajuste se consiguió con la regresión cúbica con un r2ajustado de 88,18%, 89,02%, respectivamente para machos y hembras (P<0,001), traduciéndose en ganancias medias diarias de 1.171,9 g/día (machos) y 928,9 g/día (hembras). Con respecto al efecto del sexo en la ganancia media diaria de los terneros hasta las dos edades del destete (6 y 9 meses), los machos continúan presentando valores superiores, apreciándose además cifras mayores para los destetados a los 9 meses de edad. Para evaluar las características de calidad de la carne, se han empleado muestras de L. thoracis de dos tipos de terneros: ligeros, sacrificados entre los 5 y 7 meses de edad, y pesados, entre los 8 y 10 meses. No se encontraron diferencias significativas por efecto del sexo en la carne de los dos tipos, habiéndose obtenido unos pH aceptables para la comercialización de las canales. La carne presentó un color con una alta luminosidad, sin influencia del sexo. No hubo diferencias significativas en las pérdidas de agua por descongelación, por presión o por cocción y en la dureza de la carne de terneros ligeros y pesados debidas al sexo. La carne de los terneros ligeros se ha visto afectada significativamente por el sexo en la grasa, siendo los valores más elevados para en las hembras. INTRODUCCIÓN La raza Minhota tiene como principal aptitud la producción cárnica, basándose en pequeñas explotaciones familiares con un sistema tradicional de pastoreo de las vacas y la estabulación y amamantamiento de los terneros. El sacrificio de éstos se realiza a dos edades: a edad temprana, de 5 a 7 meses de vida, y los terneros pesados entre 8 y 10 meses, produciendo unas canales muy apreciadas en el mercado regional portugués. El fin de este estudio fue: a) estudiar el crecimiento de terneros de ambos los sexos de la raza Minhota, utilizando curvas de crecimiento; b) estudiar el efecto del sexo en las características físico y químicas de la carne. MATERIAL Y MÉTODOS CRECIMIENTO DE LOS TERNEROS Entre el nacimiento y los 11 meses, se han utilizado los datos de pesos vivos de 312 terneros (161 machos y 151 hembras) con, por lo menos, dos pesadas, correspondiendo a pesadas a diferentes edades entre Julio del año 2003 y Abril de 2005, en 178 70 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES explotaciones de 103 parroquias de 14 municipios del Entre Douro e Minho. La báscula utilizada ha sido electrónica (modelo FX1-Iconix), con capacidad hasta 2000 Kg. Ganancia del peso (nacimiento hacia 11 meses de edad): Se realizó el ajuste a las curvas de crecimiento lineal y polinomial hasta el 3er grado. Ganancia media diaria (GMD): Se han utilizado datos de 90 terneros con, al menos, dos pesadas, la primera en el primer mes de edad y la última al destete (6 o 9 meses de edad). Con el fin de determinar el efecto del sexo y de la estación de nacimiento sobre la ganancia media diaria (GMD), se realizaron ANOVAs, basados en la suma de los cuadrados tipo III (determinación de las medias marginales estimadas y error típico), mediante los siguientes modelos lineales generales (PROC GLM): - Nacimiento-destete GMDijk = Si + Enj + β1Edijk + (SEn)ij + eijk (N=90) Donde: GMDijk = observación de la variable dependiente ganancia media diaria; Si = el efecto fijo del sexo (i = 1, 2); Enj = el efecto fijo de la estación de nacimiento (j = 1, ..., 4); (SEn) ij; = interacción de segundo grado; Ed = edad inicial (Covariable); β1Edijk = coeficiente de regresión lineal que indica la dependencia del GMDijk con Ed (edad inicial) en la ganancia media diaria. eijk = el error aleatorio asociado a cada observación yijk. Se analizó la significación estadística de la interacción de segundo grado, biológicamente consistente y la covariable edad inicial, en este modelo, excluyéndose en el caso de no ser significativas. - Nacimiento-destete 6 meses (N=56) GMDij = Si + eij Donde: GMDijk = observación de la variable dependiente ganancia media diaria; Si = el efecto fijo del sexo (i = 1, 2); - Nacimiento-destete 9 meses GMDij = Si + eij (N=34) Donde: GMDijk = observación de la variable dependiente ganancia media diaria; Si = el efecto fijo del sexo (i = 1, 2); Se ha utilizado el paquete estadístico SPSS 12.0.S for Windows versión 12.0.1. para el análisis de los datos. DETERMINACIONES ANALÍTICAS EN LA CARNE Se realizaron las determinaciones de calidad de la carne sobre un total de 45 muestras del total empleado para el estudio de la canal. La distribución según el tipo y sexo se indican en el Cuadro 1. 71 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Cuadro 1. Desglose de número de animales en el estudio de la carne. Tipo Sexo Nº animales Machos 17 Hembras Machos 9 11 Hembras 8 45 Ligeros Pesados Total TOMA DE MUESTRAS: Para el estudio de las características de la carne se empleó una porción de lomo (10ª chuleta), que se extrajo entre las 48 horas postmortem en diversas salas de despiece o carnicerías. La 10ª chuleta del L. thoracis de cada uno de los animales, se etiquetó y se congeló lo más rápidamente posible para su posterior análisis en laboratorio. En laboratorio se procedió a su descongelación lenta, con previa pesada, en cámaras frigoríficas a 4ºC durante 24 horas. Sobre la primera porción se obtuvieron las medidas de pH, color, dureza, capacidad de retención de agua (por presión y por cocción, a la que añadimos las pérdidas por descongelación) y el análisis químico. RESULTADOS Y DISCUSIÓN CRECIMIENTO DE LOS TERNEROS Los siguientes resultados han sido obtenidos con la totalidad de pesos de terneros entre el nacimiento y los 11 meses de edad para ambos sexos (Figura 1). Machos - El mejor ajuste se consiguió en la regresión cúbica con un r2 ajustado de 88,18%, significativo estadísticamente al 99,99%. Hembras - El mejor ajuste se consiguió igualmente con la regresión cúbica con un r2ajustado de 89,02%, estadísticamente significativo al 99,99%. 3 Peso (kg) 2 y = -8E-06x + 0,0041x + 0,6114x + 47,998 600 3 2 y = -9E-06x + 0,0037x + 0,5662x + 46,56 500 2 2 r adj = 0,8902 r adj = 0,8818 500 400 400 300 300 200 200 100 100 0 0 0 100 200 Edad (días) 300 400 0 100 200 300 400 Edad (días) Machos (r=0,9394; P < 0,00001) Hembras (r=0,9435; P < 0,00001). Figura 1. Curva de crecimiento de terneros machos y hembras de raza Minhota (Polinomiales de 3ºgrado En el Cuadro 2 y en la Figura 2 se representan los pesos estimados a edades padrón en función de las curvas para ambos sexos. 72 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Las ordenadas en el origen en los machos (30,0; 39,6 y 48,0 kg) y en las hembras (37,4; 37,1 y 46,6 kg) en los modelos lineal, cuadrático y cúbico, respectivamente, equivaldrían a la primera pesada (peso al nacimiento). En el modelo lineal, el peso al nacimiento ha sido superior en las hembras (37,4 kg) con respecto al de los machos (30,0 kg), resultado contrario a lo que biológicamente es aceptable. Este hecho puede explicarse por tratarse de una estimación de la curva desde el nacimiento al destete, en la que el parámetro a, aún teniendo un significado especial, no deja de ser tan solo un punto más de la curva. Los pesos vivos obtenidos al nacimiento de 52 terneros, han sido 43,5±1,38 kg y 42,9±1,29 kg respectivamente en machos y hembras (Araújo, 2005). Estos pesos se encuentran en el rango definido por las estimativas obtenidas por los modelos cuadráticos y cúbicos. Con respecto a los pesos estimados a edades posteriores, las diferencias entre los 3 modelos son biológicamente admisibles y similares. Cuadro 2. Valores medios de los pesos y de las ganancias medias diarias a distintas edades en terneros machos de raza Minhota. Edad / rango Machos Hembras Linear Cuadrática Cúbica Linear Cuadrática Cúbica 30,0 39,6 48,0 37,4 37,1 46,6 Nacimiento Peso 138,0 134,4 130,9 124,9 125,1 121,1 90 días 245,9 242,9 247,4 212,5 212,6 217,4 (kg) 180 días 353,9 365,1 364,4 300,1 299,7 297,4 270 días 1.054,0 920,7 977,5 827,9 0–90 días 1.199,5 1.205,7 1.294,4 966,3 972,5 1.069,8 GMD 90-180 días 1.357,4 1.300,6 967,5 889,2 (g/día) 180-270 días 1.199,6 1.205,6 1.171,9 973,0 972,6 928,9 0-270 días En nuestro estudio, la diferencia entre sexos en la ganancia media diaria nacimiento-270 días, alcanzó un 19,3%, 20,7% y 18,9% a favor de los machos, en los modelos linear, cuadrático y cúbico respectivamente. Cima García (1996) señala una mayor tendencia al crecimiento en los machos, especialmente a partir de los 5 meses y Sánchez (1978) y Havstad et al. (1989) la encuentran a partir de los 6 meses. En la raza Rubia Gallega, las diferencias empiezan a notarse a partir de los 180 días (Dios, 2000; Calvo 2001), siendo favorable para los machos, debido a la falta de diferenciación sexual en el crecimiento entre el nacimiento y los 180 días, y que en este período aún no han empezado a manifestarse en los terneros los efectos de las hormonas sexuales, que se irán acentuando con la edad. De Behr et al. (2001), en la raza Azul Belga, manifiestan que las curvas de crecimiento de ambos sexos son similares entre el nacimiento y los 8 meses de edad. En nuestro caso las diferencias se acentúan antes de los 180 días. Este hecho puede ser justificado porque en algunas situaciones las hembras que se destinan para reposición no son alimentadas al mismo nivel que las que son sacrificadas a edades tempranas para carne. 73 Peso (kg) XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES 364,4 400 350 300 250 200 150 100 50 0 247,4 297,4 130,9 217,4 48,0 121,1 46,6 0 90 180 270 Edad (días) Machos Hembras Figura 2. Comparación de la curva de crecimiento estimada para ambos sexos (Nota: Los valores indicadores se refieren a los obtenidos en el modelo cúbico). GMD (g/día) Con respecto a los pesos estimados a los 180 días en la raza Minhota (machos ≈ 242-247 kg; hembras ≈ 212-217 kg), éstos son claramente superiores a los verificados por Brito (2002) en la raza Arouquesa (138,8–machos; 123,5 kg–hembras), Barrosã (137,9– machos; 124,7 kg–hembras) y Cachena (90,1– machos; 82,6 kg–hembras), manifestando la superior capacidad de la Minhota en términos de crecimiento. Por rango de edad se puede apreciar que, principalmente en los machos, las ganancias medias diarias son inferiores en el primer período (nacimiento – 90 días), para aumentar en las fases posteriores (Figura 3). 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700 600 2º grado 3º grado 2º grado Machos 3º grado Hembras Sexo 0 – 90 90-180 180-270 Figura 3. Ganancia media diaria de terneros de raza Minhota en función del rango de edad y del modelo utilizado. EFECTO DEL SEXO DEL TERNERO LA GANANCIA MEDIA DIARIA DE PESO VIVO Los terneros hasta las dos edades del destete (6 y 9 meses), los machos continúan presentando valores superiores, apreciándose además valores superiores para los destetados a los 9 meses de edad (cuadro 3). 74 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Cuadro 3. Medias y error típico de la GMD por sexo. 6 meses 9 meses Machos Hembras Sig. Machos Hembras Sig. 1149,7±32,48 984,4±36,17 ** 1165,2±33,76 1000,6±40,35 ** Sig: Nivel de significación *** P<0,001; ** P<0,01; * P<0,05; NS no significativo Las ganancias medias diarias obtenidas (1149,7±32,48 y 1165,2±33,76 en los machos vs 984,4±36,17 y 1000,6±40,35 en las hembras) en la raza Minhota, muestran una superioridad de los primeros en 14,0%. En la raza Rubia Gallega (Calvo, 2001) ha obtenido aumentos diarios de peso vivo superiores en los machos (1271,2±15,54 vs 1050,1±14,90 en las hembras), supremacía del 17,4%, influyendo en el mismo la época de parto. En este mismo estudio no se apreciaron diferencias significativas para el peso al sacrificio entre terneros destetados a los 6 y 8 meses, debido al crecimiento compensatorio. CARACTERÍSTICAS ORGANOLÉPTICAS DE LA CARNE - EFECTO DEL SEXO En el cuadro 4 indicamos los resultados del efecto del sexo sobre las características organolépticas de la carne. El pH individual de la carne de todos los animales estuvo por debajo del 5,8, siendo un buen indicador en la carne de ganado bovino. Color del Longissimus thoracis - La luminosidad de la carne de los terneros ligeros y pesados no varió significativamente entre sexos, aunque se observaron valores superiores en los machos. Esta falta de diferenciación puede ser debido a que una menor luminosidad de la carne de las hembras es debido a su mayor precocidad, por lo que su contenido en grasa y consecuentemente el contenido en pigmentos es superior (Renerre, 1986), siendo contrarrestada por la mayor actividad física de los machos (Seideman et al., 1982). Con respecto al índice rojo, los machos presentarán mayores valores que las hembras (P<0,05) en los ligeros y sin diferencias significativas en los pesados. En cuanto al índice de amarillo de la carne, no se observaron diferencias significativas entre machos y hembras, posiblemente porque estamos considerando animales demasiado jóvenes para que existan grandes diferencias entre sexos. Con respecto a los pesados, los machos presentaron mayores valores de amarillo (P<0,05). 75 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Cuadro 4. Medias, error típico y nivel de significación de las características organolépticas de la carne de los machos y hembras. Efecto sexo. TIPO SEXO LIGEROS PESADOS SIG. MvsH Machos 5,42 ± 0,01 Hembras 5,43 ± 0,02 SIG. NS 38,50 ± 0,58 15,46 ± 0,56 9,11 ± 0,36 36,83 ± 0,82 14,66 ± 0,68 7,65 ± 0,44 NS NS * NS NS NS 3,01 ± 0,45 2,50 ± 0,61 NS NS 20,34 ± 0,69 30,08 ± 0,63 20,11 ± 0,80 29,16 ± 0,72 NS NS NS * 4,73 ± 0,37 4,41 ± 0,50 NS 4,39 ± 0,40 Dureza (kg) SIG.: *** P<0,001; ** P<0,01; * P<0,05; NS No Significativo 5,44 ± 0,48 NS NS Machos Hembras SIG. 5,41 ± 0,02 5,41 ± 0,03 NS pH CARACTERÍSTICAS ORGANOLÉPTICAS COLOR del L. thoracis NS Luminosidad 39,96 ± 0,86 39,54 ± 0,97 * Índice de rojo 13,14 ± 0,36 11,62 ± 0,36 8,15 ± 0,50 8,52 ± 0,52 NS Índice amarillo CRA (%) 2,12 ± 0,33 2,66 ± 0,43 NS Pérd. Descong. NS Pérd. Presión 19,63 ± 1,40 18,18 ± 1,68 NS Pérd. Cocción 27,60 ± 0,95 24,40 ± 1,25 NS Capacidad de retención de agua y dureza - El sexo no afectó de forma significativa (P<0,05) las pérdidas de agua por descongelación, por presión o por cocción de la carne de terneros ligeros y pesados, punto que ratifican los resultados de Dios (2001) y Oliete (2003). Dureza - No se encontraron diferencias significativas debidas al sexo, concordando con los resultados de Paterson et al. (1988); Dios (2000); y, Calvo (2001) para terneros Rubio Gallego sin destetar. Para Eilers et al. (1996), sin embargo, los valores de dureza de la carne fueron algo más bajos en la carne de las hembras en los terneros ligeros, pudiendo ser debidos a la menor tasa de colágeno en las hembras (Touraille, 1982; Hedrick et al., 1983); o por la mayor cantidad de grasa que implica un mayor grado de veteado (Seideman et al., 1982). Otros autores, por el contrario, achacan las diferencias a la mayor cantidad de fibras blancas que presentan las hembras o al diferente valor de pH (Eilers et al., 1996) que no ha sido observado en nuestro estudio. Composición química - La carne de los terneros ligeros se ha visto afectada significativamente por el sexo en el contenido de humedad y en la grasa, siendo los valores más elevados para los machos en la humedad (76,10 vs 74,66%; P<0,01), y para la grasa en las hembras (1,68 vs 0,99%; P<0,01) (Cuadro 5). En los terneros pesados el contenido en grasa ha sido superior en las hembras (2,66 vs 1,49%; P<0,01), no encontrándose diferencias significativas en ninguno de los demás constituyentes de la carne. El contenido de grasa del músculo, en el presente trabajo, ha sido superior en las hembras que en los machos para el mismo peso vivo, justificándose por el desarrollo precoz de las hembras con respecto a los machos. Así mismo, se ha demostrado en la raza Rubia Gallega, Varela (2002) y Moreno (2004), que este aumento en el contenido de grasa de las hembras, lleva asociado un descenso en el contenido de humedad con respecto a los machos. 76 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Cuadro 5. Medias, error típico y nivel de significación de la composición química de la carne de los machos y hembras. Efecto sexo. TIPO LIGEROS SEXO Machos PESADOS Hembras SIG. Machos COMPOSICIÓN QUÍMICA (%) 76,10 ± 74,66 ± ** 75,34 ± 0,23 Humedad 0,17 0,22 1,15 ± 1,15 ± NS 1,15 ± 0,01 Cenizas 0,01 0,01 21,76 ± 22,51 ± NS 22,02 ± 0,16 Proteína 0,21 0,26 0,99 ± 1,68 ± ** 1,49 ± 0,20 Grasa 0,13 0,17 SIG.: *** P<0,001; ** P<0,01; * P<0,05; NS No Significativo SIG. MvsH Hembras SIG. 74,57 ± 0,28 NS * 1,12 ± 0,01 NS NS 21,65 ± 0,17 NS NS 2,66 ± 0,26 ** *** CONCLUSIONES Los terneros de raza Minhota producidos en sistemas de manejo tradicional intensivo tienen un crecimiento elevado desde el nacimiento hasta los 11 meses de edad. Los pesos obtenidos se han ajustado mejor a una ecuación cúbica, mostrando a los 90, 180 y 270 días, valores estimados de 131 kg, 247 kg y 364 kg en los machos, y de 121 kg, 217 kg y 297 kg en las hembras. En función de la edad al destete (6 y 9 meses) los machos presentaron ganancias medias diarias superiores a las de las hembras. Así se han obtenido a los 6 meses, 1.150 g en los machos y 984 g en las hembras, y a los 9 meses 1.165 g en los machos y 1.001 g en las hembras, sin que la ganancia media diaria haya sido afectada por la estación de nacimiento. La carne presentó un color con una alta luminosidad, de tonos rosados pálidos y un alto índice de amarillo, propio de los animales sin destetar. La dureza de la carne ha sido reducida, inferior al 5,5 Kg/cm2, no encontrándose diferencias entre las dos edades de sacrificio, debido a un contenido en grasa intramuscular alto y una baja capacidad de retención de agua. A pesar de que el mercado demanda terneros muy jóvenes, las escasas diferencias que se han obtenido en las características de la carne entre las distintas edades, se aconseja que el sacrificio de los terneros debería realizarse a edades más tardías a las practicadas en la actualidad, sin que su calidad resultara mermada. BIBLIOGRAFIA Araújo, J.P. (2005). Caracterización etnológica, genética y productiva de la raza bovina Minhota - Tese de Doutoramento. Universidad de Santiago de Compostela. Brito, A.N. (2002). Contribuição para o estudo de algumas raças bovinas autóctones do Noroeste de Portugal: Análise do sistema produtivo e caracterização biométrica, produtiva, genética das raças bovinas Arouquesa, Barrosã e Cachena: perspectivas de evolução. Tese de Doutoramento. Univ. Trás-os-Montes e Alto Douro. Calvo (2001). Estudio del crecimiento y de las características de la canal y de la carne del ternero Rubio Gallego acogible a las primas de la P.A.C. en rebaños de vacas nodrizas. Tesis Doctoral. Facultad de Veterinaria. Universidad de Santiago de Compostela. 77 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Cima García, M. (1996). El ganado vacuno de la raza Asturiana de los Valles. Pasado, presente y futuro. Ed. ASEAVA. España. De Behr, V.; Hornick, J.L.; Cabaraux, J.F.; Alvarez, A.; Istasse, L. (2001). Growth patterns of Belgian Blue replacement heifers and growing males in commercial farms. Livestock Prod. Sci., 71: 121-130. Dios, A. (2000). Parámetros de calidad del ternero de raza Rubia Gallega pura y cruzada con Holstein. Tesis Doctoral. Universidad de Santiago de Compostela. Eilers, J.D.; Tatum, J.D.; Morgan, J.B.; Smith, G.C. (1996). 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Universidad de Santiago de Compostela. 78 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES INFECCIÓN POR PESTIVIRUS EN EL REBECO (Rupicapra pyrenaica) EN EL PIRINEO CATALÁN PESTIVIRUS INFECTION IN CHAMOIS (Rupicapra pyrenaica) IN THE CATALAN PYRENEES LAVÍN, SANTIAGO y MARCO, IGNASI. Servicio de Ecopatología de Fauna Salvaje. Facultad de Veterinaria. Universidad Autónoma de Barcelona. PALABRAS CLAVE: pestivirus, enfermedad de la frontera, rebeco ABSTRACT During 2001 and 2002 an outbreak of a previously unreported disease was detected in the chamois population of the National Hunting Reserve of Alt Pallars-Aran in the Catalan Pyrenees (NE Spain), near the border with Andorra and France. A new virus belonging to the Genus Pestivirus was isolated from several affected animals. Clinical signs of affected chamois included weakness, extensive alopecia, skin hyper-pigmentation and cachexia. In early 2005, a high mortality of chamois was observed at the National Hunting Reserve of Cerdanya-Alt Urgell, an area close to the border with France, and about 40 km from the 2001-2002 outbreak. Affected animals presented with respiratory signs including dyspnoea and blood exuding from the mouth and nostrils. At necropsy, severe pneumonia was diagnosed as the cause of death in the early cases. In the last animals found dead in the outbreak, pneumonia was not found however lesions similar to those of the 2001-2001 outbreak were observed, principally alopecia, skin hyperpigmentation. In all of them, a Pestivirus was isolated. In June, a chamois with skin lesions was examined at the National Hunting Reserve of Cadi, an area close to the southern border of the Cerdanya-Alt Urgell Reserve, and from this individual a Pestivirus was also isolated. During the subsequent months, tens of chamois were found dead over a large area of the Reserve. The census performed revealed a dramatic decrease in the populations of both reserves and chamois are continuing to die in these reserves. 79 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES INTRODUCCIÓN A principios del año 2001, los guardas de la Reserva Nacional de Caza del Alt Pallars-Arán, situada en los Pirineos centrales en la provincia de Lleida, detectaron una mortalidad anormal de rebecos. El Departament de Medi Ambient de la Generalitat de Catalunya, en el marco del Convenio de colaboración existente para el seguimiento del estado sanitario de las poblaciones de ungulados salvajes, encargó al Servicio de Ecopatología de Fauna Salvaje de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Autónoma de Barcelona el estudio y seguimiento de la enfermedad. Desde el inicio del 2001 hasta el verano de ese mismo año se observaron animales enfermos y se encontraron algunos muertos. A principios de 2002, se volvieron a observar rebecos con la misma sintomatología. Esta vez, la incidencia del proceso fue mayor, ya que se observó un número muy elevado de rebecos enfermos y muertos. De forma similar al año anterior, a principios del verano ya no se observaron más animales afectados. En la vertiente francesa se produjo una situación similar durante el mismo periodo, pero apenas se llevó a cabo ningún estudio de los animales afectados. En el Principado de Andorra, que limita con el sector catalán afectado, únicamente se encontró un rebeco enfermo en el mes de Agosto. Durante el año 2003, apenas se observaron rebecos afectados por la enfermedad. Los rebecos enfermos presentaban debilidad marcada y dificultad de movimiento. Con frecuencia, se desplazaban a las zonas bajas de las montañas, cerca de los torrentes, caminos y carreteras. Algunos, mostraban un cambio de comportamiento (no huían ante la presencia humana), e incluso se dejaban acercar y capturar fácilmente. Cuando se capturaba un animal, el pelo se arrancaba con facilidad. Además, presentaban un estado de delgadez muy marcado y una parasitación abundante por garrapatas. Durante la primavera, a partir del mes de Abril aproximadamente, los rebecos observados enfermos tenían diversas partes del cuerpo sin pelo y la piel presentaba un color oscuro. Los animales encontrados durante los meses siguientes, presentaron una alopecia prácticamente total. El estudio detallado de los rebecos afectados, detectó la presencia de un Pestivirus. La evaluación de la mortalidad, tanto en el primer brote como en los posteriores, se realizo comparando los censos de antes y después de la epizootia. A nivel local, en los valles afectados la disminución se situó entre el 40 y 46 %, mientras que globalmente, en la totalidad de la Reserva la disminución fue de un 30 %; de 3.880 rebecos censados en el año 2000, se pasó a un censo de 2.670 rebecos en el año 2002. A finales del mes de Diciembre de 2004, un guarda de la Reserva Nacional de Caza de la Cerdanya-Alt Urgell detectó un rebeco adulto enfermo. El animal, después de capturado, fue trasladado a la Facultad de Veterinaria donde murió al poco tiempo de llegar. El animal presentaba un proceso respiratorio (neumonía) que le había ocasionado la muerte. En los meses de Febrero y principios de Marzo de 2005, se detecto una mortalidad muy elevada de rebecos en esta Reserva. La sintomatología que presentaban los animales afectados era compatible con un proceso respiratorio, similar al del primer animal encontrado en Diciembre. Sin embargo, en los últimos animales afectados, se observaron las mismas lesiones cutáneas que las encontradas en el brote que afectó durante los años 2001 y 2002 a la Reserva del Alt Pallars-Aran. En los meses siguientes se encontraron decenas de animales muertos. En esta Reserva, de 563 rebecos censados en 2004, en la actualidad no quedan más de 30, lo que supone una disminución de más del 95%. 80 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES En el mes de Junio de 2005 se detectó el primer rebeco enfermo en la Reserva Nacional de Caza del Cadí. Se trataba de un animal con una sintomatología similar a la descrita en la Reserva del Alt Pallars-Aran durante los años 2001 y 2002. Posteriormente se registran numerosos casos y después de realizar los análisis correspondientes se confirma que el brote estaba asociado a un Pestivirus, al igual que en los casos anteriores. Durante los meses de verano se encuentran rebecos enfermos y decenas de cadáveres y el proceso se extiende afectando a los animales de una amplia zona del sector central de la Reserva. En esta Reserva, a finales de 2005 se constata una disminución del 34%. En Francia, existe también una fuerte disminución, según los sectores, que oscila del 30 al 75%. En el Principado de Andorra prácticamente no se observan animales enfermos. En la actualidad, estamos pendientes de los censos, pero la disminución de rebecos parece ser importantísima. En la mayoría de los rebecos estudiados en los tres brotes se detectó la presencia de un pestivirus. Se utilizaron técnicas inmunológicas de detección de antígeno (ELISA) y técnicas moleculares de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Además, se ha podido aislar el virus, que se caracterizó mediante técnicas moleculares. Estos estudios determinaron que se trataba de un pestivirus no descrito previamente perteneciente al genotipo ‘Border Disease’ (Enfermedad de la Frontera). Durante los años 2003 y 2004 pudimos estudiar los rebecos de la Reserva del Alt PallarsAran. Utilizamos para ello muestras de rebecos cazados que eran recogidas por los guardas durante el periodo cinegético. Pudimos constatar en estas zonas una prevalencia de anticuerpos superior al 80% y la ausencia de animales enfermos. Estos resultados indican que es presumible que hayan adquirido una defensa inmunológica suficiente como para que no se produzca un nuevo rebrote del proceso. Desde entonces, parece que se está produciendo una lenta recuperación de la población en esta Reserva del Alt Pallar-Aran. También, estudiamos poblaciones de otros ungulados salvajes, en particular muflón, ciervo, corzo y jabalí, que comparten el mismo territorio que los rebecos enfermos. En estos animales no se había detectado el proceso. Los resultados de los análisis fueron negativos, por lo que parece ser una enfermedad que afecta exclusivamente al rebeco. Igualmente, se realizó un estudio de los rebaños de ovino y de vacuno que comparten el hábitat con el rebeco en la zona afectada, y tampoco se detectó la presencia del virus. A mediados de 2005, debido a la crítica situación, las Juntas Consultivas de las Reserva de la Cerdanya-Alt Urgell y del Cadí-Moixeró deciden la suspensión de la caza del rebeco, a pesar de que ya se habían sorteado y asignado los permisos. En el sector francés afectado también se suspende la caza y desde los organismos franceses competentes y desde el Departamento de Medio Ambiente de la Generalitat de Catalunya, se solicita al Gobierno Andorrano que haga lo mismo en las zonas limítrofes. Los censos realizados en Andorra por los guardas (Cos de Banders) en las zonas que no son reserva, constatan una disminución aproximada del 50%, tal y como era de esperar, ya que son las reservas catalanas y francesas las que nutren de rebecos al Principado. La administración andorrana decide disminuir la caza de una semana a tres días. A pesar de ello, no se modifica el número de permisos (108), cuando el censo arroja una cifra de 103 rebecos. Los márgenes de maniobra en el Principado son pequeños, ya que la legislación andorrana concede los permisos en función del número de cazadores, y no en función del número de rebecos. En la actualidad la enfermedad se extienda al resto de la Reserva del Cadí-Moixeró. La única zona donde no se han detectado rebecos enfermos es en la Reserva de Freser81 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Setcases, donde existe una población muy importante de rebecos. Desde el Servicio de Ecopatología de la Universidad Autónoma de Barcelona, seguimos trabajando e investigando sobre esta enfermedad, ya que al tratarse de un proceso y de un virus totalmente desconocidos, quedan muchas preguntas por contestar y un largo camino por recorrer. Los Pestivirus son un Género de virus pertenecientes a la Família Flaviviridae. Este conjunto de virus afecta únicamente a los animales domésticos y salvajes, y son los causantes de enfermedades tan importantes como la Peste Porcina Clásica, que afecta al cerdo y que también puede afectar al jabalí, la Diarrea Vírica Bovina, que afecta al ganado vacuno principalmente, y la Enfermedad de la Frontera o Border Disease, que afecta al ganado ovino y caprino. De todas estas, la enfermedad más importante quizás sea la Peste Porcina Clásica, ya que está clasificada como una enfermedad altamente contagiosa en la lista de la Oficina Internacional de Epizootias (OIE). Estos virus son diferentes variedades y/o genotipos en cada caso, dentro del mismo Género Pestivirus, aunque hay que añadir que existen muchas otras variedades que afectan a los animales salvajes. Son unos virus de tipo ARN, lo que implica que presentan una gran variabilidad y/o mutabilidad, y además tienen mayor capacidad para sobrevivir en el medio ambiente. El virus de la Peste Porcina Clásica, a pesar de ser altamente contagioso, afecta básicamente a los suidos domésticos y salvajes, entre ellos el cerdo doméstico y el jabalí. Los virus de la Diarrea Vírica Bovina y de la Enfermedad de la Frontera, y sus variantes más próximas, pueden infectar a una gran cantidad de animales salvajes, principalmente ungulados. Se han aislado estos virus en especies de distintos continentes, como reno, ciervo, corzo, jirafa, eland, ... Sin embargo, hasta la fecha nunca se ha había encontrado un Pestivirus en el rebeco en ninguna parte de su área de distribución, y por lo tanto nunca se había asociado con ninguna enfermedad, por lo que podemos afirmar que se trata de un proceso nuevo para el rebeco y que nunca hasta ahora, había sido descrito. También cabe señalar que hasta la fecha, nunca un Pestivirus se había asociado con una epidemia en ninguna especie salvaje, y muy pocas veces se ha relacionado con una enfermedad en animales aislados. Por lo tanto, la grave epidemia que está afectando al rebeco en el Pirineo se trata de un hecho totalmente extraordinario. Un aspecto especialmente destacable de los Pestivirus es la complejidad de su ciclo biológico. En los animales domésticos se han descrito dos biotipos distintos, citopático y no citopático. El primero es el causante de las enfermedades más graves en los animales domésticos, mientras que el segundo no suele producir tanta mortalidad. Sin embargo, existen algunas excepciones, y una de ellas es la del que afecta al rebeco, ya que hasta el momento los virus aislados son de esta segunda categoría. Los principales reservorios de los Pestivirus son los individuos persistentemente infectados (IPI). Son animales que se han infectado durante la gestación y que no reconocen el virus como extraño. Por tanto, no elaboran anticuerpos y a partir del momento que nacen, eliminan gran cantidad de virus al exterior. Esta característica tan extraordinaria, hace que sea una enfermedad muy complicada de detectar inicialmente, de controlar y de erradicar, ya que puede darse la circunstancia de que animales sanos, estén eliminando virus e infectando a otros animales. En los animales salvajes no se conoce la existencia de este tipo 82 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES de animales, aunque se cree que también se encuentran presentes, y que deben ser los responsables del mantenimiento y propagación de la enfermedad. Los síntomas de las infecciones por Pestivirus en los ungulado salvajes, al igual que ocurre en los animales domésticos, dependen de la virulencia de la cepa del virus, del estado inmunitario del animal, de la vía de transmisión y de la dosis infectiva. Pueden ser muy variados, aunque principalmente se trata de una enfermedad intestinal, que produce diarreas, en ocasiones hemorrágicas, como en el caso del ganado bovino, de una enfermedad congénita y reproductiva, como en el ganado ovino, y de un síndrome hemorrágico sistémico, como en el ganado porcino. El diagnóstico de una infección por Pestivirus, se puede realizar mediante pruebas serológicas para la detección de los anticuerpos (ELISA o seroneutralización). Estas son la pruebas que habitualmente se utilizan para el estudio de la enfermedad. Sin embargo, como hemos visto puede darse la circunstancia de que animales infectados por el virus no se detecten mediante estos tests. Para poder detectarlos, se han de utilizar otras pruebas que identifiquen el virus propiamente dicho, como ELISA de captura de antígeno, inmunofluorescencia, técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y aislamiento vírico. El control del virus en los animales domésticos tendría que tener como objetivo principal la identificación, aislamiento y eliminación de los individuos persistentemente infectados. Ésta, juntamente con otras medidas de bioseguridad para minimizar el riesgo de contacto de animales susceptibles con el virus, como la cuarentena, han demostrado que son las principales medidas para el control de la enfermedad en los animales domésticos. Las pautas vacunales correctamente diseñadas (momento de aplicación de la vacuna, tipo de vacuna, etc.) también ayudaran. En los animales salvajes, medidas como el aumento de la presión cinegética, no han sido efectivas en los casos de la Peste Porcina del jabalí. Incluso, se considera que puede favorecer la expansión de la enfermedad, debido a que se produce un aumento en el movimiento de los animales, lo que provoca que se extienda más rápidamente la enfermedad. Brote de enfermedad en el rebeco A principios del año 2001, los guardas de la Reserva Nacional de Caza del Alt Pallars-Arán, situada en los Pirineos centrales en la comarca del Pallars Sobirá, en la provincia de Lérida, detectaron una mortalidad elevada de rebecos en el sector que linda con el Principado de Andorra. El Servicio de Ecopatología de Fauna Salvaje de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Autónoma de Barcelona, nos encargamos del estudio del brote de enfermedad, dentro del marco del Convenio de colaboración existente con el Departament de Medi Ambient de la Generalitat de Catalunya, para el seguimiento del estado sanitario de las poblaciones de ungulados salvajes en Cataluña. El estudio de los animales afectados no permitió inicialmente el diagnóstico concreto de la afección, ya que se trató de una enfermedad cuyos síntomas no se correspondían con las enfermedades conocidas en esta especie y en otras especies próximas de ungulados de montaña. Los rebecos enfermos presentaban dificultad de movimiento y debilidad durante 83 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES el desplazamiento, y con frecuencia eran observados en las zonas bajas de las montañas, cerca de los ríos, caminos y carreteras. Algunos de ellos mostraban un cambio de comportamiento, ya que no huían ante la presencia humana, e incluso, se dejaban acercar y capturar fácilmente. Con el animal en mano, se podía constatar un estado de delgadez muy marcado. Durante la primavera, los rebecos enfermos que se observaron tenían diversas partes del cuerpo con alopecia e hiperpigmentación cutánea. Los animales encontrados durante los meses siguientes, presentaron una alopecia prácticamente total. Únicamente quedaba un poco de pelo en la cola, extremidades y ciertas partes de la cabeza, principalmente las orejas. A principios del año 2002, se volvieron a observar rebecos enfermos con la misma sintomatología y tuvo lugar un rebrote de la enfermedad. Esta vez, la gravedad del proceso fue mayor, ya que se observó un número mayor que el año anterior de rebecos enfermos y muertos. Numerosos rebecos enfermos se pudieron capturar todavía con vida y fueron trasladados y hospitalizados en la Facultad de Veterinaria de la Universidad Autónoma de Barcelona. Sin embargo, ninguno logró recuperarse del proceso. La evaluación de la mortalidad producida por una enfermedad en animales salvajes en un medio tan agreste como es el Pirineo es muy difícil, ya que la mayoría de animales enfermos y muertos no se pueden detectar. Una forma indirecta de calcularla es mediante los censos que periódicamente se realizan en la Reserva. Tal y como se preveía, los peores pronósticos se cumplieron, ya que fueron muchos los rebecos encontrados enfermos y muertos, y lo que resultaba peor, que era los pocos rebecos vivos que se observaban. Comparando los censos del periodo 2000-2002, es decir antes y después de la epizootia, se constató un descenso importante de la población. A nivel local, en los valles afectados la disminución se situó entre el 40 y 46 %, mientras que globalmente, en la totalidad de la Reserva la disminución fue de un 30 %; de 3.880 rebecos censados en el 2000, se pasó a un censo de 2.670 rebecos en 2002. Durante los dos años que duró la epizootia, se pudieron estudiar un total de 20 rebecos enfermos. En la mayoría de ellos, se detectó la presencia de un Pestivirus, mediante técnicas inmunológicas de detección de antígeno (ELISA) y técnicas moleculares de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Además, mediante técnicas de cultivo vírico, se aisló el virus de la mayoría de los rebecos enfermos. Para determinar que Pestivirus se trataba y para poder compararlo con los otros Pestivirus conocidos, se llevó a cabo un estudio y caracterización moleculares de los virus aislados. Estos estudios determinaron que no se trataba de ninguna cepa previamente descrita, si bien mostraron una mayor similitud con las cepas de Pestivirus de tipo ovino (Enfermedad de la Frontera). Durante los años 2003 y 2004, se estudió la población de rebecos, aparentemente sana, de la zona afectada, a partir de las muestras de los rebecos cazados, que eran recogidas por los guardas durante el periodo cinegético. Se pudo constatar una prevalencia de anticuerpos superior al 80% y la ausencia de animales enfermos. Estos resultados indicaron que presumiblemente la población había adquirido una defensa inmunológica suficiente como para que no sucediera un nuevo rebrote de la enfermedad. Desde entonces, parece que se está produciendo una lenta recuperación de la población en esta Reserva. 84 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES También se estudiaron las poblaciones de otros ungulados salvajes de la Reserva, en particular muflón, ciervo, corzo y jabalí, que comparten el mismo territorio con el rebeco, a pesar de que no se había detectado ningún animal de estas especies con síntomas de la enfermedad. Los resultados fueron negativos, por lo que parece ser una enfermedad que afecta exclusivamente al rebeco. Igualmente, se realizó un estudio de los rebaños de ovino y de vacuno que comparten el hábitat con el rebeco en la zona afectada, y tampoco se detectó la presencia del virus. Nuevo brote de enfermedad A finales del año 2004, un guarda de la Reserva Nacional de Caza de la Cerdanya-AltUrgell, detectó la presencia de un rebeco adulto tumbado en el suelo con síntomas de enfermedad. Los análisis efectuados determinaron un proceso respiratorio (neumonía) como causa de la muerte. A finales del mes de Febrero y durante el mes de Marzo de ese mismo año, se detecta una mortalidad masiva de rebecos en esta Reserva. La sintomatología de los rebecos afectados es respiratoria y se comprueba que los animales fallecen por un proceso infeccioso respiratorio, idéntico al del primer animal encontrado en Diciembre. Sin embargo, en los últimos animales afectados, se observan las mismas lesiones cutáneas que las encontradas en el brote que afectó durante los años 2001 y 2002. Los estudios más detallados de los rebecos afectados, detectaron la presencia de un Pestivirus en todos ellos, por lo que se confirmó la existencia de un nuevo brote de la enfermedad. Se temía por que las consecuencias de la enfermedad fuesen dramáticas: se encontraron muertos decenas de rebecos y se observaron muy pocos animales vivos en las zonas que habitualmente ocupan durante esta época del año. Tuvo lugar un colapso de la población, ya que la mortalidad producida fue extraordianriamente elevada. En el mes de Junio de 2005 se detectó el primer rebeco enfermo en la Reserva Nacional de Caza y Parque Natural del Cadí-Moixeró. Se trató de un animal con una sintomatología similar a aquella descrita para el brote ocurrido en el Pallars, durante los años 2001 y 2002. Se cumplieron las peores previsiones y se confirmó el brote de enfermedad asociado a un Pestivirus en esta Reserva. Durante los meses de verano se encontraron rebecos enfermos y decenas de cadáveres, y el proceso se fue extendiendo, afectando a una amplia área del sector central de la Reserva. Los censos que se realizaron en ambas Reservas, proporcionaron unos resultados dramáticos. En la Reserva de Cerdanya-Alt Urgell, de 563 rebecos censados en 2004, se detectaron únicamente 81 rebecos, lo que supone una disminución de alrededor del 86%. En la Reserva del Cadí, las cifras no fueron tan apocalípticas, pero se constató una disminución importante del 34%. En Francia, se constató también una fuerte disminución, según los sectores, que oscila del 30 al 75%. En la actualidad, la epizootia continúa su avance en el Parque Natural del Cadí-Moixeró y se sigue temiendo por que la enfermedad se extienda al resto de las zonas protegidas del Pirineo. Desde el Servicio de Ecopatología de la Universidad Autónoma de Barcelona, seguimos trabajando e investigando sobre esta enfermedad, ya que al tratarse de un proceso y de un virus totalmente desconocidos, quedan muchas preguntas por contestar y un largo camino por recorrer. 85 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES El aspecto que más urgentemente cabría elucidar, es cómo detener o controlar la enfermedad. Sin embargo, esta cuestión es difícil de contestar y de llevar a cabo, ya que las enfermedades víricas en animales salvajes de vida libre, que afectan a una población tan grande y en un medio tan agreste, como es el Pirineo, son difíciles de controlar. Al no existir situaciones similares en el rebeco, podemos tomar como ejemplo la situación de la epizootia de Peste porcina en el jabalí en centroeuropa. Después de años de investigación, de intentos fallidos de erradicar la enfermedad mediante la caza intensiva de jabalís, en la actualidad se está trabajando en la vacunación de los jabalíes mediante cebos por vía oral. BIBLIOGRAFÍA Becher, P., Avalos-Ramirez, R., Orlich, M., Cedillo-Rosales, S., Konig, M., Schweizer, M., Stalder, H., Schirrmeier, H., Thiel, H-J., 2003. Genetic characterization of novel pestivirus genotypes: implications for classification. Virol. 311, 96-104. Frolich, K., Jung, S., Ludwig, A., Lieckfeldt, D., Gibert, P., Gauthier, D., Hars, J., 2005. Detection of a newly described pestivirus of Pyrenean chamois (Rupicapra pyrenaica pyrenaica) in France. J. Wildl. Dis. 41, 606-610. Hurtado, A.; Aduriz, G.; Gomez, N.; Oporto, B.; Juste, R.A.; Lavin, S.; Lopez-Olvera, J. and Marco, I. (2004). Molecular identification of a new pestivirus associated to an outbreak of disease in the Pyrenean chamois (Rupicapra pyrenaica pyrenaica) in Spain. J. Wildl. Dis., 40: 796-800. Marco, I. and Lavin, S. (2003). Pestivirus in chamois from the Catalan Pyrenees (NE Spain) in 2001 and 2002. Supplement to the J. Wildl. Dis., 39: 2-3. Marco, I. y Lavín, S. (2005). Demographic collapse of the population of chamois (Rupicapra pyrenaica) in the eastern Pyrenees due to disease associated with a pestivirus infection. Supplement to the J. Wildl. Dis., 41. Marco, I.; Rosell, R.; Mentaberre, G.; Casas, E.; Cabezón, O.; Velarde, R. y Lavín, S. (2006). Pestivirus infection in chamois (Rupicapra pyrenaica): demographic collapse of the population in the catalan Pyrenees (NE Spain). Wildlife Disease Association International Conference. Connecticut (USA), 2006. Marco, I.; Rosell, R.; Mentaberre, G.; Casas, E.; Cabezón, O.; Velarde, R. y Lavín, S. (2006). Description of an outbreak of pestivirus infection in chamois (Rupicapra pyrenaica) in the Pyrenees during 2005 and 2006. Seventh International Conference. European Wildlife Disease Association. St. Vincent (Italia), 2006. Marco, I., Lopez, J., Rosell, Vidal, E., Hurtado, A., Juste, R., Pumarola, M. y Lavín, S. (2006). Severe outbreak of disease in southern chamois (Rupicapra pyrenaica) associated with Border Disease virus infection. Vet. Microbiol. (en prensa). Nettleton, P.F., Entrican, G., 1995 . Ruminant pestiviruses. Brit. Vet. J. 151, 615-642. Nettleton, P.F., Gilray, J.A., Russo, P., Dlissi, E., 1998. Border Disease of sheep and goats. Vet. Res. 29, 327-340. 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THE IMPORTANCE OF CLINICAL ASPECTS, LEGAL ASPECTS, MANAGEMENT, STATUS OF HEALTH AND PROTECTION OF MOUFLONS IN SARDINIA. CUBEDDU G.M Istituto di Clinica Medica Veterinaria-Università di Sassari - Direttore G. Pintori. KEY WORD: mouflons, management, protection, laws, environment. SUMMARY Our aim is to evaluate the status of health and wellbeing of mouflons in Sardinia. We are going to consider clinical , and epidemiological and managing aspects, according to the modern canons of protection of the mouflon’s health as well as to the medical aspects related to the pathologies of the species in particular those trasmissible to other animals and men. Italian Autochthonal population of mouflon is the Sardinian one ,there are ,infact, 4000. Sheep and it is subdivided into different units. We remember the ratification of the agreement of Berna from the Italian Republic(Law n 503 of 05th -08-81)for protection of wild life and natural enviroment in Europe which imposes measures to protect wild species and those in danger of extinction. The 75% of the mouflon population in Sardinia is abandoned, because there are not people able to take care of them and because of the territory shape and uneven ground. The conditions of life and survival of colonies of mouflons are different according to their place as well as the institute involved in their protection. Main Pathologies:Echinococcosi and Cenurosi, gastroenteric and bronchopulmonary strongilosi, gastro-enteric “Tossiemie”, adenomatosi, tetanus, cherato-conjiiunctivitisin, blue tongue, Q fever. To sum up, we believe we are able to find solutions to some problems,in order to improve the management and the state of health of animals. For example the “the endemic agalassia”among Sardinian sheep could provoke serious effects on the population of mouflons . We should improve a correct culture of natural parks in Sardinia in order to encourage more vigilance , mutual help and cooperation among veterinarians, zoofile guardians and corps of foresters ,more protection of these wild animals with opportune interventions , and treatment so that pathologies couldn’t menace fauna in this island. PREMESSA Con questo lavoro ci proponiamo di valutare la situazione sanitaria e di benessere dei mufloni in Sardegna, alla luce delle attuali leggi protezionistiche internazionali, nazionali e regionali con l’obiettivo di migliorare il rapporto uomo-animale-ambiente in Sardegna. Valuteremo pertanto gli aspetti clinici, epidemiologici e gestionali, secondo i moderni canoni di tutela del benessere di questo animale selvatico in relazione agli aspetti sanitari legati sia alle patologie della specie in particolare, sia a quelle trasmissibili agli altri animali e all’uomo. 88 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES INTRODUZIONE Il muflone è una sottospecie di ovis orientalis; è verosimile che la pecora domestica (ovis aries) si sia originata, circa novemila anni fa, a partire proprio da ovis orientalis, e che le popolazioni di muflone sardo-corse (uniche autoctone in Europa) si siano originate a loro volta da pecore domestiche, via via inselvatichite, portate su queste due isole dall’uomo. Il maschio adulto misura 135 cm di lunghezza, la femmina 120; l’altezza nel maschio è di 7090 cm, nella femmina 65-75 cm; il peso è di 30-40 kg nel maschio, 15-30 kg nella femmina e nei neonati 2-3 kg. Il trofeo è presente quasi esclusivamente nei maschi, mentre le femmine sono o sprovviste o munite di un piccolo bozzo corneale. Il mantello è fulvo, marroncino chiaro d’estate, bruno scuro d’inverno. Il suo habitat è nelle zone rocciose con pascoli e boscaglia, dal livello del mare ai 1500 mt. La riproduzione avviene tra settembre e novembre e i parti avvengono da febbraio ad aprile con una gestazione di 150-160 giorni. E’distribuito nelle isole di Cipro, Corsica e Sardegna in Europa, e inoltre nell’Asia minore attraverso l’Armenia, l’Iran, Iraq, Afghanistan, Pakistan e India settentrionale. In Europa esistono numerosi nuclei in Germania, Repubblica Ceca, Slovacchia, Ungheria, Slovenia e Austria. La popolazione autoctona italiana del muflone è quella sarda che attualmente si aggira intorno ai 4000 esemplari ed è suddivisa in numerosi nuclei tra loro disgiunti (tabella). Diurno in autunno, inverno e primavera, crepuscolare nel periodo estivo. Agile corridore, buon arrampicatore, molto fedele al proprio territorio. Premesse legislative A partire dalla “Dichiarazione Universale dei Diritti degli Animali” (UNESCO-Parigi 1510-78), numerose sono le indicazioni normative sulla tutela delle condizioni di vita e protezione dei selvatici (Washington 1973, Berna 1979, Strasburgo 1976/79). In particolare ricordiamo la ratifica della Convenzione di Berna da parte della Repubblica Italiana (legge n. 503 del 05-08-81) per la conservazione della vita selvatica e dell’ambiente naturale in Europa, la quale impone idonee misure per la protezione delle specie selvatiche, con precisi riferimenti a quelle in grave pericolo di estinzione e dalle altre che potrebbero esserlo in futuro. Questa legge tratta le problematiche igienico-sanitarie dei selvatici, il prelievo venatorio etc. Ma in particolare costituisce punto di riferimento la legge regionale Sarda n. 21 del 18-0594 la quale detta norme per la protezione degli animali: essa sinteticamente all’art.1 promuove nel territorio regionale un’adeguata protezione degli animali, e un loro miglior rapporto con l’ambiente; all’art. 2 detta norme di tutela e salvaguardia degli animali di qualsiasi genere e specie affidando il controllo del rispetto delle stesse ai servizi veterinari delle A.S.R.L. (art. 18); all’art. 16 poi obbliga chiunque detenga animali a provvedere ad un trattamento adeguato alla specie, al mantenimento e alla nutrizione. Da ultima la legge regionale n. 23 del 27-098 recante norme per la protezione della fauna selvatica e per l’esercizio della caccia in Sardegna. 89 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Gestione Della popolazione del muflone esistente in Sardegna il 75% circa risulta pressoché abbandonato a se stesso; le popolazioni di molte zone non sono in alcun modo seguite dal punto di vista igienico sanitario e anche l’attuazione delle operazioni di censimento sistematico assume aspetti problematici, frequentemente per la mancanza di personale atto ad effettuarlo oltre che per la particolare conformazione del territorio in alcuni casi particolarmente accidentato. La tutela dei mufloni nelle località di Oschiri, Pattada, Monti, Berchidda, Alà dei Sardi, Bonassai, Cuglieri, Gonnosfanadiga, Villassalto, è affidata all’Ente Foreste della Sardegna; mentre quella delle località di Golfo Aranci, Isola di Figarolo, Gennargentu, Montalbo di Siniscola, sono di pertinenza della Regione Autonoma della Sardegna. Uno specifico accenno merita la colonia di mufloni collocata nell’isola di Asinara già sotto l’egida del Ministero di Grazia e Giustizia sino al 1998, oggi Parco Nazionale dove ancora non è ben chiaro a chi sia affidata la tutela e la gestione dei mufloni (600 esemplari circa). Le condizioni di vita e/o di sopravvivenza delle varie colonie di mufloni sono assai diverse a seconda della loro collocazione e degli enti ai quali è affidata la loro tutela. Principali Patologie Nonostante le grandi difficoltà incontrate nel tentativo di una gestione sanitaria negli anni (molti mufloni vengono casualmente rinvenuti morti in stato di avanzata decomposizione, con la conseguente impossibilità di risalire alle cause della morte), abbiamo cercato ugualmente di tracciare un quadro delle più comuni patologie di questo selvatico in Sardegna. La notevole diffusione di alcune malattie parassitarie trasmesse dal cane agli animali d’allevamento ed allo stesso uomo (Echinococcosi e Cenurosi), costituisce da sempre uno dei più gravi ed insoluti problemi igienico-sanitari che affliggono la Sardegna. Una di queste parassitosi è la Cenurosi, sostenuta dalla forma larvale (Coenurus) della tenia multiceps-multiceps, che allo stadio adulto vive nell’intestino tenue dei canidi domestici e selvatici (cane, lupo, volpe). La malattia, che colpisce il sistema nervoso centrale degli ovini, determinandone la morte e causando ingenti perdite economiche agli allevatori, è stata in questi ultimi anni ripetutamente diagnosticata anche nel muflone. Le cause della diffusione tra gli ovini selvatici vanno ricercate nel costante aumento del randagismo e soprattutto del bracconaggio (introduzione di cani da caccia nelle aree occupate dai selvatici e conseguente diffusione della parassitosi). Del tutto marginale appare invece “il ruolo sostenuto dalla volpe”, potenziale diffusore del parassita tra i mufloni. Da studi da noi effettuati sul campo si può affermare che solitamente la volpe non lede la scatola cranica degli ovini morti, per asportare gli organi cerebrali, sede delle cisti parassitarie e non può quindi essere responsabile della diffusione del parassita nell’ambiente. Non va dimenticato infine che ben nove casi di cenurosi cerebrale diagnosticati nell’uomo su 60 circa descritti a livello mondiale sono stati riscontrati in Sardegna. Le infezioni parassitarie maggiormente segnalate in tutti i distretti della Sardegna sono costituite dalle comuni strongilosi gastrointestinali e broncopolmonari. Queste endoparassitosi, in generale, non comporterebbero grave pericolo per gli animali stessi, ma, nell’isola, particolarmente siccitosa, si assommano, per almeno otto mesi all’anno, alle infestazioni da zecche. La concomitanza di 90 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES questi fattori con le carenze di pascolo può creare seri pericoli per la sopravvivenza degli animali. Abbastanza numerosi sono stati i casi di gastro-entero-tossiemie, sia nel ritrovamento di animali in decubito ( in particolare in concomitanza con le prime erbe ), sia riscontrati al tavolo anatomo-patologico. Alcuni di questi soggetti sono stati recuperati alla vita selvatica dopo idonea terapia. L’adenomatosi polmonare, conosciuta anche come carcinoma polmonare dell’ovino ( OPC ), malattia neoplastica trasmissibile sostenuta da un virus che diffonde per via aerogena, è presente da alcuni anni in un nucleo di mufloni allevati in cattività a scopo di ripopolamento nel Centro Zooiatrico Regionale di Bonassai ( SS ). La malattia al suo esordio nel muflone si è dimostrata altamente contagiosa e si è diffusa rapidamente nel gruppo, colpendo dopo un anno il 20% della popolazione. Il muflone risultava indenne da questo tipo di malattia e pare che la comparsa dell’adenomatosi sia da attribuire ad un errore gestionale messo in atto nel centro zooiatrico di Bonassai, dove degli arieti francesi, verosimilmente affetti da questa patologia, erano entrati in contatto con il gruppo dei mufloni. Da considerare inoltre che mentre nell’ovino e nel caprino domestico la quasi totalità dei casi interessa la popolazione adulta, nel muflone si assiste ad una sua comparsa anche in soggetti giovani ( pochi mesi di età ), grazie alla possibilità di una trasmissione transplacentare del virus. Più preoccupante appare il riscontro di un caso di adenomatosi in un soggetto proveniente da un’oasi faunistica ( Montalbo- Siniscola-NU). Durante lo studio delle patologie del muflone si è avuta, purtroppo, l’opportunità di diagnosticare alcuni casi mortali di tetano ( GennargentuSeui-Nu ), malattia raramente segnalata nei selvatici. Negli animali, che presentavano un drammatico quadro clinico, erano evidenti soluzioni di continuo agli arti, causate da filo spinato utilizzato per le recinzioni. Una tempestiva assistenza ne avrebbe forse consentito il recupero. Nella tarda primavera e durante la stagione estiva sono stati riscontrati diversi casi di cherato-congiuntivite in alcuni soggetti di varia provenienza, senza accertamento dell’eziologia, visti i risultati negativi degli esami effettuati. Tuttavia la presenza di zecche induce a sospettare che l’agente causale sia la rickettsia. Tale affezione non si dimostra particolarmente preoccupante, essendosi risolta spontaneamente, ad eccezione di qualche soggetto precipitato in mare nella fase acuta ( cecità momentanea ) della malattia. Blue Tongue Per quanto riguarda poi la Blue Tongue, trasmessa come è noto dal vettore del genere Culicoides, si suppone che il muflone possa avere, al pari di altri ruminanti selvatici, un ruolo di serbatoio, ospitando il virus; tuttavia non si hanno a tutt’oggi certezze sullo stadio clinico effettivo della patologia in questa specie. Sembra importante sottolineare Non si hanno dati certi sulla presenza della malattia nel muflone in Sardegna; nell’anno 2001, durante la fase di massima acuzie negli ovini, si sono avute alcune segnalazioni su diversi casi sospetti. Uno di questi, riguardante un muflone nell’isola dell’Asinara, rinvenuto morto con sospetto della malattia, purtroppo non ha potuto essere sottoposto a esami per l’avanzato stato di decomposizione della carcassa. Febbre Q Di particolare interesse la segnalazione di questa sindrome morbosa sull’ovino selvatico, sia per la rarità della patologia in questa specie, ma soprattutto per i risvolti di sanità pubblica 91 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES che ne potrebbero derivare; la possibilità di infezione per molti animali e per l’uomo (zoonosi) specialmente in un epoca in cui è sempre più evidente la tendenza a un recupero dell’ambiente e a un maggiore approccio verso le popolazioni di selvatici, con l’istituzione di numerosi parchi e oasi faunistiche, pone le basi per una profonda attenzione e conoscenza nei confronti di questa patologia. Sull’isola di Asinara sono stati segnalati a distanza di alcuni mesi l’uno dall’altro tre casi di febbre Q da Coxiella burnetii. Gli animali, due femmine rispettivamente di 6 e 8 anni, e un maschio di circa 14 mesi, sono stati sottoposti ad indagine clinica. Essi, ritrovati in condizioni di estrema debolezza, tali da lasciarsi catturare con facilità, presentavano ipertermia, magrezza ed infestione massiva da zecche. I soggetti, immediatamente ricoverati, con il sospetto di una forma clinica riferibile a Rickettsiosi venivano sottoposti a terapia sintomatica e a una serie di prelievi di sangue che, all’esame con immuno-fluorescenza indiretta evidenziavano positività verso Coxiella Burnetii. Due dei tre soggetti, dopo il secondo trattamento con tetracicline, mostravano netti segni di miglioramento delle condizioni cliniche e venivano recuperati alla vita selvatica dopo circa un mese dal ricovero, mentre la mufla di 8 anni veniva a morte 48 ore dopo il ricovero per complicazioni broncopolmonari. OSSERVAZIONI PERSONALI Le considerazioni sin qui espresse impongono una serie di riflessioni sia sul piano gestionale (protezione, tutela del benessere), sia su quello sanitario che comprendono tutto il territorio della regione Sardegna. Sembra di poter affermare che le normative sulla tutela del benessere dei mufloni in Sardegna, siano recepite in maniera sufficiente solo dall’Ente Foreste,il quale, quantomeno, provvede ad assicurare ai mufloni il dovuto apporto idrico ed alimentare insieme a condizioni di habitat compatibili. Pare invece da colmare la lacuna dovuta all’assenza di un vero e proprio comparto clinico inteso come costante monitoraggio della situazione sanitaria. L’assenza di un piano protezionistico regionale idoneo nei riguardi di tutti i selvatici, e del muflone in particolare, pare una grave inadempienza di quanto disposto dalla legge (L:R. n° 21 18/05/94 art. 1 comma 2). Altrettanto grave sembra l’assoluto disinteresse da parte dei Servizi Veterinari delle A.S.R.L. chiamati a vigilare sull’applicazione della suddetta legge (Art.18 punto 1°). Particolare poi la gravissima disattenzione da parte dell’Ente Parco nell’isola di Asinara dove la popolazione dei mufloni, in soprannumero, sembra esposta a rischio sanitario. CONCLUSIONI. Con scopo propositivo, per concludere, cerchiamo di identificare alcuni correttivi, peraltro di facile applicazione, finalizzati ad una più corretta gestione utile a migliorare la tutela delle condizioni di benessere degli animali e alla limitazione dei rischi sanitari. Non si può prescindere da una corretta conoscenza delle caratteristiche eto-fisiologiche del muflone, della ecologia, della legislazione ambientale, dell’economia ambientale e dell’antropologia. Un primo intervento da attuare è l’istituzione di operazioni di monitoraggio sistematico che permettano di avere un’idea quanto più reale possibile del numero di soggetti presenti in Sardegna. Sarebbe bene eseguire le osservazione nei periodi di aprile-maggio ovvero dopo i parti e di agosto-ottobre, nel periodo degli amori; le fasce 92 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES orarie più idonee sono quelle che vanno dall’alba fino a metà mattinata e dal tardo pomeriggio fino al tramonto, viste le abitudini prevalentemente crepuscolari di questo ungulato; addentrarsi nelle zone interessate procedendo sempre contro vento e possibilmente con il sole alle spalle. In seguito, conoscendo sempre meglio la logistica, prendendo nota dei sentieri battuti dagli animali, occorre mettere in pratica una tecnica intermedia tra il censimento per transetti e quello per battuta. In alcune aree, senza troppa vegetazione è utile il censimento notturno con il faro: il muflone infatti si individua grazie al particolare riflesso verde evidenziabile di notte attraverso gli occhi illuminati. Un’altra metodica è quella di percorrere i sentieri a cavallo. In questo modo si favorisce senz’altro l’osservazione delle abitudini degli animali che consentono una migliore gestione sia a scopo conservativo che clinico-sanitario. Le osservazioni su echinococcosi e cenurosi impongono un immediato rafforzamento dell’attuazione della legge sull’anagrafe canina e prevenzione del randagismo; la trasmissione di queste parassitosi al muflone è percentualmente scarsa, ma in alcuni distretti dove il randagismo canino ed il bracconaggio stanno assumendo proporzioni dilaganti, il problema può diventare serio, viste anche le continue aggressioni subite dai mufloni da parte di cani rinselvatichiti. Nei distretti dove il muflone vive allo stato completamente selvatico (Nuorese, Asinara, Golfo Aranci) pare opportuno creare ampi spazi all’interno del loro habitat naturale, recintati con materiale idoneo tale da evitare, in occasione di traumatismi, l’insorgenza di patologie sostenute da clostridi (tetano). Gli enti preposti dovrebbero istituire operazioni di monitoraggio sistematico, sia per un quadro reale sul censimento, come già detto, sia attraverso l’allestimento di sistemi di cattura soprattutto nelle stagioni siccitose, quando gli animali vanno in cerca di cibo ed acqua, in modo da monitorare la popolazione valutando il quadro metabolico della stessa con la possibilità di somministrare dei medicinali attraverso l’acqua di bevanda. L’eventuale futura costituzione di oasi di ripopolamento dovrà tener conto della realtà agro pastorale della zona scelta: alla luce degli ultimi riscontri epidemiologici ( adenomatosi polmonare) è necessario evitare quanto più possibile contatti tra ovi caprini domestici ed erbivori selvatici, onde prevenire il rischio di trasmissione interspecifica di patologie infettive: a tale proposito si nutrono fondati timori nei riguardi dell’agalassia contagiosa, endemica tra le greggi sarde che potrebbe provocare effetti gravissimi sulle popolazioni dei mufloni. Infine si auspica che una più corretta cultura dei parchi in Sardegna possa favorire, con una vigilanza veterinaria permanente in sinergia con le guardie zoofile ed il corpo forestale, una più corretta tutela del benessere di questi animali selvatici mediante idonei e tempestivi interventi farmaco terapeutici con l’attuazione di efficaci misure di profilassi nei confronti di patologie ad elevata morbilità e/o mortalità che possono minacciare questa specie faunistica dell’isola. 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Dpto. de Patología Animal: Sanidad Animal.Facultad de Veterinaria.Universidad de León.Mail: [email protected] Diversos organismos internacionales tales como la Oficina Internacional de Epizootias (OIE), la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO), la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (UICN.) y la Organización Mundial de la Salud (0MS) son conscientes de la importancia de la fauna silvestre; puesto que su protección es el modo de preservar la salud de los animales domésticos y la del hombre; además de mantener un patrimonio y un equilibrio biológico natural. La Comunidad de Castilla y León aparece en el contexto de la Comunidad Europea como la región más extensa (94.193 Km²) y con el record europeo de biodiversidad continental, motivado por la presencia de factores favorables, tales como marco geográfico, relieve, clima, superficie, vegetación potencial, baja demografía humana y escasa utilización de recursos. Entre las 44 especies de animales que legalmente son consideradas como cinegéticas en Castilla y León, ocho son de caza mayor, siendo el corzo, rebeco, ciervo y cabra montés cuatro de ellas. Estos rumiantes desempeñan un papel fundamental al actuar como transformadores de la cubierta vegetal, servir de alimento a los predadores y representar su explotación turística y/o cigenética una valiosa fuente de ingresos en áreas marginales y de alta montaña. Actualmente, en los espacios naturales confluyen una serie de factores como el aislamiento geográfico, la ausencia o escasez de predadores, la reducción de recursos vegetales, las traslocaciones de animales y el aumento de densidad de algunas especies que determinan cambios drásticos en las relaciones animal/agente patógeno, y por ello se hace necesario, desde el punto de vista sanitario, la intervención humana. Estudios realizados en la última década confirman la hipótesis de que los parásitos pueden regular las poblaciones de hospedadores. Se admite que animales muy parasitados tienen menos capacidad para competir por territorios, lo que podría ocasionar que sea eliminado de su hábitat primario y tenga que alimentarse en zonas con escaso alimento o de peor calidad. Como consecuencia, los efectos de la infección se exacerban y el animal es más vulnerable a los depredadores. Por otra parte, la alteración de los hábitos del hospedador o su desaparición, obligaría al parásito a utilizar hospedadores nuevos, a los que no están adaptados, provocando una situación patogénica conflictiva. También, se sabe que la resistencia fisiológica del animal silvestre es mucho más elevada que la del doméstico, de forma que en las infecciones agudas, es habitual que la observación de los primeros síntomas sea la muerte. Del mismo modo que las infecciones crónicas son muy difíciles de detectar clínicamente, ya que estos animales débiles son fácil presa de los predadores de la zona. En el diagnóstico de las enfermedades en los animales silvestres, cualquier cambio en la conducta del animal puede ser tan útil o más que las técnicas habituales de 95 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES exploración. Son de gran ayuda las técnicas coprológicas pues permiten realizar el recuento e identificación de huevos; pero presentan problemas tales como, toma individual de muestra y poca correlación con el número de huevos y adultos presentes en el hospedador; así mismo, las dificultades de la toma de sangre en animales silvestres vivos hacen que el inmunodiagnóstico no sea muy factible. El carácter cinegético de estos rumiantes silvestres hace que la técnica de elección para el diagnóstico sea la necropsia, ya que permite recuperar, cuantificar e identificar dichos parásitos y así valorar el estado sanitario de estas poblaciones para poder actuar en consecuencia. El tratamiento farmacológico tiene en la fauna silvestre serias limitaciones como es fácil comprender, es tremendamente caro y complicado. Por ello, la puesta en práctica de programas de medidas preventivas es casi la única posibilidad de actuación y, el paso previo pasa ineludiblemente, por la identificación de las especies parásitas implicadas en los problemas patológicos presentes en el área geográfica, seguido del conocimiento de sus prevalencias y de los factores epidemiológicos más importantes relacionados con sus hospedadores y con el medio natural en que se encuentran. Hay que tener presente, el papel de la fauna silvestre como reservorio de infecciones para los animales domésticos pero; también hay que tener en cuenta el riesgo de transmisión de parásitos de los animales domésticos a los silvestres; así como el aspecto zoonósico de muchos de ellos. Los estudios efectuados demuestran la presencia en estos rumiantes silvestres desde los parásitos mas sencillos (los protozoos) hasta los mas complejos (los artropodos) pasando por los mas numerosos (los helmintos). Desde 1994 hasta la actualidad, diversos miembros del Departamento de Patología Animal: Sanidad Animal de la Facultad de Veterinaria de León, ayudados por los responsables de los Servicios Territoriales de Medio Ambiente de la Junta de Castilla y León encargados de la gestión de las 3 Reservas Regionales de caza de León (figura 1), estamos trabajando en problemas parasitarios que afectan a los rumiantes silvestres. Nuestro objetivo es saber qué especies parásitas albergan estos ungulados y con qué intensidad se presentan; de otra parte, comprobar la existencia de especies comunes a rumiantes silvestres y domésticos, con posibilidad de infecciones recíprocas cuando ambos utilicen pastos comunes; y finalmente, con estos datos queremos proporcionar información y asesoramiento útil para el desarrollo de una correcta gestión de estos espacios naturales, y de esta forma colaborar en el mantenimiento de las poblaciones sanas y estables. Figura 1.- Áreas de muestreo 96 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Los primeros estudios realizados al respecto en la Cátedra de parasitología de la Facultad de Veterinaria de León datan de 1977-1979 con el estudio parasitológico de 42 rebecos procedentes del entonces Coto Nacional de Caza de Reres (Asturias) y los resultados se expusieron en el II Congreso Nacional de Parasitología celebrado en León en Octubre de 1979. El 85,71% de los animales se hallaron parasitados; siendo los vermes gastrointestinales los parásitos más frecuentemente observados. Posteriormente en 1983/84, se muestrearon 65 rebecos procedentes de la Reservas Nacionales de Riaño, Mampodre y Reres; cuyos resultados se presentaron en las primeras jornadas sobre la Montaña de Riaño, (Riaño, 1984) y en la IV Reunión Anual de la Asociación de Parasitólogos Españoles, (Madrid, 1984). El 100% de los rebecos se hallaron parasitados en mayor o menor cuantía por vermes gastrointestinales y pulmonares. Ante la abundante presencia de vermes pulmonares de ciclo indirecto, (Protostrongylidae) se pensó en determinar cual era el hospedador intermediario idóneo, observándose que Cochlicella barbara y Cepaea nemoralis eran experimentalmente los moluscos más adecuados para la evolución de las larvas de protostrongylidos. Trabajos presentados en el IV Congreso Nacional de Parasitología, (Tenerife, 1985) y en la II Conferencia Mediterránea de Parasitología (Jerusalem, 1987) y en la XII Conferencia Mundial para el Avance de la Parasitología Veterinaria (Berlín, 1989). Desde 1994 hasta la actualidad, se realiza el seguimiento parasitologíco en rebecos, corzos y ciervos de las tres Reservas Regionales de caza del norte de León, y en este sentido se viene observado la presencia casi constante de protozoos del género Eimeria spp (prevalencias del 25-100%).,y Sarcocystis spp.(60-100%). La infección intestinal producida por protozoos del género Eimeria es propio de explotaciones intensivas y descuidadas, por ello enlos animales silvestres tienen menos importancia que en animales domésticos, sin embargo la superpoblación puede conducir a la aparición de brotes con mortalidad alta entre los jóvenes. Los sarcosporidios, protozoos presentes en tejido muscular estriado (corazón, diafragma, esófago etc.) en forma de microquistes, son fases intermedias cuyo hospedador definitivo son carnívoros domésticos, silvestres. Tienen en los rumiantes silvestres gran representación, se le atribuye un poder patógeno relacionado con la disminución de la capacidad de huida, sobre todo en rebeco. Trabajos incluidos en el IV Congreso Ibérico de Parasitología (Santiago de Compostela,1995). I Congreso Internacional de Medio Ambiente y Veterinaria (Caceres,1997). IX European Multicolloquium of Parasitology (Valencia, 2004) y IX Congreso Ibérico de Parasitología (Coimbra, 2005). Muchas especies de helmintos son compartidos por los animales domésticos y silvestres, pero en estos últimos el grado de infección es generalmente bajo y los riesgos de brotes excepcionales; su importancia radica en su condición de reservorios de muchos de estos parásitos y en que algunos pueden ser zoonosis. Normalmente, en los ungulados silvestres es escasa la presencia de trematodos tales como Fasciola sp. y Dicrocoelium sp. con prevalencias que varian entre el 3 y 15%; provocan parasitosis crónicas que se traducen en un mal estado general, los animales se desplazan con dificultad, la muda del pelo se altera y la cuerna de los machos es de menor calidad. La profilaxis se hace imposible en animales en libertad; se basaría en el saneado de zonas pantanosas o en la eliminación de caracoles y/o hormigas en la zona; pero, ello provocaría grandes alteraciones del medio. 97 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Igualmente, en los rumiantes silvestres se observa la escasa presencia de cestodos (del 1-10%) tanto en sus fases adultas (Moniezia sp.) como en sus formas larvarias (C. tenuicollis). El diagnóstico de las cestodosis larvarias sólamente es posible mediante necropsia y se podría tener una idea de su prevalencia al hacer un seguimiento coprológico de los carnívoros de la zona; por ser estos los hospedadores definitivos. El control se realizará evitando que los carnívoros ingieran vísceras de herbívoros muertos; mediante la retirada, por parte de guardas y cazadores, de los rumiantes abatidos y/o hallados muertos, así como, con la desparasitación periódica de los perros de caza. En la Cordillera Cantábrica, prácticamente todos los ciervos, corzos y rebecos adultos pueden albergar una treintena de nematodos gastroentéricos y entre ellos hay especies de tricostrongílidos específicas de los silvestres, como es el caso de Spiculopteragia spiculoptera en rebeco; Nematodirus europeanus en corzos y Spiculopreragia böhmi en ciervo; asi como especies comunes como Ostertagia spp. y Trichostrongylus spp. (Citas presentadas en el VII Internacional Helminthology Symposium (Kosice, 1995). Las infecciones por nematodos del trato gastrointestinal se producen con relativa facilidad, ya que su ciclo biológico es directo y que existe cierto grado de gregarismo entre los rumiantes silvestres. Puesto que en la mayoría de los casos se presentan infecciones multiespecificas, la acción patógena mancomunada de estos nematodos tiene un efecto negativo sobre las reservas energéticas; los animales afectados están abatidos, se desplazan con dificultad y se aislan de la manada, presentan trastornos diarréicos, retraso en el crecimiento de la cuerna y pérdida considerable de vitalidad, lo que puede repercutir desfavorablemente en la lucha por la supervivencia a que están sometidos estos animales en los ámbitos naturales. Con respecto a los nematodos pulmonares, hallamos prevalencias variables según el hospedador del 8-35% para Dictyocaulus spp., es de destacar la presencia de Dictyocaulus noerneri (=D. eckerti) en corzos. La presencia de los protostrongilidos es algo mas elevada (15-65%), principalmente en rebecos y corzo Varestrongylus sp. y Muellerius sp.; y en el ciervo Elaphostrongylus cervi. Datos expuestos en el VII European Multicolloquium of Parasitology (Parma,1996) y VII Congreso Ibérico de Parasitología (Oporto, 2001). La presencia de estos parásitos supone procesos de naturaleza inflamatoria que provocan pequeñas áreas de neumonía lobular que pueden llegar a mermar la capacidad de ventilación pulmonar; además, de ser una puerta de entrada de bacterias y virus que agravarían el proceso (Pasteurella spp., Yersinia spp., tuberculosis, fiebre catarral maligna, etc..). Otro nematodo hallado en el 100% de los ciervos y que presenta una localización subcutánea es Onchocerca spp. que se caracteriza por la producción de nódulos fibrosos en el tejido subcutáneo (oncocercomas). Seguramente, los artrópodos son los principales protagonistas entre los agentes parasitarios causantes de procesos clínicos en los rumiantes silvestres. Además de la infección por piojos, moscas productoras de miasis subcutáneas (Hypoderma spp.), éstridos nasales (Oestrus sp.) y diversas especies de garrapatas, tienen especial importancia en el norte de Castilla y León las sarnas, principalmente la sarna sarcóptica (Sarcoptes scabiei) en rebeco y ahora en cabra montés. En los pequeños rumiantes de la Cordillera Cantábrica se pueden encontrar dípteros hemátofagos, conocidos como mosca araña (Lipoptena spp.) desde el 1% en 98 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES rebecos hasta el 40% en corzos; son infestaciones normalmente acompañadas de otros ectoparásitos, en su mayoría, garrapatas. Datos aportados en el VI Congreso Ibérico de Parasitología (Córdoba, 1999). La invasión de la cavidad nasal y retrofaríngea por larvas de insectos (Oestrus sp.) es una de las parasitosis más frecuentes en el ciervo. En casos graves, por infestación masiva sobre todo en primavera y verano, la presencia de larvas de estos parásitos provoca inflamación de la garganta dificultando la ingestión de alimentos y como consecuencia el animal adelgaza; asimismo, la inflamación de la glotis, pueden dificultar el paso del aire, los animales permanecen inmóviles, en posición ortopneica con las extremidades anteriores abiertas, llegando a la muerte por asfixia. Todos los rumiantes silvestres pueden ser portadores de garrapatas; los Ixódidos o garrapatas duras son las más frecuentes y su tasa de infestación depende de la localización geográfica. Nuestros estudios sobre ectoparásitos de los rumiantes silvestres en la Cordillera Cantábrica, indican la presencia casi constante de infestaciones mixtas por Ixódidos; siendo Ixodes ricinus y Haemaphysalis hispanica las más frecuentes en corzos e I. ricinus y Dermacentor marginatus en rebecos. Inicialmente su acción patógena es hematófaga y neurotóxica, pero su importacia radica en ser vector de enfermedades de diferente etiología (Lyme, piroplasmosis, erlichias, etc..). Datos presentados en VI Congreso Ibérico de Parasitología (Córdoba, 1999) Sin duda una de las principales preocupaciones para Medio Ambiente en la Junta de Castilla y León es la presencia de la sarna sarcóptica en estos ungulados. En mayo de 1993 surgió un brote de sarna en rebecos de la Reserva de Caza de Aller y de Caso en la Cordillera Cantábrica vertiente asturiana. El brote de sarna sarcóptica fue detectado en las inmediaciones del Pico Torres (Asturias), en una superficie de 10 km2. En la primavera de 1994 se detectaron nuevos rebecos afectados, ocupando una superficie de 50 km2, además surgió otro brote en la Reserva de Piloña (Asturias), unos 20 Km en línea recta al norte del sitio inicial. El origen de la sarna en estos animales se encuentra, según todos los indicios, en la presencia en la zona de rebaños incontrolados de cabras con sarna sarcóptica. (fig 2 y 3, ´acaro de la sarna obtenido por raspado cutáneo y rebeco con lesiones en el cuello). Fig 2 Adultos/ninfas/larvas/huevos Fig 3 En 1996 estos dos brotes de sarna siguieron extendiéndose hacia el Parque de Covadonga (asturias) y la Reserva de Mampodre (León); en 1999 se detectaron rebecos con sarna en la Reserva Regional de caza de Riaño (León) y en el 2000 ya estaba presente en Picos de Europa. Actualmente, se ha detectado ya en Cantabría y en cabra montes de la 99 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Reserva Regional de Riaño. (Fig.4). La superficie afectada llega a las 15.000 Has. De los rebecos abatidos son mas machos que las hembras, con edad media de 5-6 años y con incidencia mayor en primavera. Fig 4.- Superficie de avance de la sarna sarcóptica en el rebeco de la Cordillera Cantabrica Creemos importante resaltar tres aspectos que inciden directamente en la evolución de esta epizootia: el aumento en los últimos tiempos de las poblaciones de ungulados silvestres; las subvenciones a la ganadería de montaña, premiando el número de cabezas existentes sin considerar su estado sanitario; y la falta de control sanitario en los animales domésticos. Sin embargo, la cuarentena en animales de nueva introducción, el control de cabras y ovejas de la zona, el incremento del aporte alimenticio y, si es posible, el tratamiento con lactonas macrocíclicas; así como la eliminación de animales muy parasitados podrán paliar el problema de sarna sarcóptica en estas poblaciones silvestres. Al menos, con el plan de actuación seguido en nuestra comunidad, se estan observando zonas en frenca recuperación. PLAN DE ACTUACIONES FRENTE A LA SARNA DE LOS REBECOS EN CASTILLA Y LEÓN 1.-Vigilancia intensa de las zonas afectadas y sobre todo en el frente de avance y caza selectiva de animales afectados. 2.-Seguir con el Plan ordinario de caza y plan selectivo sobre las hembras para mantener el equilibrio sex-ratio 3.-Aislamiento de poblaciones y tratamientos experimentales 4.-Control del ganado doméstico, diagnostico y tratamiento 5.-Solicitud declaración obligatoria de la sarna sarcopticas en pequeños rumiantes domesticos 6.-Comunicación entre guarderías de las 3 Comunidades Autónomas implicadasComo conclusión final, habría que insistir en la necesidad de realizar mayor número de estudios para conocer la prevalencia de los procesos patológicos en los animales silvestres y su epidemiológia, que son la base para el establecimiento de programas de control y profilaxis; 100 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES así como, la colaboración de la administración como gestora de las Reservas de Caza y Parques Naturales y el impulso de la investigación en este área y el aporte de conocimientos por parte de los profesionales de la Sanidad, entre los que el veterinario puede y debe jugar un papel importante. 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Centro de Investigaciones Agrarias de Mabegondo, Apdo10,15080 A Coruña, Spain ABSTRACT wenty five calves of the Rubia Gallega (RG) breed and their mothers were used to study the effect of maternal suckling and the calving season on nutritional meat value in RG calves. 24h postmortem fatty acid profiles were determined by gas chromatography in L. thoracis. Data was analyzed using ANOVA (SAS). Calves that were suckling until slaughtering (Suprema) opposite to calves that were weaned 133d antemortem (Normal) had in both autumn and winter calvings higher levels (mg/100g muscle) in satured fatty acid, monounsaturated fatty acid and total fatty acid as well as CLA and α-linolenic, although differences were only significant in winter calvings(340 vs. 265, p<0.05 SFA), (243 vs. 189, p<0.05), ( 616 vs. 488, p<0,05. Total) (1.06 vs. 0.63, p<0.01, CLA) y (4.99 vs. 3.39, p<0.001, linolenic). In winter calving “Normal” veal had a n-6/n-3 index higher than meat from “Suprema” calves (1.26 vs. 2.10, p<0.001). The calving season affected fatty acid contents with higher values in winter calvings than autum calvings. To conclude, there are nutritional differences between “Normal” veal and “Suprema” veal, in autumn and winter. INTRODUCCIÓN Por motivos dietéticos y de salud los consumidores están cada día mas interesados en la calidad nutritiva de los alimentos, especialmente en la cantidad de grasa y en su composición en ácidos grasos por su incidencia en los problemas cardiovasculares y en la obesidad, en este sentido es importante considerar la relación ácidos grasos poliinsaturados/saturados PUFA/SFA. Se estiman como alimentos bajos en grasa los que contienen menos del 5% (Food Advisory Comitee, 1990) y como índices favorables para prevenir problemas cardiovasculares (Department of health, 1994) los de 0.45 como mínimo en el de PUFA/SFA y 4.0 como máximo en el n-6/n-3. Así mismo es interesante considerar el ácido linoléico conjugado (CLAs) por que previene procesos cancerígenos y de obesidad, por su efecto beneficioso en el sistema inmunológico (IP y col., 1994; Wong y cl., 1997) y porque es más abundante en la grasa animal que vegetal, especialmente en la de los rumiantes (0.65% frente al 0.12% del cerdo, Fritsch y Steinhart, 1998). La cantidad y composición de la grasa de la carne esta afectada por diferentes factores como la raza, el manejo, la alimentación (Boccard y Bordes, 1986; Renerre 1982; Varela 2002; Huerta-Leidez y col., 1993; Malau-Aduli y col., 1998). El ternero tradicional de Galicia se produce con la raza Rubia Gallega y se sacrifica alrededor de 8 meses sin destetar, aun cuando por razones de producción de leche de la madre ligadas a su potencial genético y a la alimentación pueden llegar al sacrificio destetados de forma natural. En los sistemas de pastoreo la alimentación esta muy ligada a la época de parto de tal forma que se ha comprobado que en las condiciones de Galicia con partos de otoño se puede llegar a un destete muy tardío mientras que en los de invierno-primavera el agostamiento temprano de 103 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES la hierba reduce la producción de leche llegándose al destete natural a edades tempranas del ternero, dependiendo de las condiciones climáticas, la fecha de nacimiento y el potencial de producción de leche de la vaca. Por otra parte Monserrat y col., (1999) han comprobado que para acabar adecuadamente el ternero tradicional gallego producido en pastoreo es necesario llevarlo 2 ó 3 meses a cebadero siendo muy útil para el manejo el destetarlo previamente. Cuando el ternero se destete dos meses antes del sacrificio no se encuentran diferencias con el sacrificado sin destetar, en la calidad organoléptica y nutritiva de la carne, sin embargo Moreno et al (2006) comprueba que el consumo de leche afecta a la composición de ácidos grasos existiendo diferencias entre los terneros sacrificados sin destetar y los destetados 2 meses antes del sacrificio. Parece por tanto conveniente estudiar el efecto del consumo de leche en condiciones de partos de otoño y primavera asociado al destete por razones de manejo. MATERIAL Y MÉTODOS Para este estudio se utilizaron 25 terneros de la raza Rubia Gallega, de los cuales 13 nacieron en otoño y 12 nacieron en invierno, de los nacidos en otoño 7 fueron destetados 114d antes del sacrificio y 6 continuaron mamando hasta ir al matadero, el grupo de terneros nacidos en invierno estaba compuesto por 6 que fueron destetados 151d antes del sacrificio y 6 que no se destetaron. Todos los terneros se criaron con sus madres en el pasto desde su nacimiento hasta su entrada en cebadero aproximadamente cuatro meses y medio antes del sacrificio, durante este periodo pastaron siguiendo un sistema de rotación de parcelas, ingirieron leche de sus madres y concentrado administrado en comederos selectivos a los cuales las vacas no tenían acceso. Las vacas, además del pasto, fueron alimentadas con silo de hierba administrado directamente en las parcelas. Una vez en el cebadero los terneros se alimentaron de pienso y heno y el grupo de animales no destetados tomaron además leche de sus madres. Los animales se pesaron al nacer, al entrar en el cebadero, la semana de entrar y el día antes de ir al matadero. Se sacrificaron en un matadero local siguiendo un procedimiento convencional. Las canales permanecieron en el matadero y 24h después del sacrificio se recogieron muestras de lomo de la 5ª a la 10ª costilla. En el laboratorio se aisló el Longissimus thoracis y a partir de este músculo se extrajo la grasa mediante el método Bligh and Dyer (1959), a continuación la grasa extraída se metiló utilizando el método Morrison and Smith (1964) y finalmente se determinó el perfil de ácidos grasos utilizando un cromatógrafo de gases. Los datos fueron analizados mediante el procedimiento de análisis de varianza del paquete estadístico SAS (SAS,1999). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los terneros de partos de invierno presentaron mayor contenido (mg/100g músculo) de ácidos grasos totales, ácidos grasos saturados y monoinsaturados, aunque las diferencias sólo fueron significativas para los animales que no fueron destetados (473 vs. 617, p<0.01), (264 vs. 340, p<0.01) y 243 vs. 176, p<0.01), respectivamente (Tabla 1). En invierno, los ácidos grasos totales así como los SFA y los MUFA fueron significativamente mayores en los músculos de los animales que mamaron hasta el sacrificio (617 vs. 488, p<0.05) , (341 vs. 265, p<0.5) y (243 vs. 190, p<0.05). En los animales nacidos en otoño el contenido de 104 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES SFA, MUFA, PUFA y ácidos grasos totales fue mayor en el lomo de los animales que mamaron hasta el sacrificio pero las diferencias no fueron significativas, únicamente se observó una tendencia en los ácidos grasos saturados (264.4 vs. 225.9, p<0.1). Tabla 1.- Contenido en ácidos grasos del lomo: efecto época de partos y amamantamiento PARTOS OTOÑO PARTOS INVIERNO Sig Acidos PARTOS grasos mg/100g No Destet. Sig No dest. Destet Sign N d D músc. dest. SFA 264.4 225.9 + 340.7 265.2 * ** NS MUFA 176.4 160.2 NS 243.1 189.6 * ** NS PUFA 32.2 33.3 NS 32.7 33.9 NS NS NS Total 473,1 419.4 NS 616.6 488.8 * ** NS ω3 C1833 C2033 C2053 C2263 13.0 4.42 1.13 3.26 4.19 11.6 3.32 1.38 2.96 3.97 NS * NS NS NS 14.1 4.99 1.02 3.68 4.37 10.7 3.39 1.08 2.79 3.47 * *** NS NS + NS NS NS NS NS NS NS * NS NS ω6 18.2 21.0 NS 17.6 Cla911 1.03 0.60 NS 1.06 p<0.1 =+; p<0.05=*; p<0.01=**; p<0.001=*** 22.5 0.63 * ** NS NS NS NS El contenido total de ácidos grasos poliinsaturados fue prácticamente igual para todos los grupos de animales. Sin embargo se encontraron diferencias significativas en los contenidos de varios de ellos por separado. El contenido de ω3 fue significativamente mayor en los animales nacidos en invierno que mamaron hasta el sacrificio respecto a los que fueron destetados (14.1 vs 10.7, p<0.05). Por el contrario los niveles de ω6 (Tabla 1) y por lo tanto el índice ω6 / ω3 (Tabla 2) fueron mayores en los animales destetados al entrar en cebadero, aproximadamente dos meses antes del sacrificio, de nuevo los datos de las muestras procedentes de partos de otoño no fueron significativas pero si lo fueron las de los partos de invierno (18 vs 23, p<0.05) y (1.26 vs. 2.10, p<0.001). En los animales que mamaron hasta el sacrificio se encontraron, (Tabla 1) niveles superiores de Cla 9:11 (1.06 vs. 0.63, p<0.01), de ácido α-linolénico (5 vs. 3.4, p<0.001) y de ácido docosahexanoico (4.37 vs. 3.47, p<0.1). 105 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Tabla 2.-Porcentaje de ácidos grasos e índices nutricionales del lomo: efecto de la época de partos y del destete. PARTOS OTOÑO PARTOS INVIERNO % sobre total de ácidos No Destet. Sig No Destet Sign grasos dest. dest. %SFA 55.9 53.9 + 55.2 54.0 NS %MUFA 37.2 37.9 NS 39.4 38.8 NS %PUFA 6.8 8.1 NS 5.4 7.2 + Índices PUFA/SFA 0.12 0.15 + 0.09 0.13 + ω6/ω3 1.42 1.82 NS 1.26 2.10 *** p<0.1 =+; p<0.05=*; p<0.01=**; p<0.001=*** Sig PARTOS N dest Dest. NS + + NS NS NS NS NS NS NS SFA: saturated fatty acids MUFA: monounsaturated fatty acids PUFA: polyunsaturated fatty acids ω3: Suma de C18:3n-3, C20:3n-3, C20:5, C22:5 y C22:6 ω6: Suma de C18:2, C18:3n-6, C20:2, C20:3n-6, C20:4 y C22:2 Cla911: Conjugated linoleic acid cis9, trans11 C1833: C18:3(n-3) : α-Linolenic acid C2033: C20:3(n-3): Eicosatrienoic acid C2053: C20:5(n-3): Eicosapentaenoic acid C2263: C20:6(n-3): Docosadienoic acid Tabla 3.- Efecto de la época de partos y del destete en el peso al sacrificio, el peso de la canal y la ganancia media diaria. PESOS Peso sacrificio Gmd total Peso canal SUPREMA OTOÑO INVIERNO Sig NORMAL OTOÑO Sig AMAMANTAMIENTO INVIERNO Sign OTOÑO INVIERNO 379.0 384.0 NS 337.1 399.6 ** ** NS 1404.5 1420.0 NS 1244.2 1495.1 *** ** NS 198.1 202.5 NS 168.5 217.8 *** *** NS p<0.1 =+; p<0.05=*; p<0.01=**; p<0.001=*** Los animales de partos de otoño pesaron al nacer 44.84kg y 163.64kg al entrar en el cebadero y los de partos de invierno 45.13kg al nacer y 142.74kg al entrar en cebadero. Los terneros nacidos en otoño entraron en cebadero con 117.87d de edad y los nacidos en invierno con 84.9d. Los terneros que estuvieron mamando hasta el sacrificio, permanecieron en el cebadero entre 122 y 154d mientras que los que fueron destetados a su entrada en el cebadero 106 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES permanecieron en él entre 114 y 85 d. Todos los terneros fueron sacrificados con una edad aproximada de 237d. Los animales de partos de invierno presentaron, (Tabla 3), un peso al sacrificio superior que los terneros nacidos en otoño, aunque las diferencias solo fueron significativas en los animales destetados al entrar en cebadero (337 vs. 399, p<0.01) La ganancia media diaria fue también mayor en los terneros nacidos en invierno frente a los nacidos en otoño pero las diferencias sólo fueron significativas en los animales destetados antes del sacrificio (1244 vs. 1495, p<0.001). En cuanto a los animales nacidos en otoño tanto el peso al sacrificio como la ganancia media diaria y el peso de la canal fueron significativamente mayores en los terneros que estuvieron mamando hasta el sacrificio (379 vs. 337, p<0.01), (1404 vs. 1244.29, p<0.01) y (198 vs. 168, p<0.001). Se puede concluir que los terneros nacidos en invierno y destetados antes del sacrificio mostraron niveles mas elevados de CLA, MUFA, SFA y ácidos grasos totales. Aunque no hubo diferencias significativas entre el efecto destete y época de partos para el contenido en PUFA, los terneros nacidos en invierno destetados y sin destetar mostraron contenidos mayores de ω3 y ω6 PUFA respectivamente. BIBLIOGRAFÍA Bligh, E.G., & Dyer, W.J. (1959). A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemestry Physiology, 37,1911-1912. Boccard, R. y Bordes, P (1959). Característiques qualitatives el tecnologiques des viandes bovines: Influence des facteurs de poduction. Production de viande bovine. Edit. Micol. D. INRA. París, 61-84 Health department (1994). Nutricional Aspects of Cardiovascular Disease. Report on Health and Social Subjects no.46. Londoon: H.M. Stationary Office. Englis Food Advisory Comitee (1990). Report on review of food laelling and advertising. Her Majesty´d Stationery Office, London. Huerta. Leindez, N.; Ríos, G. (1993). La castración del bovino a diferentes estadios de su crecimiento. 1. 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Xunta de galicia PALABRAS CLAVE: ensilado pradera, ensilado maíz, ácidos grasos. ABSTRACT The effect of the slaughter weight (375, 410, and 450 kg), in young bulls fed with silage (maize or grass), in some characteristics of the carcass and the meat, as well as outline of the fat acids of the meat was studied. The increase of the slaughter weight improved the dressing percentage, carcass conformation, carcass fattening, and meat marbling, without considerably affecting the tenderness, water retention capacity, or the colour of the meat. The total of the saturated fatty acids (SFA), monounsaturated fatty acids (MUFA), polyunsaturated fatty acids (PUFA), ω-6 fatty acids, ω-3 fatty acids, either the PUFA/SFA or ω-6/ω-3 relationships were modified by the increase of the slaughter weight. The animals fed with maize silage have better dressing percentage, better carcass conformation, more kidney fat, and the meat a little more light, than the ones fed with grass silage, where there are more water losses. The kind of silage did not considerably affect any of the nutritional index (SFA, MUFA, PUFA, ω-6, ω-3). RESUMEN Se estudia el efecto del peso de sacrificio (375, 410 y 450 kg) en terneros alimentados a base de ensilado de maíz o pradera en algunas características de la canal y la carne así como en el perfil de los ácidos grasos de la carne. El incremento del peso de sacrificio mejora el rendimiento, la conformación, el engrasamiento canal y el veteado de la carne, sin que afecte de modo importante a la terneza, capacidad de retención de agua o color de la carne. El total de ácidos grasos saturados (AGS), monoinsaturados (AGM), poliinsaturados (AGP), ω-6, ω-3, ni las relaciones AGP/AGS o ω-6/ω-3 se ven modificadas por el aumento del peso de sacrificio. Los animales alimentados con ensilado de maíz tienen mejor rendimiento, conformación, mas grasa de riñonada y carne ligeramente más clara, que los alimentados con ensilado de pradera, en los que las perdidas de agua en la carne por presión y cocción son mayores. El tipo de ensilado no afectó significativamente a ninguno de los índices nutricionales determinados (AGS, AGM, AGP, ω-6, ω-3). 109 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES INTRODUCCIÓN El objetivo es la producción de canales, que dentro de su condición de procedentes de forrajes, se adapten a la demanda del mercado. Al aumentar la ingestión de energía la carne y el hueso disminuyen y la grasa aumenta, resultando carne con savor más agradable. En general, se puede decir que el aumento del peso de sacrificio disminuye la relación músculo/hueso y aumenta la grasa. Dado que los forrajes no son iguales (el ensilado de maíz es más energético que el de pradera), las canales procedentes de distintos forrajes no tienen por qué ser iguales. El peso del animal y la alimentación afectan a la grasa intramuscular, subcutánea y al perfil de los ácidos grasos que la componen. El incremento de la grasa se caracteriza por el aumento del porcentaje de la fracción de triacilglicéridos (ricos en AGS y AGM) y por la disminución, leve, del porcentaje relativo a las fracciones de fosfolípidos (ricos en AGP) y colesterol; situación que determina cambios en los ácidos grasos totales. MATERIAL Y METODOS El diseño experimental fue: 2 ensilados (maíz y pradera) x 3 pesos de sacrificio (375, 410 y 450 kg), con 30 animales por tratamiento (10 de cada raza Rubia Gallega, Holstein-Friesian o cruce de ambas). La alimentación fue ensilado y 1,5 o 2 kg de pienso, según fuese de maíz o pradera. Los piensos de cebada y soja, se formularon para que las ingestiones resultasen del 14 o 12% de proteina, según que los animales fuesen de más o menos de 270 kg. Los ensilados pradera o maíz, bien conservados y fermentados, tenian: 64,72% y 70,02% de digestibilidad de la materia organica, 9,21 y 10,86 MJ de energia metabolizable/kg MS y 11,88 y 7,79% de proteina. A las 48 horas la media canal izquierda se cuarteo (entre la 5ª y 6ª costilla) y despiezó, clasificandola por conformación (E+=15,.....P-=1) y engrasamiento (1=magro, 9=muy graso). Las determinaciones en el L. thoracis (de la 6ª a la 10ª costilla), fueron: pH, coordenadas cromáticas: L* (luminosidad), a* (rojo) y b* (amarillo), dureza (con WarnerBratzler, muestras de 1x1x5 cm cocidas 45 minutos a 75ºC), consistencia (1=firme seca, 3=blanda húmeda) y veteado (1=trazas, 5=infiltrada). Las pérdidas por goteo (Offer y Knight, 1982), por presión (Honikel, 1997) y por cocción (Hamm, 1977) se expresan en % sobre la muestra fresca; la composición química según normas oficiales. En papel de acetato se dibujaron las áreas del L. thoracis de la 6ª y 10ª, midiendolas en cm2, y los diametros máximos A y B. En el L. thoraci, se determinaron los ácidos grasos saturados (AGS), suma de los ácidos: C8:0, C10:0, C12:0, C14:0, C15:0, C16:0, C17:0, C18:0, C20:0, C22:0, C23:0 y C24:0; los monoinsaturados (AGM): C14:1(n-5), C:15:1, C16:1(n7), C17:1, C18:1(n-9t), C18:1(n-9c), C20:1(n-9), C22:1(n-9) y C24:1(n-9); los poliinsaturados (AGP): C18:2(n-6t), C18:2(n-6c), C18:3(n-3), C18:3(n-6), C20:2(n-6), C20:3(n-3), C20:3(n-6), C20:4(n-6), C20:5(n-3), C22:2(n-6) y C22:6(n-3); los -3: C18:3(n-3), C20:3(n-3), C20:5(n-3) y C22:6(n-3); y -6: C18:2(n-6t), C18:2(n-6c), C18:3(n-6), C20:2(n-6), C22:2(n-6), C20:3(n-6) y C20:4(n-6); y las relaciones AGP/AGS y -6/-3. 110 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES RESULTADOS Y DISCUSIÓN El efecto del aumento del peso de sacrificio en las ganancias de peso es más acusado con ensilado de pradera (127 y 82 g/d de peso vivo y canal) que con el de maíz (87 y 60 g/d). Los alimentados con maíz crecieron más (1223 y 689 g/d de peso vivo y canal) que los alimentados con ensilado de pradera (1062 y 575 g/d) (Tabla I). Tabla I.- Ingestión (kg MS/cabeza y día), peso vivo inicial y final (kg), ganancias de peso (g/día) e índices de conversión de la materia seca (MS). Ingestión Ensilado Pradera Peso sacrificio 375 ensilado 410 450 Peso vivo Ganancia peso Ind. conv. MS vivo canal p. vivo 998ª 533ª 6.05 p. canal 11.30ª 1062b 575ªc 5.99 11.04ªb 1125c 615cd 5.74 10.44b 370.04ª 1179cd 659de 6.28 11.24ª b de 687ef 6.25 11.13ª e f 6.19 10.90ªb total inicial 4.257ª 6.037ª 200.62 369.72ª 4.589ªb 6.369ªb 201.10 409.20b 4.675b 6.455b 202.75 450.88c 375 6.072c 7.407c 209.93 410 cd cd 209.77 6.311 7.646 450 6.504 d 7.839 et 0.186 p< 0.01 Pradera d final 409.80 c 1223 212.82 449.80 1266 719 0.186 6.062 2.082 21.224 16.692 0.167 0.274 0.01 NS 0.001 0.001 0.001 NS 0.001 4.507 6.287 201.49 409.93 1062 575 5.92 10.93 Maíz 6.295 7.631 210.84 410.00 1223 689 6.24 11.07 et 0.081 0.081 1.734 1.240 80964 5.913 0.101 0.167 p< 0.001 0.001 0.001 NS 0.001 0.001 0.001 0.001 El incremento del peso de sacrificio mejoró el rendimiento (en 0,95 y 1,05 % con ensilados de pradera y maíz), la conformación (en 0,97 y 0,87 puntos, con pradera o maíz), el engrasamiento (en 0,70 y 0,56 puntos, en el mismo orden) y la grasa de riñonada (en 0,18 y 0,24 puntos) (Tabla II). 111 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Tabla II.- Peso canal (kg), rendimiento (%), clasificación canal, grasa de riñonada (%) y % de delantero, trasero y pistola en la canal. Peso Peso sacrificio Ensilado canal Pradera 375 410 Rendi- Clasific. canal Grasa % en la canal de miento confor. engras. riñona. delante trasero pistola 62.01 49.38ªb 61.95 49.20ªb 1.30ab 38.08 61.92 49.02ª 1.27ab 38.00 62.00 49.63b 4.03ªc 1.33bc 38.18 61.82 49.34ªb 4.43bc 1.51c 38.38 61.62 49.02ª 0.169 0.005 0.067 0.194 0.001 NS 0.194 NS 0.199 0.05 192.62 51.96ª 5.90ª 3.93ª 1.12ª 37.99 ª 214.56 52.43ª 6.27ªb 4.30ªb 1.16ab 38.05 b 450 238.58 52.91ab 6.87bc 4.63b c Maíz 375 194.99 52.65ª 6.63abc 3.87ª d 410 218.03 53.22ab 7.27c b 450 241.60 53.70b 7.50c c et p< 1.819 0.001 0.366 0.319 0.001 0.001 Pradera Maíz 215.26 52.43 6.34 218.21 53.19 7.13 4.29 4.11 1.20 1.37 38.04 38.19 61.96 61.81 49.20 49.33 et p< 0.930 0.05 0.094 NS 0.031 0.109 0.001 NS 0.110 NS 0.113 NS 0.169 0.149 0.005 0.001 Los alimentados con ensilado de maíz tienen mejor rendimiento (53.19 vs 52.43%), conformación (7.13 vs 6,34) y menos engrasamiento canal (4,11 vs 4,29), pero más grasa de riñonada (1.37 vs 1,20%). Es reconocido que cuando aumenta la calidad de la dieta lo hace el rendimiento y la conformación; y el ensilado de maíz es mas energético que el de pradera. El aumento del peso de sacrificio no afectó a las proporciónes de delantero o trasero, pero sí a la pistola, que disminuyó ligeramente. Aunque parece que la proporción de carne y hueso en la canal disminuye con el peso de sacrificio, no lo hace significativamente. Sin embargo, la grasa aumenta (Tabla III), y lo hace con los dos tipos de ensilado, aunque algo más en el caso del maíz (0,96) que en el de pradera (0,87 %). 112 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Tabla III.- Composición de la canal y áreas de longissimus thoraci al nivel de la 6ª y 10ª costillas. % en la canal de Área L. % en la canal de carne thoraci Ensilado Peso carne hueso grasa 10ª 6ª extra 1ª 2ª 3ª sacrificio Pradera 375 74.25 21.38ª 4.37ª 62.57ª 28.70ª 10.39 38.86 6.83 18.02 410 73.94 21.15ª 4.91bd 64.99a 29.79a 10.36 38.68 6.74 18.01 b b 450 73.83 20.93ª 5.24 bc c Maíz 375 c b 67.47 32.73b 10.36 38.59 6.71 18.02 c 74.80 20.67ª 4.52ªd 62.57ª 28.62ª 10.73 38.96 6.95 18.00 c 410 74.60 20.40b 5.03bc 66.83b 31.26b 10.77 38.99 6.89 c 450 et p< Pradera Maíz et p< 74.25 0.370 NS 74.01 74.55 0.154 0.05 20.27c 0.310 0.05 21.15 20.44 0.114 0.001 5.48c 0.163 0.001 4.84 5.01 0.095 NS c c 70.10c 1.417 0.001 65.01 66.50 0.584 0.1 33.57b 0.889 0.001 30.41 31.15 0.477 NS 10.45 0.154 NS 10.37 10.65 0.088 0.1 38.63 0.267 NS 38.71 38.86 0.136 NS 6.92 0.095 0.1 6.76 6.92 0.052 0.05 17.87 18.08 0.162 NS 18.01 17.98 0.095 NS La cantidad de carne o hueso aumenta o disminuye ligeramente al alimentar con ensilado de maíz. El aumento de la carne se tradujo en un incremento de la carne extra (10,65 vs 10,37%) (sólo p<0,1) y de 2ª (6,92 vs 6,76%). Zea (1978), con ganado gallego sacrificado a 400 kg, no obtuvo respuestas a dietas que variaron de 10,2 a 11,9 MJ de EM/ kg de MS. En uno de los tres experimentos se observó una ligera disminución en la proporción de carne, mientras que en los otros se observó un pequeño aumento. Kousgaard (1979), encontró que el porcentaje de carne aumenta con el nivel de nutrición, pero no observó diferencias hasta niveles próximos al 85% de la ingestión energética máxima, concluyendo que el nivel energético tiene poca influencia en la proporción de carne en la canal. El peso de sacrificio no afectó a las pérdidas de agua (Tabla IV). Las pérdidas por presión o cocción fueron más altas en los animales alimentados con ensilado de pradera. Aunque para Wismer-Pedersen (1994), la capacidad de retención de agua disminuye con la edad, nuestros resultados se explican porque el intervalo de pesos de sacrificio fue pequeño y para Sañudo (1992), la alimentación no es un factor importante de variación de las pérdidas de agua. 113 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Tabla IV.- Pérdidas en la carne por goteo, presión y cocción e índices cromáticos de la carne y grasa. Perdidas Ensilad Peso sacrificio o Pradera 375 Ind. cromáticos carne Ind. cromáticos grasa goteo presión cocción L* 1.55 24.44ªc 31.13 36.53ac 410 1.67 c 24.48ª 30.89 36.54 ac 450 1.60 25.00a 31.01 375 1.62 23.06b 410 1.55 450 1.53 et 0.068 p< NS Pradera 1.61 Maíz 1.57 et 0.037 p< NS Maíz a* b* L* 15.50 7.88ª 68.77ª ab a* b* 6.28ab 11.23ª 6.24ab 11.50ªb 15.42 7.86ª 68.13 36.28ª 15.70 7.94ab 67.45ab 6.64ª 29.42 37.74b 15.54 8.39b 67.51ab 5.91ab 12.39ª 23.41b 29.47 37.24bc 15.29 8.36ab 67.18ab 5.80b 10.82ª 23.62bc 30.36 36.82ac 15.58 8.32ab 66.61b 5.76b 10.57ª 0.340 0.614 0.325 0.210 0.180 0.638 0.271 0.349 0.005 0.1 0.01 NS 0.05 0.05 0.05 0.05 24.64 31.01 36.45 15.54 7.89 68.12 6.39 11.68 23.36 29.75 37.27 15.47 8.35 67.10 5.82 10.59 0.197 0.357 0.108 0.115 0.094 0.325 0.156 0.200 0.001 0.05 0.005 NS 0.001 0.05 0.05 0.001 12.30b Únicamente el índice de luminosidad L* de la carne que disminuyó y el b* de la grasa que aumentó (sólocon ensilado de maíz), variaron con el incremento del peso de sacrificio. La ausencia de efectos importantes en el color se debería a que el aumento de la cantidad de pigmentos con la edad no es lineal, sino que sigue una tendencia sigmoide (Journe y Teissier, 1982), alcanzándose la cima a los 18-24 meses en el caso de animales de gran formato. Los índices cromáticos L* y b* de la carne resultaron mas altos, y los L*, a* y b* de la grasa más bajos, cuando los animales reciben ensilado de maíz (Tabla V), lo que haría la carne de estos animales más clara y la de grasa más obscura. Aunque para Sañudo, 1992) la naturaleza de la alimentación no tiene demasiada importancia en los índices cromáticos de la carne, también se ha indicado que un nivel energético alto disminuye la concentración de pigmentos heminicos (Lawrie, 1977), lo que sería el caso de los animales alimentados con ensilado de maíz. 114 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Tabla V.- Veteado, consistencia, terneza, pH y composición química de la carne. ConsisEnsilado Peso sacrificio Veteado Pradera 375 tencia Composición química de la carne(%) Dureza pH proteína grasa cenizas humed. 1.08ª 1.11 7.39 5.48 21.73 0.82ª 1.21ª 76.24ª 410 1.23ab 1.11 7.32 5.47 21.68 0.99ab 1.20b 76.14ªb 450 1.38b 1.04 7.26 5.47 21.65 1.07b 1.20b 76.08ªb 375 1.17ac 1.09 7.15 5.50 21.83 0.96ab 1.20ab 76.00ab 410 1.19ac 1.12 7.32 5.50 21.76 1.04b 1.19b 75.97b 450 1.28bc 1.10 7.49 5.47 21.69 1.10b 1.19b 76.02ªb et 0.061 0.040 0.285 0.017 0.078 0.079 0.005 0.093 p< 0.05 NS NS NS NS 0.05 0.005 0.05 Pradera 1.23 1.09 7.32 5.47 21.69 0.96 1.20 76.15 Maíz 1.22 1.10 7.32 5.49 21.76 1.03 1.19 76.00 et 0.035 0.023 0.167 0.008 0.038 0.045 0.003 0.048 p< NS NS NS 0.1 NS NS 0.05 0.05 Maíz El aumento del peso de sacrificio no afectó a la consistencia o a la terneza de la carne pero sí al veteado, que aumentó (Tabla V). Según Shorthouse y Harris (1990), el peso vivo es uno de los principales factores que determina la dureza de la carne, pero sin embargo, existe un periodo, aproximadamente entre los 9 y los 16 meses de edad, en el que se produce una estabilidad en la dureza de la carne (Touraille, 1982). 115 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Tabla VI.- Ácidos grasos saturados (AGS), ácidos grasos monoinsaturados (AGM), ácidos grasos poliinsaturados (AGP), ácidos ω-6 y ω-3 y relación AGP/AGS y ω-6/ω-3, en la grasa del L.thoracis. Peso AGS AGM AGP AGP/A ω-6/ω-3 ω-6 ω-3 Ensilado sacrificio GS Pradera 375 1015.1 1279.8ªb 150.04 84.706 65.334 0.159 1.359 410 951.91 1174.3ª 136.19 74.349 61.838 0.158 1.255 450 987.93 1331.8ªb 142.97 77.041 65.930 0.156 1.241 b Maíz 375 997.16 1274.3ª 136.27 74.090 62.180 0.145 1.241 410 1062.0 1472.8b 154.86 92.166 62.696 0.151 1.437 450 1035.7 1436.5ªb 141.28 82.698 58.581 0.146 1.461 et 84.204 105.697 136.187 9.915 3.851 0.017 0.180 p< NS 0.05 NS NS 0.1 NS NS Pradera 984.97 1262.0 143.07 78.699 64.367 0.158 1.285 Maíz 1031.7 1394.6 144.14 82.984 61.152 0.147 1380 et 40.954 51.407 5.429 4.822 1.873 0.008 0.087 p< NS 0.1 NS NS NS NS NS El tipo ensilado no modificó ni el veteado, ni la consistencia, ni la dureza de la carne. Sin embargo, autores como Bruce et al. (1991), concluyen que un aumento en el nivel de alimentación conduce a una mejora de la terneza,que lo atribuyen al incremento del veteado, cosa que en nuestro caso no ocurrió. Alberti et al., (1988) no encontraron diferencias en la terneza de la carne de terneros alimentados con dietas más o menos energéticas. La grasa de la carneaumentó con el peso de sacrificio (Tabla V) y la de humedad en los animales alimentados con ensilado de maíz. Ninguno de los AGS, AGM o AGP determinados fueron modificados, de forma significativa, por el aumento del peso de sacrificio. El tipo de ensilado únicamente afectó significativamente a los ácidos C22:0 (behenico) y C24:1(n-9) (nervonico), que resultaron más altos en los terneros alimentados con ensilado de maíz. El aumento del peso de sacrificio no afectó, de modo significativo, ni al total de AGS, AGM o AGP, ni a los ácidos de las series ω-6 y ω-3, ni a las relaciones AGP/AGS o ω-6/ω-3. El tipo de ensilado consumido tampoco parece afectar a ninguno de estos índices nutricionales (Tabla VI). Hay autores como Weeb et al., (1998) que indican que el incremento del peso de sacrificio influye en el perfil de los ácidos grasos (ligera disminución de los AGP y un aumento de los AGS y de los AGM), o como Varela (2002,), que encontró que el ácido estearico (C18:0) aumentaba y los AGP disminuían ligeramente con el peso de sacrificio, lo que achacaron al aumento del engrasamiento. Si el grado de engrasamiento es el principal responsable de las variaciones en el perfil de los ácidos grasos se explican fácilmente nuestros resultados, pues nuestros animales tenían menos grasa y peso que los de los autores comentados. Por otra parte, el aumento del engrasamiento con el peso de sacrificio fue pequeño. No hay que olvidar que las razas 116 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES empleadas son de engrasamiento lento y tardío, y no sería suficiente para detectar de forma significativa posibles variaciones en el perfil de los ácidos grasos de la grasa de infiltración en el músculo L. Thoraci. CONCLUSIONES Incrementando el peso de sacrificio, de 375 a 450 kg, es posible mejorar la conformación de la canal, más en los animales alimentados con ensilado de pradera que en los alimentados con ensilado de maíz, sin que afecte de forma negativa a la calidad de la carne, ni modifique el perfil de ácidos grasos de la misma. Los animales alimentados con ensilado de maíz resultan mejores desde el punto de vista carnicero, y ligeramente peores desde el punto de vista dietético (más AGS y menos AGP y ω-3) que los de ensilado de pradera. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALBERTI, P.; SAÑUDO, C.; LAHOZ, F.; JAIME, J.; TENA, T., 1988. 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Effect of anatomical location on the composition of fatty acids in double-muscled Belgian Blue cows. Meat Sci., 50: 45-53. 117 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES WISMER-PEDERSEN, J., 1994. Química de los tejidos animales. En Ciencia de la carne y los productos carnicos, 125-149. Ed. J.F. PRICE, B.S. SCHWEIGERT. Acribia. Zaragoza. España. ZEA, J., 1978. Utilización de forrajes para la producción de añojos de la raza Rubia Gallega. Tesis Doctorales INIA nº 10. Madrid. AGRADECIMIENTOS Los autores desean expresar su agradecimiento al INIA y a la Secretaría Xeral de Investigación e Desenvolvemento de la Xunta de Galicia por la financiación de los Proyectos: XM-99-003 (Mejora de la calidad de la canal y la carne de vacuno joven alimentados a base de forrajes ensilados) y PGIDT02RAG50301PR (Efecto de la raza, sexo, peso de sacrificio y dieta en el perfil de ácidos grasos de la carne de vacuno joven), de los que se obtuvieron los datos aquí expuestos. 118 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES EFECTO DEL PESO DE SACRIFICIO Y EL TIPO DE ENSILADO EN LA CALIDAD DE LA CANAL, LA CARNE Y LA GRASA. II. TERNERAS EFFECT OF SLAUGHTERED WEIGHT AND SILAGE TYPE ON CARCASS, MEAT AND FAT QUALITY. II. HEIFERS ZEA, J., DÍAZ, Mª D. Y CARBALLO, J. A. Centro de Investigaciones Agrarias de Mabegondo. Conselleria del Medio Rural. Xunta de Galicia PALABRAS CLAVE: ensilado pradera, ensilado maíz, ácidos grasos. ABSTRACT The effect of the slaughter weight (375, 410, and 450 kg), in heifers fed with maize silage or grass silage, in some characteristics of the carcass and the meat, as well as outline of the fat acids of the meat was studied. The increase of the slaughter weight improved dressing percentage, the quantity of the meat (it only improved the fatty in the heifers fed with grass silage), and meat marbling; without considerably affecting the tenderness, the water retention or the colour of the meat. The heifers fed with maize silage have better carcass conformation, more kidney fat, less fattening carcass, the fat a little more dark and less water losses. The meat of the heifer fed with maize silage has less polyunsaturated fatty acids (PUFA) and ω-3 fatty acids, than the ones fed with grass silage. RESUMEN Se estudia el efecto del peso de sacrificio (375, 410 y 450 kg) en terneras alimentados con ensilados de maíz o pradera en algunas características de la canal y la carne así como en el perfil de los ácidos grasos de la carne. El aumento del peso de sacrificio mejoró el rendimiento, la cantidad de grasa (el engrasamiento sólo en las alimentadas con ensilado de pradera) y el veteado, sin que afecte a la terneza, perdidas de agua o color de la carne. Las terneras alimentados con ensilado de maíz tienen mejor conformación, mas grasa de riñonada, menos grasa de cobertura, la grasa ligeramente más oscura y menores perdidas de agua por presión. La carne de las terneras alimentadas con ensilado de maíz tiene menos AGP y ω-3, que los alimentados con ensilado de pradera. INTRODUCCIÓN Se ha admitido que la conformación y el engrasamiento que se les exige a las canales son difíciles de alcanzar con animales de maduración tardía alimentados con dietas forrajeras y sacrificados a los pesos ligeros. De aquí que se recomiende un acabado con concentrado. Sin embargo, estos mismos efectos se producen con el aumento del peso de sacrificio: mejora la conformación, aumenta la grasa y disminuye la carne y el hueso, mejorando en conjunto la calidad de la canal. El objetivo es evaluar el efecto mejorante del incremento del peso de sacrificio (375, 410 y 450 kg, que son usuales en Galicia) en la calidad de la canal, la carne y la grasa de terneras alimentadas a base de ensilados de maíz o pradera, distintos energéticamente, lo que “per se” puede afectar a las características de la canal, la carne y la grasa. 119 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES MATERIAL Y METODOS El diseño experimental fue un factorial: 2 ensilados (maíz y pradera) x 3 pesos de sacrificio (375, 410 y 450 kg), con 30 terneras por tratamiento (10 Rubias Gallegas,10 Holstein-Friesian y 10 cruzadas de ambas) La alimentación consistió en ensilado a voluntad y 1,5 o 2 kg de pienso según fuese ensilado de maíz o pradera. Los piensos, a base de cebada y soja, se formularon para que las ingestiones resultasen con el 14% o el 12% de proteína bruta, dependiendo de que los animales fuesen de más o menos de 270 kg. Los ensilados estaban bien conservados y fermentados, resultando con digestibilidades de la materia orgánica de 70,02 y 64,72%; proteína bruta de 7,79 y 11,88%; concentración energética de 10,86 y 9,21 MJ de EM/kg MS, según fuese de maíz o pradera. A las 48 horas, se cuarteo la media canal izquierda entre la 5ª y 6ª costillas. La canal se clasificó según la UE (E+ =15,.....P-=1); para el engrasamiento la escala fue: magro=1,.... muy graso=9. Las determinaciones realizadas a las 24 horas en la carne (L. thoracis de la 6ª a la 10ª costilla) fueron: pH, coordenadas cromáticas: L* (luminosidad), a* (rojo) y b* (amarillo), dureza (con célula Warner-Bratzler sobre muestras de 1x1x5 cm cocidas 45 minutos a 75ºC), consistencia (1=firme seca, 3=blanda húmeda) y el veteado (1=trazas, 5=infiltrada). Las pérdidas por goteo (drip loss), por presión (capacidad de retención de agua) y por cocción se expresan en % de muestra fresca; la composición química según normas oficiales. Sobre papel de acetato se dibujó el perímetro L. thoracis en las costillas 6ª y 10ª determinándose las áreas (cm2) y las distancias A y B (diámetros máximos perpendiculares). Para la determinación de los ácidos grasos se extrajo la grasa, y después de la metilación se analizó según la norma ISO 5508. Se calculan: ácidos grasos saturados (AGS), suma de los ácidos: C8:0, C10:0, C12:0, C14:0, C15:0, C16:0, C17:0, C18:0, C20:0, C22:0, C23:0 y C24:0; ácidos grasos monoinsaturados (AGM), suma de los ácidos: C14:1(n-5), C:15:1, C16:1(n-7), C17:1, C18:1(n-9t), C18:1(n-9c), C20:1(n-9), C22:1(n-9) y C24:1(n-9); ácidos grasos poliinsaturados (AGP), suma de los ácidos: C18:2(n-6t), C18:2(n-6c), C18:3(n-3), C18:3(n-6), C20:2(n-6), C20:3(n-3), C20:3(n-6), C20:4(n-6), C20:5(n-3), C22:2(n-6) y C22:6(n-3); -3, suma de los ácidos: C18:3(n-3), C20:3(n-3), C20:5(n-3) y C22:6(n-3); y -6, que son la suma de los ácidos: C18:2(n-6t), C18:2(n-6c), C18:3(n-6), C20:2(n-6), C22:2(n-6), C20:3(n-6) y C20:4(n-6); y las relaciones AGP/AGS y -6/-3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN El efecto del aumento del peso de sacrificio en las ganancias de peso vivo resultó de 60 y 75 g/día con ensilado de pradera o maíz, y de 47 y 62 g/d cuando se considera el peso canal. Los animales alimentados con maíz ensilado crecieron más que los alimentados con ensilado de pradera (108 y 67 g/d de peso vivo y canal) (Tabla I). 120 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Tabla I.- Ingestión (kg MS/cabeza y día), peso vivo inicial y final (kg), ganancias de peso (g/día) e índices de conversión de la materia seca (MS). Ingestión Ensilad o Pradera Peso vivo Peso sacrificio ensilado total inicial final 375 4.192ª 5.975ª 202.41 201.12 410 4.306ª 6.089ª Ganancia peso Ind. conv. MS vivo canal p. vivo p. canal 373.12ª 925ª 473ª 6.46ª 12.54ªd 409.28 b 950 ab ab 6.41ª 12.15ªb b 985 bc b 6.20ª 11.66b 498 450 4.324ª 6.107ª 202.07 449.35 375 5.909b 7.244b 208.75 369.90ª 1029cd 532bc 7.04b 13.52c 410 6.053 b b 209.13 409.50 b de c b 12.96cd 450 6.150b 7.485b 207.62 448.88b 1104e 594d 6.78b 12.64d et 0.231 0.231 5.616 1.605 18.525 14.838 0.125 0.274 p< 0.001 0.001 NS 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 Pradera 4.266 6.049 201.87 410.58 954 505 6.35 12.11 Maíz 7.388 1054 520 565 7.01 6.028 7.363 208.50 409.73 1062 572 6.94 13.04 et 0.138 0.138 1.756 0.955 8.616 5.713 0.076 0.157 p< 0.001 0.001 0.01 NS 0.001 0.001 0.001 0.001 Con el incremento del peso de sacrificio mejoró el rendimiento (1,18 y 1,37 % con ensilados de pradera y maíz), el porcentaje de grasa de riñonada (en 0,49 y 0,72) y el engrasamiento de la canal (únicamente en el caso de ensilado de pradera en 0,40 puntos), disminuyendo la pistola en las alimentadas con ensilado de pradera (Tabla II). 121 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Tabla II.- Peso canal (kg), rendimiento (%), clasificación canal, grasa de riñonada (%) y % de delantero, trasero y pistola en la canal. Peso Rendi- Clasific. canal Grasa % en la canal de Ensilado Peso sacrificio Pradera 375 410 450 Maíz 375 410 450 et p< Pradera Maíz et p< canal 189.39ª 211.02b 233.39c miento 50.73ª 51.55ab 51.91b confor. 5.63ª 5.80ª 6.07ª engras. 4.87ª 5.07ª 5.27b riñona. 1.84ª 2.12ªb 2.33b delante 35.98 36.08 35.99 trasero 64.02 63.92 64.01 pistola 50.76ª 49.95b 49.89b 187.59ª 212.07b 233.83c 1.753 0.001 50.72ª 51.79ab 52.09b 0.364 0.05 6.27ab 6.90b 7.00b 0.298 0.001 4.77ª 4.87ª 4.93ª 0.102 0.05 2.20ªb 2.83c 2.92c 0.166 0.001 35.69 35.82 35.85 0.166 0.1 64.31 64.18 64.15 0.166 0.1 50.67ª 50.37ªb 50.19ªb 0.229 0.01 211.27 211.17 0.783 NS 51.37 51.53 0.162 NS 5.83 6.72 0.1254 0.001 5.07 4.86 0.059 0.05 2.10 2.73 0.077 0.001 35.99 35.79 0.088 NS 64.01 64.21 0.089 NS 50.20 50.41 0.096 NS Las terneras alimentadas con ensilado de maíz tienen mejor conformación (6,72 vs 5,83) y más grasa de riñonada (2,73 vs 2,10), pero menos engrasamiento canal (4,86 vs 5,07) que los alimentados a base de ensilado de pradera lo que se explica por la mayor riqueza energética de las dietas de maíz (Andersen et al., 1984). A diferencia de lo que había ocurrido con los machos no mejoró el rendimiento. La cantidad de grasa en la canal (Tabla III) aumenta con el peso de sacrificio, aunque algo más en el caso del maíz (1,07 %) que en el de pradera (0,96 %). Con el ensilado de maíz aumenta la cantidad de carne y disminuye la de hueso, sin que el tipo de ensilado afecte a la grasa. Kousgaard (1979), alimentando terneros con cuatro niveles de nutrición, encontró que el porcentaje de carne aumenta con el nivel de nutrición, pero no observó diferencias importantes hasta niveles próximos al 85% de la ingestión energética máxima, de lo que concluye que el nivel energético tiene una escasa influencia en la proporción de carne en la canal. 122 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Tabla III.- Composición de la canal y áreas de longissimus thoraci al nivel de la 6ª y 10ª costillas. % en la canal de Ensilado Peso sacrificio carne hueso Pradera 375 72.79ab 410 72.44ab 450 Maíz Área L. thoraci grasa 10ª 20.51ª 6.77ª 20.41ª 7.15ªb 72.14ª 20.13ªb 375 73.41b 410 450 % en la canal de carne 6ª extra 1ª 2ª 58.33ª 27.70ª 10.95 37.45 6.42 17.80ª 58.58ª 28.72ªb 10.74 37.11 6.36 18.07ªb 7.73b 59.95ab 29.86b 10.69 36.75 6.31 18.23ªb 19.95ªb 6.65ª 59.34ab 27.76ª 11.32 37.40 6.49 18.04ªb 72.96ªb 19.57b 7.47b 63.54bc 30.51bc 11.04 37.04 6.42 18.29ªb b b b 65.08 c 31.97 c 11.03 36.81 6.32 18.44b 7.72 3ª 72.77ª 19.51 et 0.399 0.262 0.241 1.522 0.695 0.221 0.317 0.086 0.180 p< 0.05 0.01 0.01 0.005 0.001 0.1 NS NS 0.05 Pradera 72.46 20.35 7.22 58.95 28.76 10.80 37.10 6.37 18.03 Maíz 73.04 19.68 7.28 62.65 30.08 11.13 37.09 6.41 18.25 et 0.158 0.088 0.132 0.628 0.349 0.098 0.126 0.047 0.100 p< 0.01 0.001 NS 0.001 0.01 0.1 NS NS NS La carne aumentó con el ensilado de maíz, lo que se tradujó en un incremento de la carne extra (11,30 vs 10,80%), pero sólo con p<0.1. Otro efecto mejorante del maíz con relación al ensilado de pradera es el aumento de las áreas del l. thoracis en la 6ª y 10ª costilla (Tabla III), cosa que no había ocurrido con machos (Zea et al., 2006). El aumento del peso de sacrificio no afectó a la intensidad de las pérdidas de agua por goteo, presión o cocción (Tabla IV); si bien, las pérdidas por presión fueron más altas en las alimentadas con ensilado de pradera, como había ocurrido con los machos (Zea et al., 2006). Aunque Sañudo (1992) establece que la alimentación no es un factor importante de variación de la capacidad de retención de agua, también encuentra que la jugosidad de la carne de los animales alimentados a base de pienso es mayor que la de los alimentados a pasto, lo que puede explicar nuestros resultados de mayores pérdidas por presión con el ensilado de pradera, menos energético que el de maíz. 123 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Tabla IV.- Pérdidas en la carne por goteo, presión y cocción e índices cromáticos de la carne y grasa. Ensilado Peso sacrificio Pradera 375 410 450 Maíz 375 410 450 et p< Pradera Maíz et p< goteo 1.69 1.71 1.70 Perdidas presión 24.12ªbd 24.44ab 24.77ª cocción 29.85ab 30.10ab 30.42ª Ind. cromáticos carne L* a* b* 35.66ª 16.00 8.68 35.18ª 16.14 8.60 34.80ª 16.15 8.57 Ind. cromáticos grasa L* a* b* 63.63ª 5.56 12.51ª 63.34ª 5.59 12.46ª 62.67ab 5.61 12.59ª 1.67 1.60 1.54 0.069 NS 23.42bc 22.79c 23.29cd 0.401 0.001 29.15ab 28.86b 30.01ab 0.519 0.05 37.14b 37.04b 36.79b 0.329 0.001 15.91 15.96 16.00 0.231 NS 8.69 8.76 8.83 0.198 NS 61.90bc 60.63cd 60.30d 0.538 0.001 4.94 5.04 4.89 0.285 0.1 10.62b 10.80b 10.91b 0.323 0.001 1.70 1.60 0.037 NS 24.45 23.17 0.227 0.001 30.12 29.34 0.298 0.1 35.21 36.97 0.177 0.001 16.09 15.96 0.127 NS 8.62 8.76 0.104 NS 63.21 60.94 0.292 0.001 5.58 4.95 0.142 0.005 12.52 10.78 0.182 0.001 La única variación debida al aumento del peso de sacrificio de los índices cromáticos de la carne o la grasa fue el L* de luminosidad de la grasa, que disminuyó en las terneras las alimentadas con ensilado de maíz (Tabla IV). Como en el caso de los machos, (Zea et al., 2006) esto se debería a que el aumento de la cantidad de pigmentos con la edad sigue una tendencia de tipo sigmoide, alcanzándose la cima a los 18-24 meses en el caso de animales de gran formato (Renerre, 1982), como los nuestros, por lo que las variaciones en el color de la carne no serian apreciables. Al igual que había ocurrido con los machos (Zea et al., 2006), los índices cromáticos de la grasa de las terneras alimentadas con maíz fueron más bajos (Tabla IV) y, consecuentemente, la grasa más oscura. En la carne resultó más alto el índice L en las alimentadas con maíz (al igual que en los machos). Dado que las variaciones son pequeñas, se estaría de acuerdo con Sañudo (1992) en que en rumiantes la alimentación tiene poca importancia en los índices cromáticos de la carne; aunque también se ha indicado que niveles energéticos altos disminuyen la concentración en pigmentos heminicos (Lawrie, 1977). 124 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Tabla V.- Veteado, consistencia, terneza, pH y composición química de la carne. Ensilado Pradera Peso sacrificio 375 410 450 Veteado Consistencia Dureza pH 1.40ªc 1.69ªb 1.90b 1.08 1.13 1.11 6.91 7.12 6.87 5.46ª 5.45ab 5.43ab 21.66ab 21.55ª 21.55ª 1.77ª 2.17ªc 2.91bcd 1.18ª 1.17ab 1.16bc 75.39ª 75.11ª 74.39b 375 410 450 1.37c 1.72ªb 1.90b 0.114 0.005 1.03 1.12 1.06 0.045 NS 6.91 6.80 6.70 0.271 NS 5.46ª 5.43ab 5.42b 0.014 0.05 21.87b 21.77ab 21.64ab 0.086 0.01 1.99ª 2.55c 3.19d 0.187 0.001 1.16abc 1.17ab 1.15c 0.007 0.01 74.98ac 74.50bc 74.02b 0.193 0.001 1.66 1.66 0.054 NS 1.11 1.07 0.027 NS 6.96 6.80 0.159 NS 5.45 5.44 0.005 NS 21.59 21.76 0.043 0.005 2.28 2.58 0.072 0.005 1.17 1.16 0.004 NS 74.96 74.50 0.069 0.001 Maíz et p< Pradera Maíz et p< Composición química de la carne(%) proteína grasa cenizas humed. El veteado aumentó con el peso de sacrificio, mientras que, como en el caso de los machos (Zea et al., 2006), no afectó a la consistencia o a la terneza (Tabla V). El tipo de ensilado no modificó el veteado, la consistencia o la terneza. Aunque se admite que el peso o edad es un factor importante de la terneza, también se admite que existe un periodo, aproximadamente entre los 9 y los 16 meses, en el que la dureza se estabiliza (Touraille, 1982); y aunque hay autores (Bruce et al., 1991) que encuentran que la terneza mejora con el nivel de alimentación, otros (Alberti et al., 1988) no observan diferencias en la carne de terneros alimentados con dietas más o menos energéticas. 125 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Tabla VI.- Ácidos grasos saturados (AGS), monoinsaturados (AGM) y poliinsaturados (AGP). Ácidos grasos de la serie ω-6 y ω-3 y relación AGP/AGS y ω-6/ω-3, en la grasa intramuscular del L.thoracis. Ensilado Pradera Peso sacrificio 375 410 Maíz Pradera Maíz AGS AGM AGP ω-6 ω-3 AGP/AGS ω-6/ω-3 1069.7 1461.6 147.01 81.220 65.789 0.150ª 1.285 62.598 b 1.314 b 1216.3 1593.7 142.72 80.118 0.120ª 450 1256.1 1766.5 141.96 80.354 61.609 0.118ª 1.371 375 1213.7 1699.7 134.83 77.307 57.525 0.117ªb 1.413 b 410 1142.4 1507.1 134.09 77.778 56.314 0.128ª 1.398 450 1183.1 1678.2 125.63 69.767 55.858 0.113b 1.300 et 92.687 152.851 11.117 9.724 4.300 0.015 0.189 p< NS NS NS NS 0.1 0.05 NS 1180.7 1607.3 143.90 80.564 63.332 0.129 1.323 1179.7 1628.3 131.52 74.950 56.566 0.119 1.370 et 44.013 72.582 5.079 4.617 2.042 0.007 0.090 p< NS NS 0.05 NS 0.05 NS NS Cuando el peso de sacrificio aumenta, disminuye el contenido en humedad y cenizas, y aumenta el de grasa (Tabla V), independientemente del forraje consumido. La carne de las terneras alimentadas con ensilado de maíz tiene más proteína y grasa y menos humedad De los AGS y AGM determinados, el aumento del peso de sacrificio incrementó el nivel de los ácidos C16:0 (palmítico) y C16:1(n-7) (palmitoleico) en las terneras alimentadas con ensilado de pradera, y de los AGP únicamente se modificó el C20:5(n-3) (eicosapentaenoico), pero por el efecto del ensilado (más alto con el de pradera) no del peso. Ninguno de los índices nutricionales (AGS, AGM, AGP, AGP/AGS, ω-6, ω-3 o ω-6/ω-3) se modificó por el efecto del peso de sacrificio, pero sí por el tipo de ensilado, resultando el nivel de los AGP y ω-3 más alto en las terneras alimentadas con ensilado de pradera (Tabla VI). En el caso de los machos (Zea et al., 2006), el tipo de ensilado no se había modificado. Dado que hay autores (Malau-Aduli, 1997; Weeb et al., 1998) que indican que el aumento de la cantidad de grasa se caracteriza por una ligera disminución de los AGP y un aumento de los AGS y de los AGM, la aparición de estos efectos, que no se habían observado en los machos, se explican porque la grasa de la carne aumentó en 0,30 puntos porcentuales al pasar la alimentación de ensilado de pradera a ensilado de maíz (Tabla V); mientras que en los machos este aumento no se había producido (Zea et al., 2006). 126 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES CONCLUSIONES Con el incremento del peso de sacrificio, de 375 a 450 kg., se mejora el rendimiento, el engrasamiento (grasa en la canal y en la carne y la de cobertura sólo en el caso de alimentar con ensilado de pradera) y el veteado de la carne, sin que afecte de forma negativa a la calidad de la carne, ni modifique el perfil de ácidos grasos de la misma. Las Terneras alimentadas con ensilado de maíz tienen menos AGP y ω-3 que las que reciben ensilado de pradera. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALBERTI, P.; SAÑUDO, C.; LAHOZ, F.; JAIME, J.; TENA, T., 1988. Características de la canal y calidad de la carne de terneros cebados con dietas forrajeras y suplementados con distintas cantidades de pienso. ITEA, 76: 3-4. ANDERSON, B. A,; LAUDERDALE, J. L.; HIKE, Y. M., 1984. Composition of food: beef products-raw, processed, prepared. USDA Agriculture Handbook No. 8. BRUCE, H.L.; BALL, R.O.; MOWATT, D.N.,1991. Effects of compesatory growth and protein metabolism and meat tenderdess of beef steers. Can. J. Anim.Sci., 71: 659-671. KOUSGAARD, K., 1979. Seminar: Energy and protein feeding standards for beef cattle. Theix. Francia. LAWRIE, R.A., 1977. Ciencia de la carne. Ed. Acribia. Zaragoza. España. MALAU-ADULI, A. E. O.; SIEBERT, B. D.; BOTTERNA, C. D. K.; PITCHFORD, W. S., 1997. 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En este mismo volumen. AGRADECIMIENTOS Los autores desean expresar su agradecimiento al INIA y a la S. X. de I. e D. de la Xunta de Galicia por la financiación de los Proyectos: XM-99-003 (Mejora de la calidad de la canal y la carne de vacuno joven alimentado a base de forrajes ensilados) y PGIDT02RAG50301PR (Efecto de la raza, sexo, peso de sacrificio y dieta en el perfil de ácidos grasos de la carne de vacuno joven), de donde proceden los datos, así como a D. Eduardo Jimenez Domínguez y a D. José Tasende Fraga, por el cuidado y el manejo del ganado. 127 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES PONTREMOLESE: AN ITALIAN BOVINE BREED IN ENDANGERED STATUS LA PONTREMOLESE: UNA RAZZA BOVINA AUTOCTONA IN VIA DI ESTINZIONE GORACCI J., GIULIOTTI L., BENVENUTI N., VERITÀ P., FACDOUELLE I. Department of Animal Production, University of Pisa, Viale delle Piagge, 2, 56124, Pisa (Italy),tel. +39.050.2216892, fax +39.050.2216901, [email protected] ABSTRACT Pontremolese is a double attitude Tuscan bovine breed recognized as “reliquia” by FAO and recorded since 1985 in the book of Local Breeds with a Restricted Diffusion. Since many years, most of the rustic genotypes have been involved in specific programs dealing, on one hand, with the preservation and the protection of biodiversity and, on the other, with the promotion of the typical products derived from a strong animal-environment bond. Among all, Pontremolese was one of the least influenced autochthonous breeds by the local plans of promotion. The aim of this work was to outline the history of Pontremolese breed and to analyse its present status. Only 26 subjects resulted in two farms near Lucca (Tuscany) and 4 involved in a FAO safeguard project. In addition, the C.I.Z. Research and Genetics Centre situated in Pisa is storing more than 1300 semen doses from seven Pontremolese bulls. Today, none of the animals live in their native area: the Lunigiana countryside. Zoometric data was collected in order to typify the existing subjects. Such a severe decline, must provide rapid action plans in order to avoid the extinction of the Pontremolese genotype. KEY WORDS: Pontremolese, bovine, autochthonous breed. RIASSUNTO La Pontremolese è una razza a duplice attitudine autoctona della Toscana, riconosciuta dalla FAO come “reliquia” e inserita dal 1985 nel Registro Anagrafico delle Popolazioni Bovine Autoctone e Gruppi Etnici a Limitata Diffusione. Da molti anni le razze rustiche italiane sono state coinvolte in specifici programmi riguardanti sia la conservazione e protezione della biodiversità, sia la promozione di produzioni tipiche caratterizzate da un forte legame col territorio. Lo scopo di questo studio è stato quello di prendere in esame la storia di questa razza e di analizzarne la situazione attuale. Sono stati inoltre raccolti i dati zoometrici al fine di tipizzare i soggetti attualmente presenti. E’ stata rilevata la presenta di soli 26 animali in due allevamenti situati in Garfagnana vicino a Lucca (Toscana) e 4 in un’azienda sperimentale (in Abruzzo) coinvolta in un progetto di salvaguardia della FAO. Presso il Consorzio per l’Incremento Zootecnico di San Miniato (Pisa) sono stoccate circa 1300 dosi di seme di 7 tori Pontremolesi. Lo studio effettuato mette in luce la situazione di estrema gravità in cui si trova questa razza ormai non più allevata nel suo luogo di origine (Lunigiana). Si rendono quindi necessari ulteriori e rapidi piani di azione di recupero al fine di scongiurarne l’estinzione. PAROLE CHIAVE: Pontremolese, bovini, razze autoctone. 128 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES INTRODUCTION HYSTORICAL ANALYSIS AND CONSISTENCE DEVELOPMENT - The origin of Pontremolese breed are uncertain: some Authors assumed that it could derive from Parmigiana (Reggio Emilia district), a type of Reggiana breed (Lisi, 1893) characterized by cross with Alpina and Giurassica (Pucci, 1912); some assured that it could descend from Iberian, Asian or Alpine wild-type (Marchi and Mascheroni, 1925) and finally some retained that it seems to came from the reddish tinted horned animals that lived in the Tyrrhenic coast of Italy more than one hundred years ago (Pucci, 1912). In 1935 the Herd Book of Pontremolese breed was set up, after that there is information about the consistence of the cattle shed (Fig. 1). Fig. 1. Numerical consistence of Pontremolese breed until 70’s. Year Author Number of animals 1940 Secchiari et al., 2002 15.000 1950 Parisi, 1950 10.000 1960 Technical Land Office, 1960 5.700 Owing to the introduction of non-autochthonous breeds described as follow and the coming of the first agricultural machines, Pontremolese breed underwent a rapid decline, reaching up to 13 subjects (Fig. 2) in the mid 80’s (Ciampolini, 1993). Fig. 2. Consistence of Pontremolese breed from 80’s to present time. 60 Number of animals 50 40 30 20 10 0 1983 1993 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 Year In 1985 this breed has been included in the book of Local Breeds with a Restricted Diffusion and in various safeguard programs coordinated by Tuscan Region (i.e. 50/97 and 64/04 Regional Laws). Moreover, Pontremolese was recognized as “reliquia” genotype by FAO (2000). 129 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES The aim of this work was to outline the history of Pontremolese breed and to analyse its present status regarding consistence, morphometric and morphological traits. GEOGRAPHICAL DISTRIBUTION - Pontremolese were bred in the Appenninic Mountains and into the Magra and Vara valleys (La Spezia and Massa Carrara), but also in Piacenza and Pavia areas (“Oltrepò Pavese” region), as stated by Bonadonna in 1950. Animals are named in different ways in each district (i.e. Bettolesi). With the 1935 law enactment, two different breeding areas were identified: one in Zeri and Valdentana areas where pure Pontremolese subjects were reared, and another in the rest of Pontremoli area and in a part of La Spezia province where Bruna or Garfagnina crosses were preferred in order to obtain more productions. ATTITUDES AND PRODUCTIONS - Pontremolese were considered as triple-attitude breed, even if milk (almost 10-15 q/year with the average of 3.7% of fat content) and meat productions (40-63% of yield at slaughtering for calves, cows or steers) were not satisfactory at all (Lisi, 1922; Marchi and Mascheroni, 1925; Parisi, 1950). In fact, the severe lack of milk produced in this place drove farmers to cross the autochthonous genotype with Swiss cows, even with higher costs of purchasing and maintenance. Bonadonna (1950) revealed also Bruna Alpina crosses aimed at the same purpose. On the contrary, meat was considered a high quality product (Bonadonna, 1950) generally greatly demanded (Mascheroni, 1931). In spite of its medium size, Pontremolese was considered as a rustic, sturdy and stress-resistant breed, characterized by strong limbs and great adaptability to mountain sloping pastures (Meardi, 1883). In fact, in the past, cows were utilized for not-drudgery agricultural labour (Marchi and Mascheroni, 1925), while steers were used for hard chores, as marble slabs transport from quarries to Carrara harbour (Mazzoni, 1933). DESCRIPTION - In the Herd Book (1935) and in the book of Local Breeds with a Restricted Diffusion (1985) Pontremolese biometrical and morphological parameters were outlined. In Fig. 3, Standard measures obtained in researches conducted in the last 70 years are reported in Fig. 3. 130 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Fig. 3. Comparison between zoometric data of Pontremolese breed. D.M. 18/3/1935 Category Bulls > 3 years Bulls 1 year Cows Heifers Secchiari et al., 2002 Height Weight Height mean (cm) mean (kg) mean (cm) 135 600 128-150 120 200 128 450 125-138 118 300 - Our results Weight Height Weight mean (kg) mean (cm) mean (kg) 550-600 119 474 111 150 400-450 118 400 99 190 Coat - Presence of sexual dimorphism: female show reddish colour lighter than males; both display a clear back-lumbar line and black orbits. Skin - Medium thickness skin with thin and short hair. Head - Straight profile, poll with a dip covered by a red tuft in the middle. Horns - Presence of sexual dimorphism: lyre-shaped in female and elliptic in male; both reveal yellowish horns in the base and dark at the top. Trunk - Prominent withers and sloping rump. Tail - Thin with dark tuff at the top. Fore limbs - Muscled and sloping shoulders, thin shin and dark hooves. Hind limbs - Large and lean. Udder - Globose with quite big teats (Fig. 4). Fig. 4. Historical photo of Pontremolese (1916) taken from “Il Corriere Apuano” (2006). MATERIALS AND METHODS The study was conducted on all the 26 Pontremolese subjects resulted in two farms near Lucca (Tuscany). After a direct inspection in order to collect all useful information about livestock, a questionnaire with data regarding activities, land, structures, animals, rearing techniques, nutrition and productive traits was filled out. Morphologic and morphometric traits were collected on all the animals, evaluating head width, forehead-nose bridge, ear length, withers height, rump height, chest width, body length, back width and ischiatic 131 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES width (Meregalli, 1980). Measurements were carried out with animals in standing position on flat land, using a measuring tape and a Lydtin stick. Colour of coat, muzzle, limbs and skin were noted. Means and variances were estimated using J.M.P. software (2002). RESULTS AND DISCUSSION Farms are situated at 500-600 m above sea level and the average surface of each farm is almost 10 ha, divided into pastures, crops and woods. One farm also reared Garfagnina bovine breed, pigs and Massese sheeps. Animals generally grazed from spring to late autumn (May-October/November), while the rest of the year they were kept in tether or loose housing systems without the use of outdoor areas, owing to rigorous winter climate and sloping upland pastures (15-20%). The Pontremolese population totalled 26 subjects, divided into 16 cows, 5 bulls, 2 heifers and 2 calves at inspection time. In addition, the C.I.Z. Research and Genetics Centre in Pisa is storing more than 1300 semen doses from seven Pontremolese bulls. Animals were slaughtered at different ages: 4/5 months (veal with less than 200 kg of live weight), 15/16 months (calf of about 230/250 kg) and 19/20 months (calf of about 500 kg). Nutrition was based on hay, natural and seeding pastures and on maize, barley, bran and soybean supplement. Bulls and cows began their reproductive activity at about 2 years; cows generally live more than 10 years, while bulls are slaughtered at the age of 3 years. Births occurred in barn in order to obtain an effective control of the animals and were distributed throughout the year, with the concentration in spring and autumn. Twins births occurred rarely (less than 5%). Calves were weaned at 6 or 7 months. 132 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Fig. 4. Zoometric data of Pontremolese subjects (mean ± err.std). Head Forehead-nose Ear Withers Category Weight width bridge length height Bull 474.0±79.22 24.2±1.42 46.0±1.32 14.8±0.60 119.3±5.37 Cow 400.0±17.35 21.5±0.51 45.9±0.95 17.6±0.65 118.4±1.93 Calf 150.0±0 22.5±2.00 43.7±1.25 15.7±1.25 111.0±11.0 Heifer 190.0±0 19.0±0 39.0±0 18.0±0 99.0±0 Rump height Chest width Body length Back width Ischiatic width Bull 124.7±4.46 65.0±5.17 107.9±5.77 41.4±4.20 48.2±3.40 Cow 124.5±2.34 62.6±1.66 106.8±2.01 37.5±1.18 45.0±1.03 Calf 115.5±10.5 55.0±3.0 92.5±1.5 33.5±4.0 38.5±2.0 106.0±0 54.0±0 79.0±0 28.5±0 35.0±0 Category Heifer Compared to previous studies (D.M. 18/3/1935; Secchiari et al., 2002), our results (Fig. 3 and 4) underlined smaller and lighter subjects, revealing an evolution of the morphological traits of Pontremolese breed. Fig. 5. Frequency of colour characteristics. Regarding morphologic traits, Pontremolese coat was fairly brown, but the colour of the muzzle, limbs and eyes and nose area were more heterogeneous, as previously reported in Fig. 5. 133 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES CONCLUSIONS This work underlined the constant and gradual numeric decrease of Pontremolese subjects in the years, leading to a present severe risk of extinction. Besides, today none of the animals live in their native area (Lunigiana countryside), moving them away from all valorisation projects linked with the development of that rural territory. Thanks to the presence of several semen doses and the inclusion of Pontermolese in FAO safeguard projects, appropriate and well-timed plans could be useful only if managed in a rapid and determined way. REFERENCES BONADONNA T. (1950). Zootecnia speciale. Vol. II. Ed. Istituto Editoriale Cisalpino, Varese: 984-988. CIAMPOLINI R. (1993). 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Istituto Monografico Italiano, Firenze, Italy. 134 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES SECCHIARI P., MELE M., SERRA A., FERRUZZI G., PISTOIA A. (2002). Pontremolese. Risorse genetiche animali autoctone della Toscana. ARSIA – Regione Toscana. Ed. Effemme Lito srl, Firenze: 61-66. TECHNICAL LAND OFFICE (1960). Atlanti di zootecnia. Allevamenti Italiani. 1 Bovini. Ed. R.E.D.A., Roma: 125-128. ACKNOWLEDGEMENTS The Authors thank Olivia Paganelli and Brunella Antonioli for technical assistance. Work supported by ARSIA founds (Tuscan Region). 135 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES PRODUZIONE E QUALITA’ DEL LATTE DI CAPRE MALTESI ALLEVATE IN SICILIA MILK YIELD AND QUALITY IN MALTESE GOATS REARED IN SICILY ZUMBO A.1, DI ROSA A.R.1, FINOCCHIARO R.2 1 Dip. MO.BI.FI.P.A. - Università di Messina, Polo Universitario dell'Annunziata, 98168 Messina, Italy 2 Dip. S.En.Fi.Mi.Zo. – Università di Palermo, Viale delle Scienze, 90128 Palermo, Italy ABSTRACT The present research would like to contribute to the improvement of the Maltese goat, among the most productive of Sicilian breeds. Milk quantity and quality characteristics were investigated in 60 lactating Maltese goats of different ages and order of kidding. Every month individual daily yields were recorded and individual milk samples were taken to determine the concentrations of fat, protein and lactose, the somatic cell count (SCC), pH, titration acidity (°SH) and clotting properties, using the parameters r (clotting time), k20 (curd firming time) and a30 (curd firmness). Results show that the daily milk yield was higher for the goats in the fourth and higher parity, while the protein and fat levels were higher in the primiparous goats. Goats with multiple kids showed significant higher daily milk yield (1979 g vs1839 g), lactose percentage (4.84 vs. 4.76) and SCC (log10 2.64 vs log10 2.54) than does with single kids. The elastometric parameters of the milk from the goats in the third parity showed higher "r" values than the other goats. The clotting time “r” and curd firmness “a30” of the milk from goats that have had multiple kids were better than from goats with single kids. KEY WORDS: Maltese goat, milk quality, clotting properties INTRODUZIONE In Italia la consistenza del patrimonio caprino, in continua diminuzione da decenni, ha fatto registrare negli ultimi anni una certa inversione di tendenza. L’attuale popolazione caprina ammonta a più di un milione di capi, di cui oltre 800.000 sono capre. Questo patrimonio è concentrato prevalentemente nel meridione e nelle isole, mentre la restante parte è distribuita nell’Italia centrale e settentrionale, con preminenza di quest’ultima sulla prima. Nel meridione e nelle isole sono presenti principalmente animali rustici e quindi meglio adatti alle condizioni di allevamento tipiche di tali regioni, ma con portata lattea individuale di modica entità ed allevati in greggi di scarsa consistenza (il 90 % non supera i 50 capi). Nell’Italia centro-settentrionale si è invece diffuso un allevamento di tipo intensivo, fondato sullo sfruttamento di capre altamente selezionate, ad elevato potenziale produttivo, per lo più di provenienza estera. Secondo i dati forniti dall’ASSONAPA, la produzione nazionale di latte di capra ammonta a 1.400.000 quintali, quantitativo questo, non rilevantissimo se confrontato con i capi allevati, ma che rappresenta comunque un primo segnale dell’evoluzione di questo allevamento. Al di là delle cifre della consistenza numerica e della produzione di latte, che da sole risultano quanto meno insufficienti e non consentono di fotografare nel suo complesso questo momento di evoluzione, si può dire che il fenomeno più interessante e significativo sia rappresentato proprio dalle trasformazioni strutturali dell’allevamento che hanno comportato una sua specializzazione insieme 136 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES all’adozione delle più moderne tecnologie. Questa evoluzione che si è registrata nel settore caprino, ha fatto sentire i suoi benefici effetti anche in Sicilia . Nell’isola vengono allevati circa 122.000 caprini (ISTAT 2001), di questi la maggior parte è rappresentata da razzepopolazioni in via di definizione come la “Capra Messinese” e “l’Argentata dell’Etna”, mentre il resto numericamente inferiore è costituito da razze etnicamente definite come la Camosciata delle Alpi, la Saanen, la Girgentana, la Derivata di Siria e la Maltese (Zumbo et al. 1998). Quest’ultima originaria dell’Asia Minore, si è diffusa nei paesi del mediterraneo, e dall’isola di Malta, da cui prende il nome, è giunta in Italia attraverso la Sicilia (Portolano, 1987). Proprio nella nostra isola questa capra da sempre ha trovato un habitat ideale tanto che oggi da molti viene considerata una razza autoctona. La Maltese, docile e rustica, adattabile a diversi ambienti, mostra una spiccata attitudine lattifera. Il suo latte è caratterizzato dall’assenza dell’odore e sapore ircino, destinato in passato al consumo diretto, oggi viene utilizzato per la produzione di formaggi caprini o caseificato con quello di altre specie per la produzione di formaggi tradizionali siciliani. Scopo della presente ricerca è stato quello di fornire un contributo allo studio della quantiqualità del latte prodotto da questa razza, considerata tra le più produttive tra quelle che vengono allevate in Sicilia. MATERIALE E METODI L’indagine è stata condotta nel corso della lattazione, analizzando il latte individuale di 60 Capre Maltesi, di diversa età ed ordine di parto, provenienti da un allevamento sito in provincia di Agrigento. L'alimentazione era basata sull’utilizzo di pascoli polifiti ed integrata con la somministrazione di 1000 g capo/die di un mangime per capre in lattazione avente la seguente composizione chimica (SS 87,2 %; PG 15,5 %/ss; FG 26,3%/ss; NSC 35,7%/ss; UFL 0,84/kg di ss) ripartito tra la mattina e la sera e somministrato dopo la mungitura. A partire dal primo mese di lattazione, con cadenza mensile e per l’intera durata di essa, è stato eseguito il controllo individuale della quantità di latte prodotto nel corso di due mungiture giornaliere, effettuate alle ore 6:30 ed alle 17:30; contemporaneamente sono stati prelevati campioni individuali di latte per la determinazione del grasso, delle proteine totali, del lattosio e del contenuto in cellule somatiche attraverso l'apparecchio Combifoss 6200 (Foss Electric). Sui singoli campioni sono stati anche determinati il pH, l'acidità titolabile (°SH) e tramite tracciato lattodinamografico l'attitudine alla coagulazione del latte con apparecchio Formagraph (Foss Electric) attraverso i parametri r (tempo di coagulazione), k20 (velocità di formazione del coagulo) e a30 (consistenza del coagulo) utilizzando la metodica proposta dalla Commissione ASPA 1995. I dati ottenuti sono stati sottoposti ad elaborazione statistica, impiegando un modello di analisi della varianza (SAS, 1990) a due fattori: ordine di parto e tipo di parto. L'ordine di parto è stato suddiviso in primo, secondo, terzo, quarto ed oltre, mentre il tipo di parto comprende due livelli: parto singolo e gemellare. È stata inoltre effettuata un analisi delle correlazioni di Pearson. 137 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES RISULTATI E DISCUSSIONE Le produzioni medie giornaliere (Tab 1) sono state superiori per le capre di quarto parto ed oltre (P ≤ 0.01) in accordo con quanto riportato da Giaccone et al. (1995) su capre Derivate di Siria e da Zumbo et al (2004) su “Capre Messinesi” entrambe allevate in Sicilia. Per quanto riguarda l’aspetto qualitativo, il contenuto percentuale di grasso e proteine è risultato, al contrario maggiore nelle capre di primo parto, caratterizzate da una minore produzione di latte. Il contenuto in CCS ha fatto registrare un valore significativamente inferiore per le capre di primo parto. Relativamente al tipo di parto le capre con parto gemellare hanno mostrato differenze statisticamente significative (P ≤ 0.05) riguardo alla produzione di latte ( 1979 vs 1839), alla percentuale di lattosio (4.84 vs 4.76) e al contenuto in cellule somatiche CCS (log10 2.64 vs log10 2.54). In particolare la maggiore produzione di latte nelle capre con parto plurimo, potrebbe essere giustificata dall’effetto della maggiore quantità di ormoni placentari prodotti lungo l’arco della gravidanza e dalla maggiore azione di suzione dei capretti nelle capre con parti plurimi (Zumbo et al. 2004). Per quanto riguarda i parametri lattodinamografici riportati in Tabella 2 le capre di terzo parto hanno messo in evidenza valori maggiori di "r" e minori di "a30", che sono risultati significativi rispetto a quelli registrati per le capre di primo, secondo e quarto parto ed oltre. Per il tipo di parto valori maggiori per il tempo di coagulazione e minori per la consistenza del coagulo si sono avuti per le capre con parto singolo. Nessuno dei due fattori considerati (ordine di parto e tipo di parto) ha influenzato la velocità di formazione del coagulo. Dall'analisi delle correlazioni (Tab.3) si evince la nota associazione negativa tra quantità e qualità del latte. Infatti è emersa una correlazione negativa tra la percentuale di grasso e proteine e la produzione media giornaliera di latte ( r=-0.265 e r=-0.181, rispettivamente) in accordo con quanto riportato da Costantinou (1984) e da Zumbo et al (2004). Per il lattosio, analogamente a quanto ottenuto da Riggert (1980) e da Kala e Prakash (1990) è stata evidenziata una correlazione positiva (r=0.247) tra produzione totale di latte e contenuto percentuale in lattosio. Significativa (P< 0,05) è risultata anche la correlazione tra quantità di latte ed il contenuto in cellule somatiche (r= - 0.125). Negativa è risultata la correlazione tra la consistenza del coagulo (a30) e il contenuto in cellule somatiche, che viceversa è apparso correlato positivamente con il tempo di coagulazione, confermando, pertanto, il ruolo negativo esercitato da queste cellule sulle caratteristiche casearie del latte. Positiva è stata la correlazione tra la percentuale di proteina ed il parametro a30 ( r= 0.385; P≤0,01). Tutti i parametri lattodinamografici sono risultati correlati positivamente con il pH. CONCLUSIONI Le indicazioni emerse da questo studio contribuiscono ad ampliare le conoscenze sulla buona capacità produttiva della capra Maltese. Si è osservato,infatti, che il latte prodotto da queste capre, elevato dal punto di vista quantitativo presenta delle caratteristiche di qualità e di attitudine alla trasformazione casearia che lo rendono sicuramente idoneo per la produzione di pregiati formaggi freschi e stagionati. 138 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Tabella 2 - Medie stimate dei parametri lattodinamografici Fattori Livelli r (min) k20 (min) a30 (mm) 1 8.36± 0,47 A 4.25±0.29 34± 1.61 a 2 8.47±0.46 A 4.24±0.30 33± 1.58 a Ordine di 3 9.52±0.50 B 4.92±0.32 31± 1.69 b parto 7.56 ±0.48 C 4.36±0.31 34± 1.62 a ≥4 Tipo di 1 9.07± 0.34 A 4.20±0.23 31±1.16 a Parto 2 8.07± 0.33 B 4.22±0.20 34± 1.12 b Lettere minuscole e maiuscole diverse sulla stessa colonna indicano differenze significative rispettivamente per P<0.05 e P<0.01. Tabella 3- Matrici dei coefficienti di correlazione (%) Prodl Grasso Proteine Lattosio pH atte Prod.latte 1 -0.265** -0.181** 0.247** 0,074 °SH CCS r a30 k20 0.038 -0.125* 0.157* 0.125* 0,138 Grasso -0.220** 0.237** 0.168** 0.015 0.037 Proteine Lattosio pH °SH CCS r a30 k20 1 0.082 -0.109 0,075 1 0.307** 0,072 0.498** -0.150** -0.290** 0.385** 0.040 1 0.382** -0.296** 0.208** 0.301** 0.025 -0.121* -0.118* 0.375** 0.218** 0.173* 1 -0.301** -0.128* 0.314** -0.101 1 0,165* -0.203** 0,105 1 0.264** 0.273** 1 -0.082 0.085 1 1 °SH – acidità titolabile; CCS – contenuto cellule somatiche; r – tempo di coagulazione; k20 - velocità di formazione del goagulo; a30 - consistenza del coagulo • = P < 0.05; **= P < 0.01 BIBLIOGRAFIA ASPA, (1995) Commissione metodologie di valutazione della produzione quantiqualitativa del latte - Metodi di analisi del latte delle principali specie di interesse zootecnico. Università degli Studi di Perugia. BERTONI G., BERNABUCCI U., ROSATINI U. (1988) Rapporto tra indice di gemellarità e produzione lattea in pecore di razza Comisana. Atti VIII Convegno SIPAOC. Pp 69-75 CHIOFALO L., MICARI P., CHIOFALO V., ZUMBO A., MESSINA F., (1992) Composizione chimica, cellule somatiche lattodinamografia e caseine nel latte di caprini, di aree interne della Sicilia, seguiti nel corso della lattazione, Atti S.I.S.Vet XLVI. COSTANTINOU, A., (1984) Studies on the lactation of Damascus goat and growth of their kids.Anim. Breed. Abstr., 52, 336 (Abstr) 139 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES FINOCCHIARO R., SARDINA M.T., BUDELLI E., VAN KAAM J.B.C.H.M., RUNDO SOTERA A. ZUMBO A., PORTOLANO B., (2004) Indagine preliminare sul polimorfismo lattoproteico in diverse popolazioni caprine allevate in Sicilia. Atti XVI Congresso SIPAOC, Siena, pg 281. FINOCCHIARO R., ZUMBO A., RUNDO SOTERA A., SARDINA M.T., PORTOLANO B., (2005) La Capra Messinese: risorsa genetica autoctona Siciliana. Informatore Zootecnico, GIACCONE, P., PORTOLANO, B., BONANNO, A., ALICATA, M.L., TODARO, M., (1995) Aspetti quanti-qualitativi della produzione lattea nella popolazione caprina Derivata di Siria. Zoot. Nutr. Anim., 21, pp. 97-109. ISTAT (2001) V Censimento dell’Agricoltura, su www.Istat/Banche-dati.htm KALA S.N. & PRAKASH B. (1990) Genetic and Phenotipic parameters of milk yield and milk composition in two Indian goat breed. Small Rum. Res. 3,475-484 LOUCA A., MAVROGENIS A., LAWLOR J. (1975) The effect of early weaning on the lactation performance of Damascus goats and growth rate of the kids. Animal Production, 20:213-218 MORGANTE M., RANUCCI S., DE VUONO F., (1995) Fattori di variabilità non infettivi del numero di cellule somatiche nel secreto mammario di pecore e capre. Nota II. Fattori Zootecnici e individuali. Acta Med. Vet. 41, 429-438. PORTOLANO N. (1987) Pecore e capre Italiane. ED. Ed agricole, Bologna, 1987, 1336 RIGGERT E.H. (1980) Milk yield of German improved fown goats in lactations 1-8 Anim. Breed. Abstr., 48,360 (Abstr) ROGUINSKY M., POUTREL B., SECO J.P., PILLET R., (1980) Etude cellulaire et bacteriologique sur les laits de tropeau de chevres. Le lait, 60, 27-32. SAS, 2001. Statistical Analysis System user's guide National Academy Press, Washington D.C. ZUMBO A., CHIOFALO L., LIOTTA L. (1998) Indagini sulla produzione del latte nella capra “Argentata dell'Etna”. Parametri quanti-qualitativi. XIII Congresso Naz. SIPAOC, Palermo, 16-19 Aprile 1998, pg. 441-444. ZUMBO A., CHIOFALO V., PORTOLANO B., CHIOFALO L. (1999) Clotting properties of milk from “Derivata di Siria” goat during the lactation. VII Congresso Fe.Me.S.P.Rum, Santarem (Portogallo) 21 – 24 Aprile, pg. 171-174 ZUMBO, A., CHIOFALO, L., LIOTTA, L., (2000) La Capra Argentata dell’Etna. L’allevatore di ovini e caprini. 1, pp. 1-2 ZUMBO A., CHIOFALO B., LIOTTA L., RUNDO SOTERA A., CHIOFALO V., (2004) Quantitative and qualitative milk characteristics of Nebrodi goats., South African Journal of Animal Science, 34 Suppl. 1, 210- 212.of Animal Science, 34 Suppl. 1, 210- 212. RINGRAZIAMENTI Si ringrazia per la fattiva collaborazione l’Assistente Tecnico Sig. Dell’Acqua Stellario della Sezione di Zootecnica e Nutrizione Animale del Dip. MO.BI.FI.PA. dell’Università degli Studi di Messina. 140 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES EFECTO DE LA ESTACION DEL PARTO SOBRE LAS CARACTERISTICAS CUANTI-CUALITATIVAS DE LA LECHE DE CABRA “DERIVADAS DE SIRIA” EFFECT OF THE “SEASON OF KIDDING”ON THE QUANTITATIVE AND QUALITATIVE CHARACTERISTICS OF THE MILK OF “DERIVATA DI SIRIA”GOATS ZUMBO A., DI ROSA A.R., AMATO C., MARESCA L. Dept. MO.BI.FI.P.A. - University of Messina, Polo Universitario dell'Annunziata, 98168 Messina, Italy ABSTRACT In this study, the quantity and quality of milk production of the “Derivata di Siria”- goats reared in Sicily was evaluated , and the impact of he « season of kidding» (fall and winter ) was defined. The investigation was carried out on 60 “Derivata di Siria” goats reared in the province of Agrigento. The quantitative and qualitative parameters of the goats’ milk production were significantly influenced by the season in which the kidding took place. In fact , the goats that were raised during fall evidenced a longer period of lactation (225d vs 130d, P≤0,01), a higher daily milk yield ( 1,65 kg/d vs 1,57 kg/d , P≤0,05 ) , major fat levels (4,21 vs 3,90 %, P≤0,01) and protein levels ( 3,52 vs 3,22 %, P≤0,01),as well as a better milk clotting properties. KEY WORDS: ”Derivata di Siria” goat, season of kidding, milk quality INTRODUCCION En el ambito del patrimonio caprino criado en Sicilia, encontramos una raza-poblaciòn de pelaje rojo màs o menos oscuro denominada “derivada de Siria” o “roja Mediterranea”. Esta poblaciòn caprina se origina de la cabra de Damasco o de Siria criada en los paises del norte de Africa y llega a Sicilia en la época en la que Roma extendiò su imperio a las tierras Mediterraneas Afro-Asiàticas (Portolano 1987). Gracias a los florecientes intercambios comerciales entre Medio-oriente y Mediterraneo y gracias a la civilizaciòn Arabe, se importaron en Sicilia ovejas y cabras provenientes del Norte de Africa y de las islas de Malta y de Cipre (Schembri , 1995). En el tiempo, mediante cruces con otras poblaciones caprinas y posterior mestizaje selectivo, se llega a la constituciòn del grupo etnico presente hoy en Italia, que se diferencia de forma màs o menos sustancial de la cepa originaria. Esta poblaciòn , en el ultimo decenio, ha adquirido una importancia siempre mayor en el contexto de la crianza caprina Siciliana. Actualmente, segùn los datos facilitados de la asociaciòn de Criaderos regionales de Sicilia, las productoras criadas son de cerca de 130000 para una estima complesiva de casi 20000 cabezas distribuidas entre las nueve provincias Sicilianas. La poblaciòn derivada de la Siria encuentra su espacio tambièn en otras regiones de Italia como la Basilicata, la Calabria, la Campania y el Lazio. Rusticalidad, adaptaciòn a ambientes nuevos, producciòn làctea, proliferaciòn elevada son caracteristicas que sitùan a esta cabra al mismo nivel de la màs noble y difundida cabra Maltese. La intenciòn de este estudio, considerando la funciòn que la capricultura puede desarrollar en las ares internas de la Sicilia, ha sido realizar una bùsqueda sobre la cabra “ derivada de 141 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Siria” con el fin de aprofundizar el conocimiento de la composiciòn fisico-quimica de la leche y su actitud a la trasformaciòn casearia. Bajo esta òptica se ha considerado el estudio de la estaciòn del parto, que sabemos puede representar uno de los factores en grado de modificar las caracteristicas cuanti-cualitativas de La leche durante la lactancia. MATERIAL Y METODOS La bùsqueda se ha realizado sobre 60 cabras “Derivadas de Siria” provenientes de una cria situada en provincia de Agrigento.Se han individuado las cabras pròximas al parto y se identificaron con un collar numerado.Para cada sujeto se han registrado los datos referentes a la fecha del parto, la edad al parto y el numero de cabritos nacidos.El règimen alimentario al que han sido sometidas las cabras durante el periodo de prueba estaba basado en el provecho para el pasto de los recursos forestales disponibles en cada estaciòn, integradas, a excepciòn de la primavera, con habichuelas enteras.A partir del segundo mes de lactancia, mensualmente se ha realizado el control individual de la cantidad de leche producido en el curso de ordenar dos veces diarias, efectuadas a las horas 7:00 y a las 16:00; contemporaneamente se tomaron muestras individuales de la leche para la determinaciòn de la grasa, de las proteinas totales, de la lactosa y del contendo en cèlulas somàticas mediante el aparato Combifoss 6200( foss Electric). Sobre cada maestra ademàas se han determinado PH, acidez titulable,(°SH) y mediante trazado lactodinamogràfico la actidud a la coagulaciònde la leche con el aparato Formagraph ( foss electric) mediante los paràmetros r (tempo de coagulaciòn), k20 ( velocidad de formaciòn del coagulo) y a30(consistencia del coagulo) usando el mètodo recomendado de la Comisiòn ASPA 1995. Para la eleboraciòn estadistica los paràmetros considerados fueron la cantidad total de leche, el porcentaje de grasa, proteinas y lactosa, el contendo en cèlulas somàticas (CCS), il PH, la acidez titulable(°SH) y los paràmetros elastomètricos r, k20 y a30. El factor considerado en el anàlisis meses de octubre, novembre y dicembre y aquellas con parto en enero, febrero y marzo, definendo otoñal el primer periodo e invernal el segundo. El analisis estadistico se realizò con ANOVA del software estadistico SAS (2001). RESULTADOS Y CONCLUSIONES Parametros cuantitativos La estaciòn del parto(tab.1) ha influenciado claramente la producciòn total de leche.Estos resultados vienen interpretados en funciòn de la duraciòn de la lactancia, ya que las cabras con parto otoñal presentan lactancias màs largas respecto a las cabras con parto invernal (225d vs 130d, P ≤0,01)ya que en Sicilia por efecto de la sequia durante el verano, las lactancias terminan al final de julio.Ademàs, el efecto de la estaciòn se puede apreciar particolarmente esaminando las medias estimadas relativas a la producciòn diaria. De hecho, la mayor producciòn diaria (tab.1) de las cabras con parto invernal respecto a aquellas con parto otoñal (1,65 kg/d vs 1,57 kg/d, P≤ 0,05)es un indice claro de como la estaciòn puede influenciar la producciòn de la leche,tambien màs allà de la duraciòn de la lactancia.A la estaciòn del parto convergen por tanto toda una serie de factores que pueden influenciar distintamente la productividad de las cabras, siendo entre estos la causa principal la disponibilidad para alimentarlas.Siendo esta mayor durante la primavera, consiente a las cabras con parto otoñal una mayor duraciòn de la lactancia, con repercusiòn 142 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES directa sobre la productividad total;Por el contrario las cabras con parto invernal se aprecia una mayor producciòn diaria pero que con la llegada del verano, presentan una reducciòn del tiempo de lactancia, que al final supone una fuerte limitaciòn de la producciòn total. Parametros cualitativos Por cuanto interesa a la cualidad de la leche, en la tabla 2 se hace referenzia a los porcentuales de grasa, proteinas y lactosa.Tambien para la cualidad la estacion del parto se ha demostrado como factor importante de variaciòn. En efecto son las cabras con parto otoñal las que evidencian un portentaje de grasa màs elevado (4,21% vs 3,90 %, P≤ 0,01) y de proteinas ( 3,52% vs 3,22%, P≤ 0,01) respecto a aquellas que paren en los meses invernales.Estas variaciones podrian deberse al efecto de las distintas fuentes alimentarias a disposiciòn para los animales en las dos estaciones productivas para mantener sus necesidades en las distintas fases de la lactancia.En el periodo otoño-inverno caracterizado caracterizado por una escasa disponibilidad del pasto , la alimentaciòn viene integrada con habichuelas , mientras que en los meses primaverales las cabras consumen exclusivamente forraje verde que consumen en el prado.Este ultimo por su elevada composiciòn de agua y proteinas, pemite la màxima expresiòn de la productividad quantitativa, como se ha evidenciado en los niveles productivos diarios obtenidos en la estacion invernal.Por otra parte, el pasto verde, representando la unica fuente alimentaria podria no ser por si mismo equilibrado, particolarmente en lo que se refiere a fibra y calorias, para mantener una correcta producciòn de gasa y proteinas.Por otra parte, la observada relaciòn negativa entre producciòn diaria y cualidad de la leche se justifica plenamente ,del punto de vista fisiologico, que el aumento de esta corresponda una disminuciòn de la calidad, a no ser que se intervenga sobre la alimentaciòn.Por ultimo no se puede excluir que tambièn la menor duraciòn de la lactancia pueda contribuir a un posterior empeoramiento de la cualidad de la producciòn total de la leche, debido a que la suspensiòn anticipada de la lactancia, al que van en contra las cabras que paren en inverno,excluye la fase final de la lactancia, caracterizada de un aumento de la tasa de gasa y proteinas. Es importante recordar como el porcentaje de lactosa no ha sido influenciado por la estaciòn del parto.La lactosa, de hecho, como se encuentra en la literatura, es el componente màs estable de la leche. Actitud a la coagulaciòn El pH (tab.3) ha registrado un valor estadisticamente màs bajo en las cabras con parto en otoño respecto a aquellas con parto invernal.(6,65 vs 6,72 ,P≤ 0,05 ).No existe ninguna diferencia entre los dos grupos respecto a la acidez titulable(°SH). Por cuanto reguarda al contenido en cèlulas somàticas (CCS)se ha observado un valor màs alto, aunque no estadisticamente significativo en las cabras con parto invernal (5.73 vs 5.96).En relaciòn a los paràmetros elastomètricos (tab.4) se han registrado diferencias estadisticamente significativas para el tempo de coagulaciòn (r) y para la consistencia del coagulo( a30 )Especificamente la leche de las cabras con parto otoñal ha demostrado una mejor actitud a la coagulaciòn respecto a las cabras con parto invernal visto que los valores de r han sido menores( 8.25 vs 10.83, P≤ 0,05)mientras aquellos de a30 superiores (40 vs 35, P ≤ 0,01) Estos resultados podrian explicarse por los menores valores del pH y del contenido de cèlulas somàticas obtenido en la leche producila por las cabras con parto otoñal.Se observa, de hecho, en la literatura que un aumento en la acidez de la leche y una 143 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES disminuciòn del contendo en cèlulas somàticas provoca una disminuciòn del tiempo de coagulaciòn y un aumento de la consistencia del coàgulo que se traduce en una mejor caseificaciòn. CONCLUSIONES El estudio efectuado ha demostrado el notable efecto que la estaciòn del parto ha ejercido sobre la producciòn cuantico-cualitativa de la leche, influendo indirectamente, a travès de la disponibilidad de pastos estacional, sobre la desarrollo de la lactancia y la duraciòn de la misma. Para evitar estos problemas asociados a la estaciòn del parto, seria por tanto conveniente la administraciòn de raciones adecuadas de alimentos, suficientes para poder mantener la producciòn de la leche de estas cabras, sea del punto de vista cualitativo que quantitativo. Por otro lado,los resultados obtenidos de este estudio, la buena cantidadnumèrica, la difusiòn en buena parte del territorio Siciliano, son motivos seguramente vàlidos para considerar la cabra “ derivada de Siria” merecedora de tutela y valorizaciòn. Tabla 1 – Producciòn total de leche, duraciòn de la lactancia y producciòn diaria Estaciòn Producciòn total de Duraciòn lactancia Producciòn diaria leche (d) (kg/d) (kg) Otoño 352,4 A 225 A 1,57 a Invierno 213,5 B 130 B 1,65 b Sobre columna a,b = P≤ 0,05; A, B = P≤ 0,01 Tabla 2 – Percentaje de grasa, proteinas y lactosa (medias estimadas) Estaciòn Grasa % Proteinas % Lactosa % Otoño 4,21 A Invierno 3,90 B Sobre columna A, B = P≤ 0,01 3,52 A 3,22 B 4,64 4,62 Tabla 3 – Valores de pH, °SH y cèlulas somàticas (medias estimadas) Estaciòn pH °SH CCS Log10 Otoño 6,65 a Invierno 6,72 b Sobre columna a, b = P≤ 0,05 7.25 7.20 Tabla 4 – Parametros elastometricos: r, k20 e a30 (medias estimadas) a30 (mm) Estaciòn r (min) 40 A Otoño 35 B Invierno Sobre columna A, B = P≤ 0,01 144 8.25 A 10.83 B 5.73 5.76 k20 (min) 1.84 1.92 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS A.I.A. (1992) Controlli della produttività del latte in Italia. Roma 1992 ASPA, (1995) Commissione metodologie di valutazione della produzione quanti-qualitativa del latte - Metodi di analisi del latte delle principali specie di interesse zootecnico. Università degli Studi di Perugia. CHIOFALO L., MICARI P., CHIOFALO V., ZUMBO A., MESSINA F., (1992) Composizione chimica, cellule somatiche lattodinamografia e caseine nel latte di caprini, di aree interne della Sicilia, seguiti nel corso della lattazione, Atti S.I.S.Vet XLVI. CHOUEIRI E. (1974) The damascus goat, the future milking animal of the Mediterranean countries. Animal Breeding Abstract, 42:441 COSTANTINOU, A., (1984) Studies on the lactation of Damascus goat and growth of their kids.Anim. Breed. Abstr., 52, 336 (Abstr) FINOCCHIARO R., SARDINA M.T., BUDELLI E., VAN KAAM J.B.C.H.M., RUNDO SOTERA A. ZUMBO A., PORTOLANO B., (2004) Indagine preliminare sul polimorfismo lattoproteico in diverse popolazioni caprine allevate in Sicilia. Atti XVI Congresso SIPAOC, Siena, pg 281. FINOCCHIARO R., ZUMBO A., RUNDO SOTERA A., SARDINA M.T., PORTOLANO B., (2005) La Capra Messinese: risorsa genetica autoctona Siciliana. Informatore Zootecnico, GIACCONE, P., PORTOLANO, B., BONANNO, A., ALICATA, M.L., TODARO, M., (1995) Aspetti quanti-qualitativi della produzione lattea nella popolazione caprina Derivata di Siria. Zoot. Nutr. Anim., 21, pp. 97-109 GIACCONE P., PORTOLANO B., TODARO M., (1998) La capra Derivata di Siria allevata in Sicilia. Ed. Italo Latino-Americana Palma, Palermo. LOUCA A., MAVROGENIS A., LAWLOR J. (1975) The effect of early weaning on the lactation performance of Damascus goats and growth rate of the kids. Animal Production, 20:213-218 MAVROGENIS A.P., COSTANTINOU A., LOUCA A. (1984) Enviromental and genetic causes of variation in production traits of Damascus goats. 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(1999) Clotting properties of milk from “Derivata di Siria” goat during the lactation. VII Congresso Fe.Me.S.P.Rum, Santarem (Portogallo) 21 – 24 Aprile, pg. 171-174 145 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES ZUMBO, A., CHIOFALO, L., LIOTTA, L., (2000) La Capra Argentata dell’Etna. L’allevatore di ovini e caprini. 1, pp. 1-2 ZUMBO A., CHIOFALO B., LIOTTA L., RUNDO SOTERA A., CHIOFALO V., (2004) Quantitative and qualitative milk characteristics of Nebrodi goats., South African Journal of Animal Science, 34 Suppl. 1, 210- 212.of Animal Science, 34 Suppl. 1, 210- 212. 146 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES CORTISOL LEVELS AS INDICATOR OF STRESS IN DOMESTIC GOATS UNDER DIFFERENT HOUSING SYSTEMS FAZIO E., MEDICA P., CAVALERI S.*, CRAVANA C., FERLAZZO A. Department of Morphology, Biochemistry, Physiology and Animal Productions, Unit of Physiology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Messina.*Veterinary surgeon KEY WORDS: cortisol, goats, housing systems, stress SUMMARY Aim of this study was to define the adrenocortical response to differentiated effects of housing systems of goats. Circulating cortisol levels of No. 32 Camosciata delle Alpi goats (No. 23 females and No. 9 males) were evaluated, by taking into account the influence of the different stabling, and were divided in three groups, respectively Group A: No. 10 females stabled in paddock, aged 1-2 years, Group B: No. 9 males stabled in paddock, aged 1 - 3 years and Group C: No. 13 females half-stabled, aged elder than 2 years. Significative effects of stabling (F= 4.20; p<.02) were obtained for cortisol modifications. Females stabled (Group A) showed cortisol mean levels equal to 66.16 ± 15.57 nmol/L, males stabled (Group B) showed cortisol mean levels equal to 65.38 ± 17.86 nmol/L and females half-stabled (Group C) showed cortisol mean levels equal to 50.17 ± 12.16 nmol/L. No significative differences were obtained between female and male subjects. However, stabled goats, both females (p< .02) and males (p< .01), showed higher cortisol levels than half-stabled subjects. The reduction in adrenocortical response observed in half-stabled goats in spring may also probably reflect their better coping environmental strategies with respect to stabled goats. Endocrine data regarding physiological responses to different stress factors under different housing systems of goats will help in designing facilities and in determining management practices that are ideal for productive and reproductive goat performances. INTRODUCTION Different types of stressors may elicit varying degrees of responses in animals. Some housing systems can be a source of stress for goats and domestic animal in general (Hargreaves and Hutson, 1990; Blackburn 1995; Le Neindre et al., 1996; Palestrini et al., 1998). Many physiological indicators can be used to evaluate the coping environmental strategies, and consequently the adaptative capacities of animals to different types of housing systems, such as concentrations of plasma cortisol, glucose, and creatine kinase, that are useful indicators of stress and muscle damage in goats (Kannan et al., 2000). Data are very limited on physiological responses to stress in goats. Some published information is available on the effect of preslaughter stress on meat quality in goats (Kannan et al., 2000; 2001; 2002; 2003). Plasma cortisol concentration increase within 30 min after the beginning of transport and reach a peak value at 1 h in adult male goats; in addition, young goats had higher plasma cortisol concentrations than older ones. Conversely, the magnitudes of cortisol responses to transport stress in old goats were greater compared with young goats, which resulted in significant age main effects (Nwe et al., 1996). 147 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES The isolation of goats from their social group can cause increased emotional stress, reflected by elevated cortisol concentrations. When social isolation was not combined with holding treatment, the stress levels were significantly lower in goats that were able to maintain visual contact with other animals (Kannan et al., 2002). The study was undertaken in order to add information to the literature on the goat’s adaptative response to different housing systems. MATERIALS AND METHODS The study was carried out on a total of No. 32 Camosciata delle Alpi goats, No. 23 females and No. 9 males, submitted to different stabling. In according to stabling the subjects were divided in three groups, respectively Group A (No. 10 non pregnant females stabled in paddock, aged 1-2 years), Group B (No. 9 males stabled in paddock, aged 1 - 3 years) and Group C (No. 13 non pregnant females half-stabled, aged elder than 2 years). Blood samples were collected by jugular vein at 03.00 p.m., in basal conditions, in every groups. Circulating cortisol levels were determined in duplicate by immunoenzymatic assays supplied by RADIM. Statistical analysis by one-way repeated measures analysis of variance (ANOVA) was applied. Significant differences between female and male subjects, and among Group A, B and C were assessed using Student’s paired t-test. The level of significance was set at <.05. All calculations were performed using the PRISM package (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). RESULTS Data obtained are presented as mean ± standard deviation (S.D.) in Figure 1. Significant differentiated effects of stabling (F= 4.20; p< .02) were obtained for cortisol modifications. Females stabled (Group A) showed cortisol levels equal to 66.16 ± 15.57 nmol/L, males stabled (Group B) showed cortisol levels equal to 65.38 ± 17.86 nmol/L and females halfstabled (Group C) showed cortisol levels equal to 50.17 ± 12.16 nmol/L. No significant differences were obtained between different gender and age of stabled subjects. As compared to basal values of Group C, Group A and B showed respectively increases of cortisol levels both in stabled female (p<.02) and in stabled male (p<.01) subjects. 148 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Figure 1 - Circulating cortisol levels (M ± S.D.) of domestic goats under different housing systems 90 * ** 80 cortisol (nmol/L) 70 60 50 40 30 20 10 0 Group A Explanation: .01 Group A= stabled females Group B= stabled males Group C = half-stabled females Group B Group C vs Group C: * P< .02; **P< DISCUSSION Data obtained showed higher circulating cortisol levels both in stabled female and male than in half-stabled female goats. This preliminary investigation has shown that different housing systems may affect the adrenocortical responses of domestic goats. Although goats are gregarious animals, prefer to live in social groups and appear to enjoy human contact, in our experimental conditions agitation was caused by the presence and manipulation by an unfamiliar person, which was reflected by an increase of cortisol levels more in half-stabled than stabled subjects. However, in all the three types of housing system, cortisol levels remained within the physiological range -equal to 65 ± 8 nmol/L- reported for goats (Kaneko, 1989), probably indicating a good adaptative capacity in these species under different housing conditions. The regulation of adrenocortical response to cope with different environmental conditions is a complex processes in all mammals; therefore, the difference in glucocorticoid production between stabled and half-stabled goats, used in this study, can be taken as the adaptative response to different housing systems. 149 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES The reduction in adrenocortical response observed in half-stabled goats in spring may probably reflect better coping environmental strategies than for stabled goats. The ability to produce the lowest amount of cortisol may partially explain the superiority of adaptation in half-stabled subjects. In addition, our data confirm lower cortisol mean levels reported in Alpine and Saanen goats exposed to sun radiation in a paddock without shade than the in same goats stabled in a paddock with shadow area (Rodriguez-Martinez et al., 2002). However, the lowest cortisol levels in half-stabled female goats could also be due to the oldest age of subjects. This result confirm data previously obtained by Kannan et al., (2003) that showed as young subjects had higher plasma cortisol concentrations than older ones after transport stress. The magnitude of cortisol changes following different housing systems suggests that stabled domestic goats aged 1-3 years had higher cortisol levels than half-stabled goats elder than 2 years. This study showed the importance and efficacy of the determination of circulating cortisol levels as an indicator of stress in domestic goats of different age under different housing systems. Further research on the role of other variables such as corticotrophin-releasing hormone (CRH) and CRH-binding protein, may explain how goats deal with housing systems, and how it affects productive and reproductive performance. REFERENCES 1) Blackburn H.D., J. Anim. Sci. (1995), 73, 302-309. 2) Hargreaves A.L. and G.D. Huston, Appl. Anim. Behav. Sci. (1990), 26, 253-256. 3) Le Neindre P. et al., Appl. Anim. Behav. Sci. (1996), 49, 73-81. 4) Palestrini C. et al., Small Ruminant Research (1998), 27, 177-181. 5) Kaneko J.J. In: "Clinical Biochemistry of Domestic Animals" (1989), (J.J. Kaneko, ed), Acad. Press, Inc. NY. 6) Kannan G. et al., J. Anim. Sci. (2000), 78, 14501457. 7) Kannan G. et al., J. Anim. Sci. (2001), 79, 447. 8) Kannan G. et al., J. Anim. Sci. (2002), 80, 1771-1780. 9) Kannan G. et al., J. Anim. Sci. (2003), 81, 1499-1507. 10) Nwe T.M. et al., Small Rum. Res. (1996), 20, 129-135. 11) Rodriguez-Martinez R. et al., J. Anim. Sci. (2002), 80, 291. 150 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES APPARATO LACRIMALE IN PECORE CON INFEZIONE DA Brucella spp.: REPERTI ISTOPATOLOGICI GHIANDOLARI ED ELETTROFORESI LACRIMALE LACRIMAL SYSTEM IN SHEEPS WITH Brucella spp INFECTION: GLANDULAR HISTOPATHOLOGICAL FINDINGS AND LACRIMAL ELECTROPHORESIS. GRUPPILLO A., GALIA S., BOSCO V.R.F., PARISI F., MAZZULLO G.*, PUGLIESE A. Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie, Università di Messina; * Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria, Università di Messina. PAROLE CHIAVE: apparato lacrimale, Brucella spp., pecora, real time PCR, istologia, elettroforesi. KEY WORDS: lacrimal system, Brucella spp., sheep, real time PCR, histology, electrophoresis. RIASSUNTO La ricerca è stata effettuata su n°20 pecore adulte siero-positive a Brucella spp.. Obiettivi del presente lavoro sono stati: individuare la presenza del batterio nell’apparato lacrimale attraverso la real-time PCR (ghiandola lacrimale principale e lacrime) e valutare eventuali lesioni isto-patologiche ghiandolari in rapporto alla presenza del batterio a livello oculare. Infine, determinare l’assetto quali-quantitativo del pattern proteico lacrimale, mediante elettroforesi su gel d’agarosio, al fine di evidenziare variazioni nella composizione proteica lacrimale. I tessuti ed i liquidi biologici prelevati sono stati sottoposti a real-time PCR per Brucella spp. La positività dei campioni è risultata del 100% per quanto riguarda il secreto lacrimale e leggermente inferiore per le ghiandole lacrimali. L’esame istologico effettuato sulle ghiandole positive alla PCR ha messo in evidenza la presenza di un infiltrato infiammatorio localizzato per lo più in sede perivascolare, verosimilmente riconducibile all’azione patogena delle brucelle sui tessuti presi in esame. L’elettroforesi lacrimale ha permesso di identificare nelle lacrime, su un valore di proteine totali di 7 g/dl, le seguenti frazioni proteiche: proteine a migrazione rapida (PMR) (valore medio: 15.82%); albumina (25.77%); lattoferrina ad elevato peso molecolare (37.55%) ed immunoglobuline (20.85%).Tali valori non presentano modificazioni significative rispetto al pattern proteico lacrimale fisiologico di specie. SUMMARY The research was carried on n°20 adult sheep serum-positive to Brucella spp. The objectives of this study were: to detect the bacterium into the lacrimal system using the real time PCR on the principal lacrimal gland and the tears, and to evaluate the histopathological lesions in the gland relate to the presence of the bacterial cell into the eye. Another aim was to determine the quali-quantitative protein lacrimal pattern using the agarose gel electrophoresis, underlying the possible variations in the protein composition of tears. On the biological samples the real-time PCR to detect Brucella spp. was carried. The lacrimal samples were all positive, while the lacrimal glands showed a lower positivity. The histological examination performed on the positive to Brucella spp. lacrimal glands showed the presence of an inflammatory perivascular infiltration, that can be related to the action of 151 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES the pathogen into the tissues. The lacrimal electrophoresis allowed to identify into the tears the following protein fractions (total protein: 7 g/dl): proteins with a rapid migration (PMR) (mean value: 15.82%); albumin (25.77%); lactoferrin with elevated molecular weight (37.55%) and immunoglobulines (20.85%). Those values not show significant differences in respect to the physiological lacrimal protein pattern of this animal specie. PREMESSA La brucellosi ovi-caprina, sostenuta prevalentemente da Brucella melitensis, è un’infezione cosmopolita ad elevata contagiosità e rappresenta una tra le malattie zoonosiche più diffuse in tutto il bacino del Mediterraneo. L’uomo può contrarre l’infezione per via diretta, ossia a seguito del contatto con animali infetti, oppure per via indiretta attraverso il consumo di latte non pastorizzato o formaggi freschi ottenuti da latte infetto (1). Nella specie ovina l’infezione può realizzarsi per via orale, per via transplacentare e attraverso il coito; inoltre, soprattutto negli animali stabulati al chiuso la mucosa congiuntivale può rappresentare una via di trasmissione dell’infezione da non sottovalutare. Il batterio, una volta introdotto nell’ospite e moltiplicatosi nei fagociti e nel tessuto linfoide, determina reazioni flogistiche a carattere granulomatoso (granuloma brucellare), essudatizio-necrotizzante o purulento in organi quali milza, fegato, midollo osseo e linfonodi. Possono inoltre essere coinvolti anche l’apparato genitale (utero e placenta di femmine gravide, con conseguente aborto), la mammella (micromastite interstiziale granulomatosa), i reni, il testicolo, l’epididimo, le articolazioni, le guaine tendinee, le borse sinoviali e l’apparato oculare. In quest’ultimo caso, le manifestazioni oculari più comunemente riportate sono rappresentate da forme di episclerite, uveite, neuropatia ottica ed endoftalmite (2-7). Considerato l’importante ruolo svolto dalla specie ovina nell’ambito dell’epidemiologia della malattia e la carenza di dati bibliografici relativi alla brucellosi oculare in questa specie animale, obiettivo del presente lavoro è stato quello di effettuare una valutazione delle strutture oculari in pecore infette. In particolare, abbiamo rivolto la nostra attenzione all’apparato lacrimale (ghiandola lacrimale principale) e al secreto lacrimale, dal momento che l’occhio ed i suoi annessi possono rappresentare la prima via di penetrazione del patogeno nell’organismo ospite e la sede di una prima reazione immunologica locale. MATERIALI E METODI La nostra ricerca è stata effettuata su n°18 pecore adulte, di razze diverse, sottoposte al piano nazionale di eradicazione della brucellosi ovina e caprina. Su tutti i soggetti, prima della macellazione, si è proceduto ad effettuare: prelievo di sangue, esame oftalmologico e raccolta del secreto lacrimale di ciascun occhio tramite pipette Eppendorf, munite di puntale, poste tangenzialmente alla mucosa del fornice congiuntivale ventrale. Subito dopo l’abbattimento è stata effettuata l’enucleazione dei globi oculari e, successivamente, il prelievo delle ghiandole lacrimali principali. Parte di tessuto ghiandolare ed un aliquota di secreto lacrimale sono stati sottoposti a realtime PCR per Brucella spp., Mycoplasma spp. e Chlamydophila spp., con limite di rilevabilità di 1 equivalente genomico per ml. I rimanenti campioni lacrimali, mantenuti in ambiente refrigerato (4°C) durante il trasporto in laboratorio, sono stati sottoposti ad esame spettrofotometrico, per la determinazione del contenuto proteico totale, e ad elettroforesi zonale su gel d’agarosio, per valutare l’assetto 152 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES quali-quantitativo del pattern proteico. L’identificazione di alcune frazioni proteiche contenute nelle lacrime è stata possibile grazie al confronto con protidogrammi di siero proveniente dagli stessi soggetti e sottoposti a migrazione parallela nelle medesime condizioni. La comparazione dei tracciati è stata possibile assumendo come riferimento la migrazione dell’albumina sierica, in quanto la quota di albumina lacrimale è anch’essa di derivazione ematica e la velocità di migrazione è identica in entrambi i campioni. Dai preparati istologici delle ghiandole lacrimali, previa fissazione dei tessuti in formalina tamponata al 10% e inclusione in paraffina, sono state ottenute sezioni di 4 µm di spessore, successivamente colorate con Ematossilina-Eosina (EE). RISULTATI La positività dei campioni per Brucella spp alla real-time PCR è risultata del 100% nel secreto lacrimale e del 41,66% nelle ghiandole. Di queste ultime, il 22,22% è risultato positivo solo a Brucella spp mentre nel 19,44% del campione esaminato la positività era legata alla compresenza di Brucella spp e Mycoplasma spp; La positività dei campioni per Mycoplasma spp. alla real-time PCR è risultata del 94,44% nel secreto lacrimale e del 69,44% nelle ghiandole, di cui il 50 % è risultato positivo solo a Mycoplasma spp. e il 19,44% a Brucella spp., associata a Mycoplasma spp. (Tabella 1 e 2); ancora, tutti i campioni sono risultati negativi per Chlamydophila spp. Nelle ghiandole lacrimali negative alla RT PCR per Brucella spp. l’esame istologico non ha messo in evidenza lesioni istopatologiche riconducibili all’azione patogena svolta dal batterio. Nelle ghiandole lacrimali risultate positive a Brucella spp. la valutazione istologica ha permesso di evidenziare un infiltrato infiammatorio localizzato per lo più in sede perivascolare e costituito prevalentemente da una popolazione linfo-istiocitaria e scarse plasmacellule. Relativamente al secreto lacrimale la concentrazione media delle proteine totali nei campioni oggetto di studio è stata di 7 g/dl. L’elettroforesi lacrimale, condotta in parallelo con la foresi sierica degli stessi soggetti quale campione di riferimento, ha permesso di identificare nelle lacrime le seguenti frazioni proteiche: proteine a migrazione rapida (PMR), albumina, lattoferrina ad elevato peso molecolare ed immunoglobuline. Le rispettive concentrazioni medie erano: PMR =1,13 g/dl (15.82%); albumina =1,75 g/dl (25.77%); lattoferrina ad elevato peso molecolare =2,61 g/dl (37.55%); immunoglobuline =1,49 g/dl (20.85%). Specie batterica Tipo di campione Secreto Ghiandola Tabella 1. Positività di ghiandole lacrimali e secreto. Specie batterica BRUCELLA SPP. MICOPLASMA SPP. CHLAMYDOPHILA SPP. 100% 41,66% 94,44% 69,44% - 153 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Tabella 2. Positività nella ghiandola lacrimale principale. BRUCELLA SPP. TOTALE BRUCELLA SPP. + 7 (19,45%) 18 (50%) 25 (69,45%) MICOPLASMA SPP. + 8 (22,22%) 3 (8,33)% 11 (30,55%) MICOPLASMA SPP. 15 (41,67)% 21 (58,33)% 36 (100%) TOTALE CONSIDERAZIONI E CONCLUSIONI La brucellosi rappresenta nel nostro paese un notevole problema per la salute pubblica, in quanto è caratterizzata da un’elevata diffusibilità tra la popolazione, comprese le categorie a rischio. Il coinvolgimento dell’apparato oculare in corso di brucellosi è un’evenienza tutt’altro che rara nell’essere umano, in cui sono stati osservati episodi di uveite ricorrente ed endoftalmite e più raramente cheratocongiuntivite e dacrioadenite. Al contrario, scarso interesse è stato riservato alle possibili lesioni oculari determinate da Brucella spp. negli animali da reddito (biblio). I risultati del presente lavoro sottolineano la presenza di Brucella spp a livello oculare nelle pecore, con particolare riferimento ad un interessamento dell’apparato lacrimale, come evidenziato dall’elevata positività dei test diagnostici impiegati, sia a livello del fluido lacrimale (100% di positività alla RT PCR) che delle strutture ghiandolari (40 % circa di positività). Tali riscontri, se da una lato evidenziano che il batterio può essere presente in elevate concentrazioni anche a livello oculare, dall’altro testimoniano la possibilità che le lacrime di animali infetti possono rappresentare un veicolo di trasmissione della brucellosi all’uomo e ad altri animali di non trascurabile interesse. Le lesioni istopatologiche riscontrate a livello delle ghiandole lacrimali positive tramite RTPCR a Brucella spp., pur non potendo essere considerate patognomoniche dell’infezione brucellare, possono essere verosimilmente ricondotte all’azione flogogena svolta da tali batteri sui tessuti ghiandolari presi in esame, confermando l’esistenza di una stretta correlazione tra brucellosi e lesioni oculari. La presenza dell’infiltrato linfoplasmocitario perivascolare ghiandolare può essere riconducibile, esclusivamente, all’azione flogogena di Brucella spp., considerata la negatività dei campioni esaminati a Chlamydophila spp. e l’assenza di lesioni istopatologiche ghiandolari in quei soggetti risultati positivi unicamente a Mycoplasma spp. I dati ottenuti nel presente lavoro rappresentano la prima segnalazione del coinvolgimento della ghiandola lacrimale principale in corso di infezione naturale di brucellosi ovina, così come dimostrato per le strutture extraoculari del bovino soltanto in seguito ad esposizione sperimentale al batterio. Diversamente nell’uomo sono già state riportate manifestazioni extra ed endo-oculari della malattia, con quadri clinici riferibili ad uveiti, endoftalmiti, dacrio-adeniti e neuriti ottiche (biblio). La valutazione elettroforetica delle proteine lacrimali degli animali infetti, comparata con il pattern proteico lacrimale della specie ovina in condizioni fisiologiche, non ha evidenziato differenze significative relativamente alla composizione quali-quantitativa del pool proteico lacrimale. 154 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Il quadro elettroforetico lacrimale riscontrato testimonia un normale funzionamento del sistema di produzione delle lacrime, evidentemente non inficiato in maniera significativa dalla presenza dei batteri in sede oculare. Ancora, la presenza di elevate concentrazioni di materiale genetico brucellare nelle strutture esterne dell’occhio (vedi tabella) può confermare, in analogia con quanto riportato in letteratura per la specie bovina (Meador VP et al., 1988), che la via congiuntivale possa rappresentare la porta d’ingresso della brucella nell’organismo ospite anche negli animali oggetto di studio. Quanto affermato sottolinea l’importanza di un precoce controllo diagnostico dei fluidi oculari, considerato che la oculo-congiuntivale rappresenta una via di trasmissione non trascurabile nell’ambito dell’epidemiologia della malattia, non potendo escludere a nostro avviso un contagio diretto intra ed interspecifico con tale materiale biologico, anche in assenza di lesioni oculari macroscopiche. Riteniamo, infine, che il nostro lavoro possa rappresentare un nuovo traguardo nell’ambito dell’epidemiologia e della profilassi della brucellosi, considerato che il riscontro di brucelle nella ghiandola lacrimale principale e nel secreto lacrimale di pecore infette è un reperto di nuova acquisizione, espressione della colonizzazione del patogeno nel segmento esterno dell’occhio. BIBLIOGRAFIA Hall WH (1991): Brucellosis. In: Evans AS & Brachman PS (Eds). Bacterial infection in humans. Plenum, New York, pp.133-149. Güngör K, Bekir NA, Namiduru M (2001). Acta Ophthalmol Scand, 79, pp. 76-78. Bekir NA, Güngör K, (1999). Acta Ophthalmol Scand, 77, pp. 357-358. Bekir NA, Güngör K, Namiduru M (2001). Eur J Ophthamol, 10, pp. 259-261. Solanes MP, Heatley J, Arenas F & Ibarra GG (1953). Am J Ophthamol, 36, pp. 675-689. Tabarra KF & Al-Kassimi U (1990). Am J Ophthamol, 74, pp. 249-250. Walker J, Sharma OP & Rao NA (1992). Am J Ophthalmol, 75, pp. 374-375. 155 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES ANALISI CHIMICA DELL’UMORE ACQUEO NELLA SPECIE OVINA: VALUTAZIONE COMPARATIVA CON CAMPIONI POSITIVI PER BRUCELLA SPP. (REAL TIME PCR) OVINE AQUEOUS HUMOR CHEMICAL ANALYSIS: COMPARATIVE EVALUATION WITH SAMPLES POSITIVE TO BRUCELLA SPP. (REAL-TIME PCR) DI PIETRO S., BOSCO V.R.F., GRUPPILLO A., GALIA S., VENZA I., PUGLIESE A., DIPARTIMENTO DI Scienze Mediche Veterinarie, Università di Messina, Italia *Dipartimento di Specialità Chirurgiche – Sezione di Oftalmologia, Policlinico Universitario di Messina, Italia KEY WORDS: Brucella spp.; ovine specie; principal lacrimal gland; tears; Real Time PCR; electrophoresis PAROLE CHIAVE: Brucella spp.; specie ovina; ghiandola lacrimale principale; secreto lacrimale; Real Time PCR; elettroforesi SUMMARY In this study the Authors evaluated the composition of aqueous humor of adult sheep positive to real-time PCR for Brucella spp., comparing with that of healthy sheep to detect the quali-quantitative differences of the examined fluid related to the presence of bacterial cell. Aqueous humor samples were obtained via paracentesis of the anterior chamber of n° 18 infected sheep and n° 10 healthy sheep (control group). Chemical analysis included measurement of concentration of sodium, potassium, magnesium, chloride, calcium, phosphorus, glucose, urea as well as pH. With the exception of potassium, calcium and phosphorus concentrations, values of aqueous humor composition did not differ significantly between to Brucella spp. positive sheep and control group. Mean ± SD values for the control group and the sample group, respectively were: sodium 149±2.86 and 143.5±12.35 mmoli/l, potassium 5.08±0.62 and 8.24±1.49 mmoli/l; magnesium 1.9±0.14 and 1.8±0.16 mg/dl; chloride 127.4±2.36 and 123.2±11.06 mmoli/l; calcium 3.74±0.41 and 4.19±0.49 mg/dl; phosphorus 3.84±0.37 and 4.78±0.73 mg/dl; glucose 14.7±7.8 and 4.4±9.2 mg/dl; urea 51.3±14.4 e 44.7±9.3mg/dl. The pH ranged from 7.0 to 8.0 for both groups. The potassium, calcium and phosphorus concentrations were significantly higher in aqueous humor samples positive for Brucella spp. RIASSUNTO Nel presente lavoro gli Autori valutano la composizione dell’umore acqueo di pecore adulte positivo alla Real Time PCR (PCR quantitativa) per Brucella spp. confrontandolo con quello di pecore sane, al fine di evidenziare eventuali modificazioni quali-quantitative del liquido esaminato correlabili alla presenza del batterio. L’umore acqueo è stato prelevato da n° 18 pecore infette e da n°10 pecore sane (gruppo controllo). L’analisi chimica ha incluso le concentrazioni di sodio, potassio, magnesio, cloro, calcio, fosforo, glucosio, urea e la valutazione del pH. Ad eccezione dei valori di potassio, calcio e fosforo, la composizione dell’umore acqueo non differiva significativamente tra le pecore positive alla Brucella spp. ed il gruppo controllo. I valori medi ± DS del gruppo controllo e del gruppo campione per ciascun parametro esaminato 156 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES erano rispettivamente: sodio 149±2.86 e 143.5±12.35 mmoli/l, potassio 5.08±0.62 e 8.24±1.49 mmoli/l; magnesio 1.9±0.14 e 1.8±0.16 mg/dl; cloro 127.4±2.36 e 123.2±11.06 mmoli/l; calcio 3.74±0.41 e 4.19±0.49 mg/dl; fosforo 3.84±0.37 e 4.78±0.73 mg/dl; glucosio 14.7±7.8 e 4.4±9.2 mg/dl; urea 51.3±14.4 e 44.7±9.3mg/dl. Il pH dell’umore acqueo variava da 7 a 8 per entrambi i gruppi. Le concentrazioni di potassio, calcio e fosforo risultavano più elevate nell’umore acqueo positivo per Brucella spp. INTRODUZIONE L’umore acqueo, liquido trasparente presente nella camera anteriore e posteriore dell’occhio, viene prodotto attraverso un processo di filtrazione a livello dell’endotelio fenestrato dei capillari oculari e mediante passaggio di ioni a livello dell’epitelio ciliare con diversi meccanismi di trasporto trans-membrana: diffusione, ultrafiltrazione e secrezione attiva. Tale fluido, considerato un ultrafiltrato del plasma, è composto da proteine, immunoglobuline, enzimi, lipidi ed elettroliti (11). La concentrazione elettrolitica nell’umore acqueo è legata alla distribuzione dei vari siti di trasporto ionico a livello delle cellule epiteliali pigmentate e non pigmentate. Ancora oggi non è stato stabilito un unico modello di trasporto transepiteliale di elettroliti a livello del corpo ciliare, per la complessità dell’epitelio stesso (sincizio epiteliale ciliare), dei processi di ultrafiltrazione regolati dalla pressione arteriosa sistemica, nonché dei differenti meccanismi di trasporto nelle diverse specie animali (2; 4; 10; 17). Numerose sono le ricerche presenti in letteratura relative allo studio dei processi deputati alla formazione dell’umore acqueo e all’analisi quali-quantitativa dello stesso negli animali, in condizioni fisiologiche e patologiche (1; 5; 7; 8; 12; 14; 15; 18; 19; 20). Questo in considerazione della possibilità di utilizzare l’occhio animale quale modello sperimentale nell’ambito dell’oftalmologia comparata. Obiettivo del presente lavoro è stato quello di valutare in pecore adulte la composizione ionica dell’umore acqueo risultato positivo a Brucella spp. tramite Real Time PCR (PCR quantitativa); al contempo, è stato comparato l’assetto elettrolitico dell’umore acqueo di questi soggetti con quello di pecore sane, al fine di evidenziare eventuali modificazioni quali-quantitative del liquido esaminato correlabili alla presenza del batterio. L’interesse per l’argomento risiede principalmente nella constatazione che la brucellosi, malattia endemica nell’area geografica considerata, può determinare lesioni oculari anche di grave entità, frequentemente segnalate nella specie umana, più raramente in quella animale. MATERIALI E METODI Oggetto del presente studio sono state n° 18 pecore adulte, di razze diverse, destinate alla macellazione nell’ambito del piano di eradicazione nazionale della brucellosi ovi-caprina e n°10 pecore sane, costituenti il gruppo controllo. Immediatamente prima della macellazione, gli animali venivano sottoposti a prelievo di sangue e a visita oftalmologica, dalla quale non si evidenziava alcuna lesione oculare macroscopica. Subito dopo l’abbattimento, su ciascun animale veniva eseguita l’enucleazione del globo oculare. I campioni di umore acqueo venivano ottenuti mediante centesi della camera anteriore, aspirando circa 1 ml di liquido da ciascun occhio enucleato. In relazione alle dimensioni dell’occhio ovino, un ago da 20 gauge veniva inserito in camera anteriore 157 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES perpendicolarmente alla cornea, qualche millimetro anteriormente al limbus, senza intaccare l’iride. Tale procedura veniva effettuata entro un’ora dopo la morte. I campioni di umore acqueo, mantenuti in ambiente refrigerato durante il trasporto in laboratorio, venivano sottoposti a metodica Real Time PCR per la ricerca di Brucella spp., dalla quale veniva confermata la presenza di materiale genetico del batterio nei soggetti appartenenti al gruppo campione e l’assenza dello stesso nel gruppo controllo. Al contempo, sugli stessi campioni venivano determinate, tramite spettrofotometria, le concentrazioni di sodio, potassio, magnesio, cloro, calcio, fosforo, glucosio, urea e valutato il pH. I medesimi rilevamenti venivano eseguiti sui campioni di sangue, previa centrifugazione degli stessi. I dati ottenuti sono stati valutati statisticamente, calcolando la media aritmetica (M) e la deviazione standard (DS) dei singoli parametri. Inoltre, è stata effettuata una comparazione tra i valori dei parametri ottenuti dall’umore acqueo e quelli del siero rispettivamente di pecore sane e di pecore infette, applicando il T di Student per dati non appaiati e considerando significative le differenze per p<0,05. RISULTATI Nelle tabelle sono riportati i valori minimo, massimo, medio e deviazione standard dei parametri valutati nel siero e nell’umor acqueo di pecore sane e con infezione da Brucella spp. Nelle pecore sane, gruppo controllo, la concentrazione del cloro ([Cl-]) nell’umor acqueo (HA) è risultata significativamente più elevata rispetto al siero, con un valore medio di 127,4 ± 2,37 mmol/l contro 111,84 ± 2,77 mmol/l nel siero e con una differenza (∆) di 15,56 mmol/l (p<0.001). Una situazione inversa è stata osservata, invece, per le concentrazioni di sodio, potassio, calcio, magnesio e fosfati, così come per i metaboliti dosati, glucosio e azoto. Nelle pecore con infezione brucellare, le concentrazioni di cloro, sodio e magnesio nell’HA sono simili a quanto osservato nelle pecore sane e, sebbene siano stati riscontrati valori lievemente più bassi, la differenza non è risultata significativa. La concentrazione del potassio, viceversa, presenta valori notevolmente più elevati nell’umor acqueo sia rispetto al siero (con ∆= 3,32 mmol/l) che a quelli osservati nelle pecore sane (p<0,001). I livelli di calcio e fosforo nell’umore acqueo sono, invece, significativamente più elevati rispetto agli animali di controllo (rispettivamente p<0.02 e p<0,001). Relativamente ai due metaboliti valutati, azoto e glucosio, questi presentano livelli inferiori nell’HA rispetto al siero, così come visto per le pecore sane. 158 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Na (mmol/L) Min Max M DS K (mmol/L) Ca (mg/dL) Siero HA Siero HA Siero HA Siero HA 144.0 160.0 154.3 4.5 145.0 153.0 149.0 2.9 107.0 116.0 111.8 2.8 124.0 131.0 127.4 2.4 4.3 6.8 5.3 0.8 4.0 5.8 5.1 0.6 11.5 12.8 12.2 0.3 2.9 4.2 3.7 0.4 ∆ (HA-Siero) Min Max M DS Cl (mmol/L) - 5.3 # + 15.6 * Mg (mg/dL) P (mg/dL) - 0.2 - 8.4 * Azoto (mg/dL) Glucosio (mg/dL) Siero HA Siero HA Siero HA Siero HA 2.2 2.8 2.5 0.3 1.7 2.1 1.9 0.1 5.0 7.3 6.4 0.2 3.3 4.3 3.8 0.4 49.0 58.0 54.0 3.7 31.0 71.0 51.3 14.5 50.0 80.0 68.4 6.0 1.0 42.0 16.1 12.2 ∆ (HA-Siero) - 0.6 * - 2.6 * - 2.7 - 52.3 Tab 1 – Livelli di alcuni elettroliti e metabolici nel siero e nell’umore acqueo (HA) di pecore sane Confronto statistico (T-test): HA vs Siero * = p<0.001; # = p<0.02 Na (mmol/L) Cl (mmol/L) K (mmol/L) Ca (mg/dL) Min Max M DS Siero HA Siero HA Siero HA Siero HA 140.0 152.0 146.6 2.9 102.0 165.0 143.5 12.4 100.0 113.0 104.8 3.3 85.0 144.0 123.2 11.1 4.1 6.0 4.9 0.7 6.1 11.3 8.2 1.5 9.2 101.0 8.9 0.9 3.1 5.1 4.2 0.5 ∆ (HA-Siero) Min Max M DS ∆ (HA-Siero) - 3.1 + 18.4 * Mg (mg/dL) P (mg/dL) -3.3 * - 4.7 * Azoto (mg/dL) Glucosio (mg/dL) Siero HA Siero HA Siero HA Siero HA 1.5 2.8 1.9 0.3 1.6 2.3 1.9 0.2 4.4 11.3 7.2 1.9 3.5 6.2 4.8 0.7 36.0 72.0 55.7 9.7 29.0 55.0 44.7 9.3 18.0 117.0 64.1 25.0 0 35.0 8.1 14.2 - 0.1 - 2.4 * - 11.0 # - 55.9 * Tab 2 - Livelli di alcuni elettroliti e metaboliti nel siero e nell’umore acqueo (HA) di pecore con infezione brucellare. Confronto statistico (T test): Ha vs Siero * = p<0.001; # = p<0.02. 159 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Na (mmol/L) Sane Infette K (mmol/L) Ca (mg/dL) Siero * HA Siero * HA Siero HA * Siero * HA # 154.3 146.6 149.0 143.5 111.8 104.8 127.4 123.2 5.3 4.9 5.1 8.2 12.2 8.9 3.7 4.2 Mg (mg/dL) Sane Infette Cl (mmol/L) P (mg/dL) Azoto (mg/dL) Glucosio (mg/dL) Siero * HA Siero HA * Siero HA Siero HA 2.5 1.9 1.9 1.9 6.4 7.2 3.8 4.8 54.0 55.7 51.3 44.7 68.4 64.1 16.1 8.1 Tab 3 – Livelli medi di alcuni elettroliti e metaboliti nel siero e nell’umore acqueo (HA) di pecore sane e con infezione brucellare. Confronto statistico (T test): Pecore infette vs Pecore sane * = p<0.001; # = p<0.02. DISCUSSIONE Le ricerche presenti in letteratura relativamente all’umore acqueo delle diverse specie animali riguardano principalmente la composizione chimica di tale fluido oculare, con particolare riferimento ai meccanismi fisiologici di trasporto di alcuni elettroliti attraverso l’epitelio ciliare, considerata la stretta correlazione esistente tra composizione qualiquantitativa dell’umore acqueo e patogenesi del glaucoma (3; 13; 16; 18). Inoltre, recenti studi hanno evidenziato una maggiore similitudine nel trasporto ionico tra l’occhio di bovini, ovini e suini e l’occhio umano rispetto a quanto riferito per il coniglio, comunemente impiegato in ricerche sperimentali, sottolineando la necessità di utilizzare l’occhio di tali specie animali quale modello sperimentale per gli studi sull’umore acqueo nell’uomo (3; 7; 10). I risultati del presente lavoro consentono di effettuare alcune considerazioni. I valori di alcuni parametri chimici considerati nel presente studio, con particolare riferimento alle concentrazioni degli ioni Cl-, K+ e Na+ dell’umore acqueo di pecore sane, rientrano entro i range fisiologici della specie ovina, secondo quanto riportato in letteratura (10). Per quanto riguarda, invece, i restanti parametri esaminati (Ca++, P-, Mg-, glucosio ed urea) riteniamo che i dati riferiti al gruppo controllo possano essere considerati quali valori di riferimento per la specie in esame, considerati gli scarsi riferimenti bibliografici in merito. L’osservazione di elevati livelli di cloro nell’umor acqueo di pecore sane è in accordo con quanto riportato da altri Autori (10) in uno studio su campioni di umor acqueo prelevato in vivo in diverse specie animali. In queste indagini viene ipotizzato un trasporto attivo dell’elettrolita attraverso l’epitelio ciliare con un flusso netto dal sangue all’umor acqueo, ritenuto il principale responsabile della formazione del fluido stesso, come già dimostrato in altre specie (uomo, bovino, suino) (16; 19). Anche i livelli di sodio e potassio sono simili a quanto riportato nel precedente studio, mentre per gli altri elettroliti non è possibile fare confronti in quanto non esistono valori di riferimento. 160 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Negli animali con infezione da Brucella spp. si osserva un netto aumento dei valori di potassio e fosforo (p<0,001) nell’umor acqueo rispetto alle pecore sane, più lieve per il calcio (p=0,02). Sodio, cloro e magnesio sono invece stabili. Nel determinismo di queste alterazioni possono essere chiamati in causa diversi meccanismi: alterazioni sistemiche, con interferenza del patogeno sui diversi metabolismi, o modificazioni locali, come variazioni del flusso attraverso i processi ciliari, della permeabilità della barriera emato-acquosa e dell’attività secretoria dell’epitelio dei corpi ciliari. I livelli di azoto e di glucosio, inferiori nell’umor acqueo rispetto al sangue, concordano con quanto riportato in letteratura (6; 9; 11). In particolare, è stato riscontrato che i livelli di carboidrati e di azoto nell’umor acqueo sono circa l’80% di quelli del plasma. Poiché i carboidrati passano per diffusione nel fluido endoculare, la differenza tra i due comparti potrebbe essere la conseguenza di un loro consumo da parte della lente e della cornea. Per quanto riguarda le concentrazioni di azoto, queste non possono essere in equilibrio con quelle plasmatiche, poiché i composti azotati attraversano molto lentamente la barriera emato-acquosa, come dimostrato in studi condotti nel cane. In conclusione, il presente lavoro rappresenta un ulteriore contributo allo studio oltre che della brucellosi oculare, non sufficientemente studiata nella specie ovina, anche dei meccanismi fisiopatologici inerenti la formazione e la modificazione quali-quantitativa dell’umor acqueo in diverse situazioni cliniche. In particolare l’occhio ovino, per le peculiarità morfo-funzionali assimilabili a quelle della specie umana, potrebbe essere utilizzato come modello sperimentale nelle ricerche di oftalmologia comparata, risultando particolarmente adatto a studi patogenetici e farmacologici, per la valutazione dell’efficacia di nuove molecole e del monitoraggio degli effetti, a fini prognostici. 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RIASSUNTO Obiettivo del presente lavoro è stato quello di avvalersi della real-time PCR quale strumento di elevato valore diagnostico nel riscontro della Brucella spp. in lacrime, umore acqueo e corpo vitreo di pecore risultate positive ai test routinari impiegati nei piani di eradicazione della malattia. La real-time PCR è stata effettuata su n° 18 pecore risultate infette da Brucella spp. (esami sierologici); in particolare, il test biomolecolare è stato eseguito su n°18 campioni di lacrime e su n°36 campioni rispettivamente di umore acqueo e di vitreo. Il DNA di Brucella spp. è stato evidenziato in tutti i campioni lacrimali (100% di positività), in n° 29 campioni di umore acqueo (80% di positività), in n° 23 campioni di corpo vitreo (63% di positività). Sulla base dei risultati del presente lavoro è possibile affermare che la real-time PCR può essere applicata per l’evidenziazione della Brucella spp. nell’apparato oculare di pecore infette, quale test diagnostico altamente sensibile e specifico. SUMMARY The objective of this study is to apply the real-time Polymerase chain reaction (PCR) as a tool with a high diagnostic value to detect Brucella spp. in tears, aqueous and vitreous serum-positive to Brucella spp.. Real-time PCR assay was performed in n° 18 infected sheep: 18 lacrimal samples and respectively 36 aqueous and vitreous samples. Brucella DNA was detected in all lacrimal samples (positivity: 100%); in 29 aqueous (positivity: 80%); and in 23 vitreous samples (positivity: 63%). On the basis of the results it is possible to underline that real-time PCR can be applied to detect Brucella spp. in the ocular apparatus of infected sheep, as a diagnostic tool with high sensitivity and specificity. INTRODUZIONE Brucella spp., batterio Gram-, è responsabile di diverse affezioni acute e/o croniche nelle varie specie animali, uomo compreso. Nell’animale l’infezione può avvenire per via digerente, respiratoria, attraverso la mucosa oculo-congiuntivale, vaginale o attraverso soluzioni di continuo; nell’uomo si stabilisce sia per contatto diretto con animali e materiali infetti sia per via indiretta attraverso l’ingestione di materiale contaminato. Una volta all’interno dell’organismo ospite, il batterio, riconosciuto dalle cellule immunocompetenti, superata la barriera linfonodale, si riversa nel circolo ematico, dando luogo ad una batteriemia primaria con localizzazione in diversi organi (1). Prescindendo dalle più note 163 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES lesioni che il microorganismo può determinare in organi e tessuti, una particolare menzione nell’uomo riguarda l’apparato oculare, dove Brucella spp. può determinare entità nosologiche di una certa importanza che se non diagnosticate in tempo possono sortire degli effetti alquanto gravi come: episcleriti, uveiti, neuropatie ottiche ed endoftalmiti (2), oltre a forme di cheratocongiuntivite e dacrioadenite, con elevate concentrazioni di Brucella spp. a livello delle ghiandole lacrimali (3). Nel cane Brucella canis è stata isolata dall’occhio e riconosciuta responsabile di uveite ed endoftalmite (4), mentre nel cavallo Brucella abortus viene ritenuta potenziale agente di uveite ricorrente da immunocomplessi (5); diversamente dalle rare segnalazioni riportate in letteratura relativamente alle lesioni oculari da Brucella spp. nel cane e nel cavallo, nella specie ovina i riferimenti bibliografici sono carenti. Scopo del nostro lavoro è stato quello di valutare tramite la real-time PCR la possibile diffusione della cellula batterica nei diversi tessuti oculari, al fine di evidenziarne la capacità di determinare lesioni oculari. La diagnosi della malattia con i metodi di routine è abbastanza controversa in quanto sia la siero agglutinazione rapida che la fissazione del complemento danno luogo a reattività crociate; l’esame colturale, sebbene specifico, è abbastanza indaginoso. L’uso di test biomolecolari, nel nostro caso della Real-Time PCR (PCR quantitativa), consente una diagnosi certa e rapida, confermando uno stato di infezione prima ancora che si verifichi la siero conversione nel soggetto. Inoltre essendo un’analisi quantitativa, permette di conoscere la carica batterica del microrganismo e di valutare meglio i potenziali danni creati dallo stesso. MATERIALI E METODI Il nostro studio è stato effettuato su n°18 pecore adulte, di razze diverse, tutte femmine, risultate positive ai test di routine (SAR e FC) previsti dal piano nazionale di eradicazione della brucellosi ovi-caprina. Prima della macellazione, che si è svolta presso il mattatoio di Messina, tutti i soggetti, previa contenzione manuale, sono stati sottoposti ad esame oftalmologico ed al prelievo del secreto lacrimale tramite pipette Eppendorf munite di puntale, dalla porzione mediale del fornice congiuntivale inferiore. Subito dopo l’abbattimento si è proceduto all’enucleazione del globo oculare ed al prelievo, tramite centesi, dell’humor acqueo e dell’humor vitreo. I liquidi biologici prelevati sono stati sottoposti a real-time PCR per Brucella spp., con limite di rilevabilità di 1 equivalente genomico/ml. Il sistema di PCR in real-time è stato sviluppato su Light Cycler (Roche), sfruttando la chimica TaqMan che prevede l’uso di una coppia di primers e di una sonda marcata, scelte omologhe ad una porzione del gene 16S. I test sono stati effettuati sulla base di una curva di taratura, ottenuta saggiando diluizioni successive in base 10, di una soluzione di DNA di Brucella equivalente a 106 batteri per ml. Secondo tale schema, sono stati ottenuti 6 punti per curva, in un intervallo compreso tra 106 e 101 equivalenti genomici per ml di campione estratto. La miscela di reazione per il test è stata sviluppata come segue: FastStart DNA Master Hybridization Probes (Roche)1x, 1pmol/l per ciascun primer, 0,125pmol/l di sonda marcata, 5 l di estratto di DNA e H2O fino al completamento del volume di reazione (20l ). Per quanto riguarda il programma di analisi, in seguito ad una iniziale denaturazione di 3 min a 95°C, si sono realizzati i seguenti cicli di reazione con 45 ripetizioni: 95°C per 5 sec, 164 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES 60°C per 8 sec, 72°C per 10 sec. Il test biomolecolare è stato eseguito su n°18 campioni di lacrime e su n° 36 campioni rispettivamente di umore acqueo e vitreo. La specificità e la sensibilità del sistema sono state infine calcolate rispettivamente su campioni sicuramente negativi e sicuramente positivi. RISULTATI Il DNA di Brucella spp. è stato evidenziato in tutti i campioni di secreto lacrimale (100% di positività), in n° 29 campioni di umore acqueo (80,55% di positività) e in n°23 campioni di corpo vitreo (63,89% di positività). In tabella 1 vengono riportati i dati relativi alla realtime PCR effettuata sui fluidi oculari, suddivisi in diverse classi, in relazione al numero di equivalente genomico della cellula batterica presente in 1 ml di campione. In tabella sono riportate inoltre le percentuali di positività rispetto al numero totale dei campioni. Tabella 1 Liquido biologico Eq. Gen/ml 1-100 Eq. Gen/ml 101-1000 Eq. Gen/ml Totale positivi > 1001 Lacrime Humor acqueo Humor vitreo 2 (11,11%) 15 (83,33%) 1 (5,56%) 21 (58,33%) 8 (22,22%) 0 (0%) 21 (58,33%) 2 (5,56%) 0 (0%) 18 (100%) 29 (80,55%) 23 (63,89%) Le prove di ripetibilità hanno sempre confermato l’assenza di falsi positivi su campioni veri negativi, (Specificità 100%) e l’assenza di falsi negativi su campioni veri positivi (Sensibilità 100%). In tal senso è anche stata dimostrata la scarsa influenza che la matrice di partenza può avere sul test. CONSIDERAZIONI E CONCLUSIÓN Da quanto riportato in tabella si evince che la Brucella spp. è presente in tutti i fluidi esaminati, con maggiore incidenza nelle lacrime, nelle quali si riscontra una positività del 100%. La maggiore concentrazione del batterio nel secreto lacrimale supporta l’ipotesi di una possibile penetrazione della brucella nell’organismo attraverso la via congiuntivale anche nell’animale (1), così come riportato nell’uomo, dove sono state descritte più frequentemente forme di dacrioadenite (2). Il rilevamento del DNA batterico a livello dell’apparato oculare conferma la possibilità di localizzazione del batterio in queste strutture anche nella specie ovina, in analogia con quanto riscontrato nell’uomo (6), e depone per una diffusione per via ematica del microorganismo. Il mancato riscontro di lesioni macroscopiche a carico dei tessuti oculari, nelle pecore oggetto di studio, può essere rapportato ad uno stadio acuto della malattia; nell’uomo, infatti, viene riportato che le uveiti in corso di brucellosi si instaurano nella fase cronica, quale esito di una reazione immunitaria (7). In assenza di lesioni, la RT-PCR positiva viene considerata nell’uomo una tecnica importante per diagnosticare l’infezione in fase precoce, al fine di evitare l’instaurarsi di lesioni alquanto gravi, quali forme di endoftalmite con conseguente perdita di funzionalità dell’organo (8). Sulla base di quanto riscontrato è auspicabile, nell’ambito dell’oftalmologia comparata, l’impiego di campioni lacrimali per la diagnosi di brucellosi oculare nell’uomo, considerata 165 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES la non invasività della tecnica di prelievo. La presenza del batterio a livello di humor acqueo e vitreo in discrete quantità, esorta l’applicazione della real-time PCR anche su questi fluidi. La Real-time PCR risulta così essere un importante strumento di diagnosi e ricerca sia in medicina umana che in medicina veterinaria, in quanto rappresenta un metodo rapido, specifico (100%) e sensibile (100%) per la diagnosi e la quantificazione del patogeno. Tramite la RT-PCR, viene valutata la carica batterica totale e non quella infettante. Questa tecnica però non consente di effettuare un distinguo tra batterio vivo e morto, per cui risulta opportuno associare a suddetta tecnica la semina su terreni di coltura oppure valutare la presenza del genoma batterico al tempo “t0” nel campione, seminarlo in brodo e sempre con lo stesso metodo, valutare la crescita esponenziale del genoma al tempo “t1”. Se da un lato la RT PCR non riesce a discriminare tra batterio vivo o morto, dall’altro considerata l’elevata diffusione della brucellosi tra la popolazione, in particolare tra le categorie a rischio, non si puo´escludere che i fluidi oculari possano rappresentare un veicolo di trasmissione anche per l’uomo, coem viene riportato per gli animali.. A tal proposito sono ancora in itinere le ricerche riguardanti l’esame colturale dei campioni oculari, al fine di accertare la possibilita` di crescita e moltiplicazione del batterio sul materiale organico e il conseguente potere patogeno dello stesso. In considerazione degli scarsi riferimenti bibliografici, riteniamo opportuno sottolineare il carattere innovativo dell’applicazione della Real-time PCR, nella diagnosi della brucellosi oculare nelle pecore, nonché la possibilità di quantificare, con tale metodica, la presenza del patogeno nelle strutture oculari. Riteniamo anche che il presente studio sia da considerare un importante contributo alle ricerche scientifiche condotte nell’ambito dell’oftalmologia comparata. BIBLIOGRAFIA 1) Farina R (1998) Brucella. In: Farina R e Scatozza F “Trattato di Malattie Infettive degli Animali” II ed., UTET, Torino, pp. 155-179. 2) Güngör K, Bekir NA, Namiduru M (2001), Acta Ophthalmol Scand, 79, 76-78. 3) Bekir NA, Güngör K, Namiduru M (2000), Eur J Ophthalmol, 10 (3), 259-61. 4) Martin C.L. (1999) Ocular Manifestations of Systemic Disease. In: Gelatt K.N. “Veterinary Ophthalmology” III ed. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 1409-1411. 5) Moore C.P. (1990) Disease of the Eye. In: Smith B.P. “Large Animal Internal Medicine” ed. The C.V. Mosby Company, USA pp 1216, 1233. 6) Bourcier T, Cassoux N, Karmochkine M, Lehoang P (1998), J Fr Ophtalmol, 21 (2), 126-7. 7) Walker J, Sharma OP, Rao NA (1992), Am J Ophthalmol, 75, 374-5. 8) Van Rooyen MM, (1981), S Afr Med J. 60 (5), 206-7. 166 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES THE ANATOMOPATHOLOGICAL EXAMINATION AS A TOOL TO A BETTER KNOWLEDGE OF RETROVIRUS INFECTION OF SHEEP. A CONTRIBUTE FROM A SLAUGHTERHOUSE IN TUSCANY. BIO C*, GREGORIº Mº, TACCINI Eº, BRACA G º * USL 8 Toscana, Italy º Department of Animal Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Pisa, Italy ABSTRACT The authors present some result of a wide and long research program since 1989 on ovine pathology by Retroviridae Maedi/Visna, Caprine Artritis enceephalitis, adenomatosis; observation of anatomic-clinical reports in inspective visit at regional slaughterhouse (2001-2005), - immunocytochemical and histopathological confirmation at laboratory, description of changes in target organs: lung, udder, articulation and central nervous system. Furthermore consideration prevailing practically-applied has been presented. In conclusion the authors think that in central Italy the ovi-caprine pathology by retroviridae need a bigger engagement of studies and research by the most advanced technologies but also a heavier attention in veterinary public health both in slaughterhouse and in farms. KEY WORDS: retrovirus, sheep, anatomopathology, slaughterhouse INTRODUCTION “The dysplastic jaagziekte-like pneumopathy” was first recognized in Italy in 1959 (10) as a naturally occurring disease of sheep. Since then several researchers of Pisa University have performed investigations regarding retrovirus induced pathology in naturally (1, 2, 9, 12) and experimentally (5, 6, 7, 8) infected sheep. Both the lentvirus-induced pathology (maedi-visna and caprine arthritis encephalitis) and the OPA (jaagsiekte, sheep pulmonary adenomatosis, or ovine pulmonary carcinoma) have been anatomopathologically, histologically and immunohistochemically investigated. Among the importance of laboratory investigations, such as immunohistochemistry and virus isolation, we believe that the description of the anatomopathological findings detected during post mortem examination in a slaughterhouse should contribute to a better knowledge about the pathology and epidemiology of ovine retrovirosis in Tuscany. MATERIAL AND METHODS The Authors show data regarding retrovirus induced pathology in slaughtered sheep. The anatomopathological findings have been obtained from the slaughterhouse of medical district number 8, in Tuscany. Since 2001 a post mortem examination has been performed on a total amount of 39740 sheep. These findings have been integrated with histological and immunohistochemical data obtained from a previously performed research programme about ovine retrovirus (Department of Animal Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Pisa, Italy). 167 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES RESULTS Table 1 shows all the findings regarding both lentivirus-induced pathology and OPA obtained from the above mentioned slaughterhouse. year 2001 2002 Number of animal slaughtered s total number adults 41873 5360 46510 8650 2003 2004 45660 37610 13320 6900 2005 26990 5510 Maedi affected OPA affected sheep sheep animals % animals % 205 3.8 42 0.7 386 4.4 61 0.7 0.4 421 3.1 60 5 370 5.3 67 0.9 1.0 293 5.3 57 4 Table 1 Anatomo-pathological and histological findings Lungs On gross examination, the lungs of Maedi Visna Virus (MVV) and caprine artrithis encephalitis virus (CAEV) infected animals appear enlarged and heavy, they failed to collapse and demonstrate diffuse and scattered grey foci on pleural and cut surfaces in perilobular design. The typical form of ovine pulmonary adenomatosis (OPA) is characterized by tumour formation in the craniodorsal part of the lungs. The tumour appears as solitary or multiple white, dry and hard nodules underneath the pleura or deep in the parenchyma. The most common histological finding in MVV infected sheep consist of interstitial lymphoproliferative pneumonitis of different severity. The interstitium appears heavily infiltrated by monuclear inflammatory cells. The presence of perivascular, peribronchiolar cuffs and pseudofollicular aggregates formed by lymphocytes and macrophages, is a constant feature. These findings are related to BALT attivation. Furthermore in pregress forms it is possible to observe both alveolar secondary epithelialization and myocellular hyperplasia. OPA represents a neoplastic pathology which would be defined as a bronchioalveolar adenocarcinoma. Histological changes are characterized by atypical primary cuboidal or columnar cells proliferation, which often exhibites papillary growth patterns. The coexistence of both MVV interstitial lymphoproliferative pneumonitis and adenomatosis is rare but possible. Secondary inflammation, due to polimicrobic infection or parasitic concumitant disease, is very common. In these cases the primary pathology related to retrovirus infection might be not clear and the gross examination shows heterogeneous lesions. Histology and immunohistochemistry might be useful for final diagnosis. Mammary gland. In the slaughterhouse the mammary pathology is difficult to detect during post mortem examination since the mammary gland is removed immediately from the carcass. The characteristic MVV-induced pathology in the mammary gland mainly consists in a chronic indurative mastitis, characterized by diffuse hardening of the gland. The 168 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES coexistence of both this type of mastitis and polimicrobic inflammation is very common. It may results in heterogeneus anatomopathological lesions. Microscopic changes consist on a diffuse accumulation of mononuclear cells especially lymphocytes, with follicle formation close to the lactiferous ducts and secondary fibrosis. Immunohistochemical investigation can be useful to discriminate retrovirus-induced pathology from mycoplasmosis. Mastitis is frequent in infected sheep and free or cell-associated virus may be excreted with colostrum. Newborn lambs might became infected by colostrum as previously reported (6). Viral antigen may be immunocitochemically detect in intestinal epithelial cell of these lambs. Joints. In slaughtered sheep, joints were not carefully inspected and gross lesions were rarely observed. Lentivirus-induced arthritis may involve the carpal or tarsal joints. Clinical changes are characterized by claudication, hardening and joint’s stiffness. The synovial wall often shows both epithelial damage and diffuse infiltration of mononuclear cells, mainly lymphocytes. Histological examination of chronic lesions shows fibrotic and prolferative changes involving the synovial wall. The immunohistochemical investigation is essential to detect virus antigen. Differential diagnosis includes micoplasmosis and polimicrobic diseases. Central Nervous System. In the slaughterhouse the anatomopathological examination of the central nervous system is usually difficult to perform due to the enforced norm that prevents the opening of the box cranial. Furthermore macroscopical changes were not usually detectable. Histologically the disease is characterized by a non-suppurative leucomyelitis with mononuclear perivascular cuffing and demyelination. The presence of the virus might be confirmed by immunohistochemistry on paraffin-embedded tissue samples. Pathological changes involving other organs are not usually observed. CONCLUSION The results obtained in the slaughterhouse of Tuscany medical district number 8 reflects the epidemiological situation of ovine retrovirus-induced pathology in Italy. We believe that a great importance has to be given to ovine pathology induced by retrovirus, so that proper action can be taken in order both to limit the spreading of the disease and to implement stricter sanitary laws regarding animals’ international commerce. Furthermore, nowadays it is possible to perform an investigation on blood samples and tissutal samples in order to make an early clinical diagnosis (3, 11). Finally, we believe that the amount of the above described pathology has and is current being underestimated both due to the medical authorities’ insufficient attention and because of diagnostical difficulties faced by the veterinary service. 169 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES BIBLIOGRAPHY Braca G, Renzoni G, Rossi G, Taccini E, Vitali CG. Atti FeMeSpRum 3, 20/1,1993. Braca G, Renzoni G, Taccini E. Rivista di parassitologia 6, 56, 1989. Cubeddu T, Alberti A, Cuccurru C, Pittau M. Summa 1, 6, 15-17, 2002. Lamberti M, Strola M, Guarda F. Summa I. 35-40, 2006. Preziuso S, Renzoni, Allen TE, Taccini E, Rossi G, De Martini JC Braca G. Veterinary Microbiology 104, 157-164, 2004. Preziuso S, Taccini E, Rossi G, Mariotti F, Braca G, De Martini JC. XIX Meeting of American Society for Virology, vol 1, pp 155, Fort Collins, Colorado, USA, 2000. Preziuso S, Renzoni G, Bandecchi P, Taccini E, Braca G. 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Atti SIPAOC 10, 113, 1992. 170 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI LISOZIMA IN LATTE OVINO NORMALE E MASTITICO EVALUATION OF LYSOZYME TITRATION IN NORMAL AND MASTITIC OVINE MILK FRATINI F.1, EBANI V.V.1, AMPOLA M.2, INNOCENTI E.3, FORZALE F.4, PERICCIOLI M.4, CERRI D.1, ANDREANI E.1 1 Dipartimento Patologia Animale, Profilassi ed Igiene degli Alimenti – Università di Pisa; 2 Dottorando in Produzioni Animali, Sanità ed Igiene degli Alimenti nei Paesi a Clima Mediterraneo; 3Dottore di ricerca in Patologia dei piccoli ruminanti 4 Libero Professionista. PAROLE CHIAVE: lisozima, latte ovino, carica batterica totale KEY WORDS: lysozyme, ovine milk, total bacterial count ABSTRACT The aim of the study was to determinate the concentration of lysozyme in normal ovine milk at several lactation orders and in mastitic milks as well. 436 milk samples from sardinian sheeps has been seed on blood agar and PCA (Plate Count Agar). Collected sera from each sample and sera collected from 20 samples from subjects showing clinical and subclinical mastitis, has been analyzed by Lysoplate Assay. Total bacterial count of normal milk resulted <5000 UFC/ml and no microrganism responsible of mastitis has been isolated. 28 of 436 samples (6,4%) showed lysozyme concentration (l.c.) < 0,025 µl/ml, 61 samples (14%) showed a l.c. of 0,025 µl/ml, 255 (58,5%) a l.c. of 0,05 µl/ml, 87 (19,9%) a l.c. of 0,1 µl/ml and 5 samples (1,2%) a l.c. of 0,2 µl/ml. About lactation orders, we found that l.c. increased sensibly together with the number of lactations, from second to fourth and decreased in fifth lactation. In mastitic milk l.c. reached in 70% (14/20) of cases, values >0,2 µl/ml. INTRODUZIONE Il lisozima è un enzima ad azione batteriolitica presente in diversi liquidi biologici (sangue, latte, saliva e secreto lacrimale) sia degli animali che dell’uomo. Dal punto di vista chimico si tratta di una glicosidasi, nota anche come muramidasi, in grado di idrolizzare il peptidoglicano, polisaccaride che rappresenta la componente principale della parete cellulare batterica; questa molecola risulta costituita da unità alternate di acido Nacetilmuramico e N-acetilglucosamina legate tra loro da legami alfa 1-4-glicosidici. Il lisozima realizza la propria azione batteriolitica catalizzando la rottura del legame glicosidico che vede impegnato l’atomo di carbonio in posizione 1 dell’acido Nacetilmuramico (Streyer L., 1996). L’azione litica espressa dal lisozima, per quanto efficace su numerosi germi patogeni e non, risulta massima nei confronti di Micrococcus lysodeickticus o Micrococcus luteus e questa caratteristica può essere sfruttata per evidenziarne la presenza e la concentrazione in determinati liquidi biologici. Contrastanti sono le opinioni dei diversi Autori per quanto concerne la presenza e la concentrazione di tale enzima nel latte bovino (Goudswaard J. et al., 1978; Sarwar A. et al., 2001; Shi J. et al., 2004; Piccinini R. et al., 2005); secondo alcuni sembrerebbe attestarsi su valori relativamente bassi nel latte normale, mentre aumenterebbe nel latte mastitico, altri Autori riferiscono invece dell’impossibilità di stabilire un trend definito di concentrazione 171 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES essendo questo un dato estremamente variabile e soggetto all’influenza di molteplici fattori quali la razza, lo stadio della lattazione, le condizioni ambientali ed alimentari etc. Scarsi sono invece in letteratura i dati riguardanti la concentrazione di lisozima nel latte ovino sia in condizioni fisiologiche che in corso di mastite clinica o subclinica (Moroni P. et al., 1997). Con la presente indagine si è voluto verificare la concentrazione di lisozima nel latte di pecore di un gregge di razza sarda in condizioni fisiologiche a diversi ordini di lattazione; sono stati inoltre presi in considerazione 20 campioni di latte ovino mastitico. MATERIALI E METODI L’indagine si è svolta nei periodi compresi tra Gennaio-Maggio 2005 e Gennaio-Maggio 2006 in un allevamento di pecore di razza sarda ufficialmente indenne da brucellosi, ubicato in provincia di Grosseto costituito da 250 soggetti, provvisto di mungitrice meccanica; l’alimentazione si effettua mediante pascolo per tutto l’anno, nel periodo invernale la razione viene integrata con fieno polifita e avena. Tra gli animali sono stati selezionati 100 capi suddivisi in quattro gruppi di lattazione nell’anno 2005 (19 soggetti in 1° lattazione; 27 soggetti in 2° lattazione; 29 soggetti in 3° lattazione; 25 soggetti in 4° lattazione). Nell’anno 2006 la consistenza dei gruppi di lattazione ha subito inevitabili variazioni dovute al management di allevamento (animali deceduti per cause naturali, soggetti tolti dalla produzione perché a fine carriera etc). Pertanto il numero complessivo degli animali sottoposti ad indagine nel 2006 è stato di 117, dei quali 92 rimasti dall’anno 2005 e 25 agnelle di rimonta in 1° lattazione nell’anno 2006. In dettaglio i vari soggetti erano così ripartiti per lattazione: 25 nuovi soggetti in 1° lattazione, 21 soggetti in 2° lattazione, 27 soggetti in 3° lattazione, 23 soggetti in 4° lattazione, 21 soggetti in 5° lattazione. Il prelievo dei campioni è stato effettuato in corrispondenza della mungitura serale previo lavaggio, detersione, disinfezione e asciugatura accurata dei capezzoli eliminando i primi getti di latte. I campioni raccolti in totale sono stati 456, dei quali 436 relativi alle varie lattazioni (Tabella 1) e 20 campioni di latte mastitico prelevati da altrettante pecore di razza sarda appartenenti a diversi allevamenti presenti in provincia di Grosseto. Ciascun campione è stato seminato su piastre Petri contenenti terreno Agar-sangue incubate per 24 ore a 37°C al fine di isolare eventuali agenti patogeni. I campioni di latte tal quale e le rispettive diluizioni scalari da 10-1 a 10-5 in acqua peptonata sterile sono stati seminati in terreno PCA (Plate Count Agar) ed incubati per 48 ore a 37°C per la determinazione della carica batterica totale (CBT). Le diluizioni 10-1 e 10-2 sono state inoltre seminate su terreno Baird Parker ed incubate per 48 ore a 37°C al fine di isolare eventuali microrganismi appartenenti al genere Staphylococcus. In seguito a questa fase preliminare ogni campione è stato trattato per l’estrazione del siero mediante la metodica descritta da Carlsson et al. (1989) opportunamente modificata: 10 ml di latte del campione sono stati trasferiti in provette sterili e successivamente addizionati di 50 µl di una soluzione di caglio Rennet From Calf Stomach (Sigma®) al 2% in acqua bidistillata; dopo incubazione in termostato a 30°C per mezz’ora e conseguente formazione del coagulo si è proceduto alla rottura meccanica dello stesso e alla rimozione della caseina e del grasso tramite centrifugazione a 3500 rpm per 30 minuti a 4°C. Il siero così ottenuto è stato aspirato e dispensato in provette eppendorf e stoccato a -20°C fino alla prova per la determinazione della concentrazione di lisozima (Lysoplate Assay). Per la prova di 172 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Lysoplate Assay è stato necessario allestire una sospensione di Micrococcus luteus; per tale sospensione è stato impiegato il ceppo ATCC n° 4698 (Sigma®) liofilizzato; dopo semina del ceppo su piastre di Tryptose Agar (Difco®) e incubazione di 24 ore a 37°C, le colonie sviluppatesi sono state prelevate mediante un tampone sterile e sottoposte a lavaggio in acqua bidistillata sterile; raccolta la maggior quantità possibile di patina batterica le cellule sono state sottoposte a centrifugazione a 3000 rpm per 15 minuti, è stato eliminato il surnatante ed è stato ripetuto il lavaggio in acqua bidistillata sterile; il pellet cellulare è stato infine sospeso in PBS a pH 6.2 fino al raggiungimento di una densità ottica pari a 1.25 a 550 nm determinata tramite spettrofotometro CGA tipo CP 2300. La sospensione è stata inattivata in autoclave a 121°C per 15 minuti, lasciata raffreddare a temperatura ambiente e successivamente stoccata a -20°C fino al momento dell’impiego per il test Lysoplate Assay su piastra. Per la suddetta prova si è fatto riferimento a quanto riportato da Lie et al.(1986) effettuando le opportune modifiche: è stato necessario allestire un terreno all’agarosio all’1% in PBS a pH 6,2; sono state dispensate su piastra, nelle medesime proporzioni (circa 25 ml), terreno all’agarosio e sospensione di Micrococcus luteus. Dopo solidificazione del terreno nella piastra a temperatura ambiente sono stati praticati dei pozzetti del diametro di 5 mm per un totale di 32 pozzetti per piastra; un numero superiore avrebbe potuto determinare sovrapposizione degli aloni di lisi e difficoltà nell’interpretazione dei risultati. In otto pozzetti sono state dispensate le diluizioni standard di lisozima H.E.W.L. (Sigma®) (circa 50 µl), corrispondenti alle concentrazioni di 0,025 µg/ml, 0,05 µg/ml, 0,1 µg/ml, 0,2 µg/ml, 0,5 µg/ml, 1µg/ml, 2 µg/ml, 3 µg/ml, da impiegare per il confronto degli aloni di lisi, nei rimanenti pozzetti sono stati dispensati i sieri da testare. Le piastre sono state incubate in camera umida per 18 ore a 37°C. La lettura della prova è stata effettuata mediante la misurazione del diametro degli aloni di lisi utilizzando un calibro e l’interpretazione è stata realizzata mediante il confronto con gli aloni delle diluizioni standard; inoltre le prove sono sempre state eseguite in doppio e interpretate da due operatori per ridurre al minimo la probabilità di errori sistematici. RISULTATI Nel Grafico 1 vengono rappresentati i dati relativi alla concentrazione di lisozima (µg/ml) nei campioni di latte esaminati per ogni gruppo di lattazione relativi all’anno 2005; nel grafico 2 invece vengono rappresentati i dati relativi alla concentrazione di lisozima (µg/ml) per l’anno 2006, tenendo presente che la prima lattazione riguarda agnelle al primo parto, e quelle successive si riferiscono a gruppi di animali del 2005 aumentati di una lattazione. 173 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Grafico 1 Concetrazione Lisozima Campioni/lattazione 2005 38 40 35 35 Concentrazione lisozima (ug/ml) < 0,025 Concentrazione lisozima (ug/ml) 0,025 Concentrazione lisozima (ug/ml) 0,05 Concentrazione lisozima (ug/ml) 0,1 35 N ° C a m pio ni 30 25 20 20 13 15 11 10 9 10 6 6 3 5 5 2 0 0 Concentrazione lisozima (ug/ml) 0,2 4 1 1 2 0 0 I II III IV Lattazione Grafico 2 Concetrazione Lisozima Campioni/lattazione 2006 40 34 35 N ° C a m pio ni 30 25 26 26 21 20 20 15 14 14 13 14 10 10 0 9 6 5 3 5 10 23 1 0 0 0 1 2 1 0 I II III Lattazione 174 IV V Concentrazione lisozima (ug/ml) < 0,025 Concentrazione lisozima (ug/ml) 0,025 Concentrazione lisozima (ug/ml) 0,05 Concentrazione lisozima (ug/ml) 0,1 Concentrazione lisozima (ug/ml) 0,2 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Grafico 3 Concetrazione Lisozima Campioni/lattazione 80 72 70 61 61 N ° C a m pio ni 60 50 40 40 27 30 20 24 21 2022 11 6 10 0 21 11 3 0 1 1 2 10 7 3 9 2 1 Concentrazione lisozima (ug/ml) < 0,025 Concentrazione lisozima (ug/ml) 0,025 Concentrazione lisozima (ug/ml) 0,05 Concentrazione lisozima (ug/ml) 0,1 Concentrazione lisozima (ug/ml) 0,2 0 I II III IV V Lattazione Nella Tabella 1 vengono riportati nel dettaglio i dati relativi alla concentrazione di lisozima (µg/ml) e la rispettiva percentuale nei campioni di latte esaminati, distinti per ordine di lattazione. Tabella 1 Risultati Campioni latte normale distinti per lattazione Lattazione I II III IV V N° campioni Concentrazione Lisozima (µg/ml) Percentuale (%) 20/88 22/88 40/88 6/88 3/96 11/96 61/96 21/96 1/112 11/112 72/112 27/112 1/112 2/97 7/97 61/97 24/97 3/97 2/43 10/43 21/43 9/43 1/43 < 0,025 0,025 0,05 0,1 < 0,025 0,025 0,05 0,1 < 0,025 0,025 0,05 0,1 0,2 < 0,025 0,025 0,05 0,1 0,2 < 0,025 0,025 0,05 0,1 0,2 22,7 25 45,5 6,8 3,1 11,5 63,5 21,9 0,9 9,8 64,3 24,1 0,9 2,1 7,2 62,9 24,7 3,1 4,6 23,3 48,9 20,9 2,3 175 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Nei Grafici 4, 5, 6, 7 e 8 vengono rappresentati i dati relativi alla concentrazione di lisozima (µg/ml) per ciascun ordine di lattazione.Nel Grafico 9 vengono invece rappresentati i dati relativi alla concentrazione di lisozima (µg/ml) nei campioni di latte mastitico, mentre in Tabella 2 vengono riportati nel dettaglio i medesimi dati per i 20 campioni analizzati con le rispettive percentuali. Grafico 4,5 II lattazione I lattazione 61 70 40 60 22 20 50 N° Campioni N° Campioni 40 35 30 25 20 15 10 5 0 6 40 21 30 11 20 3 10 < 0,025 0,025 0,05 0,1 0 < 0,025 Concent razione lisozima (ug/ml) 0,025 0,05 0,1 Concent razione lisozima (ug/ml) Grafico 6,7 III lattazione 70 70 60 60 50 40 27 30 11 20 1 61 50 N° Campioni N° Campioni IV lattazione 72 80 40 24 30 20 1 10 10 7 2 3 0 0 < 0,025 < 0,025 0,025 0,05 0,1 0,025 0,05 0,1 0,2 0,2 Concent razione lisozima (ug/ml) Concentrazione lisozima (ug/ml) Grafico 7,8 Campioni latte mastitico V lattazione 7 7 25 21 6 N° Campioni N° Campioni 20 15 10 9 10 5 2 1 5 5 4 3 3 2 2 1 1 1 1 0 0 0,025 < 0,025 0,025 0,05 0,1 0,05 0,1 0,2 0,5 0,2 Conc. Lisozima (ug/ml) Concent razione lisozima (ug/ml) 176 1 2 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Tabella 3 Concentrazione lisozima campioni latte mastitico Percentuale Concentrazione N° campioni (%) Lisozima (µg/ml) 2/20 0,025 10 1/20 0,05 5 3/20 0,1 15 7/20 0,2 35 5/20 0,5 25 1/20 1 5 1/20 2 5 Gli agenti eziologici isolati e tipizzati mediante Api System (BioMerieux®) dai 20 campioni di latte mastitico analizzati sono i seguenti: 3 ceppi di Staphylococcus hyicus, 1 di Staphylococcus intermedius, 2 di diStaphylococcus epidermidis, 1 di Staphylococcus simulans, 9 di Staphylococcus aureus, 1 di Streptococcus dysgalactiae, 1 di Streptococcus mitis, 1 di Escherichia coli e 1 di Pseudomonas aeruginosa. CONCLUSIONI Per quanto concerne l’andamento della concentrazione di lisozima (µg/ml) nei gruppi suddivisi per lattazione negli anni 2005 e 2006 si osserva come i medesimi soggetti in prima lattazione nel 2005 e in seconda nel 2006 si abbia un notevole incremento del numero di campioni con aumento della concentrazione di lisozima: i campioni con concentrazione > 0,025 µg/ml in prima lattazione nel 2005 passano dal 60,5% (23/38) all’85,7% (36/42) quando nel 2006 i soggetti si trovano in seconda lattazione; i capi che erano in seconda lattazione nel 2005 e quindi in terza nel 2006 presentano invece valori pressoché invariati di concentrazione di lisozima; considerando i valori di concentrazione > 0,025 µg/ml nel 2005 abbiamo l’85,2% (46/54) dei campioni che passa all’88,9% (48/54); lo stesso dicasi per quei soggetti che si trovavano in terza lattazione nel 2005 e quindi in quarta nel 2006; per i soggetti inseriti in quarta lattazione nel 2005, e quindi in quinta lattazione nel 2006, si assiste ad una inversione di tendenza nella concentrazione dell’enzima in quanto si osservano valori più simili a quelli della prima lattazione. Da un attenta analisi dei risultati si rileva come in prima lattazione i valori complessivamente risultino piuttosto bassi; il 47,7% dei campioni presenta concentrazioni ≤0,025µg/ml, il 45,5% presenta valori pari a 0,05 µg/ml e solo il rimanente 6,8% presenta concentrazioni dell’enzima equivalenti a 0,1 µg/ml. In seconda lattazione la concentrazione di lisozima nel latte ovino subisce invece un apprezzabile incremento evidenziato dalla diminuzione della percentuale dei campioni la cui concentrazione di lisozima risulta ≤0,025µg/ml (14,6%) e dal notevole aumento della percentuale dei campioni con concentrazione pari a 0,05 µg/ml (63,5%); il restante 21,9% dei campioni si attesta su valori pari a 0,1 µg/ml. In terza lattazione il trend positivo di incremento della concentrazione di lisozima nel latte sembra proseguire avendo fornito valori pressoché sovrapponibili a quelli ottenuti nel corso della seconda lattazione; nello specifico il 10,7% dei campioni si è attestato su valori ≤0,025µg/ml, il 63,4% su valori pari a 0,05 µg/ml, il 24,1% su valori pari a 0,1 µg/ml e il 177 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES rimanente 0,9% è dato da un campione che si presenta per la prima volta con concentrazione pari a 0,2 µg/ml. L’andamento della concentrazione dell’enzima in quarta lattazione si attesta su valori analoghi (il 9,3% dei campioni presenta concentrazioni ≤0,025µg/ml, il 62,9% concentrazioni pari a 0,05 µg/ml, il 24,7% concentrazioni pari a 0,1 µg/ml, il 3,1% concentrazioni pari a 0,2 µg/ml). In quinta lattazione si può invece osservare come la concentrazione di lisozima subisca un’inversione del trend riportandosi su valori molto più simili a quelli della prima lattazione (il 27,9% dei campioni si attesta su valori di 0,05 µg/ml) pur mantenendosi numerosi i sieri con concentrazioni pari allo 0,1 µg/ml (20,9%). Sulla base di questi risultati possiamo affermare che la concentrazione di lisozima nel latte ovino sembra permanere su valori generalmente bassi in prima lattazione per subire un sostanziale incremento in seconda lattazione, mantenere tale concentrazione su livelli pressoché costanti in terza e quarta lattazione per poi subire un decremento significativo in quinta lattazione. Per quanto riguarda la concentrazione di lisozima nel latte mastitico possiamo affermare che questa è notevolmente superiore rispetto a quella del latte normale. Il 70% (14/20) dei campioni si attesta su valori ≥ 0,2 µg/ml. Le maggiori concentrazioni di lisozima si sono avute in corrispondenza dei campioni di latte i cui agenti eziologici responsabili di mastite erano rappresentati da Staphylococcus aureus, Streptococcus dysgalactiae, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. In merito alla CBT del latte normale possiamo affermare che questa si è attestata su valori medi ≤ 1000 UFC/ml, con punte massime di 5000 UFC/ml, quindi valori molto contenuti che non consentono di mettere in relazione la carica batterica con la concentrazione di lisozima. La CBT relativa ai campioni di latte mastitico ha fornito un valore medio di circa 18 milioni UFC/ml; analizzando i due dati si evidenzia come esista un legame di proporzionalità diretta tra CBT del latte mastitico e concentrazione di lisozima. In considerazione di quanto sopra esposto sarebbe auspicabile verificare l’ereditabilità della concentrazione di lisozima nel latte ovino; nel caso in cui questa venisse dimostrata, potrebbe essere impiegata per contenere l’insorgenza di mastiti. A fianco dei vantaggi dovuti alla presenza di lisozima nel latte ovino per le attività antibatteriche aspecifiche proprie dell’enzima e per gli effetti tecnologicamente positivi nell’industria lattiero-casearia (migliore resistenza della cagliata, riduzione del tempo di coagulazione etc.), possono sussistere degli svantaggi; la stessa attività antibatterica che per certi aspetti può essere considerata positiva per inibire flore microbiche alteranti, deterioranti o patogene, può altresì esplicare effetti negativi sui batteri lattici indispensabili nelle trasformazioni lattiero-casearie. Pertanto, nella produzione di formaggi pecorini tradizionali e non prodotti con latte crudo, sarebbe opportuno selezionare ceppi di batteri lattici, impiegabili come starter, resistenti all’azione litica del lisozima, cosa che per altro già avviene per altre tipologie di formaggio vaccino quali Grana Padano, Provolone e Asiago (Wasserfall F. et al., 1979; Giangiacomo R. et al., 1992). BIBLIOGRAFIA Carlsson A., Björck L., 1989. Lactoferrin and Lysozyme in milk during acute mastitis and their inhibitory effect in Delvotest P. Journal of Dairy Science. 72: 3166-3175. Giangiacomo R., Nigro F., Messina G., Cattaneo T.M.P., 1992. Lysozyme: just an additive or a technological aid as well? Food additives and contaminants. 9 (5): 427-433. Goudswaard J., Bakker-de Koff E.C., van Ravenswaaij-Kraan H.P., 1978. Lysozyme and its presence in bovine milk and serum.. 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Infectious Bovine Rhinotracheitis (IBR) is a disease of domestic and wild animals due to Bovine Herpesvirus 1 (BoHV-1). Both infections are associated with several economic losses worldwide. The aim of this study was to verify the serological situation of both diseases using a commercial ELISA test in 45 herds sampling 1,716 animals from 4 regions of Central Italy, where voluntary eradication program for IBR was planed. In addition, the BVDV seronegative animals were tested with an antigen capture ELISA (AgELISA-IDEXX) to identify PI animals. 26.3% and 25.5% of samples were positive respectively for IBR and BVD, meanwhile both antibodies were detected in 10.7% sera. All the BVDV seronegative animals were negative to AgELISA. PI animals are the principal source of infection in a farm, but viral transmission can occur also in their absence, as demonstrated by the serological results obtained in this work. The results demonstrate that IBR and BVDV are highly diffused in bovine herds of Central Italy, and the application of voluntary eradication programs is needful to contain further diffusion of the infection and to reduce the economic losses. INTRODUCTION Bovine Viral Diarrhoea Virus (BVDV) belongs to the genus Pestivirus, family Flaviviridae, which includes Border Disease Virus and Classical Swine Fever Virus, three viruses that cause important losses to the livestock industry (Tautz, et al., 1998). Pestiviruses are small enveloped viruses of 40 to 60 nm diameter with a genome consisting of a single positive stranded RNA of about 12.5 kb (Hamers et al., 2001; Brock, 2003). BVDV is classified by biotype and genotype. Two biotypes classification, cytopathic (CP) and noncytopathic (NCP), is based on the presence or absence of visible cytopathic effects in infected cell cultures, and although both biotypes infect cattle and cause disease, the majority of BVDV isolates from the field are NCP (Bolin, 2004). In other hand, BVDV genotypes (I and II) are detected by polymerase chain reaction (PCR) for nucleotide and antigenic differences (Ridpath, et al., 1998). Type I BVDV strains include the classic BVDV isolates, which are commonly used in laboratory reference and vaccine strains, meanwhile genotype II comprises the BVDV strains associated with high mortality, acute and peracute infections (Sandvik, 1999; Saliki et al., 2004). The virus has a worldwide distribution with serum antibody prevalences ranging from 19% to 90% (Brock, 2004; Lindberg et al., 2005). BVDV infections cause a complex 180 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES of diseases in cattle, ranging from mild signs to lethal mucosal disease (MD), but infections have the greatest impact when they occur in the breeding season or during pregnancy (Greiser-Wilke et al., 2003). This can result in a significant reduction in calving and cause abortions or malformations, but most importantly can lead to the birth of persistently infected (PI) calves (Grooms, 2004). The PI animals are thus not detected by the commonly used AbELISA test, represent the most important reservoir of BVDV within herds and play a significant role in spreading of infection by direct contact with susceptible animals (Houe, 1999; Brock, 2003; Smith, 2004). A general model for successful BVD control involves bio-security, virus elimination, monitoring and immunization (Lindberg et al., 2005). The key to BVD control is to prevent foetal infections in early gestation, interfering with the process by which PI animals are generated. An other critical point in BVD control is to detect and remove all PI animals at a young age in order to reduce the risk of transmission of virus to other animals. This risk could be minimized also by vaccination programs (Brock, 2004; Kelling, 2004). The Bovine Herpesvirus type 1 (BoHV-1) belongs to the family Herpesviridae, subfamily Alphaherpesvirinae, is worldwide distributed and causes significant economic losses to the cattle industry (Ackermann et al., 2006). The genome of BoHV-1 consists of a linear DNA molecule of about 140 kb that codes for approximately 70 proteins. This virus is associated with several clinical manifestations in both beef and dairy herds, such as rhinotracheitis (IBR), vulvovaginitis, balanopostitis, conjunctivitis, meningoencephalitis and several forms of reproductive disorders. BoHV-1 replicates in the up respiratory or genital tracts and gain access to neurons for establishment of latency in the corresponding ganglia (Takiuchi et al., 2005). Although IBR is a respiratory illness, the agent is not easily transmitted by aerosol. In contrast, salivation onto feed and movement of contaminated feed from positive groups to negative groups have been found to be the major source of BoHV-1 transmission in fattening units. The most severe effect of BoHV-1 as a reproductive pathogen is seen in pregnant animals, because if the infection becomes systemic, the virus can reach uterus, leading to either embryonic or foetal death and abortion (Biuk-Rudan et al., 1999; Boelaert et al., 2005). An important activity in an eradication program is the annual surveillance by serological surveys. Europe has a long history of fighting against BoHV-1 infections, however only a small number of countries has achieved the goal of IBR-eradication. Successful eradication programs based on serological tests and slaughter policies have been carried out in different countries and they suggest the movement restriction of infected animals and the seropositive cattle removing and replacing with seronegative animals. In most of these countries vaccination is widely used according voluntary program, which may help to decrease the economical losses due to disease (Ackermann et al., 2006) and the recent availability of gE- marker vaccines represents an important tool to immunize susceptible animals, allowing their detection by specific serological tests. Serological surveys on BVDV and BoHV-1 infection prevalence in Italy are limited. The studies are mainly carried out in the North Italy, where the bovine concentration is higher. Luzzago et al. (1999) found a prevalence of 53.3% of BVDV infection by seroneutralization in 375 out of 704 sera collected in 29 dairy herds. Castrucci et al. (1997) found a prevalence of 35.0% of BoHV-1 infection in 2,245 out of 6,415 sera 181 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES collected in North Italy and tested by seroneutralization. Very few data are available about BVDV and BoHV-1 prevalence in Central Italy, where a survey carried out in 4 farms revealed a BoHV-1 prevalence of 38.6% (Castrucci et al., 1997) and where a BVDV prevalence of 31.4% was found (Ferrari et al., 1999). In Italy BVD and IBR are not included in compulsory control programs but, on the basis of the available epidemiological data, some authors recommended the implementation of voluntary eradication programs in order to limit the economic losses and to reduce the diffusion of these viruses. Due to the high economic importance of these diseases, the aim of this preliminary study was to investigate the epidemiological situation in four regions of Central Italy in herds where voluntary IBR and BVD eradication programs were started. MATERIAL AND METHODS a) Animals Forty-five herds from 4 different regions of Central Italy (Umbria, Marche, Lazio and Toscana) were selected on the basis of the history of reproductive disorders and of the absence of BoHV-1 and BVDV vaccination programs. A total of 1,716 Holstein Friesian animals with an average age between 6 months and 5 years were sampled to obtain sera. The farms were stratified according to the number of animals to ensure a representative sampling and the sera were stratified in two groups by age, of 6-15 months or older than 15 months. This latter group was divided in pregnant and not pregnant cows. In each herd an inquiry was conducted to characterize herd management, animal density, contact with cattle from other farms, observation of clinical disease, replacement and vaccination practices adopted. The dimension of the samples allowed estimating with 95% of confidence the proportion of infected farms and it was calculated for an expected prevalence of infection of 10%. b) Serological Test Samples of blood were collected in tubes without anticoagulant and centrifuged at 2500 rpm for 20 minutes in order to obtain sera samples. The sera were refrigerated and tested within 2 days with two commercial ELISA kits (BVDV Antibody test kit and IBR-gB Antibody test kit; IDEXX Herd Check Laboratories) in order to detect serum antibodies against BVDV and BoHV-1. The IBR-gB enzyme immunoassay is based on the detection of specific antibodies to the BoHV-1 glycoprotein B (gB), meanwhile the BVDV antibody kit detects antibodies against the non structural proteins NS3 of BVDV. With the aim to identify PI animals, the BVDV antibody negative sera obtained from 6-15 months old animals were tested with a commercial ELISA kit (BVDV Antigen/serum, IDEXX- Herd Check Laboratories) to detect the structural glycoprotein Erns (gp44-48) of BVDV. The serological tests were carried out following the manufacturer’s instructions. Briefly, the antibody detection kits required the sera incubation in antigen–coated wells. After washing unbound materials, a specific peroxidase-conjugated monoclonal antibody was added for being detected with substrate/chromogen solution. In case of BVDV antibody test kit, the conjugated antibody was directed to the bovine antibodies bound to the antigens coated to the plates. In case of IBR-gB antibody test kit, a competitive reaction was obtained using a peroxidase-conjugated antibody directed to the gB of the BoHV-1 coated to the plate. This antibody does not bind to the BoHV-1 antigen when the antigenic 182 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES determinant has been previously blocked by antibodies in the test serum. The BVDV antigen kit required the sera incubation in antibody-coated wells. Captured BVDV antigen was detected by specific antibodies and a peroxidase conjugated antibody. In every test, the color absorbance generated by the substrate-chromogen reaction was measured using a spectrophotometer (Labsystem Multiscan) at a single wavelength of 450 nm. The statistical analysis of the data was carried out using the STATA Program version 5 and the significativity of differences was evaluated by Chi-square test. RESULTS AND CONCLUSIONS The serological survey carried out in the selected herds demonstrated that 37 (82%) out of 45 herds were contemporaneously infected by both BoHV-1 and BVDV. In particular, 451 (26.3%) out of 1,716 animals tested were positive for BoHV-1, 438 (25.5%) were positive for BVDV. 185 animals (10.8%) were positive for both tests (Tables 1 and 2). 68 (6.9%) out of the 984 pregnant cows older than 15 months had history of reproductive problems, and 10 were seropositive for BoHV-1, 18 for BVDV, 37 for both BoHV-1 and BVDV, and 3 were negative. 195 out of 310 animals aged between 6 and 15 months resulted negative for BVDV antibodies and the ELISA test aimed at the detection of BVDV antigen resulted negative in all the animals. BoHV-1 BVDV Reproductive Animals Total disorders + + 6-15 months 310 0 109 201 115 195 > 15 months 422 0 124 298 101 321 and not pregnant cows > 15 months 984 68 218 766 222 762 and pregnant cows total 1716 68 451 1265 438 1278 Table 1: BoHV-1 and BVDV serological results by the class of age BVDV BoHV-1 + + 185 253 266 1012 total 451 1265 Table 2: BoHV-1 and BVDV serological results total 438 1278 On the basis of the BVDV serological results, the herds were subdivided in three classes: seronegative herds, seropositive herds with no recent cases of infection and seropositive herds with recent infection (Table 3). An herd was considered seronegative if all the tested animals resulted seronegative for BVDV. Seropositive herds were considered with recent infection if BVDV antibodies were found in animals aged between 6 and 15 months, while they were considered with no recent infection if the animals aged between 6 and 15 months resulted seronegative, similarly as reported by Ferrari et al. (1999). 183 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Herds status n. of herds 6 n. of animals tested 217 N. of Abpositive and % 0 (0%) Seronegative herds Seropositive herds with no recent BVDV 32 1170 323 (27.6%) infection Seropositive herds with recent BVDV 7 329 115 (34.9%) infection Total 45 1716 438 (25.5%) Table 3: BVDV serological results by class of herds n. of PI animals 0 0 0 0 The purpose of this study was to evaluate the sanitary status of dairy herds with history of reproductive disorders in Central Italy, with particular reference to BoHV-1 and BVDV infections. In order to exclude interferences in the seroprevalence evaluation due to vaccine-induced antibodies, the herds included in the study did not apply vaccination programs for both the two viruses. The samples tested revealed a BoHV-1 seroprevalence of 26.3%, significantly lower (p<0.001) than the 35.0% and 38.6% reported by Castrucci et al. (1997) respectively in North and Central Italy. Similarly, the BVDV seroprevalence detected was 25.5%, significantly lower (p<0.001) than 53.3% and 31.4% reported respectively by Luzzago et al. (1999) in North Italy and by Ferrari et al. (1999) in Rome province (Central Italy). These data reveal that the situation in Central Italy regarding BoHV-1 and BVDV is not so critical as in other Italian regions, where spontaneous eradication programs began some years ago because the high seroprevalence and the economic losses, but the seroprevalence detected in the present work suggest that control measures would have to be planed also in the areas studied. The seroprevalence differences observed in different geographic areas can be attributed manly to the differences in size and management between North Italian herds and Central Italian herds. In particular, in the North Italian herds the cattle are more numerous and the animal-to-animal contact is closer, resulting in higher risk of viral transmission and consequently in higher seroprevalence. Other differences could be explained by the characteristic of the animals included in the study. Our samples were similar to those tested by Ferrari et al. (1999), while Luzzago et al. (1999) tested animals with no history of vaccination in the last two years and included also the 0-6 months old animals, which could have passive antibodies. BVDV PI animals are considered the principal source of infection in a farm and within herds, and direct contact between these animals and susceptible animals is the most important infection route (Brock, 2004, Niskanen et al., 2003; Lindberg et al., 2005). In our case, none of the 195 BVDV seronegative and 6-15 months old animals resulted positive for the viral antigen in blood samples, demonstrating the absence of PI animals in the 7 seropositive herds with recent BVDV infection. Moen et al. (2005) have recently demonstrated that transmission of BVDV by direct or indirect causes can take place over a prolonged period of time in absence of PI animals, and this is the most probable explanation of the recent viral infection in herds with no presence of PI animals observed in 184 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES this study. For this reason, a complete voluntary eradication program should include also strategies to prevent BVDV transmission in absence of PI animals, with particular reference to avoiding the use of semen not previously tested for BVDV. Several studies are worldwide carried out to evaluate BoHV-1 or BVDV seroprevalence, but very few studies evaluate the distribution of both the viruses contemporaneously. Our study revealed that 185 (10.8%) out of 1716 cattle were contemporaneously seropositive for BoHV-1 and BVDV antibodies, and 37 (20%) of them had history of reproductive problems. The reproductive disorders were reported more frequently (p<0.01) in animals seropositive for both BoHV-1 and BVDV than in animals seropositive for only one of the two viruses or than in seronegative animals. These data suggest that the association between BoHV-1 and BVDV infection could increases the rate of reproductive problems, as previously suggested by Biuk-Rudan et al. (1999). The results of this study demonstrate a diffusion of BoHV-1 and BVDV in dairy herds in Central Italy, and the contemporaneous infection by the two viruses is responsible for the increase of reproductive problems. Eradication programs should be thus directed to the control of both the two infections. BVDV eradication programs based on the detection and slaughtering of PI animals is not recommendable in this case, because recent infection in absence of PI animals occurred, and more attention have to be paid to the origin and to the “sanitary status” of the semen used in reproductive practice. REFERENCES Ackermann M, Engels M. Pro and contra IBR-eradication. Vet Microbiol. 2006 Mar 31;113(3-4):293-302 Biuk-Rudan N, Cvetnic S, Madic J, Rudan D. Prevalence of antibodies to IBR and BVD viruses in dairy cows with reproductive disorders. Theriogenology. 1999 Apr 1;51(5):87581. Boelaert F, Speybroeck N, de Kruif A, Aerts M, Burzykowski T, Molenberghs G, Berkvens DL. Risk factors for bovine herpesvirus-1 seropositivity. Prev Vet Med. 2005 Jul 12;69(34):285-95. Bolin SR, Grooms DL. Origination and consequences of bovine viral diarrhea virus diversity. Vet Clin North Am Food Anim. 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Clin Diagn Virol. 1998 Jul 15;10(2-3):121-7. 186 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES VALUTAZIONE DEI PRINCIPALI AGENTI INFETTIVI CAUSA DI ABORTO NEL BUFALO (BUBALUS BUBALIS) NEL CENTRO ITALIA SELECTED AGENTS INVOLVED IN BUFFALO (BUBALUS BUBALIS) ABORTION IN CENTRAL ITALY CUTERI V., ATTILI A.R., CITTADINI F.1, PREZIUSO S., ROMERO TEJEDA A., MARENZONI M.L.1, VALENTE C.1 Department of Veterinary Science, University of Camerino, Italy. 1Department of Diagnostic Pathology and Veterinary Clinic, Infectious Diseases Unit, University of Perugia, Italy KEY WORDS: buffalo, abortion, aetiology, diagnosis ABSTRACT Studies on the infectious agents of abortion in buffalo (Bubalus bubalis) are uncommon and very few is known about his health status in Italy. In order to investigate this situation, a serological survey has been carried out in 9 buffalo farms of Central Italy with history of reproductive disorders. During 2005, 505 buffalo sera were tested using commercial antibody-detection ELISA for BoHV-1, BVDV (IDEXX), Chlamydophila abortus (CIVTEST), Leptospira hardjo (EVL-diagnostic division) and Neospora caninum (VMRD, Inc.). All buffalos were negative for L. hardjo while 72 (14.26%) sera had antibodies against BVDV. Overall prevalence of 7.33% and 2.38% has been estimated respectively for BoHV1 and C. abortus. All herds were infected by N. caninum with a prevalence of 50.10%. A closed association between seropositivity and abortion was found only for N. caninum infection and the prevalence value was significantly higher (P<10-4) in the aborting group (79.45%) than in the non-aborting group (45.14%). Abortion occurred in the first trimester of pregnancy, and the administration of Toltrazuril and/or Sulphadiazine and Trimethoprim to all the animals was efficacious in reducing N. caninum infection and in preventing the reproductive disorders. This study suggested a correlation between N. caninum infection and abortion in buffalo. INTRODUZIONE In Italia il bufalo (Bubalus bubalis) ha ormai assunto nell’economia agricola un posto importante tanto da risultare, nel panorama zootecnico, una delle tipologie di allevamento in continua crescita con una popolazione stimata approssimativamente intorno ai 200.000 animali. In virtù della crescente domanda di latte da parte dell'industria di trasformazione, l’aumento di tali animali ha interessato contemporaneamente sia aree tradizionalmente vocate che zone nuove, tanto che in alcune circostanze l'allevamento bovino è stato sostituito con quello bufalino (Pisanelli et al., 2005). Se fino a pochi anni fa il bufalo era presente soltanto in Campania e nel Lazio, oggi si assiste ad una diffusione su tutto il territorio nazionale. In Puglia si concentra il 2,1% del patrimonio bufalino italiano (BioBank, 2001) ed aumenti nella consistenza di questa specie si sono registrati nella pianura padana (Bertoni et al., 2001) e in Lombardia (Bronzo et al., 2003). 187 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES La particolare fisiologia della riproduzione del bufalo, specie poliestrale tendenzialmente stagionale con ripristino dell’attività ciclica ovarica in fotoperiodo decrescente, e l’elevata variabilità della durata del calore pongono notevoli limiti alla produzione. A causa soprattutto dell’anestro (o subestro) stagionale, il bufalo rappresenta una delle specie animali sprovvista di performaces sia produttive che riproduttive soddisfacenti (Singh et al., 2000). Il danno economico che ne può derivare risulta rilevante soprattutto quando, oltre ai caratteri fisiologici, entrano in gioco svariate cause che concorrono a determinare infertilità e aborto. Un ruolo importante nell’eziologia dell’aborto è da attribuire agli agenti di natura infettiva. Alcuni microrganismi solitamente in grado di determinare aborto quali Brucella spp., Campylobacter spp., Tripanosoma evansi (Lohr et al., 1986), Serratia marcescens (Das et al., 1988), Yersinia enterocolitica (Das et al., 1986), Listeria monocytogenes e Salmonella spp. devono essere ancora meglio definiti. Ricerche condotte in Africa e in Malesia hanno dimostrato una positività sierologica, rispettivamente, dell’1,7% (Myburgh et al., 1990) e del 31% (Bahaman et al., 1987) nei confronti di alcuni sierotipi di Leptospira. Le informazioni circa la diffusione di Leptospira interrogans nella specie bufalina allevata in Italia sono ancora modeste pur essendo stata riscontrata in passato una prevalenza del 67,2% (Ciceroni et al., 1995). Virus della Rinotracheite infettiva e della Diarrea virale tipici del bovino sono stati isolati in concomitanza di aborto e sindromi respiratorie in associazione al virus erpetico del bufalo di tipo 1, Bubaline herpesvirus-1 (BuHV-1), che risulta strettamente correlato oltre che a BoHV-1 anche a BoHV-5. Anticorpi anti BoHV-1 sono stati evidenziati in diverse specie di ruminanti, bufalo compreso, dimostrando la suscettibilità all’infezione anche di questa specie animale e suggerendo un suo possibile ruolo come “reservoirs” (Thiry et al., 2006). Anche in Italia De Carlo et al. (2004) hanno isolato e successivamente identificato mediante tecniche di biologia molecolare, il BuHV-1 da tamponi nasali di due bufale sane, non vaccinate nei confronti della Rinotracheite infettiva del bovino ma sieropositive per BoHV-1. Tale situazione conferma la correlazione tra i due herpesvirus del bovino per la presenza di geni codificanti le glicoproteine D e B e il virus del bufalo. In ulteriori indagini condotte sul bufalo in India sono state registrate prevalenze del 52.5% per BoHV-1 (Renukaradhya et al., 1996) e del 23.21% per BVDV (Sudharshana et al., 1999), mentre in Egitto gli animali sieropositivi per BVDV erano il 52% (Zaghawa, 1998). In questo contesto, a fianco di microrganismi tradizionalmente ritenuti agenti d’infertilità e aborto, è segnalata la crescente prevalenza di patogeni emergenti anche di origine parassitaria. Relativamente al ruolo di Neospora caninum, protozoo intracellulare appartenente al phylum Apicomplexa, famiglia Sarcocystidae, nel determinismo dell’aborto nel bufalo, alcune segnalazioni e diverse indagini epidemiologiche si sono succedute rapidamente in tutto il mondo, Italia compresa. Indagini recenti sviluppate in sud d’Italia (Guarino et al., 2000) e in Egitto (Dubey et al., 1998) hanno registrato valori di prevalenza, rispettivamente, del 34,6% e del 68%. Sieropositività del 64% e del 53% sono state segnalate rispettivamente mediante il test di immunofluorescenza e di agglutinazione (NAT), in bufale naturalmente infette allevate nello Stato di S. Paolo, Brasile (Fujii et al., 2001). Lo scopo della ricerca è stato quello di valutare il coinvolgimento di alcuni agenti di natura infettiva nel determinismo dell’aborto nella specie bufalina allevata in Italia, in seguito alla 188 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES segnalazione di disordini riproduttivi verificatesi in 9 aziende della provincia di Latina. Pertanto si è proceduto alla valutazione della prevalenza nei confronti di BoHV-1, BVDV, Leptospira interrogans serovar Hardjo, Chlamydophila abortus e Neospora caninum, al fine di definire la diffusione di tali agenti di infezione e correlare la loro presenza con i disordini riproduttivi. La finalità della ricerca è stata rivolta anche all’individuazione di un intervento sanitario immediato capace di contenere soprattutto i danni derivanti dall’aborto. MATERIALI E METODI L’indagine è stata condotta nell’anno 2005 in 9 allevamenti bufalini siti nella provincia di Latina nei quali si erano verificati casi di infertilità e aborto. Tutte le aziende erano costituite da unità produttive ad indirizzo zootecnico-specializzato e gli animali erano tenuti in una forma di allevamento stabulato con paddocks e tettoie, con pascolo in regime di semilibertà. In accordo con il programma di eradicazione applicato in Italia (Decreto 27/8/1994 n. 651), gli animali erano regolarmente sottoposti ai controlli sanitari nei confronti di Brucellosi, Leucosi e Tubercolosi. Nessun allevamento praticava la vaccinazione nei confronti di BoHV-1, BVDV e Chlamydophila. Gli aborti, riferiti all’anno precedente, si registravano tra il primo trimestre e il quinto mese di gestazione e si presentavano a carattere sporadico in alcune aziende, mentre in altre coinvolgevano più bufale contemporaneamente e spesso gli stessi animali in gravidanze successive. I prelievi di sangue, effettuati nel mese di gennaio su 505 bufali, hanno interessato sia gli animali che avevano abortito sia quelli sospetti di aborto silente o riassorbimento fetale. Per ogni allevamento è stata campionata anche la popolazione di controllo, rappresentata da soggetti che non avevano manifestato disordini riproduttivi. Sul siero, ottenuto per centrifugazione, sono state effettuate indagini per la ricerca di anticorpi nei confronti di BoHV-1 (Bovine Rhinotracheitis virus antibody test Kit, Herdcheck®, IDEXX Laboratories Inc., USA), BVDV (Bovine Viral Diarrhoea Virus Antibody Test Kit Herdcheck®, IDEXX Laboratories Inc., USA), Chlamydophila abortus (CIVTEST Bovis Chlamydia PS, Hipra, S. A. Laboratorios, Amer, Spain), Leptospira interrogans serovar Hardjo (EVL-Diagnostic division, The Netherlands) e Neospora caninum (VMRD, Inc.Pullman, WA, USA), seguendo le indicazioni delle ditte produttrici. Nel mese di febbraio 2005, sulla base dei risultati sierologici, gli animali sono stati sottoposti a trattamento chemioterapico nei confronti di Neospora caninum, seguendo il protocollo formulato da Cuteri et al. (2005). Agli annutoli è stato somministrato per via endovenosa Toltrazuril 50 mg/ml (Baycox® - Bayer), mentre agli adulti Sulfadiazina 200mg/ml e Trimethoprim 40 mg/ml (Norodine 24® - Bayer). Nel trattamento sono stati inclusi anche i cani, considerati l’ospite definitivo in grado di eliminare le oocisti infettanti, ai quali è stato somministrato Toltrazuril per via orale. L’utilizzo periodico di disinfettanti fenolici, diluiti all’1%, garantiva la disinfezione dei ricoveri. Nel mese di dicembre dello stesso anno tutti i bufali sono stati nuovamente testati sierologicamente nei confronti di N. caninum e i risultati sono stati confrontati con quelli ottenuti prima del trattamento. 189 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Per la valutazione statistica dei risultati è stato utilizzato il Programma STATA versione 5 e la significatività delle differenze è stata valutata attraverso il test del χ2 e dell’Odds ratio, con intervalli di confidenza del 95%. RISULTATI E CONCLUSIONI I risultati dell’indagine sierologica condotta nel mese di gennaio 2005 sono riportati integralmente nella figura 1. La ricerca di anticorpi ha evidenziato positività per il virus della Diarrea virale del bovino in 8 delle 9 aziende saggiate con una prevalenza media del 14,26%. In tutte le aziende sono state riscontrate positività sierologiche nei confronti di BoHV-1 e di N. caninum, interessando, rispettivamente, 37 (7.33%) e 253 (50,10%) dei 505 bufali saggiati. I dati hanno mostrato una prevalenza per C. abortus del 2,38%, mentre tutti gli animali sono risultati negativi alla ricerca di anticorpi nei confronti di Leptospira interrogans serovar Hardjo. L’analisi dei dati ha evidenziato un’associazione statisticamente significativa tra sieropositività per N. caninum e soggetti con storia di disordini riproduttivi rispetto al gruppo di animali che non aveva mai presentato ipofertilità o aborto (χ2 = 29,41; P<10-4) (Tabella 1). La misura del grado di tale associazione è stata valutata mediante il calcolo dell’Odds Ratio (OR) con un valore di 4,70 (2.60 < OR < 8.49). Figura 1. Agenti abortigeni e sieroprevalenza. 60% 50,10% 50% 40% BoHV-1 BVDV 30% C. abortus 20% L. hardjo 14,26% N. caninum 7,33% 10% 2,38% 0 0% Agenti abortigeni 190 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Tabella 1. Correlazione tra sieropositività ed aborto. Prevalenza Agenti Abortigeni Aborto (n = 73) Non aborto (n = 432) BoHV-1 8,22% (CI95 1,77 - 14,67)* 7,18% (CI95 4,73 - 9,62) BVDV 10,96% (CI95 3,62 – 18,30) 14,81% (CI95 11,45 – 18,18) Chlamydophila abortus - 2,78% (CI95 1,22 - 4,33) Leptospira interrogans serovar Hardjo Neospora caninum - - 79,45% (CI95 69,96 – 88,94) 45,14% (CI95 40,43 - 49,85) * CI95: Intervallo di Confidenza del 95%. Sulla base dell’alta prevalenza di N. caninum, allo scopo di contenere gli aborti è stato ritenuto opportuno intervenire con tempestività sperimentando il protocollo applicato in precedenza nel bovino. Nella tabella 2 sono riassunti i risultati relativi alla prevalenza per N. caninum prima (T0) e dopo (T1) il trattamento. In particolare, dei 73 animali che avevano abortito prima del trattamento, 47 (64,38%) erano sieropositivi solo per N. caninum, 6 (8,23%) per N. caninum e BVDV e 4 (5,48%) sia per N. caninum che per BoHV-1. Un solo soggetto, con anamnesi di disordini riproduttivi, aveva anticorpi nei confronti di tutti e tre gli agenti aborigeni (1,37%). Durante i mesi di trattamento, in tutti gli allevamenti, è stata registrata una significativa diminuzione (P < 10-4) degli episodi di aborto e nessuno tra i bufali risultati in precedenza negativi ha contratto infezione da Neospora o ha abortito. L’intervento chemioterapico non può prescindere dall’attento controllo dei potenziali fattori di immunodepressione derivanti dalle concomitanti infezioni virali che potrebbero giustificare i 9 dei 16 casi di aborto osservati ancora dopo l’applicazione del protocollo terapeutico. Tabella 2. Sieroprevalenza per Neospora caninum prima e dopo il trattamento. Trattamento Numero di animali con anamnesi di aborto siero + per N. caninum Prevalenza per Neospora caninum (T0) 58/73 79,45% 1 (CI95 69,96 – 88,94) n = 73 (T1) 16/58 27,59% 1 (CI95 15,73 – 39,44) n = 58 CI95: Intervallo di Confidenza del 95%; 1(P < 10-4). La dimostrazione dell’infezione da N. caninum in ben 58 soggetti che avevano abortito, ribadisce l’importanza di questo protozoo quale agente di aborto anche nella specie bufalina e suggerisce un ampliamento delle indagini volte a determinare la reale diffusione di N. 191 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES caninum negli allevamenti bufalini italiani e la corretta valutazione del suo ruolo quale causa di aborto ed ipofertilità. In accordo con quanto riportato in bibliografia (Sudharshana et al., 1999), anche nella nostra indagine è stata confermata la maggiore diffusione di BVDV rispetto a BoHV-1. Negli allevamenti oggetto di studio i caratteri tipici dell’infezione da BoHV-1, come aborto negli ultimi 4 mesi di gestazione e sindrome respiratoria, non sono stati osservati, a conferma della bassa prevalenza riscontrata (7,33%). Il valore modesto riportato in questa indagine contrasta con un risultato di positività del 52,5% riportato da altri autori (Renukaradhya et al., 1996). I risultati possono contribuire alla conoscenza della possibile correlazione tra agenti di natura infettiva e i disordini riproduttivi osservati nel bufalo ed in particolare sottolineano l’importanza di N. caninum quale agente abortigeno. Considerando l’importanza dell’aborto nella gestione economica di un’azienda e dei possibili riflessi che può avere in ambito di sanità pubblica, risulta essenziale sviluppare una maggiore conoscenza del fenomeno per promuovere gli interventi gestionali opportuni. Pur rimanendo in parte irrisolti alcuni problemi legati all’allevamento bufalino, l’impiego dell’indagine sierologica rappresenta un valido mezzo diagnostico in grado di fornire informazioni sullo stato sanitario degli animali. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI Bahaman A.R., Ibrahim A.L. Adam H. (1987). Serological prevalence of leptospiral infection in domestic animals in West Malaysia. Epidemiol. Infect. Vol. 99 (2): 379-392. Bertoni G., Piccioli Capelli F., Carli D (2001). L’allevamento bufalino nel nord Italia.Atti 1 Congr. All. del bufalo, Eboli (SA): 20-27. http://www.biobank.it/it/BIObiobank.asp Bronzo V., Fedeli R., Moroni P., Casula A., Pisoni G., Antonimi M., Sgoifo Rossi C., Ruffo G. (2003). Infezioni mammarie e contenuto in cellule somatiche del latte in allevamenti bufalini della Lombardia. Atti SiSVet Ischia (Napoli). Vol. LVII: 179-180. Ciceroni L., D’Aniello P., Russo N., Picarella D., Nese D., Lauria F., Pinto A., Cacciapuoti B. (1995). 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SPAIN) SIERRA CARRO, J.A.b; LÓPEZ ALONSO, M.a; GARCÍA-PARTIDA, P.c; ESCUDERO POBLACIÓN, A.b; BENEDITO, J.L.a a Universidad de Santiago de Compostela, Departamento de Patología Animal, Facultad de Veterinaria. b Universidad de León, Departamento de Patología Animal: Medicina Veterinaria, Facultad de Veterinaria. c Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Veterinaria. ABSTRACT The aim of this study was to determine the levels of cadmium in meat and offals in sheep from León (NO Spain), and to compare them with levels in other countries and with the maximum tolerance levels in products for human consumption established by European Community. Samples of liver, kidney, muscle and blood of 255 adult ewes (3-10 years) were collected at the slaughterhouses of Leon Province in 2004-2005. The samples were processed with acid digestion and cadmium levels were determined by ICP-OES. The mean cadmium concentrations (expressed arithmetic mean±SE) were 149±11 µg/kg fresh weight in liver, 751±42 µg/kg in kidney and 14.8±2.8 µg/kg in muscle. In general, cadmium levels in our study were slightly higher than of the most countries studies. In León 4% of livers, 24% of kidneys and 2% of muscles above the maximum tolerance levels established by European Community. PALABRAS CLAVE: cadmio, hígado, riñón, músculo, ganado ovino, León INTRODUCCIÓN Los procesos agrícolas e industriales han dado lugar a la liberación de muchos metales tóxicos al medio ambiente, aunque también pueden aparecer concentraciones relativamente altas de forma natural. Si hablamos de potenciales efectos adversos sobre la salud humana y animal, el cadmio está entre los elementos que han causado una mayor preocupación. Esto es debido a que es fácilmente transferido a través de la cadena alimentaria y no se conoce que sirva para ninguna función fisiológica esencial por el contrario, cuando está presente en concentraciones elevadas puede causar importantes daños como fallo renal, anemia, hipertensión o daño hepático (Friberg y col., 1979). Uno de los aspectos más importantes de la contaminación ambiental para el hombre es la ingesta de estos elementos tóxicos con la dieta. Puesto que esta situación se debe limitar a un mínimo inevitable, se ha puesto mucha atención en los niveles de estos elementos en la dieta. La carne y productos derivados constituyen una parte importante de la dieta humana. Aunque los niveles de elementos tóxicos en el músculo son generalmente bajos, las asaduras, como el hígado y el riñón, acumulan frecuentemente mayores concentraciones de estos elementos que otros alimentos (López Alonso y col., 2000). Ante esta situación la 194 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Unión Europea en el año 2001 estableció unos niveles máximos admisibles para los productos animales destinados al consumo humano (European Comisión, 2001). Por todas estas razones se hace necesario monitorizar los niveles de cadmio en carnes para evitar el consumo de carnes con unos niveles de cadmio excesivos. Así en muchos países se han llevado a cabo programas de monitorización para evitar la distribución de alimentos que podrían plantear un riesgo para la salud humana si fueran consumidos como por ejemplo en Noruega (Kluge-Berge y col., 1992), Suecia (Jorhem y col., 1989, 1991, 1996), Holanda (Vos y col., 1987, 1988), Finlandia (Niemi y col., 1991), Polonia (Falandysz 1991, 1993, 1994), Australia (Langlands y col., 1987, 1988), Canadá (Salisbury y col., 1991), Eslovenia (Doganoc, 1996). Los objetivos de este estudio se centran en determinar los niveles de cadmio en carne y vísceras en ganado ovino procedente de León (NO España), compararlos con las concentraciones de cadmio en ganado ovino en otros países y con los niveles máximos admisibles para productos cárnicos establecidos por la Unión Europea. MATERIAL Y MÉTODOS Muestreo La recogida de las muestras se llevó a cabo en varios mataderos de la provincia de León entre Noviembre de 2003 y Octubre de 2005, pudiendo así conocer la procedencia exacta de los animales, por medio de la Guía de Origen y Sanidad Pecuaria, garantizar que todas las muestras (hígado, riñón y músculo) perteneciesen al mismo animal, y evitar problemas de contaminación por el manejo de las mismas. Se recogieron muestras de un total de 251 hembras adultas, con un edad comprendida entre los 3 y 10 años, Se descartaron aquellos animales que por cuestiones sanitarias eran objeto de decomiso. Las muestras fueron recogidas siempre de la misma procedencia anatómica mediante el empleo de cuchillos de plástico para evitar contaminación. La muestra de hígado se tomó del lóbulo cuadrado (200 g aproximadamente), para el riñón se recogió el riñón derecho y la muestra de músculo se recogió de los pilares del diafragma. Las muestras se recogieron en bolsas de polipropileno debidamente identificadas y se mantuvieron refrigeradas hasta su transporte en el mismo día al laboratorio. Una vez en el laboratorio, las muestras se limpiaron de grasa, tejido conectivo y principales vasos sanguíneos. En el caso del riñón las muestras fueron homogeneizadas para evitar posibles diferencias en la concentración de elementos entre la corteza y la médula renal. Una vez limpias de cada muestra de tejido se tomaron 3 submuestras de 10 g aproximadamente que se colocaron en bolsas de polipropileno debidamente identificadas. Todas las muestras de cada animal se colocaron en una única bolsa identificada con el código del animal, congelándolas a -18ºC hasta su posterior análisis laboratorial. Digestiones Todas las muestras de hígado, riñón y músculo (2 g aproximadamente) se pesaron de forma precisa en los vasos de digestión utilizando una balanza electrónica SALTER- AND, modelo ER-60 A. A cada muestra se le añadieron 5 ml de ácido nítrico concentrado, (Suprapur Grade, Merck 69%), 2 ml de peróxido de hidrógeno 30% p/v y 1 ml de agua ultrapura. A continuación se cerraron los vasos y se sometieron a un proceso de digestión 195 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES en un sistema microondas (marca Milestone Ethos Plus) La solución resultante se diluyó con agua ultrapura hasta un volumen final de 25 ml y se almacenó en tubos de polipropileno hasta su posterior análisis químico. Determinación laboratorial La determinación de los niveles de cadmio se llevó a cabo por Espectroscopía de Emisión con Fuente de Plasma Acoplado (ICP-OES). Los análisis se realizaron en el Laboratorio FISQUITECNAL perteneciente a los servicios centrales de la Universidad de Santiago de Compostela. Durante todo el estudio se llevó a cabo un estricto programa de control de calidad analítica. En cada lote de 10 muestras se incluía un blanco y una muestra de material de referencia certificado. El límite de detección de la digestión ácida se calculó como tres veces la desviación estándar de los blancos. Los límites de cuantificación, expresados como la concentración de cada analito en el tejido, se calcularon teniendo en cuenta el peso de la muestra y la disolución empleada. Estos límites de cuantificación fueron 12.0, 24.5 y 15.8 µg/kg para hígado, riñón y músculo respectivamente. Los estudios de recuperación analítica se llevaron a cabo empleando un Material de Referencia Certificado (Pig Kidney CRM 186, BCR Reference Materials) con una concentración certificada de cadmio de 2.71 µg/kg peso seco, obteniendo un porcentaje de recuperación de 95.0% a lo largo de todo el estudio. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Encontramos unas concentraciones medias de cadmio (expresadas como media aritmética±SE) de 149±11 µg/kg peso fresco en hígado, 751±42 µg/kg en riñón y 14.8±2.8 µg/kg en músculo (Tabla 1). Los niveles de cadmio en riñón fueron 5 veces superiores a los descritos en hígado, mientras que los niveles en músculo fueron muy bajos con un 77% de las muestras por debajo del límite de detección. En la mayoría de estudios realizados en distintas especies animales se han descrito resultados similares con niveles mucho más altos en hígado y riñón con respecto al músculo. Esto pone de manifiesto que el hígado y el riñón son los principales órganos de acumulación crónica de cadmio debido a que tienen capacidad de síntesis de metalotioneínas, a las cuáles se une el cadmio (Friberg y col., 1979); sin embargo en el músculo los niveles son siempre bajos situándose en la mayoría de las muestras por debajo del límite de detección, ya que en este tejido el cadmio no puede inducir la síntesis de dichas proteínas, pasando al hígado y al riñón donde sí va ser fijado a estas proteínas (Webb, 1979). Las concentraciones de cadmio en ganado ovino han sido determinadas en muchos países (Tabla 2). Antes de comparar los resultados obtenidos en el ganado ovino de León con estudios realizados en otros países debemos señalar que estas comparaciones deben realizarse con cierta precaución porque pueden existir diferencias entre los distintos estudios en la edad de los animales, el tipo de muestra analizada (en riñón corteza, médula ó todo el órgano ya que los niveles en corteza renal suelen ser mayores; (Friberg y col., 1979) ó diferencias en el análisis de los datos (como el límite de detección o el valor asignado a las muestras que se encuentran por debajo del límite de detección) que hacen que los datos no sean fácilmente comparables entre sí. Al comparar los resultados obtenidos en ganado ovino de León con estudios llevados a cabo en otros países observamos que en Italia (Amodio-Cocchieri y Fiore, 1987) los niveles de cadmio son superiores en los tres 196 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES tejidos estudiados; estos autores atribuyeron estos niveles tan elevados al hecho de que los forrajes locales que constituían el alimento del ganado ovino contenían también elevados niveles de cadmio. Los niveles encontrados en Australia (Langlands y col., 1988) también fueron superiores a los encontrados en León, estos autores atribuyeron estos elevados niveles de cadmio al consumo de suelo de las ovejas al pastar debido a que por las características físicas, químicas y geológicas del suelo y a la aplicación de superfosfatos que aumentaban los niveles de cadmio en estos suelos. En USA (Coleman y col., 1992) encontraron niveles sensiblemente superiores a los descritos en León pero solamente los riñones superaban en alguna ocasión los límites regulatorios fijados en 2 mg/kg. En el resto de los países los niveles fueron sensiblemente menores a los descritos en el ganado ovino de León. En un estudio realizado en ganado vacuno en León, López Alonso y col. (2004) determinaron unos niveles de cadmio de 59,6, 318 y 8,51 µg/kg en hígado, riñón y músculo respectivamente. Si comparamos estos valores con los descritos en el ganado ovino observamos que son menores lo que puede deberse a que gran parte del ganado ovino se cría en régimen extensivo consumiendo forrajes y pastos locales a diferencia del ganado vacuno criado en régimen intensivo y alimentado principalmente con piensos compuestos. La Unión Europea en el año 2001 estableció unos niveles máximos admisibles de cadmio para productos cárnicos de 0,5, 1 y 0,05 mg/kg en hígado, riñón y músculo, respectivamente. Estos niveles máximos admisibles fueron superados en un 4, 24 y 2% de las muestras de hígado, riñón y carne respectivamente. Este hecho es común en otros países aunque hay que señalar que los límites tolerables fijados para el consumo humano son distintos en los diferentes países siendo los establecidos por la UE los más restrictivos. En Australia no destinan al consumo humano los riñones de vacas y ovejas de más de 18 meses porque en muchas ocasiones superan la concentración máximas permitidas fijada en 2,5 mg/kg (Morcombe y col., 1994). En Grecia, Antoniou y col. (1995), encontraron que un 50% de los riñones y un 14,7% de los hígados de ganado caprino superaban los límites permitidos para consumo humano (riñón 3, hígado 1 mg/kg) por lo que señalan que el consumo de estas vísceras debería ser prohibido. En Canadá Salisbury y col. (1991) describieron que en équidos un 98,6% de los riñones y un 77% de los hígados superaban el límite máximo permitido de 1 mg/kg, por lo que se recomendó que estos órganos no fueran utilizados para la alimentación humana ni animal. En Holanda (Vaessen y Ellen (1985) encontraron que un 22% de los riñones y un 3% de los hígados superaban los límites máximos para el consumo humano fijados en 1 mg/kg para el hígado y 3 mg/kg para el riñón. En Polonia Falandysz y col. (2005) observaron que en ciervos cazados entre 20002001 una serie de riñones sobrepasaban los límites legales fijados en este país. Según observamos en la mayoría de los estudios son el hígado y el riñón los órganos que normalmente exceden los límites máximos fijados para el consumo humano, a diferencia de la carne que en raras ocasiones excede estos límites. Así López Alonso y col. (2002) indican que la carne, a pesar de ser consumida en mayor cantidad, contribuye poco a la ingesta de cadmio; sin embargo el consumo de asaduras (principalmente hígado y riñón) aún en pequeñas cantidades puede ser una fuente significativa de este elemento sobre todo si el ganado procede de zonas relativamente contaminadas. Ante esta situación Prankel y col. (2005) señalan que la extracción rutinaria del hígado y el riñón del ganado ovino adulto 197 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES es una buena opción para reducir la ingesta de cadmio en el hombre procedente de estos animales. CONCLUSIONES Las concentraciones de cadmio en el ganado ovino de León fueron generalmente bajas y comparables a las descritas en otros países. Puesto que un 24% de las muestras de riñón y un 4% de las muestras de hígados de animales ovinos adultos superaron los niveles máximos admisibles establecidos por la UE no se recomienda el consumo de estos órganos. Tabla 1: Niveles de cadmio en hígado, riñón y músculo en ganado ovino de la provincia de León N (<LD) Media ES Mediana Mínimo Máximo Hígado 251 (3) 149 10,5 98,1 5,99 1477 Riñón 250 (1) 751 41,8 559 12,3 3906 Músculo 251 (195) 14,8 2,79 7,90 7,90 693 Tabla 2. Niveles de cadmio en hígado, riñón y músculo (µg/kg) de ganado ovino en estudios realizados en otros países. País Nueva Zelanda Italia Australia Holanda Canadá Polonia Alemania USA Kuwait Suecia Suecia (corderos) Islandia (corderos) Hígado 100 219 (30) 298 (563) 89 (123) 60 (155) 56 (5) 271 (62) 240 (34) 44 (16) 310 (11) 45 (96) Riñón 250 1035 (30) 956 (552) 289 (124) 170 (155) 250 (5) 547 (71) 830 (34) 301 (16) 1000 (42) 120 (98) 58 (96) Músculo 178 (30) 31 (714) 6 (49) < 5 (5) 2 (72) 3,4 (43) 1,9 (98) Referencia Solly y col. (1981) Amodio-Cocchieri y col. (1987) Langlands y col. (1988) Vos y col. (1988) Salisbury y col. (1991) Falandysz (1991) Schulz-Schroeder (1991) Coleman y col. (1992) Husain y col. (1996) Jorhem (1999) Jorhem (1999) Reykdal y col. (2001) BIBLIOGRAFÍA Amodio-Cocchieri, A.; Fiore, P. 1987. Lead and cadmium concentrations in livestock bred in Campania, Italy. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 39: 460-464. 198 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Antoniou, V; Zantopoulos, N. 1995. 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Su funcionamiento supone un mecanismo primario y prácticamente exclusivo de los lactantes, permitiendo que el calostro y la leche pasen directamente al abomaso, sin caer en el retículo y rumen. El conocimiento de diversos factores fisiológicos, así como de las manipulaciones farmacológicas del reflejo de la gotera reticular, tanto para estimularlo como para inhibirlo, resultan de gran interés en la administración oral de diversos medicamentos, en el tratamiento de algunas patologías, así como un mejor aprovechamiento de algunos alimentos. Para su estimulación hemos aplicado lisina-vasopresina (LVP) i.v. a distintas ovejas y concentraciones (0,1, 0,08 y 0,06 UI/kg) con el objeto de determinar la dosis mínima eficaz capaz de estimular el cierre de la gotera esofágica. Comprobamos su funcionamiento mediante visualización directa por laparoscopia, así como mediante el incremento de la glucemia tras la administración oral de soluciones glucosadas. Observamos que a dosis de 0,1 y 0,08 UI/kg se produce el cierre de la gotera reticular de forma eficaz y el incremento de la glucemia en todas las ovejas, no sucediendo cuando la concentración era de 0,06 UI/kg. Los efectos secundarios advertidos a dosis altas de LVP y el pobre efecto a dosis bajas conllevan a que recomendemos su uso a dosis de 0,08 UI/kg. PALABAS CLAVE: vasopresina, gotera reticular, oveja, glucemia SUMMARY The esophageal groove or reticulated groove is an anatomical structure, like channel, which is situated in the digestive device of the ruminants. His functioning supposes a primary and practically exclusive mechanism of the nursing ones, allowing that the calostrum and the milk should happen directly to the abomaso, without falling down in the retículo and rumen. Esophageal or reticular groove closure is a useful technique for the oral administration of drugs and the treatment of some illness. Lysine-vasopressin was injected intravenously to the sheeps. It was used several concentrations (0.1, 0.08 and 0.06 IU/kg) to find the minimal effective doses. The reticular groove closure was observed by laparoscopy. It was administered oral glucose to measure the increase of glycemia. We found that 0.1 and 0.08 IU/kg caused the groove closure and an increase in glycemia in all the animals. We propose the use of the lower effective doses (0.08 IU/kg) due to the secondary effects of vasopressin. KEY WORDS: lysine-vasopressin, reticular groove, sheep, glycemia 201 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES INTRODUCCIÓN La gotera esofágica, tambien llamada surco reticular, es una estructura anatómica, a modo de canal, que se halla en el aparato digestivo de los rumiantes. Su funcionamiento supone un mecanismo primario y prácticamente exclusivo de los lactantes, permitiendo que el calostro y la leche pasen directamente al abomaso, sin caer en el retículo y rumen, evitando con ello que se produzcan fermentaciones indeseadas. Aunque como hemos indicado es un mecanismo presente en los animales lactantes, también en la edad adulta es posible estimular este reflejo mediante la administración de diversas sustancias entre las que se han citado sulfato, acetato y cloruro de cobre, sulfato de zinc, sulfato de cobalto, soluciones de sacarosa, clonidina, lactosuero o diversas concentraciones de sulfato sódico o de cloruro sódico. Parece ser que las sales de sodio (cloruro, sulfato, bicarbonato, acetato, etc.) son más eficaces en el ganado vacuno para estimular el cierre de la gotera, mientras que en la oveja el sulfato de cobre es altamente efectivo (Watson y col, 1944; Riek, 1954). Los resultados presentados en diversas investigaciones son contradictorios, así la respuesta de los animales es variada frente a las distintas sustancias ensayadas y a diferentes concentraciones. Así se ha comprobado que la gotera reticular permaneció abierta en 2 de 6 ovejas a las que se les aplicó cloruro de sodio al 0,9%. El cierre de la gotera esofágica y paso de un líquido con contraste desde el esófago distal al orificio retículo-omasal y abomaso se observó en 5 de 10 animales estimulados con sulfato de cobre y en 6 de 10 ovejas que recibieron sulfato de cobalto. MATERIAL Y MÉTODOS Para el presente ensayo utilizamos 9 ovejas a las que aplicamos lisina-vasopresina (LVP) ([Lys8]-vasopressin Sigma, 250 UI/mg) i.v. a distintas concentraciones (0,1, 0,08 y 0,06 UI/kg) para intentar determinar la dosis mínima eficaz capaz de estimular el cierre de la gotera esofágica. Elegimos estas dosis por ser las que ocasionalmente se citan en la bibliografía para l estímulo del reflejo en ovejas y en otras especies. La comprobación del reflejo se realizó de dos maneras, bien directamente mediante visualización directa del esfínter cardial del surco reticular o indirectamente mediante el rápido incremento de la glucemia. Para comprobar de forma directa su funcionamiento y para aproximarnos a la dosis efectiva, hemos empleado la laparoscopia visualizando el cierre del esfínter cardial de la gotera esofágica previa ruminotomía en la fosa paralumbar izquierda en 3 de esos animales, al mismo tiempo que se administraba oralmente una solución acuosa coloreada con azul de metileno. Para determinar el posible incremento de la glucemia tras el cierre de la gotera esofágica administramos LVP a diferentes dosis (0,1 UI/kg en 2 ovejas, 0,08 UI/kg en 5 ovejas y 0,06 UI/kg en las 2 ovejas restantes). Inmediatamente tras la aplicación de la LVP administramos una solución glucosada vía oral (1000 ml) mediante sonda introducida en el tramo inicial del esófago. Realizamos la experiencia 7 veces en cada oveja, con extracciones sanguíneas a los 15 minutos postratamiento para valorar la glucemia, que se midió mediante un autoanalizador Hitachi 704. 202 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES RESULTADOS Y DISCUSIÓN Mediante visualización directa comprobamos que la administración i.v. de LVP a dosis de 0,1 UI/kg P. V., provoca el cierre de la gotera esofágica, estimula el cierre del esfínter cardial, y con ello solamente una pequeña cantidad de la solución coloreada cae hacia rumen discurriendo, por tanto, el resto hacia abomaso. Al administrar la LVP a la dosis de 0,08 UI/kg P. V. se produjo la estimulación de la gotera esofágica de manera similar a lo descrito anteriormente. Con una dosis menor de LVP (0,06 UI/kg P. V.) observamos que la mayoría del agua coloreada cae al rumen, lo que nos induce a pensar que la gotera esofágica no se cierra completamente. En la segunda parte de la experiencia comprobamos que en las dos ovejas a las que se administró la LVP i.v. a dosis de 0,1 UI/kg, seguida del aporte de una solución glucosada vía oral, se produjo un importante incremento de la glucemia en todos los ensayos. A los 15 minutos postadministración la glucemia asciende desde valores iniciales entre 25 mg/dl y 62,5 mg/dl hasta valores de 72,1 mg/dl y 187,5 mg/dl. Cuando la dosis de LVP fue de 0,08 UI/kg P. V. la glucemia aumentó en todos los animales desde 42,6 y 68,8 mg/dl a 54,3 y 158,9 mg/dl a los 15 minutos postratamiento. Sin embargo la aplicación de 0,06 UI/kg P. V. de LVP o no provocó un incremento de la glucemia o éste fue mínimo. Con dosis de LVP de 0,1 UI/kg P. V. hemos observado ligeras reacciones adversas en el animal como inquietud, temblores, taquipnea y adopción reiterada de posturas de micción y flatulencia. Estos síntomas no aparecieron o lo hicieron muy levemente con 0,08 UI/kg de LVP. No se percibieron con dosis menores. Estas reacciones adversas encontradas están justificadas por el efecto que la lisinavasopresina ejerce sobre la musculatura lisa y por las alteraciones del tono vagal y simpático, dando lugar a vasoconstricción, a disminución del flujo sanguíneo, así como a bradicardia y taquipnea (Gross, 1988). El rápido incremento en la glucemia en las ovejas a las que se les administró la LVP a dosis de 0,08 y 0,1 UI/kg P. V. sólo puede ser atribuido al cierre de la gotera esofágica. Ello permite que la solución glucosada llegue directamente hasta abomaso, desde donde se absorbe rápidamente. Sin duda se ha debido a la acción de la lisina-vasopresina al estimular la musculatura de la gotera esofágica (Mikhail, 1986; Rehage, 1986; Ruckebusch y col, 1991). Una evolución similar ha sido comprobada por diversos investigadores al utilizar protocolos similares para el tratamiento de la cetosis bovina (Rehage 1986; Scholz y Rehage, 1987) y también en la gestosis ovina (El-Hamamsy y col, 1990). La no variación de la glucemia o las ligeras variaciones observadas cuando la LVP se aplicó a dosis de 0,06 UI/kg P. V. pueden ser debidas a que parte de la solución glucosada cae hacia rumen, donde es fermentada, sin llegar a abomaso debido al cierre incompleto de la gotera esofágica. 203 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES 200. 0 200.0 150. 0 150.0 100. 0 100.0 50. 0 50.0 0. 0 0 +15 mi n LVP 0 , 0 6 U I / k g P . V. 0.0 0 LVP 0,08 UI/kg P.V. + 15 min 200.0 150.0 100.0 50.0 0.0 0 LVP 0,1 UI/kg p.V. + 15 min Las figuras muestran la variación en la glucemia observada en los diferentes muestreos realizados en algunas de las ovejas con las diferentes dosis de LVP. CONCLUSIONES Tras los efectos adversos observados a dosis altas de LVP y el cierre incompleto de la gotera a la menor concentración utilizada recomendamos el empleo de LVP a dosis de 0,08 UI/kg P. V. ya que los efectos secundarios son mínimos y se produce la estimulación de la gotera esofágica de forma eficaz. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS EL-HAMAMSY HT; EL-NEWEEHY TK; ABDOU OM; KUBESY AA. 1990. Clinical significance of oesophageal groove vasopressin induced closure. II. A new concept in the oral glucose treatment of pregnancy toxaemia in ewes. Veterinary Medical Journal Giza, 38 (3): 373-384. GROSS DR. 1988. Fármacos que afectan al equilibrio acuoso y electrolítico. En: Booth, N.H.; McDonald, L.E. Farmacología y terapéutica veterinaria. 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Tierarztliche Umschau, 42 (8): 606-612. 205 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES CIRCULATING TOTAL AND FREE IODOTHYRONINES LEVELS OF SHEEP (OVIS ARIES): DIFFERENTIATED EFFECTS OF RESTRAINT AND SHEARING AND PREVIOUS EXPOSURE TO SHEARING MEDICA P., FAZIO E., CRAVANA C., ARONICA V., FERLAZZO A. Department of Morphology, Biochemistry, Physiology and Animal Productions, Unit of Physiology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Messina. KEY WORDS: total and free iodothyronines, sheep, restraint, shearing SUMMARY Aim of the study was to contribute to the characterization of mechanisms involved in thyroidal response to physical and psychological stress of sheep. Circulating T3, T4, fT3 and fT4 levels of No. 40 Pinzirita sheep (No. 20 male and No. 20 female subjects) were evaluated in basal conditions, after restraint and after shearing, by taking into account the influence of the previous exposure to shearing. In according to previous experience, the subjects were divided in two groups, respectively Group A (No. 20 sheep, aged 1-2 years, no previously exposed to shearing) and Group B (No. 20 sheep, aged elder than 2 years, previously exposed to shearing). Significative effects of both restraint and shearing stresses were recorded on total and free iodothyronines modifications of sheep in Groups A and B. As compared to basal values, sheep no previously exposed to shearing showed T3, T4, fT3 decreases and unmodified fT4 levels after restraint and increases after shearing. Sheep previously exposed to shearing showed T3 and fT3 decreases after restraint and increases after shearing, and T4 and fT4 increases after both restraint and shearing. The lowest T3 levels in basal conditions and after shearing and the highest fT3 levels in basal conditions were also recorded in sheep previously exposed to annual shearing. Female subjects showed higher total and free iodothyronines levels than male subjects. Changes in thyroidal hormones could then be used as a measure of the stress associated with management practices. INTRODUCTION A variety of handling procedures are undertaken during the management of domestic sheep. Many of these procedures are promoted by physical facilities, human handler, climate and the social and economic environment. Treatments are undertaken either to attain production goals (e.g. shearing, tail docking, weaning and classing) and for reasons of health maintenance (e.g. vaccination, dipping and drenching, marking) (Hargreaves and Hutson, 1997). The effect of handling experience may depend on the age at which handling occurs, and it may be possible to exploit the sensitivity of sheep to learning at certain ages. Habituating sheep to handling routines, familiarizing them with yard configurations and training leader sheep at critical learning periods may improve later handling (Hargreaves and Hutson, 1997). Habituation may also lead to improvements in sheep handling. The physiological stress response to handling may decline over several exposures (Hargreaves and Huston, 1990; Fordham et al., 1989), although this is often slight and may depend on the nature and severity of the procedure (Jephcott et al., 1986). Since the shearing induces variations of plasma cortisol, β-endorphin, T3 and T4 (Mears and Brown, 1997; Mears et al., 1999), ACTH and cortisol (Medica et al., 2005), PRL and 206 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES haematological parameters (Carcangiu et al., 2001), aim of the study was to contribute to the characterization of mechanisms involved in thyroidal response (total and free iodothyronines) to physical and psychological stress of sheep exposed to restraint and shearing, by taking into account the influence of previous exposure to shearing. MATERIALS AND METHODS The study was carried out on a total of No. 40 Pinzirita sheep, No. 20 male subjects and No. 20 female subjects, submitted to shearing procedure (isolation, restraint, shearing). In according to previous experience the subjects were divided in two groups, respectively Group A (No. 20 sheep, aged 1-2 years, no previously exposed to shearing) and Group B (No. 20 sheep, aged elder than 2 years, previously exposed to shearing procedures). Blood samples were collected by jugular vein at 05.00 p.m., in basal conditions, before the shearing management, and the day after, at 08.00 a.m., after restraint and at the end of shearing. Serum total and free iodothyronines concentrations (T3, T4, fT3, fT4) were determined in duplicate by immunoenzymatic assays supplied by RADIM. Statistical analysis by one-way repeated measures analysis of variance (ANOVA) was applied. Significant differences between basal conditions, after restraint and after shearing, and between Group A and B were assessed using the Student’s paired t-test. The level of significance was set at <.05. All calculations were performed using the PRISM package (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). RESULTS Data obtained are presented as mean ± standard deviation (S.D.) in Table 1. Restraint effects (p< .01) in Group A and both restraint (p< .01) and shearing effects (p< .05) in Group B were obtained for T3 modifications. As compared to basal values, Group A and B showed decreases of T3 (p< .01) after restraint and increases, significative only for Group B (p< .001), after shearing. As compared to restraint values, increases were obtained after shearing both in Group A (p< .01) and Group B (p< .001). Shearing effects (p< .01) in Group A and restraint (p< .05) and shearing effects (p< .01) in Group B were obtained for T4 modifications. As compared to basal values, Group B showed an increase of T4 (p< .05) after restraint; increases after shearing of Group A (p< .01) and Group B (p< .001) were shown. As compared to restraint values, increases were obtained after shearing both in Group A (p< .001) and in Group B (p< .05). Restraint (p< .05) and shearing (p< .01) effects in Group A and only shearing effect (p< .01) in Group B were obtained for fT3 modifications. As compared to basal values, Group A and B showed increases of fT3 (p< .001) after shearing. As compared to restraint values, increases were obtained also after shearing both in Group A and in Group B (p< .001). Shearing effects (p< .01) in Group A and Group B were obtained for fT4 modifications. As compared to basal values, Group A (p< .01) and B (p< .001) showed increases of fT4 after shearing. As compared to restraint values, increases were obtained after shearing both in Group A (p< .01) and in Group B (p< .001). Sheep previously exposed to shearing practice showed the lowest T3 levels both in basal conditions and after shearing (p< .05). 207 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Data obtained showed higher total and free iodothyronines levels in female than in male subjects. DISCUSSION AND CONCLUSIONS Data obtained showed that T3 concentrations were affected by restraint and shearing practices, T4 by restraint and only partially by shearing, fT3 and fT4 by shearing. The suppressed T3 and fT3 increase after restraint in sheep, such as induced by confinement and weaning in lambs (Medica et al., 2000), and by food deprivation only for T3 in stressed sheep (Wronska-Fortuna et al., 1993), could be interpreted as a reduction in perceived stimulus severity. In contrast, the increases of T3 and fT3 after shearing showed that this practice was more stressful than restraint. Moreover the highest fT3 levels in basal conditions in sheep previously exposed to shearing showed a preferential utilization of free respect to total iodothyronines. However, although an increase of T4 was described after restraint only in sheep previously exposed to shearing, these increases were more significative after shearing than after restraint both in Group A and in Group B. Moreover, previous studies showed that T4 and T3 concentrations were not affected by tail docking, castration, weaning, isolation and restraint in lambs (Mears and Brown, 1997). Also fT4 increases after shearing showed that this practice was more stressful than restraint. The increases of total and free iodothyronines levels were probably due also to thermal stress associated with shearing practice both in Group A and in Group B. The magnitude of total and free iodothyronines changes following restraint and shearing practices suggests that restraint was a moderate stressor in sheep while shearing was a severe stressor. Moreover, the lowest T3 levels in basal condition and after shearing in Group B showed that the previous exposure to this practice could induce an habituation to the stimulus probably, inducing the suppressed increase of T3 levels. REFERENCES Carcangiu V. et al., Atti S.O.F.I.Vet. (2001), 4, 31-33 Fordham D.P. et al., Anim. Prod. (1989), 49, 103-107 Hargreaves A.L. and G.D. Huston, Appl. Anim. Behav. Sci. (1990), 26, 253-265 Hargreaves A.L. and G.D. Huston, Livestock Prod. Sci. (1997), 49, 121-138 Jephcott E.H. et al., Res. Vet. Sci. (1987), 43, 97-100 Medica P. et al., Proc. 8th Internat. Congr. Fe.Me.S.P.Rum. (2000), 105-109 Mears G. J. and F.A. Brown, Can. J. Anim. (1997), 77, 689-694 Mears G.J. et al., Can. J. Anim. Sci. (1999), 79, 35-38 Wronska-Fortuna D. et al., Pharmacol. Biochem. Behav. (1993), 45, 601-606. 208 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Table 1 - Mean serum (M ± S.D.) levels of T3, T4, fT3 and fT4 in sheep before and after exposure to restraint and shearing SHEEP Serum levels Basal After restraint ANOVA After shearing ANOVA Basal After restraint ANOVA After shearing ANOVA Basal After restraint ANOVA After shearing ANOVA Basal After restraint ANOVA After shearing ANOVA NO PREVIOUSLY EXPOSED Group A (No. 20) T3 (nmol/l) 4.40 ± 1.34 3.47 ± 1.31b F=12.72 p<.01 4.93 ± 1.38B F=1.59 n.s. T4 (nmol/l) 144.97 ± 53.81 140.33 ± 44.89 F=0.66 n.s. 199.339 ± 56.52bC F=13.53 p<.01 fT3 (pmol/l) 3.88 ± 1.72 3.25 ± 1.34 F=3.77 p<.05 8.47 ±3.47cC F=87.05 p<.01 fT4 (pmol/l) 1.48 ± 0.63 1.49 ± 0.56 F=0.20 n.s. 2.06 ± 0.69bB F=12.99 p<.01 PREVIOUSLY EXPOSED Group B (No. 20) 3.41 ± 1.15α 2.71 ± 1.18b F=14.33 p<.01 4.01 ± 1.29aCα F=5.00 p<.05 136.81 ± 34.62 154.18 ± 40.71a F=5.74 p<.05 209.56 ± 56.58cA F=43.40 p<.01 4.98 ± 2.30α 4.29 ± 2.44 F=3.15 n.s. 10.15 ± 4.56cC F=53.33 p<.01 1.52 ± 0.53 1.55 ± 0.45 F=0.23 n.s. 2.14 ± 0.60cC F=52.54 p<.01 In parenthesis the number of subjects vs basal values: a= p< .05; b= p< .01; c=p< .001 vs restraint: A= p< .05; B= p< .01; C= p< .001 vs Group A: α=p< .05 209 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES DISMIELINIZZAZIONE SPINALE DEL BOVINO (SDM). SU DI UN CASO IN UN VITELLO DI RAZZA BRUNA TESTONI S., GENTILE A.* Dipartimento di Scienze Cliniche Veterinarie, Padova, Italia *Dipartimento Clinico Veterinario, sezione di Medicina Interna, Bologna, Italia RIASSUNTO Gli autori descrivono gli aspetti clinici, diagnostico-collaterali ed isto-patologici di un caso di Dismielinizzazione Spinale Bovina (SDM) in un vitello di razza Bruna italiana, di cinque giorni di etá, sottoposto alla nostra attenzione a causa di una grave forma di tetraparesi congenita. Alla visita clinica, nonostante lo stato sensoriale normale e l’appetito conservato, erano presenti decubito laterale, incapacità ad alzarsi e mantenere la stazione quadrupedale, tetraparesi, iperestensione degli arti posteriori, leggero opistotono, riflesso flessorio aumentato. Gli esami emato-biochimici routinari, le indagini radiografiche della colonna vertebrale e la mielografia non evidenziavano nulla di anomalo. Dallo studio del certificato genealogico emergeva la presenza di soggetti giá conosciuti portatori di SDM, sia in linea materna che paterna. L’esame istologico del midollo spinale, determinante per la diagnosi definitiva, mostrava una grave forma di ipomielinizzazione bilaterale simmetrica del fascicolo Gracile, del tratto Spinocerebellare e del tratto Solcomarginale. Sulla base della visita clinica, del certificato genealogico e dell’esame istologico del midollo spinale era emessa diagnosi di Dismielinizzazione Spinale. PAROLE CHIAVE: Dismielinizzazione Spinale, razza Bruna, malattie genetiche SUMMARY The authors describe the clinical, diagnostic-collateral and histo-phatologic findings of a case of Bovine Spinal Dysmyelination (SDM) in a five-day old Brown calves submitted due to congenital tetraparesis. The calf was alert and showed physiological appetite. The animal was lying in lateral position and was unable to stand up or support itself; furthermore there were extension of the limbs and opisthotonos. The calf responded by kicking on pressuring the interdigital skin. Haematological and biochemical parameters, radiographies of the vertebral column and mielography were normal. Pedigree information showed ancestors carrier of SDM. Histological examination of the spinal cord revealed a severe bilateral symmetric hypomyelination at the level of the Gracile funiculus, Spinocerebellar tract and Sulcomarginal tract. Clinical examination, pedigree information but especially the histological examination supported the clinical suspect of Bovine Spinal Dysmyelination. KEY WORDS: Spinal Dysmyelination, Brown breed, hereditary diseases 210 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES INTRODUZIONE Nella collezione delle malattie genetiche che negli ultimi decenni hanno preoccupato il mondo allevatoriale della razza Bruna, posizione dominante è stata assegnata alla Mieloencefalopatia Progressiva Degenerativa Bovina (BPDME o sindrome Weaver) ed alla Atrofia Muscolo Spinale (SMA), alle quali, in termini piú contenuti, puó essere aggiunta la c.d. Aracnomelia. Seppure giá descritta, invece, scarsa attenzione è stata riservata alla Dismielinizzazione Spinale (SDM, Bovine Spynal Dysmyelination), per la quale, in effetti, si trovano rare segnalazioni in letteratura. Quanto sopra ha valso anche in Italia, dove accanto a evidenze di sindrome Weaver (Baldrighi M. et al., 1992), Atrofia Muscolo Spinale (Testoni et al., 2002) ed Aracnomelia (Testoni e Gentile, 2004), nessuna segnalazione è giunta fino ad oggi in riferimento alla Dismielinizzazione Spinale. Quanto sopra motiva questa nota che intende fare menzione proprio di un caso di SDM recentemente sottoposto alla nostra attenzione, evenienza per la quale dobbiamo dare merito al rapporto di collaborazione instaurato negli ultimi anni con i veterinari operanti sul campo. DESCRIZIONE DEL CASO Si tratta di un vitello, di razza Bruna Italiana, femmina, di 5 giorni di vita. Anamnesi. Fin dalla nascita la vitella, nonostante la vivacità e l’appetito conservato non si era mai alzata, passando la maggior parte del tempo completamente sdraiata, e solo se aiutata poteva mantenere per alcuni minuti la posizione di decubito sternale. A nulla erano valsi i rimedi terapeutici a base di specialità polivitaminiche. Dal certificato genealogico, come vedremo nel dettaglio in seguito, risultava che, tra gli antenati, erano presenti portatori sia di Atrofia Muscolo Spinale che di Dismielinizzazione Spinale. Visita. A dispetto di uno stato del sensorio normale ed un appetito buono, si potevano notare: stato di nutrizione scadente, decubito laterale permanente, opistotono, iperestensione degli arti, coda sollevata. Nonostante la scomoda posizione del corpo la testa, le orecchie e gli occhi venivano mossi in modo del tutto normale dimostrando un vivace interesse nei confronti dell’ambiente circostante. Il passaggio dal decubito laterale a quello sternale avveniva solo con un aiuto e questa posizione poteva essere mantenuta per poco tempo. In decubito sternale, il collo e gli arti non manifestavano nessuno degli atteggiamenti anomali precedentemente descritti. La stazione quadrupedale non poteva essere in alcun modo assunta. La risposta del bipede posteriore al riflesso flessorio era esagerata, estrinsecandosi in un continuo scalciare; lo stesso atteggiamento compariva anche evocando i riflessi perianale e pannicolare (nella porzione posteriore del corpo). A completamento della visita clinica era udibile, all’ascoltazione del torace, un leggero rinforzo del murmure vescicolare. Approfondimenti diagnostici. Nulla di significativo ai fini diagnostici emergeva dalle indagini emato-biochimiche routinarie (esame emocromocitometrico; determinazione di proteine totali, ALT, AST, ALP, CK, GGT, creatinina, urea) cosí come negativa risultava la ricerca di anticorpi per Neospora e BVDV. 211 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Anche gli esami radiografici, sia in bianco che contrasto, della colonna vertebrale risultavano nella norma. Esame dei certificati genealogici. Dallo studio dei certificati genealogici emergeva quanto segue: - il nonno materno (A) era portatore sia di SDM che SMA, ed era fratello, per parte di padre (B), della nonna paterna; - B, libero da tare genetiche, era però figlio di un toro (C) portatore di SDM; - C era figlio di un toro (D) anch’esso portatore di SDM. Il toro D era White Cloud Jason Elengatn. Come vedremo in seguito questo toro viene considerato il responsabile della diffusione della SDM in Europa (Agerholm and Anderson, 1995; Nissen et al., 2001). Diagnosi differenziale. Da quanto sopra il nostro ragionamento differenziale prendeva in considerazione: malattie infettive (BVDV o Neospora durante la gravidanza), malattie ereditarie del sistema nervoso (SMA e SDM), miopatie congenite, malformazioni della colonna vertebrale e/o del midollo spinale (emivertebre, siringo-idromielia) potevano essere citate nel nostro ragionamento diagnostico differenziale. Sulla base degli esami eseguiti, peró, potevamo già escludere infezioni da BVDV e Neospora, nonché patologie compressive o malformative della colonna vertebrale e del midollo spinale, mentre lo studio dei certificati genealogici sempre più concretizzava il sospetto di una malattia ereditaria; in particolare una forma di Dismielinizzazione Spinale o, seppure con minor probabilità, una forma precoce di Atrofia Muscolo Spinale. ESAME POST MORTEM Macroscopicamente erano presenti i segni di una polmonite apicale ed un leggero idrocefalo del ventricolo laterale sinistro. L’esame PCR per Neospora, eseguito su campioni di encefalo, fegato e cuore, escludeva in maniera definitiva il possibile ruolo di questo agente biologico. L’esame istologico evidenziava lesioni in tutti i tratti del midollo spinale: a livello delle corna ventrali, si osservavano motoneuroni ipercondensati e cellule della microglia. Nel fascicolo Gracile, nei segmenti dorsale e ventrale del tratto spinocerebellare e nel tratto solcomarginale erano presenti aree di ipomielinizzazione (colorazione Luxol Fast Blu) con singole guaine mieliniche dilatate e macrofagi intramurari. I reperti istologici compatibili con un quadro di SDM confermavano i nostri sospetti e fugavano qualsiasi dubbio su una forma precoce di Atrofia Muscolo Spinale (Troyer et al., 1993). DISCUSSIONE E CONCLUSIONI La Dismielinizzazione Spinale è stata descritta in Germania (Hafner et al., 1993), e successivamente in Danimarca (Agerholm et al., 1994) e Svizzera (Stocker et al., 1996), e, sulla base delle segnalazioni citate, puó essere considerata una malattia ereditaria del sistema nervoso centrale, a carattere autosomico recessivo, tipica dei bovini di razza Bruna. La responsabilità della diffusione della patologia viene attribuita ad un toro americano utilizzato negli anni ’60, White Cloud Jason’s Elegant -US148551. A tale proposito non può sfuggire che, ancora una volta, come già visto per l’Atrofia Muscolo 212 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Spinale e la sindrome Weaver, un toro di oltreoceano viene incriminato come responsabile della comparsa di una malattia genetica. I vitelli ammalati, fin dalla nascita, non si alzano e stanno in decubito laterale; si possono osservare tremori e debolezza muscolare. Lo stato mentale, l’appetito e le grandi funzioni organiche sono normali. Istologicamente le lesioni sono localizzate nella sostanza bianca del midollo spinale: aree simmetriche e bilaterali di dismielinizzazione nel tratto ascendente del funicolo gracile, nel tratto ascendente dorsale spinocerebellare e nel tratto discendente solcomarginale, a livello di intumescenze cervicale e lombare. Altre malattie possono provocare quadri di ipomielinizzazione, comunque differenziabili da quelli che si osservano in corso di SDM: il virus BVD, responsabile oltre che di disturbi di crescita ed aborto fetale di disturbi neurologici, annovera fra le malformazioni a carico del sistema nervoso centrale l’ipomielinizzazione (Binkhorst et al., 1983); nella razza australiana Murray Grey è stata descritta una forma ereditaria di ipomielinizzazione; le lesioni a carico della sostanza bianca sono localizzate nelle aree marginali dei funicoli ventrale e laterale ma in forma meno grave che nella SDM (Richards and Edwards, 1986); altri due difetti ereditari di mielinizzazione sono stati descritti nei vitelli di razza Limousine (Harper et al., 1990) e Charolais. Nel primo caso si tratta di lesioni focali di demielinizzazione a carico del cervelletto; nel secondo caso di placche eosinofiliche formate da oligodendrociti ipertrofici e guaine mieliniche in alcune regioni dell’encefalo e del midollo spinale (Blakemore et al., 1974). Recenti studi localizzano il gene della SDM sul cromosoma 11 (BTA 11) (Nissen et al., 2001) e tra i geni candidati ha suscitato un particolare interesse EGR4 (early growth response 4 gene). EGR4 fa parte di un gruppo di geni con funzioni molto simili tra loro e nell’uomo mutazioni di EGR2 determinano difetti a carico della mielina. Recentemente però lo stesso autore ha smentito una possibile responsabilità di EGR4 nella SDM (Nissen et al., 2003) ed altri autori hanno dimostrato che topi deficienti di EGR4 si sviluppavano normalmente (Tourtellotte et al., 1999). La strada per l’identificazione genetica è ancora lunga ed al momento non si dispone neanche di un marker genetico per l´ identificazione dei soggetti portatori; l’unico modo per individuare animale portatori è attraverso la segnalazione di vitelli ammalati, motivo per il quale risulta fondamentale la segnalazione di casi clinici. BIBLIOGRAFIA Baldrighi M., Scanziani E. e Perotti G. “La mieloencefalopatia progressiva degenerativa bovina (sindrome weaver) della razza Bruna” Obiettivi e documenti veterinari, 4: 73-75, 1992 Blakemore W. F., Palmer A. C. and Barlow R. M.: “Progressive ataxia of Charolais cattle associated with disordered myelin”. Acta neuropathol, 29: 127-139, 1974 213 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Binkhorst G. J., Tournee D. L. H., Wouda W., Straver P. J. and Vos J. H.: “Neurological disorders, virus persistence and hypomyelination in calves due to intrauterine infections with bovine virus diarrhoea virus. I. Clinical symptoms and morphological lesions”. Vet Q, 5: 145-155, 1983 Hafner A., dahme E., Obermaier G., Schmidt P. e Dirksen G. “Spinal dysmyelination in New-Born Brown Swiss x Braunvieh Calves“ J. Vet. Med. B, 40: 413-422, 1993 Harper P. A. W., Fraser G. C., Boulton J. G. and Brown N. R.: “Multifocal encephalopathy in Limousin calves”. Austr Vet J, 67: 111-112, 1990 Agerholm J.S., Hafner A., Olsen S. e Dhane E. “Spinal Dysmyelination in Cross-Bred Brown Swiss Calves“. J. Vet. Med. A, 41: 180-188, 1994 Agerholm J.S. e Anderson O. “Inheritance of Spinal Dysmyelination in Calves”. J. Vet. Med. A, 42: 9-12, 1995 Nissen P.H., Shukri N.M., Agerholm J.S., Fredholm M. e Bendixen C. “Genetic mapping of spinal dysmyelination in cross-bred American Brown Swiss cattle to bovine Chromosome 11”. Mammalian Genome, 12: 180-182, 2001 Nissen P.H., Thomsen B., Offenberg H., Thomsen P.D. e Bendexen C. “Cloning and characterization of the bovine EGR4 gene and evaluation as candidate gene for bovine spinal dysmyelination”. Animal Genetics, 34 (2): 124-131, 2003 Richards R. B. and Edwards J. R.: “A progressive spinal myelinopathy in beef cattle”. Vet Pathol, 23: 35-41, 1986 Stocker H., Pusterla J.B., Lutz H. e Ossent P. “A new hereditary disease in Braunvieh in Switzerland: Spinal Dysmyelination (SDM) in newborn calves“. , 1996 Testoni S., Gentile A., Castagnaro M. e Lugli M. “Atrofia Muscolo Spinale del bovino. Su di un caso in un vitello di razza Bruna”. Obiettivi e Documenti Veterinari, 3: 25-29, 2002 Testoni S. e Gentile A. “Arachnomelia in four Italian Brown calves”. Veterinary Record, 155: 372, 2004 Tourtellotte W.G., Nagarajan R., Auyeung A., Mueller C. e Milbrandt J. “Infertility associated with incomplete spermatogenic arrest and oligozoospermia in Egr4-deficient mice“. Development, 126: 5061-71, 1999 Troyer D., Cash W.C., Vestweber J., Hiraga T. e Leipold H.W. “Review of spinal muscular atrophy (SMA) in Brown Swiss cattle”. J Vet Diagn Invest, 5: 303-306, 1993 214 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES IMPIEGO DELLA TERMOGRAFIA AD INFRAROSSO QUALE MEZZO PER LA VALUTAZIONE DELLO STATO DI SALUTE E BENESSERE DEI RUMINANTI: RISULTATI PRELIMINARI USE OF INFRARED THERMOGRAPHY FOR EVALUATING HEALTH AND WELFARE STATUS IN RUMINANTS: PRELIMINARY RESULTS MORGANTE M.,, GIANESELLA M., CANNIZZO C. *, D’ALTERIO G., STELLETTA C. Dipartimento di Scienze Cliniche Veterinarie, Università degli Studi di Padova, 35020 Legnaro (PD), Italy. Tel. +390498272942 Fax +390498272954, E-mail: [email protected] KEY WORDS: Infrared thermography, health, welfare, ruminants ABSTRACT Infrared thermography generates images of the superficial body temperature measurements in real time, is fast, non-invasive and it is considered a good diagnostic tool. The thermal information detected by the instrument is the expression of tissue metabolism and blood circulation: an increase or decrease might be linked to a pathological or physiological variation. The aim of this work was to investigate the potentiality of infrared thermal camera (ITC) use in same different animals: cows, sheep, goats and wild ruminant. Different body areas were evaluated by thermography: face, lombar, abdominal, mammary, vulvar and podalic regions. On ovine and caprine we suppose that the best areas can be posterior abdomen and vulvar region, because do not need shearing and it is always protect. For all our study we used a control group in order to reduce environmental effect and to compare ∆T. On lactating cows, variations in superficial body temperature were observed according to partorition time distance and time from dry off while in lactating cows, we could show no negative abdominal local impact (inflammatory process) following rumenocentesis. The use of thermography warrants further surveys in field conditions and, with the correction of natural conditions by standardised ones, can get information on species-specific algorithm. INTRODUZIONE Nel campo della biologia e della medicina veterinaria l’applicazione della termografia ad infrarossi è relativamente recente; finora sono stati condotti studi principalmente nella clinica del cavallo sportivo (Bowers et al., 2004; Eddy, 2001; Weil, 1998; Turner, 1991;) e degli animali da reddito (Nikkhah et al., 2005; Berry et al., 2003; Tessier et al., 2003; Tivey e Benhazi 2002; Scott et al., 2000). Gli studi su animali selvatici sono stati finora condotti principalmente su animali in stato di cattività (Kastberger G. e Stachl R., 2003), oppure per il censimento numerico degli esemplari nelle riserve naturali. Il funzionamento della termocamera si basa sulla rilevazione senza contatto dell’energia termica emessa dagli oggetti con detector aventi proprietà piroelettriche. Questa energia viene poi convertita attraverso circuiti integrati in un segnale elettronico che viene in seguito elaborato da software specifici al fine di produrre immagini digitali e realizzare calcoli analitici della temperatura attraverso il computer. La visualizzazione delle immagini ad infrarosso, immagini termiche o radiazioni di calore, viene fatta utilizzando diverse colorazioni in 215 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES scala per mettere in evidenza i punti caldi, quelli freddi e le differenze di calore esistenti tra le varie parti della superficie esaminata. Si ottiene così una rappresentazione del gradiente termico tra zone diverse del corpo e un modello della distribuzione termica dell’oggetto. la radiazione infrarosso può essere emessa, assorbita, riflessa e trasmessa. Così la termocamera non rileva soltanto la radiazione dovuta alla temperatura dell’oggetto, come avviene per un corpo nero reale, ma anche quella che origina dalle zone circostanti e viene riflessa dall’oggetto stesso. Entrambe queste radiazioni variano anche in base all’assorbimento atmosferico e il valore della misurazione può essere influenzata anche dalla temperatura ambientale. Per una rilevazione precisa della temperatura superficiale dell’oggetto è quindi opportuno considerare tali fenomeni ed è possibile inserendo dei parametri che permettano di tener conto delle caratteristiche dei vari corpi e delle situazioni ambientali in cui si opera, in modo da correggere i fattori di disturbo della misurazione sopra ricordati. Tali parametri sono l’emissività dell’oggetto, la temperatura riflessa, la temperatura atmosferica, la distanza tra oggetto e termocamera e l’umidità relativa. Le telecamere ad infrarossi attualmente sul mercato sono in grado di produrre immagini ad elevatissima risoluzione, tenendo conto delle variabili e dei parametri citati, in tempo reale e possono individuare anche piccole differenze di temperatura in un ampio range. Ciò consente di scattare immagini termografiche nitide anche di oggetti molto piccoli, molto grandi o in movimento. Si possono poi riprendere filmati e salvare fotogrammi, per eseguire analisi dettagliate e complete di eventi dinamici. Passi in avanti sono stati fatti anche nei software di supporto; infatti, confrontare visivamente immagini termiche può essere difficile perchè a volte si tratta di cambiamenti di temperatura minimi, che è impossibile individuare a occhio nudo; sono state così rese disponibili funzioni che permettono di analizzare le immagini termografiche mostrando le differenze e consentendo di elaborare modelli statistici più accurati. Tra i vantaggi dell’utilizzo della termografia c’è la mancanza di contatto che permette di mantenere lontano l’operatore da eventuali rischi e la rende una tecnica non invasiva evitando interferenze sull’oggetto, come possibili effetti meccanici sulla superficie. Il suo impiego riduce inoltre la necessità di manipolazione, rendendola utile per ricavare informazioni da oggetti difficili da raggiungere, non avvicinabili o in movimento. La rapidità di cattura dell’immagine nell’ordine dei millisecondi facilita poi la misurazione in situazioni dinamiche. Scopo del presente lavoro è fornire un primo screening delle esperienze finora condotte in campo veterinario mediante l’utilizzo della termocamera ad infrarossi nei ruminanti e proporre alcune possibili nuove applicazioni illustrandone i vantaggi e le limitazioni. MATERIALI E METODI Durante gli anni 2005 e 2006 sono stati effettuate numerose prove per valutare l’utilizzo pratico della termocamera ad infrarossi per la valutazione dello stato di salute e benessere dei ruminanti allevati. A tale scopo è stata utilizzata una termocamera utilizzata nelle esperienze è il modello ThermaCAM P25 della FLIR Systems. Le immagini ad infrarosso sono state memorizzate dallo strumento in formato JPEG standard su scheda Flash estraibile da 128 Mb e, tramite collegamento USB o inserimento della scheda di memoria nella porta del PC, le immagini sono state successivamente trasferite su computer grazie al software ThermaCAM QuickView e analizzate con il programma ThermaCAM Reporter 216 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES 7.0, basato su Microsoft Word. In particolare la termocamera è stata utilizzata su ruminanti selvatici, pecore, capre e bovine da latte. RISULTATI E DISCUSSIONE Ruminanti selvatici: L’esperienza sugli animali selvatici è stata condotta in Val di Rhêmes e a Valsavarenche, in due vallate parallele della Valle d’Aosta, che sono in parte comprese nel territorio del Parco Nazionale del Gran Paradiso. Sono effettuate numerose riprese termografiche di stambecchi e camosci a differente distanza. Effettuare le rilevazioni è risultato talvolta difficile perché non sempre era possibile avvicinarsi a sufficienza a tutti gli animali selvatici avvistati e inoltre il modello di termocamera a disposizione non è dotato di zoom. Il periodo in cui sono state condotte le rilevazioni, il mese di maggio, rappresenta il momento ideale per osservare gli ungulati da vicino in quanto tendono ancora a stare verso valle per alimentarsi, essendo i pascoli alpini, posti a quote più alte, ancora ricoperti di neve. Gli avvistamenti di gruppi di camosci sono stati numerosi, ma le rilevazioni termografiche a breve distanza sono state impossibili, poiché questo animale ha uno spazio di fuga maggiore rispetto allo stambecco. Le esperienze fatte ci suggeriscono che la termografia ad infrarosso potrebbe essere utilizzata per il censimento degli animali selvatici, in condizioni in cui sia difficile distinguerli dall’ambiente circostante, permettendo di osservare anche animali nascosti tra la vegetazione e non facilmente individuabili neppure con il binocolo. Con la termografia inoltre, i censimenti potrebbero essere condotti nelle ore notturne senza recare disturbo agli animali con l’utilizzo di riflettori utilizzati nei metodi tradizionali. Molto spesso però le immagini termografiche come quelle ottenute, eseguite da così lontano e senza l’ausilio di uno zoom, offrono dei risultati che non apportano un vantaggio sostanziale i rispetto ai metodi tradizionali, infatti non sono in grado di fornire i dettagli che permettono di distinguere i maschi dalle femmine e le diverse specie. Se lo scopo dell’indagine termografica è quello di ricavare informazioni riguardanti lo stato clinico degli animali, in questo tipo di immagine le parti anatomiche sono poco definite e i gradienti di temperatura corporei non si riconoscono nei particolari. Per questi motivi le immagini raccolte a distanza elevata con questo strumento non possono fornire ulteriori dati riguardanti lo stato patologico o le condizioni fisiologiche dell’animale. Un problema della tecnologia ad infrarosso è che molte specie hanno una pelliccia spessa e che si presenta diversa tra soggetto e soggetto. Infatti il pelo folto scherma la radiazione infrarosso e ciò impedisce una misurazione della temperatura superficiale che abbia un significato attendibile sullo stato termico dell’animale. Tuttavia l’occhio è una parte del corpo che non presenta questo inconveniente e perciò può rappresentare un mezzo per ottenere un’accurata misurazione della temperatura corporea una volta stabilito il valore oltre il quale il soggetto risulta essere ipertermico. Se la termografia si rivelasse sensibile ed affidabile nel rilevare una patologia tanto da permettere un’identificazione precoce dei soggetti ammalati, questa tecnologia potrebbe essere un mezzo utilizzabile per il controllo di alcune malattie trasmissibili ed arrivare ad una riduzione della loro incidenza o all’eradicazione. Il suo utilizzo sarebbe vantaggioso per diminuire il rischio di diffusione, per esempio, di forme infettive o infestive nelle popolazioni di selvatici e ridurre la possibilità di contagio degli animali domestici per il contatto nelle zone di pascolo comuni. 217 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Piccoli ruminanti: Sulle pecore sono state eseguite delle prove termografiche per osservare se la temperatura superficiale di certe regioni del corpo potessero essere correlate ad un particolare stato fisiologico dell’animale. Ciò permetterebbe una futura applicazione dello strumento, ad esempio, nella diagnosi a distanza, non invasiva, della gravidanza e anche nella rilevazione di gestazioni multiple. Le misurazioni termografiche sono state eseguite a livello della testa, del dorso, della groppa, e del perineo. Le regioni del dorso e della groppa si sono rilevate non appropriate per questo tipo di indagine. Infatti in queste zone il vello non era della stessa lunghezza e densità per tutti gli animali e sebbene ci si fosse preoccupati di separare ed abbassare il pelo, le differenze di temperatura erano presumibilmente influenzate molto più da questo elemento di disturbo o dalla la modalità di allargamento del vello per mettere in evidenza la cute che da fattori interni dell’animale legati al suo stato fisiologico. Sono state effettuate scansioni nelle ragione perineale di alcune pecore e capre e con il software è stata calcolata la temperatura media di un area selezionata a livello della vulva. Sarebbe interessante indagare le possibili correlazioni tra la temperatura a questo livello e la fase del ciclo riproduttivo per verificare la capacità dello strumento nel rilevare i calori. Infatti lo strumento potrebbe essere utile per mettere in evidenza i primi segni dell’estro rilevando precocemente un ingrossamento dei tessuti attorno alla vulva per l’aumentato flusso sanguigno e l’edema. Ciò sarebbe utile per migliorare le capacità di individuare il momento adatto per l’inseminazione e per valutare la sincronizzazione degli estri. Tuttavia per questo scopo sarebbe meglio disporre di un software superiore a quello usato, che, invece di selezionare sull’immagine termografica un’area rettangolare squadrata, permetta di considerare il profilo reale della regione anatomica da studiare in modo da ottenere valori della temperatura media relativi solo alla parte che interessa, tralasciando le zone circostanti che potrebbero alterare i risultati. Sono state eseguiti termogrammi delle mammelle di alcune pecore. In entrambi i casi alla palpazione si poteva percepire la presenza di una ciste che dall’esame termografico appare come una area localizzata più fredda. Rilevare immagini ad infrarosso della regione mammaria potrebbe essere utile anche per rilevare precocemente uno stato infiammatorio e le mastiti subcliniche. Le immagini ad infrarosso delle teste potrebbero essere utili per evidenzare precocemente lesioni localizzate a questo livello come avviene per esempio per la blue tongue. Inoltre le rilevazioni termografiche potrebbero essere associate a risultati di studi sperimentali sul comportamento animale per osservare la possibilità di utilizzo di questo strumento per indagare temi di psicologia animale, come ad esempio la lateralizzazione cerebrale. Nelle pecore c’è da puntualizzare, in fine che la presenza del vello impedisce l’effettuazione di termogrammi di alcune regioni senza dover effettuare precedentemente una adeguata tricotomia. Vacche da latte: La termografia in questi animali potrebbe essere utilizzata per monitorare costantemente i processi automatizzati nelle grandi aziende che intendono investire maggiormente nella tecnologia e sono in grado di ammortizzarne i costi della strumentazione in breve tempo. In particolare l’installazione di termocamere fisse nei locali, in determinati punti strategici (come la sala di mungitura, la posta o la mangiatoia), potrebbe essere utile per un controllo continuo degli animali e dell’ambiente permettendo la rilevazione precoce di stati patologici o fisiologici particolarmente utili per la gestione dell’allevamento, garantendo un notevole vantaggio in termini di benessere per l’animale e anche per l’economia dell’ azienda. Sono già stati citati gli studi riguardanti l’impiego della 218 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES termografia ad infrarosso per la rilevazione dell’estro (Hurnik et al., 1985), la diagnosi precoce delle mastiti (Scott et al., 2000; Berry et al., 2003) e delle patologie degli arti (Nikkhah et al., 2005). Nelle nostre esperienze in proposito lo strumento è stato in grado di rilevare lesioni localizzate in alcune vacche, una tumefazione a livello del tarso e una lesione interdigitale sulla superficie soleare del piede. In entrambi i casi si può osservare come lo strumento rilevi la zona interessata dall’infiammazione per l’aumento di temperatura localizzato che la caratterizza. La termografia si è rilevata anche molto utile per valutare le differenze di temperatura superficiale che si evidenziano in relazione a diversi stimoli ambientali, quali ad esempio somministrazione dell’alimento, variazioni dello stato emotivo, e delle condizioni climatiche. CONCLUSIONI Il preliminare approccio pratico alla termografia ha permesso di individuare ulteriori possibili applicazioni della tecnologia ad infrarosso nel campo della medicina veterinaria indicandone i pregi, ma talvolta anche gli attuali limiti e cercando di individuare quali potrebbero essere le necessità e i percorsi futuri da seguire per ottenere maggiori vantaggi da questa tecnica diagnostica. I valori di temperatura superficiale misurati in alcune delle termografie raccolte nelle esperienze sul campo probabilmente non sono reali perché influenzati da fattori esterni che non sempre è stato possibile controllare (come esposizione al sole, correnti d’aria, distanza). Nell’analisi termografia di queste immagini è quindi opportuno tener conto maggiormente delle differenze di temperatura tra le diverse aree termografate più che del loro valore assoluto. Per eliminare gli elementi di disturbo esterni durante una rilevazione termografia sarebbe utile valutare il “∆T”, vale a dire la differenza di temperatura tra due misurazioni dello stesso soggetto, raccolte in due momenti diversi, per esempio prima e dopo la somministrazione della razione. In questo modo i diversi valori di ∆T tra gli animali dipenderanno più probabilmente da fattori interni. Per ottenere risultati affidabili e ripetibili c’è poi la necessità di standardizzare altri parametri che potrebbero influenzare le misurazioni, come l’età o il sesso del soggetto. Inoltre sarebbe opportuno studiare le equazioni di regressione per valutare la relazione statistica tra questi fattori e la temperatura superficiale rilevata dallo strumento e ricavare l’accuratezza a seconda che la misurazione sia stata eseguita con l’animale in posizione, frontale, laterale o posteriore nel caso di soggetti liberi. Sempre per ottenere risultati che siano il più possibile reali sono necessari studi per stabilire dei valori di emissività specifici per ogni specie animale. Infatti in questo lavoro è stato impostato lo stesso valore (0,93) in tutti i casi, prendendo il dato riportato in bibliografia per gli studi sugli animali e sul manuale dello strumento per la cute umana. Tuttavia è presumibile che animali con densità del pelo e colore del mantello diversi, avendo una superficie con caratteristiche di assorbimento e riflessione dei raggi incidenti su di essa differenti, non abbiano lo stesso valore di remissività. Lo studio è stato finanziato con il contributo del progetto BEN-O-LAT del Ministero delle Politiche Agricole e Forestali. *Dottorato di ricerca finanziato dall’Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie. 219 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES BIBLIOGRAFIA Berry, Kennedy, Scott, Kyle and Schaefer, 2003. Daily variation in the udder surface temperature of dairy cows measured by infrared thermography: potential for mastitis detection. Canadian Journal of Animal Science 83: 687-693. Bowers, Gandy, Anderson, Ryan and Willard, 2004. Assessment of pregnancy in the mare using digital infrared Thermography. American Society of Animal Science/American Society of Dairy Science National Meeting. Eddie Y-K Ng and NM Sudharsan, 2004. Computer simulation in conjunction with medical thermography as an adjunct tool for early detection of breast cancer. http://www.biomedcentral.com/1471-2407/4/17 Hurnik, Webster, and DeBoer, 1985. An investigation of skin temperature differentials in relation to estrus in dairy cattle using a thermal infrared scanning technique. Journal of Animal Science 61: 1095-1102. Kastberger G, Stachl R. Infrared imaging technology and biological applications. Behav Res Methods Instrum Comput. 2003 Aug;35(3):429-39. Nikkhah, Plaizier, Einarson, Berry, Scott and Kennedy, 2005. Short communication. Infrared thermography and visual examination of hooves of dairy cows in two stages of lactation. Journal of Dairy Science 88: 2749-2753. Scott, Schaefer, tong and Lacasse, 2000. Use of infrared thermography for early detection of mastitis in dairy cows. Canadian Journal of Animal Science 80: 764-765. Scott, Schaefer, tong and Lacasse, 2000. Use of infrared thermography for early detection of mastitis in dairy cows. Canadian Journal of Animal Science 80: 764-765. Tessier, Du Tremblay, Klopfenstain, Beauchamp, Baulianne, 2003. Abdominal skin temperature variation in healthy broiler chickens as determined by thermography. Poult Sci 82: 846-9. Tivey D., Benhanzy T., 2002. The potential to asses environmental conditions within pig production system. Tong, Schaefer, and Jones, 1995. Detection of por quality beef using infrared thermography. Meat Focus International 4: 443-445. Turner TA. Thermography as an aid to the clinical lameness evaluation. Vet Clin North Am Equine Pract. 1991 Aug;7(2):311-38. Weil M, Litzke LF, Fritsch R. Diagnostic validity of thermography of lameness in horses. Tierarztl Prax Ausg G Grosstiere Nutztiere. 1998 Nov;26(6):346-54. 220 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES OSSERVAZIONI LEGISLATIVE E MEDICO LEGALI SUI DANNI CAGIONATI DAI RUMINANTI SELVATICI (CERVO) IN SARDEGNA LEGISLATIVE AND FORENSIC OBSERVATIONS ON THE DAMAGES CAUSED ON THE WILD SARDINIAN RUMINANTS. CUBEDDU G. M. , PINNA PARPAGLIA M. L., COCCO.R. , CARTA A*. Istituto di Clinica Medica Veterinaria-Università di Sassari. *Tecnico Faunistico. KEY WORD: deer, damages, laws. SUMMARY The authors value with critical ability the problems derivate from the damage caused by the deer in Sardinia. Particularly they highlight the crescent burden of the Regional Administration, called at the compensation for damage provoked by the wild fauna (deer) at the car in transit on the public road; they consider moreover the interpretative and applicative problems in theme of damages provoked at the agricultural productions and at work make ready on cultivated and grazed ground provoked by wild fauna, particularly that protect. For this purpose they take the law’s dictation n.157 (11/02/92) of the Italian State into account (norms for the wild fauna’s protection), comparing from forensic point of view the objective problems. At the end, considering the crescent increase of the compensation request, they take the first sentence emitted by the judge into account, condemning the regional Administration to pay the damages at the car’s owner involved in the incident. They conclude proposing some corrective suggestions useful for the protection of the species besides a correct interpretation of the law in force. PREMESSA Scopo del presente lavoro è quello di valutare le problematiche che evidenziano gli oneri crescenti per l’amministrazione regionale, chiamata al risarcimento dei danni provocati dalla fauna selvatica ai veicoli in transito su strade pubbliche. Gli autori considerano inoltre le difficoltà interpretative delle leggi di settore valutando criticamente le note emanate dalla stessa Regione Sardegna. INTRODUZIONE Il cervo sardo è stato introdotto in Sardegna dall’uomo tra il 1200 e il 700 a.C. e si è in seguito diffuso su tutto il territorio dell’isola, favorito dalle rigogliose foreste presenti.Le deforestazioni, gli incendi boschivi, il bracconaggio, la caccia (dal 1939 divieto totale della caccia al cervo) e l’apertura di nuove strade avevano ridotto drasticamente la presenza del cervo sardo in tre soli areali distinti e isolati: addirittura alla fine degli anni 60 la popolazione era talmente ridotta da essere inserita dalla I.U.C.N. (Unione Internazionale Conservazione della Natura) tra le specie minacciate di estinzione. Attualmente le popolazioni naturali del cervo sardo si trovano in tre distinte zone della Sardegna meridionale, senza soluzione di continuità. Da alcuni decenni, grazie ai progetti di tutela e di reintroduzione iniziati negli anni 70 dall’attuale Ente Foreste, si è assistito a un notevole incremento delle popolazioni naturali. 221 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Il cervo sardo ora è presente in circa 6500 esemplari nelle aree del Sulcis, del Sarrabus, nell’Arburese (Arbus-Montevecchio), negli areali del Monte Lerno (Pattada) e del Monte Linas (Villacidro). Alcuni esemplari sono stati introdotti qualche anno fa in provincia di Nuoro nel territorio di Sorgono. A fronte però dell’aumento della popolazione del cervo negli ultimi anni si stanno verificando una serie di problematiche legate sia all’incidentistica stradale provocata dal cervo stesso, sia a danni agli erbai delle aziende zootecniche che confinano con le zone più popolate dagli stessi cervi. A ben valutare la legislazione in materia non sempre è agevole offrire la giusta risposta a chi abbia subito danni, diretti o indiretti, ma soprattutto appare sempre più confuso il quadro relativo alla responsabilità oggettiva di chi dovrà risarcire i danni stessi. MATERIALE E METODI Oggetto del nostro lavoro è un incidente stradale avvenuto circa due anni fa nella zona di Montevecchio quando, in prossimità di una curva, un grosso cervo sbucato all’improvviso da un cespuglio si era bloccato in mezzo alla strada e, nonostante il tentativo di frenata del conducente, l’esemplare finì fatalmente contro l’automobile. L’impatto, mortale per il cervo provocò la distruzione della parte anteriore dell’auto oltre a danni fisici ai due occupanti la vettura. I legali del conducente, nella convinzione che i cervi fossero di proprietà della regione, come tutta la fauna selvatica, chiedevano il risarcimento dei danni alla regione stessa. I funzionari regionali risposero con un secco “No” giustificando il fatto con la motivazione che, pur essendo proprietari degli animali, sarebbero impossibilitati a custodirli e controllarli, essendo fauna selvatica la quale tale non sarebbe se non potesse vivere, spostarsi e riprodursi liberamente nel proprio ambiente naturale. I legali del conducente, per niente soddisfatti del mancato risarcimento citarono una sentenza del giudice conciliatore di Isernia che condannava la Regione Molise a pagare i danni per un caso analogo.La Regione Sarda è proprietaria dei cervi e come tale deve rispondere dei danni da essi provocati. Nella fase processuale sono state esibite le testimonianze, la perizia dei danni dell’auto, la certificazione della ASL della morte dell’animale e la giurisprudenza precedente. I legali della Regione sostenevano la loro estraneità delegando il caso e la responsabilità alla provincia. La sentenza finale da parte Giudice di Pace ha stabilito che le competenze sono esclusivamente della regione Sardegna, e dopo aver accertato che il cervo aveva praticamente investito l’auto emetteva la sentenza condannando la regione al risarcimento di € 1572,22 (oltre agli interessi maturati) e di € 1150 per le spese di giudizio. A seguito della prima sentenza in tal senso,l’assessorato alla difesa dell’ambiente della regione, trasmetteva una nota della presidenza (area legale) alle province e all’ Ente Foreste evidenziando l’impossibilità allo stato attuale ad approntare una valida linea difensiva atta a contrastare le sempre più frequenti pretese risarcitorie. Ciò in quanto la maggior parte dei danni si riferisce a sinistri stradali provocati da animali selvatici che attraversano le sedi stradali in punti totalmente privi di recinzioni ai margini delle carreggiate. Nella nota si richiama altre si l’esigenza di predisporre apposite recinzioni o qualsiasi altra opera utile ad ostacolare e impedire il transito degli animali selvatici sulle strade, con particolare riferimento alle zone attigue ad oasi di protezione faunistica, nonché l’istallazione di apposita segnaletica idonea a destare la massima attenzione da parte degli automobilisti. 222 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Osservazioni Personali: I fatti su esposti ci permettono di fare alcune riflessioni medicolegali e legislative in merito alla osservanza delle norme vigenti, soprattutto rapportate ai concetti di tutela e protezione dei selvatici in Sardegna, senza per altro dimenticare la responsabilità extra-contrattuale che potrebbe rivelarsi particolarmente ingente in caso di esiti mortali per le persone nei sinistri provocati dagli animali stessi. Al riguardo si evidenzia che recentemente in occasione di una pubblica udienza un Giudice Istruttore del Tribunale di Sassari ha manifestato agli avvocati della Regione la necessità che la Regione stessa appronti tutte le misure atte ad evitare il perpetuarsi di detti sinistri. La giurisprudenza trattata nel libro IV delle obbligazioni definisce l’obbligazione un vincolo giuridico in conseguenza del quale siamo costretti ad assolvere qualcosa secondo i principi giuridici del nostro ordinamento. Le obbligazioni derivano anche da fatto illecito o da ogni altro fatto o atto idoneo a produrle (art. 1973 C.C.). Ancora l’art.2043 dello stesso Codice dispone che chiunque provochi o con dolo o con colpa un danno ingiusto ad altri sia obbligato a risarcire il danno. Ancora dal libro delle obbligazioni deriva l’art.2052 (danno cagionato da animali) secondo il quale: “il proprietario di un animale o chi se ne serve per il tempo in cui lo ha in uso è responsabile dei danni cagionati dall’animale, sia che fosse sotto la sua custodia, sia che fosse smarrito o fuggito,salvo che provi il caso fortuito”. E’ evidente che quest’ultimo art.2052 sembra riferirsi nella fattispecie ad animali o da reddito o d’affezione e non in particolare ai selvatici, ma è pur vero che a giudicare il dettato dell’art.1 comma 2 della legge 21 appare chiaro che la Regione risulti l’unica proprietaria della fauna selvatica in Sardegna. La stessa legge infatti recita che la regione detta norme di tutela per gli animali di qualsiasi genere e specie esistenti sull’isola. Altrettanto chiara appare l’interpretazione relativa alla legge dello stato n. 157 la quale afferma senza ombra di dubbio che la fauna selvatica è patrimonio indisponibile dello stato. Ne discende che per la Sardegna, Regione a statuto speciale la norma sia totalmente sovrapponibile. Oltretutto la legge regionale n.23 del 29/07/1998 dal titolo: norme per la protezione della fauna selvatica e per l’esercizio della caccia in Sardegna, all’articolo 3 comma 1 dichiara che la fauna selvatica costituisce bene ambientale della regione ed è tutelata, insieme al suo habitat naturale, nell’interesse generale della comunità regionale, nazionale ed internazionale. Ancora all’articolo 12 la suddetta legge affida alle province compiti di pianificazione, di tutela dell’ambiente e della fauna selvatica. Tra gli altri compiti le province provvedono a predisporre la proposta del piano provinciale faunisticovenatorio, a favorire la riproduzione naturale della fauna selvatica, ad accertare gli eventuali danni alle colture provocati dalla fauna selvatica stessa.Di difficile interpretazione appare la lettura dell’articolo 59 della suddetta legge, dove si tratta del risarcimento dei danni arrecati alla produzione agricola e zootecnica, alle coltivazioni e ai pascoli dalla fauna selvatica. Il comma 2 del suddetto articolo pone in carico alla Regione il risarcimento dei danni provocati nelle oasi permanenti di protezione faunistica e di cattura, nelle zone temporanee di ripopolamento e cattura. Al comma 4 infine il regolamento di attuazione disciplina le modalità per l’erogazione dei risarcimenti, tenuto conto delle priorità, dei parametri e dei criteri individuati dal piano faunistico-venatrio Regionale. La legge 157 Italiana dell’11/02/1992 (norme per la protezione della fauna selvatica omeoterma e per il 223 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES prelievo venatorio, all’articolo 1 recita chiaramente che la fauna selvatica è patrimonio indisponibile dello Stato ed è tutelata nell’interesse della comunità Nazionale ed Internazionale. La stessa legge all’art.26 tratta del risarcimento dei danni prodotti dalla fauna selvatica e demanda alle regioni la costituzione di un fondo destinato alla prevenzione e ai risarcimenti. Come si evince da quanto su esposto, nessuna delle leggi nazionali o regionali tratta nello specifico del risarcimento dei danni arrecati ad autovetture e/o persone.E’ evidente a tutti come sempre con maggiore frequenza si verifichino incidenti che interessano la fauna selvatica in Sardegna. In tale contesto inoltre si pone con particolare attenzione il diffondersi sempre maggiore dell’interesse del pubblico e delle istituzioni nei confronti della fauna selvatica.Queste riflessioni, unicamente allo scopo di evidenziare l’attualità dell’argomento e la necessità che non si incorra in cattiva impostazione nella risoluzione di quesiti sempre più attuali. La responsabilità civile da cui deriva l’obbligazione a riparare il danno consegue ad atti dolosi o colposi che arrechino danni ingiusti a carattere patrimoniale e viene a gravare su coloro i quali “direttamente o indirettamente” li hanno causati. La responsabilità civile ha due tratti essenziali che la caratterizzano: da una parte l’esistenza di un danno, dall’altra il carattere forzato ed involontario dell’obbligazione a riparare il danno stesso. Dunque qualunque fatto doloso o colposo che cagiona ad altri un danno ingiusto, obbliga colui il quale lo ha commesso a risarcire il danno stesso (art. 2043 del C.C.). La responsabilità civile comporta quindi il risarcimento del danno economico subito dal terzo per colpa dell’autore. Nel caso in oggetto, a norma del art. 2052 del C.C. il proprietario di un animale o chi se ne serve per il tempo che lo ha in uso è responsabile dei danni cagionati dall’animale, sia che si trovi sotto la sua gestione, sia che si trovi sotto la sua custodia, ovvero che si sia smarrito o fuggito. Orbene, da tutto ciò deriva la conseguenza del risarcimento legato a disposizioni ben precise. Sembra inequivocabile, dalla lettura delle normative succitate, che la regione in questo caso sia l’unica proprietaria degli animali e quindi responsabile dei danni. Di grande negligenza sembra inoltre la risposta dei funzionari della regione, nel momento in cui affermano di essere impossibilitati alla custodia ed al controllo dei cervi, in quanto fauna selvatica. Quantomeno discutibile appare il tentativo, da parte dei legali della regione, di voler delegare la responsabilità alla provincia. Infatti così facendo, si vuole creare solo grande confusione nell’interpretazione delle norme, che peraltro sono chiarissime. Sono, entrambi gli esempi, un chiaro caso di inadempimento delle obbligazioni.Inadempimento che si può intravedere anche nella scarsa informazione, da parte degli organismi competenti, sulla possibilità di risarcimento agli agricoltori che abbiano subito danni da parte di animali della fauna selvatica ( rare sono a tutt’oggi le richieste in tal senso ). CONCLUSIONI: Per favorire una più corretta applicazione delle leggi in tema di fauna selvatica si propongono alcuni suggerimenti utili a prevenire le problematiche in oggetto. Innanzitutto un lavoro sinergico di regione e province per recintare con materiale idoneo gli areali occupati dai cervi, tali da mantenere il loro habitat naturale, rispettando peraltro quei concetti di tutela del benessere degli animali previsti dalle normative vigenti, oltre a prevenire gli incidenti. L’adeguamento della segnaletica stradale può favorire, al momento, una maggiore prudenza da parte degli automobilisti, oltre ad una diversa possibilità di valutazione della responsabilità, di fronte a segnali che, pur indicando il pericolo di 224 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES attraversamento di animali selvatici, non vengono adeguatamente rispettati: in questo modo si potrebbe individuare un concorso di responsabilità, con dimezzamento delle spese per l’istituzione regionale.Si auspica infine che sia la regione che le organizzazioni di categoria intervengano con maggiore informazione nei confronti degli agricoltori che abbiano subito danni alle colture, i quali, molto spesso, non rivolgono le dovute richieste di risarcimento per la non conoscenza delle norme. Solo con il rispetto di queste misure, peraltro di non difficile applicazione, si favorisce un corretto rapporto uomo-animale-ambiente, oltre a prevenire molti dei danni sempre più numerosi ed incidenti che potrebbero avere conseguenze anche più drammatiche. BIBLIOGRAFIA Canuto e Tovo, Medicina Legale, 1970; Censimento del cervo sardo-R.A.S- Ente Foreste, 2005; Codice Civile, art. 1973,2043,2052; Cubeddu G.M.; Pintori G.; BassuG.; ManincheddaG.- Differenti valutazioni sul danno e risarcimento in ovini di razza sarda-Atti VIII Congresso SIPAOC-1988; Gasparini U-Appunti di Medicina Legale VeterinariaEd.Esculapio,1983; Legge 11/02/1992-suppl ord. G.U. n. 46 del 25/02/92; Legge n. 623 del 14/10/85 suppl. ord. G.U. n. 266 del 12/11/85; L. R. N. 21 del 18/05/94, B.U.R.A.S.; L.R. N. 23 del 29/07/98, B.U.R.A.S; Nota Pres. R.A.S. Prot. L 5461 del 25/10/2005. 225 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES THE CLINICAL EFFICIENCY OF MINERASOL® ON CATTLES, WHICH IS A NEW TRACE ELEMENT COMBINATION* MEHMET ERMAN OR1, ABDULLAH KAYAR1, REMZĐ GÖNÜL1, BANU DOKUZEYLÜL1, ALĐ RIZA KIZILER2, BĐRSEN AYDEMĐR2, ABDULLAH AKSU3, ÇAĞLA PARKAN1, TAMERCAN MORKOÇ4, BORA BARUTÇU2 1 Istanbul University, Veterinary Faculty, Department of Internal Medicine, 34320 AvcilarIstanbul/TURKEY 2 Istanbul University, Cerrahpaşa Medicine Faculty, Department of Biophysics, Cerrahpaşa-Istanbul/TURKEY 3 Chemical Oceanography, University of Đstanbul, Enstitute of Marine Science and Management Vefa-Istanbul/TURKEY 4 Interhas Limited Company, Ankara/TURKEY. * The present work was supported by the Research Fund of Istanbul University. Project No. UDP-776/07062006” SUMMARY Cattle breeding has an important place in the country economy. Cattle, milk, meat and skin of which we benefit from have an industrial importance in terms of breeding in our country. Diseases caused by micro and macro elements are of great importance. Very significant signs like debility, lack of appetite, decrease in efficiency, anemia, diarrhea, fertility disorders are seen in animals. In the study, it is aimed to determine the effect of the clinical use of Minerasol® which is a new mineral combination on some element levels (Fe, Cu, Zn, Mg, Ca). Approximately 10 ml of blood with and without anticoagulant was drawn from 25 cattle in the faculty farm and both the hemogram parameters and serum element levels were determined. Then 20 cc drug diluted with serum physiologic was administered IV to each, blood was drawn one week later and changes were determined. All the element levels were measured in AA-680 Shimadzu atomic absorption spectrophotometry in Biophysics Department of Đstanbul University Cerrahpaşa Faculty of Medicine, hemogram parameters were measured in Đ.U. Veterinary Faculty Central Analysis Laboratory and the data were statistically assessed. When the levels before and after the treatment were examined, it was determined that there were increases in Fe, Cu, Zn, Mg and Ca element levels and these increases were significant for Fe and Zn in the level of p<0.001. Consequently, it was decided that with the inclusion of minerasol which is a new trace element combination into the routine care and nourishment program, the problems related to the deficiency of trace elements would be eliminated and predisposition in terms of bacterial viral and parasitic diseases would be prevented. KEY WORDS: Minersol, Serum, Fe, Cu, Zn, Mg and Ca. INTRODUCTION The importance of many inorganic elements classified as macro and micro elements in nourishing and growing of animals is accepted (2, 20). The diseases caused by deficiency or excess of macro and micro elements in animals are of great importance (20). Insufficient or excess intake of one or more elements ruins the normal functions and the 226 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES inaccurate rates between elements can prevent the healthy functioning of the organism (6, 20). Trace elements have an important role on growth, reproduction and productivity of domestic animals. Mineral deficiency or imbalance observed in nearly everywhere in the world causes significant losses in terms of both production and economy (5, 7, 9, 10, 11, 20). The main clinical symptoms of trace element deficiencies in animals are diarrhea, anemia, loss of hair, depigmentation, growth disorders in bones, difficulty in walking, scurf in skin, curving, hyperkeratosis, parakeratosis, lack of appetite, fertility disorders, decrease in reproductivity, young animal growth disorders, tetany, decrease in protein synthesis, immune deficiencies, abortus related to non-infectious reasons and pica (1, 6, 13, 17, 20, 21). It is reported that the losses caused by trace elements are as important as the losses caused by infectious and parasitic diseases (20). Trace elements are very important for increasing resistance to diseases in living organisms (6, 20). While deficiencies of trace elements like cobalt, copper, iron, iodine, manganese, selenium or zinc cause losses in reproduction and lactation, diseases like milk fever (hypocalcemia), grass tetany (hypomagnesemia) and abomasum displacement (alcalemia, hypochloremia and hypocalcemia) are characterized with electrolyte disorders and are generally observed in the first stage of lactation and cause significant economical losses (5, 7, 9, 10, 11, 22). That is why minerals like calcium-phosphate are of essential importance in both adult and growing cattle (18). However in many cases, it is difficult to find out since electrolyte imbalances show no clinical symptom (7). Littledike et al. (12) reported that there were few studies on the comparison of mineral levels in different cattle races and effects of body composition on mineral level. The consulting organizations recommended by Agricultural Research Commission study groups declare that the major minerals in cattle breeding are to be determined and yet, there is a limited number of studies on the effect of trace elements on animals in our country (18, 20). Minerasol® used in this study is a hypertonic infusion solution that includes calcium, phosphate, potassium, magnesium and sodium salts and iodine, iron, cobalt and zinc trace elements. Mineal substances and trace elements are critical co-enzymes necessary fort he activation of the effects of biologically important substances like hormone, enzyme, vitamin and other functional proteins (22). Any deficiency causes specific or non-specific disorders in cells’ metabolism. In this study planned under the light of all these information, the effects of Minerasol® application, a new mineral combination, on blood serum parameters were examined, its efficiency on cattle breeding and its safety on the treatments of diseases caused by macro and micro element deficiencies. MATERIAL AND METHOD This study was carried out in Đ.U. veterinary faculty farm. 25 cattle that were determined to be healthy after the clinical examination were included to the study. About 10 ml of blood with or without anticoagulant was drawn from the animals before drug administration and both hemogram parameters and serum element levels were determined. Then, each animal were administered IV 20 cc Minerasol® that includes calcium phosphonat 65.00 mg, potassium chloride 4 282 mg, calcium gluconat 300.00 mg, potassium lodide 50.00mg, sodium lodide 50.00mg, magnesium chloride 6 H2O 19.64 mg, 227 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES iron (II) chloride 4 H2O 12.96 mg, cobalt (II) chloride 6 H2O 0.164 mg, zinc chloride 0,1355 mg in one ml, blood was drawn one week later and changes were determined . All the element levels were measured in AA-680 Shimadzu atomic absorption spectrophotometry in Biophysics department of Đstanbul University Cerrahpaşa Faculty of Medicine , hemogram parameters were measured in Đ.U. Veterinary faculty Central analysis Laboratory and the data were statistically assessed. FINDINGS When the Minerasol® levels before and after the application were examined it was determined that there was no statistically significant change in hemogram levels but there was increases in Fe, Cu,, Zn, Mg and Ca element levels and that these increases were significant in p<0.001 level (Table 1). Table 1: Changes in hemogram levels and blood serum parameters before and 1 week after Minerasol® administration(n=25). Parameter / Unit Red Blood Cell (RBC) (106/mm3) Hematocrite (HCT) (%) Trombocyte (PLT) (103/mm3) Leucocyte (WBC) (103/mm3) Hemoglobine (HGB) (g/dl) Fe (µg/dL) Cu (µg/dL) Zn (µg/dL) Mg (mg/dL) Ca (mg/dL) Before the treatment X ± Sx 6,32 ± 0,87 27,07 ± 4,54 310,90 ± 80,00 22,00 ± 18,09 9,75 ± 1,02 102,45 ± 13,31 91,16 ± 9,34 105,40 ± 15,37 2,1±1,59 10.3±0,75 After the treatment X ± Sx 6,40 ± 0,87 26,78 ± 3,27 286,44 ± 46,58 14,78 ± 12,03 9,88 ± 1,11 135,76 ± 12,26 102,88 ± 11,39 126,84 ± 12,24 2,2±1,60 10,5±0,76 N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. *** N.S. *** N.S. N.S. N.S.= p > 0.05, ***p<0.001 DISCUSSION Compared to other countries, while our country is one of the leading countries in terms of economically valuable animal count, its place is much worse than expected in terms of products like meat, milk and skin obtained from these animals (1, 6). Deficiency of trace elements plays as much role as infectious and parasitic diseases in the formation of this table (20, 21). A similar appearance was observed in Trakya and after discussions with breeders and veterinary physicians it was reported that there were many diseases caused by parasites and trace element deficiencies. Particularly, complaints like walking disorders in calves, fertility related problems, loss of weight, diarrhea, predisposition to infections, decrease in fleece quality were compatible with symptoms reported in literature (2, 16). Calcium is present in the structure of tissue and bones and is necessary for healthy bone, muscle and nerve function. It is essentially responsible for blood clotting. It enables the interaction of reticuloendolthelial system and suprarenal gland (22). It has a regulatory effect on acute and chronic metabolic abnormalities and reproduction activities due to its effect on phosphate interim metabolism. It is necessary for healthy bone and dental growth 228 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES and its maintenance (22). It is also known that, calcium and phosphate deficiencies cause many metabolic diseases (4, 7, 11, 18). In our study, when the changes in calcium level of blood serum, an increase in calcium quantity was observed. It was decided that injections of calcium with phosphate could decrease the risk of metabolic diseases. Copper has an important role in hemoglobin shaping and body growth, symptoms like failure in metabolic funstions like immune function, increase in mortality rate, debility, depigmentation, walking disorders, demyelinization in nerve tissues, low osteoblastic activity and loss of weight caused by the failure of oxidation in tissued and diarrhea are reported (17, 20). Copper and zinc are the most important essential minerals necessary for the normal functioning of animals’ reproduction functions (23). Zinc is an essential mineral for healthy skin, hair and nail situation, reproduction, bone and cartilage growth, carbonhydrate, lipid and protein metabolism, enzyme and immune system. It has a vital role in DNA synthesis. Decrease in consumption, decrease in growth rate, growth retardation, anormal eustrus behaviour, decrease in testicle magnitude, spermatogenesis malfuction, decrease in the development of secondary sex organs and fertility, decreases in resistance to infections, significant compression on immune response, pathological changes in skin and hair, parakeratosis are observed in the animals with zinc deficiency (20, 22) Magnesium is necessary for bone and tooth formation and the maintenance of normal muscle functions. It was reported that the inclusion of Zn, Cu and Mg to the ration in sufficient rates plays an important role for fertilization and increasing the life chance of embryo (23). In this study we observed that serum Cu, Zn and Mg levels increased after injection and it might be efficient on preventing the diseases related to these minerals. Nelson et al. (14) reported that they found the serum zinc level as 32-40 µg/dL in a herd where anorexia, wool eating, alopecia, hyperkeratosis and parakeratosis was observed. In our study it was determined that 105,40±15,37 µg/dl serum zinc levels before injection were within normal levels for cattle (69,97-130,8 µg/dL) (3) and that this levels increased to 126,84±12,24 µg/dl after administratiom of Minerasol and that this increase was statistically significant(p<0.001). Normal blood serum Cu levels reported by several authors (8, 13) are respectively between 59-101 µg/dL and 80-120 µg/dL. Altınbaş and Fidancı (3) reported that normal copper level was between 69,85-162,56 µg/dL in cattle. In our study, it was observed that copper levels increased in a statistically nonsignificant fashion however both values were within the normal limits reported by the authors. Although the authors (16) reported that the risk of enzootic ataxia increased with the blood copper levels under 50 µg/dL, it was observed that no such risk was present in the animals in our farm and Minerasol administration completely eliminated this risk by increasing the serum copper level more. Statistically nonsignificant increase was observed in serum magnesium level and it was determined that it might be efficient for preventing diseases due to magnesium deficiency. Although Smith (19) reported that normal blood serum iron level was 57-162 µg/dl in cattle, in our study it was observed that blood serum copper level was within the normal limits before injection (102,45±13,31µg/dL) and its increase was statistically significant (p<0,001) after Minerasol administration (135,76±12,26 µg/dL) however this value was within the normal limits reported. 229 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Fe deficiency along with the Cu deficiency is known to cause violent anemiae and predisposition to parasitic diseases. Iron enters the structure of hemoglobin necessary for moving oxygen from lungs to body cells. In case of insufficiency, decrease in immune response, cell mediated immune abnormalities may be seen and the killing ability of neutrophilia can be significantly reduced (22). Authors (1, 15) reported that high amount of cobalt, zinc, cadmium, mangane and copper found in ration decreased the absorption of iron. In our study it was observed that the blood erythrocyte count, hematocrit level and hemoglobin level before and after the injection did not change and that this was compatible with the presence of blood serum Fe and Cu levels within normal limits before injection (19). Potassium administered to the animals with minerasol administration are necessary for the maintenance of cellular integrity and for healthy nerve and muscle function. Sodium and Chlorine are necessary for the maintenance of healthy nerve and muscle function (22). Đodine is the structural component of thyroid hormones called Thyroxine and triiodothyronine and has a regulatory and activating effect on metabolism. The normal growth and proper functioning of reproduction organs depend on the thyroid situation. Since blind and hairless calves, abortus in cows can be seen in its deficiency, iodine supplementation in various concentrations has a positive effect on reproduction performance. cobalt is necessary for Vitamin B12 synthesis in the large intestine of pigs and horses. The field experiences indicate that the copulation performance in sheep and cattle is deteriorated and ovarium function is deteriorated in cattle, the rate of getting pregnant, deliveries and milk and wool production decreased (22). However, although we did not have the chance to examine the changes in K, Na, Cl, I and Co levels in blood serum after the injection, it was decided that these were increased similarly to the others and this may be effective on preventing diseases due to mineral deficiencies. Minerasol is used for treating, preventing specific or non-specific diseases and disorders caused by deficiency, lack or imbalance of the components (Zinc, Cobalt, Đodine, Iron, Sodium, Potassium, Phosphor, Calcium, Magnesium) in its constitution and supporting the animal (22). It’s specific areas of use are grass tetany, milk fever, bone disorders, disorders in hair and skin related to zinc, anemia related to iron and cobalt deficiency (vitamin B12), hairless calves sue to iodine deficiency and it is used for removing the negative situations caused by the deficiency of substances in its constitution mentioned in pharmacological properties section. It can be used for prophylaxis during pregnancy and lactation fort he prevention of diseases which are likely to develop since the need of animals for substances within Minerasol is increased during these periods (22). Consequently, it was decided that with the inclusion of minerasol which is a new trace element combination into the routine care and nourishment program, the problems related to the deficiency of trace elements would be eliminated in a short time and predisposition in terms of bacterial viral and parasitic diseases would be prevented. 230 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES REFERENCES Ağaoğlu, Z.T. (1991): Ülkemiz Hayvancılığında Bazı Đz elementler ve Önemleri. Veteriner Hekimler Vakfı Dergisi, 57-62. Altıntaş, A., Uysal, H., Yıldız, S., Goncagül, T.(1990): Akkaraman ve Melezlerinde Serum ve Yapağı Örneklerinde Karşılaştırmalı Mineral Durumu. Lalahan Hayv. Araş. Derg., 30 (1-4): 40-57. Altıntaş, A., Fidancı, U.R. (1993): Evcil Hayvanlarda ve Đnsanlarda Kanın Biyokimyasal Normal Değerleri. AÜ Vet Fak Derg. 40, 173-186. Beighle, D.E., Boyazoğlu, P.A., Hemken, R.W., Serumaga-Zake, P.A. 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(2004): Đneklerin Kan Serumlarındaki Bazı Mineraller ile Embriyonik Ölüm Arasındaki Đlişki. YYÜ Vet Fak Derg, 15 (1-2):11-15. 232 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES PRIMI RISULTATI DI UN INDAGINE SUL POLIMORFISMO AI GENI ALFA E BETA GLOBINICI IN RAZZE ISOLANE ITALIANE ALPHA AND BETA GLOBIN POLYMORPHISM IN ITALIAN ISLANDER SHEEP BREEDS: PRELIMINARY RESULTS ALLOGGIO, I., BRAMANTE, G., PIERAGOSTINI, E. Dip. PROGESA- Università di Bari. Via Amendola, 165/A, Bari (BA). Tel. 0805442842, Fax 0805442828, Email [email protected] KEY WORDS. Haemoglobin , gene frequency, alpha globin triplicated haplotypes, HBB, HBA, PAGIF. ABSTRACT Previous researches highlighted the high haemoglobin polymorphism of Apulian native sheep, mainly due to the alpha globin genetic system. The unusual presence of haplotypes, characterised by extra-numerary genes, was suggested to be the effect of a possibly adaptive response to the Apulian enzootic parasites. Unfortunately, in the literature there are no data on other breeds originating in different geographical areas, and, at present, haemoglobin polymorphism is not among the favourite research subjects. According to the necessity of expanding the data set, this work reports the preliminary results obtained from a screening in Italian islander sheep breeds. Thus, in 12 different flocks located in Apulia, 465 blood samples were taken from 156 Comisana (C ) sheep, 159 Sarda (S) sheep and 150 Valle del Belice (VdB) sheep. Haemolysates were prepared from EDTA samples and analysed by PAGIF. The results indicate that when compared with Apulian native sheep, the three breeds show slight differences as to the HBA2H gene frequency and a decreased number of HBBA genes; particularly VdB exhibits no HBBA and rare HBA1A, while show almost the same frequency of triplicated haplotypes as Apulian native sheep. INTRODUZIONE Ricerche precedenti hanno messo in evidenza nelle razze autoctone pugliesi un elevato polimorfismo emoglobinico legato non solo alla presenza di alleli beta globinici quanto ad una variabilità quali quantitativa del sistema alfa globinico (Pieragostini et al., 1994; Pieragostini et al., 2005). Poiché non esistono dati di riferimento in letteratura che consentano un organico confronto con risultati ottenuti su altre razze originarie di altri ambienti abbiamo ritenuto necessario ampliare il data set a nostra disposizione, rivolgendo la nostra attenzione a razze non pugliesi ed in particolare a tre razze isolane italiane. Alla base di questa scelta sta il fatto che gli allevatori pugliesi hanno dimostrato scarsa affezione nei confronti degli ovini autoctoni rivolgendo la loro attenzione a razze specializzate ed in particolare, nell’ambito degli ovini da latte, nelle ultime decadi, dopo tentativi infruttuosi con razze nordeuropee (Pieragostini, Petazzi, 1999), hanno indirizzato le loro preferenze verso le razze isolane italiane ed in particolare la Comisana e la Sarda che hanno cominciato a diffondersi a partire dagli anni ’80; recente è invece la comparsa della Valle del Belice. Considerando l’ipotesi di valore adattativo avanzata per il polimorfismo emoglobinico registrato nelle razze autoctone pugliesi sia per quanto riguarda gli alleli al locus beta (HBB) (Pieragostini et al., 1994; Pieragostini et al., 2005) che gli arrangiamenti 233 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES genici del sistema alfa (Pieragostini et al., 2003) ed il fatto che le razze isolane summenzionate provengono da ambienti con caratteristiche simili sia a livello pedoclimatico che della diffusione dei parassiti emotropici enzoootici, questo lavoro si pone come obiettivo una ricognizione del polimorfismo emoglobinico delle razze summenzionate per le quali scarse sono le informazioni al riguardo. MATERIALI E METODI Campionamento. Lo schema di campionamento riportato in tabella 1 è stato elaborato, considerando la dimensione totale del gregge e campionando tutti i maschi presenti nelle diverse aziende. Analisi del fenotipo. Dai singoli campioni di sangue in EDTA sono stati ottenuti gli emolisati da analizzare mediante focalizzazione isoelettrica su gel di poliacrilamide (PAGIF) con aggiunta di separatori (Di Luccia et al. 1992). La valutazione densitometrica delle bande è stata effettuata mediante Ultrascan XL associato ad un densitometro laser equipaggiato con software Gelscan 2.0 della Pharmacia-LKB (Uppsala Sweden). Questo metodo consente di verificare la presenza dei varianti globinici noti, di valutarne la quantità e conseguentemente stabilire la posizione dei diversi geni alfa nell’aplotipo in base alla loro espressione (Pieragostini et al., 2003). La presenza di aplotipi alfa soprannumerari è stata confermata analizzando il campione mediante RP-HPLC come descritto in Pieragostini et al. (2003). Calcolo delle frequenze. Il calcolo delle frequenze geniche è stato effettuato mediante conteggio diretto. La deviazione standard delle frequenze geniche è stata calcolata secondo la formula s= 4 MF pq dove Ne = è stato ottenuto considerando che i maschi campionati 2 Ne N corrispondevano alla totalità delle presenze nel gregge (Tab.1). Nomenclatura. La nomenclatura utilizzata fa riferimento alle linee guida per la nomenclatura dei ruminanti (Andresen et al., 1995) per quanto riguarda i geni, mentre per gli aplotipi segue il modello adottato in Pieragostini et al., 2003. 234 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Tab. 1. Schema di campionamento che illustra il sistema di raccolta dei dati. Sampling scheme defining how the data have be obtained. Farm B1 Farm B2 Farm D Farm E Farm G (b) Farm L (a) Farm M Farm A Farm F Farm G (a) Farm I Farm C Farm H Farm L (b) Total Bree d F M N° of samples C 20 1 21 26 C 18 1 19 20 C 35 7 42 400 C 36 4 40 150 1 1 1 200 C N° of samples per breed Flock size C 18 2 20 C 12 1 13 S 30 10 40 260 S 35 5 40 800 S 36 3 39 203 S 33 7 40 VdB 52 38 90 800 VdB 33 7 40 320 VdB 9 367 11 98 20 465 156 159 150 13 417 300 3910 Purebred group 810 1680 1420 RISULTATI E DISCUSSIONE In tabella 2, sono riportate le frequenze alleliche calcolate ai loci alfa e beta globinici confrontate ai dati di letteratura. Il dato più immediato riguarda il polimorfismo al locus beta per il quale, rispetto alle razze pugliesi, si osserva l’atteso decremento latitudinale di geni HBBA proposto da Ordas (2004) che nel caso della Valle del Belice si traduce in un assenza totale. 235 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Tab 2. Confronto delle frequenze alleliche osservate ai loci alfa e beta nelle tre razze esaminate con dati di letteratura. Allele frequency at the alpha and beta globin genetic systems in the breeds under study compared with literature. HBA1 L HBA1 A HBA1 D HBA2 H HBA3 H HBBA Comisana 0,899 0.101 0.000 0.109 0.035 0.052 Present paper Sardinian 0.975 0.025 0.000 0.085 0.013 0.031 Present paper Valle del Belice 0.963 0.037 0.000 0.115 0.070 0 Breed References Present paper Pieragostini et al. and Di Luccia et al., 1995 Pieragostini et al., 2005 Altamurana (126) 0.927 0.049 0.025 0.119 0.072 0.095 Gentile di Puglia (294) 0.783 0.131 0.029 0.257 0.074 0.117 ? ? 0.025 ? ? 0.103 Pieragostini et al., 1994 0.980 0.020 0.000 0.030 Hadjjsterkotis et al., 1995 Leccese (996) Sardinian (258) 0.010 Il polimorfismo del sistema alfa richiede un analisi più articolata ed in particolare, HBA1L, che con leucina in positione 113 sembra rappresenti il residuo ancestrale comune alla maggior parte dei Bovidae (http://us.expasy.org/sprot/), è il gene wild type; HBA1A è maggiormente frequente nella razza Comisana (oltre il 10%) rispetto alle altre due nelle quali è sotto la soglia del 5%. Confrontando le frequenze di HBA2 H nelle tre razze si nota che a fronte di un 8,5% nella Sarda, sia la Comisana che la Valle del Belice sono attestate sull’11%; la differenza tra le due consiste nel fatto che, considerando che HBA1 A si trova sempre associato con HBA2 H, il valore della Comisana è da imputare prevalentemente alla alta frequenza dell’aplotipo AH che al contrario nella Valle del Belice è molto meno frequente dell’aplotipo LH (Tab.3). Gli aplotipi triplicati sono stati trovati con una frequenza pari a quella delle razze pugliesi solo nella Valle del Belice mentre nella Comisana ed ancor più nella Sarda sembra siano abbastanza rari. Complessivamente la razza Sarda è quella che presenta il più basso livello di polimorfismo relativamente al sistema alfa globinico. Interessante notare che i nostri risultati sono pressoché sovrapponibili a quelli trovati da Hadjjsterkotis et al., 1995; se, infatti si considera che detti autori non hanno rilevato separatamente la presenza di HBA2H e HBA3H, si ottiene lo stesso valore di frequenza; va inoltre sottolineata l’assenza di geni HBA1D i quali però non sono presenti in nessuna delle tre razze esaminate. Nel complesso, le razze isolane risultano meno polimorfiche delle razze pugliesi; in dettaglio si osserva che la Comisana somiglia alla Gentile di Puglia per la presenza relativamente elevata di aplotipi AH e la Valle del Belice si accosta all’Altamurana per la frequenza dei geni HBA2H e HBA3H. Questo ultimo dato, in particolare, ci incoraggia ad andare avanti nell’indagine del polimorfismo ai loci alfa, vuoi su altre razze mediterranee che su razze originarie di ambienti continentali. 236 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Tab. 3. Frequenze degli aplotipi alfa nelle tre razze esaminate e relativo valore di deviazione standard (s). Haplotype frequency (± s) at the alpha globin genetic systems. Breed LL s LH s AH s LLH s Comisana 0,809 0,010 0,056 0,006 0,101 0,007 0,035 0,005 Sardinian 0,903 0,005 0,060 0,004 0,025 0,003 0,013 0,002 Valle del Belice 0,765 0,008 0,128 0,007 0,037 0,003 0,070 0,005 Ringraziamenti. Gli Autori ringraziano il dott. Giuseppe De Felice ed il Dott. Antonio Nisi per la preziosa collaborazione nella ricognizione delle aziende i cui responsabili si sono tutti distinti per disponibilità e cortesia. Un grazie particolare va al dott. Raffaele Sbano che in qualità di proprietario dell’allevamento più numeroso si è sobbarcato l’onere di ospitarci due volte. Questo lavoro è stato finanziato dal MIUR (PRIN 2004) e dell’Università di Bari. BIBLIOGRAFIA Andresen E., Broad T.E., Brown S., Cooper D.W., Di Stasio L., Dolling C.H.S., Fleet M.: Hill D.F.: Lauvergne J.J., Lundie R.S., Maddox J., Nicholas F.W. Rae AL., Renieri C., Sponenberg D.P., Tucker E.M. (1995) Revised Guideline for gene nomenclature in Ruminants, 1993. Genet. Sel. Evol. 27, 89-93. Di Luccia A., Iannibelli L., Pieragostini E., Ferrara L. (1992) Phenotyping haemoglobin polymorphisms of sheep. Small Ruminant Res. 7, 189-194. Di Luccia A., Pieragostini E., Dario C., Ferrara L. (1995) Gene diversity in Mediterranean Bovid globin chain. In: Proceedings Joint EAAP-FAO-CIHEAM International Symposium on "Mediterranean animal germoplasm and future challenges" Benevento, Italy, 23-25 October 1995, pp. 135-138. Hadjisterkotis E. Manca L. Naitana S. Masala B. (1995) A comparative study on the haemoglobin polymorphism of domestic sheep of the islands of Chios Cyprus and Sardinia. Comp. Biochem. Physiol. A-Physiol. 112, 547-552. Ordás J.G. 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Evol. 35(1), S121-S133. 237 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES RELATIONSHIP BETWEEN MILK GENETIC POLYMORPHISM AND PHYSICO-CHEMICAL AND NUTRITIONAL QUALITY OF SHEEP MILK MARTINI M.1, SALARI F.1, SCOLOZZI C.1, CECCHI F.1, CERIOTTI G.2, CAROLI A.3 1 Dipartimento di Produzioni Animali, Università degli Studi di Pisa, 56124 Pisa, Italy. 2 Dipartimento VSA, Università degli Studi di Milano, 20134 Milano, Italy. 3 Dipartimento Scienze Biomediche e Biotecnologie, Università degli Studi di Brescia, Viale Europa, 11- 25123 Brescia, Italy. Tel.: +39-030 3717658, Fax: +39-030 3701157. Email: [email protected] KEY WORDS: Genetic Polymorphism, Milk Quality, Fat Globules, Sheep. ABSTRACT Individual milk samples (n = 72) were collected from Massese ewes bred in Central Italy. Milk phenotypes were typed by isoelectrofocusing. Milk samples were analysed for the physico-chemical composition. The lipid fraction was evaluated by the morphometric analysis of milk fat globules and by the determination of the fatty acids composition. The relationships between the genetic polymorphism of s1-casein (s1-cn) and -lactoglobulin (-lg) and the qualitative properties of milk were statistically evaluated. The comparison was performed between genotypes s1-cn AC vs CC, and -lg AA vs AB. Some interesting relationships were found between milk protein genotypes, fat globule morphometric characteristics, and fatty acid composition. A higher amount of smaller milk fat globules was associated to s1-cn AC (vs CC) and -lg AB (vs AA) genotypes, and a higher content of long-chain fatty acids was associated to -lg AA (vs AB) genotype. INTRODUCTION In the ovine species, the investigation on milk protein genetic variability has shown an interesting and complex protein pattern, but the genetic control of the variation observed was demonstrated only in few cases. Genetic polymorphism was demonstrated at the protein level for -lactoglobulin (-lg; three variants: A, B and C; Bell and McKenzie, 1967; Erhardt, 1989), and s1-casein (s1-cn; three variants: A, C, Welsh/D; King 1966; Richardson and Creamer, 1976; Ferranti et al., 1995; Chianese et al., 1996). The A and B variants of -lg are ubiquitous. Their frequencies in the most important Italian dairy ewe breeds are reported by Amigo et al. (2000). Recently, three single nucleotide polymorphisms (SNP) have been described at s1cn, cn, and κ-cn, all resulting in amino-acid exchanges (Ceriotti et al., 2004). Despite the limited genetic knowledge on milk protein variability in sheep, interesting relationships between genetic milk protein variants and traits of economical interest were already described (i.e. Rampilli et al., 1992; Pirisi et al., 1999). Relationships of such variation with milk quality, composition, and technological characteristics have been found at αs1-cn, where D allele is less favourable for cheese making than the most common C variant. Contradictory results have been obtained regarding ovine -lg. Some works found significant relationships between the main variants A and B and milk production (Bolla et al., 1986; Bolla et al., 1989; Fraghì et al., 1996; Nudda et al., 2000), fat and protein content (Garzon and Martinez, 1992; Giaccone et al., 1997; Rampilli et al., 238 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES 1997; Dario et al., 2003), while other studies did not reveal any influence on milk traits (Barillet et al., 1993; Recio et al., 1997). The aim of this work was to investigate the relationship between milk genetic polymorphisms and physico-chemical and nutritional quality of sheep milk. Particular attention was given to fatty acid composition and fat globule morphometric characteristics. MATERIALS AND METHODS Animals and genotyping. Milk samples were taken from 72 Massese ewes of first and second lambing order; all the animals came from a single herd located in the province of Pisa (Tuscany) and were raised according to the semi-extensive system, involving use of natural pastures and hay with the integration of small amounts of concentrate feed (never superior to 300 g/day) given to the animals at the time of milking. All individual samples were taken from morning milking and were refrigerated until use. Genotypes were determined by isoelectrofocusing analysis of individual milk samples according to Chessa et al. (2003). Chemical analysis. Milk samples were analyzed for: percentage of dry matter, protein, fat and lactose by infrared analysis (Milkoscan, Italian Foss Electric); density, pH, percentage of casein, ash, phosphorus and calcium (A.O.A.C., 1990), somatic cell count (SCC) (Fossomatic), colony forming units (C.F.U.); non-fat dry matter was calculated to be the difference between dry matter and fat content. Morphometric analysis. Number of fat globules mL-1 of milk and diameter was measured in each milk sample according to Scolozzi et al. (2003). Fatty Acids Composition. Milk fat extraction was performed according to following method: ammonia 25% (0.4 ml), ethil alchool 95 % (1 ml) and exane (5ml) were added to 2 g of milk. After vortexed, samples were centrifuged at 3000 rpm and 5 °C for 15 min to obtain the phase separation. The upper layer was collected and whole procedure was repeated two times. Extracted fat was dried, weighed and dissolved in hexane (Secchiari, 2003). The fatty acids of milk were analyzed by gas-chromatography as the methyl ester derivates after trans-esterification with sodium methoxide (Christie, 1982); the gaschromatographic apparatus Perkin Elmer Auto System was equipped with a FID detector and a capillary column (Omegavax 320, 30 m length, 0.25 µm thickness), with helium as carrier gas. The peak areas of individual fatty acids were identified for means of previous fatty acids standards (Sigma-Aldrich) injection and quantified as percent of total fatty acids. Total CLA comprises a pool of isomers (cis-9, trans 11 and 10, 12) of octadecadienoic acid. Statistical Analysis. Frequency distribution of total measured milk fat globules was evaluated according to their size: fat globule diameters were divided into ten classes of 1m class widths, from 0 to >9m, subsequently grouped to establish three size categories of fat globules: small globules (SG) with diameter <2m (0.29% of total measured milk fat globules), medium-sized globules (MG) with a diameter of 2-5m (40.9 % of total measured milk fat globules) and large globules (LG) with diameter >5m (58.81% of total measured milk fat globules). In this way, each milk sample was classified according to the percentage of milk fat globules that were included in these three size categories. Statistical analyses were performed with the GLM procedure of SAS software (SAS Institute, Inc., Cary, NC) using a linear model to estimate the effect of s1-cn and -lg genotype on the qualitative properties of milk. The model included also the parity as fixed 239 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES effect. The comparison was performed between genotypes s1-cn AC vs CC, and -lg AA vs AB. RESULTS AND DISCUSSION Genetic polymorphism was found at s1-cn (92% CC, 8% AC genotype frequencies) and -lg (50% AA and 50% AB). Some relationship were found between milk protein genotypes, fat globule morphometry, and fatty acid composition (table 1 and 2), while no significant difference was found between the milk protein genotypes considered for milk physico-chemical parameters. Table 1. Least-square means (LSM) and standard errors (SE) for variables significantly differing at s1-cn. s1-cn AC s1-cn CC LSM SE LSM SE P SG 2.87 0.92 0.83 0.26 0.005 MG 44.09 6.18 25.25 1.71 0.009 LG 54.03 6.42 73.92 1.78 0.006 CL1 0.995 0.333 0.198 0.092 0.034 CL2 1.877 0.656 0.635 0.182 0.087 CL3 6.693 1.671 2.984 0.463 0.048 CL4 17.132 3.244 7.347 0.900 0.010 CL8 7.804 3.278 14.566 0.909 0.064 CL9 3.132 2.148 8.057 0.596 0.042 CL10 0.651 2.451 6.370 0.680 0.038 SG: small globule %; MG: medium globule %; LG: large globule %; CL1, CL2,...CL10: % of fat globules in the size classes defined in Materials and Methods. Table 2. Least-square means (LSM) and standard errors (SE) for variables significantly differing at -lg. -lg AA -lg AB LSM SE LSM SE P SG 1.280 0.472 2.424 0.595 0.037 CL1 0.404 0.170 0.789 0.214 0.050 CL2 0.877 0.335 1.636 0.423 0.050 LCFA 50.866 0.412 49.762 0.520 0.023 C18:0 12.440 0.316 11.252 0.398 0.002 SG: small globule %; LCFA = long-chain fatty acids %; CL1, CL2: percent of fat globules in the size class defined in Materials and Methods. A higher amount of smaller milk fat globules was associated to s1-cn AC (vs CC) and -lg AB (vs AA) genotypes, and a higher content of long-chain fatty acids was 240 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES associated to -lg AA (vs AB) genotype. The effect of milk protein genotypes on milk fat globule size is interesting for the possible relationship with milk nutritional and technological quality. In recent years the process leading to the formation of lipid droplets within the endoplasmatic reticulum has been elucidated (Mather and Keenan, 1998), but the biochemical mechanisms responsible for the formation and release of fat globules of various sizes have not yet been clarified, nor is the biological significance of their different morphometric characteristics fully known. Few studies investigated the relationship between milk fat globule size and technological properties of milk. A higher content of SG was found related to a higher milk total protein content (Lopez and Dufur, 2001; Martini et al., 2004). For cheese-making, it seems that smaller globule keeps more water, thus being more useful for soft cheeses (Michalski et al., 2003). As for the fatty acids composition, a highly significant difference (P<0.002) was found between -lg AA and AB in C18:0 content (12.44 vs 11.25). According to Jensen (1990), C18:0 tends to lower the haematic cholesterol level, whereas Ulbricht and Southgate (1991) did not demonstrate any hypocholesterolemic effect for this fatty acid. The biological role of -lg is still unclear. Due to its in vitro homology with retinol (Pérez and Calvo, 1995) and some fatty acids (Narayan et al., 1997; Kontopidis et al., 2002), -lg was proposed as a retinol binding protein in the intestine of newborns (Sawyer et al., 1985; Pérez and Calvo, 1995) and as a protein involved in both transport and metabolism of dietary lipids (Pérez and Calvo, 1995). Spector et al. (1970) found that the strength of the relationship between β-lg and long fatty acids increases from C16:0, to C18:0, to C18:1. According to Perez and Calvo (1995), the bound between β-lg and fatty acids increases the protein stability against proteolitic degradation. This work is a first hint of the importance of milk protein polymorphism on morphometric characteristics of milk fat globules and fatty acid composition in the ovine species. The biological explanation of these effects is to be investigated, in order to evaluate their possible implications for animal breeding. ACKNOWLEDGEMENT: Research supported by PRIN 2005. REFERENCES A.O.A.C. 1990. Official Methods of Analysis. 15th ed. Association of Official Analytical Chemist, Arlington, VA. Amigo, L., Recio, I., Ramos, M. 2000. Genetic polymorphism of ovine milk proteins: its influence on technological properties of milk – A review. Dairy J., 10: 135–149. Barillet, F., Mahè, M.F., Pellegrini, O., Grosclaude, F., Bernard, S. 1993. Genetic polymorphism of the milk proteins in the French Lacaune breed. Hung. J. of Anim. Prod. (Suppl.1), 199-207 Bell, K., and H.A. McKenzie. 1967. The whey proteins of ovine milk. β-lactoglobulins A and B. Biochim. Biophys. Acta., 147: 23-134. 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Moreover, the s1-casein polymorphism was investigated at the genomic level, analysing the DNA extracted from the milk somatic cells. Milk samples were analysed for the physicochemical composition. The lipid fraction was evaluated by the morphometric analysis of the fat globules, and by the determination of the fatty acids composition. The relationships between s1-casein genetic polymorphism and milk quality were evaluated statistically. In particular, the favourable effect of the AA genotype on total protein, casein, and non-fat dry matter was confirmed, whereas the homozygous FF genotype was associated with a higher Ca content. A significant effect was detected of s1-casein genotype on the following milk fatty acids: C14:1, C17:0, C18:3 n3, C20:0, C21:0, C20:4. Among them, C18:3 n3 and C20:4 are of particular interest from the nutritional point of view. INTRODUCTION The analysis of casein variation in domesticated goat (Capra hircus) is quite complex, because a large number of mutations involve the four coding genes (Rando et al., 2000; Caroli et al., 2006). Deep relationships of such intense genetic variation with functional and biological properties affecting milk quality, composition, and technological characteristics have been found mainly at the goat s1-casein (s1-cn) level (Martin 1993; Grosclaude et al., 1994), which is characterized by a high quantitative and qualitative variation. Considerable differences in the clotting speed, curd firmness and cheese yield were evidenced among the s1-cn alleles in goat milk (Remeuf, 1993; Delacroix-Buchet et al., 1996). The best parameters were obtained by homozygous s1-cn AA. Allele A gives goat cheese the sweetest flavour, while allele F the sharpest (Vassal et al., 1994; Lamberet et al., 1996). Neveu et al. (2002) suggested that the s1-cn polymorphism is involved in the secretion process of goat milk proteins which is apocrine instead of merocrine as in bovine milk. In fact, casein accumulation in the endoplasmic reticulum leads to dilation of the cisternae that could disturb the whole secretion process, including lipids. The authors suggested that the apocrine pathway of secretion described in the goat could be the consequence of the dysfunction observed in the intracellular transport of caseins when s1casein is lacking. Contarini et al. (1999) observed that a low content in αs1-cn in goat milk is linked to a higher content of C4:0, C6:0, C14:0, C16:0, C16:1, C18:3, and C20:0. 244 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES The aim of this work was to further investigate the relations between s1-cn polymorphism and the physico-chemical and nutritional quality of goat milk. MATERIALS AND METHODS Animals and genotyping. Milk samples were taken from 56 Camosciata goats bred in Central Italy. All individual samples were taken from morning milking and were refrigerated until use. Genotypes were determined by isoelectrocusing analysis of individual milk samples according to Caroli et al. (2001) and at the DNA level, by analysing the DNA extracted from milk with different typing methods (Jànsa Pérez et al., 1994, Ramunno et al., 2000; Cosenza et al., 2001). Chemical analysis. Milk samples were analyzed for: percentage of dry matter, protein, fat, and lactose by infrared analysis (Milkoscan, Italian Foss Electric); density, pH, percentage of casein, ash, phosphorus and calcium (A.O.A.C., 1990), somatic cell count (SCC) (Fossomatic), colony forming units (C.F.U.); non-fat dry matter was calculated to be the difference between dry matter and fat content. Morphometric analysis. Number of fat globules mL-1 of milk and diameter was measured in each milk sample according to the method of Scolozzi et al. (2003). Fatty Acids Composition. Milk fat extraction was performed according to following method: ammonia 25% (0.4 ml), ethil alchool 95 % (1 ml) and exane (5ml) were added to 2 g of milk. After vortexed, samples were centrifuged at 3000 rpm and 5 °C for 15 min to obtain the phase separation. The upper layer was collected and whole procedure was repeated two times. Extracted fat was dried, weighed and dissolved in hexane (Secchiari, 2003). The fatty acids of milk were analyzed by gas-chromatography as the methyl ester derivates after trans-esterification with sodium methoxide (Christie, 1982); the gaschromatographic apparatus Perkin Elmer Auto System was equipped with a FID detector and a capillary column (Omegavax 320, 30 m length, 0.25 µm thickness), with helium as carrier gas. The peak areas of individual fatty acids were identified for means of previous fatty acids standards (Sigma-Aldrich) injection and quantified as percent of total fatty acids. Total CLA comprises a pool of isomers (cis-9, trans 11 and 10,12) of octadecadienoic acid. Statistical Analysis. Frequency distribution of total measured milk fat globules was evaluated according to their size: fat globule diameters were divided into ten classes of 1m class widths, from 0 to >9m, subsequently grouped to establish three size categories of fat globules: small globules (SG) with diameter <2m (40.3% of total measured milk fat globules), medium-sized globules (MG) with a diameter of 2-5m (55.7 % of total measured milk fat globules) and large globules (LG) with diameter >5m (4.0% of total measured milk fat globules). In this way, each milk sample was classified according to the percentage of milk fat globules that were included in these three size categories. Statistical analyses were performed with the GLM procedure of SAS software (SAS Institute, Inc., Cary, NC) using a linear model to estimate the effect of s1-cn on the qualitative properties of milk. The model included also the parity as fixed effect. 245 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES RESULTS AND DISCUSSION Table 1 and 2 shows the significant differences detected among s1-cn genotypes. The favourable effect of the AA genotype on total protein, casein, and non-fat dry matter was confirmed. Moreover, the homozygous FF genotype was associated with a higher Ca content (table 1). A significant effect was detected of s1-casein genotype on the following milk fatty acids: C14:1, C17:0, C18:3n3, C20:0, C21:0, C20:4 (table 2). The trend for genotype is represented in figure 1. Some indications can be extrapolated about the possible effect of the different allele, such as a higher C20:0 content linked to the F allele, a higher C18:3n3 content linked to A allele, and a lower C20:4 content linked to E allele. Among the fatty acids significantly affected by s1-cn genotype, the presence of myristoleic acid (C14:1) in plasma was shown to be a diagnostic value in patients with defects of long-chain fatty acid oxidation (Onkenhout et al., 1995). From the nutritional point of view the alpha-linolenic acid (C18:3n3) is an essential fatty acid, precursor of omega-3 fatty acids, which are known for their favourable effects on human health (Baro et al., 2003; Hardman, 2004, Sangiovanni and Chew, 2005; Blondeau and Schneider, 2006). The arachidonic acid (C20:4), belonging to the omega-6 series, has a double effect on human health, both playing a positive role on the formation of embryonic neuronal cells and in the first life years (Sala-Vila et al., 2006), and acting as a precursor of prostaglandins and leucotriens which are pro-inflammatory molecules in adult life (Tapiero et al., 2002). The results obtained are a preliminary suggestive indication of important relations between s1-cn alleles and the fatty acid profile of goat milk in the Camosciata, and support the need for further researches on the subject. ACKNOWLEDGEMENT: Research supported by PRIN 2005. Table 1. Least-square means (LSM) and standard errors (SE) for physico-chemical parameters (%) significantly differing at s1-cn genotype. s1-cn Varia AA (n = 6) AE (n = AF (n = EE (n = 3) EF (n = FF (n = 5) ble 12) 20) 10) SE LS SE LSM SE LSM SE LSM SE LSM SE LSM M Protei 3.25 0.11 3.17A 0.1 2.88B 0.0 3.03AB 0.1 2.73C 0.0 2.81B 0.092 Ba b b b n 4 20 48 22 81 A B AB B Casei 3.16 0.16 2.93 0.1 2.71 0.0 3.02 0.1 2.49 0.1 2.65B 0.137 B a b n 9 79 72 82 21 A B AB 0.1 7.66C 0.1 7.80B 0.128 n.f.d. 8.35 0.15 8.20 0.1 7.82 0.0 7.98 B m. 9 68 68 71 14 Ca 0.10 0.01 0.09B 0.0 0.08B 0.0 0.08B 0.0 0.09B 0.0 0.13A 0.012 B 5 15 06 16 10 A,B …: P≤0.01; a,b…: P≤0.05 n.f.d.m: non-fat dry matter 246 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Table 2. Least-square means (LSM) and standard errors (SE) for fatty acid composition (%) significantly differing at s1-cn genotype. s1-cn AA (n = 6) Fatty acid C14:1 C17:0 C18:3n3 C20:0 C21:0 C20:4 A,B LSM 1.17Bbc 0.72BC 0.29abc 0.89ABab 0.09bc 0.19Aab SE 0.067 0.045 0.030 0.116 0.019 0.028 AE (n = 12) LSM 1.33Ab 0.81A 0.32ab 0.70Bab 0.10abc 0.12Bd SE 0.071 0.048 0.031 0.123 0.020 0.030 AF (n = 20) LSM 1.22Bb 0.79B 0.33a 0.92ABa 0.12a 0.18ABbc SE 0.028 0.020 0.013 0.049 0.008 0.012 EE (n = 3) LSM 1.32ABb 0.74BC 0.26c 0.60Bb 0.12ab 0.17ABbcd SE 0.071 0.049 0.032 0.125 0.020 0.030 EF (n = 10) LSM 1.14Bc 0.72C 0.29bc 0.96ABa 0.08bc 0.15ABcd SE 0.048 0.032 0.021 0.083 0.014 0.020 FF (n = 5) LSM 1.09Bc 0.73BC 0.28bc 1.11Aab 0.07c 0.22Aa SE 0.054 0.037 0.024 0.094 0.015 0.023 …: P≤0.01; a,b…: P≤0.05 Figure 1. Trend of fatty acid composition per genotype. 1.4 1.2 C14:1 1 C17 0.8 C18:3n3 0.6 C20 C21 0.4 C20:4 0.2 0 AA AE AF EE EF FF REFERENCES A.O.A.C. 1990. Official Methods of Analysis. 15th ed. Association of Official Analytical Chemist, Arlington, VA. Baro, L., Fonolla, J., Pena, J.L., Martinez-Ferez, A., Lucena, A., Jimenez, J., Boza, J.J. 2003. N-3 Fatty acids plus oleic acid and vitamin supplemented milk consumption reduces total and LDL cholesterol, homocysteine and levels of endothelial adhesion molecules in healthy humans. Clin. Nutr., 22: 175-182. Blondeau, N., and Schneider, S.M. 2006. Les acides gras essentiels de la famille des omega-3 et la santé de la mère et de l’enfant. Nutrition Clinique et Métabolisme. 20: 68-72. Caroli, A., Chiatti, F., Chessa, S., Rignanese, D., Bolla, P. and G. Pagnacco. 2006. Focusing on the goat casein gene complex. J. Dairy Sci. 89 (in press). Caroli, A., Jann, O., Budelli, E., Bolla, P., Jäger, S., and G. Erhardt. 2001. Genetic polymorphism of goat κ-casein (CSN3) in different breeds and characterization at DNA level. Anim. Genet., 32: 226-230. Contarini, G., and M. Povolo. 1999. http:\\www.ilclodi.it\Luino.htm 247 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Christie, A. 1982. A simple procedure of rapid transmethylation of glycerolipids and cholesteryl esters. J. Lipid Res., 23: 1072-1075. Cosenza, G., Illario, R., Rando, A., Di Gregorio, P., Masina, P., and L. Ramunno. 2003. Molecular characterization of the goat CSN1S101 allele. J. Dairy Res., 70: 237-240. Delacroix-Buchet, A., Degas, C., Lamberet, G., Vassal, L. 1996. Influence des variants AA et FF de la caséine αs1 caprine sur le rendement fromager et les caractéristiques sensorielles des fromages. Lait, 76: 217-241. Grosclaude, F., Ricordeau, G., Martin, P., Remeuf, F., Vassal, L., and J. Bouillon. 1994. Du gène au fromage: le polymorphisme de la caséine αs1 caprine, ses effets, son évolution. INRA Prod. Anim., 7: 3-19. Hardman, W.E. 2004. (n-3) Fatty acids and cancer therapy. J. Nutr., 134 :S3427-3430. Jànsa Pérez, M., Leroux, C., Sanchez Bonastre, A., and P. Martin. 1994. Occurrence of a LINE element in the 3'UTR of an allelic form of the goat alphas1 -casein gene associated with a reduced level of protein synthesis. Gene, 147:179-187. Lamberet, G., Degas, C., Delacroix-Buchet, A., Vassal, L. 1996. Influence des caractères liés aux allèles A et F de la caséine αs1 caprine sur le flaveur chèvre: fabrications fromagères avec échange de protéines et de matières grasses. Lait, 76 : 349-361. Martin, P. 1993. Polymorphisme génétique des lactoprotéines caprines. Lait, 73: 511-532. Morgan, F., Bodin, J.P., Gaborit, P. 2001a. Lien entre le niveau de lipolyse du lait chèvre et la qualité sensorielle des fromages au lait cru ou pasteurisé. Lait 81: 743-756. Morgan, F., Gaborit, P. 2001b. The typical flavour of goat milk products: technological aspects. Internat. J. Dairy Technol., 54: 38-40. Neveu, C., Riaublanc, A., Miranda, G., Chich, J.F., Martin, P. 2002. Is the apocrine milk secretion process observed in the goat species rooted in the perturbation of the intracellular transport mechanism induced by defective alleles at the αs1-casein locus? Reprod. Nutr. Dev., 42: 163-172. Onkenhout, W., Venizelos, V., van der Poel, P.F., van den Heuvel, M.P. and BJ Poorthuis. 1995. Identification and quantification of intermediates of unsaturated fatty acid metabolism in plasma of patients with fatty acid oxidation disorders. Clinical Chemistry, 41: 1467-1474. Ramunno, L., Cosenza, G., Pappalardo, M., Pastore, N., Gallo, D., Di Gregorio, P., and P. Masina. 2000. Identification of the goat CSN1S1F allele by means of PCR-RFLP method. Anim. Genet., 31: 342. Rando, A., Ramunno, L., and P. Masina. 2000. Mutations in casein genes. Zoot. Nutriz. Anim., 26: 105-114. Remeuf, F. 1993. Influence du polymorphisme génétique de la caséine αs1 caprine sur les caractéristiques physico-chimiques et technologiques du lait. Lait, 73: 549-557. Sala-Vila, A., Campoy, C., Castellote, A.I., Garrido, F.J., Rivero, M., Rodriguez-Palmero, M., and M.C. Lopez-Sabater. 2006. Influence of dietary source of docosahexaenoic and arachidonic acids on their incorporation into membrane phospholipids of red blood cells in term infant. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids, 72: 21-28. SanGiovanni, J.P., and Chew, E.Y. 2005. The role of omega-3 long chain polyunsaturated fatty acids in health and disease of the retina. Progress in Retinal and Eye Research, 24: 87138. 248 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Scolozzi, C., Martini, M., and F. Abramo. 2003. A method for identification and characterization of ewe's milk fat globules. Milchwissenschaft, 58: 490-493. Secchiari, P., Antongiovanni, M., Mele, M., Serra, A., Buccioni, A., Ferruzzi, G., Paoletti F., Petacchi, F. 2003. Effect of kind of dietary fat on the quality of milk fat from Italian Fresian cows. Livest. Prod. 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[email protected] [email protected] RESUMEN Numerosas investigaciones realizadas en los últimos años han permitido detectar una serie de posiciones polimórficas dentro de la secuencia del gen PRNP ovino, que codifica para la proteína prión (PRP). Más de una veintena de estas mutaciones dan lugar a cambios en la secuencia aminoacídica de la PRP. De todos estos polimorfismos, se ha prestado atención especial a los que afectan a los codones 136, 154 y 171, ya que está descrita su relación con la distinta susceptibilidad/resistencia de los ovinos a padecer Scrapie (Encefalopatía Espongiforme Transmisible Ovina). Los protocolos de genotipado empleados hasta el momento en la mayoría de los laboratorios analizaban solamente cuatro posiciones polimórficas, la segunda posición de los codones 136 y 154, y la segunda y tercera posiciones del codon 171, lo que permitía la identificación de 5 haplotipos denominados ARQ, VRQ, AHQ, ARR y ARH. En el presente trabajo se describen las modificaciones realizadas en el método de análisis para la identificación de dos nuevas variantes alélicas, resultantes del polimorfismo detectado en las primeras posiciones de los codones 136 y 171, y que se denominan TRQ y ARK, respectivamente. Los análisis han sido realizados en animales inscritos en el libro genealógico de la raza ovina Assaf, que gestiona la Asociación Española de Criadores de la Raza Ovina Assaf (ASSAF.E). PALABRAS CLAVE: scrapie, ovino, PRNP, haplotipos. ABSTRACT Numerous studies developed in the last years have allowed to detect different polymorphic positions in the PRNP gene sequence, which codifies for the prion protein (PRP). More than twenty of these mutations provoke changes in the PRP amino acid sequence. A special attention has been paid to polymorphisms affecting the 136, 154 and 171 codons since it is described their relation with the different sheep susceptibility/resistance to suffer Scrapie (Sheep Transmissible Spongiform Encephalopathies). At present, genotyping protocols used by most labs only analyze four polymorphic positions (second nucleotide of 136 and 154 codons, second and third positions of 171 codon) allowing the identification of five haplotypes: ARQ, VRQ, AHQ, ARR and ARH. In the current study, we describe the adjustment in the analysis method in order to detect two new allelic variants, resultanting from the polymorphism detected in the first positions of 136 and 171 codons, called TRQ and ARK, respectively. These analyses have been realized in animals inscribed in the Assaf Sheep Breed Herdbook, which manages the Breeders Spanish Association of the Assaf Sheep Breed (ASSAF.E). 250 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES KEY WORDS: scrapie, sheep, PRNP, haplotypes INTRODUCCIÓN La Tembladera o Scrapie es una Encefalopatía Espongiforme Transmisible (EET) que afecta a ovejas y cabras, que fue descrita por primera vez hace más de 250 años y a la que sólo muy recientemente se la ha prestado atención, debido a la alarma social generada, por la posible transmisión al hombre de este tipo de enfermedades desde la especie bovina, mediante ingestión de material infectado. La sintomatología incluye prurito, hiperexcitabilidad, temblores, falta de coordinación en la marcha para acabar en parálisis y finalmente producir la muerte del individuo. El desarrollo de la enfermedad presenta largos periodos de incubación y da lugar a la degeneración progresiva del sistema nervioso central que, en etapas avanzadas de la enfermedad, adquiere el característico aspecto espongiforme. En ovinos, se ha establecido la influencia del locus PRNP en la mayor o menor resistencia de los animales a padecer la enfermedad. Este gen se ubica en el cromosoma 13 y da lugar a una proteína de 256 aminoácidos (Castiglioni et al., 1998). En la tabla 1 aparecen descritos algunos de los polimorfismos aminoacídicos detectados en esta proteína que han sido descritos en la bibliografía (Clouscard et al., 1995; Belt et al., 1995; Bossers et al., 1996; Hunter et al., 1996; Torisson et al., 1998; Thorgeirsdottir et al., 1999; Billinis et al., 2004; Acín et al, 2004; Zhang et al., 2004; Acutis et al., 2004; Goldmann et al, 2005). 101 112 116 127 136 137 Salvaje Q M A G A R T P A V V T Variantes alélicas Codón S 138 141 143 M S L H T N F R R 151 154 167 168 171 R R G H 172 174 175 R P S L Q Y Q R D E H H C K 176 180 189 195 196 211 241 Q N H G T E K T L S T R P S Q S Y R De todos estos polimorfismos, los que afectan a los codones 136, 154 y 171 son los que se han descrito como más relacionadas con el grado de padecimiento de la enfermedad. En los últimos años, la gran mayoría de los laboratorios han estado realizando un sistema de análisis que permitía genotipar, únicamente, la segunda posición nucleotídica de los codones 136 y 154, y la segunda y tercera posiciones del codón 171, mediante una técnica denominada “primer extension analysis" (Syvanen, 1999; Sauer et al., 2000), lo que daba lugar a la identificación de 5 haplotipos denominados, respectivamente, ARQ, VRQ, AHQ, ARR y ARH. Con esos datos, se ha establecido que, en general, los animales ARR/ARR son los más resistentes y los VRQ/VRQ son los más sensibles a padecer la enfermedad (Dawson et al., 1998). Utilizando este mismo protocolo, en el laboratorio de Xenética Molecular de Xenética Fontao, S.A., se han detectado animales, en los cuales la señal de lectura correspondiente al alelo salvaje, de la segunda posición del codón 171, aparecía con un tamaño considerablemente menor en homocigosis y apenas perceptible cuando aparecía en 251 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES heterocigosis. El fragmento del gen, donde están incluidas las posiciones polimórficas motivo de análisis, fue secuenciado, detectando con ello la existencia de un polimorfismo en la primera posición del codón 171. Este polimorfismo ya aparecía citado en la bibliografía pero no había sido incluido, hasta el momento, en los análisis más habitualmente llevados a cabo. El alelo al que da lugar se denomina ARK (aparece el aminoácido Lisina en lugar del Glutamina). A consecuencia de ello, surge por un lado la necesidad de modificar el protocolo de análisis para poder genotipar este tipo de animales de manera inequívoca y, posteriormente, incluir todas las posibles combinaciones de este alelo en las tablas de los grupos de riesgo de padecer la enfermedad que actualmente se usan y que condicionan los esquemas de selección de los animales. En el presente trabajo se describen las modificaciones realizadas en el método de análisis para la identificación de dos nuevas variantes alélicas, resultantes del polimorfismo descrito en las primeras posiciones de los codones 136 y 171, denominadas TRQ y ARK, respectivamente. Los análisis han sido realizados en animales inscritos en el libro genealógico de la raza ovina Assaf, que gestiona la Asociación Española de Criadores de la Raza Ovina Assaf (ASSAF.E). MATERIAL Y MÉTODOS Material Biológico: Se han analizado un total de 1391 animales machos pertenecientes a 55 ganaderías de la Asociación de Ganaderos de la raza Assaf (ASSAF.E). Las muestras utilizadas consistieron exclusivamente en sangre entera usando EDTA K3 como anticoagulante, extraídas y remitidas al laboratorio por técnicos de la Asociación. Extracción de ADN: Se llevó a cabo utilizando la 6100 Nucleic Acid PrepStation (Applied Biosystems), siguiendo el protocolo de extracción BloodPrepTM Chemistry y usando los reactivos recomendados por el fabricante. Previo a la extracción, las muestras de sangre se congelan a -80oC durante un mínimo de 10 minutos, para provocar la lisis celular y facilitar la liberación del ADN. Posteriormente, se incuban en estufa a 58oC durante 30min, 50µl de la muestra añadiendo 15µl de Proteinasa K y 85µl de Buffer de Digestión. Tras la incubación se añaden 600µl de Solución de Purificación, y se procede con el protocolo de extracción, en el que se realizan pasos consecutivos de purificación y lavado para eliminar los restos celulares, para acabar recogiendo el ADN mediante dos soluciones de Elución. Genotipado: Se llevó a cabo mediante la técnica denominada “primer extension analysis” (Syvanen, 1999 y Sauer et al., 2000) usando el ABI PRISM® SNaPshotTMMultiplex Kit de Applied Biosystems, lo que permitió analizar, de forma simultánea, las 4 posiciones polimórficas que condicionan los 3 codones citados. La PCR inicial se ha llevado a cabo usando los siguientes cebadores: 5’-TCAAGGTGGTAGCCACAGTCAGT-3’ y 5’CCACTCGCTCCATTATCTTGATGT-3’ lo que da lugar a la amplificación de un fragmento de 356bp del exón III (entre las bases 353 y 708 del ORF) y que incluye las 4 posiciones nucleotídicas cuyo polimorfismo se desea estudiar. Las defosforilaciones y las reacciones de “primer extensión" se realizaron según los protocolos que acompañan al ABI PRISM® SNaPshotTMMultiplex Kit de Applied Biosystems. La modificación del protocolo de análisis desarrollada en este laboratorio consiste en la inclusión, en la reacción de “primer extensión”, de dos nuevos cebadores que permiten analizar, adicionalmente a las 4 posiciones anteriores, la primera posición de los codones 136 y 171 y que, por lo tanto, permiten poner de manifiesto los alelos TRQ y ARK. Los resultados obtenidos fueron 252 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES visualizados mediante una electroforesis capilar en un 3130xl Genetic Analyzer de Applied Biosystems y la posterior lectura se llevó a cabo usando el software Genemapper® . Secuenciación de ADN: Fue llevada a cabo por el Servicio de Secuenciación de ADN de la empresa Sistemas Genómicos, S.L. de Paterna (Valencia). RESULTADOS Y DISCUSIÓN En la tabla 2 se presentan los resultados obtenidos para los 7 haplotipos analizados en el gen PRNP en los animales de la raza ovina Assaf. Se han analizado un total de 1391 animales y se han encontrado 16 genotipos diferentes de los 28 posibles para los haplotipos analizados. Se han encontrado 6 alelos diferentes ya que no ha aparecido ningún animal con el alelo TRQ. El Alelo ARK ha sido encontrado tanto en homocigosis como en heterocigosis con los demás alelos existentes en los animales analizados hasta el momento. Tabla 2. Frecuencias genotípicas y alélicas en el gen PRNP en los animales de la raza ovina Assaf analizados. Frecuencias Genotípicas Frecuencias Alélicas Genotipos Total Frecuencia Alelo Frecuencia AHQ/AHQ 5 0,00359 ARQ 0,45327 AHQ/ARH 6 0,00431 ARR 0,37383 AHQ/ARK 7 0,00503 ARH 0,07441 ARH/ARH 9 0,00647 AHQ 0,05715 ARH/ARK 19 0,01366 ARK 0,04098 ARK/ARK 7 0,00503 VRQ 0,00036 ARQ/AHQ 82 0,05895 TRQ 0,00000 ARQ/ARH 97 0,06973 ARQ/ARK 39 0,02804 ARQ/ARQ 267 0,19195 ARR/AHQ 54 0,03882 ARR/ARH 67 0,04817 ARR/ARK 35 0,02516 ARR/ARQ 509 0,36592 ARR/ARR 187 0,13444 ARR/VRQ 1 0,00072 Total 1391 Los resultados obtenidos señalan a los alelos ARQ y ARR como los más frecuentes en los animales analizados, siendo el primero alrededor de un 8% más frecuente que el segundo. Esta sería una situación intermedia entre lo que ocurre en las razas autóctonas españolas, en las que el alelo ARQ es claramente el más frecuente (sobre un 70%) y las razas ovinas explotadas en nuestro país pero no originarias de España (53,05% para ARR y 39,55% para el ARQ). La frecuencia encontrada para los alelos ARH y AHQ es algo más elevada que las 253 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES observadas en otras razas explotadas en España, y la frecuencia del alelo VRQ resultó ser considerablemente más baja en los animales analizados en este trabajo (Villalobos y Barba, 2003; Bouzada et al., 2004; Viana et al., 2004; Viana et al., 2005). El alelo ARK ha sido encontrado en estudios llevados a cabo con ovinos de distintas zonas del mundo, en Oklahoma (Desilva et al., 2003), en España (Acín et al., 2004), en Italia (Acutis et al., 2004) o en Grecia, aunque la frecuencia del alelo ARK en estos estudios es considerablemente menor al 4,1% encontrado en los animales de raza Assaf analizados. Hasta el momento no se dispone de datos concluyentes en cuanto al grado de susceptibilidad/resistencia de los animales portadores del alelo ARK frente a la enfermedad. Por lo tanto, en el grupo de animales analizados en el presente trabajo se han encontrado 107 animales (7,69% de los analizados), de los que no se dispone de información real sobre el riesgo a padecer Scrapie. Tabla 3. Frecuencia de los distintos grupos de riesgo en la raza ovina Assaf. Grupos R1 R2 R3 Genotipos ARR/ARR ARR/AHQ y AHQ/AHQ ARR/ARH, ARR/ARQ y ARQ/AHQ Nº animales 187 59 658 Proporción (%) 13,44 4,24 47,30 Susceptibilidad Muy bajo riesgo Bajo riesgo Bajo riesgo R4 AHQ/ARH, ARH/ARH, ARQ/ARH, ARQ/ARQ AHQ/VRQ y ARR/VRQ 380 27,32 Riesgo ocasional R5 ARQ/VRQ, ARH/VRQ y VRQ/VRQ 0 0,00 Alto riesgo Sin Clasificar ARK/ARK, ARR/ARK, ARQ/ARK, AHQ/ARK, ARH/ARK 107 7,69 Desconocida BIBLIOGRAFÍA ACÍN, C., MARTÍN-BURRIEL, I., GOLDMANN, W., LYAHYAI, J., MONZÓN, M., BOLEA, R., SMITH, A., RODELLAR, C. BADIOLA, J.J. Y ZARAGOZA, P. (2004). Prion protein gene polymorphisms in healty and scrapie-affected Spanish sheep. J. Gen. Virology, 85: 2103-2110. 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[email protected] [email protected] RESUMEN Los actuales programas de mejora genética y conservación de razas en peligro de extinción necesitan de métodos que permitan la identificación de los animales de manera precisa e inequívoca, así como la correcta asignación de las relaciones de parentesco. El laboratorio de Xenética Molecular de Xenética Fontao S.A. ha desarrollado un protocolo de trabajo capaz de responder a estas necesidades, optimizando la metodología empleada para conseguir una gran fiabilidad en los resultados obtenidos. Su base es el análisis de 14 marcadores microsatélite de ADN, que puede completarse con otros 6 adicionales para resolver casos complejos. Estos marcadores han sido elegidos, respectivamente, de las listas propuestas en los Tests de Comparación Internacional de ADN Ovino y Caprino 2003-04 y 2005-06 por la I.S.A.G. (Sociedad Internacional para la Genética Animal), de la cual este laboratorio es miembro institucional (Código ISAG: E/X). En este trabajo se describe la metodología empleada en el proceso de análisis, así como los resultados obtenidos en varias razas ovinas y caprinas. La probabilidad de exclusión global (PEG) resultó ser muy elevada para todas ellas, lo que permite realizar las asignaciones y exclusiones de parentesco de una manera muy fiable. PALABRAS CLAVE: mejora genética, microsatélites, probabilidad de exclusión, ISAG. ABSTRACT The current programs of genetic improvement and preservation of breeds in extinction danger need methods for the accurate and unequivocal animal identification, as well as, the correct assignment of parentage relations. The Molecular Genetic Lab of Xenética Fontao, S.A. has developed a work protocol in order to solve these needs, optimizing the applied methodology to obtain a great reliability in their results. This methodology is based on the analysis of 14 DNA microsatellite loci, which can be improved with six additional markers to solve complex cases. These markers have been chosen, respectively, among the proposed lists in the 2003-04 and 2005-06 sheep and goats DNA International Comparison Tests of I.S.A.G. (International Society for Animal Genetics), of which our Lab is an Institutional Member (ISAG Code: E/X). In this study, the methodology used in the analysis process is described, as well as the obtained results for several sheep and goat breeds. The global exclusion probability (PGE) was very high for all of them, which allows very reliable parentage assignments and exclusions. KEY WORDS: genetic improvement, microsatellites, exclusion probability, ISAG. 256 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES INTRODUCCIÓN Una necesidad fundamental de los esquemas de selección y mejora genética o de conservación de razas en peligro de extinción es disponer de un sistema preciso e inequívoco de identificación de los animales, así como la correcta asignación de las relaciones de parentesco. Esta necesidad es todavía mayor en el ganado ovino y caprino ya que, aunque se empieza a utilizar inseminación artificial con sincronización de celos, todavía es habitual el manejo en extensivo de rebaños de un número considerable de animales con monta natural libre, utilizando un número elevado de sementales. Consciente de ello, el laboratorio de Xenética Molecular de Xenética Fontao S.A. ha diseñado un protocolo de trabajo para intentar cubrir estas necesidades, teniendo en cuenta, además, que el coste debe ser asequible y los resultados deben estar disponibles en un corto espacio de tiempo, siendo, además, totalmente repetibles en otros laboratorios que sigan la nomenclatura de la ISAG (Sociedad Internacional para la Genética Animal), de la cual este laboratorio es miembro institucional (Código ISAG: E/X). La base de esta metodología de trabajo, tanto en ovinos como en caprinos, se asienta en el análisis de 14 marcadores microsatélite de ADN elegidos de la lista propuesta por la I.S.A.G., en el Test de Comparación Internacional de ADN Ovino y Caprino 2003-04. Recientemente, se han puesto a punto seis nuevos marcadores (ILSTS08, ILSTS30, INRA006, McM42, OarFCB11, TGLA53) propuestos también por la ISAG en el Test de Comparación Internacional de ADN ovino y caprino 2005-06, lo que permitirá ampliar el número de loci analizados en los casos donde no es posible excluir entre varios padres propuestos, aumentando así la probabilidad de exclusión y, por lo tanto, la capacidad del test para resolver casos de filiación complejos. En el presente trabajo se presenta la metodología de trabajo llevada a cabo en este laboratorio. Se muestran, además, los resultados obtenidos hasta estos momentos, después de haber analizado la correspondiente lista de 14 marcadores microsatélite en 3385 caprinos y 1956 ovinos de varias razas explotadas en la península Ibérica, también se indican las condiciones laboratoriales de análisis óptimas y el software diseñado para agilizar la obtención de los resultados. MATERIAL Y MÉTODOS Material Biológico: Se han analizado un total de 5341 animales, 1956 pertenecientes a 4 razas ovinas y 3385 a 3 razas caprinas explotadas en la península Ibérica. Los animales presentan amplia distribución de edades, pertenecen a ambos sexos y están inscritos en los Libros Genealógicos de las correspondientes razas. Las muestras estuvieron constituidas, mayoritariamente, por sangre entera y fueron recogidas en tubos estériles con anticoagulante EDTAK3. Alguna de las asociaciones remitentes de muestras ha optado por el envío de raíces de pelo o lana y, en algún caso, se han recibido muestras de suero sanguíneo, semen o pabellón auditivo. Extracción de ADN: Se llevó a cabo utilizando la 6100 Nucleic Acid PrepStation (Applied Biosystems), siguiendo el protocolo de extracción BloodPrepTM Chemistry o NucPrepTM Chemistry, según el tipo de muestra y usando los reactivos recomendados por el fabricante. En el caso de muestras de sangre entera, previo a la extracción, estas se congelan a -80oC, durante un mínimo de 10 minutos, para provocar la lisis celular y facilitar la liberación del ADN. Posteriormente se incuban, a 58ºC durante 30 minutos, 50µl de la muestra añadiendo 257 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES 15µl de Proteinasa K y 85µl de Buffer de Digestión. Tras la incubación se añaden 600µl de Solución de Purificación, y se continúa con el protocolo de extracción, en el que se realizan pasos consecutivos de purificación y lavado para eliminar los restos celulares, para acabar recogiendo el ADN mediante dos soluciones de Elución. Amplificación de secuencias: Se han diseñado dos reacciones de PCR multiplex, una para caprinos y otra para ovinos en las que se amplifican simultáneamente 14 loci microsatélite utilizando el Qiagen® Multiplex PCR kit suministrado por Qiagen® en un GeneAmp® PCR system 9700 de Applied Biosystems. Los loci amplificados en caprinos son los siguientes: BM1258, CSRD247, HSC, ILSTS19, ILSTS87, INRA005, INRA023, INRA063, MAF65, McM527, OarFCB20, SRCRSP5, SRCRSP8 y SRCRSP23. En la PCR múltiplex de ovinos se amplifican los loci: BM1258, CSRD247, HSC, INRA023, INRA063, MAF65, MAF214, McM527, OarAE129, OarCP49, OarFCB20, OarFCB304, SPS113 y SPS115. Todos estos marcadores han sido elegidos de la lista propuesta por la I.S.A.G. en el Test de Comparación Internacional de ADN Ovino y Caprino 2003-04. Recientemente se ha puesto a punto una nueva reacción de PCR múltiplex con 6 nuevos loci microsatélite (ILSTS08, ILSTS030, INRA006, McM42, OarFCB11 y TGLA53), propuestos, en este caso, por la ISAG en el Test de Comparación Internacional de ADN ovino y caprino 2005-06 y que completa los anteriores paneles en los casos que sea necesario una mayor capacidad de exclusión. Las condiciones de amplificación son las que se describen en http://www.isag.org.uk/pdf/2005_PanelsMarkersSheepGoats.pdf. Tabla 1: Marcadores microsatélite utilizados, marcaje empleado y rango alélico encontrado. Loci INRA005 ILSTS19 CSRD247 SRCRSP23 ILSTS87 INRA063 HSC BM1258 SRCRSP5 SRCRSP8 OarFCB20 MAF65 McM527 INRA023 Caprino Marcaje VIC VIC VIC 6-FAM 6-FAM 6-FAM 6-FAM NED NED NED PET PET PET PET Rango 113-123 142-154 216-240 77-107 133-151 169-181 270-298 96-124 163-181 212-244 93-107 117-141 152-170 195-215 Loci OarCP49 OarFCB304 CSRD247 SPS113 INRA063 SPS115 HSC BM1258 OarAE129 MAF214 OarFCB20 MAF65 McM527 INRA023 Ovino Marcaje VIC VIC VIC 6-FAM 6-FAM 6-FAM 6-FAM NED NED NED PET PET PET PET Rango 74-132 146-192 205-257 126-154 167-217 237-253 263-297 98-130 135-161 183-267 87-119 121-145 158-180 199-220 Loci INRA006 ILSTS08 Panel Auxiliar Marcaje VIC VIC Rango 100-144 150-190 6-FAM 122-144 McM42 ILSTS30 NED NED 70-100 140-180 TGLA53 PET 147-197 OarFCB11 Análisis de los polimorfismos: Se llevó a cabo mediante electroforesis capilar de fragmentos de ADN marcados por fluorescencia, en el analizador genético ABI Prism® 3130xl Genetic Analyzer, empleando el software de análisis GeneMapper™ de Applied Biosystems. Base de datos: Las propuestas de análisis recibidas y los resultados obtenidos del análisis de polimorfismos son, directamente, incorporados en una base de datos diseñada específicamente donde se realizan de manera automática las exclusiones de paternidad. La base de datos permite, además, la posibilidad de buscar posibles madres o padres compatibles, además de los propuestos inicialmente por el ganadero. Esta búsqueda se 258 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES puede hacer entre todos los animales hembra o macho, según el caso, existentes en la base de datos o limitando la búsqueda a solo animales pertenecientes a la misma ganadería. Estudios estadísticos: Se estudiaron los siguientes parámetros de variabilidad: Heterocigosidad (H) (Ott, 1992), Contenido de Información Polimórfica (PIC), calculado según la fórmula de Botstein et al., (1980), Probabilidad de Exclusión de cada marcador (PE) según la expresión propuesta por Jamieson y Taylor (1997) y global (PEG) del conjunto de los 14 marcadores utilizados. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En las tablas 2 y 3 se presentan los resultados generales para cada uno de los 14 loci microsatélite analizados en las especies caprina y ovina respectivamente. Se observa que, en las dos especies, todos los marcadores elegidos presentan valores de PIC (Contenido en Información Polimórfica) superiores a 0,5, lo que los hace altamente informativos. Los 14 marcadores utilizados en la especie caprina presentan una probabilidad de exclusión global (PEG) del 99,9989% (la mayor probabilidad de exclusión individual la proporciona el SRCRSP23, microsatélite que a su vez presentó el mayor número de alelos, y la menor el INRA005, que une a su bajo número de alelos al hecho de que uno de ellos presente una frecuencia próxima al 60%). El número medio de alelos para las secuencias estudiadas es de 10 (con unos valores que oscilan entre los 6 encontrados en el INRA005 y el ILSTS19 y los 16 del SRCRSP23). Estos valores son superiores a los encontrados en trabajos similares, aunque analizando un número menor de animales, realizados en algunas razas caprinas explotadas en España. En ellos se citan números promedio de alelos de 6,95 en la raza caprina Majorera (Acosta et al., 2005), de 8,22 en la Blanca Andaluza (Martínez et al., 2004) o de 8,67 (Viana et al., 2004a), 8,32 (Martínez et al., 2005ª), o 9,79 (Bouzada et al., 2005) en la Murciano-Granadina, utilizando paneles en los que se incluyen algunos de los marcadores que se analizan en el presente estudio. Los valores encontrados son también superiores a los publicados para 12 razas caprinas chinas (Li et al., 2002) con un promedio de 6,90 alelos en cada una ellas. 259 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Tabla 2. Resultados obtenidos en los loci microsatélite analizados en animales de raza caprina Locus Nº de alelos Rango H PIC PE BM1258 14 96-124 0,8286 0,8074 0,6628 CSRD247 7 216-240 0,7760 0,7413 0,5645 HSC 15 270-298 0,8886 0,8762 0,7723 ILSTS19 6 142-154 0,6367 0,6030 0,4205 ILSTS87 10 133-151 0,6734 0,6433 0,4685 INRA005 6 113-123 0,6067 0,5684 0,3832 INRA023 11 195-215 0,8364 0,8153 0,6721 INRA063 7 169-181 0,6733 0,6283 0,4348 MAF65 13 117-141 0,7809 0,7540 0,5959 McM527 8 152-170 0,6628 0,6109 0,4150 OarFCB20 7 93-107 0,5594 0,5251 0,3455 SRCRSP5 9 163-181 0,7513 0,7160 0,5390 SRCRSP8 11 212-244 0,6940 0,6528 0,4643 SRCRSP23 16 77-107 0,8801 0,8683 0,7584 Media: 10 0,73186 0,70072 PEG: 0,9999891 H: Heterocigosidad, PIC: Contenido de información polimórfica, PE: Probabilidad de exclusión, PEG: Probabilidad de exclusión global. 260 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Tabla 3. Resultados obtenidos en los loci microsatélite analizados en animales de raza ovina Locus Nº de alelos Rango H PIC PE BM1258 12 98-130 0,7725 0,7437 0,5778 CSRD247 20 205-257 0,8399 0,8234 0,6925 HSC 20 263-297 0,8675 0,8564 0,7452 INRA023 15 190-220 0,8577 0,8420 0,7160 INRA063 19 167-217 0,7819 0,7544 0,5933 MAF65 12 121-145 0,7665 0,7285 0,5463 MAF214 19 183-267 0,6976 0,6629 0,4834 McM527 12 158-180 0,8121 0,7861 0,6293 OarAE129 6 135-161 0,6575 0,5850 0,3674 OarCP49 25 74-132 0,8547 0,8402 0,7177 OarFCB20 13 87-119 0,8732 0,8598 0,7432 OarFCB304 25 146-192 0,8108 0,7918 0,6481 SPS113 12 126-154 0,7660 0,7307 0,5550 SPS115 13 237-253 0,8201 0,7957 0,6420 Media: 15,93 0,69629 0,67657 PEG:0,9999991 H: Heterocigosidad, PIC: Contenido de información polimórfica, PE: Probabilidad de exclusión, PEG: Probabilidad de exclusión global. En el caso de la especie ovina, los 14 marcadores utilizados proporcionan una probabilidad de exclusión global del 99,9999% (la mayor probabilidad de exclusión individual la proporciona el HSC y OarFCB20, microsatélites con un número de alelos próximo a la 261 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES media y la menor el OarAE129, que presenta solo 6 alelos). El grado de polimorfismo encontrado en los loci analizados es elevado, con un número medio de alelos de 15,93 (los valores oscilan entre los 6 encontrados en el OarAE129 y los 25 OarCP49 y OarFCB304). En trabajos realizados en otras razas ovinas explotadas en España se han encontrado números promedio de alelos de 7,04 en la raza ovina Palmera (Martínez el al., 2005b), de 13,64 en la Ovella Galega (Viana et al., 2004b) o de 8 en la raza Merina y 5,23 en la raza Churra Lebrijana (Zamorano et al., 1998) utilizando varios de los marcadores empleados en este estudio y analizando un número menor de individuos. Los marcadores elegidos, tanto en el panel de caprinos, como en el de ovinos, presentan una elevada capacidad de exclusión, lo que los hace muy útiles a la hora controlar las genealogías en estas dos especies, algo fundamental en los esquemas tanto de selección y mejora genética como de conservación de razas en peligro de extinción Los marcadores utilizados (elegidos de las listas de la I.S.A.G.) presentan además la ventaja de que permiten compartir y comparar los resultados obtenidos con los que se obtengan, para ésta u otras razas ovinas y caprinas, en cualquier laboratorio I.S.A.G., que se haya sometido a los Test de Comparación Internacional de Ovinos y Caprinos. A pesar de la alta capacidad de exclusión que ofrecen los paneles propuestos para la especie caprina y la ovina se han encontrado un reducido número de casos en los cuales no es posible excluir entre dos o más posibles progenitores. Para poder resolver estos casos hemos intentado aumentar la capacidad de exclusión con la puesta a punto de un panel adicional con 6 marcadores microsatélite (ILSTS08, ILSTS030, INRA006, McM42, OarFCB11 y TGLA53), elegidos de la lista propuestas por la ISAG en el Test de Comparación Internacional de Ovinos y Caprinos del año 2005/06. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ACOSTA, J.M., MARTÍNEZ, A.M., PESTANO, J., CABELLO, A., BROWN, R.P., SARAH-REY, S. Y DELGADO, J.V. (2005). Caracterización genética de la cabra Majorera de Fuerteventura con Microsatélites. Arch. Zootec., 54: 261-266. BOTSTEIN, D., WHITE, M., SKOLNIK, M. Y DAWIS, R.W. (1980). Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. American Journal of Human Genetics, 32: 314-331. BOUZADA, J.A., PRADO, C., AREÁN, H., MUÍÑO, R., LÓPEZ, M., FERNÁNDEZ, A., CANALS, A., CASTILLO, J. Y VIANA, J.L. (2005). 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MARTÍNEZ, A.M., VEGA-PLA, J.L., LOZANO, J.M., CARRERA, M.P., ACOSTA, J.M., Y CABELLO, A. (2005a). Caracterización genética de la cabra Murciano-Granadina con microsatélites. Arch. Zootec., 54: 327-331. MARTÍNEZ, A.M., VEGA-PLA, J.L., BRAVO, M.J., BARBA, C., CARABALLO, J. Y DELGADO, J.V. (2005b). Caracterización genética de la oveja Palmera con microsatélites. Arch. Zootec., 54: 363-367. OTT, J. (1992). Strategies for characterizing highly polymorphic markers in human gene mapping. Am. J. Hum. Gen., 51: 283-290. VIANA, J.L., BOUZADA, J.A., PRADO, C., AREÁN, H., MUIÑO, R., LÓPEZ, M., CANALS, A., CASTILLO, J. y FERNÁNDEZ, A. (2004a). Control genealógico en la raza caprina Murciano-Granadina mediante análisis de microsatélites de ADN. IV Congreso ibérico sobre recursos genéticos animales. VIANA, J.L., BOUZADA, J.A., PRADO, C., ADÁN, S., FEIJOO, J.B., FERNÁNDEZ, M., RIVERO, G. y FERNÁNDEZ, A. (2004b). Aplicación del análisis de diferentes marcadores moleculares en el plan de conservación de la raza ovina Ovella Galega. XXIX Jornadas científicas y VIII internacionales de la Sociedad Española de Ovinotecnia y Caprinotecnia, 374-375. ZAMORANO, M.J., RUITER, J., TOWNSEND, S., CRUICKSHANK, R., BRUFORD, M., BYRME, K., RODERO, A. Y VEGA-PLA, J.L. (1998). Polimorfismos de DNA en las razas ovinas Merino y Churra Lebrijana. Arch. Zootec. 47: 267-272. 263 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES SUPEROVULATION RESPONSE AND EMBRYO RECOVERY OF DONOR DOES BOER RACE IN EMBRYOTRANSFER PROCEDURES GRIZELJ, J.¹, VINCE, S.¹, TOMAŠKOVIĆ, A.¹, BARIL, G.², MAKEK, Z.¹, GETZ, I.¹, ðURIČIĆ, D.³, PRVANOVIĆ, N.¹, SAMARDŽIJA, M.¹ ¹Clinic for obstetrics and reproduccion, Veterinary College, University of Zagreb, Heinzelova 55, 10 000 Zagreb, Croatia ²INRA Tours, 37 380 Nouzilly, France ³Veterinary Practice ðurñevac d.o.o., Malinov trg 7, 48 350 ðurñevac, Croatia KEY WORDS: goat, embryo, superovulation, collection ABSTRACT This article examined the technique of in vivo production of goat embryos as well as the obstacles associated with those procedures. The goal of a superovulation treatement is to increase the genetic influence of valuable does by the system «mother-daughter». This treatement reduces the transporting costs of genetic material, quarantine and the risk of disease transmission (1). The techniques of superovulation as well as the transfer of embryos should significantly contribute to the build-up of the genetically superior flocks. Although, only a small number of does were treated, this technique along with the freezing and transferring of obtained embryos should contribute significantly to the genetic improvement of the flocks. These can be applied in the near future due to commerical and sanitary reasons and should encourage further studies. INTRODUCTION The basic goal of a superovulation treatement to donor does and thereafter the transfer at the preimplant stage of the embryo into the previously prepared recipient is to increase the genetic influence of valuble does by the system «mother-daughter» as one doe, in the traditional system of husbandry, kid only 2 goatlings per year, all together 6 or 8 during whole life. Although, the procedures of transfer are less developed and much less practiced than in the cow industry, this possibility considerably reduces the costs of (international) transport of genetic material, quarantine, the sanitary risk of disease transmission, and particularly the problems of aclimatization (climatic, alimentary and sanitary) (2). It is established that the embryos in the morula and blastocyst stage contain zona pellucida which presents the natural barrier for disease transmission (2). The techniques of superovulation as well as the transfer of embryos should significantly contribute to the building-up of the genetically superior flocks of goats with controlled disease transmission. PREPARATION OF DONOR DOES Boer does were superovulated with the following procedure: Day 0 (D0) - donor does were hormonally treated by inserting the vaginal sponges (chronogest, 40mg of cronolone - flugestone acetate) with steroid progestative action through 11 days. D9 start of superovulation pFSH treatement i/m in decreasing doses. 264 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES For pFSH treatement 200mg of Folltropin – V (Vetrepharm, Canada) was used for each doe and divided into 6 parts in decreasing concentration and applied at 12 hours intervals. Thus, doses were 2 times 50mg pFSH for the D9 and 2 times 25mg for the D10 and D11 as well. At the same time with the first application of pFSH (D9), 50µg of cloprostenol (0,2mL Estrumate) was applied as well. As alternative to Folltropine – V it is possible to use Stimufol (Merial, France) which contains 40% of LH action. Folltropin – V is a purified porcine FSH with a very low content of LH. D12 (D0) detection of oestrus 24 hours after removing the vaginal sponges. Does are «hand-mated» (presented one by one to the buck) if the he-goat was accepted. If rejection occurs, hand-mating is attempted every 4 hours for the does not observed in oestrus earlier. The next morning (D13) hand mating is repeated if doe is still in oestrus. COLLECTION OF EMBRYOS 7 days after the first mating (D7) laparotomyc lavage of the uterus is performed. Donor does are subjected to an alimentar and hydric diet 24h before the collection. The anesthetic procedure is performed by application of xylazine 0,11mg/kg i/m; 10min later ketamine 5,5mg/kg i/m. Donor does are positioned in dorsal recumbent, inclinated anteroposterior from 30 to 45º, medioventral laparotomy is performed with a 10cm incision. The uterus and ovaries are exteriorised, the number of corpora lutea is counted and punction of the basis (at the level of the lig. intercornualis) and tip of the horn (close to the junction utero-tubarica) is performed. The lavage of each horn is performed by retrograde perfusion of 40mL of PBS + 2g/L BSA + 50mg/L Kanamycin. During the lavage, the horn is slightly massaged. The obtained liquid is searched, thereafter, the embryos are evaluated and then transfered into the prepared recipient does or freezed. RESULTS Our research was carried out as a part of a pilot project of cryopreservation of goat embryos. Three goats and one buck Boer race were included. Goats responded with 16 ovulations on average, and the success of lavages were 89,6% (43/48CL). One out of three goats suffered early luteolysis, although the vaginal sponge were inserted 3 days after the occurence of oestrus. Nevertheless 4 retarded morulas and 15 unfertilized ovocytes were found. From the other two goats 24 embryos were recovered (13 morulas, 3 early blastocysts, 2 blastocysts, 5 expanded blastocysts and 1 hatched blastocyst), all transferable. IMPORTANT FACTORS The first ovulations occure 62±6h after removing the sponge, and about 12h elapse between the first and the last ovulation (3). The embryos enter uterus from the 4th day and onward (2). The legislation requirements due to sanitary reasons are to transfer the embryos before the hatching, which occurs from 265 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES the 8th day onward (2). When freezing the goat embryos, it is recommended to lavage the uterus on the 7th day because the blastocysts (and morulas) support the procedure well (4). With this treatment, does will, on average, have 14 ovulations (from 0 to 40) of which 11 will be fertilized, 7 will be transferable, and finally 4 goatlings delivered, if transfer is performed immediately or 3 if the embryos are freezed before being transfered (1). Also to be considered is the occurence of partial or total early luteolysis of corpora lutea in 10-35% of does (1), which as a consequence has a big percentage of retarded and degenerated, non - transferable embryos. Sometimes the consequences of that phenomenon could be minimized by insertion of vaginal sponges 2,5 or 3 days after the occurence of oestrus (D3) and maintained till the moment of lavage. On the other hand, induction of superovulation by pFSH treatement will, after the 3rd or 4th treatement, evoke a decreased ovulatory response because of the occurence of anti pFSH antibodies in 70-80% of does (2). Nevertheless, repetitive use of oFSH will not provoke a decreased ovulatory response, but, commercially available oFSH (Ovagen, ICP, New Zealand) has a great variability among different lots. Consecutive lavages of uterus are less successful because of growths that appeared in the uterus and on the ovaries which compromise the fertility and the success of lavage (3). The next treatement should be performed after a minimum of 2 months; or 5 months, if kidding has ocurred (2). Although, only a small number of does were treated, this technique along with the freezing and transfering of obtained embryos should contribute significantly to the genetic improvement of flocks and would have commercial and sanitary reasons for application in the near future and should encourage further studies. REFERENCES Chemineau P, Baril G, Leboeuf B, et al. Implications des progres recents en physiologie de la reproduction pour la conduite de la reproduction dans l'espece caprine. INRA Prod.Anim. 1999; 12(2): 135-146. Baril G, Brebion P, Chesne P. Manual de formacion practica para el transplante de embriones en ovejas y cabras. Cuadernos tecnicos de la FAO. Estudios FAO: Produccion y sanidad animal. Rome, Italy, 1995 Cognie Y, Baril G. Le point sur la production et le transfert d'embryons obtenus in vivo et in vitro chez la brebis et la chevre. INRA Prod.Anim. 2002; 15(3): 199-207. Cognie Y, Baril G, Poulin N, et al. Current status of embryo technologies in sheep and goat. Theriogenology. 2003; 59: 171-188. Grizelj, J., Vince, S., Tomašković, A., et al. Hormonal treatements of donor does in embryotransfer procedures. Proceedings 7th Middle European Buiatric Congress, Radenci, Slovenia, 23-25. 266 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES FUNCIÓN DE LAS GLICOPROTEÍNAS ASOCIADAS A LA GESTACIÓN (PAGs) Y PROGESTERONA EN DIAGNÓSTICO PRECOZ DE LA GESTACIÓN Y MORTALIDAD EMBRIONARIA PRECOZ EN VACAS ROLE OF PREGNANCY ASSOCIATED GLYCOPROTEINS (PAG) AND PROGESTERONE IN EARLY PREGNANCY DIAGNOSIS AND EARLY EMBRIONIC MORTALITY IN COWS PRVANOVIC, N.¹*, BECKERS, J.F.², SULON, J.², TOMASKOVIC, A.¹, CERGOLJ, M.¹, DOBRANIC, T.¹, GRIZELJ, J.¹, SAMARDZIJA, M.¹, KOCILA, P.³ ¹Clinic for obstetrics and reproduction, Faculty of Veterinary Medicine, University of Zagreb, Heinzelova 55, 10000 Zagreb, Croatia ²Department of Animal Endocrinology and Reproduction, Faculty of Veterinary Medicine, University of Liege, Belgium ³Veterinary Practice Cakovec, R. Steinera 7, 40000 Cakovec, Croatia *contact person. Email: [email protected], Tel: 385 1 2390 323, Fax: 385 1 2390 320 ABSTRACT The aim of this study was to investigate the role of pregnancy associated glycoproteins (PAG) and progesterone in early pregnancy physiology in cows as well as possibility of using PAG as diagnostic tool in diagnosis of embrionic mortality. In our research we used 74 cows of simmental breed aged 3-7 years, already used in reproduction and calved every year. We divided cows in 3 groups: pregnant cows (n=30), nonpregnant cows (n=20) and cows experienced embrionic mortality (n=24). According to ultrasound (17 and 35 days after AI) and laboratory findings for progesteron and PAG in sera samples collected between 12. and 45. days after AI every 72 h, we concluded: It is impossible to determine embrionic mortality on basis of progesterone profil, but it is easy to distinguish pregnant from nonpregnant cows, if cows are supposed to be pregnant more than 21 day. In group of cows with embryonic mortality, it occured 17-24 days after conception in 98% cows. It was visible in drastic decrease of PAG 7,5-9 days later (7,5-9 days consists T2 for PAG in first month of pregnancy). Using PAG for pregnancy diagnosis enables us to prove existence of alive vital embryo in uterus 24 days after conception. RESUMEN Este artículo examina la función de las glicoproteínas asociadas a la gestación (PAGs) y progesterona en fisiología precoz de la gestación en vacas. También trata la posibilidad de utilizar PAGs como herramienta de diagnóstico en la mortalidad embrionaria precoz. Nuestra investigación incluyó 74 vacas Simenthal, de 3-7 años de edad, ya utilizadas en reproducción y paridas cada año. Las vacas fueron divididas en 3 grupos: vacas gravidas (n=30), vacas no gravidas (n=20) y vacas que sufrieron mortalidad embrionaria precoz (n=24). Según los resultados de las pruebas de ultrasonido (17 y 35 días después del IA) y de las comprobaciones en laboratorio de cada 3 días de suero para progesterona y PAGs (entre 12 y 45 días después del IA) concluimos: 267 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Es imposible determinar la mortalidad embrionaria precoz solamente con un perfil de progesterona. En cambio, es fácil distinguir vacas gravidas de las que no lo están, si la gestación dura más de 21 días. En el tercer grupo de vacas, la mortalidad embrionaria precoz se dio en el 98% de los casos entre 17-24 días después de la concepción. Se dio una visible disminución drástica de PAGs 7,5-9 días después (T2 de PAGs en el primer mes de gestación son 7,5-9 días). El uso de PAGs como diagnóstico de gestación nos permite mostrar la existencia de un embrión vivo y vital 24 días después de la concepción. INTRODUCTION Pregnancy associated glycoprotein has been found in the serum of pregnant cattle and used as a pregnancy marker (Perenyi, 2002). As pregnancy failure occurs, PAG concentrations dropped and disappeared from maternal blood. Sequential assays of these proteins between day 24 and term are useful for studying the course of pregnancy, although it does not allow discrimination between early embryonic mortality and non-fertilization (Mialon et al., 1993). As PAG molecules are the products of the trophoblastic cells, it was suggested that their determination in maternal blood can be useful for prediction of fetal well-being and help to detect early placental abnormalities, embryonic mortality or abortion (Ectors et al., 1996.). Heifers expressing pregnancy failure between days 16 and 35 after AI have shown wide variation in pregnancy specific protein 60 (PSP60) concentrations at days 28 and 35. This phenomenon was explained by the variation in the time of embryo death (Mialon et al., 1993). This author reported some cases where at day 50 ultrasonic scanning and signs of oestrus indicated that the embryo was already dead, however till this day the PSP60 concentrations were increasing. Decreasing PSP60 concentrations were observed in some animals before day 50, were according to ultrasonic examination, the conceptus was still alive. Pregnancy specific protein B ( BPSPB) test in conjunction with milk progesterone test was used to determine the time of the embryonic death (Humblot et al., 1988). In most of the early failures an elevation in the PSPB concentrations was not detectable, or only after day 24. No coefficient of correlation between PSPB and progesterone concentration was significant at any days of gestation studied. Significant difference was found in the rate of mean PSPB levels between pregnant cows and cows showing late embryonic mortality between days 24 and 30-35 after AI. In their study it was not possible to predict the occurrence of embryonic mortality. After invitro production of embryos or cloning, the PAG follow up in plasma samples collected weekly was able to monitor embryonic or fetal mortality (Ectors et al., 1996, 1997). In that studies it was concluded that significantly increased PSP60 levels could indicate abnormal placental development. In veterinary practice, PAG and PSPB RIAs in biological fluids are helpful to confirm clinical diagnoses established by ultrasonography (Szenci et al., 1998.) Cows presenting an initial positive and then negative ultrasonographic diagnosis expressed decreasing PAG concentrations (Szenci et al., 1998) The high progesterone and PAG concentrations confirmed the presence of a live conceptus ansd a functional corpus luteum at the time of the first ultrasonographic examination. After the time of embryonic mortality occurred, the PAG levels had already decreased, while progesterone concentrations have shown that the 268 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES corpus luteum was maintained in three of four cases. Following embryonic mortality using ultrasonography, PAG and PSPB concentrations decreased steadily, in one animal these protein concentrations did not reach the threshold level (Szenci et al., 1998). Mentioned authors were able to diagnose late embryonic and fetal mortality cases retrospectively in seven cows using PSPB RIA test and in four cows using PAG RIA test (Szenci et al., 2000). Because of the large individual variations in PAG concentrations in maternal blood, only the marked decrease or disappearance in serum/plasma concentrations of these proteins can be a no controversial, predictive sign of embryonic or fetal death. MATERIAL AND METHODS Our research included 74 simmental cows, 3-7 years old, which were regularly used in reproduction and calved every year. According to ultrasound findings (17. and 35. day after artificial insemination; AI) the cows were divided in 3 groups: pregnant cows (n=30), nonpregnant cows (n=20) and cows suffered embryonic mortality (n=24). Cows which were suspect to be pregnant by both examinations were divided into pregnant group. Cows who were considered to be pregnant according to first ultrasound finding and nonpregnant according to the last were divided into embryonic mortality group. Cows considered to be nonpregnant by both ultrasound findings were divided into nonpregnant group. Blood samples were collected every 72 hours between 12. and 45. day after AI and level of progesterone and pregnancy associated glycoproteins (PAG) were determined. We used double RIA assay to determine level of PAG according to method described by Zoli (1992) and modified by Beckers (1995). Sensitivity and specificity of method consisted 80%. Level of progesterone was determined using ELISA method and Ovuchek commercial kits (Biomedica). Sensitivity and specificity of method consisted 86%. RESULTS Table 1: Middle values for PAG level in blood from day 12 till day 45 after AI every 72 h for all groups Number of sampling 1 2 3 4 5 Pregnant cows 0,894656 1,453688 2,103688 2,700969 3,520063 Embryonic mortality 1,115524 0,905095 0,577143 0,41981 0,405 Nonpregnant cows 0,011167 0,019889 0,006222 0 0 269 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Kretanje koncentracije PAG od 24. do 45. dana nakon UO za sve skupine krava 4 ng/ml 3 gravidne krave 2 embrionalna smrtnost negravidne krave 1 0 1 2 3 4 5 broj uzorka Table 2: Middle values for progesterone level in blood at day 12., 21. and 35 after AI Number of sampling 1 2 3 Pregnant cows 6,379625 7,587156 8,869406 Embryonic mortality 1,115524 0,905095 0,577143 Nonpregnant cows 3,761444 1,019222 4,108048 Razina progesterona u svih skupina krava 15., 21. i 35. dan nakon UO 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 gravidne krave embrionalna smrtnost negravidne krave 1 2 3 CONCLUSIONS According to ultrasound (17 and 35 days after AI) and laboratory findings for progesteron and PAG in sera samples collected between 12. and 45. days after AI every 72 h, we concluded: It is impossible to determine embrionic mortality on basis of progesterone profil, but it is easy to distinguish pregnant from nonpregnant cows, if cows are supposed to be pregnant more than 21 day. In group of cows with embryonic mortality, it occured 17-24 days after conception in 98% cows. It was visible in drastic decrease of PAG 7,5-9 days later (7,5-9 days consists T2 for PAG in first month of pregnancy). Using PAG for pregnancy diagnosis enables us to prove existence of alive vital embryo in uterus 24 days after conception. 270 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES REFERENCES Ectors FJ, Drion PV, Delval A, Smith LC, Sulon J, Zaaier D, Szenci O, Remy B, Beckers JF, Ectors F (1996): Interests of pregnancy follow up in cows after embryo transfer special focusing on IVP/NT origin; 12th Annual Meeting of AETE, Proceedings, pp 95-102 Ectors FJ; Sulon J, Delval A, Remy B, Drion PV, Beckers JF, (1997): Bovine pregnancy associated glycoprotein profiles as indicators of trophoblastic function after invitro manipulation or culture; 30th Conference of Physiology and Pathology of reproduction 32:pp1-13 Humblot P, Camous S, Martal J, Charlery J, Jeanguyot N, Thibier M, Sasser RG (1988): Pregnancy specific protein B, progesterone concentrations and embryonic mortality during early pregnancy in dairy cows, J. Reprod. 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Dipartimento di Biologia Animale, Università degli Studi di Sassari KEY WORDS: Sheep, reproduction activity, lactation ABSTRACT With the aim of evaluate the effect of lambing date on the resumption of reproductive activity, induced by male effect, 100 pluriparous Sarda ewes were examinated. The animals were divided in 5 groups, with 20 subject each, from A to E, depending on lambing month, from December to April. On 1st of June males were introduced, and every week for 8 consecutive weeks, a blood sample was taken for measuring progesterone levels with ELISA method. The 80% of the ewes who lambed in December, January and February (groups A, B and C) has shown the reproductive activity within the first month after males introduction. The 35% of the ewe who lambed in March has shown sexual activity at 42nd day, while the 80% has been reached only at 49 days after observations started. Among the animals of the E group only 40% showed reproductive activity within 56th day. Confronting all groups it has been evidenced a statistically significant difference (P<0.01) among the animals who lambed from December to February and those who lambed in the subsequent months. INTRODUZIONE L’attività riproduttiva degli ovini presenta un andamento stagionale fortemente legato all’evoluzione del fotoperiodo (Thiéry et al., 2002). Infatti la diminuzione delle ore di luce determina la ripresa dell’attività sessuale e questo fa si che il parto avvenga in Primavera, momento più propizio per la crescita dell’agnello (Bittman et al., 1983; Chemineau et al., 1988). Questo legame dell’attività riproduttiva con l’alternanza luce/buio è molto manifesto nelle razze che vivono ad alte latitudini dove il clima è molto rigido e la durata della stagione temperata è alquanto modesta e quindi il parto deve avvenire in un arco di tempo abbastanza stretto per consentire la sopravvivenza della prole (Malpaux et al., 2001). Nelle aree Mediterranee, invece, essendo il clima abbastanza temperato, il legame con il fotoperiodo è meno stretto e perciò il periodo delle manifestazioni riproduttive è considerevolmente più lungo. Di conseguenza l’anaestro ha una durata di circa 300 giorni in alcune razze di ovini che vivono in vicinanza dei poli, mentre in quelle residenti alle nostre latitudini tale periodo ha la durata di circa 50 giorni (Chemineau et al., 1995). Questo stadio di riposo sessuale è contraddistinto nelle pecore da una diminuzione della secrezione delle gonadotropine ipofisarie, che appunto non sono in grado di stimolare il ciclo ovarico, e dalla mancanza del comportamento riproduttivo. Tuttavia, nelle razze ovine da latte, come quella Sarda, il parto in Primavera non consente un lungo periodo di lattazione per l’innalzamento estivo della temperatura ambientale. Questo fatto, oltre a determinare la scomparsa dell’erba verde naturale, e quindi lo scadimento del pascolo, causa anche una riduzione del metabolismo per motivi di termoregolazione, conducendo la pecora 272 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES all’asciutta. Quindi, il periodo migliore per poter avere i parti è l’Autunno quando appunto le condizioni climatiche e di pascolo sono favorevoli per l’instaurarsi della lattazione. Infatti, nell’allevamento ovino sardo, attraverso l’utilizzo del flushing in combinazione con l’effetto maschio, si è riusciti ad ottenere un alto numero di animali che partoriscono tra Settembre e Dicembre e perciò poco sensibili al fotoperiodo (Carcangiu e Vacca, 2005). Tuttavia, un certo numero di animali presentano l’attività riproduttiva tra i mesi di Settembre e Novembre con i parti in Primavera. Questo comportamento oltre che ridurre i mesi di produzione lattea potrebbe condurre anche ad un ritardo nella ripresa dell’attività ciclica determinato dalla fase crescente della lattazione. Pertanto, lo scopo del presente studio è quello di verificare quanto il momento del parto può influenzare la ripresa dell’attività riproduttiva, indotta con l’effetto maschio, in pecore di razza Sarda. MATERIALI E METODI La ricerca è stata condotta in un allevamento di circa 600 ovini di razza Sarda situato nel centro Sardegna. L’azienda di tipo moderno, con diversi stabili e attrezzature di alto livello tecnologico, aveva una estensione di circa 50 ha dei quali 10 irrigui. Gli animali venivano alimentati con circa 400 g di mangime concentrato che conteneva il 16 % di proteine e 10,5 MJ di energia metabolizzabile per Kg di sostanza secca, suddiviso in due somministrazioni giornaliere; il fieno e l’acqua erano ad libitum. Durante il giorno le pecore andavano al pascolo su erbaio polifitico. Per lo studio sono state scelte 100 pecore pluripare che venivano identificate al momento del parto con un collare numerato e attraverso il numero tatuato sull’orecchio. Gli animali sono stati suddivisi in 5 Gruppi di 20 soggetti ciascuno in base al mese di parto: gruppo A con parto a Dicembre, gruppo B a Gennaio; gruppo C a Febbraio; gruppo D a Marzo e il Gruppo E ad Aprile. Gli agnelli sono stati allontanati dalle madri dopo 20 giorni dalla nascita. Il primo di Giugno sono stati inseriti i maschi, di provata fertilità, nel gregge e registrati gli accoppiamenti. A partire dal 1° di Giugno e fino al 26 Luglio, a cadenza settimanale sono stati eseguiti prelievi ematici per il dosaggio del progesterone. Inoltre, veniva registrato il BCS e le produzioni di ogni animale all’inizio dell’osservazione. Le pecore avevano partorito regolarmente e durante il periodo della prova si sono mantenute in ottimo stato di salute. Il progesterone è stato analizzato con metodica ELISA (assay design, Michigan , USA). I dati ottenuti sono stati sottoposti ad analisi statistica. RISULTATI E DISCUSSIONE La ripresa dell’attività riproduttiva delle pecore del gruppo A, B, C, si è manifestata già dal secondo rilievo, e perciò a 7 giorni dall’inizio della prova, raggiungendo l’80% degli animali ciclici a 28 giorni (Tabella 1). In questi tre gruppi la totalità degli animali si è riprodotta entro i 40 giorni dall’inizio delle osservazioni. Il gruppo D, invece, ha presentato la ripresa dell’attività riproduttiva a 28 giorni dall’inizio delle osservazioni e alla fine delle osservazioni il 90 % aveva manifestato il ciclo sessuale. Il gruppo E è risultato quello che ha presentato le manifestazioni riproduttive più in ritardo, intorno al 35° giorno dall’inizio della prova. Inoltre, al 56° giorno solo il 40% delle pecore sono risultate cicliche. 273 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Tabella 1 – Numero di animali che presentavano l’inizio dell’attività riproduttiva, determinata attraverso il dosaggio del progesterone, per ciascun prelievo. Animali ciclici per prelievo Gruppi I II III IV V VI VII VIII IX A 1 6 3 3 2 3 2 B 0 6 5 3 2 2 2 C 0 5 5 4 2 3 1 D 0 0 0 0 2 2 3 9 2 E 0 0 0 0 0 1 2 2 3 C 50 B 45 40 35 G io rn i 30 25 A A A Gruppo A Gruppo B Gruppo C 20 15 10 5 0 Gruppo D Gruppo E Grafico 1 – Distanza media in giorni dell’inizio dell’attività riproduttiva nei cinque gruppi in osservazione (A, B, C = P<0,01) La distanza media in giorni dell’inizio dell’attività riproduttiva è risultata più bassa nei gruppi A, B, C, rispetto agli altri due gruppi (P<0,01). Inoltre,il gruppo D ha mostrato una ripresa dell’attività riproduttiva prima del gruppo E (Grafico 1) (P<0,01). Il BCS degli animali non ha mostrato nessuna differenza tra i gruppi, invece le produzioni iniziali sono risultate differenti tra i primi tre gruppi ( 800 g/die a capo) e i gruppi D (1100 g/die a capo) ed E (1230 g/die capo) (P<0,01). L’attività riproduttiva dei diversi gruppi è stata condizionata dal periodo del parto, infatti, gli animali che avevano partorito nel mese di Aprile hanno presentato una ripresa dell’attività sessuale più tardivamente rispetto agli altri. Tale comportamento potrebbe essere determinato dall’intervento di diversi fattori come il fotoperiodo, l’alimentazione, il BCS, la fase di lattazione o altre cause ambientali che possono influenzare la ripresa dell’attività sessuale, agendo sul sistema ipotalamo-ipofisi-gonade (I’Anson et al., 1991; Rosa e Bryant, 2003). Tuttavia, nel presente studio il fotoperiodo era identico per tutti gli 274 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES animali e quindi questo fattore non può essere considerato determinante non avendo esercitato alcuna inibizione sull’attività riproduttiva. Anche nei gruppi D ed E, nonostante la riproduzione sia iniziata dopo il solstizio estivo, è difficile attribuire un preciso effetto al fotoperiodo, in quanto la diminuzione delle ore di luce è stata alquanto esigua e non sufficiente a modificare la secrezione delle gonadotropine. Bisogna comunque ricordare che il fotoperiodo estivo e pertanto il passaggio dai giorni lunghi a quelli corti, ha una importanza notevole in quanto ha la funzione di scandire la stagionalità riproduttiva negli ovini (Barrell et al., 2000). L’alimentazione è un altro fattore che assume una notevole importanza nel regolare l’attività riproduttiva, infatti, animali sottoalimentati o con un insufficiente introduzione di energia manifestano un blocco dell’attività riproduttiva attraverso la diminuzione della secrezione di LH (I’Anson et al., 2000). Inoltre gli effetti di un bilancio energetico negativo agiscono a livello ipotalamico-pituitario sul controllo della riproduzione alterando la liberazione pulsatile di GnRH,l’ovulazione e l’estro (Scaramuzzi et al. 2006). Tuttavia gli animali utilizzati nel presente studio sono stati alimentati tutti in maniera uguale ed il tipo di alimentazione, a giudicare dal BCS rilevato, era adeguata. Di conseguenza si può escludere questo fattore come causa del ritardo nella ripresa dell’attività riproduttiva nei gruppi D ed E. Tra i fattori considerati rimane da prendere in esame il periodo di lattazione: potrebbe essere stata tale fase fisiologica a modificare la risposta all’effetto maschio delle pecore del gruppo D ed E. Infatti la lattazione è uno stadio fisiologico che richiede una notevole quantità di energia per la sua espletazione e questo fatto potrebbe avere causato il rallentamento nella ripresa dell’attività ciclica dei 2 gruppi di pecore che sono risultati scarsamente stimolati dall’effetto maschio. Tale comportamento si accorda con quanto rilevato da altri AA che osservarono che l’allattamento o l’inizio della lattazione determinavano una inibizione sull’attività ovarica nelle pecore. Infatti, l’anestro da lattazione assicura che la domanda energetica per la sintesi del latte non interferisca con l’energia necessaria per la crescita embrionale o per l’attività ovarica (Abi Salloum e Claus, 2005; Boquier et al., 1993). Un possibile effetto della suzione è ancora oggetto di controverse discussioni; in passato è stato dimostrato che questo stimolo porta ad un aumento del livello ematico di β endorfine che agiscono inibendo la secrezione di LH ed FSH (Gordon e Renfree et al., 1987). Inoltre, l’effetto della suzione interverrebbe sulla secrezione della prolattina. Edgerton ha ipotizzato, infatti, che il rilascio a livello ipofisario delle gonadotropine sia inibito, durante la lattazione, dalla desensibilizzazione agli estrogeni della ghiandola pituitaria dovuta al picco di prolattina indotto dalla suzione. Questa ipotesi tuttavia non risulta essere attendibile nella pecora perché diversi studi hanno dimostrato che il trattamento con antiprolattinici non sembra agire a livello ovarico con la riduzione dell’anestro da lattazione (Hooley,1978). Tuttavia, sebbene nella nostra osservazione gli animali che hanno presentato il maggior ritardo nell’inizio dell’attività riproduttiva sono stati quelli che avevano le produzioni maggiori, lo stimolo della suzione non può aver condizionato la ripresa dell’attività ciclica, avendo allontanato gli agnelli dopo 20 giorni dal parto. Pertanto, potrebbero essere stati diversi fattori ad influenzare l’attività sessuale e principalmente quelli di origine metabolica. I più importanti sicuramente sono la somatotropina, che determina un omeoresi organica in favore della mammella, ma anche la leptina potrebbe aver condizionato la risposta riproduttiva. Infatti in diverse esperienze si riporta che i livelli bassi di questo ormone, secreto dai lipidi, che si 275 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES riscontrano nelle prime fasi di lattazione possono condizionare la ripresa della attività riproduttiva postpartum (Carcangiu et al., 2003; Chilliard et al., 2005). In conclusione il parto nel mese di Aprile determina un ritardo nell’inizio dell’attività riproduttiva nelle pecore presumibilmente dovuto allo stato metabolico determinato dalla fase della lattazione. Pertanto, è preferibile che gli animali non partoriscano oltre il mese di Marzo perché il guadagno ottenuto con i pochi mesi di lattazione primaverili vengono persi con il ritardo del parto, che nelle migliori delle ipotesi, potrebbe avvenire a Gennaio. BIBLIOGRAFIA Abi Salloum B., Claus R. (2005). Interaction between lactation, photoperiodism and male effect in German Merino ewes. Theriogenology 63, 2181-2193 Barrell G.K., Thrun L.A., Brown M.E., Viguié C., Karsch F.J., 2000. Importance of photoperiodic signal quality to entrainment of the circannual reproductive rhythm of the ewe. Biol. Reprod. 63, 769-774 Bittman E.L., Dempsey R.J. Karsh F.J. (1983). Pineal melatonin secretion driver the reproductive response to day lenght in the ewe. Endocrinology, 113, 2276-2283 Boquier F., Kann G., Thimonier J., (1993). Effect of body composition on the duration of the postpartum anovulatory period in milked ewes submitted to two photoperiods. Reprod. Nutr. Dev. 33, 395-403 Carcangiu V., Accorsi P.A., Vacca G.M., De Ambrogi M., Marogna G., Bini P.P. Concentrazioni ematiche di leptina in pecore di razza sarda in lattazione. Atti So.Fi.Vet., 2003, 5, 124-126 Chemineau P., Malpaux B, Thiéry J.C., Viguè C., Morello H., Zarazaga L., Pelletier J. (1995). The control of seasonality: a challenge to small ruminant breeding. In: Enne G., Greppi G.F., Lauria A., (Eds), Reproduction and Animal Breeding. Advances and strategy, Elsevier, Amsterdam, pp 225-250 Chemineau P., Pelletier J., Guérin Y., Colas G., Ravault J.P., Almedia G., Thimonier J., Ortavant R. (1988). Photoperiodic and melatonin treatment for the control of seasonal reproduction in the sheep and goats. Reprod. Nutr. Dev. 28, 409-422 Chilliard Y., Delavaud C., Bonnet M. (2005). Leptin expression in ruminant: Nutritional and Physiological regulations in relation with energy metabolism. Dom. Anim. Endocrinol. 29, 3-22 Edgerton L.A, (1980). Effect of lactation upon the postpartum interval. J Anim Sci.51 Suppl 2,40-52. Gordon K., Renfree M.B., Short R.V., Clarke I.J. (1987). Hypothalamo-pituitary portal blood concentration of beta endorphin during suckling in the ewe. Reprod. Fertil.;79(2), 397-408. Hooley R.D, Campbell J.J, Findlay J.K.,(1978) The importance of prolactin for lactation in the ewe. J. Endocrinol. 79(3),301-10. I’Anson H., Foster D.L., Foxcroft G.R., Booth P.J. (1991). Nutrition and reproduction. Oxf. Rev. Reprod. Biol. 13: 239-311. I’Anson H., Manning J.M., Herbosa C.G., Pelt J., Friedman C.R., Wood R.I., Bucholtz D.C., Foster D.L. (2000). Central inhibition of gonadotropin-releasing hormone secretion in the growth-restricted hypogonadotropic female sheep. Endocrinology. 2000, 141, 520-527. 276 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Malpaux B, Migaud M, Tricoire H, Chemineau P. (2001). Biology of mammalian photoperiodism and the critical role of the pineal gland and melatonin J Biol Rhythms. 16, 336-47. Rosa H.J.D., Bryant M.J., 2003. Seasonal of reproduction in sheep. Small Rum. Res. 48, 155-171 Scaramuzzi R.J., Campbell B.K, Downing J.A., Kendall N.R, Khalid M., Muñoz-Gutiérrez M., Somchit A.(2006). A review of the effects of supplementary nutrition in the ewe, on the concentrations of reproductive and metabolic hormones and the mechanisms that regulate folliculogenesis and ovulation rate Thiéry J.C., Chemineau P., Hernandez X., Migaud M., Malpaux B. (2002). Neuroendocrine interactions and seasonality. Dom. Anim. Endocrinol. 23, 87-100 277 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES ATTIVITÀ RIPRODUTTIVA E LEPTINA IN AGNELLE DI RAZZA SARDA LEPTIN AND REPRODUCTIVE ACTIVITY IN SARDA EWE LAMBS CARCANGIU V., VACCA G.M., *PARMEGGIANI A., MURA M.C., FIORI M., PAZZOLA M., BINI P.P. Dipartimento di Biologia Animale, Università degli Sudi di Sassari *Dipartimento di Morfofisiologia Veterinaria e Produzioni Animali, Università degli Studi di Bologna KEY WORDS: Sheep, puberty, leptin ABSTRACT The aim of the study was to evaluate how much leptin would be involved in the onset of reproductive activity in Sarda ewe lambs. For the study 20 ewe lambs, born by single birth during the last 15 days of November,were used. From the 2nd to the 10th month of life each animal was weighted and a blood sample was taken every 15 days for leptin and progesterone dosage. Leptin and progesterone haematyc concentrations were measured with RIA method. Animals’ body weight has kept stable until 5th sample, showing then an increase until the end (P<0.01). Leptin blood levels had shown a constant trend from 1st to 8th sample and then they had shown an increase from 9th (P<0.01). Progesterone haematic concentration has kept very low values until 10th sample, incresing subsequently (P<0.01). Body weight appeared in positive correlation with leptin (P<0.05) and progesterone (P<0.01). The high leptin blood levels in the latest samples, even if they are not in correlation with progesterone, could indicate an involvement of leptin in the onset of reproductive activity. INTRODUZIONE Gli animali attraverso la pubertà acquisiscono la piena capacità di riprodursi, pertanto questa fase fisiologica riveste una notevole importanza in quanto segna il passaggio tra il periodo improduttivo e quello produttivo dell’animale. Molti sono i fattori che possono influenzare l’inizio dell’attività riproduttiva ma i più importanti senza dubbio sono l’età, lo sviluppo corporeo e negli animali stagionali il fotoperiodo (Abecia et al., 2001). L’età, almeno negli ovini, è un parametro molto variabile in quanto esistono diverse razze con caratteristiche morfologiche e attitudinali molto differenti che ne condizionano l’inizio dell’attività riproduttiva (Dyrmundsson, 1973). Tuttavia per la nostra razza Sarda ormai è acquisito che il comportamento riproduttivo si manifesti tra il settimo e l’ottavo mese se gli altri fattori suddetti sono favorevoli (Manunta, 1985). Infatti, nonostante le agnelle abbiano raggiunto l’età idonea per riprodursi, ma non hanno maturato lo sviluppo corporeo o il fotoperiodo non è favorevole, l’attività riproduttiva non si presenta (Papachristoforou et al., 2000). Mentre l’età e il fotoperiodo sono variabili conosciute, per quanto riguarda lo sviluppo corporeo rimane ancora da identificare come l’asse ipotalamo-ipofisi-gonade riesca a percepire quando l’organismo è maturo per riprodursi. Tuttavia, è riconosciuta l’esistenza di un fattore periferico che informa il cervello delle stato energetico dell’organismo ma ancora non è stato chiaramente identificato (Friedman e Halaas, 1988). Infatti, sono stati presi in considerazione variazioni di diversi parametri ematochimici come le proteine, la glicemia, i lipidi, l’insulina ma nessuno di questi è stato in grado di 278 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES controllare la pubertà (I’Anson et al., 1991). Sicuramente, è solo alla fine dell’accrescimento, quando l’effetto lipomobilizzante determinato dal GH viene a mancare, che si osserva l’aumento della massa adiposa nell’organismo (Gatford et al., 1997), e questo fatto potrebbe essere percepito dall’ipotalamo come messaggio di maturità dello sviluppo somatico (Carcangiu et al., 1999). La recente scoperta della leptina, ormone secreto dal tessuto adiposo, ha portato alla formulazione di nuove ipotesi considerando appunto questa molecola come il segnale organico che determina la pubertà (Brann et al., 2002). La leptina infatti viene secreta in modo proporzionale alla massa adiposa presente nell’organismo e i suoi alti livelli determinano una diminuzione del feed intake inibendo il NPY a livello ipotalamico (Zhang et al., 1994; Vernon et al., 2001). Quindi questo ormone essendo implicato nella regolazione del bilancio energetico, è lecito pensare che possa fungere da segnale organico della maturità somatica. Pertanto lo scopo della presente ricerca è quella di analizzare i livelli ematici di leptina nel periodo dell’accrescimento fino alla pubertà per individuare quanto questo ormone sia coinvolto nella regolazione della pubertà nelle agnelle di razza Sarda. MATERIALI E METODI La ricerca è stata condotta in un allevamento di circa 300 capi di ovini di razza Sarda, situato nel Nord Sardegna a circa 350 m s.l.m. Dalle agnelle nate tra Ottobre e Dicembre, sono stati scelti 20 soggetti nati nell’ultima decade di Novembre, da parto singolo e con un peso omogeneo. Gli animali sono stati svezzati a 35 giorni di età e tenuti separati dal resto del gregge per tutto il tempo della prova. Le agnelle durante il giorno pascolavano su un erbaio composto da Graminacee (Orzo, Avena) e Leguminose (Trifoglio, Veccia), la notte venivano tenute nell’ovile dove ricevevano una quota di mangime concentrato in relazione all’accrescimento contenente il 16 % di proteine e il 12,5 di E.M./kg di sostanza secca. Il fieno e l’acqua erano ad libitum. Da ciascun animale a partire dal 50° fino al 260° giorno di vita, sono stati effettuati prelievi ematici dalla vena giugulare, con cadenza quindicinale, alle 07.00 del mattino, prima che gli animali venissero condotti al pascolo. Nella medesima occasione veniva rilevato il peso di ciascun animale. Il sangue veniva prelevato con l’ausilio di provette sottovuoto contenenti eparinato di litio come anticoagulante (Vacutainer, Beckton e Dickinson) e subito centrifugato a 2000 rpm per 15 minuti e il relativo plasma congelato a –20°C fino al momento delle analisi. La leptina (Multi Species RIA, Limco Research Inc.) e il progesterone sono stati analizzati con metodica RIA. I dati ottenuti sono stati sottoposti all’analisi della varianza e delle correlazioni (Minitab ® ). RISULTATI E CONCLUSIONI Il peso corporeo degli animali ha mostrato un continuo incremento, se si escludono i primi due prelievi, con differenze statisticamente significative (P<0,01)(Tabella 1). 279 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Tabella 1 - Valori medi (± d.s) del peso vivo, della leptina e del progesterone nelle agnelle durante le osservazioni Peso vivo Leptina Progesterone Prelievo (kg) (ng/ml) (ng/ml) 1° 10,5±2,2A 1,2±0,1A 0,02±0,02A 2° 10,9±1,8A 1,2±0,2A 0,02±0,01A A A 3° 13,6±2,4 1,2±0,2 0,08±0,02A A A 4° 15,5±2,2 1,2±0,3 0,07±0,02A B A 5° 16,7±2,4 1,2±0,3 0,02±0,01A B AB 6° 18,2±2,6 1,3±0,4 0,1±0,06B B AB 7° 20,1±2,5 1,3±0,4 0,1±0,05B B AB 8° 22,3±2,7 1,3 ±0,3 0,2±0,08B C B 9° 24,5±2,8 1,4±0,3 0,3±0,1B C B 10° 25,8±2,5 1,4±0,2 0,3±0,1B C B 11° 26,6±3,0 1,5±0,4 0,5±0,1C C B 12° 29,3±4,0 1,5±0,3 0,8±0,3C C B 13° 30,8±2,8 1,6±0,3 1,4±0,5D C B 14° 31,4±3,6 1,5±0,6 1,6±0,8D C B 15° 32,2±4,1 1,5±0,4 1,8±0,8C (A, B, C = P<0,01) Tale andamento dello sviluppo corporeo è quello che si riscontra comunemente negli ovini di razza Sarda e il peso raggiunto e superiore al 60 % di quello da adulto richiesto per manifestare l’attività riproduttiva (Manunta, 1985). Infatti in precedenti prove il peso intorno ai 26 Kg era quello idoneo per le manifestazioni riproduttive nelle agnelle (Bini et al., 2000). Il peso corporeo è risultato correlato positivamente con la leptina (P<0,01) e con il progesterone (P<0,001) (Tabella 2). Tabella 2 – Coefficienti delle correlazioni (r) tra i parametri esaminati Leptina Progesterone Progesterone 0,124 Peso 0,281* 0,335** (**=P<0,01; *=P<0,05) I livelli plasmatici di leptina hanno presentato un andamento crescente (P<0,01) durante le osservazioni (Tabella 1). Inoltre, l’ormone è risultato correlato positivamente con il peso (P<0,05) (Tabella 2). Il comportamento della leptina è legato all’andamento dell’accrescimento, infatti, i lipidi corporei incrementano normalmente con l’età come è stato riscontrato nell’uomo (Westerterp., 2000) e in diversi ruminanti (McLaughlin et al., 1994; Trenkle, 1970). Le concentrazioni plasmatiche della leptina aumentano con l’incremento dei lipidi corporei come osservato sia nei bovini (Dalevaud et al., 2002) che negli ovini (Ehrhardt et al., 2000; Chilliard et al., 2001; Daniel et al., 2002). Questo comportamento è in sincronia con quanto da noi osservato, infatti, i livelli maggiori dell’ormone sono stati registrati alla fine delle osservazioni quando gli animali avevano 280 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES raggiunto il peso più alto e presumibilmente il grasso di deposito era maggiore. Inoltre, in quel momento, le agnelle avevano raggiunto uno sviluppo corporeo tale da consentire l’utilizzo delle sostanze energetiche anche per altre funzioni fisiologiche come l’accumulo di sostanze di riserva, in qualità di lipidi. I livelli plasmatici della leptina da noi riscontrati risultano essere inferiori a quanto riportato da altri Autori (Narro et al., 2003; Delavaud et al., 2000). Questa differenza dei valori di questo ormone potrebbe essere attribuita alla razza o al sesso degli ovini o comunque alle diverse condizioni sperimentali utilizzate nelle prove dei suddetti Autori. Ciò nonostante, non è da escludere che i tassi ematici da noi riscontrati siano più bassi a causa della minore sensibilità del metodo di analisi utilizzato. Infatti, Delavaud et al., (2000) effettuando dosaggi in parallelo hanno rilevato una minore risposta da parte di questo metodo rispetto ad uno specifico per gli ovini. Tuttavia, ai fini di studiare l’andamento della leptina durante lo sviluppo somatico e non di stabilirne i valori assoluti, l’uso di questo metodo di misura non dovrebbe avere causato alterazioni dei risultati. Inoltre, i livelli inferiori di leptina coincidono con il periodo nel quale si ha lo sviluppo corporeo rapido e quindi con il momento in cui la richiesta energetica è elevata. Infatti, la leptina, influenzando l’effetto del neuropeptide Y, regola il feed intake (Ingvartsen et al, 2001). Quest’ultimo peptide agisce sul nucleo ipotalamico stimolando l’appetito e la sua azione viene contrastata dagli alti livelli di leptina. Quindi, i bassi livelli di leptina registrati nell’arco di tempo di massimo sforzo organico per la crescita possono essere coinvolti appunto nel regolare l’assunzione volontaria del cibo. Il progesterone manifesta un aumento a partire dal sesto prelievo (P<0.01) fino alla fine delle osservazioni. I tassi ematici dell’ormone gonadico, superiori a 0,5 ng/ml, indicano che a partire dall’undicesimo prelievo gli animali manifestano l’inizio dell’attività riproduttiva. Il progesterone inoltre, risulta correlato positivamente oltre che con il peso anche con la leptina. Pertanto l’ormone lipidico potrebbe essere il segnale di avvenuta maturazione corporea e potrebbe fungere a livello centrale da attivatore della secrezione del GnRH. L’aumento della leptina in prossimità della pubertà si accorda con quanto riscontrato nelle bovine e nelle donne (Garcia et al., 2002; Spicer, 2001). Nelle giovenche infatti è stato riscontrato un aumento dei livelli plasmatici di leptina dal 4° mese fino alla prima ovulazione (Williams et al., 2002). Tuttavia la somministrazione di leptina ovina non ha confermato le osservazioni precedenti in quanto non ha determinato l’anticipo della pubertà nelle bovine (Maciel et al.,2004a). Tale esperienza conferma quanto già ottenuto negli ovini nei quali somministrazioni croniche di leptina non hanno determinato l’anticipo della pubertà (Morrison et al., 2002). La leptina, comunque, determina una stimolazione dell’ipofisi alla liberazione dell’LH solamente negli animali sottoalimentati (Maciel et al., 2004b; Zieba et al., 2005). In conclusione si può affermare che la leptina potrebbe essere uno dei segnali di maturità organica percepiti dall’ipotalamo, capace di determinare l’inizio dell’attività riproduttiva nelle agnelle. Tuttavia ulteriori indagini sono necessarie con il dosaggio di altri ormoni coinvolti nella regolazione del metabolismo e dell’attività riproduttiva al fine di meglio chiarire l’intervento di questo ormone nella pubertà. 281 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES BIBLIOGRAFIA Abecia, J.A., Forcada, F., Zùniga, O. (2001). Differences in reproductive performance, embryo development, interferon-tau secretion by the conceptus and luteal function in ewe lambs synchronized in oestrus before or after the spontaneous onset of luteal activity preceding puberty. Reprod. Dom. Anim. 36: 73-77 Bini, P.P., Carcangiu, V., Parmeggiani, A., Vacca, G.M., Covoni, N., Ghibellini, A., Marino, G. (2000). 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Dipartimento di Biologia Animale, Università degli Sudi di Sassari KEY WORDS: Goat, melatonin receptor, seasonal reproduction ABSTRACT The aim of present research was to point out how seasonal reproductive activity of Sarda goat could be influenced by genic expression of melatonin receptor. The trial was carried out on six hundred goats, 540 females and 60 males, from 30 breeds. The goats, that were all pluriparous, have been selected according to the month of lambing, November or March. A blood sample by jugular vein has been taken to perform DNA extraction. PCR allowed the isolation of a single band of 824 bp corresponding to the second exon of the gene codifying for melatonin MT1 receptor. The obtained amplified has been submitted to an enzymatic digestion in order to investigate the possible presence of polymorphism, as shown in sheep. The results have pointed out that all the tested animals belonged to +/+ genotype , that ,in the sheep, is the less linked to photoperiod. Therefore, the results allow to hypothesize that the selection performed by breeders could have supported indirectly the spread of animals with a reproductive activity less linked to photoperiod. Besides, it could be supposed that differences at lambing between the tested subject are more connected to others factors, such as the number of receptors in the hypothalamus, than to their genetic expression. INTRODUZIONE Molte specie animali che vivono a climi temperati usano le variazioni annuali del fotoperiodo per regolare la loro attività riproduttiva. Queste informazioni luminose, percepite dalla retina, attraverso una via multisinaptica raggiungono la ghiandola pineale regolandone la sintesi della melatonina. La secrezione dell’ormone pineale segue un ritmo circadiano con alti livelli durante le ore di buio e bassi durante le ore di luce sia nel sangue che nel liquido cerebrospinale (Malpaux, 2001). L’andamento della secrezione notturna di melatonina funge come un messaggero endocrino e regola, negli animali stagionali, la secrezione pulsatile ipotalamica del GnRH. Nelle pecore i giorni corti, e di conseguenza la lunga durata della secrezione di melatonina, stimola la secrezione di GnRH (Viguié et al., 1995). La melatonina agisce a diversi livelli nel sistema nervoso centrale ma per quanto riguarda l’attività riproduttiva sono stati evidenziati un numero abbastanza elevato di recettori a livello ipotalamico e ipofisario (Stancov et al., 1991). Sebbene la pars tuberalis presenta un alto numero di recettori per la melatonina non è coinvolta nella regolazione dell’attività riproduttiva ma controlla le secrezione stagionale della prolattina (Lincoln e Clarke, 1994). Invece il sito d’azione dell’indolamina pineale ormai è accertata in diversi animali è l’ipotalamo (Bae et al., 1999). Nelle pecore, infatti, microimpianti di melatonina posizionati in vicinanza dei nuclei premammillari dell’ipotalamo sono stati capaci di 284 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES stimolare la secrezione di LH (Chabot et al., 1998; Malpaux et al., 1998). Tale effetto della melatonina viene espletato attraverso specifici recettori dei quali ne esistono tre tipi, due ad alta affinità ed uno a bassa (Conway et al., 2000). I primi due, denominati MT1 e MT2 rispettivamente, hanno caratteristiche farmacologiche e di proteine di legame transmebranario simili, sono quelli maggiormente candidati al controllo dell’attività riproduttiva stagionale (Reppert et al., 1994, 1995; Dubocovich, 1995). Tuttavia, l’utilizzo di agonisti o antagonisti dei due recettori non hanno chiarito se sono entrambi coinvolti nella regolazione della riproduzione. Inoltre, in due razze di hamster che naturalmente non presentano il gene che codifica per il recettore MT2 l’attività riproduttiva non ha subito variazioni (Weaver et al., 1996). L’espressione genica del recettore MT2 a livello dei nuclei premammillari dell’ipotalamo non è stata ancora riscontrata e per questo si ritiene che non sia coinvolto nella regolazione della stagionalità riproduttiva (Migaud et al., 2005). Il recettore MT1, perciò, oggi viene considerato l’unico ad avere un ruolo importante nel sincronizzare l’attività sessuale. Tale recettore è diffuso in molte parti del corpo di parecchi mammiferi e presenta un certo grado di polimorfismo all’esone II che risulta essere coinvolto nella stagionalità riproduttiva delle pecore (Messer et al., 1997). Infatti Pellettier et al., (2000) hanno evidenziato che una variante del polimorfismo del gene del recettore risulta poco legata al fotoperiodo e pertanto gli animali possiedono tale genotipo presentano attività sessuale in Primavera. Tuttavia nelle capre di razza Saanen, Creole e in un piccolo numero di capre Sarde non è stato osservato il polimorfismo e perciò si considera che in questa specie l’alternanza riproduttiva non dipenda dall’espressione polimorfica del recettore (Migaud et al., 2002; Mura et al., 2004). Ma considerando che le capre sarde presentano una notevole variabilità stagionale nelle manifestazioni riproduttive è lecito estendere le osservazioni al fine di chiarire la presenza o meno di tale polimorfismo e eventualmente correlarlo all’attività riproduttiva. Quindi lo scopo della ricerca è quello di analizzare il gene del recettore MT1 della melatonina in capre sarde che presentino attività sessuale in diversi periodi dell’anno. MATERIALI E METODI Al fine di ottenere dati il più eterogenei possibile, la ricerca è stata condotta in 30 allevamenti di capre, dislocati in vari distretti di tutte e quattro le province della Sardegna. Nonostante le aziende fossero situate in territori anche molto distanti tra loro, le tecniche di allevamento utilizzate in tutta l’isola sono sostanzialmente le stesse, essendo inquadrabili nello schema dell’allevamento semibrado. Perciò per tutti gli animali si può dire che pascolavano durante il giorno e la notte venivano condotti al caprile dove ricevevano un’integrazione alimentare di granella di mais, fave e piselli nei periodi di maggiore sforzo metabolico (accoppiamento e lattazione). In ciascuno di tali allevamenti gli animali sono stati scelti dopo un periodo di osservazione durato circa due anni, durante il quale venivano registrate la data del parto di ciascun soggetto. In totale lo studio è stato condotto su 540 capre e 60 becchi di razza Sarda di età compresa tra i 3 e i 9 anni, allevate sin dalla nascita a fotoperiodo naturale. Le capre oggetto della prova sono state scelte in base alla data del parto e più precisamente animali che avevano partorito in Autunno e tra il mese di Febbraio e quello di Aprile. Da ciascun animale è stato prelevato un campione di sangue giugulare utilizzando provette sottovuoto addizionate di EDTA come anticoagulante. Dal sangue è stato estratto il DNA genomico e valutata la sua concentrazione con metodica 285 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES spettrofotometrica. 100-150 ng del DNA così ottenuto venivano poi utilizzati per l’allestimento dell’amplificazione che prevedeva l’utilizzo degli stessi primers utilizzati da Messer et al. (1997), corrispondenti alla posizione 285-304 (primer sense) e 1108-1089 (primer antisense) della sequenza dell’esone II del gene che codifica per il recettore MT1 della melatonina. La PCR consisteva di 35 cicli ripartiti in denaturazione a 94 °C per 1 minuto, annealing a 62 °C per 1 minuto, estensione a 72 °C per 2 minuti, al termine dei quali veniva eseguita un’estensione finale a 72 °C per 10 minuti. Il prodotto della PCR è stato sottoposto a digestione con l’utilizzo dell’enzima di restrizione MnlI I frammenti così ottenuti venivano separati su un gel di agarosio al 3 %. RISULTATI E DISCUSSIONE Il risultato della PCR di tutti gli animali non ha mostrato differenze evidenziando un unico frammento della lunghezza di 824 paia di basi relativo all’esone secondo codificante per il recettore MT1 della melatonina (Figura - 1). La digestione con l’enzima di restrizione MnlI ha permesso di individuare 5 bande corrispondenti ai frammenti di 236 bp, 216 bp, 137 bp, 82 bp e 67 bp e questo risultato si accorda con quanto osservato da Messer et al., (1997). Contrariamente a quanto riscontrato nelle pecore da Pellettier et al. (2000), le nostre capre non hanno manifestato il polimorfismo genetico e conferma quanto riscontrato nelle razza Alpina da Migaud et al., (2002). Nelle pecore, invece, la mancanza di tale sito di taglio porta ad un frammento di 303 paia di basi (Messer et al., 1997). La forma allelica contenente il sito di taglio fu nominata da Pellettier et al. (2000) “+”, mentre fu identificata come “-“ quando tale sito non era presente. Da tale distinzione si sono ottenute le combinazioni di “+/+”, “+/-“ e “-/-“ e gli ovini che presentano il genotipo “+/+“ hanno mostrato attività sessuale in Primavera, come gli ovini di razza Merino d’Arlens e quelli Dorset X Rambouillet-Finn (Notter et al., 2003). Pertanto si può affermare che la variabilità dell’attività riproduttiva delle capre di razza Sarda non è legata alla espressione del recettore come invece ci si aspettava. Considerando, comunque, che le nostre capre presentano una stagionalità riproduttiva evidente infatti circa il 30% dei soggetti partorisce in Marzo-Aprile e l’effetto del fotoperiodo, anche se debolmente, si manifesta. L’azione dell’alternanza luce/buio, evidentemente viene espletata 1 2 3 4 5 6 attraverso altri meccanismi. Infatti, Figura 1 – Elettroforesi del prodotto della PCR e della nelle nostre capre si riscontra una digestione. Linea 1 DNA marker; Linea 2, 3, 4 e 5 variabilità individuale della risultati della digestione; Linea 6 risultato della PCR secrezione dell’ormone epifisario che risulta influenzare la 286 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES stagionalità (Carcangiu et al., 2004). Questi ultimi autori, infatti, hanno rilevato un precoce inizio dell’attività riproduttiva nelle capre che presentavano bassi livelli notturni di melatonina. Comunque, considerando che la capra in generale è stata allevata nella maggioranza dei casi per la produzione del latte si può ipotizzare che la selezione abbia favorito gli animali meno legati al fotoperiodo per poter avere nei diversi periodi dell’anno il latte. Tale ipotesi potrebbe essere la causa della scomparsa del polimorfismo del recettore della melatonina nella capra. In conclusione si può affermare che la stagionalità riproduttiva della capra di razza Sarda non è legata al polimorfismo del recettore MT1 nonostante le capre di razza Sarda appartengano ad un ceppo diverso da quello della Alpina. Pertanto ulteriori ricerche sono necessarie per chiarire quale sia il meccanismo esatto che determina l’alternanza riproduttiva nelle capre. BIBLIOGRAFIA Bae H.H., Mangeles R.A., Cho B.S., Dark J., Yellow S.M., Zucker I. 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Mapping of the melatonin receptor 1a (MTRN1A) gene pigs, sheep and cattle. Mamm. Genome 8, 368-370 287 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Migaud M., Daveau A., Malpaux B. (2005). MTNR1A melatonin receptors in the ovine premammillary Hypothalamus : day-night variation in the expression of the transcripts. Biol. Reprod. 72, 393-398 Migaut M., Gavet S., Pellettier J. (2002) Partial cloning and polymorphism of the melatonin 1a (Mel1a) receptor gene in two breeds of goat with different reproductive seasonality. Reproduction 124, 59-64 Mura M.C., Vacca G.M., Dei Giudici S., Rocchigiani A.M., Bini P.P., Carcangiu V. (2004). Melatonin receptor mel1a gene expression in two Mediterranean goats breed with different reproductive seasonality. Proceeding II° International Meeting on Veterinary Morpho-functional Biotechnologies 2, 52 Notter D.R., Cockett N.E., Hadfield T.S. (2003). 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V.1, AMPOLA M.3, ZUCCONI C.4, ANDREANI E.1 1 Dipartimento Patologia Animale, Profilassi ed Igiene degli Alimenti - Università di Pisa; 2 Dottore di ricerca in Patologia dei piccoli ruminanti; 3Dottorando in Produzioni Animali, Sanità ed Igiene degli Alimenti nei Paesi a Clima Mediterraneo; 4 Libero Professionista PAROLE CHIAVE: caciotta caprina, caratterizzazione fenotipica, batteri lattici KEY WORds: goat caciotta, phenotypical characterization, lactic acid bacteria ABSTRACT The main aim of the research is to carry out the phenotypical characterization of lactic acid bacteria isolated from goat caciotta in three cycles of caseification to prepare a native starter. Milk, curd and cheese samples have been analyzed to detect: total coliforms, Escherichia coli, Staphylococcus spp., lactic acid bacteria, yeasts and moulds. Total bacterial count (TBC) has been determined on milk as well. Staphilococci were represented on average with values of 2000 UFC/ml; total coliforms showes a progressively decreasing with seasoning (from 6000 UFC/ml to <50 UFC/ml); E. coli was represented on average with values <500 UFC/ml, while yeasts and moulds showed respectively values <100 UFC/ml e <300 UFM/ml. Medium milk TBC has been 122000 UFC/ml; lactobacillus species showed a medium increasing until 21° seasoning day in each cycle of production with spikes of 90 millions UFC/ml in cheese at 21 days at the first caseification; lactococcus and enterococcus species were respresented with high values until 28° seasoning day and successively showed a slow decreasing. About phenotypical characterization of lactic acid bacteria, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis lactis, Lactococcus cremoris e Enterococcus faecalis were found to be the main represented species. INTRODUZIONE L’Isola di Capraia assieme alle isole di Gorgona, Elba, Pianosa, Montecristo, Giglio e Giannutri, appartiene al Parco Nazionale dell’Arcipelago Toscano, il più grande parco marino d’Europa; l’isola ha una superficie di quasi 20 kmq e uno sviluppo costiero di circa 30 km ed è sicuramente l’isola più aspra e rocciosa dell’arcipelago, caratterizzata da un terreno lavico che consente il proliferare di una vegetazione arbustiva tipica della macchia mediterranea. Fin dai tempi della civiltà etrusca la capra è sempre stata presente sull’isola; tutt’oggi permane un nucleo costituito da circa 120 capi, ufficialmente indenni da brucellosi, la maggior parte dei quali è rappresentato da soggetti derivati da incroci tra Saanen, Camosciata delle Alpi e Sarda, allevati allo stato semibrado. Questi animali possono usufruire sostanzialmente per tutto l’anno di pascoli caratterizzati da essenze foraggiere ed arbustive peculiari dell’isola che conferiscono al latte aromi e sapori unici. Il latte viene interamente trasformato per produrre la caciotta caprina a latte crudo dell’Isola di Capraia che l’ARSIA (Agenzia Regionale per lo Sviluppo e l’Innovazione nel Settore 289 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Agricolo-Forestale) ha inserito nell’elenco dei prodotti tradizionali della Toscana. La caciotta viene prodotta nel periodo Marzo-Settembre con il latte della mungitura della sera e della mattina; tutte le operazioni del processo produttivo vengono svolte manualmente (rottura della cagliata, pressatura e salatura). Il prodotto è caratterizzato da un colore bianco leggermente paglierino, da una forma cilindrica del peso di circa 600-800 gr, la crosta è abbastanza evidente anche se piuttosto sottile, la pasta si presenta compatta e priva di occhiature con consistenza più asciutta rispetto ai caprini freschi. Il sapore è meno acido e più pronunciato in relazione al diverso stadio di maturazione del prodotto; generalmente viene consumata dopo 15-20 giorni di maturazione, fino ad un massimo di 30-40 giorni di stagionatura. La maturazione avviene all’interno di apposite celle del laboratorio di trasformazione ad una temperatura di circa 18°C. La caciotta può essere trattata esternamente in crosta con olio d’oliva sia per migliorarne l’aspetto estetico, sia al fine di evitare eventuali crepe della crosta stessa legate a sbalzi di temperatura e ad eccessiva disidratazione. Scopo del presente lavoro è stato quello di effettuare la valutazione igienico-sanitaria e la caratterizzazione microbiologica della caciotta caprina a latte crudo dell’Isola di Capraia al fine di individuare ceppi di batteri lattici da impiegare per la produzione di uno starter autoctono. MATERIALI E METODI L’indagine ha preso in considerazione tre cicli di caseificazione eseguiti con la medesima modalità in tre diversi periodi dell’anno (da Marzo a Settembre) nei locali del laboratorio di trasformazione dell’allevamento. Il formaggio è stato prodotto secondo la seguente procedura: 1) Impiego del latte della mattina e della sera precedente refrigerato ad una temperatura di 3°C. 2) Duplice filtrazione del latte con filtri monouso di cellulosa. 3) Riscaldamento a circa 35°C in caldaia di acciaio inox. 4) Coagulazione con caglio in polvere di vitello (titolo di 1:125000) (operazione eseguita a latte fermo). 5) Attesa del tempo di coagulazione: 2040 minuti. 6) Rottura della cagliata con rompicagliata in acciaio inox fino al raggiungimento delle dimensioni di un chicco di riso. 7) Prelievo e deposizione della cagliata in fuscelle di materiale plastico forato mediante accurata pressatura. 8) Salatura superficiale con sale da cucina a circa 12 ore dalla preparazione e successivo ribaltamento della forma. 9) Stagionatura su assi di legno di abete a partire da un minimo di 15 giorni fino ad un massimo di 35 giorni in locali stabilmente abilitati a temperatura di circa 18°C. Per ciascuno dei 3 cicli di caseificazione oggetto dell’indagine sono stati analizzati durante il processo di lavorazione i seguenti campioni del prodotto: latte prelevato in caldaia immediatamente prima del riscaldamento, cagliata appena terminata la rottura, formaggio a 2, 7, 14, 21, 28 e 35 giorni di maturazione. Per il campionamento e l’allestimento delle diluizioni si è fatto riferimento ai relativi Standard Internazionali FIL/IDF (50C: 1995 e 122C: 1996). Il campione della cagliata, di circa 200 grammi, è stato rapidamente conferito in contenitore sterile e refrigerato al laboratorio assieme al campione di latte di partenza; i formaggi sono invece stati fatti pervenire come forme intere per essere sottoposti alle analisi microbiologiche entro 6 ore dal ricevimento. La determinazione del pH è stata eseguita mediante PHMETER GLP21 (Crison) con elettrodo ad infissione. Sui campioni di latte sono state eseguite diluizioni scalari da 10-1 a 10-8 in Peptone Water sterile (Oxoid). 290 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Dalla cagliata e da ogni forma è stato prelevato sterilmente un settore a spicchio dal quale sono stati ricavati 30 gr di prodotto impiegati per l’allestimento della sospensione madre. Sono state eseguite diluizioni scalari da 10-1 a 10-8 in citrato sodico sterile al 2%. Sul latte è stata determinata la carica mesofila totale mediante semina in doppio per inclusione di 1 ml di ciascuna diluizione in terreno PCA (Plate Count Agar) (Oxoid) ed incubazione a 30°C per 72 ore. Su latte, cagliata e campioni di formaggio sono state eseguite le seguenti determinazioni microbiologiche: 1) Coliformi totali mediante semina in doppio per spatolamento superficiale di 0,2 ml di ciascuna diluizione su piastre contenenti terreno VRBA (Violet Red Bile Agar) (Oxoid) ed incubazione a 37°C per 24 ore. 2) Escherichia coli mediante semina in doppio per spatolamento superficiale di 0,2 ml di ciascuna diluizione su piastre contenenti terreno TBX (Tryptone Bile X-Glucose Agar) (Oxoid) ed incubazione a 44°C per 24 ore. 3) Staphylococcus spp. mediante semina in doppio per spatolamento superficiale di 0,2 ml di ciascuna diluizione su piastre contenenti terreno Baird Parker Agar (Oxoid) con aggiunta di Tellurite Yolk Emulsion (Oxoid) e su piastre contenenti MSA (Mannitol Salt Agar) (Oxoid) e successiva incubazione a 37°C per 48 ore. 4) Enterococchi mediante semina in doppio per spatolamento superficiale su piastre contenenti terreno Kanamicina Esculina Azide Agar Base (Oxoid) con aggiunta di Kanamicin Selective Supplement (Oxoid) di 0,2 ml di ciascuna diluizione e incubazione a 44°C per 24-48 ore. 5) Lattobacilli mesofili mediante semina in doppio per inclusione in terreno MRS Agar (Oxoid) acidificato a pH 5,4 con acido acetico glaciale di 1 ml di ciascuna diluizione e incubazione a 37°C per 72 ore in giara con atmosfera modificata al 5% di CO2. 6) Lattococchi mediante semina in doppio per inclusione in terreno M17 Agar (Oxoid) di 1 ml di ciascuna diluizione e incubazione a 30°C per 24 ore. 7) Lieviti e muffe mediante semina in doppio per spatolamento superficiale di 0,2 ml di ciascuna diluizione su piastre contenenti terreno YGCA (Yeast Extract Glucose Chloramphenicol Agar) (Difco) e incubazione a 25°C per 5 giorni. (Salvatori Del Prato O., 1998) La caratterizzazione fenotipica dei ceppi isolati è stata eseguita mediante API 50 CH (Biomerieux) per quanto riguarda lattobacilli e lattococchi, mediante API Strep per quanto riguarda gli enterococchi. (Innocenti et al., 2001; Pedonese et al., 2000; Pedonese et al.(2), 2002). RISULTATI Nelle tabelle 1,2,3,4 sono riportati i risultati delle analisi microbiologiche dai quali emerge che i parametri igienico-sanitari rientrano costantemente nella norma. Nel grafico 1 relativo all’andamento del pH nelle tre prove di caseificazione è possibile notare un decremento progressivo indice di una buona acidificazione (da valori di 6,65-6,7 del latte fino a valori di 5 nel formaggio a 32 giorni ). Il grafico 2 descrive l’andamento dei batteri lattici nel 1° lotto di produzione; è possibile notare un picco di crescita dei lattococchi a 2 giorni di stagionatura; i lattobacilli hanno un picco di crescita a 21 giorni, mentre gli enterococchi mostrano un picco a 7 giorni. Nel grafico 3 sono descritti gli andamenti dei batteri lattici relativi al 2° lotto di produzione; il picco dei lattobacilli si ha al 7° giorno e i valori si mantengono elevati fino a 32 giorni, mentre i lattococchi mostrano il loro picco a 28 giorni e gli enterococchi a 14 giorni. Il grafico 4, relativo al 3° lotto di produzione evidenzia come i lattobacilli si attestino su valori elevati a 7 giorni fino al picco massimo raggiunto al 32° giorno. I lattococchi raggiungono il picco massimo a 7 giorni e si mantengono su valori più elevati rispetto ai lattobacilli dal 2° al 32° giorno; gli 291 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES enterococchi mostrano il loro picco a 7 giorni ed il loro andamento è pressoché sovrapponibile a quello dei lattobacilli. Nei grafici 5, 6 e 7 vengono riportati gli andamenti dei batteri lattici per lotto di produzione; per quanto concerne i lattobacilli si ottengono curve simili nei 3 lotti con valori più elevati nel 2° lotto a 32 giorni. L’andamento degli enterococchi è sovrapponibile nei 3 lotti con punte massime nel 2° lotto. Per quanto Tabella 1 Caratteristiche Microbiologiche e pH del Latte impiegato nelle 3 prove di caseificazione Prova 1 Prova 2 Prova 3 CBT (ufc/ml) 1,8x105 1,5x105 3,5x104 Stafilococchi (ufc/ml) 550 100 150 Coliformi totali (ufc/ml) 450 250 200 E.Coli (ufc/ml) <50 <50 <50 Lattococchi (ufc/ml) 1,1x104 2,6x103 1000 5 Lattobacilli (ufc/ml) 2x10 1200 1000 Enterococchi (ufc/ml) 1x 104 800 <500 Lieviti (ufc/ml) <30 <10 <10 Muffe (ufc/ml) <50 <10 <10 pH 6,65 6,7 6,7 riguarda i lattococchi si assiste ad un andamento analogo nel 1° e 3° lotto di produzione, mentre il 2° lotto presenta un andamento nettamente differente con valori più bassi rispetto agli altri due lotti. Tabella 2 Risultati analisi microbiologiche effettuate nel corso della prima prova di caseificazione Cagliata 2 gg 7 gg 14 gg 21 gg 28 gg Stafilococchi (ufc/ml) 2000 1500 4150 1300 1000 1000 600 Coliformi totali (ufc/ml) <500 300 3500 2550 6000 1100 <100 292 32 gg E.Coli (ufc/ml) <50 505 <500 <50 50 <50 <50 Lattococchi (ufc/ml) 5x105 11,8x108 8x108 6,7x108 1,5x108 3,6x107 8x106 Lattobacilli (ufc/ml) 3x105 1,15x105 1,5x107 5x107 9x107 1x107 7,5x105 Enterococchi (ufc/ml) 2,5x104 3x106 3,8x106 1,5x105 2x106 1,8x106 9x105 Lieviti (ufc/ml) 50 100 1x104 1,5x104 6000 7500 <10 Muffe (ufc/ml) 50 50 2000 2500 1000 1200 <10 pH 6,57 5,6 5,3 5,2 5,1 5 5,05 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Tabella 3 Risultati analisi microbiologiche effettuate nel corso della seconda prova di caseificazione Cagliata 2 gg 7 gg 14 gg 21 gg 28 gg 32 gg Stafilococchi (ufc/ml) <100 <100 3500 5500 1500 100 120 Coliformi totali (ufc/ml) <50 4000 1500 200 <100 <100 <100 E.Coli (ufc/ml) 120 <100 <100 Lattococchi (ufc/ml) 1500 1600 1,6x10 Lattobacilli (ufc/ml) 2900 2700 2x105 6 7 Enterococchi (ufc/ml) 950 1x10 Lieviti (ufc/ml) <10 <10 Muffe (ufc/ml) <10 <10 pH 6,68 5,7 4x10 <50 8 9,1x10 <50 7 4x104 7 3,8x10 <50 12,5x10 4x105 12,5x10 <10 3,6x10 <50 7 7 1,8x107 6 18,5x10 7 1x108 1,6x107 1,8x107 20 <10 <10 <10 50 10 <10 <10 <10 5,35 5,25 5,2 5,1 5 Tabella 4 Risultati analisi microbiologiche effettuate nel corso della terza prova di caseificazione Cagliata 2 gg 7 gg 14 gg 21 gg 28 gg 32 gg 410 Stafilococchi (ufc/ml) <500 5000 7500 3800 2200 900 Coliformi totali (ufc/ml) 100 3000 1200 1400 2000 2800 260 E.Coli (ufc/ml) <50 775 400 270 140 400 <10 Lattococchi (ufc/ml) 1000 1,4x108 4x108 3,5x108 22,5x107 9x107 3,7x107 Lattobacilli (ufc/ml) 1000 1,5x104 6x105 8x105 8,1x105 3.5x105 1,8x106 6 6 Enterococchi (ufc/ml) <500 2x10 5 6,5x10 6 1x10 1,1x10 1x10 6 6x105 Lieviti (ufc/ml) 10 10 200 350 100 <10 <10 Muffe (ufc/ml) 10 <10 100 150 80 <10 <10 pH 6,55 5,72 5,45 5,3 5,2 5,1 5,1 293 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Grafico 1 Valori pH 6,7 6,55 6,7 6,68 5,72 6,65 Latte 6,57 Cagliata 5,45 5,3 5,2 5,1 5,1 5,7 5,35 5,25 5,2 5,1 5 5,6 5,3 5,2 5,1 5 5,05 14 Giorni 21 Giorni 2 Giorni 7 Giorni 1°Lotto Grafico 2 2°Lotto 28 Giorni 32 Giorni 3°Lotto 1° Lotto Valori Logaritmici 10 8 6 4 2 0 Latte Cagliata 2 Giorni 7 Giorni Lattococchi Grafico 3 Lattobacilli 21 Giorni 28 Giorni 32 Giorni Enterococchi Valori Logaritmici 2° Lotto 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Latte Cagliata 2 Giorni 7 Giorni Lattococchi 294 14 Giorni 14 Giorni Lattobacilli 21 Giorni 28 Giorni Enterococchi 32 Giorni XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Grafico 4 3° Lotto 10 Valori Logaritmici 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Latte Cagliata 2 Giorni 7 Giorni 14 Giorni 21 Giorni 28 Giorni 32 Giorni Lattococchi Grafico 5 Lattobacilli Enterococchi Valori Logaritmici Lattococchi 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Latte Cagliata 2 Giorni 7 Giorni 14 Giorni 21 Giorni 28 Giorni 32 Giorni 1° Lotto 2° Lotto 3° Lotto Lattobacilli Valori Logaritmici Grafico 6 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Latte Cagliata 2 Giorni 7 Giorni 14 Giorni 21 Giorni 28 Giorni 32 Giorni 1° Lotto 2° Lotto 3° Lotto 295 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Enterococchi 9 Valori Logaritmici 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Latte Cagliata 2 Giorni 7 Giorni 14 Giorni 21 Giorni 28 Giorni 32 Giorni 1° Lotto 2° Lotto 3° Lotto Le specie di batteri lattici identificate mediante Api System, isolate sia a partire dal latte che dai campioni di formaggio, sono state le seguenti: Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis lactis, Lactococcus cremoris ed Enterococcus faecalis. CONCLUSIONI Dalla valutazione dei risultati degli esami microbiologici eseguiti sui campioni prelevati nei tre cicli di produzione si evidenzia una buona qualità del latte di partenza in relazione alla CBT, alla colimetria ed al numero di stafilococchi coagulasi positivi. Nei campioni di formaggio si osserva sostanzialmente un buon andamento delle cariche batteriche riconducibili a coliformi ed a stafilococchi coagulasi positivi, le quali subiscono fluttuazioni durante i vari stadi di maturazione rientrando però nei valori previsti per le produzioni lattiero casearie a latte crudo; si evidenzia come sia molto contenuta anche la presenza di lieviti e muffe. Pertanto i risultati conseguiti ci permettono di affermare che in questa azienda si adempie correttamente alle BPL (Buone Pratiche di Lavorazione) sia nella fase di mungitura e stoccaggio del latte, sia all’interno del laboratorio di trasformazione, durante tutte le fasi del processo di caseificazione. Per quanto concerne i batteri lattici si evidenziano cariche elevate relative ai lattobacilli che mantengono valori relativamente alti a partire dalla prima settimana fino alla quinta mentre i lattococchi presentano un picco elevato al secondo giorno contribuendo notevolmente all’acidificazione, fatta eccezione per il secondo lotto di produzione nel quale hanno avuto un comportamento anomalo. L’andamento delle cariche relative agli enterococchi è molto simile a quello dei lattobacilli con cariche massime nella seconda e quarta settimana. La spiccata prevalenza, sia nel latte che nel formaggio, di specie omofermentanti, quali i lattococchi, e di specie eterofermentanti facoltative quali i lattobacilli ha sicuramente importanza durante l’acidificazione della cagliata (Dellaglio et al.,1995). Il loro metabolismo infatti provoca una diminuzione del pH tale da demineralizzare la caseina, primo importante passo verso la caseificazione. Questo ha condotto ad un buon processo globale di acidificazione del formaggio, raggiungendo a 35 giorni di stagionatura valori di 296 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES pH compresi tra 5 e 5,1. Non meno importante risulta il ruolo svolto dagli enterococchi, ben rappresentati nella caciotta caprina, i quali possono avere funzione significativa durante il periodo di maturazione del prodotto in relazione al loro potere proteolitico. Questi microrganismi, essendo molto resistenti al sale e diffusi nell’ambiente, vengono spesso isolati da produzioni casearie artigianali (Rossi et al., 1994; Macedo et al.,1995; Pedonese et al,(1). 2002). Gli enterococchi non possono però essere considerati dei meri contaminanti tanto che alcuni Autori riconoscono loro un ruolo filo-caseario e li impiegano, come starter, per la produzione di formaggi diversi (Cenci Goga et al., 1995). Concludendo possiamo affermare che le specie identificate in questa indagine dimostrano tutte un ruolo ben preciso durante la caseificazione e la maturazione della caciotta prodotta da latte crudo caprino, senza aggiunta di starter. I lattococchi mesofili, probabilmente assieme ai lattobacilli avviano l’acidificazione della cagliata e, quindi, il processo di caseificazione. Durante la maturazione del formaggio, gli stessi lattococchi, i lattobacilli e in particolare gli enterococchi, manifestano la loro azione proteolitica che contribuisce a conferire sapore al prodotto. Alcuni tra i ceppi isolati potrebbero dunque venire impiegati per l’allestimento di uno starter autoctono da utilizzare per la caciotta a base di latte crudo di capra dell’Isola di Capraia, al fine di ottenere una produzione con caratteristiche igienico-sanitarie, organolettiche e merceologiche molto più costanti nel tempo. Ovviamente per poter far questo saranno necessari step fondamentali inerenti ai ceppi dei batteri lattici isolati, a partire dalla conferma della identificazione fenotipica mediante identificazione genotipica (PCR specie-specifica), biotipizzazione genotipica (REP-PCR e RAPD-PCR) ed infine gli esami relativi alle caratteristiche metaboliche dei ceppi così identificati: il potere acidificante, la determinazione dell’attività proteolitica, aminopeptidasica, glutammato-deidrogenasica, nonché il dosaggio di acetaldeide e diacetile. BIBLIOGRAFIA Cenci Goga B.T, Clementi F., Di Antonio E., 1995 Behaviour of lactic e non lactic duringthe production and ripening of farmanufactured Pecorino cheese” “Annali di Microbiologia e Enzimologia” 45: 219-235 Dellaglio F., Torriani S., Pattarini F., Ricci C, Di Bucchiarico R., 1995 “Identificazione e caratterizzazione tecnologica della microflora lattica naturale del formaggio Pecorino d’Abruzzo”Scienza e tecnica lattiero casearia” 46: 82-97 Innocenti E., Pedonese F., Nuvoloni R., Gerardo B., Giraffa G., Cerri D.2001 “Identificazione fenotipica e genotipica di batteri lattici isolati da formaggio pecorino a latte crudo.” Atti A.I.V.I. , XI 119-123 Macedo A.C, Malcata F.X, Hogg T.A., 1995 “Microbiological Profile in Serra ewes’ cheese during ripening.” Journal of Applied Bacteriology 79: 1-11 Pedonese F., Nuvoloni R., D'Ascenzi C., Innocenti E., Cerri D.,Rindi S. 2000 “Caratterizzazione microbiologica di formaggio artigianale prodotto da latte crudo di pecore di razza massese”. Atti VIII Congresso Fe. Me. S.P.Rum. 137-145 Pedonese F., Innocenti E., Nuvoloni R., Gerardo B., Cerri D., Rindi S., 2002 “Sensibilità agli antibiotici,attività emolitica ed attività termonucleasica di enterococchi isolati da formaggi pecorini tradizionali a latte crudo.” Atti A.I.V.I. Vol. XII, 151-156, (1) Pedonese F., Innocenti E., Nuvoloni R., D'Ascenzi C., Giraffa G., Neviani E., Rindi S., Cerri D., 2002 “Caratterizzazione delle microflore autoctone del formaggio tradizionale 297 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES ovino prodotto nel “Parco Regionale Migliarino, San Rossore, Massaciuccoli”, Scienza e Tecnica Lattiero-casearia, n.. 3, vol. 53, 213-234, (2) Rossi J., Durant C., Gobetti M., 1994 “Indagine preliminare sull’impiego di enterococchi nella produzione di Pecorino Umbro” Industria del Latte 30: 41-53 Salvatori Del Prato O., 2001 “Trattato di tecnologia casearia” Edagricole Bologna Cap .(3,5,9,11,18,22) 298 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES OBTENCIÓN DE PROTEÍNAS MORFOGENÉTICAS OSEAS PARCIALMENTE PURIFICADAS A PARTIR DE HUESO BOVINO. EXTRACTION OF PARTIALLY PURIFIED BONE MORPHOGENETIC PROTEINS FROM BOVINE BONE. BUSTAMANTE CANO JJ*, RIVERA POSADA J**, FERNÁNDEZ REVUELTA J, ALONSO ALONSO P, ALONSO DIEZ AJ, GONZÁLEZ MONTAÑA JR. Dpto. Medicina Veterinaria. Facultad de Veterinaria. Universidad de León.24007. León. E-mail: [email protected] * Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad de Pamplona.Colombia. ** Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad de Antioquia. Colombia. SUMMARY. Bone morphogenetic proteins (BMPs) are peptides produced locally by the osteoblasts and regulated by endocrine mechanisms, which can influence the different processes of proliferation and cellular differentiation, the synthesis of proteins and the production of bone material. The purpose of this research was to extract from bovine bone and through physical and chemical procedures, BMPs partially purified, with high-quality osteoinduction characteristics, low antigenicity and high bioavailability. These proteins will be utilized as bone graft material. The procedure was performed through five basic steps: milling bovine bone, lipid extraction, demineralization, collagen extraction, obtention of the protein fraction. These steps were verified respectively through the following analysis: The Soxhlet method, atomic absorption for calcium determination, Van Gieson Pycrofucsin Stain, Polyacrilamide Gel-Electrophoresis-Sodium-Duodecyl-Sulphate (PAGE-SDS). BMPs partially purified were obtained through Polyacrilamide Gel-Electrophoresis-SodiumDuodecyl-Sulphate (PAGE-SDS, with molecular weights among 18 - 120 KDa and mainly bands at 18, 24, 34, 68, 72, 90 and 120 KDa. This material was lyophilized, packed and stored in a vacuum sailed narrow naked bottle for posterior use. BMPs obtained were used later to verify their characteristics osteoinductives. Subcutaneous implants of this material were placed in rabbits like an experimental model. KEY WORDS: biomaterials, osteoregeneration, BMPs, bovine bone. INTRODUCCIÓN Las proteínas morfogenéticas óseas (PMO) son péptidos producidos localmente por los osteoblastos y regulados por mecanismos endocrinos, que pueden influenciar los diferentes procesos de proliferación y diferenciación celular, la síntesis de proteínas y la producción de material óseo. Son reguladores fundamentales en la formación de tejido óseo y en su reparación, influenciando la proliferación y diferenciación de las células mesenquimales indiferenciadas en cartílago o en osteoblastos. La pérdida de gran cantidad de hueso, tras traumatismos o resección de hueso neoplásico, lleva a rellenar ese espacio mediante materiales que funcionan como relleno del espacio vacío. Estos materiales se denominan injertos óseos. Actualmente, la función de soporte y estabilidad puede obtenerse mediante una fijación interna rígida, mientras que el implante o 299 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES injerto soporta un peso y realiza funciones clásicamente llamadas “de entramado” o “de andamio”, para facilitar el crecimiento de hueso nuevo en el huésped. El proceso tridimensional de crecimiento y formación de capilares, de tejido perivascular y de células osteogénicas desde el lecho receptor al interior de la estructura del implante o injerto se denomina osteoconducción (Cardona, 1997). Los injertos que contienen PMO tienen una serie de ventajas sobre los injertos convencionales, principalmente derivadas de que el proceso de formación de nuevo hueso es más rápido. Las implicaciones de estas investigaciones son inmensas, ya que el cirujano puede usar un implante de tipo estructural (andamio) como la hidroxiapaatita y con la ayuda de las PMO se puede promover el crecimiento de nuevo hueso en un tiempo considerablemente reducido. La hidroxiapatita aporta sus propiedades osteoconductivas, mientras que las PMO están proporcionando las propiedades osteoinductivas. El propósito de esta experiencia fue obtener Proteínas Morfogenéticas Óseas parcialmente purificadas. Para ello, a partir de hueso bovino, y mediante sencillos procedimientos fisicoquímicos hemos obtenido una pequeña cantidad de Proteínas Morfogenéticas Óseas parcialmente purificadas, para su posterior ensayo en animales de experimentación. MATERIALES Y MÉTODOS Se recogieron 3 Kg de hueso fresco de bovino (hueso cortical) en un matadero, siendo refrigerados en hielo seco (-40° C). Tras eliminar los tejidos blandos, las epífisis y la médula ósea, se lavaron con agua destilada. Los huesos, tras congelarse, se trituraron manualmente hasta obtener partículas de aproximadamente 1 mm. Mediante un molino Thomas-Willey se obtuvieron partículas no superiores a 150 µm. Posteriormente se adicionó una solución de azida de sodio NaN3 (5 mmol/l) al agua desionizada y destilada para facilitar la limpieza de sangre de los canales vasculares. Para extraer los lípidos se tomaron 1678 g del hueso molido, y se lavaron con una mezcla de cloroformo-metanol (1:1), durante 6 horas, con agitación permanente. Tras la filtración, se dejaron secar a temperatura ambiente. El cloroformo y el metanol son solventes orgánicos que disuelven los lípidos separando las moléculas y ocupando los espacios sobrantes. El metanol convierte las grasas naturales presentes en ésteres y glicerol, siendo estos últimos solubles en agua. El cloroformo desalcoholiza la suspensión. Para provocar una descalcificación se utilizó una solución de ácido clorhídrico (HCl) 0,6 N durante 6 horas con agitación permanente y se filtró el material con papel Warthman n° 1. El producto obtenido se lavó con agua destilada para eliminar el exceso de ácido y estabilizar el pH de la solución. El ácido clorhídrico extrae los fosfatos de calcio que son solubles en ácido, así como también los aminoácidos, péptidos y otras sustancias de bajo peso molecular. A fin de solubilizar el colágeno se adicionó a la muestra una solución de cloruro de calcio (CaCl2) 2 M y ácido etilendiaminotetracético (EDTA) 0,5 M manteniéndolo durante 12 horas a 4°C, con agitación permanente y filtrando posteriormente con papel Warthman n° 1. El cloruro de calcio (CaCl2) es una sal que convierte el colágeno óseo en gelatina permitiendo una rápida separación y solubilización de las PMO, lo que facilita su extracción. El último paso para extraer las proteínas morfogénéticas óseas se realizó partir de la gelatina de matriz ósea insoluble. Para ello se tomaron 504 g y se utilizaron 4 litros de una 300 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES solución a partes iguales de urea 6 M, CaCl2 0,5 M, NEM (N–etilmaleimida) 1 mM y benzamidina HCl 0,1 mM a temperatura ambiente durante 24 horas. Se filtró la solución con papel Warthman n° 1 y se dializó, mediante membranas de diálisis, contra agua destilada durante 3 días a 4ºC (realizando 3 cambios de agua por día), calentando el material (entre 30 y 35 ºC), siempre que fue necesario. El material que quedó en las bolsas de diálisis se centrifugó a 10.000 rpm para obtener un precipitado, el cual se lavó con agua a 4 °C, para posteriormente ser liofilizado. Para la obtención de un producto de buena calidad bacteriológica fue necesario trabajar en estrictas condiciones de esterilidad, y especialmente después de la desmineralización con el ácido clorhídrico, ya que con este procedimiento se elimina la contaminación bacteriológica y viral, y se obtiene un producto prácticamente estéril. Para realizar la liofilización, se tomaron las proteínas refrigeradas y se colocaron en el interior de una cámara de bioseguridad sobre hielo seco para mantener la baja temperatura necesaria para impedir su activación. Posteriormente se comenzaron a envasar en ampollas de vidrio de boca ancha y luego se colocaron en los diferentes mecanismos de aspiración del liofilizador con capacidad para 50 unidades. Tras lograr la sublimación bajo vacío se procedió a flamear el cuello de las ampollas de vidrio, sin quitarlas del equipo, para asegurar su envasado al vacío y su completa esterilización. Finalmente se depositaron en un congelador a -148 °C hasta el día en el que fueron implantadas en animales vivos. Las pruebas realizadas para verificar la correcta extracción de PMO de hueso bovino fueron las siguientes: 1. Prueba de verificación de grasa o prueba de Soxhlet mediante extracción con éter de petróleo y calentamiento moderado. 2. Determinación de calcio por absorción atómica. 3. Prueba tinción de Van Gieson, con fuccsina ácida 0,05% (p/v) en solución de ácido pícrico al 95% saturado. 4. Electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato sódico. Se utilizaron 30 µg/ml de proteína que fue aplicada a un gel de 12,6% con un 3% de Stacking gel a 25 mA. Los geles fueron teñidos con 0,25% de azul brillante de Coomassie y plata. Para la determinación de los pesos moleculares aparentes se utilizaron los siguientes estándares: miosina: 217.000, βgalactosidasa: 126.000, albúmina sérica bovina: 73.000, anhidrasa carbónica. 43.500, inhibidor de tripsina de soja: 31.600, lisozima: 18.000 y aprotinina: 7.500. 5. Prueba BCA de Pierce. Es una formulación detergente compatible, basada en el ácido bicinconínico (BCA) para la detección colorimétrica y cuantificación de proteínas totales. Ello se realiza para conocer la cantidad de proteínas que se habían extraído por medio de los procedimientos químicos anteriormente mencionados. 301 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES RESULTADOS Y DISCUSIÓN El presente estudio no pretende identificar las Proteínas Morfogenéticas parcialmente purificadas obtenidas de hueso bovino. Únicamente pretendemos realizar una estimación de sus pesos moleculares, ya que los equipos y materiales precisos para lograr una completa identificación de las PMO son de costos muy elevados y difíciles de conseguir. Para ello es preciso obtener anticuerpos específicos que reaccionen ante las proteínas conseguidas y un equipo específico para su purificación y caracterización total. El material final obtenido fueron 50 g de PMO, cantidad baja si pensamos que partimos de 3000 g de hueso bovino. Sin embargo es importante tener en cuenta que con cantidad mínima (2-10 mg) son suficientes para inducir diferenciación celular hasta hueso lamelar a las 8 semanas según los investigadores revisados (Kusumoto et al, 1988; Oksanen et al, 1988; Boyan et al, 1992; Viljanen et al, 1996; Fujimura et al, 1997). La bibliografía consultada al respecto, en ningún caso indica los rendimientos obtenidos en cada paso, sólo cita la cantidad de hueso utilizado en la molienda y en algunos casos la fracción final de PMO obtenida. La prueba BCA para determinar la cantidad de proteínas presentes en la muestra nos proporcionó el dato de 1867 µg/ml, aún siendo una cantidad baja, se considera adecuada para inducir osteosíntesis. La extracción de lípidos, para determinar las grasas presentes, mediante el método de Soxlhet, permitió obtener un contenido en grasas del 0,556%. La cantidad de lípidos presentes en la muestra es muy baja, por lo tanto, no afectó al procedimiento químico de obtención de las PMO. Los lípidos interfieren en la estimación precisa de la concentración 302 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES de proteínas en la prueba de BCA. Por lo tanto, aunque la cantidad de lípidos presentes es baja, pudo haber interferido en la cantidad de proteína encontrada. Se obtuvieron 1867 µg/ml de proteínas lo que nos lleva a pensar que la cantidad de proteínas por ml podría ser aún mayor. La valoración del calcio mediante técnicas de absorción atómica determinó que la muestra enviada poseía un 12,69 % de calcio (12,69 g/100 g). La descalcificación al no ser completa afecta la cantidad de proteína extraída en el procedimiento químico impidiendo su liberación (Reddi, 1972). La determinación de los pesos moleculares realizada por electrofóresis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato sódico, permitió observar proteínas con rangos de peso molecular entre 18 y 120 KDa (figura 2). A las PMO obtenidas se les realizó filtración por medio de cromatografía encontrando 3 fracciones de PMO. La fracción I con pesos moleculares entre 100- 700 kDa, la fracción II con pesos moleculares entre 25-55 kDa y la fracción III entre 15-25 kDa, teniendo un componente dominante, con peso molecular de 18 kDa. Los resultados logrados en la presente investigación concuerdan con los hallazgos encontrados en otras investigaciones (Hanamura, 1980; Mizutani, 1982; Urist et al, 1982; Urist et al, 1984; Boyan et al, 1992). Las PMO más importantes presentan pesos moleculares de 12, 18 y 23 kDa. Mizutani y Marshall (1982) obtuvieron PMO de origen bovino, mediante filtración por diferentes métodos, obteniendo proteínas de 22 kDa y fracciones proteicas de 17,5 kDa y 24 kDa. Además de las PMO entre 20 y 40 kDa obtenidas por Ashby et al (1996), encontraron una pequeña fracción de polipéptido soluble en agua de 2,5 kDa, que creemos que en nuestra experiencia pudo haberse disuelto o perdido en los diferentes lavados del procedimiento de obtención. Entre las proteínas encontradas por Wang et al (1988) con 16, 18 y 30 kDa, éstas últimas son las más representativas y de más cantidad y, con las que indujeron formación de cartílago y hueso con 50 ng ultrapurificados. Viljanen et al (1996) y Viljanen y Lindholm (1997) extrajeron PMO de alce y probaron su capacidad osteoinductora por medio de la implantación intramuscular (0,5 - 20 mg) en ratas, la posterior evaluación histológica y radiográfica concluyó que la implantación de 2 mg es suficiente para inducir formación ósea. Si bien las fracciones con pesos moleculares entre 100- 700 kDa y las fracciones con 15-25 kDa (con un componente dominante con peso molecular de 18 kDa) produjeron inducción ósea, en cambio la fracción con entre 25-55 kDa únicamente produjo reacción inflamatoria. Por tanto se debe tener en cuenta que existen fracciones proteicas de menos de 18 KDa que poseen propiedades osteoinductoras. CONCLUSIONES 1. Es posible la obtención de Proteínas Morfogenéticas Óseas (PMO) parcialmente purificadas mediante sencillos procedimientos fisico-químicos a partir de hueso bovino. 2. El procedimiento de extracción precisa cinco etapas básicas: molienda, extracción de lípidos, desmineralización, extracción del colágeno y obtención de la fracción proteica 303 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES 3. Se ha obtenido un material con proteínas de peso molecular entre 18 y 120 Kda. Este material puede ser liofilizado y almacenado en ampollas de vidrio selladas al vacío para su conservación y posterior uso. 4. Mediante este sencillo procedimiento es posible el abaratamiento del producto. Su precio se vería reducido al menos a la quinta parte del precio actual de mercado. BIBLIOGRAFÍA Ashby E, Rudkin G, Ishida K, Miller T. Evaluation of a novel osteogenic factor, bone cell stimulating substance, in a rabbit cranial defect model. 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USA 1988; 85: 9484–9488. 305 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES EFFECT OF THE REPEATED DOSES OF PROSTAGLANDINS ON THE UTERINE DISCHARGES IN THE COWS WITH RETAINED FETAL MEMBRANES HAMALI H., Department of Theriogenology,Faculty of Veterinary Medicine, University of Tabriz, Tabriz-Iran, Tel:+989141145575,Fax: +984113357834 ABSTRACT Long time uterine discharge in the cows with retained fetal membranes (RFM) is the most prominent feature that causes infertility and low conception rate in the dairy cows. For determine of the best prostaglandin injection program for treatment of uterine discharges, a total 150 RFM cows were selected in the farms of Tabriz(north-west of Iran) and randomly categorized in three groups of A,B and C ( n=50). In the group of A, 25mg PGF2α(Lutalyse,Upjohn Ltd, containing 25mg dinoprost as 33.6mg of dinoprost tromethamine with 0.9% benzylalcol as preservative) were injected to cows on 8 and 15 days postpartum. In the group of B, 25mg PGF2α were injected to cows on 8, 15 and 22 days postpartum. In the group of C, 25mg PGF2α were injected to cows on 8, 15, 22 and 29 days postpartum. On day 35 postpartum all of cows were examined by rectal palpation and vaginoscopy for detecting the uterine discharges and endometritis. In the group of A, 17 cases (34%), in the group of B, 9 cases (18%) and in the group of C, no any case (0%) of endometritis were observed. Significant statistical differences were observed between three groups. These results indicated that injections of PGF2α on days 8, 15, 22 and 29 postpartum are necessary for treatment of uterine discharges in the RFM cows. KEY WORDS: cow- prostaglandin- retained fetal membranes-retained placenta INTRODUCTION Long time uterine discharge in the cows with retained fetal membranes (RFM) is the most prominent feature that causes infertility and low conception rate in the dairy cows. When the placenta is not removed completely, a prolonged vaginal discharge follows. In the some cows, even, uterine discharge extended beyond the 50 days of postpartum (6). This feature causes the increased days of open, increased service per conceptive indices, increased calving interval and decreased conception rate. In a study conducted in The Netherlands with 160,000 calving, the relative economic impact expressed in percentage was identified in four main areas: decreased milk production (40%), increased veterinary services (32%), increased culling rate (19%), and increased calving interval (9%)(4). Many approaches have been used to treat or prevent of uterine infections. These include systemic antibiotherapy, intrauterine antibiotic infusion, and intrauterine infusion of antiseptics. None of these methods are completely effective in treating the uterine infections (1). The preference of prestaglandins to the antibiotics in the treatment of uterine infections, already have been proved (7). But, the frequency of the prostaglandin injections have not been determined. The aim of this research was the determining of the best program for prostaglandin injections in the RFM cows. 306 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES MATERIALS AND METHODS From January 2004 - January 2006 a total number of 150 RFM cows in the farms of Tabriz ( north – West of Iran) were selected and randomly divided to three groups of A,B and C (n=50) . After manual removal of their placenta, prostaglandin injection to these cows was begun on 8 days postpartum. In group of A, 25mg PGF2α ( lutalyse, Upjohn Ltd, containing 25mg dinoprost as 33.6mg of dinoprost trome thamine with 0.9% benzylalcol as preservative) were injected to cows on 8 and 15 days postpartum. In group of B, 25mg PGF2α were injected to cows on 8, 18 and 22 days postpartum. In group of C, the same of PGF2α were injected to cows on 8, 15, 22 and 29 days postpartum. On 35 days postpartum all cows in three groups were examined by rectal palpation and vaginoscopy for detecting the uterine discharge and endometritis. RESULTS In the group of A, 17 cases (34%) and in the group of B, 9 cases (18%) of cows with uterine discharges were detected. In the examination of the cows in group of C, uterine discharge or endometritis were not detected (0%) (Fig.1). 50 Per percent of uterine discharge 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Group A Group B Group C Fig.1. Percentage of uterine discharge in three groups of A (2 injections of PGF2α ), B (3 injections of PGF2α ) and C (4 injections of PGF2α ) on 35 days of postpartum. Collected data from three groups of cows, analyzed by statistical method of chi-square and statistical differences were observed between three groups (P≤0.05). 307 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES DISCUSSION The syndrome of retained fetal membranes (RFM) in the cows is one of the most important problems that affect cows in the farms of Iran and other countries. Many approaches have been used to detach RFM. These include manual removal, attachment of a weight to the membranes to speed expulsion and administration of uterokinetic drugs, sulfonamids, prostaglandins (6), antibiotics, antiseptics and hormones. A new approach for the treatment of RFM is the injection of collagenase into the umbilical arteries retrieved from RFM (2, 3). However, after the expulsion or manual removal of the RFM.(5), the long time uterine discharge is a very serious problem in this cows. Previous researchers have been emphasized that in treatment of uterine infection, PGF2α is more efficacious than antibiotics (7). But the dose and frequency of prostaglndin have not been determined yet. For this reason, in this research we focused on the frequency of the prostaglandin treatment and our results indicted that the injections of the 25mg PGF2α on 8, 15, 22 and 29 days postpartum are necessary for treating the uterine discharges in the RFM cows. REFERENCES Drillich M., Mahlstedt M., Reichert U., Tenhagen B.A., Heuwieser W.: Strategies to improve the therapy of retained fetal membranes in dairy cows. J Dairy Sci. 2006 Feb; 89 (2): 627-35 Eiler H., Hopkins F M.: Bovine retained placenta: Effects of collagenase and hyaluronidase on detachment of placenta. 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Theriogenology Vol.25, NO.3, 1986, P: 353381. 308 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES ECOGRAFIA DEL CAPEZZOLO MEDIANTE IMMERSIONE IN ACQUA: VALUTAZIONE NELLA BOVINA IN LATTAZIONE E ASCIUTTA ULTRASONOGRAPHY OF TEAT BY WATER-FILLED CUP: EVALUATION IN LACTATING AND DRIED COWS DE DOMENICO A., PARISI F., LA SPISA M.*, PUGLIESE M., NIUTTA P.P., DE MAJO M. Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie – Università di Messina (Italia) - * Med. Vet. collaboratore esterno KEY WORDS: Teat, ultrasonograpy, water filled cup, cows. SUMMARY In bovine medicine, examination of the teat is an important application. Ultrasonography allows for the localization and demarcation of the extent of teat stenoses and other abnormalities of the teat. The objective of this study was to evaluate various kinds of waterfilled cup ultrasonography technique on teats and the different aspects of ultrasonic images of teats in lactation and in the dry period (measurement of teat canal length, teat diameter, cistern diameter and teat wall thickness). Clinical and ultrasonographic teat examinations of 30 multiparous cows (all Holstein-Friesian, 15 lactating and 15 dried) were performed. Ultrasonography was performed using Esaote-falco-100® ultrasonography units with linear 2-D transducer (6-8 MHz). The good cup was small, with thin wall and slightly flexible (7 cm diameter, 12 cm height, 0.5 mm thickness). Significant differences emerged between lactating and dried cows. In some cows we found teat stenosis. Ultrasonography of teats by water-filled cup is useful for appraising the different aspects of teats in dried and lactating cows, but it is important to utilize a suitable cup. This technique could be useful to diagnose anomalies of the teat that could lead to mastitis. INTRODUZIONE L’incremento produttivo e l’esigenza di avere sempre maggiori prodotti di qualità, nel rispetto della sicurezza alimentare, hanno portato negli ultimi anni ad un innalzamento degli standards igienico-sanitari della produzione e all’immissione di sistemi di indagine articolati e sofisticati. In particolar modo questi sistemi operativi hanno trovato applicazione nella produzione lattea, dove si richiede una riduzione assai marcata delle cellule somatiche e la presenza di requisiti sempre più intransigenti per il conferimento dei premi di qualità. Questo comporta una maggiore attenzione da una parte, ai processi infettivi ed infiammatori della ghiandola, con particolare riguardo alla prevenzione e a tutti quei fattori responsabili di entità nosologiche, dall’altra ai diversi distretti: cisterna capezzoli dotti galattofori e sfinteri. Quest’ultimi oltre a rendere difficili le operazioni di mungitura, possono rappresentare i pabula laeta per l’insediamento di processi patologici responsabili di entità di non trascurabile interesse. Va considerato che le stesse operazioni di mungitura sono capaci di provocare alterazioni, a volte patologiche, dei capezzoli (7, 9, 18, 19 ). Quindi, se da un lato attraverso l’esame clinico dell’organo è possibile giungere ad una diagnosi e, talvolta ad una prognosi, in molti casi si ha la necessità di ricorrere ad esami più approfonditi, come ad esempio l’esame ecografico, strumento non invasivo di facile 309 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES applicazione che consente la valutazione della morfologia e della struttura dell’organo stesso, portando all’identificazione di eventuali processi patologici. Oltre alle già consolidate applicazioni dell’indagine ecografia nel campo della ginecologia, l’ecografia della ghiandola mammaria e del capezzolo possiede interessanti potenzialità nell’allevamento di vacche da latte ad alta produzione. Infatti, le informazioni che si possono ottenere, accompagnate dai risultati dell’esame obiettivo particolare (E.O.P.) dell’organo e degli esami di laboratorio, risultano particolarmente utili per formulare una diagnosi, emettere una prognosi ed effettuare terapie appropriate (4, 5, 6). L’esame clinico del capezzolo, riveste un ruolo fondamentale per lo stato sanitario della mammella in toto in quanto, essendo di fatto la “porta dell’organo con il mondo esterno”, l’insorgenza di processi mastitici spesso dipende dalla sua integrità (6, 16). Allo scopo di valutare l’integrità anatomica del capezzolo, diversi Autori hanno studiato la possibilità di applicare l’ecografia attraverso l’utilizzo di diverse metodologie (1, 10, 17). Queste applicazioni ecografiche, attraverso alcune misurazioni (lunghezza e diametro del canale, diametro della cisterna, spessore della parete), hanno consentito di correlare eventuali modificazioni alle tecniche di mungitura meccanica e al prolungamento della stessa (8, 11, 12, 13, 14, 15). Obiettvi del presente lavoro sono stati la valutazione in campo di differenti tipi di contenitori da utilizzare per l’esame ecografico del capezzolo immerso in acqua e, ancora, la valutazione delle modificazioni delle strutture anatomiche del capezzolo in relazione alla fase di lattazione e di asciutta. MATERIALI E METODI Sono state utilizzate 35 bovine di razza Holstein-Friesian, multipare, allevate in una azienda zootecnica sita nella provincia di Ragusa (Italia). Dei 35 animali, 20 erano in lattazione (metà lattazione) e 15 in asciutta (da 9-30gg). Dall’anamnesi remota, risultava che alcuni animali avevano presentato in passato episodi mastitici, trattati farmacologicamente con successo. L’anamnesi prossima di alcune bovine in lattazione (n° 5) riportava svuotamento difficoltoso dei quarti mammari alla mungitura meccanica, infatti nell’unità di tempo si raccoglieva meno latte rispetto alle mungiture precedenti. Su tutti gli animali sono stati effettuati esame obiettivo generale (E.O.G.), l’esame obiettivo particolare (E.O.P.) della mammella in toto ed, infine, sulle bovine sane (15 in lattazione e 15 in asciutta), l’esame ecografico del capezzolo mediante immersione in acqua. All’esame ispettivo della mammella e del capezzolo, era possibile registrare in due bovine alterazioni a carico dei meati esterni dei condotti papillari con ispessimento cutaneo (casi 1-2) (Fig. 9-10) e difficoltà nello svuotamento dei quarti; alcun sintomo degno di nota nelle altre. Per effettuare le indagini ecografiche, è stata utilizzata una macchina portatile Esaote-falco100® (Pie Medical Equipment B.V.–Philipsweg 1 6227 AJ Maastricht The Netherlands) con sonda da 6-8 Mhz. Le video-immagini sono state registrate mediante masterizzatore DVD+RW ed acquisite su Personal Computer. Tutte le ecografie sono state realizzate in sala mungitura (Fig. 1) ad una temperatura ambientale di 27°C±2. Per ottenere delle buone immagini ecografiche sono stiti valutati sperimentalmente quattro tipi di contenitori plastici diversi per forma e consistenza: 1. bicchiere comune di plastica per uso alimentare (Fig. 2); 2. contenitore per detersivo da bucato, con impugnatura e ritagliato nella parte inferiore (fig.3); 310 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES 3. 4. contenitore artigianale in plexiglass con 2 supporti (orizzontale e verticale) per la sonda ecografica, dalle dimensioni di 15x15x15 cm e dello spessore di 3 mm nella porzione di contatto con la superficie di lettura della sonda (Fig. 4); contenitore per paillettes da fecondazione artificiale di dimensione 7x12x0.05 cm rispettivamente di diametro, altezza e spessore (Fig. 5). Per la valutazione dei contenitori sono stati considerati: qualità dell’immagine ecografica e praticità di esecuzione dell’esame. Nella superficie di contatto tra sonda e contenitore è stato applicato del gel ecografico. Le ecografie sono state effettuate su tutti i capezzoli delle 30 bovine, sia in scansione orizzontale che verticale, in modo da comprendere il capezzolo dal meato esterno del condotto papillare fino alla piega anulare del seno galattifero. I contenitori, riempiti con acqua corrente alla temperatura di 18°C, prima di passare da un capezzolo all’altro, venivano lavati e disinfettati con clorexidina. Sui capezzoli delle 30 bovine sane sono state effettuate le seguenti misurazioni morfo-metriche: (a) lunghezza del canale (Teat Canal Length, TCL); (b) diametro (Teat Diameter, CD); (c) diametro della cisterna misurata a 10 mm da (b) (Cistern Diameter, CD); (d) spessore della parete (Teat Wall Thickness, TWT) (fig. 6). Le misurazioni di (b) e (d) sono state realizzate anche in scansione orizzontale, mentre le altre esclusivamente in verticale. Le misure dei vari distretti considerati, sono state effettuate mediante software applicato alle immagini acquisite su PC. Per tutte le misure sono stati calcolati valore medio e deviazione standard sia nelle bovine in lattazione che in asciutta. I valori sono stati confrontati mediante test di Student con significatività statistica per P < 0.001. RISULTATI Per quanto riguarda il contenitore n°1 (bicchiere di plastica), le immagini ecografiche ottenute risultavano di qualità media anche se, datii i bruschi movimenti dell’animale, la rottura del bicchiere era una evenienza frequente. Utilizzando il contenitore n° 2, comodo da maneggiare per la presenza dell’impugnatura ergonomica, si ottenevano buone immagini, ma l’eccessivo contenuto in acqua portava ad un esagerato affaticamento dell’operatore dopo pochi minuti di utilizzo. Il terzo contenitore (n° 3), oltre ad essere poco pratico per le stesse motivazioni espresse per il contenitore precedente, dava delle immagini con presenza di artefatti di riverberazione nella porzione prossimale dell’immagine ecografica (Fig. 7). L’ultimo contenitore (n° 4), oltre ad essere perfettamente dimensionato per il capezzolo bovino, ha permesso di ottenere eccellenti immagini ecografiche sia in scansione orizzontale che verticale; inoltre era possibile realizzare scansioni apicali (Fig. 8), ponendo la sonda sulla base dello stesso. L’esame ecografico dei capezzoli degli animali positivi all’E.O.P. (casi 1-2) ha fatto emergere allo stesso livello, un tipico aspetto iperecogeno, riconducibile a processi infiammatori cronici (Fig. 9a-10a). Per gli altri soggetti negativi all’E.O.P., in tre casi è stato possibile mettere in evidenza processi patologici. In una bovina (Caso 3 - fig. 11) si osservava ecograficamente una neoformazione ecogena (lunghezza 3,4 cm) a livello della cisterna del capezzolo, il canale era anecogeno e quindi dilatato, edema di una porzione della mucosa della cisterna e, nello spessore della parete, una varice di 1 cm di diametro. Nei casi 4 (Fig. 12) e 5 (Fig. 13) si repertavano strutture ecogene, riconducibili a neoformazioni, all’interno del canale del capezzolo che lo ostruivano a gradi differenti. Tutti i casi patologici riportati sono stati 311 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES riscontrati in bovine in lattazione. Nelle figure 14-15 e 16-17 vengono riportati alcuni aspetti ecografici di capezzoli fisiologici rispettivamente in asciutta e in lattazione. I risultati delle misurazioni, delle deviazioni standard e del confronto statistico tra le stesse nei due gruppi vengono riportate in tabella 1. Le misurazioni (c) e (d) relative agli animali in asciutta non sono state effettuate in quanto l’aspetto ecografico non consentiva una misurazione precisa. CONSIDERAZIONI E CONCLUSIONI E’ oramai accertato che l’ecografia del capezzolo nella bovina risulta un potente strumento diagnostico. In precedenti indagini gli stessi Autori avevano valutato la possibilità di effettuare l’ecografia del capezzolo sia poggiando il trasduttore direttamente sulla cute, che previa immersione del capezzolo in acqua (5), mediante l’utilizzo di un condom o di differenti contenitori plastici così come suggerito da altri Ricercatori (1, 2, 3, 13). Riscontrata la possibilità di ottenere buone immagini utilizzando le tecniche per immersione, è stato ritenuto interessante approfondire le conoscenze sull’utilizzo di un contenitore standardizzabile, di facile reperimento, dal prezzo modesto con il quale si potessero ottenere immagini di qualità superiore ed il cui uso risultasse assolutamente pratico. Dall’analisi delle differenti tecniche, si evince come l’utilizzo della sonda applicata direttamente sulla cute, ma anche attraverso l’interposizione di un condom riempito di acqua, risulti poco pratico. Difatti il sistema sonda-capezzolo, è eccessivamente mobile in entrambi i casi e ancora per effetto della forza di gravità, il condom ripieno di acqua tende a scivolare verso il basso e la porzione dorsale del capezzolo non è sempre ben leggibile. Inoltre la necessità di mantenere il capezzolo in posizione corretta (interfaccia sonda capezzolo), porta spesso alla deformazione dell’organo; sulla superficie al disotto della sonda si esercita una compressione e su quella opposta alla sonda, una deformazione causata dalla digito-pressione esercitata dall’operatore. In questi casi le immagini risultavano spesso artefatte. Tra i differenti contenitori utilizzati nel presente lavoro, quello assolutamente pratico e con il quale si ottengono le migliori immagini è risultato il n° 4: involucro per paillettes da fecondazione artificiale. Oltre ai motivi sopra esposti, l’utilizzo di questo contenitore ha permesso di effettuare scansioni apicali, utili soprattutto nella valutazione della porzione distale del capezzolo, spesso interessata da processi patologici. L’ennesima dimostrazione del potere diagnostico della tecnica ecografica per immersione effettuata con un buon contenitore è stata dimostrata dal fatto di diagnosticare patologie del capezzolo che non erano emerse all’ E.O.P.. Le lesioni riscontrate sui meati esterni dei capezzoli nei casi 1 e 2, erano causate verosimilmente dall’impianto di mungitura non perfettamente calibrato (eccessiva depressione) e da alcune tettarelle particolarmente usurate. Relativamente all’aspetto ecografico che assume il capezzolo in asciutta, si è visto come questo sia diffusamente ecogeno a dimostrazione di una sua significativa riduzione di volume con conseguente collabimento delle pareti mucose della cisterna; questi aspetti sono dimostrati dalla diminuzione della TCL (lunghezza del canale del capezzolo) e del TD (diametro del capezzolo). L’aspetto ecografico, riscontrato in tutte le bovine in asciutta, ha reso difficoltose le misurazioni del CD (diametro della cisterna del capezzolo) e dello TWT (spessore della parete del capezzolo), in quanto, i limiti morfo-strutturali utilizzati per le misurazioni non risultavano ben differenziati e le relative misurazioni sarebbero state approssimative. Concludendo, si ritiene che la metodica ecografica mediante immersione 312 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES del capezzolo in acqua, realizzata in modo standardizzabile, possa permettere, oltre alla diagnosi di patologie difficilmente rinvenibili mediante il comune E.O.P., la possibilità di effettuare valutazioni morfo-strutturali tali, da esprimere importanti considerazioni in quei periodi particolarmente delicati, rappresentati dalla messa in asciutta della bovina e dalla ripresa della lattazione. Il mancato riscontro di queste modificazioni morfo-strutturali a carattere protettivo potrebbe rappresentare un importante fattore di rischio per l’insorgenza di processi infettivi di tipo ascendente del quarto mammario. IMMAGINI E TABELLE Fig 1 Fig 2 Fig 3 Fig 4 Fig 5 Fig 6 313 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Fig 7 Fig 8 Fig. 9a Fig 9 Fig 9a 314 Fig 10 Fig 10a XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Fig. 11 Fig 12 Fig. 13 Fig 14 Fig 15 Fig 16 315 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Fig. 17 BIBLIOGRAFIA Ayadi M, Caja G, Such X, Knight CH. (2003). Use of ultrasonography to estimate cistern size and milk storage at different milking intervals in the udder of dairy cows. J Dairy Res. Feb;70(1):1-7. Babkine M. (2004). Ecografia del capezzolo e della mammella. Esami complementari in clinica bovina. pp.100-104. Ed. Point Veterinaire Italie s.r.l. Beal, W.E., Perry R.C. and Corah, L.R. (1991). The use of ultrasound in monitoring reproductive physiology in beef cattle. Journal of Animal Science 70: 924-929. David E. Gleeson, Edmond J. 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Machine induced teat tissue reactions and infection risk in dairy herd free of contagious mastitis pathogens. Journal of Dairy Research 59: 265- 271. 317 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES ENDOPARASITES IN A FLOCK OF ZERASCA, AN ITALIAN AUTOCHTONOUS BREED OF SHEEP PERRUCCI S. 1, BIANCHI C. 1, BENVENUTI N. 2, GORACCI J. 2, FICHI G. 1, GIULIOTTI L. 2 1 Dipartimento di Patologia Animale - Profilassi ed Igiene degli Alimenti - Faculty of Veterinary Medicine, University of Pisa (Italy) 2 Dipartimento di Produzioni Animali - Faculty of Veterinary Medicine, University of Pisa - Viale delle Piagge, 2 – 56124, Pisa (Italy); Tel: +39.050.2216893; Fax: +39.050.2216901; E-mail: [email protected] ABSTRACT In this work the endo-parasites of Zerasca sheep, an autochthonous breed of Tuscany (Italy), were investigated for the first time. The evaluation of the zootechnical risks linked with these diseases and of the efficacy of control measures used in the examined flock represented other important aims. During a period of 15 months, individual faecal and blood samples were collected monthly from 45 animals. Blood samples were used to evaluate the Packed Cell Volume (PCV), while on faecal samples parasitological analysis were performed with flotation tests, a modified McMaster method and with sedimentation. Quantitative data of gastrointestinal nematodes (EPG) and coccidian (OPG) were statistically analyzed. Results obtained show the presence in the flock of coccidia, gastrointestinal and lung strongyles, whip-worms, cestodes (Moniezia benedeni) and flukes (Dicrocoelium dendriticum, Fasciola hepatica and Paramphistomidae). All these parasites can be responsible for negative effects on sheep productions. EPG number resulted highly influenced (P<0.01) by the date of sampling, while PCV and EPG values showed a negative correlation (P<0.01). Significant influence between OPG and data of sampling and age of animals (p<0.001) was also found. The use of collective pastures represents the main characteristic of the breeding of Zerasca sheep. Thus, in our opinion the use of common management practices are fundamental for an efficacious control of the endo-parasitic diseases in this autochthonous breed. KEY WORDS: sheep, Zerasca breed, autochthonous breed, endoparasitic diseases, prevalence, seasonal variability, zootechnical risk, control. INTRODUCTION Zerasca sheep is a native Italian breed with endangered status. Today, Zeri lamb has a considerable economic impact on the territory, ensuring increasing profits for shepherds. The Zeri region is located in northwest Tuscany at an altitude of 600-1200 m in the Lunigiana countryside, where natural pastures and woods of chestnut, beech, alder, hazel and acacia are the most important sources for animal nutrition. Moreover, the climate is generally extremely variable, implying inconstant quantitative and qualitative grazing land productions. This situation has considerable effects on meat production, forcing breeders to provide nutrition for the animals in winter and in summer, requiring them to send the flocks to high altitude territory, where there is greater availability of grass. Generally, mothers lead their lambs to pasture all year round, except for winter periods, when they 318 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES are kept indoors, due to adverse climatic conditions. However, regular and frequent rainfall assure the good fertility of the land (Verità et al., 2001). Zeri is an example of the younger generation’s determination to keep sheep breeding closely connected to the territory. Thus, after a period of total abandonment and serious risk of extinction, the Zerasca breed has begun to recover, thanks to various public interventions (Mountain Communities, Local Administration and Agencies, Pisa University) and to the aforementioned determination of individual farmers - especially women - organized by a Consortium (“Consortium for the Valorization and Safeguarding of Zerasca Sheep and Lambs”) born in 2001. Zeri lamb is a sturdy animal, medium-large in size and with a white fleece. Zeri sheep have milk high in nutrients. Lambs are usually slaughtered at the age of 60-90 days for the production of heavy lambs (Martini et al., 1993). Moreover, it is important to underline that Zeri has another typical production associated with sheep breeding: the “mezzalana”, a mixture of wool and hemp used for the manufacture of socks, sweaters, carpets, mattresses, pillows and special long full skirts (the traditional women’s clothing) (Verità et al., 2001). Parasitic diseases represent one of the most important health problem of sheep in Italy (Ambrosi, 1995). Among them, endo-parasitic diseases greatly impairs animal productivity trough reduction in voluntary food intake and/or decrease in the efficiency of nourishments, particularly, in the inefficient use and absorption of nutrients. Disturbance in protein metabolism and reduced assimilation and/or retention of minerals are particularly significant. As a consequence, growth, milk, wool production and reproductive efforts could be reduced in parasitized animals. Pathological lesions caused by endoparasites can lead to the exclusion from human nutrition of slaughtered and infected animals or be responsible for severe clinical forms, particularly in young animals even till death (Casarosa, 1985; Ambrosi, 1995; Urquhart et al. 1996; Coop and Kyriazakis, 2001; Cringoli, 2003). For all these reasons, an efficient control of endoparasitic diseases results extremely important in sheep breeding. Thus, for the first time, in the present study the endo-parasitic diseases present in a flock of Zerasca sheep were investigated. The evaluation of the zootechnical risks linked with these diseases and of the efficacy of control measures used in the examined flock represented other important aims of this work. MATERIALS AND METHODS In the present study parasitological analysis were performed in order to: 1. know the endoparasites of Zerasca sheep; 2. evaluate the prevalence and variability of each endoparasitosis in the course of a year; 3. assess the zootechnical risks linked with the endoparasitoses present in the flock; 4. estimate the efficacy of control measures used in the farm. Flock The farm breed 90 ewes for heavy lamb production (22-35 kg of live weight in 60-90 days). It is located at an altitude of 800 m a.s.l., typified by a climate midway between Mediterranean and Continental conditions. During the course of the study animals were treated with Febendazol (Panacur) in April 2004. 319 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Sampling From January 2004 to March 2005, faecal and blood samples were collected monthly from 45 animals (36 sheeps and 9 lambs). Blood samples Blood samples were collected from the jugular vein and PCV was estimated by capillary microhematocrit analysis using a hematocrit centrifuge (Centrifugette 4203 ALC®). Faecal samples Faecal samples were individually collected directly from the rectal ampoule and individually examined quail-quantitatively as follow. Qualitative methods (Ambrosi, 1995; Urquhart et al. 1996 ; Gibbson et al., 2005) Flotation test by using a low specific gravity solution (s.g.: 1.200) for the search of: coccidia, gastrointestinal nematodes (gastrointestinal strongyles, Trichuris spp.) and cestodes. Flotation test by using a high specific gravity solution (s.g.: 1.450) for the search of Dicrocelium dendriticum. Baermann method for the search of lung strongyles that were identified at the species level. Sedimentation method for detecting Fasciola hepatica and Paramphistomidae. Faecal cultures to obtain the infective L3 stage of gastrointestinal strongyles (Henriksen and Horsholm, 1983) in order to identify the genera (M.A.F.F., 1986) that were expressed in percentage. Quantitative methods (Permin and Hansen, 1998) Modified McMaster Method to estimate the FEC of gastrointestinal strongyles (EPG) and Eimeria spp. (OPG). Statistical Analysis (J.M.P., 2002) Quantitative data were statistically analyzed by ANOVA. The tested factors in the model were represented by data of sampling, age of animals and physiological status (peri-parturient period: about one month before and after the parturition). Data regarding strongyles eggs and coccidia oocysts were logarithmic transformed [y = log(X + 25)] to normalize variance (Baker et al., 1997). Post-drench samples (May and June 2004) were excluded from statistical analysis. 320 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES RESULTS Dicrocoelium dendriticum and Paramphistomidae prevalence was high during all the year (mean values 97.3% and 71.2% respectively), showing that sheep grazed in extremely contaminated pastures. Their seasonal fluctuation was in accordance with previous studies on other italian sheep breeds, confirming a summer decrease for D. dendriticum and a spring rise and an autumn decrease for Paramphistomidae. The prevalence found for flukes (Fig.1) could be linked with possible productive performance losses (Ambrosi, 1995; Urquhart et al., 1996). Fig. 1. Monthly fluctuation of the three different species of Trematodes. FH PF DD 100 % 80 60 40 20 M ar . '0 4 A pr .'0 4 M aj ' 04 Ju n. ' 04 A ug .'0 4 Se p. '04 O ct .'0 4 N ov . '0 4 D ec . '0 4 Ja n. ' 05 M ar . '0 5 0 Month If compared with the other species, the prevalence of F. hepatica resulted lower, and it was not constant during the year. Among cestodes, Moniezia benedeni resulted the unique species isolated. Trend showed a spring and autumn rise, in accordance with other italian sheep breeding realities (Ambrosi, 1995). Whip worms had a non-linear prevalence in the year, showing a trend similar to cestodes. As reported in other Italian areas (Ambrosi, 1995), isolated lung strongyles (Cystocaulus ocreatus, Dyctyocaulus filaria, Mullerius capillaris, Protostrongylus rufescens, e Neostrongylus linearis) showed an autumn and winter rise, even with an inconstant distribution along the year. Strongyloides papillosus showed a not regular prevalence, with peaks that appeared to be related with lambing. Gastro-intestinal strongyles (Fig. 2) were constantly present in faecal samples (Fig. 3). 321 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Fig. 2. Monthly variation of gastro-intestinal strongyles genera (%). Month February March April May June July August September October November December February March Year 2004 2004 2004 2004 2004 2004 2004 2004 2004 2004 2004 2005 2005 Cooperia 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 Chabertia Haemonchus Oesophag. Bunostomum Ostertagia Trychostr. 2.5 6.4 51.3 0 20.5 19.2 0 19.1 14.2 0 3.8 4.3 18.8 8.6 21.11 0 31.7 18.4 0 50 0 0 50 0 0 0 5.3 0 87.3 1.9 2.2 18.6 4.9 0.7 34.9 38.6 19.5 11.7 24.4 1.1 22.4 19.3 5 7.7 23.6 0 46 24.8 4.3 17.3 17.4 0 26.1 34.8 1.5 8.8 8.8 0 27.9 50 0 0 0 0 46.1 46.1 3.6 0 1.9 0 15.3 78.3 16.4 6 20.1 0 10.4 43.3 Strongyloides 0 53.5 1 0 5.4 0 0 0.6 0 3 7.7 0 3 Fig. 3. Gastro-intestinal strongyles prevalence. Marc Dece Octo Augu May Marc 150 100 50 0 A comparable trend of FEC in the period comprised from January to April 2004 and from May 2004 and April 2005 was observed with a decrease of FEC in April just after the time of large infection (Fig. 4). Figure 4. Trend of FEC and PCV. 322 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES March January November September July 2004 May 2004 March January March Decem Octob Augus May March Coccidia prevalence was constantly high with young animals showing a larger number of OPG than adults (Fig. 5). An OPG reduction after the treatment with the anthelmintic drug (April) was noticed (Fig. 6). This result seem to suggest a possible indirect action of the anthelmintic treatment, with the enhancement of the whole physiological response of the animals. Fig. 5. Coccidia prevalence. Fig. 6. Trend of OPG during the trial. 150 100 8000 50 6000 0 4000 2000 0 Statistical analysis (J.M.P., 2002) showed a non significant influence between FEC, age of animals and their physiological status, while revealed significant influence of data of sampling on FEC (p<0.001), negative correlation between FEC and PCV and significant influence between OPG and data of sampling and age of animals (p<0.001). CONCLUSIONS Results obtained showed the presence in the flock of coccidia, gastrointestinal and lung strongyles, whip-worms, cestodes (Moniezia benedeni) and flukes (Dicrocoelium dendriticum, Fasciola hepatica and Paramphistomidae). All these parasites, alone or in association, can be responsible for negative effects on sheep health and productions (Urqhuart et al., 1996). Seasonality of all isolated endoparasites resulted similar to other italian sheep breeds (Ambrosi, 1995) and prevalence resulted higher in spring and autumn in most of them. This was confirmed also by statistical analysis for coccidia and gastrointestinal strongyles. Endoparasitic diseases control methods used in the flock were not satisfactory at all and represented by nutrient supplementation of the diet in winter: young animals and late pregnancy or early lactation sheeps often can’t get enough protein from pastures, especially from low quality grazing lands (Louvandini et al., 2006). In addition, the farmer systematically used two anthelmintic treatments, particularly against strongyles (Albendazol, Gardal in December 2003; Febendazol, Panacur in April 2004). These drugs are efficacious also against other nematodes, against cestodes and, only partially, against flukes. On the basis of data obtained in the present study, it is possible to suggest the following other measures for a more efficacious control of endoparasitic diseases: 1. nutrient supplementation differenced on the basis of animal age and peri-parturient period (Kyriazakis and Houdijk, 2006); 2. treatment more targeted against flukes and coccidian, 323 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES according to animal age and endoparasitic infection (necessity for a continuous parasitological monitoring in the flock); 3. use of other non-chemical worm control methods, such as selection for resistance and grazing management. However, the frequent utilize of collective pastures represents the main characteristic of the breeding of Zerasca sheep. Thus, in our opinion, the use of common control measures and management practices are fundamental for an efficacious control of the endo-parasitic diseases in Zerasca sheep, in order also to reach a real valorization and safeguarding of this autochthonous breed of Tuscany. REFERENCES Ambrosi M. (1995). Parassitologia Zootecnica. Ed. Edagricole, Bologna (Italy). Casarosa L. (1985). Parassitologia degli animali domestici. Ed. Ambrosiana, Milano. Coop R.L. and Kyriazakis I. (2001). Influence of host nutrition on the development and consequences of nematodes parasitism in ruminants. Trends in Paras., 17: 325-330. Cringoli G. (2003). Mappe parassitologiche. Ed. Litografia Vigilante s.r.l., Napoli. Gibbons L.M., Jacobs D.E., Fox M.T., Hansen J. (2005). The RVC/FAO guide to Veterinary Diagnostic Parasitology. Part 1 Ruminants: faecal examination for helminth parasites. www.fao.org/ag/againfo/resources /documents/Parasitology/Index/Index.htm. Henriksen A. and Horsholm H. (1983). 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E-mail: [email protected] ABSTRACT The climatic conditions in NW Spain enhance the presence of the trematoda Fasciola hepatica, Dicrocoelium dendriticum and Calicophoron daubneyi, and these parasites may cause elevated economical losses. A study to know the true prevalence of these trematodosis was conducted, and the liver, rumen and abomasum of 334 cattle slaughtered in NW Spain were examined. The prevalence of fasciolosis was 29%, 1.5% for dicroceliosis and 11.2% for paramfistomosis. By considering the origin of the samples, we observed the highest seroprevalence of fasciolosis and paramfistomosis in Ourense (80% and 100%, respectively), and in Lugo for dicroceliosis (1.4%). The greatest seroprevalence of fasciolosis was observed in the oldest cattle (36%), whereas that of dicroceliosis in cattle under 2 years and that of paramfistomosis in 3-6 yr cattle. One surprisingly result was the elevated prevalence of fasciolosis, because of the number of treatments/year has been significantly increased. These results mark the needed for control-measures to reduce the presence of F. hepatica and C. daubneyi especially. INTRODUCCIÓN Los sistemas de explotación extensivos o semi-extensivos empleados en la cría del ganado bovino, aumentan de forma notable las posibilidades de que los animales adquieran infecciones de etiología parasitaria. Tienen especial importancia las trematodosis, siendo las más frecuentes las ocasionadas por Fasciola hepatica, Dicrocoelium sp., y distintos géneros de la familia Paramphistominae. Los dos primeros en estado adulto se localizan en el hígado y vesícula biliar, mientras que los paramfistomas adultos se localizan en el rumen y con menor frecuencia en el retículo de sus hospedadores definitivos. Todos ellos ocasionan importantes pérdidas económicas debido al descenso de la productividad de los animales (Díaz et al., 2001; Padungtod et al., 2001) al decomiso de órganos en el matadero (Rangel-Ruíz et al., 2003), e incluso a la mortalidad (Boray, 1959). La similitud entre la fase externa del ciclo de Calicophoron daubneyi y Fasciola hepatica es tal, que incluso comparten el mismo hospedador intermediario, caracoles acuáticos del género Lymnaea (Szmidt-Adjide et al., 2003), por el contrario el ciclo endógeno en ambos parásitos es muy distinto, en el caso de Calicophoron daubneyi, tras la ingestión de las metacercarias infectivas que se encuentran fijadas en la hierba, éstas se desenquistan en el duodeno, liberando las adolescarias que se fijan en la mucosa y a partir de las 6-8 semanas regresan al abomaso y posteriormente al rumen, en donde se asientan definitivamente entre las microvellosidades, para después de unas 3-4 semanas comenzar la puesta de huevos que 325 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES se eliminan con las heces del hospedador. La fase interna del ciclo de Fasciola hepatica comienza también con la liberación de las adolescarias en el intestino, pero en este caso las fasciolas juveniles emigran atravesando el parénquima hepático hasta los conductos biliares, en donde maduran y comienzan a eliminar huevos con las heces de los animales. El ciclo de Dicrocoelium sp. evoluciona en su fase externa en moluscos terrestres y hormigas, y en estado adulto se localiza al igual que Fasciola hepatica en conductos biliares y vesícula biliar. El norte de España ofrece las condiciones apropiadas para el desarrollo de la fase externa del ciclo vital de F. hepatica y de C. daubneyi, desde los factores climáticos con temperaturas suaves y lluvias abundantes durante gran parte del año, hasta las edáficas ya que son frecuentes los terrenos llanos y poco drenados que constituyen los hábitats idóneos para el caracol Lymnaea truncatula. La presencia de Dicrocoelium sp. por el contrario está tradicionalmente ligada a terrenos calcáreos, en pastos de montaña y asociada fundamentalmente al ganado ovino, siendo reciente la primera denuncia de este trematodo en ganado vacuno en Galicia (Morrondo et al., 2003). El diagnóstico rutinario y directo de estas parasitosis consiste en la observación de huevos de los trematodos en las heces de los animales parasitados, sin embargo, a menudo pasan desapercibidas infecciones de baja intensidad, y además hay que esperar a que los parásitos alcancen la madurez sexual para poder encontrar huevos en las heces. Por esta razón, se han desarrollado diferentes técnicas inmunoenzimáticas, como el ELISA (directo e indirecto), para detectar la presencia de antígenos parasitarios y de anticuerpos específicos (IgG), sin embargo los datos obtenidos, son un poco discordantes al emplear las distintas técnicas. Por todo ello, el objetivo de este trabajo es conocer de forma directa la prevalencia de las trematodosis hepáticas y gástricas, en bovinos sacrificados en Galicia. MATERIAL Y MÉTODOS El estudio se llevó a cabo desde febrero de 2004 hasta junio de 2006. Una vez a la semana se recogieron hígados, vesículas biliares y rúmenes-retículos de bovinos sacrificados en el matadero local Novafrigsa (n=406). Cada uno de los órganos examinados se identificó teniendo en cuenta el animal del que procedía y se tomó nota de la edad, raza y procedencia del mismo, después de un meticuloso examen de dichos órganos, los ejemplares parásitos recolectados se identificaron y se contaron. Para establecer si la prevalencia de parasitación estaba relacionada con la edad, raza o zona de procedencia de los animales, se agruparon del siguiente modo: Así, según la edad de los animales distinguimos tres grupos: grupo 1, ≤ 2 años, (2% de los animales); grupo 2, 3-6 años, (36% de los animales) y grupo 3, ≥7 años, (62% de los animales). Según la raza de los animales diferenciamos entre: frisona (80% de los animales); Rubia Gallega (10% de los animales); cruces (8%) y otras (2% de los animales). Por último, los agrupamos teniendo en cuenta la provincia gallega de procedencia: Lugo (39% de los animales); A Coruña (31% de los animales); Pontevedra (28%) y Ourense (2% de los animales). 326 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Grupo 1 (≤ ≤2 años) 2% Grupo 2 (3-6 años) 36% Grupo 3 (≥ ≥7 años) 62% Rubia Cruces 8% Gallega 10% P o nt e v e dra 28% Otras 2% A C o ruña 3 1% Frisona 80% O ure ns e 2% Lugo 39% RESULTADOS Y DISCUSIÓN Al examinar los hígados se comprobó que el 29% tenían ejemplares de Fasciola hepatica y el 3´5% de Dicrocoelium sp., mientras que en el 12% de los rumenes se encontraron adultos de Calicophoron daubneyi. Estos datos coinciden con lo observado por Morrondo et al. (2003), que establecían que las trematodosis más comunes en el ganado bovino de Galicia son por orden decreciente fasciolosis, paranfistomosis y dicroceliosis. Es interesante destacar que este estudio fue desarrollado con animales procedentes de zonas con temperaturas medias y altas precipitaciones, las cuales son muy adecuadas para el desarrollo del caracol Lymnaea truncatula, hospedador intermediario de Fasciola hepatica y Calicophorom daubneyi (Morrondo et al., 1994). Son escasos los estudios llevados a cabo en matadero en los países de nuestro entorno para detectar la presencia de trematodos. Szmidt-Adjide et al. (2000), señalaron que el 20% de los bovinos sacrificados en varios mataderos de Francia estaban parasitados por Calicophoron daubneyi, porcentaje similar al apuntado por Scala et al. (1997) en un estudio realizado en un matadero de Cerdeña, este mismo autor señala además que en el 31 % de los hígados de los bovinos, encontraron adultos de Dicrocoelium sp.. Theodoropoulos et al. (2002) en mataderos de Grecia únicamente detectaron Dicrocoelium sp. en el 2% de los hígados examinados, porcentaje muy inferior al 21% señalado por Ansari-Lari et al. (2006) en hígados decomisados en un matadero en el sur de Irán. En Tanzania, Keyyu et al. (2006), destacaron que al estudiar órganos de bovinos que habían salido al pasto, la prevalencia de anfistómidos (62´6%) era mayor que la de Fasciola 327 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES hepatica (46´1%). En los últimos años, son varios los autores que mediante coprología han detectado un notable aumento de la paramfistomosis (Szmidt-Adjide el al., 2000; Mage et al., 2002), según estos autores este hecho está relacionado con el elevado potencial biológico del caracol que actúa como hospedador intermediario (Dinnik, 1964), las medidas de control frente a Fasciola hepatica y nematodos gastrointestinales y la ausencia de fármacos eficaces para el tratamiento de la paramfistomosis. Al relacionar la edad de los animales con la presencia de C. daubneyi se comprobó mayor prevalencia (13´4%) en los bovinos de más edad, mientras que los menos parasitados fueron los de 3 a 6 años (8´5%). Aunque existen muy pocos trabajos que hagan referencia al efecto que la edad tiene en la infección por paramfistomas, la mayoría de los autores coinciden al señalar que las vacas adultas están más parasitadas que los animales jóvenes. Scala et al (1997), en un estudio realizado en mataderos de Cerdeña, apreciaron que los mayores porcentajes de parasitación por Paramphistomum cervi se encontraron en los bovinos mayores de 5 años (50%) y los menores en los animales de menos de 18 meses (12%). En mataderos de Tanzania según Keyyu et al. (2006), la prevalencia de anfistomas fue superior en animales adultos (75’2%), que en animales de dos años (51´5%) o terneros (47´2%). Sin embargo en Grecia, Theodoropoulos et al. (2002), después de examinar 792 rúmenes, sólo observaron Paramphistomum cervi en el rumen de dos vacas mayores de dos años. Aunque según Szmidt-Adjide et al. (2000), la edad de los animales no está asociada con la infección de P. daubneyi, para Schillhorn van Veen (1980) la mayor prevalencia observada por la mayoría de los autores en animales adultos; puede relacionarse con el mayor tiempo de exposición a la infección al llevar más tiempo los animales saliendo al pasto, a lo que hay que añadir la menor respuesta a los fármacos usados habitualmente contra la paramfistomosis (Keyyu et al., 2006). Gráfico 1: Prevalencia de parasitación en función de la edad 100 80 60 40 20 0 Grupo 1 Grupo 2 Prev C.d. Prev F.h. Grupo 3 Prev D.d. El porcentaje de animales infectados por F. hepatica aumentó con la edad, (grupo 1: 10%; grupo 2: 23´4% y grupo 3: 32´6%). Al igual que ocurre con C. daubneyi la posibilidad de reinfección por F. hepatica, se incrementa con la edad al permanecer más tiempo las vacas 328 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES en pastos contaminados, o porque se alimentan con hierba o ensilado que contiene metacercarias (Sánchez-Andrade et al., 2002). Pérez Verdugo (1992) y Díaz et al. (2001) estudiaron mediante análisis coprológicos la prevalencia de parasitación por F. hepatica en el ganado vacuno en Galicia y encontraron mayores porcentajes de parasitación en novillas que en vacas adultas, siendo además los animales más jóvenes y peor alimentados los que eliminan mayor nº de hpg (Rojo-Vázquez et al., 1989; Morrondo et al., 1994); esta falta de concordancia entre las prevalencias detectadas mediante coprología y estudio directo puede ser debido a que los bovinos desarrollan un cierto grado de resistencia frente a F. hepatica tras una primera exposición al parásito, lo que hace que los animales de más edad eliminen menor cantidad de huevos que los jóvenes (Boray et al., 1985; Hillyer et al., 1996). Estudios realizados en mataderos de Tanzania y Zimbawe detectaron al igual que en el presente estudio, que eran los animales de más edad los que con mayor frecuencia estaban parasitados por F. hepatica (Keyyu et al. 2006; Phiri et al 2005) En los animales menores de 2 años no se recolectaron ejemplares de D. dendriticum, mientras que en los bovinos de los grupos G-2 y G-3, se observó una prevalencia similar (en torno al 3%). Theodoropoulos et al. (2002), detectaron en un matadero de Grecia que el 2% de los hígados de bovinos estaban parasitados por D. dendriticum. En los animales de raza frisona se detectó menor presencia de los tres trematodos, (11% C. daubneyi; 27´9%, F. hepatica y 1´6%, D. dendriticum). Aunque para Szmidt-Adjide et al. (2000) la raza de los animales no está significativamente asociada con la infección de P. daubneyi en este trabajo los bovinos de otras razas y los cruces resultaron los más parasitados por los trematodos hepáticos. Gráfico 2: Prevalencia de parasitación en función de la raza 100 80 60 40 20 0 Frisona Rubia Galllega Prev C.d. Cruces Prev F.h. Otras Prev D.d. Es de destacar que en los bovinos de Ourense no se encontraron adultos C. daubneyi, mientras que el 16% de los rúmenes de bovinos de Pontevedra tenían adultos de este trematodo. En un estudio llevado a cabo por Szmidt-Adjide et al. (2000), en el centro de Francia se comprobó que la prevalencia de la infección por P. daubneyi (20 %) era mucho más elevada que la registrada en otras zonas de Francia (5´5%) por Casset (1989), pero 329 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES similar (17%) a la detectada en zonas del norte de Italia (Agosti et al., 1980) y en Turquía (15%, Tinar et al., 1992). Estos resultados podrían deberse a las diferencias climáticas de las distintas zonas, fundamentalmente a las precipitaciones (Rolfe et al. 1991). La prevalencia de infección por F. hepatica fue mayor en Ourense (50%) y menor en A Coruña y Pontevedra (25%). En un estudio realizado por Phiri et al (2005) en Zambia, apreciaron que el origen del ganado vacuno examinado tuvo una influencia significativa en la prevalencia de infección por Fasciola gigantica. El porcentaje más alto de animales parasitados por D. dendriticum fue del 12´5% en Ourense, en Lugo y A Coruña del 4% y no se observaron adultos de D. dendriticum en los hígados ni vesículas de los bovinos procedentes de Pontevedra. Gráfico 3: Prevalencia de parasitación en función de la procedencia 100 80 60 40 20 0 A Coruña Lugo Prev C.d. Ourense Prev F.h. Pontevedra Prev D.d. CONCLUSIONES 1. La prevalencia encontrada de las tres trematodosis estudiadas, pone de manifiesto que en Galicia se dan las condiciones adecuadas para el desarrollo de la fase exógena del ciclo de F. hepatica y C. daubneyi. 2. En el presente estudio se corrobora la elevada prevalencia de fasciolosis y la importancia real de la paranfistomosis en los bovinos gallegos, lo que hace necesario establecer medidas de control adecuadas. AGRADECIMIENTOS Al personal del matadero Novafrigsa y en especial a los inspectores veterinarios. Estudio subvencionado por el Proyecto de Investigación PGIDIT04RAG261009PR (Xunta de Galicia, España). BIBLIOGRAFÍA AGOSTI, M.; CAVALLETTI, E.; POZZA, O. (1980). Clinica ed epizootologia della paramfistomiasi bovina in Provincia di Milano. La Clinica Veterinaria, 103: 284296. 330 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES ANSARI-LARI, M.; MOAZZENI, M. (2006). A retrospective survey of liver fluke disease in livestock based on abattoir data in Shiraz, south of Iran. Preventive Veterinary Medecine, 73: 93-6. BORAY, J.C. (1959). Studies on intestinal paramphistomosis in cattle. Australian Veterinary Journal, 35: 282-287. 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Tel: +34982285900; Fax: +34982285940, e-mail: [email protected] ABSTRACT Organic livestock farming has set the goal of establishing environmentally friendly production, sustaining animals in a good health, realising high animal welfare standards, and producing products of high quality. The responsibility for maintaining animal health and welfare is an important goal in organic farming and veterinary intervention must face potential conflicts: disregards of disease patterns on organic compared to conventional farms (when authors found differences in the incidence of metabolic and reproductive disorders, mastitis, parasite infections), no use of “chemical” products, antimicrobial resistance and longer withdrawal times among others. There has been an increasing number of organic farms in Galicia and there is a need of solving conflicts between objectives and requirements in these farms. In this study, guidelines of veterinarians´ organic farms are analysed: strategies of treatment, promotion alternatives as natural medicine, management like a tool for preventing diseases, first assessments of animal performance due to the scepticism of the effectiveness of these farms and currently consumers’ high-demanding on safety products. PALABRAS CLAVE Granjas ecológicas, granja convencional, retos, prevención, gestión interdisciplinar. INTRODUCCIÓN Las granjas de ganado ecológico han establecido una serie de objetivos consensuados por la Federación Internacional de Movimientos de Agricultura Orgánica (IFOAM) que trabaja a nivel mundial y que coordina toda una red de organizaciones ecológicas que se basan en una producción afín con el medio ambiente, optimizando la salud animal y su bienestar, además de ofrecer productos de alta calidad. La rápida expansión de las granjas ecológicas ha planteado numerosos desafíos dentro de los sistemas para la producción animal. Al ir dándole importancia a la salud y bienestar animal se han ido potenciando ciertas restricciones referidas a la salud animal que de forma rutinaria se emplean en las granjas convencionales (Vaarst et al., 2005). Al mismo tiempo que van en aumento las granjas ecológicas se va requiriendo mayor investigación, asesoramiento agrícola, además de un especial conocimiento de estas granjas. Los veterinarios en estas granjas todavía realizan servicios y programan tratamientos sin especialización (Bennedsgaard et al.; 2003). Ante el creciente número de explotaciones ecológicas en España, el trabajo del veterinario es solventar los conflictos generados entre los objetivos y los distintos puntos que la 333 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES legislación de estas granjas abarca con el fin de aproximarse así a sus metas (Hovi et al., 2003). Desde el momento en el que la sanidad animal se conecta con la higiene, alimentación y producción, bienestar animal y prácticas de manejo del ganado vacuno y que se integran en el medio ambiente se requieren muchas más investigaciones en este campo multidisciplinar. SANIDAD Los programas sanitarios en las explotaciones ecológicas deben ser completos, integrados, dinámicos respondiendo siempre a objetivos de medicina preventiva (García Romero et al., 2003), de manera que las medidas de profilaxis sanitaria e higiene adquieren todo su valor, son fundamentales para la lucha eficaz y rentable de las patologías, potencian el bienestar animal, ayudan a impedir la entrada de grandes epizootías y previenen de zoonosis a la población humana (García Romero et al., 2003), y es en este contexto donde surgen nuevas herramientas más acordes con este sistema de producción: el manejo, control biológico, profilaxis y terapias naturales (García Romero et al., 2003). Por lo tanto, entre sus esfuerzos, las granjas ecológicas deben desarrollar técnicas zootécnicas que favorezcan el equilibrio entre los animales y el ecosistema, además de fortalecer la capacidad de respuesta defensiva del animal de manera que la prevención sea prioritaria (García Romero et al., 2003). Desde el punto de vista preventivo está prohibido en la ganadería ecológica la administración rutinaria, sistemática y reiterada, en todos los ciclos productivos de sustancias alopáticas o de síntesis química, antibióticos, coccidiostáticos, incluyendo tratamientos coadyuvantes, estimulantes del crecimiento y/o reproducción, hormonas (anabolizantes, progestágenos, etc.) y otros. La razón de su restricción son las repercusiones para la salud pública y/o animal y/o medio-ambiental (García Romero et al., 2003). En caso de llegar a aplicar un tratamiento, debe priorizarse el uso de medicinas naturales incluyendo homeopatía, medicina ayurvédica y acupuntura (Cabaret, 2003). Basándose en el empleo de sustancias que no sean excesivamente agresivas, se plantea entonces la terapia curativa con productos homeopáticos, fitoterapéuticos (extractos, esencias de plantas, etc.), oligoelementos autorizados y otros productos (se encuentran dentro del anexo II , parte C, sección 3 del reglamento de la CE 1804/1999). En el caso de la homeopatía, las materias primas o sustancias que se utilizan proceden de plantas y animales, parásitos, trozos de vísceras y se manejan dosis muy pequeñas por vía oral. En relación a la fitoterapia, que quizás sea la medicina natural más antigua, utiliza sustancias químicas naturales. La composición de los principios activos es variada y actualmente se emplean estratos completos de plantas al comprobarse que ofrecen mayores beneficios que cuando se emplea el principio activo aislado (García Romero et al., 2003). La razón por la que la ganadería ecológica está a favor de terapias naturales es que son más efectivas al adaptarse a los ciclos naturales y productivos del animal, además regulan las infecciones potenciando la acción del sistema inmunológico sin riesgos para la salud y para el medio ambiente cuando su prescripción está realizada por un veterinario especializado (García Romero et al., 2003). Las explotaciones ecológicas se convierten así en herramientas básicas de trabajo para evitar el desarrollo de resistencias (Lund y Algers, 2003). 334 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Tan sólo se permite el uso de productos químicos cuando no está disponible ningún tratamiento alternativo quedando justificado su uso y deberán ser aplicados en los periodos de máximo riesgo de infección para la ganadería. La consideración primaria de estas granjas es mantener en todo momento el bienestar del animal. Tras la administración de tratamientos convencionales, por supuesto, por prescripción veterinaria, el ganadero debe asumir cierto riesgo de que el animal sea excluido de la cadena de producción ecológica, con una gran repercusión económica para él, de modo que la rutina de un tratamiento antibiótico se convierte en una gran preocupación para los productores ecológicos. Así, se ha producido un giro hacia el uso de productos homeopáticos y fitoterapéuticos al ser libre su uso en estas ganaderías. En relación a la reproducción animal, el manejo de las granjas orgánicas prohíbe el uso de técnicas como la transferencia embrionaria o el tratamiento hormonal para el tratamiento de desórdenes reproductivos. Además se prefiere la monta natural en lugar de la inseminación artificial (Reksen et al., 1999). En cuanto a la prevalencia de enfermedades en granjas ecológicas, debemos señalar que son necesarios grandes esfuerzos por parte del sector veterinario para conseguir una base de datos de las enfermedades más frecuentes en las granjas ecológicas. Es más, para la realización de estudios comparativos entre los distintos tipos de explotaciones es necesaria mucha cautela y tener en cuenta ciertas consideraciones. Debe conocerse el momento de la conversión, si existió, de las granjas convencionales, es decir, cuando se han transformado en granjas ecológicas. La razón es que las leyes que las regulan han ido cambiando con regularidad, por lo que se hace necesario conocer las prácticas que estaban o no permitidas y, que deben considerarse en la salud del ganado. También es importante conocer el país de donde procede la información ya que además de diferencias climáticas, de manejo y económicas, también se interpretan las normas de la IFOAM de forma distinta. Por ejemplo, mientras que en Suecia se prohíbe el uso de antihelmínticos, éste no es el caso de Noruega; el tiempo de supresión después de un tratamiento con medicación alopática es del doble de tiempo en Suecia (2 meses para antibióticos y 6 meses para quimioterapéuticos) mientras que en Dinamarca el tiempo de supresión requerido se triplica por orden de la Administración de Alimentación y Veterinaria danesas. También podrían existir diferencias entre países en el uso de tratamientos alternativos, por ejemplo, los veterinarios suecos tienen restringido por ley el uso de cualquier tipo de tratamiento homeopático mientras que en Dinamarca algunos remedios homeopáticos pueden aplicarse con prescripción veterinaria. Hasta el momento se ha publicado muy poco acerca de las enfermedades registradas en granjas ecológicas a partir de evaluaciones realizadas por granjeros y técnicos. En un estudio llevado a cabo en el Reino Unido en el que se realizó una encuesta en 270 granjas ecológicas, los problemas que se registraron fueron en vacuno de carne: parasitaciones, infertilidad, problemas en los partos; mientras que en ganado lechero: parasitaciones, problemas podales y mastitis entre otros en ambos casos. En Francia los problemas de salud asociados al ganado vacuno implican parasitaciones, mamitis y problemas de reproducción, así como toda la complejidad de su tratamiento ante la imposibilidad del uso de medios médicos como antihelmínticos, antibióticos e inducción hormonal respectivamente. En otras especies también criadas en sistemas ecológicos por ejemplo en el sector porcino y aviar se plantean problemas que afectan a la adaptación de genotipos a estos “nuevos” 335 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES sistemas, la alimentación (adición de aminoácidos, vitaminas) y a condiciones de las instalaciones (Cabaret, 2003). En conclusión, a los recientes estudios de revisión se podría generalizar que en las granjas ecológicas se observa una reducción del patrón de enfermedades metabólicas que podría ser debida a la menor producción de los sistemas ecológicos (Sundrum , 2001). ALIMENTACIÓN La mayor dificultad con la que se encuentran los veterinarios en el campo de la alimentación, es asegurar una ración compuesta íntegramente por materias primas ecológicas, cultivadas sin fertilizantes, ni plaguicidas de síntesis artificial, no sometidas a transformaciones con productos químicos, ni derivados de organismos transgénicos (Caballero Luna et al., 2003). En la formulación de las raciones es imprescindible que las necesidades nutricionales estén perfectamente cubiertas y se debe respetar al máximo sus comportamientos nutricionales, siendo esencial para preservar su salud. Cualquier desajuste en la formulación de la ración podría traducirse en enfermedades de forma más o menos inmediata al tener una fuerte influencia en el funcionamiento del sistema inmunitario. Por ejemplo, dietas bajas en proteína inducen la aparición de parasitosis más intensas y raciones con menos fibra pueden bloquear las funciones inmunológicas; también pueden aparecer acidosis y meteorismos inducidos por desequilibrios nutricionales. Destacar también que los desórdenes vitamínicos y minerales suelen pasar inadvertidos al originar procesos subclínicos pero que están en el origen de muchas enfermedades de base infecciosa, disminución de la fertilidad, tetanias, parasitismo y alteraciones en el comportamiento (Caballero Luna et al., 2003). La base de la dieta, aunque no de forma exclusiva, lo constituye el pasto, el forraje y el silo (en función de su disponibilidad en las distintas épocas del año) ofreciendo una dieta de calidad, variada, rica en vitaminas y minerales. La proporción de concentrado se restringe al 40% y se prohíbe el uso de promotores de crecimiento aunque sí se autorizan ciertos alimentos complementarios y prebióticos (Caballero Luna et al., 2003). Cuidando la alimentación se pretende asegurar la calidad de la producción más que una producción máxima, para ello es necesario conocer los requerimientos del ganado en cada una de las fases del desarrollo, empleando productos de la propia granja (Hermansen, 2003). En la fase de cría-lactación es necesario respetar un tiempo mínimo de lactación de tres meses, siendo el calostro y la leche materna insustituibles. Es deseable prolongar todo lo posible la lactación ya que desarrollan menos enfermedades y favorecen altas velocidades de crecimiento. Si además cuentan con alimentos complementarios alcanzarán un buen peso al destete y su flora digestiva se irá desarrollando con el uso de prebióticos que estén autorizados (Caballero Luna et al., 2003) En la fase de recría-cebo es necesario disponer de un forraje de alta calidad. Teniendo muy en cuenta en esta fase la incidencia de parasitosis. (Caballero Luna et al., 2003) Para el ganado adulto, en cuanto a los reproductores es imprescindible una buena adaptación a la disponibilidad de pastos y forrajes de la granja, completando la dieta con un mínimo porcentaje de concentrado (Caballero Luna et al., 2003). Se ha demostrado que la eficacia reproductiva de las granjas ecológicas se descompensa en la época de invierno de forma significativa, situación de desequilibrio que podría producirse por la falta de 336 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES conocimiento de las necesidades energéticas de las vacas en comparación con las granjas convencionales (Sundrum, 2001). Es importante también destacar la necesidad de planificar la alimentación para adecuar la carga ganadera a la disponibilidad de producción de alimentos ecológicos de la propia explotación para conseguir el máximo grado de autoabastecimiento (Caballero Luna et al., 2003). Así, en el caso del pasto y teniendo en cuenta que al menos un 60% de la ración diaria debe está formada por silo, heno o hierba, debe maximizarse su uso en función de su disponibilidad en las diferentes épocas del año (Hermansen, 2003). Por último, comentar que un punto innovador en la alimentación de la ganadería ecológica es la inclusión de plantas aromáticas y medicinales para su alimentación; al tener factores antimicrobianos y reguladores del metabolismo, mejoran la transformación de alimentos vegetales en productos pecuarios. En este sentido existen sustancias fitoterapéuticas y homeopáticas que pueden administrarse con el alimento y/o agua de bebida para regular las funciones, digestiva, pulmonar, hepática, del sistema inmune, etc., por su efecto amortiguador. (Caballero Luna et al., 2003) PRODUCCIÓN ANIMAL En los últimos tiempos se ha producido un crecimiento considerable en Europa en el número de granjas ecológicas, de menos de 20.000 en 1992 a más de 120.000 en 1999 (Padel, 2000), y que incluyen el ganado ecológico como uno de los 5 productos más importantes de los sistemas ecológicos (Michelsen et al., 1999). Este desarrollo ha generado importantes cambios en la sociedad con respecto a ciertos aspectos de la agricultura, y puede ser atribuido a un aumento en el interés de los consumidores por los productos ecológicos al mismo tiempo que los granjeros se han interesado por la conversión de sus granjas a sistemas ecológicos, a menudo estimulados por las ayudas o subvenciones del gobierno. La producción ecológica se enfrenta a grandes desafíos con la búsqueda de un equilibrio e integración exitosa en el sistema de producción ecológico (Vaarst et al., 2005). En el momento en el que las granjas ecológicas asumen su papel como sistema de producción surgen numerosas dificultades, ya que por ejemplo para la producción láctea bajo las condiciones ecológicas existe muy poca información acerca de la producción lechera del ganado vacuno en relación al efecto que desencadena la suplementación con productos ecológicos (Khalili et al.; 2002). Es más, en ganado vacuno de alto potencial genético, la reducción del nivel de ingesta podría causar una movilización de las reservas y un balance energético negativo (Khalili et al., 2002). La alimentación del ganado vacuno lechero está supeditada a la misma normativa que se ha establecido en estas granjas y tan sólo una proporción muy baja de los productos convencionales comerciales de alimentación se ajustan a esta normativa. En relación con la alimentación del ganado de carne ésta afecta a la calidad del producto que llega al mercado: sabor, color, nivel de infiltración y perfil graso (Mata Moreno et al., 2003). De los 17 objetivos que se plantea la IFOAM sólo 3 se refieren a la producción de ganado. El primero de ellos se basa en el mantenimiento de la biodiversidad que viene a ser el principal desafío. En segundo lugar, ofrecer al ganado libertad para que alcance su comportamiento natural. Y por último, los sistemas ecológicos deberían equilibrar cultivos y ganado construyéndose así ciclos cerrados y sostenibles de nutrientes (Hovi et al., 2003). 337 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Las granjas ecológicas, debido a la competencia que sufren por parte de las granjas convencionales, intentan maximizar la producción con un manejo lo menos intensivo posible (Mata Moreno et al., 2003). La ganadería ecológica conoce y asume la exigencia de un creciente número de consumidores que están siendo muy críticos con los productos de las granjas convencionales (Sundrum, 2001) de manera que las granjas ecológicas para hacer frente a esta competencia deben ofrecer la calidad como punto fuerte de sus productos. Hoy en día se está desarrollando un mercado creciente debido a las profundas crisis que han sensibilizado a los consumidores de forma irreversible y sobre todo en la carne de vacuno (Caballero Luna et al., 2003). Los consumidores de carne ecológica se preocupan por su salud y consecuentemente por su alimentación, buscan que los productos sean más sanos y que se obtengan protegiendo el medio ambiente y el bienestar animal (Caballero Luna et al., 2003). La carne ecológica debe ofrecer además de calidad cualidades organolépticas diferenciadas: recuperación del sabor, aroma, textura y aspecto de la “auténtica carne” siendo muy importante para su consecución una buena alimentación del ganado (Mata Moreno et al., 2003). Para compensar esta situación desequilibrada entre los dos sistemas de producción algunos autores recomiendan el uso de razas adaptadas a este tipo de nutrición, renunciando a una mayor ganancia diaria de peso del ganado pero obteniendo un sabor óptimo generado por la grasa infiltrada, mucho más apreciado por los consumidores tanto en ganado vacuno como en porcino (Sundrum et al., 2000). MANEJO En relación a las instalaciones, la normativa (reglamentación No. 1984/1999 con un suplemento No. 2092/91) se centra en las características del área de locomoción que debe ser al menos un 75% de la zona cubierta, exige ciertas condiciones del suelo con almacenamiento adecuado de los efluentes (Hermansen, 2003), estado seco de las camas, determinadas prácticas ganaderas (Sumdrum, 2001) y además exige la agrupación de los animales en rebaños quedando prohibida terminantemente su sujeción (Hermansen, 2003). Las infraestructuras que deben poseer las granjas ecológicas pueden ser muy sencillas en el caso de adaptarse para el ganado vacuno. Es necesario proporcionar al ganado vacuno el máximo espacio para facilitar su movimiento, alimentación y abrevado y proporcionándole el máximo confort posible (Caballero Luna et al., 2003). La importancia del manejo en las explotaciones ecológicas radica en que en función al que se someten las granjas de forma individual (independientemente del tipo de explotación al que pertenezca) se explican las diferencias obtenidas en salud animal y calidad de los productos obtenidos que son destinados al mercado. La calidad de producción depende por tanto del manejo intra-granja, mostrándose así una gran variabilidad en la producción ecológica e intensiva (Sundrum, 2001). Algunas pautas para el tratamiento de enfermedades importantes en las que se hace necesario prevenir el uso de medicamentos como es el caso de la mamitis son construir sistemas de estabulación abiertos, siendo un factor importante para un ambiente con bajo riesgo de enfermedad mantener limpias las camas (con un ritmo de limpieza de 2 o 3 veces al día) y tener constancia en la rutina de ordeño (Vaarst et al., 2006). Para la prevención de enfermedades parasitarias, desde el momento que los tratamientos médicos profilácticos no se emplean, se podrían aplicar una serie de medidas cuyo uso se 338 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES potencia por los parasitólogos para evitar así el desarrollo de resistencias: mover el ganado a zonas no infectadas, intentar suavizar el grado de infestación al alternar o mezclar (vacas y ovejas) en los mismos pastos, etc. Al no poder aplicarse en todos los casos este tipo de estrategia, el ganado se encuentra en riesgo de sufrir enfermedades. Existe por tanto la necesidad de buscar otras alternativas para generar resistencias como por ejemplo introducir nuevas especies en los pastos que podrían mejorar la resistencia conjunta de los animales (Hermansen, 2003). Por último comentar que el manejo del animal al aire libre también es criticado al estar relacionado con algunos riesgos para la salud y bienestar del animal. Existen ciertas enfermedades que ven facilitadas su propagación en esta situación, como por ejemplo las zoonosis que podrían afectar a la salud humana fracturándose la barrera de seguridad y reduciendo la calidad que los productos ecológicos ofrecen al consumidor (Vaarst et al., 2005). BIENESTAR ANIMAL Desde los orígenes de las granjas ecológicas éstas mostraban sus preocupaciones sobre el cuidado del bienestar animal que de forma negativa presentaban las granjas industriales. El bienestar animal desde el enfoque que tratan de abordar las granjas ecológicas incluye la posibilidad de mejora del comportamiento animal, consiguiendo alimento adaptado a su fisiología, y viviendo en un ambiente similar a su biotipo al cual por medio de su evolución se ha adaptado (Lund, 2006). Las granjas ecológicas disponen de potencial suficiente para ofrecer a los animales todas las condiciones para alcanzar su bienestar, y las investigaciones más recientes no lo contradicen. Aunque si bien se puede interpretar que la importancia del bienestar animal es básico en este tipo de granjas, la creación de sistemas de producción sostenibles y mantener el bienestar animal encierra sin duda la mayor preocupación para los granjeros (Lund, 2006). FUTURAS IMPLICACIONES Los objetivos de las granjas ecológicas junto con las bases en las que se fundamenta, no deben considerarse como fines en sí mismo sino como un medio, de manera que podrían verse modificadas con los años si aparecen nuevos conocimientos que optimizan estos valores (Sundrum, 2001). Los veterinarios de las granjas ecológicas preocupados por solventar los problemas de carácter agudo han dedicado su estudio a necesidades urgentes (Lund y Algers, 2003)siendo necesaria mucha más investigación en todos las áreas integrantes de esta unidad: la ganadería ecológica. BIBLIOGRAFÍA Bennedsgaard, T.W.; Thamsborg, S.M.; Vaarst, M.; Enevoldsen, C. (2003). Eleven years of organic dairy production in Denmark: herd health and production related to time of conversion and compared to conventional production. Livestock Production Science 80:121-131. Caballero Luna, I.; Mata Moreno, C.; García Romero, C.; Díaz Gaona, C.; Arroyo Valverde, F.C.; Fernández Ortiz, E. (2003). Aspectos clave para la planificación y manejo ecológico. Bovis 110: 53-77. 339 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Cabaret, J. (2003). Animal health in organic farming: subjective and objective assessments and farmers´ actions. 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Vaarst, M.; Padel, S.; Hovi, M.; Younie, D.; Sundrum, A. (2005). Sustaining animal Health and Food safety in European organic livestock farming. Livestock Production Science 94: 61-69. 340 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES HUESO BOVINO COMO FUENTE DE MATRIZ ÓSEA DESMINERALIZADA BOVINE BONE LIKE SOURCE OF DEMINERALIZED BONE MATRIX BUSTAMANTE CANO JJ*, RIVERA POSADA J**, CANO QUINTERO W***, ROBLES ROBLES R, GONZÁLEZ MONTAÑA JR, PRIETO MONTAÑA F. Universidad de León.24007. León. E-mail: [email protected] * Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad de Pamplona.Colombia. ** Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad de Antioquia. Colombia. *** Interkim SA. Girardota, Antioquia, Colombia. RESUMEN La matriz de hueso desmineralizado ha mostrado la capacidad de inducir la formación de hueso en lugares ectópicos y como material de injerto óseo osteoinductivo. Igualmente ha sido mezclado con diferentes transportadores de forma que permita su manipulación durante el implante en aplicaciones que requieran recuperación ósea. La desmineralización del hueso, disminuye la respuesta inmune y expone los diversos factores de crecimiento de la matriz, los cuales tienen participación directa en las funciones de osteogénesis, osteoconducción, remodelación, realización y homeostasis en el microambiente celular óseo. Este estudio explora un método práctico que permita obtener una matriz orgánica después de remover la fase mineral del hueso, de tal manera que aquella promueva una efectiva osteoinducción en modelos vivos. La operación inicial de desmineralización comenzó con la recolección en matadero de huesos frescos de bovino. Posteriormente el hueso es pulverizado hasta el tamaño deseado de partícula, seguido por desengrasado/desinfección y tratamientos de desmineralización con ácido. Finalmente la muestra es liofilizada. La caracterización se realizó mediante un análisis de espectroscopia de infrarrojos. PALABRAS CLAVE: Matriz ósea, bovino, osteoinducción. SUMMARY Demineralized bone matrix has shown the capacity to induce bone formation in ectopic places and as material of osteoinductive bone graft. It has been mixed with a carrier’s variety like allow different forms of manipulation for a variety of carriers that need osseous recovery. Bone demineralization diminishes the immune response and exposes the diverse factors of growth of the bone matrix, which have direct participation in the functions of osteogenesis, osteoconduction, remodelling and homeostasis in the cellular osseous microatmosphere. This study explores a method that allows to obtain an organic matrix after removing the mineral phase of the bone like it promotes an effective osteoinduction in animal models. The initial bone demineralization operation began with fresh bovine bones taked from slaughterhouse. First, bone is pulverized to the desired average particle size, followed by deffating/disinfecting and acid demineralization treatments. After the sample is liophilized and then is realized its characterization with an infrared analysis. Key words: bone matrix, bovine, osteoinduction. 341 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES INTRODUCCIÓN En los últimos años se ha prolongado la vida humana y han mejorado las perspectivas de vida animal. La síntesis de materiales biocompatibles, ha permitido reemplazar alguna parte del cuerpo cuando ésta está deteriorada. La regeneración ósea es la técnica de elección para reparar defectos de pequeño y mediano tamaño en maxilares y huesos largos, empleándose como tratamiento complementario para la colocación de implantes oseointegrados. Aún no existe un sustituto de hueso ideal, y por ello continuamente se están realizando investigaciones. En la mayoría de los casos son productos caros, lo que no permite que estén al alcance de todas las personas y menos aún en la práctica veterinaria. La matriz de hueso desmineralizada es un material de injerto que promueve la formación ósea y que ha sido ampliamente usado en aplicaciones ortopédicas y odontológicas en todo el mundo. Se ha obtenido de hueso humano, rumiante, roedor y de otras especies. Para la obtención del hueso desmineralizado pueden seguirse varios procedimientos (Reddie et al, 1972; Concannon et al, 1997; Rabie et al, 2000; Han et al, 2005). Aunque el descrito por Concannon, resulta ser el más práctico. El presente estudio explora un método de síntesis de dicha matriz orgánica, la cual después de verificar sus características será utilizada para producir una pasta ósea maleable (en combinación con proteinas morfogenéticas óseas, colágeno e hidroxiapatita), con el fin de comprobar sus propiedades osteoinductivas en un modelo in vivo y así contribuir en la satisfacción de las necesidades del cirujano en el campo de la cirugía plástica y ortopédica. MATERIAL Y MÉTODOS Como hemos indicado el método propuesto por Concannon,es el más usado para la obtención de hueso desmineralizado. El hueso molido se desmineraliza en ácido clorhídrico 0,6 N (25 meq de HCl/g de hueso) durante un periodo de tres horas realizando el cambio de la solución cuando ésta se satura. El hueso desmineralizado es entonces deshidratado en etanol al 70% durante un periodo de 10 minutos, luego se decanta, se liofiliza y se guarda a temperatura ambiente. Proponemos un método similar con ligeras modificaciones que permite una mejor extracción de los lípidos, una desalcoholización más eficiente de la solución y que además puede ser realizado en sencillos laboratorios. A partir de huesos bovinos recogidos directamente en el matadero, se hierve el hueso para eliminar lípidos y fluidos sanguíneos y posteriormente se pone a secar hasta que presente un porcentaje bajo de 342 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES humedad. Tras tener el hueso bien seco, se realiza una pretrituración con un martillo para poder dejar el tamaño adecuado para el siguiente paso. Se introduce la muestra en un molino Thomas-Willey, con intención de lograr un tamaño de partícula adecuado (no superiores a 150 µm) para el siguiente paso teniendo al final un total de 80 gramos de muestra. Este tamaño de partícula se define tamizando en mallas finas (micras)- (ROTAP DE MALLAS 270-240-200-150-120-80-70-40-20-10 PLATO DE RESIDUO FINAL), ya que a menor tamaño de la partícula se obtiene mayor superficie de contacto con los reactivos. Luego de tener la muestra en polvo se adiciona en una solución de ácido clorhídrico 0,6 N, y se toman 3,3 litros que corresponden a la cantidad de muestra de hueso molido (80 gramos). Se dejan en homogenización por espacio de tres horas, iniciando con 1 litro y cada hora cambiando la solución ya que esta se satura. En total se obtuvieron tres muestras de 1 litro respectivamente. Posteriormente se procede a deshidratar con etanol cada una de las muestras obtenidas, para más tarde proceder a la liofilización a temperatura ambiente. La muestra líquida se filtra con papel filtro (Schleicher & Schuell, 125 mm 5893) y se obtiene la muestra para liofilización. La prueba de Soxhlet o de verificación de grasa permite mediante extracción con éter de petróleo y calentamiento moderado la cuantificación de los lípidos presentes en la muestra. La cantidad de calcio presente se valoró mediante absorción atómica. El análisis de la muestra por medio de un espectrofotómetro permite determinar las absorbancia de dicha muestra, y es realizada a 512 nm que es el adecuado para muestras sólidas según la normas. La medición del tamaño de la partícula se realizó, como hemos indicado mediante las mallas ROTAP. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los lípidos presentes en la muestra son 0,556%, cantidad muy baja, por lo que no afectó al procedimiento químico de obtención del hueso desmineralizado. La absorbancia a 512 nm fue de 1.518 mg/g (mg de Ca(PO3)2/g de HCl 0,6 N). El calcio presentó valores de 2,58%. Según Reddi (1972) la descalcificación preferiblemente debe dar resultados menores del 10%, siendo el ideal 0,5%. No se logró descalcificación completa, lo que a su vez puede provocar una posible interferencia en extracción de proteínas, pero está dentro del rango aceptado para su utilización como material osteoinductor. El tamaño de las partículas se situó en 150 µm. Bolander y Balian (1986) trabajaron con 100-300 µm, mientras que Reddi et al (1972) con tamaños entre 74-420 µm. Es preferible menor tamaño de partícula (100-150 µ), puesto que ello aumenta la superficie de contacto (Le Geros, 1991). Por todo lo expuesto podemos afirmar que el producto obtenido es adecuado para la producción de pasta ósea, que tras combinarse con proteínas morfogenéticas óseas, colágeno e hidroxiapatita, pueda ser usado en osteoinducción. La pasta así formada debe, posteriormente, ser utilizada en implantes óseos in vivo. 343 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES BIBLIOGRAFÍA Bolander ME, Balian G. The use of demineralized bone matrix in the repair of segmental defects. Augmentation with extracted matrix proteins and a comparison with autologus grafts. The Journal of Bone and Joint Surgery, 1986; 68 (8): 1264-1274. Bowman SM, Zeind J, Gibson LJ, Hayes WC, McMahon TA. The Tensile Behavior of Demineralized Bovine cortical Bone. J. Biomechanics 1996; 29 (11): 1497-1501. Broz JJ, Simske SJ, Greenberg AR. Material and compositional properties of selectively demineralized cortical bone. Journal of Biomechanics. 1995; 28 (11): 1357-1368. Concannon MJ, Boschert MT, Puckett CL. Bone induction using demineralized bone in the rabbit femur: A long term study. Plastic and Reconstructive Surgery. 1997; 99 (7): 1983– 1988. Han B, Tang B, Nimni, ME. Quantitative and sensitive in vitro assay for osteoinductive activity of demineralized bone matrix. Journal of Orthopaedic Research. 2003; 21: 648 654. Han B, Yang Z, Nimni M. 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En este sentido, cualquier actuación encaminada a la lucha frente a la enfermedad, debería centrarse en la localización de los rebaños con alta probabilidad de tener animales persistentemente infectados (PI), para poder posteriormente identificarlos. La detección de los niveles de anticuerpos (Ac) en la muestra de tanque de leche es una herramienta muy útil para establecer el riesgo de infección que existe en un rebaño. Se analizaron, con un ELISA de competición para anticuerpos anti-p80, un total de 285 muestras de tanque de explotaciones con prevalencia y situación vacunal conocidas, con el fin de establecer los puntos de corte y los intervalos que permitan agrupar a los rebaños en uno de los 4 grupos de seroprevalencia establecidos: > 65%: alta probabilidad de presencia de PI. 25-65%: alto riesgo de infección activa. 5-25%: bajo riesgo de infección activa. < 5%: rebaños negativos. Durante los años 2005 y 2006 se realizó el seguimiento de explotaciones en las que los valores de Ac indicaban una alta prevalencia de la enfermedad con el fin de seleccionar aquellas con alto riesgo de presentar animales PI. El objetivo del estudio es determinar los valores de Ac que puedan indicar la presencia activa de animales PI. El empleo de la muestra de tanque de leche para la localización de rebaños con presencia de animales PI, podría ser una herramienta de gran utilidad debido a su eficacia, rapidez y bajo coste. ABSTRACT The bovine viral diarrhoea (BVD) is a highly difussion disease that causes considerables economics losses. The main cause of the infection dissemination is the presence of persistently infected animals (PI). So, to prevent the development of infection or its diffusion, it would be necessary the establishment of a control program based on localization of farms with PI animals . 345 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Bulk milk antibodies levels are an useful assistance to determine the risk of infection in a herd. Then, 285 tank samples from herds with prevalence and vaccinated status known were analysed with a BVDV anti-p80 competition ELISA, so we determine the cutt-off for these four groups of seroprevalence: - > 65%: high probability of presence of PI animals. - 25-65%: high risk of active infection. - 5-25%: low risk of active infection. - < 5%: negative herds. During years 2005 and 2006,the herds were selected according to antibody values that indicated high disease prevalence. The aim of this study is to determine the antibody levels that can indicate the real presence of PI animals. The employment of tank milk samples of herds with PI animals could be an important assistance for its efficacy , speed and low cost. INTRODUCCIÓN La muestra de tanque de leche se está revelando como una herramienta eficaz, barata y fiable para el estudio de la presencia de DVB en los rebaños de vacuno lechero. En un estudio previo realizado en el Laboratorio de Sanidade e Producción Animal de Galicia se pudieron establecer los intervalos de confianza que permiten clasificar a las explotaciones según el riesgo de infección (tabla 1). % prevalencia <5% 5-25% 25-65% >65% Intervalo > 87,5 (87,5-57,45) (57,45-21,15) < 21,15 Riesgo de infección Explotación negativa. Bajo riesgode infección. Alto riesgo de infección. Alta probabilidad de tener PI. Tabla 1: valores de DO de ELISA Ac (% inhibición). Intervalos. Una vez seleccionadas las explotaciones con alta probabilidad de tener circulación viral (gráfica 1 y 2), el objetivo de este trabajo es la identificación de explotaciones que puedan tener animales persistentemente infectados. Gráficas 1 y 2: ejemplos de perfiles serológicos de rebaños con circulación viral. EXPLOTACIÓN CON CIRCULACIÓN VÍRICA Nº de animales 8 6 4 2 0 N P+ P++ P+++ P++++ P+++++ Positividad 9-12 meses 346 12-24 meses 25-36 meses > 36 meses XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES EXPLOTACIÓN CON PI Nº de animales 12 10 8 6 4 2 0 N P+ P++ P+++ P++++ P+++++ Positividad 9-12 meses 12-24 meses 25-36 meses > 36 meses Resultados tanque R e b a ñ o s 25 Eliminados antes 20 Eliminados después 15 10 5 0 < 11 % 11-22% 22-40% 40-57,5% 57,5-72,5% 72,5-87,5% > 87,5% % inhibición MATERIAL Y MÉTODOS Muestras A partir de las muestras de tanques recibidas en el Laboratorio de Sanidade e Producción Animal en el período 2004-2006 (tabla 2), se escogieron para el estudio 83 rebaños en los que se tenía historial de identificación de animales PI (33 posteriores a la toma de muestra de tanque y 50 anteriores). 57 de estos rebaños tenían una prevalencia mayor del 65%, 16 entre el 25-65%, 5 entre e 5-25% y 5 con menos de un 5% de seroprevalencia. Intervalo de % inh % prev. Nº Tanques > 87,5 < 5% 5 (87,5-57,45) 5-25% 5 (57,45-21,15) 25-65% 16 < 21,15 > 65% 57 Tabla 2: nº de tanques. 347 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES Técnicas analíticas - ELISA de competición para detección de anticuerpos p80 en muestras de tanque de leche. - ELISA de detección de antígeno en muestras de suero o muesca de oreja. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En 24 (42,1%) de los 57 rebaños con un porcentaje de inhibición correspondiente a una prevalencia mayor del 65% se identificó al menos 1 animal PI (43 animales en total) posteriormente a la recogida de la muestra del tanque y en los 33 restantes (57,9%) en algún momento en el pasado fueron eliminados animales PI (52). En 9 (34,6%) de los establos con menos de 65% de prevalencia se identificaron 19 PI con posterioridad y en los 17 (65,4%) restantes ya habían sido eliminados con anterioridad 21 PI (gráfico 3). Gráfico 3: Resultados de las muestras de tanque de leche. A tenor de estos resultados podemos decir que la muestra de tanque de leche permite establecer una clasificación de los rebaños según su riesgo de infección, siendo una herramienta eficaz en el control de esta enfermedad. También se puede concluir que la búsqueda de animales PI debería realizarse en todos los rebaños con más de un 25% de seroprevalencia, ya que son los que tienen riesgo de circulación vírica (infección activa). Para poder detectar rebaños con infección muy reciente (que aún pueden presentar prevalencia menor del 5%), lo ideal es la monitorización de la explotación mediante recogidas periódicas de muestras de tanque de leche para poder detectar seroconversión. BIBLIOGRAFÍA Alenius, S.; Lindberg, A.; Larsson, B.(1996). A nacional approach to the control of bovine viral diarrhoea virus. 3rd ESVV Symposium pestivirus infections: 162-169. Bitsch, V.; Ronsholt, L. (1995). 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Luís, 16. CP 4000-509. Porto, Portugal. *Corresponding autor: phone: 34981647902; fax: 34 981673656. e-mail: [email protected] PALABRAS CLAVE/ KEWORDS: Giardia duodenalis; Protozoa; Sheep; Prevalence; Zoonoses. ABSTRACT Giardia duodenalis (synonym G. lamblia, G. intestinalis) infects numerous mammals, including man. Although specimens of G. duodenalis isolated from humans and other animals are morphologically similar, there exist different genotypes. The most commonly detected are: A-I (humans, domestic ruminants, dogs, cats, beavers, rats and other animals); A-II (responsible for anthroponotic transmission); B (humans, beavers, dogs, rats and other animals); C and D (canine species); E, F and G (domestic ruminants, cats and rats). The purpose of this study was to determine the prevalence and intensity of infection of G. duodenalis in adult sheep and to identify which genotypes are present. Faecal samples were collected from 575 adult sheep selected at random from 68 herds in Galicia (NW Spain) and were concentrated and processed by a direct immunofluorescence technique using monoclonal antibodies (IFAT) and PCR. G. duodenalis cysts were detected in 188 sheep (32.7%) from 67 (98.5%) of herds and the rate of cyst shedding ranged between 10 and 4319 cysts/g of faeces (mean 177 ± 598 cysts/g of faeces). In these preliminary assays on genetic analysis, it was used PCR-based procedures in order to genotype with amplification and sequencing of the beta-giardin gene. Assemblage E was detected. All adult animals sampled were asymptomatic indicating a real source of environmental contamination by G. duodenalis. Nevertheless, the preliminary results of molecular biology showed that the sheep may not be an important zoonotic reservoir for this parasite. INTRODUCCIÓN Giardia duodenalis (sinónimo G. lamblia, G. intestinalis) es la especie que infecta a numerosos mamíferos incluido el hombre (Adam, 2001). Aunque aislados de G. duodenalis procedentes del hombre y animales son morfológicamente similares, existen distintos genotipos. Los más frecuentemente detectados son: A-I (hombre, rumiantes domésticos, perros, gatos, castores y otros animales); A-II (responsable de la transmisión antroponótica); B (hombre, castores, perros, ratas y otros animales); C y D (cánidos); E, F y G (rumiantes domésticos, gatos y ratas) (Fayer y col., 2004). La giardiosis ha sido detectada prácticamente en todos los países en los que se ha investigado. A pesar de que la 349 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES información sobre giardiosis en rumiantes domésticos es escasa, los estudios realizados en estos animales, han puesto de manifiesto la alta prevalencia observada, en las ganaderías bovina, ovina y caprina (Olson y col., 1995; Bomfim y col., 2005, Trout y col., 2005; Castro-Hermida y col., 2005, 2006). En los rumiantes domésticos, el período de prepatencia oscila entorno a 4 días. La infección se produce durante los primeros días de vida, con persistencia a lo largo de más de 10 semanas, eliminando una gran cantidad de quistes en las heces entre las semanas 5-10 de vida (Xiao, 1994). Así, un ternero puede eliminar 109 quistes/día, mientras que una vaca adulta la cifra, aunque menor (7,6 × 105 – 7,2 × 108 quistes/día), sigue siendo significativa. El origen de la infección son los animales enfermos y los portadores asintomáticos eliminadores de quistes, generalmente adultos. Las hembras gestantes constituyen, como en otras protozoosis, la principal fuente de infección, ya que eliminan abundantes quistes al final de la gestación y durante los primeros días de lactancia (Xiao y col., 1994). Esta parasitosis en muchas ocasiones es asintomática, pero se han descrito casos clínicos en rumiantes domésticos con síndromes de malabsorción y diarrea persistente, con heces mucosas, deshidratación, fiebre, apatía, alteración del apetito, distensión abdominal y dolor a la palpación, lo cual conduce a un retraso en el crecimiento e incluso la muerte (Olson y col., 1995; Thompson, 2000). Respecto al tratamiento tanto el metronidazol como el tinidazol han proporcionado buenos resultados. El objetivo del presente estudio fue determinar la prevalencia, la intensidad de infección y los genotipos presentes de G. duodenalis en ovejas adultas. MATERIAL Y MÉTODOS 2.1. Área geográfica de estudio y explotaciones ganaderasEl estudio se llevó a cabo en Galicia, región situada en el Noroeste de España. Durante el período comprendido entre Enero y Junio de 2005, se recogieron muestras fecales de 575 ovejas adultas seleccionadas al azar en 68 rebaños. Las heces se recogieron directamente del recto usando guantes estériles de plástico. Para cada animal, se cumplimentó una ficha en la que se indicó la fecha de recogida de las muestra, lugar de la explotación, número de crotal del animal y observaciones (diarrea, enfermedades, etc...). Todas las muestras se transportaron en una nevera portátil al Laboratorio, se conservaron a 4ºC y se procesaron en un período máximo de 24 horas después de su recogida. 2.2. Procesado de las muestras Las heces fueron diluidas en agua destilada y filtradas a través de mallas (45 µm). El líquido filtrado se recogió en tubos de centrífuga de fondo cónico. Se adicionó en proporción 2:1 éter dietílico y se centrífugo a 1.000 g durante 5 minutos a 4ºC, eliminándose las tres capas por decantación. Una parte del sedimento se utilizó para el examen microscópico y otra para realizar estudios de biología molecular. 2.3. Inmunofluorescencia Directa (IFD) Una alícuota del sedimento se depositó sobre un portaobjetos y los quistes de G. duodenalis se identificaron al microscopio de fluorescencia con el objetivo 40x, empleando un anticuerpo monoclonal comercial (Aqua-Glo G/C Direct, FL, Comprehensive Kit. Waterborne, Inc. New Orleans, USA), y siguiendo el protocolo indicado por el fabricante. La intensidad de infección se determinó como el número de quistes/g de heces aplicando la siguiente ecuación: número de quistes presentes en la muestra/volumen de muestra examinada (ml) x peso de las heces (g) . 350 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES 2.4. Obtención del ADN, amplificación del gen ß-giardina y secuenciación Los quistes de G. duodenalis se aislaron a partir del sedimento fecal empleando un kit comercial Dynabeads® GC-Combo (Dynal, Biotech ASA, Noruega) basado en una técnica de Separación Inmunomagnética (IMS). A continuación, la extracción de ADN genómico se realizó mediante el kit comercial QIAamp® DNA Minikit (QIAGEN, CA) siguiendo el protocolo específico para tejidos descrito por el fabricante. La amplificación del gel ßgiardina se realizó por Hemi-Nested PCR usando los siguientes cebadores G7: 5’AAGCCCGACGACCTCAC CCGCAGTGC-3’; G376: 5’CATAACGACGCCATCGCGGCTCTCAGCAA-3’; G759: 5’GAGGCCGCCCTGGA TCTTCGAGACGAC-3’. En la primera reacción de PCR se amplificó un fragmento de 753 pb usando los cebadores G7 y G759, de acuerdo con el protocolo descrito por Cacció y col. (2002). En la segunda reacción, se amplificó un fragmento de 384 pb usando los cebadores G376 y G759. Para las reacciones de PCR se mezclaron, en un volumen final de 50 µl, los siguientes reactivos: 5 µl de tampón 10x (BioLabs, New England); 1,5 mM de MgCl2; 200 µM de cada dNTP; 10 pM de cada cebador; 2,5 unidades de ExTaq DNA polimerasa (BioLabs, New England), 10 µl de ADN purificado (primera reacción) o 2 µl (segunda reacción) y agua (c.s.p. 50 µl). Para la reacción se emplearon 35 ciclos cada uno de ellos integrado por: 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 65ºC y un minuto a 72ºC, con una fase inicial de desnaturalización (5 minutos a 94ºC) y una extensión final (7 minutos a 72ºC). Los productos amplificados se separaron por electroforesis en gel de agarosa del 1,4% con bromuro de etidio (0,5 µg/ml). Tras purificar el fragmento de ADN se procede a su clonación en el plásmido TOPO TA Cloning® (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los insertos de ADN se secuenciaron en un laboratorio externo (MWG Biotech, Alemania) utilizando los cebadores G376 y G759. Las secuencias se compararon con los existentes en la base de datos del GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Los alineamientos y análisis de polimorfismos se llevaron a cabo usando los programas informáticos ChromasPro® 1.2. y Proseq® 2.91. RESULTADOSSe identificaron quistes de G. duodenalis en 188 ovejas (32,7%) pertenecientes a 67 (98,5%) rebaños. La eliminación quística osciló entre 10-4.319 quistes/g de heces (media 177 ± 598 quistes/g de heces). Mediante el análisis de secuencias del fragmento amplificado únicamente se detectó el genotipo E. DISCUSIÓN En Galicia apenas se ha estudiado la epidemiología de la giardiosis ovina y no existe información sobre la importancia del ganado ovino adulto como fuente de infección para los animales y el hombre. La elevada prevalencia obtenida en el presente estudio (32,7%), así como el hecho de que en el 98,5% de los rebaños existiesen ovejas adultas eliminadoras de quistes, pone de manifiesto que la infección por G. duodenalis en la ganadería ovina está ampliamente distribuida en Galicia. Los datos de prevalencia obtenidos por diversos autores son difíciles de comparar al variar – entre otros – parámetros como la edad del animal en el momento del muestreo, el número de muestras analizadas, la metodología aplicada o la presencia / ausencia de sintomatología. No obstante, opinamos que nuestros resultados son representativos ya que el presente estudio no se llevó a cabo en animales con edades incluidas en el período de 351 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES máximo riesgo para el padecimiento de la infección, ni en corderos con sintomatología sino que fueron ovejas adultas seleccionadas al azar y en 68 rebaños distribuidos por toda la geografía de Galicia. Incluso, la actual prevalencia podría estar subestimada porque sólo se recogió una única muestra fecal por animal. La excreción quística se puede presentar de manera intermitente, principalmente hacia el final del período de patencia, si la muestra fue negativa durante este período el animal se consideró negativo. Estudios realizados por diferentes autores muestran prevalencias de giardiosis ovina entre un 6,2% y un 68,6% (Buret y col., 1990; Taylor y col., 1993; Diaz y col., 1996; Olson y col., 1995; Ryan y col., 2005), aunque la mayoría de estos trabajos se realizaron con animales jóvenes. El examen microscópico de las heces es uno de los mejores métodos para determinar la prevalencia e intensidad de la infección de esta parasitosis, sin embargo, para conocer las rutas de transmisión es preciso recurrir a técnicas moleculares que permitan la caracterización de los quistes proporcionando datos objetivos sobre su potencial zoonótico (Lalle y col., 2005). En el presente estudio, los resultados obtenidos tras la aplicación de técnicas moleculares son preliminares debido al escaso número de muestras analizadas. La detección de quistes de G. duodenalis en heces de ovejas adultas por IFD fue más sensible que la técnica de PCR. Así, en muestras con una intensidad de parasitación baja (< 100 quistes/g de heces), tras el proceso de extracción de ADN, la técnica de PCR fue negativa, esto podría ser debido a la presencia de inhibidores en las heces, a los pequeños volúmenes utilizados en los procedimientos moleculares o que los quistes sólo estaban concentrados y no purificados. En nuestra opinión, la técnica de PCR es altamente sensible y útil en muestras fecales que, por su elevada carga parasitaria, permitan purificar los quistes presentes en las mismas. Sin embargo, presenta serias limitaciones cuando se aplica sobre heces con baja intensidad de infección. La intensidad de infección de G. duodenalis en ovejas adultas osciló entre 104.319 quistes/g de heces. Estos valores son similares a los obtenidos en estudios previos realizados en ovejas (Giangaspero y col., 2005). En términos de contaminación ambiental, el número medio de quistes de G. duodenalis que puede eliminar una oveja adulta puede estimarse entre 2×104 quistes/día y 8638×103 quistes/día, considerando que la cantidad de heces producida por animal/día es aproximadamente 2 kg. Los estudios genéticos realizados en el presente trabajo y basados en la amplificación del gel ß-giardina mostraron que únicamente se detectó el genotipo E. Este genotipo es común en la ganadería bovina y en otros rumiantes domésticos incluyendo el ganado ovino (Becher y col., 2004; Hunter y Thompson, 2005; Itagaki y col., 2005; Ryan y col., 2005; Trout y col., 2005). No existen datos epidemiológicos ni genéticos que confirmen que el genotipo E infecta al hombre, por tanto, no está considerado su carácter zoonótico (Thompson y col., 2000; Thompson, 2003). Estudios realizados en Australia y Norte América en el ganado bovino, indicaron que el riesgo que representan para la salud pública terneros infectados con G. duodenalis puede ser mínimo (O’Handley y col., 2000; Hoar y col., 2001). Aunque, está ampliamente demostrado que los rumiantes domésticos, principalmente las ganaderías bovina, ovina y caprina, son susceptibles a la infección con genotipos zoonóticos de G. duodenalis y que el genotipo A es geográficamente el más ampliamente detectado en el hombre y rumiantes domésticos (Thompson y col., 2000), estudios longitudinales llevados a cabo en Australia sugieren que los genotipos zoonóticos pueden estar presentes sólo de forma transitoria y podría existir un mecanismo competitivo 352 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES cuando la frecuencia de transmisión del genotipo E es alta (Becher y col., 2004). Incluso, Trout y col. (2005) sugieren que el genotipo A (zoonótico) y el genotipo E (no zoonótico) podría tener períodos de patencia distintos. Todos los animales examinados fueron asintomáticos. Sin embargo, en un estudio realizado por Ryan y col. (2005) observaron una asociación significativa entre ovejas adultas parasitadas y la presencia de diarrea. Son necesarios estudios posteriores para analizar un mayor número de muestras con el fin de confirmar si el genotipo E es el predominante en las ovejas adultas en Galicia, lo que pondría de manifiesto la importancia del ganado ovino adulto en la transmisión de la giardiosis dentro de la explotación y el escaso riesgo que representarían estos animales para la salud pública. AGRADECIMIENTOS Este estudio ha sido financiado por la Consellería de Innovación e Industria de la Xunta de Galicia (PGIDIT05RAG50306PR). BIBLIOGRAFÍA Adam, R.D. 2001. Biology of Giardia lamblia. Clinical Microbiology Review, 14: 447-475. 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ABSTRACT Cryptosporidiosis is a universally-distributed parasitic disease, diarrhoea being the main clinical symptom in neonatal domestic ruminants. The disease is caused by protozoans included in the genus Cryptosporidium, which comprises organisms that develop and multiply in the epithelial cells of the digestive and respiratory tract of vertebrates. Although this parasitic infection is important in domestic ruminants in terms of animal health and production, the zoonotic nature of the infection and the possibility that livestock may act as sources of infection - thereby transmitting the parasite to the human population via food and water, must also be considered. At present, there is no effective treatment available for cryptosporidiosis in man or animals. The aim of the present study was to evaluate the efficacy of Bobel-24 (2,4,6-triiodophenol) against experimental cryptosporidiosis in neonatal mice model. C. parvum oocysts were collected from naturally infected calves. Concentration, purification and quantification of oocysts were as described previously. Neonatal mice (2,5-3,0 g/body weight) were inoculated intragastrically (2,5x104 oocysts/0,1 ml). Preventive and curative efficacies at different doses (50, 100 y 125 mg/kg body weight) and regimens of Bobel-24 against cryptosporidial infection were evaluated. Prevalence and intensity of infection were determined 7 days after infection by examination of intestinal homogenates. No apparent toxic effects were observed. Although we were unable to eliminate infectivity in the mice, our study revealed that the intensity of infection for the preventive litters and preventive/curative was significantly lower (P < 0.001) than in the control litters. INTRODUCCIÓN Cryptosporidium parvum (Apicomplexa: Cryptosporidiidae) es un protozoo parásito que infecta a un amplio rango de mamíferos, entre los que se incluye el hombre. Las infecciones en individuos inmunocompetentes son de corta duración y el compromiso intestinal puede originar procesos diarreicos de intensidad variable con pérdidas de peso. Sin embargo, en individuos inmunocomprometidos, la infección puede ser persistente e incluso mortal. Desde el punto de vista de la sanidad y la producción animal, C. parvum es uno de los principales agentes etiológicos del síndrome de diarrea neonatal en rumiantes domésticos, 355 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES ocasionando importantes pérdidas económicas, especialmente en las ganaderías bovina, ovina y caprina, debido a que puede ocasionar fuerte deshidratación que conlleva un importante retraso en el crecimiento de los animales. Incluso en ausencia de otros enteropatógenos, la infección por Cryptosporidium puede ocasionar elevadas tasas de mortalidad y la morbilidad puede llegar a alcanzar el 100% (Fayer y col., 2004). Sin embargo, la cryptosporidiosis no debe considerarse únicamente bajo la perspectiva de la sanidad humana y animal, sino que es necesario tener en cuenta su carácter zoonótico y la posibilidad de que los animales de renta actúen como fuente de contagio, vehiculando el parásito a la población humana a través de los alimentos y el agua. Lo anteriormente expuesto se agrava por dos circunstancias: la extraordinaria resistencia de las formas infectantes a los antisépticos y desinfectantes habitualmente empleados y por la ausencia de un tratamiento eficaz. Aunque una gran diversidad de moléculas han sido evaluadas frente a la cryptosporidiosis humana y animal, en la actualidad, no existe ningún tratamiento totalmente eficaz tanto para la profilaxis como para el tratamiento (Coombs y Müller, 2002). Sin embargo, entre las moléculas que han mostrado una eficacia parcial frente a la cryptosporidiosis animal destacan: el lactato de halofuginona (Villacorta y col., 1991; Lefay y col., 2001), paromomicina (Chartier y col., 1996; Viu y col., 2000; Grinberg y col., 2002) y los excipientes α-, β-ciclodextrina (Castro-Hermida y col., 2001a, 2002, 2004). Frente a la cryptosporidiosis humana, la nitazoxanida ha mostrado resultados esperanzadores (Amadi y col., 2002; Gilles y Hoffman, 2002). El Bobel-24 o AM-24 (2,4,6-triyodofenol) es un antiinflamatorio de síntesis que presenta una acción superior a los anti-inflamatorios no esteroídicos. Este principio activo está indicado para problemas asociados con las formas inflamatorias y degenerativas de reumatismo; cualquier condición inflamatoria de origen traumático; enfermedades del colon (colitis ulcerosa y síndrome de Crohn); enfermedades respiratorias (asma, fibrosis pulmonar y Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda (SDRA) y dermatosis (soriasis, dermatitis atópica, irritación, acné, dermatitis seborreica, etc...) (García-Capdevila y col., 1998). El objetivo del presente estudio es evaluar la eficacia del Bobel-24 en el tratamiento de la cryptosporidiosis experimental. MATERIAL Y MÉTODOS 2.1. Parásito Los ooquistes de C. parvum procedieron de un ternero de raza Frisona naturalmente infectado. Las heces, sobre las que se aplicó inicialmente un examen directo con Fucsina básica fenicada (Heine, 1982), fueron sometidas a procesos de concentración, purificación y cuantificación de acuerdo con el protolo descrito por Lorenzo y col. (1993). El material fecal fue recogido directamente del recto y una vez confirmada la infección de intensidad grave (>10 ooquistes/campo microscópico 100 Х) se conservó en dicromato potásico al 5% (1:1) a 4 ºC hasta su posterior utilización en un tiempo máximo de 48 horas. Las heces fueron filtradas a través de mallas (45 µm) y el líquido filtrado se centrífugo, repetidas veces, a 1.000 g durante 5 minutos a 4 ºC hasta eliminar el exceso de dicromato potásico. El sedimento fue suspendido en tampón fosfato salino (PBS) 0,04M, pH 7,2 y dietil éter (2:1) y centrifugado a 800 g durante 5 minutos a 4 ºC, eliminándose las tres capas por decantación. Este paso se repitió las veces necesarias hasta la total extracción de restos lipídicos. Después de varios lavados, el sedimento se resuspendió en agua destilada estéril y 1 ml de la suspensión resultante fue procesado mediante un gradiente discontinuo de Percol 356 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES (Sigma P-1644) constituido por cuatro capas de 2,5 ml de densidades 1,13; 1,09; 1,05; 1,01 g/ml y centrifugado a 650 g durante 15 minutos a 4 ºC. La banda conteniendo los ooquistes purificados se lavó repetidas veces con agua destilada estéril a 1.000 g durante 5 minutos a 4 ºC para eliminar los restos de Percol. El número de ooquistes presentes en 1 ml de la suspensión se cuantificó en una cámara de Neubauer utilizando verde malaquita (0,16%) como contracolorante. Para evitar la contaminación bacteriana se adicionaron a la suspensión ooquística purificada 2.000 UI/ml de penicilina y 10 mg/ml de gentamicina conservándose a 4 ºC hasta su utilización. 2.2. Ensayos de infectividad in vivo Se evaluó la eficacia preventiva, preventiva/curativa y curativa de suspensiones de Bobel24 (50 y 125 mg/kg peso vivo) elaboradas con el excipiente carboximetilcelulosa sódica (CMC) en el tratamiento de la cryptosporidiosis experimental. Para ello, se utilizaron un total de 18 camadas de ratones Swiss CD-1 (6-18 ratones/camada). En todos los ensayos se emplearon animales con un peso corporal comprendido entre 2,5-3 g (3-4 días de edad). Todas las camadas con sus respectivas madres se mantuvieron separadas en jaulas de plástico, recibieron un pienso comercial adecuado y agua ad libitum, manteniéndose bajo unas condiciones higiénicas buenas y con las características del animalario existente en nuestro Laboratorio de Parasitología, es decir, una sala blanca ISO-7 con un nivel de bioseguridad P-3. En todo momento, se cumplió con la legislación vigente sobre protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos (Real Decreto 1201/2005 de 10 de octubre de 2005) (BOE nº 252 de 21 de octubre de 2005). En todos los ensayos la dosis administrada en las infecciones experimentales fue de 2,5 x 104 ooquistes/0,1 ml/ratón, dosis establecida en estudios previos como superior a la necesaria para conseguir implantar la infección en la totalidad de los animales (Villacorta, 1989). Cada ensayo se realizó por duplicado y se utilizaron camadas control de infección y del excipiente. A los siete días post-inoculación, día de máxima producción ooquística (Villacorta, 1989), se sacrificaron los animales y los intestinos se recogieron individualmente sobre 5 ml agua destilada estéril. A continuación, fueron triturados utilizando un homogenizador de barras (Ultra-Turrax® T-25, IKA®-WERKE). La producción ooquística, se cuantificó en cámara de Neubauer como se describe anteriormente. El resultado se expresó como el número de ooquistes x 105 / totalidad de intestino homogenizado. Las camadas recibieron cuatro horas antes de ser inoculadas 100 µl de la suspensión del Bobel-24 y los días uno y dos post-inoculación (ensayos de eficacia preventiva) y desde el día uno hasta el día seis post-inoculación (ensayos de eficacia preventiva/curativa). En los estudios de eficacia curativa la suspensión de Bobel-24 se administró los días tres, cuatro, cinco y seis post-inoculación. 2.3. Tratamiento estadístico de los datos El análisis estadístico de los resultados se llevó a cabo mediante el análisis de la varianza (ANOVA) de una sóla vía y el test de comparación múltiple SNK (Student-NewmanKeuls), GraphPad InStat® (Version 3.05). 357 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES RESULTADOS Los porcentajes de parasitación obtenidos tanto en las camadas control de infección como del excipiente CMC fueron del 100%. La intensidad de infección detectada entre ambos controles fue similar y no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre ellos (Tabla 1). La administración del principio activo a las dos dosis ensayadas no permitió, en ningún caso, disminuir el número de animales infectados. Sin embargo, se consiguió reducir significativamente las intensidades de infección (P < 0,001) en los ensayos de eficacia preventiva y preventiva/curativa respecto a las observadas en las camadas control. Además, la intensidad de parasitación en las camadas tratadas curativamente fue significativamente menor (P < 0,05) que la obtenida para ambos controles. A pesar de estas reducciones significativas en las intensidades de infección para los diferentes tratamientos, en ningún caso, existió una relación directa entre la dosis administrada y el descenso de intensidad de parasitación determinado (Tabla 1). Tabla 1. Eficacias preventiva, preventiva/curativa y curativa de la suspensión de Bobel-24 en carboximetilcelulosa sódica, evaluadas en ratones lactantes infectados con 2,5 x 104 ooquistes de C. parvum. TRATAMIENTOS Preventivo Preventivo / Curativo Curativo Intensidad Intensidad Intensidad Nº ratones de Nº ratones de Nº ratones de inoculados infección inoculados infección inoculados infección a a a 61,7 ± 61,7 ± 61,7 ± Control 20 20 20 36,8 ■ 36,8 ■ 36,8 ■ infección 51,7 ± 58,6 ± Control 25 23 32,6 ■ 36,2 ■ CMC 15,1 ± 9,8 20,9 ± 40,9 ± Bobel (50 28 22 23 • 11,4 • 26,2 * mg/kg) Bobel 13,0 ± 21,0 ± 9,1 35,8 ± 7,7 24 26 19 (125 10,1• • * mg/kg) a : media ± desviación estándar de ooquistes × 105 / totalidad del intestino homogenizado; ■, • y * : No existen diferencias estadísticamente significativas entre los pares. DISCUSIÓN En estos últimos años y como consecuencia de las importantes repercusiones de la cryptosporidiosis tanto en sanidad humana como animal, se ha incrementado la investigación de medidas terapéuticas y preventivas frente a esta parasitosis. Sin duda, los resultados obtenidos en bioensayos utilizando distintos modelos animales son más fiables que los alcanzados en estudios in vitro. La mayoría de los ensayos in vivo utilizan roedores de laboratorio consiguiendo, en algunas especies, incrementar la susceptibilidad al parásito mediante la administración de agentes inmunosupresores. Por otra parte, el empleo de animales con inmunodeficiencias congénitas proporciona un modelo aplicable a hospedadores naturales inmunodeficientes (Rehg, 1996; Bjorneby y col., 1991). 358 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES El modelo murino lactante utilizado en el presente estudio presenta varias ventajas. Los ratones lactantes se pesan diariamente, lo que permite ajustar la dosis del Bobel-24 para mantenerla constante durante todo el experimento. Es posible la extracción de todo el tracto gastrointestinal, lo que permite cuantificar la totalidad de ooquistes presentes en el mismo. Al no interferir el sistema inmune simulamos una situación semejante a la que se presenta en condiciones naturales cuando se trata de hospedadores inmunocompetentes. Sin embargo, la cryptosporidiosis en estos animales no cursa con sintomatología por lo que no permite evaluar la eficacia frente a las manifestaciones clínicas que ocasiona esta parasitosis en otros animales. Finalmente, su fácil manejo, bajo coste y rápida procreación hacen que este modelo sea el más aceptado con sus ventajas e inconvenientes (Blagburn y col., 1998). No obstante, la creciente preocupación de la sociedad por la protección de los animales y la calidad de la investigación, en la que la observación, el control, el bienestar, el mantenimiento y el cuidado de los animales que se utilizan en experimentación es un pilar básico, así como los cambios en la legislación y los continuos avances científicos, hacen que sea necesario el estricto cumplimiento de la normativa vigente (Real Decreto 1201/2005 de 10 de octubre de 2005, BOE nº 252 de 21 de octubre de 2005). La elección de las pautas de administración tanto preventiva, preventiva/curativa como curativa, se realizó teniendo en cuenta el tiempo necesario para que se complete el ciclo biológico en un hospedador y establecido, por Current y Haynes (1984), en torno a 72 horas. Los resultados obtenidos en el presente estudio demuestran que el Bobel-24 aunque no permite erradicar la infección reduce significativamente la intensidad de la misma en todos los ensayos, si bien, este efecto fue más importante en las camadas inoculadas preventivamente. De igual forma, al evaluar in vivo la actividad de este anti-inflamatorio no esteroídico a las dosis establecidas, comprobamos que independientemente del régimen de administración empleado, se produce un descenso en la intensidad de infección con respecto a las camadas control, aunque no se observó una relación efecto dosisdependiente, quizá debido a las propiedades físico-químicas del principio activo. Un problema bastante común entre los principios activos ensayados frente a la cryptosporidiosis es su baja solubilidad, la disolución de un principio activo es el paso previo para su absorción. Al mejorar la solubilidad del principio activo, se aumenta la fracción absorbida del mismo, con lo cual se puede disminuir la dosis a administrar para lograr el mismo efecto terapéutico, lo que implica una ventaja adicional de una disminución de los efectos secundarios obtenidos a consecuencia de las elevadas dosis administradas. Por tanto, la formulación correcta de un compuesto posee una importancia decisiva a la hora de garantizar su adecuada biodisponibilidad y por tanto, su eficacia terapéutica. La intensidad de infección observada con el excipiente carboximetilcelulosa sódica (CMC) ha sido similar a la obtenida en las camadas control. Algunos excipientes han mostrado una cierta actividad frente a la cryptosporidiosis, incluso se ha observado un posible efecto sinérgico entre el excipiente y el principio activo (Harp, 1999; CastroHermida y col., 2000; 2001). Las dosis utilizadas en el modelo murino lactante no presentaron toxicidad aparente como lo demuestran la ganancia de peso observada a lo largo de todos los ensayos y la ausencia de mortalidad respecto a las camadas control. A pesar de que no se ha conseguido erradicar la infección por C. parvum, se ha observado una actividad anti-cryptosporidial de Bobel-24 en los ensayos de eficacia 359 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES preventiva y preventiva/curativa que permite abrir nuevas vías en los estudios de tratamiento de esta parasitosis. AGRADECIMIENTOS Este estudio ha sido financiado por la Consellería de Innovación e Industria de la Xunta de Galicia (PGIDIT05RAG50306PR) y por la Fundación Universitaria S. Pablo-CEU BIBLIOGRAFÍA Amadi, B.; Mwiya, M.; Musuku, J.; Watuka, A.; Sianongo, S.; Ayoub, A. y Kelly, P. 2002. 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Cows that presented warbles on their back were used as positive animals and calves 6 months old as negative. The lymphocytes was isolated from those animals and they were cultivated for 24, 48 and 72h with 11µg of HA and different concentrations of both mitogens (Con A and PHA). The stimulation of lymphocytes with HA without mitogen, did not induce the secretion of INF-γ. The coincubation with Con A increased considerably the secretion of IFN-γ in the infested animals, with a maximum at 48 h. On the contrary, in cultures from negative animals the presence of HA diminished notably the effects of Con A. Something similar happened to PHA, so the negative animals showed basal levels. In cultures of positive animals incubated with 20 µg/ml of PHA, IFN-γ levels raised when increasing the culture time. In conclusion, differences between negative and positive animals showed an inhibition on the secretion of IFN-γ in the first ones, which could be interpreted as an evasion strategy that would explain the survival of larvae in primo infected animals. INTRODUCCIÓN La hipodermosis es una miasis cutánea del ganado vacuno que guarda mucha relación con la edad y el estado inmunitario de los animales. Está comprobado, que el ganado vacuno desarrolla cierta resistencia tras repetidas exposiciones a las larvas de Hypoderma spp., como lo demuestra el hecho repetido de que los animales más jóvenes presenten, por lo general, un número de nódulos larvarios significativamente superior a los de más edad (GINGRICH, 1982). Esta resistencia constituye un factor importante en el control de las poblaciones del parásito, comprobándose que es dependiente del número de exposiciones previas y del número de larvas que infesten al hospedador (COLWELL, 1985). La respuesta humoral se ha estudiado ampliamente, permitiendo el desarrollo de técnicas de diagnóstico precoces, encaminadas a detectar anticuerpos y antígenos parasitarios (PANADERO y col., 2002; COLWELL y col., 2003). No obstante, es manifiesta la ausencia de relación directa entre los niveles de inmunoglobulinas séricas y el grado de resistencia alcanzado por los animales (PRUETT y BARRETT, 1985; PANADERO, 1996), por lo que se sospecha que la respuesta celular, que ha sido menos investigada hasta el momento, desempeña un papel muy importante en la respuesta protectora frente a esta parasitosis. 362 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES NELSON y WEINTRAUB (1972) denunciaron que la respuesta celular estaba implicada en la inmunidad frente a Hypoderma, como lo demostraba la fuerte reacción celular producida tras la penetración de las larvas, en especial en los animales reinfestados. Tras esta primera aproximación, BARON y WEINTRAUB (1986) estudiaron la respuesta linfoproliferativa en animales primo y reinfestados tras la activación con distintos mitógenos. Estos autores sugierieron que la resistencia adquirida frente a la hipodermosis era de base celular y en ella participaban células T y B. Sin embargo, todavía se desconoce el patrón exacto de secreción de distintas citoquinas por parte de los linfocitos activados, de modo que es importante conocer si la protección se debe al predominio de la respuesta linfocitaria tipo I (Th1), y a la consiguiente liberación de citoquinas que tienen un efecto estimulador de la inmunidad celular, o bien se trata de la respuesta tipo II (Th2), donde predomina la liberación de citoquinas cuyo efecto principal es la regulación de la producción de anticuerpos. Dentro de la respuesta celular Th1 destaca el IFN-γ, que es una citoquina producida por linfocitos T y células NK (ROMAGNANI, 1997). A parte de su clara actividad antiviral y reguladora del crecimiento celular, sus propiedades inmunomoduladoras son con toda probabilidad las más importantes. El IFN-γ es el principal activador de la función de los macrófagos y también regula el proceso de diferenciación de las células mieloides (BOEHM y col., 1997). Además, juega un papel importante en el crecimiento y diferenciación de los linfocitos citotóxicos, activa las células NK y actúa como un factor de maduración de los linfocitos B. Su papel exacto en el desarrollo de ciertas enfermedades y en la terapia todavía no está muy claro; se sabe que está implicado en la defensa frente a parásitos, patógenos intracelulares y posiblemente también ante células tumorales (STARK y col., 1998). El presente trabajo se realizó con objeto de estudiar el efecto de la hipodermina A (HA), sobre la secreción de IFN-γ, por los linfocitos de bovinos infestados y no infestados por Hypoderma lineatum observando la acción moduladora de esta sobre la actividad de los mitógenos concanavalina A y fitohemaglutinina. MATERIAL Y MÉTODOS La obtención del antígeno de Hypoderma se llevó a cabo a partir de larvas 1 de H. lineatum recogidas de la submucosa esofágica de bovinos sacrificados en matadero. Las L1 permanecieron congeladas a -20ºC hasta el momento de obtener el antígeno. La hipodermina A (HA) se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico empleando DEAE (diethylaminoetil) ligado a celulosa (DEAE-celulosa, Whatman) como intercambiador aniónico. Posteriormente, se determinó la concentración proteica de esta mediante la técnica del BCA de Pierce. La concentración observada fue de 0,11 mg/ml. Para obtener sangre de animales infestados se emplearon como animales positivos 3 vacas de 4 a 8 años, las cuales presentaban nódulos larvarios de Hypoderma en el dorso durante el periodo de la toma de muestras. Ante la dificultad de encontrar ganado vacuno adulto que no hubiera estado nunca en contacto con las larvas parásitas (negativos) , tomamos la sangre de terneros procedentes de una explotación de ganado vacuno de la provincia de Lugo. La edad de los terneros escogidos fue de aproximadamente 6 meses. Las muestras sanguíneas se tomaron por punción de la vena caudal en tubos de vidrio heparinizados. En ambos casos (infestados y no infestados), la sangre procedente de distintos animales se mezcló para evitar posibles variaciones individuales. Posteriormente 363 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES se aislaron los linfocitos depositando en tubos de vidrio 6 ml de una solución comercial (Biocoll δ 1,077) a la que se le añadió cuidadosamente 4 ml de sangre heparinizada y a continuación se centrifugó a 400 g durante 30 minutos (Esquema 1). Esquema 1: Protocolo de aislamiento linfocitario LINFOCITOS S Después del aislamiento se realizó un análisis de la viabilidad celular con azul tripán, y a continuación se ajustó la concentración a 5 x 106 linfocitos/ml usando para ello medio de cultivo completo que contenía RPMI-1640®, suero fetal bovino (SFB) descomplementado, 100 UI/ml de penicilina, 20 µg/ml de estreptomicina y 1 µl/ml de anfotericina B. Posteriormente se añadieron los mitógenos concanavalina A (Con A, Biochrom) y fitohemaglutinina (PHA-L, Biochrom) a razón de 5, 10 y 20 µg/ml, dejando un pocillo sin estimular al que se le añadieron 100 µl de PBS. Al mismo tiempo se sensibilizaron los linfocitos con 11µg de HA. De esta forma se cultivaron los linfocitos de los animales positivos y negativos a Hypoderma. Después de 24, 48 y 72 horas de incubación, a una temperatura de 37ºC, en una atmósfera de CO2 al 5% y con un 95 % de humedad, se recogió el sobrenadante de cada pocillo centrifugándolo a 800 g durante 10 minutos y se congeló a -80ºC. La cuantificación del interferón-γ se llevó a cabo mediante el ensayo comercial IFN-γ-Bovine EASIA (BIOSOURCE). RESULTADOS Y DISCUSIÓN La estimulación de los linfocitos con la hipodermina A en ausencia de mitógenos, no induce la secreción de INF-γ. Estos resultados coinciden con los de MOIRÉ y col. (1997) quienes demostraron que esta proteasa de la familia de las tripsinas degrada los marcadores de superficie implicados en la activación de los linfocitos, inhibiendo por tanto la secreción de determinadas citoquinas, entre las que se encuentra el INF-γ. De acuerdo con estos autores, el efecto de la HA sobre los linfocitos comenzaría en las fases tempranas de la estimulación y los efectos pueden revertirse retirando la HA. Esta actividad enzimática también podría estar implicada en la inhibición de la proliferación linfocitaria. FISHER y col. (1991) y CHABAUDIE y BOULARD (1992) fueron los primeros en sugerir el papel de esta enzima en la inmunosupresión observada en los animales infestados. Así, la HA actúa degradando el componente C3 del complemento implicado en la respuesta antígeno364 XIV CONGRESO INTERNACIONAL DE LA FEDERACIÓN MEDITERRÁNEA DE SANIDAD Y PRODUCCIÓN DE RUMIANTES específica y en el control de la linfoproliferación (BOULARD, 1989; BARON, 1990; ERDEI y col., 1991). Abs (450 nm) Abs (450 nm) Abs (450 nm) Al cultivar en presencia del mitógeno concanavalina observamos el siguiente comportamiento: En la figura 1A se aprecia que la 4 co-incubación de la HA con 5 µg/ml Testigo (+) Testigo (-) A de Con A produjo, en los cultivos de Negativo Positivo 3 animales no infestados, una disminución de la respuesta al 2 mitógeno. Así, la presencia de Con A 1 provocó un aumento en los niveles de INF-γ que alcanzó niveles 0 máximos (D.O. 1,70) tras 48h de 24h 48h 72h incubación; mientras que la adición de HA disminuyó los niveles de esta 4 citoquina. Por el contrario, en los B 3 cultivos de animales infestados la exposición a la HA no redujo la 2 respuesta a la Con A, excepto en los incubados durante 24h. 1 Al aumentar la concentración de mitógeno a 10 µg/ml observamos 0 24h 48h 72h de nuevo que en los cultivos procedentes de animales negativos la 4 presencia de HA disminuyó notablemente los efectos de la Con A. C 3 En cambio, en los cultivos de animales infestados la secreción de 2 INF-γ aumentó notablemente con 1 respecto a sus testigos, con valores máximos (D.O. 3.90) alcanzados tras 0 48h de cultivo. 24h 48h 72h Finalmente, al añadir 20 µg/ml de Horas de cultivo mitógeno vemos que el Fig 1.- Niveles de IFN-γ en linfocitos comportamiento de los linfocitos de estimulados con HA y en presencia de 5 (A), terneros sin infestar fue similar a los 10 (B) y 20 µg/ml de Con A casos anteriores. Los cultivos de vacas infestadas reprodujeron el mismo comportamiento que