Transformación y mejoramiento genético vegetal

Transcripción

Métodos de transformación en plantas
1
1
Métodos de transformación en plantas mediado por Agrobacterium
tumefaciens y bombardeo de partículas “biolística”.
Methods in plant transformation by Agrobacterium tumefaciens and
bombardment of particles "biolistic".
Israel Giovanni González M. ¹
RESÚMEN
La transformación vegetal se define en sentido estricto como el proceso de
cambio del fenotipo de un organismo a través de la introducción de ADN
foráneo al genoma. En plantas esta técnica ha avanzado vertiginosamente, con
el objeto de lograr mayor conveniencia y eficiencia, en un rango de genotipos
más amplio y de características moleculares deseadas en las plantas
transformadas. En la base de la biotecnología agrícola contemporánea, existe
un rango considerable de técnicas y herramientas disponibles que varían
ampliamente en sofisticación y en el tiempo necesario para producir resultados,
estas técnicas en su mayoría parten del aislamiento de células, tejidos y
órganos de plantas y el crecimiento de estos bajo condiciones in vitro, en la
actualidad existen dos tipos de técnicas básicas, la primera introduce el ADN a
las células vegetales usando un vector plasmidico Ti (Agrobacterium), una
bacteria que infecta los tejidos vegetales, modifica el genoma de estas y
provoca crecimientos tumorosos. La otra técnica involucra la introducción
directa de ADN desnudo usando distintos métodos, como el bombardeo de
partículas, la electroporación o mediada por glicol polietilénico (PEG). Todas
estas técnicas que convergen en la ingeniería genética conllevan a obtener
Organismos Genéticamente Modificados (OGM);
a usar marcadores
moleculares y sondas para el mapeo de genes y la identificación clara de
genotipos a través de la secuenciación de DNA.
PALABRAS CLAVES: Transformación vegetal, biotecnología agrícola, vector
plasmidico Ti, electroporación, PEG, OGM.
1
M.V. Docente facultad de ciencias agrarias, Universidad de Pamplona.
2
ABSTRACT
Plant transformation is defined in a strict sense as the process of changing of
the phenotype of an organism by introducing foreign DNA to the genome. In
plants this technology has advanced rapidly, in order to achieve major
convenience and efficiency, in a wider range of genotypes and molecular
characteristics desired in the transformed plants. contemporary agricultural
biotechnology, there exists a considerable range of technologies and available
tools which vary greatly in sophistication and in the necessary time to produce
results, These techniques usually start with the isolation of cells, tissue and
organs of plants and the growth of those under in vitro conditions, At present
there exist two types of basic techniques exist. The first one introduces DNA to
plant cells using a plasmid vector Ti (Agrobacterium), a bacteria that infects the
plant tissues; it modifies the genome of these and provokes tumour growth
Another technique involves the direct introduction of isolated DNA using
different methods, as the bombardment of particles, the electroporation or
happened for glycol polyethylene (PEG). All these techniques that converge on
the genetic engineering bear to obtain Genetically Modified Organisms(GMO);
by using molecular markers and sounds for the gene mapping and the clear
identification of genotypes trough DNA sequencing.
KEY WORDS: Plant transformation, agricultural biotechnology, plasmid vector
Ti, electroporation, PEG, GMO.
Introducción
El mejoramiento vegetal se originó
aproximadamente
hace
10.000
años, cuando el hombre se hizo
agricultor
y
comenzó
la
domesticación de las plantas, el
traspaso del material genético de
interés de un individuo a otro, fue
incentivado por las considerables
perdidas económicas de $30-$50
billones anuales por causa de los
daños por fitopatogenos en los
cultivos o cosechas almacenadas
(Baker et al., 1997). Además la
aplicación de los pesticidas no solo
incrementa significativamente los
costos también son considerados
como un serio peligro ambiental,
pero también contribuyen a la
resistencia antimicrobial de las
especies (Khan et al., 2006). La
transgénesis vegetal partió del
principio de que el código genético
es
universal y la información
contenida en los genes es
interpretada de la misma manera en
todos los seres vivos esto hizo
posible pensar en la producción de
organismos transgénicos. Popelka
2004 afirmó que la transferencia de
genes incorpora una información
definida desde un organismo vivo a
un nuevo huésped y pueden ayudar
a proveer soluciones a muchos
problemas
que
afectan
la
producción
vegetal.
Este
mejoramiento genético se basa en
principios
de
existencia
de
variabilidad genética a través de los
caracteres que se pretenden
mejorar y la reproducción sexual
para incorporación de los mismos.
La transformación en plantas se
empezó a trabajar en el siglo XX, a
partir del experimento de Broglie et
al. (1984), En el cual un callo de
petunia expresó un gen de guisante
y se demostró que los genes
introducidos pueden expresarse en
3
células
transformada,
la
incorporación
de
cruzamientos
sexuales, el conocimiento de la
biología floral de las especies y los
avances de la genética y la
estadística experimental influyeron
en el desarrollo de las técnicas
contemporáneas de mejoramiento
genético en plantas. En la
actualidad se utilizan técnicas y
herramientas que convergen en la
ingeniería genética y la tecnología
del ADN recombinante, estas nos
permiten modificar en un solo gen el
patrimonio genético de una variedad
de cultivo obtenida por técnicas de
mejora
tradicionales,
permitiéndonos cambiar el fenotipo
de un organismo a través de
incorporación de un ADN foráneo en
su genoma.
Métodos para la transformación
vegetal
La transformación genética en
plantas presenta varios métodos
que permiten la introducción e
integración de ADN foráneo en el
genoma y así poder seleccionar
eficientemente
las
células
transformadas
permitiendo
la
regeneración completa de las
células transformadas, este ADN
puede ser introducido a nuestra
planta de interés de diferentes
formas, Agrobacterium tumefaciens,
o directamente, por bombardeo con
partículas,
por
microinyección
(Neuhaus y Spangenberg,1990), el
método mas comúnmente utilizado
hace uso de un sistema de
transferencia de ADN que ocurre
naturalmente. Este sistema está
basado en una bacteria del suelo
denominada Agrobacterium que
transfiere a través de su factor
plasmidico inductor de tumores (Ti)
una porción específica de su ADN a
las células de algunas especies de
plantas modificándoles su genoma.
Otro método es el conocido como
biolística o método de ADN libre,
usa una pistola para disparar
partículas microscópicas de oro o
tungsteno
dentro
de
células
vegetales cultivadas. Las partículas
se cubren primero con el ADN que
acarrea el gen de interés, aislado de
la bacteria en la cual fue clonado.,
también es ampliamente usada la
electroporación (Fromm et al., 1986,
Lindsey y Jones, 1990)
o las
técnicas mediadas
por glicol
polietilénico
(PEG)
(Potrykus,
1990).
1. Agrobacterium tumefaciens
Chilton et al. (1977) Evidenciaron la
presencia de un pequeño fragmento
de
ADN
de
la
bacteria
Agrobacterium tumefaciens a nivel
de lesiones tumorales axénicas de
la agalla de la corona del tabaco, de
esta forma se demostró la
capacidad de esta bacteria de
transferir información genética de un
organismo a otro, A. tumefaciens es
el único organismo natural capaz de
transformar genéticamente una
célula vegetal (Zupan y Zambryski,
1995).
Agrobacterium tumefaciens es una
bacteria presente en el suelo que
causa la enfermedad conocida
como “agalla”, se caracteriza por el
crecimiento de neoformaciones en
los
tejidos
vegetales. Esos
crecimientos tumorales son la
integración estable en el genoma
vegetal de un segmento de ADN,
ADN-T
(ADN
transferido),
proveniente
de
un
vector
plásmidico, Ti (plásmido inductor de
tumor), el cual está presente en un
pequeño
porcentaje
de
las
poblaciones
naturales
de
A.
tumefaciens. (Zupan y Zambryski,
4
1995). La caracterización molecular
de estos plásmidos, el proceso de
transferencia y las causas de la
sintomatología que producen han
sido estudiadas con gran detalle
(Drapper y scout, 1991; Zupan et
al., 2000) Los genes El ADN-T está
delimitado por repeticiones directas
de 25 pares de bases, y cualquier
ADN entre estos bordes será
transferido al ADN de la célula
vegetal. Este ADN puede integrarse
en diferentes lugares en el
cromosoma vegetal (Stam et al.,
1997), ADN-T tienen dos tipos de
genes, oncogénicos codificados por
enzimas presentes en la síntesis de
auxinas y citoquinas responsables
de la formación tumoral; y los genes
que codifican para la producción de
opinas, productos resultantes de la
condensación de aminoácidos y
azucares (Opabode 2006) estos
derivados de los aminoácidos son
aprovechados por las bacterias
(Valderrama et al., 2005) al ser
excretados por la corona de las
células de la agalla, y son
consumidas como fuente de carbón
y nitrógeno (Opabode 2006) Para
lograr esta trascripción, el ADN-T
contiene secuencias eucarióticas de
control como las cajas TATA y
CAAT y señalas vegetales de
poliadenilación (McLean, 1998).
Dentro del plásmido Ti encontramos
los genes vir importantes en la
transferencia e incorporación del
ADN en el genoma de la planta
(Valderrama et al., 2005). La región
vir esta compuesta por 30kb,
organizada por seis operones
esenciales en la transferencia de
ADN-T (virA,virB,virD,virG) o para
incrementar la eficiencia en la
transferencia (virC y virE) (Zupan y
Zambryski, 1995; Jeon et al., 1998).
La proteína virA detecta los
compuestos fenólicos secretados
por las células heridas y provoca la
fosforilación de la proteína virG,
provoca
una
cascada
de
trascripción de las demás proteínas
vir, que se encargan, a través de un
proceso aún no completamente
caracterizado, de la transferencia e
integración del ADN-T (Zupan y
Zambryski, 1995, McLean, 1998).
Se han observado tumores de
Agrobacterium bajo condiciones
naturales en 643 especies en 331
géneros
de
dicotiledóneas
y
gimnospermas (McLean, 1998).
Este A. tumefaciens junto con las
especies A. rhizogenes y A. vitis son
patógenos reconocidos de las
plantas y tienen la capacidad de
integrar establemente parte de su
material genético dentro del genoma
de su hospedero (Tzfira y Citovsky
2000). Las monocotiledóneas no se
generalmente susceptibles a A
tumefaciens, Aunque se ha logrado
la transferencia de genes a
especies de monocotiledóneas de
importancia económica como el
arroz (Cheng et al., 1998), el
banano (May et al., 1995) el maíz
(Ishida et al., 1996), el trigo (Cheng
5
dicotiledonias y monocotilidoneas
transformadas por A. tumefaciens.
(Tomado de Opabode 2006).
Tzfira y Citovsky 2000 describen
siete eventos fundamentales para
que exista una buena interacción
entre A. tumefaciens y la planta; I
reconocimiento y adherencia, II
identificación de las señales de las
plantas, III activación de los genes
vir, IV generación del ADN-T, V
exportación del ADN-T a la planta,
VI importación del ADN-T al núcleo
de la planta, VII integración del
ADN-T
en
el
genoma
del
hospedero.
Table
1.
Transformación
mediada
Agrobacterium de algunas plantas dicots
por
TF-frecuendia de transformación; nptII-neomicina
fosfotransferasa;
CN-nodo
cotilodenario;EC-callo
embrionario; MP-protoplasma mesófilo; H Hypocotyl;
IS-segmento internodal.
et al., 1997) y la caña de azucar
(Arencibia et al., 1998). En las
tablas 1 y 2 se observan las plantas
Host plant
ICP787
Lobab
lippoi
Westars
Maplus
Semsen
Lambaré
Ekang 9
Strain plasmid
marker
Explant
Pigeon pea (Cajanus cajan L.)
LBA4404 (pdhdps-GUS)
nptII
CN
Broad be an (Vicia faba L.)
C58C1 (pArA4b)
none
IS
Canola (Brassica napus L.)
GV3850 (pBinmGFP5-ER)
nptII
H
GV3850 (pNK55-Resy.KCS)
nptII
MP
Chickpea (Cicer arientum L.)
AGL1 (pRM50)
nptII
CN
Soybean (Glycine max L. Merill)
LBA4404 (pCAMBIA 1303)
hpt
CN
Cotton (Gossypium hirsutum)
LBA4404 (pBin438)
nptII
EC
TF(%)
Reference
93.2
Thu et al.2002
92.5
Jelenic et al.2000
17.0
25.0
Cardoza and Stewart 2003
Wang et al.2005
0.5
Sarmah et al.2004
16.4
Olhoft et al.2003
33.0
Wu et al.2005
6
Table 2. Transformación mediada por Agrobacterium de algunas plantas monocotiledoneas
Host plant
Grand Nain (AAA)
Winter (igri)
Indica (basmati 370)
Japonica (Taipei 309)
Spring (L22)
Ja60-5
C401
Pioneer 8505
A188
A188
Spring(Bobwhite)
Winter(Candenza)
Strain plasmid
marker
Explant
Banana (Musa spp.)
LBA4404
nptII
MCS
(pBI141)
Barley (Hordeum vulgare L.)
LBA4404 (pSBI:
hpt
PC
VG35PAT)
Rice (Oryza sativa L.)
EHA101
hpt
EC
(pIGI21Hm))
LBA4404 (pTOK233)
hpt
PCIE
Rye (Secale cereale L.)
AGLO (pJFnptII)
nptll
PCIE
TF(%)
Reference
2.0
May et al. 1995
2.2
Kumlehn et al.2006
22
Rashid et al.1996
3.0
Uze et al.1997
3.5
Popelka and
Altpeter,2003
Sugarcane (Saccharium officinarium L.)
LBA4404 (pBI141)
hpt
SC
0.94-1.15
Sorghum (Sorghum bicolor L.)
EHA101 (pPZP201)
pmi
IE
3.3
EHA101 (pPZP201)
pmi
IE
2.8
Maize (Zea mays L.)
EHA101 (pTF102)
Bar
FIIE
5.5
LBA4404 (pTOK233)
hpt
FIIE
11.8-30.6
Wheat (Triticum aestivum L.)
ABI (pMON18365)
nptII
EC
10.5
AGLI (pAL151)
Bar
IE
1.7
Arencibia et al.,1998
Gao et al. 2005
Gao et al.2005
Frame et al.2002
Ishida et al.1996
Cheng et al.2003
Wu et al.2003
TF- Frecuencia de transformación; nptII-neomicina fofotransferasa; hpt-hygromycina fosfotranferasa; pmi-fosfo manosa
isomerasa; Bar-bialafos-gen resistente ; PCIE- precultura de embrión inmaduro; EC-callo embriogénico; FIIE- embrión
inmaduro recién aislado; SC- cultura de suspensión; IE - embrión inmaduro; MCS Meritemcorn slice; PC-cultura de
Polen
1.1 Métodos de transformación
mediada por Agrobacterium
Existen diversos métodos para la
transformación con Agrobacterium,
todo esto depende de la especie
tratada y su resistencia a la
infección y al cultivo in vitro. Es
mejor
establecer primero las
condiciones para la transferencia de
genes y luego trabajar en la
regeneración
de
las
células
transformadas (Birch, 1997). El
laboratorio de Monsanto trabajó
inicialmente con la metodología
(Fraley et al., 1983, Horsch et al.,
1985, Broglie et al., 1984)
regeneraba
las
plantas
transformadas a partir de
protoplastos. Un método que se
volvió estándar es el de los discos
foliares (Horsch et al., 1985). Aquí
se trabaja con discos de 6 mm de
hojas de tabaco esterilizadas y se
sumergen en un cultivo de A.
tumefaciens en caldo luria. Los
discos se ponen al revés en platos
de cultivo con un medio que
estimula brotes a partir de las
células foliares y después de 2 o 3
días, los discos son pasados a
platos petri con un medio que
contiene carbenicilina y kanamicina,
las plantas transformadas que
incorporaron el gen NOS-NPTIINOS
de
resistencia
a
la
kanamicina. Después de cuatro
semanas más tarde, los brotes que
crecieron fueron separados de los
callos y transplantados a otro medio
inductor de raíces con carbenicilina
y kanamicina y de ahí a suelo. Es
importante que el material vegetal
tenga heridas que estimulen la
infección
por
Agrobacterium.
Además puede optimizarse con el
uso de inductores de genes vir tales
como la acetosiringona o extractos
de células heridas (Birch, 1997).
También se han obtenido mutantes
de Arabidopsis thaliana resistente a
la
transformación
con
Agrobacterium con los cuales se
espera entender el papel de los
genes y las proteínas de las plantas
que median el proceso de
transformación (Zhu et al., 2003).
Además se ha usado en conjunto
con técnicas de embriogénesis
somática en regeneración de
árboles tropicales como Azadirachta
excelsa (Morimoto 2006).
1.2 Pruebas utilizadas para la
detección de mutantes
Se requieren pruebas genotípicas, a
través de un análisis Southern
utilizando sondas para los genes
introducidos
y
enzimas
de
restricción que generen fragmentos
de hibridización de diferentes
longitudes en diferentes sitios de
integración (Birch, 1997). Se puede
confirmar
analizando
bandas
amplificadas con PCR (Rao y
Rohini, 1999). Además una prueba
fenotípica que muestre la expresión
estable de los genes introducidos en
las plantas que resultan positivas en
la prueba anterior, mas no en los
controles sin transformar.
En
muchos casos se utiliza el gen
“reportero” de la b-glucuronidasa o
GUS (uir A) con un promotor 35S
del virus del mosaico de la coliflor
(CaMV), el cual puede ser
detectado
con
medios
7
espectrofluorofotométricos
o
histoquímicos. Se asume que a la
hora de aplicar el método con fines
prácticos, el gen reportero puede
ser reemplazado por un gen de
interés económico o científico.
El uso de esta bacteria como
herramienta en ingeniería genética
de plantas ha proporcionado
cimientos en la formulación de
modelos de señalización celular,
transporte de célula a célula,
importe nuclear de proteínas y ADN
y mecanismos de integración
genómica (Tzfira y Citovsky 2000).
2. Método directo de
transformación biolístico.
Estos métodos físicos tienen la
capacidad de introducir ADN
foráneo en cualquier célula o tejido
vegetal y cuentan con un único y
exclusivo interés de proteger al
vector de la degradación mecánica
y
enzimática.
Potrycus
y
Spangenberg (1995) afirma que
algunos de estos métodos están
limitados al uso en células que se
encuentran formando un tejido.
2.1 Transformación por
bombardeo con partículas
“biolística”
El bombardeo de partículas para la
introducción de ADN en las células
fue introducido en 1987 por Sanford
y sus colaboradores con el nombre
de “biolística” – balística biológica
(Rusell et al., 1992). Este método
transforman células completas de
un órgano o tejido a partir de un
bombardeo con micro proyectiles de
oro o tungsteno (1,3µm) estos están
recubiertos de nuestro ADN de
interés,
estas
partículas
son
aceleradas por cargas explosivas y
descargas eléctricas, expansión de
gases inertes a alta presión (helio),
o aire comprimido (Christou y Yang,
1994).
2.2 Ventajas de la biolística
Con un exceso de optimismo se
propuso el bombardeo de partículas
como una manera de eliminar el uso
de Agrobacterium (Klein et al.,
1988). Este método actualmente es
el más usado en especies en las
que
la
transformación
con
Agrobacterium
tumefaciens
es
renuente. Entre las ventajas del
bombardeo de partículas, por ser un
método físico, no discrimina el tipo
de célula blanco y ha sido utilizado
no sólo para introducir ADN
exógeno a células vegetales, sino a
células de una gran variedad de
organismos tales como bacterias,
algas, hongos, células animales, y
aún animales y plantas intactas.
Birch (1997) menciona que se ha
logrado
introducir
hasta
12
plásmidos
separados
y
600
kilobases de ADN
2.3 Limitaciones de la biolÍstica
Klein et al., (1988) uso partículas de
tungsteno aceleradas con un
dispositivo a base de pólvora. La
utilización de esta metodología
biolística provoca un trauma a nivel
celular por el impacto del gas el
shock acústico además de la
toxicidad del tungsteno reduciendo
la eficiencia de la recuperación de la
planta con transformación estable.
Sin embargo La técnica fue
mejorada usando partículas de oro y
un acelerador de partículas con flujo
de helio (Kim y Minamikawa, 1996).
Algunos problemas asociados con
la biolística como método para la
transformación vegetal incluyen la
8
frecuente integración de múltiples
copias de los transgenes (Birch,
1997) y la dificultad de superar la
etapa de expresión transiente y
lograr integración estable (Potrykus,
1990). Otras limitantes son la
resistencia natural a la penetración
de las partículas, dada por cutículas
endurecidas, paredes celulares
lignificadas o superficies vellosas y
la baja relación entre el total de
células sometidas al bombardeo y el
número de células que logran
incorporar de manera permanente la
información genética transferida,
como así también la alta frecuencia
de múltiple inserción de copias del
transgén o re-arreglos del mismo,
dentro del genoma vegetal.
3. Aplicaciones para la
investigación
En la actualidad La aplicación de
estas
tecnologías
para
la
investigación son diversas. En la
investigación aplicada, la inserción
de genes específicos en cultivos de
uso agrícola permite la obtención de
fenotipos deseables en mucho
menos tiempo que con los métodos
tradicionales investigar en esta área
de la biotecnología agrícola es
complicado por el hecho de que
muchos de los rasgos de una
cosecha son codificados no por un
gene sino por muchos genes que
trabajan juntos.
Los métodos de transformación
vegetal permiten insertar genes
específicos (gen de interés) en el
genoma de una planta, los
investigadores
utilizan
estas
técnicas como una herramienta
singular para el estudio de la
expresión de genes y de la fisiología
vegetal. Se hizo posible así la
validación directa de hipótesis que
habían sido imposibles o muy
difíciles de resolver utilizando otros
métodos (Birch, 1997). Potrykus
(1990) cita algunas las áreas sobre
las que se ha obtenido información
gracias al uso de la transformación
vegetal, incluyendo conocimientos
sobre promotores, mejoradores,
silenciadores,
terminadores
y
secuencias
regulatorias
con
especificidad de órgano, tejido o
etapa de desarrollo, al igual que
sobre elementos de actividad cis
que responden a luz, temperatura,
patógenos o heridas otras áreas en
que se ha trabajado es en estudios
de regulación de fotosíntesis (Dai et
al y Heineke et al., 1999), Estudio
de los mecanismos de defensa
(Ryals et al., 1994), Introducción de
genes para la inspección visual de
procesos moleculares (Liang et al.
1989) y El silenciamiento genético
(Stam, et al., 1997 ; Kooter et al.,
1999 y Waterhouse,1999).
Conclusiones
La biotecnología aplicada incursiona
con fuerza cada día mas en el
ámbito agrícola, esto depende en su
medida de las necesidades de la
comunidad mundial, Por lo tanto,
una
necesidad
primaria
es
identificar todos los genes que
funcionen como un sistema para
expresar
una
característica
particular. Este conocimiento se
puede entonces aplicar a alterar las
líneas germinales de los cultivos
alimenticios
comercialmente
importantes.
Una
exitosa
transferencia de genes y de uso de
la ingeniería genética o técnicas de
ADN recombinante requiere de la
identificación del gen o grupo de
genes que controla caracteres
9
económicamente ventajosos y su
aislamiento.
Las técnicas de DNA recombinante
son utilizadas para la producción de
individuos transgénicos, e incluyen
aislamiento,
clonación,
recombinación y reinserción de
material
genético
por
varios
métodos. Variedades transgénicas
en cultivos alimenticios han sido
liberadas con genes incorporados
para resistencia a herbicidas,
cambios
medioambientales,
insectos o virus.
En la actualidad los métodos de la
ingeniería genética para mejorar la
fruta y plantas van encaminados a
resaltar características tales como
gusto, la textura, el tamaño, el color,
la acidez o el dulzor, y el proceso de
maduración, se están explorando
como estrategia potencialmente
superior al método tradicional de
cruce. Este procedimiento requiere
éxito en muchas áreas: clonación de
genes y secuenciación, desarrollo
de vectores de genes adecuados
para
células
vegetales,
transferencia exitosa de los genes,
expresión de genes, estabilidad
genética y transmisión de genes a
través
de
la
subsiguiente
reproducción sexual. Aunque las
herramientas de la ingeniería
genética están disponibles, se
requiere más conocimiento de la
biología molecular de plantas. La
obtención de cultivos mejorados a
través de la ingeniería genética es
el resultado de un esfuerzo de
grupo que incluye por lo menos un
biólogo
celular
y
molecular,
especialistas en cultivo de tejidos
vegetales y mejoradores. Estas
técnicas se refinan día a día, son
mas la especies de plantas que
lograr integrar y expresar genes
foráneos con intereses económicos
o investigativos.
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Transformación y mejoramiento genético vegetal

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