(Sorghum bicolor (L.) Moench)

Transcripción

ÍICE DE
Facultad de Ciencias
Licenciatura en Ciencias Biológicas
Orientación Microbiología
Construcción y caracterización de una colección
bacteriana de probables endófitos diazótrofos
nativos asociados a plantas adultas de la
variedad M81E de sorgo dulce
(Sorghum bicolor (L.) Moench)
Gabriela Heijo Davino
Montevideo, Uruguay 2015
Orientadores: Dr. Federico José Battistoni Urrutia
MSc. Cintia Mareque Acosta
Tribunal: Dra. Silvia Batista
Dra. Karina Antúnez
Departamento de Bioquímica y Genómica Microbiana
Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable-MEC
1
ÍNDICE
ÍNDICE
ABREVIATURAS .............................................................................................................................. 6
RESUMEN ...................................................................................................................................... 7
1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 9
1.1. Biocombustibles ................................................................................................................... 10
1.2. El cultivo de sorgo dulce....................................................................................................... 12
1.3. Bacterias promotoras del crecimiento vegetal .................................................................... 14
1.4. Bacterias endófitas ............................................................................................................... 18
ANTECEDENTES DEL GRUPO ....................................................................................................... 22
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS............................................................................................................... 24
2. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................................ 25
2.1. Construcción de una colección de bacterias endófitas diazótrofas a partir de plantas de
sorgo dulce cultivadas en Uruguay ............................................................................................. 26
2.1.1. Esterilización de la superficie del material vegetal ................................................... 26
2.1.2. Aislamiento de PBED a partir del macerado de raíz, tallo y semilla.......................... 27
2.1.3. Extracción de ADN genómico a partir del lisado de colonia ...................................... 28
2.2 Caracterización de la colección ............................................................................................. 29
2.1.3. Búsqueda de probables mecanismos de infección (PMI) en los aislamientos de la
colección.............................................................................................................................. 29
2.2.2. Búsqueda de características promotoras del crecimiento vegetal (PCV) en los
aislamientos de la colección................................................................................................ 30
2.1.4. Búsqueda de aislamientos diazótrofos en la colección............................................. 31
2.3. Identificación de aislamientos de interés y análisis filogenéticos basados en el gen ADNr
16S ............................................................................................................................................... 33
2.3.1. Amplificación del gen ADNr 16S ................................................................................ 33
2.3.2. Secuenciación de los amplicones obtenidos del gen ADNr 16S ................................ 34
2.4. Análisis filogenético de aislamientos seleccionados de la colección ................................... 34
2
ÍNDICE
3. RESULTADOS ........................................................................................................................... 35
3.1. Construcción de una colección de PBED asociados a la variedad de sorgo dulce M81E ..... 36
3.2. Caracterización de la colección ............................................................................................ 36
3.2.1. Búsqueda de PMI ...................................................................................................... 36
3.2.2. Búsqueda de características PCV .............................................................................. 37
3.3. Identificación de aislamientos de interés de la colección.................................................... 42
3.4. Análisis filogenético de los aislamientos identificados ........................................................ 44
4. DISCUSIÓN ............................................................................................................................... 48
4.1. Construcción de una colección de probables endófitos diazótrofos asociados a la variedad
M81E de sorgo dulce ................................................................................................................... 49
4.2. Caracterización de la colección de probables endófitos diazótrofos bacterianos asociados a
la variedad M81E de sorgo dulce ................................................................................................ 50
4.3. Identificación de aislamientos de interés asociados a la variedad M81E de sorgo dulce ... 51
5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS ............................................................................................ 54
ANEXO ......................................................................................................................................... 55
BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................................. 62
3
ÍNDICE DE FIGURAS
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Características morfológicas de las plantas de sorgo dulce ......................................... 13
Figura 2. Reacción de reducción del nitrógeno atmosférico. ..................................................... 17
Figura 3. Esquema del complejo enzimático nitrogenasa........................................................... 18
Figura 4. Mapa de la República Oriental del Uruguay. Se indica la localidad de Bella Union,
Artigas de donde provenian las plantas de dorgo dulce ............................................................. 26
Figura 5. Esquema de la metodología empleada para la construcción de la colección de PBED
asociados a plantas adultas de la variedad de sorgo dulce M81E. ............................................. 28
Figura 6. Búsqueda de aislamientos diazótrofos. 1.A. Electroforesis en gel de agarosa
mostrando los productos de amplificación del gen nifH obtenidos mediante PCR. 1.B. viales
conteniendo medio de cultivos semisólido NFCC inoculados con el aislamiento NR154. .......... 38
Figura 7. Aislamientos positivos para cada una de las características estudiadas...................... 40
Figura 8. Porcentaje de aislamientos nifH +de la colección que presentaron otras
características PCV y PMI... ......................................................................................................... 42
Figura 9. Árbol filogenético construido a partir de la secuencia del gen ADNr 16S.................... 47
4
ÍNDICE DE TABLAS
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Número de aislamientos y recuento de los mismos obtenidos a partir de los diferentes
órganos evaluados de plantas adultas de sorgo dulce variedad M81E. ..................................... 36
Tabla 2. Características PCV identificadas en los aislamientos nifH+ .......................................... 40
Tabla 3. . Número de aislamientos y porcentaje de los filos bacterianos identificados, mediante
secuenciación del gen ADNr 16S. ................................................................................................ 43
Tabla 4. Identidad de los aislamientos secuenciados de la colección de PEBD. ......................... 43
5
ABREVIATURAS
ABREVIATURAS
BPCV
Bacterias promotoras del crecimiento vegetal
PCV
Promoción del crecimiento vegetal
PMI
Probables mecanismos de infección
FBN
Fijación biológica del nitrógeno
ARA
Actividad reductora del acetileno
PBED
Probables bacterias endófitas diazótrofas
6
RESUMEN
7
RESUMEN
En nuestro país se está llevando a cabo un plan estratégico el cual busca consolidar
una matriz energética diversificada, con fuerte participación de energías propias y
renovables, incluidos los biocombustibles. Una de las principales materias primas
utilizada en la producción de bioetanol es el sorgo dulce (Sorghum bicolor (L.)
Moench), un cultivo multipropósito que presenta condiciones óptimas para ser
cultivado en el país. Sin embargo, el mismo requiere de la aplicación de altas
concentraciones de fertilizantes químicos, generando grandes costos económicos y
efectos ambientales adversos. Una alternativa a esta práctica es la utilización de
bacterias promotoras del crecimiento vegetal.
El presente trabajo busca aportar conocimientos sobre las bacterias promotoras del
crecimiento vegetal nativas, fijadoras de nitrógeno (diazótrofos), asociadas a la
variedad M81E cultivada en Uruguay para la producción de azúcar y biocombustibles.
Para ello se construyó una colección de endófitos-diazótrofos asociados a dicha
variedad, a partir de raíces, tallos y semillas de plantas adultas, crecidas en condiciones
de campo. La misma se caracterizó buscándose in vitro, la presencia de características
promotoras del crecimiento vegetal, así como características probablemente
involucradas en el proceso de colonización e infección de la planta. Aislamientos de
interés fueron identificados a nivel de género mediante la amplificación y
secuenciación del gen marcador ADNr 16S, realizándose análisis filogenéticos.
Siguiendo esta aproximación se logró construir y caracterizar una colección de 181
aislamientos de probables endófitos nativos, de los cuales 102 fueron definidos como
diazótrofos. Asimismo el análisis filogenético de las secuencias del gen ARNr 16S,
permitió conocer los géneros a los cuales pertenecen 38 aislamientos seleccionados de
la colección. Los géneros identificados incluyen Cellulomonas, Microbacterium
(Actinobacterias), Enterobacter, Kosakonia, Citrobacter, Pantoea y Klebsiella
(Proteobacterias) así como Bacillus (Firmicutes).
En términos generales, este trabajo generó aportes valiosos para continuar
profundizando en el estudio de bacterias promotoras del crecimiento vegetal endófitas
nativas asociadas a este cultivo, con el fin último de desarrollar un inoculante.
8
1. INTRODUCCIÓN
9
INTRODUCCIÓN
1.1. BIOCOMBUSTIBLES
Los biocombustibles (biogás, bioetanol y biodiésel), son combustibles obtenidos de
forma renovable a partir de materias primas de origen vegetal. Particularmente el
bioetanol, es un combustible líquido producido durante la fermentación de los
azúcares que se encuentran en los cultivos como la remolacha azucarera, la caña de
azúcar, el sorgo dulce, el maíz, el trigo y la cebada (Chiaramonti, 2005).
El uso de esta fuente de energía renovable y limpia genera menos elementos nocivos
para el ambiente que los combustibles tradicionales. Los biocombustibles reducen el
volumen total de dióxido de carbono emitido a la atmósfera, ya que los cultivos
empleados como materia prima absorben, a medida que crecen, prácticamente la
misma cantidad de dióxido de carbono que la liberada durante la quema del
biocombustible. Esto es relativo al tipo de cultivo que se utiliza ya que los balances de
gases de efecto invernadero varían en gran medida en función de este. A modo de
ejemplo, los niveles estimados de reducción de emisiones de gases con efecto
invernadero para el caso de la caña de azúcar en Brasil rondan entre un 70-90% en
comparación con el diésel fósil y el petróleo (FAO, Biocombustibles, 2008). Por otra
parte, los biocombustible cuentan con la ventaja de ser más económicos que los
combustibles tradicionales, ya que al ser renovables e inagotables no sufren
constantes incrementos en sus precios como ocurre en el caso del petróleo.
Biocombustibles en Uruguay
Una de las estrategias actuales que se está llevando en nuestro país en búsqueda de
una mayor soberanía energética es la diversificación de la matriz energética, siendo
uno de los objetivos principales la producción de agrocombustibles. Para ello, en el
año 2007 se promulgó la ley de Agrocombustibles N° 18.195, con el objetivo de
fomentar y regular la producción de los mismos, la cual junto al decreto reglamentario
N° 523/2008 encomiendan a ANCAP la producción en el país de biocombustibles con
materias primas nacionales, para ser incorporados a las gasolinas en un 5%
(http://www.alur.com.uy/ley18195.html).
A partir de esta reglamentación se definieron dos proyectos: el "proyecto sucro
alcoholero", para la creación de un complejo industrial situado en el norte del país,
10
INTRODUCCIÓN
donde se produce etanol a partir de la caña de azúcar y sorgo dulce, y el "proyecto
metropolitano", para la generación de biodiesel en el sur del país a partir de aceites de
soja y girasol. Con esta estrategia se procura diversificar la matriz energética y lograr
mayor soberanía energética con menores necesidades de importación de petróleo,
generar empleos y promover el desarrollo económico de zonas rurales.
El proyecto sucro alcoholero comienza en el año 2005, impulsado por la empresa
estatal ANCAP a través de la empresa ALUR S.A. Es llevado a cabo en el complejo
agroindustrial de ALUR, ubicado en Bella Unión, Artigas en complementación con la
planta de bioetanol en Paysandú, recientemente puesta en marcha. El principal cultivo
empleado como materia prima por ALUR Bella Unión, es la caña de azúcar (Saccharum
officinarum), la cual es cultivada en una extensión agrícola de casi 10.000 hectáreas.
Sin embargo, este cultivo presenta limitaciones agroclimáticas para su óptimo
crecimiento en esta región (Fogliata, 1995). En este contexto surge el sorgo dulce
(Sorghum bicolor (L.) Moench) como materia prima complementaria, el cual posee
condiciones óptimas para ser cultivado en nuestro país (Siri-Prieto et al., 2008), siendo
utilizado en ALUR exclusivamente para la producción de bioetanol.
Producción de bioetanol a partir de sorgo dulce
El cultivo de sorgo dulce constituye un insumo energético importante por su
posibilidad de producción de etanol carburante a partir de sus jugos. Actualmente es
utilizado en muchos países para tal fin, en forma aislada o complementaria a la caña de
azúcar y la remolacha azucarera, pudiendo ser incorporado en los ciclos de rotación de
estos cultivos al no superponerse con los mismos (Woods, 2000; Viator et al., 2009).
Asimismo, su procesamiento es muy similar al de la caña de azúcar, siendo posible
integrarlo a la industria cañera para la producción de bioetanol.
En Uruguay el sorgo dulce se procesa en las mismas instalaciones que se utilizan para
industrializar la caña de azúcar. El procesamiento de este cultivo es entre los meses de
marzo y abril, mientras que el de la caña de azúcar es entre los meses de junio a
noviembre. Este esquema permite ser más eficientes al extender en dos meses el uso
de la fábrica, sin que haya competencia entre las materias primas utilizadas
(http://www.alur.com.uy/articulos/2011/p-15-7-11.html).
11
INTRODUCCIÓN
1.2. EL CULTIVO DE SORGO DULCE
Origen y usos
El sorgo dulce es un cultivo perteneciente a la tribu Andropogonae de la familia
herbácea Poaceae. Es originario de las estepas y sabanas del África oriental, donde es
posible encontrar la mayor diversidad de sorgo dulce cultivado y salvaje. Existe una
gran diversidad de razas y variedades debido a la selección disruptiva así como a
fenómenos de aislamiento y recombinación en ambientes variados (Doggett, 1970).
Se le denomina cultivo multipropósito, debido a que a partir del mismo se pueden
producir diversos productos ya sea para el consumo humano (tanto para la
alimentación como para la elaboración de bebidas alcohólicas); para la alimentación
animal (mediante pastoreo directo o mediante la producción de forrajes o piensos);
además de la mencionada producción de bioetanol (Smith et al., 1987; Gnansounou et
al., 2005). Hoy en día el sorgo dulce es un grano básico para millones de personas en
todo el mundo, siendo el quinto cultivo de mayor importancia en el mundo, luego del
trigo, el arroz, el maíz y la cebada. En nuestro país, entre los años 2012 y 2013, se
sembraron 49.000 hectáreas a partir de las cuales se procesaron 209.000 toneladas del
cultivo (Anuario 2014, MGAP).
Morfología y fisiología
El cultivo de sorgo dulce presenta un formato tipo caña, con un tallo cilíndrico que
puede alcanzar alturas desde 50 centímetros hasta 4,5 metros de alto. Las plantas
tienen un sistema radicular fibroso extenso y ramificado, que puede penetrar hasta 1,8
metros dentro del suelo. Las hojas se presentan en un número de entre 7 y 28
dispuestas en forma alternada y opuesta. Morfológicamente, las hojas son similares a
las del maíz, siendo lineales, lanceoladas, con un borde con dientes curvos, filosos y
numerosas células motoras ubicadas cerca de la nervadura central del haz. Los
macollos se forman a partir de las yemas axilares localizándose generalmente en el
extremo de la planta y siendo su maduración más tardía que el tallo principal. La
forma de las flores en la espiga es variable entre las razas. La planta se autopoliniza, ya
que la espiga está compuesta por flores bisexuales. El grano es una cariópside esférica
12
INTRODUCCIÓN
y oblonga, de color negro, rojizo y amarillento, de alrededor de 4 mm de diámetro
(Figura 1) (Artschwager et al., 1948).
Figura 1. Características morfológicas de las plantas de sorgo dulce (Shorgum bicolor). Tomado de
http://grassdueroriverbasin.blogspot.com/2013_05_01_archive.html.
Este cultivo posee un eficiente metabolismo C4 (ciclo del malato), lo cual significa que
la temperatura, la intensidad lumínica y el fotoperíodo deben ser considerados como
factores de control o limitantes, afectando tanto los rendimientos de tallos como el
contenido de azúcares utilizables de los jugos. ()
El uso de fertilizantes para mejorar la productividad del cultivo frecuentemente tiene
efectos negativos que afectan el complejo sistema de los ciclos biogeoquímicos
(Perrott et al., 1992; Steinshamn et al., 2004). Aproximadamente el 50% del fertilizante
aplicado se pierde del sistema suelo-planta mediante emisiones gaseosas, lixiviación,
erosión y escurrimiento lo que lleva a una degradación de los ecosistemas,
contribuyendo al efecto invernadero y contaminando con nitrato y fósforo el agua
superficial y la napa freática (Rejesus, 1999). Por otra parte, la fertilización es uno de
los principales gastos de producción en la agricultura de países como el nuestro, cual
importa gran porcentaje del mismo. Estas problemáticas hacen necesaria la búsqueda
de alternativas sustentables, económica y ambientalmente, que reduzcan la
dependencia de la fertilización química. En este contexto surge como alternativa el uso
de bacterias promotoras del crecimiento vegetal (BPCV).
13
INTRODUCCIÓN
1.3. BACTERIAS PROMOTORAS DEL CRECIMIENTO VEGETAL
Las BPCV comprenden un conjunto de bacterias que se asocian a las plantas mediante
diversos hábitos (endofítico, rizoférico o endosimbionte), estimulándolas para
incrementar su crecimiento, su productividad y/o mejorando su estado sanitario. Entre
los organismos más estudiados están las especies pertenecientes a los géneros
Rhizobium, Pseudomonas y Azospirillum (Lugtenberg et al., 2013a). La promoción del
crecimiento vegetal (PCV) puede darse mediante diversos mecanismos, clasificados en
indirectos (I) o directos (II).
I.
Los mecanismos indirectos comprenden aquellos que proveen protección a la
planta contra factores bióticos (control biológico) o mediante la estimulación
de la resistencia sistémica inducida de las plantas. El control biológico contra
fitopatógenos se realiza mediante la competencia por el nicho, nutrientes,
agua, luz, oxígeno; por predación o parasitismo del agente; así como por la
producción de compuestos químicos (antibióticos, bacteriocinas). Por su
parte, los microorganismos inductores de la respuesta sistémica, benefician a
las plantas, ya que sin ocasionarles daños las inmunizan adquiriendo el
potencial de movilizar sus defensas más rápida y efectivamente en presencia
del patógeno (Lugtenberg et al., 2013b)
II.
Algunos microorganismos actúan como biofertilizantes, ya que poseen
mecanismos directos implicados en incrementar el crecimiento de las plantas
mediante el mejoramiento del ciclo de los nutrientes y minerales. Estos
mecanismos incluyen la movilización de nutrientes que no se encuentran
disponibles para la planta. El fósforo es movilizado mediante la actividad
solubilizadora de fosfatos (Lipton et al., 1987) y el hierro mediante la
producción de sideróforos (Schalk et al., 2011). En cuanto al nitrógeno, el
mismo puede ser provisto mediante la fijación biológica del nitrógeno (FBN)
(Sanchez et al., 2006). Otros mecanismos directos son la producción o
regulación de hormonas estimulantes del crecimiento vegetal por las
bacterias, como lo son las auxinas, giberelinas, citoquininas y etileno
(Fuentes-Ramirez, 2005).
14
INTRODUCCIÓN
Mecanismos PCV directos
Auxinas
Las auxinas son hormonas de origen vegetal que participan en diversos procesos
relacionados con el desarrollo de la planta, como lo son el crecimiento, la dominancia
apical, el enraizamiento, la partenocarpia, el tropismo y la abscisión. Debido a estas
funciones las mismas son frecuentemente utilizadas como fitorreguladores, con
numerosas aplicaciones agronómicas y biotecnológicas. El representante característico
y de mayor abundancia dentro de la familia es el ácido indolacético (AIA), aunque
también existen dentro de la familia otras auxinas de origen natural y sintético.
Se estima que casi el 80% de las bacterias rizoféricas son capaces de sintetizar AIA
(Patten & Glick, 1996). Las bacterias productoras de AIA pueden actuar incrementando
el desarrollo de las raíces, permitiendo a la planta acceder a más nutrientes y agua del
suelo, y/o aumentar o influenciar los niveles endógenos de las auxinas de la planta
(Patten & Glick, 1996). Diferentes vías pueden ser usadas para la biosíntesis de AIA, la
mayoría de las bacterias utilizan al triptófano como precursor, el cual es secretado por
las plantas como un componente de los exudados radiculares (Costacurta &
Vanderleyden, 1995; Spaepen et al., 2007). Un ejemplo de una bacteria productora de
AIA y aplicada biotecnologicamente es la cepa Azospirillum brasilense. La misma es una
bacteria fijadora del nitrógeno atmosférico (diazótrofa) que promueve el crecimiento
vegetal mediante el aumento de la superficie radicular, acortando el largo radicular y
aumentando la formación de pelos radiculares (Pliego et al., 2011).
Solubilización de fosfatos
El fósforo es el tercer factor limitante para el crecimiento de las plantas, luego del agua
y el nitrógeno. Su importancia radica en su participación en numerosos procesos en las
plantas, incluyendo los mecanismos de generación de energía, síntesis de ácidos
nucleicos, fotosíntesis, respiración y señalización celular (Vance et al., 2003).
La mayoría de los suelos contiene cantidades de fosfatos suficientes para mantener a
la planta en crecimiento. Sin embargo muchas de las formas en las que se encuentra
no son disponibles para la misma, las cuales logran absorber el fósforo únicamente
como H2PO4- y HPO4-- (Rodriguez & Fraga, 1999). Determinadas bacterias son capaces
de solubilizar el fosfato uniéndolo a moléculas orgánicas o inorgánicas volviéndolo así
disponible para las plantas (Lipton et al., 1987).
15
INTRODUCCIÓN
Producción de sideróforos
El hierro es un elemento esencial para todos los seres vivos. A pesar de encontrarse en
abundancia en el suelo, es difícilmente soluble a pH neutro, por lo que no se encuentra
disponible para todos los organismos. En condiciones limitantes de hierro, ciertas
bacterias producen quelantes de bajo peso molecular altamente específicos para el ion
férrico llamados sideróforos. Dichas bacterias tienen la capacidad de producir y
excretar los sideróforos quelando el Fe3+ para luego internalizarlo activamente.
Algunas especies de plantas pueden absorber los complejos Fe3+-sideróforo bacteriano
en la superficie de la raíz donde es reducido y absorbido (Glick et al., 1999). Otras son
capaces de producir fitosideróforos, los cuales son de muy baja afinidad por el ion Fe
en comparación con los sideróforos bacterianos (Lemanceau et al., 2009).
Fijación biológica del nitrógeno
El nitrógeno es el elemento de mayor abundancia en la naturaleza, encontrándose en
el suelo, en la biomasa y en la atmósfera como gas dinitrógeno (N2). El mismo es uno
de los factores limitantes para el crecimiento de las plantas, ya que forma parte de
numerosas biomoléculas como las proteínas, los ácidos nucleicos, las porfirinas y los
alcaloides. Las plantas son capaces de tomar el nitrógeno en forma de nitrato y amonio
presente en el suelo. Sin embargo, la mayoría del nitrógeno presente en la litósfera no
se encuentra biodisponible, de modo que la mayor parte del N necesario para el
crecimiento de las plantas proviene de la fijación biológica del nitrógeno atmosférico
(FBN). Los responsables de la reducción del 87% del N2 atmosférico son los
microorganismos, lo cuales la efectúan mediante la FBN. Las plantas establecen
diversos tipos de asociaciones simbióticas con microorganismos diazótrofos, lo que ha
permitido a los organismos distribuirse ampliamente en la biósfera, ocupar nuevos
nichos y adaptarse a diversos estreses ambientales (Azcon-Brieto, 2008).
Solamente algunos procariotas diazótrofos pueden utilizar el nitrógeno atmosférico y
convertirlo mediante el proceso de FBN a NH3, la forma asimilable por las plantas. El
espectro de estos organismos es muy amplio, habiéndose identificado alrededor de 87
especies distribuidas en diversos hábitats, con representantes tanto en el dominio de
las arqueas (2 géneros) como en el bacteria (38 géneros) y las cianobacterias (20
géneros) (Vandamme et al., 2002).
16
INTRODUCCIÓN
El más específico y eficiente proceso de FBN involucra la formación de nódulos en
legumbres, las bacterias involucradas en este proceso son los rizobios miembros de los
subgrupos Alfa y Beta del filo Protobacteria. Otra asociación simbionte es la efectuada
por Frankia, un actinomiceto capaz de asociarse simbióticamente con 200 especies
diferentes de angiospermas. Por otro lado, existen además, diazótrofos que se asocian
a las raíces y demás órganos internos de las plantas. Esta relación se denomina
endófitica, e incluye a bacterias de diferentes géneros tales como Acetobacter,
Azoarcus, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Beijerincka, Burkholderia, Enterobacter,
Herbaspirillum,
Klebsiella,
Paenibacillus,
Pseudomonas
y
Stenotrophomonas
(Dobbelaere et al., 2003). Tambien existen diazotrofos de vida libre, los cuales ocupan
nichos ecológicos muy diversos. Los mismos incluyen a anaerobios estrictos
(Desulfovibrio, Clostridium), a anaerobios facultativos, que fijan solo en condiciones
anaeróbicas (Klebsiella, Citrobacter) o microaeróbicas (Azospirillum, Xanthobacter) y a
aerobios estrictos (Azotobacter, Beijerinckia).
La FBN es catalizada por el complejo enzimático nitrogenasa, el cual se encuentra
altamente conservado tanto en los diazótrofos de vida libre como en los simbióticos.
La reacción catalizada por la nitrogenasa requiere un donador de electrones, ATP, Mg +
y una concentración mínima de O2 (Figura 2). En condiciones fisiológicas, los electrones
son utilizados para reducir el N2 a amonio y en menor cuantía H+ a H2. Sin embargo la
enzima no es completamente específica para el N2, siendo capaz de utilizar otros
sustratos con triples enlaces como cianuro, óxido nitroso o acetileno (Sanches et al.,
2006; Monza et al., 2004)
N2 + 8H+ + 8e-
NITROGENASA
16-MgATP
2NH3 + H2
16-MgADP + Pi
Figura 2. Reacción de reducción del nitrógeno atmosférico a NH3 catalizada por el complejo enzimático
ntrogenasa.
Existen distintos tipos de la enzima nitrogenasas. La nitrogenasa más abundante y
ampliamente distribuida entre los organismos diazótrofos
consta de dos
ferrosulfoproteinas, la Fe-proteína (dinitrogenasa reductasa) es un dímero con
estructura α2 y masa molecular de 62 KDa, codificada por el gen nifH. La FeMoproteína (dinitrogenasa) es un tetrámero, con estructura α2β2 y masa molecular de 220
17
INTRODUCCIÓN
KDa, codificada por los genes nifD (subunidad α) y nifK (subunidad β) (Peters et al.,
1995). Durante la reacción de la nitrogenasa, el ATP debe encontrarse como complejo
ATP-Mg, ya que el ATP libre es un inhibidor. La Fe-proteína enlaza el ATP-Mg y reduce
específicamente la FeMo-proteína, mientras que la FeMo-proteína enlaza y reduce el
sustrato (Figura 3).
Figura
3.
Esquema
del
complejo
enzimático
nitrogenasa.
http://fisiolvegetal.blogspot.com/2012/10/fijacion-biologica-de-nitrogeno.html
Tomado
de
1.4. BACTERIAS ENDÓFITAS
Las bacterias endófitas representan un subgrupo de la comunidad rizobacteriana
capaces de colonizar activamente los tejidos internos de la planta, sin ocasionar daños
al hospedero. Las mismas no residen en el interior de las células, ni se encuentran
rodeadas por un compartimiento membranoso como los endosimbiontes, sino que
habitan en los espacios intercelulares de las raíces, tallos y hojas de la planta (Quispel,
1992).
Para comprobar el estilo de vida endófito de una bacteria aislada de tejidos de plantas
con su superficie desinfectada, se debe constatar mediante microscopía, la presencia
de la bacteria dentro del tejido de la planta re-inoculada. Esta búsqueda debe incluir la
identificación mediante hibridación inmunológica in situ, o mediante marcaje con
genes reporteros. Además, la bacteria aislada debe tener la habilidad de cumplir el
postulado de Koch, siendo capaz de reinfectar al huésped y persistir en él (Rosenblueth
et al., 2006; Reinhold-Hurek & Hurek, 1998).
18
INTRODUCCIÓN
Esta asociación simbiótica aporta beneficios para ambos participantes de la interacción
endofítica. Por un lado, la planta se beneficia ya que los endófitos colonizan nichos
similares a los de los patógenos lo que hace que sean agentes de biocontrol. Además
pueden acelerar la emergencia de las semillas, promover el crecimiento bajo
condiciones adversas, prevenir el desarrollo de enfermedades mediante la sistesis de
algunos metabolitos, así como proporcionar resistencia a metales pesados (Berg et al.,
2005; Chanway, 1997; Sevilla & Kennedy, 2000). Por otro lado, los endófitos se ven
beneficiados ya que habitan ambientes más favorables que los rizoféricos, en donde
son menos vulnerables a la competencia con otras bacterias y están protegidos de los
estreses bióticos y abióticos del ambiente externo a la planta (Reinhold-Hurek &
Hurek, 1998).
Trabajos previos han reportados la presencia de bacterias endófitas-diazótrofas
asociadas al cultivo de caña y sorgo, desconociéndose cuáles de ellas contribuyen a la
FBN o a la PCV observada en estos cultivos (James et al., 1997; Coelho et al., 2008;
Boddey et al., 1995).
Proceso de colonización de las plantas por bacterias endófitas
Los pasos de colonización de la planta por las bacterias endófitas fueron definidos y
comprendidos mediante técnicas de visualización microscópica y caracterización de
mutantes, definiéndose tres etapas principales: (I) colonización del rizoplano, (II)
infección a la planta y (III) colonización del córtex.
I. Colonización del rizoplano: La colonización activa, implica en una primera
instancia, la atracción de la bacteria a la superficie de la raíz mediante
quimiotaxis. Esta atracción se genera debido a que la planta secreta
compuestos que son fuente de nutrientes y quimioatrayentes para la bacteria
(Lugtenberg & Dekkers, 1999). Tal es el caso del carbón fijado por la fotosíntesis
de la planta, el cual es parcialmente translocado a la región de la raíz y liberado
como
exudado
radicular,
junto
con
otros
quimioatrayentes
como
carbohidratos, aminoácidos y ácidos orgánicos (Bais et al., 2006; Walker et al.,
2003). La composición de estos exudados varía con el tipo de cultivo, el estado
19
INTRODUCCIÓN
de crecimiento y el estrés que sufre la planta (Haichar et al., 2008). Diversos
genes han sido reportados como los responsables de la respuesta de la bacteria
a los exudados, incluyendo aquellos que codifican para los componentes
aromáticos de catabolismo, la biosíntesis de aminoácidos, el sistema de
secreción del tipo III así como proteínas generadoras de energía (Mark et al.,
2005). Luego de que ocurrió la colonización de la rizósfera, la bacteria se
mantiene unida a la superficie radicular mediante interacciones específicas
irreversibles entre las estructuras de las paredes de la planta y la bacteria
(Malfanova et al., 2013).
La colonización también puede darse mediante mecanismos pasivos, como lo
es el caso de las bacterias presentes en las semillas de la planta o en los casos
de propagación vegetativa del cultivo (ej. papa, caña de azúcar). Otro
mecanismo de ingreso pasivo a la planta es mediante el uso de vectores, como
lo son los hongos colonizadores (Rosenblueth et al., 2006).
II. Infección de los tejidos: El proceso de penetración pasiva al tejido ocurre en
zonas de tejido agrietado o en las aberturas naturales de la planta sin ser
necesario la hidrólisis de la pared celular, ej: estomas, lenticelas, tricomas, cofia
de las raíces y quiebres tales como los que ocurren en los sitios de emergencia
de las raíces laterales o los generados por microorganismos patogenos
(Reinhold-Hurek & Hurek, 1998). Por su parte, el ingreso activo puede darse en
zonas de diferenciación y elongación cercanas a la punta de la raíz donde los
tejidos no están diferenciados, así como por los espacios intercelulares en las
regiones epidérmicas y corticales. Para el ingreso activo a la planta, las
bacterias endófitas secretan enzimas degradadoras de la pared celular tales
como proteasas, celulasas, hemicelulasas y enzimas lignolíticas (Compant et al.,
2010; Hardoim et al., 2008; Reinhol-Hurek & Hurek, 1998; Reinhold-Hurek et
al., 2006).
III.Colonización del córtex: una vez dentro de la planta, las bacterias pueden
permanecer en el lugar de entrada o pueden transportarse mediante el sistema
vascular a los demás órganos y así lograr colonizar tallos, hojas, frutos y
semillas. Sólo unas pocas bacterias son las que logran colonizar el sistema
vascular de la planta (Hardoim et al., 2008; Compant et al.,, 2010). Esta
20
INTRODUCCIÓN
colonización ocurre a través de las células no-suberizadas del endodermo en la
zona radicular apical y/o en la zona de las raíces basales.
21
ANTECEDENTES DEL GRUPO
ANTECEDENTES DEL GRUPO
Una de las principales líneas de investigación del Departamento de Bioquímica y
Genómica Microbianas (BIOGEM) del Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente
Estable (IIBCE) consiste en el estudio de la interacción BPCV y cultivos de interés
agronómico. El objetivo principal de la línea consiste en generar conocimientos sobre
la diversidad microbiana asociada a diversos cultivos de interés agronómico para el
desarrollo de posibles aplicaciones biotecnológicas.
Estos estudios comenzaron con la investigación de las BPCV asociadas a la caña de
azúcar con foco en las bacterias diazótrofas, extendiéndose posteriormente la
investigación a otros cultivos de interés agronómico incluyendo el sorgo dulce, la
festuca (Festuca arundinacea) y la canola (Brassica napus). Estos proyectos apuntan a
obtener bacterias endófitas y conocer sus propiedades PCV in vitro, para luego
determinar los posibles efectos benéficos de la inoculación bacteriana sobre el
crecimiento vegetal de los cultivos (Taulé et al., 2012, Mareque et al., 2014 De los
Santos et al., 2015).
22
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
23
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
HIPÓTESIS
La hipótesis de este trabajo propone que en plantas de sorgo dulce adultas existen
asociadas bacterias endófitas, algunas de las cuales poseen capacidad de fijar el
nitrógeno atmosférico y/u otras características promotoras del crecimiento vegetal.
OBJETIVO GENERAL
Aportar conocimientos para el desarrollo de un inoculante basado en BPCV nativas, en
particular bacterias diazótrofas endófitas, en la variedad M81E de sorgo dulce
cultivada por ALUR.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
I.
Construir una colección de endófitos-diazótrofos asociados a la variedad de
sorgo dulce M81E, a partir de semillas, raíces y tallos de plantas adultas
crecidas en campo.
II.
Caracterizar dicha colección buscando: características PCV in vitro (FBN,
producción de AIA, capacidad de solubilizar Fe y P), así como probables
mecanismos de infección (PMI)
(actividad celulolítica, hemicelulolítica,
proteolítica y lignolítica).
III.
Identificar, mediante la secuenciación del gen ADNr 16S, aislamientos
seleccionados de acuerdo a las características mencionadas.
IV.
Realizar estudios filogenéticos de los aislamientos identificados.
24
2. MATERIALES Y MÉTODOS
25
MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. CONSTRUCCIÓN DE UNA COLECCIÓN DE BACTERIAS ENDÓFITAS DIAZÓTROFAS A
PARTIR DE PLANTAS DE SORGO DULCE CULTIVADAS EN URUGUAY
Para el estudio de las probables bacterias endófitas
diazótrofas (PBED) asociadas a plantas de sorgo
dulce, se construyó una colección a partir de nueve
plantas de la variedad comercial M81E. Las plantas
se colectaron en mayo de 2014, seis meses
posteriores a su siembra, a partir de parcelas con
bajos niveles de fertilización y buena producción,
situadas
en
la
localidad
Bella
Unión
del
departamento de Artigas, Uruguay (30° 15′ 0″ S,
57° 35′ 0″ W) (Figura 4). Se escogieron parcelas
con bajo contenido de fertilizante, debido a que
bajo estas condiciones se estima que las bacterias
Figura 4. Mapa de la República
Oriental del Uruguay. Indicado la
localidad de Bella Unión, ubicada en el
departamento de Artigas (30° 15′ 0″ S,
57° 35′ 0″ W).
no se encuentran afectadas por los efectos de la fertilización. Las plantas colectadas se
mantuvieron a 4°C hasta su procesamiento en el laboratorio. Brevemente, la
construcción de la colección consistió en la esterilización de la superficie y luego el
macerado de las plantas y semillas de sorgo dulce a ser analizadas. A partir del
macerado del material, se realizaron diluciones seriadas las cuales se sembraron en
placas conteniendo los medios de cultivo TSA (Triptic Soy Agar, Difco Laboratories) y
NFCC (Mirza et al., 2012). En esta última etapa se buscó aislar bacterias endófitasdiazótrofas empleando una metodología que implicó reducir los niveles de oxígeno en
la atmosfera para evitar la inhibición de la actividad de la enzima nitrogenasa.
Finalmente se seleccionaron aislamientos para conformar la colección de acuerdo a
caracteres morfológicos.
2.1.1. Esterilización de la superficie del material vegetal
Para la construcción de la colección en primera instancia, se realizó la esterilización de
la superficie del material. Para esto se trataron por separado las semillas así como las
26
porciones aéreas y radiculares de las plantas, los cuales se fragmentaron en trozos de 5
cm de largo. El primer paso consistió en lavar con abundante agua el material a
procesar con el fin de limpiar la tierra adherida. Posteriormente, el material lavado se
incubó con EtOH 70% (v/v) durante 5 minutos, lavándose el remanente de alcohol con
agua destilada estéril. A continuación se realizó una incubación con una solución de
hipoclorito de sodio 4% (v/v) durante 20 minutos en agitación y se enjuagó cuatro
veces con agua desionizada estéril para remover los restos de hipoclorito de sodio
(Mareque et al., 2014).
Para comprobar la efectividad de la esterilización de la superficie, se efectuó un
control de esterilización. El mismo consistió en rolar el material procesado sobre la
superficie de una placa de Petri conteniendo medio de cultivo TSA (Anexo), cuidando
no dañar el material. El mismo se retiró y incubándose la placa durante 24 hs. a 30°C.
Se consideró una esterilización de superficie exitosa, aquella en la que no se observó
crecimiento sobre la placa control.
2.1.2. Aislamiento de PBED a partir del macerado de raíz, tallo y semilla
Luego de efectuada la esterilización de la superficie se procedió a realizar el
aislamiento de las PBED, conformándose la colección. El procedimiento consistió en
macerar el material vegetal, así como las semillas, en una jarra de licuadora
previamente lavada con EtOH 70% (v/v) y expuesta a radiación UV durante 15 minutos.
Para la realización del macerado se agregaron 90 ml de NaCl 0,9% (p/v) y 1 ml de
cicloheximida 100 mg/ml (antifúngico) cada 10 g de material vegetal de partida. A
partir del macerado inicial (dilución -1) se realizaron diluciones seriadas 1/10 en NaCl
0,9% (p/v). A continuación se sembraron en placas de Petri, conteniendo medio de
cultivo NFCC (Anexo), 100 µl de las diluciones -1 a la -6 de la raíz y de la parte aérea, así
como de las diluciones -1 a la -3 de las semillas, por duplicado para obtener los
aislamientos. En paralelo en placas conteniendo medios de cultivo TSA y NFCC, se
realizaron los conteos bacterianos, inoculando 100 µl de las diluciones -1, -2, -3, -4, -5 y
-6 de la raíz y parte aérea y -1 y -2 del semillas . El medio de cultivo NFCC (Anexo) es un
medio de cultivo rico selectivo para organismos diazótrofos, el cual contiene tres
fuentes de carbono diferentes, carece de fuente de nitrógeno y para el cual se utiliza
27
como solidificante “gellan gum”. Las placas inoculadas se incubaron a 30°C durante 21
días en condiciones de hipoxia generadas por el sistema Microbiology Anaerocult A
Mini (Alemania) (Perin et al., 2006). A partir de las placas conteniendo medio de
cultivo NFCC, se seleccionaron colonias para la construcción de la colección de acuerdo
a sus características morfológicas, tales como forma, color, elevación y borde de la
misma. Las colonias se repicaron, al menos dos veces sucesivas en placas conteniendo
medio TSA para la obtención de cultivos puros. Los aislamientos puros se guardaron en
glicerol 25% (v/v) por triplicado y almacenados a -20°C y -80°C. (Figura 5).
Esterilización de
la superficie Macerado Diluciones
Control de esterilización
Siembra en
medio NFCC
Incubación en
Condiciones de
microaerofília
Purificación, Selección y
guardado de cepas a 20°C y -80°C en glicerol
25%
Figura 5. Esquema de la metodología empleada para la construcción de la colección de probables
endófitos diazótrofos asociados a plantas adultas de la variedad de sorgo dulce M81E.
Los aislamientos de la colección se nombraron con la letra N en referencia al medio del
cual se realizó el aislamiento (NFCC), con las letras T, R o S en referencia al órgano del
cual se obtuvo (tallo, raíz y semilla respectivamente), seguido con el número de
aislamiento. Por ejemplo el aislamiento “NR88” se aisló en medio NFCC, se obtuvo a
partir de la raíz y es el aislamiento número 88.
2.1.3. Extracción de ADN genómico a partir del lisado de colonia
El ADN genómico extraído mediante el método de lisado celular fue utilizado como
molde para realizar la amplificación del gen ADNr 16S y el gen nifH mediante la técnica
de reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction, PCR). Para esto se
colectó, en condiciones asépticas, una ansada de varias colonias puras a partir de
placas conteniendo medio de cultivo TSA, resuspendiéndose las mismas en 100 µl de
28
agua ultra pura estéril. La suspensión obtenida se centrifugó a 15.600 g durante 2
minutos conservándose el pellet. Este se resuspendió en 100 µl de NaOH 0,05 M
incubándose posteriormente durante cuatro minutos a 100 °C, seguido de dos minutos
en baño de hielo, con el propósito de provocar una lisis por “shock” térmico. A la
suspensión obtenida se le agregó 900 µl de H2O ultra pura, centrifugandose a 15.600 g
por 2 minutos. Como solución de trabajo se guardaron a -20°C 700µl del sobrenadante
obtenido.
2.2 CARACTERIZACIÓN DE LA COLECCIÓN
La caracterización de la colección consistió en la búsqueda de aislamientos con
características PCV, con énfasis en la identificación de bacterias diazótrofas. A su vez,
se buscó identificar la presencia de aislamientos con PMI.
2.2.1. Búsqueda de probables mecanismos de infección (PMI) en los aislamientos de la
colección.
Con el fin de identificar en la colección aislamientos con PMI, se evaluó las actividades
lignolíticas, hemicelulolíticas y celulolíticas de cada aislamiento utilizando medio de
cultivo TSA suplementado con distintas fuentes de carbono según la actividad a
ensayar (Anexo). Las mismas fueron Avicel 0,5% (p/v) para la detección de
hemicelulasas (Voget et al.,, 2006; Wakiyama et al.,, 2008), celulosa granulada 0,2%
(p/v) y celulosa en sal 0,2% (p/v) para la detección de enzimas celulolíticas (Cavalcante
et al., 1998), y TSA suplementado con ABTS 250 mg/l o ABTS 250 mg/l y MnCl 24H2O
0,1 g/l, para la detección de peroxidasas dependiente e independiente de manganeso
respectivamente (Hofricher et al., 1997). Como control positivo para los ensayos de
producción de celulasas y hemicelulasas se utilizó la cepa Acinetobacter sp. UYSB41
Todos los aislamientos se inocularon e incubaron durante siete días en los diferentes
medios a 30°C. Transcurrido este período, se retiraron las colonias de las placas con un
algodón humedecido en NaCl 1N y se lavaron las placas con rojo Congo 0,05% (p/v).
29
Las mismas se guardaron a 4°C durante 24 horas y luego se lavaron las placas
nuevamente con NaCl 1N. Las actividades de las enzimas celulolíticas se visualiza la
formación de un halo amarillo alrededor de la colonia, mientras que la actividad de las
enzimas peroxidasas se visualiza mediante un color marrón en la colonia.
Para la detección de aislamientos con actividad proteolítica, el medio de cultivo TSA
diluido 1/100, se suplementó con leche descremada 5% (p/v) (Martinez-Rosales et al.,
2011) (Anexo). Las placas inoculadas se incubaron durante 2 días a temperatura
ambiente. Aquellos aislamientos positivos se visualizaron por la presencia de un halo
translúcido alrededor de la colonia.
Todos los ensayos se realizaron por duplicado y los aislamientos positivos se
reconfirmaron.
2.2.2. Búsqueda de características promotoras del crecimiento vegetal (PCV) en los
aislamientos de la colección
Ciertas bacterias poseen la capacidad de generarle beneficios a las plantas debido a
que poseen mecanismos PCV, los cuales de forma directa o indirecta estimulan el
crecimiento o mejoran el estado sanitario de la planta. La búsqueda de estas
propiedades en los aislamientos de la colección se basó en la identificación de los
siguientes mecanismos: solubilización de fosfatos, producción de sideróforos,
producción de fitohormonas, capacidad FBN.
Búsqueda de aislamientos solubilizadores de fosfatos
La detección de los aislamientos con capacidad de solubilizar fosfatos se efectúo
mediante el crecimiento de los mismos en placas de Petri conteniendo medio GL
(Anexo) suplementado con 50 ml de solución estéril de K2HPO4 10% (p/v) y 100 ml de
solución estéril de CaCl2 10% (p/v) (Sylvester et al., 1982). Las placas inoculadas se
incubaron durante 5 días a 28°C, visualizándose los aislamientos positivos, por la
presencia de un halo translucido formado alrededor de la colonia. Como control
positivo se utilizó la cepa Acinetobacter sp. UYSO01 (Taulé et al., 2012). El ensayo se
realizó por duplicado, y aquellos aislamientos positivos se reconfirmaron.
30
Búsqueda de aislamientos productores de sideróforos
La detección de los aislamientos productores de sideróforos se efectuó mediante el
crecimiento de la colección en placas de Petri conteniendo el medio de cultivo sólido
CAS (Schwyn et al., 1987) (Anexo), las cuales se incubaron a 30ºC durante 5 días. Los
aislamientos positivos se visualizaron por la presencia de un halo amarillo-naranja
alrededor de la colonia. Como control positivo se utilizó la cepa de referencia
Herbaspirillum seropedicae Z67 (Rosconi et al., 2013). El ensayo se realizó por
duplicado, y aquellos aislamientos positivos se reconfirmaron.
Búsqueda de aislamientos productores de ácido indol-3-acético (AIA)
Para determinar si los aislamientos producian la hormona AIA se utilizó el método
colorimétrico descripto por Sarwar y colaboradores, (1995). Para esto, los aislamientos
de la colección se cultivaron en microplacas conteniendo medio de cultivo DYGs
(Rodrigues et al., 1986) (Anexo) suplementado con triptófano 10,1 mg/ml, a 30°C con
agitación durante 72 horas por duplicado. A continuación las mismas se cetrifugaron a
4100 g durante 15 minutos. Posteriormente, a 150 µl del sobrenadante se le agregó
100 µl de la solución reveladora de Salkowski (Gordon & Weber, 1951), incubándose
en la oscuridad durante 30 minutos para luego determinarse la absorbancia a 540 nm
(D.O.540nm). Los cálculos se normalizaron con los datos de la absorbancia a 620 nm
(D.O.620nm) del cultivo inicial. La cuantificación del AIA producido por la bacteria se
calculó en base a una curva de calibración con concentraciones de 0 µM/ml a 100
µM/ml de AIA sintético 10mM (Sarwar & Kremer, 1995). El experimento se efectuo por
duplicado.
2.2.3. Búsqueda de aislamientos diazótrofos en la colección
En primera instancia se evaluó la presencia del gen nifH en los aislamientos de la
colección con el propósito de identificar aquellos con posible capacidad fijadora del N2
atmosférico. Como se mencionó, este gen codifica para una de las subunidades
estructurales de la enzima dinitrógeno reductasa perteneciente al complejo enzimático
31
nitrogenasa, encargado de la FBN. Aquellos aislamientos en los cuales se comprobó
que poseen el gen nifH en su genoma, se les evaluó la capacidad de crecimiento en
viales conteniendo medio de cultivo NFCC semisólido, observando si ocurría un
crecimiento en forma de halo, característico de los microorganismos diazótrofos.
Amplificación del gen nifH en los aislamientos de la colección
Para la amplificación mediante la técnica de PCR se utilizaron el par de cebadores PolF
(5´-TGCGAYCCSAARGCBGACTC-3´) y PolR (5´- ATSGCCATCATYTCRCCGGA-3´) (Poly et
al., 2001). La mezcla de reacción consistió en 14,82 µl de agua desionizada estéril, 2,5
µl de DreamTaq Buffer 10X (Thermo Fisher Scientific Inc.) que incluía MgCl2 en una
concentración de 20 mM; 2,5µl de dNTPs 2mM, 1 µl de cada cebador 20mM, 0,18 µl
de BSA 1%, 1 µl de DreamTaq (5u/µl 500U) y 2 µl de lisado bacteriano. El programa
empleado para la reacción de amplificación consistió en un ciclo de desnaturalización
inicial de 5 minutos a 95ºC, seguido de 30 ciclos de 45 segundos a 95ºC para la
desnaturalización de ADN, 45 segundos a 58ºC para que se efectúe la hibridación de
los cebadores al molde de ADN, continuado por 30 segundos a 72ºC para que se
realice la etapa de polimerización del ADN. La reacción se finalizó con un ciclo de
extensión final de 5 min a 72ºC. Como control positivo se utilizó la cepa
Enterobacter sp. UYSO10 (Taulé et al., 2012).
Los productos de amplificación se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa
0,8 % (p/v) en buffer Tris-Acético-EDTA (TAE 1X) (Anexo). Se utilizó el agente
intercalante Good View (Beijing SBS. Genetech. Co. Ltd.) en una relación de 1μl/50ml
(colorante: agarosa). La corrida se realizó durante 40 minutos, a 90 V. El tamaño
correcto del amplicón (aproximadamente 327 pb) se confirmó mediante su
comparación con el marcador de peso molecular GeneRuler 1 kb DNA Ladder
(Thermoscientific #SM1332) al ser el gel expuesto a luz ultravioleta.
Crecimiento de los aislamientos nifH+ en viales con medio NFCC semisólido
Se cultivaron los aislamientos en medio de cultivo TSB durante 24 horas, se lavaron las
células con NaCl 0,9% y se inocularon 1x109 ufc/ml en viales conteniendo 10 ml de
medio de cultivo NFCC semisólido, por duplicado. Los viales se incubaron a 30°C
32
durante siete días momento en el cual se evaluó la formación de halos de crecimiento,
característicos de diazótrofos (Baldani et al., 2014), así como demás características:
viraje de color del medio de cultivo, altura del halo, producción de burbujas y
formación de película papel. Como control positivo se utilizaron las cepas UYFAA23 y la
cepa UYFA113 de la colección del laboratorio de festuca (De los Santos et al., 2015).
2.3. IDENTIFICACIÓN DE AISLAMIENTOS DE INTERÉS Y ANÁLISIS FILOGENÉTICOS
BASADOS EN EL GEN ADNr 16S
Los aislamientos de la colección que presentaron características típicas de los
organismos diazótrofos se seleccionaron para su identificación a nivel de género,
utilizando el gen marcador ADNr 16S.
2.3.1. Amplificación del gen ADNr 16S
Para la amplificación del gen ADNr 16S se utilizaron los cebadores 27f (5′AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′) y 1492r (5-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3) (Lane,
1991). La mezcla de reacción consistió en 29,6 µl de agua desionzada estéril, 5 µl de
DreamTaq Buffer 10X (Thermo Fisher Scientific Inc.) que incluía MgCl2 en una
concentración de 20 mM; 5 µl de dNTPs 2mM, 2 µl de cada cebador 20 µM, 2 µl de BSA
1%, 0,4 µl de Taq (5u/ µl 500U) y 4 µl de lisado bacteriano. El programa empleado para
la reacción de amplificación consistió en un ciclo de desnaturalización inicial de 2
minutos a 95ºC, seguido de 30 ciclos de un minuto a 94ºC, un minuto a 55ºC y un
minuto a 72ºC., con un ciclo de extensión final de 15 min a 72ºC.
Los productos de amplificación se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa
0,8 % (p/v) en buffer TAE 1X. La corrida se realizó durante 40 minutos, a 90 V. El agente
intercalante utilizado fue el GoodView (Beijing SBS. GenetechCo. Ltd.) en una relación
de 1μl/50ml (colorante: agarosa). El tamaño correcto del amplicón se confirmó
mediante su comparación con el marcador de peso molecular GeneRuler 1 kbDNA
Ladder (Thermo Scientific #SM1332) al ser el gel expuesto a luz ultravioleta.
33
2.3.2. Secuenciación de los amplicones obtenidos del gen ADNr 16S
Los productos de PCR obtenidos mediante la amplificación del gen ADNr 16S se
enviaron a Macrogen Inc. Corea para su purificación y posterior secuenciación; la
misma se realizó con los mismos cebadores utilizados. La secuencias obtenidas a partir
de ambos extremos se editaron y empalmaron con el programa DNA Baser Sequence
Assembler v3.x (2012) (HeracleBioSoft SRL Romania, http://www.DnaBaser.com)
siendo cada una de 1400 pares de bases aproximadamente. Luego estas secuencias se
compararon con la base de datos del The Ribosomal Database Project (RDP), (Cole et
al., 2014, Wang et al., 2007, http://rdp.cme.msu.edu/seqmatch/seqmatch_intro.jsp),
mediante el algoritmo KKN matches.
2.4. ANÁLISIS FILOGENÉTICO DE AISLAMIENTOS SELECCIONADOS DE LA COLECCIÓN
El estudio filogenético de los aislamientos seleccionados se realizó con las secuencias
del gen ADNr 16S, las cuales se utilizaron para la construcción del árbol filogenético.
Para esto, las secuencias se alinearon con la base de datos de RDP construyéndose el
árbol filogenético mediante el algoritmo Neighbour Joining, utilizándose un bootstrap
de 100 réplicas.
34
3. RESULTADOS
35
RESULTADOS
3.1. CONSTRUCCIÓN DE UNA COLECCIÓN DE PBED ASOCIADAS A LA VARIEDAD DE
SORGO DULCE M81E
El primer objetivo del trabajo consistía en construir una colección de bacterias nativas
asociadas a plantas adultas de sorgo dulce de la variedad M81E, particularmente PBED.
La metodología empleada para construir dicha colección implicó aislar las bacterias en
placas conteniendo medio de cultivo NFCC sin N en condiciones con niveles de oxígeno
reducidas. Siguiendo esta metodología se logró construir una colección compuesta por
181 aislamientos de bacterias PCV nativas, 162 de los cuales fueron aisladas a partir de
la raíz, 10 del tallo y 9 de las semillas (Tabla 1.a). Para los recuentos microbianos de
raíz, tallo y semillas se empleó la misma metodología que la utilizada para efectuar los
aislamientos, pero usando como medio de cultivo TSA. Los recuentos fueron: 5,4
x104ufc/g en semilla, 9 x 104ufc/g en tallo y 7,7 x107ufc/g en raíces (Tabla 1.b).
Tabla 1. Número y recuento de aislamientos obtenidos a partir de los diferentes órganos de plantas
adultas de sorgo dulce de la variedad M81E.
1. a
Número de aislamientos
Medio de aislamiento
NFCC
Tallo
Semilla
Raíz
10
9
162
1. b
Recuento bacteriano
Medio de recuentos
TSA
Tallo (ufc/g)
semilla (ufc/g)
raíz (ufc/g)
9 x 104
5,4 x104
7,7 x107
3.2. CARACTERIZACIÓN DE LA COLECCIÓN
3.2.1. Búsqueda de PMI
La caracterización de los 181 aislamientos de la colección implicó, en parte, buscar
características que revelaran la presencia de posibles mecanismos de infección de la
bacteria a la planta. Con este fin se evaluaron las capacidades lignolíticas,
36
RESULTADOS
hemicelulolíticas y celulolíticas de cada aislamiento. De la totalidad de los aislamientos
de la colección fueron identificados 3 aislamientos productores de proteasas (NR03,
NR88, NR152), todos ellos aislados a partir de la raíz. No obstante, no se hallaron
aislamientos productores de celulasas, hemicelulasas o peroxidasas.
3.2.2. Búsqueda de características PCV
Por otro lado, la caracterización de la colección se completó efectuando la búsqueda
de características PCV en los aislamientos de la colección. Las características PCV
estudiadas fueron: solubilización de fosfatos, producción de sideróforos, producción
de AIA y la capacidad FBN. Siguiendo la estrategia experimental se identificaron 33
aislamientos productores de la fitohormona AIA y un aislamiento con capacidad de
solubilizar fosfatos, todos ellos aislados a partir de la raíz (Tabla 2). No se encontró
ninguno aislamiento con capacidad de producir sideróforos, en las condiciones
ensayadas.
Identificación de aislamientos con capacidad de FBN
En todos los aislamientos de la colección se buscó la presencia del gen nifH mediante
su amplificación por PCR (Figura 6.a). Como resultado se identificaron 102 aislamientos
nifH positivos, lo que representa el 56% del total de la colección. Posteriormente, fue
evaluado el tipo de crecimiento que presentaban los aislamientos nifH positivos en
viales conteniendo medio de cultivo NFCC semisólido, un crecimiento en forma de
película es característico de organismos diazótrofos (Baldini et al., 2014).
Los
resultados mostraron que la totalidad de los aislamientos nifH+ presentaba un
crecimiento en forma de película (Figura 6.b).
37
RESULTADOS
A
B
1
2
3
4
5
6
Figura 6. Búsqueda de aislamientos diazótrofos. 1.A. Electroforesis en gel de agarosa mostrando los
productos de amplificación del gen nifH obtenidos mediante PCR. Carriles: 1- control negativo, 2- control
positivo, 3 a 5- aislamientos representativos de la colección y 6- marcador de peso molecular GeneRuler
1 kb DNA Ladder. 1.B. Crecimiento en viales conteniendo medio de cultivos semisólido NFCC inoculados
con el aislamiento NR154. Con la flecha se señalan los halos de crecimiento en la zona superior del
medio.
A modo de resumen, en la figura 7 se muestra los resultados obtenidos de la
caracterización de los aislamientos de la colección, indicando la cantidad de
aislamientos positivos para cada característica PCV y para la producción de proteasas;
especificadose además a partir de cual órgano vegetal fueron aislados.
En la misma se puede apreciar como la mayoría de los aislamientos positivos para
alguna característica fueron aislados a partir de la raíz, con excepción de la capacidad
de FBN y producción de AIA, la cual se observa mayormente en los aislamientos de la
raíz pero también estan presente en los aislamientos de tallo y semilla. Asimismo se
observa un elevado número de organismos diazótrofos en comparación con los
resultados obtenidos para las demás características, como era de esperar de acuerdo a
la metodología empleada.
38
RESULTADOS
Figura 7. Número de aislamientos positivos para cada una de las características estudiadas, indicándose
el órgano vegetal a partir del cual fue aislado.
En la tabla 2 se detallan cuáles son los aislamientos nifH positivos y se informa acerca
de sus otras características PCV. Analizando particularmente la información de los
aislamientos nifH positivos, se constata que 21 aislamientos nifH positivos también
posee capacidad productora de AIA (NR02, NR24, NR48, NR60, NR98, NR101, NR103,
NR105, NR106, NR116, NR131, NR139, NR154, NT05, NT07, NT08, NT09, NS02, NS03,
NS04, NS09), uno también posee capacidad de solubilizar fosfatos (NR123) y dos
también son productores de proteasas (NR88, NR152). Ninguno de los aislamientos
presentó más de dos características PCV, incluyendo el poseer el gen nifH (Figura 8).
Tabla 2. Características PCV identificadas en los aislamientos nifH+ asociados a plantas de sorgo dulce
de la variedad M81E.
DIAZÓTROFíA
NR01
NR02
NR04
NR10
NR11
NR13
NR15
NR16
Presencia
del gen
nifH
+
+
+
+
+
+
+
+
Crecimiento
en forma de
película
+
+
+
+
+
+
+
+
Produccción
de AIA
Solubilización
de fosfatos
Producción de
proteasas
+
-
-
39
RESULTADOS
NR19
NR24
NR26
NR27
NR29
NR30
NR31
NR41
NR43
NR48
NR49
NR52
NR53
NR54
NR60
NR63
NR64
NR73
NR75
NR76
NR82
NR83
NR84
NR85
NR88
NR92
NR95
NR96
NR97
NR98
NR101
NR102
NR103
NR104
NR105
NR106
NR107
NR108
NR110
NR112
NR113
NR114
NR116
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
40
RESULTADOS
NR118
NR120
NR121
NR122
NR123
NR124
NR125
NR126
NR127
NR128
NR131
NR132
NR133
NR134
NR135
NR136
NR138
NR139
NR140
NR141
NR142
NR143
NR144
NR145
NR147
NR148
NR149
NR151
NR152
NR153
NR154
NR158
NR159
NR160
NR161
NR162
NT03
NT04
NT05
NT07
NT08
NT09
NT10
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
-
+
41
RESULTADOS
NS02
NS03
NS04
NS05
NS06
NS07
NS08
NS09
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
No nifH+ (79)
nifH+ + productores
de AIA (21)
nifH+ + productores
de proteasas (2)
nifH+ + solubilizadores
de fosfatos (1)
nifH+ (79)
Figura 8. Porcentaje de aislamientos nifH +de la colección que presentaron otras características PCV y
PMI.
3.3. IDENTIFICACIÓN DE AISLAMIENTOS DE INTERÉS DE LA COLECCIÓN
La identificación de 38 aislamientos, seleccionados de acuerdo a la presencia del gen
nifH y sus capacidades de PCV, se realizó mediante la secuenciación del producto de
PCR obtenido de la amplificación del gen marcador molecular ADNr 16S.
Las secuencias obtenidas fueron editadas mediante el programa DNA Baser Sequence
Assemmbler v3.x, siendo el tamaño de las mismas de aproximadamente 1400 pares de
bases. Las secuencias editadas fueron comparadas con la base de datos del RDP. Los
resultados mostraron la presencia de 8 géneros pertenecientes a 3 Filos distintos
dentro del Dominio Bacteria (Tabla 3).
42
RESULTADOS
Tabla 3. Número de aislamientos y porcentaje de los filos bacterianos identificados, mediante
secuenciación del gen ADNr 16S.
Filo bacteriano
Actinobacteria
Género bacteriano
Número de
Porcentaje de
aislamientos
aislamientos (%)
Cellulomonas
2
8
Microbacterium
1
Enterobacter
12
Kosakonia
13
Citrobacter
3
Pantoea
3
Kelbsiella
1
Bacillus
3
Proteobacteria
Firmicutes
84
8
Asimismo en la tabla 4 se muestra información sobre la identidad de los aislamientos
secuenciados de la colección. Los filos bacterianos que se vieron representados dentro
de la colección son las Actinobacteria, Firmicutes y Proteobacterias. Dentro de las
Actinobacterias se identificaron los géneros Cellulomonas (NR16, NR11) y
Microbacterium (NT03). A su vez, los Firmicutes estuvieron representados por el
género Bacillus (NR29, NS05, NS06), mientras que el filo de las Proteobacterias estuvo
representado por los géneros Enterobacter (NR15, NR60, NT04, NT07, NR88, NR48,
NR76, NR113, NR02, NR19) Kosakonia (NR85, NR01, NR158, NS02,NS01, NR124,
NR125, NR106, NS07, NR149, NR123, NR127, NR152, NS09, NR126) Citrobacter
(NR160, NR21, NR108), Pantoea (NS04, NS08, NS03) y Klebsiella (NR135).
Tabla 4. Identidad de los aislamientos secuenciados de la colección de PEBD asociados a plantas de
Cepa
Filo
NR16
Actino
bacteria
sorgo dulce de la variedad M81E.
NR11
NT03
Género
Cellulomonas
Microbacterium
Nombre
ID
Porcentaje
de
similaridad
(%)
s_ab
score
Cellulomonas hominisT
S000004448
98,8
0.931
T
S000004449
98,9
0.931
S000965858
99,5
0.978
Cellulomonas hominis
Microbacterium binotii
T
43
RESULTADOS
NR01
Enterobacter ludwigii T
NR15
T
Enterobacter ludwigii
NR60
Enterobacter cancerogenus
NR85
NT07
NR88
Enterobacter
NR48
NR76
NR113
NR124
NR125
NR106
Proteobacteria
NS01
NS07
NR149
NR127
NR152
S000539659
99,5
0.983
T
S000539659
99,5
0.975
T
S000539659
99,5
0.975
T
S000539659
99,8
0.993
S000131263
99,8
0.944
S000539659
99,8
0.998
S001612795
91,9
0.700
S000539659
99,8
0.997
T
T
NR21
Citrobacter
NR108
NS04
NS08
Pantoea
NS03
NR135
Firmicutes
Klebsiella
99,7
0.945
Kosakonia cowanii
S000114246
99,6
0.946
Kosakonia cowanii
T
S000114246
99,5
0.934
Kosakonia cowanii
T
S000114246
99,8
0.953
S000503537
99,7
0.966
S000114246
98,5
0.881
S000114246
99,5
0.948
S000503537
99,7
0.951
S001573096
99,6
0.969
S001573096
98,1
0.916
S000503537
99,7
0.951
99,5
0.948
Kosakonia cowanii
T
Kosakonia cowanii
T
Kosakonia oryzae
T
Kosakonia oryzae
T
T
T
T
T
S000114246
T
S001573096
99,8
0.984
Citrobacter sedlakii
T
S000427770
97,6
0.871
Citrobacter farmeri
T
S000427777
98,5
0.892
Citrobacter farmeri
T
S000427777
98,2
0.885
Pantoea eucrina
T
S001187643
99,7
0.985
Pantoea eucrina
T
S001187643
99,7
0.984
Pantoea eucrina
T
S001187643
99,7
0.992
Klebsiella variicola
T
Bacillus megaterium
Bacillus
T
S000503537
Kosakonia oryzae
NR160
T
T
T
Kosakonia cowanii
NR126
NS06
0.990
Kosakonia radicincitans
NS09
NS05
99,8
NR123
NR29
S000539659
T
Kosakonia
0.988
NS02
99,9
0.948
NR158
S000539659
99,8
Leclerciaade carboxylata
NR19
0.985
S000131263
NT04
99,8
T
Enterobacter cancerogenus
NR02
T
S000539659
S000324392
T
0.983
S000979521
99,4
0.918
Bacillus pumilus
T
S000481068
99,8
0.978
Bacillus safensis
T
S000458519
100
0.987
3.4. ANÁLISIS FILOGENÉTICO DE LOS AISLAMIENTOS IDENTIFICADOS
Para efectuar un análisis que permitiese inferir las relaciones filogenéticas entre los
aislamientos secuenciados de la colección y cepas de referencia, se construyó un árbol
44
RESULTADOS
filogenético en base a las secuencias del gen marcador ADNr 16S. Las secuencias se
alinearon con secuencias tipos pertenecientes a la base de datos de RDP y el árbol
filogenético se construyó utilizando el algoritmo Neighbour Joining con un boostrap de
1000 réplicas. Como grupo externo, fue seleccionado Methanocaldococcus jasnnaschii,
perteneciente al dominio de las Arquea (Figura 9). En el árbol obtenido se reconocen
tres grupos definidos, la rama más grande está formada por el grupo de las
Proteobacterias, mientras que las otras dos están formadas por los grupos de los
Firmicutes y las Actinobacterias respectivamente.
El grupo de las Protobacterias se dividió en dos ramas, una formada por el género
Pantoea y la segunda conformada por los géneros Enterobacter, Kosakonia, Klebsiella y
Citrobacter. En la rama de las Pantoea se agruparon los aislamientos NS08, NS03 y
NS04 junto con la cepa de referencia Pantoea eucrinaT LMG2781. Por otro lado, la
segunda rama se subdividió en dos grupos, uno de ellos representó al género
Enterobacter, el cual agrupó a los aislamientos NR01, NR15, NR48, NR88, NT07,
relacionados a las cepas referencia Enterobacter ludwigiiT DSMZ16688 y Enterobacter
cancerogenusT LMG2693. En el segundo grupo se agruparon por un lado el género
Kosakonia y por otro los géneros Citrobacter y Klebsiella. Dentro del grupo del género
Kosakonia, los aislamientos NR125, NR126, NR152, y NR158 se agruparon junto a la
cepa de referencia Kosakonia oryzaeT Ola51; mientras que en otra rama y junto a la
cepa de referencia Kosakonia cowanii TCIP107300, lo hicieron los aislamientos NS01 y
NR124. Los aislamientos NS02, NS07 y NS09, se agruparon entre sí pero junto a
ninguna cepa de referencia.
Por otra parte, los aislamientos pertenecientes al género Citrobacter NR21, NR108 y
NR160 se agruparon en un nodo aparte de los aislamientos pertenecientes al género
Klebsiella, y relacionados a las cepas de referencia C. farmeri TCDC2991-81 y C. sedlakiiT
CDC4696-86. Finalmente dentro de las Proteobacterias, el único aislamiento
relacionado al género Klebsiella, NR135, se agrupó con la cepa de referencia Klebsiella
variicolata TF2R9 con un soporte de bootstrap de 100.
En referencia al filo Firmicutes, todos los aislamientos identificados mostraron ser
pertenecientes al género Bacillus. De ellos, el aislamiento NR29 se agrupó en una rama
con un bootstrap de 100, junto a la cepa referencia B. megaterium
T
IAM 13418,
45
RESULTADOS
mientras que los aislamientos NS05 y NSO6 se agruparon en un nodo aparte junto a las
cepas de referencia B. pumilus T ATCC 7061 y B. safensis T FO-036b.
Finalmente y dentro del filo de las Actinobacterias, los aislamientos identificados
mostraron estar relacionados a los géneros Microbacterium y Cellulomonas, formando
2 brazos de acuerdo al género relacionado. En el primer grupo el aislamiento NT03 se
agrupó junto a la cepa de referencia M. binotii T CIP 101303. Mientras que en una rama
aparte, el aislamiento NR16 se agrupó con un soporte de bootstrap de 100, junto a la
cepa de referencia C. hominis T CE40.
46
RESULTADOS
NS08
NS03
70
NS04
Pantoea eucrinaT LMG 2781
NR88
69
NR01
NR48
78
NT07
NR15
55
Enterobacter ludwigiiT EN-119 = DSMZ16688
Enterobacter cancerogenus T LMG 2693
56
Kosakonia arachidis T Ah-143
Kosakonia oryzae T Ola 51
90
Proteobacterias
NR158
NR126
NR152
NR125
Kosakonia radicincitans T D5/23
NS07
56
NS09
NS02
63
NS01
51
NR124
Kosakonia cowanii T CIP 107300
52
100
NR160
100
NR21
61
NR108
Citrobacter farmer T CDC 2991-81
98
45
Citrobacter sedlakii T CDC 4696-86
NR135
61 95
Klebsiella variicola T F2R9
Firmicutes
Enterobacter cloacae T ATCC13047T
100
NR29
Bacillus megaterium T IAM 13418
NS05
86
Bacillus pumilus T ATCC 7061
Bacillus safensis T FO-036b
Actinobacterias
96
NS06
100
NT03
Microbacterium binotii T CIP 101303
100
NR16
100
Cellulomonas hominis T CE40 <cdc group A-3>
Methanocaldococcus jannaschii DSM 2661
0.05
Figura 9. Árbol filogenético construido a partir de la secuencia del gen ADNr 16S. En la filogenia se
muestra las relaciones de los 26 aislamientos de la colección de probables bacterias endófitas
diazótrofas asociadas a sorgo dulce seleccionados a partir de sus características PCV. Las secuencias se
alinearon mediante la base de datos de RDP construyéndose el árbol filogenético utilizando el algoritmo
Neighbour Joining. Se utilizó un bootstrap de 100 réplicas. Se seleccionó como grupo externo a la cepa
tipo Methanocaldococcus jasnnaschii, perteneciente al dominio de las Arquea.
47
4. DISCUSIÓN
48
DISCUSIÓN
Con el propósito de generar insumos enfocados en preservar la sustentabilidad
ambiental durante la ejecución de prácticas agronómicas, el presente trabajo buscó
contribuir a la generación de conocimiento de las BPCV asociadas a plantas de sorgo
dulce.
Las BPCV son un recurso natural de nuestros suelos y una alternativa
prometedora para disminuir el uso de la fertilización química y sus impactos
medioambientales. En Uruguay, la variedad de sorgo dulce M81E es cultivada para la
producción de azúcar y biocombustibles. Recientemente se ha comenzado a investigar
si dicha variedad presenta bacterias endófitas PCV asociadas, así como su rol en la PCV
Para cumplir los objetivos planteados en este trabajo, en una primera instancia se
construyó una colección de bacterias endófitas diazótrofas asociadas a plantas de
sorgo dulce de la variedad comercial M81E. Dicha colección se caracterizó mediante la
búsqueda in vitro de mecanismos PCV, así como de posibles mecanismos de infección
en los aislamientos. Asimismo, aislamientos de interés seleccionados fueron
identificados a nivel de género, analizándose las relaciones filogenéticas de los
mismos.
4.1. CONSTRUCCIÓN DE UNA COLECCIÓN DE PBED ASOCIADOS A LA VARIEDAD M81E
DE SORGO DULCE
La colección se construyó a partir de las raíces, tallos y semillas de la variedad M81E,
esterilizadas en la superficie, las cuales fueron traídas de la zona de siembra en Bella
Unión, Artigas. El estudio se centro particularmente en la búsqueda de bacterias con
capacidad de fijar biológicamente el N2 atmosférico (diazótrofos). Para ello se empleó
una metodología la cual consistió por un lado, en utilizar un medio de cultivo sin
fuente de nitrógeno y con tres fuentes de carbono. Además, se utilizó como
solidificante del medio de cultivo gellam gum, el cual es recomendado para el
aislamiento de bacterias diazótrofas ya que posee muy bajos niveles de nitrógeno en
comparación con el agar (Perin et al., 2006). Por otro lado, las placas inoculadas se
incubaron en condiciones de hipoxia. Esto último tuvo la finalidad de evitar que la
49
DISCUSIÓN
enzima nitrogenasa se viera inhibida por las altas concentraciones de oxígeno
presentes en la atmósfera.
Mediante esta aproximación se logró construir una colección compuesta por 181
aislamientos de bacterias PCV nativas, el 89% de los cuales fueron aisladas a partir de
la raíz, el 6% del tallo y el 5% de las semillas. Los porcentajes mencionados son
consistentes con los datos obtenidos para los recuentos microbianos, los cuales
mostraron que el mayor número de unidades formadoras de colonias por gramo de
tejido se obtuvieron en la raíz, seguida por el tallo y las semillas. Esto mismo ha sido
previamente reportado para en otros cultivos incluyendo soja (Glycine max), caña de
azúcar, festuca y sorgo dulce (Kuklinsky-Sobral et al., 2004; Taulé et al., 2012, de los
Santos et al., 2015; Mareque et al., 2014). La explicación a esta observación es que las
raíces son la principal vía de entrada de las bacterias endófitas a la planta mientras que
aquellas localizadas en el tallo o las semillas, corresponden a las pocas que fueron
capaces de continuar el trayecto de colonización desde la raíz a través de los vasos del
xilema, o aquellas que se trasmitieron a la segunda generación de plantas debido al
tipo de reproducción (Mercado-Blanco & Lugtenberg 2014). Desde el punto de vista
biotecnológico es interesante la búsqueda de endófitos de semillas dado que se
contempla aquellas bacterias transmitidas de forma vertical heredadas a través de las
mismas, lo que cual remarca cierta especificidad planta-bacteria (Coombs & Franco
2003b; Hallmann et al., 1999).
4.2. CARACTERIZACIÓN DE LA COLECCIÓN DE PBED BACTERIANOS ASOCIADOS A LA
VARIEDAD M81E DE SORGO DULCE
La caracterización de la colección consistió en la búsqueda de aislamientos con
características PCV, con énfasis en la identificación de bacterias diazótrofas. A su vez,
se buscó identificar la presencia de aislamientos con características probablemente
involucradas en los procesos de infección de la bacteria a la planta.
La mayoría de los aislamientos que presentaron alguna característica positiva fueron
aislados a partir de las raíces (91%). Por otra parte, el 100% de los aislamientos
obtenidos a partir del tallo y de semilla presentaron al menos una característica PCV.
50
DISCUSIÓN
Del total de la colección se identificó que el 18% de los aislamientos son productores
de ácido indo acético (AIA), el 2% son productores de proteasas, y el 1% posee
capacidad de solubilizar fosfatos. En cuanto a la capacidad FBN, los resultados
mostraron la presencia de 102 aislamientos diazótrofos, los cuales representan el 56%
del total de la colección. Esta característica PCV fue la más ampliamente encontrada en
la colección, hecho de esperar teniendo en cuenta la aproximación experimental
abordada. El 85% de los aislamientos nifH+ fueron aislados a partir de la raíz, el 7% del
tallo y el 8% de las semillas. Si se evalúan en conjunto todas las características PCV
estudiadas, se observa que el 14% de los aislamientos de la colección son diazótrofos y
además presentan otra característica PCV. En este sentido, se observa un mayor
número de organismos diazótrofos en comparación con los resultados obtenidos en
colecciones anteriores en el laboratorio. Por ejemplo en una colección de aislamientos
asociados a caña de azúcar los aislamientos endófitos-diazótrofos representaron el
17%; mientras que en una de sorgo dulce representaron el 25% (Taulé et al., 2012;
Mareque et al., 2014). Estas diferencias observadas en el porcentaje de diazótrofos de
cada una de las colecciones son atribuibles a la metodología empleada, por ejemplo en
la colección de caña de azúcar, los medios de cultivos utilizados fueron semisólidos
selectivos sin nitrógeno, mientras que en la colección de sorgo dulce anterior, se tuvo
en consideración el obtener la mayor cantidad de heterótrofos endófitos. Sin embargo,
en el caso de una colección de festuca, en la cual se empleó la misma aproximación
que en este trabajo, los resultados mostraron que un 12,3% del total de la colección
fueron diazótrofos (de los Santos et al., 2015). Por otra parte cabe destacar que en una
colección de bacterias asociadas a plantas de sorgo dulce provenientes de Namibia, no
se logró identificar ningún aislamiento diazótrofo (Grönemeyer et al., 2011). En su
conjunto estos resultados podrían sugerir la influencia del tipo de suelo, tipo de cultivo
así como la variedad del mismo sobre la comunidad de bacterias diazotrófas asociadas.
4.3. IDENTIFICACIÓN DE AISLAMIENTOS DE INTERÉS ASOCIADOS A LA VARIEDAD
M81E DE SORGO DULCE
Con el fin de determinar la identidad de aislamientos seleccionados, así como para
conocer sus relaciones filogenéticas, se amplificó mediante PCR y se secuenció el gen
51
DISCUSIÓN
ARNr 16S. Dicho gen está presente en todas las bacterias y posee regiones de
secuencia conservadas y otras variables que permiten la clasificación taxonómica
(Lane, 1991).
Mediante esta aproximación se identificaron 38 aislamientos bacterianos de la
colección, seleccionados teniendo en cuenta las diferencias morfológicas de la colonia,
así como las capacidades PCV y PMI in vitro. La mayoría de los mismos pertenecieron al
filo Proteobacteria (84%), mientras que los filos Actinobacteria y Firmicutes estuvieron
representados por un 8% cada uno.
En términos generales, la mayoría de los géneros bacterianos encontrados en este
trabajo han sido previamente reportados como asociados a cultivos de importancia
agronómica, incluyendo al sorgo dulce (Rosenblueth et al., 2006; Hallmann et al., 2006;
Mareque et al., 2014). En las colecciones mencionadas anteriormente, de PEB
asociados a caña de azúcar, sorgo dulce y festuca, se identificaron al igual que en este
trabajo,
una
amplia
mayoría
de
aislamientos
pertenecientes
a
las
Gammaproteobacterias incluyéndose la mayoría de los géneros bacterianos
reportados aquí (Taulé et al., 2012; Mareque et al., 2014; De los Santos et al., 2015).
Sin embargo, en la colección de aislamientos bacterianos asociados a sorgo dulce, se
obtuvo una mayor diversidad de filos y géneros que la obtenida en el presente trabajo.
Esto podría ser explicado mediante la aproximación experimental utilizada, la cual fue
enfocada al obtener la mayor cantidad de heterótrofos endófitos (Mareque et al.,
2014). Asimismo en ese trabajo también se obtuvo mayoritariamente aislamientos
pertenecientes a las Proteobacterias (65%), incluyendo aislamientos pertenecientes a
las Alfaproteobacterias, Gamaproteobacterias y Betaprotebacterias; así como a los
Filos Actinobacteria (2%), Firmicutes (30%) y Bacteroidetes (2%). Por otra parte, en un
trabajo similar realizado con bacterias endófitas asociadas a sorgo dulce, se reportó
también proporciones diferentes, con un mayor número de aislamientos
pertenecientes a los géneros Firmicutes y Actinobacterias (Zinniel et al., 2002).
Nuevamente estos resultados estarían mostrando diferentes tipos de comunidades
bacterianas asociadas, dependiendo del tipo de variedad de sorgo así como región
geográfica.
Dentro del Filo Proteobacteria, la clase mayormente representada fue el de las
Gammaproteobacteria y dentro de la misma los géneros Kosakonia, Enterobacter
52
DISCUSIÓN
Citrobacter, Pantoea y Klebsiella los cuales han sido previamente reportados como
endófitos asociados a diferentes cultivos tales como de banana (Musa paradisiaca),
maíz (Zea mays), arroz (Oryza sativa) y algodón (Gossypium sp) (Martínez et al.,. 2003,
McInroy & Kloepper 1995, Engelhard et al.,. 2000). En particular, los aislamientos
pertenecientes al género Enterobacter y Klebsiella han sido reportados como
asociados a sorgo dulce en Nebraska, Estados Unidos (Zinniel et al., 2002, Pedersen et
al., 1978). Según la bibliografía consultada, el género Citrobacter ha sido reportado
como diazótrofo asociado a cultivos de arroz salvaje en Japón (Elbeltagy et al., 2001),
pero no como asociada a sorgo dulce, siendo este el primer trabajo en reportarlo. En
cuanto al género Kosakonia, se ha reportado que la cepa K. cloacae promueve el
crecimiento de las raíces e incrementa la biomasa de plantas de sorgo dulce en
Namibia (Hosea Haiyambo et al., 2015). Por su parte, el género Pantoea ha sido
previamente reportado como endófito-diazótrofo asociado a sorgo dulce y promotor
del crecimiento vegetal de la misma variedad estudiada en este trabajo (Mareque et
al., 2014).
Dentro del Filo Firmicutes el único representante identificado perteneció al género
Bacillus. Aislamientos pertenecientes a esté género han sido previamente reportados
como endófitos o asociados a diversos cultivos incluyendo el sorgo dulce (Rosenblueth
et al., 2006; Hallman et al., 2006; Mareque et al., 2014). Cabe resaltar que aislamientos
pertenecientes
a
este
género
fueron
también
descriptos
como
agentes
biocontroladores de hongos patógenos asociados a sorgo dulce (Budi et al., 1999,
Martinez-Absalon, 2012).
Por último y en referencia al Filo Actinobacteria, los géneros identificados
Cellulomonas y Microbacterium, han sido previamente reportados como endófitos de
sorgo dulce así como antagonistas microbianos que disminuyen las poblaciones de
nematodos que infectan cultivos de algodón (Zinniel et al., 2002; Hallmann et al.,
1999; Vargas-Ayala et al., 2000).
A modo de resumen de esta parte del trabajo, se puede destacar que en la mayoría de
los trabajos previos consultados se obtuvieron una amplia mayoría de aislamientos
pertenecientes a las Gammaproteobacterias, al igual que en el presente estudio.
Asimismo, la mayoría de los géneros encontrados fueron previamente reportados
como endófitos de cultivos de importancia agronómica. Dentro de la colección es
53
DISCUSIÓN
particularmente interesante mencionar el caso del género Citrobacter, el cual fue
reportado aquí por primera vez como asociado a sorgo dulce.
54
5. CONCLUSIONES Y
PERSPECTIVAS
55
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
5.1 CONCLUSIONES
Mediante la estrategia utilizada se lograron cumplir los objetivos planteados en este
trabajo. En el mismo se logró construir y caracterizar una colección de probables
endófitos bacterianos asociados a la variedad M81E de sorgo dulce. Esta colección
presentó una gran variedad de características PCV con una particular predominancia
de organismos diazótrofos. Además se logró identificar una proporción de los
aislamientos, reportándose el género Citrobacter por primera vez como posible
endófitos asociado a sorgo dulce.
Las características de esta colección resaltan su gran potencial para su aplicación
biotecnológica. Las bacterias nativas PCV son un recurso natural y una alternativa muy
prometedora al uso de la fertilización química en cultivos de importancia agronómica
nacional como lo es el sorgo dulce. Su aplicación apunta a la preservación,
sustentabilidad así como a la disminución de los impactos adversos en el ambiente
debido a la fertilización química durante la ejecución de las prácticas agronómicas.
5.2 PERSPECTIVAS
Este estudio sienta las bases para profundizar en la caracterización de aislamientos de
la colección con el objetivo final del desarrollo de un bioinoculante.
Para continuar estudiando la capacidad FBN de estos aislamientos se sugiere realizar
una medición directa de la actividad de la enzima nitrogenasa, mediante el ensayo de
reducción de acetileno (ARA) (Capone, 1993). Por otra parte, se plantea realizar
ensayos gnotobióticos y en condiciones de invernáculo que permitan investigar la
capacidad PCV de los aislamientos cuando se implementan como inoculantes en
plantas de sorgo dulce. Estos ensayos se deberán realizar en un soporte sin nitrógeno
agregado e incluir plantas inoculadas con aislamientos fijadores y plantas sin inocular
para luego comparar si existen diferencias entre el peso seco y la altura de los distintos
tratamientos. Para estos ensayos se seleccionarán aquellos aislamientos diazótrofos
que presentaron alguna otra característica PCV.
56
57
ANEXO
ANEXO
MEDIO NFCC
Medio Base:
Acido Málico
5,0 g
NaOH
4,7 g
K2PO4
0,1 g
KH2PO4
0,4 g
MgSO4 7H2O
0,2 g
NaCl
0,1 g
CaCl2
0,02 g
FeCl3
0,01 g
NaMoO4.2H2O
0,002 g
Azul de
Bromotimol
2,5 mg
Agua desionizada
c.s.p. 1,0 l
Fuentes de Carbono
Glucosa 14mM
2,5 g
Acetato de sodio 30mM
2,46 g
Piruvato de sodio 23mM
2,53 g
pH = 6,8
Solidificante: Gellan Gum
0,6 g
MEDIO TSA
Tripteína Soya Agar
15 g
Agar
15 g
Agua Agua desionizada
c.s.p. 1,0 l
58
ANEXO
DYGs
Glucosa
2,0 g
ácido máilco
2,0 g
Peptona
1,5 g
extracto de levadura
2,0 g
K2HPO4
0,5 g
MgSO4.7H2O
0,5 g
Ácido glutámico
1,5 g
agua desionizada
c.s.p. 1,0 l
pH=6.5
Agar
18 g
MEDIO PARA CELULASAS
TSA
1,5 g
celulása sal
2,0 g
Agua desionizada
c.s.p. 1,0 l
Agar
15,0 g
MEDIO PARA HEMICELULASAS
TSA
1,5 g
Avicel
5,0 g
Agua desionizada
c.s.p. 1,0 l
Agar
15,0 g
59
ANEXO
MEDIO PARA PEROXIDASAS
TSA
1,5 g
ABTS
250 mg
Agua desionizada
c.s.p. 1,0 l
Agar
150 g
MEDIO PARA PEROXIDASAS
TSA
1,5 g
ABTS
250 mg
MnCL2.4H4O
0,1 g
Agua desionizada
c.s.p. 1,0 l
Agar
15,0 g
MEDIO PARA EXOPROTEASAS
TSA
75,0 mg
Leche descremada en polvo
5,0 g
Agua desionizada
c.s.p. 1,0 l
Agar
15,0 g
MEDIO CAS
Medio base
Solución salina*
100 ml
PIPES
30,24 g
Extracto de levadura desferrado
1,0 g
MgCl 1M
1 ml
CaCl2 0,1M
1 ml
60
ANEXO
Manitol
1,0 g
Agua desionizada
748 ml
Agar
15,0 g
pH= 6,8 ( ajustar con NaOH)
Solución colorante
CAS
60,48 g
Agua desionizada
59 ml
Procedimiento

Se agregó al medio base ya estéril 10 ml de Glucosa 20% previamente esterilizada.

Se mezcló la solución colorante con 1 ml de FeCl36H2O (135 mg/50ml en HCl
0,01N) y bajo agitación agregándose gota a gota sobre una solución de 72.88 mg
de HDTMA en 40 ml de agua deionizada.

Se agregó la solución final al medio base justo antes de armar las placas.
* Preparación de solución salina
KH2PO4
0,3g
NaCl
0,5g
NH4Cl
1,0g
Agar
3,75 g
Agua desionizada
c.s.p 100 ml
BUFFER TAE 1X
EDTA
0,001 M
Tris-acetato
0,04 M
61
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(Sorghum bicolor (L.) Moench)

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