Testosterona RIA KIT

RK-61MECE100126
Testosterona RIA KIT
RK-61M. Estuche para 100 determinaciones
Juego de reactivos para la determinación
cuantitativa in vitro de Testosterona en suero
humano, en el rango de 0-35 nmol/L (0-10
ng/mL).
Introducción
La Testosterona (17β-hidroxi-4-androsten-3ona) es el andrógeno natural más potente. En
los hombres es segregada fundamentalmente
en los testículos y en las mujeres en las
glándulas suprarrenales y ovarios. En varones,
su concentración sérica durante la infancia es
baja y comienza a aumentar con la pubertad.
Aproximadamente un 60% de la Testosterona
sérica se encuentra ligada a la globulina
transportadora de hormonas sexuales (SHBG)
con gran afinidad.
En condiciones normales, la Testosterona
estimula la espermatogénesis y el desarrollo de
los genitales masculinos externos. En
hombres, se observan concentraciones
elevadas en casos de pubertad precoz,
deficiencia congénita de la 21-hidroxilasa,
hiperplasia adrenal (síndrome de Cushing) y
tumores testiculares. En mujeres la
Testosterona puede elevarse en casos de
tumores de ovario y endometrio, en el
síndrome
Stein-Leventhal
(ovario
poliquístico), en la hiperplasia adrenal, el
hirsutismo y la terapia glucocorticoide.
Los niveles disminuidos de Testosterona en
varones
pueden
observarse
en
el
hipogonadismo primario o secundario, el
anorquismo, agonadismo, el síndrome de
Klinerfelter, el síndrome de Kallman y en la
cirrosis hepática. En las mujeres disminuye su
concentración en la post-menopausia.
Principio del ensayo
Este ensayo está basado en una reacción
competitiva entre la Testosterona no marcada,
presente en las muestras y calibradores, con
una cantidad fija de Testosterona marcada con
125
I por un número limitado de sitios de unión
al anticuerpo anti-Testosterona. La cantidad de
125
I que se une al
Testosterona marcada con
anticuerpo es inversamente proporcional a la
concentración de Testosterona no marcada
presente en las muestras.
Después de la incubación, se adiciona al
sistema un reactivo inmunosorbente que
enlaza los inmunocomplejos antígenoanticuerpo a partículas magnetizables. La
separación del antígeno enlazado del antígeno
libre se realiza mediante sedimentación
magnética o por centrifugación, luego se
decanta el sobrenadante y se mide la
radiactividad enlazada en un contador gamma.
La concentración del antígeno es inversamente
proporcional a la radiactividad medida en los
tubos. Utilizando los calibradores de
concentración conocida de Testosterona, se
prepara una curva estándar a partir de la cual
se
determina
por
interpolación
la
concentración de Testosterona presente en las
muestras.
Contenido del juego
1. TRAZADOR, 1 frasco con 1 mL, contiene <
150 kBq de Testosterona marcada con 125I en
etanol.
2. ANTISUERO, 1 frasco con 10 mL,
liofilizado,
contiene
anti-Testosterona
policlonal de conejo en solución tampón y
0,05 % de mertiolato.
3. CALIBRADORES (S1-S6), 6 frascos con
0,5 mL de suero humano liofilizado y
0,1% NaN3. Los calibradores contienen:
0 – 0,43 – 1,73 – 4,3 – 17,3 - 35 nmol/L de
Testosterona.
4. SUERO CONTROL, 1 frasco, contiene 0,5
mL de suero humano liofilizado con 0,1%
NaN3. La concentración del suero control está
especificada en el certificado de calidad
incluído.
5. TAMPÓN para diluir el Trazador, 1 frasco
con 24 mL, listo para usar. Contiene solución
tampón y 0,1% NaN3.
6. INMUNOSORBENTE MAGNÉTICO, 1
frasco, contiene 55 mL de suspensión de
partículas paramagnéticas en solución tampón
con 0,1 % NaN3.
Materiales y equipos necesarios
Gradilla para tubos de ensayo, tubos de ensayo
de polietileno o polipropileno, pipetas de
precisión con puntas desechables (50, 100,
200, 500 µL), agitador vortex, separador
magnético o alternativamente centrífuga, papel
absorbente, contador gamma.
Materiales y equipos recomendados:
Pipetas de repetición (100, 200, 500 µL),
agitador orbital.
Recolección y almacenamiento de
las muestras
Las muestras de suero deben colectarse de
acuerdo a los procedimientos habituales que se
practican en los laboratorios clínicos. Las
muestras pueden conservarse entre 2 y 8 °C si
el análisis se efectuará dentro de las 24 horas
siguientes a su recolección, de lo contrario
deben conservarse congeladas a una
temperatura igual o menor que -20 °C. Las
muestras congeladas deben descongelarse y
mezclarse completamente antes de su uso.
Evitar la congelación y descongelación
repetida de las muestras.
PRECAUCIÓN!
Permitir que todos los reactivos y muestras
alcancen la temperatura ambiente (mín. 1
hora). Homogenizar completamente los
reactivos y muestras antes de su uso, evitando
la formación de espuma.
Procedimiento para el ensayo
(Ver Tabla 1.)
1. Marcar los tubos por duplicado para la
actividad total (T), calibradores (S1-S6),
suero control (C) y muestras (M).
2. Añadir por duplicado 50 µL de
calibrador, suero control y muestras en los
tubos apropiados.
3. Añadir 200 µL de trazador en cada tubo.
4. Añadir 100 µL de antisuero en cada tubo,
excepto T. Este paso no debe durar más
de 5 minutos, utilizar preferiblemente una
pipeta de repetición.
5. Mezclar bien los tubos en agitador vortex
o, si se dispone, en agitador orbital por
algunos segundos.
6. Incubar los tubos durante 3 horas a
temperatura ambiente.
7. Agitar bien el frasco de inmunosorbente
magnético (MIS). Añadir 500 µL a cada
tubo utilizando una pipeta de repetición.
Si se utiliza una pipeta simple, es
necesario agitar el frasco cada 15-20
tubos.
8. Agitar bien los tubos en vortex, incubar
durante 15 minutos a temperatura
ambiente.
9. Fijar la gradilla en un separador
magnético de manera que cada tubo esté
en contacto con la base. Dejar sedimentar
las partículas por 5 minutos. No se debe
quitar la gradilla del separador! Decantar
el sobrenadante mediante la inversión de
la gradilla y colocar los tubos sobre un
papel absorbente por 5 minutos
manteniendo la posición invertida.
10. (Alternativamente) Centrifugar los tubos
por 15 minutos a 1500-2000 g. Aspirar o
decantar el sobrenadante cuidando de no
aspirar el precipitado.
11. Medir la radiactividad de cada tubo por
60 segundos en un contador gamma.
Tabla 1. Protocolo del ensayo (volúmenes en
microlitros)
T
Preparación y conservación de los
reactivos
Agua
destilada
NSB
M
C
100
Calibrador
Conservar los reactivos entre 2 y 8 °C. A esta
temperatura cada reactivo es estable hasta la
fecha de vencimiento del juego. La fecha de
caducidad exacta se especifica en la etiqueta
del estuche y en el certificado de calidad.
El Trazador se diluye inmediatamente antes de
usarse con la solución tampón proporcionada.
El antisuero se reconstituye con 10 mL de
agua destilada. Mezclar suavemente los
reactivos evitando la formación de espuma.
Permitir que alcancen la temperatura ambiente
(20 a 30 °C) antes de su uso.
Los calibradores y el suero control se
reconstituyen con 500 µL de agua destilada.
Para usos posteriores, conservar bajo -20 °C
hasta la fecha de vencimiento del juego.
S1-6
50
Muestra
50
Control
50
Trazador
200
200
Antisuero
200
200
200
100
100
100
Agitar, incubar 3 horas a temperatura ambiente
MIS
500
500
500
500
Agitar, incubar 15 min. a temperatura ambiente
Colocar los tubos en el separador magnético por 5
min. o centrifugar 15 min. a 1500g
Decantar y secar en papel absorbente
Medir la radiactividad (60 s/tubo)
Cálculo de los resultados
En la Tabla 2 y la figura 1 se muestran a
manera de ejemplo los cálculos y una curva
estándar típica de un ensayo.
Para los cálculos:
Hallar la media de los conteos por minuto
(cpm) para cada par de tubos.
Calcular el porciento B0/T% para el calibrador
de concentración cero (S1) según la ecuación
siguiente:
S1 – NSB (cpm)
x 100
B0/T% = ________
T (cpm)
B0/T% es un parámetro opcional del control de
calidad, no necesario para la determinación de
la concentración de las muestras.
Calcular el porciento de unión para cada
calibrador, control y muestra, utilizando la
siguiente ecuación:
S2-6 / C / Mx - NSB (cpm)
B/B0(%) = ___________________ x 100
S1 – NSB (cpm)
Plotear los porcientos B/B0 (%) contra la
concentración de Testosterona de cada
calibrador en un papel semi-logarítmico.
Determinar la concentración de Testosterona
en las muestras por interpolación de la curva
estándar. No extrapolar valores fuera del rango
de la curva.
Para el procesamiento automatizado de los
datos pueden utilizarse programas de ajuste
tipo spline o logit-log.
Tabla 2. Datos típicos del ensayo
Conc.
Media
Tubos
B/T % B/Bo %
(nmol/L)
CPM
48595
T
S1
21633
S2
17875
35,03
81,9
0,43
S3
14008
27,07
63,3
1,73
S4
10709
20,29
47,4
4,3
S5
6267
11,15
26,1
17,3
S6
4949
8,43
19,7
35
C
8115
16,7
34,95
9,59
NSB
851
1,75
42,77
100,0
Sensibilidad
La sensibilidad analítica es de 0,087 nmol/L.
Este valor corresponde a la suma de la media y
dos desviaciones estándar de 10 réplicas del
calibrador de concentración cero (S1).
Especificidad
Los valores de reacción cruzada están
estimados como el cociente de la
concentración de Testosterona (multiplicada
por 100) sobre la concentración de la sustancia
evaluada, cuando ambas ocasionan un 50% de
desplazamiento.
Analito
Testosterona
5α-dihidro-testosterona
5β-dihidro-testosterona
17β-estradiol
Cortisol
Reacción cruzada %
100
35
0,8
0,01
0,01
Precisión
La precisión intra-ensayo se determinó a partir
de 10 réplicas de 3 muestras, medidas en una
serie. Para determinar la precisión inter-ensayo
se midieron por duplicado 3 muestras, en 12
series independientes. Los valores obtenidos
se muestran a continuación.
Intra-assay
Inter-assay
70,00
B/Bo %
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
0,1
1
10
Testosterona (nmol/L)
100
Peligro químico
Algunos componentes de este juego contienen
azida sódica como preservante. Al verter los
desechos no radiactivos al sistema de desagüe
se debe diluir con grandes cantidades de agua,
para evitar la acumulación de azidas metálicas
explosivas en las tuberías de plomo y cobre.
Este producto contiene en total 83 mg de azida
sódica.
Media (nM)
CV%
3,12
6,72
2,55
7,57
Fecha de
vencimiento
10,55
5,18
8,89
9,63
Almacenar entre
26,45
4,87
16,16
7,02
2 y 8 ˚C
Valores de referencia
Los valores presentados a continuación deben
considerarse
como
informativos.
Se
recomienda que cada laboratorio establezca
sus propios intervalos de referencia.
Hombres: 9 – 38 nmol/L (2,6 – 11 ng/mL)
Mujeres: 0,9 – 4,5 nmol/L (0,26 – 1,3 ng/mL)
1 nmol/L = 0,29 ng/mL
1 ng/mL = 3,47 nmol/L
Limitaciones del procedimiento
80,00
Material potencialmente infeccioso
El suero humano utilizado en este producto ha
sido analizado con métodos aprobados y no ha
presentado positividad para anticuerpos frente
al Virus de Inmunodeficiencia Humana (AntiHIV-1) y el antígeno de superficie de la
Hepatitis-B (HBsAg). Ninguno de los métodos
analíticos disponibles actualmente puede
garantizar por completo la eliminación de
posibles riesgos biológicos. Se deben
manipular todos los reactivos y muestras de
sangre
como
material
potencialmente
infeccioso.
CV%
Conversión de las unidades de medida
90,00
Material radiactivo
Este producto contiene material radiactivo. Es
responsabilidad de cada laboratorio cumplir
con las regulaciones locales referentes a la
manipulación, conservación y desecho de
materiales radiactivos.
Media (nM)
0
Figura 1.
Ejemplo de curva estándar
(No utilizar para calcular valores de las muestras!)
Precauciones
• Los reactivos provistos en este juego están
optimizados para la medición de Testosterona
en suero.
• Las muestras hemolizadas, turbias o
lipémicas pueden dar resultados falsos, evite
su uso.
• Los resultados solo deben ser interpretados
dentro del contexto clínico apropiado y nunca
como prueba única e infalible de anomalía o
enfermedad
Características del ensayo
Parámetros típicos
NSB/T
<3%
B0/T
46 ± 6 %
ED-50
3,5 ± 1,5 nmol/L
Suero Control
Precaución
Calibrador
Peligro biológico
Inmunosorbente
magnético
Consulte las
instrucciones
Trazador
Dispositivo para
diagnóstico in
vitro
Antisuero
Fabricante
Material
radiactivo
Número de
referencia
Tampón para
trazador
Sitio WEB: http://www.izotop.hu
E-mail técnico: [email protected]
E-mail comercial: [email protected]
INSTITUTE OF ISOTOPES Ltd.
1535 Budapest. Pf.: 851.
Tel.: (+36) 1-392-2577, Fax: (+36) 1-395-9247
Edición: enero/2010
Atención! No mezclar los componentes de
lotes diferentes o con productos de otro
fabricante!
Número de lote