Fluorometro basado en un LED un monocromador y un tubo

Transcripción

|
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERÍA
MECÁNICA Y ELÉCTRICA
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
“FLUORÓMETRO BASADO EN UN LED,
UN MONOCROMADOR Y UN TUBO
FOTOMULTIPLICADOR”
TESIS
Que para obtener el grado de:
“MAESTRO EN CIENCIAS EN INGENIERÍA ELECTRÓNICA”
PRESENTA:
ING. CRUZ ELENA GUERRA MARTÍNEZ
DIRECTORES DE TESIS:
Dr. José Manuel de la Rosa Vázquez
M. C. Edgard Moreno Garcia
México, D. F., Diciembre de 2008
AGRADECIMIENTOS.
Agradezco a Dios por iluminarme para poder concluir esta meta, siempre me
encomendare a él y solicitare su ayuda si me encuentro en algún problema, yo
se que él jamás nos abandonara y siempre podre contar con él gracias a su
gran misericordia.
Gracias al Dr. José Manuel De La Rosa y al M.C Edgard Moreno a
quienes admiro por su dedicación y empeño en lograr sus proyectos a
sabiendas de que son difíciles, por su experiencia y estudio logran ver en los
resultados de sus análisis lo que los demás no vemos. Su capacidad de
visualizar los proyectos a futuro los hace decidir si se llevan a cabo o no,
gracias por su paciencia y su tolerancia hacia mi persona.
Gracias al Dr. Francisco Gallegos Funes por su comprensión, confianza y la
motivación que nos brinda a todos los estudiantes.
Gracias a la Secretaria Mónica por su apoyo y su preocupación por los
estudiantes, siempre en lo particular me ayudo en lo que estaba a su alcance.
Agradezco a mis padres: Carlos y Amelia, el haberme orientado por el
camino del estudio, por inculcarme el trabajo como principal herramienta en
la vida y por alentarme para continuar siempre en mis proyectos. Mis Padres
con el simple hecho de verme saben lo que me hace falta, lo que tengo o como
estoy y de inmediato intervienen de mil formas para mejorar la situación.
Seria imposible el haber estudiado, e incluso mi vida seria diferente y muy
complicada si no los tuviera.
Gracias a mis Hermanos Omar y Carlos por su apoyo incondicional y
preocupación por mí, por alentarme e impulsarme siempre a salir adelante.
Agradezco a mi esposo Fernando por su paciencia por que a pesar de la
distancia siempre estuvo apoyándome en todo, jamás me limito y siempre
respeto mis decisiones.
INDICE
Pág.
Índice……………………………………………………………………………….. I
Índice de figuras……………………………………………………….…………
III
Índice de fotografías………………………………………………….…………
IV
Índice de tablas………………………………………………………….………
IV
Resumen………………………………………………………………………..…. V
Abstract…………………………………………………………………………...
V
Objetivo……………………………………………………………………….…...
VI
Justificación……………………………………………………………………...
VI
Nomenclatura…………………………………………………………………….
VII
CAPÍTULO 1. ESPECTROSCOPIA
1.1 ESPECTROSCOPIA……………………………………………………………………….….1
1.1.1 FORMA Y ANCHURAS ESPECTRALES. ………………………..…………..…1
1.1.2 ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA.……………………………..……3
1.2 ESPECTROSCOPIA PROPUESTA..…………………………………………………….…4
1.2.1 MONOCROMADOR……………………………………………………………….5
1.2.2 TUBO FOTOMULTIPLICADOR (PMT)………….…………………………….…8
1.2.3 TARJETA DE ADQUISICIÓN DE DATOS (DAQ)………..………………….…9
REFERENCIAS.…………………………………………………………………………………..11
CAPÍTULO 2. FLUORESCENCIA PARA LA DETECCIÓN DE CÁNCER
2.1 CÁNCER A NIVEL MUNDIAL Y NACIONAL………………………..…………………...12
2.2. MÉTODOS DE DETECCIÓN DE CÁNCER………………………………………….…..14
2.2.1 DETECCIÓN DE CÁNCER POR MEDIO DE BIOPSIA…………………….…14
2.2.2 TECNICAS CONVENCIONALES DE DETECCIÓN DE
CÁNCER EN VIVO………………………………………………………………..16
2.3 FLUORESCENCIA PARA DETECCIÓN DE CANCER EN PIEL……………………..17
2.4 DETECCIÓN DE CÁNCER CERVICOUTERINO POR FLUORESCENCIA…………19
I
2.5 FLUORESCENCIA DE HIBRIDACIÓN IN SITU (FISH)………………………………...19
REFERENCIAS………………………………………………………………………….………..20
CAPÍTULO 3. FLUORESCENCIA EN OTROS DIAGNOSTICOSY TERAPIA
FOTODINÁMICA
3.1 DETECCIÓN POR FLUORESCENCIA DE HONGOS Y BACTERIAS EN LA PIEL...22
3.2 FLUORESCENCIA EN ODONTOLOGÍA…………………………………………………23
3.3 TERAPIA FOTODINÁMICA (TFD)………………………………………………………...24
REFERENCIAS…………………………………………………………………………………...26
CAPITULO 4. FLUORÓMETRO DESARROLLADO
4.1 FUENTE DE ILUMINACIÓN…………………………………………………………..……27
4.2 FIBRA ÓPTICA…………………………………………………………….…………………28
4.2.1 PARÁMETROS PARA CARACTERIZAR UNA FIBRA ÓPTICA…………….30
4.2.2 PERDIDAS DE POTENCIA EN UNA FIBRA ÓPTICA……………………….30
4.2.3 CONFIGURACIONES DE FIBRA ÓPTICA……………………………………32
4.2.4 FIBRA ÓPTICA UTILIZADA……………………………………………………..33
4.3 ACOPLAMIENTO ÓPTICO…………………………………………………………………34
4.4 PROGRAMA DE CONTROL……………………………………………………….………35
REFERENCIAS…………………...………………………………………………………………37
CAPÍTULO 5. CALIBRACIÓN Y MEDICIONES
5.1 CALIBRACIÓN………………………………………………………………………………..38
5.2 MEDICIONES…………………………………………………………………………………39
5.2.1 Mediciones
REFERENCIAS…………………...………………………………………………………………43
CAPÍTULO 6. CONCLUSIONES
6.1 CONCLUSIONES…………………………………………………………………………….44
6.2 TRABAJO A FUTURO……………………………………………………………………….45
II
INDICE DE FIGURAS
Figura 1.1
Figura 1.2
Figura 1.3.
Figura 1.4.
Figura 1.5.
Figura 2.1.
Figura 2.2.
Figura 4.1.
Figura 4.2.
Figura 4.3.
Figura 4.4.
Figura 4.5.
Figura 4.6.
Figura 4.7.
Figura 5.1.
Figura 5.2.
Figura 5.3.
Figura 5.4.
Figura 5.5.
Figura 5.6.
Figura 5.7.
Procesos de desactivación de estados electrónicos excitados,
diagramas de Jablonski……………………………..………………….....…..3
Diagrama esquemático del fluorómetro desarrollado…………….………..4
Circuitos de potencia para el motor a pasos y sistema de
medición………………………………………………….………………..…....7
Curva del espectro de detección del H7732P-11 y su
transferencia voltaje de control-ganancia…………….…………….....…….9
Tarjeta DAQ USB-6009………………………….…………………………….10
Toma de una biopsia incisional………………………………………….…...15
Principio de una biopsia óptica………………………………………….…...17
Diagrama esquemático del fluorómetro desarrollado…...………...….…...27
Espectro del diodo emisores de luz NSHU590A (365nm) Y
una ilustración del Led…….………………………….…………….….….…28
Fuente de corriente para la alimentación de los led……………….………28
Sección longitudinal de una fibra óptica, propagación de la
radiación…………………..…………………………………………….………29
Fibra óptica bifurcada R200-ANGLE-UV de la firma
Ocean Optics………………………………….…………………………..…...33
Lente colimadora 74-UV…………………….…………...……………....…...34
Panel frontal del instrumento desarrollado en LabVIEW 7.1
después de realizar la opción Barrido. El espectro medido
corresponde al espectro de la lámpara de mercurio HG-1
utilizada para calibrar el Instrumento……………..…………..….…......…...37
Espectros de emisión de cuatro leds: un led ultravioleta (375 nm)
y tres leds de alta luminosidad: azul (447 nm), verde (449 nm)
y rojo (638 nm)……………………………………………………..………….39
Espectros de fluorescencia emitida por papel bond color
naranja claro cuando es excitado con el led UV y con
el led azul……..………………………………………..………………….……40
Espectros de fluorescencia emitida por un anticongelante
irradiado por el led UV y el led azul………………..…………………..……40
Espectros de fluorescencia emitida por papel bond color amarillo,
naranja medio y verde claro irradiados con el led UV………………...…..41
Espectros de fluorescencia emitidos por agua jabonosa y
por un detergente comercial color verde……………..………………..…...41
Espectros de fluorescencia emitidos por cáscara de papaya,
pulpa de mango y tomate verde. Los tres componentes emiten
fluorescencia máxima alrededor de 550nm………………...………….…..42
Autofluorescencia de distintas localizaciones de piel de una
misma persona que a la vista manifiesta una coloración diferente……..42
III
INDICE DE FOTOGRAFIAS
Fotografía 1.1. Componentes del monocromador………….………………………..…..…….5
Fotografía 1.2. Monocromador ensamblado en el chasis con fotodetector
PMTy motor a pasos……………………………………..…..……..……….....7
Fotografía 3.1. Tratamiento con FTD de Queratosis actínica……………………….…...…25
Fotografía 3.2. Tratamiento con FTD Cáncer de células basales en rostro y en
brazo…………………..………………………………………….…..…………25
Fotografía 4.1. Herrajes de acoplamiento y ajuste óptico para la fibra
Bifurcada…………………………………………………...……………..…….34
Fotografía 4.2. Herraje de la cámara óptica para tubos de ensaye
montado en el monocromador………...…………….………………….……35
INDICE DE TABLAS
Tabla 4.1. Porcentaje de potencia de salida en función de la pérdida en dB…….……..…31
Tabla 4.2. Atenuación en el cable de fibra óptica………………………………………..……31
Tabla 5.1. Error en λ a partir de los valores patrón y los datos experimentales……..……38
.
IV
RESUMEN
La finalidad de este trabajo es la del desarrollo de un espectrofluorometro para el estudio
de la fluorescencia de tejido canceroso. El sistema construido tiene el fin de apoyar la
investigación médica sobre la posibilidad de usar el fenómeno de fluorescencia para hacer
diagnóstico de cáncer en vivo.
En este trabajo se reporta un espectrofluorómetro basado en un diodo emisor de luz
ultravioleta, una fibra óptica bifurcada, un espectrómetro, un tubo fotomultiplicador de alta
sensitividad, una tarjeta de adquisición de datos y una computadora Laptop. Para fines
de comparación se utilizaron dos fuentes de luz: un led UV (375 nm) y un led de alta
luminosidad azul (447 nm). Con el espectrofluorómetro se midió la fluorescencia en
estado estacionario emitida por muestras de líquidos (anticongelantes, detergentes),
sólidos (papeles bond de colores) y piel sana. El espectrofluorómetro trabaja en un
intervalo de 200 a 800 nm (regiones ultravioleta y visible), con una precisión y exactitud de
1 nm y con una resolución de 0.05 nm. El prototipo tarda alrededor de 10 min en realizar
la medición de un espectro completo en todo el intervalo. El software usado se desarrollo
en el lenguaje gráfico G de Lab-View 7.1.
ABSTRACT
The goal of this work is the development of a spectrofluorometer to study the cancer tissue
fluorescence. The developed system will be used to investigate the fluorescence
phenomena as an in vivo medical cancer diagnoses method.
Here is reported on an spectrofluorometer based on an ultraviolet photodiode, a bifurcated
optical fiber, a spectrometer, a high sensitivity photomultiplier tube, a data acquisition
board and a Laptop computer. For purposes of comparison we use two light sources: an
UV led (375nm) and a high luminescence blue led (447nm). Some measurements of
steady-state fluorescence emitted by samples of liquids (Antifreezes, detergents), solids
(colored bond paper) and healthy skin are presented. The spectrofluorometer works in the
range from 200 to 800 nm (ultraviolet and visible regions), with a precision and accuracy of
1nm and 0.05 nm resolution. The prototype takes about 10 min to make the measurement
of a complete spectrum in the interval. The software was developed in the graphical
language G of Lab-View 7.1.
V
OBJETIVO
Desarrollar un espectrofluorómetro modular que permita realizar estudios de fluorescencia
de diversas sustancias. Particularmente se pretende aplicar el instrumento desarrollado
en la investigación para el diagnóstico de enfermedades de piel, in vivo e in situ, como el
cáncer.
JUSTIFICACIÓN
Hoy en día la mayoría de los métodos de diagnóstico en enfermedades humanas y de
detección de contaminantes, ocurren a través de la toma de muestras de tejido por medio
de biopsias o de muestras de gases o líquidos del medio contaminado. Estas muestras
son enviadas al laboratorio para su posterior análisis, lo cual es costoso y consume
mucho tiempo para la realización de un diagnóstico más oportuno. Con las tecnologías
ópticas actuales es posible aplicar la espectroscopia de fluorescencia como técnica de
análisis in situ, en vivo y en tiempo real a través del desarrollo de espectrofluorómetros
basados en fibras ópticas, LED’s ultravioleta y laptops.
En el diagnóstico médico las principales ventajas de la biopsia óptica, por medio de
fluorescencia inducida, son su naturaleza no-invasiva y la rápida obtención del diagnóstico
casi en tiempo real.
Estos espectrofluorómetros pueden construirse, como es el caso de esta tesis, en
tamaños tales que pueden ser transportados como un equipo portátil.
VI
Nomenclatura.
(OMS)
(IMSS)
(SSA)
Organización Mundial de la Salud
Instituto Mexicano del Seguro Social
Secretaría de Salud
(TC)
(IRM)
y(LIF)
(nm)
(HPV)
(FISH)
(TDF)
Tomografía Computarizada
Imagen por Resonancia Magnética
Fluorescencia Inducida por Láser
Nanómetros
Virus del Papiloma Humano.
Fluorescencia de Hibridación In Situ
Terapia Fotodinamica.
(ALA)
Acido Aminolevulínico
Metil Aminolevulínato
Porfirinas Fotoactivas Endógenas
Especies de Oxígeno Reactivo
Queratosis Actínica
Carcinoma Basocelular
(MAL)
(PAP)
(ROS)
(QA)
(CBC)
(DFD)
PMT
So y S1
T1 y T2
s
UVA
UVB
UVC
ADN
UV
φf
HpD
USB
λ
PC
µm
mm
TTL
V
cd
kΩ
Ω
MΩ
mA/W
Diagnostico Fotodinamico.
Tubo Fotomultiplicador
Primero y segundo estado excitado de un singulete
Estado Excitado Tripletes
Segundos
Onda Larga
Onda Media
Onda Corta
Acido Deoxiribunucléico
Ultravioleta
Cociente entre el número de fotones emitidos por fluorescencia y el
número de fotones absorbidos.
Derivados Hematoporfirínicos
Bus Universal en Serie.
Lamda
Computadora Personal
Micrometros
Milímetros.
Lógica Transistor a Transistor
Volts
Corriente Directa
Kilo Ohm
Ohm
Mega Ohm
Miliamperio sobre Watt
VII
(CAD)
(CDA)
PCI
PXI
PCMCIA
ISA
AC
NI
MAX
mW
mA
dB/Km
cm
Analógico/Digital
Digital/Analógico
Interconexión de Componentes Periféricos
Bus Industrial de Comunicaciones Estándar para la Instrumentación y
Control.
Personal Computer Memory Card International Association
Arquitectura Estándar Industrial
Corriente Alterna
National Instruments
Measurements and Automation
Miliwatt
Miliampere
Decibelio sobre kilometros
Centimetros
VIII
CAPÍTULO 1
ESPECTROSCOPIA
1.1 ESPECTROSCOPIA [1, 2]
La espectroscopia estudia las transiciones que se producen entre los estados cuánticos
de un sistema material inducidas por la radiación electromagnética. La radiación
electromagnética provoca las transiciones entre los niveles de energía cuantizados del
sistema material que dan lugar al espectro. La cual manifiesta un comportamiento dual
onda-corpúsculo, característico de las partículas microscópicas. Desde el punto de vista
corpuscular, la radiación electromagnética es un haz de partículas con masa en reposo
nula, denominadas fotones que se mueven a la velocidad de la luz y que transportan
momento lineal, además de energía. Todas las gamas de frecuencia conocidas
constituyen el espectro electromagnético, que se divide en regiones que, en orden de
frecuencias, son: ondas de radio, microondas, infrarrojo, visible, ultravioleta, rayos X,
rayos gama y rayos cósmicos.
Los rayos ultravioleta cubren un intervalo de frecuencias que va desde 390nm a 10nm. La
zona ultravioleta se subdivide a su vez en ultravioleta cercano que va de (390-200nm,
más próximo al visible), en ultravioleta lejano (200-100nm) y en ultravioleta extremo o
vacío (100-10nm). Atendiendo a los efectos de radiación salud, los rayos ultravioleta se
diven en rayos UV-A (390-315nm), rayos UV-B (315-280nm) y rayos UV-C (280-10nm).
La energía de los fotones ultravioleta va aproximadamente desde 3.2eV hasta 120eV y es
lo suficiente elevada para producir reacciones químicas. Los rayos UV-A, los menos
energéticos son los responsables del bronceado de la piel y activan la síntesis de la
vitamina D en el interior de la misma. Los más energéticos rayos UV-B y UV-C son por el
contrario, dañinos ya que se pueden romper enlaces en el ADN de las células de la piel e
inducir así mutaciones y procesos cancerígenos. Afortunadamente el oxigeno y el ozono
de la atmósfera absorben (por ahora en lo que respecta al ozono) la mayor parte de estas
radiaciones procedentes de el sol. Los rayos ultravioleta ionizan los átomos presentes en
la alta ionosfera.
1.1.1
.1.1 FORMA Y ANCHURAS ESPECTRALES
ESPECTRALES [1, 2, 3]
El coeficiente de absorción cuantifica es la cantidad de radiación que absorbe una
muestra para cada frecuencia de radiación. La absorción macroscópica neta, resultante
de los innumerables procesos de absorción y emisión que tienen lugar entre los niveles de
energía a escala microscópica, satisface la denominada ley de Lambert-Beer que
introduce conceptos como absorbancia, coeficiente de absorción molar y transmitancia
para designar las magnitudes que relacionan la intensidad transmitida y la intensidad
incidente.
1
La absorbancia alcanza un máximo para la frecuencia de resonancia y disminuye hasta
anularse fuera de una banda espectral. El coeficiente de absorción se puede determinar
teóricamente a partir de las magnitudes que caracterizan las transiciones
espectroscópicas, incluyendo el ensanchamiento de las líneas espectrales. Los
mecanismos que explican el ensanchamiento de las líneas espectrales son varios. La
contribución de la emisión espontánea da lugar a la denominada anchura natural, y la
banda espectral resultante es de tipo lorentziano. Su anchura media, definida en general
como la anchura de la banda a mitad de la altura máxima, está relacionada con el tiempo
de vida media del estado excitado. La anchura natural aumenta con el cubo de la
frecuencia de resonancia.
El efecto Doppler es responsable de la variación de la frecuencia que percibe una muestra
con respecto a la que emite una fuente. La distribución de velocidades genera una
distribución de bandas lorentzianas entorno a la frecuencia de resonancia, cuya
combinación da lugar a un ensanchamiento no homogéneo. La distribución de
velocidades genera una función de distribución de frecuencias gaussiana, con lo que el
perfil de las bandas espectrales ensanchadas por efecto Doppler es de tipo gaussiano.
Los estados excitados también pueden desactivarse de forma no radiativa mediante
colisiones atómicas o moleculares lo que repercute en el tiempo de vida media del estado
excitado y se manifiesta en un ensanchamiento adicional de la banda espectral
denominado ensanchamiento debido a la presión o por colisiones que es un
ensanchamiento homogéneo al producir bandas centradas en la misma frecuencia.
Una molécula situada en un estado electrónico excitado, puede desactivarse emitiendo
espontáneamente radiación electromagnética. El espectro de emisión contiene
información complementaria al del espectro de absorción. Una representación de todos
los procesos que pueden tener lugar en el estado electrónico excitado y que representan
los mecanismos de desactivación, radiativos y no radiativos se denomina diagrama de
Jablonski los cuales se muestran en la figura 2.1.
La molécula esta inicialmente, en su estado electrónico fundamental que es un estado
singlete y que representamos de la forma S0 . Por encima tiene otros estados electrónicos
de la misma multiplicidad, que denotamos como S1, S2,...., por orden creciente de
energía, y estados de diferente multiplicidad, que supondremos que son todos tripletes y
que representamos de la forma T1,T2,..., las energías electrónicas de los estados
tripletes son inferiores a las de sus correspondientes estados singletes, de acuerdo con la
regla de Hund. Todos los estados electrónicos tienen además, su correspondiente
estructura asociada de niveles de energía vibracionales.
El proceso de absorción de radiación, deja a la molécula en uno de los niveles
vibracionales de un estado electrónico superior. Supondremos que la molécula pasa así al
estado singlete mas bajo S1 . La absorción de radiación (S1 ← S0) es rápida se produce
en unos 10-15 s, y va seguida de una serie de procesos de desactivación mas lentos
mediante los cuales la molécula vuelve al estado electrónico fundamental.
2
La relajación vibracional, la redistribución de energía vibracional, la conversión interna, las
colisiones, que pueden dar lugar a una reacción química y el cruce entre sistemas son
procesos que contribuyen, con diferente eficacia según la molécula, a la desactivación de
los estados excitados.
Conversiones internas y
Relajaciones vibracionales
Energía
Cruce intersistemas
ISC
S1
T
T1
Fluorescencia
(10-9 – 10 -7 s)
Fotón
Absorción
(10-15s) S0
Fosforescencia
(10-3 – 10 2 s)
2
1
0
Figura 1.1 Procesos de desactivación de estados electrónicos excitados,
diagramas de Jablonski.
1.1.2 ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA
FLUORESCENCIA [1, 2, 3]
3]
La emisión espontánea de radiación se denomina en general, luminiscencia. Si la
emisión procede de un estado electrónico con la misma multiplicidad que el fundamental
se le denomina fluorescencia, y si la emisión se debe a una transición entre estados
electrónicos con diferente multiplicidad, se le denomina fosforescencia. El tiempo de vida
media radiativa de los estados electrónicos excitados varía entre 10-10 y 10-7 s y éste
tiempo es el que tarda la molécula en emitir la radiación fluorescente. La relajación
vibracional es mucho más rápida, entre 10-14 y 10-12 s, lo que provoca que la emisión
fluorescente se produzca desde el nivel vibracional mas bajo del estado electrónico
excitado, que es la denomina Fluorescencia Normal. Si se reduce la presión y aumenta el
tiempo entre las colisiones, la molécula puede emitir desde el nivel vibracional inicial del
estado excitado dando Fluorescencia Resonante.
El espectro de fluorescencia que se observa habitualmente es el correspondiente a las
transiciones desde el estado excitado singlete más bajo, S1, al estado singlete
fundamental, S0, incluso si la absorción de radiación puebla los estados singletes más
altos S2, S3…., Sn. Este comportamiento, que se conoce como regla de Kasha, se debe a
que los procesos de conversión interna y de relajación vibracional entre los estados
electrónicos excitados singletes excitados Sn a S1 son tan rápidos, que la emisión de
3
radiación no puede competir con ellos y queda bloqueada. La presencia de más de una
banda en el espectro de fluorescencia es, casi siempre, un indicativo de que está
emitiendo fluorescencia, más de una especie química. No todas las moléculas en estado
electrónico excitado singlete más bajo, vuelven al fundamental emitiendo un fotón. El
número de las que lo hacen se mide usando el rendimiento cuántico de fluorescencia φf ,
que se define como el cociente entre el numero de fotones emitidos por fluorescencia y el
numero de fotones absorbidos.
La espectroscopia de fluorescencia es una técnica usada en medicina, ya que puede
proporcionar información útil respecto a la concentración y a las propiedades físicoquímicas de algún sustrato biológico lo que, eventualmente, podría servir como técnica de
diagnóstico. La emisión luminiscente producida por tejido irradiado con luz láser
ultravioleta puede ser usada para localizar tumores, a través de la fluorescencia natural
del tejido (autofluorescencia) o empleando marcadores tipo HpD (derivados
hematoporfirínicos). A la fecha, se ha reportado un número considerable de trabajos en
animales y aplicaciones clínicas en humanos. Un ejemplo ilustrativo es el uso de
espectroscopia de fluorescencia para identificar plaquetas ateroscleróticas en arterias
humanas. El análisis espectroscópico del plasma inducido por láser, obtenido cuando un
haz láser pulsado normalmente interacciona con tejido, es muy útil cuando se remueven
plaquetas (ateromas), así como para fragmentar cálculos en el riñón y la vesícula.
1.2 ESPECTROSCOPIA PROPUESTA [4,10]
El espectrómetro que se utiliza en este trabajo se fabrico en el laboratorio de láseres y
optoelectrónica de le ESIME-ZAC, el cual esta formado por un monocromador asociado a
un tubo fotomultiplicador (PMT) de alta sensibilidad (H7732P-11 de la firma Hamamatsu).
El monocromador contiene una rejilla de difracción que descompone la luz policromática
que recibe en su entrada, en sus diferentes longitudes de onda. Cada una de estas
longitudes de onda puede ser seleccionada a la salida del monocromador por medio del
posicionamiento angular de la rejilla. Este posicionamiento se logra por medio de un motor
a pasos, que esta acoplado al sistema mecánico que posiciona a la rejilla de difracción
(ver figura 1.2). Bajo el control de un programa, la tarjeta DAQ envía los comandos
necesarios para mover el motor y posicionar así a la rejilla de difracción en λ de salida
deseada. Se requiere de circuitos de potencia para manejar las corrientes demandadas
por los devanados del motor.
PMT
LUZ MONOCROMÁTICA DE SALIDA
LUZ
POLICROMÁTICA
DE ENTRADA
AMP V-I
TARJETA
DAQ
REJILLA DE
DIFRACCIÓN
LAP-TOP
MONOCROMADOR
MOTOR
CIRCUITOS DE
POTENCIA
LABVIEW
Figura. 1.2 Diagrama esquemático del fluorómetro desarrollado
4
La luz con una sola longitud de onda que sale del monocromador se envía a un tubo
fotomultiplicador (PMT), el cual produce a su salida una señal eléctrica de corriente, que
es proporcional a la irradiancia detectada en su entrada óptica. Esta señal de corriente es
convertida a voltaje para aplicarse a una entrada analógica de la tarjeta de adquisición de
datos, la cual se encarga de convertir el voltaje analógico de entrada a un formato digital
para que la PC pueda reconocer y procesar la información medida. La tarjeta DAQ (USB6009 de la firma National Instruments) se comunica con la PC por medio de un puerto
serie USB.
El programa de control se desarrollo en el lenguaje gráfico G dentro del ambiente de
programación de LabVIEW ®. Por medio de este programa se controla la posición de la
rejilla de difracción del monocromador para generar un barrido en longitud de onda. En
cada λ el programa mide la correspondiente irradiancía, procesa las mediciones y grafica
en tiempo real la información, construyendo así el espectro de la radiación detectada por
el PMT.
1.2.1 MONOCROMADOR
El monocromador que se utiliza en el espectrómetro básico es del tipo Czemy-Turner con
una longitud focal de 275 mm y una rejilla de 32 x 27 mm que contiene 1200 ranuras/mm.
La rejilla descompone la luz policromática que entra al monocromador en sus diferentes
longitudes de onda en un intervalo de 200 a 800nm. En la fotografía 1.1 se muestra el
sistema del monocromador con el que se desarrollo el espectrómetro, donde se enumeran
sus principales componentes:
4
2
3
5
7
6
1
Fotografía 1.1. Componentes del monocromador
5
1. Rendijas de entrada. Se tienen cuatro rendijas de entrada, cada una con un ancho
diferente (100, 200, 400 y 800µm). La rendija a utilizar para el haz luminoso de entrada se
puede seleccionar manualmente por medio de un sistema mecánico. La intensidad de luz
que pasa a través de una rendija es aproximadamente proporcional al cuadrado del ancho
de la rendija [1]. Mientras mayor es la apertura de la rendija mayor es la intensidad
luminosa que pasa por ella, pero la resolución es menor.
2. Primer espejo. La luz que atraviesa a la rendija de entrada seleccionada, incide en éste
espejo y es reflejada a la rejilla de difracción.
3. Rejilla de difracción. Descompone en sus diferentes longitudes de onda al haz de luz
que proviene del primer espejo. Dependiendo del ángulo en que se encuentre
posicionada, será la longitud de onda que incida sobre el segundo espejo.
4. Segundo espejo. Refleja la longitud de onda que proviene de la rejilla de difracción
hacia la rendija de salida.
5. Rendijas de salida. También se tienen cuatro rendijas de salida con aperturas similares
a las rendijas de entrada. Ambos conjuntos de rendijas se pueden seleccionar
manualmente por un mismo sistema mecánico para tener a la entrada y a la salida
rendijas del mismo ancho.
6. Espejo de salida. Cambia la trayectoria del haz de luz que proviene de la rendija de
salida en 90º, dirigiéndolo a la salida.
7. Sistema mecánico. Posiciona a la rejilla de difracción en la longitud de onda deseada
En la fotografía 1.2 se presenta el monocromador ensamblado en el chasis con sus
componentes adicionales: un fotodetector (PMT) y un motor a pasos acoplado al sistema
mecánico de posicionamiento angular de la rejilla.
El motor de pasos utilizado es del tipo unipolar y está formado por un estator de 4 fases y
un rotor magnético permanente de 24 polos, con una resolución de 1.8° por paso. Es el
modelo 57BYG084 de la marca GBM. Este motor de pasos puede ser modelado como un
arreglo de 4 bobinas conectadas por un extremo a un solo punto común, cada una de
ellas consume hasta 0.6A cuando es excitada. Cada bobina está controlada por un
amplificador contenido en el circuito integrado de potencia media L293 como se muestra
en la figura 1.3. Este circuito esta formado por cuatro amplificadores independientes que
pueden proporcionar hasta 1A cada uno, a un voltaje máximo de alimentación de 36V y
tiene una entrada (EN) para deshabilitar las salidas de potencia [5]. El estado de cada
bobina del motor de pasos se determina escribiendo cierto código en las 4 respectivas
líneas de salida de la tarjeta DAQ (PO3-PO0). Los niveles lógicos del tipo TTL que
proporciona la tarjeta DAQ son desacoplados eléctricamente de la etapa de potencia por
medio de circuitos fotodarlington 4N33. La secuencia de los códigos binarios, que deben
ser enviados hacia el circuito de potencia, para mover al motor en una cierta dirección es
la siguiente: 0011, 0110, 1100, 1001. Para invertir la dirección de rotación deben enviarse
los mismos códigos pero en secuencia inversa. La velocidad de rotación depende de la
frecuencia con la que cada código es enviado hacia el motor. Se utiliza una salida digital
(PO4) de la tarjeta DAQ para controlar el encendido del motor.
6
Rejilla de difracción
PMT
Porta objetos de salida
ENTRADA
DE LUZ
SALIDA
DE LUZ
Sistema mecánico para
posicionar a la rejilla de
difracción
Engranes cónicos
Selector de rendijas
de acoplamiento
de entrada y salida
motor a pasos
Fotografía 1.2. Monocromador ensamblado en el chasis con fotodetector PMT
y motor a pasos
+5V
4 FOTO
ACOPLADORES
(4N33)
TARJETA
DAQ
PO0PO3
(NI USB6009)
PO4
LAP-TOP
4
+24V
4 AMP DE
POTENCIA
MEDIA
(L293)
MOTOR
A PASOS
4
EN
EN
MONOCROMADOR
4N33
If
USB
AI1
LF356
-
PMT Vref
+ (H7732P-11)
+
-
Vc
Ganancia
7
Figura 1.3. Circuitos de potencia para el motor a pasos y sistema de medición
1.2.2 TUBO FOTOMULTIPLICADOR (PMT) [6,7]
El fotodetector que hasta ahora ha sido el más utilizado en espectroscopia de
fluorescencia es el tubo fotomultiplicador (PMT). Un PMT consiste de un fotocátodo y una
serie de dinodos que actúan como etapas de amplificación. El fotocátodo es una fina
película de metal dentro de la ventana del PMT y los fotones que inciden en ésta película
de metal producen la expulsión de electrones de su superficie. La eficiencia en el proceso
de generación de fotoelectrones es dependiente de la longitud de onda incidente. El
fotocátodo se polariza con un potencial negativo, con valores típicos entre -1000V y 2000V, y los dinodos también se alimentan con potenciales negativos pero inferiores en
magnitud al potencial del fotocátodo. Estas diferencias de potencial aceleran a los
electrones expulsados del fotocátodo hacia el primer dinodo y por efectos de colisión se
expulsan más electrones de este dinodo hacia el siguiente dinodo de la cadena. Este
proceso continúa a través de toda la cadena de dinodos hasta que los electrones
liberados alcanzan el ánodo del PMT.
Para mediciones cuantitativas la corriente de ánodo debe ser proporcional a la Intensidad
luminosa que incide en el fotocátodo. El amplio uso de los PMTs se debe a que tienen alta
ganancia con bajo ruido, lo cual permite medir señales débiles de fluorescencia. En la
actualidad se cuenta con módulos completos que incluyen un convertidor de cd-cd para
suministrar el alto voltaje de polarización que requiere el PMT a partir de un voltaje de
+15V, una entrada de voltaje de cd para controlar la ganancia del PMT y una salida de
referencia.
El PMT que utiliza el espectrómetro básico forma parte de todo un módulo completo
fabricado por la firma Hamamatsu, modelo H7732P-11, Este modulo contiene un
convertidor de cd a cd para proporcionar el alto voltaje de polarización que requiere el
tubo a partir de un voltaje de +15V. Adicionalmente el modulo utilizado tiene una entrada
de voltaje de cd para controlar la ganancia del PMT y una salida de referencia (1.2V) cuyo
voltaje se varía con un potenciómetro lineal de 10kΩ para controlar la ganancia del PMT
(ver figura 3.3). El PMT produce a su salida una señal eléctrica de corriente que es
proporcional a la irradiancia detectada. Esta señal es convertida a voltaje por medio del
amplificador tipo BiFet LF356 (impedancia de entrada de 1012Ω y ancho de banda de
5MHz) configurado para tener una transresistencia de 1.27 MΩ.
2
El H7732P-11 tiene un área efectiva de detección de 4x20 mm y una sensitividad
radiante de 80 mA/W para una longitud de onda de 430nm [7]. En la figura 3.4 se muestra
la curva del espectro de detección del H7732P-11, donde se observa que en un intervalo
de 300nm a 600nm se tiene alta sensitividad, especificándose un valor máximo para
430nm (UV). Es en esta región ultravioleta de mayor sensitividad del PMT, donde se
requiere medir espectros de fluorescencia aplicando la técnica LIF (Laser Induced
Fluorescence).En la figura 1.4 también se muestra la curva de transferencia entre la
ganancia y el voltaje de control aplicado al PMT.
8
Figura 1.4. Curva del espectro de detección del H7732P-11 y su transferencia
voltaje de control-ganancia.
1.2.3 TARJETA DE ADQUISICIÓN DE DATOS (DAQ) [8, 9]
La gran mayoría de los fenómenos que se presentan en la naturaleza, varían en forma
continua y se dice que producen señales analógicas ó señales que son análogas al
fenómeno. Cuando se utiliza una PC en el procesamiento digital de un instrumento, se
requiere cambiar el formato analógico de la información generada por el fenómeno a
detectar, a un formato digital que pueda ser interpretado por la computadora. En algunas
ocasiones se necesita que la información procesada en forma digital sea convertida a un
formato analógico de salida. Para realizar el cambio de formato de la información se
utilizan convertidores Analógico/Digital (CAD) y Digial/Analógico (CDA).
El concepto de adquisición de datos se refiere primariamente a la captura de señales
analógicas con una PC por medio de una interfase. A esta interfase se le llama Tarjeta de
Adquisición de Datos (Data AQuisition Board), la cual permite que la información del
mundo real pueda ser reconocida por una computadora. Las tarjetas DAQ son sistemas
electrónicos completos, que se conectan a la computadora a través de su bus interno, ó
bien, a través de un puerto paralelo, serie o USB. Las tarjetas DAQ realizan una ó más de
las siguientes funciones:
•
•
•
•
Entradas Analógicas
Salidas Analógicas
Entradas/Salidas Digitales
Contadores/Temporizadores
9
Hoy en día se dispone de una gran variedad de tarjetas que pueden conectarse a una PC,
la gran mayoría de ellas dentro de su bus interno. En este caso es importante conocer en
que tipo de plataforma se va a conectar una tarjeta, por ejemplo: PCI, PXI, PCMCIA, USB,
ISA, VXI. En algunos casos las tarjetas están diseñadas para conectarse al puerto
paralelo estándar de la PC. También existen tarjetas que realizan otro tipo de funciones
tales como: adquirir imágenes (señales de video), controlar motores (AC, DC, de pasos),
generar instrumentos básicos con PC (osciloscopios, multímetros, generadores de
funciones), por ejemplo.
Para utilizar un sistema de adquisición de datos en forma óptima, dentro de una aplicación
específica, es necesario conocer los fundamentos de operación de las diversas funciones
que puede realizar el sistema. También es importante, para realizar una buena selección,
conocer el significado de las principales características del sistema.
La tarjeta de adquisición de datos utilizada es el modelo NI USB-6009 fabricada por
National Instruments Inc. Esta es una tarjeta de bajo costo, pequeña y potable que
fácilmente se conecta a cualquier PC o laptop por medio de la interfase estándar USB (ver
imagen de la figura 1.5). Sus principales características son las siguientes:
Entradas analógicas: 8 canales simples o 4 diferenciales, resolución de 14 bits,
razón de Muestreo = 48 KS/s, intervalos desde ±1V hasta ±20V.
Salidas Analógicas: 2 canales, resolución de 12 bits, intervalos de 0 a 5V.
12 líneas de entrada/salida digitales tipo TTL.
1 contador/temporizador de 16 bits.
Figura 1.5. Tarjeta DAQ USB-6009
La máxima razón de muestreo de ésta tarjeta es baja, pero debido a la naturaleza
estacionaria de las mediciones no se requiere una mayor razón de muestreo. Se utiliza
una entrada analógica de la tarjeta DAQ (AI1) en modo simple con un intervalo bipolar de
10
±10V para medir el voltaje que contiene la información de la señal luminosa que incide en
el PMT. Cinco líneas digitales de salida de la tarjeta (PO4-PO0) se utilizan para controlar
el motor a pasos. La entrada analógica esta programada para realizar 50 mediciones a
una razón de 1000 muestras por segundo cada vez que se invoca una lectura de la
entrada.
La tarjeta es completamente configurable por programa y se tienen dos tipos de
configuración:
a) Una relacionada con el bus interno de la PC e incluye la dirección base de la
tarjeta dentro del mapa de memoria del sistema, el canal de acceso directo a
memoria (DMA) y el canal de interrupción.
b) Otra relacionada con la adquisición de datos, tales como: el intervalo y la polaridad
de las entradas analógicas y dirección de flujo en líneas digitales.
La USB-6009 es compatible con las especificaciones del estándar industrial de
Intel/Microsoft llamado “Plug and Play”. Este programa administra y asigna los recursos
del sistema, de tal manera que al conectar la tarjeta DAQ al sistema, se asegura que no
existan conflictos con otros recursos. La otra configuración, la que programa las funciones
propias de la tarjeta, se puede realizar por medio del programa “Measurements and
Automation” (MAX), o bien, por medio de las funciones que proporciona LabVIEW.
REFERENCIAS
[1]. A. Requena Rodríguez, J. Zúñiga Román, Espectroscopia, Pearson Educación, S.A.,
Madrid, 2004.
[2]. Morcillo-Rubio, J. M. Orza-Segade, Espectroscopía, Alhambra, S.A., 1972
[3] J. R. Lakowicz, “Principles of Fluorescence Spectroscopy”, Klumer Academic/Plenum
Publishers, 2nd Edition USA, 1999.
[4]. E. Moreno-García, R. Rosas-Vélez, P. Reyes-López, J. de la Rosa-Vázquez.
Development of a spectrometer controlled by a PC, Científica, Vol 11, No 3, Julio-Sept
2007, pp.149-154.
[5] Texas Instruments, “L293 Quadruple Half-H Drivers data sheet”,
http://focus.ti.com/lit/ds/symlink/l293.pdf
[6] Hamamatsu Corp., “PMT Handbook”, http://www.hamamatsu.com/
[7].Hamamatsu Corp., “Photosensor Modules H7732 Series”, http://www.hamamatsu.com/
[8]. E. Moreno, Notas de iinstrumentation con LabVIEW, ESFM, 2002
[9] National Instruments Corp, “NI USB-6009 data sheet”,
http://www.ni.com/pdf/products/us/20043762301101dlr.pdf
[10]. National Instruments, “G Programming Reference Manual” , National Instruments
Corp., Austin TX, USA, 1998.
11
CAPÍTULO 2
FLUORESCENCIA PARA LA DETECCIÓN
DE CÁNCER
2.1
CÁNCER
CÁNCER A NIVEL MUNDIAL Y NACIONAL [1 – 10]
Las estadísticas muestran que el cáncer es una enfermedad grave, sobre todo en el
mundo desarrollado. Sólo un 4 % de las muertes en África se deben a ese mal, mientras
que en Europa representan un 19 %. La razón de lo anterior es que el cáncer se presenta
en personas de edad avanzada y la esperanza de vida en los países desarrollados es
considerablemente mayor que en los subdesarrollados. Se estima que aproximadamente
7.6 millones de personas morirán este año en todo el mundo por diferentes tipos de
cáncer, y aparecerán 12.3 millones de nuevos casos. Se calcula que 5.4 millones de
personas se enfermarán de cáncer y 2.9 millones morirán de esta dolencia en las
naciones desarrolladas, con 6.9 millones de casos nuevos y 4.7 millones de muertes en
los países en vías de desarrollo. El hábito de fumar ha sido el principal responsable del
cáncer de pulmón provocando la muerte anual de 975,000 hombres y 376,000 mujeres.
La carga del cáncer está en aumento en países en vías de desarrollo, ya que las muertes
por enfermedades infecciosas y la mortalidad infantil disminuyen con el consecuente
aumento de la esperanza de vida. Otra de las causas de aumento en la incidencia de
cáncer es atribuido a las dietas grasosas, la cuales son típicas en México. Debido a la
atención, en Europa y América del Norte, el 75% de los niños con cáncer viven hasta
cinco años con dicha enfermedad, en tanto que en los países centroamericanos, entre el
48 y el 62 % solo viven hasta tres años.
Los cánceres relacionados con infecciones estomacales, hepáticas y cervicales son más
comunes en los países en vías de desarrollo. Globalmente, el 15% de todos los tipos de
cáncer están causados por infecciones. La bacteria Helicobacter pylori causa el cáncer de
estómago, la hepatitis puede dar paso al del hígado y el virus del papiloma humano
provoca el cáncer cervical del útero.
Entre los hombres, los tres tipos de cánceres más comúnmente diagnosticados en países
desarrollados son los de próstata, pulmón y colon, en tanto que en países en vías de
desarrollo son los del pulmón, estómago e hígado. En el caso de las mujeres, los tres
cánceres más comunes en países desarrollados son de pulmón, mama y colon, y en
países en vías de desarrollo los de mama, cerviz uterina y estómago.
Se estima que aproximadamente 465,000 mujeres morirán este año de cáncer de mama,
convirtiéndose en la principal causa de muerte por cáncer entre mujeres en todo el
mundo. El cáncer es uno de los principales problemas de salud pública, ya que a pesar de
12
los avances en investigación y tratamiento, anualmente fallecen más de seis millones de
personas en el mundo. Esta situación se torna crítica y de no implementarse estrategias
de prevención, para el año 2025 se presentarán 15.5 millones de nuevos casos, advierte
la Organización Mundial de la Salud (OMS).
En México, por ejemplo, las enfermedades oncológicas son la segunda causa de muerte,
representando gastos millonarios para los institutos de salud que las atienden. Tan sólo
en 1999, el Hospital de Oncología del Centro Médico Nacional Siglo XXI del Instituto
Mexicano del Seguro Social (IMSS), gastó 451 millones de pesos en atención al
derechohabiente con cáncer, es decir 43 millones de pesos más del presupuesto anual
destinado para su combate en ese año.
De 1950 a 1998 las muertes por enfermedades oncológicas tuvieron un incremento del
68%; mientras que en los cincuenta fallecieron por esta causa 1.655 personas por cada
100,000 habitantes, en el 98 la cifra fue de 52,681. A partir de la década de los noventa,
los tumores malignos aumentaron considerablemente en mexicanos mayores de 30 años,
y según el Registro Histopatológico de Neoplasias Malignas de 1998, el cáncer de cerviz
uterina ocupaba el primer lugar con 22,000 casos por año. A su vez, se detectaron 11,139
casos de cáncer de mama; 6,146 de cáncer de próstata, y 4,594 de cáncer de ganglios
linfáticos.
Del total de los casos de cáncer, 63.5% correspondieron al sexo femenino y 35.3% al
masculino; de las 52,681 defunciones registradas ese año, 47.8% correspondieron a
hombres y 52.2% a mujeres. De acuerdo con la Secretaría de Salud (SSA), la enfermedad
en todas sus manifestaciones ha llegado a cifras alarmantes, pues en 1999 se reportaron
53.6 decesos por cada 100,000 habitantes. Asimismo, resalta que entre el 70 y 80 % de
los afectados acuden a las instituciones de salud cuando el padecimiento se encuentra en
etapas avanzadas e incluso tardías, y precisa que la alta incidencia y su desenlace fatal
este íntimamente relacionado con el envejecimiento de la población y la adopción de
hábitos poco saludables.
Los casos de muerte en mujeres entre 30 y 60 años de edad ocurren en mayor proporción
debido al cáncer de cerviz uterina con un 32.2% y de mama con un 16.4%. En lo que
respecta a la población masculina, informa que el carcinoma de la próstata es la
neoplasia más frecuente en mayores de 40 años, y la primera causa de muerte entre
aquellos que rebasan los 65. Además, revela que el año pasado en el Instituto Nacional
de Cancerología se reportaron 118 casos.
Por otro lado, los cánceres que más afectan a la población infantil (linfático, huesos,
glándulas, testículos, entre otros) tienen una incidencia mayor entre los cuatro y siete
años de edad. Aun cuando no hay estadísticas precisas, informes médicos apuntan que la
tasa aproximada de este padecimiento en menores de 11 años es de 120 casos anuales,
y de cada cuatro infantes, tres son hombres y uno es mujer. Empero, el cáncer en niños
alcanza cifras de curación superiores al 70 %, siempre y cuando se detecte a tiempo y se
brinde tratamiento adecuado.
Las terapias para combatir el cáncer tienen un alto costo que ni los pacientes, familiares e
institutos de atención sanitaria pueden cubrir en la mayoría de los casos, ya que la
13
atención de la enfermedad no sólo se limita al pago de medicamentos, sino que el
afectado además requiere integración familiar, rehabilitación, apoyo psicológico y estudios
de seguimiento. Frente a este panorama, el Programa Nacional de Salud (PNS) 20012006 subraya que las intervenciones dirigidas al combate del cáncer deberán
encaminarse a la promoción de estilos de vida más sanos, prevención de riesgos
específicos entre los sectores poblacionales expuestos, detección oportuna y atención
temprana.
2.2. MÉTODOS DE DETECCIÓN
DETECCIÓN DE CÁNCER
CÁNCER
Uno de los problemas claves en el tratamiento del cáncer es la detección temprana de la
enfermedad. A menudo, el cáncer se detecta en sus fases más posteriores, cuando ha
comprometido la función de unos o más sistemas vitales del órgano y es extendido a
través del cuerpo. Los métodos de la detección temprana del cáncer son de suma
importancia y son un área activa de la investigación actual. Después de la detección inicial
de un crecimiento canceroso, el diagnóstico y la localización exactos de la enfermedad
son esenciales para el diseño de un plan del tratamiento. Este proceso depende de la
prueba clínica y las observaciones del médico.
2.2.1 DETECCIÓN
DETECCIÓN DE CÁ
CÁNCER POR MEDIO DE BIOPSIA [11,12]
Una biopsia es un procedimiento realizado con el propósito de obtener tejido o células del
cuerpo para examinarlos con el microscopio. Algunas biopsias pueden realizarse en la
oficina del médico, mientras otras necesitan realizarse en las instalaciones de un hospital.
Además, algunas biopsias requieren el uso de anestésicos para adormecer el área,
mientras otras no requieren sedantes de ninguna clase. Las biopsias usualmente se
realizan para determinar si un tumor es maligno (canceroso) o para determinar la causa
de una infección o inflamación inexplicada.
Una biopsia puede obtenerse de varias formas, dependiendo del tipo de muestra que se
necesite. Los endoscopios flexibles (tubos flexibles de fibra óptica, que permiten iluminar y
ver con un lente) permiten que el cirujano observe dentro del cuerpo a través de una
incisión pequeña y que tome una muestra de tejido. Las muestras de tejido son, por lo
general, pequeñas y se extirpan del tejido que parece haber sufrido cambios en su
estructura, como lo son los tumores. Existen varios tipos de biopsia, las cuales se
discuten a continuación.
a) La biopsia endoscópica
Este tipo de biopsia se realiza por medio de un endoscopio de fibra óptica (un tubo
delgado y largo que tiene un telescopio de enfoque cercano en su punta para poder
observar) insertado a través de un orificio natural (como por ejemplo el recto) o una
incisión pequeña (por ejemplo, en la artroscopia). El endoscopio se usa para observar el
órgano en cuestión, buscar áreas anormales o sospechosas y obtener una pequeña
cantidad de tejido para estudiarlo. Los procedimientos endoscópicos reciben el nombre
del órgano o parte del cuerpo que se va a visualizar, recibir tratamiento o ambos. Los
14
médicos pueden insertar el endoscopio dentro del tracto gastrointestinal (endoscopia del
tracto alimenticio), en la vejiga (citoscopia), en la cavidad abdominal (laparoscopia), en la
cavidad de una articulación (artroscopia), en la porción central del pecho
(mediastinoscopia), o en la tráquea y el sistema bronquial (laringoscopia y broncoscopia).
b) La biopsia de la médula ósea por aspiración y por punción.
La biopsia por aspiración y por punción de la médula ósea es un procedimiento que
comprende la extracción de una pequeña cantidad de líquido de la médula ósea
(aspiración) y/o de tejido sólido de la médula ósea (biopsia de núcleo o por punción),
generalmente de los huesos de la cadera, para estudiar la cantidad, tamaño y madurez de
los glóbulos y/ o de las células anormales.
c) La biopsia excisional o incisional en piel.
Este tipo de biopsia se usa frecuentemente cuando se necesita una porción amplia o
profunda de la piel. Usando un bisturí (cuchillo quirúrgico, escalpelo), se extirpa una parte
de la piel en su totalidad para un examen detallado, y la herida se cose (con suturas
quirúrgicas). Cuando se extirpa todo el tumor, la técnica se llama biopsia excisional. Si se
extirpa sólo una parte del tumor, se le llama técnica de biopsia incisional (ver figura 2.1).
La biopsia excisional es el método preferido cuando se sospecha la presencia de
melanoma.
Figura 2.1. Toma de una biopsia incisional
d) La biopsia de aspiración por medio de una aguja fina (su sigla en inglés es FNA)
Este tipo de biopsia incluye el uso de una aguja fina para extirpar partes muy pequeñas
de un tumor. Algunas veces se utilizan analgésicos locales para adormecer el área, pero
el examen raramente causa incomodidad y no deja cicatrices. La FNA no se utiliza para
diagnosticar un lunar sospechoso, pero puede utilizarse para realizar biopsias de los
nódulos linfáticos grandes cercanos a un melanoma para saber si se ha producido
metástasis. Puede usarse la tomografía computarizada, un procedimiento que produce
imágenes de cortes transversales del cuerpo, para guiar la aguja dentro del tumor en un
órgano interno como el pulmón o el hígado. Usualmente el paciente sólo siente el leve
15
pinchazo de una aguja y un poco de ardor durante más o menos un minuto, con un poco
de presión, pero sin dolor. Los sitios comunes para las biopsias son: la médula ósea, los
senos, el tracto gastrointestinal, el riñón, el hígado, el pulmón, los nódulos linfáticos, la
piel, la tiroides y el cerebro. Después de una biopsia, la muestra de tejido se envía al
laboratorio para los estudios de patología quirúrgica y citología.
e) La biopsia de perforación de la piel.
Las biopsias de perforación toman una muestra de piel más profunda, con un instrumento
que extirpa un cilindro corto o “corazón de manzana”, del tejido. Después de proporcionar
anestesia local, el instrumento se rota en la superficie de la piel hasta que corta todas las
capas, incluyendo la dermis, epidermis y las partes más superficiales del subcutis (grasa).
f) La biopsia de raspado de piel.
Este tipo de biopsia se realiza removiendo las capas más superficiales de la piel
raspándolas con un instrumento afilado. Las biopsias de raspado también se realizan con
anestesia local.
2.2.2 TÉCNICAS
TÉCNICAS CONVENCIONALES DE DETECCIÓN DE CÁNCER
CÁNCER EN VIVO [13, 14]
Las principales técnicas de detección de cáncer en vivo que se utilizan hoy en día son:
ultrasonido, tomografía computarizada y resonancia magnética nuclear.
La técnica con ultrasonido hace uso de la reflexión de ondas acústicas de alta frecuencia
para diferenciar tejidos, lo que permite examinar varios órganos en el cuerpo. La máquina
de ultrasonido envía ondas acústicas de alta frecuencia que hacen eco en las estructuras
corporales y un computador recibe dichas ondas reflejadas y las utiliza para crear una
imagen. A diferencia de los rayos X, en este examen no se presenta ninguna exposición a
radiación ionizante. El examen se realiza en el departamento de ultrasonido y radiología.
La persona se acuesta y se le aplica un gel conductor a base de agua en el área del
cuerpo que se va a evaluar para facilitar la transmisión de las ondas sonoras. Una sonda
manual (transductor) se desplaza sobre el área de estudio y se le pide a la persona que
cambie de posición para poder examinar otras áreas.
Los exámenes de ultrasonido son mejores que el análisis de sangre para identificar si los
tumores por ejemplo en el ovario son benignos o malignos. Con la técnica del ultrasonido
se identifica correctamente el 93% de los tumores como benigno o canceroso, mientras
que el análisis de sangre se acierta el 83% de las veces. La enfermedad afecta por lo
general a las mujeres mayores de 55 años. Entre los síntomas se encuentra la hinchazón,
el dolor pélvico o abdominal, dificultad para comer o sensación de llenura, o síntomas
como la necesidad frecuente de orinar. En vista de que los síntomas son a menudo
similares a afecciones menos serias, solo el 20% de los canceres de ovario se detectan
16
en sus primeras etapas. Esto hace que la búsqueda de mejores técnicas para detección
temprana del cáncer sea aun más importante.
La tomografía computarizada (TC) consiste en el uso de radiografías para producir una
foto transversal de las partes del cuerpo. En la obtención de imágenes de Resonancia
Magnética (IRM) se hace uso de campos magnéticos y ondas de radio para mostrar
modificaciones en los tejidos blandos sin el uso de radiografías.
La más novedosa técnica para la detección de cáncer en vivo es la fluorescencia inducida
por láser (LIF), o biopsia óptica, la cuál es materia de investigación actual a nivel mundial.
Esta técnica consiste en aplicar luz ultravioleta en el tejido que se quiere analizar, y medir
la respuesta fluorescente de la piel en esa zona. En la figura 2.1 se ilustra el principio de
una biopsia óptica.
Luz de excitación
Fluorescencia + luz reflejada
Luz esparcida
tejido
Luz transmitida
Figura 2.1. Principio de una biopsia óptica
2.3 FLUORESCENCIA PARA
PARA DETECCIÓN DE CÁNCER EN PIEL [14, 15, 16
16, 17,
17, 18]
El primero que observó fluorescencia en el estrato córneo fue Beccari, en 1745, quien
demostró que las plumas de los pájaros eran fluorescentes. En 1794, Kortum observó la
fluorescencia de los huesos. En 1810 Dessaignes encontró que la piel seca fluoresce.
Más tarde, entre 1904 y 1930, muchos autores estudiaron la fluorescencia de la piel y
uñas así como de diversos procesos patológicos. En 1925, Margarot y Deveze fueron los
primeros que la usaron para el diagnóstico de las enfermedades por hongos.
Robert Williams Wood (1868-1955), notable físico americano, fue quien ideó un filtro de
vidrio que dejaba pasar solamente las radiaciones ultra violeta de longitud de onda de 366
nm, que son las más apropiadas para la fluorescencia y en su nombre la conocemos
17
como luz de Wood. Utilizando la luz de Wood se obtuvieron resultados favorables en
anatomía.
•
El estrato corneo de la piel humana está facultada para emitir rayos visibles bajo la
influencia de la luz ultravioleta. El color resulta de la combinación del grosor de
dicho estrato, del contenido de agua y de la edad del individuo; si el estrato
corneo es delgado, la fluorescencia es de color blanco-azulado y si es más grueso
•
es más amarillenta. Este cambio de color se debe a la diferencia entre la
fluorescencia de la superficie y la fluorescencia que proviene de la profundidad y
dependen de la irrigación sanguínea de la piel, el grado de pigmentación, la
estructura de la superficie (más lisa o más rugosa), el grosor de la epidermis y los
sitios de la piel.
•
En la cara, hay fluorescencia muy resaltante; los folículos en el surco nasogeniano,
mentón, región interciliar y pabellones auriculares fluorescen de rojo claro o
amarillento-rojizo; esta fluorescencia se ve más en los jóvenes que en los viejos.
•
Los dientes normalmente fluorescen de blanco brillante; el sarro alrededor de los
dientes fluoresce rojo y la lengua de algunas personas puede presentar
fluorescencia roja en la parte central.
•
En el ojo fluoresce la esclerótica y la córnea de color blanco azulado; el cristalino
fluoresce fuertemente y la fluorescencia aumenta con la edad; el iris no fluoresce.
•
Los cabellos negros, marrones o rubio oscuro no fluorescen, mientras que, en el
cabello rubio claro se puede ver una fluorescencia amarilla clara.
•
Las uñas fluorescen de un color blanco-azulado que dependiendo del grosor de la
uña toma un tinte amarillento.
•
La palma de la mano también fluoresce fuertemente de color blanco-amarillento,
sobre todo en los pliegues.
•
Las partes rugosas del estrato corneo y mínimas descamaciones (como en la piel
seca) fluorescen de color blanco-azulado. Se presenta un contraste entre la
hiperpigmentación de la piel y la piel despigmentada; la hiperpigmentación se ve
más oscura (negra o marrón oscuro) y en las partes sin pigmento la fluorescencia
es más clara, de color blanco-amarillento, por lo que resalta sobre la piel normal.
•
En el vitiligio se puede observar que las áreas despigmentadas fluorescen más
fuertemente que a su alrededor. El pigmento es como un filtro, absorbe la
radiación y de esta manera puede influir sobre la fluorescencia de las fibras y del
colágeno subyacente.
En las partes donde hay procesos de mayor queratización o alteración de la
queratinización se observa mayor intensidad de la fluorescencia sin cambio en el color.
Cuando hay aumento de grosor del estrato córnea, como en los callos y verrugas
18
vulgares, la fluorescencia blanco-azulada o blanco-amarillenta resalta sobre la piel
normal.
2 .4 D ETECCIÓN DE CÁNCER CERVICOUTERINO
CERVICOUTERINO POR FLUORESCENCIA [19, 20]
El cáncer cérvico uterino a pesar de ser una enfermedad prevenible, sigue siendo una de
las más frecuentes causas de mortalidad en mujeres de Latinoamérica y otras partes del
mundo. La mayoría de mujeres que desarrollan cáncer cervical se encuentran en su
cuarta o quinta década de vida. Uno de los factores estudiados en las últimas décadas es
el virus del papiloma humano (HPV), como agente precursor de lesión genética del
epitelio genital, causante de neoplasia que es diagnosticada en fases avanzadas del
padecimiento. Existen más de 80 tipos de este virus, de los cuales unos 25 afectan el
tracto genital. Los subtipos de HPV se clasifican en categorías de riesgo (bajo, intermedio
y alto) sobre la base de su relación con lesiones de alto grado e invasoras.
El Coloscopio de luz actínica, es utilizado específicamente para ver las neoplasias, utiliza
los conocimientos de óptica de microscopia de fluorescencia con iluminación episcopica,
es decir, con luz incidente sobre el plano focal observado. Usa colorantes especiales para
fluorescencia llamados fluorocromos que permiten de manera específica teñir las partes
de las células en los tejidos que se desea caracterizar, dando como resultado una imagen
con alta resolución que es captada mediante sistemas de filtros específicos resaltando así
la imagen en un fondo oscuro (ley de Stokes - Adams). Este sistema cuenta con una
fuente de iluminación similar a la de tipo Kohler en la cual el filamento se enfoca al infinito
en el plano de observación, lo que provoca que los diferentes matices aumenten el
contraste y el color, y den una imagen de mayor calidad.
La modificación al técnica del acido acético permite por varias razones visualizar de mejor
manera las neoplasias. Una de ellas es la absorción del ácido acético con el flurocromo y
otra por la absorción del DNA al fluorocromo de las células neoplasicas debido a que se
encuentran en mayor proporción que en las células sanas. Mediante coloscopia
tradicional, en las zonas de tejido enfermo en las que el acido acético actúa se observa un
blanco casi transparente En colposcopia de luz actinia aparece un color verde sobre un
fondo oscuro. Un agente como el acido acético facilita la unión del fluorocromo al tejido
infectado y lesionado por el VPH.
2. 5 FLUORESCENCIA
FLUORESCENCIA DE HIBRIDACIÓN IN SITU (FISH) [14]
La biología molecular permite valorar los cambios genéticos en las células neoplásicas,
demostrar secuencias moleculares que han determinado los cambios de comportamiento
celular, así como investigar y demostrar la presencia de secuencias virales como agentes
de inducción neoplásica.
En los últimos años se han desarrollados técnicas moleculares que demuestran de
diferente manera secuencias de DNA o RNA con diferente grado de sensibilidad, una de
ellas, práctica en el trabajo en anatomía patológica es la Hibridación in Situ mediante
19
cromógenos y fluorescencia, que nos permite ver sobre el tejido la presencia de virus o
secuencias buscadas para una correlación con los hallazgos patológicos. FISH es una
técnica que permite determinar el número de copias de un cromosoma dado en muestras
de tejidos y frotis de células en interfase mediante el uso de sondas y sistemas de
detección fluorescente. La sonda es un fragmento de ácido nucleico de secuencia
conocida y caracterizada como propia para un cromosoma determinado. La forma de
conocer si hubo hibridación o no se realiza marcando ciertos nucleótidos en la sonda, la
cual puede hacerse con biotina.
El método de fluorescencia de hibridación in situ (FISH) se basa en la detección y
localización de secuencias específicas de ADN o ARN dentro de las células o tejidos; esta
técnica consiste en colocar la sonda directamente sobre el espécimen (material genético
como cromosomas, citologías, secciones histológicas embebidas en parafina) que tiene la
secuencia del DNA inmovilizada; el tejido es tratado con una enzima que permite el
acceso de la sonda al DNA nuclear, el que ha sido previamente desnaturalizado por calor.
La sonda se agrega para la hibridación y ésta ocurre si está presente el DNA
complementario de la sonda. La sonda viene ligada a una sustancia fluorescente, que es
observada mediante microscopía de fluorescencia.
El uso de FISH con sondas derivadas de los cromosomas 21, 18, 13, X y Y ha
comenzado a dar resultados muy prometedores en el diagnóstico de anaploidas de estos
cromosomas. Con estas experiencias, se ha probado al menos que el diagnóstico
prenatal no invasivo de enfermedades genéticas mediante la utilización de células fetales
de sangre materna puede ser una realidad, y que unido a otros métodos de diagnóstico
prenatal, también en sangre materna (determinación de los niveles de alfa-feto proteína,
estriol conjugado y gonadotropina coriónica, serán de gran valor en la investigación de
alteraciones genéticas prenatales, lo que hará que se logre un índice muy superior de
prevención, y permitirá que se reserven las manipulaciones intrauterinas con sus posibles
consecuencias negativas para la madre y el feto, sólo para aquellas pacientes en que
fuera necesario confirmar resultados alterados en estudios en sangre materna.
REFERENCIAS
[1]. A. Mantilla Reinaud, B. E. Vesga Angarita, J. Solier Insuasty Enríquez, Registro de
cáncer, Unidad de Oncología, Hospital Universitario Ramón González Valencia,
Bucaramanga, Colombia (1996 - 1999).
[2]. C. Pardo, R. Murillo, M. Piñeros, M. A. Castro. Casos nuevos de cáncer en el Instituto
Nacional de Cancerología, Colombia, 2002. Rev Colomb Cancer 2004; 7:4-19.
[3]. B. Caan, B. Sternfeld, E. Gunderson, A. Coates, C. Quesenberry, M. L. Slattery “Life
After Cancer Epidemiology (LACE) Study: A cohort of early stage breast cancer
survivors (United States)”. Cancer Causes Control 2005; 16:545-56.
[4]. Unión internacional contra el cáncer, (UICC); (2005). “Estadísticas epidemiológicas
globales del cáncer a nivel mundial”. Organización Panamericana de la Salud.
[5]. M. Parkin, F. Bray, P. Ferlay. Global Cancer statistics, 2002. CA Cancer J Clin.
2005;55:74-108.
20
[6]. World Cancer Research Fund, American Institute for Cancer Research. Food, Nutrition
and the prevention of cancer: a global perspective. American Institute for Cancer
Research, Washington D.C. USA 1997. p. 148-75.
[7]. R.T. Greenlee, T. Murray, S. Bolden et al., Cancer statistics, 2000. CA Cancer J Clin.
2000; 50: 7-33.
[8]. J. Skowronek, T. Piotrowski., Bilateral breast cancer. Neoplasma 2002; 49(1):49-54
[9]. Datos
y
Estadisticas
de
Cancer
en
los
hispanos
y
Latinos.
http://www.cancer.org/downloads/STT/862301.pdf.
[10]. ACS. Cancer Facts & Figures 2005. American Cancer Society, 2005.
[11]. Biopsy
proceedings
used
to
diagnose
cancer,
http://www.mayoclinic.com/healt/biopsy/CA00083, 01.12.2008.
[12]. Diccionario de medicina, OCÉANO MOSBY, MCMXCIV.
[13]. Aplicaciones del ultrasonido. Rev Colomb Cir 2003; 18(2) : 94-99.
[14]. Tuan Vo-Dinh, “Biomedical Photonics Handbook, 2003
[15]. R. E. Schneider, M. A. Cimrmancic. M. H. West, R. E. Barsley and S. Hayne,
“Narrow band illumination and fluorescence and its role in wound pattern
documentation”. http://www.docschneideronline.com/nbifinal.doc (15.04.07)
[16] N.S. Agar, J.M. Halliday, R.S. Bernetson, H.N. Ananthaseamy, M. Wheeler, A.M.
Jones, “The basal layer in human squamous tumors harbors more UVA than UVB
fingerprint mutations: A role for UVA in human skin carcionogenesis”, PNAS, Vol
101, No. 14, (2004) 4954-4959.
[17] G. Pal, A. Dutta, K. Mitra, M.S. Grace, A. Amat, T.B. Romanczyk, X. Wu, K.
Chakrabarti, J. Anders, E. Gorman, R.W. Waynant, D.B. Tata, “Effect of low intensity
laser interaction with human skin fibroblast cells using fiber-optic nano-probes”, J.
Photochem Photobiol. B: Biol, 86 (2007), 252-261.
[18]. “The reddish-orange fluorescence of necrotic cancerous surfaces under the Wood
light. Arch”. Derm. Syph., 69:31-42, 1954.
[19]. E.A Morrison, Hogyf, S.H. Vermumnd. “Human papilomavirus infection and other risk
factor for cervical neoplasia”. Int J Cáncer 1991;
[20]. A. Keefe. E. Chahine., “Fluorescence detection of cervical intraepithelial neoplasia for
photodynamic therapy with the topical agents 5- aminolevulinic acid and
benzoporphyrin-derivate monoacid ring”. Am J Obtet Gynecol 20001; 184(6):116469.
21
CAPÍTULO 3
FLUORESCENCIA EN OTROS DIAGNOSTICOS
Y TERAPIA FOTODINÁMICA
3.1 DETECCIÓN POR FLUORESCENCIA DE HONGOS Y BACTERIAS EN LA PIEL [1,2]
En 1958, Wolf logró extraer un pigmento fluorescente, pteridina, desde cultivos y pelos
infectados por M. canis y M. gypseum. El uso de la luz de Wood en lesiones axilares y
genitocrurales permite un diagnóstico rápido de eritrasma. Las lesiones fluorescen de
color rojo brillante (coral o carmín). Esta fluorescencia característica, cuando está
presente, puede corresponder a toda la lesión, puede estar presente sólo en el borde de
la lesión o puede formar placas dentro de la lesión. En todo caso, la fluorescencia aparece
solamente dentro de los límites de la lesión.
En la pilonodosis palmelina, los pelos fluorescen de color blanco-amarillento mate, a
veces con un tinte amarillo-rojizo dependiente de la variedad blanca, roja o negra. En la
psoriasis la fluorescencia es blanco-amarillenta y el tono amarillo predomina cuando es
mayor el grosor de las escamas. En cambio, en la dermatitis seborreica la luminosidad es
menor debido al mayor contenido de grasa de las escamas. Las verrugas seniles dan una
fluorescencia amarilla intensa que no se ve en las verrugas seborreicas de la cara.
En la pitiriasis versicolor, la prueba de la fluorescencia sigue siendo de incuestionable
valor tanto para el diagnóstico como en los controles durante y después del tratamiento.
Como medio diagnóstico, por la fluorescencia podemos poner en evidencia lesiones poco
aparentes para el paciente o el médico y localizaciones insospechadas que, si no son
reconocidas y tratadas, constituyen la fuente de recaída o reinfección en la gran mayoría
de los casos. La desaparición de la fluorescencia en el curso del tratamiento está en
relación directa con la desaparición del parásito. La fluorescencia disminuida y la ausencia
de fluorescencia pueden ser debidas a tratamientos aplicados previamente, lavado
excesivo o uso de sustancias cosméticas. La fluorescencia puede variar desde amarillooro a rosado-naranja. Las manchas fluorescen todas por igual o en ocasiones, algunas
manchas fluorescen y otras no presentan fluorescencia o son de fluorescencia dudosa:
blanca o blanco-amarillenta. Durante la fluoroscopia se suelen marcar los puntos
sospechosos para tomar de allí la impronta para el estudio microscópico.
Malassezia furfur y Malassezia ovalis fluorescen en forma similar. Igualmente fluorescen
las manchas hipocrómicas como las hipercrómicas, las manchas fluorescen si hay
descamación; si no hay descamación, la fluorescencia es inaparente. La piel normal
habitada por Pityrosporum orbiculare o Pityrosporum ovale no fluoresce o en ocasiones,
sitios con fluorescencia dudosa dan a la microscopia abundante población de
Pityrosporum al igual que en la piel sana no fluorescente.En la papilomatosis confluente
22
reticuda de Gougerot-Carteaud ha sido reportada fluorescencia amarillo-oro,
encontrándose en algunos casos P. orbiculare y aún M. furfur en las lesiones, lo que ha
llevado a suponer que la afección es debida a una respuesta anormal del huésped al
hongo. Sin embargo, en otros casos la fluorescencia está presente sin coexistencia con
Pityrosporum o Malassezia. Aquí, la fluorescencia puede ser debida a un aumento en el
grosor del estrato córneo como puede verse también en psoriasis y en las verrugas.
En la tiña ectothrix producida por Microsporum canis, los pelos atacados fluorescen de
color verde brillante, pudiendo variar en tonalidad a verde-azulosa o verde-amarillenta.
Cada uno de los pelos atacados fluorescen por separado, mientras que los pelos sanos y
las escamas no fluorescen. La inspección de todo el cuero cabelludo permite reconocer
lesiones incipientes o inaparentes a la luz ordinaria. La muestra para examen directo y
cultivo puede tomarse de los puntos fluorescentes. La fluorescencia puede ser
enmascarada por la aplicación de remedios tópicos y la formación de costras (producto de
la inflamación y secreción purulenta) o hacerse menos aparente durante el tratamiento.
Se ha venido utilizando la fluorescencia para el estudio de diversos procesos patológicos
y enfermedades de la piel, pero su uso actualmente se ha restringido para algunas
entidades producidas por hongos o bacterias.
3.2 FLUORESCENCIA EN ODONTOLOGÍA [1, 3, 4]
El principio común para este método es la fluorescencia del esmalte y la dentina. Los
dientes al iluminarse con luz ultravioleta emiten luz verde amarillenta y cuando existe
caries, la fluorescencia se pierde.
Se han desarrollado técnicas de fotografía ultravioleta capaces de evaluar la formación de
lesiones cariosas in vitro. No obstante, se observó que la fluorescencia o pérdida de la
misma no es suficientemente sensible para detectar lesiones iniciales de caries. Las
diferencia en la absorción y reflexión de la luz ultravioleta se deben particularmente a la
longitud de onda y que longitudes de onda corta son mucho más sensibles para la
detección de lesiones iniciales. Cuando ocurre la desmineralización del esmalte durante la
formación de caries, los espacios ocupados por el calcio y el fosfato son rellenados por
placa y material de película derivado del medio ambiente bucal. Estos materiales
depositados contienen sustancias tales como proteínas que absorben fotones en la
porción ultravioleta del espectro electromagnético, pero en la lesión inicial los espacios
ampliados por la desmineralización son muy pequeños y la visualización de la lesión en
sus estadios iniciales requiere mayor sensibilidad del método.
En conclusión este método se basa en la capacidad de la superficie dentaria de absorber
y reflejar la radiación ultravioleta y no en las diferencias en la fluorescencia o pérdida de la
misma. Es importante notar que el ojo humano puede detectar diferencias debidas a la
fluorescencia, pero no puede diferenciar la absorción y la reflexión de la luz ultravioleta.
Los resultados indican una mayor sensibilidad de la luz ultravioleta para detectar caries.
Para subsanar el problema de irradiación con luz ultravioleta de zonas aledañas al diente
del paciente e incluso a la sobreexposición de ultravioleta del médico, las nuevas
tecnologías ópticas, permiten el desarrollo de equipos especiales en los que se garantiza
23
un alto grado de seguridad contra una exposición no deseada. Se utilizan fibras de vidrio
o cuarzo conducir la luz ultravioleta. Las imágenes son captadas por una cámara y luego
computarizadas, esto permite cuantificar la cantidad de luz emitida y compararla con una
referencia de tejido sano de la misma imagen. Los equipos desarrollados traen
dispositivos (fibras de vidrio o cuarzo) en forma de anillos para ser usados en superficies
lisas y en forma de punta para caras oclusales (fosas y fisuras).
El uso de luz de 488 nm de longitud de onda es un nuevo método para el diagnóstico de
la lesión de caries, basado en la fluorescencia de la estructura dentaria. Esta luz permite
detectar más fácilmente las lesiones iníciales que no podrían ser detectadas con las
radiografías coronales. Esta luz también se ha utilizado exitosamente para cuantificar el
grado de remineralización de lesiones incipientes de esmalte en terapias con fluoruros.
3.3 TERAPIA FOTODINÁMICA (TFD) [1, 5, 6]
6]
La terapia fotodinámica (TDF) es uno de los tratamientos más recientes e innovadores
para el cáncer de piel no melanoma. La técnica es selectiva, eliminando sólo a las células
tumorales y dejando intacto el tejido sano. Su naturaleza no invasiva y los excelentes
resultados cosméticos son las claves de esta terapia.
La terapia fotodinámica es un proceso en tres pasos: la preparación de la lesión, la
aplicación tópica de una sustancia sensible a la luz y la activación de dicha sustancia
mediante la iluminación con una fuente de luz específica. Tras la aplicación por vía
cutánea del profármaco, ácido aminolevulínico (ALA) o 5-metil aminolevulínato (MAL), el
agente fotosensibilizante sufre transformación enzimática in situ a porfirinas fotoactivas
endógenas (PAP). El 5-metil o aminolevulinato es absorbido por las células tumorales,
induciendo acumulación selectiva de porfirinas fotoactivas (PAP) en estas células
tumorales enfermas. La acumulación de porfirinas fotoactivas, tras la aplicación de la
crema de MAL, es aproximadamente 20 veces más alta en las células tumorales que en el
tejido normal. Esta mayor selectividad es una de las diferencias entre el uso del ALA y del
MAL.
Cuando posteriormente se expone a luz roja de 630 nm, con una dosis total de 37 J/cm2
en presencia de oxígeno, durante 7-9 minutos, la reacción fotodinámica resultante
promueve la formación de especies de oxígeno reactivo (ROS) citotóxicas, que producen
daños en los compartimientos celulares, especialmente sobre las mitocondrias, es decir,
ocasiona citotoxicidad, produciendo la muerte y destrucción selectiva de las células
tumorales. Es decir, la activación luminosa de las porfirinas acumuladas induce una
reacción fotoquímica y, por tanto, fototoxicidad en las células diana expuestas a la luz.
Como el tejido sano no acumula porfirinas fotoactivas, éste no es sensible a la
iluminación, y queda, por ello, intacto.
La TFD ha demostrado una excelente eficacia en el tratamiento de la queratosis actínica
(QA) (ver fotografía 3.1) y del carcinoma basocelular (CBC) (ver fotografía 3.2). En un
amplio programa de ensayos clínicos realizados con MAL y luz de 630 nm se ha
evidenciado altas tasas de respuesta completa. La terapia fotodinámica tópica es un
24
tratamiento seguro, siendo los síntomas más frecuentes sensaciones dolorosas en la piel,
y que es dependiente de la localización anatómica y del tamaño superficie afectada.
Aunque no se han presentado ningún síntoma de fotosensibilidad sistématica, tras el
tratamiento se debe recomendar al paciente el uso de protección solar en la zona tratada
hasta 48 h después de TFD para evitar cualquier riesgo de fotosensibilización y es
recomendable mantener esta fotoprotección hasta 3-6 semanas después de la TFD para
evitar hiperpigmentación postinflamatoria. La duración media de tratamiento es de 3
meses en las QA y de 3-6 meses en el CBC.
Fotografía 3.1. Tratamiento con FTD de Queratosis actínica.
Fotografía 3.2. Tratamiento con FTD Cáncer de células basales en rostro y en brazo.
Una característica propia de los agentes fotosensibilizadores es la capacidad de tornarse
fluorescentes gracias a la energía que absorben procedentes de la luz, lo que hace que la
propia terapia fotodinámica sea de utilidad con fines de detección y delimitación de los
tumores. Esta propiedad se conoce como Detección por Fluorescencia o Diagnóstico
Fotodinámico (DFD), y que aunque aún se considera una modalidad experimental, se
25
sabe que las protoporfirias activadas emiten una fluorescencia roja cuando vuelven a un
menor estado de energía. Ya que la fluorescencia se acumula selectivamente en las
células cancerígenas que se encuentran en estado de hiperproliferación, esta propiedad
puede utilizarse para delinear los bordes de la lesión, así como detectar lesiones latentes
no visibles clínicamente.
La capacidad de metil aminolevulinato de inducir protoporfirias IX de manera selectiva en
las células tumorales, ofrece importante utilidad diagnóstica. Tras la iluminación (con luz
de Wood), el tumor se convierte en visible y aparece delineado y diferenciado del tejido
circundante. Este procedimiento permitirá realizar una biopsia guiada o controlar muy
probablemente la resección del tumor, preservando el tejido sano. Además, la detección
por fluorescencia puede ser una herramienta útil para evaluar la eficacia de la TFD
propiamente dicha y permitirá detectar una actividad tumoral más extensa, más allá que la
aparente en la inspección clínica. Las principales indicaciones de esta DFD serán la
delineación clínica del tumor así como el control de la eficacia de otros tratamientos
antitumorales.
El dermatólogo, con la terapia fotodinámica tiene a su disposición un tratamiento eficaz,
con pocos efectos adversos, sencilla de aplicar, que no requiere hospitalización y cuyo
procedimiento está totalmente validado y estandarizado, tiene buena tolerancia y es fácil
de cumplir por el paciente. Evita el trauma quirúrgico al paciente, y es útil en pacientes
inadecuados para cirugía.
REFERENCIAS
[1]. Tuan Vo-Dinh, “Biomedical Photonics Handbook, 2003
[2] W.J.P Neish, & H.C Dawkins, “Mechanisms involved in the production of red
fluorescence of human and experimental tumors”. J. Patch. Bact., 85 (1):77-92,
1963.
[3]. M. Angmar, B. Ten, “Advances in methods for diagnosing caries: A review”. Adv Dent
Res 1993; 7:70-79.
[4]. H. Eggertsson, M. Analoi, M. Van der Veen, C. Gonzalez-Cabezas, G. Eckert, G.
Stookey. “Detection of early interproximal caries in vitro using laser fluorescence,
Dye–Enhanced laser fluorescence and Direct Visual Examination”. Caries Res
1998; 33:227-233.
[5]. A. Keefe, E. Chahine. “Fluorescence detection of cervical intraepithelial neoplasia for
photodynamic therapy with the topical agents 5- aminolevulinic acid and
benzoporphyrin-derivate monoacid ring”. Am J Obtet Gynecol 20001; 184(6):116469.
[6]. C. Fritsch, K. Lang, W. Neuse, T. Ruzicka, P. Lehmann. “Photodynamic Diagnosis and
Therapy in Dermatology”. Skin Pharmacol Appl Skin Physicol 1998; 11: 358-73
26
CAPITULO 4
FLUORÓMETRO DESARROLLADO
En la figura 4.1 se muestra un diagrama esquemático del espectrofluorómetro
desarrollado para obtener espectros de fluorescencia de diversas muestras. El sistema
esta formado por una fuente luminosa de excitación, un espectrómetro básico, una fibra
óptica bifurcada, circuitos adicionales y una computadora laptop.
Fuente de I
y led UV
Iluminación
Captura
Laptop
Fibra Óptica
Bifurcada
USB
Tarjeta DAQ
Potencia
Amp V-I
Motor
Muestra
Monocromator
PM
Figura. 4.1. Diagrama esquemático del fluorómetro desarrollado
4.1 FUENTE DE ILUMINACIÓN [1]
En este trabajo se utilizó como fuente de luz el led NSHU590A (Nichia Co.), el cual tiene
su pico de emisión en la región ultravioleta (365 nm), un ancho de espectro de 10 nm y
una potencia continua de radiación de 1 mW. En la figura 4.2 se muestra la grafica del
espectro de emisión del led NSHU590A y una ilustración de su aspecto físico.
También se utilizó un led de alta luminosidad con un pico de emisión en la región azulultravioleta (447 nm), un ancho de espectro de 30 nm y una potencia continua de
radiación de 1.2 mW, medida respecto a la potencia del led ultravioleta.
Ambos led´s se alimenta con una fuente de corriente ajustable a 20 mA que se construyo
con una referencia de voltaje (AD586 de Analog Devices Inc.) y el transistor 2N2222, tal y
como se ilustra en el diagrama de la figura 4.3.
27
Figura 4.2. Espectro del diodo emisores de luz NSHU590A (365nm) y
una ilustración del led.
Figura 4.3. Fuente de corriente para la alimentación de los led.
4.2 FIBRA ÓPTICA [2, 3, 4]
Una fibra óptica básicamente es una guía capaz de conducir la radiación electromagnética
a cortas o grandes distancias con pocas pérdidas. La guía de onda debe fabricarse en un
material transparente a la radiación. En general el cable de una fibra óptica está formado
de un núcleo, un revestimiento, un tubo protector, amortiguadores, miembros resistentes y
uno o más forros de protección. También está contenida en un tubo de protección, dentro
del tubo hay un compuesto de poliuretano que encapsula, o sella a la fibra y evita la
penetración de agua. Rodeando al revestimiento de la fibra se acostumbra tener una capa
28
ya sea de laca, silicona, o acrilato, que se aplica normalmente para sellar y preservar las
características de resistencia y atenuación de la fibra.
El principio por el que la fibra óptica guía la radiación por el camino deseado, se basa en
la reflexión total. Este fenómeno tiene lugar al llegar la radiación que viaja por el material
(núcleo) de alto índice de refracción (n1 ) , a la internase de un material (revestimiento) de
menor índice (n2 ) , como se muestra en la figura 4.4.
Figura 4.4. Sección longitudinal de una fibra óptica, propagación de la radiación.
La radiación al incidir en el revestimiento, parte se refleja y parte se refracta, la relación
entre el ángulo de incidencia i y el ángulo de refracción r, esta dada por la ley de Snell:
n1sen i = n2 sen r
(4.1)
Basándonos en esta expresión y teniendo en cuenta que n2<n1, se deduce fácilmente, que
no hay refracción siempre que se cumpla la relación:
sen i >
n2
n1
(4.2)
en este caso, se produce únicamente el fenómeno de la reflexión. Según lo expuesto, la
refracción en la interfase de los dos dieléctricos se evita si el ángulo de incidencia es
mayor que un determinado valor denominado ángulo límite o critico.
α il > arcsen
n2
n1
(4.3)
Bajo estas condiciones la radiación se confina en el núcleo y se propaga a lo largo de éste
por reflexiones sucesivas. Por el contrario, aquellos haces de rayos que inciden con
ángulos de incidencia
se refractan y por lo tanto no se propagan por la fibra.
En lugar de caracterizar las fibras por el ángulo crítico, se suele utilizar el valor que
representa el ángulo límite de entrada de la radiación en la fibra óptica.
(4.4)
29
Donde
es el ángulo límite de aceptación o de entrada y
es el índice de refracción
del medio exterior a la fibra (generalmente aire). Por tanto, toda la radiación que penetra
en la fibra con ángulo menor que
será transmitida ya que no se produce refracción.
4.2.1 PARÁMETROS PARA
PARA CARACTERIZAR UNA FIBRA
FIBRA ÓPTICA
Una fibra óptica esta caracterizada por dos tipos de parámetros: estáticos y dinámicos.
Los parámetros estáticos permanecen constantes a lo largo de la fibra y los dinámicos
varían a medida que la radiación avanza por la fibra y definen el grado de distorsión que
sufre la señal luminosa en su propagación.
• Estáticos: Estos parámetros son la abertura numérica y las características
geométricas. La apertura numérica (AN) indica la cantidad de energía
electromagnética que es capaz de captar la fibra y esta dado por la siguiente
ecuación:
(4.5)
Donde
es el índice de refracción del medio y
es el ángulo limite de
aceptación. Sustituyendo en la ecuación (4.5) el valor de
y teniendo en cuenta
la expresión (4.3), se obtiene:
(4.6)
• Dinámicos. Estos parámetros son la atenuación y la dispersión temporal.
Los parámetros geométricos que caracterizan a una fibra son:
1.
2.
3.
4.
Diámetro del núcleo.
Diámetro del revestimiento.
Excentricidad.
No-circularidad de núcleo o del revestimiento.
4.2.2 PERDIDAS DE POTENCIA EN UNA FIBRA ÓPTICA
La pérdida de potencia en un cable de fibra óptica es la característica más importante del
cable. Con frecuencia se llama atenuación a la perdida de potencia y produce una perdida
de potencia de la onda luminosa al atravesar el cable. La atenuación tiene varios efectos
adversos sobre el funcionamiento, que incluyen la reducción del ancho de banda del
sistema, la rapidez de transmisión de información, la eficiencia y la capacidad general del
sistema. La perdida total de potencia en un cable de fibra esta dada por:
30
A(dB) = 10 log
Psal
Pent
(4.7)
En donde: A(dB)= reducción total de potencia (atenuación).
Psal = potencia de salida del cable (watts).
Pent = potencia de entrada al cable (watts).
La tabla 4.1 muestra la potencia de salida como porcentaje de la potencia de entrada para
un cable de fibra óptica a distintos valores de pérdida en decibeles.
Tabla 4.1. Porcentaje de potencia de salida en función de la pérdida en dB.
Pérdida (dB)
Potencia de Salida (%)
1
3
6
9
10
13
20
30
40
50
79
50
25
12.5
10
5
1
0.1
0.01
0.001
Aunque la pérdida total de potencia es de principal importancia, la atenuación de un cable
óptico se expresa, en general en decibeles de pérdida por unidad de longitud. La tabla 4.2
muestra una lista de atenuaciones, en dB/Km, para diversos tipos de cables de fibra [4].
Tabla 4.2. Atenuación en el cable de fibra óptica.
Tipo de
cable
Unímodal
Índice
graduado
Índice
escalonado
PCS
Plástico
Diámetro del
núcleo ( µm )
8
5
50
100
200
300
200
400
-----
Diámetro del
revestimiento ( µm )
125
125
125
140
380
440
350
550
750
1000
NA
(adimensional)
----0.2
0.3
0.27
0.27
0.3
0.3
0.5
0.5
Atenuación
dB/Km
0.5 @ 1300 nm
0.4 @ 1300 nm
4 @ 850 nm
5 @ 850 nm
6 @ 850 nm
6 @ 850 nm
10 @ 790 nm
10 @ 790 nm
400 @ 650 nm
400 @ 650 nm
31
Las pérdidas de transmisión en los cables de fibra óptica son una de las características
más importantes de la fibra. Las perdidas en la fibra causan una reducción de la potencia
luminosa y reducen el ancho de banda del sistema, la rapidez de transmisión de
información, la eficiencia y la capacidad general del sistema. Las principales pérdidas en
la fibra son:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Perdidas de absorción.
Perdidas por dispersión en material o de Rayleigh.
Dispersión cromática, o de longitudes de onda.
Perdidas por radiación.
Dispersión modal.
Perdidas por acoplamiento.
4.2.3 CONFIGURACIONES DE FIBRA
FIBRA ÓPTICA
En la actualidad existen tres variedades de fibra óptica fabricadas con vidrio, plástico o
una combinación de vidrio y plástico. Estas variedades son:
• Núcleo y forro de plástico.
• Núcleo de vidrio con forro de plástico (llamado con frecuencia fibra PCS, revestido
con plástico).
• Núcleo de vidrio y forro de vidrio (llamado con frecuencia SCS, revestido con fibra
de sílice).
Las fibras de plástico tienen varias ventajas sobre las de vidrio, son más flexibles, más
robustas, fáciles de instalar y resisten mejor los esfuerzos, menos costosa y pesan menos
que las de vidrio. Su principal desventaja es su alta atenuación característica, por lo que
su aplicación se limita a tramos relativamente cortos. Las fibras con núcleo de vidrio
tienen bajas atenuaciones características, las fibras PCS son un poco mejores que las
SCS, las PCS también se afectan menos por la radiación, tienen aplicaciones militares.
Las SCS tienen mejores características de propagación, su desventaja es que son menos
robustas y son más susceptibles a aumentos de atenuación cuando están expuestos a la
radiación.
Actualmente se investiga en Bell Laboratories, la posibilidad de usar una cuarta variedad
que usa una sustancia no silicea, el cloruro de zinc. Los experimentos preliminares
parecen indicar que esta sustancia será hasta 1000 veces más eficiente que el vidrio su
contraparte a base de silicio.
La forma en que se propague la luz a través de una fibra óptica depende del modo de
propagación y del perfil del índice(s) de la fibra. El perfil del índice de una fibra óptica es
una representación grafica del índice de refracción en la sección transversal de la fibra.
Hay dos tipos básicos de perfil índice: graduados y escalonados. Una fibra de índice
escalonado tiene un núcleo central con índice de refracción uniforme, este núcleo está
rodeado por un revestimiento externo con índice de refracción uniforme pero menor que el
del núcleo central. En una fibra de índice escalonado hay un cambio abrupto de índice de
refracción en la interfaz entre núcleo y revestimiento. En la fibra de índice graduado no
32
hay revestimiento y que el índice de refracción del núcleo no es uniforme, es máximo en
el centro y disminuye en forma gradual de acuerdo con la distancia hacia la orilla externa.
4.2.4 FIBRA ÓPTICA UTILIZADA
UTILIZADA [5]
En este trabajo se utilizo la fibra bifurcada R200-ANGLE-UV de la firma Ocean Optics, la
cual se muestra en la figura 4.5. Esta fibra consiste de un arreglo en “Y” de 7 fibras
individuales: un conjunto de 6 fibras para iluminación en un extremo y una sola fibra de
lectura en el otro extremo. En el extremo común del arreglo “Y” las seis fibras de
iluminación se encuentran alrededor de la fibra de lectura, tal y como se muestra en la
figura 4.5. Todas las fibras tienen un diámetro de 200 µm, una apertura numérica de 0.22
y puede trabajar en un intervalo de longitud de onda desde la región ultravioleta hasta la
visible (250-800nm). La R200-ANGLE-UV esta diseñada para medir reflexión y
fluorescencia en superficies sólidas o fluorescencia y esparcimiento en líquidos [7].
Figura 4.5. Fibra óptica bifurcada R200-ANGLE-UV de la firma Ocean Optics.
Otro problema que se debe tomar en cuenta es que la señal óptica reemitida por la
muestra debe discriminarse de la radiación interferente que la acompaña, principalmente
en el caso de sensores fluorescentes de la emisión Raman. Los sensores que utilizan
haces de fibra bifurcados resuelven este problema fácilmente, puesto que al no viajar la
radiación incidente y emitida por el mismo camino, basta con situar un filtro a la entrada
del detector para conseguir la separación de la radiación interferente.
33
4.3 ACOPLAMIENTO ÓPTICO [6]
Es muy importante considerar el acoplamiento óptico entre la
radiación procedente de la fuente y la fibra óptica, con objeto de
conseguir que penetre en la guía de onda la máxima intensidad
de radiación, esto se logra empleando lentes de enfoque o
fuentes colimadas,
igualmente se debe conseguir que la
intensidad que llegue al detector procedente de la fase reactiva
sea la máxima. En este trabajo la luz proveniente de diodos es
acoplada a las seis fibras de iluminación por medio de una lente
colimadora 74-UV de la firma Ocean Optics, la cual se muestra en
la figura 4.6.
Figura 4.6. Lente colimadora 74-UV.
Se diseñaron y construyeron herrajes para acoplar la señal luminosa de un led, a las 6
fibras de iluminación de la fibra óptica bifurcada. El acoplamiento se realiza por medio de
lentes esféricas de 10 mm de diámetro (BK7 de la firma Edmund Optics), tal y como se
ilustra en la fotografía 4.1. Se desarrollo también un herraje para apoyar en una superficie
el extremo donde se unen las dos fibras bifurcadas. Se realizaron pruebas en superficies
para ajustar la distancia óptima de reflexión.
Herraje para soportar
la fibra óptica en su
extremo de 7 fibras
Iluminación
Entrada de luz
(led)
Herrajes cilíndricos de
latón con cuerda para
ajustar distancias
focales.
Lentes esféricas
Fotografía 4.1. Herrajes de acoplamiento y ajuste óptico para la fibra bifurcada
También se diseño y construyo una cámara óptica a la entrada del monocromador para
irradiar muestras contenidas en tubos de ensaye de 1 cm de diámetro, y para medir la
señal de referencia de la excitación. La cámara óptica se construyo a partir de una barra
cuadrada de aluminio de 2.5 cm por lado y una longitud de 6.5 cm (ver fotografía 4.2).
34
Tubo con anticongelante
como muestra
Entrada óptica del
monocromador
Entrada de luz
led en soporte
de teflón
Ranura para introducir
un portaobjetos como
divisor de haz
Salida luminosa de referencia
Fotografía 4.2. Herraje de la cámara óptica para tubos de ensaye montados en el
monocromador.
La barra se perforo longitudinalmente en su centro a un diámetro de 1 cm. En un extremo
esta dispuesto un soporte de teflón para fijar el led de excitación y a 3.5 cm del led se
perforo la barra en forma normal a la perforación longitudinal. Esta perforación normal
sirve para colocar verticalmente el tubo de ensayo que contiene a la muestra. La distancia
de 3.5 cms es la distancia necesaria para que el haz emitido por el led UV abra hasta 1
cm de diámetro, que es el área de irradiación sobre la muestra. La cámara esta ranurada
a 45° en la trayectoria de la luz que incide en la mue stra, con la finalidad de insertar un
vidrio portaobjetos de microscopio como divisor del haz de luz. Experimentalmente se
determino que el portaobjetos refleja aproximadamente 17% a 45° de la luz incidente.
Con estos sistemas desarrollados y acoplados al monocromador se realizaron mediciones
de fluorescencia en estado estacionario para diversas muestras, los resultados se
presentan en el capitulo 5.
4.4 PROGRAMA DE CONTROL
CONTROL
A partir de un programa que se escribio en el lenguaje gráfico G de LabVIEW 7.1 [8.9],
para controlar la operción del espectrómetro básico, se desarrollo un programa más
completo. Este programa de control puede ejecutar una de cuatro posibles opciones de
trabajo: Posicionar/Medir, Barrido, Autocalibración y Lectura de Archivos que se describen
en las siguientes líneas.
35
Posicionar/Medir
Esta opción de trabajo sirve para posicionar el sistema óptico del monocromador de tal
manera que su señal luminosa de salida se encuentre en una longitud de onda deseada.
El posicionamiento se realiza a partir de los valores de Lamda Actual y Lamda a
Posicionar. También en esta opción se pueden realizar mediciones continuas de la
intensidad luminosa detectada por el PMT.
Barrido
Cuando se ejecuta esta opción el monocromador se posiciona desde el valor de Lamda
Actual hasta el valor de Lamda Inicial donde se desea iniciar el barrido. Se efectúa un
barrido completo de la longitud de onda con una ∆λ seleccionada por el usuario desde
Lamda Inicial hasta el valor de Lamda Final (ver figura 4.9). Para cada valor de λ se mide
un voltaje proporcional a la intensidad luminosa emitida por la muestra en esa longitud de
onda y la información recolectada de λ vs intensidad luminosa se presenta en forma
gráfica y si se desea se puede almacenar en un archivo.
Autocalibración
Determina experimentalmente la línea recta de calibración, la cuál relaciona el valor de
lamda real a la salida del monocromador con el número de pasos ejecutados por el motor.
La ecuación de calibración se guarda en un archivo para mantenerla actualizada en su
posterior uso.
Ver Archivo
Con esta opción de trabajo es posible abrir el archivo (intensidad vs λ) de una muestra
que fue almacenado anteriormente, y graficarlo en la pantalla del panel para estudiar la
respuestal espectral de la muestra.
En la figura 4.9 se presenta el panel frontal del instrumento desarrollado después de
ejecutar la opción de Barrido. El espectro medido corresponde al espectro de la lámpara
de mercurio utilizada para la calibración del instrumento, tal y como se describe en el
capitulo 5.
Si consideramos que la lámpara de calibración genera líneas espectrales, entonces,
observando la figura 4.9 podemos decir que la transferencia del monocromador introduce
un ancho de espectro de aproximadamente 4nm.
36
Figura 4.7. Panel frontal del instrumento desarrollado en LabVIEW 7.1 después de realizar
la opción Barrido. El espectro medido corresponde al espectro de la lámpara de mercurio
HG-1 utilizada para calibrar el instrumento.
REFERENCIAS
[1].
Nichia Corp., “Specifications for Nichia UV Led, Modelo NSHU590A”
http://www.nichia.co.jp/specification/led_lamp/NSHU590A-E.pdf
[2]. E. Hecht, “Optica”, Addison Wesley Iberoamericana, Madrid, 2000
[3]. Optral, la Fibra Óptica como medio de transmisión, www.optral.com
[4]. Tomasi, Wayne, Sistema de Comunicaciones Electrónicas, Pearson Educación,
México, 2003.
[5]. Ocean Optics, Inc., “Reflection/Backscattering Probes”,
http://www.oceanoptics.com/Products/reflectionprobes.asp
[6]. Ocean Optics, Inc., “74-series Lens Fixtures”,
http://www.oceanoptics.com/Products/74series.asp
[7]. National Instruments, “G Programming Reference Manual” , National Instruments
Corp., Austin TX, USA, 1998.
[8]. National Instruments Corp, “LabVIEW Graphical Programming for Instrumentation,
Users Manual”, National Instruments Corp, Austin TX, USA, 1999.
37
CAPÍTULO 5
CALIBRACIÓN Y MEDICIONES
5.1 CALIBRACIÓN
La ecuación de transferencia del monocromador relaciona la longitud de onda λ de la
señal luminosa de salida con el número de pasos de entrada. Para determinar
experimentalmente esta ecuación se utilizó como patrón la lámpara de calibración de
Mercurio HG-1 de Ocean Optics [1], la cual tiene líneas de emisión bien definidas en su
espectro. La calibración se realizó únicamente en un intervalo del espectro visible en
cuatro longitudes de onda: 365.0146 nm, 404.6563 nm, 435.8328 nm y 546.0735 nm.
Se realizaron tres barridos en un intervalo de 4000 pasos, desde un valor aleatorio de
6000 pasos hasta 10,000 pasos. En cada paso del motor se midieron 40 muestras de
intensidad luminosa a razón de 4800 muestras por segundo tomando su valor promedio.
Se tomo el valor promedio de pasos de los tres barridos para cada pico y se obtuvo una
gráfica de pasos vs λ. Los datos experimentales se ajustaron a una línea recta obteniendo
como resultado la siguiente ecuación de transferencia:
λ = 0.050015 (nm/paso) * Pasos + 54.62 nm
De acuerdo a ésta recta los valores de los datos experimentales, los valores ajustados, y
sus errores se muestran en la tabla 5.1. La pendiente de ésta última recta de ajuste
representa la máxima resolución para el posicionamiento de λ del monocromador y tiene
un valor de 0.05 nm/paso , es decir, es la mínima diferencia que se puede obtener de λ en
promedio para cada paso del motor.
Tabla 5.1. Error en λ a partir de los valores patrón y los datos experimentales
Pasos
λ patrón (nm)
λ ajustada (nm)
Error (nm)
Error (%)
9820
546.0735
545.7838
-0.29
-0.05
7615
435.8328
435.4842
-0.34
-0.078
6992
404.6563
404.3248
-0.33
-0.081
6200
365.0146
364.7460
-0.27
-0.074
Por otra parte se realizaron varios barridos en las dos direcciones de λ alrededor de una
sola longitud de onda, encontrándose un error máximo debido al efecto backlash del
sistema mecánico de 0.1nm. En la figura 2.3 se presenta el espectro obtenido de la
lámpara de mercurio con el espectrómetro calibrado.
38
5.2 MEDICIONES
En las siguientes figuras se presentan algunos espectros medidos con el espectrómetro
desarrollado. En la figura 5.1 se muestran los espectros de emisión de cuatro led´s: un led
ultravioleta (375 nm) y tres leds de alta luminosidad: azul (447 nm), verde (449 nm) y rojo
(638 nm). Los espectros mostrados están normalizados y corresponden a la reflectancia
de la luz irradiada por los leds en un papel blanco. Una tira de papel blanco se coloco
dentro de la cámara óptica formando un ángulo de 45° entre la luz incidente y la reflejada.
Figura 5.1. Espectros de emisión de cuatro leds: un led ultravioleta (375 nm) y tres leds de
alta luminosidad: azul (447 nm), verde (449 nm) y rojo (638 nm).
Para fines de comparación se irradió una muestra de papel bond color naranja claro con
los leds UV y azul, obteniendo los espectros de fluorescencia que se ilustran en la figura
5.2. En la figura 5.3 se muestran los espectros emitidos por un anticogelante irradiados
con luz UV y luz azul.
En la figura 5.2 se puede observar que cuando el papel naranja claro se excita con luz
ultravioleta, su espectro de emisión de fluorescencia inicia en 450 nm. Esta longitud de
onda esta contenida dentro del espectro de excitación del led azul y por lo tanto, cuando
el papel se excita con ésta luz no se registra fluorescencia en el intervalo de 450 a 500
nm. En cambio, los espectros de fluorescencia emitidos por un anticongelante, excitado
con el led UV y con el led azul aparecen completos (λ p=530 nm), tal y como se observa
en la figura 5.3. En ésta figura también se observa el espectro completo de reflectancia de
la excitación azul y que la fluorescencia tiene una intensidad mayor a la del pico de
reflectancia del led azul.
Con los espectros de la Fig., 5.2 y de la Fig. 5.3 se pueden comprobar dos principios
39
fundamentales de la fluorescencia:
a) Que el espectro de emisión de la fluorescencia siempre se produce a longitudes de
onda mayores a la longitud de onda de la excitación luminosa (corrimiento de Stokes).
b) Que el espectro de emisión de fluorescencia siempre se produce en la misma longitud
de onda independientemente de la longitud de onda de excitación (regla de Kasha).
Figura 5.2. Espectros de fluorescencia emitida por papel bond color naranja claro cuando
es excitado con el led UV y con el led azul.
Figura 5.3. Espectros de fluorescencia emitida por un anticongelante irradiado por el led
UV y el led azul.
40
Utilizando solamente el led UV como fuente de excitación se obtuvieron los espectros de
fluorescencia de papel bond de tres distintos colores, los cuales se presentan en la figura
5.4 y de dos líquidos mostrados en la figura 5.5.
Figura 5.4. Espectros de fluorescencia emitida por papel bond color amarillo, naranja
medio y verde claro irradiados con el led UV.
Figure 5.5. Espectros de fluorescencia emitidos por agua jabonosa y por un detergente
comercial color verde.
Los espectros mostrados en las figuras 5.2, 5.3 y 5.4 son similares a los reportados en la
referencia [2].
41
Figure 5.6. Espectros de fluorescencia emitidos por cáscara de papaya, pulpa de mango y
tomate verde. Los tres componentes emiten fluorescencia máxima alrededor de 550nm.
En la figura 5.7 se muestran espectros de fluorescencia obtenidos en diferentes zonas de
la piel en una misma persona. Se aprecia como la zona menos pigmentadas (palma de la
mano) es la que emite una mayor intensidad de radiación fluorescente.
Figura 5.7. Autofluorescencia de distintas localizaciones de piel de una misma persona
que a la vista manifiesta una coloración diferente.
42
REFERENCIAS
[1] Ocean Optics, Inc., “HG-1 Mercury Argon Calibration Source”,
http://www.oceanoptics.com/products/hg1.asp
[2] F. J. Bautista Diaz, “Sistema para la medición de fluorescencia inducida por láser (LIF)
resuelta en tiempo”, Tesis de Maestría, ESIME-IPN, Septiembre de 2004.
43
CAPÍTULO 6
CONCLUSIONES
6.1 CONCLUSIONES.
Se puede concluir que el sistema electrónico desarrollado trabaja adecuadamente y que
ha servido para realizar mediciones de los espectros de radiación de diversas fuentes de
luz, y de los espectros de emisión fluorescente para diversas muestras. Con este trabajo
también se han podido comprobar dos principios fundamentales de la fluorescencia: La
ley de Stokes y el principio de Kasha. El prototipo se encuentra trabajando
satisfactoriamente en un intervalo útil de 200nm a 800nm, para el estudio de papel bond,
anticongelantes y frutas. Sin embargo la potencia del LED utilizado no es suficiente para
estudiar fluorescencia en piel.
La potencia de radiación de 1 mW, emitida por el diodo ultravioleta que se utilizó, sufre
una atenuación de aproximadamente 18% cuando incide sobre la muestra, debido a las
perdidas producidas por la fibra óptica bifurcada. Por otro lado, la señal de fluorescencia
emitida por la muestra también sufre una atenuación similar, la cual que ocurre durante su
viaje a través de la fibra hacia la entrada del monocromador. Aunque si bien se usa un
tubo fotomultiplicador de muy alta sensibilidad, el cuál es capaz de detectar señales
débiles de fluorescencia, es recomendable utilizar un diodo UV de mayor potencia. La
precisión y la exactitud en las mediciones de un espectro son inferiores a 1 nm con una
resolución de 0.05 nm.
El uso del fenómeno de fluorescencia para la detección de cáncer en piel es una técnica
muy promisoria con ventajas evidentes sobre las técnicas convencionales. Estas técnicas
requieren de la realización y estudio de una biopsia para obtener un diagnóstico final., la
cual además de dolorosa puede ser traumática si hay que realizarla en la cara. La boipsia
óptica por medio de fluorescencia inducida es un atécnica no invasiva y de rápido
diagnóstico in vivo e in situ. La detección de cáncer de piel por medio de fluorescencia es
un problema abierto, el cual requiere aún de mucha investigación para generar una gran
confianza en sus resultados para poder sustituir la realización de biopsias. Otra ventaja
radica en la posibilidad de realizar diagnósticos más tempranos que los posibles a la
fecha con las técnicas convencionales. El espectrofluorómetro desarrollado tiene la
sensibilidad suficiente para avanzar en esta investigación y resulta ahora necesario
aumentar la potencia de irradiación del LED para su aplicación en pacientes con visibles
alteraciones en la estructura o color en su piel.
44
6.2 TRABAJO A FUTURO
• Usar como fuente luminosa diodos de UV de mayores potencias a 1mW.
Recientemente paraecieron en el mercado LEDS que emiten en el
ultravioleta de 7 y 200 mW.
• Aplicar el prototipo en pacientes con enfermedades de piel..
• Estudiar y analizar los espectros de fluorescencia medidos en pacientes con
cáncer de piel para identificar el estado de avance de la enfermedad.
45

Fluorometro basado en un LED un monocromador y un tubo

Transcripción

Documentos relacionados

Pardeamiento no enzimático - Departamento de Química Orgánica

Recomendaciones dietéticas del estreñimiento

Guía para seleccionar probador

Descargar PDF

FieldTurf Classic HD